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特表2023-534879Ｎ－アセチルグルコサミン産生菌株並びにその構築方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-14
(54)【発明の名称】Ｎ－アセチルグルコサミン産生菌株並びにその構築方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230804BHJP
C12P 19/02 20060101ALI20230804BHJP
C12N 15/74 20060101ALN20230804BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P19/02
C12N15/74 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023505387
(86)(22)【出願日】2020-08-17
(85)【翻訳文提出日】2023-03-22
(86)【国際出願番号】 CN2020109480
(87)【国際公開番号】W WO2022016641
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】202010725842.9
(32)【優先日】2020-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507190994
【氏名又は名称】上海交通大学
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯ ＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】８００ Ｄｏｎｇｃｈｕａｎ Ｒｄ．，Ｍｉｎｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００２４０，Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】523026916
【氏名又は名称】安徽銀創生物科技股▲ふん▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シュイ、ピン
(72)【発明者】
【氏名】ウー、ユイトン
(72)【発明者】
【氏名】タオ、フェイ
(72)【発明者】
【氏名】シャン、ハイタオ
(72)【発明者】
【氏名】ムー、シアオリン
(72)【発明者】
【氏名】チャン、イー
(72)【発明者】
【氏名】トアン、チョンユエ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF02
4B064CA19
4B064CC06
4B064CC24
4B064CD02
4B064CD09
4B064CD20
4B064CD30
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA15X
4B065AA15Y
4B065AA49X
4B065AA80Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB02
4B065BB03
4B065BB15
4B065BB19
4B065BB29
4B065BC09
4B065BC12
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
(57)【要約】
Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変菌株並びにその構築方法及び使用に関する。前記遺伝子改変菌株は、４０℃～５０℃の条件下でＮ－アセチルグルコサミンを発酵させることができる。親細菌由来のグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼの遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼの遺伝子、及びＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質の遺伝子をノックアウトすることによって、Ｎ－アセチルグルコサミン異化経路が遮断される。さらに、グルコサミン－６－リン酸シンターゼの過剰発現遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの過剰発現遺伝子を導入して、Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞外蓄積及び４０℃以上でのＮ－アセチルグルコサミンの高温発酵を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株であって、４０℃～５０℃の条件下でＮ－アセチルグルコサミンを発酵させることを特徴とする、前記遺伝子改変株。
【請求項2】
前記遺伝子改変株の原株がサーモフィルス菌であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項3】
前記遺伝子改変株の原株がバチルス属菌であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項4】
前記遺伝子改変株の原株が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、好熱性バチルス・イヌリヌス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、又はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項5】
前記遺伝子改変株の原株がバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ １４５８０であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項6】
前記遺伝子改変株が、２０２０年３月１４日に中国培養系統保存機関（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＣＣＴＣＣ番号Ｍ２０２００５４として寄託された、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＮＧＳ１であることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項7】
前記遺伝子改変株の原株におけるＮ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルグルコサミン中間体の異化経路及び細胞内輸送経路が遮断されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子改変株。
【請求項8】
前記Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルグルコサミン中間体の異化経路が、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼのｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子並びにＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼのｎａｇＡ遺伝子のうちの１又は複数の不活性化若しくは欠失によって遮断され、前記Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞内輸送経路が、Ｎ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質のｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子の一方又は両方の不活性化若しくは欠失によって遮断されていることを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子改変株。
【請求項9】
グルコサミン－６－リン酸シンターゼの過剰発現遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの過剰発現遺伝子が、前記遺伝子改変株に導入されていることを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子改変株。
【請求項10】
前記グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの遺伝子配列は配列番号１に示す通りであることを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子改変株。
【請求項11】
前記グルコサミン－６－リン酸シンターゼの遺伝子配列は配列番号２に示す通りであることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変株。
【請求項12】
請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変株の構築方法であって、原株のＮ－アセチルグルコサミン異化経路におけるグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼの遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼの遺伝子、及びＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質の遺伝子のうちの１又は複数を不活性化又は欠失させること、並びにグルコサミン－６－リン酸シンターゼの過剰発現遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの過剰発現遺伝子を導入すること、を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項13】
ステップＡ．前記原株のグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼのｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼのｎａｇＡ遺伝子、並びにＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質のｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子をノックアウトすることによって、ノックアウト株を得るステップ、ステップＢ．グルコサミン－６－リン酸シンターゼのｇｌｍＳ遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼのＧＮＡ１遺伝子の両方を含む二重発現ベクターを構築するステップ、並びに
ステップＣ．ステップＡで得られた前記ノックアウト株に前記二重発現ベクターを導入することにより、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する前記遺伝子改変株を得るステップ
を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
プロモーターを導入し、前記プロモーターと前記ｇｌｍＳ遺伝子及び前記ＧＮＡ１遺伝子とが直列である発現ベクターを発現させることによって、前記二重発現ベクターを構築することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記発現ベクターがｐＨＹ３００ＰＬＫであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記プロモーターが、Ｐａｌｓ、Ｐ４３、Ｐｓｔ、及びＰａｐｒｅであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｐａｌｓプロモーターの配列は配列番号３に示す通りであり、前記Ｐ４３プロモーターの配列は配列番号４に示す通りであり、前記Ｐｓｔプロモーターの配列は配列番号５に示す通りであり、及び前記Ｐａｐｒｅプロモーターの配列は配列番号６に示す通りである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記グルコサミン－６－リン酸シンターゼのｇｌｍＳ遺伝子が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、好熱性バチルス・イヌリヌス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、又はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
前記グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼのＧＮＡ１遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイヴェロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、又はナドソニア・フルベセンス（Ｎａｄｓｏｎｉａ ｆｕｌｖｅｓｃｅｎｓ）に由来することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項20】
前記原株がバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ １４５８０であることを特徴とする、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項21】
Ｎ－アセチルグルコサミンの生産に使用されることを特徴とする、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変株の使用。
【請求項22】
前記生産の発酵温度が４０℃～５０℃であることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記生産において利用される炭素源が、グルコース、グリセロール、キシロース、又はアラビノースであることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項24】
前記生産が、１）種培養：前記遺伝子改変株を種培地に接種し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して種を活性化するステップ、
２）振盪フラスコ培養：ステップ１）で活性化した種を５％の接種率で発酵培地を含む振盪フラスコに移し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して二次活性化するステップ、並びに
３）発酵培養：ステップ３）で二次活性化した種を接種率４％で発酵槽に移し、テトラサイクリン耐性を付与し、炭素源を添加して４０℃～５０℃で流加発酵を行い、発酵が終了するまで培養するステップ
を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項25】
ステップ１）における前記種培地が、以下の成分：ペプトン、酵母粉末、及び塩化ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項26】
ステップ２）における前記発酵培地が、以下の成分：酵母粉末、ペプトン、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウム三水和物、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項27】
ステップ３）における前記発酵培地が、以下の成分：酵母粉末、コーンスティープリカー粉末、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウム三水和物、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項28】
ステップ３）における発酵条件が、３ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液及び２５容量％のアンモニア溶液を使用して７．０に維持されたｐＨ値、１．５ｖｖｍの通気量、６００ｒｐｍの初期撹拌速度、グルコースが３～４ｇ／Ｌ消費された時点でグルコースを補充することにより３０ｇ／Ｌに継続的に調節されるグルコース濃度である、請求項２４に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物工学の分野に関し、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株並びにその構築方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
生物における様々な多糖類の構成単位であるＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、グルコースのヒドロキシル基をアミノ基で置換することによって形成され、特に甲殻類の外骨格に豊富に含まれており、食品業界、医薬品業界、及び化粧品業界において広く使用されている。食品業界では、食品の酸化防止剤、乳幼児向け食品の添加物、及び糖尿病患者向けの甘味料として使用され得る。医薬品業界では、新規生化学薬品として、リウマチ及び関節リウマチの治療に臨床的に使用されている。他の重要な用途は、ヒトの免疫系の機能を強化し、癌細胞又は線維芽細胞の過剰な増殖を抑制し、がん及び悪性腫瘍を抑制又は治療することである。また、Ｎ－アセチルグルコサミンは、変形性関節症及び関節痛にも治療効果を有する。化粧品業界では、ヒアルロン酸を生成するためにＤ－グルクロン酸高分子ムコ多糖類で形成することができる。この用途は、幅広い市場の可能性を有することが期待されている。
【0003】
Ｎ－アセチルグルコサミンは、主に化学的、酵素的、及び微生物的な発酵アプローチによって生成される。化学的アプローチは、キチンの酸加水分解からＮ－アセチルグルコサミンを得ることである。カニ及びエビの甲羅からキチンを抽出し、酸加水分解によりグルコサミンを生成することが含まれる。続いて、Ｎ－アセチルグルコサミンは、濃塩酸によって直接的に加水分解及び脱アセチル化され、グルコサミンになる。無水酢酸は、グルコサミンをＮ－アセチルグルコサミンにアセチル化するために使用され得る。しかしながら、このアプローチは環境に配慮したものではなく、汚染度が高く、魚介類アレルギーの患者を除外するものである。化学的アプローチと比較して、酵素的及び微生物的な発酵アプローチはどちらも環境に配慮したものである。しかしながら、酵素的アプローチは、キチンの分解及びＮ－アセチルグルコサミンの合成を触媒するための酵素の使用を含み、基質としてのエビ及びカニの甲羅の高度な前処理の複雑さ、主な酵素の活性の低さ、及び生成物の分離及び精製の困難さによって制限され、大量生産することが非常に困難である。微生物発酵は、現在、Ｎ－アセチルグルコサミンを生産するための最も有望な方法であり、本発明が関係する分野における研究の焦点でもある。
【0004】
４０℃以下の低温発酵と比較して、高温発酵は、混入のリスクを最小限に抑え、原料の変換を高速化し、熱交換のコストを削減するなどの利点がある。代謝的に改変された微生物によるＮ－アセチルグルコサミンの生産に関するこれまでの全ての報告は、３８℃以下の発酵温度を利用しており、Ｎ－アセチルグルコサミンの高温生産に関する特許又は報告は依然として存在しない。したがって、Ｎ－アセチルグルコサミンを高温で高収率で生産可能な低コストで堅牢な微生物プラットフォ－ムを開発する必要がある。バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの好熱菌は、高温条件下（４０℃以上）で増殖し、有機炭素源（グルコース、キシロース、アラビノースなど）を発酵に利用することができる。例えば、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．リケニフォルミス）ＡＴＣＣ １４５８０は、通性嫌気性のグラム陽性内生胞子形成細菌であり、様々な五炭糖及び六炭糖を利用することができ、細胞増殖速度が速いため、発酵サイクルを短くする必要がある。この細菌は安定した遺伝子操作を可能とし、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって「一般に安全とみなされている」（ＧＲＡＳ）株として認められている。さらに、この菌株は５０℃もの高温で発酵し得る。これらの利点は、ＡＴＣＣ １４５８０が理想的なプラットフォ－ム株として使用できることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記課題を解決するために、本発明は、高温条件下でＮ－アセチルグルコサミンを産生可能な遺伝子改変株並びにその構築方法及び使用を提供する。好熱性Ｂ．リケニフォルミス株を例に取ると、本発明によれば、Ｂ．リケニフォルミス株からＮ－アセチルグルコサミン異化経路が除去されてＮ－アセチルグルコサミン産生代謝経路が導入され、Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞外蓄積及び高温条件下でのＮ－アセチルグルコサミンの効率的な生産が可能になる。本発明で提案される菌株構築概念は、様々な産物の高温生産のための菌株を開発するために利用することができる。提案される菌株及び発酵プロセスは、産業用高温Ｎ－アセチルグルコサミン発酵における良好な応用の可能性を有する。
【0006】
本発明のある態様では、４０℃～５０℃の条件下でＮ－アセチルグルコサミンを発酵させ得る、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株が提供される。
【0007】
さらに、遺伝子改変株の原株は、サーモフィルス菌である。
【0008】
さらに、遺伝子改変株の原株は、バチルス属菌である。
【0009】
好ましくは、遺伝子改変株の原株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、好熱性バチルス・イヌリヌス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、又はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などである。
【0010】
好ましくは、遺伝子改変株の原株は、ＡＴＣＣのウェブサイトから直接入手可能な、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ １４５８０である。
【0011】
さらに、遺伝子改変株は、２０２０年３月１４日に中国培養系統保存機関（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＣＣＴＣＣ番号Ｍ２０２００５４として寄託された、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＮＧＳ１である。
【0012】
さらに、遺伝子改変株の原株におけるＮ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルグルコサミン中間体の異化経路及び細胞内輸送経路が遮断されている。
【0013】
好ましくは、Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルグルコサミン中間体の異化経路が、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼのｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子並びにＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼのｎａｇＡ遺伝子のうちの１又は複数の不活性化若しくは欠失によって遮断され、Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞内輸送経路が、Ｎ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質のｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子の一方又は両方の不活性化若しくは欠失によって遮断されている。
【0014】
さらに、グルコサミン－６－リン酸シンターゼの過剰発現遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの過剰発現遺伝子が、遺伝子改変株に導入されている。
【0015】
さらに、グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの遺伝子配列は、配列番号１に示す通りであり、及びグルコサミン－６－リン酸シンターゼの遺伝子配列は、配列番号２に示す通りである。
【0016】
好ましくは、グルコサミン－６－リン酸シンターゼの遺伝子は、Ｂ．リケニフォルミスの全ゲノムのＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）を鋳型として用いたＰＣＲ増幅から得られ得る。
【0017】
好ましくは、グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１１７９９４９）によるコドン最適化を用いた全ゲノム合成によって得られ得る。
【0018】
本発明の別の態様では、上記で定義した遺伝子改変株を構築する方法が提供される。特定の一実施形態では、前記方法は、原株のＮ－アセチルグルコサミン異化経路におけるグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼの遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼの遺伝子、及びＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質の遺伝子のうちの１又は複数を不活性化又は欠失させること、並びにグルコサミン－６－リン酸シンターゼの過剰発現遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼの過剰発現遺伝子を導入することを含む。
【0019】
さらに、前記方法は、
Ａ．前記原株のグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼのｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼのｎａｇＡ遺伝子、並びにＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質のｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子をノックアウトすることによって、ノックアウト株を得るステップ、
Ｂ．グルコサミン－６－リン酸シンターゼのｇｌｍＳ遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼのＧＮＡ１遺伝子の両方を含む二重発現ベクターを構築するステップ、並びに
Ｃ．ステップＡで得られた前記ノックアウト株に前記二重発現ベクターを導入することにより、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株を得るステップ
を含む。
Ａ．前記原株のグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼのｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼのｎａｇＡ遺伝子、並びにＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質のｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子をノックアウトすることによって、ノックアウト株を得るステップ、
Ｂ．グルコサミン－６－リン酸シンターゼのｇｌｍＳ遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼのＧＮＡ１遺伝子の両方を含む二重発現ベクターを構築するステップ、並びに
Ｃ．ステップＡで得られた前記ノックアウト株に前記二重発現ベクターを導入することにより、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株を得るステップ
を含む。
【0020】
さらに、プロモーターを導入し、前記プロモーターとｇｌｍＳ遺伝子及びＧＮＡ１遺伝子とが直列である発現ベクターを発現させることによって、二重発現ベクターを構築する。
【0021】
好ましくは、発現ベクターは、ｐＨＹ３００ＰＬＫである。
【0022】
好ましくは、プロモーターは、Ｐａｌｓ、Ｐ４３、Ｐｓｔ、及びＰａｐｒｅである。
【0023】
好ましくは、Ｐａｌｓプロモーターの配列は配列番号３に示す通りであり、Ｐ４３プロモーターの配列は配列番号４に示す通りであり、Ｐｓｔプロモーターの配列は配列番号５に示す通りであり、及びＰａｐｒｅプロモーターの配列は配列番号６に示す通りである。
【0024】
好ましくは、グルコサミン－６－リン酸シンターゼのｇｌｍＳ遺伝子は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、好熱性バチルス・イヌリヌス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、又はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などに由来する。
【0025】
好ましくは、グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼのＧＮＡ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はクルイヴェロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）若しくはナドソニア・フルベセンス（Ｎａｄｓｏｎｉａ ｆｕｌｖｅｓｃｅｎｓ）などの同じ機能を有する好熱性酵素を産生する別の微生物由来である。
【0026】
好ましくは、原株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ １４５８０である。
【0027】
本発明のさらなる態様では、特にＮ－アセチルグルコサミン生産のための、上記で定義した遺伝子改変株の使用が提供される。
【0028】
さらに、生産の発酵温度は、２５℃～５０℃である。
【0029】
好ましくは、生産の発酵温度は、４０℃～５０℃である。
【0030】
さらに、生産において利用される炭素源は、グルコース、グリセロール、キシロース、又はアラビノースなどである。
【0031】
さらに、遺伝子改変株の種培養から種培養物が得られ、続いて炭素源としてグルコースを使用する発酵培地中で二次活性化が行われる。最後に、Ｎ－アセチルグルコサミンの発酵のために発酵槽に移される。具体的には、以下のステップが含まれる。
１）種培養：遺伝子改変株を種培地に接種し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して種を活性化するステップ、
２）振盪フラスコ培養：ステップ１）で活性化した種を５％の接種率で発酵培地を含む振盪フラスコに移し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して二次活性化するステップ、並びに
３）発酵培養：上記を接種率４％で発酵槽に移し、テトラサイクリン耐性を付与し、炭素源を添加して４０℃～５０℃で流加発酵を行い、発酵が終了するまで培養するステップが含まれる。
１）種培養：遺伝子改変株を種培地に接種し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して種を活性化するステップ、
２）振盪フラスコ培養：ステップ１）で活性化した種を５％の接種率で発酵培地を含む振盪フラスコに移し、テトラサイクリン耐性を付与し、５０℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間培養して二次活性化するステップ、並びに
３）発酵培養：上記を接種率４％で発酵槽に移し、テトラサイクリン耐性を付与し、炭素源を添加して４０℃～５０℃で流加発酵を行い、発酵が終了するまで培養するステップが含まれる。
【0032】
好ましくは、ステップ１）の種培地は、以下の成分：ペプトン、酵母粉末、及び塩化ナトリウムを含む。好ましくは、種培地は、１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母粉末、及び１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む。
【0033】
好ましくは、ステップ２）における発酵培地は、以下の成分：酵母粉末、ペプトン、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウム三水和物、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを含む。好ましくは、１２ｇ／Ｌの酵母粉末、６ｇ／Ｌのペプトン、６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１８．７５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、２．５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、及び３０ｇ／Ｌのグルコースを含む。
【0034】
好ましくは、ステップ２）において、振盪フラスコは、５００ｍＬ三角フラスコであり、発酵培地は７５ｍＬ含まれている。
【0035】
好ましくは、ステップ３）における発酵培地は、以下の成分：酵母粉末、コーンスティープリカー粉末、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウム三水和物、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを含む。好ましくは、発酵培地は、１２ｇ／Ｌの酵母粉末、６ｇ／Ｌのコーンスティープリカー粉末、６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１８．７５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、２．５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、及び３０ｇ／Ｌのグルコースを含む。
【0036】
好ましくは、ステップ３）における発酵条件は、３ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）のアンモニア溶液を使用して７．０に維持されたｐＨ値、１．５ｖｖｍの通気量、６００ｒｐｍの初期撹拌速度、グルコースが３～４ｇ／Ｌ消費された時点でグルコースを補充することにより３０ｇ／Ｌに継続的に調節されるグルコース濃度である。
【0037】
本出願で提供される遺伝子改変株は、Ｎ－アセチルグルコサミンの高温生産を可能にする。さらに、遺伝子改変株の発酵時、構成的発現のため、誘導物質の添加は省略される。さらに、発酵プロセスはほとんど温度低下を必要とせず、発酵は高温で大幅に増加した速度で進行することができる。また、高温により他の微生物の増殖が抑制されるため、開放発酵が可能となり、生産コストを効果的に抑えることができる。本発明は、４０℃～５０℃の比較的高温でのＮ－アセチルグルコサミンの発酵を可能にし、産業上の利用価値が高い。本発明で提案される菌株構築概念は、様々な産物の高温生産のための菌株を開発するために利用することができる。提案される菌株及び発酵プロセスは、産業用高温Ｎ－アセチルグルコサミン発酵における良好な応用の可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】改変Ｂ．リケニフォルミス株におけるＮ－アセチルグルコサミン合成及び代謝経路を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本明細書に記載の改変株のＮ－アセチルグルコサミン合成及び代謝経路は、図１に示される通りであり、グルタミン（Ｇｌｎ）はアミノ酸供与体として機能し、ｇｌｍＳ遺伝子によってコードされるグルコサミン合成酵素はフルクトース－６－リン酸（Ｆ－６－Ｐ）をグルコサミン－６－リン酸（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）に変換し、次にグルコサミン－６－リン酸アセチラーゼ（ＧＮＡ１）の作用下でＮ－アセチル－グルコサミン－６－リン酸（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）に変換される。ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐは、ホスホリラーゼの触媒作用により脱リン酸化されてＮ－アセチルグルコサミンになり、細胞外に分泌される。グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼをコードするｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子並びにＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼをコードするｎａｇＡ遺伝子が不活性化されるようにノックアウトされるか、又はＮ－アセチルグルコサミンの前駆体が細胞内であまり消費されないようノックアウトされる。さらに、Ｎ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質をコードするｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子がノックアウトされるので、改変株で産生されたＮ－アセチルグルコサミンは、輸送されず、細胞外に高濃度で蓄積することになる。
【0040】
本明細書によれば、好熱性Ｂ．リケニフォルミス株においてＮ－アセチルグルコサミンの高温発酵のための代謝経路が確立され、ここで、Ｎ－アセチルグルコサミンの合成に関与する律速酵素をコードする遺伝子の発現が増強され、Ｎ－アセチルグルコサミンの消費及び逆拡散を引き起こし得る遺伝子が不活性化又はノックアウトされている。Ｎ－アセチルグルコサミンの消費及び逆拡散を阻害することにより、改変株によって産生されたＮ－アセチルグルコサミンが高濃度に蓄積することが可能になる。
【0041】
本発明のある態様では、Ｎ－アセチルグルコサミンを産生する遺伝子改変株が提供される。この遺伝子改変株は、４０℃～５０℃でＮ－アセチルグルコサミンを発酵させ得る。
【0042】
特定の一実施形態では、遺伝子改変株の原株におけるＮ－アセチルグルコサミン異化経路が遮断される。
【0043】
別の一実施形態では、Ｎ－アセチルグルコサミン異化経路は、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼをコードするｎａｇＢ遺伝子及びｇａｍＡ遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼをコードするｎａｇＡ遺伝子、並びにＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質をコードするｇａｍＰ遺伝子及びｎａｇＰ遺伝子のうちの１又は複数の不活性化又は欠失の結果として、遮断される。
【0044】
本明細書で使用される場合、「遮断」という用語は、経路に必要な１又は複数の触媒酵素をコードする遺伝子を不活性化又は欠失させることによって経路を実行できなくすることを含む、様々な遺伝子工学的アプローチによって経路を遮断することを指す。
【0045】
原株が、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼの遺伝子、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼの遺伝子、及びＮ－アセチルグルコサミン輸送体タンパク質の遺伝子などが欠失又は不活性化された遺伝子、又はさらには遮断された経路を含まないことも不可能であることを当業者は理解するであろう。この場合、遺伝子又は経路が存在しないため、遺伝子改変株の構築には、遺伝子操作によって達成される不活性化、欠失、又は遮断は含まれない。
【実施例】
【0046】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに説明する。
【0047】
以下の実施例は例示であり、いかなる意味においても本発明の保護範囲を限定するものではない。以下の実施例の説明において参照される実験方法は、特に断りのない限り、すべて従来の方法である。以下の実施例の説明で参照される材料及び試薬などは、特に断りのない限り、商業的供給源から入手可能である。
【0048】
実施例１：Ｂ．リケニフォルミスｎａｇＰ遺伝子のノックアウト
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＰ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
【化1】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＰ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
【0049】
２．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＰ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【化2】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＰ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【0050】
３．２種類のＰＣＲ産物を精製した後、それぞれ１μＬを鋳型として採取し、シームレスクローニング技術を使用してｐＫＶＭベクターに挿入した。その結果、△ｎａｇＰノックアウトｐＫＶＭベクターを得た。
【0051】
４．前記△ｎａｇＰノックアウトｐＫＶＭベクターを、大腸菌Ｓ１７－１に形質転換し、Ｂ．リケニフォルミスとの接合伝達及び相同組換えによるｎａｇＰ遺伝子のノックアウトを行った。使用したプライマーは、以下のようであった。
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰを得た。
【化3】
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰを得た。
【0052】
実施例２：Ｂ．リケニフォルミスｇａｍＰ遺伝子の追加的ノックアウト
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＰ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
【化4】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＰ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
【0053】
２．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＰ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【化5】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＰ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【0054】
３．２種類のＰＣＲ産物を精製した後、それぞれ１μＬを鋳型として採取し、シームレスクローニング技術を使用してｐＫＶＭベクターに挿入した。その結果、△ｇａｍＰノックアウトｐＫＶＭベクターを得た。
【0055】
４．前記△ｇａｍＰノックアウトｐＫＶＭベクターを、大腸菌Ｓ１７－１に形質転換し、ノックアウトＢ．リケニフォルミス株ＭＷ３△ｎａｇＰとの接合伝達及び相同組換えによるｇａｍＰ遺伝子のノックアウトを行った。使用したプライマーは、以下のようであった。
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰを得た。
【化6】
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰを得た。
【0056】
実施例３：Ｂ．リケニフォルミスｇａｍＡ遺伝子の追加的ノックアウト
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＡ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
【化7】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＡ遺伝子の上流の８００ｂｐ断片を得た。
【0057】
２．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＡ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【化8】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇａｍＡ遺伝子の下流の８００ｂｐ断片を得た。
【0058】
３．２種類のＰＣＲ産物を精製した後、それぞれ１μＬを鋳型として採取し、シームレスクローニング技術を使用してｐＫＶＭベクターに挿入した。その結果、△ｇａｍＡノックアウトｐＫＶＭベクターを得た。
【0059】
４．前記△ｇａｍＡノックアウトｐＫＶＭベクターを、大腸菌Ｓ１７－１に形質転換し、ノックアウトＢ．リケニフォルミス株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰとの接合伝達及び相同組換えによるｇａｍＡ遺伝子のノックアウトを行った。使用したプライマーは、以下のようであった。
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡを得た。
【化9】
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡを得た。
【0060】
実施例４：Ｂ．リケニフォルミスｎａｇＡＢ遺伝子クラスターの追加的ノックアウト
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＡＢ遺伝子クラスターの上流の８００ｂｐ断片を得た。
１．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
【化10】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＡＢ遺伝子クラスターの上流の８００ｂｐ断片を得た。
【0061】
２．以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＡＢ遺伝子クラスターの下流の８００ｂｐ断片を得た。
【化11】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｎａｇＡＢ遺伝子クラスターの下流の８００ｂｐ断片を得た。
【0062】
３．２種類のＰＣＲ産物を精製した後、それぞれ１μＬを鋳型として採取し、シームレスクローニング技術を使用してｐＫＶＭベクターに挿入した。その結果、△ｎａｇＡＢノックアウトｐＫＶＭベクターを得た。
【0063】
４．前記△ｎａｇＡＢノックアウトｐＫＶＭベクターを、大腸菌Ｓ１７－１に形質転換し、ノックアウトＢ．リケニフォルミス株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡとの接合伝達及び相同組換えによるｎａｇＡＢ遺伝子クラスターのノックアウトを行った。使用したプライマーは、以下のようであった。
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢを得た。
【化12】
１６００ｂｐ断片の増幅が成功したことは、ダブルクロスオーバー陽性クローンのスクリーニングの成功、及び前記遺伝子のノックアウトの成功の兆候と考えられた。最終的に、ノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢを得た。
【0064】
実施例５：ＧＮＡ１－ｇｌｍＳ二重発現ベクターの構築
以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、Ｐａｌｓプロモーター配列を得た。
以下のプライマーを、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
【化13】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、Ｐａｌｓプロモーター配列を得た。
【0065】
Ｐ４３プロモーターを用いて全遺伝子合成を行った。使用したプライマーは、以下のように設計した。
さらに、ＰＣＲ増幅により、Ｐ４３プロモーター配列を得た。
【化14】
さらに、ＰＣＲ増幅により、Ｐ４３プロモーター配列を得た。
【0066】
Ｐｓｔプロモーターを用いて全遺伝子合成を行った。使用したプライマーは、以下のように設計した。
さらに、ＰＣＲ増幅により、Ｐｓｔプロモーター配列を得た。
【化15】
さらに、ＰＣＲ増幅により、Ｐｓｔプロモーター配列を得た。
【0067】
ＰａｐｒＥプロモーターを用いて全遺伝子合成を行った。使用したプライマーは、以下のように設計した。
さらに、ＰＣＲ増幅により、ＰａｐｒＥプロモーター配列を得た。
【化16】
さらに、ＰＣＲ増幅により、ＰａｐｒＥプロモーター配列を得た。
【0068】
グルコサミン－６－リン酸アセチラーゼをコードするＧＮＡ１遺伝子を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１１７９９４９）の全ゲノムから得た。コドン最適化による全遺伝子合成を行い、最適化したＧＮＡ１配列をＰＣＲ増幅により得た。使用したプライマーは、以下のように設計した。
【化17】
【0069】
プライマーは、Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００６２７０．３）の配列に従って設計した。
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇｌｍＳ遺伝子配列を得た。
【化18】
Ｂ．リケニフォルミスＭＷ３ゲノムのＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅により、ｇｌｍＳ遺伝子配列を得た。
【0070】
ＰＣＲ増幅から収集したＰａｌｓプロモーター配列、ＧＮＡ１、及びｇｌｍＳの３種類の遺伝子の断片を、各遺伝子について１μＬを採取し、シームレスクローニングによってｐＨＹ３００ＰＬＫベクターに挿入して、ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐａｌｓ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを構築した。
【0071】
ＰＣＲ増幅から収集したＰ４３プロモーター配列、ＧＮＡ１、及びｇｌｍＳの３種類の遺伝子の断片を、各遺伝子について１μＬを採取し、シームレスクローニングによってｐＨＹ３００ＰＬＫベクターに挿入して、ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐ４３－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを構築した。
【0072】
ＰＣＲ増幅から収集したＰｓｔプロモーター配列、ＧＮＡ１、及びｇｌｍＳの３種類の遺伝子の断片を、各遺伝子について１μＬを採取し、シームレスクローニングによってｐＨＹ３００ＰＬＫベクターに挿入して、ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐｓｔ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを構築した。
【0073】
ＰＣＲ増幅から収集したＰａｐｒＥプロモーター配列、ＧＮＡ１、及びｇｌｍＳの３種類の遺伝子の断片を、各遺伝子について１μＬを採取し、シームレスクローニングによってｐＨＹ３００ＰＬＫベクターに挿入して、ｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＰａｐｒＥ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを構築した。
【0074】
実施例６：改変株ＢＮＧＳ１、ＢＮＧＳ２、ＢＮＧＳ３、及びＢＮＧＳ４の構築
前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐａｌｓ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを、エレクトロポレーションによってノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢに導入した結果、Ｎ－アセチルグルコサミンを合成可能な新たなＢ．リケニフォルミス株が得られ、ＢＮＧＳ１と命名した。
前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐａｌｓ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを、エレクトロポレーションによってノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢに導入した結果、Ｎ－アセチルグルコサミンを合成可能な新たなＢ．リケニフォルミス株が得られ、ＢＮＧＳ１と命名した。
【0075】
前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐ４３－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを、エレクトロポレーションによってノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢに導入した結果、Ｎ－アセチルグルコサミンを合成可能な新たなＢ．リケニフォルミス株が得られ、ＢＮＧＳ２と命名した。
【0076】
前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｐｓｔ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを、エレクトロポレーションによってノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢに導入した結果、Ｎ－アセチルグルコサミンを合成可能な新たなＢ．リケニフォルミス株が得られ、ＢＮＧＳ３と命名した。
【0077】
前記ｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＰａｐｒＥ－ＧＮＡ１－ｇｌｍＳベクターを、エレクトロポレーションによってノックアウト株ＭＷ３△ｎａｇＰ△ｇａｍＰ△ｇａｍＡ△ｎａｇＡＢに導入した結果、Ｎ－アセチルグルコサミンを合成可能な新たなＢ．リケニフォルミス株が得られ、ＢＮＧＳ４と命名した。
【0078】
実施例７：組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の振盪フラスコ発酵
１．種培地及び発酵培地
種培地としてＬＢ培地（１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母粉末、及び１０ｇ／Ｌのペプトンを含む）を用いた。液体培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
１．種培地及び発酵培地
種培地としてＬＢ培地（１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母粉末、及び１０ｇ／Ｌのペプトンを含む）を用いた。液体培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
【0079】
発酵培地は以下の成分を含む：１２ｇ／Ｌの酵母粉末、６ｇ／Ｌのペプトン、６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１８．７５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、２．５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、及び３０ｇ／Ｌのグルコース。
【0080】
２．振盪フラスコ発酵のプロセス
ＢＮＧＳ１株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
ＢＮＧＳ１株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0081】
３．検出方法
カラム：Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ
移動相：０．００５ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：６０．０℃
注入量：２０．００μＬ
検出器：示差屈折率検出器
検出器温度：３５℃
カラム：Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ
移動相：０．００５ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：６０．０℃
注入量：２０．００μＬ
検出器：示差屈折率検出器
検出器温度：３５℃
【0082】
検出結果は、振盪フラスコ発酵の５０時間後、Ｎ－アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２．３ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0083】
実施例８：組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ２の振盪フラスコ発酵
ＢＮＧＳ２株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
ＢＮＧＳ２株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0084】
検出結果は、振盪フラスコ発酵の５０時間後、Ｎ－アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に１．５ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0085】
実施例９：組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ３の振盪フラスコ発酵
ＢＮＧＳ３株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
ＢＮＧＳ３株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0086】
検出結果は、振盪フラスコ発酵の５０時間後、Ｎ－アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に０．５７ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0087】
実施例１０：組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ４の振盪フラスコ発酵
ＢＮＧＳ４株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬの三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
ＢＮＧＳ４株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。振盪フラスコ発酵用の７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬの三角フラスコに５％の接種率で移した。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。発酵は４０℃で５０時間行い、１ｍＬの試料を採取して１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記試料を０．２２μｍの水性膜でろ過し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0088】
検出結果は、振盪フラスコ発酵の５０時間後、Ｎ－アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に０．３２ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0089】
実施例１１：１Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：ＢＮＧＳ１株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
１．種培養：ＢＮＧＳ１株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
【0090】
２．振盪フラスコ培養：５％の接種率で（５００ｍＬ振盪フラスコに含まれる）７５ｍＬの発酵培地に移した。振盪フラスコ培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。培養は、５０℃及び２００ｒｐｍで一晩行った。
【0091】
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で１Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0092】
検出結果は、発酵の７０時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に１２ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0093】
実施例１２：１Ｌ発酵槽における５０℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で１Ｌの全自動発酵槽に移し、５０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で１Ｌの全自動発酵槽に移し、５０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0094】
検出結果は、発酵の７０時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２．８ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0095】
実施例１３：５０Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0096】
検出結果は、発酵の６９．５時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に５０．９ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0097】
実施例１４：５０Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0098】
検出結果は、発酵の７３時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に５２．５ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0099】
実施例１５：５０Ｌ発酵槽における４０℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0100】
検出結果は、発酵の５４時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２８．１ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0101】
実施例１６：５０Ｌ発酵槽における４０℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0102】
検出結果は、発酵の５６時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に３４．６ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0103】
実施例１７：５０Ｌ発酵槽における４５℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0104】
検出結果は、発酵の５０時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２４ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0105】
実施例１８：５０Ｌ発酵槽における５０℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ１の流加発酵
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、５０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、５０℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0106】
検出結果は、発酵の２４時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に４．１ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0107】
実施例１９：５０Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ２の流加発酵
１．種培養：ＢＮＧＳ２株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
１．種培養：ＢＮＧＳ２株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
【0108】
２．振盪フラスコ培養：５％の接種率で（５００ｍＬ振盪フラスコに含まれる）７５ｍＬの発酵培地に移した。振盪フラスコ培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。培養は、５０℃及び２００ｒｐｍで一晩行った。
【0109】
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を付与し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0110】
検出結果は、発酵の６４時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２３．６ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0111】
実施例２０：５０Ｌ発酵槽における４５℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ２の流加発酵
１．種培養：実施例１９と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１９と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例１９と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例１９と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0112】
検出結果は、発酵の４９時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に１１．６ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0113】
実施例２１：５０Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ３の流加発酵
１．種培養：ＢＮＧＳ３株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
１．種培養：ＢＮＧＳ３株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
【0114】
２．振盪フラスコ培養：５％の接種率で（５００ｍＬ振盪フラスコに含まれる）７５ｍＬの発酵培地に移した。振盪フラスコ培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。培養は、５０℃及び２００ｒｐｍで一晩行った。
【0115】
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0116】
検出結果は、発酵の６４時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に１０．８ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0117】
実施例２２：５０Ｌ発酵槽における４５℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ３の流加発酵
１．種培養：実施例２１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例２１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例２１と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例２１と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0118】
検出結果は、発酵の５８時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に７．２ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0119】
実施例２３：５０Ｌ発酵槽における３７℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ４の流加発酵
１．種培養：ＢＮＧＳ４株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
１．種培養：ＢＮＧＳ４株を含む種溶液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、５０℃及び２００ｒｐｍで１２～１６時間インキュベートした。培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。
【0120】
２．振盪フラスコ培養：５％の接種率で（５００ｍＬ振盪フラスコに含まれる）７５ｍＬの発酵培地に移した。振盪フラスコ培養中、２５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン耐性を付与した。培養は、５０℃及び２００ｒｐｍで一晩行った。
【0121】
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、３７℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0122】
検出結果は、発酵の６４時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に６．１ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0123】
実施例２４：５０Ｌ発酵槽における４５℃での組換えＢ．リケニフォルミスＢＮＧＳ４の流加発酵
１．種培養：実施例２３と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例２３と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
１．種培養：実施例２３と同様。
２．振盪フラスコ培養：実施例２３と同様。
３．発酵培養：活性化した種溶液を４％（ｖ／ｖ）の接種率で５０Ｌの全自動発酵槽に移し、４５℃の温度でインキュベートした。作用濃度が２５ｍｇ／Ｌに到達するまでテトラサイクリン耐性を添加し、３ｍｏｌ・Ｌ－１塩酸溶液及び２５％（ｖ／ｖ）アンモニア溶液を添加してｐＨを７．０に調整及び維持した。通気量を１．５ｖｖｍに保ち、最初に６００ｒ・ｍｉｎ－１の速度で撹拌した。グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度に継続的に調節される必要がある。この目的のために、グルコースが３～４ｇ／Ｌまで消費されると、一定の流速で持続的にグルコースを補充した。発酵が終了するまで培養を続けた。試料を採取し、高速液体クロマトグラフィーで検出した。
【0124】
検出結果は、発酵の５８時間後、アセチルグルコサミンが発酵ブロス中に２．９ｇ／Ｌ存在することを示した。
【0125】
実施例２５：ＢＮＧＳ１株の安定性アッセイ
ＢＮＧＳ１株を含む発酵ブロスで２５ｍｇ／ｍＬ固体ＬＢ培地プレートに線を引いた。５０℃で１８時間培養した後、１０個の単一コロニーを採取し、それぞれ７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ振盪フラスコ中に接種した。振盪機温度４０℃及び２００ｒｐｍでフラスコを振盪し、グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度で存在した。Ｎ－アセチルグルコサミンの産生安定性は、接種後７０時間でＨＰＬＣを使用して評価し、産物は２．２４ｇ／Ｌ～２．４１ｇ／Ｌの範囲の濃度で存在することが決定された。
ＢＮＧＳ１株を含む発酵ブロスで２５ｍｇ／ｍＬ固体ＬＢ培地プレートに線を引いた。５０℃で１８時間培養した後、１０個の単一コロニーを採取し、それぞれ７５ｍＬの発酵培地を含む５００ｍＬ振盪フラスコ中に接種した。振盪機温度４０℃及び２００ｒｐｍでフラスコを振盪し、グルコースは３０ｇ／Ｌの濃度で存在した。Ｎ－アセチルグルコサミンの産生安定性は、接種後７０時間でＨＰＬＣを使用して評価し、産物は２．２４ｇ／Ｌ～２．４１ｇ／Ｌの範囲の濃度で存在することが決定された。
【0126】
以上、本発明の好ましい特定の実施形態について詳細に説明した。当業者は、創造的な努力をすることなく、本発明の概念に基づいて様々な修正及び変更を行うことができることを理解されたい。よって、先行技術に基づく本発明の概念に従って、当業者が論理的分析、推論、又は限られた実験によって得ることができる全ての技術的解決方法は、特許請求の範囲で定義されている保護範囲内に含まれるように意図されている。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】