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特表2023-534727懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの取得方法、当該懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ、およびそれらの懸濁アレイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-10
(54)【発明の名称】懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの取得方法、当該懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ、およびそれらの懸濁アレイ
(51)【国際特許分類】
C12N 11/08 20200101AFI20230803BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230803BHJP
【ＦＩ】
C12N11/08 ZNA
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504343
(86)(22)【出願日】2021-07-20
(85)【翻訳文提出日】2023-03-20
(86)【国際出願番号】 ES2021070539
(87)【国際公開番号】W WO2022018314
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】P202030756
(32)【優先日】2020-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】ES
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】593005895
【氏名又は名称】コンセホ・スペリオル・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス（セエセイセ）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】プラサ プラサ，ホセ アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】アグシル アントノフ，フアン パブロ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B033NA22
4B033NA42
4B033NA45
4B033NB33
(57)【要約】
本発明はＳＵ－８フォトリソグラフィーの手段による、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの取得方法であって、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を作製し、それぞれのチップ上にプリント平面配置またはプリント平面配置を作製するソフトリソグラフィーを作製する方法に関し、前記方法は、剥離され、水性媒質中に溶解される固化膜を形成する工程を含む。さらに、本考案は懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップに関し、少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを含む懸濁アレイに関する。最後に、本発明は、バーコーディングチップおよび前記懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップまたは前記懸濁アレイを備える感知デバイスに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを得るための方法であって、以下：●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●および分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせ、
を含み、
ここで、前記分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの第１および第２の平坦表面上にグラフトされ、また；
●当該分子は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾発色団、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾蛍光色団からなるリストから選択され、
●当該生体分子は、好ましくは糖質、タンパク質、抗体、酵素および核酸からなるリストから選択され、
●当該ナノ粒子は、好ましくはアミン官能基を含む炭素系ナノ粒子、アミン官能基を含む金属ナノ粒子、アミン官能基を含むセラミックナノ粒子、アミン官能基を含むポリマーナノ粒子、およびアミン官能基を含む半導体ナノ粒子から選択され；
前記方法は、以下の工程：
ａ）ＳＵ－８フォトリソグラフィーによって、ＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定し；それによって、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を形成する工程であって、各ＳＵ－８チップは第１の平坦表面および第２の平坦表面を有し、第２の平坦表面は基材と直接接する工程；
ｂ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ａ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップに第１の反応性平坦表面を形成する工程であって、前記シラン架橋剤は、以下の２つの官能基を含む、工程：
●シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基；
ｃ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｂ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｄ）工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップの上にマウンティング媒質をキャスティングし、固化したままにすることにより、工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップをマウンティング媒質に埋め込み、固化膜を基材上に形成する工程；
ｅ）工程（ｄ）で得られた固化膜を基材から剥離することにより、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面をロック解除する工程；
ｆ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｅ）で得られた各ＳＵ－８チップのロック解除された第２の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップ中に第２の反応性表面を形成する工程であって、前記シラン架橋剤は、以下の２つの官能基を含む、工程：
●シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基；
ｇ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｆ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の反応性表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｈ）工程（ｇ）で得られたＳＵ－８チップの固化膜を水性媒質に溶解する工程；および
ｉ）遠心分離により工程（ｈ）で得られた懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを再回収する工程、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項2】
工程（ａ）を繰り返すことができ、これにより、基材上の規則的なＳＵ－８チップの二重高さ配置を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｃ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子が各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含み、それによって第１のプリント平面配置を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程（ｃ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子が各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子の組み合わせを含み、それによって第１の平面アレイを形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
工程（ｂ）および（ｃ）のソフトリソグラフィーが、ラインパターンおよび／またはスポットの形態で行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｆ）および（ｇ）を繰り返すことができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
工程（ｇ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子が各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含み、それによって第２のプリント平面配置を形成する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｇ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子が各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子の組み合わせを含み、それによって第２の平面アレイを形成する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｆ）および（ｇ）のソフトリソグラフィーが、ラインパターンおよび／またはスポットの形態で実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
好ましくは請求項１～１０のいずれかに記載の方法によって得られる、懸濁ダブルフラットヤヌスチップであって、以下を含む懸濁ダブルフラットヤヌスチップ：●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ、
ここで前記分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの前記第１の平坦表面および前記第２の平坦表面の上にグラフトされている。
【請求項12】
前記分子が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾発色団、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾蛍光色団からなるリストから選択される、請求項１１に記載の懸濁ダブルフラットヤヌスチップ。
【請求項13】
前記生体分子が、糖質、タンパク質、抗体、酵素および核酸からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の懸濁ダブルフラットヤヌスチップ。
【請求項14】
前記ナノ粒子が、アミン官能基を含む炭素系ナノ粒子、アミン官能基を含む金属ナノ粒子、アミン官能基を含むセラミックナノ粒子、アミン官能基を含むポリマーナノ粒子、およびアミン官能基を含む半導体ナノ粒子から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の懸濁ダブルフラットヤヌスチップ。
【請求項15】
請求項１１～１４のいずれか１項に記載の、少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットヤヌスチップを含むことを特徴とする、懸濁アレイ。
【請求項16】
少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットヤヌスチップを混合する工程を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の懸濁アレイの取得方法。
【請求項17】
請求項１１～１４のいずれかに記載の少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットヤヌスチップ、または請求項１５に記載の懸濁アレイを含むことを特徴とする、バーコーディングチップ。
【請求項18】
前記バーコーディングチップがカラーバーコーディングチップであり、少なくともナノ粒子がラインパターンおよび／またはスポットの形態で各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされており、前記ナノ粒子がアミン修飾量子ドットである、請求項１７に記載のバーコーディングチップ。
【請求項19】
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の懸濁ダブルフラットヤヌスチップ、または請求項１５に記載の懸濁アレイを備えることを特徴とする、感知デバイス。
【請求項20】
前記感知デバイスがｐＨ感知デバイスであり、少なくとも分子が各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされており、前記分子がＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含むｐＨ感知蛍光色団である、請求項１９に記載の感知デバイス。
【請求項21】
前記感知デバイスがＤＮＡ感知デバイスであり、少なくとも生体分子が各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされており、前記生体分子がＤＮＡプローブである、請求項１９に記載の感知デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＵ－８フォトリソグラフィーの手段による懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの取得方法であって、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を作り出し、ソフトリソグラフィーにより、それぞれのチップ上にプリント平面または平面アレイを作り出す方法に関し、この方法は、剥離され、水性媒質中に溶解される固化膜を形成する工程を含む。さらに、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップおよび懸濁アレイに関する本発明は、少なくとも二つの異なる懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを含む。最後に、本発明はバーコーディングチップ、および当該懸濁二重フラットＳＵ－８ヤヌスチップまたは当該懸濁アレイを備える、感知デバイスに関する。
【背景技術】
【0002】
高度に小型化された（生物）分子ツールは、それらの選択された物理的および化学的異方性を合わせることに基づく動的設計機構から恩恵を受けている。主に、微粒子は、異方性のカスタマイズを介してこれらの特性を統合する。それらの設計は機能性を決定するが、それらの作製はそれらの物理的特性、意図された化学的修飾、生体適合性およびスループットの間の妥協を必要とする[Misra, AC& Lahann, JProgress of Multicompartmental Particles for Medical ApplicationsAdvHealthcMater.7,1-9(2018)]。
【0003】
調整されたサイズおよび形態、形状符号化、ならびに複雑な３Ｄトポグラフィーを包含する物理的異方性ドメインを増加させるために、非球状微粒子を構築するための多大な努力が払われてきた。液滴およびフローリソグラフィー、マイクロ流体工学、遠心分離、電気流体力学、および２光子リソグラフィーなどの逐次作製方法が、選択された物理的特性を有する微粒子を作製するために開発されている。しかしながら、機能性を増強するための単一の微粒子におけるこれらの物理的特性の全ての組み合わせ、またはさらにカスタマイズされた特性は、相補的な物理的異方性を組み込むための作製アプローチの限られた利用可能性によって妨げられる。
【0004】
あるいは、化学的異方性にも着目した研究が行われている。広範な異方性は、該プロセスによって制限されるものの、作製中に細分化を加えることによって実施することができる。または、反応性溶液中の懸濁微粒子の確率的性質によって妨げられ得るか、または微粒子の表面上に存在する利用可能な直交化学反応部位によって制限され得る後方官能化によって、実施することができる。イメージネイティブソリューションは複数の細分化された微粒子又はチップを作製するために使用されており、符号化および偽造防止分野において魅力的なアプローチを提供しているが、その主な用途は生物医学的および生物工学的用途を中心としている。それにもかかわらず、単一の微粒子における官能性を増加させるためのさらなるカスタマイズされた特性の組み合わせは、直交化学を組み込むための利用可能な反応性経路によって制限される。
【0005】
これらの技術の統合は微粒子分野における大きな進歩を実証したが、物理的異方性間の、化学的異方性間の、およびそれらの組み合わせ間の一定のトレードオフは、可能性のあるカスタマイズされた微粒子の並外れたライブラリーを制限し、微細化と共にさらに悪化した。したがって、調整されたサイズおよび形態、ならびにカスタマイズされた特性／機能性を有する非球状微粒子を得るための、新しい方法を開発することが必要である。
【発明の概要】
【0006】
本発明の方法によって解決されるべき課題は特異的なシラン架橋剤によって、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組合せが、それぞれのＳＵ－８チップの第１および第２の平坦表面上にグラフトされる、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを得るための多用途の処理を提供することである。この方法は、物理的な寸法（横方向１μｍ、垂直方向０．５μｍ）および１μｍ２以下の分子パターンの制御された微細化を可能にする。カスタマイズされた形状およびサイズを有する本発明の小型感知デバイスの工程に続いて、マイクロスケールでの感知能力が達成可能である。したがって、当該方法は、以下の製造において興味深いことである；
●例えばｐＨ変化検出などの感知デバイス
●例えばＤＮＡコード化認識選択的ＤＮＡ認識などの感知デバイス
●バーコードライブラリの作製
本発明の第１の態様は、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを得るための方法（本明細書における本発明の方法）であって、以下：
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●および分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせ、
を含み、ここで、前記分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの第１および第２の平坦表面上にグラフトされ、また；
●当該分子は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾発色団、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾蛍光色団からなるリストから選択され、
●当該生体分子は、好ましくは糖質、タンパク質、抗体、酵素および核酸からなるリストから選択され、
●当該ナノ粒子は、好ましくはアミン官能基を含む炭素系ナノ粒子、アミン官能基を含む金属ナノ粒子、アミン官能基を含むセラミックナノ粒子、アミン官能基を含むポリマーナノ粒子、およびアミン官能基を含む半導体ナノ粒子から選択され；
前記方法は、以下の工程：
ａ）ＳＵ－８フォトリソグラフィーによって、ＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定し；それによって、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を形成し、ここで各ＳＵ－８チップは第１の平坦表面および第２の平坦表面を有し、第２の平坦表面は基材と直接接触する工程；
ｂ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ａ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップに第１の反応性平坦表面を形成する工程；
ｃ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｂ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｄ）工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップの上にマウンティング媒質をキャスティングし、固化したままにすることにより、工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップをマウンティング媒質に埋め込み、固化膜を基材上に形成する工程；
ｅ）工程（ｄ）で得られた固化膜（工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップが埋め込まれた状態）を基材から剥離することにより、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面をロック解除する工程；
ｆ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｅ）で得られた各ＳＵ－８チップのロック解除された第２の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップ中に第２の反応性表面を形成する工程；
ｇ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｆ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の反応性表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｈ）工程（ｇ）で得られたＳＵ－８チップの固化膜を水性媒質に溶解する工程；および
ｉ）遠心分離により工程（ｈ）で得られた懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを再回収する工程、を含むことを特徴とする。
●例えばｐＨ変化検出などの感知デバイス
●例えばＤＮＡコード化認識選択的ＤＮＡ認識などの感知デバイス
●バーコードライブラリの作製
本発明の第１の態様は、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを得るための方法（本明細書における本発明の方法）であって、以下：
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●および分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせ、
を含み、ここで、前記分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの第１および第２の平坦表面上にグラフトされ、また；
●当該分子は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾発色団、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾蛍光色団からなるリストから選択され、
●当該生体分子は、好ましくは糖質、タンパク質、抗体、酵素および核酸からなるリストから選択され、
●当該ナノ粒子は、好ましくはアミン官能基を含む炭素系ナノ粒子、アミン官能基を含む金属ナノ粒子、アミン官能基を含むセラミックナノ粒子、アミン官能基を含むポリマーナノ粒子、およびアミン官能基を含む半導体ナノ粒子から選択され；
前記方法は、以下の工程：
ａ）ＳＵ－８フォトリソグラフィーによって、ＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定し；それによって、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を形成し、ここで各ＳＵ－８チップは第１の平坦表面および第２の平坦表面を有し、第２の平坦表面は基材と直接接触する工程；
ｂ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ａ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップに第１の反応性平坦表面を形成する工程；
ｃ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｂ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｄ）工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップの上にマウンティング媒質をキャスティングし、固化したままにすることにより、工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップをマウンティング媒質に埋め込み、固化膜を基材上に形成する工程；
ｅ）工程（ｄ）で得られた固化膜（工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップが埋め込まれた状態）を基材から剥離することにより、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面をロック解除する工程；
ｆ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｅ）で得られた各ＳＵ－８チップのロック解除された第２の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し；それによって、各ＳＵ－８チップ中に第２の反応性表面を形成する工程；
ｇ）ソフトリソグラフィーによって、工程（ｆ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の反応性表面上に、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトする工程；
ｈ）工程（ｇ）で得られたＳＵ－８チップの固化膜を水性媒質に溶解する工程；および
ｉ）遠心分離により工程（ｈ）で得られた懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを再回収する工程、を含むことを特徴とする。
【0007】
本発明の方法の工程（ａ）は、ＳＵ－８フォトリソグラフィーによってＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定し、それによって基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を形成することを指し、ここで各ＳＵ－８チップは第１の平坦表面および第２の平坦表面を有し、第２の平坦表面は基材と直接接触し、基材は各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面をロックする。
【0008】
「ダブルフラットＳＵ－８チップ」という用語は、本明細書では第１の平坦表面（上部）および第２の平坦表面（底部）を有するＳＵ－８チップを指す。
【0009】
「ＳＵ－８フォトリソグラフィー」という用語は、基材上に規則的なＳＵ－８チップの配置を作り出すために、ＳＵ－８スピンコート層をパターニングするＵＶ曝露リソグラフィー技術を指す。
【0010】
「規則的なＳＵ－８チップの配置」という用語は、基材上のＳＵ－８チップの規則的な配置または規則的な接合部を指す。
【0011】
ＳＵ－８フォトリソグラフィーは、球状ポリマー微粒子によって支配され、カスタマイズ可能な唯一のパラメータが球の半径であるフィールドにおいて、カスタマイズ可能な形状およびサイズを有するＳＵ－８チップの作製を可能にする。本発明においては、１μｍ程度の小さな特徴を有するデザインを転写することができる。
【0012】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ａ）を繰り返すことができ、これにより、基材上の規則的なＳＵ－８チップの二重高さ配置を得る。
【0013】
「規則的なＳＵ－８チップの二重高さ配置」という語は、本明細書では異なる形状およびサイズ（物理的な特性）の、少なくとも二つの重なり合うＳＵ－８層、を含むＳＵ－８チップを指す。
【0014】
工程（ｂ）はソフトリソグラフィーにより、工程（ａ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化し、それにより、各ＳＵ－８チップに第１の反応性平坦表面を形成することを指し、ここで、シラン架橋剤は、２つの官能基を含む：
●シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基。
●シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基。
【0015】
「ソフトリソグラフィー」という用語は、分子、生体分子、ナノ粒子などによって覆われたエラストマースタンプを接触させることによって、分子、生体分子、ナノ粒子などをプリントする技術を指す。本発明において、ソフトリソグラフィー技術は、ダブルフラットＳＵ８チップの第１および第２の平坦表面上に分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせをプリントするために使用される。
【0016】
本発明においては、マイクロコンタクトプリンティングまたはポリマーペンリソグラフィーなどのソフトリソグラフィー技術が好ましい。
【0017】
「シラン架橋剤」という用語は、本明細書においては以下２つの官能基を有するヘテロ二官能性分子を指す：
●自発的に反応してＳＵ－８チップの表面と共有結合を形成する、シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基であって、分子、生体分子、またはナノ粒子と共有結合を形成する、官能基。
●自発的に反応してＳＵ－８チップの表面と共有結合を形成する、シラン官能基、および
●一級または二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基であって、分子、生体分子、またはナノ粒子と共有結合を形成する、官能基。
【0018】
本発明の方法の工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られたＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に、ソフトリソグラフィーによって分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせをグラフトすることを指す。
【0019】
「分子」という語は、本明細書ではシラン架橋剤によって反応面にグラフトすることができるＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾された発色団または蛍光色団を指す。シラン官能基は、自発的に反応してＳＵ－８チップの表面と共有結合を形成するが、第一級または第二級アミン基、エポキシド基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、ビニル基、イソシアネート基、またはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基は、修飾された発色団または蛍光色団中に存在するＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基と共有結合を形成する。それによって、分子は、各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に共有結合される。蛍光色団をグラフトすることは、例えば、ｐＨに対する発光強度を変化させること、または蛍光色団をビットとして使用することによるバーコーディング、または粒子を追跡するようなイメージングのための、化学的感知において興味深いことである。
【0020】
本明細書において、「生体分子」とは、糖類およびデンプン、タンパク質および抗体、酵素、ならびＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸を指す。前記生体分子は反応性表面上にグラフトすることができ、シラン架橋剤によることを含む：シラン官能基が自発的に反応して、ＳＵ－８チップの表面と共有結合を形成するが、第一級または第二級アミン、エポキシド、チオール、カルボキシル、アジド、ビニル、イソシアネートまたはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基は生体分子またはアミン修飾生体分子、例えばアミン修飾オリゴ中に存在するアミンと共有結合を形成する。それによって、生体分子は、各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に共有結合される。生体分子のグラフトは、プロテオミクスおよびゲノム検定法において興味深いことである。
【0021】
「ナノ粒子」という用語は、本明細書において、アミン修飾ナノ粒子を指す。例えば炭素系ナノ粒子、例えばフラーレンおよびカーボンナノチューブ、金属前駆体より作られる金属ナノ粒子、非金属固体より作られるセラミックナノ粒子、ポリマーナノ粒子、および量子ドットとしての半導体ナノ粒子であり、それらの各々は、シラン架橋剤の手段によって反応面上にグラフトすることができるアミン官能基を含む。シラン官能基は自発的に反応してＳＵ－８チップの表面と共有結合を形成するが、第一級または第二級アミン、エポキシド、チオール、カルボキシル、アジド、ビニル、イソシアネートまたはメタクリルオキシ基からなるリストから選択される官能基はアミン修飾ナノ粒子中に存在するアミンと共有結合を形成する。それによって、ナノ粒子は、このようにして、各ＳＵ－８チップの第１の反応性平坦表面上に共有結合される。ナノ粒子の移植は、画像化、バーコーディング、表面反応度増加、触媒作用または核形成部位において興味深いことである。
【0022】
本発明の処理の利点は、ＳＵ－８チップの第１の平坦表面の官能化およびグラフト化がＳＵ－８チップの第２の平坦表面の官能化およびグラフト化を妨げないことである。直交化学は、本明細書では回避される。
【0023】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことができる。
【0024】
さらに、工程（ｃ）で得られたＳＵ－８チップは各ＳＵ－８チップの完全性を失うことなく、過剰な分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせを排除するために、すすぎ洗いすることができる。
【0025】
工程（ｃ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は、以下を形成することができる：
●第１のプリント平面配置
●または第１の平面アレイ
「第１のプリント平面配置」という用語は各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子を指し、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含む。
●第１のプリント平面配置
●または第１の平面アレイ
「第１のプリント平面配置」という用語は各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子を指し、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含む。
【0026】
「第１の平面アレイ」という用語は、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子、またはナノ粒子の組み合わせを含む、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子、またはナノ粒子を指す。
【0027】
本発明の処理の好ましい実施形態では、工程（ｃ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含み、それによって第１のプリント平面配置を形成する。
【0028】
本発明の処理の別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）で得られた各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子の組み合わせを含み、それによって第１の平面アレイを形成する。
【0029】
エポキシシラン架橋剤などの特定のシラン架橋剤によるＳＵ－８チップの１つの平坦表面の官能化は、例えばタンパク質、ＤＮＡプローブおよび量子ドットの組合せの、前記ＳＵ－８チップの単一の平坦表面へのグラフトをもたらすことができるので、本発明の方法にとって有利である。したがって、ＳＵ－８チップの他の平坦表面の同じ方法でのさらなる官能化は、先のものとは化学的に独立している。
【0030】
工程（ｂ）および（ｃ）のソフトリソグラフィーは、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面全体を一度に覆うことができる。本発明の好ましい実施形態では、工程（ｂ）および（ｃ）のソフトリソグラフィーがフォームラインパターンおよび／又はスポットで実行される。工程（ｂ）および（ｃ）のソフトリソグラフィーは、正確かつ再現可能なラインおよび／またはスポットパターンを可能にし、これはバーコーディング用とおよび多重化能力において興味深いことである。
【0031】
「バーコード」または「バー・コード」という用語は、視覚的な機械可読形式でデータを表す方法である。平行線の幅および間隔を変化させることによってデータを表すバーコードは、一般に線形または一次元（１Ｄ）と呼ばれ、バーコードリーダと呼ばれる特殊な光学スキャナによって走査することができる。長方形、ドット、六角形、および他の幾何学的パターンを使用する２次元（２Ｄ）変形はマトリクスコードまたは２Ｄバーコードと呼ばれるが、バーをそのように使用しない。２Ｄバーコードは、スマートフォンなどの内蔵カメラを有するモバイルデバイス上のアプリケーションソフトウェアを使用して、読み取りまたは分解することができる。
【0032】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られたグラフトされた規則的なＳＵ－８チップの配置の上にマウンティング媒質をキャスティングし、固化させることにより、工程（ｃ）で得られたグラフトされた規則的なＳＵ－８チップの配置をマウンティング媒質に埋め込み、固化膜を基材上に形成することを指す。
【0033】
「マウンティング媒質」という語は、本明細書では化学的に官能化されたチップを損傷することなく、室温で凝固し、水性媒質中に後で溶解することができる液相の非反応性ポリマー液を指す。マウンティング媒質の例として、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）がある。別の例として、１０％ポリビニルアルコール、５％グリセリンの２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝剤溶液ｐＨ ８．７がある。
【0034】
本発明の方法の工程（ｅ）は工程（ｄ）で得られた固化膜を基材から剥離し、それによって各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面をロック解除することを指す。
【0035】
本発明のステップ（ｆ）およびステップ（ｇ）は、ステップ（ｅ）で得られた各ＳＵ－８チップのロック解除された第２の平坦表面の官能化およびグラフトを、各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面に対して行われたのと同じ方法で指す。シラン架橋剤および好ましい分子、生体分子およびナノ粒子は、工程（ｂ）について前述したものと同じである。
【0036】
工程（ｆ）および工程（ｇ）はチップの上部平坦表面（各ＳＵ－８チップの第１の平坦表面）の化学性から独立しており、底部平坦表面（各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面）の化学的官能化は、上部平坦表面の前記官能化を損なわない。
【0037】
特に、本発明の方法の工程（ｆ）はソフトリソグラフィーの手段により、工程（ｅ）で得られた各ＳＵ－８チップのロック解除された第２の平坦表面を、シラン架橋剤を用いて官能化することを指し、それにより各ＳＵ－８チップに第２の反応性表面を形成することを指し、工程（ｇ）は、ソフトリソグラフィーの手段により工程（ｆ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の反応性表面上にグラフト分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組合せを形成することを指す。前述のように、分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、このようにして、各ＳＵ－８チップの第２の反応性平坦表面上に共有結合される。
【0038】
本発明の好ましい実施形態では、工程（ｆ）および（ｇ）は繰り返すことができる。
【0039】
工程（ｇ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は、以下を形成することができる：
●第２のプリント平面配置
●または第２の平面アレイ
「第２のプリント平面配置」という用語は各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子を指し、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含む。
●第２のプリント平面配置
●または第２の平面アレイ
「第２のプリント平面配置」という用語は各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子を指し、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含む。
【0040】
「第２の平面アレイ」という用語は、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子の組み合わせを含む、各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子を指す。
【0041】
本発明の処理の好ましい実施形態では、工程（ｇ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた１種類の分子、生体分子またはナノ粒子のみを含み、それによって第２のプリント平面配置を形成する。
【0042】
本発明の処理の別の好ましい実施形態では、工程（ｇ）で得られた各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子は各ＳＵ－８チップの第２の平坦表面上にグラフトされた分子、生体分子またはナノ粒子の組み合わせを含み、それによって第２の平面アレイを形成する。
【0043】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、ステップ（ｆ）および（ｇ）のソフトリソグラフィーがラインパターンおよび／またはスポットの形態で実行される。前述のように、ソフトリソグラフィー工程は正確かつ再現可能なラインおよび／またはスポーツパターンを可能にし、これはバーコーディング適用において興味深いことである。
【0044】
本発明の工程（ｈ）は工程（ｇ）で得られたＳＵ－８チップの固化膜を水性媒質に溶解し、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを得ることを指す。
【0045】
「水性媒質」という語は、本明細書では水をベースとする任意の溶液を指す。例えば、脱イオン水、生理学的媒質または細胞培養媒質である。
【0046】
用語「ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ」は本明細書では第１の平坦表面（上部）および第２の平坦表面（底部）を有するダブルフラットＳＵ－８チップを指し、分子、生体分子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの第１および第２の平坦表面上にグラフトされる。
【0047】
「懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ」という語は、本明細書では水性媒質中のダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの懸濁液を指す。前述のように、「水性媒質」という語は、本明細書では水をベースとする任意の水溶液を指す。例えば、脱イオン水、生理学的媒質または細胞培養媒質である。
【0048】
本発明方法の工程（ｄ）では基材上に配置された固化膜が得られ、前記固化膜は工程（ｅ）で基材から剥離され、工程（ｈ）で水性媒質に溶解される。このようにして、それぞれのＳＵ－８チップの第２の平坦表面のグラフト化中に、化学損傷の危険性が防止される。
【0049】
さらに、工程（ｈ）で得られた懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップは、工程（ｉ）における遠心分離を介して再回収される。この遊離工程はＳＵ－８チップの物理的完全性を保護し、デブリの生成を防止する。
【0050】
本発明の第２の態様は、好ましくは上述の発明のプロセスによって得られ、それらが以下を含むことを特徴とする、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ（本明細書中の本発明のチップ）に関する：
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ。
ここで前記分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの前記第１の平坦表面および前記第２の平坦表面の上にグラフトされている。
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ。
ここで前記分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの前記第１の平坦表面および前記第２の平坦表面の上にグラフトされている。
【0051】
本発明のチップの好ましい実施形態では、分子がＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾発色団、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含む修飾蛍光色団からなるリストから選択される。
【0052】
本発明のチップの別の好ましい実施において、生体分子は、炭水化物、タンパク質、抗体、酵素および核酸からなるリストから選択される。
【0053】
本発明のチップの別の好ましい実施形態では、ナノ粒子がアミン官能基を含む炭素系ナノ粒子、アミン官能基を含む金属ナノ粒子、アミン官能基を含むセラミックナノ粒子、アミン官能基を含むポリマーナノ粒子、およびアミン官能基を含む半導体ナノ粒子から選択される。
【0054】
本発明の第３の態様は、少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットヤヌスチップの混合物を含むことを特徴とする、懸濁アレイ（本明細書中の本発明の懸濁アレイ）に関し、ここで、それぞれの懸濁ダブルフラットヤヌスチップ（本発明のチップ）は、（前述のように）以下を含む：
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ。
ここで前記分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの前記第１の平坦表面および前記第２の平坦表面の上にグラフトされている。
●各ＳＵ－８チップが第１の平坦表面および第２の平坦表面を有する、複数のダブルフラットＳＵ－８チップ、
●分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせ。
ここで前記分子、生体分子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせは、各ＳＵ－８チップの前記第１の平坦表面および前記第２の平坦表面の上にグラフトされている。
【0055】
本発明の第４の態様は、例えば、最初の容器から懸濁したチップの集団を再収集し、それらを同じ容器に添加することによって、少なくとも２つの異なる懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップを混合する工程を含むことを特徴とする、懸濁アレイを得るための方法に関する。
【0056】
本発明の第５の態様は、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ（本発明のチップ）または上述の懸濁アレイ（本発明のアレイ）を含むことを特徴とするバーコーディングチップである。
【0057】
バーコーディングチップの好ましい実施形態では、当該バーコーディングチップはカラーバーコーディングチップであり、少なくともナノ粒子がラインパターンおよび／またはスポットの形態で各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされ、当該ナノ粒子は量子ドットである。
【0058】
「カラーバーコーディングチップ」という用語は、本明細書ではコードを定義する一意の、またはいくつかの色のラインまたはスポットを有するチップを指す。
【0059】
アミン修飾量子ドットを使用することの主な利点は、その長い発光安定性および光退色を低減することである。
【0060】
本発明の第６の態様は、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップ（本発明のチップ）または上述の懸濁アレイ（本発明の懸濁アレイ）を含むことを特徴とする感知デバイスに関する。
【0061】
感知デバイスの好ましい実施形態では、当該感知デバイスが、少なくとも分子が各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされているｐＨ感知デバイスであり、当該分子はＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルエステル基を含むｐＨ感知蛍光色団である。
【0062】
「ｐＨ感知蛍光色団」という用語は、本明細書ではその蛍光発光強度が即時の周囲ｐＨによって決定される、任意の応答性蛍光色団分子を指す。
【0063】
感知デバイスの好ましい実施形態では、前記感知デバイスが少なくともＤＮＡプローブが各ＳＵ－８チップの第１または第２の平坦表面にグラフトされたＤＮＡ感知デバイスであり、前記生体分子はＤＮＡプローブである。
【0064】
「ＤＮＡプローブ」という用語は、本明細書ではハイブリダイゼーションによって相補的核酸配列の存在を検出するために使用される短い一本鎖ＤＮＡストレッチを指す。
【0065】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施において使用することができる。本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」という用語およびその変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、または工程を排除することを意図するものではない。本発明のさらなる物体、利点、および特徴は、説明を検討することによって当業者に明らかになるか、または本発明を実施することによって知ることができる。以下の実施例および図面は、例示のために提供され、本発明を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】グラフトされた蛍光色団、ＤＮＡプローブ、タンパク質および量子ドットを有する、懸濁ダブルフラットＳＵ－８ヤヌスチップの調製の模式図。
【図2】カスタマイズされた物理的異方性によって識別される基材上のＳＵ－８チップの走査型電子顕微鏡像：（ａ）基準マーカー、（ｂ）アスペクト比 幅：長さ１：２、１：３、および１：４、（ｃ）分岐、および（ｄ）ファセット。
【図3】グラフトされた蛍光色団、ＤＮＡプローブ、タンパク質および量子ドットを有する、懸濁二重高さダブルフラットＳＵ－８チップの側面図の模式図。
【図4】初期基準チップと二次分岐チップからなる二重高さＳＵ－８チップの走査電子顕微鏡像。
【図5】水中に再懸濁した遊離チップの光学顕微鏡画像。
【図6】赤色発光蛍光色団でグラフトされた基準ＳＵ－８チップの配置の蛍光顕微鏡画像であり、ａ）スポット、またはｂ）チップの平坦表面上の線を画定し、可視化目的のために緑色発光蛍光体で埋め戻されている。ｃ）パターニングして赤色発光蛍光色団をグラフトした、チップの配置の上部平坦表面全体。ｄ）赤色発光蛍光色団でグラフトされたチップの配置の上部平坦表面および側面。
【図7】ａ）基材上の分岐ＳＵ－８チップの配置の蛍光顕微鏡画像であって、赤色発光蛍光色団でグラフトされている、蛍光顕微鏡画像。ｂ）グラフトされたチップの配置は、水中に遊離され再懸濁される。
【図8】ａ）最初のエポキシ樹脂反応性表面を有し、テキサス赤色標識オリゴでグラフトされた遊離分岐ＳＵ－８チップの蛍光顕微鏡画像、ｂ）最初のエポキシ樹脂反応性表面を有し、ＧＦＰでグラフトされた、遊離アスペクト比ＳＵ－８チップの蛍光顕微鏡画像。
【図9】ａ）ＱＤ５４５でグラフトされたアスペクト比ＳＵ－８チップの配置の蛍光顕微鏡画像。ｂ）ＱＤ５４５でグラフトされた遊離アスペクト比ＳＵ－８チップの集団の蛍光顕微鏡画像。ｃ）ＱＤ５２５でグラフトされた基準ＳＵ－８チップの配置の蛍光顕微鏡画像。ｄ）ＱＤ５２５でグラフトされた遊離基準ＳＵ－８チップの集団の蛍光顕微鏡画像。
【図10】ａ）上部平坦表面上に赤色発光蛍光色団で、および底部平坦表面上に緑色発光蛍光色団でグラフトされた遊離基準チップの赤色蛍光顕微鏡チャネル画像。ｂ）緑色蛍光チャネルで観察された、同じ懸濁チップ。ｃ）前記画像の複合画像。ｄ）上部平坦表面上に赤色発光ＱＤ６５５で、および底部平坦表面上に緑色発光蛍光色団でグラフトされた、遊離ファセットチップの赤色蛍光顕微鏡チャネル画像。
【図11】ａ）遊離懸濁二重高さＳＵ－８チップの光学顕微鏡画像。ｂ）分岐側にＱＤ６５５を、基準側にＱＤ５４５をグラフトした、同じ二重高さＳＵ－８チップの蛍光顕微鏡画像。
【図12】異なるｐＨ：ａ）ｐＨ４、ｂ）ｐＨ７、およびｃ）ｐＨ９で、ｐＨ感受性赤色蛍光色団でグラフトされた、懸濁分岐ＳＵ－８チップの蛍光顕微鏡画像。
【図13】ａ）上部平坦表面上にＱＤ６５５で、および底部平坦表面上にプローブにハイブリダイズした緑色発光オリゴでグラフトされた遊離基準チップの、赤色蛍光顕微鏡チャネル画像。ｂ）緑色蛍光チャネルで観察された同じ懸濁チップ。ｃ）前記画像の複合画像。
【図14】上面に明瞭な赤色および緑色発光蛍光色団のスポットがあり、底面にＱＤ５４５がグラフトされている、懸濁アスペクト比ＳＵ－８チップの赤色および緑色蛍光チャネルの複合画像。
【発明を実施するための形態】
【0067】
〔実施例〕
図１は、蛍光体、ＤＮＡプローブおよびタンパク質分子、ならびに量子ドットとしてのナノ粒子がグラフトされた、懸濁ダブルフラットヤヌスチップの調製の概略図を示す。
図１は、蛍光体、ＤＮＡプローブおよびタンパク質分子、ならびに量子ドットとしてのナノ粒子がグラフトされた、懸濁ダブルフラットヤヌスチップの調製の概略図を示す。
【0068】
ａ）ＳＵ－８チップ（２）は、ＳＵ－８リソグラフィーによって基材（１）上に直接的に作製された規則的なチップの配置の一部である。チップの上部平坦表面（３）はマイクロコンタクトプリントによって官能化され、選択された架橋剤（４）を有する反応性表面を得る。
【0069】
ｂ）選択された架橋剤を有する反応性表面を有する規則的なチップの配置は、マイクロコンタクトプリントなどのソフトリソグラフィーでパターニングして、チップを完全に被覆するか、またはポリマーペンリソグラフィーでパターニングして、同じ分子もしくはナノ粒子の平面アレイをグラフトする（５）。あるいは、異なる分子およびナノ粒子を、連続するポリマーペンリソグラフィープロセスを用いて独立してパターニングして、選択された分子またはナノ粒子を有する平面アレイをチップの別個の領域にグラフトすることができる（５．１、５．２、５．３）。
【0070】
ｃ）マウンティング媒質（６）は、同じ分子およびナノ粒子の完全な被覆、または同じ分子およびナノ粒子の平面アレイ、または異なる分子およびナノ粒子の平面アレイのいずれかとともに、選択された架橋剤を有する反応性表面を有する規則的なＳＵ－８チップの配置上にキャスティングされ、放置して固化され、そのマトリックス中にチップを埋め込む。
【0071】
ｄ）固化したマウンティング媒質は基材から剥離され、そのマトリックスに従ってチップを運び、チップ（７）の底面を露出させる。基材（１）は廃棄することができる。
【0072】
ｅ）チップの露出された底部平坦表面（７）は続いて、マイクロコンタクトプリントなどのソフトリソグラフィーでパターニングされ、選択された架橋剤（８）を有する反応性表面を得る。
【0073】
ｆ）ＳＵ－８チップの底部平坦表面（７）由来の、選択された架橋剤（８）を有する反応性表面は、グラフト分子またはナノ粒子（９）へのマイクロコンタクトプリントなどのソフトリソグラフィーでパターニングすることができる。
【0074】
ｇ）固化したマウンティング媒質（６）は水性媒質に溶解し、ヤヌスチップとしてダブルフラットチップを得る。
【0075】
種々のサイズ（３～１２μｍ）、厚さ（０．５～１．２μｍ）、およびトポグラフィーのポリマーチップを、ファセット、基準、アスペクト比、および分岐の寸法と組み合わせて作製した。次に、チップの上部および底部平坦表面を選択的に官能化し、蛍光プローブ、生体分子（タンパク質およびＤＮＡ鎖）、および量子ドット（ＱＤ）としてのナノ粒子の分子の０Ｄ、１Ｄ、２Ｄ、および３Ｄパターンを高スペクトル分解能で生成した。重要なことに、官能化は多重化学ストラテジーの使用を可能にし、直交化学を考慮する必要なしに、異なるまたは干渉する固定化化学を有するプローブをパターニングした。最後に、環境におけるｐＨ変化とＤＮＡの選択的認識を検知する、懸濁ダブルフラットヤヌスチップの感知能力および検知能力を実証した。
［材料および方法］
全てのプリントスタンプは、マイクロコンタクトプリントまたはポリマーペンリソグラフィーのために、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ ＰＤＭＳエラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて作製し、および全てのチップは、ＳＵ－８ ２０００．５樹脂（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を用いて作製した。ＨＩＰＲ ６５１２ポジ型フォトレジスト（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＵＳＡ）およびＳｉｏｅｔｃｈ（登録商標）リムーバー（Ｓｅｌｅｃｔｉｐｕｒ）を微細加工中に使用した。３－グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（エポキシ－シラン）および（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）シラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＳＵ－８とその後の表面修飾との間の架橋剤として独立して使用した。１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ－ペルフルオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）は、Ｆｌｕｋａから入手した。他の試薬として、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）水溶液マウンティング媒質、ハイブリダイゼーション液、生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝剤２０ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エタノール（Ｐａｎｒｅａｃ）がある。全ての蛍光プローブは、Ｑｄｏｔ（商標）ＩＴＫ（商標）アミノ（ＰＥＧ）量子ドット（ＱＤ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ蛍光色団またはｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、スクシンイミジルエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかであった。修飾オリゴヌクレオチド鎖は、アンカー部分および／または蛍光プローブ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ）を有していた。
●ＰＰＬスタンプモールドの作製：
厚さ５２５μｍのＰ型＜１００＞シリコンウエハを１１００℃で湿式酸化し、厚さ１μｍのＳｉＯ２層を得た。次いで、厚さ１．２μｍのＨＩＰＲ ６５１２フォトレジスト層を、酸化されたウエハ上にスピンし、ＭＡ５６マスクアライナー（Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ、ドイツ）を用いてフォトマスクを通してＵＶ光に露光した。２００℃で３０分間レジストを現像し、ハード焼成した後、Ｃ２Ｆ６／ＣＨＦ３を用いてＤｒｙｔｅｋ Ｑｕａｄ４８４ ＲＩＥ（Ｄｒｙｔｅｋ、米国）でＳｉＯ２膜をドライエッチングした。７５℃で４分間の４０％ＫＯＨ異方性エッチングは露出したＳｉを攻撃し、逆ピラミッドを作り出した。残ったＳｉＯ２をＳｉｏｅｔｃｈ（登録商標）で除去した。最後に、モールドを１００Ｗで３０秒間プラズマ活性化し、飽和ＰＦＯＴＣＳ雰囲気に１時間曝露した。７５℃で１時間焼成した後、モールドをエタノールですすぎ、Ｎ２流下で乾燥させた。
●ＰＤＭＳスタンプの作製：
１０：１ｗ／ｗのプレポリマー－触媒混合物を十分に撹拌し、脱気し、フラットスタンプのための純粋なシリコンウエハ上、または所望の特徴を有する選択されたシリコンモールド上に注いだ。ＰＤＭＳスタンプの収縮を防止するために、プラズマ活性化スライドガラスを未硬化ＰＤＭＳ上に置き、７５℃で１時間架橋させ、最終厚さを約１００μｍにした。
●ＳＵ－８チップの作製：
標準的なＳＵ－８フォトリソグラフィーを使用して、ＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定した。純粋な４インチシリコンウエハをＳＵ－８ ２０００．５でスピンコーティングして、均一な５００ｎｍ厚の層を得、続いてこれを焼成し、フォトマスクを介して４４５ｍＪｃｍ－２の線量でＵＶ光に曝露した。未架橋樹脂を現像する前に、最終焼成工程を行った。ウエハは１×１ｃｍ２の部分に分割した。
●選択された架橋剤を有する反応性表面：
フラットＰＤＭＳスタンプを、２％ｖ／ｖエポキシ－シランまたは２％ｖ／ｖＡＰＴＥＳエタノール溶液中で１５分間インキュベートし、続いてＮ２で乾燥させた。基材上のＳＵ－８チップの配置は、３０秒間に５００Ｗの酸素プラズマ下で活性化され、１０秒間にインキュベートされたスタンプと直ちに接触プリントされた。反応面を有するＳＵ－８チップの配置は、続いて、窒素雰囲気中にて２０分間１００℃で硬化され、室温まで急速に下げてＳＵ－８基材境界で熱衝撃を誘起し、その後のチップの遊離を補助した。同じプロトコルに従い、チップの底面を官能化し、これはＳＵ－８チップの第１（上部）面の改質および凝固したマウンティング媒質の剥離を完了した後に行われた。
●蛍光色団のマイクロコンタクトプリントおよびＰＰＬ：
アミン反応性ＮＨＳエステル蛍光色団を、最初にＤＭＳＯ中で希釈し、その後、４：３ｖ／ｖアセトニトリル：３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液中で１００μｇ ｍＬ－１の終濃度に希釈した。ＰＤＭＳスタンプをプラズマ活性化し、続いて溶液と共にインキュベートした。２分間インキュベートした後、スタンプをＮ２でブロー乾燥し、ＳＵ－８チップのＡＰＴＥＳ修飾配置と１０秒間接触させた。リフトオフ後、インクを暗湿チャンバー中で１時間反応させ、脱イオン（ＤＩ）水で３０秒間徹底的にすすいだ。
●ＱＤのマイクロコンタクトプリント：
種々の放射のＱＤを、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液で、０．８μＭの終濃度に希釈した。インクスタンプは１０秒の間にＳＵ－８チップのエポキシ変性ＳＵ－８配置に接触し、ＱＤを活性化表面に転写した。ＳＵ－８チップの配置を１時間反応させた。その後、未反応のエポキシ部分を、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤中の２％ｖ／ｖＥＤＡ溶液で１時間ブロックし、最後に脱イオン水で３０秒間完全にすすいだ。
●ＤＮＡ鎖のマイクロコンタクトプリント：
以下の修飾オリゴヌクレオチド鎖を、１００μＭの初濃度までＤＤＩ水中に懸濁し、続いてＮａ２ＨＰＯ４溶液中で１０μＭの終濃度まで懸濁した：
ＴＳ３１４：５’－［アミノリンクＣ６］－ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＣＴＡ Ｃ－３’（配列番号１）
ＲＰ－ＴＳ３１４：５’－［ＤＹ－４８５－ＸＬ］－ＧＴＡ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＡ Ｇ－３’（配列番号２）
ＴＳ３１５：５’－［アミノリンクＣ６］－ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＣＴＡ ＴＣＴ ＣＧ－［ＴｘＲｄ］（配列番号３）
ＲＰ－ＴＳ３１５：５’－［ＤＹ－４９０］－ＣＧＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＧ－３’（配列番号４）
続いて、ＰＤＭＳスタンプをオリゴ溶液と共に１５分間インキュベートし、蒸留脱イオン（ＤＤＩ）水ですすぎ、ＳＵ－８チップのエポキシ変性配置上に１０秒間プリントした。ＳＵ－８チップの配置を、暗湿雰囲気中で１時間反応させた後、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤中の２％ｖ／ｖＥＤＡ溶液で１時間ブロッキングした。ハイブリダイズするために、相補鎖をハイブリダイゼーション緩衝剤中１０μＭの終濃度に懸濁し、２時間３６℃で反応させた。その後、チップをＳＳＣ中で５分間２回すすぎ、次いでＳＳＣ中で１回５分間すすぎ、続いてＳＳＣ中で５分間０．１回すすぎ、最後にＤＤＩ水中ですすいだ。それぞれのすすぎ工程の間に、チップを遠心分離によって濃縮し、上清を回収し、除去した。
●プリントチップの遊離：
基材上のＳＵ－８チップの配置の上に水溶液マウンティング媒質の液滴を置き、室温で凝固させた。後に、手動の横方向の力を用いて、固化した媒質を基材から分離した。埋め込まれたチップを有する固化したマウンティング媒質を脱イオン水に溶解し、懸濁したチップを遠心分離によって回収した。
［材料および方法］
全てのプリントスタンプは、マイクロコンタクトプリントまたはポリマーペンリソグラフィーのために、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ ＰＤＭＳエラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて作製し、および全てのチップは、ＳＵ－８ ２０００．５樹脂（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を用いて作製した。ＨＩＰＲ ６５１２ポジ型フォトレジスト（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＵＳＡ）およびＳｉｏｅｔｃｈ（登録商標）リムーバー（Ｓｅｌｅｃｔｉｐｕｒ）を微細加工中に使用した。３－グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（エポキシ－シラン）および（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）シラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＳＵ－８とその後の表面修飾との間の架橋剤として独立して使用した。１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ－ペルフルオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）は、Ｆｌｕｋａから入手した。他の試薬として、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）水溶液マウンティング媒質、ハイブリダイゼーション液、生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝剤２０ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エタノール（Ｐａｎｒｅａｃ）がある。全ての蛍光プローブは、Ｑｄｏｔ（商標）ＩＴＫ（商標）アミノ（ＰＥＧ）量子ドット（ＱＤ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ蛍光色団またはｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、スクシンイミジルエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかであった。修飾オリゴヌクレオチド鎖は、アンカー部分および／または蛍光プローブ（ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ）を有していた。
●ＰＰＬスタンプモールドの作製：
厚さ５２５μｍのＰ型＜１００＞シリコンウエハを１１００℃で湿式酸化し、厚さ１μｍのＳｉＯ２層を得た。次いで、厚さ１．２μｍのＨＩＰＲ ６５１２フォトレジスト層を、酸化されたウエハ上にスピンし、ＭＡ５６マスクアライナー（Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ、ドイツ）を用いてフォトマスクを通してＵＶ光に露光した。２００℃で３０分間レジストを現像し、ハード焼成した後、Ｃ２Ｆ６／ＣＨＦ３を用いてＤｒｙｔｅｋ Ｑｕａｄ４８４ ＲＩＥ（Ｄｒｙｔｅｋ、米国）でＳｉＯ２膜をドライエッチングした。７５℃で４分間の４０％ＫＯＨ異方性エッチングは露出したＳｉを攻撃し、逆ピラミッドを作り出した。残ったＳｉＯ２をＳｉｏｅｔｃｈ（登録商標）で除去した。最後に、モールドを１００Ｗで３０秒間プラズマ活性化し、飽和ＰＦＯＴＣＳ雰囲気に１時間曝露した。７５℃で１時間焼成した後、モールドをエタノールですすぎ、Ｎ２流下で乾燥させた。
●ＰＤＭＳスタンプの作製：
１０：１ｗ／ｗのプレポリマー－触媒混合物を十分に撹拌し、脱気し、フラットスタンプのための純粋なシリコンウエハ上、または所望の特徴を有する選択されたシリコンモールド上に注いだ。ＰＤＭＳスタンプの収縮を防止するために、プラズマ活性化スライドガラスを未硬化ＰＤＭＳ上に置き、７５℃で１時間架橋させ、最終厚さを約１００μｍにした。
●ＳＵ－８チップの作製：
標準的なＳＵ－８フォトリソグラフィーを使用して、ＳＵ－８チップの形状およびサイズを規定した。純粋な４インチシリコンウエハをＳＵ－８ ２０００．５でスピンコーティングして、均一な５００ｎｍ厚の層を得、続いてこれを焼成し、フォトマスクを介して４４５ｍＪｃｍ－２の線量でＵＶ光に曝露した。未架橋樹脂を現像する前に、最終焼成工程を行った。ウエハは１×１ｃｍ２の部分に分割した。
●選択された架橋剤を有する反応性表面：
フラットＰＤＭＳスタンプを、２％ｖ／ｖエポキシ－シランまたは２％ｖ／ｖＡＰＴＥＳエタノール溶液中で１５分間インキュベートし、続いてＮ２で乾燥させた。基材上のＳＵ－８チップの配置は、３０秒間に５００Ｗの酸素プラズマ下で活性化され、１０秒間にインキュベートされたスタンプと直ちに接触プリントされた。反応面を有するＳＵ－８チップの配置は、続いて、窒素雰囲気中にて２０分間１００℃で硬化され、室温まで急速に下げてＳＵ－８基材境界で熱衝撃を誘起し、その後のチップの遊離を補助した。同じプロトコルに従い、チップの底面を官能化し、これはＳＵ－８チップの第１（上部）面の改質および凝固したマウンティング媒質の剥離を完了した後に行われた。
●蛍光色団のマイクロコンタクトプリントおよびＰＰＬ：
アミン反応性ＮＨＳエステル蛍光色団を、最初にＤＭＳＯ中で希釈し、その後、４：３ｖ／ｖアセトニトリル：３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液中で１００μｇ ｍＬ－１の終濃度に希釈した。ＰＤＭＳスタンプをプラズマ活性化し、続いて溶液と共にインキュベートした。２分間インキュベートした後、スタンプをＮ２でブロー乾燥し、ＳＵ－８チップのＡＰＴＥＳ修飾配置と１０秒間接触させた。リフトオフ後、インクを暗湿チャンバー中で１時間反応させ、脱イオン（ＤＩ）水で３０秒間徹底的にすすいだ。
●ＱＤのマイクロコンタクトプリント：
種々の放射のＱＤを、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液で、０．８μＭの終濃度に希釈した。インクスタンプは１０秒の間にＳＵ－８チップのエポキシ変性ＳＵ－８配置に接触し、ＱＤを活性化表面に転写した。ＳＵ－８チップの配置を１時間反応させた。その後、未反応のエポキシ部分を、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤中の２％ｖ／ｖＥＤＡ溶液で１時間ブロックし、最後に脱イオン水で３０秒間完全にすすいだ。
●ＤＮＡ鎖のマイクロコンタクトプリント：
以下の修飾オリゴヌクレオチド鎖を、１００μＭの初濃度までＤＤＩ水中に懸濁し、続いてＮａ２ＨＰＯ４溶液中で１０μＭの終濃度まで懸濁した：
ＴＳ３１４：５’－［アミノリンクＣ６］－ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＣＴＡ Ｃ－３’（配列番号１）
ＲＰ－ＴＳ３１４：５’－［ＤＹ－４８５－ＸＬ］－ＧＴＡ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＡ Ｇ－３’（配列番号２）
ＴＳ３１５：５’－［アミノリンクＣ６］－ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＣＴＡ ＴＣＴ ＣＧ－［ＴｘＲｄ］（配列番号３）
ＲＰ－ＴＳ３１５：５’－［ＤＹ－４９０］－ＣＧＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＧ－３’（配列番号４）
続いて、ＰＤＭＳスタンプをオリゴ溶液と共に１５分間インキュベートし、蒸留脱イオン（ＤＤＩ）水ですすぎ、ＳＵ－８チップのエポキシ変性配置上に１０秒間プリントした。ＳＵ－８チップの配置を、暗湿雰囲気中で１時間反応させた後、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤中の２％ｖ／ｖＥＤＡ溶液で１時間ブロッキングした。ハイブリダイズするために、相補鎖をハイブリダイゼーション緩衝剤中１０μＭの終濃度に懸濁し、２時間３６℃で反応させた。その後、チップをＳＳＣ中で５分間２回すすぎ、次いでＳＳＣ中で１回５分間すすぎ、続いてＳＳＣ中で５分間０．１回すすぎ、最後にＤＤＩ水中ですすいだ。それぞれのすすぎ工程の間に、チップを遠心分離によって濃縮し、上清を回収し、除去した。
●プリントチップの遊離：
基材上のＳＵ－８チップの配置の上に水溶液マウンティング媒質の液滴を置き、室温で凝固させた。後に、手動の横方向の力を用いて、固化した媒質を基材から分離した。埋め込まれたチップを有する固化したマウンティング媒質を脱イオン水に溶解し、懸濁したチップを遠心分離によって回収した。
【0076】
＜実施例１ ＳＵ－８チップの形状とサイズを規定する工程（ａ）後のＳＵ－８チップの特徴づけ＞
まず、所望のＳＵ－８チップを得るために必要な物性を確立した。物理的定義はトポグラフィーなどの形態学的寸法と共に、各ＳＵ－８チップのサイズおよび形状を指定する。次に、フォトマスク上に物理的記述子を定義した。標準的なフォトリソグラフィーを後に使用して、規定の厚さ（０．５～１．２μｍ）を有するＳＵ－８上にデザインを転写した。ＳＵ－８の開発後、基材上の規則的なＳＵ－８チップ配置を得た。図１ａでは、規則的なＳＵ－８チップ配置由来の単一チップ（２）が基材（１）上に示され、その露出された上部平坦表面（３）を有する。
まず、所望のＳＵ－８チップを得るために必要な物性を確立した。物理的定義はトポグラフィーなどの形態学的寸法と共に、各ＳＵ－８チップのサイズおよび形状を指定する。次に、フォトマスク上に物理的記述子を定義した。標準的なフォトリソグラフィーを後に使用して、規定の厚さ（０．５～１．２μｍ）を有するＳＵ－８上にデザインを転写した。ＳＵ－８の開発後、基材上の規則的なＳＵ－８チップ配置を得た。図１ａでは、規則的なＳＵ－８チップ配置由来の単一チップ（２）が基材（１）上に示され、その露出された上部平坦表面（３）を有する。
【0077】
図２は、ＳＵ－８チップを走査型電子顕微鏡を用いて基材上に配置した形状とサイズを示している。ＳＵ－８チップのそれぞれの配置は、ａ）基準マーク、ｂ）アスペクト比、ｃ）分岐、ｄ）ファセット、という特有の物理的特性を含んでいる。
【0078】
このアプローチは、球状ポリマー微粒子によって支配されるフィールドにおいて、カスタマイズ可能な形状およびサイズを有するＳＵ－８チップの作製を可能にし、カスタマイズすることができる唯一のパラメータは球の半径である。フォトリソグラフィー工程は、１μｍ程度の小さい特徴を有するデザインを転写することを可能にする。
【0079】
＜実施例２ 二重高さＳＵ－８チップの特徴づけ：ＳＵ－８チップの形状とサイズを定義する工程（ａ）の後＞
二重高さＳＵ－８チップは２つの連続するフォトリソグラフィー工程、すなわち、図３に表されるように、最初のＳＵ－８チップを基材上に直接的に画定するための第１の工程と、最初のＳＵ－８チップ上に第２のチップを作り出すための第２のフォトリソグラフィー工程とに続いて作製される。得られた二重高さチップは、図４で見ることができる。
二重高さＳＵ－８チップは２つの連続するフォトリソグラフィー工程、すなわち、図３に表されるように、最初のＳＵ－８チップを基材上に直接的に画定するための第１の工程と、最初のＳＵ－８チップ上に第２のチップを作り出すための第２のフォトリソグラフィー工程とに続いて作製される。得られた二重高さチップは、図４で見ることができる。
【0080】
最初に、規則的なＳＵ－８チップの配置が、ＳＵ－８フォトリソグラフィーを介して製造され、基材上に残される。第２のＳＵ－８フォトリソグラフィー処理は、第２の高さ（１０）に特徴を有するＳＵ－８チップを得る、秩序化されたＳＵ－８チップの初期配置にわたって実行される。分子およびナノ粒子は図１ａ－ｂに記載されるように、二重高さＳＵ－８チップの上部平坦表面（３）上にグラフトされる。二重高さのＳＵ－８チップは図１ｃ－ｄに記載されるように、キャスティング媒質（６）を用いて遊離される。分子およびナノ粒子は、二重高さＳＵ－８チップの底部平坦表面（７）上にグラフトされる。
【0081】
この作製方法は、２つの反対にある上部および底部平坦表面を有するＳＵ－８チップの取得と、その後の化学的官能化を確実にする。また、二重高さチップは、２つの異なるチップの物理的特性を単一のデバイスに組み込むことができる。
＜実施例３ 遊離ＳＵ－８チップの特徴づけ＞
遊離工程は、懸濁グラフト化ＳＵ－８チップを得るために重要である一方、表面官能化の保護を提供しなければならない。いくつかの遊離方法は、過酷な化学的方法を用いて基材とチップとの間の犠牲となる層を除去することを必要とし、敏感な表面官能化を損なう。逆に、浸漬超音波は作製基材からチップを解放するのを助けた一方、この方法はチップを粉砕し、また、表面改質の安定性および機能性を妨げる可能性がある。あるいは、基材からＳＵ－８チップを削り取るために剪断力も使用される一方、これはチップを不均一に破壊し、デブリを発生させることがある。
＜実施例３ 遊離ＳＵ－８チップの特徴づけ＞
遊離工程は、懸濁グラフト化ＳＵ－８チップを得るために重要である一方、表面官能化の保護を提供しなければならない。いくつかの遊離方法は、過酷な化学的方法を用いて基材とチップとの間の犠牲となる層を除去することを必要とし、敏感な表面官能化を損なう。逆に、浸漬超音波は作製基材からチップを解放するのを助けた一方、この方法はチップを粉砕し、また、表面改質の安定性および機能性を妨げる可能性がある。あるいは、基材からＳＵ－８チップを削り取るために剪断力も使用される一方、これはチップを不均一に破壊し、デブリを発生させることがある。
【0082】
したがって、実施例１の工程に続く本発明の工程に従って得られた、グラフトされたＳＵ－８チップを遊離させるために、グラフトされたチップの上にマウンティング媒質をキャスティングし（図１ｃの（６））、次いで、室温（ｔ＝２１℃、ＲＨ５０％）で凝固させたままにし、グラフトされたＳＵ－８チップを凝固マトリックスに埋め込む。得られた固化膜は後に、グラフトされたＳＵ－８チップを運ぶ基材から剥離される。ＳＵ－８チップを有するこの膜は水性媒質中に溶解されて、チップの配置を解放し、懸濁チップを得ることができ、化学損傷の危険性を防止する。懸濁ＳＵ－８チップの集団は、図５の光学顕微鏡像で観察することができる。
【0083】
チップは、さらなる特徴づけまたは使用のために遠心分離を介して再収集することができる。この遊離方法はＳＵ－８チップの物理的完全性を保護し、デブリの生成を防止する。
＜実施例４ チップの上部平坦表面上に画定されたパターンを作る、蛍光色団を有するグラフトされたＳＵ－８チップの特徴づけ＞
次いで、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して、図１ａの基材番号（４）に固定された各ＳＵ－８チップの上面に反応性表面を生成した。ソフトリソグラフィーと湿潤ケミストリープロトコルを開発し、ＳＵ－８チップの反応面を選択インクでパターニングした。マイクロコンタクトプリント（μＣＰ）を使用して、チップ全体をパターニングするか、または図１ｂの（５）に示すように、同じ分子またはナノ粒子を有する固定チップの上部にラインパターンを作り出した。ポリマーペンリソグラフィー（ＰＰＬ）は、異なる発光を有する複数の分子またはナノ粒子と結合された、選択された位置におけるマイクロメトリック分解可能な特徴（スポット）をグラフトし、図１ｂに表されるグラフトされた特徴（５．１、５．２、および５．３）を得る。各ＳＵ－８チップインク上のそれらの位置によって識別可能な複数のスポットを有することは、同じ色で発光するスポットを有する多重化チップを作り出すためのベースを提供し、スペクトル分解色素の数によって制限される色ベースの多重化チップの制限を排除する。
＜実施例４ チップの上部平坦表面上に画定されたパターンを作る、蛍光色団を有するグラフトされたＳＵ－８チップの特徴づけ＞
次いで、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して、図１ａの基材番号（４）に固定された各ＳＵ－８チップの上面に反応性表面を生成した。ソフトリソグラフィーと湿潤ケミストリープロトコルを開発し、ＳＵ－８チップの反応面を選択インクでパターニングした。マイクロコンタクトプリント（μＣＰ）を使用して、チップ全体をパターニングするか、または図１ｂの（５）に示すように、同じ分子またはナノ粒子を有する固定チップの上部にラインパターンを作り出した。ポリマーペンリソグラフィー（ＰＰＬ）は、異なる発光を有する複数の分子またはナノ粒子と結合された、選択された位置におけるマイクロメトリック分解可能な特徴（スポット）をグラフトし、図１ｂに表されるグラフトされた特徴（５．１、５．２、および５．３）を得る。各ＳＵ－８チップインク上のそれらの位置によって識別可能な複数のスポットを有することは、同じ色で発光するスポットを有する多重化チップを作り出すためのベースを提供し、スペクトル分解色素の数によって制限される色ベースの多重化チップの制限を排除する。
【0084】
アミン含有シラン（ＡＰＴＥＳ、［材料および方法］を参照）を、実施例１で製造されたＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面上に固定して、選択された架橋剤との反応性表面を作り出す。赤色および緑色発光を有する２つのＮＨＳ－エステル誘導体化蛍光色団を、ソフトリソグラフィーまたは湿式化学を介して反応性表面上にグラフトした。図６ａでは、赤色発光蛍光色団を、ポリマーペンリソグラフィーを介してグラフトして、固定化チップの配置上にスポットを形成した。あるいは、図６ｂに示すように、マイクロコンタクトプリントを用いて、チップの配置の上面に蛍光色団ラインをグラフトすることができる。蛍光顕微鏡法を用いてより良好に可視化するために、チップの配置、ならびにグラフトされたスポットおよびライン、緑色発光蛍光色団を埋め戻して、チップの配置の上面の残りを覆った。マイクロコンタクトプリンティングは、チップの配置の上部平坦表面全体にわたって蛍光色団をグラフトするために使用され、これは図６ｃで観察することができる。あるいは、図６ｄに示すように、チップの配置を蛍光色団の溶液に浸漬して、湿式化学を介してチップの側面および上部平坦表面に蛍光色団をグラフトすることができる。
【0085】
このグラフト方法は、チップの配置の上面にカスタマイズされたパターンを作り出す。加えて、チップの配置はＳＵ－８チップを失うことなく、過剰な分子またはナノ粒子を排除するために、各パターニングプロセス後にすすぎ洗いすることができる。
【0086】
＜実施例５ 蛍光色団を有するグラフトされたＳＵ－８チップの特徴づけと、その後の遊離＞
蛍光チップは、マイクロスケールでの用途において、タグ付け、識別、およびバーコーディング装置を作り出すために使用されてきた。本発明の上部平坦表面は同様の目的を達成するために、選択された蛍光色団でグラフトすることができる。これを達成するために、分岐ＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面を最初に修飾して、選択されたアミン含有架橋剤を有する反応性表面を作り出す。第２に、上部平坦表面は、マイクロコンタクトプリンティングを介して赤色発光ＮＨＳ－エステル誘導体化蛍光色団でグラフトされる。分岐ＳＵ－８チップの配置上のグラフトされた蛍光色団の得られる発光は、図７ａに見ることができる。グラフトされたＳＵ－８チップは、実施例３に提示されたマウンティング媒質を用いて遊離され、水中に再懸濁される。チップ上にグラフトされた赤色発光蛍光色団の蛍光発光を図７ｂに示す。
蛍光チップは、マイクロスケールでの用途において、タグ付け、識別、およびバーコーディング装置を作り出すために使用されてきた。本発明の上部平坦表面は同様の目的を達成するために、選択された蛍光色団でグラフトすることができる。これを達成するために、分岐ＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面を最初に修飾して、選択されたアミン含有架橋剤を有する反応性表面を作り出す。第２に、上部平坦表面は、マイクロコンタクトプリンティングを介して赤色発光ＮＨＳ－エステル誘導体化蛍光色団でグラフトされる。分岐ＳＵ－８チップの配置上のグラフトされた蛍光色団の得られる発光は、図７ａに見ることができる。グラフトされたＳＵ－８チップは、実施例３に提示されたマウンティング媒質を用いて遊離され、水中に再懸濁される。チップ上にグラフトされた赤色発光蛍光色団の蛍光発光を図７ｂに示す。
【0087】
材料の光透過率が選択された波長で９５％未満であるので、蛍光発光はチップを通して検出され、グラフトされた表面が上向きであるか下向きであるかにかかわらず、無視可能な自家蛍光と共に発光が観察される。このアプローチは特定の部分、例えばアミン、エポキシ樹脂またはチオールを有する選択された架橋剤を有する、ＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面のカスタマイズを可能にし、蛍光色団またはナノ粒子が共有結合できる反応性表面を作り出す。
＜実施例６ 核酸およびタンパク質を用いたグラフトＳＵ－８チップの特徴づけ、およびその後のグラフトＳＵ－８チップの遊離＞
あるいは、ＳＵ－８チップの配置上への核酸およびタンパク質の共有結合的固定化がバイオセンシング、生体触媒作用、およびポイントオブケアモニタリングのための好ましい安定性および生体分子アクセス性を提供する。電流官能化方法は、チップをランダムにコーティングするために湿式化学を用いる。チップの表面の選択された位置に向けて官能化を導くために、ＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面は最初に、エポキシ含有架橋剤で官能化され、反応性表面を作り出し、これは、修飾オリゴ中およびタンパク質中に存在する第二級アミンと自発的に反応する。
＜実施例６ 核酸およびタンパク質を用いたグラフトＳＵ－８チップの特徴づけ、およびその後のグラフトＳＵ－８チップの遊離＞
あるいは、ＳＵ－８チップの配置上への核酸およびタンパク質の共有結合的固定化がバイオセンシング、生体触媒作用、およびポイントオブケアモニタリングのための好ましい安定性および生体分子アクセス性を提供する。電流官能化方法は、チップをランダムにコーティングするために湿式化学を用いる。チップの表面の選択された位置に向けて官能化を導くために、ＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面は最初に、エポキシ含有架橋剤で官能化され、反応性表面を作り出し、これは、修飾オリゴ中およびタンパク質中に存在する第二級アミンと自発的に反応する。
【0088】
これを達成するために、反応性エポキシ－シラン（［材料および方法］）上部平坦表面を有する分岐ＳＵ－８チップの配置を、マイクロコンタクトプリントによってパターニングして、テキサス赤色標識アミン誘導体化オリゴをグラフトした。同様に、反応性エポキシ－シラン（［材料および方法］）上面を有するアスペクト比ＳＵ－８チップの配置を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いたマイクロコンタクトプリントによってパターニングした。オリゴおよびタンパク質をグラフトした後、チップを遊離させ、実施例３の工程に続いて特徴づけのために再回収した。得られた遊離グラフトＳＵ－８チップは、図８に見られるように蛍光顕微鏡で特徴づけすることができる。図８ａの蛍光シグネチャーは、チップの上面に存在するテキサス赤色標識オリゴの存在を確認する。同様に、図８ｂの緑色蛍光発光は、遊離したチップの上面上のグラフト化ＧＦＰを確認する。
【0089】
遊離方法はグラフトされた生体分子の完全性を保護し、したがってそれらは、チップのさらなる利用のための官能性を維持する。
＜実施例７ 量子ドットを用いたグラフトＳＵ－８チップの特徴づけおよびその後のグラフトＳＵ－８チップの遊離＞
本発明は、全ての形状およびサイズのＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面上への量子ドット（ＱＤ）のグラフト、およびその後のグラフトされたチップの遊離を可能にする。ＳＵ－８チップの配置は、実施例１に記載の通り作製され、選択されたエポキシ－シラン架橋剤を用いて反応面で最初に官能化された。続いて、５４５ｎｍで蛍光発光を有するアミノ官能化ＱＤ（ＱＤ５４５）をアスペクト比ＳＵ－８チップの配置上にグラフトし（図９ａ）、５２５ｎｍで蛍光発光を有するアミノ官能化ＱＤ（ＱＤ５２５）を基準ＳＵ－８チップの配置上にグラフトした（図９ｃ）。両方のグラフト化プロセスは、マイクロコンタクトプリントによって達成された。その後、チップのグラフトされた配置は、実施例３で確立された工程に続いて、マウンティング媒質を用いて基材から遊離された。
＜実施例７ 量子ドットを用いたグラフトＳＵ－８チップの特徴づけおよびその後のグラフトＳＵ－８チップの遊離＞
本発明は、全ての形状およびサイズのＳＵ－８チップの配置の上部平坦表面上への量子ドット（ＱＤ）のグラフト、およびその後のグラフトされたチップの遊離を可能にする。ＳＵ－８チップの配置は、実施例１に記載の通り作製され、選択されたエポキシ－シラン架橋剤を用いて反応面で最初に官能化された。続いて、５４５ｎｍで蛍光発光を有するアミノ官能化ＱＤ（ＱＤ５４５）をアスペクト比ＳＵ－８チップの配置上にグラフトし（図９ａ）、５２５ｎｍで蛍光発光を有するアミノ官能化ＱＤ（ＱＤ５２５）を基準ＳＵ－８チップの配置上にグラフトした（図９ｃ）。両方のグラフト化プロセスは、マイクロコンタクトプリントによって達成された。その後、チップのグラフトされた配置は、実施例３で確立された工程に続いて、マウンティング媒質を用いて基材から遊離された。
【0090】
図９ｂおよび図９ｄに示されるように、水性媒質中に懸濁された遊離チップの正規化された蛍光発光は、小さな蛍光発光分散および凝縮発光強度を有する、均一なＱＤ表面被覆を実証する。蛍光発光は放出された懸濁ＳＵ－８チップの亜集団を区別するために使用することができる個々のシグネチャーを提供し、それぞれの亜集団は、異なったＱＤでグラフトされる。シグネチャーの効率は、一方のグラフトされたＳＵ－８チップを他方から識別する能力に関連する。まとめると、この技術の潜在的能力はＳＵ－８チップの上面全体にわたって正確かつ再現可能なＱＤパターンを得ることを可能にし、穏やかな遊離処理は遊離されたＳＵ－８チップの上面上のカスタマイズされた物理的および化学的特性の保存を実証する。
【0091】
＜実施例８ 上面に分子またはナノ粒子でグラフトしたＳＵ－８チップの特徴づけ、続くグラフトＳＵ－８チップの遊離、およびＳＵ－８チップ底面への第２蛍光色団グラフト＞
本発明は、ＳＵ－８チップの上面に選択された表面パターニング特性を与える経路を確立する。これは、ヤヌスチップを得るためのチップの底面の被覆および選択的プリントを含めることによってさらに拡張することができる。これらのチップを作製するために、実施例３で確立された剥離とそれに続く底部パターニングの後に、凝固したマウンティング媒質へのそれらのフラッシュおよび規則的な埋め込みを利用する。
本発明は、ＳＵ－８チップの上面に選択された表面パターニング特性を与える経路を確立する。これは、ヤヌスチップを得るためのチップの底面の被覆および選択的プリントを含めることによってさらに拡張することができる。これらのチップを作製するために、実施例３で確立された剥離とそれに続く底部パターニングの後に、凝固したマウンティング媒質へのそれらのフラッシュおよび規則的な埋め込みを利用する。
【0092】
膜を溶解する代わりに、グラフトされたＳＵ－８チップの平坦な下面（図１ｄの７）は露出された平坦な底面を誘導体化して、選択された架橋剤（図１ｅの８）を有する反応性表面を作り出すこと、および選択された分子およびナノ粒子（図１ｆの９）をグラフトするために固化されたマウンティング媒質上に埋め込まれながら、それらのその後のマイクロコンタクトプリントを可能にし、膜を溶解した後、懸濁ヤヌスチップを得る（図１ｇ）。
【0093】
したがって、本発明者らは最初に、それぞれ反対にある表面上に２つの蛍光色団を有するヤヌスチップを作製した（図１０ａ～ｃ）。基準チップの配置の露出した上面をＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）で官能化して反応性表面を作製し、ＮＨＳ－エステル誘導体化赤色蛍光色団をマイクロコンタクトプリントで連続的にプリントした。実施例３中の処理に続いてチップを遊離させた後、底面をアミノ誘導体化してチップの底面上に反応面を作製し、その後、マイクロコンタクトプリントを用いてＮＨＳ－エステル誘導体化緑色蛍光色団をプリントした。赤色および緑色蛍光チャネル（それぞれ図１０ａ、ｂ）は膜を溶解し、チップを水性媒質に再懸濁した後のそれぞれの蛍光色団の独立した寄与を有する、得られたチップを示す。図１０ｃにおける前の２つの画像の組合せによって形成される合成画像は、懸濁チップの上部および底面に局在する赤色および緑色蛍光発光の位置を明確に示す。
【0094】
同様に、このストラテジーはチップの上面および底面に特異的な形質を付加するために、様々な共有結合機構の使用を可能にする。本発明に、ファセットＳＵ－８チップの配置をエポキシ－シラン（［材料および方法］）で修飾して、チップの上面に反応性表面を作製した。次いで、６５５ｎｍの蛍光発光を有するアミノ修飾ＱＤ（ＱＤ６５５）をマイクロコンタクトプリントでグラフトした。実施例３に示される工程に従ってチップの配置が遊離された後、チップの現在露出されている底部平坦表面をアミン含有架橋剤で修飾して、緑色ＮＨＳエステル誘導体化およびアミン反応性蛍光色団のその後のパターン形成のための反応性表面を作り出すことができる。図１０ｄの赤色蛍光画像はＱＤ６５５の発光を示し、図１０ｅの緑色蛍光発光は、緑色発光蛍光色団の発光を示す。合成画像（図１０ｆ）は２つの前記蛍光発光の組み合わせを示し、各チップ上のＱＤ６５５および緑色発光蛍光色団の局在化を実証する。
【0095】
この多重化学プロトコルは、結合経路を誘導し、化学的に干渉する実体を有するヤヌスチップを得ることを可能にする。
＜実施例９ ナノ粒子で上面にグラフトされた二重高さＳＵ－８チップの特徴づけ、その後のグラフトＳＵ－８チップの遊離、およびＳＵ－８チップ底面上へのナノ粒子の第２グラフト＞
二重高さＳＵ－８チップに存在する物理的特性はさらなる化学的パターニングのために、上面および底面上に物理的制約を形成するために利用することができる。先に実施例２に示したように、これらのチップは２つの特徴的な高さに特徴を有する上面を有し、したがって、パターニングは隆起した特徴の上でのみ生じる。分子（実施例５）、生体分子（実施例６）、およびナノ粒子（実施例７）はマイクロコンタクトプリンティングなどのソフトリソグラフィーを介してパターニングすることができ、またはポリマーペンリソグラフィーをこれらの領域上にパターニングすることができる。さらに、本発明は実施例３に記載されているように、パターニングされた二重高さチップを遊離させ、実施例８に示されているように、選択された架橋剤との反応性表面を形成するために、現在露出されている底部平坦表面に機能性基を付加する手段を確立する。この底部平坦反応面は、マイクロコンタクトプリントを用いて、分子（実施例５）、生体分子（実施例６）、およびナノ粒子（実施例７）でパターニングすることができる。
＜実施例９ ナノ粒子で上面にグラフトされた二重高さＳＵ－８チップの特徴づけ、その後のグラフトＳＵ－８チップの遊離、およびＳＵ－８チップ底面上へのナノ粒子の第２グラフト＞
二重高さＳＵ－８チップに存在する物理的特性はさらなる化学的パターニングのために、上面および底面上に物理的制約を形成するために利用することができる。先に実施例２に示したように、これらのチップは２つの特徴的な高さに特徴を有する上面を有し、したがって、パターニングは隆起した特徴の上でのみ生じる。分子（実施例５）、生体分子（実施例６）、およびナノ粒子（実施例７）はマイクロコンタクトプリンティングなどのソフトリソグラフィーを介してパターニングすることができ、またはポリマーペンリソグラフィーをこれらの領域上にパターニングすることができる。さらに、本発明は実施例３に記載されているように、パターニングされた二重高さチップを遊離させ、実施例８に示されているように、選択された架橋剤との反応性表面を形成するために、現在露出されている底部平坦表面に機能性基を付加する手段を確立する。この底部平坦反応面は、マイクロコンタクトプリントを用いて、分子（実施例５）、生体分子（実施例６）、およびナノ粒子（実施例７）でパターニングすることができる。
【0096】
二重高さチップの特徴の光学顕微鏡像が図１１ａに示されており、これは、実施例２に詳述される手順に従って、基準ＳＵ－８チップの配置からなる最初の層と分岐ＳＵ－８チップの第２の層とで製造されている。次いで、二重高さチップの配置の上部平坦表面を官能化して、反応性表面にエポキシシラン（［材料および方法］）を付与した。後に、マイクロコンタクトプリントを用いて、実施例７に詳述されるように、アミノ官能化ＱＤ６５５を二重高さチップの反応性上部平坦表面上にグラフトした。二重高さチップは、実施例３に詳述されるステップに従って、マウンティング媒質を用いて解放された。次いで、マウンティング媒質マトリックスに埋め込まれたチップの底部平坦表面をエポキシシランで修飾して反応性表面を形成し、その後、アミノ官能化ＱＤ５４５をマイクロコンタクトプリントでパターニングした。
【0097】
図１１ｂの蛍光顕微鏡画像は、ＱＤ６５５が最初にチップの分岐側にプリントされ、連続的なエポキシ誘導体化および遊離後の基準部分へのＱＤ５４５プリントを有する懸濁チップの明確な評価をもたらす。蛍光発光はＱＤの選択的パターニングの正しい形とサイズを、最初は上面の上に、続いて遊離後のチップの露出底面の上に示す。
【0098】
全体として、膨大な数の可能性のあるヤヌスチップを本発明で得ることができる。同時に、チップは選択された（生物）化学的なまたはナノ粒子ベースのインクを使用してパターニングされ、カスタマイズされたスタンプを必要とせずに、初期の物理的特性によって決定される表面化学異方性を得ることができる。さらに、多重化表面を作り出すための直交化学の必要性なしに、単一チップにおける多重化学官能化を容易にする。
＜実施例１０ ｐＨを測定するためのｐＨ感知蛍光色団をグラフトした懸濁ＳＵ－８チップの適用＞
カスタマイズされた形状およびサイズを有する小型感知デバイスを設計し、それをマイクロスケールでの感知能力と組み合わせた。装置は、反応性上面を形成するためにＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）で誘導体化された分岐チップの配置で構成された。その後、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、スクシンイミジルを反応性表面上にマイクロコンタクトプリントでグラフトした。その後、実施例３に記載されているようにチップを遊離させ、その後、様々なｐＨ（図１２）の環境に曝露させた。ｐＨ感知蛍光色団ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄは、低いｐＨ値でその発光を増加させ、したがって中性環境（図１２ｂ）と比較して、低いｐＨで蛍光の４倍の増加が観察された（図１２ａ）。高いｐＨでは蛍光がごくわずかであるという反対のことが起こり（図１２ｃ）、したがってチップの蛍光は目に見えなかった。
＜実施例１０ ｐＨを測定するためのｐＨ感知蛍光色団をグラフトした懸濁ＳＵ－８チップの適用＞
カスタマイズされた形状およびサイズを有する小型感知デバイスを設計し、それをマイクロスケールでの感知能力と組み合わせた。装置は、反応性上面を形成するためにＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）で誘導体化された分岐チップの配置で構成された。その後、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、スクシンイミジルを反応性表面上にマイクロコンタクトプリントでグラフトした。その後、実施例３に記載されているようにチップを遊離させ、その後、様々なｐＨ（図１２）の環境に曝露させた。ｐＨ感知蛍光色団ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄは、低いｐＨ値でその発光を増加させ、したがって中性環境（図１２ｂ）と比較して、低いｐＨで蛍光の４倍の増加が観察された（図１２ａ）。高いｐＨでは蛍光がごくわずかであるという反対のことが起こり（図１２ｃ）、したがってチップの蛍光は目に見えなかった。
【0099】
同定を容易にするための詳細な物理的異方性は、それらのカスタマイズされた物理的特性を有する懸濁チップ中で同じ蛍光発光波長を使用する多重化調査に向けて外挿することができ、それは非常に小さな容積におけるそれらのサイズに起因する。
＜実施例１１ 上面上に感知生体分子をグラフトし、底面上に蛍光標識をグラフトした懸濁ＳＵ－８チップの適用＞
本発明はチップの上面に感知面を有し、チップの底面に相補的な標識面を有するヤヌスチップからなる単一工程バイオアッセイを実施することによる検知能力を実証する。チップは、ＤＮＡ感知面と、もう一方の面（図１３）上のＱＤシグネチャーとからなる。
＜実施例１１ 上面上に感知生体分子をグラフトし、底面上に蛍光標識をグラフトした懸濁ＳＵ－８チップの適用＞
本発明はチップの上面に感知面を有し、チップの底面に相補的な標識面を有するヤヌスチップからなる単一工程バイオアッセイを実施することによる検知能力を実証する。チップは、ＤＮＡ感知面と、もう一方の面（図１３）上のＱＤシグネチャーとからなる。
【0100】
最初に、基準チップの配置をエポキシ－シラン（［材料および方法］）で修飾して、反応性上面を得た。続いて、アミン修飾オリゴ（「プローブ１」）を、実施例６に詳述する工程に従って、マイクロコンタクトプリントを用いて上面上に誘導体化した。グラフトされたチップは後に、マウンティング媒質を用いて実施例３に詳述されるように遊離され、チップの底面に反応面が付与され、一方、マウンティング媒質には、ＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）が埋め込まれた。次いで、アミノ誘導体化されたＱＤ６５５を、実施例９の工程に続いて、マイクロコンタクトプリントを用いて反応性底面上にプリントした。その後、マウンティング媒質を溶解し、懸濁チップを、完全な塩基対一致を有する「プローブ１」に相補的な緑色発光蛍光マーカーで修飾されたプローブ（「プローブ２」）と共にインキュベートし、ハイブリダイゼーションを促進した。ハイブリダイズした「プローブ２」を有する懸濁チップを洗浄し、最後に遠心分離により再回収した。
【0101】
チップは底面上にグラフトされたＱＤ６５５で見ることができ、チップを識別するための標識として使用される（図１３ａ）。
【0102】
蛍光顕微鏡を用いたバイオアッセイの分析は、プリントされた「プローブ１」への「プローブ２」の標的化を示し、緑色発光シグネチャーをもたらす（図１３ｂ）。
【0103】
これは、多重化された亜集団において、懸濁デバイスを用いたＤＮＡコード認識において大きな利点を示すことができる。このアプローチは異なるＱＤを使用して、独自のＤＮＡ配列で誘導体化されたチップの集団、およびすべて同じ蛍光色団で標識されたｃＤＮＡ鎖のための独立した蛍光シグネチャーを作りだすことができ、それゆえ、ＤＮＡ標識のための限られた利用可能な蛍光色団に存在する欠点を排除する。
＜実施例１２ 懸濁ＳＵ－８チップを用いたバーコードライブラリの作製に向けた適用＞
本発明は、非常に小さな容積でバーコーディングするために、多重化学と表面パターンデザインを組み合わせたヤヌス多重化チップを、正確なコード読み取りのための基準マークと組み合わせて実証する。アスペクト比ＳＵ－８チップの配置をＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）で誘導体化して、チップの上面に反応性部分を付与した。次いで、ＮＨＳ－エステル誘導体化され、アミン反応性蛍光色団を、ＳＵ－８チップの配置の上面上に別個の蛍光発光スポットを生成するポリマーペンリソグラフィーでグラフトした。色発光およびスポットの位置は、バーコードのコード化要素を生成する。チップの配置は後に、実施例３に説明されるようにマウンティング媒質で遊離され、埋め込まれたチップの露出底面は、反応面を形成するためにエポキシ－シラン（［材料および方法］）で官能化された。次いで、マイクロコンタクトプリントを用いて、アミノ修飾ＱＤ６５５をチップの反応性底面上にグラフトする。ＱＤはこの場合、チップの識別を容易にするためにプリントされたが、任意の感知分子またはナノ粒子によって置き換えることができる。固化したマウンティング媒質は後に、水性媒質に溶解されて、懸濁チップ（図１４）を得る。
＜実施例１２ 懸濁ＳＵ－８チップを用いたバーコードライブラリの作製に向けた適用＞
本発明は、非常に小さな容積でバーコーディングするために、多重化学と表面パターンデザインを組み合わせたヤヌス多重化チップを、正確なコード読み取りのための基準マークと組み合わせて実証する。アスペクト比ＳＵ－８チップの配置をＡＰＴＥＳ（［材料および方法］）で誘導体化して、チップの上面に反応性部分を付与した。次いで、ＮＨＳ－エステル誘導体化され、アミン反応性蛍光色団を、ＳＵ－８チップの配置の上面上に別個の蛍光発光スポットを生成するポリマーペンリソグラフィーでグラフトした。色発光およびスポットの位置は、バーコードのコード化要素を生成する。チップの配置は後に、実施例３に説明されるようにマウンティング媒質で遊離され、埋め込まれたチップの露出底面は、反応面を形成するためにエポキシ－シラン（［材料および方法］）で官能化された。次いで、マイクロコンタクトプリントを用いて、アミノ修飾ＱＤ６５５をチップの反応性底面上にグラフトする。ＱＤはこの場合、チップの識別を容易にするためにプリントされたが、任意の感知分子またはナノ粒子によって置き換えることができる。固化したマウンティング媒質は後に、水性媒質に溶解されて、懸濁チップ（図１４）を得る。
【0104】
数値は、コード領域に割り当てることができる：値２を有する赤色蛍光体スポット、値１を有する緑色蛍光体スポット、および３値コードシステムの０を表す空の空間。
【0105】
カラーバーコードチップは、～０．６３×１０６μｍ３の全容積の６つのコード特徴（ｍ）を、最大９種類の色（ｎ）で実証し、理論コード化密度はｎｍ／Ｖで計算して～０．８コードμｍ－３であった。この密度は、コード特徴の数を増加させるためにチップサイズを増大させることによって拡張することができる。そのような手法は、～４．８×１０６μｍ３の容積の１０個のコード特徴を含む他の報告されたチップに使用され、８つの異なった色と結合され、したがって計算された２２３個のコードμｍ－３である。これらのチップの大きなバーコードの潜在的能力は、本発明が有効な代替案を提示し得る、さらなる小型化を必要とする用途において制限される。興味深いことに、９つの可能なスポットにおける２つの異なる蛍光色団のみと結合した並列パターニングにより、１８μｍ３アスペクト比チップをコード化して、小さな容積において１，０９３コードμｍ－３の計算されたコード化密度を得ることができた。したがって、これらのコード化されたヤヌスチップは多重化平面アレイと干渉しない最下層を追加することによって、それらのアウトリーチを拡張し、その後、機能性を拡張するために使用され得るか、またはバーコード化の増加のために使用され得る。
【図1a)】
【図1b)】
【図1c)】
【図1d)】
【図1e)】
【図1f)】
【図1g)】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11a】
【図11b】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】