(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-15
(54)【発明の名称】自己増幅ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ＲＮＡワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20230807BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230807BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20230807BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230807BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230807BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230807BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20230807BHJP
C07K 14/18 20060101ALN20230807BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
C12N15/50 ZNA
C12N15/40
A61K31/7105
A61P31/14
A61K48/00
C07K14/165
C07K14/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022577630
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(85)【翻訳文提出日】2023-02-13
(86)【国際出願番号】 EP2021066679
(87)【国際公開番号】W WO2021255270
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】20181249.2
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20184036.0
(32)【優先日】2020-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21170302.0
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522488845
【氏名又は名称】ジフィウス ヴァクシーンス
【氏名又は名称原語表記】ＺＩＰＨＩＵＳ ＶＡＣＣＩＮＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100167623
【弁理士】
【氏名又は名称】塚中 哲雄
(72)【発明者】
【氏名】イティシュリ サフー
(72)【発明者】
【氏名】アシクル ハック エイ ケイ エム
(72)【発明者】
【氏名】シーン マク キャファティ
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアーン カルドン
(72)【発明者】
【氏名】ニック サンダース
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA19
4C084AA23
4C084MA02
4C084MA65
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4C085EE03
4C086AA01
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4C086EA16
4C086MA02
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4C086NA14
4C086ZB33
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、非構造タンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－５２のタンパク質抗原をコードしている配列とを含む自己複製ＲＮＡ分子に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列とを含む組み合わせであって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子に含まれ、前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子がさらに非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列を含む、組み合わせ。
【請求項2】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、同一の自己複製ＲＮＡ分子に含まれるか、または前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、異なる自己複製ＲＮＡ分子に含まれる、請求項１の組み合わせ。
【請求項3】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、例えば、ＴＣ－８３株、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する株である、請求項１または２に記載の組み合わせ。
【請求項4】
前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項5】
前記スパイクタンパク質抗原が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項6】
前記ＲＢＤが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に相当する、請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項7】
前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３の非構造タンパク質と、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異と、ｎｓＰ２におけるＱ７３９Ｌ変異とを含む、請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている前記配列が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または前記受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または切断型の下流でポリＡテールを含む、請求項１～７のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている前記配列が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原をコードしている配列を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原の下流でポリＡテールを含む、請求項１～８のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の組み合わせと、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項11】
少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
前記ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、脂質ナノ粒子、リポソーム、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、請求項１～１３のいずれかに記載の組み合わせを含むワクチンであって、前記ワクチンにおける前記ＲＮＡの有効用量が０．１～１００μｇである、ワクチン。
【請求項15】
医薬として使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組み合わせ、または請求項１０から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のワクチン。
【請求項16】
感染症の予防および／または治療に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み合わせ、または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のワクチン。
【請求項17】
対象における免疫応答の誘導での使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み合わせ、または実施形態１０～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または実施形態１４に記載の使用のためのワクチン。
【請求項18】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルス疾患に対する対象のワクチン接種での使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み合わせ、または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のワクチン。
【請求項19】
前記ＲＮＡの有効用量が０．１～１００μｇである、実施形態１５～１８のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物または使用のためのワクチン。
【請求項20】
筋肉内、皮内、または皮下に投与される、実施形態１５～１９のいずれかに記載の使用のための組み合わせ、医薬組成物、またはワクチン。
【請求項21】
単回投与として、または予め規定された期間内に投与される、２回以上の投与の連続を必要とする多回投与として投与される、実施形態１５～２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ、医薬組成物、またはワクチン。
【請求項22】
毎年または隔年など、定期的に投与される、実施形態１５～２１のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物、または使用のためのワクチン。
【請求項23】
前記ワクチンの用量が０．０５～１ｍＬである、実施形態１～２２のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物、または使用のためのワクチン。
【請求項24】
自己複製ＲＮＡ分子を含むコロナウイルスワクチンであって、前記各自己複製ＲＮＡ分子は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列とを含み、前記ＲＮＡ分子はカチオン性脂質、脂質ナノ粒子、リポソーム、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョンならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、コロナウイルスワクチン。
【請求項25】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、例えば、株ＴＣ－８３またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する株である、実施形態２４に記載のワクチン。
【請求項26】
５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む、実施態様２４または２５に記載のワクチン。
【請求項27】
前記スパイクタンパク質抗原が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型であり、前記ＲＢＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対応する、実施形態２４～２６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項28】
前記スパイクタンパク質が、Ｃ３ｄ－ｐ２８などの免疫刺激タンパク質に融合している、実施形態２４から２７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項29】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原および／またはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２膜タンパク質抗原をコードしている配列をさらに含む、実施形態２４～２８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項30】
ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３の非構造タンパク質と、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異およびｎｓＰ２におけるＱ７３９Ｌ変異と、前記ＲＢＤを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の切断型をコードしている２５配列とを含む、実施形態２４～２９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項31】
前記各自己増幅ＲＮＡ分子が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または切断型の下流でポリＡテールを含む、実施形態１～３０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項32】
前記ワクチンが、対象、好ましくはヒト対象に投与された場合、前記対象においてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２および／またはその変異型に対する免疫応答を誘発または誘導することができる、実施形態２４～３１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項33】
前記ワクチンの１用量が０．１μｇ～１００μｇのＲＮＡを含むように製剤化される、実施形態２４～３２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項34】
前記ワクチンの用量が、０．０５～１ｍＬである、実施形態２４～３３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項35】
アジュバントをさらに含む、実施形態１～３４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項36】
コロナウイルス感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療または予防方法であって、実施形態１～９のいずれかによる組み合わせ、実施形態１０～１３または１４～３５のいずれかに記載の医薬組成物またはワクチンを、対象、好ましくはヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項37】
コロナウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する対象の免疫応答を誘導する方法であって、実施形態１～９のいずれかに記載の組み合わせ、実施形態１０～１３または１４～３５のいずれかによる医薬組成物またはワクチンを、対象、好ましくはヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項38】
前記組み合わせ、医薬組成物またはワクチンが、皮下、筋肉内または皮内注射によって前記対象に投与される、実施形態３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
投与用量が０．１～１００μｇのＲＮＡを含む、実施形態１～３８のいずれかに記載の方法。
【請求項40】
前記組み合わせ、医薬組成物またはワクチンが、単回投与として、または予め規定された期間内に投与される、２回以上の投与の連続を必要とする多回投与として投与される、実施形態１～３９のいずれかに記載の方法。
【請求項41】
前記組み合わせ、組成物またはワクチンが、毎年または隔年など、定期的に投与される、実施形態１～４０のいずれかに記載の方法。
【請求項42】
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしており、プロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある抗原配列と；－前記抗原配列の下流にあるポリ（Ａ）配列と；
－ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１～４をコードしている配列とを含む、ベクター。
【請求項43】
前記抗原配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質もしくはその切断型をコードしている、または前記抗原配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている、実施形態４２に記載のベクター。
【請求項44】
前記スパイクタンパク質の切断型が受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、実施形態４２および４３に記載のベクター。
【請求項45】
ｎｓＰ２の配列が、前記ベクターの５’ＵＴＲにＱ７３９Ｌ変異および／またはＡ３Ｇ変異を有するｎｓＰ２タンパク質をコードしている、実施形態１～４４に記載のベクター。
【請求項46】
前記ベクターがプラスミドまたは線状化ＤＮＡである、実施形態１～４５に記載のベクター。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列とを含む自己複製ＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、コロナウイルス科に属するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである（Ahmed et al., 2020）。新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はベータコロナウイルスに属し、さらに４つの系統（すなわちＡ－Ｄ）に分けられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＢ系統は約２００のウイルス配列が公表されているが、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）を含むＣ系統は５００超のウイルス配列を有する（Letko et al., 2020）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他のコロナウイルスと同様に、複数の構造および非構造タンパク質をコードしている、～３０キロベースのゲノムサイズを有している。構造タンパク質には、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質が含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はごく最近発見されたため、現在、このウイルスについての利用可能な情報は不足している。予備的研究では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、全長ゲノムの系統解析、および推定的に類似した細胞侵入機構とヒト細胞受容体の使用に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと非常に類似していることが示唆されている（Ahmed et al, 2020）。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＲＮＡウイルスであるため、世界のさまざまな地域で継続的に発生している変異によって急速に進化している。したがって、感染率または病気を引き起こす能力といった重要なウイルスの特性を変えることができる変異は、注意深く監視する必要がある。最近、ある種の突然変異がこれらの重要なウイルスパラメーターの変化を引き起こし、現在世界的に広がっている３つの懸念される変異型につながった（Volz et al., 2021）。懸念される第１の変異型、Ｂ１．１．７は英国で生まれたもので、スパイクタンパク質をコードしている遺伝子に３つの重要な変異：Ｎ５０１Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｈ６９－Ｖ７０を含んでいる。この変異型は、病気の重症度および感染力がより高いグレードになることと関連している（Davies et al., 2021）。懸念される第２の変異型、Ｂ．１．３５１は南アフリカで最初に特定され、スパイクタンパク質をコードしている領域に３つの重要な置換変異：Ｎ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋを含んでいる。この変異型のデータから、このウイルスは、これらの変異によって感染率が上昇し、および／または、免疫応答を回避しやすくなっていることが示唆されている（Tegally et al., 2021）。現在懸念されている最後の変異型、Ｐ．１は、ブラジルで生まれたもので、南アフリカの変異型と同様にスパイクタンパク質をコードしている遺伝子に重要な変異を含んでいる。そのため、この変異型も野生型ウイルスと比較して高い感染率を引き起こす（Moore & Offit, 2021）。このウイルスは常に進化しているため、今後も新たなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型が出現する可能性が高い。
【0004】
すべてのＣｏＶは表面糖タンパク質であるスパイクをコードしており、これが宿主細胞の受容体に結合してウイルスの侵入を媒介する。ベータコロナウイルスの場合、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と呼ばれるスパイクタンパク質の１つの領域が、宿主細胞の受容体との相互作用を仲介している。受容体と結合した後、近傍の宿主プロテアーゼがスパイクを切断し、スパイク融合ペプチドを遊離してウイルスの侵入を促進させる。既知のベータコロナウイルスの宿主受容体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）が挙げられる（Letko et al, 2020）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶよりも高い親和性でＡＣＥ２と結合することが研究で示されている（Zhou et al., 2020）。さらに、ヌクレオカプシドは、タンパク質のオリゴマー化によってウイルスゲノムをパッケージングするための重要なサブユニットでもある（Zhou et al., 2020）。タンパク質配列のアラインメント解析により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶに対し進化的に最も保存されていることが示された。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープとヌクレオカプシドのタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと比較してそれぞれ９６％および８９．６％の配列同一性を有する、進化的に保存された２つの領域である。しかし、スパイクタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶの間で最も低い配列保存性（配列同一性７７％）を示した。一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶと比較して３１．９％の配列同一性しかない（Zhou et al., 2020）。
【0005】
近年、ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ワクチン接種が注目されている。より慣習的なワクチン接種法と比較して、ＤＮＡワクチンの主な利点の１つは、ワクチン抗原が宿主細胞によって新規に産生されることである。ＤＮＡワクチンは、動物において、様々な抗原に対して強力なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を誘導することができた。これは、動物用のプラスミドＤＮＡベースのワクチンの開発と商業化につながった（Davis et al., 2001; Garver et al., 2005; Kurath et al., 2006; Grosenbaugh et al., 2011）。しかし、ヒト用のＤＮＡワクチンの開発は、これまでのところ、同様の成功を収めていない。いくつかの臨床試験で、ＤＮＡワクチンがヒトの細胞性Ｔ細胞およびＢ細胞応答を誘導する原理的な能力があることが実証されているが、これらの免疫応答の強さは、より従来的なアプローチで達成されたものよりもむしろ低かった。さらに、ＤＮＡワクチンには、例えば、非分裂細胞または低分裂細胞における有効性の低さ、ＤＮＡ構成物のエピジェネティックなサイレンシング、抗生物質耐性遺伝子の存在、および長期間の非制御発現などのいくつかの欠点があり、これらは必ずしも良い免疫応答と必ず相関するとは限らないだけでなく、意図した免疫効果に有害で、Ｔ細胞の消耗を招く可能性すらある（Wherry et al., 2003; Shin & Wherry, 2007; Han et al., 2010）。ヒトにおけるＤＮＡワクチンの「性能不足」に対する別の説明は、これらのワクチンの免疫賦活作用が推定よりも弱いことである可能性がある。ＤＮＡ依存性免疫応答の誘導における細胞質ＤＮＡセンサの重要性は、近年ますます認識されている（Aoshi et al., 2011; Marichal et al., 2011; Desmet & Ishii, 2012）。高度な送達方法の助けがなければ、十分なＤＮＡが細胞質に到達しない可能性、またはＤＮＡによる刺激に対するこれらのセンサの感度に種差が存在する可能性があると考えられる（Kallen & Theβ, 2014）。
【0006】
そこで研究者らは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンの応用に目を向けている。トランスフェクトされた細胞の機構は、薬理学的に活性な産物である対応するタンパク質へのメッセージのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳に利用される。ＩＶＴ ｍＲＮＡの薬理活性の主要なコンパートメントは、細胞質である。核内で産生され核外輸送により細胞質に入る天然ｍＲＮＡとは対照的に、ＩＶＴ ｍＲＮＡは細胞外空間から細胞質に入る必要がある。ＩＶＴ ｍＲＮＡがいったん細胞質に入ると、その薬理作用は、天然ｍＲＮＡの安定性と翻訳を制御するのと同じ複雑な細胞機構によって支配される。ＩＶＴ ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物は翻訳後修飾を受け、このタンパク質が生理活性化合物となる。ＩＶＴｍＲＮＡのテンプレートとタンパク質産物の両者の半減期は、ｍＲＮＡベースの治療薬の薬物動態の重要な決定要因になる。免疫療法的なアプローチの場合、コード化されたタンパク質のプロセシング経路は、その薬物動態を決定する上で重要である。内因的に生成されたタンパク質と同様に、ｍＲＮＡにコードされた生成物はプロテアソームによって分解され、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上でＣＤ８＋Ｔ細胞へ提示される。一般に、細胞内タンパク質はＭＨＣクラスＩＩプロセッシング経路に到達してヘルパーＴ細胞の応答を誘導することはない。しかし、抗原コード配列に分泌シグナルを導入することで、分泌シグナルがタンパク質抗原を細胞外空間に誘導するため、ヘルパーＴ細胞応答を達成することができる（Sahin et al., 2014）。
【0007】
１９９０年代には、ＩＶＴ ｍＲＮＡの前臨床調査が、がんおよび感染症に対するタンパク質代替およびワクチン接種アプローチなど、多様な用途を目的に開始された。その結果、蓄積された知識は、半減期の短さおよび好ましくない免疫原性など、ｍＲＮＡに関連する障害のいくつかを克服するための近年の科学技術の進歩を実現させた（Sahin et al., 2014）。
【0008】
宿主細胞のサイトゾル内に合成ｍＲＮＡが送達された後、未修飾の合成ｍＲＮＡは異物として認識され、パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって検出され、自然免疫応答が引き起こされる（Tam & Jacques, 2014）。また、合成ｍＲＮＡは、サイトゾルＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５の引き金を引くことによって自然免疫系を活性化することができる（Schlee et al, 2009; Goubau et al, 2014; Reikine et al, 2014）。さらに、合成ｍＲＮＡ分子はＮＬＲによっても認識され、カスパーゼ－１を介したピロトーシスによる細胞死を引き起こすという指摘もある（Bergsbaken et al., 2009; Andries et al., 2013）。したがって、未修飾の合成ｍＲＮＡに基づいた遺伝子ワクチンは、ｍＲＮＡワクチン接種後の細胞性および液性応答を促進する様々なサイトカインの発現を活性化することにより、優れた自己アジュバントとして機能することが可能である。しかしながら、未修飾ｍＲＮＡのキャリア媒介送達後の自然免疫応答は、ｍＲＮＡの翻訳の阻害、さらにはｍＲＮＡの分解につながるほど活発であり得る（Kormann et al., 2011; Katalin Kariko et al., 2012; Wu & Brewer, 2012; Zangi et al., 2013; Zhong et al., 2018）。さらに、最近の報告では、非修飾／非ＨＰＬＣ精製合成ｍＲＮＡの免疫刺激特性に起因する誘発性I型ＩＦＮが、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激に負の影響を及ぼす可能性が示された（De Beuckelaer et al., 2017）。Ｉ型インターフェロンは血栓性微小血管症（Kavanagh et al., 2016）、貧血（Libregts et al., 2011）、および自己免疫疾患（Di Domizio & Cao, 2013）と関連しているため、合成ｍＲＮＡの固有の生来の免疫原性は、安全性に関する懸念も潜在的に持っている。したがって、ｍＲＮＡの翻訳と自然免疫応答の完璧なバランスを追求することが重要である。そこで、ＩＶＴ－ｍＲＮＡにプソイドウリジン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジンまたはＮ６－メチルアデノシンなどの天然由来の修飾ヌクレオシドを組み込むと、免疫刺激が大幅に減少し、ＲＮａｓｅ切断に対して分子が安定化することが示されている（Katalin Kariko et al., 2005, 2012; B. R. Anderson et al., 2011; Kormann et al., 2011）。ウリジン欠乏は、免疫原性を低下させ、翻訳活性を増加させるための配列操作の最新の形態である（拙稿参照：10.1016/j.omtn.2018.06.010）。さらに、修飾ｍＲＮＡの免疫刺激は、例えば逆相クロマトグラフィーを用いた精製によってさらに低減することができる（Kariko et al., 2005; Bart R. Anderson et al.,2010; Andries, Mc Cafferty, et al.,2015）。ＩＶＴ－ｍＲＮＡの異なる構造配列を改変して細胞内安定性と翻訳効率を系統的に改善することにより、ＩＶＴ－ｍＲＮＡからのタンパク質発現を数桁超増加させることができる（K Kariko et al., 1999; Holtkamp et al., 2006; Kallen & Theβ, 2014）。
【0009】
ワクチン接種の場合、ＩＶＴ ｍＲＮＡの強い免疫刺激効果と内在性アジュバント活性により、強力な抗原特異的な細胞性および体液性の免疫応答が得られる（Sahin et al., 2014）。ワクチン接種にｍＲＮＡを使用する主な利点は、同じ分子が適応免疫に抗原源を提供するだけでなく、同時にパターン認識受容体に結合して自然免疫を刺激することができることである。タンパク質抗原に対する体液性および細胞性の免疫応答は、核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種によって効率的に刺激することができる。核酸ベースのワクチン接種では、免疫原性タンパク質が正しい翻訳後修飾、コンフォメーションまたはオリゴマー化で発現し；これにより中和抗体（Ｂ細胞）応答を刺激するエピトープの完全性が確保される。
【0010】
しかし、ＩＶＴ ｍＲＮＡベースのアプローチとＤＮＡワクチンなどの他の核酸ベースの技術との間には、概念的にいくつかの重要な違いがある。ＩＶＴ ｍＲＮＡは機能するために核に入る必要がなく；いったん細胞質に到達すると、ｍＲＮＡは即座に翻訳される。対照的に、ＤＮＡはＲＮＡに転写されるために核にアクセスする必要があり、その機能性は細胞分裂時の核膜の破壊に依存する（Sahin et al., 2014）。さらに、ｍＲＮＡはＤＮＡプラスミドのように核に入る必要がないため、非分裂細胞にも送達することができる（Sergeeva et al., 2016）。さらに、ＩＶＴ ｍＲＮＡベースの治療薬は、プラスミドＤＮＡおよびウイルスベクターとは異なり、ゲノムに組み込まれないため、挿入変異原性のリスクも提起しない。また、ＩＶＴ ｍＲＮＡは一過性の活性しかなく、生理的な代謝経路を経て完全に分解されることも有利である（Sahin et al., 2014）。ＲＮＡ免疫化は、一過性のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション後に発現した細胞内または細胞外タンパク質抗原から、（ウイルスタンパク質による干渉なしに）抗原性ペプチドが（内因性または外因性の）プロセシング経路で効率的に生成されるため、Ｔ細胞応答を刺激する上で例外的に強力である。この２つの特徴とも、真核生物または原核生物の発現系で製造された組換えサブユニットワクチンでは達成困難である（Reimann & Schirmbeck, 2000）。天然の感染病原体から製造されるサブユニットワクチンは依然として重要な役割を担っているが、免疫原の製造と精製にかかるコストは非常に高い可能性がある。所望のタンパク質を作るために患者の体内に依存することで、ＩＶＴ ｍＲＮＡ薬は、発酵タンクでの高価なタンパク質の製造の必要性を回避し、治療タンパク質の安定かつ調整可能な生産が可能なアプローチを提供する（Sahin et al., 2014）。
【0011】
さらに、およそ１０年前、Pascolo (2004)は、ｍＲＮＡを大規模に製造するコストは、ＤＮＡを製造するコストよりも低くなると指摘した（Pascolo, 2004）。ｍＲＮＡに基づくヌクレオチドワクチンは、非常に短い時間で事実上あらゆるタンパク質を抗原としてコードする柔軟性を備えているが、同じ製造設備で同じ製造プロセスを用いて製造することが可能である。したがって、新規ワクチンを限られた財政投資で非常に短時間で作ることができ、これは感染症のパンデミックシナリオにとって非常に重要である（Kallen & Theβ, 2014）。ＩＶＴ ｍＲＮＡを薬として用いるコンセプトは、特定の疾患状態を予防または変更するという最終目的のために患者の細胞内に定められた遺伝メッセージを伝達することである（Sahin et al., 2014）原則として、２つのアプローチのＩＶＴ ｍＲＮＡの使用が追求されている。１つは、それを患者の細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入することであり；これらのトランスフェクトされた細胞は、その後、養子的に患者に戻される。第２のアプローチは、様々な経路を利用してＩＶＴ ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで直接送達することである。
【0012】
自己増幅型（self-amplifying、ｓａ）ウイルスｍＲＮＡレプリコンはＲＤＲＰ遺伝子を持ち、プラス鎖ＲＮＡウイルスの特徴的な複製特徴を模倣している（Echinson & Ehrenfeld, 1981; Mizutani & Colonno, 1985; van der Werf et al,1986; C. M. Rice et al., 1987; Liljestrom & Garoff, 1991; Rolls et al., 1994; Khromykh & Westaway, 1997; Perri et al., 2003）。レプリコンＲＮＡは、ｃＤＮＡ鋳型から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することにより容易に製造することができる。ＲＮＡウイルスの構造遺伝子は、目的の異種遺伝子に置き換えられ、それらはサブゲノムプロモータによって制御される（Xiong et al., 1989; Zhou et al., 1994; Ying et al., 1999; Hewson, 2000; Lundstrom, 2009）。
【0013】
近年、ｓａ－ｍＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン）ワクチン接種は、ナノテクノロジーをベースとした革新的なワクチン戦略として認識されている（Andries, Kitada, et al., 2015）。前述のように、ウイルスレプリコン粒子（すなわち、ウイルスカプシドタンパク質に包まれたＲＮＡ）とは異なり、ＲＮＡレプリコンはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってのみ製造することができる。したがって、製造プロセス全体が完全に無細胞であり、その結果、組成が正確に定義された治療薬が得られる。ＲＮＡレプリコンワクチンは、非複製対応物と比較して発現期間（約２カ月）および発現の大きさが伸びるなど、いくつかの魅力的な特徴を有する（Kowalski et al., 2019）。さらに、ｓａ－ｍＲＮＡの細胞内複製は一過性であり、複製中に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中間体を生成し、パターン認識受容体を誘発することによってインターフェロンを介した宿主防御機構を誘発することができる。この結果、挿入された標的分子に対する強力な抗原特異的免疫応答が引き起こされる。したがって、ｓａ－ｍＲＮＡベクター系は、高い一過性の導入遺伝子発現と固有のアジュバント効果を提供するため、ワクチン開発に理想的に適している（Sahin et al., 2014）。
【0014】
一般的な分類によると、標的細胞に遺伝物質を導入するために、２種類のベクターが使用され得る。一方は、前駆体ウイルスの挙動を模倣したウイルスベクターが使用される。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなど、さまざまな種類のベクターが採用されたことがあり、ヨーロッパでは臨床使用までもが承認されている。一方、非ウイルス性ベクターも存在し、これはその組成によって説明することができる。最もよく言及されるのは、リポプレックス（脂質＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）とポリプレックス（ポリマー＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）である（Perez Ruiz de Garibay, 2016）。
【0015】
不活性化または非複製ウイルスベクターを用いた遺伝子導入の実行は、臨床試験の約３分の２を構成し（Ginn et al., 2018）、任意の特定のウイルスベクターの選択は、治療標的に依存する。例えば、頻繁に採用されているアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクターは、分裂しているまたは非分裂の細胞のいずれかを標的とすることができる。Ａｄ５ウイルスは安定で遺伝子的に操作することが容易であるが、その免疫原性が臨床への応用の妨げとなっている（Salameh et al., 2019）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、最も活発に研究されている遺伝子治療媒体の１つであり、一般に他のウイルスよりも免疫原性が低いことが示されている。しかし、ＡＡＶに対する既存の免疫、特に循環中和抗体の存在は、ＡＡＶの臨床効果に劇的な影響を与える可能性がある。現在までのところ、これは全身投与されたＡＡＶの使用に対する最大の治療上の課題の１つであり、初期の臨床失敗の要因の１つであると考えられている（Naso et al., 2017）。レトロウイルスおよびレンチウイルスは、そのゲノムを宿主細胞に統合し、長期的な導入遺伝子の発現をもたらすことができる。しかし、レトロウイルスは活発に分裂している細胞にしかトランスフェクトできず、したがって非分裂細胞（例えば、脳組織内）を標的にすることはできない。さらに、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは製造コストが高く、Ａｄ５よりも組換えベクターとしての安定性が低いため、遺伝子導入の再現性が阻害される。さらに、ウイルスベクターによって誘導される自然および適応免疫応答も、その有効性を制限する。そこで、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドポリ（ＨＰＭＡ）などの合成ポリマーを共有結合させて免疫原性をマスキングすることに多くの取り組みがなされている。このようなポリマー－ウイルスのハイブリッドは、安定的で持続的な遺伝子発現を生み、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる（Ramsey et al., 2010）。残念ながら、副作用の低減は、トランスフェクション効率の望ましくないほど大きな低下と一致する（Salameh et al., 2019）。
【0016】
一方、ポリマー、リポソーム、または他のナノスケール構造から調製される非ウイルスベクターは、ウイルスベクターの欠点を克服する方法を提供する。非ウイルス性ベクターは安全なプラットフォームであり、その製造はウイルスベクターよりも単純で安価、かつ再現性がより高い。さらに、送達できるＤＮＡまたはＲＮＡのカーゴに制限がない。非ウイルスベクターのトランスフェクションの有効性が、いくつかの戦略によって改善され、その結果、臨床試験に入る製品の数が増加しているとは言うものの、その主な制限である（delpozo-Rodriguez et al, 2016; Molla & Levkin, 2016; Perez Ruiz de Garibay, 2016）。
【0017】
タンパク質およびＲＮＡ（例えば、スモールＲＮＡ）などの遺伝子産物をコードしている核酸は、所望の脊椎動物の対象に直接送達することができ、または対象から得られたもしくはそれに由来する細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達し、その細胞を対象に再移植することができる。このような核酸を脊椎動物の対象に送達することは、多くの目的、例えば、遺伝子治療のため、コード化されたポリペプチドに対する免疫応答を誘導するため、または内因性遺伝子の発現を調節するために望ましいことである。このアプローチの使用は、遊離ＤＮＡが細胞によって容易に取り込まれず、遊離ＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで急速に分解されるために妨げられてきた。そこで、核酸送達系を用いて、核酸送達の効率を向上させることが行われてきた。
【0018】
核酸送達系は、組換えウイルス系と非ウイルス系の２つの大きなカテゴリに分けられる。ウイルスベクターとしてのウイルスは、細胞に感染するために進化してきた高効率の送達系である。一部のウイルスは、改変して感染性はないものの外来遺伝子産物をコードしている核酸を宿主細胞に効率よく送達できるウイルスベクターになっている。しかし、組換えウイルスなど、ある種のウイルスベクターには、安全性および有効性に関する潜在的な懸念が残っている。例えば、ベクターがパッケージングを含んだ方法を用いて製造される場合、ベクター成分間の組換え事象によって感染性ウイルスが生成されることがあり、ウイルスタンパク質は望ましくない免疫応答を誘発することがあり、これにより導入遺伝子発現の時間が短縮され、組換えウイルスの反復使用が妨げられることさえあり得る。例えば、Seung et al., Gene Therapy 10:706-711(2003), Tsai et al., Clin. Cancer. Res. 10:7199-7206(2004)を参照のこと。
【0019】
さらに、組換えウイルスを用いて送達できる核酸のサイズには制限があり、大きな核酸または複数の核酸を送達することができない場合がある。一般に検討されている非ウイルス送達系には、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遊離核酸の送達と、核酸および脂質（例えば、リポソーム）、ポリカチオン、または遺伝子導入の速度を高めることを意図した他の薬剤を含む製剤の送達が含まれる。例えば、Montana et al., Bioconjugate Chem.18:302-308(2007), Ouahabi et al., FEBS Letters, 380:108-112(1996)を参照のこと。しかしながら、これらのタイプの送達系は、一般に、組換えウイルスよりも効率が低い。
【0020】
核酸ワクチンによって誘導される免疫応答には、核酸によってコードされた抗原に対し反応性があり、病原体特異的な免疫力を与える。抗原の投与期間、用量、および免疫系への抗原提示の種類は、免疫応答の種類と大きさに関係する重要な要因である。核酸ワクチン接種の効果は、核酸の細胞への取り込みが非効率的であることにより、しばしば制限される。一般に、注射部位の筋肉または皮膚細胞のうち、目的の遺伝子を発現しているのは１％未満である。この低い効率は、遺伝子ワクチンが標的組織に存在する細胞の特定のサブセットに入ることが望ましい場合に、特に問題となる。例えば、Restifo et al., Gene Therapy 7:89-92(2000)を参照のこと。
【0021】
自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞内で複製され、所望の遺伝子産物をコードしているＲＮＡの量の増幅をもたらし、ＲＮＡ送達の効率とコードされた遺伝子産物の発現を高めることが可能である。例えば、Johanning, F.W., et al, Nucleic Acids Res., 23(9): 1495-1501(1995); Khromykh, A. A., Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2(5):556-570(2000); Smerdou et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics, 1(2):244-251(1999)を参照のこと。自己複製ＲＮＡは、ウイルス粒子として、および遊離ＲＮＡ分子として産生されてきた。しかしながら、遊離ＲＮＡ分子はｉｎ ｖｉｖｏで急速に分解され、試験されたほとんどのＲＮＡベースのワクチンは、強力で耐久性のある免疫応答を生じさせるのに必要な用量および期間で抗原を提供する能力が限られていた。例えば、Probst et al., Genetic Vaccines and Therapy, 4:4; doi:10.1186/1479-0556-4-4(2006)を参照のこと。
【0022】
ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症は世界的な大流行となった。現在、１８８の国と地域で１億７５００万人超の症例が報告され、約3,700,00人の死者が出ており、緊急治療室の収容可能人数を超えている。また、世界経済への脅威も証明され、人類史上最もコストのかかる災害となった。世界各国の政府が抜本的な対策を講じ、いくつかのワクチンは緊急時の手続きを経て承認されたが、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型に対して持続的な防御力を発揮することのできる有効なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを得ることは、依然として絶対的に緊急かつ必要である。いくつかの報告はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者における抗体反応の持続性を問題とし、同族体の再感染が確認されていることから、これらのウイルスに対するワクチン開発は困難な作業であることが証明されている。さらに、患者は、症状が軽い患者であっても、非常に長い期間症状が続くことがあり、これはウイルスの持続性を示している。さらに、ウイルスが急速に進化し、感染率および発病能力などのウイルス特性を変化させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型が出現することが懸念されている。最後に、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がない回復した患者も、後の時間枠では陽性となることが示されており、持続性または再発性の感染の発生が確認されている。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および重篤な疾患の可能性を著しく減少させるのに十分な免疫応答を生じさせ、好ましくは長期間の有効性をもってそれを行い、同時に既知および将来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型から強力に保護することを可能にする有効なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの必要性が存在する。
【0023】
Sheahan et al. (2011)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質を抗原として含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子ワクチンでマウスを免疫化することを記載している。しかし、この技術はヒト用に最適化されておらず、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する効果も開示されていない。
【0024】
一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用の２つのＲＮＡワクチンが、緊急時に特化した条件付き販売承認手続きによりＥＭＡとＦＤＡから承認されているが、これらのワクチンには多用量のｍＲＮＡを必要とする。これらのワクチンの製造は高価であり、時間もかかる。さらに、高濃度のＲＮＡは、投与された患者に副作用を引き起こす可能性がある。したがって、本明細書に挙げた問題の１つまたは複数を解決する、より効率的でより強力なＲＮＡワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0025】
本発明者らは、この度、驚くべきことに、特許請求の範囲に詳述するように、上記のニーズを満たすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む自己複製ＲＮＡ分子を特定した。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原をコードしている配列の組み合わせが、強い結合抗体反応、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の効率的な中和、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の両方の誘発をもたらし、種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型に対する強固な保護を提供することを見出した。
【0026】
第１の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列を含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス／ベネズエラウマ脳炎ウイルスのＲＮＡゲノムを基にしている。好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、標的タンパク質（例えば、抗原）またはＲＮＡ（例えば、スモールＲＮＡ）／少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などの遺伝子産物をコードしている異種配列を含む。特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、変異、好ましくは５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ置換とｎｓＰ２ Ｑ７３９Ｌ変異の両方を含む。
【0027】
特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原である。さらなる実施形態では、スパイクタンパク質抗原は、受容体結合ドメイン（Receptor-Binding Domain、ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型である。さらなる実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｃ３ｄ－ｐ２８などの免疫刺激タンパク質に融合している。
【0028】
別の特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原である。さらに別の特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原である。好ましい実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原および／またはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２膜タンパク質抗原をコードしている配列をさらに含んでいる。一実施形態では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列をさらに含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。他の１つの実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている配列をさらに含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。
【0029】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子と、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物（例えば、免疫原性組成物およびワクチン）に関する。医薬組成物は、少なくとも１つのアジュバントおよび／または核酸送達系をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）、またはポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョンまたはそれらの組み合わせをさらに含む。
【0030】
特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクリエート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョンエマルジョン、またはそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている。
【0031】
別の態様では、本発明は、感染症、特にコロナウイルス疾患などの疾患を治療または予防するための医学的使用を含む、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子および医薬組成物を使用する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＳＡＲＳ－コロナウイルスによって引き起こされる疾患、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、より詳細にはＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のために、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子および組成物を提供する。したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種のための本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子および組成物も提供する。このような方法は、有効量の本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる。例えば、本発明は、対象において免疫応答を誘導するための抗原をコードしている、本発明の自己複製ＲＮＡ分子の使用を提供する。
【0032】
本発明はまた、有効量の本発明の自己複製ＲＮＡ分子または組成物を前記対象に投与することを含む、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の産生を誘導する方法に関する。本発明はまた、対象における免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。さらなる実施形態において、本発明はまた、対象における抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の産生を誘導するための方法であって、有効量の本発明の自己複製ＲＮＡ分子または組成物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【0033】
本発明はまた、対象にワクチン接種する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【0034】
本発明はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および抗原を産生するように哺乳動物細胞を誘導する方法であって、細胞による自己複製ＲＮＡ分子の取り込みに適した条件下で、細胞を本明細書に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法に関する。
【0035】
本発明はまた、本明細書に記載の医薬組成物に投与することを含む、遺伝子導入方法に関する。
【0036】
特に、本発明は、以下の実施形態で定義されるが、これらは本発明を限定するものではない。
【0037】
１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列とを含む組み合わせであって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子に含まれ、前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子がさらに非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列を含む、組み合わせ。
【0038】
２．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、同一の自己複製ＲＮＡ分子に含まれるか、または前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、異なる自己複製ＲＮＡ分子に含まれる、実施形態１の組み合わせ。
【0039】
３．前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、例えば、ＴＣ－８３株、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する株である、実施形態１または２に記載の組み合わせ。
【0040】
４．前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組み合わせ。
【0041】
５．前記スパイクタンパク質抗原が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の組み合わせ。
【0042】
６．前記ＲＢＤが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に相当する、実施形態５に記載の組み合わせ。
【0043】
７．前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３の非構造タンパク質と、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異と、ｎｓＰ２におけるＱ７３９Ｌ変異とを含む、実施形態１～６のいずれかに記載の組み合わせ。
【0044】
８．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または切断型の下流でポリＡテールを含む、実施形態１～７のいずれかに記載の組み合わせ。
【0045】
９．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている配列が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原をコードしている配列を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原の下流でポリＡテールを含む、実施形態１～８のいずれかに記載の組み合わせ。
【0046】
１０．実施形態１～９のいずれか１つに記載の組み合わせと、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む、医薬組成物。
【0047】
１１．少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、実施形態１０に記載の医薬組成物。
【0048】
１２．カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、実施形態１０または１１に記載の医薬組成物。
【0049】
１３．前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
【0050】
１４．前記ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、実施形態１～１３のいずれかに記載の組み合わせを含むワクチンであって、前記ワクチンにおける前記ＲＮＡの有効用量が０．１～１００μｇである、ワクチン。
【0051】
１５．医薬として使用するための、実施形態１から９のいずれか１つに記載の組み合わせ、または実施形態１０から１３のいずれか１つに記載の医薬組成物、または実施形態１４に記載のワクチン。
【0052】
１６．感染症の予防および／または治療に使用するための、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組み合わせ、または実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の医薬組成物、または実施形態１４に記載のワクチン。
【0053】
１７．対象における免疫応答の誘導での使用のための、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組み合わせ、または実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の医薬組成物、または実施形態１４に記載の使用のためのワクチン。
【0054】
１８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルス疾患に対する対象のワクチン接種での使用のための、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組み合わせ、または実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の医薬組成物、または実施形態１４に記載のワクチン。
【0055】
１９．前記ＲＮＡの有効用量が０．１～１００μｇである、実施形態１５～１８のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物または使用のためのワクチン。
【0056】
２０．筋肉内、皮内、または皮下に投与される、実施形態１５～１９のいずれかに記載の使用のための組み合わせ、医薬組成物、またはワクチン。
【0057】
２１．単回投与として、または予め規定された期間内に投与される、２回以上の投与の連続を必要とする多回投与として投与される、実施形態１５～２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ、医薬組成物、またはワクチン。
【0058】
２２．毎年または隔年など、定期的に投与される、実施形態１５～２１のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物、または使用のためのワクチン。
【0059】
２３．前記ワクチンの用量が０．０５～１ｍＬである、実施形態１～２２のいずれかに記載の組み合わせ、医薬組成物、または使用のためのワクチン。
【0060】
２４．自己複製ＲＮＡ分子を含むコロナウイルスワクチンであって、前記各自己複製ＲＮＡ分子は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列とを含み、前記ＲＮＡ分子はカチオン性脂質、脂質ナノ粒子、リポソーム、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョンならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、コロナウイルスワクチン。
【0061】
２５．前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、例えば、株ＴＣ－８３またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する株である、実施形態２４に記載のワクチン。
【0062】
２６．５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む、実施態様２４または２５に記載のワクチン。
【0063】
２７．前記スパイクタンパク質抗原が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型であり、前記ＲＢＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対応する、実施形態２４～２６のいずれか１つに記載のワクチン。
【0064】
２８．前記スパイクタンパク質が、Ｃ３ｄ－ｐ２８などの免疫刺激タンパク質に融合している、実施形態２４から２７のいずれか１つに記載のワクチン。
【0065】
２９．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原および／またはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２膜タンパク質抗原をコードしている配列をさらに含む、実施形態２４～２８のいずれか１つに記載のワクチン。
【0066】
３０．ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３の非構造タンパク質と、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異およびｎｓＰ２におけるＱ７３９Ｌ変異と、前記ＲＢＤを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の切断型をコードしている２５配列とを含む、実施形態２４～２９のいずれか１つに記載のワクチン。
【0067】
３１．前記各自己増幅ＲＮＡ分子が、５’キャップを含み、次いで、非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列とサブゲノムプロモータを含み、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原または切断型の下流でポリＡテールを含む、実施形態１～３０のいずれかに記載のワクチン。。
【0068】
３２．前記ワクチンが、対象、好ましくはヒト対象に投与された場合、前記対象においてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２および／またはその変異型に対する免疫応答を誘発または誘導することができる、実施形態２４～３１のいずれかに記載のワクチン。
【0069】
３３．前記ワクチンの１用量が０．１μｇ～１００μｇのＲＮＡを含むように製剤化される、実施形態２４～３２のいずれかに記載のワクチン。
【0070】
３４．前記ワクチンの用量が、０．０５～１ｍＬである、実施形態２４～３３のいずれかに記載のワクチン。
【0071】
３５．アジュバントをさらに含む、実施形態１～３４のいずれかに記載のワクチン。
【0072】
３６．コロナウイルス感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療または予防方法であって、実施形態１～９のいずれかによる組み合わせ、実施形態１０～１３または１４～３５のいずれかに記載の医薬組成物またはワクチンを、対象、好ましくはヒト対象に投与することを含む、方法。
【0073】
３７．コロナウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する対象の免疫応答を誘導する方法であって、実施形態１～９のいずれかに記載の組み合わせ、実施形態１０
～１３または１４～３５のいずれかによる医薬組成物またはワクチンを、対象、好ましくはヒト対象に投与することを含む、方法。
～１３または１４～３５のいずれかによる医薬組成物またはワクチンを、対象、好ましくはヒト対象に投与することを含む、方法。
【0074】
３８．前記組み合わせ、医薬組成物またはワクチンが、皮下、筋肉内または皮内注射によって前記対象に投与される、実施形態３６または３７に記載の方法。
【0075】
３９．投与用量が０．１～１００μｇのＲＮＡを含む、実施形態１～３８のいずれかに記載の方法。
【0076】
４０．前記組み合わせ、医薬組成物またはワクチンが、単回投与として、または予め規定された期間内に投与される、２回以上の投与の連続を必要とする多回投与として投与される、実施形態１～３９のいずれかに記載の方法。
【0077】
４１．前記組み合わせ、組成物またはワクチンが、毎年または隔年など、定期的に投与される、実施形態１～４０のいずれかに記載の方法。
【0078】
４２．－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードしており、プロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある抗原配列と；
－前記抗原配列の下流にあるポリ（Ａ）配列と；
－ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１～４をコードしている配列とを含む、ベクター。
－前記抗原配列の下流にあるポリ（Ａ）配列と；
－ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１～４をコードしている配列とを含む、ベクター。
【0079】
４３．前記抗原配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質もしくはその切断型をコードしている、または前記抗原配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている、実施形態４２に記載のベクター。
【0080】
４４．前記スパイクタンパク質の切断型が受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、実施形態４２および４３に記載のベクター。
【0081】
４５．ｎｓＰ２の配列が、前記ベクターの５’ＵＴＲにＱ７３９Ｌ変異および／またはＡ３Ｇ変異を有するｎｓＰ２タンパク質をコードしている、実施形態１～４４に記載のベクター。
【0082】
４６．前記ベクターがプラスミドまたは線状化ＤＮＡである、実施形態１～４５に記載のベクター。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1】ｓａＲＮＡのＳ１－ＲＢＤタンパク質発現の発現能を示すウェスタンブロットの図である。
【図2】ｓａＲＮＡのＮタンパク質発現の発現能を示すウェスタンブロットの図である。
【図3】皮内注射＋エレクトロポレーション後のｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤの免疫原性を示す図である。
【図4】ｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤ筋肉内注射の免疫原性を示す図である
【図5】モックワクチン（ルシフェラーゼ）をｉｎ ｖｉｖｏで投与した後のスイスマウスにおける抗原発現を示す図である。
【図6】スイスマウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＳ－ＲＢＤおよびＳ－ＲＢＤ＋Ｎプライムワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的結合抗体反応の誘導を示す図である。データは、平均±ＳＤで個々の値（群あたりｎ＝６マウス）として示される；ｎｓ＝非有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図7】スイスマウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＮおよびＳ－ＲＢＤ＋Ｎプライムワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ特異的結合抗体反応の誘導を示す図である。データは、平均±ＳＤで個々の値（群あたりｎ＝６マウス）として示される；ｎｓ＝非有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図8】スイスマウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＳ－ＲＢＤおよびＳ－ＲＢＤ＋Ｎプライム接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的結合抗体反応の誘導と、これが追加免疫により増強されることを示す図である。データは、平均±ＳＤで個々の値（群あたりｎ＝６マウス）として示される；ｎｓ＝非有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図9】スイスマウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＮおよびＳ－ＲＢＤ＋Ｎプライムワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ特異的結合抗体反応の誘導と、これが追加免疫によって増強されることを示す図である。データは、平均±ＳＤで個々の値（群あたりｎ＝６マウス）として示される；ｎｓ＝非有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図10】ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤおよびｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎの組み合わせを用いたワクチン接種が、マウスの野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏ－２（武漢）に対する中和抗体を誘導することを示す図である。
【図11】野生型ＳＡＲＳ－Ｃｏ－２（武漢）の感染日から犠牲となった日までのハムスターの体重変化を示す図である。
【図12】ハムスターの肺組織１ｍｇあたりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノムコピー量を示す図である。
【図13】ハムスターの血清を接種した細胞の５０％に細胞障害活性をもたらすのに必要なウイルス量（ＴＣＩＤ５０）を示す図である。
【図14】ＬＮＰ Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡを用いた免疫化により、ハムスターに中和抗体（武漢ＳＡＲＳ－ＣｏＶ株）が誘導されることを示す図である。
【図15】低用量のＺＩＰ－ＬＮＰ Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ（ＺＩＰ１６４２）免疫により、ワクチン接種したハムスターの肺組織におけるＩＬ－６サイトカインのｍＲＮＡ発現が減少することを示す図である。
【図16】ＺＩＰ－ＬＮＰ Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ（ＺＩＰ１６４２）免疫により、ワクチン接種したハムスターの肺組織におけるＩＰ－１０ケモカインのｍＲＮＡ発現が低下することを示す図である。
【図17】１および５μｇの投与量でのＺＩＰ－ＬＮＰ Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ（ＺＩＰ１６４２）免疫により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺の病理組織学的特徴が減少することを示す図である。
【図18】１および５μｇの投与量でのＺＩＰ－ＬＮＰ Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ（ＺＩＰ１６４２）免疫により、ハムスターに強固なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的結合抗体反応が誘導されることを示す図である。
【図19】本明細書に記載のワクチンのＲＮＡ成分として使用できるＳ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ構築物の一例を示す図である。
【図20】スイスマウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＳ－ＲＢＤおよびＳ－ＲＢＤ＋Ｎプライムワクチン接種後のＴｈ２、Ｔｈ１およびＣＴＬ細胞のＳ特異的Ｔ細胞応答を示す図である。データは、平均±ＳＤで個々の値（群あたりｎ＝６マウス）として示される；ｎｓ＝非有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
【発明を実施するための形態】
【0084】
本発明は、自己複製ＲＮＡ分子と、自己複製ＲＮＡを治療目的、例えば免疫化または遺伝子治療のために使用する方法に関する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９を予防するための積極的な免疫化のための方法を提供する。
【0085】
近年、ｓａ－ｍＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン）ワクチン接種が、ナノテクノロジーをベースとした革新的なワクチン戦略として認識されている（Andries, Kitada, et al., 2015）。ウイルスレプリコン粒子（すなわち、ウイルスカプシドタンパク質にカプセル化されたＲＮＡ）とは異なり、ＲＮＡレプリコンはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のみによって作製することができる。したがって、製造プロセス全体が完全に無細胞であり、その結果、組成が正確に定義された治療薬がもたらされる。ＲＮＡレプリコンワクチンは、非複製ワクチンと比較して発現期間（約２カ月）および発現の大きさが延長されるなど、いくつかの魅力的な特徴を有する（Kowalski et al., 2019）。さらに、ｓａ－ｍＲＮＡの細胞内複製は一過性であり、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はパターン認識受容体を誘発することによりインターフェロンを介した宿主防御機構を誘発する。その結果、挿入された標的分子に対する強力な抗原特異的免疫応答が生じる。このように、ｓａ－ｍＲＮＡベクター系は、高い一過性の導入遺伝子発現と固有のアジュバント効果を提供するため、ワクチン開発に理想的に適している（Sahin et al., 2014）。
【0086】
本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子（例えば、ネイキッドＲＮＡの形態で送達される場合）は、それ自体を増幅し、宿主細胞における異種遺伝子産物の発現と過剰発現を開始させることができる。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡとは異なり、それ自身のコード化されたウイルスポリメラーゼを使用して自己を増幅する。アルファウイルスに基づくものなど、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、大量のサブゲノムｍＲＮＡを生成し、そこから大量のタンパク質（またはスモールＲＮＡ）を発現させることができる。自己複製ＲＮＡ分子は、本明細書では「レプリコン」ともいう。
【0087】
定義
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドと、少なくとも１つのリン酸を含む分子を指す技術用語である。ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドは、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素塩基に連結した単一の５炭素糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含有する。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドアナログ」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の窒素塩基中または上に１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含むヌクレオチドのことを言う。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖アナログ、または開鎖糖アナログ）、またはリン酸中または上にさらなる化学修飾を含むことができる。ＲＮＡ配列は、その「ＤＮＡ等価」配列を使用して本明細書に提示されることがある。周知のように、ＤＮＡ等価配列は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に置き換えることによって、それが表すＲＮＡ配列に容易に変換することができる。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドと、少なくとも１つのリン酸を含む分子を指す技術用語である。ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドは、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素塩基に連結した単一の５炭素糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含有する。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドアナログ」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の窒素塩基中または上に１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含むヌクレオチドのことを言う。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖アナログ、または開鎖糖アナログ）、またはリン酸中または上にさらなる化学修飾を含むことができる。ＲＮＡ配列は、その「ＤＮＡ等価」配列を使用して本明細書に提示されることがある。周知のように、ＤＮＡ等価配列は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に置き換えることによって、それが表すＲＮＡ配列に容易に変換することができる。
【0088】
「配列の同一性」。２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列の同一性パーセントは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセントと定義される。アミノ酸または核酸配列の同一性パーセントを決定することを目的としたアライメントは、様々な従来の方法で達成することができ、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1):387, 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）を用いる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である（BLAST Manual Altschul et al. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al. J. Mol.Biol. 215:403-410, 1990）。熟練した技術者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを求めることができる。同一性および類似性を求める方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。
【0089】
自己複製ＲＮＡの「有効量」とは、検出可能な量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の発現を誘発するのに十分な量、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的応答を誘発するのに十分な量、好ましくは所望の治療または予防効果をもたらすのに適した量のことをいう。
【0090】
本明細書で使用する「ネイキッド」という用語は、脂質、ポリマー、およびタンパク質などの他の高分子を実質的に含まない核酸を指す。自己複製ＲＮＡのような「ネイキッド」核酸は、細胞への取り込みを改善するために他の高分子と配合されることはない。したがって、ネイキッド核酸は、リポソーム、マイクロ粒子またはナノ粒子、カチオン性エマルジョンなどにカプセル化されたり、それに吸着されたり、結合されたりはしていない。
【0091】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、疾患もしくは状態の症状の緩和、軽減または改善、追加の症状の予防、症状の根本的な代謝原因の改善または予防、疾患もしくは状態の抑制、例えば、疾患もしくは状態の発生の阻止、疾患もしくは状態の緩和、疾患もしくは状態の退行の発生、疾患もしくは状態により引き起こされる状態の緩和、または疾患もしくは状態の症状の停止を含む。用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、予防的および／または治療的な治療を含むが、これらに限定されない。
【0092】
本明細書で使用する場合、用語「コロナウイルス疾患」は、コロナウイルスへの感染に関連する疾患、特にコロナウイルスへの感染に起因する疾患を指す。
【0093】
本明細書で使用する場合、用語「コロナウイルス」には、サブファミリーのレトロウイルス亜科およびオルトコロナウイルス亜科を含むがこれらに限定されないコロナウイルス科の任意のメンバーが含まれる。したがって、それらは、アルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、ガンマコロナウイルス属、およびデルタコロナウイルス属を含む。本発明の文脈において好ましいコロナウイルスは、ベータコロナウイルス、特に重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む）である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、変異型と呼ばれる様々な既知の変異を有し、それによって変異型は、類似の特徴的変異の集積に関連し得る（系統と呼ばれる）。最初の変異型であるＢ１．１．７は英国で発生し、スパイクタンパク質をコードする遺伝子に３つの重要な変異：Ｎ５０１Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｈ６９－Ｖ７０を含んでいる。第二の変異型、Ｂ．１．３５１は南アフリカで最初に確認され、スパイクタンパク質をコードする領域に３つの重要な置換変異：Ｎ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋを含んでいる。。第３の変異型、Ｐ．１はブラジルで生まれたもので、南アフリカの変異型と同様にスパイクタンパク質をコードする遺伝子に重要な変異を含んでいる。第４の変異型、Ｂ．１．６１７はインドで最初に確認され、スパイクタンパク質をコードする領域に３つの重要な置換変異：Ｅ４８４ｑ、Ｌ４５２ｒ、Ｐ６８１ｒを含んでいる。本明細書で使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２という用語は、変異型が具体的に言及されていない限り、現在までに知られているすべての変異型を包含している。
【0094】
本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」とは、抗原（＝異物）によって引き起こされ、その結果、原因物質を殺す、または抑制することで病気と闘うことのできる抗体が作られる反応に関連する。
【0095】
本明細書で使用する場合、用語「アルファウイルス」は、ほぼ全世界で発生するエンベロープ型で一本鎖の、ポジティブセンスＲＮＡウイルスのトガウイルス科の属（アルファウイルス）を含む。アルファウイルスは、主に、蚊を媒介物として齧歯類、霊長類、鳥類内で維持される動物由来感染症の病原体であるが、魚類やアザラシに感染するものもあり、節足動物を媒介しない場合もある。ヒト疾患は、ヒトが風土病感染地に侵入して感染した蚊に刺されるか、または、アルファウイルスが出現して家畜流行病もしくは流行病を引き起こしたりした場合に起こる。
【0096】
本明細書で用いる場合、サブゲノムプロモータという用語は、サブゲノムＲＮＡ種の産生に必要な機能的要素を構成する配列を意味する。サブゲノムプロモータは、ＲＮＡを鋳型として用いて遺伝子の発現を駆動するために必要であり；サブゲノムプロモータは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ウイルスＲＮＡレプリカーゼであってもよい）により認識される。プロモータ自体は、天然由来または合成の２つ以上のソースに由来するセグメントの複合体であってもよい。サブゲノムプロモータは、サブゲノムＲＮＡ種またはそれが転写を開始する特定の遺伝子に関連して位置し、それが適切な（－）極性のＲＮＡ分子内に含まれるとき、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（またはウイルスＲＮＡレプリカーゼ）により機能的に認識されることに留意されたい。サブゲノムプロモータの機能コピーを含む（－）センスＲＮＡ分子は、コアプロモータと活性化ドメインの機能単位を含み、（＋）センスＲＮＡ分子を鋳型としてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるか、または（細胞性）ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってｐｏｌＩＩプロモータが開始する転写物として合成された可能性がある。
【0097】
本発明によれば、ワクチンは少なくとも１つの５’末端キャップを有していてもよく、脂質ナノ粒子内で製剤化される。ポリヌクレオチドの５’－キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成するために以下の化学ＲＮＡキャップアナログを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ－転写反応中に同時に完了させてもよい：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］; Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ; Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ; ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ; ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、ワクチンウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了させて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓｃａｐ）を生成することができる。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成されて、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏメチルを生成することができる。キャップ２構造は、キャップ１構造に続き、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’末端から３番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造に続き、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して５’末端から４番目のヌクレオチドを２’－Ｏメチル化することにより背性することができる。酵素は、組換え起源に由来してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドの５’－キャッピングは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐＧまたはｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡ（CellScript Inc）、ＣｌｅａｎＣａｐ（TriLink Biotechnologies LLC）、５’－ホスホロチオレートキャップアナログ（Univ. Warszawski）、または代替キャップアナログの使用による共転写キャッピングによって達成されてもよい。
【0098】
本明細書で使用する場合、用語「３’－ポリ（Ａ）テール」または「ポリ（Ａ）テール」は、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加される一続きのアデニンヌクレオチドである。ある場合には、１５０ヌクレオチドと短く、または約５００アデニンヌクレオチドまでを含むこともある。ある場合には、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須の要素である場合がある。前記長さは、最大約４００アデニンヌクレオチド、例えば約２０～約４００、好ましくは約５０～約４００、より好ましくは約５０～約３００、さらに好ましくは約５０～約２５０、最も好ましくは約６０～約２５０アデニンヌクレオチドであり得る。ポリ（Ａ）配列は、典型的には、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明の文脈において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡまたは任意の他の核酸分子内、例えば、ベクター内、例えば、ベクターの転写によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの生成のための鋳型として機能するベクター内に位置してもよい。
【0099】
本明細書で使用する場合、５’－キャップは、一般に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的には修飾ヌクレオチドの実体である。５’－キャップは、典型的には、修飾ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’－キャップは、５’－５’－三リン酸結合を介して５’末端に連結される。５’－キャップはメチル化されていてもよく、例えばｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’－キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的にはＲＮＡの５’末端である）。５’－キャップ構造のさらなる例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基性残基（部分）、４’、５’メチレンヌクレオチド、ｌ－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド。炭素環ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、α－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’、４’－セコナクレオチド、非環状３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位脱塩基性部位、３’－２’－逆位ヌクレオチド部分、３’－２’－逆位脱塩基性部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。本発明の文脈において使用され得るさらに修飾された５’－キャップ構造は、キャップ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第２ヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ３（ｍ７ＧｐｐｐＮ下流の第３ヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ４（ｍ７ＧｐｐｐＮ下流の第４ヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（抗逆キャップアナログ、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオログアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンである。特に好ましい５’－キャップは、ＴｒｉＬｉｎｋ社から提供されているＣｌｅａｎＣａｐ構造である。
【0100】
本明細書で使用する場合、用語「５’－ＵＴＲ」は、通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定のセクションを指す。それは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’に位置する。典型的には、５’－ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの１ヌクレオチド前で終わる。５’－ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するためのエレメント（調節エレメントとも呼ばれる）を含んでいてもよい。このような調節エレメントは、例えば、リボソーム結合部位または５’末端オリゴピリミジン領域であってもよい。５’－ＵＴＲは、例えば、５’－キャップの付加によって転写後に修飾されてもよい。本発明の文脈では、５’－ＵＴＲは、５’－キャップと開始コドンの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。好ましくは、５’－ＵＴＲは、５’－キャップに対して３’側に位置するヌクレオチド、好ましくは５’－キャップの３’側直ぐに位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチド、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンの５’側直ぐに位置するヌクレオチドまで伸びる配列に相当する。成熟ｍＲＮＡの５’－キャップの３’側直ぐに位置するヌクレオチドは、典型的には、転写開始部位に相当する。用語「対応する」は、５’－ＵＴＲ配列が、５’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明の文脈において、用語「遺伝子の５’－ＵＴＲ」、例えば「ＴＯＰ遺伝子の５’－ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡ、すなわち遺伝子の転写および成熟前のｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに相当する配列である。用語「遺伝子の５’－ＵＴＲ」は、５’－ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。好ましくは、本発明に従って使用される５’－ＵＴＲは、ｍＲＮＡ配列のコーディング領域と異種である。天然に存在する遺伝子に由来する５’－ＵＴＲが好ましいとしても、本発明の文脈では、合成的に操作されたＵＴＲもまた使用され得る。
【0101】
本発明の文脈では、３’－ＵＴＲは、典型的には、タンパク質コード領域（すなわち、オープンリーディングフレーム）とｍＲＮＡの３’末端の間に位置するｍＲＮＡの一部である。ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲは、アミノ酸配列には翻訳されない。３’－ＵＴＲ配列は、一般に、遺伝子によってコードされ、これは、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される。本発明の文脈において、３’－ＵＴＲは、タンパク質コード領域の停止コドンの３’側、好ましくはタンパク質コード領域の停止コドンの３’側直ぐに位置し、ｍＲＮＡの３’末端またはポリ（Ａ）配列の５’側まで、好ましくはポリ（Ａ）配列の５’側直ぐのヌクレオチドまで伸長している、成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。用語「対応する」は、３’－ＵＴＲ配列が、３’－ＵＴＲ配列を定義するために使用されるｍＲＮＡ配列等におけるＲＮＡ配列であってもよいし、かかるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であってよいことを意味する。本発明の文脈において、用語「遺伝子の３’－ＵＴＲ」、例えば「アルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡ、すなわち遺伝子の転写および前熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに相当する配列である。用語「遺伝子の３’－ＵＴＲ」は、３’－ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。好ましくは、本発明に従って使用される３’－ＵＴＲは、ｍＲＮＡ配列のコーディング領域とは異種である。天然に存在する遺伝子に由来する３’－ＵＴＲが好ましいとしても、本発明の文脈では、合成的に操作されたＵＴＲもまた使用され得る。
【0102】
本発明の文脈におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的には、ペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る、いくつかのヌクレオチド三連の配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、その５’末端において通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ）と、それに続く、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくはストップコドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終わる。典型的には、これは、オープンリーディングフレームの唯一のストップコドンである。したがって、本発明の文脈におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えばＡＴＧ）で始まり、好ましくはストップコドン（例えばＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧ）で終わる、３で割り切れる数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離されていてもよいし、例えばベクターまたはｍＲＮＡなどのより長い核酸配列に組み込まれていてもよい。オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」とも呼ばれることもある。
【0103】
本発明の文脈における複製起点（ＯＲＩ）は、典型的には、染色体、プラスミドまたはウイルス上で複製が開始されるＤＮＡの配列であり得る。細菌のプラスミドや小さなウイルスなどの小さなＤＮＡの場合、起点は１つで十分である。より大きなＤＮＡは多くの起点を持つことができ、ＤＮＡ複製はそれらのすべてで開始される。複製起点はベクターコピー数により決められ、これは、典型的には、発現ベクターが低コピー数のプラスミドに由来する場合は２５－５０コピー／細胞の範囲、高コピー数のプラスミドに由来する場合は１５０～２００コピー／細胞の範囲となる。コピー数はプラスミドの安定性、すなわち細胞分裂の際に細胞内でプラスミドが維持されるかに影響する。コピー数が多いことの＋効果は、細胞分裂時にランダムな分割が行われる際に、プラスミドがより安定に維持されることであり得る。一方、プラスミドが多いと増殖速度が低下するため、プラスミドが少ない細胞は増殖速度が速いことから培養を支配できる可能性がある。複製起点はまた、プラスミドの互換性：同じ細菌細胞内で別のプラスミドと組み合わせて複製する能力を決定することもある。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌細胞内で共存することはできない。これらは同じ互換性グループに属すると言われている。同じ互換性グループから２番目のプラスミドという形で新しい起源を導入すると、常在しているプラスミドの複製結果を模倣する。したがって、２つのプラスミドが異なる細胞に分離されて複製前の正しいコピー数が作られるまでは、さらなる複製は阻止される。
【0104】
自己複製ＲＮＡ分子
近年、ｓａ－ｍＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン）ワクチン接種は、ナノテクノロジーに基づく革新的なワクチン戦略として認識されている（Andries, Kitada, et al., 2015）。前述のように、ウイルスレプリコン粒子（すなわち、ウイルスカプシドタンパク質にカプセル化されたＲＮＡ）とは異なり、ＲＮＡレプリコンはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のみで作製することが可能である。したがって、製造プロセス全体が完全に無細胞であり、その結果、組成が正確に定義された治療薬が得られる。ＲＮＡレプリコンワクチンは、非複製対応物と比較して発現期間（約２カ月）および発現の大きさが延長されるなど、いくつかの魅力的な特徴を有する（Kowalski et al., 2019）。さらに、ｓａ－ｍＲＮＡの細胞内複製は一過性であり、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はパターン認識受容体を誘発することによりインターフェロンを介した宿主防御機構を誘発する。その結果、挿入された標的分子に対する強力な抗原特異的免疫応答が生じる。このように、ｓａ－ｍＲＮＡベクター系は、高い一過性の導入遺伝子発現と固有のアジュバント効果を提供するため、ワクチン開発に理想的に適している（Sahin et al., 2014）。
近年、ｓａ－ｍＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン）ワクチン接種は、ナノテクノロジーに基づく革新的なワクチン戦略として認識されている（Andries, Kitada, et al., 2015）。前述のように、ウイルスレプリコン粒子（すなわち、ウイルスカプシドタンパク質にカプセル化されたＲＮＡ）とは異なり、ＲＮＡレプリコンはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のみで作製することが可能である。したがって、製造プロセス全体が完全に無細胞であり、その結果、組成が正確に定義された治療薬が得られる。ＲＮＡレプリコンワクチンは、非複製対応物と比較して発現期間（約２カ月）および発現の大きさが延長されるなど、いくつかの魅力的な特徴を有する（Kowalski et al., 2019）。さらに、ｓａ－ｍＲＮＡの細胞内複製は一過性であり、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はパターン認識受容体を誘発することによりインターフェロンを介した宿主防御機構を誘発する。その結果、挿入された標的分子に対する強力な抗原特異的免疫応答が生じる。このように、ｓａ－ｍＲＮＡベクター系は、高い一過性の導入遺伝子発現と固有のアジュバント効果を提供するため、ワクチン開発に理想的に適している（Sahin et al., 2014）。
【0105】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡを基にしているが、１つまたは複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠いている。自己複製ＲＮＡ分子は、翻訳されてＲＮＡウイルスの非構造タンパク質および自己複製ＲＮＡによってコードされる異種タンパク質を産生することが可能である。
【0106】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導できないように設計することができる。これは、例えば、自己複製ＲＮＡにおいてウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を省くことによって達成することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がシンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づく場合、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を省くことが可能である。所望であれば、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、減弱性または毒性の感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように、またはその後の１ラウンドの感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【0107】
自己複製を達成するための適切な系の１つは、アルファウイルスに基づくＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの＋鎖レプリコンは、細胞に送達された後翻訳されて、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ－転写酵素）を提供する。このレプリカーゼはポリタンパク質として翻訳され、自動的に切断されて複製複合体となり、送達された＋鎖ＲＮＡのゲノム－鎖コピーを作り出す。これらの－鎖の転写物は、それ自体が転写されて、＋鎖の親ＲＮＡのさらなるコピーを提供し、また所望の遺伝子産物をコードするサブゲノム転写物を提供することができる。このようにして、サブゲノム転写物の翻訳が、感染細胞による所望の遺伝子産物のｉｎ ｓｉｔｕ発現につながる。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス等からのレプリカーゼを使用することができる。
【0108】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている。ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ、例えばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むものであり得る。
【0109】
天然のアルファウイルスゲノムが、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードしているのに対し、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしていないのが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、細胞内でそれ自身のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことはできるが、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生には至らない。このようにビリオンを作れないということは、野生型のアルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子は感染性の形態で自身を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおける永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、その代わりに所望の遺伝子産物をコードしている遺伝子が存在するため、サブゲノム転写物は、アルファウイルスビリオン構造タンパク質ではなく、所望の遺伝子産物をコードすることになる。したがって、特定の実施形態において、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列とを含む。より詳細には、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、４つの非構造性アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列とを含む。好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの構造アルファウイルスタンパク質を産生する能力を欠くように操作されたアルファウイルスに由来する。より好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも２つの、より好ましくはすべての、構造アルファウイルスタンパク質を産生する能力を欠くように操作されたアルファウイルスに由来する。特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、５’から３’の順に、（ｉ）非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’配列と、（ｉｉ）アルファウイルス、特にベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードしているヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモータであって、異種核酸配列がアルファウイルス構造タンパク質遺伝子の一つまたは全てを置換する、プロモータと、（ｉｖ）非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’配列と、（ｖ）ポリアデニル酸トラクトとを含む。
【0110】
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有することができる。第１（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼ、特にアルファウイルスの非構造タンパク質をコードし; 第２（３’）オープンリーディングフレームは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている。
【0111】
ある態様では、自己複製ＲＮＡ分子はアルファウイルスに由来するか、またはアルファウイルスに基づくものである。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子はアルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、ヘパシウイルス、またはカリシウイルスから得られるかまたはそれらに基づく。適切な野生型アルファウイルス配列は周知であり、配列保管所、例えばAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md.から入手可能である。好適なアルファウイルスの代表例としては、アウラ（ＡＴＣＣ ＶＲ－３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６００、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４０）、カバス（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６４、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４１）、東部馬脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６５，ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３６９、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４３）、キジラガク（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ ＶＲ－６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１２７７）、ミドルバーグ（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－５８０、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４４）、ヌヅム（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７１），ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７２、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６８、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４８）、トナテ（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ ＶＲ－４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７４）、ベネズエラ馬脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ－６９、ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０ ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２）、西洋馬脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ－７０、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ－６２２、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５２）、ホワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２６）およびＹ－６２－３３（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７５）がある。特定の実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。より特定の実施形態では、アルファウイルスは、株ＴＣ－８３または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する株などの生きた減衰ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。株ＴＣ－８３は公的に入手可能であり、そのゲノムはＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｌ０１４４３．１で存在する。
【0112】
自己複製ＲＮＡ分子生成およびワクチン接種のための使用を改善するアルファウイルスの様々な遺伝子改変変異型が生成されており、例えば、米国特許出願公開第２０１５２９９７２８号明細書、国際公開第１９９９０１８２２６号および米国特許第７３３２３２２号明細書（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているようなものである。特に、レプリコンの５’ＵＴＲの第３ヌクレオチドとしてグアニンを有すること、および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）においてＱ７３９Ｌ変異を有することが有益であることが見出されている。したがって、本発明の特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、５’ＵＴＲにおいてＡ３Ｇ変異を含む。別の特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）においてＱ７３９Ｌ変異を含む。好ましい実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス、特にＶＥＥＶ、より詳細にはＶＥＥＶ ＴＣ－８３の非構造タンパク質をコードしている配列を含み、自己複製ＲＮＡ分子は、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異およびｎｓＰ２におけるＱ７３９Ｌ変異を含んでいる。さらにより好ましい実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＶＥＥＶ ＴＣ－８３の非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしており、好ましくはＱ７３９Ｌ変異がｎｓＰ２中に存在する。一実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４からなる群から選択される配列を含むタンパク質、または各例において少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より一層好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている。さらなる実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の配列を含むタンパク質、または各例において少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている。さらなる実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の配列を含むタンパク質、または各例において少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている。ＮｓＰ３とＮｓＰ４の間には、稀にリードスルーを伴うストップコドンが存在する可能性がある。これにより、非構造タンパク質の様々な前駆体が形成され、ｎｓＰ１－３またはｎｓＰ１－４のいずれかになる可能性がある。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を構成するタンパク質（ｎｓＰ１－４前駆体に存在するｎｓＰ３）は、本発明のいくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（稀にリードスルーを有するストップコドンにより、ｎｓＰ１－３前駆体に存在するｎｓＰ３）を包含している。
【0113】
特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＲＮＡ等価物、またはそれに対し少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、任意に１つまたは複数の追加の配列で中断されている。さらなる実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＲＮＡ等価物、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、前記配列は、好ましくは前記配列のヌクレオチド７５６７付近で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のいずれか１つなどの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする１つまたは複数の配列で中断されている。
【0114】
本明細書の開示内容から明らかなように、好ましくは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原である。したがって、特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のＲＮＡ等価物、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、前記配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列で中断されている。好ましい実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のＲＮＡ等価物、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、前記配列は任意に１つまたは複数の追加の配列で中断されている。そのような追加の配列は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、例えばヌクレオカプシドタンパク質抗原および／または膜タンパク質抗原をコードしていてもよい。特に、そのような追加の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列を含むタンパク質をコードしていてもよい。別の実施形態では、そのような追加の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のＲＮＡ等価物を含んでいてもよい。
【0115】
ある特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のＲＮＡ等価物、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列またはその抗原性断片を含むタンパク質をコードしている配列など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列で中断されている。別の特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のＲＮＡ等価物、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列またはその抗原性断片を含むタンパク質をコードしている配列など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている配列で中断されている。
【0116】
本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子は、２つ以上のオープンリーディングフレームから、複数のヌクレオチド配列を発現するように操作され得、それによって、サイトカインまたは他の免疫調節物質とともに２つ以上の抗原などのタンパク質を共発現することができ、免疫応答の生成を高めることができる。このような自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、二価もしくは多価ワクチンとして、様々な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を同時に生産する場合、または遺伝子治療への応用において特に有用である可能性がある。
【0117】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原
本発明での使用のために、任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原を使用することができ、これは、自己複製ＲＮＡ分子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列を含むことを意味する。特に興味深いのは、スパイクタンパク質（Ｓタンパク質とも呼ばれる）、膜タンパク質（Ｍタンパク質とも呼ばれる）、またはヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質とも呼ばれる）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原である。用語「抗原」は、抗原性断片を包含する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、全長スパイクタンパク質の他、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）等の抗原性断片およびそのような抗原性断片を含む融合分子を包含する。
本発明での使用のために、任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原を使用することができ、これは、自己複製ＲＮＡ分子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列を含むことを意味する。特に興味深いのは、スパイクタンパク質（Ｓタンパク質とも呼ばれる）、膜タンパク質（Ｍタンパク質とも呼ばれる）、またはヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質とも呼ばれる）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原である。用語「抗原」は、抗原性断片を包含する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、全長スパイクタンパク質の他、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）等の抗原性断片およびそのような抗原性断片を含む融合分子を包含する。
【0118】
本明細書の開示内容から理解されるように、自己複製ＲＮＡ分子は、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原を含む。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、スパイクタンパク質の切断型である。ある特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の少なくとも１５、特に少なくとも２０、より特に少なくとも２５の連続したアミノ酸を含む。さらなる特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のＲＮＡ等価物、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のＲＮＡ等価物に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0119】
別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。さらに別の特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、ＲＢＤを含むスパイクタンパク質の切断型である。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、任意に別のペプチドに融合したＲＢＤから本質的になる。したがって、特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、任意に別のペプチドに融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、任意に別のペプチドに融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から本質的になるアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＲＮＡ等価物、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＲＮＡ等価物と少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、リーダーペプチド、例えば、限定するわけではないが、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターリーダーペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列）およびＩｇＧカッパ軽鎖リーダー配列などが先行してもよい。
【0120】
さらなる実施形態では、スパイクタンパク質は、任意にリンカー配列を介して、免疫刺激タンパク質に融合している。本発明の適用には、異なる免疫刺激性タンパク質を使用することができる。本発明で使用するための好ましい免疫刺激タンパク質は、Zhang et al. (Vaccine 2011,29:629-635)に記載されているような、Ｃ３ｄ－ｐ２８、特にＣ３ｄ－ｐ２８．６である。したがって、特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、Ｃ３ｄ－ｐ２８に融合した受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。さらに別の特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、Ｃ３ｄ－ｐ２８に融合したＲＢＤを含むスパイクタンパク質の切断型である。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、Ｃ３ｄ－ｐ２８に融合し、任意に別のペプチドに融合したＲＢＤから本質的になる。したがって、特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、任意に別のペプチドに融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、任意に別のペプチドに融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から本質的になるアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＲＮＡ等価物、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＲＮＡ等価物に対し少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0121】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原は、別のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原と組み合わされる。これにより、ワクチン接種の効果をより高めることができることが分かっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、例えば、本明細書に記載されるような異なる自己複製ＲＮＡ分子中で提供することによって、または異なる抗原をコードしている本明細書に記載されるような単一の自己複製ＲＮＡ分子を提供することによって、組み合わせることができる。
【0122】
したがって、本発明の一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と、さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列とを含む組み合わせが提供される。好ましくは、さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原である。
【0123】
本発明による組み合わせの一実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列は、同じ自己複製ＲＮＡ分子に含まれる。１つの特定の実施形態において、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、好ましくは（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原と、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている。１つの特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原と、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている。別の特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原と（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている。
【0124】
本発明による組み合わせの別の実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列は、別々の自己複製ＲＮＡ分子中に含まれる。ある特定の実施形態では、組み合わせは、それぞれが１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、好ましくは（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原と、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている２つの異なる自己複製ＲＮＡ分子を含む。ある特定の実施形態では、組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている１つの自己複製ＲＮＡ分子と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている第２の自己複製ＲＮＡ分子を含む。別の特定の実施形態では、組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている１つの自己複製ＲＮＡ分子と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質抗原をコードしている第２の自己複製ＲＮＡ分子を含む。
【0125】
自己複製ＲＮＡ分子の送達
一般的な分類では、標的細胞に遺伝物質を導入するために２種類のベクターが使用される。一方は、前駆体ウイルスの挙動を模倣したウイルスベクターが使用される。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなど、さまざまな種類のベクターが採用されており、ヨーロッパでは臨床使用も認可されているほどである。もう一方で、その組成によって説明できる非ウイルス性ベクターがある。最も引用されているのは、リポプレックス（脂質＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびポリプレックス（ポリマー＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）である（Perez Ruiz de Garibay, 2016）。また、エレクトロポレーションによって遺伝子を挿入することも可能である。細胞から異物を導入するこのプロセスは、細胞膜の透過性を高めるために、細胞に電界をかけることで機能する。このプロジェクトでは、非ウイルス性の送達系の研究に焦点を当てることとする。
一般的な分類では、標的細胞に遺伝物質を導入するために２種類のベクターが使用される。一方は、前駆体ウイルスの挙動を模倣したウイルスベクターが使用される。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなど、さまざまな種類のベクターが採用されており、ヨーロッパでは臨床使用も認可されているほどである。もう一方で、その組成によって説明できる非ウイルス性ベクターがある。最も引用されているのは、リポプレックス（脂質＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびポリプレックス（ポリマー＋ＤＮＡまたはＲＮＡ）である（Perez Ruiz de Garibay, 2016）。また、エレクトロポレーションによって遺伝子を挿入することも可能である。細胞から異物を導入するこのプロセスは、細胞膜の透過性を高めるために、細胞に電界をかけることで機能する。このプロジェクトでは、非ウイルス性の送達系の研究に焦点を当てることとする。
【0126】
本発明の自己複製ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡの送達、または細胞への侵入を容易にする脂質、ポリマーもしくは他の化合物との組み合わせを含む様々な様式での送達に適している。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適切な技術、例えば、直接注入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティックなどによって、標的細胞または対象に導入することができる。
【0127】
自己複製ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡとして（例えば、単にＲＮＡの水溶液として）送達することができるが、細胞への侵入およびその後の細胞間効果を高めるために、自己複製ＲＮＡは、リポソームまたはナノ粒子などの送達系と組み合わせて投与されることが好ましい。
【0128】
リポソームを作成するために、様々な両親媒性脂質に水性環境下で二重層を形成させて、ＲＮＡを含む水性コアをカプセル化することが可能である。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性または双性イオン性の親水性頭部基を持つことができる。一部のリン脂質は陰イオン性であるが、他のリン脂質は双性イオン性である。
【0129】
リポソームは、単一の脂質から、または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）双性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質の混合物、（ｖ）アニオン性脂質と双性イオン性脂質の混合物、（ｖｉ）双性イオン性脂質とカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質および双性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質と不飽和脂質の両方を含んでもよい。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（双性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物中のすべての成分脂質が両親媒性である必要はなく、例えば、１つまたは複数の両親媒性脂質がコレステロールと混合されることも可能である。ＲＮＡは好ましくはリポソーム内にカプセル化され、従ってリポソームは水性ＲＮＡ含有コアの周りに外層を形成する。
【0130】
ｍＲＮＡをナノ粒子に配合した効率的な送達系は、細胞への取り込みを増加させ、ｍＲＮＡをＲＮａｓｅから保護することができます。後者は、ｍＲＮＡが血液または粘液のような生体流体に接触する経路で投与される場合に特に重要である。脂質ベースの担体、ポリマーベースの担体、ならびにカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはデンドリプレックス（デンドリマー＋ＤＮＡ／ＲＮＡ）などのハイブリッドおよび他のナノ製剤がｉｎ ｖｉｖｏで評価された（Perez Ruiz de Garibay, 2016）。使用されるｍＲＮＡの脂質製剤のほとんどは、むしろ単純であり、脂質とｍＲＮＡの通常の混合を伴う。さらに、得られたｍＲＮＡ－リポソーム複合体は、生理的ｐＨで正に帯電していることが多く、それゆえ、生体液中に存在する負に帯電した（マクロ）分子と相互作用しやすい。さらに、そのような帯電したｍＲＮＡ－複合体は、免疫細胞によって急速に捕捉される（Zhong et al., 2018）。
【0131】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡのためのより高度な脂質製剤として導入され（Moss et al., 2007; Islam et al., 2015; Kauffman et al., 2016; Granot &peer, 2017; Hajj & Whitehead, 2017; B. Li et al., 2019）、ｍＲＮＡ治療薬のｉｎ ｖｉｖｏ送達のための理想的候補として考えられている。ＬＮＰの特徴は、生理的ｐＨでは準中性であるが、酸性ｐＨでは陽性となるナノ粒子にｍＲＮＡをカプセル化することである。このため、アルブミンなどの生体液中の荷電（マクロ）分子がＬＮＰに大量に結合することを防ぐことができる。一方、酸性エンドソームでは、ｐＨ応答性脂質がプロトン化することにより、ｍＲＮＡのエンドソームからの脱出が促進される。ＬＮＰのｐＨ応答性は、適切なｐＫａを持つイオン化可能な脂質の存在に起因する。すなわち、脂質は低いｐＨでは正に帯電し、生理的ｐＨ付近では中性である。このようなｐＨ応答性脂質と専用の混合手順により、ｍＲＮＡを効率的にカプセル化することができる。
【0132】
ＬＮＰ－ｃｍＲＮＡをベースとする系は、嚢胞性線維症および他の一遺伝子性疾患の矯正のための強力なプラットフォーム技術になる可能性がある。肺へのＬＮＰ－ｃｍＲＮＡの投与は、非侵襲的なツールとして、エアロゾル吸入／ネブライゼーションによって行うことができる。Johler et al., (2015)は、タンパク質の持続時間にもカチオン性複合体の毒性にも影響しないカチオン性ＩＶＴ ｍＲＮＡ複合体のエアロゾル化が、嚢胞性線維症などの遺伝子疾患のタンパク質置換を目的とした肺の細胞をトランスフェクトする潜在的に強力な手段を構成し、トランスフェクト剤としてのｐＤＮＡと比較してＩＶＴ ｍＲＮＡの利点も伴っていることを示した（Johler et al., 2015)。Robinson et al., (2018)は、野生型嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードしているｍＲＮＡ－ＬＮＰの鼻腔内投与が、ＣＦＴＲノックアウトマウスの誘導気道におけるＣＦＴＲ媒介塩化物分泌を回復することを立証した（Robinson et al., 2018b）。また、特定の用途では、特定の細胞型または組織を標的にする必要がある。例えば、最近では、希少な細胞型であるＦｏｘｉ１＋肺イオノサイトが、マウス（Ｃｆｔｒ）とヒト（ＣＦＴＲ）の両方において嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子の転写物の主要な供給源として特定された（Montoro et al., 2018）。ｍＲＮＡ治療薬の標的送達がｍＲＮＡ送達分野のホットトピックになると予想されるため、この新しい細胞型はｍＲＮＡ治療薬の理想的な標的となり、イノベーションの大きな機会を提供する可能性がある。
【0133】
さらに、脂質ベースのマイクロ／ナノ粒子は、生体適合性があり、粘膜の生理的障壁を克服でき、上皮のＡｇ横断およびＡＰＣによる取り込みを促進し、関連ペイロードを保護し、アジュバントを組み込むのに適切であり、粘着特性を示す場合があるので、ワクチン接種用の興味深い抗原（Ａｇ）－送達系の望ましい特徴のいくつかを有し得る（Corthesy & Bioley, 2018）。Geall et al. (2012)は、脂質ナノ粒子カプセル化ｓａ－ｍＲＮＡワクチンが、ＨＩＶおよび呼吸器合胞体ウイルスの抗原に対する機能的免疫応答を誘発することを示した（Geall et al., 2012）。
【0134】
本開示の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般に知られているような成分、組成物、および方法を用いて生成することができ、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６号; ＰＣＴ／ＵＳ６０００１２９号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２号; ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１号を参照されたい（これらは全て参照により全体としてここに組み込まれるものとする）。
【0135】
特に好ましい実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、脂質ナノ粒子にカプセル化されている。
【0136】
自己複製ＲＮＡ分子の送達について上述したすべての実施形態は、上述したように、いくつかの異なる自己複製ＲＮＡ分子の組み合わせの送達にも等しく適用される。特に、別々の自己複製ＲＮＡ分子に含まれる複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列が送達される場合、これらは、１つの単一のリポソームで送達することもできるし、別々のリポソームで送達することもできる。任意に、製剤のさらなる取り扱いを容易にするために、別々のリポソームを送達の前に混合することができる。前記別々のリポソームは、異なる自己複製ＲＮＡ分子を効率的にカプセル化、結合または吸着するように、同じ組成または異なる組成を有し得る。
【0137】
したがって、本発明の１つの特定の実施形態は、上述の組み合わせに関連するものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列が異なる自己複製ＲＮＡ分子に含まれ、両方の自己複製ＲＮＡ分子は１つの単一のリポソームにカプセル化され、結合され、または吸着されている。本発明において２つ以上の異なる自己複製ＲＮＡ分子が使用される場合、異なる自己複製ＲＮＡ分子をカプセル化するリポソームは、同じ組成を有していてもよいし、異なる組成を有していてもよい。したがって、特定の実施形態において、本発明は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列を含む第１の自己複製ＲＮＡ分子と、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列を含む第２の自己複製ＲＮＡ分子を提供し、前記第１の自己複製ＲＮＡ分子は、第１のリポソームにカプセル化され、結合され、または吸着され、前記第２の自己複製ＲＮＡ分子は、第２のリポソームにカプセル化され、結合され、または吸着されていkる。第１および第２のリポソームは、同じ組成を有していても異なる組成を有していてもよく、特に、それらは同じ脂質を含んでいても異なる脂質を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、第１の自己複製ＲＮＡ分子は、第１のＬＮＰにカプセル化され、第２の自己複製ＲＮＡ分子は、第２のＬＮＰにカプセル化される。ある特定の実施形態では、第１のＬＮＰの組成は、第２のＬＮＰの組成と異なる。これは、例えば、第１の自己複製ＲＮＡ分子を第１のＬＮＰカプセル化混合物中にカプセル化し、第２の自己複製ＲＮＡ分子を第２のＬＮＰカプセル化混合物中にカプセル化することによって得ることができる。その後、第１および第２のカプセル化された自己複製ＲＮＡ分子を異なる組成物で提供してもよいし、それらを組み合わせて、両方のカプセル化された自己複製ＲＮＡ分子を含む組成物を得てもよい。
【0138】
本発明の別の特定の実施態様では、上記のようなものに関し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列が、異なる自己複製ＲＮＡ分子に含まれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列を含むｓａ－ＲＮＡ分子およびさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列を含むｓａ－ＲＮＡ分子は、別々のリポソームにカプセル化、結合または吸着されている。別々のリポソームは、２つの別々の組成物において送達され得る。任意に、別々のリポソームはまた、送達前に１つの単一組成物中で結合させることもできる。
【0139】
医薬組成物
本発明は、Ｓ、ＮもしくはＭタンパク質コード化自己複製ＲＮＡ配列、または２つもしくは３つのタンパク質コード化自己複製ＲＮＡ配列の組み合わせを含む医薬組成物に関する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子と１つまたは複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体およびリポソームなどの好適な送達系またはビヒクルが、典型的には含まれる。しかしながら、ｍＲＮＡはまた、エレクトロポレーションで、またはエレクトロポレーションなしで、ネイキッド状態でも送達され得る。少なくとも１つのアジュバントを医薬組成物に含めることができ、所望により他のアジュバントまたは賦形剤のような他の医薬成分を含めることができる。これらの成分は、抗ウイルスワクチンとして使用することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が異なる自己複製ＲＮＡ分子で提供される場合、これらの分子は、同じ組成物中に存在してもよいし、異なる組成物中に存在してもよい。
本発明は、Ｓ、ＮもしくはＭタンパク質コード化自己複製ＲＮＡ配列、または２つもしくは３つのタンパク質コード化自己複製ＲＮＡ配列の組み合わせを含む医薬組成物に関する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子と１つまたは複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体およびリポソームなどの好適な送達系またはビヒクルが、典型的には含まれる。しかしながら、ｍＲＮＡはまた、エレクトロポレーションで、またはエレクトロポレーションなしで、ネイキッド状態でも送達され得る。少なくとも１つのアジュバントを医薬組成物に含めることができ、所望により他のアジュバントまたは賦形剤のような他の医薬成分を含めることができる。これらの成分は、抗ウイルスワクチンとして使用することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が異なる自己複製ＲＮＡ分子で提供される場合、これらの分子は、同じ組成物中に存在してもよいし、異なる組成物中に存在してもよい。
【0140】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。続いて、本発明の医薬組成物の好適な製剤は多種多様である。自己複製ＲＮＡ分子は、カチオン性脂質、脂質ナノ粒子、リポソーム、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョンまたはそれらの組み合わせにカプセル化、結合、または吸着させることができる。
【0141】
医薬組成物は、好ましくは無菌であり、従来の滅菌技術によって滅菌することができる。
【0142】
組成物は、生理学的条件に近づけるために、薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整および／または緩衝剤ならびに浸透圧調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。
【0143】
医薬組成物のｐＨは、好ましくは５．０～９．５、例えば、６．０～８．０とする。
【0144】
本発明の医薬組成物の浸透圧は、ナトリウム塩、例えば、塩化ナトリウムで調整する必要がある場合がある。非経口投与のための医薬組成物の浸透圧は、典型的には０．９％または９ｍｇ／ＮａＣｌ ｍＬである。
【0145】
本発明の医薬組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２４０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有していてもよい。
【0146】
保存剤を含まないワクチンが好ましい。しかしながら、所望により、本発明の医薬組成物は、フェノールおよび２－フェノキシエタノールなどの１つまたは複数の保存剤を含んでもよい。水銀を含有する保存剤であるチオメルサルは、水銀を含有しない組成物が好ましいことから避けるべきである。
【0147】
本発明の医薬組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば、１用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵを含む。本発明の医薬組成物は、好ましくはグルテンフリーである。
【0148】
医薬組成物中の自己複製ＲＮＡの濃度は変化し得、特定の投与様式に従って、液量、粘性、体重および他の考慮事項に基づいて選択されるであろう。医薬組成物中の自己複製ＲＮＡの濃度は、単回投与または一連の投与の一部として、予防に有効であることが証明されているであろう。その量は、治療される個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）の健康、身体状態、年齢および分類群、抗原コード化タンパク質またはペプチドに反応する個体の免疫系の能力、治療される状態および他の関連要因によって変化する。本発明の組成物の自己複製ＲＮＡ含量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡ量で表されるであろう。好ましい用量は、０．１～１００μｇの自己複製ＲＮＡ、好ましくは０．５～９０μｇの自己複製ＲＮＡ、好ましくは０．１～７５μｇの自己複製ＲＮＡ、好ましくは０．１～５０μｇの自己複製ＲＮＡ、好ましくは０．５～５０μｇの自己複製ＲＮＡ、好ましくは０．５～２５μｇの自己複製ＲＮＡ、より好ましくは０．５～１０μｇの自己複製ＲＮＡ、より好ましくは１～１０μｇ、さらに好ましくは１～５μｇの自己複製ＲＮＡ、およびはるかに低いレベル（例えば、０．０５μｇ自己複製ＲＮＡ／ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用中の用量）である。
【0149】
適切な投与経路としては、経腸、非経口、および局所投与が挙げられる。
【0150】
非経口投与には、関節内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下注射が含まれる。筋肉内、皮内または皮下投与が好ましい。非経口投与に適した製剤には、水性および非水性の等張性無菌注射液が含まれ、これらには、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、保存剤および溶質が含まれ得る。
【0151】
限定するわけではないが、関節内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下注射などの非経口投与に適した製剤には、水性および非水性の等張性無菌注射液または懸濁液があり、これらには製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌、および溶質が含まれ得る。
【0152】
自己複製ＲＮＡ分子の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回投与用の密閉容器で提示することができる。注射液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、錠剤から調製することができる。また、自己複製ＲＮＡ分子によってトランスフェクトされた細胞を、静脈内または非経口的に投与することができる。
【0153】
前記製剤またはワクチンは、単回投与として、または予め定められた期間内に投与される２回以上の連続投与を必要とする複数回投与として投与することができる。このような期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間から最大１年までであってよい。
【0154】
実施形態では、製剤またはワクチンは、毎年または隔年など、定期的に投与される。
【0155】
適量は、０．０５～１ｍＬ、より好ましくは０．２５～０．７５ｍＬ、例えば０．５ｍＬとすることができる。
【0156】
医薬製剤がエマルジョンからなる場合、自己複製ＲＮＡ分子とエマルジョンは単純な振盪によって混ぜることができる。他の技術、例えば、エマルジョンと溶液または懸濁液の混合物を、小さな開口部（皮下注射針など）を通して自己複製ＲＮＡ分子と迅速に合わせ、医薬製剤を混ぜることも可能である。
【0157】
経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液、（ｂ）液体、固体、顆粒またはゼラチンとして所与の量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、サシェまたは錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）適切なエマルションからなることが可能である。液体溶液は、水、生理食塩水またはＰＥＧ４００などの希釈剤に懸濁した有効量のパッケージングされた核酸からなる。錠剤の形態は、乳糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、トラガカント、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、色素、崩壊剤ならびに薬学的に適合する担体の１つまたはそれ以上を含み得る。薬用キャンディー形態は、活性成分を通常ショ糖とアカシアまたはトラガカントなどのフレーバーで含むことができ、ゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのエマルジョン、ゲルなどの不活性基剤に活性成分を含み、活性成分に加えて当技術分野で既知の担体も含むトローチと同様である。経口投与された自己複製ＲＮＡ分子を保護するために、分子は、酸性および酵素的加水分解に対して耐性となるように組成物と複合化されるか、または自己複製ＲＮＡ分子をリポソームなどの適切に耐性のある担体にパッケージングすることによって、保護される。さらに、医薬組成物は、例えばリポソーム中に、または活性成分の徐放をもたらす製剤中にカプセル化することができる。
【0158】
吸入により投与されるエアロゾル製剤を含む局所用組成物も同様に調製することができる。好適な組成物は、単独の自己複製ＲＮＡ分子から、または他の好適な成分との組み合わせからなる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタンおよびプロパン窒素などの加圧された許容可能な噴霧剤に入れることができる。
【0159】
好適な座薬製剤は、自己複製ＲＮＡ分子および座薬基剤からなる。好適な坐剤基剤には、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。また、自己複製ＲＮＡと適切な基剤、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素との組み合わせで充填したゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。
【0160】
自己複製ＲＮＡ分子を含む医薬組成物について上述したすべての実施形態は、上述したように、いくつかの異なる自己複製ＲＮＡ分子の組み合わせを含む医薬組成物にも同様に適用される。特に、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列が別々の自己複製ＲＮＡ分子に含まれている場合、これらは１つの単一製剤中に存在することも、別々の製剤中に存在することもできる。好ましくは、別々の自己複製ＲＮＡ分子に含まれる複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードしている配列が別々の製剤中に存在する場合、さらなる取り扱いを容易にするために、これらの別々の製剤は送達前に混ぜることができる。前記別々の製剤は、同じ薬学的に許容される担体を含んでもよい。あるいは、別々の製剤は、異なる薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【0161】
上記のような別々の製剤は、同じ投与経路を用いて投与することも、異なる投与経路を用いて投与することもできる。好ましくは、両方の製剤は、同じ投与経路を用いて投与される。
【0162】
治療方法および医療用途
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、治療的または予防的な免疫応答を誘導するためなど、様々な治療または予防目的のために哺乳類（ヒトを含む）などの脊椎動物に送達することができる。本発明はまた、免疫応答を誘導するため、内因性遺伝子の発現を調節するため、または治療上の利益を提供するために十分な量のコードされた外因性遺伝子産物を生成するために十分な量など、所望の治療効果を得るために有効な量の、本明細書に記載の１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子を対象に投与することを含む対象における免疫応答を刺激する、または対象を治療する方法を対象とする。対象は、好ましくは動物、哺乳類、魚類、鳥類、より好ましくはヒトである。好適な動物対象としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、ヒツジ、ヤギ、バイソン、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、アヒル、および七面鳥等が挙げられる。
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、治療的または予防的な免疫応答を誘導するためなど、様々な治療または予防目的のために哺乳類（ヒトを含む）などの脊椎動物に送達することができる。本発明はまた、免疫応答を誘導するため、内因性遺伝子の発現を調節するため、または治療上の利益を提供するために十分な量のコードされた外因性遺伝子産物を生成するために十分な量など、所望の治療効果を得るために有効な量の、本明細書に記載の１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子を対象に投与することを含む対象における免疫応答を刺激する、または対象を治療する方法を対象とする。対象は、好ましくは動物、哺乳類、魚類、鳥類、より好ましくはヒトである。好適な動物対象としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、ヒツジ、ヤギ、バイソン、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、アヒル、および七面鳥等が挙げられる。
【0163】
本発明はまた、本明細書に記載の１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子を、免疫応答を誘発するのに有効な量で動物に投与することを含む、宿主動物において免疫応答を誘発する方法を対象とする。好ましくは、前記免疫応答は、コロナウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する対象において誘発される。好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、病原体抗原をコードする。宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は上述したとおりである。本方法は、追加免疫応答を生じさせるために使用することができる。本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子および組成物は、他の予防的または治療的化合物とともに投与することができる。非限定的な例として、予防または治療的化合物は、アジュバントまたはブースターであってもよい。本明細書で使用する場合、ワクチンなどの予防組成物に言及する際の用語「ブースター」は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を意味する。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の先の投与の後に与えてもよい。上述したように、ＲＮＡレプリコンワクチンの魅力的な特徴の１つは、ワクチンが投与された宿主動物における免疫応答の持続時間が延長されることである。したがって、予防組成物の初回投与とブースターの間の投与時間は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年であってよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、予防組成物の初回投与とブースターの間の投与期間は、２ヶ月または３ヶ月である。本発明は、対象をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して免疫化する方法に関し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子を、防御免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含む。宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【0164】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、対象に投与されると、防御免疫または免疫応答を誘導する。
【0165】
好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、および卵巣内注射などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。経口および経皮投与、ならびに吸入または坐剤による投与もまた企図される。特に好ましい投与経路は、筋肉内、皮内、および皮下注射である。特に好ましいのは、筋肉内注射である。本発明のいくつかの実施形態によれば、自己複製ＲＮＡ分子は、よく知られ広く利用可能なニードルレス注射装置を用いて宿主動物に投与される。本発明の自己複製ＲＮＡ分子はまた、個々の患者から摘出した細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または普遍的ドナー造血幹細胞など、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に送達し、その後、通常は自己複製ＲＮＡ分子でトランスフェクトした細胞を選択した後、その細胞を患者に再移植することが可能である。患者に送達する適切な細胞数は、患者の状態および所望の効果によって異なるが、これは当業者が決定し得る。
【0166】
自己複製ＲＮＡ分子、例えば病原体抗原をコードし、したがって免疫応答を誘導するための使用に適しているものは、筋肉のような組織に直接導入することができる。本発明による哺乳動物の細胞への自己複製ＲＮＡの導入には、「生物学的」または粒子媒介形質転換のような他の方法も適している。これらの方法は、哺乳動物へのＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ導入だけでなく、哺乳動物に再導入するための細胞のｅｘ ｖｉｖｏ修飾にも有用である。
【0167】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、全細胞またはウイルス免疫原性組成物とともに、精製抗原、免疫原またはタンパク質サブユニットまたはペプチド免疫原性組成物と組み合わせて使用できることが企図される。標的細胞型を標的とする自己複製ＲＮＡワクチンを採用することが有利な場合がある。
【0168】
自己複製ＲＮＡの有効量は、本明細書に記載の方法に従って、単回投与または一連の投与の一部として、対象に投与される。本明細書に記載されるように、この量は、治療される個人の健康および身体状態、治療される状態、ならびに他の関連する要因により異なる。この量は、本明細書で議論される要因、および他の関連要因に基づいて熟練した臨床医が決定することができる比較的広い範囲に収まることが予想される。
【0169】
ポリペプチドを発現する本発明の自己複製ＲＮＡ分子ワクチンは、パック、ディスペンサー装置、およびキットにパッケージングすることができる。例えば、１単位またはそれ以上の投与形態を含むパックまたはディスペンサー装置が提供される。典型的には、自己複製ＲＮＡ分子が示された状態の治療に適していることを示すラベル上の適切な表示とともに、投与のための説明書がパッケージングとともに提供されよう。例えば、ラベルには、パッケージング内の自己複製ＲＮＡ分子が、特定の感染症、自己免疫疾患、腫瘍の治療に有用であること、または哺乳類の免疫応答によって媒介されるか、もしくはその影響を受けやすい他の疾患もしくは状態を予防もしくは治療するために有用であることが記載される場合がある。
【0170】
ベクターとＲＮＡ構築物
本発明のベクターは、抗原を含んでいてもよく、前記抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその切断型をコードしているか、または前記抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしており、前記抗原はプロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある。
本発明のベクターは、抗原を含んでいてもよく、前記抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその切断型をコードしているか、または前記抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしており、前記抗原はプロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある。
【0171】
ベクターは、抗原配列の下流にキャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および可変長のポリ（Ａ）テールを含む基本エレメントを含んでいてもよい。ベクターは、さらに、複製起点、およびＴ７またはＳＰ６プロモータのようなプロモータ配列、ならびに発現系でベクターを生成する目的で、例えば抗生物質をコードする選択遺伝子を含んでいてもよい。
【0172】
一実施形態において、ベクターは、自己増幅ＲＮＡ発現を駆動するためのレプリコンバックボーンとして用いられるＴＣ－８３株ゲノムを有するベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を含んでいてもよい。自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）およびサブゲノムプロモータ配列をコードし得る。ｎｓＰ１～４は、非複製ｍＲＮＡよりも低い投与量を可能にする、ｓａＲＮＡの増幅に関与するレプリカーゼをコードする。
【0173】
前記ベクターは、５’キャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）をさらに含んでいてもよい。本発明による非構造タンパク質は、好ましくは、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）の５’ＵＴＲにＡ３Ｇ変異および／またはＱ７３９Ｌ変異を含む。
【0174】
スパイクタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＧＰプロモータの後にクローニングされてもよく、それによってスパイクタンパク質抗原は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型であってもよい。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列は、ＳＧＰプロモータの後にクローニングされてもよい。優先的に、細胞質への送達後、ｓａＲＮＡの翻訳により、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を形成する非構造タンパク質１－４（ｎｓＰ１－４）が生成され得る。ＲＤＲＰは、ｓａＲＮＡの複製を担い、ｓａＲＮＡのコピーを生成する。したがって、もともと送達されていた各ｓａＲＮＡから、サブゲノムＲＮＡの複数のコピーが生成される。これは、非増幅ＲＮＡと比較して、より多くの抗原のコピーの翻訳をもたらす。本発明によるベクターは、プラスミドＤＮＡまたは直鎖化ＤＮＡであってもよい。そのために、プラスミドは、該プラスミドの直鎖化を可能にする制限酵素（ＲＥ）部位を含んでいてもよい。
【0175】
実施形態において、抗原配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその切断型であって、前記スパイクタンパク質またはその切断型が受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでいるものをコードしているか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている。
【0176】
本発明の好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子と本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている。ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ例えばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むものであり得る。
【0177】
一実施形態において、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列とを含む。より詳細には、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、４つの非構造性アルファウイルスタンパク質をコードしている配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列とを含む。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の切断型、Ｃ３ｄ－ｐ２８．６に融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質（Ｍ）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）から選択される。
【0178】
好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの構造的アルファウイルスタンパク質を産生する能力を欠くように操作されたアルファウイルスに由来する。より好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも２つの、より好ましくはすべての、構造的アルファウイルスタンパク質を産生する能力を欠くように操作されたアルファウイルスに由来する。特定の実施形態では、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス、特にベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードしているヌクレオチド配列を含み、優先的には５’ＵＴＲのＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）のＱ７３９Ｌ変異を含んでいる。
【0179】
本発明で使用するための好ましい配列であり、実施例で実際に使用した配列：
【0180】
［配列１］
【0181】
［配列２］
【0182】
［配列３]
【0183】
［配列４‐１]
［配列４‐２]
【0184】
［配列５]
【0185】
［配列６‐１]
[配列６‐２]
【0186】
[配列７‐１]
［配列７‐２]
［配列７‐３]
[配列７‐４]
[配列７‐５]
【0187】
[配列８]
【0188】
[配列９]
【0189】
[配列１０－1]
[配列１０－２]
[配列１０－３]
[配列１０－４]
[配列１０－５]
【0190】
[配列１１]
【0191】
[配列１２]
【0192】
[配列１３]
【0193】
[配列１４]
【0194】
[配列１５]
【0195】
[配列１６－１]
[配列１６－２]
【0196】
[配列１７－１]
[配列１７－２]
[配列１７－３]
【0197】
［配列１８]
【0198】
［配列１９]
【実施例】
【0199】
実施例１－ｓａ－ＲＮＡによるワクチン抗原の発現：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｓ－ＲＢＤ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびヌクレオカプシド（Ｎ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ置換およびｎｓＰ２ Ｑ７３９Ｌ変異の両方を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスのＴＣ－８３ワクチン株に由来する自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子にクローニングした。ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａＲＮＡ－Ｎをベビーハムスター腎臓２１（ＢＨＫ－２１）細胞にトランスフェクトした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤまたはＮ抗原を発現するｓａＲＮＡまたは非トランスフェクト対照細胞のいずれかでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞から総タンパク質を単離し、ウェスタンブロットを行うために使用した。図１：１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ＲＢＤをトランスフェクトしたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）－２１細胞（５０，０００）において、商業的に利用可能な特異的ポリクローナル抗体（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、コード：１３０－１０７５９）を用いて、細胞内のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓ１ ＲＢＤタンパク質（～３５ｋＤａ）の発現をウェスタンブロット（バンドで表示）により検出した。また、対照として非トランスフェトＢＨＫ細胞もテストしたが、ここでは特異的なバンドは確認されなかった。この結果は、ｓａＲＮＡ－ＳＲＢＤによるコード化タンパク質の発現の特異性を示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｓ－ＲＢＤ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびヌクレオカプシド（Ｎ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ置換およびｎｓＰ２ Ｑ７３９Ｌ変異の両方を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスのＴＣ－８３ワクチン株に由来する自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子にクローニングした。ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａＲＮＡ－Ｎをベビーハムスター腎臓２１（ＢＨＫ－２１）細胞にトランスフェクトした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤまたはＮ抗原を発現するｓａＲＮＡまたは非トランスフェクト対照細胞のいずれかでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞から総タンパク質を単離し、ウェスタンブロットを行うために使用した。図１：１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ＲＢＤをトランスフェクトしたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）－２１細胞（５０，０００）において、商業的に利用可能な特異的ポリクローナル抗体（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、コード：１３０－１０７５９）を用いて、細胞内のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓ１ ＲＢＤタンパク質（～３５ｋＤａ）の発現をウェスタンブロット（バンドで表示）により検出した。また、対照として非トランスフェトＢＨＫ細胞もテストしたが、ここでは特異的なバンドは確認されなかった。この結果は、ｓａＲＮＡ－ＳＲＢＤによるコード化タンパク質の発現の特異性を示している。
【0200】
図２：１μｇのｓａＲＮＡ－Ｎタンパク質をトランスフェクトした際のベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）－２１細胞（５０，０００）において、細胞内のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｎタンパク質（～５５ｋＤａ）の発現を、商業的に利用可能な特異的ポリクローナル抗体（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、コード：１３０－１０７６０）を用いてウェスタンブロット（バンドで表示）により検出した。また、対照として非トランスフェクトＢＨＫ細胞もテストしたが、ここでは特異的なバンドは確認されなかった。この結果は、ｓａＲＮＡ－Ｎによるコード化タンパク質の発現の特異性を示している。
【0201】
例２－ワクチン特異的な適応免疫応答：
ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤをスイスマウスに筋肉内注射（ＩＭ）または皮内エレクトロポレーション（ＩＤ）により送達した。ルシフェラーゼを発現するｓａＲＮＡも同様の方法で送達し、対照として用いた。ワクチン接種したマウスとモック対照マウス（ｎ＝３）の両方の脾臓を注射後７日目に単離した。脾細胞をＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓペプチドカクテルで刺激し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）およびヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の応答を評価した。ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ治療マウス（ＩＭ、ＩＤとも）の細胞障害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞の両方で、高い割合（モック対照の３倍）でＩＬ－４＋（液性応答、Ｔｈ２／Ｔｃ２）細胞が観察された。ＩＮＦ＋（Ｔｈ１／Ｔｃ１、細胞性免疫）細胞レベルもｓａＲＮＡ－ルシフェラーゼ群に比べ治療マウス群で上昇した（図３、図４）。
ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤをスイスマウスに筋肉内注射（ＩＭ）または皮内エレクトロポレーション（ＩＤ）により送達した。ルシフェラーゼを発現するｓａＲＮＡも同様の方法で送達し、対照として用いた。ワクチン接種したマウスとモック対照マウス（ｎ＝３）の両方の脾臓を注射後７日目に単離した。脾細胞をＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓペプチドカクテルで刺激し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）およびヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の応答を評価した。ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ治療マウス（ＩＭ、ＩＤとも）の細胞障害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞の両方で、高い割合（モック対照の３倍）でＩＬ－４＋（液性応答、Ｔｈ２／Ｔｃ２）細胞が観察された。ＩＮＦ＋（Ｔｈ１／Ｔｃ１、細胞性免疫）細胞レベルもｓａＲＮＡ－ルシフェラーゼ群に比べ治療マウス群で上昇した（図３、図４）。
【0202】
皮内注射
スイス非近交系マウスに、１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤを皮内注射し、その後０日目にエレクトロポレーションを行った。脾細胞を７日目に単離し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞特異的細胞傷害性応答（ＣＤ８＋）および液性応答（ＣＤ４＋）をチェックした。全てのサンプルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コーディングペプチドカクテルで刺激した。Ｌｕｃ－ｓａＲＮＡを注入したマウスを比較のための対照として使用した。ＩＬ－４とＩＦＮ－ｇ ＣＤ４＋細胞の上昇、およびＣＤ８＋細胞の上昇の両方が、ヘルパーおよび細胞傷害性適応Ｔ細胞媒介応答の誘導を示す。結果を図３に示す。
スイス非近交系マウスに、１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤを皮内注射し、その後０日目にエレクトロポレーションを行った。脾細胞を７日目に単離し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞特異的細胞傷害性応答（ＣＤ８＋）および液性応答（ＣＤ４＋）をチェックした。全てのサンプルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コーディングペプチドカクテルで刺激した。Ｌｕｃ－ｓａＲＮＡを注入したマウスを比較のための対照として使用した。ＩＬ－４とＩＦＮ－ｇ ＣＤ４＋細胞の上昇、およびＣＤ８＋細胞の上昇の両方が、ヘルパーおよび細胞傷害性適応Ｔ細胞媒介応答の誘導を示す。結果を図３に示す。
【0203】
筋肉内注射
スイス非近交系マウスに、１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤを０日目に筋肉内注射した。脾細胞を７日目に単離し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞特異的細胞傷害性応答（ＣＤ８＋）および液性応答（ＣＤ４＋）をチェックした。全てのサンプルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コーディングペプチドカクテルで刺激した。Ｌｕｃ－ｓａＲＮＡを注入したマウスを比較のための対照として使用した。ＩＬ－４およびＩＦＮ－ｇ ＣＤ４＋細胞の上昇、およびＣＤ８＋細胞の上昇は、両方とも、ヘルパーおよび細胞傷害性適応Ｔ細胞媒介応答の誘導を示す。結果を図４に示す。
スイス非近交系マウスに、１μｇのｓａＲＮＡ－Ｓ１ ＲＢＤを０日目に筋肉内注射した。脾細胞を７日目に単離し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞特異的細胞傷害性応答（ＣＤ８＋）および液性応答（ＣＤ４＋）をチェックした。全てのサンプルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質コーディングペプチドカクテルで刺激した。Ｌｕｃ－ｓａＲＮＡを注入したマウスを比較のための対照として使用した。ＩＬ－４およびＩＦＮ－ｇ ＣＤ４＋細胞の上昇、およびＣＤ８＋細胞の上昇は、両方とも、ヘルパーおよび細胞傷害性適応Ｔ細胞媒介応答の誘導を示す。結果を図４に示す。
【0204】
実施例３－ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡのワクチン抗原発現
安定性と細胞内送達を高めるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原ｓａＲＮＡ構築物を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化した。
安定性と細胞内送達を高めるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原ｓａＲＮＡ構築物を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化した。
【0205】
簡単に説明すると、カプセル化されたｓａＲＮＡを含むＬＮＰをＩｇｎｉｔｅＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｔｅｍｓ，ＰＮＩ）で調製した。脂質溶液（複合化脂質Ｃ１２－２００、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００）は、脂質を１００％エタノールに溶解することで調製した。ＬＮＰは、クエン酸緩衝液中で３：１の比率でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｓａＲＮＡ構築物と組み合わせて、脂質溶液をＩｇｎｉｔｅＴＭ装置にロードすることによって調製した。合計１μｇのｓａＲＮＡを使用して、ＰＢＳで４０μＬの総容量に希釈されたＬＮＰ製剤を調製した。混合ワクチンの場合、Ｓ－ＲＢＤ ｓａＲＮＡを含むＬＮＰ製剤を、Ｎ ｓａＲＮＡを含むＬＮＰ製剤と１：１の割合で混合した（ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ０．５μｇ＋ｓａＲＮＡ－Ｎ０．５μｇ）。また、ルシフェラーゼをコードしているｓａＲＮＡ（モック）ＬＮＰ製剤も同条件で調製した。
【0206】
ｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの発現
ルシフェラーゼをコードしているｓａＲＮＡ（モック）ＬＮＰ製剤を上記のように調製し、スイスマウスにおけるｓａＲＮＡプラットフォームのｉｎ ｖｉｖｏ発現を評価するために使用した。メスのスイスマウス（６～８週齢）をＪａｎｖｉｅｒ（フランス）から入手し、餌と水に自由にアクセスできる個別換気式ケージで飼育した。マウスにイソフルランを使用して麻酔した。ルシフェラーゼをコードしているｓａＲＮＡ（モック）ＬＮＰ製剤１マイクログラムを、６匹のマウスの腓腹筋に注射した。マウスは、２１日間隔のプライムブーストワクチン接種体制に従って免疫した。ルシフェラーゼ誘発生物発光の全光束を、ワクチン接種体制のいくつかの時点において、Ｄ－ルシフェリン皮下注の１２分後に、非侵襲的ｉｎ ｖｉｖｏイメージング系（ＩＶＩＳ）Ｌｕｍｉａ ＩＩＩスキャンによって求めた。この評価結果を図５に示す。
ルシフェラーゼをコードしているｓａＲＮＡ（モック）ＬＮＰ製剤を上記のように調製し、スイスマウスにおけるｓａＲＮＡプラットフォームのｉｎ ｖｉｖｏ発現を評価するために使用した。メスのスイスマウス（６～８週齢）をＪａｎｖｉｅｒ（フランス）から入手し、餌と水に自由にアクセスできる個別換気式ケージで飼育した。マウスにイソフルランを使用して麻酔した。ルシフェラーゼをコードしているｓａＲＮＡ（モック）ＬＮＰ製剤１マイクログラムを、６匹のマウスの腓腹筋に注射した。マウスは、２１日間隔のプライムブーストワクチン接種体制に従って免疫した。ルシフェラーゼ誘発生物発光の全光束を、ワクチン接種体制のいくつかの時点において、Ｄ－ルシフェリン皮下注の１２分後に、非侵襲的ｉｎ ｖｉｖｏイメージング系（ＩＶＩＳ）Ｌｕｍｉａ ＩＩＩスキャンによって求めた。この評価結果を図５に示す。
【0207】
モックワクチンの初回投与後（０日目、ベースライン）、生物発光シグナルは急速に増加し（約２．０ｘ１０４ｐ／ｓから１ｘ１０８ｐ／ｓへ）、高い状態が続いたが、注入後１０日目に徐々に減少した。２回目の投与でも同様に、生物発光シグナルの急激な上昇が検出された（ブースと）。対照的に、同様の実験条件を用いて、Pardi et al., 2015は、本明細書で報告されたものの１０分の１（約２．０×１０６ｐ／ｓ）の接種後７日目の生物発光信号の誘導を観察した。同様に、de Alwis et al., 2020は、Ａｒｃｔｕｒｕｓプラットフォームを使用して、本明細書で報告されたものと同様の生物発光シグナルを得るためには２μｇのｓａＲＮＡが必要であったと報告した。
【0208】
これらのデータから、今回開発したｓａＲＮＡプラットフォームは、スイスマウスに投与した場合、抗原発現の延長をもたらすことができることが確認された。
【0209】
実施例４－プライムワクチン接種後のマウスにおける結合抗体反応
１μｇのｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤のプライム注射による筋肉内免疫後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的体液性反応を、ＥＬＩＳＡを用いてメスのスイスマウスから２１日目に採取した血清で特徴づけた（ｎ＝６）。
１μｇのｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤のプライム注射による筋肉内免疫後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的体液性反応を、ＥＬＩＳＡを用いてメスのスイスマウスから２１日目に採取した血清で特徴づけた（ｎ＝６）。
【0210】
Ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原発現は、上記実施例３に記載したように行った。プライム注入前（０日目）、ブースト注入前（２１日目）、および犠牲時（３５日目）に尾静脈から血液試料を採取した。マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および脾臓を収集した。血清は血液凝固後に遠心分離で採取し、さらに使用するまでは－８０℃で保存するために分注した。
【0211】
マウス血清中の抗原特異的総ＩｇＧ価を、１μｇ／ｍＬの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニットタンパク質ＲＢＤ（Ｓ－ＲＢＤ）、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）でコーティングしたＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＣｏｓｔａｒＴＭ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）プレートを用いて評価した。総ＩｇＧ価のためにＥＬＩＳＡプレートをブロックし、あらかじめ希釈した血清サンプルでインキュベートし、ＨＲＰ結合検出抗体を加えた。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を用いて現像し、４５０ｎｍ（バックグラウンド５７０ｎｍ）の分光光度計で読み取った。この評価結果を図６および図７に示す。
【0212】
ＬＮＰ製剤化Ｓ－ＲＢＤ抗原（ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ）とＮ抗原（ｓａＲＮＡ－Ｎ）を別々のワクチンとして用いる免疫化は、プライムワクチン接種から３週間後に１００％の抗体陽転を誘導し、モックワクチン接種と比較してＳ抗原結合ＩｇＧ抗体反応（６．２９×１０４，ｐ＜０．０００１，図６）とＮ抗原結合ＩｇＧ抗体反応（２．９７×１０４，ｐ＜０．０５）も有意に強固になった（図７）。さらに、混合ワクチン（ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａＲＮＡ－Ｎ）でも、図６および図７に示すように、プライム免疫化の３週間後にＳおよびＮ抗原特異的結合ＩｇＧ価レベルの上昇（それぞれ１．５６×１０４，ｐ＜０．０００１および２．８５×１０４，ｐ＜０．０００１，）が誘導された。
【0213】
これらのデータから、ＬＮＰ製剤化ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤおよびｓａＲＮＡ－Ｎを用いたプライムワクチン接種は、個別接種および混合ワクチン接種体制のいずれでも、スイスマウスにおいて強固な結合抗体反応を誘導することが示された。
【0214】
実施例５－ブーストワクチン接種後のマウスにおける結合抗体反応
ｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤１μｇのブースト注射による筋肉内免疫後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的液性応答を、ブーストワクチン接種の２週間後（すなわち、プライムワクチン接種後の５週間目、最初の免疫から３５日目）に採取したスイスマウスの血清によりＥＬＩＳＡを用いて特徴づけた。実験方法は、実施例４について上述したのと同様であった。これらの評価の結果を図８および図９に示す。
ｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤１μｇのブースト注射による筋肉内免疫後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的液性応答を、ブーストワクチン接種の２週間後（すなわち、プライムワクチン接種後の５週間目、最初の免疫から３５日目）に採取したスイスマウスの血清によりＥＬＩＳＡを用いて特徴づけた。実験方法は、実施例４について上述したのと同様であった。これらの評価の結果を図８および図９に示す。
【0215】
図８に示すように、ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤワクチン接種マウスおよびｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａＲＮＡ－Ｎの組み合わせをワクチン接種したマウスからプライム注射後２１日目に採取したサンプルの平均Ｓ特異的ＩｇＧ価は、同様に上昇したままだった（それぞれ６．５５×１０４および３．１３×１０４）。同様の結果が、図９に示すように、ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａＲＮＡ－Ｎの組み合わせをワクチン接種したマウスの平均Ｎ特異的ＩｇＧ価（３．４２×１０４）についても得られた。
【0216】
プライム注射後３５日目（すなわちブーストワクチン接種の２週間後）に採取したサンプルでは、ｓａＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａＲＮＡ－Ｎの組み合わせをワクチン接種した群では、Ｓ特異的およびＮ特異的ＩｇＧ価ともに統計的有意性は失われた。これは、プライムワクチン注射後３５日目に採取した多くのサンプルに、通常のサンプル希釈を用いては測定できないほど高いＩｇＧ価（ＩｇＧ価＞２×１０５）が含まれていたためである。
【0217】
これらの実験は、個々の、および組み合わせたｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤を用いたプライムワクチン接種が重要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合抗体反応を誘導し、これはブースト免疫後に増強できることを実証している。本明細書に記載のｓａＲＮＡプラットフォームを使用して得られたＳ特異的ＩｇＧ価は、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチン開発者による公表データと比較して、期待を上回るものであおる。実際、Vogel et al. 2020によれば、１μｇの従来のｍＲＮＡワクチンを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスのプライムのみのワクチン接種は、＜１０２のＳ特異的結合ＩｇＧ価に終わった。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に同じワクチンを３０μｇプライムブーストワクチン接種しても、Ｓ特異的結合ＩｇＧ価は約１．５×１０４までしか誘導できなかった。一方、Corbett et al., 2020に記載されたｍＲＮＡワクチン１μｇを３種類のマウス系統にプライムブーストワクチン接種すると、より高いＳ特異的ＩｇＧ価を誘導でき、１０５～１０６のレベルに到達した。本明細書に記載のものとは異なるｓａＲＮＡプラットフォームを使用して、de Alwis et al., 2020は、そのｓａＲＮＡ構築物２μｇを使用したＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのプライムワクチン接種後３０日目に、約１０６のＳ特異的ＩｇＧレベルを報告している。同様に、２つの異なるグループが、１μｇの代替ｓａＲＮＡ構築物を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスのプライムブーストワクチン接種後のＳ特異的ＩｇＧ価を、約１０６（Mckay et al. 2020）および＜１０３（Erasmus et al. 2020）であると報告している。最後に、あるグループは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのプライムのみのワクチン接種の１２週間後まで、１．３×１０５という高いＳ特異的ＩｇＧ価を誘導することができたが、そのような結果を得るためには１０μｇのｓａＲＮＡが必要であった。
【0218】
実施例６－ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤを用いた免疫化で、マウスの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染をｉｎ ｖｉｔｒｏで中和
ブースト免疫化により作製された特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する中和能を評価するため、野生型ウイルス中和試験（ｗｔＶＮＴ）を行った（武漢ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を用いた）。
ブースト免疫化により作製された特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する中和能を評価するため、野生型ウイルス中和試験（ｗｔＶＮＴ）を行った（武漢ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を用いた）。
【0219】
培地中の血清希釈液を３×ＴＣＩＤ１００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインキュベートし、試料－ウイルス混合物をＶｅｒｏ細胞９６ウェルプレートを含む細胞懸濁液に加えた。５日間のインキュベーション時間後、各ウェルの細胞障害活性（ＣＰＥ）を評価し、ウイルス増殖について陰性または陽性と顕微鏡的にスコア化した。感染細胞数を５０％（ＮＴ５０）または９０％（ＮＴ９０）減少させる中和価（ＮＴ）を算出するために、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法を用いた。
【0220】
ＬＮＰ製剤ｓａ－ＲＮＡ－Ｎ単独ワクチン接種マウスでは中和抗体が観察されたが、これらの群では対照マウスと同程度のＮＴ５０価（＞５０）にしか達しなかった。一方、ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤおよびｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎの組み合わせをワクチン接種したマウスでは、非常に効率的なウイルス中和が観察され、平均ＮＴ５０価がそれぞれ４．８×１０３および４．９×１０３に到達した。平均ＮＴ９０価は、各ワクチン接種群でそれぞれ３．５×１０３および２．４×１０３の値に達していた。この評価結果を図１０に示す．
【0221】
上記の結果の解釈には注意が必要である。実際、間違った解釈は、ＮＴ５０およびＮＴ９０価がＳ－ＲＢＡとＳ－ＲＢＤ＋Ｎワクチングループとの間で有意な差がないことから、（ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤに加えて）ワクチン製剤へＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｎを添加することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの保護という点で利益を提供しないことが示唆され得る。実際には、この観察は，ｗｉｔｌ型ＶＮＴアッセイの実験デザインの限界に起因するものである。かかるアッセイでは、ワクチン接種したマウスからの血清希釈液をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とある時間インキュベートした後、この混合物を細胞を播種した９６ウェルプレートに加え、５日間インキュベートする。その後、感染ウェル数を５０％（ＮＴ５０）または９０％（ＮＴ９０）減少させることができた試料希釈率を算出する。血清サンプルには、ＥＬＩＳＡ法で観察されたＳ特異的結合抗体とＮ特異的結合抗体の両方が含まれている（図６～図９参照）。しかし、Ｓ－抗原はウイルス粒子の表面に存在し、Ｎ－抗原は内部のヌクレオカプシドに隠されているため、Ｓ－特異的抗体のみがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合（したがって中和）することが可能である。したがって、Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡワクチン対Ｓ－ＲＢＤ ｓａＲＮＡワクチンで、より高いＮＴ５０／ＮＴ９０レベルに到達することは事実上不可能である。
【0222】
さらに、２つのｓａＲＮＡ構築物を細胞内に取り込むと、レプリカーゼ複合体の優先的な複製により、一方の構築物が他方を上回るため、複製競争につながる可能性が示唆されている（Wroblewska et al., 2015）。これは、両方の抗原のうち一方が発現しにくくなるため、抗原の個々の免疫学的効果を妨害または阻害する可能性がある。したがって、Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡワクチン候補が、Ｓ－ＲＢＤ ｓａＲＮＡワクチンと同様に高い（相反性の有意差がないため、低くならない）中和抗体反応を誘導することができるという事実は、非常に有望である（図１０）。
【0223】
対照的に、従来のＲＮＡまたはｓａＲＮＡ製造業者のいずれの発表データも、混合ワクチン候補について本明細書で開示したものほど高いＮＴ５０価（４．９×１０３）に到達することはできていなかった。具体的には、Vogel et al., 2020に記載されたワクチン１μｇをＢＡＬＢ／ｃマウスにプライムワクチン接種のみ行うと、１０２より低いＮＴ５０特異的力価が誘導された。同様に、ＮＨＰに３０μｇの同ワクチンをプライムブーストワクチン接種しても，ＮＴ５０価は約９．６２×１０２までしか誘導できなかった．一方、Corbett et al., 2020に記載されたｍＲＮＡ構築物１μｇは，３種類のマウス系統にプライムブーストワクチン接種を行った後、ＮＴ５０レベルを８９から１１１９まで誘導した。
【0224】
同様の結果は、他の様々なｓａ－ＲＮＡワクチン候補でも得られている。De Alwis et al., 2020は、２μｇのｓａＲＮＡ（ｗｔＶＮＴ）を用いたプライムワクチン接種について、３２０のＮＴ５０価を報告した。一方、Gritstone Oncologyは、１０μｇのｓａＲＮＡを用いたプライムワクチン接種で１９１０のＮＴ５０価を報告した（https://ir.gritstoneoncology.com/static-files/6a7c26ca-06a6-4295-bf76-83948a341397を参照）。また、１μｇのｓａ－ＲＮＡを用いたプライムブーストワクチン接種では，McKay et al., 2020 と Erasmus et al., 2020は、それぞれ２５６０と３２０のＮＴ５０価を報告した。
【0225】
実施例７－ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａ－ＲＮＡ－Ｎとの併用免疫化により、ハムスターのｉｎ ｖｉｖｏ野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染からの保護を誘発
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎ混合ワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ有効性をＳＧハムスター鼻腔内チャレンジ実験により評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎ混合ワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ有効性をＳＧハムスター鼻腔内チャレンジ実験により評価した。
【0226】
実験は、Sanchez-Felipe et al., 2021に記載されているように行った。簡潔には、６～８週齢のメスのＳＧハムスター（体重９０～１２０ｇ）を耳標し、個別に換気したケージに収容しながら、異なる治療群に無作為に割り付けた。０日目に、抗原特異的結合抗体価（ＩＩＦＡ; 総ＩｇＧ）および中和抗体価（疑似型ウイルス血清中和試験－ｐｓＶＮＴ）を測定するため、ハムスターを採血した。各動物はまた、３つの異なる用量（０．１μｇ、１μｇおよび５μｇ）のＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎ（上記の通り）を含む混合ワクチンの筋肉（大腿筋）内（各脚に１００μＬ）注射を受けた。対照群には、同量のルシフェラーゼ－ｓａＲＮＡまたは偽ＰＢＳ／ＬＮＰ希釈液を注射した。各実験条件に対して６匹の動物を治療し、合計３０匹の動物を治療した。
【0227】
２１日目に再び採血し（ブースト前）、ハムスターに３種類の用量の混合ワクチン、またはルシフェラーゼｓａＲＮＡ、または偽薬／ＰＢＳ／ＬＮＰ希釈液で２度目のＩＭ（大腿筋）注射（ブースター）を行った（条件ごとにｎ＝６）。
【0228】
３５日目に採血し、ハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、継代数３、１０Ｅ４ ＴＣＩＤ５０／ＶｅｒｏＥ６増殖ＢｅｔａＣｏＶ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０（ｍＬ））を経鼻的に感染させた。簡単に言えば、ハムスターに、キシラジン、ケタミン、およびアトロピン溶液の腹腔内注射によって麻酔した。各ハムスターは、両鼻孔に５０μＬのウイルスストックの液滴を加えることにより、鼻腔内に接種された。実際には、＆１５０ｃｍ２ Ｖｅｒｏ細胞培養フラスコに、以前の低継代数ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ストック［ＢｅｔａＣｏＶ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０］を１／１０００最終希釈率で感染させた。３日目、ＣＰＥ時に感染後、ウイルス含有上清を収集し、アリコートして－８０℃で保存した。感染性ウイルス量は、プラークアッセイによって決定した。
【0229】
また、３５日目のチャレンジ前では、１μｇおよび５μｇのＳ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮをワクチン接種したハムスターで効率的な疑似ウイルス中和（武漢ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株）が観察され、平均ＮＴ５０中和価はそれぞれ５．４×１０２および９．２×１０２、到達した。その結果を図１４に示す。
【0230】
チャレンジ後、ハムスターの体重を毎日測定し、病気の兆候（嗜眠、激しい呼吸、または毛並みの乱れ）、運動性、自己メンテナンス、人道的エンドポイント（後肢麻痺、猫背、目の酸欠）について毎日モニターした。
【0231】
チャレンジから４日後の３９日目に、動物を５００μＬのＤｏｌｅｔｈａｌ（２００ｍｇ／ペントバルビタールナトリウム（ｍＬ））の腹腔内投与により安楽死させて、血清と肺を採取した。肺は、（ｉ）リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によるウイルス量の定量、（ｉｉ）ろ過による感染性ウイルス量の定量、（ｉｉｉ）組織学的検査、および（ｉｖ）肺のサイトカイン分析（ＩＬ－６、ＩＰ－１０）のために採した。血液を採取し、血清はさらなる解析のために保存した。
【0232】
治療のプライム投与開始から５週間後（すなわちブーストから２週間後）に、ハムスターに野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢株）を経皮的に感染させた。チャレンジ後、ハムスターは犠牲になるまで毎日体重を測定した。ワクチン接種後のハムスターの体重は、偽薬治療動物またはビヒクル治療動物に比べ、高い値を維持した（図１１）。
【0233】
感染性ウイルス量は、肺組織１ｍｇあたりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノムコピー数として定量化し、報告した（図１２）。さらに、感染性ウイルス力価の指標として５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を求めた。このエンドポイント希釈アッセイは、ハムスターの血清を接種した細胞の５０％で細胞毒性効果をもたらすのに必要なウイルス量を定量化するものである（図１３）。いずれのアッセイにおいても、０．１μｇのＳ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡの混合ワクチン接種後のウイルス量の低下が観察され、１μｇおよび５μｇのＳ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ混合ワクチン接種後のウイルスの有意な減少が観察された。
【0234】
犠牲後（チャレンジ後）の肺組織におけるサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した。１μｇおよび５μｇのＳ－ＲＢＤ＋Ｎをワクチン接種したハムスターの肺組織では、ＩＬ－６およびＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）のｍＲＮＡ発現レベルが、ＩＬ－６については０．１および１μｇ投与条件、ＩＬ－１０については１および５ｕｇ投与条件で、モックワクチン接種対照群と比較して減少した（図１５および１６を参照）。ＣＯＶＩＤ－１９患者ではマクロファージによるＩＬ－６サイトカイン産生が上昇し、炎症性反応が誘導されるため、これは非常に重要なことである。同様に、ケモカインＩＰ１０もまた、ＣＯＶＩＤ－１９感染者における有害なサイトカインストームと関連している。
【0235】
犠牲後（チャレンジ後），肺組織を取り出し，肺疾患の重症度に対するワクチン接種の影響を評価するために病理組織学的分析を行った（図１７）。肺病理組織学総スコアは、肺胞損傷（浮腫および出血）、気管支壁におけるアポトーシス体の存在および壊死性気管支炎、血管周囲の浮腫および炎症、気管支周囲の炎症、内皮炎、気管支肺炎および肺の％に基づいて算出した。チャレンジ後、ワクチン未接種およびモック（ならびに０．１μｇ）ワクチン接種ハムスターは、肺病理が悪化していた。これは、１および５μｇのプライムブースト用量レジメンのｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤ＋ｓａ－ＲＮＡ－Ｎ（ＺＩＰ１６４２）ワクチン接種により防止された。
【0236】
ＺＩＰ１６４２を用いたプライム＆ブースト接種後の液性免疫の誘導を評価するため、血清ＥＬＩＳＡ法により総結合ＩｇＧ抗体反応を測定した。１μｇおよび５μｇのＳ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡを用いたプライムブースト免疫化のいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的結合抗体を有意に誘導した（図１８）。
【0237】
実施例８－ＬＮＰ製剤化ｓａ－ＲＮＡ－Ｓ－ＲＢＤとｓａ－ＲＮＡ－Ｎの併用免疫化により、マウスでＴ細胞およびサイトカイン応答を誘発
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞免疫によって影響を受け、動員されたＴ細胞の性質によって、ＣＯＶＩＤ－１９患者の回復期に保護的または損害的な効果を誘発することができる。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞活性化および抗体産生に重要であり、サイトカイン産生に基づいて機能的サブセットに分別されることが可能である。最近の研究では、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の効果的な解決に関連することが明らかになったが、一方でＣＤ４＋Ｔｈ２細胞の誘導は免疫病理学に関連している。さらに、Ｔｈ２応答がない状態でＣＤ４＋Ｔｈ１応答が起こると、ワクチン関連強化呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）は一般に観察されないことが実証されている。したがって、ワクチン接種戦略は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴｈ１偏向ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫を誘発するはずである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞免疫によって影響を受け、動員されたＴ細胞の性質によって、ＣＯＶＩＤ－１９患者の回復期に保護的または損害的な効果を誘発することができる。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞活性化および抗体産生に重要であり、サイトカイン産生に基づいて機能的サブセットに分別されることが可能である。最近の研究では、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の効果的な解決に関連することが明らかになったが、一方でＣＤ４＋Ｔｈ２細胞の誘導は免疫病理学に関連している。さらに、Ｔｈ２応答がない状態でＣＤ４＋Ｔｈ１応答が起こると、ワクチン関連強化呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）は一般に観察されないことが実証されている。したがって、ワクチン接種戦略は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴｈ１偏向ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫を誘発するはずである。
【0238】
ブーストワクチン接種後、Ｓ－ＲＢＤ＋Ｎ ｓａＲＮＡ（ＺＩＰ１６４２）の混合抗原の免疫では、Ｓ－ＲＢＤ抗原単独に対する免疫と比較して、優れたＣＤ４＋Ｔｈ１偏向Ｓ特異的Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。さらに、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答の誘導が期待されます。このようなＣＤ８＋ＣＴＬ応答は、最近、軽症のＣＯＶＩＤ－１９疾患において保護的な役割を果たすことが示唆されている。どちらのＣＭＩ反応も、長期的なサイトカイン発現がない状態で起こることが予想される。
【0239】
ＣＤ８＋ＣＴＬ毒性アッセイを行う。フローサイトメトリー実験により、細胞数に基づいて、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応の誘導を実証する。Ｔ細胞機能性アッセイはこれらのＣＤ８＋細胞の潜在的な細胞傷害性（したがって有効性）を実証する。Ｓ特異的Ｔ細胞応答は、図２０に示されている。
【0240】
結論から言うと、フローサイトメトリーおよび機能性アッセイにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して機能的なＣＤ８＋ＣＴＬ応答が示された。
【0241】
サイトカイン応答は、非特異的自然免疫の誘導の指標となる。ワクチン接種後、サイトカイン反応が高くなると、発熱および筋肉痛などの副作用の原因となる。好ましくは、これらは制限されるべきものである。予備的なデータ（非開示）では、ワクチン接種後、サイトカインレベルが低下することが示唆されている。
【0242】
最後に、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１比はワクチン接種マウスでより大きく、Ｔｈ１偏向反応が優先していることを示す。ＩＬ－４はＢ細胞を制御してＩｇＧ１抗体を分泌させるが、インターフェロン－γはＩｇＧ２ａ抗体の発現を刺激するため、いずれのアイソタイプもマウスにおけるＴｈ２（ＩＬ－４）またはＴｈ１（ＩＦＮγ）応答の基礎となる指標となる。
【0243】
結論として、ワクチン接種したマウスでの結果は、効率的な反応を示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染からの長期的な保護を示唆するものであった。
【0244】
実施例９ ＶＥＥＶベースのｓａＲＮＡプラットフォーム
図１９は、本発明の文脈で使用されるベクターの可能な実施形態と、特定のＲＮＡワクチンの製造に使用できる２つの自己増幅ＲＮＡ鎖の組み合わせを示している。ＴＣ－８３株ゲノムを有するＣ３ｄ－ｐ２８．６に融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインをレプリコンバックボーンとして使用して、自己増幅ＲＮＡ発現を駆動させる（図１９）。従来のｍＲＮＡも自己増幅型ｍＲＮＡも、キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および可変長のポリ（Ａ）テールなどの基本エレメントを共有している。自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）はまた、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－４）およびアルファウイルスのゲノムに由来するサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）もコードしている。ｎｓＰ１－４は、非複製ｍＲＮＡよりも低い用量を可能にするｓａＲＮＡの増幅を担うレプリカーゼをコードしている。前記バックボーンは、５’キャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）をさらに含んでいてもよい。本発明によるバックボーンは、好ましくは、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む。スパイクタンパク質抗原をコードしている配列がＳＧＰプロモータの後にクローニングされ、それによってスパイクタンパク質抗原は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型となる。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列がＳＧＰプロモータの後にクローニングされる。細胞質への送達後、ｓａＲＮＡの翻訳により、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を形成する非構造タンパク質１－４（ｎｓＰ１－４）が産生される。ＲＤＲＰは、ｓａＲＮＡの複製を担い、ｓａＲＮＡのコピーを生成する。ＲＤＲＰは、ｓａＲＮＡの複製を担当し、ｓａＲＮＡのコピーを生成する。したがって、もともと送達されていた各ｓａＲＮＡから、サブゲノムＲＮＡの複数のコピーが生成される。これは、非増幅ＲＮＡと比較して、より多くの抗原のコピーの翻訳につながる。ＲＮＡを産生するために使用されるベクターは、図１９に等しく示される。前記ベクターは好ましくは抗原を含み、前記抗原配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその切断型をコードし、または前記抗原配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードし、前記抗原はプロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある。
図１９は、本発明の文脈で使用されるベクターの可能な実施形態と、特定のＲＮＡワクチンの製造に使用できる２つの自己増幅ＲＮＡ鎖の組み合わせを示している。ＴＣ－８３株ゲノムを有するＣ３ｄ－ｐ２８．６に融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインをレプリコンバックボーンとして使用して、自己増幅ＲＮＡ発現を駆動させる（図１９）。従来のｍＲＮＡも自己増幅型ｍＲＮＡも、キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および可変長のポリ（Ａ）テールなどの基本エレメントを共有している。自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）はまた、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－４）およびアルファウイルスのゲノムに由来するサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）もコードしている。ｎｓＰ１－４は、非複製ｍＲＮＡよりも低い用量を可能にするｓａＲＮＡの増幅を担うレプリカーゼをコードしている。前記バックボーンは、５’キャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）をさらに含んでいてもよい。本発明によるバックボーンは、好ましくは、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／または非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）におけるＱ７３９Ｌ変異を含む。スパイクタンパク質抗原をコードしている配列がＳＧＰプロモータの後にクローニングされ、それによってスパイクタンパク質抗原は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型となる。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列がＳＧＰプロモータの後にクローニングされる。細胞質への送達後、ｓａＲＮＡの翻訳により、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を形成する非構造タンパク質１－４（ｎｓＰ１－４）が産生される。ＲＤＲＰは、ｓａＲＮＡの複製を担い、ｓａＲＮＡのコピーを生成する。ＲＤＲＰは、ｓａＲＮＡの複製を担当し、ｓａＲＮＡのコピーを生成する。したがって、もともと送達されていた各ｓａＲＮＡから、サブゲノムＲＮＡの複数のコピーが生成される。これは、非増幅ＲＮＡと比較して、より多くの抗原のコピーの翻訳につながる。ＲＮＡを産生するために使用されるベクターは、図１９に等しく示される。前記ベクターは好ましくは抗原を含み、前記抗原配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその切断型をコードし、または前記抗原配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードし、前記抗原はプロモータ配列、好ましくはアルファウイルス由来のサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流にある。
【0245】
前記ベクターは、前記抗原配列の下流にあるポリ（Ａ）配列と；ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１～４をコードしている配列とをさらに含む。好ましくは、ｎｓＰ２の配列は、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異および／またはＱ７３９Ｌ変異を有するｎｓＰ２タンパク質をコードしているような配列である。
【0246】
前記ベクターは、複製起点と、Ｔ７またはＳＰ６プロモータのようなプロモータ配列とをさらに含んでもよい。前記ベクターは、発現系で該ベクターを生産することを目的として、例えば抗生物質をコードするような選択遺伝子を含んでいてもよい。
【0247】
ベクターは、プラスミドＤＮＡであってもよいし、直鎖化ＤＮＡであってもよい。そのために、プラスミドは、該プラスミドの直鎖化を可能にする制限酵素（ＲＥ）部位を含んでいてもよい。
【0248】
実施例１０－本発明の実施形態によるベクターおよび構築物
図１９は、本発明の文脈において使用されるベクターの可能な実施形態、ならびに特定のＲＮＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの製造に使用できる自己増幅ＲＮＡ鎖を概略的に示す図である。このワクチンは、複数の同定された変異型に関連する、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原による免疫化を可能にする。そのため、疾患に対するより効率的で優れた保護が得られる。
図１９は、本発明の文脈において使用されるベクターの可能な実施形態、ならびに特定のＲＮＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの製造に使用できる自己増幅ＲＮＡ鎖を概略的に示す図である。このワクチンは、複数の同定された変異型に関連する、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原による免疫化を可能にする。そのため、疾患に対するより効率的で優れた保護が得られる。
【0249】
ＲＮＡ鎖は、プラスミドなどのＤＮＡベクターによって製造することができる。前記ベクターは、例えば原核生物系における複製を可能にするための複製起点のような従来の制御領域を備えることができる。ベクターは、例えば耐性遺伝子をコードしている配列のような、選択を可能にするタンパク質をコードしているヌクレオチド配列をさらに備えることができる。ベクターは、クローニングの目的のため、およびベクターの線形化を可能にするために、制限酵素部位をさらに備えてもよい。Ｔ７（またはＳＰ６、図示せず）のようなプロモータ領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写を可能にするために存在し得る。
【0250】
図１９に与えられた例では、Ｔ７プロモータの下流に、ベクターは、５’から３’の順に、（ｉ）５’ＵＴＲ配列と、（ｉｉ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードしている核酸配列と、（ｉｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列、またはＲＢＤ領域を含む（切断型）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている核酸配列に作動可能に連結しているＳＧＰプロモータ領域と、（ｉｖ）３’ＵＴＲと、（ｖ）ポリアデニル酸トラクトとを含む。
【0251】
図１９に示すようなベクターは、ｍＲＮＡ鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用される。前記ｍＲＮＡ鎖は、その５’ＵＴＲでキャップされ、さらに（５’から３’の順で）以下を含む：
－５’ＵＴＲ；
－ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードしている配列；
－サブゲノムプロモータ領域；
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列；
－３’ＵＴＲ
－ポリアデニル酸トラクト。
－５’ＵＴＲ；
－ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードしている配列；
－サブゲノムプロモータ領域；
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードしている配列；
－３’ＵＴＲ
－ポリアデニル酸トラクト。
【0252】
これらのｍＲＮＡ鎖の複数をワクチンとして製剤化し、従来の経路で対象に投与することができる。前記対象に投与されると、ｉｎ ｓｉｔｕ翻訳に続いて、ｎｓＰ１－４タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）複合体を形成し、その結果、ｍＲＮＡ中のＳＧＰ領域からｍＲＮＡ転写物の増幅が開始される。後者では、もともと送達されていた各ｓａＲＮＡからサブゲノムＲＮＡが複数コピーされる。
【0253】
サブゲノムＲＮＡ転写物（５）は、その５’領域で、レプリカーゼに存在するキャッピング活性によってキャップされることになる。転写物中に存在するＮタンパク質またはＳタンパク質のコード配列が翻訳され、細胞内にＮまたはＳ抗原が産生される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原をコードしている配列（ここで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列は、有効量の１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子に含まれている）と；
－薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、同一の自己複製ＲＮＡ分子に含まれるか、または前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質抗原をコードしている配列が、異なる自己複製ＲＮＡ分子に含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルスをベースとし、非構造アルファウイルスタンパク質をコードしている配列を含む、請求項１～２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、例えば株ＴＣ－８３、またはそれに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する株である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、５’ＵＴＲにおけるＡ３Ｇ変異を有する５’ＵＴＲおよび／またはＱ７３９Ｌ変異を有する非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）を含む、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記スパイクタンパク質抗原が、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むスパイクタンパク質の切断型である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ＲＢＤが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に相当する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列が：
－５’キャップを含み、次いで
－非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列と、
－サブゲノムプロモータとを含み、次いで
－前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードしている配列と；
－前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原の下流でポリＡテールとを含む、請求項１～７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）抗原をコードしている前記配列が：－５’キャップを含み、次いで
－非構造アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードしている配列と；
サブゲノムプロモータと、その後に続く前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原をコードしている配列と；
－前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗原の下流にあるポリＡテールとを含む、請求項１～８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項10】
少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項11】
カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項１～１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記１つまたは複数の自己複製ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、請求項１～１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記ＲＮＡ分子が、カチオン性脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、コクレアート、ビロソーム、免疫刺激複合体、マイクロ粒子、微粒子、ナノ粒子、単層ベシクル、多重層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにそれらの組み合わせにカプセル化され、結合され、または吸着されている、請求項１～１２の何れかに記載の医薬組成物であって、前記ワクチンにおける前記ＲＮＡの有効用量が０．１～１００μｇである、医薬組成物。
【請求項14】
対象における免疫応答の誘導での使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する対象のワクチン接種での使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記ＲＮＡの有効量が０．１～１００μｇである、請求項１４または１５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項17】
筋肉内、皮内または皮下に投与される、請求項１４～１６のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項18】
単回投与として、または予め規定された期間内に投与される、２回以上の投与の連続を必要とする多回投与として投与される、請求項１４～１７のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項19】
毎年または隔年など、定期的に投与される、前記請求項１４～１８のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項20】
前記医薬組成物の用量が０．０５～１ｍＬである、請求項１４～１９のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。【国際調査報告】