特表 2023-535157 血管新生疾患の治療に使われる１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-16

(54)【発明の名称】血管新生疾患の治療に使われる１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07D 405/14 20060101AFI20230808BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230808BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230808BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20230808BHJP

【ＦＩ】

C07D405/14 CSP

A61P27/02

A61P9/10

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K31/496

A61K31/551

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023502982

(86)(22)【出願日】2021-07-14

(85)【翻訳文提出日】2023-03-06

(86)【国際出願番号】 GB2021051810

(87)【国際公開番号】W WO2022013555

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】2010829.6

(32)【優先日】2020-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523015264

【氏名又は名称】エクソネイト リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000626

【氏名又は名称】弁理士法人英知国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】バクスター、アンドリュー ダグラス

(72)【発明者】

【氏名】モーリス、ジョナサン

【テーマコード（参考）】

4C063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA03

4C063AA05

4C063BB01

4C063CC78

4C063DD75

4C063EE01

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC50

4C086BC54

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA12

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZC75

(57)【要約】

特に眼内若しくは眼上での異常な血管形成又は血管新生促進性ＶＥＧＦ_xxxアイソフォームの異常な生産過剰に関連する状態の抗血管形成治療、及び抗血管形成治療に使用するための化合物は記載されている。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｘが、ＣＦ₃、メチル、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、且つｎ＝１又は２であるとするとき、式（Ｉ）の化合物：

【化1】

又はその、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物若しくはプロドラッグ。

【請求項2】

Ｘ＝ＣＦ₃、メチル、Ｃｌ又はシクロプロピルであり；且つｎ＝１である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｘ＝ＣＦ₃である、請求項１又は請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

眼血管新生の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項5】

眼血管新生の治療又は予防は、異常な血管形成又は血管新生促進性ＶＥＧＦ_xxxアイソフォームの異常な生産過剰に関連する眼疾患の治療又は予防を含む、請求項４に記載の使用のための化合物。

【請求項6】

加齢黄斑変性の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項7】

糖尿病性黄斑浮腫の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項8】

糖尿病性網膜症の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項9】

網膜静脈閉塞症の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項10】

未熟児網膜症の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項11】

眼神経変性障害の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項12】

地図状萎縮などの眼変性疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項13】

眼透過性亢進障害の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項14】

眼上皮変性障害の治療又は予防に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物。

【請求項15】

局所治療又は予防を含む、請求項４～１４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項16】

請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、任意選択的に１つ又は複数の他の活性成分、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項17】

請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、任意選択的に１つ又は複数の他の活性成分、及び薬学的に許容される担体を含む、眼内注射に適切な形態の医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、任意選択的に１つ又は複数の他の活性成分、及び薬学的に許容される担体を含む、眼への局所投薬に適切な形態の医薬組成物。

【請求項19】

請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の治療有効量を被験者に投薬することを含む、それを必要とする前記被験者における眼血管新生の治療又は予防のための方法。

【請求項20】

前記眼血管新生は、異常な血管形成、又は血管新生促進性ＶＥＧＦ_xxxアイソフォームの異常な生産過剰を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記眼血管新生は加齢黄斑変性である、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記眼血管新生は糖尿病性黄斑浮腫である、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記眼血管新生は糖尿病性網膜症である、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記眼血管新生は網膜静脈閉塞症である、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記眼血管新生は、未熟児網膜症の治療又は予防を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項26】

被験者の眼神経変性障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする前記被験者に、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の治療有効量を投薬することを含む方法。

【請求項27】

被験者の眼変性障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする前記被験者に、請求項１に定義された式（Ｉ）の化合物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の治療有効量を投薬することを含む方法。

【請求項28】

前記眼神経変性障害は地図状萎縮である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

被験者の眼透過性亢進障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする前記被験者に、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の治療有効量を投薬することを含む方法。

【請求項30】

被験者の眼上皮変性障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする前記被験者に、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、又は請求項１６に記載の医薬組成物の治療有効量を投薬することを含む方法。

【請求項31】

前記投薬は局所投薬を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項32】

前記投薬は局所投薬を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項33】

前記投薬は局所投薬を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項34】

前記投薬は局所投薬を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項35】

前記投薬は局所投薬を含む、請求項３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に眼内若しくは眼上での異常な血管形成又は血管新生促進性ＶＥＧＦ_xxxアイソフォームの異常な生産過剰に関連する状態、例えば、眼血管新生、脈絡膜血管新生、加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症の抗血管形成治療、及び抗血管形成治療に使用するための化合物に関する。

【0002】

本発明はまた、眼内の透過性亢進障害、例えば、糖尿病性黄斑浮腫の治療法、及び透過性亢進障害の治療に使用するための化合物に関する。

【0003】

本発明はまた、眼変性、例えば地図状萎縮若しくは緑内障を治療又は予防する方法、及びそのような方法において使用するための化合物に関する。

【背景技術】

【0004】

糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＯ、ＤＭＥとしても知られている）及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、黄斑の中心領域に影響を及ぼす視力低下を引き起こす疾患であり、高所得国における失明の主要原因である（Ｂｒｅｓｓｌｅｒ、２００４）。ＤＭＯは、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の血管新生促進性アイソフォームの発現が増加した結果、内外の血液網膜バリアが破壊されることによって生じる（Ｐｅｒｒｉｎら、２００５）。この結果、新生血管の増殖、並びに血管から網膜への液体及びタンパク質の漏出、そして網膜色素上皮細胞を介した網膜への液体輸送が増加し、網膜浮腫及び視力低下が引き起こされる。滲出型ＡＭＤ（ｗｅｔ－ＡＭＤ又はｗＡＭＤとしても知られている）は、ＡＭＤの最も重症な型であり（Ｆｅｒｒｉｓら、１９８４）、主に黄斑下の脈絡膜循環から生じ、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）によって特徴付けられる。ＣＮＶは、脈絡膜から網膜色素上皮（ＲＰＥ）への新生血管の異常な増殖であり（Ｐａｔｚら，１９７７）、ＲＰＥの下及びＲＰＥを介して血液及び漿液が漏出し、最終的に光受容体の喪失、網膜剥離及び黄斑部瘢痕の緻密化のために視力低下を引き起こすと考えられている（Ｆｉｎｅら、２０００；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏら、２００６）。血管形成及び血管漏出の重要な因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｄｖｏｒａｋら、１９９５）は、ＤＭＯ及びＣＮＶの進行中に増加し（Ｓｐｉｌｓｂｕｒｙら、２０００；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２；Ｄａｓら、２００３）、滲出性ＡＭＤの治療のためのリード治療標的となっている。

【0005】

ＶＥＧＦは、複数のアイソフォームのファミリーを形成するために選択的スプライシングされる複雑な遺伝子である（Ｌｅｕｎｇら、１９８９；Ｊｉｎｇｊｉｎｇら、１９９９）。それぞれのアイソフォームは生物学的特性、活性及び機能において異なる（Ｈｏｕｃｋら、１９９１）。ほとんどの細胞は、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、及びＶＥＧＦ₁₈₉のアイソフォームを一般的に発現するが、ＶＥＧＦ₁₄₅及びＶＥＧＦ₂₀₆は比較的珍しい。ＶＥＧＦアイソフォームの大部分はエクソン１～５を含むが（例外はＶＥＧＦ₁₁₁（Ｍｉｎｅｕｒら、２００７））、ヘパリン硫酸（ＨＳ）結合ドメインをコードするエクソン６及び７の異なる部分を含む。

【0006】

２００２年、第８エクソンの差動スプライシングは、近位スプライスサイト（ＰＳＳ）から６６塩基下流の遠位スプライスサイト（ＤＳＳ）まで実証された（Ｂａｔｅｓら、２００２；Ｗｏｏｌａｒｄら、２００４年）。この領域での選択的スプライシングによって、その抗血管形成（Ｐｅｒｒｉｎら、２００５）及び抗透過性特性で注目される第２のアイソフォームのファミリー（ＶＥＧＦ_xxxｂ）は生成した。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０１２１０５号パンフレットには、選択的スプライシングされたアイソフォーム及びその治療上の重要性が記載されている。

【0007】

病的な血管増殖の間、血管新生促進性、透過性促進アイソフォームは選択的に増加し（Ｂａｔｅｓら、２００２；Ｐｅｒｒｉｎ、２００５、Ｖａｒｅｙら、２００８；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ－Ｊｏｎｅｓら、２００７）、ＶＥＧＦ_xxx及びＶＥＧＦ_xxxｂは別々の制御経路を有し得ることを示唆する。ＶＥＧＦ₁₆₅ｂ及びＶＥＧＦ₁₂₁ｂなどのこれらの抗血管形成アイソフォームは、強力に抗血管形成性であり、そして網膜及び脈絡膜血管新生の動物モデルにおいて、眼内注射後にＶＥＧＦ媒介血管透過性を阻害し（Ｈｕａら、２００８、Ｖｅｄら、２０１６）、内皮、網膜上皮細胞及び網膜神経細胞保護を生じることが示された（Ｂｅａｚｌｅｙ Ｌｏｎｇ ２０１５、Ｍａｇｎｕｓｓｅｎら、２０１０）。血管新生促進性、透過性促進性アイソフォームから抗血管形成性、抗透過性、サイト－及び神経保護性アイソフォームへのスイッチングスプライシングは、血管漏出、血管増殖、又は神経若しくは上皮細胞変性が病態の主要因となる眼疾患患者に対する潜在的治療アプローチとなるであろう。

【0008】

２００４年１２月に血管新生ＡＭＤの治療のためにＦＤＡの承認を受けた最初の治療法は、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉及びＶＥＧＦ₂₀₆特異的アプタマーであるペガプチニブナトリウム（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ Ｓｏｄｉｕｍ）（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））であった。臨床試験において、ペガプチニブは投与量依存的に重度の視力低下のリスクを低減し、血管新生ＡＭＤの進行を遅らせたが、視力の大幅な改善には至らなかった。２００６年、新規ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントであるラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））が、血管新生ＡＭＤの治療薬としてＦＤＡから承認された。この承認は、３つの臨床試験の結果に基づいており、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（０．５ｍｇ）で毎月治療した患者の約９５％が視力を維持し（１５文字未満の損失として画定された）、４０％以下が１年後に視力を改善した（１５文字以上の増加として画定された）のに対し、偽対照治療群は１１％であった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２００６；Ｂｒｏｗｎら、２００６；Ｂｒｏｗｎら、２００９）。現在の治療レジメンでは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓを毎月程度の頻度で眼内注射によって投薬する必要がある（Ｂｒｏｗｎら、２００９；Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｅｒｆｕｔｈら、２０１１）。このような眼内注射は、眼圧を上昇させ（Ｇｏｏｄら、２０１０）、軽度ではあるが眼内炎や他の重篤な副作用のリスクをもたらす（Ｊａｇｅｒら、２００４）。さらに、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）が誘導されたた抗ＶＥＧＦ抗体のベビシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））は、ＶＥＧＦ₁₆₅と同等の効力を持ち、血管新生促進性及び抗血管形成ＶＥＧＦアイソフォームの両方を標的とするＶＥＧＦ₁₆₅ｂと結合することが示された（Ｖａｒｅｙら、２００８）。これらの治療法は全て、疾患患者の硝子体に定期的に薬剤を注射することを必要とする。このように侵襲的で不快、且つ損傷を与える可能性のある処置が必要なのは、注射せずにＲＰＥ及び他の網膜組織に浸透できる、ＶＥＧＦを標的とする抗血管形成剤の開発がまだできていないためである。分子を目の奥に到達させる方法の問題を解決することから生じる局所的治療法の開発は、これら及び他の網膜又は眼血管新生／透過性亢進疾患を有する患者に実質的利益を提供する重要な新規アプローチとなるであろう。

【0009】

ＶＥＧＦの抗血管形成アイソフォーム及び血管形成アイソフォームの両方が同一遺伝子に由来するため、アイソフォームファミリーの制御は、選択的スプライシングの制御の結果である。我々は、近位スプライスサイトでのＶＥＧＦのスプライシングを制御する経路の一部を特定し、ＲＮＡ結合タンパク質ＳＲＳＦ１（Ｎｏｗａｋ ら、２００８；Ａｍｉｎら、２０１１）及びそのキナーゼＳＲＰＫ１（Ｓａｎｆｏｒｄら、２００５）が、細胞が近位スプライスサイトを使用し、したがってＶＥＧＦの血管新生促進性アイソフォームを生成するという決定に必要な主要コンポーネントであることが示された（Ｎｏｗａｋら、２００８；Ｎｏｗａｋら、２０１０）。ＳＲＰＫ１のノックダウンは、腫瘍においてインビボでＶＥＧＦ媒介血管形成を強力に減少させ、ＳＲＰＫ１の阻害はインビボで血管形成を減少させた（Ａｍｉｎら、２０１１）。

【0010】

国際公開第２００８／１１０７７７号パンフレット、国際公開第２００９／１０６８５５号パンフレット、国際公開第２０１０／０５８２２７号パンフレット、国際公開第２０１１／１４８２００号パンフレット、及び国際公開第２０１９／０６４５１２号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、ＶＥＧＦ_xxxｂアイソフォームに有利に発現を誘導する薬剤の治療的及び他の生理学的使用について記載している。ＳＲＰＫ阻害剤は、原理的にそのような薬剤を構成することができる。
国際公開第２００５／０６３２９３号パンフレットは、ＳＲＰＩＮ３４０、並びにその誘導体及び類似体を含むＳＲＰＫ阻害剤の分類を記載している。

【0011】

国際公開第２０１４／０６０７６３号パンフレットは、特に抗血管形成剤、神経保護剤、透過性亢進障害の治療又は予防に用いるための薬剤、疼痛の治療剤並びに子癇前症のリスク低減又は治療のための薬剤として用いるための、ＳＲＰＫ１を標的とするＳＲＰＫ阻害剤を記載している。
ＶＥＧＦ_xxxｂアイソフォームの発現を誘導する薬剤の開発は、例えば、血管新生ＡＭＤの治療のみならず、ＶＥＧＦ_xxxｂが関与する他の全ての疾患における新時代を意味する。しかしながら、これを達成するためには、強力なＳＲＰＫ１阻害剤であり、且つ眼球を透過する分子を開発する必要があるであろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、新規低分子阻害剤は、特に局所抗血管形成剤、神経保護剤、透過性亢進障害の治療又は予防に用いる薬剤、及び眼線維症の治療又は予防のための薬剤としての使用に関して、驚くべきことに且つ予想外であることに、ＳＲＰＫ１阻害活性を維持しながら、局所治療薬として眼への高い透過性を有するという我々の知見に基づくものである。本発明はまた、少なくとも部分的に、これらの低分子量化合物を、ＣＮＶの進行及び血管形成（抗血管形成ではない）ＶＥＧＦの発現を阻害するために局所的に使用することができるという驚くべき知見に基づくものである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

第１の態様において、本発明は、Ｘが、ＣＦ₃、メチル、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、且つｎ＝１又は２であるとするとき、式（Ｉ）の化合物：

【化1】

又はその、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物若しくはプロドラッグ、を提供する。

【0014】

本発明はまた、眼血管新生の治療又は予防に使用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。

【0015】

式（Ｉ）の化合物及びその、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物又はプロドラッグは、それ自体が化合物として新規であり（同様に、本明細書に記載の予防及び治療におけるそれらの使用）、それらは本発明の一態様を構成するものである。

【0016】

本発明で使用される化合物は、サイズ、厚さ、内容物及び機能の点でヒトの眼と同様の特性を有する動物からの眼において、眼血管新生の有効な治療又は予防、或いは眼血管新生の局所治療又は予防を可能にする眼全体への透過性を有することは驚くべきことであり予想外である。

【0017】

新規化合物を含む医薬組成物、及び新規化合物及びそれらを含む医薬組成物の、抗透過性及び／又は抗血管形成治療（異常又は過剰な眼血管形成又は透過性によって特徴付けられる障害及び疾患の治療及び予防を含む）、眼透過性亢進障害の治療、眼神経障害及び神経変性障害の治療、眼上皮変性障害の治療における使用は、本発明のさらなる態様を構成している。

【0018】

したがって、本発明は、（ｉ）本明細書で定義された異常又は過剰な眼血管形成によって特徴付けられる障害及び疾患を治療又は予防する方法；（ｉｉ）本明細書で定義された眼透過性亢進障害を治療又は予防する方法；（ｉｉｉ）本明細書で定義された眼神経変性障害を治療又は予防する方法；（ｉｖ）及び眼上皮変性障害を治療又は予防する方法であって；式（Ｉ）の化合物を、それを必要としている患者へ投薬することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかについて、式（Ｉ）の化合物は、それを必要とする患者に治療有効量で投薬される。

【0019】

式（Ｉ）の特定の化合物及び式（Ｉ）の化合物の好ましい例示的なサブクラスは、本発明における使用のために特に言及され得る。

【0020】

言及され得る式（Ｉ）の化合物の例には、
ｎ＝１であり、且つＸはＣＦ₃、又はＣｌであるもの；及び
ｎ＝２であり、且つＸはＣＦ₃、又はＣｌであるものが含まれる。

【0021】

本発明の化合物は、ＳＲＰＫ１特異的阻害剤であり、したがって、ＳＲＰＫ１が関与する眼の任意の疾患又は状態を治療又は予防する方法において使用され得る。そのような状態及び治療を、次に説明する。

【0022】

抗血管形成治療
本発明の化合物は、眼の抗血管形成治療において使用され得る。抗血管形成治療は、好ましくは、異常な血管形成又は血管新生促進性ＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦ_xxx）の異常な生産過剰に関連する任意の疾患又は障害の治療又は予防を含む。このような疾患及び障害としては、例えば、糖尿病性網膜症、トラコーマ、水晶体後過形成（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、血管腫、眼損傷又は感染に伴う角膜血管形成、増殖性糖尿病性網膜症が挙げられる。また、本発明による抗血管形成治療は、例えば美容目的の血管発達を抑制するために健常者に行われる非治療的な処置を含んでもよい。異常な血管形成に関連する疾患及び障害、並びに抗血管新生治療に関するさらなる詳細については、その内容は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１１０７７７号パンフレットを参照のこと。

【0023】

特に、本発明の化合物は、網膜血管新生又は脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症又は加齢黄斑変性を含み得るがこれらに限定されない、眼血管新生の治療又は予防に使用され得る。さらに、本発明の化合物は、悪性眼新生物又は癌、例えばブドウ膜メラノーマの治療又は予防に使用することができる。

【0024】

微小血管透過性亢進障害、上皮細胞生存性の障害
ＳＲＰＫ１阻害剤としての本発明の化合物は、選択的スプライシングされたＶＥＧＦ_xxxｂアイソフォームが関与している他の疾患の治療における治療薬としても使用され得る。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０５８２２７号パンフレットにおいて、ＶＥＧＦ_xxxｂは、様々な微小血管透過性亢進障害、上皮細胞生存性の障害、上皮濾過膜のフェネストレーション（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎｓ）の障害に対して活性であることが示されている。

【0025】

微小血管透過性亢進、ＶＥＧＦ_xxxアイソフォームの血管新生促進性透過性促進性の調節障害、上皮細胞生存性及び透過性の障害、及び／又は上皮濾過膜のフェネストレーションの性質（例えば数密度及び／又はサイズ）の障害は、多数の重大な眼疾患の根底にある。

【0026】

そのような状態の例には、例えば、増殖性及び非増殖性の糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、滲出性加齢黄斑変性及び網膜静脈閉塞症（中心及び分枝）が含まれる。

【0027】

上皮細胞生存性を支援する治療が有効であろう障害の例は、以下の通りである。

【0028】

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（ウェット型又はドライ型）、中心性漿液性脈絡網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、虹彩血管新生、未熟児網膜症、中心及び分枝網膜静脈閉塞症、炎症性／感染性網膜血管新生／浮腫（例えば、後部ブドウ膜炎、サルコイド、トキソプラズマ症、ヒストプラズマ症、Ｖｏｇｔ－小柳－原田（Ｖｏｇｔ－Ｋｏｙａｎａｇｉ－Ｈａｒａｄａ）疾患、慢性ブドウ膜炎、結核、梅毒、点状及び多発性内膜症）、網膜芽腫、眼メラノーマ、眼腫瘍、網膜剥離、近視性血管新生、アンギオドストリーク、イールズ（Ｅａｌｅｓ）疾患、虚血性網膜症（網膜動脈閉塞症、高安症（Ｔａｋａｙａｓｕ’ｓ）、頸動脈閉塞症）、脈絡膜破裂又はそれらの任意の組合せ。最も好ましい実施形態において、目の奥の状態は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。

【0029】

本発明は、黄斑ジストロフィーの治療において使用され得る。これには、以下のものが含まれる。スターガート（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ）疾患／眼底黄点症；スターガート様黄斑ジストロフィー；常染色体優性「ブルアイ」黄斑ジストロフィー；ベスト（Ｂｅｓｔ）黄斑ジストロフィー；成人卵黄様ジストロフィー；パターン（Ｐａｔｔｅｒｎ）ジストロフィー；ドイン（Ｄｏｙｎｅ）ハニカム網膜ジストロフィー；ノースカロライナ（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）黄斑ジストロフィー；ＭＣＤＲ１類似の常染色体優性黄斑ジストロフィー；難聴を伴うノースカロライナ様黄斑ジストロフィー；進行性二焦点脈絡膜萎縮；ソースビー（Ｓｏｒｓｂｙ）眼底ジストロフィー；中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー；優性嚢胞様黄斑ジストロフィー；若年網膜隔離症；オカルト（Ｏｃｃｕｌｔ）黄斑ジストロフィー；非家系性オカルト黄斑ジストロフィー。

【0030】

障害は、特に、網膜上皮の障害、例えば、地図状萎縮、又は加齢黄斑変性であり得る。
微小血管透過性亢進障害、上皮細胞生存性の障害、上皮濾過膜のフェネストレーションの障害、及びそれらの治療に関するさらなる詳細については、その内容は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０５８２２７号パンフレットを参照のこと。

【0031】

活性化合物
本発明の化合物は、式（Ｉ）で定義されたとおりであり、キナーゼＳＲＰＫ１の阻害剤であることが示されており、したがって、ＶＥＧＦ_xxxｂ及び／又はＳＲＰＫ１が関与していることが示されている本明細書に記載の疾患の治療において有用である。本発明の化合物は、ＳＲＰＫ１特異的阻害剤であり得る。

【0032】

本発明の化合物は、任意の公知の方法によって合成され得る。例示的な合成法は、以下の実施例に記載されている。

【0033】

同時投薬
本発明の化合物は、所望であれば、１つ又は複数の追加の活性剤、例えば、限定されないが、コリンエステラーゼ阻害剤、ドーパミンアゴニスト（例えばＬ－ドーパ）、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、抗コリン剤、アセチルコリンアゴニスト、セロトニンアゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト、ｂ－アドレノセプターアゴニスト、ジゴキシン、ドブタミン、抗炎症剤、神経栄養因子、スタチン、アデノシンＡ２ａ受容体アンタゴニスト、アルドース還元酵素阻害剤、免疫調節剤、カンナビノイドアゴニスト、インターフェロン又は三環系抗鬱剤から選択される１つ又は複数の薬剤と一緒に投薬されてもよい。

【0034】

定義
本明細書における式（Ｉ）の定義において、
「塩」は、本発明による化合物によって形成される医薬的に許容される塩である限り、特に限定されない。このような塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、及び酸性又は塩基性アミノ酸塩が挙げられる。好ましい無機酸塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。好ましい有機酸塩の例としては、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、及びｐ－トルエンスルホン酸塩が挙げられる。

【0035】

好ましい無機塩基塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；並びにアンモニウム塩が挙げられる。好ましい有機塩基塩の例としては、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩が挙げられる。

【0036】

好ましい酸性アミノ酸塩の例としては、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩が挙げられる。好ましい塩基性アミノ酸塩の例としては、アルギニン塩、リジン塩及びオルニチン塩が挙げられる。

【0037】

空気中に放置すると、本発明の化合物は、水分を吸収することがあり、吸収した水分に付着したり、水和物に変換されたりすることがある。いくつかの実施形態において、水和物は半水和物を含み得る。そのような水和物も本発明に含まれる。

【0038】

さらに、本発明の化合物は、いくつかの他の溶媒を吸収して、溶媒和物に変換されることがある。そのような溶媒和物もまた本発明に含まれる。

【0039】

本発明の化合物の溶媒和物を調製するためには、原則として任意の有機溶媒は使用され得る。

【0040】

溶媒和物は、１種又は複数種の有機溶媒と一緒に水も含むことができる。

【0041】

したがって、例えば、溶媒は、ケトン、アルコール、エーテル、エステル、芳香族溶媒、及び可能であれば、それらの相互の混合物、他の有機溶媒及び／又は水との混合物から選択され得る。

【0042】

式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容されるプロドラッグの形態は、本発明において使用され得る。「薬学的に許容されるプロドラッグ」とは、正常な医学的及び獣医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒト及び下等動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に相応し、その意図する使用に対して有効な化合物のプロドラッグ、並びに可能であればその化合物の双性イオン形態が意味される。「プロドラッグ」という用語は、例えば血中での加水分解によって、インビボで急速に変換され、上記式の親化合物が得られる化合物を意味する。代謝切断によって、インビボで迅速に変換され得る官能基は、カルボキシル基と反応性のある基の分類を形成する。化合物の代謝切断可能な基がインビボで切断されることが容易であるため、そのような基を有する化合物はプロドラッグとして作用する。プロドラッグに関する徹底的な考察は、参照により本明細書に組み込まれる、以下に提供される：Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，４２，ｐ．３０９－３９６，１９８５；Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ－Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ５；Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｐ．１１３－１９１，１９９１；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｈ．Ｂｕｎｄｇａｒｄ，８，ｐ．ｌ－３８，１９９２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７７，ｐ．２８５，１９８８；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，Ｎ．Ｎａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ，３２，ｐ．６９２，１９８４；Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７。

【0043】

組成物及び投薬
本発明による化合物は、活性剤及び任意の適切な追加成分を含む組成物の形態で投薬され得る。組成物は、例えば、好適には局所投薬用（例えば、点眼薬又はクリーム若しくはローションとして）の医薬組成物（メディカメント）であり得る。

【0044】

本発明に関連する「医薬組成物」又は「メディカメント」という用語は、活性剤を含み、さらに１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を意味する。組成物は、投薬及び投与形態の性質に応じて、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビヒクル、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香料、調香剤、抗菌剤、抗真菌剤、潤滑剤及び分散剤から選択される成分をさらに含んでもよい。組成物は、例えば、懸濁液、散剤、乳剤、溶液、カシェ剤、顆粒剤及びリポソーム製剤を含む液体製剤の形態であってよい。技術及び製剤は一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見られ得る。

【0045】

液体形態の製剤には、溶液、懸濁液、及びエマルションが含まれる。例として、局所投薬用の水又は水－プロピレングリコール溶液は挙げられ得る。液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中に溶液で配合することもできる。

【0046】

また、使用直前に局所投薬のための液体形態製剤に変換することを意図した固体形態製剤も含まれる。そのような液体形態には、溶液、懸濁液、及びエマルションが含まれる。これらの特定の固体形態製剤は、単位投与形態で提供されるのが最も便利であり、そのようなものとして、単一液体投与単位を提供するために使用される。或いは、液体形態への変換後、注射器、ティースプーン、又は他の容量容器若しくは器具を用いるように液体形態製剤の所定の容量を測定することによって、複数の個々の液体投与を得ることができるように、十分な固体が提供されてもよい。液体形態に変換されることを意図した固体形態製剤は、活性材に加えて、香料、着色剤、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。液体形態製剤を調製するために利用される液体は、水、等張水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコールなど、並びにそれらの混合物であってよい。

【0047】

組成物は、局所適用を意図した製剤であってもよい。製剤は、局所適用後の活性剤の放出、従って利用可能性を制御するためのゲル化製剤であってもよい。製剤は、１つ又は複数のゲル化剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んでもよい。製剤は、１つ又は複数の界面活性剤、例えば非イオン性液体ポリマーを含んでもよく、その例としては、Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ、及びＢＡＳＦからのＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）ポロキサマーが挙げられる。製剤は、１つ又は複数の可溶化剤、例えばブドウ糖又はソルビトールを含んでもよい。製剤は、１つ又は複数の抗菌剤若しくは防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウムを含んでもよい。前述のゲル化剤、界面活性剤、可溶化剤及び抗菌剤は、純粋に例として挙げられたものであり、これらの機能を果たす他の薬剤が知られていることは理解されよう。

【0048】

活性剤（例えば、式（Ｉ）の化合物）の投与は、患者の要求、状態の性質、重症度及び程度、患者の年齢及び状態、使用される化合物、並びに当業者に公知の他の因子に応じて変化させてもよい。

【0049】

いくつかの例において、治療は、化合物の最適投与量より少ない投与量で開始される。その後、状況下で最適な効果に達するまで、投与量を少量ずつ増加させる。便宜上、１日の総投与量は、所望により日中に分割して投与してよい。例えば、１日の総投与量は、１日の間に２回、３回又は４回に分けて投薬されてよい。１日の総投与量は、１日～１４日の範囲の投与期間、又は必要に応じてそれ以上の投与期間で投薬されてよい。例えば、慢性眼障害の長期治療の場合、１日の総投与量は、少なくとも２年、例えば少なくとも３年、例えば少なくとも４年、例えば少なくとも５年、例えば少なくとも１０年、例えば少なくとも１５年、例えば少なくとも２０年の投与期間にわたって投薬されてもよい。

【0050】

活性剤の投薬のための投与レジメンは、例えば、活性剤の最大３０ｍｇ、例えば最大２０ｍｇ、例えば最大１０ｍｇ、例えば最大５００μｇ、例えば最大４００μｇ、例えば最大３００μｇ、例えば最大２００μｇ、例えば最大１００μｇ、例えば最大５０μｇ、例えば最大２０μｇ、例えば１０μｇの１日の総投与量を含み得る。

【0051】

活性剤の投薬のための投与レジメンは、例えば、活性剤の少なくとも１０μｇ、例えば少なくとも２０μｇ、例えば少なくとも５０μｇ、例えば少なくとも６０μｇ、例えば少なくとも１００μｇ、例えば少なくとも２００μｇ、例えば少なくとも３００μｇ、例えば少なくとも４００μｇ、例えば少なくとも５００μｇ、例えば少なくとも１ｍｇ、例えば少なくとも１０ｍｇ、例えば少なくとも２０ｍｇ、例えば少なくとも３０ｍｇの１日の総投与量を含み得る。

【0052】

式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物若しくはプロドラッグは、治療有効量で投薬されてよい。本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、治療される疾患又は障害の症状の緩和が含まれる、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医が求める組織系、動物又はヒトにおける生物学的又は薬学的反応を引き出す活性化合物又は医薬剤の量を意味する。

【0053】

ＣＮＶの治療のための局所投薬のための式（Ｉ）の化合物の治療有効量は、少なくとも約５μｇ／送達ビヒクル１０μＬであってよい。或いは、治療有効量は、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１０００μｇ／ｍＬであってよい。或いは、治療有効量は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１．５ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬであってよい。或いは、治療有効量は、約５ｍｇ／ｍＬ未満、例えば約４ｍｇ／ｍＬ未満、約３ｍｇ／ｍＬ未満、約２ｍｇ／ｍＬ未満、約１．５ｍｇ／ｍＬ未満、約１ｍｇ／ｍＬ未満であってよい。治療有効量は、例えば１～１４日の範囲の投与期間、毎日投薬されてよい。治療有効量は、例えば慢性眼障害の長期的治療において、生涯にわたって毎日投薬されてよい。治療有効量は、例えば１日２回又は１日４回など、１日の間に分割して投薬され得る１日の総投与量であってもよい。

【0054】

「治療又は予防」
本明細書で使用される「治療又は予防」という表現及び類似の用語は、一般的な医学及び精神医学の実践に従って利用可能な検査のいずれかに従って判断される、予防、治癒及び緩和ケアを含む、障害の除去又は回避、或いはその症状の緩和を意図した全ての形態の医療を指す。特定の結果を得るために合理的な期待を持って行うが、常にそうなるとは限らない介入は、「治療又は予防」という表現に含まれる。障害の進行を遅らせたり止めたりすることに成功した介入は、「治療又は予防」という表現に含まれる。

【0055】

本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「治療する」、「治療」などの用語は、疾患、状態、又は障害と闘う目的で、被験者又は患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの管理及びケアを含み、症状又は合併症の発症を予防する、症状又は合併症を緩和する、疾患又は障害の進行を遅くする、或いは疾患、状態、又は障害を除去するための本発明の化合物の投薬が含まれる。「治療する」又は「治療」という用語は、（ａ）疾患状態を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び／又は（ｂ）疾患状態を緩和すること、すなわち疾患状態の退行を引き起こすことをさらに含む。

【0056】

本明細書で使用する場合、「予防」は、臨床的な疾患状態の発生の確率を低減することを目的とした、哺乳動物、特にヒトにおける不顕性疾患状態の予防治療を含む。患者は、一般集団と比較して臨床的な疾患状態に罹患するリスクを高めることが知られている因子に基づいて、予防治療のために選択される。
本明細書で使用する場合、「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物の少なくとも１つの治療有効量を患者に投薬することによって、疾患状態のリスクを低減及び／又は最小化するため、及び／又は再発のリスクを低減するための疾患状態の保護治療である。患者は、一般集団と比較して臨床的な疾患状態に罹患するリスクを高めることが知られている要因に基づいて、予防法治療のために選択され得る。予防法治療の場合、臨床的な疾患状態の条件は、まだ提示されていなくてもよい。「予防法」治療は、（ａ）一次予防法と、（ｂ）二次予防法とに分けられる。一次予防法は、臨床的な疾患状態をまだ呈していない患者において、疾患状態のリスクを低減又は最小化する治療として定義されるのに対して、二次予防は、同一又は類似の臨床的な疾患状態の再発又は二度目の発生のリスクを最小化又は低減する治療として定義される。

【0057】

「罹患しやすい（Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ）」
本明細書で使用される「罹患しやすい」という表現、及び類似の用語は、特に、個体又は障害に関する既知のリスク因子を用いて評価した、医学的又は精神医学的障害、又は人格変化を発症するリスクが通常よりも高い個体を指す。そのような個体は、例えば、薬物が処方され、及び／又は特別な食事、ライフスタイル若しくは同様の推奨がその個体に対してなされる程度に、１つ又は複数の特定の障害又は人格変化を発症する実質的なリスクを有するものとして分類され得る。

【0058】

哺乳類
本発明は、ヒトの治療に有用である以外に、様々な哺乳動物にも有用である。そのような哺乳類には、例えば動物園にいる非ヒト霊長類（例えばサル（ａｐｅｓ）、サル（ｍｏｎｋｅｙｓ）及びキツネザル）、ネコ又はイヌのような伴侶動物、イヌ、ウマ及びポニーのような作業及びスポーツ動物、農場動物、例えばブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ウシ（ｏｘｅｎ）及びウシ（ｃａｔｔｌｅ）、並びに齧歯動物（例えばウサギ、ラット、マウス、ハムスター、スナネズミ又はモルモット）などの実験動物が含まれる。

【0059】

治療すべき障害又は機能がヒトに限定される場合、治療すべき哺乳類はヒトであると理解されるであろう。治療すべき障害又は機能がその種に排他的である場合、他の哺乳類種にもそれぞれ同じことが当てはまる。

【0060】

本発明の実施形態は、純粋に例示として、添付の図面を参照することによって説明される。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】眼の透過性の項で説明した方法によって測定された、化合物１及び他の化合物の透過性を示す。

【図2】メラニンに結合していない化合物の量を示す。

【図3a】化学的に類似した化合物（Ｎ－（２－（４－（（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）－フェニル）－５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フラン－２－カルボキサミド、化合物Ｒと呼ぶ）及びパゾパニブと比較した網膜への化合物１の浸透を示す。

【図3b】種々の眼組織を通しての化合物１の分配を示す。

【図4】化合物１、化合物Ｒ及びＳＰＨＩＮＸ３１（国際公開第２０１５／１５９１０３号パンフレット）に関するｅｘ ｖｉｖｏ透過性と網膜に見出される化合物の量との間の関係を示す。

【図5】ＥＬＩＳＡから、化合物１が選択的スプライシングをスイッチングして、網膜色素上皮細胞株のＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ａアイソフォームの発現を減少させることを示す。

【図6a】ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によって測定した糖尿病ラットのＶＥＧＦ発現に対する化合物１の２８日間の隔日点眼の結果を示す。

【図6b】総ＶＥＧＦが減少したことを示す。

【図6c】ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂが増加したことを示す。

【図6d】総ＶＥＧＦに対するＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂの割合が化合物１によって増加したことを示す。

【図7a】フルオレセイン血管造影画像を示す。

【図7b】ＣＮＶのレーザー誘発マウスモデルにおいて、化合物１が参照化合物と同じ病変サイズに対する抗血管形成活性を有することを実証する同一データをグラフ化して示す。

【図8a】３週間、０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ及び１．５ｍｇ／ｍＬの点眼によって隔日治療されたカニクイザルの網膜に認められた化合物１の量を示す。

【図8b】眼内の異なる組織における化合物１の量を示す色強度である。

【図9】異なる投与量で化合物１を単回点眼した後の水中における化合物１の濃度を示す。

【図10a】点眼薬として化合物１によって治療したサルにおいて網膜のＶＥＧＦレベルが変化することを示す（上：Ｐａｎ ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅、下：ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂ）。

【図10b】各ブロットの未治療の平均値に対するウェスタンブロットのバンドの強度を示す（治療、群あたりＮ＝３、群あたりＮ＝６個の眼、未治療Ｎ＝６匹、Ｎ＝１２個の眼、平均±ＳＥＭ）、（Ｔｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．００１、ＦＤＲのポストホックＢＫＹテスト^**＝ｐ＜０．０１、^***＝ｐ＜０．００１ ＶＥＧＦ１６５ｂと比較、＃＃＝ｐ＜０．０１，＃＃＃＝ｐ＜０．００１ 未治療と比較）。

【図10c】各試料のｐａｎＶＥＧＦ対ＶＥＧＦ³⁶⁵ｂの比率を示し、減少は、血管形成の少ない状態へのスイッチである（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０１、^**＝ｐ＜０．０１ 未治療と比較）（Ｈｏｌｍ Ｓｉｄａｋ ｐｏｓｔ ｈｏｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0062】

方法
合成
本発明の化合物は、当業者に公知の任意の合成方法、例えば国際公開第２０１５／１５９１０３号パンフレット及び国際公開第２０１７／０６４５１２号パンフレットに記載されたものに基づいて調製することができる。具体的には、化合物１～３は、以下の例示的な方法論に従って調製した。

【0063】

化合物１
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート

【化2】

ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレート（２．９０ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）、１－クロロ－２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゼン（３．９９ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）、及び炭酸ナトリウム（４．１０ｇ、３８．６６ｍｍｏｌ）の懸濁液を１１０℃で３時間加熱した。得られた反応混合物を室温まで冷却し、冷水（１００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、表題の生成物をオレンジ色の液体として得た（５．４ｇ、９２％）、これは、全ての分析データが必要な構造に一致し、次のステップで使用するのに十分な純度であった。

【0064】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），３．１２－３．１５（ｍ，４Ｈ），３．４５（ｂｒ ｓ，４Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，Ｊ＝２，９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［Ｍ⁺－５６］３２０．０１ｍ／ｚ、純度９８．３７％。

【0065】

ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－アミノ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート

【化3】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ヒドラジン水和物（１７．８７ｇ、３５７．５ｍｍｏｌ）を、メタノール（５０ｍＬ）中のピペラジン（５．４ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（０．４６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）及びチャコール（２．７ｇ）の溶液に滴下して添加した。得られた反応混合物を還流温度まで１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、セライトのショートパッドを通して濾過し、酢酸エチルで溶出させた。有機濾液を減圧下で濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料をｎ－ペンタン（２×１０ｍＬ）でトリチュレートして、表題の生成物をオフホワイトの固体として得た（３．５ｇ、７１％）。

【0066】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．４２（ｓ，９Ｈ），２．７６－２．７８（ｍ，４Ｈ），３．５０（ｂｒ ｓ，４Ｈ），５．２３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝１．６，８Ｈｚ，１Ｈ），６．９６－７．０１（ｍ，２Ｈ）；ＬＣＭＳ：［Ｍ⁺－５６］２９０．０１ｍ／ｚ、純度９８．８０％。

【0067】

Ｎ－（２－（ピペラジン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フラン－２－カルボキサミド

【化4】

窒素雰囲気下、０℃温度で、ジクロロメタン（８ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（２－アミノ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート（２ｇ、５．８ｍｍｏｌ）溶液にトルエン中のトリメチルアルミニウムの２Ｍ溶液（８．７ｍＬ、１７．３７ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、メチルジクロロメタン（５ｍＬ）中の５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－２－フルオレート（１．２２ｇ、５．８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で滴下した。得られた反応溶液を室温でさらに１５時間攪拌した。反応をクエンチするために、ロッシェル（Ｒｏｃｈｅｌｌｅ’ｓ）塩の飽和水溶液を室温で滴下し、溶液を室温でさらに１５分攪拌させた。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタンで抽出した（３回）。有機抽出物を組み合わせ、水及び塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、表題の生成物を淡黄色固体として得た（１．８ｇ、７３％）。

【0068】

¹Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．６５－１．７６（ｍ，２Ｈ），１．９４（ｄｄ，Ｊ＝２，１２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８５－２．８８（ｍ，４Ｈ），２．９７－２．９９（ｍ，４Ｈ），３．０１－３．０９（ｍ，１Ｈ），３．４５－３．５１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．９５（ｍ，２Ｈ），６．４６（ｄｄ，Ｊ＝０．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．４９（ｍ，２Ｈ），８．５６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），９．４５（ｓ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺４２４．２２ｍ／ｚ、純度４３．５６％。

【0069】

Ｎ－（２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フラン－２－カルボキサミド

【化5】

メタノール（５ｍＬ）中のピペラジン（０．１０ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボアルデヒド（０．０２６ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を窒素雰囲気下、周囲温度で３０分間攪拌した。次に、ナトリウムシアノボロヒドリド（０．４４ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を０℃で反応混合物中に数部分にわけて添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌させた。その後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、水中１０ｍＭ重炭酸アンモニウム及びアセトニトリルを移動相とする分取ＨＰＬＣにより精製して、表題の生成物（化合物１）をオフホワイト固体として得た（０．０５ｇ、４０．９１％）。

【0070】

Ｍｐ：１４８～１５０°Ｃ；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．７１－１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９７－２．００（ｍ，２Ｈ），２．６５－２．６７（ｍ，４Ｈ），２．９２（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．０６－３．１２（ｍ，１Ｈ），３．４７－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．９８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｓ，２Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｓ，１Ｈ），９．４７（ｓ，１Ｈ）．
ＨＰＬＣ純度：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）：ｍ／ｚ Ｃ₂₆Ｈ₃₁Ｆ₃Ｎ₅Ｏ₃［ＭＨ］⁺に関する計算値：５１８．２４、実測値：５１８．１２

【0071】

化合物２
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート

【化6】

無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の１－クロロ－２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゼン（２．２５ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート（２．０ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）及び固体炭酸ナトリウム（３．１８ｇ、２９．９６ｍｍｏｌ）の懸濁液を１１０℃まで１７時間加熱した。得られた反応混合物を室温まで冷却し、セライトのショートパッドを通して反応混合物を濾過し、酢酸エチルで溶出させた。有機濾液を減圧下で濃縮した。残渣を水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（ヘキサン中９０％酢酸エチル）を用いたシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の生成物を淡黄色固体として得た（３．７８ｇ、９７％）。

【0072】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．１２－１．２０（ｍ，９Ｈ），１．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．１２－３．２４（ｍ，２Ｈ），３．３０－３．３８（ｍ，２Ｈ，ＤＭＳＯの残留水分に合体），３．５０（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），３．６１－３．６９（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．４０（ｍ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０２－８．０３（ｍ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［Ｍ⁺－５６］３３４．０８ｍ／ｚ、純度１００％。
１－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン

【化7】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ジオキサン中の４ ＮＨＣｌ（２５ｍＬ）を、ジオキサン（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート（３．７８ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して添加した。得られた反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応完了後、反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和溶液（１００ｍＬ）に注いだ。生成物を酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、水及び塩水洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、表題の生成物をオレンジ色の液体として得（２．８５ｇ、定量的）、これをさらなる精製なしに次のステップで直接使用した。

【0073】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．７９－１．８１（ｍ，２Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺２８９．９６ｍ／ｚ、純度９９．９７％。

【0074】

１－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－４－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン

【化8】

１，２－ジクロロエタン（２５ｍＬ）中の１－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン（１．４ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）及び１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボアルデヒド（５）（０．６３９ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）の溶液に硫酸ナトリウム（０．３４３ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）、続いて氷酢酸（０．５８１ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を窒素雰囲気下、周囲温度で３時間攪拌した。次に、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１．５４ｇ、７．２６ｍｍｏｌ）を０℃の温度で反応混合物中に数部分にわけて添加した。得られた反応混合物を室温で４時間攪拌させた。その後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（クロロホルム中４％メタノール）を用いたシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題の生成物をオレンジ色の液体として得た（１．８０ｇ、９７％）。

【0075】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ２．０１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６７（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺３８４．１４ｍ／ｚ、純度９９．３５％。

【0076】

２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）アニリン

【化9】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ヒドラジン水和物（５．８８ｇ、１１７．３８ｍｍｏｌ）を、メタノール（３０ｍＬ）中の１－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－４－（２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジアゼパン（１．８０ｇ、４．７０ｍｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（０．１２５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）及びチャコール（０．２ｇ）の溶液に滴下して添加した。得られた反応混合物を３０分間還流温度まで加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、セライトのショートパッドを通して濾過し、酢酸エチルで溶出させた。有機濾液を減圧下で濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（クロロホルム中４％メタノール）を用いたシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題の生成物を無色液体として得た（１．４ｇ、８４％）。

【0077】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．８１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．７１－２．７５（ｍ，４Ｈ），３．０１－３．０７（ｍ，４Ｈ），３．５８（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），５．０７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝１．６，８Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺３５４．２２ｍ／ｚ、純度１００％。

【0078】

Ｎ－（２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フラン－２－カルボキサミド

【化10】

テトラヒドロフラン（８ｍＬ）中の２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）－５－（トリフルオロメチル）アニリン（０．２ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）及び５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－２－フロ酸（０．１３３ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、室温でトリエチルアミン（０．１１４ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）及びＴ₃Ｐ（０．１７９ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を還流温度まで４時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、イソプロピルアルコール：メタノール（７０：３０）及びｎ－ヘプタンを移動相とする分取ＨＰＬＣにより精製して、表題の生成物（化合物２）を茶色の半固体として得た（０．０５９ｇ、１９．６１％）。

【0079】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．６４－１．７４（ｍ，２Ｈ），１．９０－１．９３（ｍ，４Ｈ），２．７７－２．７９（ｍ，４Ｈ），２．９８－３．０４（ｍ，１Ｈ），３．１３－３．１６（ｍ，４Ｈ），３．４２－３．４７（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３８－７．４６（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ），９．５５（ｓ，１Ｈ）．
ＨＰＬＣ純度：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）：ｍ／ｚ Ｃ₂₇Ｈ₃₃Ｆ₃Ｎ₅Ｏ₃［ＭＨ］⁺に関する計算値：５３２．２５、実測値：５３２．０８

【0080】

化合物３
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート

【化11】

無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の１－ブロモ－４－クロロ－２－ニトロベンゼン（２．３６ｇ、９．９８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート（２．０ｇ、９．９８ｍｍｏｌ）及び固体炭酸ナトリウム（４．１４ｇ、２９．９４ｍｍｏｌ）の懸濁液を１１０℃まで１７時間加熱した。得られた反応混合物を室温まで冷却し、セライトのショートパッドを通して反応混合物を濾過し、酢酸エチルで溶出させた。有機濾液を減圧下で濃縮した。残渣を水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（１００％クロロホルム）を用いたシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題の生成物をオレンジ色の液体として得た（３．２０ｇ、５７％）。

【0081】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．３９－１．４８（ｍ，９Ｈ），１．９５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．２１－３．４３（ｍ，４Ｈ），３．５１－３．５７（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［Ｍ⁺－５６］２９９．８７ｍ／ｚ、純度１００％。

【0082】

１－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－１，４－ジアゼパン

【化12】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ジオキサン（２０ｍＬ）中の４Ｎ ＨＣｌを、ジオキサン（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－１，４－ジアゼパン－１－カルボキシレート（２．２０ｇ、６．１８ｍｍｏｌ）溶液に滴下して添加した。得られた反応混合物を室温で１５時間攪拌した。反応完了後、反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、水及び塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、表題の生成物を黄色固体として得（１．７ｇ、定量的）、これをさらなる精製なしに次のステップで直接使用した。

【0083】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ２．７３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺２５５．９６ｍ／ｚ、純度１００％。

【0084】

１－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン

【化13】

１，２－ジクロロエタン（１２ｍＬ）中の１－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－１，４－ジアゼパン（０．５ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）及び１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボアルデヒド（０．２５８ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で硫酸ナトリウム（０．１３８ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、続いて氷酢酸（０．２３４ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を窒素雰囲気下、周囲温度で６時間攪拌した。次に、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（０．６２１ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を０℃の温度で反応混合物に数部分にわけて添加した。得られた反応混合物を室温で１７時間攪拌させた後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（クロロホルム中２％メタノール）を用いたシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、表題の生成物をオレンジ色の液体として得た（０．７８ｇ、定量的）。

【0085】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．７０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．１０（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．２７－３．３０（ｍ，４Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．９７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．４６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８－７．４５（ｍ，２Ｈ），７．７０－７．７２（ｍ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺３５０．０３
ｍ／ｚ、純度９８．３２％。

【0086】

５－クロロ－２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）アニリン

【化14】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ヒドラジン水和物（２．７９ｇ、５５．７４ｍｍｏｌ）を、メタノール（３０ｍＬ）中の１－（４－クロロ－２－ニトロフェニル）－４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン（０．７８ｇ、２．２３ｍｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（０．０７２ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びチャコール（０．１ｇ）の溶液に数回に分けて添加した。得られた反応混合物を３０分間還流温度まで加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、セライトのショートパッドを通して濾過し、酢酸エチルで溶出させた。有機濾液を減圧下で濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、溶出液として（クロロホルム中２％メタノール）を用いたシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題の生成物を薄茶色の液体として得た（０．５ｇ、７０％）。

【0087】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．８２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．７８（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），３．６４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），５．０３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．１８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝２．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ：［ＭＨ］⁺３２０．０７ｍ／ｚ、純度１００％。

【0088】

Ｎ－（５－クロロ－２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）フェニル）－５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）フラン－２－カルボキサミド

【化15】

窒素雰囲気下、０℃の温度で、ジクロロメタン（８ｍＬ）中の５－クロロ－２－（４－（（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）メチル）－１，４－ジアゼパン－１－イル）アニリン（０．２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）溶液にトルエン中のトリメチルアルミニウム（０．９３ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）の２．０Ｍ溶液を滴下して添加した。この混合物を室温で１時間攪拌した後、ジクロロメタン（３ｍＬ）中のメチル５－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－２－フロエート（０．１３１ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液を室温、窒素雰囲気下に滴下して添加した。得られた反応混合物を室温で２１時間攪拌した。得られた反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３回）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。得られた原材料を、水中０．１％ギ酸及びアセトニトリルを移動相とする分取ＨＰＬＣにより精製して、表題の生成物（化合物３）を茶色固体として得た（０．０３５ｇ、１１．２４％）。

【0089】

Ｍｐ：１４８～１５０℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ₆）δ１．６７－１．７１（ｍ，２Ｈ），１．８７－１．９３（ｍ，４Ｈ），２．７６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０１－３．０４（ｍ，５Ｈ），３．４４（ｔｄ，Ｊ＝８，１１．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝２，１１．６Ｈｚ，２Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｄｄ，Ｊ＝０．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．８，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），９．６１（ｓ，１Ｈ）．
ＨＰＬＣ純度：９８．７０％
ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）：ｍ／ｚ Ｃ₂₆Ｈ₃₃ＣｌＮ₅Ｏ₃［ＭＨ］⁺に関する計算値：４９８．２３、実測値：４９８．１２

【0090】

インビトロキナーゼアッセイ
キナーゼアッセイは、³³Ｐ ＡＴＰを用いた放射性フィルター結合アッセイを用いてＭＲＣ Ｄｕｎｄｅｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｃｅｎｔｒｅによって実施された（Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ ２００６．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（２）：９６８－７１；Ｂａｉｎ，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００７ Ｄｅｃ １５；４０８（３）：２９７－３１５）。

【0091】

インビボ血管形成アッセイ：レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）プロトコル
５０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．５ｍｇ／ｋｇのメデトミジンの混合物の腹腔内注射によって、６～８週齢の雌のＣ５７／Ｂ６マウスに麻酔をかけた。５％塩酸フェニレフリン及び１％トロピカミドなどの散大剤を局所（点眼）適用することによって、瞳孔を直ちに散大させた。緑色Ｍｅｒｉｌａｓ５３２αレーザー（４５０ｍＷ、１３０ｍｓ）を用いて、各眼で１～２乳頭径の距離で、乳頭周囲分布において血管のないクリアスペースの「大きな」網膜血管の間に４つの光凝固病変が見られた。治療時に網膜下気泡のあるクリーンなレーザー病変のみが研究に含まれた。レーザー光凝固直後、動物に２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０６６μｇ／ｍＬの候補化合物、又は点眼製剤対照を表示通りに１日２回、局所点眼した（１０μＬ、動物が液滴を拭き取らないよう３０秒間眼を固定）。ＰＢＳ中１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース、０．２％チロキサポール、３．４％デキストロース、０．００６％塩化ベンザルコニウム及び０．０２５％エチレンジアミンテトラ酢酸と、１％ＤＭＳＯとを含有する初期眼製剤によって実験を実行し、そしてＰＢＳ中７％ポリオキシル４０ステアレート及び４％デキストロースを含有する第２の点眼製剤でデータを確認した。

【0092】

１週間後、５０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び０．５ｍｇ／ｋｇのメデトミジンの混合物の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけた。５％塩酸フェニレフリン及び１％トロピカミドなどの散大剤を局所（点眼）適用することによって、瞳孔を直ちに散大させた。マウスにナトリウムフルオレセイン（１０％）の腹腔内注射を行った。血管造影顕微鏡及びカメラを用いて、各病巣に焦点を合わせた位相差及び緑色蛍光眼底画像を撮影した。マウスをスケジュール１法で死亡させ、網膜剥離及びタンパク質抽出のために眼を未固定にするか、又は固定して核摘出を行い、脈絡膜を染色して検査した。

【0093】

ＶＥＧＦ₁₆₅ａ捕捉抗体によるＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
９６ウェルクリアマイクロプレート（高感度サーモイミュロン又はコスター９０１８）に、１ウェルあたり１０μｇ／ｍのＬＶＥＧＦ_xxxｂ又は０．２５μｇ／ｍＬの抗ｈＶＥＧＦ₁₆₅ａを１００μＬコーティングした。プレートをパラフィルムで密封し、室温のシェーカー上で一晩インキュベートした。各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液（２００μＬ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％）で２回、合計３回洗浄を行った。最後の洗浄後、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルにブロッティングすることにより、残った洗浄緩衝液を除去した。各ウェルに１００μＬの試薬希釈液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）を添加することによってプレートをブロッキングし、室温で２時間、シェーカーでインキュベートした。吸引／洗浄を繰り返した。各ウェルに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の標準品又は試料１００μＬを添加し、パラフィルムで覆い、室温で２時間インキュベートした。吸引／洗浄を繰り返し、試薬希釈液で希釈した１００ｎｇ／ｍＬの検出抗体（ＢＡＦ２９３）１００μＬを各ウェルに添加し、これをパラフィルムで覆い、室温で２時間インキュベートした。吸引／洗浄を繰り返し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰの作用希釈液（１：２００希釈）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬの基質溶液（ＤＹ９９９からの１：１のＡ：Ｂ）を各ウェルに添加し、室温で２０～６０分間インキュベートした。５０μＬの停止溶液（１Ｍ ＨＣｌ）を各ウェルに添加した。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの光学密度を直ちに測定した。

【0094】

メラニン結合アッセイ
１％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬの試験化合物を、１ｍｇ／ｍＬのメラニンと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次に、溶液を１５ｋｇで１５分間回転させ、上清を回収し、化合物をメタノール中に抽出した。その後、質量分析に供し、定量した。

【0095】

ウサギ薬物動態試験
ＰＢＳ中１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース、０．２％チロキサポール、３．４％デキストロース、０．００６％塩化ベンザルコニウム及び０．０２５％エチレンジアミンテトラ酢酸と、１％ＤＭＳＯとを含有する初期点眼製剤中８０μｇ／ｍｌ（最大溶解度限界）のパゾパニブ及び５００μｇ／ｍＬの化合物Ｒの単回５０μＬ点眼によって、又はＰＢＳ中７％ポリオキシル４０ステアレート及び４％デキストロースを含有する点眼製剤中５００μｇ／ｍＬの化合物１の単回５０μＬ点眼によってウサギを治療した。別々の試験で点眼製剤間の差異は確認されなかった。点眼後、指示された時点でウサギを死亡させ、採血、採眼し、網膜を脈絡膜及び強膜から剥離し、切開し、平らに置いた。網膜、ＲＰＥ／脈絡膜及び強膜の眼区画を７つの異なる領域に分解した。全ての試料の重量を測定した。網膜及び脈絡膜／強膜試料、並びに血漿から、上記と同様に逆相抽出により化合物を抽出し、眼の異なる領域及び血液中を質量分析により決定した。各試料について、化合物Ｒ、化合物１及びパゾパニブに関する組織１ミリグラム当たりの量を計算し、平均した。

【0096】

強膜透過性は、ＰＢＳ中１％ヒドロキシプロピルメチルセルロース、０．２％チロキサポール、３．４％デキストロース、０．００６％塩化ベンザルコニウム及び０．０２５％エチレンジアミンテトラ酢酸と、１％ＤＭＳＯとを含有する初期点眼製剤（ｐＨ７．４）中、修正ウジング（Ｕｓｓｉｎｇ）チャンバーアセンブリを用いて測定された。ブタの摘出眼組織を、上強膜側がドナーチャンバーに、網膜側がレシーバーチャンバーに面するようにチャンバー内に装着した。ドナー側には１０μｇ／ｍＬの化合物を、レシーバー側には１０μｇ／ｍＬの化合物を含まない等容積の点眼製剤をチャンバーに充填した。２４時間後、チャンバーから組織を取り出し、レシーバー側（「硝子体」）をサンプリングした。組織は強膜、脈絡膜／ＲＰＥ、及び網膜に分解され、均質化された。Ｂａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）に記載されているように、トレーサー（ＳＰＨＩＮＸ７；国際公開第２０１５／１５９１０３号パンフレット）を添加し、アセトニトリル抽出により組織を抽出した。その後、Ｂａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）に記載されているように、質量分析によって化合物を分析した。

【0097】

非ヒト霊長類薬物動態試験
ＰＢＳ中７％ポリ－オキシル－４０－ステアレート及び４％デキストロースを含有する点眼剤中０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ又は１．５ｍｇ／ｍｌの化合物１を３５μＬ点眼することによってカニクイザルを２０日間、隔日治療した。１日目の点眼投薬から１時間、４時間、８時間、１０時間及び１４時間後、並びに試験終了時に血液及び水性試料を採取した。２１日目の最終点眼から１時間後に動物を安楽死させ、眼組織及び血液を採取した。網膜を脈絡膜及び強膜から剥離し、切開し、平らに置いた。網膜、ＲＰＥ／脈絡膜及び強膜の眼区画を７つの異なる領域に分解した。全ての試料の重量を測定した。網膜及び脈絡膜／強膜試料、並びに血漿から、上記と同様に逆相抽出により化合物を抽出し、眼の異なる領域及び血液中を質量分析により決定した。各試料について、組織１ミリグラム当たりの量、又は水溶液及び血液のｎＭを計算し、平均した。

【0098】

眼の半分からサンプリングした網膜切片を、Ｇａｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１３に記載のようにＮＰ４０溶解緩衝液中で均質化した。次いで、抽出物を、ウサギ抗－ｐａｎＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａ２０ｓｃ－１５２；１：５００）又はマウス抗－ＶＥＧＦ₁₆₅ｂ（ＭＡＢ３０４５；Ｒ＆Ｄ；１：５００）のいずれかを用いてイムノブロットした。

【0099】

結果
以下の実施例は本発明を実証するものである。本発明の化合物は、強力なＳＲＰＫ１阻害剤であり、高い眼透過性を有する。

【0100】

我々は、高い効力（ＩＣ₅₀＜１０^-8Ｍ）を有し、脈絡膜血管新生のマウスモデルにおいて抗血管形成性であり、強膜を通してウサギの脈絡膜及び網膜色素上皮層に浸透することができるＳＲＰＫ１阻害剤を生成することができることを以前に決定している。有効な局所治療薬の開発には、眼内への分子の浸透性を最大化することが重要であると考えた。本発明の化合物は、国際公開第２０１４／０６０７６３号パンフレット及び国際公開第２０１７／０６４５１２号パンフレットに記載の化合物よりも改善された特性を有し、抗血管形成ＶＥＧＦアイソフォームの過剰発現に依存する眼血管新生及び透過性亢進障害の局所治療に有用である。

【実施例】

【0101】

透過性
化合物がより大きな動物の強膜を通過できるかどうかを決定するために、ブタの強膜を２つのチャンバー間で固定し、下のチャンバーに点眼製剤を添加し、上のチャンバーに化合物を添加して、化合物を強膜に添加した。２４時間後、下のチャンバーからの液体（硝子体）及び網膜組織を分離し、メタノール又はアセトニトリル抽出及びＨＰＬＣによって化合物を精製した。これにより、高浸透性及び高い効力を併せ持つ化合物を生成できることは明らかになった。特に、本発明の新規化合物（化合物１～３に関して示されたもの）は、ＳＰＨＩＮＸ３１の透過性よりもはるかに高い驚くべき高い透過性を有し（図１；表１）、依然として高い効力を有することが明らかであった（表２）。これは、ピラゾール上のメチル基を欠いた化学的に類似した化合物、例えば上述の化合物Ｒが有意に低い透過性を有していたことから、特に驚くべきことであった（図１）。さらに、本発明の化合物はまた、以前にＶＥＧＦＲ２を介してＶＥＧＦシグナルを阻害することが示されているが曝露不足のために臨床試験で失敗した化合物（パゾパニブ、レゴラフェニブ、ＬＨＡ５１０）よりも実質的に浸透性が高く、局所点眼剤として有効に使用されているが前部に作用する化合物（インドメタシン、セレコキシブ）よりも大きい－図１を参照のこと。

【表1】

メラニン結合は、眼内での化合物のバイオアベイラビリティに重要であることが提唱されている。本発明の化合物のメラニン結合を測定し、抗血管形成剤として試みられてきた以前のＳＲＰＫ１阻害剤（ＳＰＨＩＮＸ３１；国際公開第２０１５／１５９１０３号パンフレット、及び化合物Ｒ）、並びに以前のＶＥＧＦＲ２阻害剤よりもメラニンへの結合が大幅に少ないことが決定された（図２）。

【0102】

化合物が大きな眼を有する動物のＲＰＥに接近することができるかどうかを決定するために、点眼によってウサギを５００ｇ／ｍＬの化合物に曝露し、網膜、強膜、硝子体及び他の眼組織（角膜）；水晶体；ＲＰＥ／脈絡膜における濃度を測定した（図３ａ）。１、４、１２、又は２４時間後に動物を死亡させ、眼を採取した。次に、角膜（１００）、水晶体（１０２）、及び硝子体（１１０）の個々の切片、並びに眼の後方部分からの強膜（１０８）、ＲＰＥ／脈絡膜（１０６）及び網膜（１０４）の切片を化合物に関してアッセイをした。本発明の化合物に関して、網膜の浸透は見られた。化合物１に関して得られた結果を図３ａ及び３ｂに示す。透過性は、ＳＰＨＩＮＸ３１などの以前に研究されたＳＲＰＫ１阻害剤の透過性よりも優れており、化合物Ｒなどの化学的に類似した分子よりも優れた持続的透過性（例えば、４時間）を有していた（図４）。

【0103】

ＳＲＰＫ１選択性
ＳＲＰＫ１に対する本発明の化合物の阻害活性を測定し、データを表２に示す。全ての化合物は、ＳＰＲＫ１の強力な阻害剤であり、１μＭでキナーゼのパネルに対して試験した場合、ＳＲＰＫ１に対して高い選択性を有していた。

【表2】

【0104】

化合物１は、ヒト細胞において抗血管形成アイソフォームへの発現をスイッチする。
化合物１はＶＥＧＦアイソフォームのスプライシングをスイッチすることができるかどうかを決定するために、アイソフォーム特異的ＥＬＩＳＡによって網膜色素上皮細胞中のＶＥＧＦを測定した。図５は、化合物１による治療は、投与量依存的に血管新生促進性ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ａアイソフォームの発現を減少させることを示す。

【0105】

化合物１は、ラット糖尿病性網膜症モデルにおいて、血管新生促進性ＶＥＧＦアイソフォームから発現をスイッチする。
化合物１は糖尿病モデルにおいてＶＥＧＦのスプライシングを効果的にスイッチすることができるかどうかを決定するために、ノルウェーブラウン（Ｎｏｒｗａｙ Ｂｒｏｗｎ）ラットの糖尿病のＳＴＺモデルを使用した。糖尿病動物に化合物１を１日２回４週間点眼治療し、死亡させ、網膜を剥離した。タンパク質を抽出し、ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂ及びｐａｎＶＥＧＦのイムノブロットに供した。図６ａ～図６ｄは、糖尿病動物において、健常ラットと比較して、総ＶＥＧＦは増加しているが、ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂは低下しており、これは化合物１による治療によって逆転したことを示している。

【0106】

化合物１は、インビボで脈絡膜血管新生を阻害する。
我々は以前に、ＳＰＨＩＮＸ３１によるＳＲＰＫ１阻害が、脈絡膜血管新生のマウスモデルにおいて、２μｇ／ｍｌで最大の効果を有する点眼剤として、これらの化合物が比較的親油性で眼内への浸透性が高いことから、抗血管形成性であることを示した。したがって、この同一モデルで点眼薬としての化合物１の効果を試験した。化合物１は、０．０６６μｇ／ｍＬで脈絡膜血管新生を有意に阻害した（図７ｂ）。

【0107】

化合物１は、非ヒト霊長類において有効量で浸透する。
化合物１は霊長類の網膜に浸透することができるかどうかを決定するために、０．５、１．０又は１．５ｍｇ／ｍＬの化合物１を１日２回、２１日間、カニクイザルに投与した。図８は、霊長類の網膜においても、網膜、脈絡膜、硝子体及びその他の眼の組織において、マウスモデルに基づく有効性に必要な濃度よりもはるかに高い濃度で化合物１の有意な濃度が見られたことを示す（図８ａ及び図８ｂ）。治療中に水滴及び血漿を採取し、液体中の化合物１を測定した。３つの投与全てにおいて有意な濃度が見られ、水中での半減期は１．５ｍｇ／ｍＬの投薬後２時間であると算出された（図９）。これらの投与量は、血管形成ＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム発現を阻害するのに十分であるかどうかを決定するために、網膜組織を、ｐａｎ－ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。図１０ａは、化合物１によって点眼治療したサルにおいて、網膜のＶＥＧＦレベルが変化することを示し、図１０ｂは、３週間の隔日投与後に総ＶＥＧＦレベルは減少し、ＶＥＧＦ－Ａ₁₆₅ｂレベルは減少せず、１ｍｇ／ｍｌで増加することを示し、そして図１０ｃは、化合物１を投与したサルの網膜で血管形成性ＶＥＧＦ－Ａと抗血管形成性ＶＥＧＦ－Ａとの比率が減少することを示す。

【0108】

参考文献
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Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．，Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ｓ．ａｎｄ Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ｚ．（１９９９）‘Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ’，Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ，１３（１），９－２２．

Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．，Ｃｕｉ，Ｔ．Ｇ．，Ｄｏｕｇｈｔｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｏｎｏ，Ｍ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｅａｔ，Ｄ．，Ｇｉｌｌａｔｔ，Ｄ．ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．（２００２）‘ＶＥＧＦ（１６５）ｂ，ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｉｓ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ’，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２（１４），４１２３－４１３１．

Ｗｏｏｌａｒｄ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ｂｅｖａｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ－Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｕｉ，Ｔ．Ｇ．，Ｓｕｇｉｏｎｏ，Ｍ．，Ｗａｉｎｅ，Ｅ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｄｉｇｂｙ－Ｂｅｌｌ，Ｊ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｗｈｉｔｔｌｅｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｕｓｈｅｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｉｌｌａｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｚｉｃｈｅ，Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２００４）‘ＶＥＧＦ（１６５）ｂ，ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ’，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４（２１），７８２２－７８３５．

Ｐｅｒｒｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｎｏｐａｔｓｋａｙａ，Ｏ．，Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．（２００５）‘Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｎｔｉ－ ｔｏ ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ’，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４８（１１），２４２２－２４２７．

Ｖａｒｅｙ，Ａ．Ｈ．Ｒ．，Ｒｅｎｎｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｂｅｖａｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｒａｆｆｙ，Ｓ．，Ｄｉｘｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｐａｒａｓｋｅｖａ，Ｃ．，Ｚａｃｃｈｅｏ，Ｏ．，Ｈａｓｓａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２００８）‘ＶＥＧＦ（１６５）ｂ，ａｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＶＥＧＦ－Ａ ｉｓｏｆｏｒｍ，ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏ－ ａｎｄ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＶＥＧＦ－Ａ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｈａｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ’，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９８（８），１３６６－１３７９．

Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ－Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｄｕｎｎ，Ｄ．Ｂ．Ａ．，Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｖａｒｅｙ，Ａ．Ｈ．Ｒ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ａ．，Ｒｉｇｂｙ，Ｈ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２００７）‘Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ（ｘｘｘ）ｂ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ＶＥＧＦ，ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ’，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９７（２），２２３－２３０．

Ｈｕａ，Ｊ．，Ｓｐｅｅ，Ｃ．，Ｋａｓｅ，Ｓ．，Ｒｅｎｎｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ，Ａ．Ｌ．，Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｖａｒｅｙ，Ａ．，Ｄｈａｙａｄｅ，Ｓ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．ａｎｄ Ｈｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２０１０）‘Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（１６５）ｂ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ’，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１（８），４２８２－４２８８．

Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ，Ａ．Ｌ．，Ｒｅｎｎｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｈｕａ，Ｊ．，Ｂｅｖａｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｌｏｎｇ，Ｎ．Ｂ．，Ｌｅｈｒｌｉｎｇ，Ｃ．，Ｇａｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｆｌｏｅｇｅ，Ｊ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ａｇｏｓｔｉｎｉ，Ｈ．Ｔ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．（２０１０）‘ＶＥＧＦ－Ａ（１６５）ｂ Ｉｓ Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａ’，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１（８），４２７３－４２８１．

Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｒｉｃｈ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｌａｌｗａｎｉ，Ｇ．Ａ．（２００６）‘Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ： Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ’，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，１９（３），３６１－７２．

Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｐ．Ｋ．，Ｍｉｃｈｅｌｓ，Ｍ．，Ｓｏｕｂｒａｎｅ，Ｇ．，Ｈｅｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｒ．Ｙ．，Ｓｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｇｒｐ，Ａ．Ｓ．（２００６）‘Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ’，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５５（１４），１４３２－１４４４．

Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｉｃｈｅｌｓ，Ｍ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｐ．Ｋ．，Ｈｅｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｙ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ Ｉａｎｃｈｕｌｅｖ，Ｔ．（２００９）‘Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： Ｔｗｏ－Ｙｅａｒ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＮＣＨＯＲ Ｓｔｕｄｙ’，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１６（１），５７－６５．

Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｅｒｆｕｒｔｈ，Ｕ．，Ｅｌｄｅｍ，Ｂ．，Ｇｕｙｍｅｒ，Ｒ．，Ｋｏｒｏｂｅｌｎｉｋ，Ｊ．－Ｆ．，Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ，Ｒ．Ｏ．，Ａｘｅｒ－Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｐ．，Ｓｉｍａｄｅｒ，Ｃ．，Ｇｅｋｋｉｅｖａ，Ｍ．，Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｐ，Ｅ．Ｓ．（２０１１）‘Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｔｈｌｙ ｖｅｒｓｕｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： Ｔｈｅ ＥＸＣＩＴＥ Ｓｔｕｄｙ’，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１８（５）．

Ｇｏｏｄ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｋａｈｏｏｋ，Ｍ．Ｙ．（２０１０）‘Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｌａｕｃｏｍａ’，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，１４（６），６４７－６５４．

Ｊａｇｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｐ．，Ｐａｔｅｌ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｅ．Ｔ．（２００４）‘Ｒｉｓｋｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ： Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ’，Ｒｅｔｉｎａ－ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｖｉｔｒｅｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２４（５），６７６－６９８．

Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｇ．，Ａｍｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｒｅｎｎｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｈｏａｒｅａｕ－Ａｖｅｉｌｌａ，Ｃ．，Ｇａｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｄａｍｏｄｏｒａｎ，Ｇ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｗｏｏｌａｒｄ，Ｊ．，Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２０１０）‘Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｏ Ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５（８），５５３２－５５４０．

Ａｍｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｏｌｔｅａｎ，Ｓ．，Ｈｕａ，Ｊ．，Ｇａｍｍｏｎｓ，Ｍ．Ｖ．Ｒ．，Ｈａｍｄｏｌｌａｈ－Ｚａｄｅｈ，Ｍ．，Ｗｅｌｓｈ，Ｇ．Ｉ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｍ．－Ｋ．，Ｎｉ，Ｌ．，Ｋａｓｅ，Ｓ．，Ｒｅｎｎｅ，Ｅ．Ｓ．，Ｓｙｍｏｎｄｓ，Ｋ．Ｅ．，Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｇ．，Ｒｏｙｅｒ－Ｐｏｋｏｒａ，Ｂ．，Ｓａｌｅｅｍ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｖ．Ａ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．ａｎｄ Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｒ．（２０１１）‘ＷＴ１ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌ ＳＲＰＫ１ ｔｏ Ｂｅ ａ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔ ｂｙ Ａｌｔｅｒｉｎｇ ＶＥＧＦ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ’，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０（６），７６８－７８０．

Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｚａｌｌａ，Ｄ．ａｎｄ Ｃａｃｅｒｅｓ，Ｊ．Ｆ．（２００５ａ）‘Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｕｎｃｔｏｎｓ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ２／ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０２（４２），１５０４２－１５０４７．

Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｇ．，Ｗｏｏｌａｒｄ，Ｊ．，Ａｍｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｋｏｎｏｐａｔｓｋａｙａ，Ｏ．，Ｓａｌｅｅｍ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２００８）‘Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏ－ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２１（２０），３４８７－３４９５．
Ｄｏｕｋａｓ，Ｊ．，Ｍａｈｅｓｈ，Ｓ．，Ｕｍｅｄａ，Ｎ．，Ｋａｃｈｉ，Ｓ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｙｏｋｏｉ，Ｋ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｄｅｌｌａｍａｒｙ，Ｌ．，Ｔａｍ，Ｂ．，Ｒａｃａｎｅｌｌｉ－Ｌａｙｔｏｎ，Ａ．，Ｈｏｏｄ，Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｎｈａ，Ｇ．，Ｓｏｌｌ，Ｒ．ａｎｄ Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｐ．Ａ．（２００８）‘Ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｅｄｅｍａ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２１６（１），２９－３７．

Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｔ．，Ｈｏｓｏｙａ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．，Ｓｕｍｉ，Ｋ．，Ｏｓｈｉｒｏ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｎａｋａ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．（２００６）‘Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ＳＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｄｕｒｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０３（３０），１１３２９－１１３３３．

Ｒｅｎｎｅｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｒｅｇｕｌａ，Ｊ．Ｔ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２０１１）‘Ａ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ａｎｇ－２ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｏｃｕｌａｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ’，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１８（７）．

Ａｕｂｏｌ，Ｂ．Ｅ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．，Ｎｇｏ，Ｊ．，Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ．，Ｎｏｌｅｎ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｘ．Ｄ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｇ．ａｎｄ Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．（２００３）‘Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ２’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１００（２２），１２６０１－１２６０６．

Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ－Ｄｏｎｅｓ，Ａ．，Ｈａｇｏｐｉａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｍａ，Ｃ．Ｔ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｌ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｇ．，Ｆｕ，Ｘ．Ｄ．ａｎｄ Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．（２００５）‘Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＳＦ／ＳＦ２ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＳＲＰＫ１ ａｎｄ Ｃｌｋ／Ｓｔｙ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８０（５０），４１７６１－４１７６８．

Ｎｇｏ，Ｊ．Ｃ．Ｋ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．，Ｄｉｎｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ－Ｄｏｎｅｓ，Ａ．，Ｎｏｌｅｎ，Ｂ．，Ａｕｂｏｌ，Ｂ．Ｅ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｆｕ，Ｘ．Ｄ．ａｎｄ Ｇｈｏｓｈ，Ｇ．（２００５）‘Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＲＰＫ ａｎｄ Ｃｌｋ／Ｓｔｙ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＡＳＦ／ＳＦ２ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｃｋｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＡＳＦ／ＳＦ２’，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，２０（１），７７－８９．

Ｘｕ，Ｊ．，Ｄｏｕ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｆｕ，Ｍ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｇｕ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．ａｎｄ Ｘｉｅ，Ｙ．（２０１１）‘Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｘｏｎｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ’，Ｇｅｎｅ，４８７（２）．

Ｃａｉｒｅｓ，Ｋ．Ｃ．，ｄｅ Ａｖｉｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｕｐｐ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＬｅａｎ，Ｄ．Ｊ．（２０１２）‘ＶＥＧＦＡ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｓｏｆｏｒｍｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ｖｉｖｏ’，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５３（２）．

Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｌｉａｎｇ，Ｊ．，Ｍｉａｏ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｘ．（２０１１）‘Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏ－ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ’，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９３（６），９２１－９２６．

Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．，Ｃｒａｚｅ，Ｍ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｊ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．，Ｓｈｉｍａ，Ｄ．Ｔ．，Ｔｏｚｅｒ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｋａｎｔｈｏｕ，Ｃ．（２０１２）‘Ｄｏ Ａｎｔｉ－Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ_xxxｂ）Ｉｓｏｆｏｒｍｓ Ｅｘｉｓｔ？ Ａ Ｃａｕｔｉｏｎａｒｙ Ｔａｌｅ’，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，７（５）．

ＭｃＦｅｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｏｚｅｌｌ，Ｔ．Ｇ．ａｎｄ Ｃｕｐｐ，Ａ．Ｓ．（２０１２）‘Ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＶＥＧＦＡ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４９（３）．

Ｉｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｕｓｕｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，Ｋａｊｉ，Ｙ．，Ａｍａｎｏ，Ｓ．，Ｏｇｕｒａ，Ｙ．，Ｈｉｄａ，Ｔ．，Ｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ａｍｂａｔｉ，Ｊ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｒａｇｏｕｄａｓ，Ｅ．Ｓ．，Ｎｇ，Ｙ．Ｓ．，Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．，Ｓｈｉｍａ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ Ａｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．（２００３）‘ＶＥＧＦ（₁₆₄）－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８（３），４８３－４８９．

Ｇｅｒｏｓｋｉ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ Ｅｄｅｌｈａｕｓｅｒ，Ｈ．Ｆ．（２０００）‘Ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ’，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４１（５），９６１－９６４．

Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｖ．，Ｂｅｒｌｅａｕ，Ｌ．Ｔ．，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．（１９９６）‘Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ＫＤＲ ａｎｄ ＦＬＴ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ － Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＶＥＧＦ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（１０），５６３８－５６４６．

Ｓｔａｌｍａｎｓ，Ｉ．，Ｎｇ，Ｙ．Ｓ．，Ｒｏｈａｎ，Ｒ．，Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｍ．，Ｂｏｕｃｈｅ，Ａ．，Ｙｕｃｅ，Ａ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｈ．，Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｂ．，Ｓｈａｎｉ，Ｍ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．，Ｈｉｃｋｌｉｎ，Ｄ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｔ．，Ｈａｍｍｅｓ，Ｈ．Ｐ．，Ｍｏｏｎｓ，Ｌ．，Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎ，Ｍ．，Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．（２００２）‘Ａｒｔｅｒｉｏｌａｒ ａｎｄ ｖｅｎｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＶＥＧＦ ｉｓｏｆｏｒｍｓ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０９（３）．

Ｇａｍｍｏｎｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｄｉｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２０１３）ＳＲＰＫ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ＶＥＧＦ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ Ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．５４（８）５７９７－５８０６．

Ｇａｍｍｏｎｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ，Ｏ．，Ｉｖｉｓｏｎ，Ｄ．，Ｄｕ，Ｃ．，Ｃｌａｒｋ，Ｔ．，Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｃ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｍ．，Ｄｉｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ｃｏｘ，Ｒ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｎｃｏｘ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．（２０１３）Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＳＲＰＫ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｒｅｄｕｃｅ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ＡＭＤ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４（９）６０５２－６０６２．

Ｆｅｄｅｒｏｖ Ｏ，Ｎｉｅｓｅｎ ＦＨ，Ｋｎａｐｐ Ｓ．Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ．Ｉｎ： Ｋｕｓｔｅｒ Ｂ，ｅｄ．Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１１：１０９－１８．

Ｃａｒｔｅｒ ＪＧ，Ｇａｍｍｏｎｓ ＭＶ，Ｄａｍｏｄａｒａｎ Ｇ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ ＡＪ，Ｈａｒｐｅｒ ＳＪ，Ｂａｔｅｓ ＤＯ．（２０１５）Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ＶＥＧＦ－Ａ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １８（１），２３－３０．

Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｑｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｐｈｅｎｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２： １５６－１５９，１９８７．

Ｂａｔｓｏｎ，Ｊ．，Ｔｏｏｐ，Ｈ．Ｄ．，Ｒｅｄｏｎｄｏ，Ｃ．，Ｂａｂａｅｉ－Ｊａｄｉｄｉ，Ｒ．，Ｃｈａｉｋｕａｄ，Ａ．，Ｗｅａｒｍｏｕｔｈ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｂ．，Ａｌｌｅｎ，Ｃ．，Ｔａｌｌａｎｔ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｄｕ，Ｃ．，Ｈａｎｃｏｘ，Ｊ．Ｃ．，Ｈａｗｔｒｅｙ，Ｔ．，Ｄａ Ｒｏｃｈａ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｒ．，Ｋｎａｐｐ，Ｓ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＳＲＰＫ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１７，１２，８２５－８３２．

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【国際調査報告】