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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-10
(54)【発明の名称】ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及びその融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230803BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20230803BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230803BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230803BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230803BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230803BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230803BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230803BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230803BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230803BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230803BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230803BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230803BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230803BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230803BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20230803BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20230803BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230803BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230803BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230803BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/715 ZNA
C07K16/28
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P31/00
A61P37/06
A61K38/17
A61K47/68
A61K47/65
A61K38/19
A61K38/02
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504523
(86)(22)【出願日】2021-07-23
(85)【翻訳文提出日】2023-03-22
(86)【国際出願番号】 CN2021108065
(87)【国際公開番号】W WO2022017487
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】202010721371.4
(32)【優先日】2020-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522261352
【氏名又は名称】▲邁▼威（上海）生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲錦▼超
(72)【発明者】
【氏名】王 双
(72)【発明者】
【氏名】焦 莎莎
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲暢▼
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲栄▼娟
(72)【発明者】
【氏名】▲曾▼ 大地
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC03
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA41
4C084BA44
4C084CA53
4C084DA01
4C084DA32
4C084DB63
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB081
4C084ZB261
4C084ZB311
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085AA25
4C085AA26
4C085BB01
4C085BB12
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC07
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA51
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその融合タンパク質が組み換え発現の過程で分解及び切断を起こしやすいという技術的問題に鑑み、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及びその融合タンパク質を提供する。配列番号６の野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩの細胞外領域と比較して、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は６位のＧｌｎ、１２位のＡｓｐ及び２０位のＧｌｙから選択される突然変異を有する。ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、ＴＧＦ－βに結合することができる。野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、組換え発現時の切断及び／又は分解がより少ない。これは、より安定した品質での抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ二官能性タンパク質の大量生産に好都合である。
【選択図】図２３
【選択図】図２３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体であって、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して６位、１２位及び２０位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基位置に突然変異を含み、ここで該野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩのアミノ酸残基のナンバリングが配列番号６を指すことを特徴とする、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体。
【請求項2】
前記野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較してＱ６Ｎ、Ｄ１２Ｔ及びＧ２０Ｔからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体。
【請求項3】
ＴＧＦ－βに結合することができ、該ＴＧＦ－βがＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体。
【請求項4】
前記野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、組換え発現させた場合に、より少ない切断及び／又は分解を有することを特徴とする、請求項１に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体。
【請求項5】
２つ以上の機能フラグメントを含む融合タンパク質であって、該機能フラグメントの少なくとも１つが請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項6】
前記２つ以上の機能フラグメントが互いに独立して機能し、任意に、該機能フラグメントがポリペプチドリンカー（リンカー）を介して互いに連結されることを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記機能フラグメントが抗体又はその抗原結合部分、受容体又はそのリガンド結合部分、サイトカイン又はそのフラグメント、細胞毒素又はその変異体、標識又はトレーサー等を更に含むことを特徴とする、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記機能フラグメントが腫瘍免疫療法又は癌免疫療法の標的、慢性感染性疾患免疫療法の標的、及び自己免疫疾患療法の標的からなる群から選択される標的に特異的に結合することを特徴とする、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記標的が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５等を含むことを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
２つ以上の機能活性を有する多機能活性分子であって、該機能活性の少なくとも１つが、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントによって与えられるＴＧＦ－β結合活性であることを特徴とする、多機能活性分子。
【請求項11】
前記機能活性が抗原結合活性、リガンド結合活性、サイトカイン活性、細胞毒性又は標識活性を更に含むことを特徴とする、請求項１０に記載の多機能反応性分子。
【請求項12】
前記機能活性が、以下の分子：上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５等に対する結合活性を更に含むことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の多機能活性分子。
【請求項13】
抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子であって、該抗体が腫瘍療法の標的を標的とし、該ＴＧＦ－β ＲＩＩが請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項14】
前記抗体が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ５、好ましくはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１３３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を特異的に標的とすることを特徴とする、請求項１３に記載の抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項15】
前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体又はナノボディであることを特徴とする、請求項１３に記載の抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項16】
前記抗体が抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであり、該抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２５に示すＣＤＲ１、配列番号２６に示すＣＤＲ２及び配列番号２７に示すＣＤＲ３を重鎖に有し、配列番号２８に示すＣＤＲ１、配列番号２９に示すＣＤＲ２及び配列番号３０に示すＣＤＲ３を軽鎖に有することを特徴とする、請求項１３に記載の抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項17】
前記抗体が抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディであり、該抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディのアミノ酸配列が配列番号２０であることを特徴とする、請求項１３に記載の抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項18】
前記ＴＧＦ－β ＲＩＩがリンカーペプチドを介して前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体に連結され、該リンカーペプチドが好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここでｎが１～４の整数であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子。
【請求項19】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、請求項５～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の多機能活性分子又は請求項１３～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
【請求項20】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、請求項５～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の多機能活性分子又は請求項１３～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子をコードする核酸。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸を含む組換えベクター又は組換え宿主細胞。
【請求項22】
生成物を生成する方法であって、請求項２０に記載の核酸、又は請求項２１に記載の組換えベクター若しくは組換え宿主細胞を用いてＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、その融合タンパク質、その多機能活性分子又はそのコンジュゲート分子を生成することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項23】
ＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントを含む組換えタンパク質の分解又は切断を低減又は排除する方法であって、前記組換えタンパク質中の前記ＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントをコードするコード領域を突然変異誘発に供し、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、該コード領域にコードされるＴＧＦ－β ＲＩＩが６位、１２位及び２０位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基位置に突然変異を含むようにし、ここで前記野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩのアミノ酸残基のナンバリングが配列番号６を指すことを特徴とする、方法。
【請求項24】
前記野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、前記ＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントがＱ６Ｎ、Ｄ１２Ｔ及びＧ２０Ｔからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の組換えタンパク質の分解又は切断を低減又は排除する方法。
【請求項25】
疾患を治療する方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、請求項５～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の多機能活性分子、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、請求項１９に記載の組成物、請求項２０に記載の核酸、又は請求項２１に記載の組換えベクター若しくは組換え宿主細胞からなる群から選択される生成物を有効量、それを必要とする被験体に投与することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項26】
腫瘍若しくは癌、慢性感染性疾患、又は自己免疫疾患を予防又は治療する方法であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記腫瘍又は癌が、好ましくは咽頭扁平上皮癌、非小細胞肺癌、膵癌、肝癌、尿路上皮癌、大腸癌及び胃癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
療法用の薬剤の製造における生成物の使用であって、該生成物が請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、請求項５～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の多機能活性分子、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、請求項１９に記載の組成物、請求項２０に記載の核酸、又は請求項２１に記載の組換えベクター若しくは組換え宿主細胞を含むことを特徴とする、使用。
【請求項29】
前記薬剤が腫瘍若しくは癌、慢性感染性疾患、又は自己免疫疾患の予防又は治療のためのものであることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項30】
前記腫瘍又は癌が、好ましくは咽頭扁平上皮癌、非小細胞肺癌、膵癌、肝癌、尿路上皮癌、大腸癌及び胃癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年７月２４日に出願された中国特許出願第２０２０１０７２１３７１．４号の優先権の利益を主張し、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
【0002】
本発明は生物薬学の分野、特に腫瘍に対する治療用タンパク質医薬の分野に属する。特に、本発明はＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及び融合タンパク質、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【0003】
プログラム死因子リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７相同タンパク質１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られ、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、ＣＤ２７４遺伝子にコードされる。成熟ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、４０ｋＤａのサイズであり、２７２個のアミノ酸からなるＩ型膜貫通タンパク質であり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来マスト細胞及び非造血細胞の表面に誘導発現され、腫瘍組織、例えば肺癌、肝癌、膀胱癌等でも広く発現される。ＰＤ－Ｌ１の発現は、腫瘍組織及び他の組織においてインターフェロン及び他の炎症因子の刺激に応答して急速に上方調節されることがある。ＰＤ－Ｌ１の受容体は、プログラム死タンパク質１（ＰＤ－１）である。ＰＤ－１は、ＣＤ２７９としても知られ、Ｔ細胞受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、様々な免疫細胞、例えば活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球等の表面に発現される。ＰＤ－Ｌ１がその受容体ＰＤ－１に結合すると、Ｔ細胞のアポトーシス、アネルギー及び枯渇が誘導される可能性があり、次いで腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化、増殖及び抗腫瘍機能が阻害され、腫瘍免疫回避が引き起こされる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断抗体は、ＰＤ－Ｌ１の免疫抑制効果を緩和し、Ｔ細胞等のｉｎ ｖｉｖｏ免疫細胞による腫瘍細胞の認識及び死滅を増強し、それにより腫瘍死滅効果を達成することができる。これまで、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする複数の抗体医薬が世界中で販売され、黒色腫、肺癌、腎癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、尿路上皮癌等を含む様々な腫瘍に対して臨床的に良好な治療効果を示している。しかしながら、治療用ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体には依然として幾つかの問題があり、主な問題は、かかる抗体を臨床的に単独で使用した場合の低い有効率である。殆どの癌について、治療用ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体を単独で無差別に使用した場合、平均１０％～２０％の有効率しか達成することができない。したがって、臨床ニーズを満たすために、より有効な抗体分子を開発することが望ましい。
【0004】
トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーであり、その主な機能は、細胞の成長及び分化を調節することである。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β ＲＩ、ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びＴＧＦ－β ＲＩＩＩの３つのサブタイプに分けられる高親和性受容体（ＴＧＦ－β Ｒ）を細胞表面に有する。ＴＧＦ－βは、細胞膜の表面でセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有するＴＧＦ－β ＲＩＩに結合することで、ＴＧＦ－β ＲＩＩと複合体を形成し、これがＴＧＦ－β ＲＩと複合体を形成することによりシグナルを伝達して、対応するシグナル伝達経路の活性化を引き起こし、細胞増殖、分化及びアポトーシスを調節する役割を果たす。腫瘍微小環境においては、ＴＧＦ－βは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生を調節し、ＤＣ細胞の成熟を阻害し、Ｂ細胞によるＩｇＡの生成を阻害し、ＮＫ細胞の活性化を阻害する等の効果を有することで、免疫抑制を引き起こし、腫瘍細胞の成長及び転移を促進する。ＴＧＦ－βの主要受容体ＴＧＦ－β ＲＩＩへの結合を遮断することで、ＴＧＦ－βの腫瘍促進活性を阻害することができる。したがって、ＴＧＦ－β遮断医薬の開発は、腫瘍治療の重要な方向性である。
【0005】
現在、ＴＧＦ－β経路を標的とする多数の小分子阻害剤及び高分子タンパク質医薬が臨床研究段階にあり、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体医薬との併用に関する複数の臨床試験が進行中であり、文献で報告されているように併用の機序が深く検証されている（非特許文献１、非特許文献２）。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路及びＴＧＦ－β／ＴＧＦ－β－Ｒ経路の両方を遮断することが可能な療法又は薬剤の開発は、腫瘍微小環境における免疫抑制の問題を更に解決することが期待される。
【0006】
ＴＧＦ－β遮断剤とＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤との併用に基づき、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路及びＴＧＦ－β／ＴＧＦ－β－Ｒ経路の両方を同時に遮断する医薬が更に開発されている。Merck & GSKのＰＤ－Ｌ１抗体とＴＧＦ－β ＲＩＩとによって形成される二官能性融合タンパク質Ｍ７８２４の臨床データから、これが様々な固形腫瘍に対して確実な臨床治療効果を有することが示されている（ＮＣＴ０２６９９５１５、ＮＣＴ０２５１７３９８及びＮＣＴ０３４２７４１１）。Ｍ７８２４の構造についてMerckにより多数の特許出願が申請されている。特許文献１を参照されたい。同様の構造の幾つかの二官能性分子、例えばHengrui Medicineによって開発されたＳＨＲ－１７０１が続々と臨床試験に入っている（ＣＴＲ２０１８２４０４／ＣＴＲ２０１８１８２３）。現在、多くの抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質が特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５及び特許文献１等の特許文献に開示されているが、一部の融合タンパク質には不安定であるという問題がある。実際の生産及び適用においては、より安定し、高度に発現される抗体／ＴＧＦ－β Ｒ融合タンパク質の開発が依然として必要とされている。
【0007】
Ｍ７８２４は良好な抗腫瘍効果を有するが、生産時にＴＧＦ－β ＲＩＩで切断されやすいという問題があり、その生産時の処理及び品質管理に幾らか困難をもたらす。この問題を解決するために、Hengrui MedicineはＴＧＦ－β ＲＩＩの切断型を設計しており、特許文献６に示される研究から、ＴＧＦ－β ＲＩＩのＮ末端の最初の２６個のアミノ酸の欠失、特に１４位～２１位のアミノ酸の欠失を含む切断型がＴＧＦ－β ＲＩＩの生理的機能を維持し、より安定していることが見出された。しかしながら、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質に含まれるＴＧＦ－β ＲＩＩは、抗体よりも小さいため、融合タンパク質中のＴＧＦ－β ＲＩＩの機能は、抗体分子によって遮蔽されていても抗体分子による干渉の影響を受けやすい。かかる問題は、可動性リンカーを用いても或る程度しか緩和することができず、ＴＧＦ－β ＲＩＩのＮ末端での切断により、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質分子の２つの機能部分の間の分子サイズの差が更に悪化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１５１１８１７５号
【特許文献2】国際公開第２００６０７４４５１号
【特許文献3】国際公開第２００９１５２６１０号
【特許文献4】国際公開第９３０９２２８号
【特許文献5】国際公開第９４０９８１５号
【特許文献6】国際公開第２０１８／２０５９８５号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Nature, 2018 Feb 22. doi: 10.1038/nature 25492
【非特許文献2】Nature, 2018 Feb 22. doi: 10.1038/nature 25501
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明が解決しようとする技術的問題は、従来技術における抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質が生産時に切断及び分解を起こしやすく、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の２つの機能部分の間の分子サイズの差が、Ｎ末端切断型ＴＧＦ－β ＲＩＩを使用した場合に更に悪化することである。
【0011】
本発明者らは、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の不安定性の主な理由が以下の通りであることを研究により発見した：抗体のＣ末端がリンカーペプチドを介してＴＧＦ－β ＲＩＩに連結された後に、抗体とＴＧＦ－β ＲＩＩとの間で切断が生じ、融合タンパク質の構造が不完全となることで、融合タンパク質の純度及び品質の均一性に影響を与え、ひいては医薬の安全性及び有効性に関する懸念を生じさせる可能性がある。その知見に基づき、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の切断及び分解を起こしやすいという欠点を克服し、更には２つの機能部分の分子サイズのバランスを取り、より安定した品質での大量生産により好都合な抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質を提供することができる、ＴＧＦ－β ＲＩＩに対して突然変異修飾を行う技術的解決策を本明細書で提供する。具体的には、本発明の技術的解決策を以下に提示する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
一態様においては、本発明は、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体であって、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して６位、１２位及び２０位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基位置に突然変異を含み、ここで野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩのアミノ酸残基のナンバリングが配列番号６を指すことを特徴とする、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体を提供する。
【0013】
さらに、本発明によるＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較してＱ６Ｎ、Ｄ１２Ｔ及びＧ２０Ｔからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含むことを特徴とする。
【0014】
さらに、本発明によるＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、ＴＧＦ－βに結合することができ、ＴＧＦ－βがＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３を含むことを特徴とする。
【0015】
更にまた、本発明によるＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、組換え発現させた場合に、より少ない切断及び／又は分解を有することを特徴とする。
【0016】
第２の態様においては、本発明は、２つ以上の機能フラグメントを含む融合タンパク質である、機能フラグメントの少なくとも１つが本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする、融合タンパク質を提供する。
【0017】
さらに、本発明による融合タンパク質は、２つ以上の機能フラグメントが互いに独立して機能することを特徴とする。
【0018】
任意に、機能フラグメントは、ポリペプチドリンカー（リンカー）を介して互いに連結される。
【0019】
さらに、本発明による融合タンパク質は、機能フラグメントが抗体又はその抗原結合部分、受容体又はそのリガンド結合部分、サイトカイン又はそのフラグメント、細胞毒素又はその変異体、標識又はトレーサー等を更に含むことを特徴とする。
【0020】
更にまた、本発明による融合タンパク質は、機能フラグメントが腫瘍免疫療法又は癌免疫療法の標的、慢性感染性疾患免疫療法の標的、及び自己免疫疾患療法の標的からなる群から選択される標的に特異的に結合することを特徴とする。
【0021】
更にまた、本発明による融合タンパク質は、標的が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５等を含むことを特徴とする。
【0022】
第３の態様においては、本発明は、２つ以上の機能活性を有する多機能活性分子であって、機能活性の少なくとも１つが、本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントによって与えられるＴＧＦ－β結合活性であることを特徴とする、多機能活性分子を提供する。
【0023】
さらに、本発明による多機能活性分子は、機能活性が抗原結合活性、リガンド結合活性、サイトカイン活性、細胞毒性又は標識活性を更に含むことを特徴とする。
【0024】
さらに、本発明による多機能活性分子は、機能活性が、以下の分子：上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５等に対する結合活性を更に含むことを特徴とする。
【0025】
第４の態様においては、本発明は、抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子であって、抗体が腫瘍療法の標的を標的とし、ＴＧＦ－β ＲＩＩが本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子を提供する。
【0026】
さらに、本発明による抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子は、抗体が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、セリントレオニンプロテインキナーゼＲａｓ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ５、好ましくはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１３３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を特異的に標的とすることを特徴とする。
【0027】
さらに、本発明による抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子は、抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体又はナノボディであることを特徴とする。本発明によって提供される抗体又はそのフラグメントは任意の形態、例えばモノクローナル抗体、一本鎖抗体、シングルドメイン抗体、二官能性抗体、ナノボディ、完全ヒト化抗体若しくは部分ヒト化抗体、又はキメラ抗体等である。代替的には、抗体又はそのフラグメントは、半抗体又は半抗体の抗原結合フラグメント、例えばｓｃＦｖ、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖであってもよい。本発明によって提供されるフラグメントに関して、好ましくは、フラグメントはＰＤ－Ｌ１に結合することができる抗体の任意のフラグメントであり得る。本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントはマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖであってもよい。
【0028】
好ましくは、本発明によって提供される抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、より好ましくはＩｇＧ１である。抗体のフラグメントは、抗体のｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントからなる群から選択される。
【0029】
好ましくは、抗体又はそのフラグメントはヒト又はマウスの定常領域、好ましくはヒト又はマウスの軽鎖定常領域（ＣＬ）及び／又は重鎖定常領域（ＣＨ）を更に含む。より好ましくは、抗体又はそのフラグメントはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択される重鎖定常領域及び／又はκ型若しくはλ型軽鎖定常領域を含む。本発明の特定の実施の形態によると、抗体はモノクローナル抗体、好ましくはマウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体であり得る。より好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプである。
【0030】
さらに、本発明による抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子は、抗体が抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであり、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２５に示すＣＤＲ１、配列番号２６に示すＣＤＲ２及び配列番号２７に示すＣＤＲ３を重鎖に有し、配列番号２８に示すＣＤＲ１、配列番号２９に示すＣＤＲ２及び配列番号３０に示すＣＤＲ３を軽鎖に有することを特徴とする。
【0031】
さらに、本発明による抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子は、抗体が抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディであり、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディのアミノ酸配列が配列番号２０に示されることを特徴とする。
【0032】
さらに、本発明による抗体－ＴＧＦ－β ＲＩＩコンジュゲート分子は、ＴＧＦ－β ＲＩＩがリンカーペプチドを介して抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体に連結され、リンカーペプチドが好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここでｎが１～４の整数であることを特徴とする。
【0033】
第５の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、本発明の第２の態様に記載の融合タンパク質、本発明の第３の態様に記載の多機能活性分子又は本発明の第４の態様に記載のコンジュゲート分子と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物を提供する。
【0034】
第６の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、本発明の第２の態様に記載の融合タンパク質、本発明の第３の態様に記載の多機能活性分子又は本発明の第４の態様に記載のコンジュゲート分子をコードする核酸を提供する。
【0035】
第７の態様においては、本発明は、本発明の第６の態様に記載の核酸を含む組換えベクターを提供する。
【0036】
第８の態様においては、本発明は、本発明の第６の態様に記載の核酸又は本発明の第７の態様に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【0037】
第９の態様においては、本発明は、生成物を生成する方法であって、本発明の第６の態様に記載の核酸、第７の態様に記載の組換えベクター又は第８の態様に記載の組換え宿主細胞を用いてＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、その融合タンパク質、その多機能活性分子又はそのコンジュゲート分子を生成することを含むことを特徴とする、方法を提供する。
【0038】
第１０の態様においては、本発明は、ＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントを含む組換えタンパク質の分解又は切断を低減又は排除する方法であって、組換えタンパク質中のＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントをコードするコード領域を突然変異誘発に供し、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、コード領域にコードされるＴＧＦ－β ＲＩＩが６位、１２位及び２０位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基位置に突然変異を含むようにし、ここで野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩのアミノ酸残基のナンバリングが配列番号６を指すことを特徴とする、方法を提供する。
【0039】
さらに、本発明による組換えタンパク質の分解又は切断を低減又は排除する方法は、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、ＴＧＦ－β ＲＩＩフラグメントがＱ６Ｎ、Ｄ１２Ｔ及びＧ２０Ｔからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含むことを特徴とする。
【0040】
第１１の態様においては、本発明は、疾患を治療する方法であって、本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、第２の態様に記載の融合タンパク質、第３の態様に記載の多機能活性分子、第４の態様に記載のコンジュゲート分子、第５の態様に記載の組成物、第６の態様に記載の核酸、第７の態様に記載の組換えベクター、又は第８の態様に記載の組換え細胞からなる群から選択される生成物を有効量、それを必要とする被験体に投与することを含むことを特徴とする、方法を提供する。
【0041】
さらに、本発明による方法は、腫瘍若しくは癌、慢性感染性疾患、又は自己免疫疾患を予防又は治療する方法であることを特徴とする。
【0042】
さらに、本発明による方法は、腫瘍又は癌が、好ましくは咽頭扁平上皮癌、非小細胞肺癌、膵癌、肝癌、尿路上皮癌、大腸癌及び胃癌からなる群から選択されることを特徴とする。
【0043】
第１２の態様においては、本発明は、薬剤の製造における生成物の使用であって、生成物が本発明の第１の態様に記載のＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体、第２の態様に記載の融合タンパク質、第３の態様に記載の多機能活性分子、第４の態様に記載のコンジュゲート分子、第５の態様に記載の組成物、第６の態様に記載の核酸、第７の態様に記載の組換えベクター、又は第８の態様に記載の組換え細胞を含むことを特徴とする、使用を提供する。
【0044】
さらに、本発明による薬剤の製造における生成物の使用は、薬剤が腫瘍若しくは癌、慢性感染性疾患、又は自己免疫疾患の予防又は治療のためのものであることを特徴とする。
【0045】
さらに、本発明による薬剤の製造における生成物の使用は、腫瘍又は癌が好ましくは咽頭扁平上皮癌、非小細胞肺癌、膵癌、肝癌、尿路上皮癌、大腸癌及び胃癌からなる群から選択されることを特徴とする。
【0046】
本発明のより良い理解を助けるために、幾つかの用語の定義を以下に提供する。他の定義は、以下の発明を実施するための形態の部全体を通して説明する。
【0047】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全長抗体及びその任意の抗原結合フラグメント（すなわち、抗原結合部分）又は単鎖を包含することを意図している。完全長抗体は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含み、重鎖と軽鎖とがジスルフィド結合によって連結される糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）と重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域と、ＣＤＲを隔てる、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）とに更に分けることができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、様々な免疫系細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主内の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0048】
本明細書で使用される「単離された抗体」という用語は、異なる抗原に対する特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
【0049】
本明細書で使用される抗体の「抗原結合フラグメント」という用語（又は抗体の一部と略される）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントによって実現され得ることが実証されている。抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１から構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１から構成されるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨから構成されるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨから構成されるｄＡｂフラグメント（Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは、異なる遺伝子にコードされるが、合成リンカーを介して組換えにより接合されて、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖を形成することができる（一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Bird et al, (1988) Science 242: 423-426及びHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883を参照されたい）。これらの一本鎖抗体も、この用語の意味に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の手法を用いて得ることができ、インタクト抗体と同様に機能的にスクリーニングすることができる。
【0050】
本発明の抗原結合フラグメントには、抗原に特異的に結合することができるものが含まれる。抗体結合フラグメントの例としては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及び単一ドメインフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0051】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加している点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断によって生成する。抗体フラグメントの付加的な化学的結合は、当業者に既知である。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクト抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域を欠き、動物の循環からより迅速に除去され、インタクト抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性がある（例えば、Wahl et al, 1983, J. Nucl. Med. 24:316を参照されたい）。
【0052】
当該技術分野において一般に理解されているように、「Ｆｃ」領域は、抗原特異的結合領域を含まない抗体のフラグメント結晶化可能定常領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤの抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２の定常ドメイン及び第３の定常ドメイン（それぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）に由来する２つの同一のタンパク質フラグメントからなる。ＩｇＭ及びＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン）を含む。
【0053】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識及び結合部位を含む抗体の最小フラグメントである。この領域は、密接に非共有結合性会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ－ＶＬ二量体）からなる。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に標的結合部位を画定する。概して、６つのＣＤＲが抗体に標的結合特異性を与える。しかしながら、場合によっては、単一の可変ドメイン（又は標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、標的を認識し結合する能力を有することができる。
【0054】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体結合フラグメントは、単一ポリペプチド鎖に存在する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。概して、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これによりｓｃＦｖが標的結合に望ましい構造を形成することができる。
【0055】
「単一ドメインフラグメント」は、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインから構成される。特定の実施の形態においては、単一ドメインフラグメントはラクダ化される（例えば、Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38を参照されたい）。
【0056】
本発明の抗体は、誘導体化抗体を包含する。例えば、誘導体化抗体は通例、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は細胞リガンド若しくは他のタンパク質への付着によって修飾される。多数の化学修飾のいずれかを、限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む既知の手法によって行なうことができる。加えて、誘導体は、例えばambrxの手法を用いて１つ以上の非天然アミノ酸を含ませたものであってもよい（例えば、Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13 (10): 1011-2を参照されたい）。
【0057】
ポリペプチドリンカーは、ポリペプチド連結アーム及びポリペプチドリンカーとも呼ばれ、２つの機能活性分子を連結するために使用されるポリペプチド分子である。融合タンパク質中の２つの活性構成要素がそれぞれ正確な空間構造を形成し、生物学的機能をより良好に発揮することができるかは、融合タンパク質中の２つの構成要素を連結するリンカー配列と密接に関連する。組換え生成される融合タンパク質は、融合タンパク質に挿入されるリンカーが対象のタンパク質のそれぞれの機能を妨げないことを必要とする。
【0058】
リンカー配列の設計及び選択に関して多くの関連研究が行われてきた。現在、２つのタイプ、すなわち（１）［Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ］等のヘリックスの形態のリンカー、及び（２）ヘリックスを形成し得る異なる長さのペプチド鎖、可動性リンカー、ブドウ球菌プロテインＡ等を含む、疎水性が低く、荷電効果が低いリンカーが主に研究されている。リンカーの長さが別の重要な要素であり、リンカーが過度に長いと、融合タンパク質がプロテアーゼに対して感受性となり、生産時の活性融合タンパク質の収率が低下することがあり、より短いリンカーを使用すると、２つの分子が過度に密接に融合し、タンパク質の機能が影響を受けることがある。
【0059】
従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、以下の利点を有する。
【0060】
第一に、本発明者らは、バイオインフォマティクス分析と組み合わせた組み換え抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の質量分析結果により、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質分子が切断及び分解される部位を同定し、アミノ酸突然変異の設計により切断及び分解部位を更に検証した。したがって、抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質が組み換え発現時に分解を起こしやすいという技術的問題が克服される。
【0061】
第二に、本発明者らは、ＴＧＦ－β ＲＩＩを部位特異的突然変異誘発により修飾した。ＴＧＦ－β ＲＩＩのアミノ酸数及びＴＧＦ－β ＲＩＩの長さを変えることなく、ＴＧＦ－β ＲＩＩを抗体等のマルチサブユニットタンパク質と融合／コンジュゲートした場合の分子量の差が過度に大きいことによる遮蔽又は機能の喪失が回避される。本開示ではＴＧＦ－β ＲＩＩの６位、１２位及び２０位のアミノ酸に対して部位特異的突然変異誘発を行い、得られるＴＧＦ－β ＲＩＩを融合タンパク質の構成要素として用いる場合、ＴＧＦ－βに対する特異的結合活性を維持し、それによりＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３に効果的に結合することができるだけでなく、ＴＧＦ－β Ｒの生物学的機能が保持され、それによりＴＧＦ－βとＴＧＦ－β Ｒとの結合をｉｎ ｖｉｖｏで遮断し、ＴＧＦ－βの腫瘍促進活性を阻害し、抗腫瘍効果及び機能を有することができる。
【0062】
第三に、本発明者らは、ＴＧＦ－β ＲＩＩと融合させる抗体も操作し、スクリーニングした。分子量が比較的小さいナノボディを採用し、リンカーを介してＴＧＦ－β ＲＩＩと融合させることで、二官能性融合タンパク質中の２つの構成要素間の分子サイズの差及び組換え二官能性融合タンパク質の構造の複雑さの両方を低減し、より安定した品質での大量生産により好都合な抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ二官能性融合タンパク質及びその調製方法を提供する。
【0063】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1】還元１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって検出した、９日間～１４日間の融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを発現する細胞の培養上清の結果を示すグラフである。
【図2a】還元１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の上清を示す図である。親：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを発現する細胞の培養上清、ｍ１：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１を発現する細胞の培養上清、ｍ２：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を発現する細胞の培養上清、ｍ３：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３を発現する細胞の培養上清。
【図2b】還元１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の精製タンパク質を示す図である。親：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの精製タンパク質、ｍ１：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１の精製タンパク質、ｍ２：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の精製タンパク質、ｍ３：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３の精製タンパク質。
【図3】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した組換えタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの結果を示すグラフである。
【図4a】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した組換えタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１の結果を示すグラフである。
【図4b】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した組換えタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結果を示すグラフである。
【図4c】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した組換えタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３の結果を示すグラフである。
【図5】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した、高温に置いたタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２のサンプルの結果を示すグラフである。赤色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－４０Ｃ、サンプルボトル１：Ａ，１；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、緑色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－４０Ｃ－１Ｗ、サンプルボトル１：Ａ，２；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、青色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－４０Ｃ－２Ｗ、サンプルボトル１：Ａ，３；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、灰色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－４０Ｃ－３Ｗ、サンプルボトル１：Ａ，４；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ。
【図6】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した、繰り返し凍結融解したタンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２のサンプルの結果を示すグラフである。赤色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－２０Ｃ、サンプルボトル１：Ａ，５；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、緑色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－２０Ｃ－１回凍結融解、サンプルボトル１：Ａ，６；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、青色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－２０Ｃ－２回凍結融解、サンプルボトル１：Ａ，７；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ、灰色の線：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２－２０Ｃ－３回凍結融解、サンプルボトル１：Ａ，８；ローディング１：チャネル２４８９ ＣｈＡ。
【図7】還元１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した、１０日間及び１５日間の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の培養上清を示す図である。
【図8】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した、１５日間のＭ７８２４の培養上清からの精製タンパク質の結果を示すグラフである。
【図9】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した、１５日間のｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の培養上清からの精製タンパク質の結果を示すグラフである。
【図10】組換えヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメインタンパク質に対するｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の親和性分析の結果を示すグラフである。
【図11】組換えヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメインタンパク質に対するＭ７８２４の親和性分析の結果を示すグラフである。
【図12】組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質に対するｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の親和性分析の結果を示すグラフである。
【図13】組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質に対するＭ７８２４の親和性分析の結果を示すグラフである。
【図14】ＥＬＩＳＡによって検出した、組換えヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメインタンパク質に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性の結果を示すグラフである。
【図15】ＥＬＩＳＡによって検出した、組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性の結果を示すグラフである。
【図16】ＥＬＩＳＡによって検出した、組換えヒトＴＧＦ－β２タンパク質に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性の結果を示すグラフである。
【図17】ＥＬＩＳＡによって検出した、組換えヒトＴＧＦ－β３タンパク質に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性の結果を示すグラフである。
【図18】ＦＡＣＳによって検出した、細胞表面上の天然ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性の結果を示すグラフである。
【図19】ＥＬＩＳＡによって検出した、ヒトＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との結合に対する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の阻害効果を示す図である。
【図20】融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の生物活性の検出を示す図である。
【図21】ＰＢＭＣ免疫再構築マウスにおける皮下移植腫瘍の腫瘍体積の統計値を示す図である。
【図22】ＰＢＭＣ免疫再構築マウスにおける皮下移植腫瘍の腫瘍重量の統計値を示す図である。
【図23】ＨＣＣ８２７細胞を皮下接種したヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスの腫瘍モデルにおける融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の抗腫瘍活性の評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0065】
ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその融合タンパク質が組み換え発現時に分解及び切断を起こしやすいという技術的問題を解決するために、本発明は、配列番号６に示す野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩの細胞外ドメインと比較して、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体が６位（Ｇｌｎ）、１２位（Ａｓｐ）及び２０位（Ｇｌｙ）から選択される位置（複数の場合もある）に突然変異（複数の場合もある）を有する、ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及びその融合タンパク質を提供する。ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、ＴＧＦ－βに結合することができる。ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体は、野生型ＴＧＦ－β ＲＩＩと比較して、組換え発現させた場合に、より少ない切断及び／又は分解を有する。より安定した品質での大量生産により好都合な抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ二官能性タンパク質及びその融合タンパク質を提供する。
【0066】
以下に本発明を、具体例を参照して説明する。これらの実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではないことが当業者には理解されよう。
【0067】
以下の実施例における実験手順は、特に明示がない限り、全て慣用のものである。以下の実施例で用いた原材料及び試薬は、特に明示がない限り、いずれも市販品である。
【実施例】
【0068】
実施例１：抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質及び対照のサンプルの調製
１．１ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の調製
ＰＣＲ法を用いて、ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４（ＭＷ２２、中国特許出願第２０１９１１４１９８０２．５号より）の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を介して、ＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号５）にＣ末端で連結し、ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖－ＴＧＦ－β ＲＩＩを含むＨ１８２－ＭＵＴ４－Ｈ－ＴＧＦ－β ＲＩＩをコードする配列（配列番号９）を得た。Ｈ１８２－ＭＵＴ４－Ｈ－ＴＧＦ－β ＲＩＩをコードするヌクレオチド配列及びＰＤ－Ｌ１抗体（Ｈ１８２－ＭＵＴ４－Ｌ）の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を酵素消化によってライゲートし、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用のＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを大腸菌（Escherichia coli）細胞に移入して増殖させ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現プラスミドを大量に単離し、得た。調製したＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現プラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを安定発現する細胞を得た。細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。細胞の培養上清の一部を９日目から毎日回収し、細胞活性が２０％未満になった時点で全ての細胞培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現上清の一部を精製し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを得た。
１．１ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の調製
ＰＣＲ法を用いて、ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４（ＭＷ２２、中国特許出願第２０１９１１４１９８０２．５号より）の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を介して、ＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号５）にＣ末端で連結し、ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖－ＴＧＦ－β ＲＩＩを含むＨ１８２－ＭＵＴ４－Ｈ－ＴＧＦ－β ＲＩＩをコードする配列（配列番号９）を得た。Ｈ１８２－ＭＵＴ４－Ｈ－ＴＧＦ－β ＲＩＩをコードするヌクレオチド配列及びＰＤ－Ｌ１抗体（Ｈ１８２－ＭＵＴ４－Ｌ）の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を酵素消化によってライゲートし、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用のＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを大腸菌（Escherichia coli）細胞に移入して増殖させ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現プラスミドを大量に単離し、得た。調製したＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの真核生物発現プラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを安定発現する細胞を得た。細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。細胞の培養上清の一部を９日目から毎日回収し、細胞活性が２０％未満になった時点で全ての細胞培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現上清の一部を精製し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩを得た。
【0069】
１．２ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質対照の調製
Ｍ７８２４の軽鎖及び重鎖－ＴＧＦ－β ＲＩＩの遺伝子（配列については特許文献１を参照されたい）を人工的に全合成し、酵素消化によってライゲートし、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用の真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって組換えタンパク質Ｍ７８２４を安定発現する細胞を得た。細胞を培養してタンパク質を発現させ、組換えタンパク質Ｍ７８２４を得て、対照として使用した。
Ｍ７８２４の軽鎖及び重鎖－ＴＧＦ－β ＲＩＩの遺伝子（配列については特許文献１を参照されたい）を人工的に全合成し、酵素消化によってライゲートし、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用の真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって組換えタンパク質Ｍ７８２４を安定発現する細胞を得た。細胞を培養してタンパク質を発現させ、組換えタンパク質Ｍ７８２４を得て、対照として使用した。
【0070】
実施例２：Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩにおける切断部位の分析
２．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によるＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの分析
Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの発現上清を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動分析に供した。結果から、電気泳動ゲルには３つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４の軽鎖であり、タンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａの明確なタンパク質バンドは、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＨ１８２－ＭＵＴ４の重鎖と推定されることが示された（図１）。培養時間の延長に伴い、切断したタンパク質のバンドの割合が増加した。Ｍ７８２４の分析結果は、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩと同様であり、同様に切断によるバンドの問題があった。
２．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によるＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの分析
Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの発現上清を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動分析に供した。結果から、電気泳動ゲルには３つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４の軽鎖であり、タンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａの明確なタンパク質バンドは、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＨ１８２－ＭＵＴ４の重鎖と推定されることが示された（図１）。培養時間の延長に伴い、切断したタンパク質のバンドの割合が増加した。Ｍ７８２４の分析結果は、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩと同様であり、同様に切断によるバンドの問題があった。
【0071】
２．２ 質量分析によるＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩにおける切断部位の分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル中の５０ｋＤａ～７０ｋＤａの分子量を有するバンドを回収した。脱色バッファーをサンプルに添加して十分に脱色し、還元バッファーを添加して還元処理を行った。その後、トリプシンを添加し、酵素消化を３７℃で一晩行った。次いで、酵素消化産物を抽出し、脱塩し、最後にペプチドフラグメントを、その後の質量分析のために０．１％ギ酸水溶液に再溶解した。質量分析のために、適量のペプチドフラグメントのサンプルを、Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００システム（Thermo Scientific）をナノリットル流量で用いたクロマトグラフ分離に供した。ペプチドフラグメントを分離した後、Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Thermo Scientific）を用いたＤＤＡ（データ依存的取得）質量分析によって分析した。最後に、質量スペクトルデータベース検索用のＭａｘＱｕａｎｔ １．６．１．０ソフトウェアを並列分析に用いた。質量分析による分析結果を下記表１に提示し、サンプルが４７８位以降のアミノ酸を欠くことが示された。トリプシンによって消化される部位がアミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇの後にある可能性があるという推測と併せて、包括的分析後に、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの重鎖がアミノ酸位置４７７／４７８で切断し得ると考えた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル中の５０ｋＤａ～７０ｋＤａの分子量を有するバンドを回収した。脱色バッファーをサンプルに添加して十分に脱色し、還元バッファーを添加して還元処理を行った。その後、トリプシンを添加し、酵素消化を３７℃で一晩行った。次いで、酵素消化産物を抽出し、脱塩し、最後にペプチドフラグメントを、その後の質量分析のために０．１％ギ酸水溶液に再溶解した。質量分析のために、適量のペプチドフラグメントのサンプルを、Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００システム（Thermo Scientific）をナノリットル流量で用いたクロマトグラフ分離に供した。ペプチドフラグメントを分離した後、Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Thermo Scientific）を用いたＤＤＡ（データ依存的取得）質量分析によって分析した。最後に、質量スペクトルデータベース検索用のＭａｘＱｕａｎｔ １．６．１．０ソフトウェアを並列分析に用いた。質量分析による分析結果を下記表１に提示し、サンプルが４７８位以降のアミノ酸を欠くことが示された。トリプシンによって消化される部位がアミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇの後にある可能性があるという推測と併せて、包括的分析後に、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの重鎖がアミノ酸位置４７７／４７８で切断し得ると考えた。
【0072】
【表1】
【0073】
実施例３：抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体の設計、発現及び分析
３．１ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体の設計及び発現
切断が生じる部位についての推測に従い、ＴＧＦ－β ＲＩＩのＮ末端酵素切断部位の前後のグリコシル化部位を、切断部位の保護を実現し、切断の発生を防止するように設計した。突然変異体の設計を表２に提示する。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの発現ベクター中のＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＳｔａｒＭｕｔ遺伝子部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号：Ｔ１１１－０１、GenStar）を用いた部位特異的突然変異誘発に供し、突然変異体の発現プラスミドを得た。次いで、プラスミドを大腸菌細胞に移入して増殖させ、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体、すなわちＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のプラスミドを得た。調製したＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のプラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによってＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体を安定発現する細胞を得た。Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、並びにその突然変異体Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３を発現する細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。細胞活性が２０％未満になった時点で全ての細胞培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて上清の一部を精製し、融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体を得た。
３．１ 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体の設計及び発現
切断が生じる部位についての推測に従い、ＴＧＦ－β ＲＩＩのＮ末端酵素切断部位の前後のグリコシル化部位を、切断部位の保護を実現し、切断の発生を防止するように設計した。突然変異体の設計を表２に提示する。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩの発現ベクター中のＴＧＦ－β ＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＳｔａｒＭｕｔ遺伝子部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号：Ｔ１１１－０１、GenStar）を用いた部位特異的突然変異誘発に供し、突然変異体の発現プラスミドを得た。次いで、プラスミドを大腸菌細胞に移入して増殖させ、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体、すなわちＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のプラスミドを得た。調製したＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のプラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによってＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体を安定発現する細胞を得た。Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、並びにその突然変異体Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３を発現する細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。細胞活性が２０％未満になった時点で全ての細胞培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて上清の一部を精製し、融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体を得た。
【0074】
【表2】
【0075】
３．２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によるＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の検出
融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の発現上清及び精製タンパク質のサンプルを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。結果から、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩのタンパク質突然変異体の電気泳動ゲルには２つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、それぞれのＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体の重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４の軽鎖であり、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＨ１８２－ＭＵＴ４の重鎖であるタンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａのバンドが消失することが示された（図２ａ及び図２ｂ）。
融合タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の発現上清及び精製タンパク質のサンプルを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。結果から、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩのタンパク質突然変異体の電気泳動ゲルには２つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、それぞれのＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体の重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｈ１８２－ＭＵＴ４の軽鎖であり、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＨ１８２－ＭＵＴ４の重鎖であるタンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａのバンドが消失することが示された（図２ａ及び図２ｂ）。
【0076】
３．３ ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ及びその突然変異体の検出
タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、並びにその突然変異体Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のサンプルをＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析に供した。結果から、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩが分解フラグメントの明白な特性ピークを有し（図３及び表３）、突然変異修飾後に分解問題が解決され、分解フラグメントの特性ピークが消失し、主ＨＰＬＣピークの純度が明らかに上昇することが示された（図４ａ、図４ｂ及び図４ｃ、並びに表３）。
タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、並びにその突然変異体Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３のサンプルをＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析に供した。結果から、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩが分解フラグメントの明白な特性ピークを有し（図３及び表３）、突然変異修飾後に分解問題が解決され、分解フラグメントの特性ピークが消失し、主ＨＰＬＣピークの純度が明らかに上昇することが示された（図４ａ、図４ｂ及び図４ｃ、並びに表３）。
【0077】
【表3】
【0078】
実施例４：抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体の安定性検出
二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２のサンプルを３週間４０℃に置き、毎週サンプルのチューブを１本取り、安定性について検出した。加えて、タンパク質のサンプルを－２０℃で３回繰り返し凍結融解し、毎回１つのサンプルを凍結融解安定性について検出した。処理したサンプル及び常に４℃に置いた対照サンプルをＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度について検出し、それらの安定性を検証した。結果を図５及び図６に示す。示されるように、高温に置き、繰り返し凍結融解に供したサンプルの純度は、基本的に対照サンプルの純度と一致し、生成物が安定しており、切断が生じないことが示された。
二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２のサンプルを３週間４０℃に置き、毎週サンプルのチューブを１本取り、安定性について検出した。加えて、タンパク質のサンプルを－２０℃で３回繰り返し凍結融解し、毎回１つのサンプルを凍結融解安定性について検出した。処理したサンプル及び常に４℃に置いた対照サンプルをＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度について検出し、それらの安定性を検証した。結果を図５及び図６に示す。示されるように、高温に置き、繰り返し凍結融解に供したサンプルの純度は、基本的に対照サンプルの純度と一致し、生成物が安定しており、切断が生じないことが示された。
【0079】
実施例５：抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質の親和性検出
抗体親和性は、FortebioのＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器上の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーで抗体Ｆｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによって検出した。アッセイのために、二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３、並びにＨ１８２－ＭＵＴ４及びＴＧＦ－β ＲＩＩ－ｈＦｃ（カタログ番号：ＣＣ１０、Novoprotein Scientific Inc.）の各々をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ番号：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流した。組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質及び組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）を６０ｎＭの濃度で移動相として使用した。結合時間を３００秒間、解離時間を３００秒間とした。アッセイが終了した後、ブランク対照の応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした後、抗原－抗体結合の動態パラメーターを算出した。結果を表４に提示する。示されるように、ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦ－β１に対する二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３の親和性は、ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦ－β１に対するＨ１８２－ＭＵＴ４及びＴＧＦ－β ＲＩＩ－ｈＦｃの親和性とは明らかには異ならなかった。
抗体親和性は、FortebioのＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器上の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーで抗体Ｆｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによって検出した。アッセイのために、二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３、並びにＨ１８２－ＭＵＴ４及びＴＧＦ－β ＲＩＩ－ｈＦｃ（カタログ番号：ＣＣ１０、Novoprotein Scientific Inc.）の各々をＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ番号：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流した。組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質及び組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）を６０ｎＭの濃度で移動相として使用した。結合時間を３００秒間、解離時間を３００秒間とした。アッセイが終了した後、ブランク対照の応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした後、抗原－抗体結合の動態パラメーターを算出した。結果を表４に提示する。示されるように、ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦ－β１に対する二官能性タンパク質Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩ、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ１、Ｈ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＨ１８２－ＭＵＴ４－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ３の親和性は、ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦ－β１に対するＨ１８２－ＭＵＴ４及びＴＧＦ－β ＲＩＩ－ｈＦｃの親和性とは明らかには異ならなかった。
【0080】
【表4】
【0081】
実施例６：抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディ／ＴＧＦ－β ＲＩＩ融合タンパク質突然変異体の設計及び発現
ＰＣＲ法を用いて、ヒト化抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディｈｚＦ２（中国特許出願第２０２０１０３２４７６１．８号より）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を介して、ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）にＣ末端で連結し、ＰＤ－Ｌ１ナノボディ－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を含むｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２をコードする配列（配列番号２３）を得た。ヌクレオチド配列を、酵素消化部位を介してグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用のｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを大腸菌細胞に移入して増殖させ、融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の真核生物発現プラスミドを大量に単離し、得た。調製した真核生物発現プラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を安定発現する細胞を得た。細胞を培養して発現させ、精製し、融合タンパク質突然変異体ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を得た。
ＰＣＲ法を用いて、ヒト化抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディｈｚＦ２（中国特許出願第２０２０１０３２４７６１．８号より）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を介して、ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）にＣ末端で連結し、ＰＤ－Ｌ１ナノボディ－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を含むｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２をコードする配列（配列番号２３）を得た。ヌクレオチド配列を、酵素消化部位を介してグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を含む安定発現ベクターにクローニングし、安定トランスフェクション用のｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の真核生物発現ベクターを構築した。ベクターを大腸菌細胞に移入して増殖させ、融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の真核生物発現プラスミドを大量に単離し、得た。調製した真核生物発現プラスミドを懸濁培養液中のＣＨＯ－Ｋ１細胞に電気的にトランスフェクトし（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ、Lonza）、ＭＳＸ圧力スクリーニングによって融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を安定発現する細胞を得た。細胞を培養して発現させ、精製し、融合タンパク質突然変異体ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を得た。
【0082】
実施例７：融合タンパク質ｈｚＦ２ ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の純度検出
Ｍ７８２４及びｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を発現する細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。培養中期（１０日目）に細胞培養ブロスの一部を回収し、培養後期に細胞活性が２０％未満になった時点で残りの細胞培養ブロスを回収した（１５日目）。培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて精製した。次いで、精製した発現上清をタンパク質定量に供し、サブパッケージングして使用した。発現上清を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって検出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（図７）から、Ｍ７８２４の電気泳動ゲルには３つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、Ｍ７８２４の重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、Ｍ７８２４の軽鎖であり、タンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａの明確なタンパク質バンドは、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＭ７８２４の重鎖と推定されることが示された。培養時間の延長に伴い、切断したタンパク質のバンドの割合が増加した。対照的に、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の電気泳動ゲルでは、５０ｋＤａ～７０ｋＤａに１本の明確な主バンドがあり、他の明白なタンパク質バンドは見られなかった。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる同定結果を図８及び図９、並びに表５に示す。示されるように、Ｍ７８２４は低分子量のフラグメントの明確なピークを有していたが、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２では明らかに分解が減少した。
Ｍ７８２４及びｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を発現する細胞を流加培養にて培養し、細胞の密度及び活性について毎日観察した。培養中期（１０日目）に細胞培養ブロスの一部を回収し、培養後期に細胞活性が２０％未満になった時点で残りの細胞培養ブロスを回収した（１５日目）。培養ブロスの高速遠心分離によって上清を回収した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて精製した。次いで、精製した発現上清をタンパク質定量に供し、サブパッケージングして使用した。発現上清を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって検出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（図７）から、Ｍ７８２４の電気泳動ゲルには３つの明確なバンドがあり、そのうち７０ｋＤａ超の分子量を有するバンドは、Ｍ７８２４の重鎖が融合したタンパク質鎖であり、２０ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するバンドは、Ｍ７８２４の軽鎖であり、タンパク質マーカーの５０ｋＤａ～７０ｋＤａの明確なタンパク質バンドは、ＴＧＦ－β ＲＩＩが脱落したＭ７８２４の重鎖と推定されることが示された。培養時間の延長に伴い、切断したタンパク質のバンドの割合が増加した。対照的に、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の電気泳動ゲルでは、５０ｋＤａ～７０ｋＤａに１本の明確な主バンドがあり、他の明白なタンパク質バンドは見られなかった。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる同定結果を図８及び図９、並びに表５に示す。示されるように、Ｍ７８２４は低分子量のフラグメントの明確なピークを有していたが、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２では明らかに分解が減少した。
【0083】
【表5】
【0084】
実施例８：融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の親和性分析
抗体親和性は、FortebioのＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器上の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーで抗体Ｆｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによって検出した。アッセイのために、タンパク質（ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＭ７８２４）の各々をＰＢＳで４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ番号：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流した。組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ～２３８ａａ）及びヒトＴＧＦ－β１（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）を移動相として使用した。結合時間を３００秒間、解離時間を３００秒間とした。アッセイが終了した後、ブランク対照の応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした後、抗原－抗体結合の動態定数を算出した。
抗体親和性は、FortebioのＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器上の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーで抗体Ｆｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによって検出した。アッセイのために、タンパク質（ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＭ７８２４）の各々をＰＢＳで４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ番号：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流した。組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ～２３８ａａ）及びヒトＴＧＦ－β１（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）を移動相として使用した。結合時間を３００秒間、解離時間を３００秒間とした。アッセイが終了した後、ブランク対照の応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした後、抗原－抗体結合の動態定数を算出した。
【0085】
組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４の応答曲線を図１０及び図１１に示し、組換えヒトＴＧＦ－β１タンパク質に対するそれらの応答曲線を図１２及び図１３に示す。曲線をフィッティングし、親和性を算出した。結果から、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２が１．５８Ｅ－０９ＭのＫＤでＰＤ－Ｌ１に対する親和性、２．４６Ｅ－０９ＭのＫＤでＴＧＦ－β１に対する親和性を有し、Ｍ７８２４が３．２１Ｅ－０９ＭのＫＤでＰＤ－Ｌ１に対する親和性、２．８１Ｅ－０９ＭのＫＤでＴＧＦ－β１に対する親和性を有することが示された。詳細な動態パラメーターを下記表６に提示する。結果から、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２がヒトＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦ－β１の両方に対して高い親和性を有することが示された。
【0086】
【表6】
【0087】
実施例９：ＥＬＩＳＡによって検出した融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性
プレートに組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６１．２、１９ａａ～２３８ａａ）、ヒトＴＧＦ－β１（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）、ヒトＴＧＦ－β２（カタログ番号：ＣＪ７９、Novoprotein Scientific Inc.）及びヒトＴＧＦ－β３（カタログ番号：ＣＪ４４、Novoprotein Scientific Inc.）のそれぞれを、各タンパク質を１μｇ／ｍｌの濃度にし、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロッキングした。ＨｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌの初期濃度から３倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、これを続いて恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。５０００倍希釈のＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ番号：１０９－０３５－０９８、Jackson ImmunoResearch）をプレートに添加して４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質（カタログ番号：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）を添加して１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでのプレートの吸光度を読み取り、記録した。
プレートに組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６１．２、１９ａａ～２３８ａａ）、ヒトＴＧＦ－β１（カタログ番号：ＣＡ５９、Novoprotein Scientific Inc.）、ヒトＴＧＦ－β２（カタログ番号：ＣＪ７９、Novoprotein Scientific Inc.）及びヒトＴＧＦ－β３（カタログ番号：ＣＪ４４、Novoprotein Scientific Inc.）のそれぞれを、各タンパク質を１μｇ／ｍｌの濃度にし、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロッキングした。ＨｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌの初期濃度から３倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、これを続いて恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。５０００倍希釈のＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ番号：１０９－０３５－０９８、Jackson ImmunoResearch）をプレートに添加して４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質（カタログ番号：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）を添加して１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでのプレートの吸光度を読み取り、記録した。
【0088】
結果から、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２がヒトＰＤ－Ｌ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３に対して結合活性を有し、それがＭ７８２４と同等であり、５０％有効濃度（ＥＣ５０）値がそれぞれ０．２６１ｎＭ、０．３９４ｎＭ、１８．０４５ｎＭ及び１．１２１ｎＭであり、Ｍ７８２４がヒトＰＤ－Ｌ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３に対してそれぞれ０．２０９ｎＭ、０．４７２ｎＭ、１８．１７２ｎＭ及び０．９８１ｎＭの５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を有することが示された（図１４～図１７）。
【0089】
実施例１０：ＦＡＣＳによって検出した融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の結合活性
ヒトＰＤ－Ｌ１を自然発現するヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで添加した後、５％ＢＳＡを添加して室温で３０分間ブロッキングした。その後、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（１０ｎＭの初期濃度から３倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、これを続いて氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した後、２００倍希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（カタログ番号：Ｆ９５１２、Sigma）をプレートに添加し、その後氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した後、２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をフローサイトメーターによって測定した。
ヒトＰＤ－Ｌ１を自然発現するヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで添加した後、５％ＢＳＡを添加して室温で３０分間ブロッキングした。その後、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（１０ｎＭの初期濃度から３倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、これを続いて氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した後、２００倍希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（カタログ番号：Ｆ９５１２、Sigma）をプレートに添加し、その後氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有）で２回洗浄した後、２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をフローサイトメーターによって測定した。
【0090】
結果から、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１と結合する際のｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＭ７８２４の５０％有効濃度（ＥＣ５０）値がそれぞれ０．０７１７ｎＭ及び０．１９７ｎＭであることが示された（図１８）。
【0091】
実施例１１：ＥＬＩＳＡによって検出した融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の遮断活性
プレートに組換えヒトＰＤ－１－ｈＦｃタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、２１ａａ～１６７ａａ）を、１μｇ／ｍｌの濃度にし、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロッキングした。５０μｌのｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（６０ｎＭの初期濃度から１．５倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、続いて５０μＬのＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ～２３８ａａ）を１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。次いで、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。５０００希釈のＨＲＰ－抗マウスＦｃ（カタログ番号：１１５－０３５－０７１、Jackson ImmunoResearch）をプレートに添加して４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質（カタログ番号：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）を添加して１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでのプレートの吸光度を読み取り、記録した。
プレートに組換えヒトＰＤ－１－ｈＦｃタンパク質（アクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２、２１ａａ～１６７ａａ）を、１μｇ／ｍｌの濃度にし、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間、５％ＢＳＡでブロッキングした。５０μｌのｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４、並びにアイソタイプ対照ＮＣ－ｈＩｇＧ１（６０ｎＭの初期濃度から１．５倍段階希釈して得た１２濃度の希釈物）をプレートに添加し、続いて５０μＬのＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（アクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１、１９ａａ～２３８ａａ）を１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。次いで、プレートを恒温インキュベーターにて３７℃で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。５０００希釈のＨＲＰ－抗マウスＦｃ（カタログ番号：１１５－０３５－０７１、Jackson ImmunoResearch）をプレートに添加して４５分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質（カタログ番号：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）を添加して１５分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでのプレートの吸光度を読み取り、記録した。
【0092】
結果から、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２が組換えヒトＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との結合を効果的に遮断し得ることが示された。ヒトＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との結合に対するｈｚＦ２ｍ９－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びＭ７８２４の競合阻害効果をＥＬＩＳＡによって検出し、それらの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値は、それぞれ７．５３３ｎＭ及び６．９３５ｎＭであった（図１９）。
【0093】
実施例１２：ＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ１との結合を遮断する融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の細胞学的活性の観察
ヒトＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＤ３－ＳｃＦｖを組換え発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ、JIANGSU T-MAB BIOPHARMA CO., LTD.）を９６ウェルプレート（カタログ番号：３９１７、Corning）に５０００細胞／ウェルで接種し、細胞インキュベーターにて一晩インキュベートした後、上清を捨てた。ＨｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４（５μｇ／ｍｌの初期濃度から２．５倍段階希釈して得た８濃度の希釈物）（２５μＬ／ウェル）、並びにヒトＰＤ－１及びルシフェラーゼを組換え発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ、JIANGSU T-MAB BIOPHARMA CO., LTD.）の５０μＬの懸濁液（１×１０６細胞／ｍＬ）をプレートに添加し、これを細胞インキュベーターにて６時間インキュベートした。Ｂｉｏ－Ｔｕｒｂｏホタルルシフェラーゼ基質（カタログ番号：ＲＡ－ＧＬ０３、RHINOZYME BIOTECHNOLOGY）をプレートに１２５μＬ／ウェルで添加し、プレートをマイクロプレート恒温オシレーターに入れ、暗所にて８００ｒｐｍで５分間インキュベートした。多機能マイクロプレートリーダーを発光モード下で動作するよう設定し、解釈を５００（機器のデフォルト値）とした。ＲＬＵ値を読み取り、検出結果を図２０に示す。示されるように、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４は、それぞれ１０．１２２ｎＭ及び８．５３７ｎＭのＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１経路に対する遮断効果を示した。
ヒトＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＤ３－ＳｃＦｖを組換え発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ、JIANGSU T-MAB BIOPHARMA CO., LTD.）を９６ウェルプレート（カタログ番号：３９１７、Corning）に５０００細胞／ウェルで接種し、細胞インキュベーターにて一晩インキュベートした後、上清を捨てた。ＨｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４（５μｇ／ｍｌの初期濃度から２．５倍段階希釈して得た８濃度の希釈物）（２５μＬ／ウェル）、並びにヒトＰＤ－１及びルシフェラーゼを組換え発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ、JIANGSU T-MAB BIOPHARMA CO., LTD.）の５０μＬの懸濁液（１×１０６細胞／ｍＬ）をプレートに添加し、これを細胞インキュベーターにて６時間インキュベートした。Ｂｉｏ－Ｔｕｒｂｏホタルルシフェラーゼ基質（カタログ番号：ＲＡ－ＧＬ０３、RHINOZYME BIOTECHNOLOGY）をプレートに１２５μＬ／ウェルで添加し、プレートをマイクロプレート恒温オシレーターに入れ、暗所にて８００ｒｐｍで５分間インキュベートした。多機能マイクロプレートリーダーを発光モード下で動作するよう設定し、解釈を５００（機器のデフォルト値）とした。ＲＬＵ値を読み取り、検出結果を図２０に示す。示されるように、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照タンパク質Ｍ７８２４は、それぞれ１０．１２２ｎＭ及び８．５３７ｎＭのＥＣ５０値でＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１経路に対する遮断効果を示した。
【0094】
【表7】
【0095】
実施例１３：ヒト咽頭扁平上皮癌Ｆａｄｕ細胞を皮下移植したＰＢＭＣ免疫再構築マウスのモデルにおける融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の抗腫瘍効力の評価
５週齢～６週齢の雄性ＮＣＧマウスの右脇腹にヒト咽頭扁平上皮癌（ＦａＤｕ）細胞を５×１０６細胞／０．１ｍＬの濃度で皮下接種し、ヒトＰＢＭＣをマウスに２×１０６細胞／マウスで接種した。腫瘍が４０ｍｍ３～６０ｍｍ３に成長した時点で、腫瘍体積が要件を満たすマウスを各群６匹のマウスで無作為に２群に分けた後、それぞれｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１を投与した。投与スケジュールを表８に提示する。結果を図２１及び図２２に示す。示されるように、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２は、腫瘍成長を有意に阻害し、明確な抗腫瘍効力を有し、５３％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ；腫瘍重量）率を達成した。
５週齢～６週齢の雄性ＮＣＧマウスの右脇腹にヒト咽頭扁平上皮癌（ＦａＤｕ）細胞を５×１０６細胞／０．１ｍＬの濃度で皮下接種し、ヒトＰＢＭＣをマウスに２×１０６細胞／マウスで接種した。腫瘍が４０ｍｍ３～６０ｍｍ３に成長した時点で、腫瘍体積が要件を満たすマウスを各群６匹のマウスで無作為に２群に分けた後、それぞれｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及びアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１を投与した。投与スケジュールを表８に提示する。結果を図２１及び図２２に示す。示されるように、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２は、腫瘍成長を有意に阻害し、明確な抗腫瘍効力を有し、５３％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ；腫瘍重量）率を達成した。
【0096】
【表8】
【0097】
実施例１４：ＨＣＣ８２７細胞を皮下接種したヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスの腫瘍モデルにおける融合タンパク質ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２の抗腫瘍活性の評価
ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株を回収及び培養し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにてＲＭＰＩ １６４０培地（不活性化１０％ＦＢＳを添加）中で培養及び継代した。対数増殖期の腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍接種に使用した。２０匹の適格な雌性ヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスに、１週間の適応給餌後にヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞を接種し、腫瘍細胞の接種後の腫瘍体積及び体重について観察した。腫瘍体積が１２０ｍｍ３～２００ｍｍ３のマウスを選択し、腫瘍体積及び体重に応じて各群５匹のマウスで無作為に３群に分けた。群分け当日に投与を開始し、投与開始日を０日目とみなした。投与スケジュール及び群分け情報を表９に提示する。本実験では、それぞれ単独で投与した、等モル量の試験ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照薬物アテゾリズマブの抗腫瘍効力を、ＨＣＣ８２７細胞を皮下接種したヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスの腫瘍モデルにおいて検出した。結果から、単独で投与した場合に８ｍｇ／ｋｇのｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び１０ｍｇ／ｋｇのアテゾリズマブがどちらも強い効力を示し、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を投与した群では、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ；腫瘍体積）率が８０％超に達し、アテゾリズマブを投与した場合よりも優れていることが示された（図２３及び表１０）。
ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株を回収及び培養し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにてＲＭＰＩ １６４０培地（不活性化１０％ＦＢＳを添加）中で培養及び継代した。対数増殖期の腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍接種に使用した。２０匹の適格な雌性ヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスに、１週間の適応給餌後にヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞を接種し、腫瘍細胞の接種後の腫瘍体積及び体重について観察した。腫瘍体積が１２０ｍｍ３～２００ｍｍ３のマウスを選択し、腫瘍体積及び体重に応じて各群５匹のマウスで無作為に３群に分けた。群分け当日に投与を開始し、投与開始日を０日目とみなした。投与スケジュール及び群分け情報を表９に提示する。本実験では、それぞれ単独で投与した、等モル量の試験ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び対照薬物アテゾリズマブの抗腫瘍効力を、ＨＣＣ８２７細胞を皮下接種したヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞ヒト化マウスの腫瘍モデルにおいて検出した。結果から、単独で投与した場合に８ｍｇ／ｋｇのｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２及び１０ｍｇ／ｋｇのアテゾリズマブがどちらも強い効力を示し、ｈｚＦ２－ＴＧＦ－β ＲＩＩｍ２を投与した群では、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ；腫瘍体積）率が８０％超に達し、アテゾリズマブを投与した場合よりも優れていることが示された（図２３及び表１０）。
【0098】
【表9】
【0099】
【表10】
【0100】
本発明の実施形態に関する以上の説明は、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で本発明に種々の変更及び修正を加えることができ、これは添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】