特表 2023-534949 グルカゴン誘導体又はその結合体の肝臓疾患に対する治療的用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-15

(54)【発明の名称】グルカゴン誘導体又はその結合体の肝臓疾患に対する治療的用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/26 20060101AFI20230807BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230807BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230807BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230807BHJP

   C07K 14/605 20060101ALI20230807BHJP

【ＦＩ】

A61K38/26

A61P1/16

A61K47/68

A61K39/395 V

C07K14/605 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023502759

(86)(22)【出願日】2021-07-15

(85)【翻訳文提出日】2023-01-13

(86)【国際出願番号】 KR2021009124

(87)【国際公開番号】W WO2022015082

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】10-2020-0087684

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515022445

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】キム ジュン クク

(72)【発明者】

【氏名】チョ ヒョ サン

(72)【発明者】

【氏名】クウォン ヒョン ジュ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC16

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084BA23

4C084BA37

4C084NA12

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA75

4C085AA34

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA18

4H045BA41

4H045BA57

4H045CA40

4H045DA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、グルカゴン誘導体又はその結合体の肝臓疾患に対する治療的用途に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝臓疾患の予防又は治療のための薬学的組成物であって、
薬学的に許容される賦形剤；と
下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドを薬学的有効量として含む薬学的組成物：
Ｙ－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤＹＳＫＹ－Ｘ１４－Ｄ－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－ＦＶＱＷＬＭＮＴ－Ｘ３０（一般式１、配列番号：４６）
Ｘ２はＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ２１は アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない
（ただし、前記一般式１のアミノ酸配列が配列番号：１又は配列番号：１２と同一の場合を除く）。

【請求項2】

前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表される、請求項１に記載の薬学的組成物：

【化1】

ただし、このとき、Ｘは前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合の連結を示す。

【請求項3】

前記肝臓疾患は、単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）によるものであるか、又は伴うものである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体において肝炎スコア（ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）を減少させる、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体においてヒドロキシプロリン含量を減少させる、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体において肝臓組織内の中性脂肪含量を減少させる、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記ペプチドのＣ末端がアミド化された、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

肝臓疾患の予防又は治療のための薬学的組成物であって、
薬学的に許容される賦形剤；と
配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドを薬学的有効量として含む薬学的組成物。

【請求項14】

前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表される、請求項１３に記載の薬学的組成物：

【化2】

ただし、このとき、Ｘは配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合の連結を示す。

【請求項15】

前記肝臓疾患は、単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１３又は１４に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１５に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）によるものであるか、又は伴うものである、請求項１５に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルカゴン誘導体又はその結合体の肝臓疾患に対する治療的用途に関する。

【背景技術】

【0002】

肝臓は動物の主要生体器官の一つであり、脂質などの代謝作用、解毒、胆汁の排泄、各種栄養素の貯蔵、造血や血液凝固、及び循環血液量の調節など多様な役割を担う器官である。肝臓は非常に多様な大量の生化学的作用を調節するため、生命の維持のために必須である。このような肝臓と関連した疾患としては、代表的に、単純脂肪症、肝線維症、肝炎、肝硬変、肝不全、肝臓癌、胆汁うっ滞性肝臓疾患などが挙げられる。

【0003】

脂肪の過剰摂取や内因的に肝臓内脂肪合成が増加したり、排出が減少して肝臓細胞内に脂肪が蓄積される脂肪肝の一種である、単純脂肪症は炎症を誘発して非アルコール性脂肪肝炎のような他の肝臓疾患に進行する様相を示すことがある。

【0004】

一般に、肝臓に炎症が生じる肝炎が肝臓疾患の大部分を占め、肝炎が進行するにつれ多様な肝臓疾患（肝線維症、硬変など）が現れることが知られている。肝炎の様相によって急性肝炎と慢性肝炎、原因によってウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、薬物性肝炎などに分けられる。胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）も炎症性疾患が原因となって発生するものと推定されている。

【0005】

他の肝臓疾患としては、肝線維症、肝硬変、肝不全、肝臓癌などがあり、このような肝臓疾患は初期に自覚症状がなく、かなり進行してこそ発見されるため、国内だけでなく世界的に死亡原因の数位を占めており、薬物開発の必要性が高い。

【0006】

肝臓疾患の主要原因として知られている肝炎は、多様な遺伝的及び環境的要因により肝固有マクロファージ（ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であるクッパー細胞（ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ）が活性化されて発生する。活性化されたクッパー細胞は、多様な炎症性サイトカインを分泌して肝炎を誘発するだけでなく、ケモカインを血中に分泌して血中単核球細胞及び好中球を含む多様な免疫細胞を肝臓に誘導（ｒｅｃｒｕｉｔ）することにより肝炎を持続させる。このような持続的な肝炎は肝臓組織の損傷を引き起こすが、これは、肝炎をさらに深化させることが知られている。このような悪循環は、究極的に肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ）の活性化を誘発することにより肝線維化まで誘発することが知られている。このような肝線維化を含む様々な肝臓疾患の原因となる肝炎を治療するために、現在はその原因を除去する療法や対症療法を主に行うが、肝炎はかなり進行してこそその症状が発見されるため、予防又は対症療法だけでは疾患の進行を調節することがかなり困難である。そのため、肝炎に直接的に作用できる治療薬物の開発の必要性が依然として高いのが現状である。

【0007】

一方、グルカゴンは薬物治療又は疾病、ホルモンや酵素欠乏などの原因で血糖値が下がり始めると膵臓で生産される。グルカゴンは肝臓でグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように信号し、血糖水準を正常水準まで高める役割をする。それだけでなく、グルカゴンは血糖上昇の効果以外に食欲抑制、脂肪組織におけるエネルギー代謝（ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ）の増加、そして肝組織における脂質代謝の改善を促進し、肥満を含むメタボリックシンドロームの治療剤になり得ることが最近まで提案された。しかし、グルカゴンは低い溶解度と中性ｐＨにおける沈殿により治療剤としてその使用が制限されてきた。

【0008】

したがって、物性が改善されたグルカゴン誘導体が開発され、メタボリックシンドロームなどの治療に利用されてきた（ＵＳ２０１７－０３６０８９２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＵＳ２０１７－０３６０８９２

【特許文献2】国際公開特許ＷＯ２０１６／１０８５８６

【特許文献3】国際公開特許ＷＯ２０１７／００３１９１

【特許文献4】国際公開特許ＷＯ９７／３４６３１

【特許文献5】国際公開特許ＷＯ９６／３２４７８

【特許文献6】ＷＯ２００７／０２１１２９

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３

【非特許文献2】Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９

【非特許文献3】Ｇ．Ｊ． Ｗｅｂｂら、Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１５ Ｎｏｖ；６４：４２－５２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

効果的な肝臓疾患の予防及び治療のための薬物の開発が求められる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の一つの目的は、一般式１のペプチド又はこれを含む結合体を含む組成物、具体的には、肝臓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することにある。

【0013】

本発明のもう一つの目的は、前記一般式１のペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓疾患の予防又は治療方法を提供することにある。

【0014】

本発明のもう一つの目的は、肝臓疾患の予防又は治療のための薬剤の製造において、前記一般式１のペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物の用途を提供することにある。

【0015】

本発明のもう一つの目的は、前記一般式１のペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物の肝臓疾患の予防又は治療用途を提供することにある。

【0016】

本発明のもう一つの目的は、配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド又はこれを含む結合体を含む肝臓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することにある。

【0017】

本発明のもう一つの目的は、配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド又はこれを含む結合体又はこれを含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓疾患の予防又は治療方法を提供することにある。

【0018】

本発明のもう一つの目的は、肝臓疾患の予防又は治療のための薬剤の製造において、配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド又はこれを含む結合体又はこれを含む組成物の用途を提供することにある。

【0019】

本発明のもう一つの目的は、前記配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物の肝臓疾患の予防又は治療用途を提供することにある。

【発明の効果】

【0020】

本発明によるグルカゴン受容体に対する活性を有するペプチド又はその結合体は、肝臓疾患の予防又は治療に有用に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明による配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の肝炎に対する効果を確認した図である。

【図2】本発明による配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の肝線維症に対する効果を確認した図である。

【図3】本発明による配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の肝臓内中性脂肪減少効果を確認した図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明を具現する一つの態様は、ペプチド又はこれを含む結合体を含む組成物、具体的には、肝臓疾患の予防又は治療用薬学的組成物である。

【0023】

一つの具体例において、本発明は、肝臓疾患の予防又は治療のための薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤と下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドを薬学的有効量として含む薬学的組成物に関する：

【0024】

Ｙ－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤＹＳＫＹ－Ｘ１４－Ｄ－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－ＦＶＱＷＬＭＮＴ－Ｘ３０（一般式１、配列番号：４６）

【0025】

Ｘ２はＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ２１は アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない。
（ただし、前記一般式１のアミノ酸配列が配列番号：１又は配列番号：１２と同一の場合を除く）。

【0026】

他の具体例として、前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表される薬学的組成物であることを特徴とする：

【0027】

Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
ただし、このとき、Ｘは前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合の連結を示す。

【0028】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記肝臓疾患は、単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）から選択されるいずれか一つであることを特徴とする。

【0029】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする。

【0030】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）によるものであるか、又は伴うことを特徴とするが、これに限定されるものではない。

【0031】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0032】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

【0033】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体において肝炎スコア（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）を減少させることを特徴とする。

【0034】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体においてヒドロキシプロリン含量を減少させることを特徴とする。

【0035】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記薬学的組成物は、投与時に投与された個体において肝臓組織内の中性脂肪含量を減少させることを特徴とする。

【0036】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記ペプチドのＣ末端がアミド化されたことを特徴とする。

【0037】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記Ｌ内のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。

【0038】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記化学式（１）の構造は下記化学式（３）の構造であることを特徴とする：

【0039】

・・・（３）

【0040】

ここで、Ｘ及びＦは化学式（１）で定義した通りである。

【0041】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎであり、ｎは自然数で、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａになるように定められることを特徴とする。

【0042】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１０ｋＤａになるように定められることを特徴とする。

【0043】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記Ｘはペプチド内のシステインの硫黄原子を通じて連結されたことを特徴とする。

【0044】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４由来であることを特徴とする。

【0045】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記Ｆは二つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖中の一鎖の窒素原子を通じてのみ連結されたことを特徴とする。

【0046】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記Ｆは配列番号６９のアミノ酸配列であるモノマーを含むことを特徴とする。

【0047】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記Ｆは配列番号６９のアミノ酸配列のモノマーのホモ二量体であることを特徴とする。

【0048】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記ＦはそのＮ末端プロリンの窒素原子を通じて連結されたことを特徴とする。

【0049】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域であるＦとＸがグリコシル化されていないことを特徴とする。

【0050】

本発明を具現する他の態様は、肝臓疾患の予防又は治療のための薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤と配列番号２０、２２、３３、３７及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドを薬学的有効量として含む薬学的組成物である。

【0051】

一つの具体例において、前記ペプチドは持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は下記化学式（１）で表されることを特徴とする。

【0052】

Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
ただし、このとき、Ｘは配列番号２０、２２、３３、３７及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合の連結を示す。

【0053】

他の具体例として、前記肝臓疾患は、単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする。

【0054】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする。

【0055】

前述の具体例のいずれか一つによる組成物であって、前記の肝臓疾患は非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）によるものであるか、又は伴うことを特徴とするが、これに限定されるものではない。

【0056】

本発明を具現する他の態様は、前記ペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、肝臓疾患の予防又は治療方法である。

【0057】

本発明を具現する他の態様は、肝臓疾患の予防又は治療のための薬剤の製造において、前記ペプチド又はこれを含む結合体、又はこれを含む組成物の用途である。

【0058】

本発明を実施するための具体的な内容を説明すると次の通りである。一方、本願で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記記述される具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは言えない。

【0059】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知又は確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれることが意図される。

【0060】

本明細書全般を通じて、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなくＡｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書で略語に言及されたアミノ酸はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法により記載された。

【0061】

アラニン Ａ アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ グルタミン酸 Ｅ
グルタミン Ｑ グリシン Ｇ
ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ リシン Ｋ
メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ セリン Ｓ
トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ バリン Ｖ

【0062】

本明細書において、「Ａｉｂ」は「２－アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」又は「アミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）」と混用されてもよく、２－アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）とアミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）は混用されてもよい。

【0063】

本発明を具現する一つの態様は、ペプチド又はこれを含む結合体を含む肝臓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。前記ペプチドはグルカゴン受容体に対する活性を有するペプチドであり、具体的にはグルカゴン誘導体であってもよいが、これに制限されない。

【0064】

本発明によるグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンと比較してアミノ酸配列に一つ以上の差があるペプチド、天然型グルカゴン配列を、改質（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じて変形させたペプチド、天然型グルカゴンのようにグルカゴン受容体を活性化させる天然型グルカゴンの模倣体を含む。

【0065】

前記グルカゴン誘導体の種類として、国際公開特許ＷＯ２０１６／１０８５８６及び国際公開特許ＷＯ２０１７／００３１９１に記載された種類が挙げられ、前記国際公開特許の明細書全体は本願に参考資料として全て含まれる。また、前記グルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体の製造方法はＷＯ２０１７／００３１９１に記載されており、前記国際公開特許の明細書全体も本願に参考資料として含まれることは明らかである。

【0066】

このようなグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに対して変化したｐＩを有して改善された物性を示すものであってもよい。

【0067】

また、前記グルカゴン誘導体は、非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。

【0068】

一方、天然型グルカゴンは、次のアミノ酸配列を有することができる：

【0069】

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号：１）

【0070】

本発明において用語「等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）」又は「ｐＩ」とは、あるポリペプチドあるいはペプチドのような分子においてその全体純荷電（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）がなくなる（０）ｐＨ値を意味する。多様な荷電された作用基が存在するポリペプチドの場合、ｐＩにおいてこれら荷電の和はゼロである。ｐＩより高いｐＨにおいてポリペプチドの全体純荷電は陰性になるはずであり、ｐＩより低いｐＨ値においてポリペプチドの全体純荷電は陽性になるはずである。

【0071】

ｐＩは、ポリアクリルアミド、澱粉又はアガロースで構成される固定されたｐＨ勾配ゲル状で等電点電気泳動により、又は、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバでｐＩ／ＭＷツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算することにより決定され得る。

【0072】

本発明において用語「変化したｐＩ」とは、天然グルカゴンのアミノ酸配列で一部配列が負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換されて天然グルカゴンのｐＩとは異なる、即ち、これより減少又は増加したｐＩを有することを意味する。

【0073】

より具体的には、前記グルカゴン誘導体は天然型グルカゴンのｐＩ値（６．８）ではなく変化したｐＩ値を有するものであってもよく、より具体的には、６．８未満、具体的には６．７以下、さらに具体的には６．５以下であるｐＩ値、また、具体的には６．８超、７以上、さらに具体的には７．５以上であってもよいが、これに制限されず、天然型グルカゴンと相違するｐＩ値を有すると、本発明の範疇に含まれる。

【0074】

さらに具体的には、４～６．５及び／又は７～９．５、さらに具体的には７．５～９．５、より一層具体的には８．０～９．３のｐＩ値を有するものであってもよいが、これに制限されない。

【0075】

具体的には、天然型グルカゴンの誘導体は天然型グルカゴンで一部アミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及び修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中のいずれか一つの方法又はこのような方法の組み合わせを通じて変形させることができる。

【0076】

このような方法の組み合わせにより製造されるグルカゴンの誘導体の例として、天然型グルカゴンとアミノ酸配列が一つ以上異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）した、グルカゴン受容体に対する活性化機能を保有しているペプチドなどがあるが、これに制限されず、誘導体の製造のための複数の方法の組み合わせにより本発明に適用される天然型グルカゴンの誘導体を製造することができる。

【0077】

また、天然型グルカゴンの誘導体の製造のためのこのような変形は、Ｌ－型あるいはＤ－型アミノ酸、及び／又は非天然型アミノ酸を用いた変形；及び／又は天然型配列を改質、例えば、側鎖作用基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化等のように改質することにより変形することを全て含む。また、前記変形は非天然型化合物での置換を全て含む。

【0078】

また、天然型グルカゴンのアミノ及び／又はカルボキシ末端に一つ又はそれ以上のアミノ酸が追加されたものを全て含む。

【0079】

前記置換又は追加されるアミノ酸は、ヒトタンパク質から通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく非定形又は非自然的発生アミノ酸を用いることができる。非定形アミノ酸の商業的出所にはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと定形的なペプチド配列は商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購買可能である。

【0080】

アミノ酸誘導体も同様の方式で入手することができるが、その例を一部だけ挙げると、４－イミダゾ酢酸（４－ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）などを用いることができる。

【0081】

グルカゴンは、約７のｐＩを有しており、生理学的ｐＨ（ｐＨ４－８）の溶液中で不溶性であり、中性ｐＨでは沈殿する傾向がある。ｐＨ３以下の水溶液中で、グルカゴンは初期には溶解するが、１時間以内にゲル形成により沈殿する。ゲル化したグルカゴンは、主にβ－シートフィブリルからなり、このように沈殿したグルカゴンはゲルが注射針や、静脈に投与される場合、血管を詰まらせるため、注射剤として用いるのに適しない。沈殿過程を遅延させるために、酸性（ｐＨ２－４）の剤形を用いることが通常であるが、これを通じて短時間で、相対的に無凝集状態でグルカゴンを維持することができる。しかし、グルカゴンのフィブリル形成が低いｐＨで非常に速やかになされるため、このような酸性剤形は、調剤後に直ちに注射されなければならない。

【0082】

本発明によるグルカゴン誘導体は、天然グルカゴンのｐＩを負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基の置換により変化させて延長された作用プロファイルを有するものである。

【0083】

本発明において、前記グルカゴン誘導体は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよいが、これに制限されない：

【0084】

Ｙ－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤＹＳＫＹ－Ｘ１４－Ｄ－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｒ－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－ＦＶＱＷＬＭＮＴ－Ｘ３０（一般式１、配列番号：４６）

【0085】

Ｘ２はＡｉｂ（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）であり；
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、又はセリン（Ｓ）であり；
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、又はグルタミン（Ｑ）であり；
Ｘ２１は アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン酸（Ｅ）であり；
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない
（ただし、前記一般式１のアミノ酸配列が配列番号：１又は配列番号：１２と同一の場合を除く）。

【0086】

その例として、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0087】

具体的には、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３７、３８、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須で）構成されているものであってもよいが、これらに限定されない。

【0088】

他の具体例として、本発明のペプチドは配列番号２～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、又は配列番号２～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されない。又は配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むもの、又は配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されたアミノ酸配列で（必須で）構成されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0089】

本願において「特定の配列番号で構成されるペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一もしくは相当する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列前後の無意味な配列の追加又は自然に発生し得る突然変異、又はそのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除外するものではなく、このような配列の追加もしくは突然変異を有する場合であっても、本明細書の範囲内に属することが自明である。

【0090】

以上の内容は、本発明の他の具体例又は他の態様にも適用し得るが、これらに限定されるものではない。

【0091】

本発明において、前記ペプチドは、天然型グルカゴンと配列同一性を比較したとき、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するものであってもよいが、特にこれに限定されるものではなく、前記ペプチドと天然型グルカゴンの配列比較を通じて当業者が容易に把握することができる。

【0092】

本発明の用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列との類似度を示すためのものであり、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列と前記のようなパーセント以上の同一な配列を有する配列を含む。このような相同性は、両配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて配列して相同性程度を分析する生物情報アルゴリズム（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて決定することができる。前記二つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表すことができる。有用な自動化したアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ、ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。

【0093】

また、本発明において、前記ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性を示すペプチド又はグルカゴン誘導体であってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0094】

特に、これに限定されるものではないが、前記グルカゴン受容体に対して有意な水準の活性を有するペプチドは、グルカゴン受容体に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が天然型リガンド（天然型グルカゴン）に対して約０．００１％以上、約０．０１％以上、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上を表すことがあるが、有意に活性を示す範囲は制限なく含まれる。そのようなペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、本願明細書の実施例４を参照することができるが、特にこれに限定されるものではない。

【0095】

本発明において用語「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。

【0096】

特に、これに限定されるものではないが、そのようなペプチドは、非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。

【0097】

上述したグルカゴン誘導体は、分子内架橋（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅ）を含んでもよく（例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋）、具体的には環を含む形態であってもよい。例えば、グルカゴン誘導体の１６番及び２０番アミノ酸間に環が形成された形態であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。

【0098】

前記環の非制限的な例としてラクタム架橋（又はラクタム環）を含んでもよい。

【0099】

また、前記グルカゴン誘導体は環を含むように、目的とする位置に環を形成することができるアミノ酸を含むように変形されたことを全て含む。

【0100】

このような環は、前記グルカゴン誘導体内のアミノ酸側鎖間に形成され得、その例としてリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖との間にラクタム環が形成される形態であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。

【0101】

例えば、前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対において、各アミノ酸対のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸又はリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。前記、Ｘｎ（ｎは自然数）でｎは提示されたアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸位置を示す。

【0102】

また、前記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｘ１２とＸ１６のアミノ酸対、Ｘ１６とＸ２０のアミノ酸対、又はＸ１７とＸ２１のアミノ酸対のアミノ酸のそれぞれが環を形成するグルタミン酸又はリシンで置換されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0103】

また、前記一般式１において、Ｘ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対のうち少なくとも一つのアミノ酸対で各アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸間に環（例えば、ラクタム環）を形成したものであってもよいが、これに制限されない。

【0104】

また、前記一般式１において、Ｘ１６がグルタミン酸であり、Ｘ２０はリシンであり、Ｘ１６とＸ２０の側鎖がラクタム環を形成しているものであってもよいが、これに制限されない。

【0105】

また、本発明によるペプチドはＮ末端及び／又はＣ末端が変形されていないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断酵素から保護し、安定性を増加させるために、このＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾されたり有機基で保護されたり、又はペプチド末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態も本発明によるペプチドの範疇に含まれる。Ｃ末端が変形されていない場合、本発明によるペプチドの末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに制限されるものではない。

【0106】

又は化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するためにＮ末端をアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及び／又はＣ末端をアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）することができるが、特にこれに制限されない。

【0107】

本明細書において別途に指すことがなければ、本発明による「ペプチド」又はこのようなペプチドが生体適合性物質に共有結合で連結された「結合体」に関する明細書の詳細な説明や請求の範囲の技術は、当該ペプチド又は結合体はもちろん、当該ペプチド又は結合体の塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、又はその溶媒和物の形態を全て含む範疇にも適用される。従って明細書に「ペプチド」又は「結合体」とだけ記載されていても当該記載内容はその特定塩、その特定溶媒和物、その特定塩の特定溶媒和物にも同様に適用される。このような塩形態は、例えば、薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに制限されるものではない。

【0108】

前記用語、「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、又はアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。

【0109】

本発明において用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、又は塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩はナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含み得る。

【0110】

また、本発明で用いられた用語「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド、結合体、又はこの塩が溶媒分子と複合体を形成したことをいう。

【0111】

本発明によるペプチドのＣ末端はアミド化されるか、又は遊離カルボン基（－ＣＯＯＨ）を有するペプチドであるか、又はＣ末端が変形していないペプチドを含むものであってもよいが、これに制限されない。

【0112】

一つの具体例として、前記ペプチドは、Ｃ末端がアミド化されているものであってもよいが、これに制限されない。

【0113】

一つの具体例として、前記ペプチドは非グリコシル化されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0114】

本発明のペプチドは、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法を通じて合成でき、組換え方法でも生産可能であり、商業的に依頼して製造することができるが、これに制限されない。

【0115】

本発明のペプチドは、その長さによってこの分野においてよく知られている方法、例えば、自動ペプチド合成器により合成でき、遺伝子操作技術により生産することもできる。

【0116】

具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム、又は任意の他の当該分野の方法により製造することができる。従って、本発明によるグルカゴン誘導体は、例えば、下記を含む方法を含む多数の方法で合成することができる：

【0117】

（ａ）ペプチドを固相又は液相法の手段で段階的に又は断片組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法；又は
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；又は
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を行い、発現生成物を回収する方法；又は
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドの断片を得、続いて、断片を連結させてペプチドを得、当該ペプチドを回収する方法。

【0118】

より具体的な例として、遺伝子操作を通じて、融合パートナー及びグルカゴン誘導体を含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子を製造し、これを宿主細胞に形質転換させた後、融合タンパク質形態で発現し、タンパク質分解酵素又は化合物を用いて融合タンパク質からグルカゴン誘導体を切断、分離して所望のグルカゴン誘導体を生産することができる。このため、例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａやエンテロキナーゼのようなタンパク質分解酵素、ＣＮＢｒ又はヒドロキシルアミンのような化合物により切断され得るアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を融合パートナーとグルカゴン誘導体をコードするポリヌクレオチドとの間に挿入することができる。

【0119】

より具体的な様態として、本発明によるペプチド、あるいはグルカゴン誘導体は、この生体内半減期を増加させる生体適合性物質部に結合した、持続型結合体の形態であってもよいが、これに制限されない。前記生体適合性物質部はキャリアと混用され得る。

【0120】

本発明において用語、「持続型結合体」は、生理活性物質（例えば、グルカゴン誘導体）に生体適合性物質部又はキャリアが結合した形態であり、具体的には、前記結合体は、ペプチド部位及び前記ペプチド部位に共有結合により連結された生体適合性物質部を含み、前記ペプチド部位は、前記一般式１のアミノ酸配列又は配列番号２～１１、及び１３～４５と同一の配列であるか、又はこれを含む配列であってもよい。前記持続型結合体において生体適合性物質部又はキャリアは生理活性物質に共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。

【0121】

本発明において、前記ペプチドの結合体は、キャリアが結合していないペプチドに比べて増加した効力の持続性を示すことができ、本発明では、このような結合体を「持続型結合体」と称する。

【0122】

一方、そのような結合体は非自然な（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってもよい。

【0123】

本発明の具体的な実施形態において、前記持続型結合体はグルカゴン誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域が互いに連結された形態を指す。具体的には、前記結合体はグルカゴン誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域がリンカーを通じて共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに制限されない。

【0124】

一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸはグリコシル化されていなくてもよいが、これに制限されない。

【0125】

本発明の一具体例において、前記持続型結合体は、下記化学式（１）で表される結合体であってもよいが、これに限定されない。

【0126】

Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
ただし、このとき、Ｘは前記ペプチドであり；
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬとの間、ＬとＦとの間の共有結合の連結を表す。

【0127】

前記化学式（１）の持続型結合体のＸは、上述したグルカゴン誘導体であってもよいが、これに限定されない。

【0128】

具体的には、前記Ｘは、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、又は、前記Ｘは、配列番号２～４５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、又は配列番号２～１１及び１３～４５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドであってもよく、又は、Ｘは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであってもよいが、これらに限定されない。

【0129】

本発明において用語「化学式（１）の持続型結合体」は、グルカゴン誘導体及び免疫グロブリンＦｃ領域が互いにリンカーで連結された形態であり、前記結合体は免疫グロブリンＦｃ領域が結合されていないグルカゴン誘導体に比べて増加した効力の持続性を示すことができる。

【0130】

前記持続型結合体において、Ｆは、Ｘ、即ち、グルカゴン誘導体の半減期を増加させる物質であり、本発明の前記結合体を構成する部位の一構成に相当する。

【0131】

化学式（１）の持続型結合体において、グルカゴン誘導体であるペプチドであるＸと免疫グロブリンＦｃ領域の連結は物理又は化学結合であるか、非共有又は共有結合であってもよく、具体的には共有結合であってもよいが、これに制限されない。

【0132】

また、化学式（１）の持続型結合体のグルカゴン誘導体であるＸと免疫グロブリンＦｃ領域の連結方法は特に制限されないが、リンカーを通じてグルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が互いに連結されたものであってもよい。

【0133】

前記化学式（１）において共有結合でＬを通じてＸとＦが互いに結合されてもよい。

【0134】

より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは共有結合で互いに連結されてもよく、この時、前記結合体は化学式（１）の順に、Ｘ、Ｌ、及びＦが共有結合を通じてそれぞれ連結された結合体であってもよい。

【0135】

また、前記ＸはＦが直接的に連結されるか（即ち、前記化学式（１）においてａが０であるか）、又はリンカー（Ｌ）を通じて連結されたものであってもよい。

【0136】

具体的な例として、前記Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であってもよく、より具体的には前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ由来であってもよいが、特にこれに限定されない。

【0137】

本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の持続型結合体の部位をなす一構成であってもよい。前記免疫グロブリンＦｃ領域は「免疫グロブリンＦｃ断片」と混用され得る。

【0138】

本明細書においてＦｃ領域とは、免疫グロブリンのパパイン消化から得られる天然型配列だけでなく、その誘導体、例えば、天然配列中の１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組合せにより変換され、天然型と相異なった配列など変形体まで網羅して含まれる。前記誘導体、置換体、変形体はＦｃＲｎに結合する能力を有することを前提とする。本発明において、Ｆはヒト免疫グロブリン領域であってもよいが、これに限定されない。前記Ｆは、二つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結されている構造であり、前記二鎖のうちの一鎖の窒素原子を介してのみ連結されている構造であってもよいが、これに限定されない。前記窒素原子を介した連結は、リシンのイプシロンアミノ原子やＮ末端アミノ基に還元的アミノ化を通じて連結することができる。

【0139】

還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（即ち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成した後、還元反応によりアミン結合を形成させる反応を意味し、当技術分野において広く知られている有機合成反応である。

【0140】

一具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端プロリンの窒素原子を介して連結されていてもよいが、これらに限定されない。

【0141】

そのような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むことができるが、これらに限定されない。

【0142】

本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端に特定のヒンジ配列を含んでもよい。

【0143】

本発明の用語「ヒンジ配列」は、重鎖に位置し、ジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ領域の二量体を形成する部位を意味する。

【0144】

本発明において、ヒンジ配列は、下記のアミノ酸配列を有するヒンジ配列の一部が欠失して一つのシステイン残基のみを有するように変異したものであってもよいが、これに限定されない。

【0145】

Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４９）。

【0146】

ヒンジ配列は、配列番号４９のヒンジ配列のうちの８番目又は１１番目のシステイン残基が欠失して一つのシステイン残基のみを含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、一つのシステイン残基のみを含む３～１２個のアミノ酸で構成されてもよいが、これらに限定されない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は、以下のような配列を有することができる：

【0147】

Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５０）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号５１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５３）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５５）、Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５６）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５７）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５８）、Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５９）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６０）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６１）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６２）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６３）、Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６４）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６５）、Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号６７）、Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６８）。

【0148】

より具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号５９（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号６８（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに限定されない。

【0149】

本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列の存在で免疫グロブリンＦｃ鎖２分子が二量体を形成した形態であってもよく、また、本発明の化学式（１）の結合体は、リンカーの一末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ領域の一本鎖に連結した形態であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0150】

本発明の用語、「Ｎ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味するものであり、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列をＮ末端に含むことができるが、これらに限定されない。

【0151】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を奏する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部又は全体重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する相当長い一部アミノ酸配列が除去された領域であってもよい。

【0152】

例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン中の１個又は２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。しかし、これに制限されるものではない。

【0153】

本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体の形態であってもよいが、これに制限されない。

【0154】

また、一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は二量体形態（ｄｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）であり、二量体形態の一つのＦｃ領域にＸの一分子が共有結合で連結されてもよく、この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、非ペプチド性ポリマーにより互いに連結されてもよい。一方、二量体形態の一つのＦｃ領域にＸの二つの分子が対称的に結合することも可能である。この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは非ペプチド性リンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、前記例に限定されるものではない。

【0155】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなくこの配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせにより相違する配列を有することを意味する。

【0156】

例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番アミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられ得る。

【0157】

また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたり、天然型ＦｃでＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加される等、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクタ機能をなくすために補体結合部位、例としてＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号等に開示されている。

【0158】

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知となっている（Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ． Ｌ． Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も通常生じる交換は、アミノ酸残基 Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

【0159】

上述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。

【0160】

また、このようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット又はモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）₂に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。さらに具体的な実施形態ではヒト由来のＦｃ領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。

【0161】

また、免疫グロブリンＦｃ領域は天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は補体（ｃ１ａ）との結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が減少又は除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形態は糖鎖が除去されたり、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域と言える。

【0162】

本発明において「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を言い、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は原核動物、さらに具体的な実施形態では大腸菌で生産して糖グリコシルされないＦｃ領域を意味する。

【0163】

一方、免疫グロブリンＦＣ領域は、ヒト又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラビット、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、さらに具体的な実施形態ではヒト起源である。

【0164】

また、免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるものであってもよい。さらに具体的な実施形態では、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態ではリガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来である。より一層具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であるが、これに制限されるものではない。

【0165】

また、一つの具体的な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃの領域であり、各モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）の３番アミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ形態）を通じて二個のモノマーが連結されたホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）の形態であってもよく、このとき、ホモ二量体の各モノマーは、独立して３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合、即ち、二個の内部のジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ－ｃｈａｉｎの形態）を有したり／有することができる。各モノマーのアミノ酸の数は２２１個のアミノ酸で構成されることができ、ホモ二量体を形成するアミノ酸は、全部で４４２個のアミノ酸からなってもよいが、これに限定されない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ断片は、配列番号６９のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有するモノマー２個が各モノマーの３番アミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体のモノマーは、それぞれ独立して３５番及び９５番のシステイン間の内部のジスルフィド結合及び１４１番及び１９９番のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであってもよいが、これらに限定されない。

【0166】

前記化学式（１）のＦは配列番号６９のアミノ酸配列であるモノマーを含むものであってもよく、前記Ｆは配列番号６９のアミノ酸配列のモノマーのホモ二量体であってもよいが、これに制限されない。

【0167】

一例として、免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号７０のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸で構成される）を含むホモ二量体であってもよいが、これに制限されない。

【0168】

一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドとの結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ領域からなるグループから選択された２個以上の領域から二量体又は多量体の製造が可能である。

【0169】

一方、前記Ｌは、非ペプチド性リンカー、例えば、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカーであってもよい。

【0170】

本発明において「非ペプチド性リンカー」は、繰り返し単位が二個以上結合した生体適合性ポリマーを含む。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく任意の共有結合を通じて互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の部位をなす一構成であってもよく、前記化学式（１）においてＬに対応する。本発明で使用し得る非ペプチド性リンカーは、インビボタンパク質分解酵素に抵抗性のあるポリマーであれば、制限なく使用することができる。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性ポリマーと混用して使用することができる。

【0171】

特にこれに限定されないが、前記非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含有するリンカー、例えば、ポリエチレングリコールであってもよく、また、当該分野において既知のそれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も本発明の範囲に含まれる。

【0172】

前記非ペプチド性リンカーの繰り返し単位は、エチレングリコール繰り返し単位であってもよく、具体的には、非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含みながら、結合体で構成される前には結合体の製造に用いられる作用基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、前記作用基を介してＸとＦが連結された形態であってもよいが、これらに限定されない。本発明において、前記非ペプチド性リンカーは、２個、又は３個以上の作用基を含んでいてもよく、各作用基は同一又は互いに異なっていてもよいが、これらに限定されない。

【0173】

具体的には、前記リンカーは、下記化学式（２）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよいが、これに限定されるものではない：

【0174】

・・・（２）

【0175】

ここで、ｎ＝１０～２４００、ｎ＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これに限定されない。

【0176】

前記持続型結合体においてＰＥＧ部位は、－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－構造だけでなく、連結要素とこの－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－との間に介在する酸素原子も含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0177】

一つの具体例として、前記エチレングリコール繰り返し単位は、その例として、［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎで表すことができ、ｎ値は自然数で、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が０超過～約１００ｋＤａになるように定められるが、これに制限されない。もう一つの例として、前記ｎ値は自然数で、前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、又は約１０ｋＤａであってもよいが、これに限定されない。

【0178】

また、一つの具体的な実施形態において、前記結合体は、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド（Ｘ）と免疫グロブリン断片（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合で連結された構造であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0179】

前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコールホモポリマー、ＰＥＧコポリマー、又はモノメチル置換ＰＥＧポリマー（ｍＰＥＧ）の形態を全て包括する用語であるが、特にこれに限定されるものではない。

【0180】

前記非ペプチド性ポリマーの分子量は、１～１００ｋＤａの範囲、具体的には１～２０ｋＤａの範囲、又は１～１０ｋＤａの範囲であるが、これらに限定されない。また、Ｆに該当するポリペプチドと結合する本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類のポリマーだけでなく、異なる種類のポリマーの組み合わせが使用されてもよい。

【0181】

一つの具体例として、前記リンカーの両末端は免疫グロブリンＦｃ領域のチオール基、アミノ基、ヒドロキシ基及びペプチド（Ｘ）のチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシ基に結合できるが、これに制限されない。

【0182】

具体的には、リンカーは、両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びペプチド（Ｘ）と結合できる反応基、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域のシステインのチオール基；Ｎ末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置するアミノ基；及び／又はＣ末端に位置するヒドロキシル基と結合され、ペプチド（Ｘ）のシステインのチオール基；リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基；アジドリシンのアジド基；及び／又はヒドロキシ基と結合できる反応基を含むことができるが、これに限定されない。

【0183】

より具体的には、前記リンカーの反応基は、アルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに制限されない。

【0184】

前記において、アルデヒド基としてプロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を例として挙げることができるが、これに限定されない。

【0185】

前記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジル吉草酸、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオン酸、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが利用されてもよいが、これらに限定されない。

【0186】

前記リンカーは、前記のような反応基を通じて免疫グロブリンＦｃ領域であるＦ及びペプチド（グルカゴン誘導体）であるＸに連結され、リンカー連結部に転換できる。

【0187】

また、アルデヒド結合による還元性アルキル化により生成された最終生成物は、アミド結合により連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低ｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高ｐＨ、例えば、ｐＨ９．０の条件下ではリシン残基と共有結合を形成することができるが、これに限定されない。

【0188】

本発明のリンカーの末端反応基は、互いに同一又は異なってもよい。前記リンカーは末端にアルデヒドグループ反応基を有するものであってもよく、また前記リンカーは末端にそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミド反応基を有するか、末端にそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに制限されない。

【0189】

例えば、一方の末端にはマレイミドグループを、他方の末端にはアルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有してもよい。もう一つの例として、一方の末端にはスクシンイミジルグループを、他方の末端にはプロピオンアルデヒドグループ又はブチルアルデヒドグループを有してもよい。

【0190】

プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして利用する場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを利用して本発明の結合体を製造することができる。

【0191】

一つの具体的な実施形態において、前記リンカーの反応基がペプチドのシステイン残基、より具体的には、システインの－ＳＨ基に連結されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0192】

もし、マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを使用する場合、マレイミド基はペプチドの－ＳＨ基とチオエーテル（ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ）結合で連結し、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ₂基と還元的アルキル化反応を通じて連結できるが、これに制限されず、これは一例に該当する。

【0193】

このような還元的アルキル化を通じてＰＥＧの一方の末端に位置する酸素原子に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端アミノ基が－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－の構造を有するリンカー作用基を通じて互いに連結され、－ＰＥＧ－Ｏ－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ－免疫グロブリンＦｃのような構造を形成することができ、チオエーテル結合を通じてＰＥＧの一方の末端がペプチドのシステインに位置する硫黄原子に連結された構造を形成することができる。上述のチオエーテル結合は、

の構造を含むことができる。

【0194】

しかし、上述の例に特に制限されるものではなく、これは一例に該当する。

【0195】

また、前記結合体において、リンカーの反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ₂と連結されたものであってもよいが、これは一例に該当する。

【0196】

また、前記結合体において、本発明によるペプチドは反応基を有するリンカーとＣ末端を通じて連結されてもよいが、これは一例に該当する。

【0197】

本発明において「Ｃ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端を意味し、本発明の目的上、リンカーと結合できる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｃ末端の最末端アミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端周囲のアミノ酸残基を全て含むことができ、具体的には、最末端から１番目～２０番目のアミノ酸残基を含むことができるが、これに制限されない。

【0198】

一つの具体例として、前記化学式（１）の結合体は下記化学式（３）の構造を有することができる。

【0199】

・・・（３）

【0200】

前記化学式（３）において、Ｘは前記のペプチド（グルカゴン誘導体）であり、
Ｆはヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり；
ｎは自然数であってもよい。この時、ｎに対する説明は前記の通りである。

【0201】

一つの具体例として、前記化学式（３）の持続型結合体はペプチドＸとヒト免疫グロブリンＦｃ領域Ｆがエチレングリコール繰り返し部を介して共有結合で連結された構造であり、それぞれＸは化学式（３）のスクシンイミド環に、Ｆは化学式（３）のオキシプロピレン基に連結される形態であってもよい。

【0202】

前記化学式３において、前記ｎの値は前記ペプチド結合体内の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部位の平均分子量、例えば、数平均分子量が１～１００ｋＤａ、又は１～２０ｋＤａ又は１０ｋＤａになるように定められてもよいが、これに制限されない。

【0203】

一実施形態において、化学式（３）のスクシンイミド環にＸが連結される部位は、ＸのＣ末端システインの硫黄原子であってもよい。

【0204】

Ｆ内において前記オキシプロピレン基に連結される部位は特に限定されない。本発明の一実施形態において、前記オキシプロピレン基に連結されるＦの部位は、Ｎ末端の窒素又はＦ内部残基の窒素原子（例えば、リシンのイプシロン窒素）であってもよい。本発明の一つの具体的な実施形態において、Ｆが前記オキシプロピレン基に連結される部位はＦのＮ末端プロリンであってもよいが、これに制限されない。

【0205】

また、上述した結合体は、効果の持続性が天然型グルカゴンに比べて、又はＦが修飾されていないＸに比べて増加したものであってもよく、このような結合体は上述した形態だけでなく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態などを全て含む。

【0206】

本発明によるペプチド又はその結合体は、肝臓疾患に対する予防又は治療用途を有する。具体的には、本発明によるペプチド又はその結合体又はこれを含む組成物は、肝臓組織における炎症及び／又は線維化を抑制し、改善する効果を示し、肝臓疾患に対する予防又は治療用途を有するものであってもよいが、これに制限されない。また、本発明によるペプチド又はその結合体又はこれを含む組成物は、肝臓組織における脂肪含量を減少させ、単純脂肪症だけでなく、様々な肝臓疾患の原因となる過度な脂肪沈着を改善することができるが、これに制限されない。

【0207】

本発明において、「肝臓疾患」は肝臓で発生する疾患を意味し、単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｒｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであってもよく、具体的には、前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）またはこれらの組み合わせであってもよいが、肝臓の組織及び機能に異常が生じる限り、肝臓疾患が前記疾患に制限されるものではない。

【0208】

本発明の実施例では、ＡＭＬＮ（アミリン）食餌で誘導された非アルコール性脂肪肝マウスモデルにおいて肝組織内の中性脂肪減少の効果を確認したため（図３）、本発明によるグルカゴン誘導体、その結合体、又はこれを含む組成物は、肝組織内の脂肪を減少させて単純脂肪症をはじめとする代謝性肝臓疾患に対する予防及び治療効果を有する。さらに、肝臓組織内の脂肪沈着は炎症を誘発し、他の肝臓疾患への進行を招くことになる。

【0209】

本発明のペプチド又はその結合体が治療効果を有する肝臓疾患は、代謝性肝臓疾患であってもよいが、これらに限定されない。代謝性肝臓疾患は、身体の非正常な化学反応が身体の新陳代謝を妨げることにより生じる疾患であり、単純脂肪症、脂肪肝、脂肪肝炎、などが含まれる。

【0210】

本発明による組成物は、投与時に肝臓組織内の中性脂肪を減少させ、炎症を緩和することにより代謝性肝臓疾患に予防又は治療効果を示すものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記代謝性肝臓疾患は、炎症を伴うか、又は炎症を伴わないことがあり、本発明による組成物で治療できる肝臓疾患の例としては単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎などが挙げられるが、これに制限されるものではない。

【0211】

代謝性肝臓疾患の代表的な例である「非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＦＬＤ）」とは、アルコール摂取の過去歴がなく、アルコール摂取に関係がないのに脂肪肝を伴う場合をいう。脂肪肝とは、中性脂肪が正常な場合とは異なり、肝細胞内に非正常に沈着する現象が現れたことをいう。正常の肝臓は、約５％が脂肪組織で構成されており、中性脂肪、脂肪酸、リン脂質、コレステロール及びコレステロールエステルが脂肪の主成分であるが、一度脂肪肝が発生すると、大部分の成分が中性脂肪に代替され、中性脂肪の量が肝臓重量の５％以上であれば脂肪肝と診断される。脂肪肝は、肝細胞内の脂肪代謝障害や過剰脂肪を運搬する過程における欠陥などによりもたらされるものであり、主に肝臓における脂肪代謝の障害により発生する。前記脂肪肝に蓄積された脂肪の大部分は中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）であってもよい。

【0212】

非アルコール性脂肪肝疾患は、肝細胞に脂肪の過剰な蓄積のみがある単純脂肪症（ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ）、肝細胞壊死と炎症と線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）などを含む一連の疾患群を意味するが、本発明の組成物で治療される限り、これに限定されるものではない。本発明による非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎を伴うものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0213】

多くの場合において、脂肪沈着、ウイルス、アルコール、薬物、免疫異常、代謝疾患などの原因により肝臓に炎症が発生することがあり、肝炎の進行及び慢性化により肝線維症、肝硬変、肝不全、肝臓癌などの疾患として発病することが知られている。

【0214】

本発明の実施例では、ＡＭＬＮ（アミリン）／ＴＡＡ（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）マウスモデルにおいて肝炎及び肝線維症改善の効果を確認し（図１及び２）、これは、肝炎及び肝線維症だけでなく、肝炎に変異した肝細胞に起因し得る原発性肝癌及び肝線維症の最後の段階である肝硬変及びこれによる肝不全のような肝臓疾患の発病において主要なメカニズムに本発明のグルカゴン誘導体が効果を示すことを示唆することである。高脂肪、高果糖、高コレステロール含量を有しており、肥満及び脂肪肝炎を誘発することが知られているＡＭＬＮ食餌及び肝炎の誘導を通じて線維化を誘発することが知られているＴＡＡ（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）の投与により誘導されたＡＭＬＮ／ＴＡＡマウスモデルは、一般に、炎症又は線維化モデルとして利用され、さらに非アルコール性脂肪肝炎モデルとしても利用される。したがって、本発明によるグルカゴン誘導体、その結合体、又はこれを含む組成物は、肝炎及び肝線維症をはじめとする肝臓疾患に対する予防又は治療効果を示すことができ、具体的には、前記肝臓疾患は非アルコール性脂肪肝炎に起因したり、これを伴うものであるが、これに制限されない。

【0215】

本発明において、「肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）」とは、肝臓疾患の最大の原因であり、肝臓に炎症を引き起こす疾患を意味し、原因と症状に応じて急性肝炎と慢性肝炎に区別される。ウイルス、アルコール、薬物、免疫異常、代謝疾患などを主原因とする。本発明の組成物は、投与時に投与された個体において肝炎スコア（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）を減少させることにより肝炎に対する予防又は治療効果を示すことができるが、これに制限されない。

【0216】

本発明によるペプチド及びその結合体は、肝臓の炎症自体を軽減する効果を有するだけでなく、肝臓の炎症を伴うか、又は肝臓の炎症に起因して発病した疾患にも効果を奏することができる。

【0217】

本発明において、「線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」は、器官又は組織において過度な線維質結合組織を形成する疾患である。線維症は、人体内で組織が様々なストレス（炎症、化学的刺激、放射線など）により損傷を受けた後、創傷治癒（ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）過程で正常な統制が不可能な状態であり、特に慢性疾患に共通する経路であり、そのメカニズムが非常に複雑で、現在でも完全に究明されていない。線維症は、肺、心臓、肝臓など様々な臓器に発生し、まだ根本的な治療剤が開発されず、未充足の需要が高い分野の一つである。

【0218】

本発明において、「肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」とは、反復的な肝損傷に対する損傷回復過程の結果であり、肝硬変症とは異なって可逆的であり、薄い原線維（ｔｈｉｎ ｆｉｂｒｉｌ）で構成され、結節（ｎｏｄｕｌｅ）の形成がないことが知られており、肝損傷の原因が消失すれば、正常回復が可能であってもよいが、このような肝線維症の過程が繰り返されると、ＥＣＭ（ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）間の交差結合（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）が増加し、結節（ｎｏｄｕｌｅ）のある不可逆的な肝硬変症に進行する。

【0219】

本発明の組成物は、前記薬学的組成物は投与時に投与された個体においてヒドロキシプロリン含量を減少させることにより肝線維症に対する予防又は治療効果を示すことができるが、これに制限されるものではない。本発明によるペプチド及びその結合体は、肝臓の線維化自体を緩和する効果を有するだけでなく、肝臓の線維化を伴ったり、これに起因して発病した疾患にも効果を示すことができる。

【0220】

本発明の「肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）」は、肝細胞の再生及び線維組織の増加を繰り返しながら発病し、病理学的に壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を伴う慢性疾患であり、究極的には肝不全のような肝硬変合併症及び肝癌などの疾患に進行して死亡に至る。特に、初期に自覚症状がなく、かなり進行してこそ発見されるため、肝硬変などに進化する前の状態である肝線維症を迅速に治療することが求められる。

【0221】

本発明の「肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）」とは、ウイルス性肝炎、肝硬変症、薬物又はアルコールのような肝損傷又は肝臓疾患により、肝機能が低下し、肝臓が正常な生理作用としてのタンパク質合成と代謝機能を遂行できない状態を意味する。進行速度により急性肝不全又は慢性肝不全に分けられ、多様な合併症を起こすことが知られている。
本発明の「肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」とは、肝細胞由来の悪性腫瘍を意味し、肝細胞自体から発生した原発性肝癌（肝細胞癌；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と他の組織の癌が肝臓に転移してきた転移性肝癌に区分できるが、肝癌の約９０％以上は原発性肝癌である。主な原因としては、肝炎、慢性肝臓疾患のほかに、アルコール、喫煙、肥満などが知られている。

【0222】

本発明において、「胆汁うっ滞症（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）」は、肝臓から十二指腸への胆汁の流動が遅くなったり遮断された病態であり、「胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）」は肝臓内において、胆汁形成が各種疾患、拡張された経静脈栄養、又は特定の薬物（例えば、一部の抗生剤）の副作用のような病態により妨害されたことを意味する。胆汁うっ滞症の通常の徴候には、疲労、そう痒感（かゆみ）、黄疸、及び黄色腫（皮下への高コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ）物質の堆積）が含まれる。胆汁うっ滞症の影響は極度で広範囲であり、これは、肝臓疾患の全身性疾患への悪化、肝不全、及び肝移植の必要性をもたらす。胆汁うっ滞性肝臓疾患の原因としては、急性肝炎、胆管の炎症などが挙げられる。

【0223】

前記胆汁うっ滞性肝臓疾患には、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）、及びアラジール症候群（Ａｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＳ）などが含まれるが、これに限定されない。

【0224】

原発性胆汁性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ：ＰＢＣ）としても知られている原発性胆汁性硬変症は、原因不明の慢性胆汁うっ滞性肝臓疾患である。門脈（ｐｏｒｔａｌ）及び門脈周囲（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ）の炎症による進行性胆管損傷は、進行性線維症及び最終的な肝硬変を引き起こすことがある。これまでは、免疫学的、遺伝的及び環境的要因が疾患の潜在的な原因として知られている。原発性胆汁性硬変症は、主に中年の女性に多く見られ、症状は初期発現において疲労、かゆみ、又は不糾明の高脂血症も原発性胆汁性硬変症の症状として現れることがある。

【0225】

現在までは、原発性胆汁性硬化症が免疫媒介された疾患であることが知られており、具体的には、門脈及び門脈周辺の部位においてＴリンパ球の免疫組織化学的染色は、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性Ｔ細胞を示す。また、罹患した個体の無症候性第一等級の同類（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）において、非正常抑制性Ｔ細胞活性が報告された。インターロイキンが変更された免疫機能及び線維症に寄与することによりＰＢＣの発病機序に役割を果たすことが報告された（Ｇ．Ｊ． Ｗｅｂｂら、Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１５ Ｎｏｖ；６４：４２－５２）。

【0226】

ＰＢＣの治療方法は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＳＡ）及びオベチコール酸（ＯＣＡ）を用いた胆汁酸治療法である。ＰＢＣにおいて両薬物の作用メカニズムは、ＦＸＲ及びＴＧＦＲ－５を活性化させて抗炎症性効果を発揮させるそれらの能力と関連している。しかしながら、ＵＤＣＡで治療された患者の約４０％で十分な生化学反応が達成されなかった。

【0227】

原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ：ＰＳＣ）は、原因のわからない肝内／肝外胆道の炎症と線維化により引き起こされる慢性進行性胆汁うっ滞性肝臓疾患である。具体的には、胆管及び胆道の炎症性疾患として疾患が進行すると、線維化が起こり、胆管壁が厚くなりながら、狭くなったり狭窄する疾患である。まだ原因は不明であるが、遺伝的要因、環境的要因、これに関連する免疫反応など多様な因子が複合的な原因として推定されている。

【0228】

血液による肝機能検査において、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ値の上昇、ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ値の上昇、ガンマグロブリン血症などが見られれば、原発性硬化性胆管炎と診断している。

【0229】

ＰＳＣの治療方法は、まだ明確に報告されておらず、肝移植手術が根本的に治療できる唯一の治療方法である。

【0230】

そこで、患者の利便性の確保及び副作用なしにＰＢＳ及びＰＳＣを治療することができる薬物の開発が依然として求められている。

【0231】

本発明の組成物は、（ａ）肝炎スコア（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）の減少；（ｂ）ヒドロキシプロリン含量減少の効果；及び／又は（ｃ）肝臓組織内の中性脂肪含量の減少を示し、肝臓疾患を予防又は治療することができるが、これに制限されるものではない。

【0232】

本発明の組成物は、単純脂肪症、肝炎及び肝線維症に対して予防、改善、又は治療効果を有するグルカゴン誘導体又はその結合体を含むことにより、肝臓疾患の予防又は治療に使用することができる。本発明の組成物は、本発明によるペプチドの投与により改善又は治療できる、上述の肝臓疾患を有する個体に投与され、肝臓疾患の予防又は治療効果を示すことができる。また、本発明の組成物が投与される個体は非アルコール性脂肪肝炎を有するか、これによる肝臓疾患を有する個体であってもよいが、これに制限されない。本発明において用語「予防」とは、前記グルカゴン誘導体、これを含む結合体、又は組成物の投与により目的とする疾患、例えば、肝臓疾患の発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記グルカゴン誘導体、これを含む結合体、又は組成物の投与により目的とする疾患、例えば、肝臓疾患の症状が好転又は有益になる全ての行為を意味する。

【0233】

本発明において用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は特にこれに制限されないが、前記組成物が生体内の標的に到達できる任意の一般的な経路を通じて投与でき、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。

【0234】

本発明によるグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに比べて変化したｐＩを有し、持続型結合体の形態において中性ｐＨで改善された溶解度及び高安定性を示すことができ、またグルカゴン受容体に対して活性を示すことができるため、肝臓疾患をはじめとする目的とする疾患の予防又は治療に有用に使用できる。

【0235】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含み得る。本発明における用語「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を引き起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時用いられる薬物など、医学分野によく知られている要素に応じて当業者により容易に決定され得る。

【0236】

本発明のペプチド又はその結合体を含む薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。前記賦形剤は、特にこれに制限されないが、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。

【0237】

本発明の組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容可能な賦形剤と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

【0238】

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート又は鉱物油などが用いられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含み得る。

【0239】

また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。

【0240】

また、前記組成物は、薬学的分野において通常の方法により患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的には、ペプチド医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化させて当業界において通常に用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む非経口投与経路により投与されてもよいが、これらに限定されるものではない。

【0241】

また、前記ペプチド又は結合体は、生理食塩水又は有機溶媒のように薬剤として許容された種々の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して用いられ、安定性や吸収性を増加させるために、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）又はグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート剤、低分子タンパク質又は他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）などが薬剤として用いられる。

【0242】

本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度等の種々の関連因子と共に、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。具体的には、本発明の組成物は、前記ペプチド又はこれを含む持続型結合体を薬学的有効量として含むものであってもよいが、これに制限されない。

【0243】

前記ペプチド又は持続型結合体を薬学的有効量として含むことは、ペプチド又は持続型結合体による目的とする薬理活性（例えば、肝臓疾患の予防、改善又は治療）を得ることができる程度を意味し、また、投与される個体において毒性又は副作用が起きなかったり、微々たる水準で薬学的に許容される水準を意味することができるが、これに限定されない。このような薬学的有効量は、投与回数、患者、剤形などを総合的に考慮して決定することができる。

【0244】

特にこれに制限されないが、本発明の前記薬学的組成物は、前記成分（有効成分）を０．０１～９９％重量対体積で含有することができる。

【0245】

本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明のペプチド又は結合体の好ましい全体用量は、１日に患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ～５００ｍｇであってもよい。しかし、前記ペプチド又は結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食物及び排泄率等、多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定し得る。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。

【0246】

本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れ、他の薬剤に比べて低い投与回数及び頻度を示すことができるが、特にこれに制限されるものではない。

【0247】

本発明を具現するもう一つの態様は、配列番号２０、２２、３３、３７、及び３８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド又はその結合体を含む肝臓疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0248】

前記肝臓疾患は、単純脂肪症（ｓｔａｔｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝炎（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ）、肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝不全（ｌｉｖｅｒ ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、又は胆汁うっ滞性肝臓疾患（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）であってもよく、前記胆汁うっ滞性肝臓疾患は、原発性胆汁性硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、又は原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）であってもよいが、これに限定されない。また、前記肝臓疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）によるものであるか、又は伴うものであってもよいが、これに限定されない。

【0249】

ペプチド、結合体、肝臓疾患、予防、治療、薬学的組成物は、前記の通りである。

【0250】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記ペプチド、これを含む結合体、又はこれを含む組成物を個体に投与する段階を含む肝臓疾患を予防又は治療する方法を提供する。

【0251】

前記ペプチド、これを含む結合体、これを含む組成物、肝臓疾患、予防、及び治療については、前述の通りである。

【0252】

本発明において前記個体は肝臓疾患が疑われる個体であり、前記肝臓疾患の疑いのある個体は、当該疾患が発病したり発病し得るヒトを含むマウス、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明のグルカゴン誘導体あるいはこれを含む前記組成物で治療可能な個体は制限なく含まれる。また、本発明のグルカゴン誘導体を含む薬学的組成物を肝臓疾患の疑いのある個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。肝臓疾患については、前記の通りである。

【0253】

具体的には、前記の肝臓疾患が疑われる個体は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）を有する個体であってもよく、又は前記非アルコール性脂肪肝炎により単純脂肪症、肝線維症、肝炎、肝不全、肝臓癌、胆汁うっ滞性肝臓疾患、原発性胆汁性硬変症、又は原発性硬化性胆管炎を発症する個体であってもよいが、これに制限されない。本発明の方法は、ペプチドを含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含むことができる。適した総１日使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとした具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食物、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられたり、同時用いられる薬物をはじめとした多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子に応じて異なって適用することが好ましい。

【0254】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記ペプチド又はこれを含む結合体、あるいは前記組成物を肝臓疾患に対する予防又は治療用薬剤（あるいは薬学的組成物）の製造に使用する用途を提供する。

【0255】

前記ペプチド、結合体、前記組成物、肝臓疾患については、前述の通りである。

【0256】

本発明を具現するもう一つの態様は、前記ペプチド又はこれを含む結合体又はこれを含む組成物の肝臓疾患の予防又は治療用途を提供する。

【0257】

前記ペプチド、結合体、前記組成物、肝臓疾患については、前述の通りである。

【0258】

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

【0259】

実施例１：グルカゴンに対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の生産
ヒトグルカゴン受容体遺伝子のｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ． ＵＳＡ）においてＯＲＦに該当する部分を鋳型とし、ＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位をそれぞれ含む下記配列番号４７及び４８の正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを行った。

【0260】

この時、ＰＣＲ反応は９５℃で６０秒の変性、５５℃で６０秒のアニーリング及び６８℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。これから増幅されたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、４５０ｂｐサイズのバンドを溶離して得た。

【0261】

正方向プライマー（配列番号：４７）：
５’－ＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣ－３’
逆方向プライマー（配列番号：４８）：
５’－ＣＴＡＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣ－３’

【0262】

前記ＰＣＲ産物を公知となった動物細胞発現ベクターであるｘｏＧｃ／ｄｈｆｒにクローニングして組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを製造した。

【0263】

前記製造した組換えベクターｘＯＧＣ／ＧＣＧＲを１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞にリポフェクタミンを用いて形質転換し、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８及び１０ｎＭメトトレキサートを含む選別培地で選別培養した。これから制限希釈法で単一クローン細胞株を選別し、このうちからグルカゴンに対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選別した。

【0264】

実施例２：グルカゴン誘導体の合成
改善された物性を有するグルカゴン誘導体を開発するために、配列番号：１の天然グルカゴンのアミノ酸配列を負電荷及び正電荷を帯びたアミノ酸残基で置換して下記表１のようなグルカゴン誘導体を合成した。これに記載された相対的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、下記実施例４に記述された方法で測定した。

【0265】

【表1】

【0266】

前記表１に記載された配列においてＸと表記されたアミノ酸は非天然型アミノ酸であるアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を、アミノ酸記号の下線は、下線を引いた当該アミノ酸対の側鎖の間でラクタム環の形成を、そして「－」は当該位置にはアミノ酸残基がないことを示す。また、環形成如何に対する列において「－」は当該配列には環が形成されていないことを示す。

【0267】

実施例３：グルカゴン誘導体のｐＩ測定
前記実施例２で合成されたグルカゴン誘導体の改善された物性を確認するためにＥｘＰＡＳｙサーバでｐＩ／Ｍｗツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３）を用いてアミノ酸配列からｐＩを推算した。

【0268】

前記表１に示された通り、配列番号：１の天然グルカゴンが６．８のｐＩを有する一方、本発明による一部のグルカゴン誘導体は約４～６の範囲のｐＩを有した。このようなグルカゴン誘導体は、天然グルカゴンに比べて低いか、又は高いｐＩを有するため、中性ｐＨなどで天然型グルカゴンに比べて改善された溶解度及び高い安定性を示すことができる。

【0269】

実施例４：グルカゴン誘導体のＣＡＭＰ活性の測定
実施例１で生産されたヒトグルカゴン受容体を有する細胞株において実施例２で合成されたグルカゴン誘導体の活性を測定した。具体的には、前記形質転換細胞株を１週間に３回又は４回継代培養した後、３８４ウェルプレートに各ウェル当たり６×１０³個の継代培養された細胞株を分注して２４時間培養した。前記培養された細胞に０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、５ｍｍ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液に天然型グルカゴンは２００ｎＭで、グルカゴン誘導体は１６００ｎＭでそれぞれ懸濁させた後、４倍ずつ１０回連続的に希釈し、これをＣＡＭＰアッセイキット（ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ３８４ ｋｉｔ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に適用して前記細胞に添加した後、蛍光値を測定した。測定後に最高の蛍光値を１００％に選定した後、これからグルカゴン誘導体のＥＣ₅₀値を算出した後、天然型グルカゴンと相互比較した。その結果を前記表１に示した。

【0270】

実施例５：グルカゴン誘導体の持続型結合体の製造
前記グルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体は、次のような方法で製造された。

【0271】

両末端の水素がそれぞれ３－（３－マレイミドプロピオンアミド）プロピル基及び３－オキソプロピル基（プロピオンアルデヒド基）で置換された分子量１０ｋＤａの線形改質ポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（日本ＮＯＦ社）を前述のグルカゴン誘導体ペプチド中のシステインを有する誘導体に反応させ、このグルカゴン誘導体ペプチドのシステイン残基をマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドの末端にペギル化させた。具体的には、配列番号３７のグルカゴン誘導体ペプチドとマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～５、タンパク質の濃度を３～１０ｍｇ／ｍｌにして低温で１～３時間反応させた。この時、反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％イソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液をＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用してシステインにモノペギル化されたグルカゴン誘導体を精製した。

【0272】

免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ－末端にＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ配列（配列番号５９）のヒンジ領域を有する免疫グロブリンＦｃ領域（４９．８ｋＤａ、配列番号６９の二鎖がジスルフィド結合で連結されたホモ二量体）を使用して国際公開特許ＷＯ２００７／０２１１２９に記載された方法で製造した。

【0273】

次に、前記精製されたモノフェペギル化されたグルカゴン誘導体ペプチドと免疫グロブリンＦｃ切片をモル比が１：２～１０、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍＬとして４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応液は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である１０～５０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムと１０～２０％のイソプロパノールが添加された環境下で行われた。反応終了後、前記反応液をＢｕｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に適用し、前記モノペギル化グルカゴン誘導体ペプチドのアルデヒド側のポリエチレングリコール末端が免疫グロブリンＦｃホモ二量体の二鎖中、一鎖のＮ末端プロリン窒素に連結されたグルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体を精製した。

【0274】

製造後に逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで分析した純度は９５％以上であった。

【0275】

ここで、グルカゴン誘導体ペプチド及び免疫グロブリンＦｃ切片がＰＥＧを通じて連結された結合体を、「グルカゴン誘導体の持続型結合体」と命名した。

【0276】

実施例６：グルカゴン誘導体の持続型結合体の肝炎改善効果
前記実施例５で製造された持続型結合体の肝炎改善効能を確認するために、ＡＭＬＮ（アミリン）／ＴＡＡ（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）マウスモデルを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０週間ＡＭＬＮ食餌摂取及びＴＡＡ投与（５０～４００ｍｇ／ｋｇ、ＴＩＷ－週３回）を行い、モデルを誘導した。

【0277】

誘導されたＡＭＬＮ／ＴＡＡマウスモデルは、賦形剤対照群、持続型結合体（１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ）投与群に分け、４週間皮下に繰り返し投与を行った。陰性対照群としては、ＡＭＬＮ食餌のみを摂取したマウスを使用した。４週間繰り返し投与した後、解剖を通じて取得した各マウスの肝組織にＨ＆Ｅ染色を行った後、肝炎スコア（ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）を測定した。

【0278】

その結果、図１のように持続型結合体を４週間繰り返し投与した結果、ＡＭＬＮ／ＴＡＡ賦形剤対照群に比べて持続型結合体投与群で肝炎スコアが有意に減少したことを確認した（＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＡＭＬＮ／ＴＡＡ賦形剤対照群 ｂｙ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。このような肝炎スコアの減少を通じて、グルカゴン誘導体の持続型結合体が肝炎改善効果を有することを確認した。

【0279】

実施例７：グルカゴン誘導体の持続型結合体の肝線維化改善効果
前記実施例５で製造された持続型結合体の線維症改善効能を確認するために、実施例６と同一のＡＭＬＮ（アミリン）／ＴＡＡ（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）マウスモデルを使用した。誘導されたＡＭＬＮ／ＴＡＡマウスモデルを賦形剤対照群、持続型結合体（１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ）投与群に分け、４週間皮下に繰り返し投与を行った。陰性対照群としてはＡＭＬＮ食餌のみを摂取したマウスを使用した。４週間繰り返し投与した後、解剖を通じて取得した各マウスの肝組織で浸潤性線維症マーカーであるヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）含量を測定した。

【0280】

その結果、図２に示すように、ＡＭＬＮ／ＴＡＡ賦形剤対照群において、肝組織内のヒドロキシプロリン含有量が増加した一方、持続型結合体投与群においては、持続型結合体投与により有意に肝組織内のヒドロキシプロリン含有量が減少したことを確認した（＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＡＭＬＮ／ＴＡＡ賦形剤対照群 ｂｙ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。このような浸潤性線維症指標の改善を通じて、グルカゴン誘導体の持続型結合体が肝線維化に対する改善効果を有することを確認した。

【0281】

実施例８：グルカゴンの持続型結合体の単純脂肪症改善効果
前記実施例５で製造されたグルカゴン誘導体の持続型結合体の単純脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）改善効力を確認するために、高脂肪食餌誘導を通じて非アルコール性脂肪肝を誘発した動物モデルであるＡＭＬＮマウスを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて２９週間ＡＭＬＮ（４０ｋｃａｌ－％ ｆａｔ、２２％ ｆｒｕｃｔｏｓｅ、１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ、２％ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）食餌摂取を行い、非アルコール性脂肪肝を誘導し、試験は、正常食餌を摂取した正常マウス、ＡＭＬＮ食餌に誘導された非アルコール性脂肪肝疾患マウス（賦形剤対照群）、グルカゴン誘導体の持続型結合体投与群（２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ）に分け、当該物質を１２週間皮下に繰り返し投与した。繰り返し投与した後、解剖を通じて各マウスの肝臓組織を取得した後、肝臓内の中性脂肪数値を通じてグルカゴン誘導体の持続型結合体の単純脂肪症改善の程度を評価した。

【0282】

図３は、各群において肝臓１ｇ当たりの中性脂肪の数値を評価した結果を示している。グルカゴン誘導体の持続型結合体を１２週間繰り返し投与した結果、肝臓組織内の中性脂肪の数値が賦形剤対照群と比較した時、有意に減少したことが確認できた（正常食餌摂取群＝肝臓１ｇ当たり１５．０ｍｇの中性脂肪、ＡＭＬＮ食餌対照群＝肝臓１ｇ当たり１３９．０ｍｇ、ＡＭＬＮ食餌グルカゴン誘導体の持続型結合体２．０ｎｍｏｌ／ｋｇ＝肝臓１ｇ当たり２５．０ｍｇの中性脂肪）。

【0283】

統計処理は、一元ＡＮＯＶＡを使用し、賦形剤対照群と比較してグルカゴン誘導体の持続型結合体の効能を評価した。（＊ｐ＜０．０５， ＊＊ｐ＜０．０１， ａｎｄ ＊＊＊ｐ＜０．００１）

【0284】

このような結果は、本発明のグルカゴン誘導体の持続型結合体の投薬時、単純脂肪症、肝炎及び肝線維化の効果的な改善が期待できるだけでなく、このような単純脂肪症、肝炎及び肝線維化により誘発されるその他の肝臓疾患に対する追加的な改善を示すことができることを示唆する。

【0285】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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【国際調査報告】