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特表2023-534968遺伝的に多様なＨＩＶ－１単離株に対するＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ガイドＲＮＡの効率及び特異性のための方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-15
(54)【発明の名称】遺伝的に多様なＨＩＶ－１単離株に対するＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ガイドＲＮＡの効率及び特異性のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230807BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230807BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230807BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230807BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230807BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230807BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230807BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230807BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230807BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230807BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C12N15/867 Z
A61K31/7105
A61K48/00
A61K35/76
A61P31/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023503084
(86)(22)【出願日】2021-07-13
(85)【翻訳文提出日】2023-03-07
(86)【国際出願番号】 US2021041385
(87)【国際公開番号】W WO2022015702
(87)【国際公開日】2022-01-20
(31)【優先権主張番号】63/051,212
(32)【優先日】2020-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523015714
【氏名又は名称】ハウエル アレクサンドラ エル
(71)【出願人】
【識別番号】523015725
【氏名又は名称】エスターハス スーザン ケイ
(71)【出願人】
【識別番号】523015736
【氏名又は名称】ヘイデン マシュー エス
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ハウエル アレクサンドラ エル
(72)【発明者】
【氏名】エスターハス スーザン ケイ
(72)【発明者】
【氏名】ヘイデン マシュー エス
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB33
(57)【要約】
ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（配列番号１）を含む５’ＬＴＲヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が開示される。ＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧ（配列番号２）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。ＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴ（配列番号３）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸配列であって、上記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、核酸配列が開示される。１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターであって、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、ベクターが開示される。細胞内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を阻害するため、又は細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する、方法が開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（配列番号１）を含む５’ＬＴＲヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）配列に特異的に結合する、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項2】
ＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧ（配列番号２）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合する、ｇＲＮＡ。
【請求項3】
ＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴ（配列番号３）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合する、ｇＲＮＡ。
【請求項4】
Ｃａｓタンパク質に結合する核酸配列を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項5】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸配列であって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、前記標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、核酸配列。
【請求項6】
ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項7】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、前記標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、ベクター。
【請求項8】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項10】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
前記ベクターが、ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項12】
細胞内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を阻害するための方法であって、細胞ゲノムを含み、前記細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は前記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及び
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、
それによって、前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する、方法。
【請求項13】
細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、細胞ゲノムを含み、前記細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は前記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及び
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、
それによって、前記細胞ゲノムから前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去する、方法。
【請求項14】
前記１つ以上のｇＲＮＡが、前記細胞ゲノムに結合しない、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記１つ以上のｇＲＮＡが、２つ以上のＨＩＶクレードのＬＴＲ領域を標的とすることができる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記１つ以上のｇＲＮＡが、２つ以上のＨＩＶクレードの前記ＬＴＲ領域内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列にハイブリダイズする、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が配列番号１であり、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸が、配列番号１の配列又はその相補体を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が配列番号２であり、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸が、配列番号２の配列又はその相補体を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が配列番号３であり、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸が、配列番号３の配列又はその相補体を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記１つ以上のガイドＲＮＡ及び前記ｃａｓタンパク質が、前記細胞内で複合体を形成し、前記複合体が、前記ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を切断し、それによって前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の前記機能又は存在を阻害する、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記複合体が、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲで前記ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を切断し、それによって前記標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の前記機能又は存在を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ｃａｓタンパク質がｃａｓ９である、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記ｃａｓタンパク質が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ｃａｓタンパク質が、核局在化配列を更に含む、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記核酸、及び前記ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、発現ベクターに含まれる、請求項１２～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
接触させることは、前記細胞を、前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記核酸及び前記ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含む１つ以上の発現ベクターと接触させることを含む、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記接触ステップが、インビトロで行われる、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
接触ステップが、インビボで行われる、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
キットであって、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記ガイドＲＮＡが標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、１つ以上のガイドＲＮＡ又は核酸と、
ｃａｓタンパク質、又は前記ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、を含む、キット。
【請求項31】
ベクターのセットであって、１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、前記標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、ベクターと、
ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、ベクターのセット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
真核細胞内のゲノムＤＮＡの標的切除のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含むＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の開発は、組み込まれたウイルス病原体の永続的な根絶のための潜在的なアプローチを提供した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子破壊は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとともに、約２０塩基対の標的ＤＮＡ配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を使用して、標的ＤＮＡ領域に結合し、次いで切断する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が二本鎖ＤＮＡを効率的に切断するためには、ガイドＲＮＡが結合する標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される「Ｎ－Ｇ－Ｇ」ヌクレオチド配列に対して５’に位置しなければならない。Ｃａｓ９によって切断されると、内因性細胞のＤＮＡ修復機構である、最も顕著な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が二本鎖切断（ＤＳＢ）に作用し、エラーが起こりやすい修復機構を介して、小さな置換、挿入、又は欠失（インデル）を導入することができる。大きな欠失又は反転も、２つ以上の二本鎖切断を導入することによって達成することができる。ウイルス病原体に対するガイドＲＮＡ配列の設計において、ガイドＲＮＡが正常な細胞遺伝子、特に細胞増殖、生存能及び代謝にとって重要な遺伝子に対する相補性を欠いていることを確認することが極めて重要である。ＣＲＩＳＰＲベースの治療薬は、ＨＩＶの場合のように宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、又はＢ型肝炎ウイルスの共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）のように染色体外体に存在するかのいずれかである、ウイルス遺伝子配列を標的とすることができる。抗ウイルスＣＲＩＳＰＲ治療戦略には、ウイルス感染に対する免疫若しくは耐性を改善するための宿主ゲノムの操作、又はウイルス遺伝子転写の干渉につながるウイルスゲノムの重要な成分の一部若しくは全てを切除するための組み込みウイルスの直接標的化が含まれる。ＨＩＶ－１の場合、複数の群がＨＩＶ－１耐性を高めるための戦略を模索しており、最も顕著なのは、ケモカイン共受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４をコードする遺伝子を破壊すること、及びＨＩＶ－１プロウイルスを不活性化又は欠失させるアプローチを使用することによるものである。
【0002】
優勢なＨＩＶ－１主要（Ｍ）群は、複数のクレードを含み、これは、長末端リピート（ＬＴＲ）、並びにｅｎｖ（エンベロープ）及びｇａｇ（群抗原）遺伝子を含むＨＩＶ－１ゲノムのいくつかの領域内の配列が異なる遺伝的サブタイプである。現在、１４個のＭ群クレード（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ、及びＫ）が存在し、９７個の循環組換え型（ＣＲＦ）が報告されている（ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ＣＲＦｓ／ＣＲＦｓ．ｈｔｍｌ）。個々のサブタイプは、異なる地理的領域内で優勢であり得、普遍的な臨床適用性を有するウイルス特異的なＣＲＩＳＰＲベースの治療法の設計を困難にしている。例えば、ＨＩＶ－１Aは東アフリカで一般的であり、ＨＩＶ－１Bはヨーロッパ及びアメリカで優勢な型である。アジアでは、ＨＩＶ－１Aがロシアで優勢であり、ＨＩＶ－１Cがインドで優勢であり、大陸全体、特に中国で多数のＣＲＦが見られる。したがって、臨床的治療遺伝子編集アプローチの開発を検討する場合、ゲノムの保存領域内の複数のクレードに対してガイドＲＮＡを試験することが重要である。
【発明の概要】
【0003】
本明細書に記載されるガイドＲＮＡのうちの１つ以上が開示される。
【0004】
ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（配列番号１）を含む５’ＬＴＲヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が開示される。
【0005】
ＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧ（配列番号２）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。
【0006】
ＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴ（配列番号３）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。
【0007】
本明細書に記載される核酸配列のうちの１つ以上が開示される。
【0008】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸配列であって、上記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、核酸配列が開示される。
【0009】
本明細書に記載されるベクターのうちの１つ以上が開示される。
【0010】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターであって、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、ベクターが開示される。
【0011】
細胞内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を阻害するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する、方法が開示される。
【0012】
細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、
１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去する、方法が開示される。
１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去する、方法が開示される。
【0013】
開示される方法及び組成物の更なる利点は、以下の説明の一部に記載され、部分的に該説明から理解されるか、又は開示される方法及び組成物の実践によって学習され得る。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって実現され、達成される。前述の概要及び以下の発明を実施するための形態の両方は、単に例示的及び説明的であり、特許請求される発明を限定するものではないことを理解されたい。
【0014】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法及び組成物のいくつかの実施形態を例示し、説明と一緒に、開示される方法及び組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】５’ＬＴＲ配列のＵ３領域の一例を示す。ガイドＲＮＡの４つの異なる標的領域の配列保存は、全てのクレードからの１２４２個の完全なＨＩＶ配列を利用して、ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖによるウェブ上でのアライメントによって得た。各標的領域のロゴは、特定の位置における各ヌクレオチドの確率を示す。ＰＡＭ配列はボックスで囲まれており、灰色のボックスは、アライメントが失われたが、下流に再確立される複数のクレードにおける配列挿入及び欠失の部位を示す。分析した１，２４２個のＨＩＶ－１配列からのコンセンサス配列（太字フォントで示される）を、図２で用いられるプラスミド中のＬＴＲの供給源であるＮＬ４－３の配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ３２４４９３．２）と整列させた。４つのガイドの標的領域には下線が引かれ、ＰＡＭ配列は赤いフォントである。括弧内の数字は、ＨＩＶ－１ ＨＢＸ２配列を参照した座標である。
【図2A-2B】インビトロ切断アッセイで使用した２つのプラスミドのマップを示す。（図２Ａ）緑色蛍光タンパク質遺伝子（緑色のｅＧＦＰ）に隣接する５′及び３′ＬＴＲ（ＮＬ４－３由来のＨＩＶ－１ ＬＴＲ、青色の矢印として示される）を用いたプラスミドｐＮＬ－ＧＦＰの概略図。プラスミドを３つの断片に切断するＸｍｎ Ｉ及びＫｐｎ Ｉの制限酵素部位が記され、予想される断片サイズが示される。ＬＴＲガイドの標的部位は、ＰＡＭに最も近いヌクレオチドを表す数値によって記される。（図２Ｂ）プラスミドｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲ－ｌｕｃ－Ｂの概略図。このプラスミドは、青い矢印として示される、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）に由来するＬＡＩ ＨＩＶ－１の３’ＬＴＲを含有する。このプラスミドを各クレードの骨格として使用し、３’ＬＴＲを適切に対応するように置き換える。プラスミドを２つの断片に切断するＸｍｎ Ｉ及びＥｃｏＲＩの制限酵素部位、並びにＬＴＲｇ ＲＮＡ １２７及びｇＲＮＡ ３６３の標的部位が記される。
【図3A-3B】単一又は二重ＬＴＲガイドＲＮＡで切断された断片化ｐＮＬ－ＧＦＰのインビトロ分析が示される。左パネル：５’及び３’ＬＴＲに誘導された（図Ａ）単一ＬＴＲガイド又は（図Ｂ）二重ＬＴＲガイドによって切断された断片化ｐＮＬ－ＧＦＰのゲル画像。右パネル：試験した各ガイドの切断効率を、５’及び３’ＬＴＲについて独立して決定した。データは、３つの実験からの平均±ＳＥＭであり、対応のない両側Ｔ検定を用いて分析される；＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。結果は、５’及び３’ＬＴＲで１つのＬＴＲガイド（右パネル、図３Ａ）及び２つのＬＴＲガイド（右パネル、図３Ｂ）によって切断されたｐＮＬ－ＧＦＰの切断を示す。
【図4A-4D】複数のＨＩＶ－１クレードからの３’ＬＴＲの個々のｇＲＮＡによる切断を示す。（Ａ）ｐＢｌｕｅ ３’ＬＴＲ－ｌｕｃ－Ａ～Ｇからの３’ＬＴＲのｇＲＮＡ １２７（図４Ａ、上部パネル）及びｇＲＮＡ ３６３（図４Ａ、下部パネル）切断のゲル画像。（図４Ｂ）ｇＲＮＡ １２７（図４Ｂ、上パネル）又はｇＲＮＡ ３６３（図４Ｂ、下パネル）に対する各クレードの切断効率を定量した。データは、３つの実験からの平均±ＳＥＭであり、統計解析は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定された。全ての平均を互いに比較した。ガイド３６３で切断されたクレードについてのｐ値が表に見られる：＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。ｇＲＮＡ１２７で切断されたクレード間で顕著な差は見られなかった。（図４Ｃ）ＨＩＶ－１参照配列ＨＸＢ２（標的配列）に対するｇＲＮＡ１２７（上）及びｇＲＮＡ３６３（下）の標的配列間のＤＮＡ配列差（赤色で示される）。（図４Ｄ）切断周波数決定（ＣＦＤ）は、パッケージｐｉｃｋｌｅ、ｒｅ、及びｎｕｍｐｙを含むＰｙｔｈｏｎバージョン２．７を使用して計算された。元のコードは、Ｄｏｅｎｃｈらから得た。
【図5A-5D】１つ以上のＬＴＲガイドＲＮＡを有するＴＺＭ－ｂｌ細胞における５’ＬＴＲのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断を示す。遺伝子改変を、Ｔ７ＥＩアッセイを用いて分析した。（図５Ａ）ガイドＲＮＡ ３６３及び１２７によって、並びに組み合わせにおいて、増幅された５’ＬＴＲ及びＨＰＲＴ遺伝子への陽性遺伝子改変を示したＴ７Ｅ１アッセイによって得られたゲル画像の例。（図５Ｂ）Ｔ７Ｅ１消化後のＰＣＲ産物の予想される断片サイズ。（図５Ｃ）各ガイドＲＮＡ処理の遺伝子改変パーセントを、式：１００×（（１－（１－切断された断片））１／２）を用いて決定した。６つの実験からの平均データ±ＳＥＭ。（図５Ｄ）３連からのルシフェラーゼレポーターアッセイの平均データ±ＳＥＭ。統計解析は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、パネルＣ及びＤの両方について決定した。全ての平均を互いに比較した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【図6A】ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑを用いたオン及びオフターゲット切断事象の評価を示す。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞由来のＤＮＡと、組換えＳｐＣａｓ９、並びに転写ｓｇＲＮＡ ３６３（図６Ａ）及びｓｇＲＮＡ １２７（図６Ｂ）で形成されたＲＮＰとを用いて行った。得られた配列決定データの分析により、示されるリードカウント数を有する示される切断事象を同定した。（図６Ｃ）ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑによって同定された切断事象の注釈。タンパク質コード遺伝子のエクソン内では、オフターゲット事象は同定されなかった。示されるように、オフターゲット切断事象は、遺伝子間領域及びイントロン領域の両方内で生じた。
【図6B】同上
【図6C-1】同上
【図6C-2】同上
【図7A-7B】ＬＴＲ配列のアライメントを示す。（図７Ａ）ＨＸＢ２ ５’ＬＴＲ（参照配列）及びｐＮＬ－ＧＦＰ ５’ＬＴＲ配列のアライメント。（図７Ｂ）ＨＸＢ２ ５’ＬＴＲ（参照配列）及びｐＮＬ－ＧＦＰ ３’ＬＴＲ配列のアライメント。ガイド標的領域及びＰＡＭ領域は、それぞれ青色及び灰色のボックスで示される。ミスマッチは赤いフォントで示される。アライメントはＳｅｒｉａｌ Ｃｌｏｎｅｒ ２．６．１によって作製した。
【図8A-8B】ｐＮＬ－ＧＦＰのＨＩＶ－１ ３’ＬＴＲに対するＬＴＲガイド１２７の切断効率の決定を示す。（図８Ａ）緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）に隣接する５’及び３’ＬＴＲ（ＮＬ４－３由来のＨＩＶ－１ ＬＴＲ、青い矢印として示される）を用いたプラスミドｐＮＬ－ＧＦＰの概略図。プラスミドを切断する制限酵素（Ｘｍｎ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）が示され、予想される断片サイズ及びガイドの標的部位が示される。（図８Ｂ）断片化されたｐＮＬ－ＧＦＰが５’及び３’ＬＴＲでＬＴＲ ｇＲＮＡ１２７によって切断されることを示すアガロースゲル。３’ＬＴＲについて、ガイド１２７の切断効率を決定した。切断効率データを図３Ａに示す。
【図9A-9B】ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７の両方で切断されたＴＺＭ－ｂｌ細胞のＤＮＡからＩＣＥソフトウェアによって生成された出力を示す。改変ＨＩＶ－１の５’ＬＴＲを、Ｔ７Ｅ１アッセイの方法に記載されるようにＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｍｏｎａｒｃｈ核酸精製キット（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してクリーンアップし、逆方向プライマー（ＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧを使用して、Ｓｔｕｄｉｏ Ｓｅｑ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）上で配列決定した。ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３を用いた配列決定のために試料を調製した。１サイクルの配列決定を行い、ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）精製キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）を使用して製造業者のプロトコルに従ってクリーンアップした。分析のために、ＡｂファイルをＩＣＥソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ、Ｒｅｄｗｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に保管した。（図９Ａ）ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７の切断部位にまたがる、未処理（対照）及び標的（遺伝子編集）試料の追跡ファイルセグメント。ガイド配列には下線が引かれ、ＰＡＭ配列は赤い点線で示される。縦の破線は各ＲＮＰの切断部位を示す。（図９Ｂ）ｇＲＮＡ ３６３及び１２７によって標的化される試料内のＩＣＥによって計算されたインデル及びその相対有病率。
【図10】インビトロ切断効率に関するガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ領域との間のヌクレオチドミスマッチを示す。５’ＬＴＲ（５’）又は３’ＬＴＲ（３’）のいずれかに対する単一ｇＲＮＡを用いたインビトロ切断効率を、ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ配列との間の対応する数（番号）のミスマッチに対してプロットした。予想通り、ミスマッチの数が増加するにつれて、切断効率が低下した。
【図11】ＨＩＶ－１クレードにわたるガイドＲＮＡ標的領域の保存を示す。濾過したウェブアライメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）によって得られたクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧからの標的領域を、ｇＲＮＡ １２７、ｇＲＮＡ ３６３、ｇＲＮＡ ３６１、及びｇＲＮＡ ２７８と整列させた。各ガイドについて、各位置における所望のヌクレオチド出現パーセントが報告されている。クレード内の全ての単離株が特定の位置に関する欠損ヌクレオチド情報を含む場合、「ギャップ」という用語が注目される。ＰＡＭ領域は、ｇＲＮＡ １２７及びｇＲＮＡ ２７８の最初の３つのヌクレオチドである。ＰＡＭ領域は、ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ ３６１の最後の３つのヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
開示される方法及び組成物は、特定の実施形態の以下の詳細な説明及びその中に含まれる実施例、並びに図及びそれらの前後の説明を参照することにより、より容易に理解され得る。
【0017】
開示される方法及び組成物は、別途指定されない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されず、したがって、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0018】
開示される方法及び組成物のために使用され得る、併用され得る、調製に使用され得る、又は生成物である材料、組成物、及び成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々の及び集合的な組み合わせ及び順列に関する具体的な言及は明示的に開示されない場合があるが、それぞれが本明細書で具体的に企図され、記載されることを理解されたい。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラス、並びに分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラス、並びに組み合わせ分子の一例であるＡ－Ｄが開示される場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれが個別に及び集合的に企図される。したがって、この例では、Ａ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、及びＣ－Ｆの組み合わせのそれぞれが具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ、並びに組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されるとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に企図され、開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、及びＣ－Ｅのサブグループは、具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、並びに例示的な組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されるとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物の作製及び使用方法のステップを含むがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実行することができる様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示される方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実行することができ、そのような組み合わせは、具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることが理解される。
【0019】
Ａ．定義
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るため、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るため、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0020】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「核酸配列」への言及は、複数のそのような核酸配列を含み、「ガイドＲＮＡ」への言及は、当業者に既知の１つ以上のガイドＲＮＡ及びその等価物への言及である等である。
【0021】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、限定されないが、一本鎖、二本鎖、又は多本鎖の、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限は存在しない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離されてもよいか、又は当該技術分野で既知の方法によって化学的に合成されてもよい。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖（センス又はアンチセンス等）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【0022】
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び「ガイド」という用語は、互換的に使用される。一実施形態において、ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」は、野生型タンパク質（すなわち、自然界に存在するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。また、Ｃａｓタンパク質は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性変異体又は断片であり得る。
【0024】
本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」とは、ガイドＲＮＡ又は組成物が、その標的（例えば、ＨＩＶ－１のＬＴＲ）を認識し物理的に相互作用し、他の標的を顕著に認識し相互作用しないことを意味する。いくつかの態様において、全体を通して使用される「特異的に結合する」は、「選択的に結合する」又は「特異的に標的とする」と互換的に使用することができる。
【0025】
「治療する」とは、疾患の影響の悪化を予防若しくは遅延させるため、又は疾患の影響を部分的若しくは完全に逆転させるために、ＨＩＶに感染しているか、若しくはＡＩＤＳを発症する感受性が高い、又はＨＩＶに感染しているか、若しくはＡＩＤＳにかかっているヒト若しくは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）等の対象に、本発明の核酸配列、ベクター、又は組成物を投与することを意味する。
【0026】
「予防する」とは、対象がＨＩＶに感染する又はＡＩＤＳを発症する高い感受性を有する可能性を最小限に抑えることを意味する。
【0027】
本明細書で使用される場合、「投与すること」及び「投与」という用語は、開示されるポリペプチド、核酸配列、ベクター、組成物、又は医薬調製物を対象に提供する任意の方法を指す。そのような方法は、当業者に周知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、及び非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与等の注射剤を含む）を含むが、これらに限定されない。投与は、連続的又は間欠的であり得る。様々な態様において、調製物は、治療的に投与することができる、すなわち、既存の疾患又は状態を治療するために投与される。更なる様々な態様において、調製物は、予防的に投与され得る、すなわち、疾患又は状態の予防のために投与される。ある態様において、当業者は、対象を治療するため又はアポトーシスを誘発するために、開示される組成物又は開示されるコンジュゲートの有効な用量、有効なスケジュール、又は有効な投与経路を決定することができる。ある態様において、当業者は、開示されるポリペプチド、核酸配列、ベクター、組成物、又は医薬製剤の有効性を向上させるために、投与ステップの態様を変更又は改変することもできる。
【0028】
本明細書で提供される核酸配列、ベクター、又は組成物の「有効量」とは、所望の効果をもたらすのに十分な量の核酸配列、ベクター、又は組成物を意味する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態、治療されている疾患（又は根底にある遺伝的欠陥）の重症度、使用される特定の組成物、その投与様式等に応じて、対象ごとに異なるであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することは不可能である。しかしながら、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者によって決定され得る。「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／又は状態（例えば、ＡＩＤＳ）に罹患している若しくは感受性のある対象に投与されたときに、ＡＩＤＳ疾患、障害、及び／又は状態を治療する、緩和する、回復させる、症状を軽減する、予防する、発症を遅延させる、進行を阻害する、重症度を低減する、かつ／又は発生率を減少させるのに十分である治療薬、予防薬、及び／又は診断薬の量を意味する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、開示される方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類であり得る。「対象」という用語はまた、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌ等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエ等）を含む。一態様において、対象は、哺乳類である。別の態様において、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、成人、小児、青年及び新生児、並びに胎児（男性又は女性にかかわらず）が包含されることが意図される。
【0030】
「ハイブリダイズ可能な」又は「ハイブリダイズする」又は「相補的」又は「実質的に相補的」とは、核酸（例えばＲＮＡ）が、適切な温度及び溶液イオン強度のインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的な、アンチパラレルな様式で別の核酸に非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する、「アニールする」又は「ハイブリダイズする」ことを可能にするヌクレオチドの配列を含む（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対は、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）との対合、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）との対合、及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との対合［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）がウラシル（Ｕ）と塩基対合することも、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対は、ｍＲＮＡ中のコドンとｔＲＮＡアンチコドンとの塩基対合に関連して、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）に部分的に関与する。本開示に関連して、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に対して相補的であると考えられ、逆もまた同様である。したがって、主題のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対が作製され得る場合、その位置は非相補的であるとはみなされず、代わりに相補的であるとみなされる。
【0031】
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその第１１章及び表１１．１；並びにＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【0032】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチは可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。短い相補性の区間（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、又は１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記、１１．７～１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドである。更に、当業者は、温度及び洗浄液の塩濃度が、相補領域の長さ及び相補性の程度等の要因に従って、必要に応じて調整され得ることを認識するであろう。
【0033】
ポリヌクレオチドの配列が、特異的にハイブリッド可能又はハイブリッド可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことは、当該技術分野で理解されている。更に、ポリヌクレオチドは、介在セグメント又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドは、標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドのうち１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス核酸は、９０パーセントの相補性を表す。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか、又は相補的ヌクレオチドとともに散在してもよく、互いに又は相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。核酸内の核酸配列の特定の区間の間の相補性パーセントは、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を使用して、又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを用いるデフォルト設定を使用して、日常的に決定することができる。
【0034】
「任意選択的」又は「任意選択的に」とは、その後に記載される事象、状況、又は材料が発生又は存在してもしなくてもよく、その記載が、事象、状況、又は材料が発生又は存在する場合と、それが発生又は存在しない場合とを含むことを意味する。
【0035】
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表現される場合、文脈が具体的にそうではないと示さない限り、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までの範囲も具体的に企図され、開示されると考えられる。同様に、先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表現される場合、特定の値は、文脈が具体的にそうではないと示さない限り、開示されているとみなされるべきである別の具体的に企図される実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の終点は、文脈が具体的にそうではないと示さない限り、他の終点との関連において、及び他のエンドポイントとは独立して、顕著であることが更に理解されるであろう。最後に、文脈が具体的にそうではないと示さない限り、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値及び値の部分範囲の全てもまた具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることが理解されるべきである。上記は、特定の場合において、これらの実施形態の一部又は全てが明示的に開示されているかどうかにかかわらず、適用される。
【0036】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本方法及び組成物の実施又は試験に使用することができるが、特に有用な方法、デバイス、及び材料は、記載されている通りである。本明細書に引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。いかなる参考文献も先行技術を構成することを認めない。参考文献の議論は、著者が主張することを述べ、出願人は引用された文書の正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。いくつかの刊行物が本明細書で言及されているが、そのような言及は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することを認めるものではないことを明確に理解されたい。
【0037】
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語及び該単語の変形例、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加剤、成分、整数又はステップを除外することを意図するものではない。特に、１つ以上のステップ又は動作を含むと記載される方法では、各ステップが（そのステップが「からなる」等の限定用語を含む場合を除き）列挙されるものを含むことが具体的に企図され、各ステップが、例えば、該ステップに列挙されていない他の添加剤、成分、整数、又はステップを除外することを意図するものではないことを意味する。
【0038】
Ｂ．核酸配列
本明細書に開示されるのは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。開示されるｇＲＮＡ配列は、１つ以上の所望の標的配列に特異的であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は標的配列に特異的であり得、標的配列はＨＩＶ－１配列である。いくつかの態様において、ＨＩＶ－１配列はＨＩＶ－１のＬＴＲ配列であり得る。例えば、標的配列は、配列番号１、２、又は３のうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は、細胞のゲノム内の標的配列とハイブリダイズする。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞であり得る。
本明細書に開示されるのは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。開示されるｇＲＮＡ配列は、１つ以上の所望の標的配列に特異的であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は標的配列に特異的であり得、標的配列はＨＩＶ－１配列である。いくつかの態様において、ＨＩＶ－１配列はＨＩＶ－１のＬＴＲ配列であり得る。例えば、標的配列は、配列番号１、２、又は３のうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は、細胞のゲノム内の標的配列とハイブリダイズする。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞であり得る。
【0039】
ガイド配列又は単一ガイド配列（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するのに十分な標的配列（ポリヌクレオチド配列）との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの態様において、ガイド配列（例えば、ｇＲＮＡ）とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれより大きい。いくつかの態様において、ガイド配列は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のヌクレオチドの長さ又はその間の任意の数である。ｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡは、互換的に使用することができる。
【0040】
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、ガイド配列（例えば、ｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ）が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する限り、完全な相補性が必ずしも必要ではない。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド等の任意のポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置し得る。いくつかの態様において、標的配列は、真核細胞の小器官（例えば、ミトコンドリア）内に存在し得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列又はテンプレートは、「編集用テンプレート」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と称される。ある態様において、標的配列は、細胞増殖経路内の遺伝子をコードする核酸配列のうちの１つ以上から選択され得る。ある態様において、標的配列は、配列に関連する活性の阻害又は調節が対象にとって有益である任意の配列であり得る。例えば、本明細書に記載されるように、標的配列は、ＨＩＶ－１配列、特にＨＩＶ－１のＬＴＲ配列であり得る。いくつかの態様において、「標的配列」及び「目的の遺伝子」という用語は、互換的に使用され得る。いくつかの態様において、標的配列は、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列であり、この配列の阻害又は調節は、細胞中のＨＩＶ－１の機能又は存在の阻害をもたらす。
【0041】
ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（配列番号１）を含む５’ＬＴＲヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。
【0042】
ＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧ（配列番号２）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。
【0043】
ＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴ（配列番号３）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列に特異的に結合するｇＲＮＡが開示される。
【0044】
本明細書に記載される核酸配列のうちの１つ以上が開示される。
【0045】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸配列であって、上記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、核酸配列が開示される。
【0046】
いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸配列であって、上記１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、核酸配列が開示される。
【0047】
本明細書に開示されるのはｇＲＮＡであり、ｇＲＮＡは、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列は配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される。
【0048】
本明細書に開示されるのは、ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（配列番号１）を含む５’ＬＴＲヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）配列とハイブリダイズするｇＲＮＡである。
【0049】
本明細書に開示されるのは、ＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧ（配列番号２）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列とハイブリダイズするｇＲＮＡである。
【0050】
本明細書に開示されるのは、ＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴ（配列番号３）を含む５’ＬＴＲ ＨＩＶ－１配列とハイブリダイズするｇＲＮＡである。
【0051】
配列番号１、２又は３の配列を含む標的配列が開示される。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列は、真核細胞に内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチド配列であり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）をコードする配列であり得る。いくつかの態様において、標的配列は、細胞に感染したＨＩＶ－１等のウイルス由来の配列であり得る。標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列に関連付けられるべきであると考えられる。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに隣接する２～５塩基対配列（すなわち、標的配列）である。当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素とともに使用するための更なるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。ある態様において、ＰＡＭは、ＮＧＧ（式中、Ｎは、任意のヌクレオチド、（Ｇ）グアニン、（Ｇ）グアニンである）を含む。
【0052】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合する核酸配列を更に含むことができる。
【0053】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ配列、及びＣａｓタンパク質をコードする配列のうちの１つ以上を含む核酸配列が開示される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合し、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、標的核酸（例えば、標的配列）内の特定の位置に複合体を標的とする、核酸分子である。ある場合には、ｇＲＮＡがＲＮＡ塩基に加えてＤＮＡ塩基を含むように、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡを作製することができるが、「ｇＲＮＡ」という用語は依然として、本明細書でそのような分子を包含するために使用されることを理解されたい。
【0054】
本明細書に記載される場合、ｇＲＮＡは、標的化セグメント（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ））及びタンパク質結合セグメント（トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））の２つのセグメントを含むことができる。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）内の特異的配列（標的配列）に相補的である（したがって、それとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼと相互作用する（結合する）。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）、又はステムループを形成する、２つの相補的なヌクレオチドの区間を含む。標的核酸（例えば、ウイルスＤＮＡ）の部位特異的結合及び／又は切断は、ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのガイド配列）と標的核酸の標的配列との間の塩基対相補性によって決定される位置（例えば、標的遺伝子座の標的配列）で生じ得る。
【0055】
ｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。ｇＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の標的配列に相補的なヌクレオチド配列）を含む標的化セグメントを含むことによって、複合体に対する標的特異性を提供する。複合体のＣａｓエンドヌクレアーゼは、部位特異的活性（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって提供される切断活性）を提供する。換言すれば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡとの会合により、標的核酸配列（例えば、標的配列）に誘導される。
【0056】
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズした後に形成され得（例えば、それらは相補的セグメントを有する）、したがって、ｃｒＲＮＡの標的化配列が標的配列に結合することを可能にする一方で、ｔｒａｃｒＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、エンドヌクレアーゼをもたらし、次いで標的配列を切断することができる。
【0057】
ｇＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸中の配列（標的配列、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３）に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（すなわち、標的化配列）を含む。換言すれば、ｇＲＮＡの標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的な様式で、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）と相互作用することができる。ｇＲＮＡのガイド配列は、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）内で（例えば、ＰＡＭを考慮しながら、例えば、ｄｓＤＮＡ標的を標的とする場合に）任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように修飾（例えば、遺伝子工学によって）／設計することができる。
【0058】
一部の実施形態では、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは１００％である。
【0059】
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続したヌクレオチドにわたって、６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続したヌクレオチドにわたって、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続したヌクレオチドにわたって、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続したヌクレオチドにわたって１００％である。
【0060】
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９～２５個の連続したヌクレオチドにわたって、６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９～２５個の連続したヌクレオチドに対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９～２５個の連続したヌクレオチドに対して、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９～２５個の連続したヌクレオチドにわたって１００％である。
【0061】
ある場合には、ガイド配列は、１９～３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１９～２５、１９～２２、１９～２０、２０～３０、２０～２５、又は２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９～２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１９～２２、１９～２０、２０～２５、２０～２５、又は２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９以上のｎｔ（例えば、２０以上、２１以上、又は２２以上のｎｔ；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。
【0062】
Ｃ．ベクトル
本明細書に記載されるベクターのうちの１つ以上が開示される。例えば、ｇＲＮＡを含む核酸配列を含むベクターが開示される。
本明細書に記載されるベクターのうちの１つ以上が開示される。例えば、ｇＲＮＡを含む核酸配列を含むベクターが開示される。
【0063】
１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターであって、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１内の標的配列とハイブリダイズし、標的配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される、ベクターが開示される。
【0064】
ｇＲＮＡを含む核酸配列を含み、少なくとも１つのマーカー遺伝子を更に含むベクターが開示される。
【0065】
ｇＲＮＡを含む核酸配列と、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列とを含むベクターが開示される。
【0066】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターが開示される。
【0067】
いくつかの態様において、開示されるベクターは発現ベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターは、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターであり得る。いくつかの態様において、ベクターは、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかであってもよい。
【0068】
本明細書に開示されるベクターは、ウイルス若しくは非ウイルスベクター、又は任意のタイプの発現ベクターであり得る。発現ベクターは、遺伝子若しくは遺伝子断片を細胞（例えば、プラスミド）に送達するために、又は遺伝子若しくは遺伝子断片を送達するための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルス若しくはアデノウイルスの一部として使用される任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，（１９９３））。例えば、本明細書に開示されるのは、Ｃａｓタンパク質をコードすることができる核酸配列を含む発現ベクターである。いくつかの態様において、ベクターはまた、ｇＲＮＡを送達することができる。
【0069】
インビトロ又はインビボのいずれかで、ガイドＲＮＡ等の核酸を細胞に送達するために使用され得るいくつかの組成物及び方法が存在する。これらの方法及び組成物は、ウイルスベースの送達系及び非ウイルスベースの送達系の２つのクラスに大別することができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド等のいくつかの直接的な送達系によって、又は細胞若しくはカチオン性リポソーム等の担体中の遺伝物質の移動によって送達され得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、又はＤＮＡエレクトロポレーション及び直接拡散等の物理的機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）、及びＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって記載されている。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。ある特定の場合では、方法は、大分子ＤＮＡで特異的に機能するよう改変されるであろう。更に、これらの方法を使用して、担体の標的化特性を使用することによって、ある特定の疾患及び細胞集団を標的とすることができる。
【0070】
発現ベクターは、遺伝子若しくは遺伝子断片を細胞（例えば、プラスミド）に送達するために、又は遺伝子若しくは遺伝子断片を送達するための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルス若しくはアデノウイルスの一部として使用される任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，（１９９３））。例えば、本明細書に開示されるのは、制御要素に作動可能に連結された開示される突然変異Ｃａｓ９タンパク質のうちの１つ以上をコードすることができる核酸配列を含む発現ベクターである。
【0071】
発現ベクターに存在する「制御要素」は、ベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域）であり、これらは、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのような要素は、その強度及び特異性において異なり得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写及び翻訳要素が使用され得る。例えば、細菌系でクローニングする場合、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）又はｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーター等の誘導性プロモーターを使用してもよい。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子由来又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成する必要がある場合、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを、適切な選択マーカーとともに有利に使用してもよい。
【0072】
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサイトメガロウイルス等のウイルスのゲノムから、又は異種の哺乳動物プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター）から入手され得る。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として都合よく得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として都合よく得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。加えて、宿主細胞又は関連種由来のプロモーターも使用することができる。
【0073】
エンハンサーは一般に、転写開始部位から固定されていない距離で機能し、転写単位の５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、及びコード配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））内であり得る。これらは、通常、１０～３００ｂｐの長さで、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答要素を含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答要素も含有し得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列が現在知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、及びインスリン）、典型的には、一般的な発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００～２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマのエンハンサー、及びアデノウイルスのエンハンサーである。
【0074】
プロモーター又はエンハンサーは、光又はそれらの機能を誘発する特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリン及びデキサメタゾン等の試薬によって、調節することができる。また、ガンマ線照射等の照射への曝露、又はアルキル化の化学療法薬によって、ウイルスベクターの遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【0075】
任意選択的に、プロモーター又はエンハンサー領域は、本発明のポリヌクレオチドの発現を最大化するための構成的プロモーター又はエンハンサーとして機能することができる。ある特定の構築物において、プロモーター又はエンハンサー領域は、特定の時間に特定の種類の細胞でのみ発現する場合でも、全ての真核細胞の種類において活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、及びレトロウイルスベクターのＬＴＲである。
【0076】
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位が、ｍＲＮＡのようにプロセシング及び輸送される可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、十分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物に使用されることが好ましい。ある特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。
【0077】
発現ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子、及び緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。
【0078】
一部の実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであってもよい。哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、及びピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に移行されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合、生存することができる。選択的レジームには、広く使用される２つの異なるカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充培地とは無関係に増殖する能力を欠いた変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチン等の栄養素を添加せずに成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある特定の遺伝子を欠いているため、欠損したヌクレオチドが補充培地に提供されない限り、生存することはできない。培地を補充する代替手段は、それぞれの遺伝子を欠く細胞に、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を導入することで、それらの成長要件を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することができないであろう。
【0079】
第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択で生き残るであろう。そのような優勢選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、又はハイグロマイシン、（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を使用する。３つの実施例は、真核生物の制御下の細菌遺伝子を用いて、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシン、への耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピュラマイシンが含まれる。
【0080】
本明細書で使用される場合、プラスミド又はウイルスベクターは、ガイドＲＮＡ等の開示される核酸を分解することなく細胞内に輸送する物質であり、それが送達される細胞で遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、ウイルス又はレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む）である。また、これらのウイルスをベクターとしての使用に好適にするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスとしては、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、及びＭＭＬＶのベクターとしての望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード、すなわち、導入遺伝子又はマーカー遺伝子を運ぶことができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかしながら、それらは非増殖細胞においてはそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、操作が容易であり、力価が高く、エアロゾル製剤で送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、これらは熱安定性であり、室温で貯蔵することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される、宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０のコード領域を有する。
【0081】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入する化学的又は物理的方法よりも高いトランザクション能力（すなわち、遺伝子を導入する能力）を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的な初期遺伝子、構造的な後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びカプシド形成に必要な逆向き末端リピート、並びにウイルスゲノムの転写及び複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは典型的には、初期遺伝子のうちの１つ以上が除去され、遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入される。このタイプの構築物は、最大約８ｋｂの外来遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように操作された細胞株によって供給される。
【0082】
レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）によって記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子治療にレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号及び第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０２８０６号及び第ＷＯ８９／０７１３６号、並びにＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３））に記載されており、その教示は、遺伝子治療にレトロウイルスベクターを使用する方法の教示に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0083】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴに詰め込まれたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを有し、これは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的にパッケージングされることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製のためのシス位での、及び複製されたウイルスのパッケージングのための、必要とされるいくつかの分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有する。標的細胞に導入されるのは、典型的には、外来ＤＮＡによって置き換えられたｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートに組み込むためのパッケージシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要な要素、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを誘導する末端リピート配列、ＤＮＡ合成の第２鎖の合成のためのプライミング部位として機能する３’ＬＴＲに対して５’側のプリンリッチ配列、及びＤＮＡ状態のレトロウイルスの宿主ゲノム内への挿入を可能にするＬＴＲの末端付近の特定の配列を含む。この量の核酸は、各転写物のサイズに応じて、１個～多数個の遺伝子を送達するのに十分である。インサート中に、他の遺伝子とともに陽性又は陰性のいずれかの選択可能マーカーを含めることが好ましい。
【0084】
レトロウイルスベクターにおけるほとんどの複製機構及びパッケージングタンパク質は除去されているため（ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）、ベクターは典型的には、それらをパッケージング細胞株に配置することによって生成される。パッケージング細胞株は、複製及びパッケージング機構を含むが、あらゆるパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスでトランスフェクト又は形質転換された細胞株である。選択したＤＮＡを担持するベクターがこれらの細胞株にトランスフェクトされると、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって、目的の遺伝子を含有するベクターが複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。機構のゲノムは、必要なシグナルを欠いているため、パッケージングされない。
【0085】
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３－１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２－２８８３（１９８６）；Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７－２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６－１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用することの利点は、これらは最初に感染した細胞内で複製することはできるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないため、それらが他の細胞型に広がり得る範囲が限られていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質及び他の多くの組織部位への直接的インビボ送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されており（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０－１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１－３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５－１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４－１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９－２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１－４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５－８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１－１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７－２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７－１２９１（１９９３）；及びＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１－５０７（１９９３））、その教示は、遺伝子治療にレトロウイルスベクターを使用する方法の教示に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することによって遺伝子導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型又は複製欠損アデノウイルスと同じ様式で、受容体媒介性エンドサイトーシスによって内在化される（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２－４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６－３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２－４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０－６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１５２８－１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１－６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：３０９－３１９（１９９３））。
【0086】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものとすることができ、これらのバイロン（ｖｉｒｏｎ）は、ヒト２９３細胞株等の細胞株において生成される。任意選択的に、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスゲノムから除去される。
【0087】
本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入するために使用することができる別の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠陥のあるパルボウイルスは、多くの細胞型に感染でき、ヒトに対して非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約４～５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは１９番染色体に安定に挿入することが知られている。この部位特異的な組み込み特性を含むベクトルが好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって製造されるＰ４．１ Ｃベクターであり、これは、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ－ｔｋ、又は、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子等のマーカー遺伝子を含有し得る。
【0088】
別の種類のＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子に作用可能に連結された細胞特異的発現を誘導するプロモーターを有する少なくとも１つのカセットに隣接する、一対の逆向き末端リピート（ＩＴＲ）を有する。この文脈において異種とは、ＡＡＶ又はＢ１９パルボウイルスに対して天然ではない任意のヌクレオチド配列又は遺伝子を指す。典型的には、ＡＡＶ及びＢ１９コード領域が欠失することにより、安全な細胞非毒性ベクターが得られる。ＡＡＶ ＩＴＲ、又はその改変は、感染性及び部位特異的組み込み能を付与するが、細胞毒性は付与せず、プロモーターは細胞特異的な発現を誘導する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する材料に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0089】
ウイルス及びレトロウイルスベクターに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助けるために、プロモーター又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素及び応答要素を含有し得る。
【0090】
他の有用な系としては、例えば、複製及び宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。更に、開示される核酸配列は、非核酸ベースの系で標的細胞に送達され得る。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって、又はリポフェクションによって、又はリン酸カルシウム沈殿によって送達することができる。選択される送達機構は、標的とされる細胞のタイプ、及び送達が、例えばインビボ又はインビトロで行われるかどうかに一部依存する。
【0091】
したがって、組成物は、開示される発現ベクターに加えて、リポソーム等の脂質、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール）又はアニオン性リポソームを含むことができる。リポソームは、所望される場合、特定の細胞の標的化を容易にするために、タンパク質を更に含むことができる。ペプチド及びカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、血液、標的器官に投与され得るか、又は気道の標的細胞まで気道内に吸入され得る。例えば、本明細書に記載されるペプチド又は核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む組成物は、対象の肺細胞に投与することができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５ １００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３ ７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。更に、化合物は、マクロファージ等の特定の細胞型を標的とすることができるか、又は化合物の拡散若しくはマイクロカプセルからの化合物の送達が、特定の速度若しくは投与量のために設計される、マイクロカプセルの成分として投与することができる。
【0092】
他の有用な系としては、例えば、複製及び宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。更に、開示される核酸配列は、非核酸ベースの系で標的細胞に送達され得る。例えば、開示される核酸配列及び構築物は、エレクトロポレーションによって、又はリポフェクションによって、又はリン酸カルシウム沈殿によって送達することができる。選択される送達機構は、標的とされる細胞のタイプ、及び送達が、例えばインビボ又はインビトロで行われるかどうかに一部依存する。
【0093】
したがって、組成物は、開示される発現ベクターに加えて、リポソーム等の脂質、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール）又はアニオン性リポソームを含むことができる。リポソームは、所望される場合、特定の細胞の標的化を容易にするために、タンパク質を更に含むことができる。ペプチド及びカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、血液、標的器官に投与され得るか、又は気道の標的細胞まで気道内に吸入され得る。例えば、本明細書に記載されるペプチド又は核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む組成物は、対象の肺細胞に投与することができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５－１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。更に、化合物は、マクロファージ等の特定の細胞型を標的とすることができるか、又は化合物の拡散若しくはマイクロカプセルからの化合物の送達が、特定の速度若しくは投与量のために設計される、マイクロカプセルの成分として投与することができる。
【0094】
インビトロ又はインビボのいずれかで、核酸を細胞に送達するために使用され得るいくつかの組成物及び方法が存在する。これらの方法及び組成物は、ウイルスベースの送達系と非ウイルスベースの送達系の２つのクラスに大別することができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド等のいくつかの直接的な送達系によって、又は細胞若しくはカチオン性リポソーム等の担体中の遺伝物質の移動によって送達され得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、又はＤＮＡエレクトロポレーション及び直接拡散等の物理的機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）、及びＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって記載されている。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。ある特定の場合では、方法は、大分子ＤＮＡで特異的に機能するよう改変されるであろう。更に、これらの方法を使用して、担体の標的化特性を使用することによって、ある特定の疾患及び細胞集団を標的とすることができる。
【0095】
Ｄ．組成物
本明細書に記載される標的配列、核酸配列（例えば、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡ配列をコードすることができる配列）、又はベクターを含む組成物が開示される。例えば、ベクターを含む組成物が開示され、ベクターは、本明細書に開示される核酸配列のうちのいずれかを含む。
本明細書に記載される標的配列、核酸配列（例えば、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡ配列をコードすることができる配列）、又はベクターを含む組成物が開示される。例えば、ベクターを含む組成物が開示され、ベクターは、本明細書に開示される核酸配列のうちのいずれかを含む。
【0096】
１．薬学的組成物
いくつかの態様において、開示される組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
いくつかの態様において、開示される組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
【0097】
例えば、本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される」とは、当業者に周知のように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために選択される材料又は担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝食塩水、又は多胞性リポソームが挙げられる。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチド又はＰＣ：ペプチドが、本発明における担体として使用され得る。他の好適な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、製剤を等張にするために、製剤中に適切な量の薬学的に許容される塩が使用される。薬学的に許容される担体の他の例としては、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５～約８、又は約７～約７．５であり得る。更なる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス等の持続放出製剤が挙げられ、マトリックスは、成形物の形態、例えば、フィルム、ステント（血管形成術の間に血管に移植される）、リポソーム又は微粒子である。ある特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましくてもよいことは、当業者には明らかであろう。これらは、最も典型的には、生理的ｐＨの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝液等の溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体である。
【0098】
薬学的組成物はまた、本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図される活性が損なわれない限り、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤等を含むことができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１つ以上の活性成分を（本発明の組成物に加えて）含んでもよい。本医薬組成物は、局所治療又は全身治療が所望されるかどうか、及び治療される領域に応じて、ある数の方法で投与され得る。
【0099】
２．組成物の送達
本明細書に記載される方法では、対象又は細胞への組成物の送達（又は投与）は、様々な機序を介して行うことができる。上記に定義されるように、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ又はベクターのうちの任意の１つ以上を使用して、薬学的に許容される担体等の担体を含むこともできる組成物を生成することができる。例えば、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が開示される。
本明細書に記載される方法では、対象又は細胞への組成物の送達（又は投与）は、様々な機序を介して行うことができる。上記に定義されるように、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ又はベクターのうちの任意の１つ以上を使用して、薬学的に許容される担体等の担体を含むこともできる組成物を生成することができる。例えば、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が開示される。
【0100】
非経口投与の調製物としては、滅菌された水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養素補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくもの等）等が挙げられる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等も存在し得る。
【0101】
光学投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体及び粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、又は油性の基剤、増粘剤等が必要であるか又は望ましくてもよい。
【0102】
経口投与のための組成物には、粉剤又は顆粒剤、水又は非水媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。組成物の一部は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸と、有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸との反応によって、又は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムと、有機塩基、例えば、モノ－、ジ－、トリアルキル及びアリールアミン及び置換エタノールアミンとの反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩として、潜在的に投与され得る。
【0103】
開示される送達技術は、開示された組成物だけでなく、開示される核酸構築物及びベクターにも使用することができる。
【0104】
Ｅ．方法
細胞における標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を改変、修飾、又は阻害するための方法が開示される。
細胞における標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を改変、修飾、又は阻害するための方法が開示される。
【0105】
細胞内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を阻害するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、本明細書に記載されるもののうちのいずれか１つ以上であり、それによって、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する、方法が開示される。
【0106】
細胞内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能を阻害するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する、方法が開示される。
【0107】
細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法が開示される。
【0108】
細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、本明細書に記載されるもののうちのいずれか１つ以上であり、それによって、細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去する、方法が開示される。
【0109】
細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、細胞ゲノムを含み、細胞ゲノムに組み込まれた標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を含むＨＩＶ－１ゲノムを保有する細胞を、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（ｃａｓ）タンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列と接触させることを含み、１つ以上のｇＲＮＡが、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって、細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去する、方法が開示される。
【0110】
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法が開示される。
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法であって、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を対象に投与することを含み、対象が、ゲノムに組み込まれたＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を有し、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、それによってゲノムからＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去することを含む、方法が開示される。
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法であって、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を対象に投与することを含み、対象が、ゲノムに組み込まれたＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を有し、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、それによってゲノムからＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去することを含む、方法が開示される。
【0111】
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法が開示される。
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法であって、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を対象に投与することを含み、対象が、ゲノムに組み込まれたＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を有し、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去することを含む、方法が開示される。
ＨＩＶ－１に感染した対象を治療するための方法であって、１つ以上のｇＲＮＡ、又は上記１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を対象に投与することを含み、対象が、ゲノムに組み込まれたＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を有し、１つ以上のｇＲＮＡが、ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列と独自にハイブリダイズし、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択され、それによって細胞ゲノムから標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を除去することを含む、方法が開示される。
【0112】
いくつかの態様において、１つ以上のｇＲＮＡは、細胞ゲノムに結合又はハイブリダイズしない。したがって、いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＨＩＶ－１配列、例えば、ＨＩＶ－１ ＬＴＲ配列のみに結合又はハイブリダイズする。
【0113】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、２つ以上のＨＩＶクレードのＬＴＲ領域を標的とすることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、２つ以上のＨＩＶクレードのＬＴＲ領域内の標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。例えば、ＨＩＶクレードは、既知のクレードのいずれかのうちの２つ以上であり得る。例えば、いくつかの態様において、ＨＩＶクレードＡ～Ｇは、開示されるｇＲＮＡによって標的とされ得る。したがって、本明細書に記載されるｇＲＮＡ及び標的配列を使用して２つ以上のＨＩＶ－１クレードを標的とする方法が開示される。
【0114】
いくつかの態様において、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列は、配列番号１であり、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１の配列又はその相補体を含む。
【0115】
いくつかの態様において、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列は、配列番号２であり、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２の配列又はその相補体を含む。
【0116】
いくつかの態様において、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列は、配列番号３であり、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸は、配列番号３の配列又はその相補体を含む。
【0117】
いくつかの態様において、１つ以上のガイドＲＮＡ及びｃａｓタンパク質が、細胞内で複合体を形成し、複合体が、ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列を切断し、それによって標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する。いくつかの態様において、複合体が、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲでＨＩＶ－ １ ＤＮＡ配列を切断し、それによって、標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する。５’及び３’ＬＴＲは、ＨＩＶ－１ゲノムのいずれかの末端のリピートであるため、ＬＴＲでＨＩＶ－１を切断することは、ＨＩＶ－１ゲノムの大部分を宿主配列から切断する結果となり得る。
【0118】
いくつかの態様において、方法は、対象に、ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を投与すること、ｃａｓタンパク質を投与すること、又はｃａｓタンパク質をコードするベクターを投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、細胞を、ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードするベクターと接触させることを含む。いくつかの態様において、ｃａｓタンパク質は、ｃａｓ９であり得る。いくつかの態様において、開示されるｃａｓタンパク質のいずれかを、開示される方法に使用することができる。いくつかの態様において、ｃａｓタンパク質は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、ｃａｓタンパク質は、核局在化配列を更に含む。
【0119】
いくつかの態様において、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸、及びｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現ベクターに含まれる。いくつかの態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。
【0120】
いくつかの態様において、接触させることは、細胞を、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸及びｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む１つ以上の発現ベクターと接触させることを含む。いくつかの態様において、接触ステップは、インビトロで行われる。いくつかの態様において、接触ステップは、インビボで行われる。したがって、発現ベクターと接触させるとき、いくつかの態様において、細胞は培養物中又は対象中に存在し得る。
【0121】
いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡが開示される方法に使用され得る。第１のｇＲＮＡは、ウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的であり得、第２のｇＲＮＡは、第２の標的配列に相補的であり得る。いくつかの態様において、ウイルスゲノムがリピート配列を有する場合、単一ｇＲＮＡは、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列に相補的であり得る。例えば、これは、本明細書に記載されるＨＩＶ－１等の、ウイルスゲノムの各末端（５’及び３’）に長末端リピート（ＬＴＲ）を有し、該ＬＴＲが、ウイルスゲノムの５’末端とウイルスゲノムの３’末端とで同じである、レトロウイルスで起こり得る。したがって、ｇＲＮＡは、ウイルスゲノムの５’末端及びウイルスゲノムの３’末端の両方に存在する単一の配列に相補的であり得る。例えば、第１の標的配列及び第２の標的配列は、ＬＴＲ内の単一の配列であり得る。第１の標的配列は、５’ＬＴＲに存在することができ、第２の標的配列は、３’ＬＴＲに存在することができる。
【0122】
いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、異なるベクター／構築物から発現される。したがって、いくつかの態様において、少なくとも２つの異なる構築物を使用することができる。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、同じ構築物から発現される。例えば、構築物は、核酸配列を含むことができ、核酸配列は、少なくとも２つの要素を含み、第１の要素は、Ｃａｓ９をコードする核酸配列を含み、第２の要素は、ｇＲＮＡを発現する核酸配列を含む。
【0123】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。また、Ｃａｓタンパク質は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性変異体又は断片であり得る。
【0124】
いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９。様々なＣａｓ９ガイドＲＮＡの例は、当該技術分野に見出され得、ある場合には、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに導入されたものと同様の変異体が、本開示のＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ ｇＲＮＡにも導入され得る。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ．２４；１１０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３１（９）：８３９－４３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ．２８；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８；Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ．３１；Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１９；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ；２３（１０）：１１６３－７１；Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１９５（３）：１１７７－８０；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒｉｌ；４１（７）：４３３６－４３；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１０（１０）：１０２８－３４；Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０；Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１８７；Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２３（１１）：１３２２－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１８８；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１）：２１８０－９６；Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１０（１０）：９５７－６３；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５１（１２）：８３５－４３；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１）：２２８１－３０８；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ．１２；１５４（６）：１３８０－９；Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ．９；３（１２）：２２３３－８；Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ．２４；１１０（３９）：１５５１４－５；Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ．９；Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ．１２；１５４（６）：１３７０－９；Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ．２３；５６（２）：３３３－９；並びに米国特許及び特許出願：米国特許第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４／００６８７９７号、第２０１４／０１７０７５３号、第２０１４／０１７９００６号、第２０１４／０１７９７７０号、第２０１４／０１８６８４３号、第２０１４／０１８６９１９号、第２０１４／０１８６９５８号、第２０１４／０１８９８９６号、第２０１４／０２２７７８７号、第２０１４／０２３４９７２号、第２０１４／０２４２６６４号、第２０１４／０２４２６９９号、第２０１４／０２４２７００号、第２０１４／０２４２７０２号、第２０１４／０２４８７０２号、第２０１４／０２５６０４６号、第２０１４／０２７３０３７号、第２０１４／０２７３２２６号、第２０１４／０２７３２３０号、第２０１４／０２７３２３１号、第２０１４／０２７３２３２号、第２０１４／０２７３２３３号、第２０１４／０２７３２３４号、第２０１４／０２７３２３５号、第２０１４／０２８７９３８号、第２０１４／０２９５５５６号、第２０１４／０２９５５５７号、第２０１４／０２９８５４７号、第２０１４／０３０４８５３号、第２０１４／０３０９４８７号、第２０１４／０３１０８２８号、第２０１４／０３１０８３０号、第２０１４／０３１５９８５号、第２０１４／０３３５０６３号、第２０１４／０３３５６２０号、第２０１４／０３４２４５６号、第２０１４／０３４２４５７号、第２０１４／０３４２４５８号、第２０１４／０３４９４００号、第２０１４／０３４９４０５号、第２０１４／０３５６８６７号、第２０１４／０３５６９５６号、第２０１４／０３５６９５８号、第２０１４／０３５６９５９号、第２０１４／０３５７５２３号、第２０１４／０３５７５３０号、第２０１４／０３６４３３３号、及び第２０１４／０３７７８６８号（これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0125】
いくつかの態様において、開示される方法は、ＣＲＩＳＰＲ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用する。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ系」及び「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」とも称される；例えば、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ）、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又は活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を指す。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ等の内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の関連においてプロトスペーサーとも称される）によって特徴づけられる。
【0126】
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは標的配列を標的としてハイブリダイズし、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをＤＮＡ遺伝子座に誘導する。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及びベクターは、１つ以上のｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及びベクターは、２、３、４個以上のｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び／又はベクターは、単一の系に４つのｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ配列を使用して、ＨＩＶ－１感染又は複製を調節することができる。
【0127】
本明細書に記載される組成物は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸を含むことができる。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はタンパク質である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はタンパク質は、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの配列と同一の配列を有することができる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はタンパク質は、例えば、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、若しくは他の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物を含む他の種の配列であり得る。いくつかの態様において、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの配列を修飾することができる。いくつかの態様において、核酸配列は、真核細胞における効率的な発現のためにコドンを最適化することができる。
【0128】
本明細書に開示されるのは、ＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）と称される、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ不活性型（ｄＣａｓ９）を利用するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９を使用して、１つ以上の標的配列（例えば、腫瘍壊死因子受容体（例えば、ＴＮＦＲ２）、インターロイキン１受容体（例えば、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ６Ｒ）、Ａキナーゼアンカータンパク質５（例えば、ＡＫＡＰ５、糖タンパク質（例えば、ｇｐ１３０）、及び一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１））の発現を抑制することができる。切断を誘発する代わりに、ｄＣａｓ９は、ＤＮＡ配列に緊密に結合したままであり、能動的に転写された遺伝子内で標的とされると、例えば、立体障害機構を介したｐｏｌ ＩＩ進行の阻害が、効率的な転写抑制につながる可能性がある。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９を使用して、１つ以上の標的配列（例えば、ＰＴＥＮ、ＭＹＣ）の発現を誘発することができる。
【0129】
いくつかの態様において、核が不活性化されたＣＲＩＳＰＲ系を使用することができる。更に、ＫＲＡＢ、ＶＰＲ又はｐ３００コアを結合することができる。いくつかの態様において、ＫＲＡＢは、細胞内の１つ以上の遺伝子を下方制御するために結合される。いくつかの態様において、ｐ３００コア又はＶＰＲは、細胞内の１つ以上の遺伝子を上方制御するために結合され得る。
【0130】
Ｆ．キット
上記の材料及び他の材料は、開示される方法を実行するのに有用であるか、又は実行を補助するのに有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージングすることができる。所与のキット内のキット構成要素が、開示される方法において一緒に使用されるように設計及び適合されると有用である。例えば、開示される核酸配列を含むベクターを生成するためのキットが開示される。
上記の材料及び他の材料は、開示される方法を実行するのに有用であるか、又は実行を補助するのに有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージングすることができる。所与のキット内のキット構成要素が、開示される方法において一緒に使用されるように設計及び適合されると有用である。例えば、開示される核酸配列を含むベクターを生成するためのキットが開示される。
【0131】
開示されるキットはまた、開示される核酸配列（例えば、ガイドＲＮＡ）のうちの１つ以上を含むことができる。
【0132】
１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸（ガイドＲＮＡは標的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする）と、ｃａｓタンパク質、又はｃａｓタンパク質をコードする核酸と、を含むキットが開示される。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡ又はｃａｓタンパク質は、本明細書に開示されるもののいずれかであり得る。
【実施例】
【0133】
１．序論
本明細書では、プロウイルスＬＴＲ領域を標的とするＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡのパネルのインビトロ及びインビボ切断有効性を比較し、ＨＩＶ－１の異なるクレードからＬＴＲ領域を切断するためのこのガイドパネルの広範な適用性を評価した。オンターゲット及びオフターゲットの両方の切断効率を定義するために、組み込まれたＨＩＶ－１プロウイルスを含有するゲノムＤＮＡを、特異的及びオフターゲットゲノム切断事象を定量及び同定する方法として、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ分析に供した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる遺伝子編集後のＤＮＡ切断を定量するためにバイオインフォマティクスを用いる、非常に感度の高いアプローチである。いくつかの単一ガイドＲＮＡを用いた高度な遺伝子切断は、ある場合には、２つのガイドを一緒に使用したときに増加した。更に、設計された特定のガイドは、複数のＨＩＶ－１クレードから５’ＨＩＶ－１ ＬＴＲ領域を切断することができた。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ分析により、予測されたオフターゲット事象が非常に少ないことが明らかになった。これらの知見は、遺伝的に異なるＨＩＶ－１源の間で広く保存された領域を特定し、非標的領域におけるオフターゲット事象の欠如を確認するために、遺伝的に異なる標的に対してガイドＲＮＡを試験することの重要性を強調している。最後に、ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ領域の位置に基づいて命名される研究室間でのガイドＲＮＡの命名を標準化するために、抗ＨＩＶ－１ガイド命名法が提案された。
本明細書では、プロウイルスＬＴＲ領域を標的とするＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡのパネルのインビトロ及びインビボ切断有効性を比較し、ＨＩＶ－１の異なるクレードからＬＴＲ領域を切断するためのこのガイドパネルの広範な適用性を評価した。オンターゲット及びオフターゲットの両方の切断効率を定義するために、組み込まれたＨＩＶ－１プロウイルスを含有するゲノムＤＮＡを、特異的及びオフターゲットゲノム切断事象を定量及び同定する方法として、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ分析に供した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる遺伝子編集後のＤＮＡ切断を定量するためにバイオインフォマティクスを用いる、非常に感度の高いアプローチである。いくつかの単一ガイドＲＮＡを用いた高度な遺伝子切断は、ある場合には、２つのガイドを一緒に使用したときに増加した。更に、設計された特定のガイドは、複数のＨＩＶ－１クレードから５’ＨＩＶ－１ ＬＴＲ領域を切断することができた。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ分析により、予測されたオフターゲット事象が非常に少ないことが明らかになった。これらの知見は、遺伝的に異なるＨＩＶ－１源の間で広く保存された領域を特定し、非標的領域におけるオフターゲット事象の欠如を確認するために、遺伝的に異なる標的に対してガイドＲＮＡを試験することの重要性を強調している。最後に、ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ領域の位置に基づいて命名される研究室間でのガイドＲＮＡの命名を標準化するために、抗ＨＩＶ－１ガイド命名法が提案された。
【0134】
２．材料及び方法
ｉ．ＨＩＶ－１プロウイルスに対するガイドＲＮＡ配列の同定
ＨＩＶ－１切除のためのｇＲＮＡ候補を開発するために、インシリコアプローチを用いて、ＳｐＣａｓ９標的として機能し得る領域を同定した。２つの方法を使用して、候補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列を同定した。第１の方法は、Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔソフトウェア（Ｔｅｘｔｃｏ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を使用してＣａｓ９ ＰＡＭ（ＮＧＧ）をスキャンし、次いで、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトからＢｌａｓｔを使用して、ヒトゲノムＤＮＡに対する意図しない相同性について、隣接する２０塩基対（ｂｐ）配列のそれぞれを試験することによって、ｐＮＬ４－３ ＨＩＶ ５’ＬＴＲ内の可能性のある標的領域を検索した。このプロセスを使用して、Ｕ３Ｂ ｇＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９－２７８+ HXB2）を同定し、続いてＧｉｂｓｏｎ法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ｃａｔａｌｏｇ 番号Ｅ２６１１Ｓ）により、ヒトＵ６プロモーター下にガイドＲＮＡ足場を含有するベクター（ｇＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ，Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ 番号４１８２４；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ ４１８２４）内にクローニングした。第２の方法は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のカスタムｇＲＮＡ設計リンクを使用してｇＲＮＡ標的配列を同定した。ＨＸＢ２ ５’ＬＴＲ領域の配列をＩＤＴ部位にアップロードし、この方法により、ＳｐＣａｓ９－１２７+ HXB2、ＳｐＣａｓ９－３６１- HXB2、及びＳｐＣａｓ９－３６３- HXB2として知られるｇＲＮＡを同定した。これらのｇＲＮＡの標的領域を図１及び図２に示す。Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用して、可能な数のオフターゲット事象を決定した（表１）。ＨＩＶ－１単離株間のこれらの標的領域の保存を、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からのウェブアライメントを使用して決定した。全てのクレードが、使用した１，２４２のＨＩＶ配列で表された（２０１７年に入手可能なデータ）。その特定の塩基対位置における各ヌクレオチドの確率のロゴによる図解表現を作製した（図１）。
ｉ．ＨＩＶ－１プロウイルスに対するガイドＲＮＡ配列の同定
ＨＩＶ－１切除のためのｇＲＮＡ候補を開発するために、インシリコアプローチを用いて、ＳｐＣａｓ９標的として機能し得る領域を同定した。２つの方法を使用して、候補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列を同定した。第１の方法は、Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔソフトウェア（Ｔｅｘｔｃｏ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を使用してＣａｓ９ ＰＡＭ（ＮＧＧ）をスキャンし、次いで、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトからＢｌａｓｔを使用して、ヒトゲノムＤＮＡに対する意図しない相同性について、隣接する２０塩基対（ｂｐ）配列のそれぞれを試験することによって、ｐＮＬ４－３ ＨＩＶ ５’ＬＴＲ内の可能性のある標的領域を検索した。このプロセスを使用して、Ｕ３Ｂ ｇＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９－２７８+ HXB2）を同定し、続いてＧｉｂｓｏｎ法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ｃａｔａｌｏｇ 番号Ｅ２６１１Ｓ）により、ヒトＵ６プロモーター下にガイドＲＮＡ足場を含有するベクター（ｇＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ，Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ 番号４１８２４；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ ４１８２４）内にクローニングした。第２の方法は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のカスタムｇＲＮＡ設計リンクを使用してｇＲＮＡ標的配列を同定した。ＨＸＢ２ ５’ＬＴＲ領域の配列をＩＤＴ部位にアップロードし、この方法により、ＳｐＣａｓ９－１２７+ HXB2、ＳｐＣａｓ９－３６１- HXB2、及びＳｐＣａｓ９－３６３- HXB2として知られるｇＲＮＡを同定した。これらのｇＲＮＡの標的領域を図１及び図２に示す。Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用して、可能な数のオフターゲット事象を決定した（表１）。ＨＩＶ－１単離株間のこれらの標的領域の保存を、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からのウェブアライメントを使用して決定した。全てのクレードが、使用した１，２４２のＨＩＶ配列で表された（２０１７年に入手可能なデータ）。その特定の塩基対位置における各ヌクレオチドの確率のロゴによる図解表現を作製した（図１）。
【表1】
【0135】
ｇＲＮＡ命名法の標準化。本研究で利用したＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡについて、ガイドＲＮＡ命名法を開発した。Ｃａｓ酵素の種起源が最初に記述され、続いてＣａｓ特異的ＰＡＭに隣接するヌクレオチド位置が記述される。ガイドＲＮＡが結合する相補鎖の配向は、プラス（＋）鎖（５’→３’）又はマイナス（－）鎖（３’→５’）のいずれかとして上付き文字で示される。ここで報告されるｇＲＮＡの場合、ｇＲＮＡの数値表示は、ＨＢＸ２－ＨＩＶ参照ゲノム（登録番号Ｋ０３４５５．１）におけるヌクレオチド位置を指す。使用される参照ゲノムは、下付き文字として示される。
【0136】
ｉｉ．インビトロＤＮＡ切断アッセイ
いくつかのガイドＲＮＡを、ＨＩＶ－１ ＬＴＲに特異性を有するように設計し（図１は標的配列を示し、図２はｐＮＬ－ＧＦＰ中の部位を示す）、単一ｇＲＮＡ又は２つのｇＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いて切断効率を試験した。標的プラスミドであるｐＮＬ－ＧＦＰ（図２）は、ＮｓｉＩ及びＸｈｏＩで消化してＨＩＶ及びルシフェラーゼ配列の大部分を除去することによってｐＮＬ４－３ Ｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号３４１８）から得た。次いで、ＰＣＲを用いて核局在化及びスプライスアクセプター部位を再導入し、ＸｈｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間のＣｌｏｎｔｅｃｈプラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）からのＰＣＲによるｅＧＦＰ配列を添加した。加えて、ＨＩＶ－１クレードＡ～Ｇ（ＮＩＨ ＡＩＤＳリポジトリ、カタログ番号４７８７～４７９３）から種々のＨＩＶ－１ ３’ＬＴＲを発現するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＬＴＲ－ｌｕｃプラスミドに対して、２つの異なるｇＲＮＡを試験した。
いくつかのガイドＲＮＡを、ＨＩＶ－１ ＬＴＲに特異性を有するように設計し（図１は標的配列を示し、図２はｐＮＬ－ＧＦＰ中の部位を示す）、単一ｇＲＮＡ又は２つのｇＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いて切断効率を試験した。標的プラスミドであるｐＮＬ－ＧＦＰ（図２）は、ＮｓｉＩ及びＸｈｏＩで消化してＨＩＶ及びルシフェラーゼ配列の大部分を除去することによってｐＮＬ４－３ Ｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号３４１８）から得た。次いで、ＰＣＲを用いて核局在化及びスプライスアクセプター部位を再導入し、ＸｈｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間のＣｌｏｎｔｅｃｈプラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）からのＰＣＲによるｅＧＦＰ配列を添加した。加えて、ＨＩＶ－１クレードＡ～Ｇ（ＮＩＨ ＡＩＤＳリポジトリ、カタログ番号４７８７～４７９３）から種々のＨＩＶ－１ ３’ＬＴＲを発現するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＬＴＲ－ｌｕｃプラスミドに対して、２つの異なるｇＲＮＡを試験した。
【0137】
ＨＩＶ－１ ＤＮＡの切断を試験するために、ｐＮＬ－ＧＦＰプラスミドを最初にＫｐｎ１及びＸｍｎ１制限酵素、又はＸｈｏ１及びＸｍｎ１制限酵素（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のいずれかの組み合わせで消化して、３つの断片を得た（図２及び図８）。異なるＨＩＶ－１クレード（Ａ～Ｇ）を発現するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）プラスミドを、それぞれ、Ｘｍｎ１及びＥｃｏＲ１制限酵素の組み合わせで消化して、６ｋＢ及び０．４ｋＢの２つの断片を作製した。インビトロ切断アッセイは、最初にｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖を形成し、続いて組換えＳｐＣａｓ９を添加してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することによって実行した。簡潔に述べると、３００ｐｍｏｌｅのｇＲＮＡを、３００ｐｍｏｌｅのｔｒａｃｒＲＮＡ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＩＤＴｄｎａ Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）とともに９５℃で５分間インキュベートすることにより、ｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を形成した。次いで、この二重鎖を、ヌクレアーゼを含まない二重鎖緩衝液（ＩＤＴ ＤＮＡ）で１：１００に希釈して、３μＭの最終濃度とした。３０μｌのＲＮＰアセンブリの場合、１μｌ（３ｐｍｏｌｅ）のｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を、３μｌの１０×Ｃａｓ９ヌクレアーゼ反応緩衝液（ＩＤＴ）とともに、３ｐｍｏｌｅのＣａｓ９（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３、ＩＤＴｄｎａ）に、添加した。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いで、消化されたプラスミドＤＮＡ３００ｎｇに添加し、３７℃で更に１５分間インキュベートした。１μｌのプロテアーゼＫ（８００単位／ｍｌ、ＮＥＢ）の添加により反応を停止させ、室温で１０分間インキュベートした。切断効率を評価するために、ＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル上で分離し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、Ｂｉｏｒａｄ Ｖｅｒｓａ Ｄｏｃイメージングシステム上でＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）により視覚化した。
【0138】
ｉｉｉ．ＨＩＶ－１ ＬＴＲのインビボ切断
ＴＺＭ－ｂｌ細胞は、ルシフェラーゼ又はベータ－ガラクトシダーゼ遺伝子のいずれかを発現する修飾ＨＩＶ－１プロウイルスの２つのコピーを含有するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子切断のインビボ評価のためのモデルとして使用した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＬＴＲのＵ３領域に対する１つ又は２つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ１２７）のいずれかを含有するＲＮＰの混合物を、ＣＲＩＳＰＲｍａｘ（ＣＭＡＸ０００１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＴＺＭ－ｂｌ細胞にトランスフェクトした。ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に対するｇＲＮＡを使用して対照ＲＮＰを調製した。簡潔に述べると、ＴＺＭ－ｂｌ細胞のＲＮＰは、４０ｐｍｏｌｅのｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖、４０ｐｍｏｌｅのＣａｓ９、及び３．４μｌのＣａｓ９－ｐｌｕｓ試薬（総体積＝８３μｌ）を混合し、室温で５分間インキュベートすることによって調製した。次いで、このＲＮＰを４μｌのＣＲＩＳＰＲＭａｘ及び７９μｌのＯＰＴＩ Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、更に２０分間インキュベートした。次いで、ＲＮＰを２４ウェルプレートのウェルに添加し、最終体積０．５ｍｌの１％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に８×１０４個のＴＺＭ－ｂｌ細胞を添加した。細胞を、遺伝子切断の分析の前に６０時間インキュベートした。
ＴＺＭ－ｂｌ細胞は、ルシフェラーゼ又はベータ－ガラクトシダーゼ遺伝子のいずれかを発現する修飾ＨＩＶ－１プロウイルスの２つのコピーを含有するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子切断のインビボ評価のためのモデルとして使用した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＬＴＲのＵ３領域に対する１つ又は２つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ１２７）のいずれかを含有するＲＮＰの混合物を、ＣＲＩＳＰＲｍａｘ（ＣＭＡＸ０００１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＴＺＭ－ｂｌ細胞にトランスフェクトした。ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に対するｇＲＮＡを使用して対照ＲＮＰを調製した。簡潔に述べると、ＴＺＭ－ｂｌ細胞のＲＮＰは、４０ｐｍｏｌｅのｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖、４０ｐｍｏｌｅのＣａｓ９、及び３．４μｌのＣａｓ９－ｐｌｕｓ試薬（総体積＝８３μｌ）を混合し、室温で５分間インキュベートすることによって調製した。次いで、このＲＮＰを４μｌのＣＲＩＳＰＲＭａｘ及び７９μｌのＯＰＴＩ Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、更に２０分間インキュベートした。次いで、ＲＮＰを２４ウェルプレートのウェルに添加し、最終体積０．５ｍｌの１％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に８×１０４個のＴＺＭ－ｂｌ細胞を添加した。細胞を、遺伝子切断の分析の前に６０時間インキュベートした。
【0139】
ＨＩＶ－１ ＬＴＲのインビボ切断後のＴＺＭ－ｂｌ細胞における機能的活性の喪失を、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。簡潔に述べると、ＲＮＰ（上記）でトランスフェクションしたＴＺＭ－ｂｌ細胞を、６０時間のインキュベーション後にトリプシンを用いて除去し、計数し、各トランスフェクション条件から１×１０４個の細胞を、９６ウェルプレートのウェルに３連で播種した。細胞をプラスチックウェルに一晩結合させ、次いで１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αで４時間刺激し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２５μｌのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。細胞を含有するプレートを－８０℃で一晩置いて溶解を促進させ、次いで暗所にて室温で解凍した。次いで、２０μｌの各溶解物を１．５ｍｌのマイクロリットルチューブに移し、続いて１００μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ルシフェラーゼ活性を輝度計（Ｔｕｒｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０／２０）で記録した。
【0140】
ｉｖ．Ｔ７Ｅ１アッセイ
ＲＮＰのインビボトランスフェクション後、ＱＩＡｍｐ Ｍｉｃｒｏ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ＴＺＭ－ｂｌ細胞からＤＮＡを単離した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を介したゲノム編集を、製造業者の指示に従ってＥｎＧｅｎ変異検出キット（ＮＥＢ）によって定量した。簡潔に述べると、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）プライマー対（順方向：ＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡ、逆方向：ＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧ）を使用して、５’ＬＴＲ標的部位に隣接するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを３５サイクル（９８℃、３０秒；６６℃、２０秒；７２℃、３０秒）行って、５００ｎＭの最終濃度、及び５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡとした。ＨＰＲＴ遺伝子の１．０８３ｋｂ部分を、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）、及びＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＨＰＲＴ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＩＤＴ）を使用して増幅した。このＰＣＲを３５サイクル（９８℃、１５秒；６７℃、２０秒；７２℃、３０秒）行った。アッセイを完了するために、ＰＣＲ産物を、５μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液２を使用して、１９μｌの最終体積で（９５℃～８５℃、２℃／秒；８５℃～２５℃、０．１℃／秒）再アニールし、次いで１μｌのＥｎＧｅｎ Ｔ７Ｅ１で１５分間、３７℃で消化した。１μｌのプロテアーゼＫ（ＮＥＢ）を３７℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させ、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離させた。ＤＮＡバンドをＧｅｌＲｅｄで可視化し、バンド密度を上記のように決定した。遺伝子改変の定量は、相対的なバンド強度に基づいており、式：％遺伝子改変＝１００×（１－切断された断片）1/2によって決定した。
ＲＮＰのインビボトランスフェクション後、ＱＩＡｍｐ Ｍｉｃｒｏ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ＴＺＭ－ｂｌ細胞からＤＮＡを単離した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を介したゲノム編集を、製造業者の指示に従ってＥｎＧｅｎ変異検出キット（ＮＥＢ）によって定量した。簡潔に述べると、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）プライマー対（順方向：ＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡ、逆方向：ＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧ）を使用して、５’ＬＴＲ標的部位に隣接するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを３５サイクル（９８℃、３０秒；６６℃、２０秒；７２℃、３０秒）行って、５００ｎＭの最終濃度、及び５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡとした。ＨＰＲＴ遺伝子の１．０８３ｋｂ部分を、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）、及びＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＨＰＲＴ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＩＤＴ）を使用して増幅した。このＰＣＲを３５サイクル（９８℃、１５秒；６７℃、２０秒；７２℃、３０秒）行った。アッセイを完了するために、ＰＣＲ産物を、５μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液２を使用して、１９μｌの最終体積で（９５℃～８５℃、２℃／秒；８５℃～２５℃、０．１℃／秒）再アニールし、次いで１μｌのＥｎＧｅｎ Ｔ７Ｅ１で１５分間、３７℃で消化した。１μｌのプロテアーゼＫ（ＮＥＢ）を３７℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させ、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離させた。ＤＮＡバンドをＧｅｌＲｅｄで可視化し、バンド密度を上記のように決定した。遺伝子改変の定量は、相対的なバンド強度に基づいており、式：％遺伝子改変＝１００×（１－切断された断片）1/2によって決定した。
【0141】
ｖ．ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ
単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡの合成。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑインビトロ切断反応に使用したガイドＲＮＡは、標的特異的ｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含有する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であった。Ｅｎｇｅｎ ｓｇＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ３３２２Ｓ）を使用して、ｄｓＤＮＡテンプレートからＴ７プロモーターでこれらを転写し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｔ２０４０Ｌ）を使用して精製した。ｄｓＤＮＡテンプレートの合成に必要なＴ７プロモーター及び標的特異的配列を含有するＤＮＡオリゴを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号１０３３６０２２）から購入した。
単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡの合成。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑインビトロ切断反応に使用したガイドＲＮＡは、標的特異的ｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含有する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であった。Ｅｎｇｅｎ ｓｇＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ３３２２Ｓ）を使用して、ｄｓＤＮＡテンプレートからＴ７プロモーターでこれらを転写し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｔ２０４０Ｌ）を使用して精製した。ｄｓＤＮＡテンプレートの合成に必要なＴ７プロモーター及び標的特異的配列を含有するＤＮＡオリゴを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号１０３３６０２２）から購入した。
【0142】
ｖｉ．ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑライブラリーの調製
Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１５８６６７；入力：１－２×１０7細胞）を使用してＴＺＭ－ｂｌ細胞からゲノムＤＮＡを精製し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０音響ソニケータ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って平均長さ３００ｂｐに剪断した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑプロトコルは、主に以前に報告された通りに実行された。簡潔に述べると、剪断されたゲノムＤＮＡを、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズベースの二重サイズ選択（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｊｅｒｓｅｙ Ｃｉｔｙ，ＮＪ；カタログ番号ＮＣ９９５９３３６、サイズ範囲：２００～７００ｂｐ）を用いて固相可逆的固定化ビーズ（ＳＰＲＩ）に曝露し、Ａテールを付加し、ヘアピンアダプター（ｏＳＱＴ１２８８；５’－Ｐ－ＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＵＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＧ＊Ｔ－３’、＊はホスホロチオエート結合を示す）にライゲートした（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号ＫＫ８２３５）。ライゲートされたヘアピンＤＮＡ断片を、ラムダエキソヌクレアーゼとＥ．ｃｏｌｉエクソヌルセアーゼ（Ｅｘｏｎｕｌｃｅａｓｅ）Ｉ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６２Ｌ、Ｍ０２９３Ｌ）との混合物で処理して、遊離端を有するＤＮＡを除去した。次に、アダプターをライゲートしたＤＮＡをユーザ酵素（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ５５０５Ｌ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０１Ｌ）で処理し、相補的な３’オーバーハングを生成して、ＤＮＡ断片の自己ライゲーション及び環状化を促進した。得られたＤＮＡ（５００ｎｇ）をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）で一晩環状化し、次いでＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、カタログ番号Ｅ３１０１Ｋ）で処理して、ｇＲＮＡ／ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３８６Ｓ）によるインビトロ消化前に非円形ＤＮＡ断片を除去した。Ｃａｓ９処理ＤＮＡにＡテールを付加し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔアダプター（ＮＥＢカタログ番号Ｅ７６０１Ａ）にライゲートし、ＵＳＥＲ酵素処理し、ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉポリメラーゼ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ２６０１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ（カタログ番号Ｅ７６００Ｓ）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、別のラウンドのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズベースの両側サイズ選択に供した。
Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１５８６６７；入力：１－２×１０7細胞）を使用してＴＺＭ－ｂｌ細胞からゲノムＤＮＡを精製し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０音響ソニケータ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って平均長さ３００ｂｐに剪断した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑプロトコルは、主に以前に報告された通りに実行された。簡潔に述べると、剪断されたゲノムＤＮＡを、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズベースの二重サイズ選択（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｊｅｒｓｅｙ Ｃｉｔｙ，ＮＪ；カタログ番号ＮＣ９９５９３３６、サイズ範囲：２００～７００ｂｐ）を用いて固相可逆的固定化ビーズ（ＳＰＲＩ）に曝露し、Ａテールを付加し、ヘアピンアダプター（ｏＳＱＴ１２８８；５’－Ｐ－ＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＵＡＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＧ＊Ｔ－３’、＊はホスホロチオエート結合を示す）にライゲートした（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号ＫＫ８２３５）。ライゲートされたヘアピンＤＮＡ断片を、ラムダエキソヌクレアーゼとＥ．ｃｏｌｉエクソヌルセアーゼ（Ｅｘｏｎｕｌｃｅａｓｅ）Ｉ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６２Ｌ、Ｍ０２９３Ｌ）との混合物で処理して、遊離端を有するＤＮＡを除去した。次に、アダプターをライゲートしたＤＮＡをユーザ酵素（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ５５０５Ｌ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０１Ｌ）で処理し、相補的な３’オーバーハングを生成して、ＤＮＡ断片の自己ライゲーション及び環状化を促進した。得られたＤＮＡ（５００ｎｇ）をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）で一晩環状化し、次いでＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、カタログ番号Ｅ３１０１Ｋ）で処理して、ｇＲＮＡ／ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３８６Ｓ）によるインビトロ消化前に非円形ＤＮＡ断片を除去した。Ｃａｓ９処理ＤＮＡにＡテールを付加し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔアダプター（ＮＥＢカタログ番号Ｅ７６０１Ａ）にライゲートし、ＵＳＥＲ酵素処理し、ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉポリメラーゼ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ２６０１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ（カタログ番号Ｅ７６００Ｓ）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、別のラウンドのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズベースの両側サイズ選択に供した。
【0143】
完成したＤＮＡライブラリーを、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０７９６０１４０００１）、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ定量、及びＡｇｉｌｅｎｔフラグメントアナライザでのサイジングを使用してｑＰＣＲによって定量し、その後、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ－Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）のＧｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｈａｒｅｄ ＲｅｓｏｕｒｃｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００機器で配列決定した。
【0144】
ｖｉｉ．ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑデータ解析
完成したＤＮＡライブラリーを正規化し、変性させ、フローセル上にロードし、試料当たり約５００万個の配列リード対を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００機器で１５０塩基対の対合末端リードにより配列決定した。修正されたＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑのパイプラインを、１２コアのｉＭａｃ Ｐｒｏでローカルに実装した。簡潔に述べると、脱多重化、トリミング、マージした対合末端リードを、別個の染色体としてヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３７及びＨＩＶ－１ ＨＸＢ２からなるカスタムゲノムアセンブリにマッピングした。マッチした部位及びマッチしない部位を、以前に公開されたデフォルト設定を使用して同定した。要するに、標的（ガイド）＋ＰＡＭ配列に対する６ヌクレオチドミスマッチ（欠失及び挿入を含む）以下のリード配列をオフターゲット部位として同定し、６ヌクレオチドミスマッチを超えるものをマッチしないと分類した。
完成したＤＮＡライブラリーを正規化し、変性させ、フローセル上にロードし、試料当たり約５００万個の配列リード対を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００機器で１５０塩基対の対合末端リードにより配列決定した。修正されたＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑのパイプラインを、１２コアのｉＭａｃ Ｐｒｏでローカルに実装した。簡潔に述べると、脱多重化、トリミング、マージした対合末端リードを、別個の染色体としてヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３７及びＨＩＶ－１ ＨＸＢ２からなるカスタムゲノムアセンブリにマッピングした。マッチした部位及びマッチしない部位を、以前に公開されたデフォルト設定を使用して同定した。要するに、標的（ガイド）＋ＰＡＭ配列に対する６ヌクレオチドミスマッチ（欠失及び挿入を含む）以下のリード配列をオフターゲット部位として同定し、６ヌクレオチドミスマッチを超えるものをマッチしないと分類した。
【0145】
３．結果
ｉ．ＨＩＶ－１プロウイルスＬＴＲ配列のインビトロ切断
ｐＮＬ－ＧＦＰプラスミド中に存在するＨＩＶ－１ ＬＴＲ配列を標的とする様々なｇＲＮＡの特異性及び切断活性を試験するために、インビトロ切断アッセイを行った。個々のｇＲＮＡをＳｐＣａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体化し、組換えＳｐＣａｓ９と組み合わせてＲＮＰを形成した。次いで、ＲＮＰを制限酵素で消化したｐＮＬ－ＧＦＰとともにインキュベートした。アガロースゲル電気泳動によって視覚化した予想された切断産物の生成及び強度を監視することにより切断効率を評価した。図８及び図３Ａ（左パネル）は、標的ＤＮＡ切断のアガロースゲル画像を示す。切断された標的領域の百分率が棒グラフ形式（図３Ａ、中央及び右パネル）で示され、ｇＲＮＡｓ ＳｐＣａｓ９－３６３－ＨＸＢ２（３６３）及びＳｐＣａｓ９－３６１－ＨＸＢ２（３６１）が、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの両方の切断において最も効果的であったことを示しているのに対し、ＳｐＣａｓ９－２７８＋ＨＸＢ２（２７８）及びＳｐＣａｓ９－１２７＋ＨＸＢ２（１２７）は、５’及び３’ＬＴＲ領域の異なる切断効率を示した。５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間の切断効率の差は、我々の標的のこれらの領域における遺伝子配列の差に起因する可能性がある（図７、図１０）が、様々なｇＲＮＡ含有ＲＮＰが本質的に標的ＤＮＡの切断においてより効率的であることを排除することはできない。
ｉ．ＨＩＶ－１プロウイルスＬＴＲ配列のインビトロ切断
ｐＮＬ－ＧＦＰプラスミド中に存在するＨＩＶ－１ ＬＴＲ配列を標的とする様々なｇＲＮＡの特異性及び切断活性を試験するために、インビトロ切断アッセイを行った。個々のｇＲＮＡをＳｐＣａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体化し、組換えＳｐＣａｓ９と組み合わせてＲＮＰを形成した。次いで、ＲＮＰを制限酵素で消化したｐＮＬ－ＧＦＰとともにインキュベートした。アガロースゲル電気泳動によって視覚化した予想された切断産物の生成及び強度を監視することにより切断効率を評価した。図８及び図３Ａ（左パネル）は、標的ＤＮＡ切断のアガロースゲル画像を示す。切断された標的領域の百分率が棒グラフ形式（図３Ａ、中央及び右パネル）で示され、ｇＲＮＡｓ ＳｐＣａｓ９－３６３－ＨＸＢ２（３６３）及びＳｐＣａｓ９－３６１－ＨＸＢ２（３６１）が、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの両方の切断において最も効果的であったことを示しているのに対し、ＳｐＣａｓ９－２７８＋ＨＸＢ２（２７８）及びＳｐＣａｓ９－１２７＋ＨＸＢ２（１２７）は、５’及び３’ＬＴＲ領域の異なる切断効率を示した。５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間の切断効率の差は、我々の標的のこれらの領域における遺伝子配列の差に起因する可能性がある（図７、図１０）が、様々なｇＲＮＡ含有ＲＮＰが本質的に標的ＤＮＡの切断においてより効率的であることを排除することはできない。
【0146】
ＨＩＶ－１ ＬＴＲの異なる領域を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは、単一のＲＮＰと比較して、組み合わせて使用された場合に遺伝子切断においてより効率的であった。図３Ｂに示すように、ｇＲＮＡの組み合わせの使用は、個々のｇＲＮＡと比較して同様の又はより高い切断効率を示した。例えば、ｇＲＮＡ ２７８＋ｇＲＮＡ ３６１（９３．４±０．６％切断）、及びｇＲＮＡ ２７８＋ｇＲＮＡ ３６３（９４．３±０．８％切断）の組み合わせは、我々が試験した他の組み合わせと比較して、５’ＬＴＲで顕著に高い標的領域切断を示した。対照的に、ｇＲＮＡの組み合わせによる３’ＬＴＲでの切断を定量したとき、全てのｇＲＮＡの組み合わせが、単一ｇＲＮＡと比較して切断効率の増加を示した。２つの最良のガイドの組み合わせであるｇＲＮＡ ２７８＋３６１（９６．８±３．２％）、及びｇＲＮＡ ２７８＋３６３（９５．６±３．４％）は、５’ＬＴＲと比較して、３’ＬＴＲにおける切断効率をわずかに増加させた。５’及び３’ＬＴＲに対するこの差異的切断のパターンは、個々のｇＲＮＡ及び同時に使用される２つの異なるｇＲＮＡの組み合わせの両方で一貫していた（切断効率は８０％～１００％の範囲であった）。
【0147】
ｉｉ．ＨＩＶ－１ ＬＴＲに対するガイドＲＮＡは、様々な効率でＨＩＶ－１クレードを標的とする
単一のＨＩＶ－１クレードに対する各ガイドＲＮＡの活性は、機能的活性のある程度の指標となるが、様々なＬＴＲ配列を標的とする能力も評価されるべきである。したがって、ＨＩＶ－１クレードＡ～Ｇの３’ＬＴＲの異なる部分を含有するプラスミドを、上記で行われたものと同様のインビトロアッセイで使用した。ｇＲＮＡ １２７は、このｇＲＮＡが全ての様々なクレードの中で標的領域に対する最大の相同性を有していたために試験し、またｇＲＮＡ ３６３は、様々なクレードの３’ＬＴＲの全てにわたって最小の相同性を有していたために試験した。
単一のＨＩＶ－１クレードに対する各ガイドＲＮＡの活性は、機能的活性のある程度の指標となるが、様々なＬＴＲ配列を標的とする能力も評価されるべきである。したがって、ＨＩＶ－１クレードＡ～Ｇの３’ＬＴＲの異なる部分を含有するプラスミドを、上記で行われたものと同様のインビトロアッセイで使用した。ｇＲＮＡ １２７は、このｇＲＮＡが全ての様々なクレードの中で標的領域に対する最大の相同性を有していたために試験し、またｇＲＮＡ ３６３は、様々なクレードの３’ＬＴＲの全てにわたって最小の相同性を有していたために試験した。
【0148】
インビトロ切断における試験を行ったとき、これらのｇＲＮＡの切断効率は、様々なＨＩＶクレードＡ～Ｇ間の標的配列とガイドＲＮＡとの間の相同性と相関していた（図４、パネルＡ～Ｃ）。標的切断をアガロースゲル電気泳動により評価し（図４Ａ）、切断効率パーセントを計算して図４Ｂに示す。図４Ｃは、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のヌクレオチドミスマッチを示し、これは、ある場合には、非連続的であり、ＰＡＭの近位及び遠位の両方に位置していた。切断効率に対するミスマッチの影響を予測するために、各代表的なクレード配列との対比較を用いて、各ガイドについて切断頻度決定（ＣＦＤ）スコアを計算した（図４Ｄ）。この分析は、ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチの数、ミスマッチの位置、ＰＡＭ、及び特定のヌクレオチドミスマッチを考慮する。ガイドＲＮＡ １２７の切断効率は、７６±４％～８３±０．５％の範囲であり、クレード間で同様であった（図４Ｂ）。対照的に、ｇＲＮＡ ３６３を有するＲＮＰは、３’ＬＴＲとのヌクレオチドミスマッチの程度が大きかったが、標的遺伝子切断の減少を示した（図４Ｂ）。ｇＲＮＡ ３６３と標的配列（クレードＢ及びＤ）との間のマッチングは、最も高い切断効率をもたらした（それぞれ８９±１．３％及び８９±２．３％）（図４Ｂ）。ｇＲＮＡ ３６３によって標的とされた配列は、ＨＩＶ－１クレードＡ及びＧにおける対応する配列との４つのヌクレオチドミスマッチを含有し、これらのミスマッチは、ＰＡＭの近位にクラスター化していた（図４Ｃ）。ミスマッチの程度は、クレードＡ（４．２±０．６％）及びクレードＧ（１６±６．１％）の切断効率の低下に対応していた（図４Ｂ）。ｇＲＮＡ ３６３とクレードＣの３’ＬＴＲとの間に６個の塩基対ミスマッチがあり、その結果、この標的の切断レベルが非常に低かった（５．４±０．３％）（図４Ｂ及び図４Ｃ）。ｇＲＮＡ ３６３とクレードＥとの間に１０個の塩基対ミスマッチがあり、これは標的切断の完全な欠如をもたらした（図４Ｂ）。このパターンとは対照的に、ｇＲＮＡ ３６３は、クレードＦの３’ＬＴＲと４つのヌクレオチドミスマッチを有していたが、高いレベルの標的切断（８４±３％）を示した（図４Ｂ）。これらの結果は、抗ＨＩＶ－１ ｇＲＮＡの潜在的な治療上の有用性に対する配列多様性の影響を示し、また、標的とｇＲＮＡとの間の不完全な相補性が、ＨＩＶ－１配列にわたる所与のｇＲＮＡの広範な使用を妨げないことを示す。
【0149】
ｉｉｉ．ＴＺＭ－ｂｌ細胞におけるＨＩＶ－１プロウイルス５’ＬＴＲのインビボ切断
細胞への送達後の抗ＨＩＶ－１ ｇＲＮＡの有効性を評価するために、ＨＩＶ－１プロウイルスの２つの修飾形態の組み込まれたコピーを含有するＴＺＭ－ｂｌ細胞においてインビボアッセイを行った。ＲＮＰによるトランスフェクションの４日後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、５’ＬＴＲの切断から生じる遺伝子改変の百分率を、ＰＣＲ、続いてＴ７Ｅ１アッセイを用いて決定した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子を標的とする最適化対照ｇＲＮＡを、陽性対照として使用した。ＨＰＲＴ遺伝子を標的とするＲＮＰのトランスフェクション後の遺伝子改変パーセントは、４１±４．０％であった（図５Ａ及び図５Ｃ）。各ガイドによる切断後の予想される断片サイズを図５Ｂに示す。ｇＲＮＡ ３６３又はｇＲＮＡ １２７を発現するＲＮＰを用いたトランスフェクションにより、ＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いたものと比較して、同様の頻度の５’ＬＴＲの改変がもたらされた。ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７を含有するＲＮＰのコトランスフェクションは、最も高いレベルの遺伝子改変（５２±５．２％）を示し、いずれのｇＲＮＡ単独のトランスフェクションよりも有意に高かった（ｇＲＮＡ ３６３による３１±２．２％の遺伝子改変、及びｇＲＮＡ １２７による２５±３．９％の遺伝子改変）（図５Ｃ）。更に、２つの異なるガイドＲＮＡの使用により、２３１個の塩基対欠失事象が引き起こされた（図９）。Ｔ７Ｅ１アッセイによって欠失事象が定量されないことを考慮すると、ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７の両方のトランスフェクションによる５’ＬＴＲの標的化が、測定したものよりも高かった可能性がある。ルシフェラーゼレポーターアッセイを行って、上述のＲＮＰによるトランスフェクション後のＬＴＲの機能的活性を調べた。ＬＴＲガイドＲＮＰで処理した細胞は、ＨＰＲＴ ＲＮＰで処理した細胞よりも顕著に少ないルシフェラーゼ発現を示した。ガイドＲＮＡ ３６３及び１２７は、単独又は組み合わせのいずれかで、ＬＴＲの機能的損傷を媒介し、転写能力を損なう。
細胞への送達後の抗ＨＩＶ－１ ｇＲＮＡの有効性を評価するために、ＨＩＶ－１プロウイルスの２つの修飾形態の組み込まれたコピーを含有するＴＺＭ－ｂｌ細胞においてインビボアッセイを行った。ＲＮＰによるトランスフェクションの４日後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、５’ＬＴＲの切断から生じる遺伝子改変の百分率を、ＰＣＲ、続いてＴ７Ｅ１アッセイを用いて決定した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子を標的とする最適化対照ｇＲＮＡを、陽性対照として使用した。ＨＰＲＴ遺伝子を標的とするＲＮＰのトランスフェクション後の遺伝子改変パーセントは、４１±４．０％であった（図５Ａ及び図５Ｃ）。各ガイドによる切断後の予想される断片サイズを図５Ｂに示す。ｇＲＮＡ ３６３又はｇＲＮＡ １２７を発現するＲＮＰを用いたトランスフェクションにより、ＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いたものと比較して、同様の頻度の５’ＬＴＲの改変がもたらされた。ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７を含有するＲＮＰのコトランスフェクションは、最も高いレベルの遺伝子改変（５２±５．２％）を示し、いずれのｇＲＮＡ単独のトランスフェクションよりも有意に高かった（ｇＲＮＡ ３６３による３１±２．２％の遺伝子改変、及びｇＲＮＡ １２７による２５±３．９％の遺伝子改変）（図５Ｃ）。更に、２つの異なるガイドＲＮＡの使用により、２３１個の塩基対欠失事象が引き起こされた（図９）。Ｔ７Ｅ１アッセイによって欠失事象が定量されないことを考慮すると、ｇＲＮＡ ３６３及びｇＲＮＡ １２７の両方のトランスフェクションによる５’ＬＴＲの標的化が、測定したものよりも高かった可能性がある。ルシフェラーゼレポーターアッセイを行って、上述のＲＮＰによるトランスフェクション後のＬＴＲの機能的活性を調べた。ＬＴＲガイドＲＮＰで処理した細胞は、ＨＰＲＴ ＲＮＰで処理した細胞よりも顕著に少ないルシフェラーゼ発現を示した。ガイドＲＮＡ ３６３及び１２７は、単独又は組み合わせのいずれかで、ＬＴＲの機能的損傷を媒介し、転写能力を損なう。
【0150】
ｉｖ．オンターゲット及びオフターゲット切断事象のＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ分析
ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑを実行して、いくつかの異なるｇＲＮＡの使用に起因するオフターゲット切断事象を評価した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑを行うために、ＴＺＭ－ｂｌ細胞株からの環状化ゲノムＤＮＡを、ＳｐＣａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｇＲＮＡ １２７又はｇＲＮＡ ３６３のいずれかからなるＲＮＰを用いたインビトロ切断のための標的として使用した。アダプターライゲーション及びライブラリー調製後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって誘発されるオフターゲット事象を次世代配列決定によって評価した。これらのｇＲＮＡの最も一般的なオフターゲット切断事象は、オンターゲット切断事象の頻度の約５％で生じた（図６Ａ及び図６Ｂ）。これは、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑによって試験された他の公開されているガイドと比較して比較的高い程度の標的特異性であった［１４］。また、分析を行って、最も近い注釈付き遺伝子を同定し、標的遺伝子に対する予測されるオフターゲット切断部位の位置を画定した（図６Ｃ）。いくつかの内因性切断事象が検出されたが、既知のタンパク質コード配列内では、いずれのオフターゲット事象も検出されなかった。これらのデータは、同定されたｇＲＮＡの前臨床開発中に、標的化、捕捉、又はアンプリコンベースの再配列決定によって評価され得る潜在的なオフターゲット事象のリストを提供する。総合すると、これらのデータは、複数のクレードのＨＩＶ－１のＬＴＲを効果的かつ特異的に標的とすることができるｇＲＮＡの設計及び実装を示し、ｇＲＮＡ候補の開発及び徹底的な評価のための枠組みを提供する。
ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑを実行して、いくつかの異なるｇＲＮＡの使用に起因するオフターゲット切断事象を評価した。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑを行うために、ＴＺＭ－ｂｌ細胞株からの環状化ゲノムＤＮＡを、ＳｐＣａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｇＲＮＡ １２７又はｇＲＮＡ ３６３のいずれかからなるＲＮＰを用いたインビトロ切断のための標的として使用した。アダプターライゲーション及びライブラリー調製後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって誘発されるオフターゲット事象を次世代配列決定によって評価した。これらのｇＲＮＡの最も一般的なオフターゲット切断事象は、オンターゲット切断事象の頻度の約５％で生じた（図６Ａ及び図６Ｂ）。これは、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑによって試験された他の公開されているガイドと比較して比較的高い程度の標的特異性であった［１４］。また、分析を行って、最も近い注釈付き遺伝子を同定し、標的遺伝子に対する予測されるオフターゲット切断部位の位置を画定した（図６Ｃ）。いくつかの内因性切断事象が検出されたが、既知のタンパク質コード配列内では、いずれのオフターゲット事象も検出されなかった。これらのデータは、同定されたｇＲＮＡの前臨床開発中に、標的化、捕捉、又はアンプリコンベースの再配列決定によって評価され得る潜在的なオフターゲット事象のリストを提供する。総合すると、これらのデータは、複数のクレードのＨＩＶ－１のＬＴＲを効果的かつ特異的に標的とすることができるｇＲＮＡの設計及び実装を示し、ｇＲＮＡ候補の開発及び徹底的な評価のための枠組みを提供する。
【0151】
４．考察
組み込まれたＨＩＶ－１プロウイルスを切断し、新しいウイルス産生を防ぐためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集の開発は、革新的な治療アプローチの開発に新しい機会を提供する。この方法は、標的ＤＮＡ配列内の小さな領域に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡ切断事象を指示するガイドＲＮＡ分子の設計を必要とする。１，２００超のＨＩＶ－１ ＬＴＲ配列を、５００を超える潜在的なガイドＲＮＡ部位と整列させたとき、最も保存された標的領域は、全ての主要なＭ群サブタイプを含む試験した配列の７０％に見出された。別の分析では、ＴＡＲコード領域内又はその近位を標的とするガイドは、クレードＢ配列の１００％、及び各共通サブタイプからの独自の配列の９６．１％を切断すると予測された。
組み込まれたＨＩＶ－１プロウイルスを切断し、新しいウイルス産生を防ぐためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集の開発は、革新的な治療アプローチの開発に新しい機会を提供する。この方法は、標的ＤＮＡ配列内の小さな領域に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡ切断事象を指示するガイドＲＮＡ分子の設計を必要とする。１，２００超のＨＩＶ－１ ＬＴＲ配列を、５００を超える潜在的なガイドＲＮＡ部位と整列させたとき、最も保存された標的領域は、全ての主要なＭ群サブタイプを含む試験した配列の７０％に見出された。別の分析では、ＴＡＲコード領域内又はその近位を標的とするガイドは、クレードＢ配列の１００％、及び各共通サブタイプからの独自の配列の９６．１％を切断すると予測された。
【0152】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる単回編集は、最終的にウイルス回避につながる可能性があり、したがって、ＬＴＲに対するｇＲＮＡを用いたウイルスゲノムの完全な切除は、ウイルス回避の可能性を回避するであろう。加えて、最も保存された領域がウイルスの完全性に不可欠であり、突然変異に対して耐性が低いため、ゲノム内の高度に保存された領域を標的とすることが、ウイルス回避の可能性を減少させることも見出された。代替として、ウイルスゲノム内の２つの異なる領域を同時に標的とするための１つより多くのｇＲＮＡの使用（多重化）が、遺伝子編集後のウイルス回避を顕著に減少させることも見出されている。
【0153】
本明細書に示されるように、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９対は、４つのミスマッチを有する配列に対して顕著な切断活性を示した。ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ分析では、ＤＮＡ又はＲＮＡバルジを有する部位での切断事象も検出された。単一のＲＮＡ又はＤＮＡバルジ及び４つのミスアライメント塩基を可能にすることにより、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ等のインシリコツールを使用して、３０００を超えるオフターゲット部位の同定をもたらす。最近、インシリコ予測の代替又は補足として、Ｃａｓ切断部位のインビトロ同定のための方法が浮上している。これらの方法は、ゲノムＤＮＡ及びｇＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとのインビトロ切断反応を使用して、好ましい切断部位の領域を同定する。これらの方法のうちの２つであるＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ及びＳＩＴＥ－Ｓｅｑは、細胞内のＣａｓ９媒介性オンターゲット及びオフターゲット切断事象の詳細な調査を可能にするために、アンプリコンベースの配列決定と関連付けられている。
【0154】
ＨＩＶ－１プロウイルスの５’及び３’長末端リピート（ＬＴＲ）領域を標的とするいくつかのガイドＲＮＡの設計及び試験が本明細書に記載される。ｇＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９を含有するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を調製し、これらの複合体を使用して、標的ＤＮＡのインビトロ改変及びインビボ送達を達成して、核細胞におけるガイドＲＮＡの切断効率を評価した。標的ＤＮＡの顕著な切断効率がインビトロで観察された。インビボ切断効率は５０％に達し、ＴＺＭ－ｂｌ細胞株におけるルシフェラーゼ活性の低下によるＬＴＲへの機能的損傷と相関していた。他の方法は、インビボでの遺伝子切断を定量するために使用されるＴ７エンドヌクレアーゼ１変異検出（Ｔ７Ｅ１）アッセイに加えて、切断編集の干渉（ＩＣＥ）、及び分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）を含む。これらの研究に続いて、標的配列に対するｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット効率の詳細な分析を行った。これらの知見は、設計されたガイドＲＮＡが、個別に使用されたときに高いレベルの切断効率を有し、ある場合には、２つのガイドの使用が、単一のガイド上の標的切断の割合を増加させたことを示す。ｇＲＮＡ １２７がＨＩＶ－１クレードＡ～Ｇの異なるＬＴＲ配列の高レベルの切断を示したことも判明し、ガイドＲＮＡと標的との間の相同性が完全ではなくても効率的な遺伝子切断が起こり得ることを示した。これらの結果は、インビトロでのオフターゲット切断事象の以前の分析と一致する。３’ＬＴＲにおける異なるＨＩＶ－１クレード配列にわたるガイドＲＮＡ標的領域の保存を評価するために、４つの異なるｇＲＮＡの各々を、８つのクレードの各々におけるそれらの標的配列に整列させた。次いで、ガイドＲＮＡが各クレードと一致する頻度を、各クレード内のＨＩＶの複数の単離株と比較することによって評価した。これらの分析は、クレードにわたって、かつ各クレードからの異なる単離株の高い百分率内で、標的領域の保存を示した（図１１）。
【0155】
これらの試験は、ＨＩＶ－１を含むウイルス標的を排除するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用におけるいくつかの考慮事項を強調している。
【0156】
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
参考文献
１．ｄｅ Ｂｕｈｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｈｕｍａｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８．５４：ｐ．１２３－１２９．
２．Ｈｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ ｌａｔｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｗ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１４．１１１（３１）：ｐ．１１４６１－６．
３．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２．３３７（６０９６）：ｐ．８１６－２１．
４．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ＨＢＶ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１４．３：ｐ．ｅ１８６．
５．Ｗａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＣＲ５ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｖｉａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ Ｒｅｎｄｅｒｓ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＨＩＶ－１ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４．９（１２）：ｐ．ｅ１１５９８７．
６．Ｋａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＣＲ５ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＣＲ５－ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ－１ Ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１５．４：ｐ．ｅ２６８．
７．Ｌｉｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＣＲ５ ａｎｄ ＣＸＣＲ４ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２０１７．７：ｐ．４７．
８．Ｘｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＣＲ５ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ ＨＩＶ－１ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１７．２５（８）：ｐ．１７８２－１７８９．
９．Ｐａｎｆｉｌ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏ Ｄｉｓａｂｌｅ ｔｈｅ Ｌａｔｅｎｔ ＨＩＶ－１ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１８．９：ｐ．３１０７．
１０．Ｘｉａｏ，Ｑ．，Ｄ．Ｇｕｏ，ａｎｄ Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＨＩＶ－１／ＡＩＤＳ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１９．９：ｐ．６９．
１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ＣＲＦｓ／ＣＲＦｓ．ｈｔｍｌ．
１２．Ｂｂｏｓａ，Ｎ．，Ｐ．Ｋａｌｅｅｂｕ，ａｎｄ Ｄ．Ｓｓｅｍｗａｎｇａ，ＨＩＶ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ，２０１９．１４（３）：ｐ．１５３－１６０．
１３．Ｈｅｍｅｌａａｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＩＶ－１，１９９０－２０１５：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ，ｇｌｏｂａｌ ｓｕｒｖｅｙ，ａｎｄ ｔｒｅｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１９．１９（２）：ｐ．１４３－５５．
１４．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ：ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（６）：ｐ．６０７－６１４．
１５．Ａｄａｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９８６．５９：ｐ．２８４－２９１．
１６．ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ．
１７．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９．６（５）：ｐ．３４３－５．
１８．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０１１．４９８：ｐ．３４９－６１．
１９．Ｍａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３．３３９（６１２１）：ｐ．８２３－６．
２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｏｒｄｅｒ／ｄｅｓｉｇｎｔｏｏｌ／ｉｎｄｅｘ／ＣＲＩＳＰＲ＿ＣＵＳＴＯＭ．
２１．Ｊｅｅｎｉｎｇａ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｓｕｂｔｙｐｅｓ Ａ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（８）：ｐ．３７４０－５１．
２２．Ｋｌａｖｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ５’ａｎｄ ３’ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９４．６８（６）：ｐ．３８３０－４０．
２３．Ｐｌａｔｔ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＴＺＭ－ｂｌ ｃｅｌｌｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００９．８３（１６）：ｐ．８２８９－９２．
２４．Ｐｌａｔｔ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＣＲ５ ａｎｄ ＣＤ４ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｔｒｏｐｉｃ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（４）：ｐ．２８５５－６４．
２５．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｍ．Ｏ．ＭｃＣｌｕｒｅ，ａｎｄ Ｍ．Ｐｉｚｚａｔｏ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００８．８２（２４）：ｐ．１２５８５－８．
２６．Ｗｅｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔ－２０）ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００２．４６（６）：ｐ．１８９６－９０５．
２７．Ｄｅｒｄｅｙｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔ－２０ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｏｆ ｇｐ１２０．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（１８）：ｐ．８３５８－６７．
２８．Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０．６４９：ｐ．２４７－５６．
２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓａｉｌａｂＳＪ／ｃｉｒｃｌｅｓｅｑ．
３０．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６．３４（２）：ｐ．１８４－１９１．
３１．Ｇｅｏｎｎｏｔｔｉ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＴＺＭ－ｂｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｇａｍｍａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２０１０．２６（３）：ｐ．２７９－９１．
３２．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ ｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ｓａｆｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１９．９（１）：ｐ．１７０８８．
３３．Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｓ ａｎ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＩＶ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌ，２０１８．１６（１）：ｐ．７５．
３４．Ｄａｍｐｉｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ－ＨＩＶ－１ ｇＲＮＡｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７．７（１）：ｐ．１４４１３．
３５．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３．３１（９）：ｐ．８２７－３２．
３６．Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，ＨＩＶ－１ Ｅｍｐｌｏｙｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｔｏ Ｒｅｓｉｓｔ Ｃａｓ９／Ｓｉｎｇｌｅ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１８．９２（２０）．
３７．Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，Ｃ．Ｓ．Ｂｉｎｄａ，ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ ＤＮＡ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２０１９．３８：ｐ．８１－８８．
３８．Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｃａｎ ｈａｌｔ ＨＩＶ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｅｓｃａｐｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７．７：ｐ．４１９６８．
３９．Ｄａｒｃｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＨＩＶ－１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｎ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｅｓｃａｐｅ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１９．１１（３）．
４０．Ｗａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｔｔａｃｋ ｏｎ ＨＩＶ－１ ＤＮＡ Ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ａｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１６．１７（１１）：ｐ．２８１９－２８２６．
４１．Ｊａｍａｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｏｎ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１８．２６：ｐ．６５－８０．
４２．Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｒ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ａｎｄ Ｌ．Ｂｏｒｔｅｓｉ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，２０１７．３５（１）：ｐ．９５－１０４．
４３．Ａｋｃａｋａｙａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１８．５６１（７７２３）：ｐ．４１６－４１９．
４４．Ｂａｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｐａｒｋ，ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１４．３０（１０）：ｐ．１４７３－５．
４５．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（６）：ｐ．６００－６０６．
４６．Ｈａｄｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｔ７ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１．８（１）：ｐ．６２－６７．
４７．Ｈｓｉａｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｂｉｏｒｘｉｖ／ｅａｒｌｙ／２０１９／０１／１４／２５１０８２．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ．
４８．Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１４．４２（２２）：ｐ．ｅ１６８．
参考文献
１．ｄｅ Ｂｕｈｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｈｕｍａｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８．５４：ｐ．１２３－１２９．
２．Ｈｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ ｌａｔｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｗ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１４．１１１（３１）：ｐ．１１４６１－６．
３．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２．３３７（６０９６）：ｐ．８１６－２１．
４．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ＨＢＶ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１４．３：ｐ．ｅ１８６．
５．Ｗａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＣＲ５ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｖｉａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ Ｒｅｎｄｅｒｓ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＨＩＶ－１ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４．９（１２）：ｐ．ｅ１１５９８７．
６．Ｋａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＣＲ５ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＣＲ５－ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ－１ Ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１５．４：ｐ．ｅ２６８．
７．Ｌｉｕ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＣＲ５ ａｎｄ ＣＸＣＲ４ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２０１７．７：ｐ．４７．
８．Ｘｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＣＲ５ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ ＨＩＶ－１ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１７．２５（８）：ｐ．１７８２－１７８９．
９．Ｐａｎｆｉｌ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏ Ｄｉｓａｂｌｅ ｔｈｅ Ｌａｔｅｎｔ ＨＩＶ－１ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１８．９：ｐ．３１０７．
１０．Ｘｉａｏ，Ｑ．，Ｄ．Ｇｕｏ，ａｎｄ Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＨＩＶ－１／ＡＩＤＳ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１９．９：ｐ．６９．
１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ＣＲＦｓ／ＣＲＦｓ．ｈｔｍｌ．
１２．Ｂｂｏｓａ，Ｎ．，Ｐ．Ｋａｌｅｅｂｕ，ａｎｄ Ｄ．Ｓｓｅｍｗａｎｇａ，ＨＩＶ ｓｕｂｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ，２０１９．１４（３）：ｐ．１５３－１６０．
１３．Ｈｅｍｅｌａａｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＩＶ－１，１９９０－２０１５：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ，ｇｌｏｂａｌ ｓｕｒｖｅｙ，ａｎｄ ｔｒｅｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１９．１９（２）：ｐ．１４３－５５．
１４．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ：ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（６）：ｐ．６０７－６１４．
１５．Ａｄａｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９８６．５９：ｐ．２８４－２９１．
１６．ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ．
１７．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９．６（５）：ｐ．３４３－５．
１８．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０１１．４９８：ｐ．３４９－６１．
１９．Ｍａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３．３３９（６１２１）：ｐ．８２３－６．
２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｏｒｄｅｒ／ｄｅｓｉｇｎｔｏｏｌ／ｉｎｄｅｘ／ＣＲＩＳＰＲ＿ＣＵＳＴＯＭ．
２１．Ｊｅｅｎｉｎｇａ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｓｕｂｔｙｐｅｓ Ａ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（８）：ｐ．３７４０－５１．
２２．Ｋｌａｖｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ５’ａｎｄ ３’ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９４．６８（６）：ｐ．３８３０－４０．
２３．Ｐｌａｔｔ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＴＺＭ－ｂｌ ｃｅｌｌｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００９．８３（１６）：ｐ．８２８９－９２．
２４．Ｐｌａｔｔ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＣＲ５ ａｎｄ ＣＤ４ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｔｒｏｐｉｃ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（４）：ｐ．２８５５－６４．
２５．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｍ．Ｏ．ＭｃＣｌｕｒｅ，ａｎｄ Ｍ．Ｐｉｚｚａｔｏ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００８．８２（２４）：ｐ．１２５８５－８．
２６．Ｗｅｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔ－２０）ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００２．４６（６）：ｐ．１８９６－９０５．
２７．Ｄｅｒｄｅｙｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔ－２０ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｏｆ ｇｐ１２０．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（１８）：ｐ．８３５８－６７．
２８．Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０．６４９：ｐ．２４７－５６．
２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓａｉｌａｂＳＪ／ｃｉｒｃｌｅｓｅｑ．
３０．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６．３４（２）：ｐ．１８４－１９１．
３１．Ｇｅｏｎｎｏｔｔｉ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＴＺＭ－ｂｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｇａｍｍａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２０１０．２６（３）：ｐ．２７９－９１．
３２．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ ｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ｓａｆｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１９．９（１）：ｐ．１７０８８．
３３．Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｓ ａｎ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＩＶ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌ，２０１８．１６（１）：ｐ．７５．
３４．Ｄａｍｐｉｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ－ＨＩＶ－１ ｇＲＮＡｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７．７（１）：ｐ．１４４１３．
３５．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３．３１（９）：ｐ．８２７－３２．
３６．Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，ＨＩＶ－１ Ｅｍｐｌｏｙｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｔｏ Ｒｅｓｉｓｔ Ｃａｓ９／Ｓｉｎｇｌｅ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０１８．９２（２０）．
３７．Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，Ｃ．Ｓ．Ｂｉｎｄａ，ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ ＤＮＡ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２０１９．３８：ｐ．８１－８８．
３８．Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｃａｎ ｈａｌｔ ＨＩＶ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｅｓｃａｐｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７．７：ｐ．４１９６８．
３９．Ｄａｒｃｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＨＩＶ－１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｎ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｅｓｃａｐｅ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１９．１１（３）．
４０．Ｗａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｔｔａｃｋ ｏｎ ＨＩＶ－１ ＤＮＡ Ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ａｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１６．１７（１１）：ｐ．２８１９－２８２６．
４１．Ｊａｍａｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｏｎ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１８．２６：ｐ．６５－８０．
４２．Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｒ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ａｎｄ Ｌ．Ｂｏｒｔｅｓｉ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，２０１７．３５（１）：ｐ．９５－１０４．
４３．Ａｋｃａｋａｙａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１８．５６１（７７２３）：ｐ．４１６－４１９．
４４．Ｂａｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｐａｒｋ，ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１４．３０（１０）：ｐ．１４７３－５．
４５．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（６）：ｐ．６００－６０６．
４６．Ｈａｄｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｔ７ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１．８（１）：ｐ．６２－６７．
４７．Ｈｓｉａｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｂｉｏｒｘｉｖ／ｅａｒｌｙ／２０１９／０１／１４／２５１０８２．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ．
４８．Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１４．４２（２２）：ｐ．ｅ１６８．
【図1】
【図2A-2B】
【図3A-3B】
【図4A-4D】
【図5A-5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C-1】
【図6C-2】
【図7A-7B】
【図8A-8B】
【図9A-9B】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】