特表 2023-535225 改変ヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-16

(54)【発明の名称】改変ヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20230808BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20230808BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230808BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230808BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20230808BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20230808BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230808BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230808BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20230808BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20230808BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20230808BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20230808BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K9/51

A61K9/14

A61K47/18

A61P37/04

A61P43/00 105

A61P35/00

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/10

A61K47/68

A61K47/62

A61K47/65

C12N15/24 ZNA

C12N15/88 Z

A61K38/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023505388

(86)(22)【出願日】2021-07-26

(85)【翻訳文提出日】2023-03-23

(86)【国際出願番号】 US2021043214

(87)【国際公開番号】W WO2022020811

(87)【国際公開日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】63/056,382

(32)【優先日】2020-07-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523026950

【氏名又は名称】ストランド セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ベクラフト， ジェイコブ

(72)【発明者】

【氏名】ソーウェル， ライアン

(72)【発明者】

【氏名】クラナ， ジャスプリート

(72)【発明者】

【氏名】北田 輔

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA30

4C076AA65

4C076AA94

4C076BB02

4C076BB11

4C076BB12

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB31

4C076CC07

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD09

4C076DD52

4C076DD52A

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE59

4C076EE59M

4C076FF02

4C076FF31

4C084AA13

4C084BA44

4C084DA12

4C084MA05

4C084MA38

4C084MA43

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA07

4C084NA12

4C084NA13

4C084ZB021

4C084ZB091

4C084ZB211

4C084ZB261

(57)【要約】

本開示は、（ｉ）１種または複数種の脂質、および（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む改変ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、脂質ナノ粒子が、免疫原性細胞死を誘発することができる、脂質ナノ粒子、ならびにそれを使用する処置方法に関する。一部の態様では、改変ＲＮＡは、半減期延長部分をさらに含む。一部の態様では、半減期延長部分は、Ｆｃ、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＸＴＥＮ、またはそれらの任意の組合せを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）１種または複数種の脂質、および（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む改変ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、前記脂質ナノ粒子が、免疫原性細胞死を誘発することができる、脂質ナノ粒子。

【請求項2】

前記１種または複数種の脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項3】

前記カチオン性脂質が、式Ｉ：

【化5】

の化合物およびその塩であり、式中、各Ｒ^１は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^２は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^３は、独立して、水素、または置換もしくは無置換アルキルであり、各ｍは、独立して、３、４、５、６、７、または８である、
請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項4】

少なくとも１つのＲ^１が、Ｃ_１１Ｈ_２３である、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項5】

少なくとも１つのＲ^３が、水素である、請求項３または４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項6】

少なくとも１つのｍが、３である、請求項３～５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項7】

各Ｒ^１が、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^２が、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^３が、水素であり、各ｍが、３である、請求項３～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項8】

前記カチオン性脂質が、構造：

【化6】

を有するＮ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）およびその塩であり、式中、ｍは、３である、
請求項２～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項9】

ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項10】

前記改変ＲＮＡが、改変５’－キャップを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項11】

前記改変５’－キャップが、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと等価に指定され得る）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項12】

前記改変ＲＮＡが、環状ＲＮＡである、請求項１～９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項13】

前記改変ＲＮＡが、半減期延長部分をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項14】

前記半減期延長部分が、Ｆｃ、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＸＴＥＮ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項15】

前記ＩＬ－１２分子が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２サブユニット、または免疫調節機能を保持する変異体ＩＬ－１２分子からなる群より選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項16】

前記ＩＬ－１２が、配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項17】

前記ＩＬ－１２分子が、ＩＬ－１２αサブユニットおよび／またはＩＬ－１２βサブユニットを含む、請求項１６に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項18】

前記ＩＬ－１２αサブユニットが、配列番号２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項19】

前記ＩＬ－１２βサブユニットが、配列番号３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項20】

前記ＩＬ－１２αサブユニットおよび前記ＩＬ－１２βサブユニットが、リンカーによって連結されている、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項21】

前記リンカーが、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、または少なくとも約２０アミノ酸のアミノ酸リンカーを含む、請求項２０に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項22】

前記リンカーが、（ＧＳ）リンカーを含む、請求項２１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項23】

前記ＧＳリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式を有し、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または１００からなる群より選択される正の整数である、請求項２２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項24】

前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項25】

前記ＩＬ１２分子が、配列番号４または配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項26】

前記改変ｍＲＮＡが、配列番号６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項27】

前記改変ＲＮＡが、配列番号７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項28】

前記改変ＲＮＡが、調節エレメントをさらに含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項29】

前記調節エレメントが、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位またはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項30】

連結ヌクレオシドの前記３’テーリング領域が、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、またはステムループ配列を含む、請求項２９に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項31】

前記改変ＲＮＡが、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項32】

前記少なくとも１つの改変ヌクレオシドが、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、プソイド－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、プソイド－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、５－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項33】

前記改変ＲＮＡが、配列番号８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項34】

前記改変ＲＮＡが、配列番号９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項35】

約３０～５００ｎｍの直径を有する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項36】

約５０～４００ｎｍの直径を有する、請求項１～３５のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。

【請求項37】

約７０～３００ｎｍの直径を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項38】

約１００～２００ｎｍの直径を有する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項39】

約１００～１７５ｎｍの直径を有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項40】

約１００～１２０ｎｍの直径を有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項41】

前記脂質ナノ粒子および前記改変ＲＮＡが、約１：２～約２：１の質量比を有する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項42】

前記脂質ナノ粒子および前記改変ＲＮＡが、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１．１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．５：１、または２：１の質量比を有する、請求項４１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項43】

前記脂質および前記改変ＲＮＡが、約１：１の質量比を有する、請求項４２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項44】

請求項１～４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項45】

前記医薬組成物が、腫瘍内、髄腔内、筋肉内、静脈内、皮下、吸入、皮内、リンパ内、眼内、腹腔内、胸膜内、脊髄内、血管内、鼻、経皮、舌下、粘膜下、経皮的、または経粘膜投与のために製剤化されている、請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

がんの処置を必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、有効量の請求項１～４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子または請求項４４もしくは４５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項47】

前記対象が、がんを有するか、またはがんを有すると疑われるヒト患者である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ヒト患者が、黒色腫、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌、胃がん、および頭頸部がんからなる群より選択されるがんを有する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記脂質ナノ粒子または前記医薬組成物が、単回用量で前記対象に投与される、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記医薬組成物が、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって前記対象に投与される、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年７月２４日に出願された米国仮出願第６３／０５６，３８２号の優先権の利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への言及
電子的に提出された配列表（名称：４５９７＿００４ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：２８，６３３バイト；および作成日：２０２１年７月２１日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化するその能力に起因して、ＩＬ１２タンパク質は、１９９４年以後、前途有望な抗がん治療薬として研究されている。Nastala, C. L. et al., J Immunol 153: 1697-1706 (1994)を参照されたい。しかし、高い期待にもかかわらず、初期臨床研究は、満足な結果を与えなかった。Lasek W. et al., Cancer Immunol Immunother 63: 419-435, 424 (2014)。ＩＬ１２の反復投与は、ほとんどの患者において、適応応答、および血液中のＩＬ１２誘導インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルの進行性の減少をもたらした。同上。また、ＩＬ１２誘導抗がん活性が、ＩＦＮγの二次分泌によって主に媒介されることが認識されたが、ＩＬ１２による他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α）またはケモカイン（ＩＰ－１０またはＭＩＧ）と併せたＩＦＮ－γの同時誘導は、重篤な毒性を引き起こした。同上。
負のフィードバックおよび毒性に加えて、臨床背景におけるＩＬ１２療法のわずかな有効性は、ヒトにおける強い免疫抑制環境によって引き起こされ得る。同上。ＩＦＮ－γの毒性を最小化し、ＩＬ１２の有効性を改善するために、科学者らは、ＩＬ１２療法に対する異なる用量および時間プロトコールなどの異なるアプローチを試みた。Sacco, S. et al., Blood 90: 4473-4479 (1997)；Leonard, J. P. et al., Blood 90: 2541-2548 (1997)；Coughlin, C. M. et al., Cancer Res. 57: 2460-2467 (1997)；Asselin-Paturel, C. et al., Cancer 91: 113-122 (2001)；およびSaudemont, A. et al., Leukemia 16: 1637-1644 (2002)を参照されたい。それにもかかわらず、これらのアプローチは、患者の生存に顕著な影響を及ぼさなかった。Kang, W. K., et al., Human Gene Therapy 12: 671-684 (2001)。そのため、ＩＬ１２を使用して腫瘍を処置するための改善された治療アプローチに対する当技術分野における必要性が存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ａｓｓｅｌｉｎ－Ｐａｔｕｒｅｌ，Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ（２００１）９１：１１３～１２２

【非特許文献2】Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ，Ａ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２００２）１６：１６３７～１６４４

【非特許文献3】Ｋａｎｇ，Ｗ．Ｋ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００１）１２：６７１～６８４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の簡潔な概要
本開示は、（ｉ）１種または複数種の脂質、および（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む改変ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子であって、脂質ナノ粒子が、免疫原性細胞死を誘発することができる、脂質ナノ粒子を提供する。一部の態様では、１種または複数種の脂質は、カチオン性脂質を含む。一部の態様では、カチオン性脂質は、式Ｉ：

【化1】

の化合物およびその塩［式中、各Ｒ^１は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^２は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^３は、独立して、水素、または置換もしくは無置換アルキルであり、各ｍは、独立して、３、４、５、６、７、または８である］である。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^１は、Ｃ_１１Ｈ_２３である。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、水素である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、３である。

【0006】

一部の態様では、カチオン性脂質は、構造：

【化2】

を有するＮ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）およびその塩［式中、ｍは、３である］である。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む。

【0007】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、改変５’－キャップを含む。一部の態様では、改変５’－キャップは、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと等価に指定され得る）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0008】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、環状ＲＮＡである。

【0009】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、半減期延長部分をさらに含む。一部の態様では、半減期延長部分は、Ｆｃ、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＸＴＥＮ、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0010】

一部の態様では、ＩＬ－１２分子は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２サブユニット、または免疫調節機能を保持する変異体ＩＬ－１２分子からなる群より選択される。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２分子は、ＩＬ－１２αサブユニットおよび／またはＩＬ－１２βサブユニットを含む。一部の態様では、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の態様では、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、リンカーによって連結されている。一部の態様では、リンカーは、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、または少なくとも約２０アミノ酸のアミノ酸リンカーを含む。一部の態様では、リンカーは、（ＧＳ）リンカーを含む。一部の態様では、ＧＳリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または１００からなる群より選択される正の整数である］を有する。一部の態様では、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。

【0012】

一部の態様では、ＩＬ１２分子は、配列番号４または配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、改変ｍＲＮＡは、配列番号６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0013】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、調節エレメントをさらに含む。一部の態様では、調節エレメントは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位またはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一部の態様では、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域は、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、またはステムループ配列を含む。

【0014】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む。一部の態様では、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、プソイド－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、プソイド－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、５－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0015】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0016】

一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約３０～５００ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約５０～４００ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約７０～３００ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約１００～２００ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約１００～１７５ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約１００～１２０ｎｍの直径を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子および改変ＲＮＡは、約１：２～約２：１の質量比を有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子および改変ＲＮＡは、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１．１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．５：１、または２：１の質量比を有する。一部の態様では、脂質および改変ＲＮＡは、約１：１の質量比を有する。

【0017】

本開示は、本明細書に開示される脂質ナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。一部の態様では、医薬組成物は、腫瘍内、髄腔内、筋肉内、静脈内、皮下、吸入、皮内、リンパ内、眼内、腹腔内、胸膜内、脊髄内、血管内、鼻、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、舌下、粘膜下、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、または経粘膜投与のために製剤化されている。

【0018】

本開示は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、有効量の本明細書に開示される脂質ナノ粒子または医薬組成物を対象に投与することを含む、方法も含む。一部の態様では、対象は、がんを有するか、またはがんを有すると疑われるヒト患者である。一部の態様では、ヒト患者は、黒色腫、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん（cervical cancer）、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌、胃がん、および頭頸部がんからなる群より選択されるがんを有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子または医薬組成物は、単回用量で対象に投与される。一部の態様では、医薬組成物は、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって対象に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１Ａは、自己複製性ｍＲＮＡおよび改変ＲＮＡの間のＩＬ－１２発現レベルを示す。Ｙ軸は、Ｂ１６．Ｆ１０細胞系における発現レベルを示し、Ｘ軸は、トランスフェクション後の時間を示す。図１Ｂは、自己複製性ｍＲＮＡおよび改変ＲＮＡの間のＩＬ－１２発現レベルを示す。Ｙ軸は、４Ｔ１細胞系における発現レベルを示す。

【0020】

【図2】図２Ａは、処置することが非常に困難なマウスモデルにおける改変ＲＮＡおよび自己複製性ＲＮＡの有効性（腫瘍サイズ）を示す。上部の線は、対照についてであり、下部の２本の線は、ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ－１２およびｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ－１２についてである。図２Ｂは、改変ＲＮＡ－ＩＬ－１２およびｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ－１２の間の有効性（腫瘍サイズ）を示す。

【0021】

【図3】図３は、改変ＲＮＡおよび複製性ＲＮＡにおけるＩＬ－１２ペイロードの発現を示す。

【0022】

【図4】図４は、Ｂ１６－Ｆ１０細胞が皮下導入された後、ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ１２またはｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ１２を投与されたマウスの生存の確率を示す。ｍＲＮＡは、約３５０ｍｍ^３の腫瘍サイズで、単回用量として投薬された。

【発明を実施するための形態】

【0023】

発明の詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本出願が支配する。文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。

【0024】

本開示全体を通して、「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを表すと理解される。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では、互換可能に使用することができる。

【0025】

さらにまた、「および／または」は、本明細書で使用される場合、他のものの有無にかかわらず、２つの特定された特性または構成要素のそれぞれの特定の開示として取られるべきである。したがって、「および／または」という用語は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「および／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される場合、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。

【0026】

「約」という用語は、本明細書では、およそ、大体、おおよそ、またはその範囲内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、これは、示される数値の上および下の境界を拡張することによって、その範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、他に示されない限り、上方または下方（より高いまたはより低い）１０パーセントの変動によって、述べられた値の上および下に数値を修飾するために使用される。

【0027】

数または一連の数の前の「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数、ならびに文脈から明確な場合、論理的に含まれ得るすべてのその後の数または整数を含むことが理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが示された性質を有することを意味する。少なくともが、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」が一連または範囲の数のそれぞれを修飾することができることが理解される。「少なくとも」はまた、整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」は、有効桁数を考慮せずに、５．０％、５．１％、５．１８％を含む）。

【0028】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、ホスホジエステル連結によって接続されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書では、５’から３’方向の向きで存在する。本開示のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、本明細書では、一文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）によって示される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、他に示されない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

【0030】

「コード配列」または「コードする」配列という用語は、本明細書では、特定のタンパク質、例えば、ＩＬ－１２などを「コードする」ＤＮＡまたはＲＮＡ領域（転写された領域）を意味するために使用される。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれた場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ポリペプチドに転写（ＤＮＡ）および翻訳（ＲＮＡ）される。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、限定されるものではないが、原核生物または真核生物由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物由来のゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終止配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。

【0031】

コザックコンセンサス配列、コザックコンセンサスまたはコザック配列は、真核生物ｍＲＮＡに存在する配列として公知であり、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にコンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（ここで、Ｒは、プリン（アデニンまたはグアニン）である）を有し、これに、別の「Ｇ」が続く。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列と少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列を含む。

【0032】

「ＲＮＡ」という用語は、本明細書では、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味するために使用される。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的にまたは完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に生成されたＲＮＡ、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＲＮＡと異なる改変ＲＮＡを含む。「ｍＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成される「転写物」に関し、ペプチドまたはタンパク質をコードする。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて限定的な半減期のみを有する。本発明の文脈では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の方法論は、当業者に公知である。例えば、市販の各種のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットがある。本開示の一部の態様では、ＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡは、５’－キャップ構造で改変されている。

【0033】

「配列同一性」という用語は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、２つもしくはそれよりも多くのアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列、または２つもしくはそれよりも多くの核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係を意味するために使用される。ある特定の態様では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長またはその部分に基づいて算出される。その部分は、両方の配列番号の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、または任意の他の特定されたパーセンテージを意味し得る。「同一性」という用語は、場合によって、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関係性の程度も意味し得る。

【0034】

ある特定の態様では、同一性を決定するための方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。

【0035】

「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）による適切なヌクレオチドの挿入または欠失とともに最適に整列された場合に、配列の少なくとも約９５～９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを示すことを意味する。

【0036】

「アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、１～２４個の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル（tetracedcyl）、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基はまた、置換または無置換であり得る。アルキル基は、限定されるものではないが、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシル、ケトン、ニトロ、シリル、スルホキソ、スルホニル、スルホキシド、またはチオールを含む、１つまたは複数の基で置換され得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、例えば本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む遺伝子治療組成物の「有効量」、「治療有効量」および「十分量」という用語は、ヒトを含む対象に投与された場合に、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を生じるのに十分な量を指し、例えば、「有効量」またはそれに対する同義語は、それが適用されている文脈に依存する。

【0038】

所与の治療剤または組成物の量は、そのような量に対応し、さまざまな要因、例えば、所与の薬剤、医薬製剤、投与の経路、疾患または障害の種類、処置される対象（例えば、年齢、性別、および／または体重）または宿主の正体などに応じて変わる。

【0039】

「半減期」という用語は、分子の活性、量または数の半分が排除されるのに必要な期間に関する。本発明の文脈では、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性について表す。

【0040】

脂質ナノ粒子
本開示は、脂質ナノ粒子を使用する生物学的に活性な分子の細胞への送達に関する。一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子によって封入されたＩＬ－１２を発現する改変ＲＮＡまたは環状ＲＮＡ、その組成物、およびがんを有するか、またはがんを有すると疑われる対象を処置するためのその組成物の使用に関する。

【0041】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、本明細書で使用される場合、ベシクル、例えば、連続的な脂質二重層を有する球状ベシクルを指す。脂質ナノ粒子は、薬学的療法を標的化された場所に送達する方法において使用することができる。ＬＮＰの非限定的な例としては、リポソーム、双頭型両親媒性化合物（bolaamphihile）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、および単層膜構造（例えば、アーケオソーム（archaeosome）およびミセル）が挙げられる。

【0042】

一部の態様では、脂質ナノ粒子は、１種または複数種の脂質を含む。脂質は、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、脂肪酸のエステルを含む有機化合物の群を指し、一部の態様では、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることによって特徴付けられる。それらは、通常、少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。脂質の非限定的な例としては、トリグリセリド（例えば、トリステアリン）、ジグリセリド（例えば、ベヘン酸グリセロール（glycerol bahenate））、モノグリセリド（例えば、モノステアリン酸グリセロール）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびワックス（例えば、パルミチン酸セチル）が挙げられる。一部の態様では、ＬＮＰ中の１種または複数種の脂質は、カチオン性脂質を含む。

【0043】

カチオン性脂質は、本明細書で使用される場合、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を持ついくつかの脂質種のいずれかを指す。そのような脂質としては、限定されるものではないが、Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；リポフェクタミン；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）；ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ，－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ－Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ（dimyristyloxprop）－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。

【0044】

一部の態様では、カチオン性脂質は、式Ｉ：

【化3】

およびその塩［式中、各Ｒ^１は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^２は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^３は、独立して、水素、または置換もしくは無置換アルキルであり、各ｍは、独立して、３、４、５、６、７、または８である］によって表される。一部の態様では、各Ｒ^１は、独立して、無置換アルキルであり、各Ｒ^２は、独立して、無置換アルキルであり、Ｒ^３は、水素であり、各ｍは、３である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ^１は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0045】

一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^２は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0046】

一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^１は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0047】

一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^２は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0048】

一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の態様では、Ｒ^１のすべての実例は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0049】

一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_１～２４アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_６～１８アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_６～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_８～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_{１０～１２}アルキルである。一部の態様では、Ｒ^２のすべての実例は、無置換Ｃ_１１アルキルである。

【0050】

一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、水素である。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～６アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～４アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_２～４アルキルである。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換または無置換メチルである。

【0051】

一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲンで置換されている。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、フッ素で置換されている。一部の態様では、少なくとも１つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲン化アルキルで置換されている。

【0052】

一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、水素である。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～６アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_１～４アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換Ｃ_２～４アルキルである。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換または無置換メチルである。

【0053】

一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲンで置換されている。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、フッ素で置換されている。一部の態様では、少なくとも２つのＲ^３は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲン化アルキルで置換されている。

【0054】

一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、水素である。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換Ｃ_１～１８アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換Ｃ_１～１２アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換Ｃ_１～６アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換Ｃ_１～４アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換Ｃ_２～４アルキルである。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換または無置換メチルである。

【0055】

一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲンで置換されている。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、フッ素で置換されている。一部の態様では、Ｒ^３のすべての実例は、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、ハロゲン化アルキルで置換されている。

【0056】

一部の態様では、少なくとも１つのｍは、３である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、４である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、５である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、６である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、７である。一部の態様では、少なくとも１つのｍは、８である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、３である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、４である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、５である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、６である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、７である。一部の態様では、少なくとも２つのｍは、８である。

【0057】

一部の態様では、ｍのすべての実例は、３である。一部の態様では、ｍのすべての実例は、４である。一部の態様では、ｍのすべての実例は、５である。一部の態様では、ｍのすべての実例は、６である。一部の態様では、ｍのすべての実例は、７である。一部の態様では、ｍのすべての実例は、８である。

【0058】

本開示の一部の態様では、カチオン性脂質は、

【化4】

【0059】

［式中、すべての実例がｍ＝３］によって表されるＴＴ３である。式ＩおよびＴＴ３の組成物、合成および使用は、ＷＯ２０１６１８７５３１Ａ１に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0060】

ＴＴ３は、本明細書で使用される場合、さまざまな生物学的に活性な薬剤の細胞への送達のための脂質ナノ粒子を形成することができる。加えて、本開示は、負荷されていないＴＴ３－ＬＮＰが、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、がん細胞において免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することができることも実証する。免疫原性細胞死は、本明細書で記載される場合、樹状細胞（ＤＣ）の活性化および結果として生じる特異的Ｔ細胞応答の活性化を通して有効な免疫応答を誘導することができる細胞死の形態を指す。本開示の一部の態様では、免疫原性細胞死を受ける細胞は、腫瘍細胞である。免疫原性腫瘍細胞死は、有効な抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。本開示の一部の態様では、脂質ナノ粒子は、レポーター遺伝子のみをコードする改変ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を封入しているＴＴ３－ＬＮＰ（ＴＴ３－ＬＮＰ－ｍｏｄＲＮＡ）を含む。改変ＲＮＡは、ＴＴ３－ＬＮＰと相乗的に働いて、ＴＴ３－ＬＮＰ単独と比較して、腫瘍細胞においてより高いレベルのＩＣＤを誘導することができる。本開示の一部の態様では、脂質ナノ粒子は、ＩＬ－１２分子をコードするｍｏｄＲＮＡを封入しているＴＴ３－ＬＮＰを含む。免疫調節性サイトカインであるＩＬ－１２は、局所腫瘍に対して強力な免疫応答を誘発する。ＴＴ３－ＬＮＰ、ｍｏｄＲＮＡおよびＩＬ－１２発現の組合せは、部位における腫瘍細胞の相乗的阻害に有効であるだけでなく、全身的な抗腫瘍免疫応答も誘発して、遠位腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍の再発を防止する。

【0061】

本開示の一部の態様では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。ＤＯＴＡＰは、本明細書で使用される場合、脂質ナノ粒子を形成することもできる。ＤＯＴＡＰは、一過性のまたは安定な遺伝子発現のために、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むＤＮＡの真核細胞への非常に効率的なトランスフェクションのために使用することができ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびタンパク質などの他の負に帯電した分子の哺乳動物細胞の研究試料への効率的な移入のためにも好適である。

【0062】

本開示の一部の態様では、カチオン性脂質は、リポフェクタミンである。リポフェクタミンは、本明細書で使用される場合、分子細胞生物学において使用される、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって製造および販売される一般的なトランスフェクション試薬である。これは、リポフェクションによるＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む）またはプラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物へのトランスフェクション効率を増加させるために使用される。リポフェクタミンは、水性環境下でリポソームまたは脂質ナノ粒子を形成することができる脂質サブユニットを含有し、これが、トランスフェクションペイロード、例えば、ｍｏｄＲＮＡを封入する。ＲＮＡ含有リポソーム（それらの表面において正に帯電）は、リポソームの細胞膜との融合を媒介する中性共脂質（neutral co-lipid）に起因して、生細胞の負に帯電した形質膜と融合することができ、複製または発現のために、核酸カーゴ分子が細胞質を横断するのを可能にする。

【0063】

本開示の一部の態様では、ＬＮＰは、主に、カチオン性脂質と共に他の脂質成分から構成される。これらとしては、典型的には、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（例えば、１，ｓ－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（Ｃ１４－ＰＥＧ２０００））に属する他の脂質分子が挙げられる。表１は、例示的なＬＮＰ、ＴＴ３－ＬＮＰおよびＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの処方を示す。
表1.

【表1】

【0064】

脂質ナノ粒子の粒子サイズは、薬物放出速度、生体内分布、粘膜接着、ナノ粒子の内部への水の細胞取り込みおよび緩衝液交換、ならびにタンパク質拡散に影響を及ぼし得る。本開示の一部の態様では、ＬＮＰの直径は、３０～５００ｎｍの範囲である。本開示の一部の態様では、ＬＮＰの直径は、約３０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約７０～約３００ｎｍ、約１００～約２００ｎｍ、約１００～約１７５ｎｍ、または約１００～約１２０ｎｍの範囲である。本開示の一部の態様では、ＬＮＰの直径は、１００～１２０ｎｍの範囲である。本開示の一部の態様では、ＬＮＰの直径は、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１０１ｎｍ、１０２ｎｍ、１０３ｎｍ、１０４ｎｍ、１０５ｎｍ、１０６ｎｍ、１０７ｎｍ、１０８ｎｍ、１０９ｎｍ、１１０ｎｍ、１１１ｎｍ、１１２ｎｍ、１１３ｎｍ、１１４ｎｍ、１１５ｎｍ、１１６ｎｍ、１１７ｎｍ、１１８ｎｍ、１１９ｎｍ、または１２０ｎｍであり得る。

【0065】

ゼータ電位は、脂質ナノ粒子表面の有効な電荷の尺度である。ゼータ電位の大きさは、粒子の安定性についての情報を提供する。本開示の一部の態様では、ＬＮＰのゼータ電位は、３～６ｍｖの範囲である。本開示の一部の態様では、ＬＮＰのゼータ電位は、３ｍｖ、３．１ｍｖ、３．２ｍｖ、３．３ｍｖ、３．４ｍｖ、３．５ｍｖ、３．６ｍｖ、３．７ｍｖ、３．８ｍｖ、３．９ｍｖ、４ｍｖ、４．１ｍｖ、４．２ｍｖ、４．３ｍｖ、４．４ｍｖ、４．５ｍｖ、４．６ｍｖ、４．７ｍｖ、４．８ｍｖ、４．９ｍｖ、５ｍｖ、５．１ｍｖ、５．２ｍｖ、５．３ｍｖ、５．４ｍｖ、５．５ｍｖ、５．６ｍｖ、５．７ｍｖ、５．８ｍｖ、５．９ｍｖ、または６ｍｖであり得る。

【0066】

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子により封入されたｍｏｄＲＮＡに関する。本開示の一部の態様では、ＬＮＰおよびｍｏｄＲＮＡの間の質量比は、１：２～２：１の範囲である。一部の態様では、ＬＮＰおよびｍｏｄＲＮＡの間の質量比は、１：２、１：１．９、１：１．８、１：１．７、１：１．６、１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、または２：１であり得る。本開示の一部の態様では、ＬＮＰおよびｍｏｄＲＮＡの間の質量比は、１：１であり得る。

【0067】

改変ＲＮＡ
一部の態様では、改変ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを指し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｅｘ ｖｉｖｏで、翻訳されて、目的のコードされるポリペプチドを産生することができる。本開示の一部の態様では、改変ＲＮＡは、合成である。

【0068】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、翻訳可能領域、および１、２、または２つより多くの改変を含む。一部の態様では、改変核酸は、対応する未改変核酸と比べて、核酸が導入される細胞において低減された分解を示す。

【0069】

一部の態様では、改変は、ヌクレオチドの糖部分に位置し得る。一部の態様では、改変は、ヌクレオチドのリン酸骨格に位置し得る。

【0070】

一部の態様では、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合、細胞に導入される改変核酸が細胞内で分解されることが望ましい。したがって、一部の態様では、改変ＲＮＡは、分解ドメインを含み、これは、細胞内で指示された様式で作用され得る。

【0071】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、改変５’－キャップ、半減期延長部分、または調節エレメントの少なくとも１つを含む。

【0072】

一部の態様では、改変５’－キャップは、５’－キャップ構造なしの同じＲＮＡと比較した場合に、ＲＮＡの安定性を増加させ、ＲＮＡの翻訳効率を増加させ、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させる。

【0073】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、環化（例えば、環状ｍＲＮＡ）またはコンカテマー化されて、翻訳適格性分子を生成して、ポリＡ結合タンパク質および５’末端結合タンパク質の間の相互作用を支援する。環化またはコンカテマー化のメカニズムは、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的経路、２）酵素的経路、および３）リボザイム触媒経路を通して起こり得る。新しく形成された５’／３’連結は、分子内または分子間であり得る。

【0074】

第１の経路では、核酸の５’末端および３’末端は、一緒に接近している場合に、分子の５’末端および３’末端の間に新しい共有結合的連結を形成する化学反応性基を含有する。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’－アミノ末端ヌクレオチドが５’－ＮＨＳ－エステル部分において求核攻撃を受けて、新しい５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ－エステル反応性基を含有していてもよく、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有していてもよい。

【0075】

第２の経路では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、５’－リン酸化核酸分子を核酸の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結させて、新しいホスホロジエステル連結を形成することができる。反応の例では、１μｇの核酸分子を、製造業者のプロトコールに従って、１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）と共に３７℃で１時間インキュベートする。ライゲーション反応は、並置された５’および３’領域の両方と塩基対合して、酵素的ライゲーション反応を支援することができる分割オリゴヌクレオチドの存在下で起こり得る。

【0076】

第３の経路では、ｃＤＮＡ鋳型の５’または３’末端のいずれかは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の間に、生じた核酸分子が核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端にライゲーションすることができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、群Ｉイントロン、群Ｉイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得るか、またはＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）によって選択されてもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間かかり得る。

【0077】

一部の態様では、複数の別個の核酸、改変ＲＮＡまたは一次構築物は、３’末端で改変されるヌクレオチドを使用して、３’末端を通して一緒に連結されてもよい。化学的コンジュゲーションを使用して、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路の酵素であるイソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼは、１：１の比でＨｅｐＧ２細胞に供給されて、細胞の脂肪酸代謝を変更することができる。この比は、ある核酸または改変ＲＮＡ種上の３’－アジド末端ヌクレオチド、ならびに反対側の核酸または改変ＲＮＡ種上のＣ５－エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを使用して、核酸または改変ＲＮＡを化学的に連結させることによって制御され得る。改変ヌクレオチドは、製造業者のプロトコールに従って、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）を使用して転写後に付加される。３’－改変ヌクレオチドの付加後、２つの核酸または改変ＲＮＡ種は、水溶液中、銅の存在下または非存在下で合わされて、文献に記載されているクリックケミストリーメカニズムを介して新しい共有結合的連結を形成し得る。

【0078】

一部の態様では、２つより多くのポリヌクレオチドが、官能化リンカー分子を使用して、一緒に連結され得る。例えば、官能化サッカライド分子は、３’－官能化ｍＲＮＡ分子（すなわち、３’－マレイミドエステル、３’－ＮＨＳ－エステル、アルキニル）上の同族部分と反応する複数の化学反応性基（ＳＨ－、ＮＨ２－、Ｎ３など）を含有するように化学的に改変され得る。改変サッカライド上の反応性基の数は、化学量論的な様式で制御され得、コンジュゲートされた核酸またはｍＲＮＡの化学量論比を直接制御することができる。

【0079】

一部の態様では、タンパク質産生をさらに増強するために、本開示の核酸、改変ＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン（Sapphyrin））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞もしくは骨細胞などの特定された細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、または薬物にコンジュゲートされるように設計することができる。

【0080】

コンジュゲーションは、増加した安定性および／または半減期をもたらし得、細胞、組織または生物体における特異的部位に核酸、改変ＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたは一次構築物を標的化するのに特に有用であり得る。

【0081】

一部の態様では、一次構築物は、目的の１つもしくは複数のポリペプチド、またはその断片をコードするように設計される。目的のポリペプチドとしては、限定されるものではないが、ポリペプチド全体、１つまたは複数の核酸によって独立してコードされ得る複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片、複数の核酸、前述のいずれかの核酸の断片またはバリアントが挙げられ得る。本明細書で使用される場合、「目的のポリペプチド」という用語は、本発明の一次構築物においてコードされるように選択された任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合にペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造または機能の、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。一部の例では、コードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、その結果、ポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、および他の等価物、バリアント、ならびに前述のアナログが挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子の複合体であってもよい。それらは、単一鎖、または抗体もしくはインスリンなどの多鎖ポリペプチドも含み得、会合または連結されていてもよい。最も一般的なジスルフィド連結は、多鎖ポリペプチドにおいて見出される。ポリペプチドという用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。

【0082】

「ポリペプチドバリアント」という用語は、ネイティブまたは参照配列とはそれらのアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、ネイティブまたは参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失および／または挿入を有し得る。通常は、バリアントは、ネイティブまたは参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、それらは、ネイティブまたは参照配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一（相同）である。

【0083】

したがって、参照配列に関して置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有結合性改変を含有する目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つまたは複数のリシンは、本発明のペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチドの精製または局在化のために使用することができる。リシンは、ペプチドの溶解度を増加させるため、またはビオチン化を可能にするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、必要に応じて欠失されて、トランケートされた配列を提供することができる。あるいは、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるか、または固体担体に連結されたより大きい配列の一部としての配列の発現に応じて、欠失されていてもよい。

【0084】

当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的のポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００アミノ酸長よりも長い参照タンパク質の任意のタンパク質断片（他は同一であるが、参照ポリペプチド配列よりも少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短いポリペプチド配列を意味する）が本明細書に提供される。別の例では、本明細書に記載される配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である、約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本発明に従って利用することができる。ある特定の実施形態では、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または言及される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くの変異を含む。

【0085】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、改変５’－キャップ、半減期延長部分、調節エレメント、またはそれらの組合せを含む。

【0086】

一部の態様では、改変５’－キャップは、ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧＲＮＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７Ｇｐｐｐｐｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{（７，３’－Ｏ）}ＧｐｐｐＧ、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ１）、ｍ_２ ^{（７，２’－Ｏ）}ＧｐｐｓｐＧ（Ｄ２）、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ、（ｍ^７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと等価に指定され得る）、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐ、ｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0087】

本開示は、５’キャップおよび本開示の改変ＲＮＡの両方を含むポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）も含む。

【0088】

天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）を結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性の原因となり、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡスプライシングの間に５’近位のイントロンの除去をさらに支援する。

【0089】

内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基および５’末端転写センスヌクレオチドの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸連結を生成し得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップは、メチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端（anteterminal）転写ヌクレオチドのリボース糖も、必要に応じて、２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断による５’－キャップ除去（decapping）は、分解のために、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的化し得る。

【0090】

本開示によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップアナログを含み得る。本開示によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含み得る。有用なグアニンアナログとしては、限定されるものではないが、イノシン、Ｎｌ－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられる。

【0091】

一部の態様では、５’末端キャップ構造は、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣ Ａ、イノシン、Ｎｌ－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらのアナログである。

【0092】

非限定的な追加のキャップとしては、参照により本明細書に組み込まれる２０１７年１１月２３日公開のＷＯ／２０１７／２０１３５０に開示されている５’キャップが挙げられる。

【0093】

一部の態様では、半減期延長部分は、Ｆｃ、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＸＴＥＮ、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0094】

一部の態様では、半減期延長部分は、Ｆｃを含む。一部の態様では、半減期延長部分は、アルブミンまたはその断片を含む。

【0095】

一部の態様では、調節エレメントは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位またはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0096】

一部の態様では、調節エレメントは、ポリＡ領域をさらに含む。一部の態様では、本開示の改変ＲＮＡ（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡテールをさらに含む。一部の態様では、ポリＡテール上の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡテールは、ｄｅｓ－３’ヒドロキシルテールを含む。ＲＮＡプロセシングの間に、アデニンヌクレオチドの長い鎖（ポリＡテール）は、安定性を増加させるために、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。

【0097】

転写直後に、転写物の３’末端は、切断されて、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含む、およそ８０～およそ２５０残基長の間であり得るポリＡテールを付加する。

【0098】

ポリＡテールはまた、構築物が核から輸送された後に付加され得る。

【0099】

本開示によれば、ポリＡテール上の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ－３’ヒドロキシルテールを含み得る。それらは、Junjie Li, et al.（Current Biology, Vol. 15, 1501-1507, August 23, 2005、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって教示される構造部分または２’－Ｏメチル改変も含み得る。さらなるポリＡテールについて、参照により本明細書に組み込まれる２０１７年１１月２３日公開のＷＯ／２０１７／２０１３５０も参照されたい。

【0100】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、本明細書に記載される任意の改変または改変の組合せを含む。

【0101】

末端構造改変：非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、停止コドンの直後に開始し、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性の観点から、ＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増えている。ＵＴＲの調節特性は、本開示の改変ＲＮＡに組み込まれて、分子の安定性を増強することができる。特定の特性も組み込まれて、それらが望ましくない臓器部位に誤って指向される場合に、転写物の制御された下方調節を確実にすることができる。

【0102】

５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たす特性を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知であるコザック配列のようなシグネチャーを保有する。コザック配列は、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にコンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（ここで、Ｒは、プリン（アデニンまたはグアニン）である）を有し、これに、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも公知である。

【0103】

伸長因子結合に関与する５’ＵＴＲ二次構造は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ中の他のＲＮＡ結合分子と相互作用して、遺伝子発現を調節することができる。例えば、５’ＵＴＲにおいて二次構造化エレメントに結合する伸長因子ＥＩＦ４Ａ２は、マイクロＲＮＡ媒介抑制のために必要である（その全体が参照により本明細書に組み込まれるMeijer H A et al., Science, 2013, 340, 82-85）。５’ＵＴＲにおける異なる二次構造が、隣接領域に組み込まれて、特定の組織または細胞においてｍＲＮＡを安定化するか、または選択的に不安定にすることができる。

【0104】

特定の標的臓器の豊富に発現した遺伝子において典型的に見出される特性を操作することによって、本発明の核酸またはｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子などの肝臓で発現されるｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入を使用して、肝細胞系または肝臓におけるｍｍＲＮＡなどの核酸分子の発現を増強することができる。同様に、その組織における発現を改善するための他の組織特異的ｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲの使用は、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Herculin））に対して、内皮細胞（Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）に対して、骨髄性細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）に対して、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）に対して、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）に対して、および肺上皮細胞（ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に対して可能である。

【0105】

他の非ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込まれてもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本発明の核酸またはｍＲＮＡの隣接領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、およびｍＲＮＡレベルを増加させ得る。

【0106】

本開示の一部の態様では、ＧＴＸ遺伝子由来のＩＲＥＳ配列の少なくとも１つの断片を、５’ＵＴＲに含んでいてもよい。非限定的な例として、断片は、ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳ由来の１８ヌクレオチド配列であってもよい。別の非限定的な例として、ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳ配列由来の１８ヌクレオチド配列断片は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおいてタンデムに反復されていてもよい。１８ヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲにおいて、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回よりも多く反復されてもよい。

【0107】

ヌクレオチドは、変異され、置き換えられ、および／または５’（または３’）ＵＴＲから除去され得る。例えば、開始コドン上流の１つまたは複数のヌクレオチドが、別のヌクレオチドで置き換えられ得る。置き換えられるヌクレオチド（単数または複数）は、開始コドン上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６０ヌクレオチドよりも多くであり得る。別の例として、開始コドン上流の１つまたは複数のヌクレオチドが、ＵＴＲから除去され得る。

【0108】

５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）
一部の態様では、改変ＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳のエンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント、翻訳のエンハンサーエレメント（まとめて「ＴＥＥ」と称する）を含む。一部の態様では、ＴＥＥは、転写プロモーターおよび開始コドンの間に位置する。一部の態様では、５’ＵＴＲに少なくとも１つのＴＥＥを有する改変ＲＮＡは、５’ＵＴＲにキャップを含む。一部の態様では、少なくとも１つのＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を受ける改変ＲＮＡの５’ＵＴＲに位置していてもよい。

【0109】

「翻訳のエンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）」（本明細書で、まとめて「ＴＥＥ」と称する）という用語は、ｍＲＮＡから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。

【0110】

一態様では、ＴＥＥは、限定されるものではないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促進し得るＵＴＲ中の保存されたエレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含む１４種にわたって、Panek et al（Nucleic Acids Research, 2013, 1-10；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって以前に示されている。

【0111】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国出願第２０１４／０１４７４５４号に開示されるものと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを有する。一部の態様では、改変ＲＮＡは、そのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号、第ＵＳ２００７００４８７７６号、第ＵＳ２０１３０１７７５８１号および第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、ＷＯ２０１２００９６４４号、ＷＯ２００９０７５８８６号およびＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号およびＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第６，３１０，１９７号、米国特許第６，８４９，４０５号、米国特許第７，４５６，２７３号、米国特許第７，１８３，３９５号に記載されるＴＥＥと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含む。

【0112】

一部の態様では、改変ＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０よりも多くのＴＥＥ配列を含んでいてもよい。一部の態様では、改変ＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列である。一部の態様では、ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、もしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはそれらのバリアントなどのパターンで、１回、２回、または３回よりも多く反復される。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。

【0113】

一部の態様では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、限定されるものではないが、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）などの改変ＲＮＡの翻訳を調節する当技術分野において公知の他の配列を含む。一部の態様では、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含む。

【0114】

一部の態様では、本発明の改変ＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、限定されるものではないが、そのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４６８，２７５号および国際特許公開第ＷＯ２００１０５５３６９号に記載されるものなどのＩＲＥＳ配列である。

【0115】

一部の態様では、本明細書に記載されるＴＥＥは、改変ＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに位置する。一部の態様では、３’ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置するか、および／またはそこへの組み込みのために記載されるＴＥＥと同じおよび／または異なる。

【0116】

一部の態様では、改変ＲＮＡの３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０よりも多くのＴＥＥ配列を含み得る。一部の態様では、本開示の改変ＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列である。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、もしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはそれらのバリアントなどのパターンで、１回、２回、または３回よりも多く反復される。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。

【0117】

一部の態様では、３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含む。一部の態様では、スペーサーは、１５ヌクレオチドのスペーサー、および／または当技術分野において公知の他のスペーサーである。一部の態様では、３’ＵＴＲは、３’ＵＴＲにおいて、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回および少なくとも９回、または９回よりも多く反復されるＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含んでいてもよい。

【0118】

一部の態様では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、限定されるものではないが、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）などの改変ＲＮＡの翻訳を調節する当技術分野において公知の他の配列を含む。一部の態様では、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含む。

【0119】

マイクロＲＮＡ結合部位の組み込み
一部の態様では、改変ＲＮＡは、センサー配列をさらに含む。センサー配列としては、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列および／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の偽受容体（pseudo-receptor）として作用するように操作された人工結合部位が挙げられる。少なくとも１つのセンサー配列を含むポリヌクレオチドの非限定的な例は、米国出願第２０１４／０１４７４５４号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0120】

一部の態様では、標的細胞または組織のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイリングは、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を決定するために実行される。

【0121】

マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子の安定性を低減すること、または翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方調節する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。一部の態様では、改変ＲＮＡは、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８および米国公開ＵＳ２００５／００５９００５に教示されるものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得、これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、ヒトゲノムにおける公知のマイクロＲＮＡ、それらの配列およびシード配列は、米国出願第２０１４／０１４７４５４号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0122】

マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２～８位の領域の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン－クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８または２～７位を含む。一部の態様では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡの１位と反対側のアデニン（Ａ）に隣接する。一部の態様では、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡの１位と反対側のアデニン（Ａ）に隣接する。例えば、Grimson A, Farh K K, Johnston W K, Garrett-Engele P, Lim L P, Bartel D P; Mol Cell. 2007 Jul. 6; 27(1):91-105を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。問題のマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件として、マイクロＲＮＡ標的配列を本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲに操作することによって、分解または低減された翻訳のために分子を標的化することができる。このプロセスは、核酸分子送達の際のオフターゲット効果の危険を低減する。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学における役割が報告されている（Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949；Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176；Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec. 20. doi: 10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414；Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403およびそれらのすべての参考文献；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0123】

例えば、ｍＲＮＡが肝臓に送達されることを意図しないが、そこに行き着く場合には、肝臓中で豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１２２は、ｍｉＲ－１２２の１つまたは複数の標的部位が改変核酸、増強された改変ＲＮＡまたはリボ核酸の３’ＵＴＲに操作される場合に、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、改変核酸、増強された改変ＲＮＡまたはリボ核酸の長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合すること（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、従来のワトソン－クリックハイブリダイゼーションの規則に従い得るか、またはマイクロＲＮＡ部位の、もしくはそこに隣接する標的配列とのマイクロＲＮＡの任意の安定な会合を反映し得ることが理解されるべきである。

【0124】

逆に、本発明の改変核酸、増強された改変ＲＮＡまたはリボ核酸の目的のために、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に存在するマイクロＲＮＡ結合部位を操作して配列外にする（すなわち、そこから除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位が除去されて、肝臓におけるタンパク質発現が改善され得る。

【0125】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、限定されるものではないが、正常なおよび／またはがん性細胞（例えば、ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）などの特定の細胞に細胞傷害性のまたは細胞保護的なｍＲＮＡ治療薬を指向させるために、３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。

【0126】

マイクロＲＮＡがｍＲＮＡ、およびそれによってタンパク質発現を調節することが公知である組織の例としては、限定されるものではないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄性細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。

【0127】

具体的には、マイクロＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマイクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球（granuocyte）、ナチュラルキラー細胞などにおいて差次的に発現されることが公知である。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療および組織／臓器移植後の望まない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化およびアポトーシスの多くの態様も調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２およびｍｉＲ－１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に骨髄樹状細胞において豊富である。外因性核酸分子に対する免疫応答が、送達された遺伝子構築物の３’ＵＴＲへｍｉＲ－１４２結合部位を付加することによって遮断され、組織および細胞におけるより安定な遺伝子移入を可能にしたことが当技術分野において実証された。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞における外因性ｍＲＮＡを効率的に分解し、形質導入された細胞の細胞傷害性排除を抑制する（Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161；Brown B D, et al., Nat med. 2006, 12(5), 585-591；Brown B D, et al., blood, 2007, 110(13): 4144-4152、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0128】

多くのマイクロＲＮＡ発現研究が、さまざまながん細胞／組織および他の疾患におけるマイクロＲＮＡの差次的発現をプロファイルするために、当技術分野において実行されている。一部のマイクロＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、他のものは、過小発現される。例えば、マイクロＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、米国特許第８，３８９，２１０号）；喘息および炎症（米国特許第８，４１５，０９６号）；前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、米国特許第８，２５２，５３８号）；肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節（lympho node）（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；鼻咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、これらのそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）において差次的に発現される。

【0129】

少なくとも１つのマイクロＲＮＡ部位は、改変ＲＮＡの３’ＵＴＲに操作され得る。一部の態様では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれよりも多くのマイクロＲＮＡ部位が、改変ＲＮＡの３’ＵＴＲに操作されてもよい。一部の態様では、改変ＲＮＡに組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は、同じまたは異なるマイクロＲＮＡ部位である。一部の態様では、改変ＲＮＡに組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は、身体の同じまたは異なる組織を標的にする。非限定的な例として、改変核酸ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける組織、細胞型または疾患特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入により、特定の細胞型（例えば、肝細胞、骨髄性細胞、内皮細胞、がん細胞など）における発現の程度を低減することができる。

【0130】

一部の態様では、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端および３’末端のほぼ中間、ならびに／または３’ＵＴＲの３’末端付近で操作される。一部の態様では、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、ならびに３’ＵＴＲの５’末端および３’末端のほぼ中間で操作される。一部の態様では、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近、ならびに３’ＵＴＲの５’末端および３’末端のほぼ中間で操作される。一部の態様では、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、および３’ＵＴＲの３’末端付近で操作される。

【0131】

一部の態様では、改変メッセンジャーＲＮＡは、公知のシード配列と１００％の同一性を有するか、またはシード配列と１００％未満の同一性を有するマイクロＲＮＡ結合領域部位を含む。シード配列は、部分的に変異されて、マイクロＲＮＡ結合親和性を減少させることができ、そのようにして、そのｍＲＮＡ転写物の低減された下方モジュレーションをもたらす。本質では、標的ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡシードの間の一致または不一致の程度は、タンパク質発現をモジュレートするマイクロＲＮＡの能力をより細かく調整するレオスタットとして作用し得る。加えて、マイクロＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異は、タンパク質発現をモジュレートするマイクロＲＮＡの能力にも影響を及ぼし得る。

【0132】

ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）のためのＲＮＡモチーフ
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、限定されるものではないが、ＲＮＡスプライシング、局在化、翻訳、ターンオーバー、ポリアデニル化、キャッピング、改変、排出、および局在化などの同時転写のおよび転写後の遺伝子発現の多くの態様を調節することができる。限定されるものではないが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲ）およびｈｎＲＮＰ Ｋ相同（ＫＨ）ドメインなどのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）は、典型的には、ＲＢＰおよびそれらのＲＮＡ標的の間の配列の会合を調節する（Ray et al. Nature 2013. 499:172-177；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の態様では、カノニカルなＲＢＤは、短いＲＮＡ配列を結合する。一部の態様では、カノニカルなＲＢＤは、ＲＮＡ構造を認識する。

【0133】

ＲＮＡ結合タンパク質ならびに関連する核酸およびタンパク質配列の非限定的な例は、米国出願第２０１４／０１４７４５４号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0134】

一部の態様では、目的のｍＲＮＡの安定性を増加させるために、ＨｕＲをコードするｍＲＮＡを、目的のｍＲＮＡと一緒に、細胞または組織に共トランスフェクトまたは共注入する。これらのタンパク質はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的のｍＲＮＡに繋留され、次いで、細胞に一緒に投与され得る。ポリＡテール結合タンパク質ＰＡＢＰは、真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相互作用して、翻訳開始を刺激する。ｍＲＮＡ薬物と共にこれらのＲＢＰをコードするか、および／またはこれらのタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡ薬物に繋留するｍＲＮＡの共投与、ならびにタンパク質結合ｍＲＮＡを細胞へ投与することは、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させることができる。同じ概念は、ｍＲＮＡの、さまざまな転写因子および促進因子をコードするｍＲＮＡとの、ならびにそれら自体のタンパク質との共投与に拡張して、ＲＮＡ安定性および／または翻訳効率に影響を及ぼし得る。

【0135】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）などの少なくとも１つのＲＮＡ結合モチーフを含む。

【0136】

一部の態様では、連結ヌクレオシドの第１の領域および／または少なくとも１つの隣接領域は、少なくとも１つのＲＢＤを含む。一部の態様では、連結ヌクレオシドの第１の領域は、スプライシング因子に関連するＲＢＤを含み、少なくとも１つの隣接領域は、安定性および／または翻訳因子についてのＲＢＤを含む。

【0137】

３’ＵＴＲにおける他の調節エレメント
マイクロＲＮＡ結合部位に加えて、異なる組織および細胞においてｍＲＮＡ安定性および翻訳を調節する天然ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲにおける他の調節配列を、除去するか、または改変メッセンジャーＲＮＡに導入することができる。そのようなシス調節エレメントとしては、限定されるものではないが、シス－ＲＮＰ（リボヌクレオタンパク質）／ＲＢＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）調節エレメント、ＡＵリッチエレメント（ＡＵＥ）、構造化ステムループ、構成的減衰エレメント（constitutive decay element）（ＣＤＥ）、ＧＣの豊富さ、および他の構造化ｍＲＮＡモチーフが挙げられ得る（Parker B J et al., Genome Research, 2011, 21, 1929-1943、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＣＤＥは、ロキン（Roquin）タンパク質とのそれらの相互作用を通してｍＲＮＡ分解を媒介する調節モチーフのクラスである。特に、ＣＤＥは、マクロファージにおけるサイトカイン産生を制限する、発生および炎症の調節因子をコードする多くのｍＲＮＡにおいて見出される（Leppek K et al., 2013, Cell, 153, 869-881、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0138】

一部の態様では、改変ｍＲＮＡは、栄養要求性である。本明細書で使用される場合、「栄養要求性」という用語は、タンパク質発現が実質的に防止または低減されるように、空間的または時間的キューに応答してｍＲＮＡの分解または不活性化を誘発する、促進する、または誘導する少なくとも１つの特性を含むｍＲＮＡを指す。そのような空間的または時間的キューとしては、特定の組織または臓器または細胞環境など、翻訳されるｍＲＮＡの場所が挙げられる。温度、ｐＨ、イオン強度、水分含有量などを含むキューも企図される。

【0139】

３’ＵＴＲおよびＡＵリッチエレメント
３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンがそれらに埋め込まれたストレッチを有することが公知である。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー速度を有する遺伝子において特に普及している。それらの配列の特性および機能的性質に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類され得る（Chen et al, 1995）。クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩ ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つまたはそれよりも多くの重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩ ＡＲＥは、あまり十分に定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎおよびミオゲニンが、このクラスの２つの十分に研究された例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定にすること公知であるが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も注目すべきことに、ＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つのクラスすべてのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに操作することで、ＨｕＲ結合、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージの安定化をもたらす。

【0140】

３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または改変を使用して、本発明の核酸またはｍＲＮＡの安定性をモジュレートすることができる。特定の核酸またはｍＲＮＡを操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーが導入されて、本発明の核酸またはｍＲＮＡをより不安定にし、それによって、得られるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥは、特定されそして除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を増加させ、したがって、得られるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。トランスフェクション実験を、本発明の核酸またはｍＲＮＡを使用して、関連する細胞系で実行することができ、タンパク質産生を、トランスフェクション後のさまざまな時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるＡＲＥ操作分子でトランスフェクトすることができ、関連するタンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用することによって、トランスフェクションの６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日後で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。

【0141】

３’ＵＴＲおよび三重ヘリックス
一部の態様では、改変ＲＮＡは、改変核酸、増強された改変ＲＮＡまたはリボ核酸の３’末端に三重ヘリックスを含む。一部の態様では、改変ＲＮＡの３’末端は、三重ヘリックスを単独で、またはポリＡテールと組み合わせて含む。

【0142】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、少なくとも、第１および第２のＵリッチ領域、第１および第２の領域の間の保存されたステムループ領域、ならびにＡリッチ領域を含む。一部の態様では、第１および第２のＵリッチ領域ならびにＡリッチ領域は、会合して、核酸の３’末端に三重ヘリックスを形成する。この三重ヘリックスは、核酸を安定化させ、核酸の翻訳効率を増強し、および／または３’末端を分解から保護し得る。例示的な三重ヘリックスとしては、限定されるものではないが、転移関連の肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）、ＭＥＮ－βおよびポリアデニル化核（ＰＡＮ）ＲＮＡの三重ヘリックス配列が挙げられる（Wilusz et al., Genes & Development 2012 26:2392-2407を参照されたい；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0143】

ステムループ
一部の態様では、改変ＲＮＡは、ステムループ、例えば、限定されるものではないが、ヒストンステムループを含む。一部の態様では、ステムループは、限定されるものではないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載される配列番号７～１７などの約２５または約２６ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列である。ヒストンステムループは、コード領域に対して、３’に位置していてもよい（例えば、コード領域の３’末端）。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載される核酸の３’末端に位置していてもよい。

【0144】

一部の態様では、ヒストンステムループを含む改変ＲＮＡは、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの付加によって安定化され得る。理論に拘束されることを望まないが、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの付加は、核酸の分解を遅らせる可能性があり、したがって、核酸の半減期を増加させることができる。

【0145】

一部の態様では、鎖終結ヌクレオシドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載されているものである。一部の態様では、鎖終結ヌクレオシドは、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、２’，３’－ジデオキシチミン、２’－デオキシヌクレオシド、または－Ｏ－メチルヌクレオシドである。

【0146】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ヒストンステムループ、ポリＡテール配列、および／または５’キャップ構造を含む。一部の態様では、ヒストンステムループは、ポリＡテール配列の前および／または後である。ヒストンステムループおよびポリＡテール配列を含む核酸は、本明細書に記載される鎖終結ヌクレオシドを含んでいてもよい。

【0147】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ヒストンステムループおよび５’キャップ構造を含む。５’キャップ構造としては、限定されるものではないが、本明細書に記載されるもの、および／または当技術分野において公知のものが挙げられ得る。

【0148】

５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）を結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性の原因となり、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡスプライシングの間に５’近位のイントロンの除去をさらに支援する。

【0149】

内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされ、ｍＲＮＡの末端グアノシンキャップ残基および５’末端転写センスヌクレオチドの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸連結を生成し得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップは、メチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成してもよい。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、必要に応じて、２’－Ｏ－メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断による５’－キャップ除去は、分解のために、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的化してもよい。

【0150】

本開示のＲＮＡへの改変は、キャップ除去を防止する非加水分解性キャップ構造を生成し、したがって、ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル連結の切断を必要とするので、改変ヌクレオチドが、キャッピング反応の間に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）からのワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従って、α－チオ－グアノシンヌクレオチドと共に使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにおけるホスホロチオエート連結を作り出してもよい。α－メチル－ホスホネートおよびセレノ－リン酸ヌクレオチドなどの追加の改変グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。

【0151】

追加の改変としては、限定されるものではないが、糖環の２’－ヒドロキシル基におけるｍＲＮＡの５’末端および／または５’前末端ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化（上に言及される通り）が挙げられる。複数の別個の５’－キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子の５’－キャップを生成し得る。

【0152】

本明細書で合成キャップアナログ、化学キャップ、化学キャップアナログ、または構造的もしくは機能的キャップアナログとも称されるキャップアナログは、それらの化学構造において天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’－キャップとは異なるが、キャップ機能を保持している。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）もしくは酵素的に合成され、および／または核酸分子に連結されてもよい。

【0153】

例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基、ならびに３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと等価に指定され得る）を含有する。他方の未改変グアニンの３’－Ｏ原子は、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。

【0154】

別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと類似するが、グアノシン上に２’－β－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。

【0155】

一部の態様では、キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。一部の態様では、ジヌクレオチドキャップアナログは、異なるリン酸位置で、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で改変された、例えば、その内容が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５１９，１１０号に記載されるジヌクレオチドキャップアナログである。

【0156】

一部の態様では、キャップアナログは、当技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載されるキャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド（dicucleotide）形態である。キャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、Kore et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574に記載されるさまざまなキャップアナログおよびキャップアナログを合成する方法を参照されたい；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の態様では、本発明のキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。

【0157】

キャップアナログは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において核酸分子の同時に起こるキャッピングを可能にするが、転写物の最大２０％がキャップされないままである。この、および内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’－キャップ構造とのキャップアナログの構造の相違は、低減された翻訳適格性および低減された細胞安定性をもたらし得る。

【0158】

一部の態様では、５’－キャップまたは５’－キャップアナログを有するＲＮＡを提供することは、前記５’－キャップまたは５’－キャップアナログの存在下でＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって達成され、ここで、前記５’－キャップは、生成したＲＮＡ鎖に転写と同時に（co-transcriptionally）組み込まれる。

【0159】

一部の態様では、ＲＮＡは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されてもよく、５’－キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、転写後にＲＮＡに付着されてもよい。一部の態様では、改変ＲＮＡは、より真正の５’－キャップ構造を生成するために、酵素を使用して転写後にキャップされる。本明細書で使用される場合、「より真正の」という語句は、構造的または機能的のいずれかで、内因性のまたは野生型の特性を厳密に反映させるか、または模倣する特性を指す。すなわち、「より真正の」特性は、先行技術の合成特性もしくはアナログなどと比較して、内因性の、野生型の、天然のもしくは生理学的な細胞機能および／もしくは構造のより良好な代表であるか、またはこれは、対応する内因性の、野生型の、天然のもしくは生理学的な特性よりも１つもしくは複数の点で優れている。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例は、当技術分野において公知の合成５’キャップ構造（または野生型の、天然のもしくは生理学的な５’キャップ構造）と比較して、数ある中でも、キャップ結合タンパク質の増強された結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低減された感受性、および／または低減された５’キャップ除去を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよびグアニンキャップヌクレオチドの間にカノニカルな５’－５’－三リン酸連結を作り出すことができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。このキャップは、例えば、当技術分野において公知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症促進性サイトカインの低減された活性化をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ ｍｐおよびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐが挙げられる。

【0160】

一部の態様では、５’末端キャップとしては、内因性キャップまたはキャップアナログが挙げられる。一部の態様では、５’末端キャップは、グアニンアナログを含む。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられる。

【0161】

一部の態様では、５’キャップは、５’－５’三リン酸連結を含む。一部の態様では、５’キャップは、三リン酸改変を含む５’－５’三リン酸連結を含む。一部の態様では、５’キャップは、２’－Ｏまたは３’－Ｏ－リボースメチル化ヌクレオチドを含む。一部の態様では、５’キャップは、改変グアノシンヌクレオチドまたは改変アデノシンヌクレオチドを含む。一部の態様では、５’キャップは、７－メチルグアニレートを含む。例示的なキャップ構造としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７，２’Ｏ－ｍＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ－ｍＧ、およびｍ７，３’Ｏ－ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）２’Ｏ－ｍＡが挙げられる。

【0162】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、改変５’キャップを含む。５’キャップにおける改変は、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡの半減期を増加させてもよく、ｍＲＮＡ翻訳効率を増加させ得る。一部の態様では、改変５’キャップは、以下の改変の１つまたは複数を含む：キャップされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’および／もしくは３’位の改変、糖環の酸素（炭素環を生じた）のメチレン部分（ＣＨ２）による置き換え、キャップ構造の三リン酸架橋部分での改変、または核酸塩基（Ｇ）部分での改変。

【0163】

改変され得る５’キャップ構造としては、限定されるものではないが、米国出願第２０１４／０１４７４５４号およびＷＯ２０１８／１６０５４０に記載されるキャップが挙げられ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0164】

ＩＲＥＳ配列
一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。特徴的なピコルナウイルスＲＮＡと最初に特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成を開始するのに重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、単独のリボソーム結合部位として作用してもよく、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとしての役割を果たしてもよい。１つよりも多くの機能的リボソーム結合部位を含有する核酸またはｍＲＮＡは、リボソーム（「多シストロン性核酸分子」）によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。核酸またはｍＲＮＡがＩＲＥＳと共に提供される場合、必要に応じて、第２の翻訳可能領域がさらに提供される。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、限定されないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（pest virus）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。

【0165】

末端構造改変：ポリＡテール
ＲＮＡプロセシングの間、アデニンヌクレオチドの長い鎖（ポリＡテール）は、通常、分子の安定性を増加させるためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加される。転写直後に、転写物の３’末端は、切断されて、３’ヒドロキシルが遊離する。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、１００～２５０残基長の間であるポリＡテールを付加する。

【0166】

一部の態様では、３’テールの長さは、３０ヌクレオチド長よりも長い。一部の態様では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長よりも長い。一部の態様では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。一部の態様では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。

【0167】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ポリＡ－Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方におけるＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この態様では、Ｇカルテットは、ポリＡテールの末端に組み込まれる。得られる核酸またはｍＲＮＡは、安定性、タンパク質産生、およびさまざまな時点での半減期を含む他のパラメーターについてアッセイされてもよい。ポリＡ－Ｇカルテットが、１２０ヌクレオチドのポリＡテールを単独で使用して見られるタンパク質産生の少なくとも７５％と同等のタンパク質産生をもたらすことが発見された。

【0168】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ポリＡテールを含み、鎖終結ヌクレオシドの付加によって安定化される。一部の態様では、ポリＡテールを有する改変ＲＮＡは、５’キャップ構造をさらに含む。

【0169】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ポリＡ－Ｇカルテットを含む。一部の態様では、ポリＡ－Ｇカルテットを有する改変ＲＮＡは、５’キャップ構造をさらに含む。

【0170】

一部の態様では、ポリＡテールまたはポリＡ－Ｇカルテットを含む改変ＲＮＡは、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド ３’－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、ならびに当技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載される他の改変ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化される。

【0171】

改変ヌクレオシド
一部の態様では、改変ＲＮＡは、１つまたは複数の改変ヌクレオシドを含む。一部の態様では、１つまたは複数の改変ヌクレオシドは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、α－チオ－シチジン、プソイド－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、α－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、プソイド－ウリジン、イノシン、α－チオ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシン、ピロロ－シチジン、５－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－メチル－ウリジン、５－ヨード－シチジン、およびそれらの組合せを含む。

【0172】

一部の態様では、改変ＲＮＡにおける１つまたは複数のウリジンは、改変ヌクレオシドによって置き換えられる。一部の態様では、ウリジンを置き換える改変ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）である。

【0173】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、米国出願番号２０１４／０１４７４５４号、国際出願ＷＯ２０１８１６０５４０、国際出願ＷＯ２０１５／１９６１１８、または国際出願ＷＯ２０１５／０８９５１１に記載される改変ＲＮＡを含み、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0174】

細胞傷害性ヌクレオシド
一部の態様では、改変ＲＮＡは、１つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドを含む。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二官能性改変ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗がん剤としては、限定されるものではないが、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ＦＴＯＲＡＦＵＲ（登録商標）（テガフールおよびウラシルの組合せ）、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、および６－メルカプトプリンが挙げられる。

【0175】

抗がん剤として、いくつかの細胞傷害性ヌクレオシドアナログが、臨床使用されているか、または臨床試験の対象になっている。そのようなアナログの例としては、限定されるものではないが、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、クラドリビン、クロファラビン、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシンおよび１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシンが挙げられる。そのような化合物の別の例は、リン酸フルダラビンである。これらの化合物は、全身的に投与されてもよく、限定されるものではないが、増殖している正常細胞よりも腫瘍細胞に対する特異性がほとんど、または全くないなどの細胞傷害剤に典型的な副作用を有し得る。

【0176】

細胞傷害性ヌクレオシドアナログのいくつかのプロドラッグも、当技術分野において報告されている。例としては、限定されるものではないが、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、およびＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。一般に、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環において活性薬物に変換され、腫瘍組織における活性薬物の選択的放出をほとんどまたは全く示さない場合がある。例えば、５’－デオキシ－５－フルオロシチジン（最終的に５－フルオロウラシル）のプロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織の両方で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含有する一連のカペシタビンアナログは、Fujiu et al.（米国特許第４，９６６，８９１号）によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｕｊｉｕによって記載される一連のものは、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンのＮ４アルキルおよびアラルキルカルバメート、ならびにこれらの化合物が通常の生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンを生じるという含意を含む。

【0177】

一連のシタラビンＮ４－カルバメートが、Fadl et al（その全体が参照により本明細書に組み込まれるPharmazie. 1995, 50, 382-7）によって報告されており、これらの化合物は、肝臓および血漿においてシタラビンに変換されるように設計された。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０４１２０３は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、このプロドラッグの一部は、Ｎ４－カルバメートである。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計され、胃腸管からの無傷プロドラッグの吸収後、肝臓および血漿における加水分解放出によってゲムシタビンを提供するよう意図された。Nomura et al（その全体が参照により本明細書に組み込まれるBioorg Med. Chem. 2003, 11, 2453-61）は、生体内還元において、酸性条件下でさらなる加水分解を必要とする中間体を生じて、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を生じる１－（３－Ｃ－エチニル－β－Ｄ－リボ－ペントファラノシル）シトシンのアセタール誘導体を記載している。

【0178】

化学療法薬であり得る細胞傷害性ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、ピラゾロ［３，４－Ｄ］－ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、６－チオグアニン、アシクロビル、ａｒａ－アデノシン、リバビリン、７－デアザ－アデノシン、７－デアザ－グアノシン、６－アザ－ウラシル、６－アザ－シチジン、チミジンリボヌクレオチド、５－ブロモデオキシウリジン、２－クロロ－プリン、およびイノシン、またはそれらの組合せも挙げられる。

【0179】

コード配列
本開示の一部の態様では、改変ＲＮＡは、インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２分子に含まれるのは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２サブユニット、または免疫調節機能を保持する変異体ＩＬ－１２分子である。

【0180】

一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0181】

一部の態様では、ＩＬ－１２分子は、ＩＬ－１２αサブユニットおよび／またはＩＬ－１２βサブユニットを含む。一部の態様では、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0182】

一部の態様では、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0183】

一部の態様では、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、リンカーによって連結されている。一部の態様では、リンカーは、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、または少なくとも約２０アミノ酸のアミノ酸リンカーを含む。一部の態様では、リンカーは、（ＧＳ）リンカーを含む。一部の態様では、ＧＳリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または１００からなる群より選択される正の整数である］を有する。一部の態様では、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。

【0184】

一部の態様では、ＩＬ１２分子は、配列番号４または配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0185】

一部の態様では、改変ｍＲＮＡは、配列番号６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0186】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0187】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0188】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、配列番号９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0189】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、ヌクレオチド配列を含むか、または表２中の配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の同一性を有するアミノ酸をコードする。

【0190】

追加の配列は、国際出願第ＷＯ２０１７２０１３５０号およびＷＯ２０１８／１６０５４０号に開示されており、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
表2

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【0191】

一部の態様では、改変ＲＮＡは、実験または治療目的の１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の態様では、実験または治療目的の遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、またはＩＬ－１２以外の増殖因子をコードする。サイトカインは、当技術分野において公知であり、用語それ自体が、免疫系内のある特定の細胞によって分泌され、他の細胞に対する効果を有する小タンパク質の一般化されたグループ分けを指す。サイトカインは、細胞性免疫応答を増強することが公知であり、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＴＧＦβ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、Ｉｌ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、およびケモカインを挙げることができる。ケモカインは、他の適用の中でも、感染に対する応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がん、および生殖を調べる研究のために有用である。ケモカインは、当技術分野において公知であり、近隣の応答性細胞、典型的には白血球の感染の部位への走化性を誘導するある種類のサイトカインである。ケモカインの非限定的な例としては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、およびＣＸＣＬ１０が挙げられる。増殖因子は、当技術分野において公知であり、用語それ自体が、サイトカインという用語と互換可能である場合がある。本明細書で使用される場合、「増殖因子」という用語は、細胞間でシグナル伝達し、細胞の成長を刺激することができる天然に存在する物質を指す。サイトカインは、増殖因子であり得るが、ある特定の種類のサイトカインは、細胞成長に対する阻害効果も有し得、したがって、２つの用語を区別する。増殖因子の非限定的な例としては、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＦＧ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子３（ＦＧＦ３）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ５）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）、線維芽細胞増殖因子１１（ＦＧＦ１１）、線維芽細胞増殖因子１２（ＦＧＦ１２）、線維芽細胞増殖因子１３（ＦＧＦ１３）、線維芽細胞増殖因子１４（ＦＧＦ１４）、線維芽細胞増殖因子１５（ＦＧＦ１５）、線維芽細胞増殖因子１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子１７（ＦＧＦ１７）、線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、線維芽細胞増殖因子２２（ＦＧＦ２２）、線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）、胎仔ウシ成長ホルモン（ＦＢＳ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン（Peresphin）、アルテミン、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、胎盤増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。

【0192】

医薬組成物
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。本開示の一部の態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体（賦形剤）をさらに含んで、標的疾患の処置における使用のための医薬組成物を形成する。「許容される」は、本明細書で使用される場合、担体が、組成物の活性成分と適合性でなければならず、処置される対象に有害であってはならないことを意味する。一部の態様では、担体は、活性成分を安定化することができる。薬学的に許容される賦形剤（担体）としては、緩衝液が挙げられ、これは、当技術分野において周知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkoins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。

【0193】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成される。脂質ナノ粒子は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈内溶液用バッグまたはバイアルに入れられてもよい。

【0194】

本開示の一部の態様では、医薬組成物は、腫瘍内、髄腔内、筋肉内、静脈内、皮下、吸入、皮内、リンパ内、眼内、腹腔内、胸膜内、脊髄内、血管内、鼻、経皮、舌下、粘膜下、経皮的、または経粘膜投与のために製剤化することができる。本開示の一部の態様では、医薬組成物は、腫瘍内注射のために製剤化することができる。腫瘍内注射は、本明細書で使用される場合、腫瘍への直接注射を指す。少量の薬物を使用しながら、高濃度の組成物を、ｉｎ ｓｉｔｕで達成することができる。免疫療法の局所送達は、著しい全身曝露およびオフターゲット毒性を防止しながら、複数の併用療法を可能にする。

【0195】

本開示の一部の態様では、医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射のために製剤化することができる。

【0196】

本開示の一部の態様では、医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態における、薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤、塩、または安定剤を含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。許容される担体および賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0197】

一部の態様では、本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されるような当技術分野において公知の方法によって調製され得る脂質ナノ粒子を含み、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の態様では、リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、規定の細孔サイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。

【0198】

本開示の一部の態様では、医薬組成物は、持続放出形式で製剤化される。持続放出調製物の好適な例としては、脂質ナノ粒子を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、限定されるものではないが、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸および７エチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＭ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、イソ酪酸酢酸スクロース、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

【0199】

一部の態様では、好適な表面活性剤としては、限定されるものではないが、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、３０、６０、８０、または８５）が挙げられる。一部の態様では、表面活性剤を有する組成物は、０．０５～５％の間の表面活性剤を含む。一部の態様では、組成物は、０．１および２．５％を含む。必要であれば、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルが添加されてもよいことが認識されるであろう。

【0200】

一部の態様では、医薬組成物は、経口、非経口、もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤もしくは懸濁剤、または坐剤などの単位剤形である。

【0201】

錠剤などの固形組成物を調製するために、主な活性成分は、薬学的担体、例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤化成分、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合して、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均一な混合物を含有する固形予備処方組成物を形成することができる。これらの予備処方組成物を均質なものと称する場合、活性成分が、組成物全体にわたって均一に分散し、その結果、組成物が、錠剤、丸剤およびカプセル剤などの同様に有効な単位剤形に容易にさらに分割され得ることを意味する。次いで、この固形予備処方組成物は、０．１～約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上に記載される種類の単位剤形にさらに分割される。新規組成物の錠剤または丸剤は、コーティングされるか、または他の方法で配合されて、延長された作用の利益を与える剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投薬構成要素および外側投薬構成要素を含むことができ、後者は、前者の上を覆うエンベロープの形態にある。２つの構成要素は、胃における崩壊に耐える役目を果たし、内側構成要素が、十二指腸に無傷で通過するか、または放出の遅延を可能にする腸溶性層によって分離され得る。各種の材料を、そのような腸溶性層またはコーティングのために使用することができ、そのような材料としては、いくつかのポリマー酸、ならびにポリマー酸とセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物が挙げられる。

【0202】

好適な乳剤は、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）、およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）などの市販の脂肪乳剤を使用して調製され得る。活性成分は、事前に混合された乳剤組成物に溶解させてもよく、あるいは、油（例えば、大豆油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、またはアーモンド油）に溶解させて、リン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質、または大豆レシチン）および水と混合する際に乳剤が形成されてもよい。乳剤の張度を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが認識されるであろう。好適な乳剤は、典型的には、最高で２０％まで、例えば、５～２０％の間の油を含有する。脂肪乳剤は、好適なサイズを有する脂肪液滴を含むことができ、５．５～８．０の範囲のｐＨを有することができる。

【0203】

吸入または吹送のための医薬組成物は、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁物、ならびに粉末を含む。液体または固形組成物は、上で示される好適な薬学的に許容される賦形剤を含有していてもよい。一部の態様では、組成物は、局所または全身効果のために、経口または鼻呼吸経路によって投与される。

【0204】

薬学的に許容される溶媒中の組成物は、気体の使用によって噴霧されてもよい。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸い込まれてもよく、または噴霧デバイスを、フェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸器に取り付けてもよい。溶液、懸濁物、または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから投与されてもよい。

【0205】

治療適用
本開示の一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、がんを処置するために使用される。

【0206】

一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物のいずれかの有効量は、好適な経路、例えば、腫瘍内投与、静脈内投与（例えば、ボーラスとして、またはある期間にわたる持続注入によって）を介して、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerebospinal）、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、吸入、または局部経路によって、それを必要とする対象に投与される。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む液体製剤のための市販の噴霧器が、投与のために有用である。液体製剤は、噴霧することができ、凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧することができる。一部の態様では、本明細書に記載される医薬組成物は、フッ化炭素製剤および定量吸入器を使用して、エアロゾル化されるか、または凍結乾燥および破砕された粉末として吸入される。一部の態様では、本明細書に記載される医薬組成物は、腫瘍内注射のために製剤化される。一部の態様では、本明細書に記載される医薬組成物は、局所経路を介して対象に投与され、例えば、腫瘍部位または感染部位などの局所部位に注射される。一部の態様では、対象は、ヒトである。

【0207】

本明細書で使用される場合、「有効量」は、単独で、または１つもしくは複数の他の活性薬剤と組み合わせてのいずれかで、対象に対して治療効果を付与するために必要な各活性薬剤の量を指す。一部の態様では、治療効果は、低減された腫瘍負荷、がん細胞の低減、または増加した免疫活性である。脂質ナノ粒子が治療効果を達成するかどうかの決定は、当業者に明白であろう。有効量は、当業者によって認識されるように、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別および体重を含む個々の患者のパラメーター、処置の持続期間、併用療法（もしあれば）の性質、投与の特定の経路、ならびに医療従事者の専門知識内の同様な要因に応じて変わる。これらの要因は、当業者に周知であり、慣例的な実験だけで対処することができる。一般に、個々の構成要素またはその組合せの最大用量、すなわち、妥当な医学的判断による最高安全用量が使用されることが好ましい。

【0208】

半減期などの経験的な考慮事項は、一般に、投薬量の決定に寄与する。投与の頻度は、治療の間にわたって決定および調整され得、必ずしもそうではないが、一般に、標的疾患／障害の処置および／または抑制および／または回復および／または遅延に基づく。あるいは、脂質ナノ粒子の持続的連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するためのさまざまな製剤およびデバイスが、当技術分野において公知である。

【0209】

本開示の一部の態様では、処置は、本明細書に開示される脂質ナノ粒子または医薬組成物の単回注射である。一部の態様では、単回注射は、それを必要とする対象に腫瘍内投与される。

【0210】

本開示の一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物のための投薬量は、脂質ナノ粒子の１回または複数の投与が与えられた個体において経験的に決定され得る。個体は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物の漸増投薬量を与えられる。本明細書の脂質ナノ粒子または医薬組成物の有効性を評価するために、疾患／障害の指標が追跡され得る。数日またはそれよりも長くにわたる反復投与のために、状態に応じて、所望の症状の抑制が起こるまで、あるいは十分な治療レベルが達成されて、標的疾患もしくは障害またはその症状が軽減されるまで、処置は持続される。

【0211】

本開示の一部の態様では、投薬頻度は、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごとに１回；あるいは１か月ごと、２か月ごと、もしくは３か月ごと、またはそれよりも長い期間ごとに１回である。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。使用される脂質ナノ粒子の投薬レジメンは、時間にわたり変えることができる。

【0212】

本開示の一部の態様では、方法は、１用量または複数回用量の本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0213】

本明細書に記載される脂質ナノ粒子の適切な投薬量は、特定の脂質ナノ粒子、疾患／障害の種類および重症度、脂質ナノ粒子が予防または治療目的のために投与されるか、以前の治療、対象の病歴および脂質ナノ粒子への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまで、本明細書に開示される脂質ナノ粒子または医薬組成物を投与してもよい。一部の態様では、所望の結果は、腫瘍負荷の減少、がん細胞の減少、または増加した免疫活性である。投薬量が所望の結果をもたらしたかどうかを決定する方法は、当業者に明白であろう。１つまたは複数の本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的であるか、および当業者に公知の他の要因に応じて、連続的または断続的であり得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物の投与は、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、または、例えば、標的疾患もしくは障害が発生する前、その間、もしくはその後のいずれかに、一連の間隔をおいた用量であってもよい。

【0214】

本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、障害、疾患の症状、または疾患もしくは障害への素因を、治癒する、治す、軽減する、和らげる、変更する、是正する、回復させる、改善する、またはそれに影響を与える目的で、標的疾患もしくは障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害への素因を有する対象への、１つまたは複数の活性薬剤を含む組成物の適用または投与を指す。

【0215】

本明細書で使用される場合、標的疾患／障害を軽減することは、疾患の発生もしくは進行を遅延させること、または疾患の重症度を低減することを含む。疾患を軽減することは、必ずしも治癒的結果を必要としない。本明細書で使用される場合、標的疾患または障害の発生を「遅延させること」は、疾患の進行を、延ばす、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化する、および／または遅らせることを意味する。この遅延は、処置される疾患および／または対象の病歴に応じて、さまざまな時間の長さであり得る。疾患の発生を遅延させるもしくは軽減する、または疾患の開始を遅延させる方法は、方法を使用しないときと比較した場合に、所与の時間枠において疾患の１つもしくは複数の症状を発生する確率を低減する、および／または所与の時間枠において症状の程度を低減する方法である。そのような比較は、典型的には、統計学的に有意な結果を与えるのに十分な対象の数を使用した臨床研究に基づく。

【0216】

疾患の「発生」または「進行」は、疾患の初期の症状発現および／または次の進行を意味する。疾患の発生は、当技術分野において周知の標準的な臨床技法を使用して、検出可能で、評価することができる。しかしながら、発生は、予測不可能であり得る進行も指す。本明細書で使用される場合、発生または進行は、症状の生物学的経過を指す。発生は、出現、再発、および開始を含む。本明細書で使用される場合、標的疾患または障害の開始または出現は、初期の開始および／または再発を含む。

【0217】

一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも高くｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍負荷またはがん細胞成長を低減するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれよりも高く免疫活性を増加させるのに有効な量で投与される。

【0218】

一部の態様では、対象は、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、またはラットである。一部の態様では、対象は、ヒトである。一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、対象におけるＴ細胞活性などの免疫活性を増強する。

【0219】

一部の態様では、対象は、がんを有するか、がんを有すると疑われるか、またはがんについてのリスクがあるヒトである。一部の態様では、がんは、黒色腫、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌、胃がん、および扁平上皮細胞頭頚部がんを含むさまざまな種類の頭頸部がんからなる群より選択される。一部の態様では、がんは、黒色腫、肺がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、尿路上皮癌、またはホジキンリンパ腫であり得る。

【0220】

標的疾患または障害を有する対象は、慣例的な健康診断、例えば、臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、または超音波によって特定することができる。標的疾患または障害を有すると疑われる対象は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を示す可能性がある。疾患または障害についてのリスクがある対象は、その疾患または障害に関連するリスク因子の１つまたは複数を有する対象であり得る。疾患または障害のリスクがある対象は、慣例的な医療行為によって特定することもできる。

【0221】

一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、少なくとも１つの追加の好適な治療剤と共投与される。一部の態様では、少なくとも１つの追加の好適な治療剤は、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、または本明細書に記載される脂質ナノ粒子の免疫刺激効果を増強および／もしくは補完する役目を果たす他の薬剤である。一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物、および少なくとも１つの追加の治療剤は、逐次的な様式で対象に投与される、すなわち、各治療剤は、異なる時間に投与される。一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物、および少なくとも１つの追加の治療剤は、実質的に同時の様式で対象に投与される。

【0222】

一部の態様では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物は、他の生物学的に活性な成分（例えば、異なる抗がん療法）、非薬物療法（例えば、手術）、またはそれらの組合せの投与と組み合わされてもよい。

【0223】

本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物および別の抗がん剤（例えば、化学療法剤）の任意の組合せが、がんを処置するために任意の順番で使用されてもよいことが当業者に認識されるであろう。本明細書に記載される組合せは、限定されるものではないが、腫瘍形成もしくは腫瘍成長を低減すること、がん細胞を低減すること、免疫活性を増加させること、および／またはがんに関連する少なくとも１つの症状を軽減することについての有効性、あるいは組合せの別の薬剤の副作用を緩和することについての有効性を含むいくつかの要因に基づいて選択され得る。例えば、本明細書に記載される併用療法は、組合せの各個々のメンバーに関連する副作用のいずれか、例えば、抗がん剤に関連する副作用を低減し得る。

【0224】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、化学療法、放射線療法、手術療法、免疫療法、またはそれらの組合せである。一部の態様では、化学療法剤は、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、ｎａｂ－パクリタキセル（nab-paclitexal）、ペメトレキセド、ビノレルビン、またはそれらの組合せである。一部の態様では、放射線療法は、電離放射線、ガンマ線、中性子ビーム放射線療法、電子ビーム放射線療法、陽子療法、近接照射療法、全身放射性同位元素、放射線増感剤、またはそれらの組合せである。一部の態様では、手術療法は、根治的手術（例えば、腫瘍除去手術）、予防的手術、腹腔鏡手術、レーザー手術、またはそれらの組合せである。一部の態様では、免疫療法は、養子細胞移入、治療がんワクチン、またはそれらの組合せである。

【0225】

一部の態様では、化学療法剤は、白金剤(platinating agent)、例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、ロバプラチン、トリプラチン、四硝酸塩、ピコプラチン、プロリンダク、アロプラチン、および他の誘導体；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン／ＳＮ３８、ルビテカン、ベロテカン、および他の誘導体；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド（ＶＰ－１６）、ダウノルビシン、ドキソルビシン剤（例えば、ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンアナログ、またはリポソーム中のドキソルビシンおよびその塩もしくはアナログ）、ミトキサントロン、アクラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、アムサクリン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン、テニポシド、および他の誘導体；代謝拮抗薬、例えば、葉酸ファミリー（メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン、および関連物）；プリンアンタゴニスト（チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、６－メルカプトプリン、ペントスタチン、クロファラビン、および関連物）およびピリミジンアンタゴニスト（シタラビン、フロクスウリジン、アザシチジン、テガフール、カルモフール、カペシタビン（Capacitabine）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル（５ＦＵ）、および関連物）；アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、イホスファミド、トロホスファミド、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、および関連物）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、および関連物）；トリアゼン（例えば、ダカルバジン、アルトレタミン、テモゾロミド、および関連物）；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、および関連物）；プロカルバジン；ミトブロニトール、およびアジリジン（例えば、カルボコン、トリアジクオン、チオテパ、トリエチレンメラミン（triethylenemalamine）、および関連物）；抗生物質、例えば、ヒドロキシウレア、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン剤、ダウノルビシン、エピルビシン、および他の誘導体）；アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロンおよび関連物）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓファミリー（例えば、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、プリカマイシン）；紫外光；ならびにそれらの組合せである。

【0226】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、抗体である。抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、さまざまなメカニズムを通して、がん細胞に対するそれらの治療効果を達成する。それらは、アポトーシスまたはプログラム細胞死を生じさせる際に直接的な効果を有し得る。それらは、例えば、増殖因子受容体などのシグナル伝達経路の構成要素をブロックし、腫瘍細胞の増殖を効率的に阻むことができる。モノクローナル抗体を発現する細胞では、それらは、抗イディオタイプ抗体形成を引き起こすことができる。間接的な効果としては、単球およびマクロファージなどの細胞傷害を有する細胞を動員することが挙げられる。この種類の抗体媒介性細胞死滅は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。抗体は、補体も結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として公知の直接的な細胞毒性をもたらす。手術法と免疫療法薬または方法を組み合わせることは、例えば、Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40において実証されるように、成功裏のアプローチである。以下のリストは、本発明と組み合わせて使用することができる抗がん抗体および可能性がある抗体標的（括弧内）の一部の非限定的な例を提供する：アバゴボマブ（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブマフェナトックス（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シズツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンαｖβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ－Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬ－１β）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ））、グレンバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマ(Igovoma)（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ－５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナルナツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒ α）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ(human scatter factor receptor kinase)）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（Pemtumoma）（ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（Pertuzuma）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ－６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（アルファ－フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ－１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４－１ＢＢ）、ボロシキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（ＣＤ４）。

【0227】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、融合タンパク質、またはそれらの組合せである。ケモカインの例としては、限定されるものではないが、ＣＣＲ７ならびにそのリガンドのＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１、さらにまた、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ１６が挙げられる。他の例は、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸＣＬ１２である。さらにまた、共刺激分子または調節分子、例えば、Ｂ７リガンド（Ｂ７．１およびＢ７．２）などが有用である。例えば、インターロイキン、特に（例えば、ＩＬ－１からＩＬ１７）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮアルファ１からＩＦＮアルファ８、ＩＦＮアルファ１０、ＩＦＮアルファ１３、ＩＦＮアルファ１４、ＩＦＮアルファ１６、ＩＦＮアルファ１７、ＩＦＮアルファ２１、ＩＦＮベータ１、ＩＦＮＷ、ＩＦＮＥ１およびＩＦＮＫ）、造血因子、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、およびＴＧＦファミリーの他のメンバー）、限定されるものではないが、４１ＢＢ、４１ＢＢ－Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＴＬＡ－４ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、Ｆａｓ、Ｆａｓ－Ｌ、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｐ７５ＮＧＦ－Ｒ、ＤＲ６、ＬＴ．ベータ．Ｒ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、ＴＡＪ、ＴＮＦＲＩＩ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＲＥＬＴ、およびＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ－１）を含む受容体の腫瘍壊死因子ファミリーの最終メンバーおよびそれらのリガンド、ならびに他の共刺激分子、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）、ならびに細胞死受容体６（ＤＲ６）などの他のサイトカインも有用である。特に、ＣＤ４０／ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞の生存および増殖に対するそれらの直接的な影響を理由として、併用免疫療法のための重要な標的である。総説について、Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340を参照されたい。

【0228】

一部の態様では、他の抗がん治療薬は、細菌処置である。研究者らは、酸素が不十分な腫瘍の内側を破壊するためにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉなどの嫌気性細菌を使用している。次いで、これらは、腫瘍の酸素化された側と接触すると死滅するはずであり、それらが、身体の残りの部分に無害であろうことを意味する。別の戦略は、非毒性プロドラッグを毒性薬物に変換することができる酵素で形質転換された嫌気性細菌を使用することである。腫瘍の壊死および低酸素エリアにおける細菌の増殖により、酵素は、腫瘍中でのみ発現される。したがって、全身的に適用されたプロドラッグは、腫瘍においてのみ毒性薬物に代謝される。これは、非病原性嫌気性生物のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓで有効であることが実証されている。

【0229】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、キナーゼ阻害剤である。がん細胞の成長および生存は、キナーゼ活性の調節解除と密接に連動する。正常なキナーゼ活性を修復し、したがって腫瘍成長を低減するために、幅広い範囲の阻害剤が使用されている。標的化キナーゼの群は、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂ－Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２／ＥｒｂＢ２、ＩＧＦ－ＩＲ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ｃ－Ｋｉｔ、Ｆｌｔ－４、Ｆｌｔ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ｃ－Ｒｅｔ、ＡＬＫ、細胞質チロシンキナーゼ、例えば、ｃ－ＳＲＣ、ｃ－ＹＥＳ、Ａｂｌ、ＪＡＫ－２、セリン／トレオニンキナーゼ、例えば、ＡＴＭ、Ａｕｒｏｒａ ＡおよびＢ、ＣＤＫ、ｍＴＯＲ、ＰＫＣｉ、ＰＬＫ、ｂ－Ｒａｆ、Ｓ６Ｋ、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１、ならびに脂質キナーゼ、例えば、ＰＩ３Ｋ、ＳＫ１を含む。小分子キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＨＡ－７３９３５８、ニロチニブ、ダサチニブ、およびＰＤ１６６３２６、ＮＳＣ ７４３４１１、ラパチニブ（ＧＷ－５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、スーテント（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３－９００６）、ならびにレフルノミド（ＳＵ１０１）である。より多くの情報について、例えば、Zhang et al. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39を参照されたい。

【0230】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、トール様受容体である。トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーは、自然免疫および適応免疫の間の重要なリンクであり、多くのアジュバントの効果は、ＴＬＲの活性化に依拠する。多数の確立されたがんに対するワクチンには、ワクチン応答をブーストするために、ＴＬＲに対するリガンドを組み込まれている。ＴＬＲ２以外に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、特に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、受動免疫療法アプローチにおいてがん治療のために検討されている。密接に関連するＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、免疫細胞、腫瘍細胞、および腫瘍微小環境に影響を及ぼすことによって、抗腫瘍応答に寄与し、ヌクレオシドアナログ構造によって活性化され得る。すべてのＴＬＲは、単独で動作する免疫療法薬またはがんワクチンアジュバントとして使用されており、本発明の製剤および方法と相乗的に組み合わされ得る。より多くの情報について、van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55を参照されたい。

【0231】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、血管新生阻害剤である。血管新生阻害剤は、腫瘍が生存するために必要な血管の広範な成長（血管新生）を防止する。腫瘍細胞の栄養素および酸素の需要の増加に合わせて腫瘍細胞によって促進される血管新生は、例えば、異なる分子を標的化することによってブロックすることができる。本発明と組み合わされ得る血管新生媒介分子または血管新生阻害剤の非限定的な例は、可溶性ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦアイソフォームのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５、受容体のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ならびに共受容体のニューロピリン－１およびニューロピリン－２）１およびＮＲＰ－１、アンジオポエチン２、ＴＳＰ－１およびＴＳＰ－２、アンジオスタチンおよび関連分子、エンドスタチン、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子－４、ＴＩＭＰおよびＣＤＡＩ、Ｍｅｔｈ－１およびＭｅｔｈ－２、ＩＦＮ－α、－βおよび－γ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－４、－１２および－１８、プロトロンビン（クリングルドメイン－２）、アンチトロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質、レスチン、ならびに例えば、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ－４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ－α、血小板因子－４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来血管新生阻害因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、２－メトキシエストラジオール、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチン（prolactina）Ｖβ３阻害剤、リノミド、タスキニモドのような薬物であり、総説について、Schoenfeld and Dranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81を参照されたい。

【0232】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、ウイルス系ワクチンである。利用可能なまたは開発中のいくつかのウイルス系がんワクチンがあり、これらは、本開示の製剤と一緒に併用治療アプローチにおいて使用することができる。そのようなウイルスベクターの使用の１つの利益は、免疫応答を開始するそれらの固有の能力であり、ウイルス感染の結果として起こる炎症反応は、免疫活性化に必要な危険シグナルを生じる。理想的なウイルスベクターは、抗腫瘍特異的応答をブーストすることを可能するために、安全であるべきであり、かつ抗ベクター免疫応答を導入してはならない。ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびトリポックスウイルスなどの組換えウイルスは、動物腫瘍モデルにおいて使用されており、それらの有望な結果に基づいて、ヒト臨床試験が開始されている。特に重要なウイルス系ワクチンは、ウイルスの外皮由来のある特定のタンパク質を含有する小粒子のウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ウイルス様粒子は、ウイルス由来の任意の遺伝子材料を含有せず、感染を引き起こすことができないが、それらは、それらの外皮上に腫瘍抗原を提示するように構築され得る。ＶＬＰは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、またはパルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、およびフラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）を含む他のウイルス科などのさまざまなウイルスに由来し得る。一般的な総説については、Sorensen and Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177-93を参照されたい；がんに対するウイルス様粒子については、Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569-83；およびGuillen et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133に総説されている。

【0233】

一部の態様では、他の抗がん治療剤は、ペプチド系標的療法である。ペプチドは、細胞表面受容体、または腫瘍の周囲の影響を受けた細胞外基質に結合することができる。これらのペプチド（例えば、ＲＧＤ）に付着する放射性核種は、核種が細胞の近辺で減衰する場合に、最終的に、がん細胞を死滅させる。特に、これらの結合モチーフのオリゴマーまたはマルチマーは、これが増強された腫瘍特異性およびアビディティーをもたらし得るので、非常に興味深いものである。非限定的な例について、Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61を参照されたい。

【0234】

治療における使用のためのキット
本開示は、がん（例えば、黒色腫、肺がん、結腸直腸がん、または腎細胞がん）に対する免疫療法における使用のため、および／またはがんについてのリスクを処置もしくは低減するためのキットも提供する。一部の態様では、キットは、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物を含む１つまたは複数の容器を含む。

【0235】

一部の態様では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかに従った使用についての指示を含む。例えば、含まれる指示は、標的疾患を処置し、その開始を遅延させ、または軽減するための本明細書に記載される医薬組成物の投与の説明を含み得る。一部の態様では、指示は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物を標的疾患／障害のリスクがある対象に投与する説明を含む。

【0236】

一部の態様では、指示は、投薬量の情報、投薬スケジュール、および投与の経路を含む。一部の態様では、容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、または部分単位（sub-unit）用量である。一部の態様では、指示は、標識または添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）における書面での指示である。一部の態様では、指示は、機械可読指示（例えば、磁気または光学保存ディスクに入れられた指示）である。

【0237】

一部の態様では、標識または添付文書は、本明細書に開示される脂質ナノ粒子または医薬組成物が、本明細書に記載されるものなどのがんに関連する疾患または障害を処置する、その開始を遅延させる、および／または軽減するために使用されることを示す。指示は、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するために提供され得る。

【0238】

一部の態様では、本明細書に記載されるキットは、好適な包装中にある。一部の態様では、好適なパッキングは、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、包装は、吸入器、鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）、またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせた使用のためのパッケージを含む。一部の態様では、キットは、無菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈内溶液用バッグまたはバイアルであり得る）。一部の態様では、容器はまた、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈内溶液用バッグまたはバイアルであり得る）。一部の態様では、少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載される脂質ナノ粒子または医薬組成物である。

【0239】

一部の態様では、キットは、緩衝液および説明情報などの追加の構成要素をさらに含む。一部の態様では、キットは、容器、および容器上のまたはそれに関連する標識もしくは添付文書を含む。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるキットの内容物を含む製品を提供する。

【0240】

一般技法
本開示の実施は、他に指示されない限り、当技術分野の技能内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いる。分子クローニング：A Laboratory Manual, second edition（Sambrook, et al., 1989） Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；細胞生物学：A Laboratory Notebook（J. E. Cellis, ed., 1998） Academic Press；Animal Cell Culture（R. I. Freshney, ed. 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture（J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998） Plenum Press；細胞および組織培養：Laboratory Procedures（A. Doyle, J.B. Giffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8） J. Wiley and Sons；Method of Enzymology（Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology（D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology（F.M. Ausubel, et al., eds., 1987)：ＰＣＲ：The Polymerase Chain Reaction,（Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology（J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology（C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies（P. Finch, 1997)；抗体：a practical approach（D. Catty, ed., IRL Press, 1988-1989)；モノクローナル抗体：a practical approach（P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；抗体の使用：a laboratory manual（E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies（M. Zanette and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。さらなる労作なしで、当業者は、上の記載に基づいて、本開示をその最大限度まで利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【実施例】

【0241】

（実施例１：改変ＲＮＡの構築）
本明細書に開示される改変ＲＮＡを構築するために、以下の材料および方法を使用した。

【0242】

鋳型調製
レプリコンＲＮＡのために、ペイロードを含有するＶＥＥレプリコンベクターを調製した。そのようなベクターを調製する方法は、当技術分野において公知である。ベクタープラスミドは、以下の通り、Ｉ－ＳｃｅＩを使用してさらに線状化した。簡潔には、１μｇのレプリコンプラスミドベクターを、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中、Ｉ－ＳｃｅＩで、３７℃で１時間処理した。次いで、酵素を、６５℃で２０分間、熱失活させた。異なる構成要素の濃度および体積を表３（下記）に提供する。
表3. ベクタープラスミドの線状化

【表3】

【0243】

改変ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）鋳型のために、ＤＮＡベクターを、Ｔ７プロモーター（ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＴＡ ＧＴ；配列番号ＸＸ）およびＳＧＰを含有するフォワードプライマーならびに３’－ＵＴＲ（ＧＡＡ ＡＴＡ ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＡＴ ＴＣＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡ；配列番号ＸＸ）のリバースプライマーと共にレプリコンプラスミドを使用して、生成した。フォワードおよびリバースプライマーについてのＴ_ｍは、それぞれ、６８℃および６４℃であった。表４および５（下記）は、ＰＣＲ反応に関する追加情報を提供する。
表4. PCR設

【表4】

表5. PCRサイクリング条件

【表5】

【0244】

ＰＣＲ反応におけるプラスミドＤＮＡ（鋳型）を、ＤｐｎＩによって消化した。より具体的には、初期プラスミド１μｇあたり１μＬのＤｐｎＩを、ＰＣＲ試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。

【0245】

ＰＣＲ（ｍｏｄＲＮＡ鋳型）およびＩ－ＳｃｅＩ処理レプリコンＤＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ鋳型）を、プレキャストゲルにおいてチェックして、複製された構築物の純度（ＰＣＲ）および完全性（レプリコン鋳型）を確認した。具体的には、２０ｎｇのＤＮＡを、１．２％のＤＮＡゲル上にロードし、２７５Ｖで７～１０分間流した。確認したら、ＤＮＡを、２０μＬの水で溶出させた。

【0246】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
上記のＤＮＡをＲＮＡに転写するために、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ Ｔ７キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、本明細書に記載される改変と伴って使用した。改変ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）合成のために、キットのＵＴＰ構成要素を、Ｎ１－メチルプソイドウリジン－５’－三リン酸で置き換えた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プロセスを開始するために、キットの構成要素を、氷上で解凍し、混合し、微量遠心分離機中でパルススピンした。試料を、さらなる使用まで、氷上に置いた。

【0247】

同時転写キャッピング法：キャップアナログレプリコンプラスミドおよびｍｏｄＲＮＡ鋳型を使用する産生のために、表６（下記）に示される構成要素を混合し、微量遠心分離機中でパルススピンし、次いで、４００ｒｐｍで、サーモミキサーにおいて３７℃で３時間、インキュベートした。１μＬのアリコートを、品質管理の目的で取り出した。
表6. 同時転写キャッピングの構成要素

【表6】

【0248】

転写後酵素キャッピング法：酵素レプリコンプラスミドを使用する産生のために、反応を、表７（下記）に提供される構成要素を使用して、室温でアセンブルした。
表7. 転写後酵素キャッピングの構成要素

【表7】

【0249】

ＤＮＡｓｅ処理：鋳型ＤＮＡを消化するために、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ酵素を使用した。酵素がＩＶＴ反応において活性であったので、１０×緩衝液を添加する必要はなかった。反応物を、ヌクレアーゼ不含水で５０μＬに希釈した。次いで、５μＬの酵素（２Ｕ／μＬ）を、２０μＬのＩＶＴ反応物に添加した。次いで、混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキットを使用して精製した。１μＬのアリコートを、品質管理の目的で取り出した。

【0250】

キャッピングおよび２’－Ｏ－メチル化：上記の転写後キャッピング法を使用して作製されたＩＶＴ ｍＲＮＡの５’末端上に２’－Ｏ－メチル化を有するメチル化グアニンキャップ（キャップ１）構造を調製するために、以下の方法を使用した。最初に、キャップされていないＲＮＡおよびヌクレアーゼ不含水を混合して、１３μＬの最終体積にした。次いで、混合物を、６５℃で５分間加熱した。次いで、混合物を、さらに５分間、氷上に置いた。次いで、表８（下記）に提供される構成要素を、混合物に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次に、ＲＮＡを、少量のＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキットを使用して精製した。
表8. キャッピングおよび2'-O-メチル化の構成要素

【表8】

【0251】

ポリ（Ａ）テール合成：ポリ（Ａ）テールを改変ＲＮＡに付加するために、表９（下記）に提供される構成要素を、反応管に添加した。次いで、反応物を、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応を、少量のＭｏｎａｒｃｈクリーンアップキットによりＲＮＡを直接精製することによって、停止した。品質管理として、２００ｎｇのＲＮＡを、１．２％のＲＮＡゲル上を流して、ＲＮＡのサイズを確認した。それを行うために、ＲＮＡを、５０％のホルムアルデヒド試料緩衝液で、６５℃で５分間変性させ、次いで、直ぐに、少なくとも１分間氷上に置いた。次いで、変性ＲＮＡを、ゲル上にロードし、トランスイルミネーターを使用して可視化した。
表9. ポリ(A)テール合成の構成要素

【表9-1】

【表9-2】

【0252】

（実施例２：発現動態のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析）
本明細書に開示されるＲＮＡ構築物の発現効率を評価するために、ＩＬ－１２タンパク質をコードする自己複製性ｍＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）および改変ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）の両方を、本明細書に記載される方法（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して構築した。次いで、ｍＲＮＡ構築物を、ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを使用して２つの異なる細胞系（すなわち、Ｂ１６．Ｆ１０および４Ｔ１）にトランスフェクトし、コードされたタンパク質の発現レベルを、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後に評価した。

【0253】

図１Ａに示されるように、ＩＬ－１２発現を、ｒｅｐＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＢ１６．Ｆ１０細胞において、早ければ２４時間で観察した。トランスフェクション４８時間後まで、ＩＬ－１２発現の有意差を、ｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトされた細胞と比較して、ｒｅｐＲＮＡでトランスフェクトされたＢ１６．Ｆ１０細胞において観察した。増加したＩＬ－１２発現は、少なくともトランスフェクション７２時間後まで持続した。類似の結果が、４Ｔ１細胞系において観察された（図１Ｂを参照されたい）。これらの結果は、本明細書に開示される自己複製性ｍＲＮＡが、改変ｍＲＮＡよりも高いレベルおよび長い持続期間、コードされるタンパク質を発現することができることを示唆する。

【0254】

（実施例３：抗腫瘍有効性のｉｎ ｖｉｖｏ分析）
本明細書に開示されるＲＮＡ構築物が、ｉｎ ｖｉｖｏで活性を発揮し得るかどうかを評価するために、黒色腫のマウスモデルを使用した。簡潔には、黒色腫を、Ｂ６－Ｆ１０細胞を動物に接種する（皮下投与を介して）ことによって誘導した。腫瘍が最適サイズ（約３５０ｍｍ^３）に達したら、以下の１つの単回高用量を、動物の腫瘍に注射した：以下のうちの１つの投与：（１）対照ｍＲＮＡ；（ｉｉ）ＩＬ－１２をコードする改変ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ１２）；および（ｉｉｉ）ＩＬ－１２をコードする自己複製性ｍＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ１２）。次いで、腫瘍体積および動物の生存の両方を、処置後のさまざまな時点で評価した。

【0255】

予想通り、対照ｍＲＮＡで処置された動物は、腫瘍を制御できなかった（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。すべての対照動物は、処置後約２５日目までに腫瘍で死亡した（図４を参照されたい）。対照的に、ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ１２またはｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ１２のいずれかで処置された動物において顕著な腫瘍の低減があった。腫瘍体積の全体的な低減は、２つの群の間で類似していた。ｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ１２構築物で処置された動物は、ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ－１２を受けた動物と比較して、わずかに長く生存していた（図４を参照されたい）。これらの結果は、少なくともｉｎ ｖｉｖｏで、本明細書に開示される改変ｍＲＮＡ構築物（例えば、ＩＬ－１２をコードする）は、高用量で投与された場合に、腫瘍の処置において自己複製性ｍＲＮＡ（例えば、ＩＬ－１２をコードする）とほぼ同じぐらい有効であることを示唆する。

【0256】

（実施例４：自己複製性ｍＲＮＡおよび改変ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達後のペイロード発現の比較）
本明細書に開示されるＲＮＡ構築物のｉｎ ｖｉｖｏ活性をさらに特徴付けるために、コードされたＩＬ－１２タンパク質の発現を、実施例３からの腫瘍動物において評価した。図３に示されるように、処置後４日目に、対照と比較して、ｒｅｐＲＮＡ－ＩＬ１２またはｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ１２のいずれかで処置された動物は、送達部位（すなわち、腫瘍）でより高いレベルのＩＬ－１２を発現した。しかしながら、ＩＬ－１２発現は、ｍｏｄＲＮＡ－ＩＬ１２で処置された動物において顕著により高かった。この結果は、実施例２に提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致すると思われ、本明細書に開示される自己複製性ｍＲＮＡ構築物が、改変ｍＲＮＡ構築物と比較して、コードタンパク質の発現にはるかにより効率的であることを示唆する。

【0257】

概要および要約のセクションではなく、詳細な説明のセクションは、請求項を解釈するために使用されることが意図されることが認識されるべきである。概要および要約のセクションは、本発明者によって企図されるすべてではないが１つまたは複数の本発明の例示的な実施形態を示し得、したがって、本発明および添付の特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。

【0258】

本発明を、特定された機能およびその関係の実現を示す機能的ビルディングブロックの助けにより、上に記載した。これらの機能的ビルディングブロックの境界は、説明の便宜上、自由裁量で本明細書に定義されている。特定された機能およびその関係が適切に行われる限り、代替の境界を定義することができる。

【0259】

特定の実施形態の前述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の者は、当技術分野における技能内の知識を適用することによって、過度の実験なく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態のさまざまな適用に容易に改変および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および改変は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の表現または専門用語は、説明の目的であって限定の目的ではないことが理解されるべきであり、その結果、本明細書の専門用語または表現は、教示およびガイダンスを踏まえて当業者によって解釈されるべきである。

【0260】

本発明の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。

【0261】

本出願の特許請求の範囲は、親出願または他の関連出願の特許請求の範囲とは異なる。したがって、出願人は、本出願に関して、親出願または任意の先行出願において行われた特許請求の範囲の任意の放棄を無効にする。したがって、審査官は、回避するために行われた任意のそのような以前の放棄および引用された参考文献を再検討する必要があり得ることが勧告される。さらに、審査官は、本出願において行われた任意の放棄が、親出願にまたは親出願に対して読まれるべきではないことにも気付かされる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】