特表 2023-535264 キメラ抗原受容体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-17

(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230809BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230809BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230809BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230809BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230809BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20230809BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230809BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230809BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230809BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230809BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230809BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230809BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230809BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230809BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230809BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230809BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230809BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230809BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230809BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/725

C07K14/705

C12N15/867 Z

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/02

A61P43/00 121

A61P25/00

A61K39/395 N

A61K39/395 L

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/17

C12N5/0783

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022576551

(86)(22)【出願日】2021-06-11

(85)【翻訳文提出日】2023-02-08

(86)【国際出願番号】 CN2021099797

(87)【国際公開番号】W WO2021249549

(87)【国際公開日】2021-12-16

(31)【優先権主張番号】202010535848.X

(32)【優先日】2020-06-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520285879

【氏名又は名称】中国科学院分子細胞科学卓越創新中心

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＥＸＣＥＬＬＥＮＣＥ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３５， ３２０ Ｙｕｅｙａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｘｕｈｕｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０００３１， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】許▲シン▼▲チ▼

(72)【発明者】

【氏名】周秋萍

(72)【発明者】

【氏名】呉微

(72)【発明者】

【氏名】何星

(72)【発明者】

【氏名】孫赫

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA06

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC751

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB44

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA09

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA06

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内領域が連結されているキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、Ｂ細胞白血病／リンパ腫の治療において、Ｂ細胞白血病／リンパ腫の治療効果を更に向上させることが可能である。且つ、自身のサイトカインをダウンレギュレーションさせて、マクロファージ／単球の活性化による炎症性サイトカインの産生を低下させることで、サイトカインストームの早期予防及び神経毒性のリスク低下を可能とする。また、メソテリン陽性の腫瘍治療において、メソテリンが高発現している固形腫瘍の治療効果を更に向上させるとともに、サイトカインストームの早期予防及び神経毒性のリスク低下を可能とする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内領域が連結されている、キメラ抗原受容体。

【請求項2】

更に、
（１）前記ＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、
（２）前記細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内領域、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ζ細胞内領域を含む、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ及びＩＣＯＳの細胞内領域のうちの１つ又は複数から選択されることを特徴とする請求項２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

更に、
（１）前記ＣＤ２８細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、
（２）前記ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項３に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

更に、
ａ．前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択され、
ｂ．前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ＴＭ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂから選択される、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

更に、
ｃ．前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３又はＳＳ１から選択され、
ｄ．前記ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りであることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

（１）請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）で記載したポリヌクレオチド配列の相補的配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す通りであることを特徴とする請求項８に記載のポリヌクレオチド配列。

【請求項10】

核酸構築物であって、
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含むレンチウイルスベクターシステム。

【請求項12】

請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、請求項１０に記載の核酸構築物を含むか、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステムに感染していることを特徴とする遺伝子組換えＴ細胞。

【請求項13】

請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項１０に記載の核酸構築物、或いは、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦの分泌阻害、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（５）Ｔ細胞の増殖能力の強化、（６）Ｔ細胞の殺傷能力の向上、（７）ＧｒｚＢの産生促進、（８）脱顆粒の促進、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用。

【請求項14】

請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項１０に記載の核酸構築物、或いは、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステム、或いは、請求項１２に記載の遺伝子組換えＴ細胞の、（１）腫瘍の治療、（３）腫瘍治療時に発生するサイトカインストームの阻害、（４）腫瘍治療時に発生する神経毒性の阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用であって、
好ましくは、前記腫瘍は、白血病又は固形腫瘍のうちの１つ又は複数から選択される、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キメラ抗原受容体の分野に関し、具体的には、キメラ抗原受容体及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

キメラ抗原受容体は、ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と略称され、特定の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲが搭載されたＴ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と称する。ＣＡＲ－Ｔ療法は、腫瘍治療において幅広く応用されているが、依然として多くの限界が存在する。例えば、白血病や固形腫瘍の臨床治療で遭遇するサイトカインストームや神経毒性の安全上の課題、及び治療効果の向上が望まれるとの課題がある。とりわけ、固形腫瘍の免疫療法への応用においてはそうである。

【0003】

現在のところ、サイトカインストーム（ＣＲＳ）と神経毒性（ＮＴ）の解決方法にはいずれも限界がある。臨床では、現在、主としてＦＤＡで認可されているロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）のアクテムラ（トシリズマブ、ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体）を使用してＣＲＳをコントロールしている。トシリズマブは、リウマチ様関節炎の治療用として米国ＦＤＡに初めて認可されたものであり、それらのサイトカイン誘導性の炎症反応をブロック可能である。しかし、欠点として、患者体内の血液中におけるＩＬ－６レベルを上昇させることがある。高濃度のＩＬ－６は血液脳関門を通過可能であり、神経毒性を誘発し得る。

【0004】

ＩＬ－１阻害剤：２０１８年５月、イタリアのサンラファエル病院－サンラファエル科学研究所及びＭＳＫＣＣ（メモリアルスローンケタリング癌センター）という２つの研究チームによる２つの独立した実験結果より、ＣＲＳは炎症性分子ＩＬ－１により誘発されるため、治療プランにＩＬ－１受容体アンタゴニストであるキネレット（アナキンラ、リウマチ様関節炎用薬）を投入し、競合的にＩＬ－１を阻害することでＣＲＳを効果的に制御可能なことが証明された。これは、キネレットが血液脳関門を通過する能力を有しており、神経毒性を制御することも可能なためである。

【0005】

限界：トシリズマブ及びアナキンラは、いずれも早期に介入して細胞のＣＲＳ／ＮＳを予防するものではなく、応急措置に相当するため、発見や処置が遅れた場合には、命に関わる危険がある。しかし、現在のところ、副作用の発生に早期に介入するための最適な手段が何であるのかは明らかとなっていない。

【0006】

よって、ＣＡＲ構造そのものを対象とした改変設計がより好ましい手段と考えられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、キメラ抗原受容体及びその用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の態様において、キメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。

【0009】

前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。

【0010】

前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内領域が連結されている。

【0011】

本発明は、第２の態様において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、（１）請求項で記載するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で記載したポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。

【0012】

本発明は、第３の態様において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。

【0013】

好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。

【0014】

より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、前記ポリヌクレオチド配列を含む。

【0015】

本発明は、第４の態様において、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、上述した核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。

【0016】

本発明は、第５の態様において、遺伝子組換えＴ細胞、又は当該遺伝子組換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、前記核酸構築物を含むか、前記レンチウイルスベクターシステムに感染している。

【0017】

本発明は、第６の態様において、前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物又は前記レンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦの分泌阻害、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（５）Ｔ細胞の増殖能力の強化、（６）Ｔ細胞の殺傷能力の向上、（７）ＧｒｚＢの産生促進、（８）脱顆粒の促進、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用を提供する。

【0018】

本発明は、第７の態様において、前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステム又は前記遺伝子組換えＴ細胞の、（１）腫瘍の治療、（３）腫瘍治療時に発生するサイトカインストームの阻害、（４）腫瘍治療時に発生する神経毒性の阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用を提供する。

【0019】

好ましくは、前記腫瘍は、白血病又は固形腫瘍のうちの１つ又は複数から選択される。

【発明の効果】

【0020】

上述したように、本発明におけるキメラ抗原受容体及びその用途は、以下の有益な効果を有する。

【0021】

本発明のキメラ抗原受容体は、Ｂ細胞白血病／リンパ腫の治療において、Ｂ細胞白血病／リンパ腫の治療効果を更に向上させることが可能である。且つ、自身のサイトカインをダウンレギュレーションさせて、マクロファージ／単球の活性化による炎症性サイトカインの産生を低下させることで、サイトカインストームの早期予防及び神経毒性のリスク低下を可能とする。また、メソテリン陽性の腫瘍治療において、メソテリンが高発現している固形腫瘍の治療効果を更に向上させるとともに、サイトカインストームの早期予防及び神経毒性のリスク低下を可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1.a】図１.ａは、ＣＤ１９を標的とする２８Ｚ ＣＡＲ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲの概略構造図である。

【図1.b】図１.ｂは、２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞膜表面におけるａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲレベルを示すフローサイトメトリーグラフである。

【図1.c】図１.ｃは、２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－ＴにおけるＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の細胞割合を示すフローサイトメトリーグラフである。

【図1.d】図１.ｄは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲをＣＤ１９抗原で刺激したあとのＣＤ３ζリン酸化レベルの比較である。

【図1.e】図１.ｅは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲをＣＤ１９抗原で刺激したあとの変化である。

【図1.f-h】図１.ｆは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。図１.ｇは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。図１.ｈは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。

【図1.i】図１.ｉは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとの脱顆粒反応である。

【図1.j】図１.ｊは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとのグランザイム放出反応である。

【図1.k】図１.ｋは、ＣＤ１９^＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性反応である。

【図1.l】図１.ｌは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとの増殖状況である。

【図1.m】図１.ｍは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとのアポトーシス状況である。

【図1.n】図１.ｎは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとの生存能力である。

【図1.o】図１.ｏは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとの疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）状態である。

【図1.p】図１.ｐは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９抗原で刺激したあとの疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）状態である。

【図1.q】図１.ｑは、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＲａｊｉ皮下異種移植腫瘍モデルの治療フローチャートである。

【図1.r】図１.ｒは、ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療後のＲａｊｉ皮下異種移植腫瘍の成長状況である。

【図2.a】図２.ａは、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を標的とする２８Ｚ ＣＡＲ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲの概略構造図である。

【図2.b】図２.ｂは、２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞膜表面におけるａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎＣＡＲレベルを示すフローサイトメトリーグラフである。

【図2.c】図２.ｃは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－ＴにおけるＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋の細胞割合を示すフローサイトメトリーグラフである。

【図2.d-f】図２.ｄは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をメソテリン抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。図２.ｅは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をメソテリン抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。図２.ｆは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をメソテリン抗原で刺激したあとのサイトカインレベルの比較である。

【図2.g】図２.ｇは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をメソテリン抗原で刺激したあとのアポトーシス状況である。

【図2.h】図２.ｈは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をメソテリン抗原で刺激したあとの生存能力である。

【図2.i】図２.ｉは、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔの毒性反応である。

【図2.j】図２.ｊは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるヒト由来ＰＡＮＣ－１膵臓癌細胞株（メソテリンを高発現）皮下異種移植腫瘍モデルの治療フローチャートである。

【図2.k】図２.ｋは、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療後のＲａｊｉ皮下異種移植腫瘍の成長状況である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明で記載するキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内領域が連結されている。

【0024】

更に、前記ＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、具体的には、ＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩである。

【0025】

前記細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内領域、共刺激シグナル伝達領域の細胞内領域及びＣＤ３ζ細胞内領域を含む。

【0026】

一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ又はＩＣＯＳの細胞内領域のうちの１つ又は複数から選択される。

【0027】

更に好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域はＣＤ２８から選択される。この場合、殺傷能力が更に強くなる。

【0028】

ＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、具体的には、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳである。

【0029】

一実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りであり、具体的には、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲである。

【0030】

一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＡＰ）、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択される。

【0031】

好ましくは、ＣＤ１９又はメソテリンから選択される。この場合、標的特異性が良好となる。

【0032】

前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ＴＭ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂから選択される。

【0033】

好ましくは、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８ＴＭから選択される。具体的に、前記ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであり、具体的には、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶである。

【0034】

一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。

【0035】

一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。

【0036】

一実施形態において、前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３又はＳＳ１から選択される。

【0037】

ＦＭＣ６３には、市販の製品を使用可能である。

【0038】

一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。

【0039】

一実施形態において、前記一本鎖抗体はモノクローナル抗体ＳＳ１の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。

【0040】

ＳＳ１のｓｃＦｖヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示す通りであり、具体的には以下とする。

【0041】

ＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ

【0042】

ＳＳ１のｓｃＦｖアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、具体的には以下とする。

【0043】

ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＹＧＡＧＴＫＬＥＩＫ

【0044】

更に、前記細胞外ドメインはシグナルペプチドを更に含み、順に連結されるシグナルペプチド－抗原認識領域－ヒンジ領域を形成している。

【0045】

一実施形態において、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（Ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）に示す通りである。

【0046】

具体的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）は以下の通りである。

【0047】

ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＹＰＹＤＶＰＤＹＡＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊

【0048】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）に対応するヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は下記の通りである。

【0049】

ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧ
ＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴａｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｇｔｔａｃｃａｃａｃｃｃａｇｃａｔｔｃｃｔｃｃｔｇａｔｃｃｃａＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇａｃｔａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃａｇｇｇｃａａｇｔｃａｇｇａｃａｔｔａｇｔａａａｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇａｔｇｇａａｃｔｇｔｔａａａｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔａｃａｔｃａａｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇｇａｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔａｔｔｃｔｃｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃａａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇｔａａｔａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｃｔａａｇｔｔｇｇａａａｔａａｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｇａｇｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｔａｃｃｃｇａｃｔａｔｇｇｔｇｔａａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｃｇａａａｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔａａｔａｔｇｇｇｇｔａｇｔｇａａａｃｃａｃａｔａｃｔａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｇａｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｃａａｃｔｃｃａａｇａｇｃｃａａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａａｔｇａａｃａｇｔｃｔｇｃａａａｃｔｇａｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｃａａａｃａｔｔａｔｔａｃｔａｃｇｇｔｇｇｔａｇｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａａｔａｇａａａｇｇｃｃａａｇｇｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃｇａｇｇａｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｃａａａｇｇｇｇａｃａａａａｃａａｇｇａｇａｇｇｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｔｃｃｃａａｃｃｃａｇａｃｔａｔｇａｇｃｃｃａｔｃｃｇｇａａａｇｇｃｃａｇｃｇｇｇａｃｃｔｇｔａｔｔｃｔｇｇｃｃｔｇａａｔｃａｇａｇａｃｇｃａｔｃａｇｇａｇｔａａｇａｇｇａｇｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｃａｃａｇｔｇａｃｔａｃａｔｇａａｃａｔｇａｃｔｃｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｃａａｇｃａｔｔａｃｃａｇｃｃｃｔａｔｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｇａｃｔｔｃｇｃａｇｃｃｔａｔｃｇｃｔｃｃａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃ
ａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃｔａａ

【0050】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（Ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）は下記の通りである。

【0051】

ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＹＰＹＤＶＰＤＹＡＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＹＧＡＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊

【0052】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（Ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）に対応するヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（Ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は下記の通りである。

【0053】

ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣ
ＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴａｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｇｔｔａｃｃａｃａｃｃｃａｇｃａｔｔｃｃｔｃｃｔｇａｔｃｃｃａＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａａｔａｇａａａｇｇｃｃａａｇｇｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃｇａｇｇａｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｃａａａｇｇｇｇａｃａａａａｃａａｇｇａｇａｇｇｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｔｃｃｃａａｃｃｃａｇａｃｔａｔｇａｇｃｃｃａｔｃｃｇｇａａａｇｇｃｃａｇｃｇｇｇａｃｃｔｇｔａｔｔｃｔｇｇｃｃｔｇａａｔｃａｇａｇａｃｇｃａｔｃａｇｇａｇｔａａｇａｇｇａｇｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｃａｃａｇｔｇａｃｔａｃａｔｇａａｃａｔｇａｃｔｃｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｃａａｇｃａｔｔａｃｃａｇｃｃｃｔａｔｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｇａｃｔｔｃｇｃａｇｃｃｔａｔｃｇｃｔｃｃａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃｔａａ

【0054】

本発明のキメラ抗原受容体を形成する上記各部分は、互いを直接連結してもよいし、リンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列は、当該分野において周知の抗体に適用されるリンカー配列とすればよく、例えば、Ｇ及びＳを含むリンカー配列とする。通常、
リンカーは、前後で繰り返される１つ又は複数のモチーフを含む。例えば、当該モチーフは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＳＳＧ、ＧＳＧＳＡ及びＧＧＳＧＧとすることができる。好ましくは、当該モチーフは、リンカー配列において隣接しており、繰り返し間にアミノ酸残基は挿入されない。リンカー配列は、１個、２個、３個、４個又は５個の繰り返しモチーフを含んで構成可能である。リンカーの長さは３～２５個のアミノ酸残基とすることができ、例えば、３～１５個、５～１５個、１０～２０個のアミノ酸残基とする。いくつかの実施方案において、リンカー配列はポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列中のグリシンの数に特に制限はなく、通常は２～２０個とし、例えば、２～１５個、２～１０個、２～８個とする。グリシン及びセリン以外にも、リンカーは、その他の既知のアミノ酸残基（例えば、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等）を含み得る。

【0055】

理解すべき点として、遺伝子クローン操作では、適切な酵素切断部位の設計を要することが多い。その場合、発現するアミノ酸配列の末端に必然的に１つ又は複数の無関係な残基が導入されるが、これが標的配列の活性に影響することはない。また、融合タンパク質の作製、組換えタンパク質の発現促進、宿主細胞外に自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、或いは組換えタンパク質の有利な精製のためには、組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は当該タンパク質内のその他の適切な領域内（例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長等を含むが、これらに限らない）に何らかのアミノ酸を添加せねばならないことが多い。そのため、本発明の融合タンパク質（即ち、上記のＣＡＲ）のＮ末端又はＣ末端は、タンパク質タグとして、１つ又は複数のポリペプチドフラグメントを更に含んでもよい。本文では、任意の適切なタグをいずれも適用可能である。例えば、前記タグは、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ、Ｐｏｌｙ－Ａｒｇ、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇＩＩ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ及びＴｙ１とすることができる。これらのタグは、タンパク質の精製に適用可能である。

【0056】

本発明で提供するポリヌクレオチド配列は、（１）請求項で記載するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で記載したポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。

【0057】

本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ形式であってもよいし、ＲＮＡ形式であってもよい。ＤＮＡ形式は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは、１本鎖であってもよいし、２本鎖であってもよい。ＤＮＡは、コード鎖であってもよいし、非コード鎖であってもよい。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の縮重バリアントも含む。即ち、同一のアミノ酸配列をコードするがヌクレオチド配列の一部が異なるヌクレオチド配列も含む。

【0058】

通常、本文中で記載するポリヌクレオチド配列はＰＣＲ増幅法で取得可能である。具体的には、本文中で開示するヌクレオチド配列（特に、オープンリーディングフレーム配列）に基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリか、当業者にとって既知の一般的な方法で作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として用い、増幅することで関連の配列を取得する。配列が長い場合には、２回又は複数回のＰＣＲ増幅を行ったあと、各回で増幅した断片を正しい順序で連結せねばならないことが多い。

【0059】

本発明で提供する核酸構築物は、上記のポリヌクレオチド配列を含む。

【0060】

前記核酸構築物は、更に、上記のポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１つ又は複数の調節配列を含む。本発明で記載するＣＡＲのコード配列は、前記タンパク質の発現を
保証するために、様々な方式で操作可能である。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの違いや要求に応じて、核酸構築物を操作してもよい。組換えＤＮＡ手法を利用してポリヌクレオチド配列を改変する技術は、当該分野において既知である。

【0061】

調節配列は、適切なプロモーター配列とすることができる。通常、プロモーター配列は、発現されるタンパク質のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。

【0062】

調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列としてもよい。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作的に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。

【0063】

調節配列は、宿主細胞の翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列としてもよい。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。

【0064】

好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。

【0065】

通常は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を操作可能にプロモーターに連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことで、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の発現を実現する。当該ベクターは、真核細胞の複製及び統合にとって適切となり得る。代表的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節可能な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。

【0066】

本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、数多くのタイプのベクターにクローニング可能である。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドにクローニング可能である。更に、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクター形式で細胞に提供可能である。ウイルスベクター技術は当該分野において公知である。ベクターとして用い得るウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれる（ただし、これらに限らない）。通常、適切なベクターには、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製起点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、及び１つ又は複数の選択可能なマーカーが含まれる。

【0067】

より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ及び前記ポリヌクレオチド配列を含む。

【0068】

適切なプロモーターの一例としては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列が挙げられる。当該プロモーター配列は、自身に操作可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列を高水準で発現可能とする強い構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例としては、伸長因子－１α（ＥＦ－１α）が挙げられる。ただし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルスの最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモ
ーター。ただし、これらに限らない）を含む（ただし、上記に限らない）その他の構成型プロモーター配列を使用してもよい。更に、誘導型プロモーターの使用を検討してもよい。誘導型プロモーターを使用することで分子スイッチが提供される。分子スイッチは、一過性発現時において、誘導型プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンとすることができ、発現を期待しない場合には発現をオフとする。誘導型プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる（ただし、これらに限らない）。

【0069】

ＣＡＲのポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子うちのいずれか一方又は双方を含んでもよい。このことは、ウイルスベクターによってトランスフェクション又は感染を試みた細胞群から発現細胞を鑑定及び選択するのに都合がよい。他方で、選択可能なマーカーは、単独のＤＮＡ断片に保持されてコトランスフェクション手順に使用することが可能である。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の双方のフランキングは、宿主細胞内で発現可能となるよう、いずれも適切な調節配列を有し得る。有効な選択可能なマーカーには、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。

【0070】

レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞の鑑定に用いられるとともに、調節配列の機能性評価にも用いられる。ＤＮＡが受容細胞に導入されたあと、レポーター遺伝子の発現が適切なタイミングで測定される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る。また、適切な発現システムは、公知且つ既知の技術で作製可能であるか、商業的に取得される。

【0071】

遺伝子を細胞に導入する方法及び遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該分野において既知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞（例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞）に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。

【0072】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。また、興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを使用する方法が含まれる。また、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズといったコロイド分散系や、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。

【0073】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ウイルスベクター（特に、レンチウイルスベクター）を使用する方法が含まれる。これは、遺伝子を哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に導入するための最も汎用的な方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等から入手可能である。遺伝子を哺乳動物の細胞に導入するための数多くのウイルスベースのシステムがすでに開発されており、例えば、レンチウイルスによって、遺伝子導入システムに用いられる便利なプラットフォームが提供されている。当該分野において既知の技術を用いれば、選択した遺伝子をベクターに導入し、レンチウイルス粒子にパッケージングすることが可能である。当該組換えウイルスは、その後分離して体内又は体外の対象細胞に導入可能となる。当該分野では、数多くのレトロウイルスシステムが知られている。また、いくつかの実施方案では、アデノウイルスベクターを
使用する。当該分野では、数多くのアデノウイルスベクターが知られている。また、一実施方案では、レンチウイルスベクターを使用する。

【0074】

本発明は、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、上述した核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。

【0075】

前記レンチウイルスの補助成分は、レンチウイルスパッケージングプラスミドと細胞株を含む。

【0076】

前記レンチウイルスベクターシステムは、レンチウイルスパッケージングプラスミド及び細胞株の補助のもと、前記核酸構築物がウイルスパッケージングされてなる。前記レンチウイルスベクターシステムの構築方法は、当該分野において常用される方法である。

【0077】

本発明は、Ｔ細胞の体外活性化方法を提供する。前記方法は、前記レンチウイルスを使用して前記Ｔ細胞を感染させるステップを含む。

【0078】

本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、安定的な体内でのＴ細胞の増殖と、血液及び骨髄における高水準での持続的延長時間を経て、特異的メモリーＴ細胞を形成可能である。代替抗原を発現する標的細胞に遭遇し、その後これが除去された場合、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、体内でセントラルメモリー様状態に分化可能である。

【0079】

本発明は、更に、細胞療法を含む。当該細胞療法において、Ｔ細胞は本文中で記載するＣＡＲを発現するよう遺伝子組換えがなされる。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、これを必要とする適用者に注入される。注入された細胞は、適用者の腫瘍細胞を殺傷可能である。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で複製可能であって、持続的に腫瘍を制御可能な長期持続性を発揮する。

【0080】

ＣＡＲ－Ｔ細胞に起因する抗腫瘍免疫反応は、能動的又は受動的な免疫反応である。このほか、ＣＡＲにより誘導される免疫反応は、養子免疫細胞療法のステップの一部分となり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲの抗原結合部分について特異的な免疫反応を誘導する。

【0081】

治療可能な癌は、血液腫瘍（例えば、白血病やリンパ腫）のような非固形腫瘍とすることができる。特に、本発明のＣＡＲ、そのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス及びＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて治療可能な疾病は、好ましくはＣＤ１９誘導性の疾病であり、特にＣＤ１９誘導性の血液腫瘍である。

【0082】

具体的に、本文中の「ＣＤ１９誘導性の疾病」には、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病といった白血病及びリンパ腫が含まれる（ただし、これらに限らない）。

【0083】

本発明は、遺伝子組換えＴ細胞、又は当該遺伝子組換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、前記核酸構築物を含むか、前記レンチウイルスベクターシステムに感染している。

【0084】

本発明のＣＡＲ－修飾Ｔ細胞は、単独で投与してもよいし、薬物組成物として、希釈剤及び／又はその他の成分（例えば、関連のサイトカイン又は細胞群）と組み合わせて投与してもよい。簡単に言うと、本発明の薬物組成物には、本文中で記載したＣＡＲ－Ｔ細胞と、１又は複数種類の薬学的又は生理学的に許容可能なベクター、希釈剤又は賦形剤の組み合わせが含まれ得る。このような組成物には、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水、硫酸塩緩衝生理食塩水等）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖又はデキ
ストラン、マンニトール）、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤が含まれ得る。

【0085】

本発明の薬物組成物は、治療（又は予防）対象の疾病に適した方式で投与される。投与の数量及び頻度は、例えば、患者の病症、患者の疾病タイプ及び深刻度といった要素から決定する。

【0086】

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍－抑制有効量」又は「治療量」を示す場合、投与される本発明の組成物の正確な量は医師により決定可能である。その際には、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び病症の個体差が考慮される。通常、本文中で記載するＴ細胞を含む薬物組成物の投与量は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ（体重）、好ましくは、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ（体重）とすることができる。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において公知の注入技術で投与可能である。具体的な患者に対する最適な投与量及び治療プランについては、医療分野の技術者であれば、患者の疾病の兆候を観察し、それにより治療を調節することで容易に決定可能である。

【0087】

対象組成物の投与は、噴霧法、注射、内服、点滴、埋め込み又は移植を含む任意の容易な方式で実施可能である。本文中で記載する組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射又は腹膜内注射によって患者に投与可能である。一実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与する。他の実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈注射によって投与する。また、Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注入可能である。

【0088】

本発明のいくつかの実施方案において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はその組成物は、当該分野において既知のその他の治療法と組み合わせ可能である。前記治療法には、化学療法、放射線治療及び免疫抑制剤が含まれる（ただし、これらに限らない）。例えば、各種の放射線治療製剤を組み合わせて治療することが可能である。これらの放射線治療製剤には、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ＦＫ５０６、フルダラビン、ラパマイシン及びミコフェノール酸等が含まれる。更なる実施方案において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植や、化学療法薬（例えば、フルダラビン）、放射線外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド又は抗体（例えば、ＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ）を利用したＴ細胞アブレーション療法と組み合わせて（例えば、事前、同時又は事後）患者に投与する。

【0089】

本文中の「抗腫瘍効果」とは生物学的な効果を意味し、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、推定寿命の延長又は癌関連の各種生理的症状の改善によって示すことができる。

【0090】

「患者」、「対象」「個体」等は、本文中で互換的に使用可能であり、免疫反応を発生させ得る生体有機体（例えば、哺乳動物）を意味する。これには、例えば、ヒト、犬、猫、マウス、ラット及びその遺伝子組換え種が含まれる（ただし、これらに限らない）。

【0091】

前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステムは、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦの分泌阻害、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（５）Ｔ細胞の増殖能力の強化、（６）Ｔ細胞の殺傷能力の向上、（７）ＧｒｚＢの産生促進、（８）脱顆粒の促進、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造に使用される。

【0092】

前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステム又は前記遺伝子組換えＴ細胞は、（１）腫瘍の治療、（３）腫瘍治療時に発生するサイトカインストームの阻害、（４）腫瘍治療時に発生する神経毒性の阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造に使用される。

【0093】

好ましくは、前記腫瘍は、白血病又は固形腫瘍のうちの１つ又は複数から選択される。

【0094】

より好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択される。

【0095】

以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。

【0096】

本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、理解すべき点として、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らない。更に、理解すべき点として、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するためのものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、本文中で別途明示している場合を除き、「１つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。

【0097】

実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同義である。また、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。

【0098】

別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法には、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。

【実施例1】

【0099】

ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲの配列は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．実験室がＮＣＢＩで共有した配列を参照した。我々はこれをベースに、遺伝子合成技術を利用して、ＣＤ３ε細胞内領域全体をＣＤ２８ＴＭ膜貫通ドメインの後方に挿入して新型のＣＡＲを構築し、Ｅ２８Ｚと命名した。

【0100】

ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りであり、具体的には以下の通りである。

【0101】

ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧ
ＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴａｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｇｔｔａｃｃａｃａｃｃｃａｇｃａｔｔｃｃｔｃｃｔｇａｔｃｃｃａＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇａｃｔａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃａｇｇｇｃａａｇｔｃａｇｇａｃａｔｔａｇｔａａａｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇａｔｇｇａａｃｔｇｔｔａａａｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔａｃａｔｃａａｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇｇａｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔａｔｔｃｔｃｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃａａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇｔａａｔａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｃｔａａｇｔｔｇｇａａａｔａａｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｇａｇｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｔａｃｃｃｇａｃｔａｔｇｇｔｇｔａａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｃｇａａａｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔａａｔａｔｇｇｇｇｔａｇｔｇａａａｃｃａｃａｔａｃｔａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｇａｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｃａａｃｔｃｃａａｇａｇｃｃａａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａａｔｇａａｃａｇｔｃｔｇｃａａａｃｔｇａｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｃａａａｃａｔｔａｔｔａｃｔａｃｇｇｔｇｇｔａｇｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａａｔａｇａａａｇｇｃｃａａｇｇｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃｇａｇｇａｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｃａａａｇｇｇｇａｃａａａａｃａａｇｇａｇａｇｇｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｔｃｃｃａａｃｃｃａｇａｃｔａｔｇａｇｃｃｃａｔｃｃｇｇａａａｇｇｃｃａｇｃｇｇｇａｃｃｔｇｔａｔｔｃｔｇｇｃｃｔｇａａｔｃａｇａｇａｃｇｃａｔｃａｇｇａｇｔａａｇａｇｇａｇｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｃａｃａｇｔｇａｃｔａｃａｔｇａａｃａｔｇａｃｔｃｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｃａａｇｃａｔｔａｃｃａｇｃｃｃｔａｔｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｇａｃｔｔｃｇｃａｇｃｃｔａｔｃｇｃｔｃｃａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇ
ｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃｔａａ

【0102】

ＣＡＲをレンチウイルス発現プラスミドｐＨＡＧＥベクターにサブクローニングし、ＣＡＲ発現プラスミドとパッケージングプラスミドｐＳＰＡＸ２及びｐＭＤ２Ｇをそれぞれ１０：７．５：３．５の割合で混合したあと、リン酸カルシウムトランスフェクション手法で２９３ＦＴ細胞に導入し、レンチウイルス粒子を生成した。次に、超高速遠心分離手法を用い、２８Ｚ ＣＡＲ又はＥ２８Ｚ ＣＡＲをそれぞれ発現したレンチウイルスを濃縮して小体積・高力価ウイルス（～１０＾８／ｍｌ）としたあと、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ａｂ－ｂｅａｄｓで１日活性化した初代Ｔ細胞（ＭＯＩ＝１０）にそれぞれトランスフェクションした。Ｔ細胞完全培地（ＸＩＶＯ－１５＋１％Ｐ．Ｓ．＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５＋１０ｍＭ＋５％Ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ，１０ｍＭ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ ＮＡＣ）を用いた初代Ｔ細胞の培養期間は、ウイルスを１日トランスフェクションしたあと除去した。そして、抗体で４日間刺激したあとこれも除去し、抗体での刺激から５日目に、ＣＡＲ発現量が同様のＣＡＲ－Ｔ細胞を分別した。次に、一定時間増幅したあと、ＣＡＲの膜上レベル、ＣＤ４とＣＤ８のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの生存継続能力、及びインビボでの抗腫瘍効果等の一連の指標鑑定をＣＡＲ－Ｔについて行った。

【0103】

ＣＤ１９を標的とする２８Ｚ ＣＡＲ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲの構造は図１：ａに示す通りである。

【0104】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＭ６３ ｓｃＦｖ抗体を用いて、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞膜表面におけるＣＡＲレベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図１：ｂに示す。グラフより、両者のＣＡＲ陽性率及び発現量（ＭＦＩ）に差は見られなかった。

【0105】

ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体を用いて、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞につきフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図１：ｃに示す。グラフより、両者のＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は類似していた。

【0106】

ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で混合し、４℃で遠心分離して細胞間の接触を促進させた。これを３７℃のウォーターバスに入れて計時し、一連のタイミングでＬＤＳサンプルバッファを用いて反応を停止させたあと、ａｎｔｉ－ｐＣＤ３ζ（ｐ１４２）抗体を用いてウエスタンブロッティング検出を行った。結果は図１：ｄに示す通りであった。図中のｐＣＤ３ζバンドから明らかなように、Ｅ２８Ｚは、０ｍｉｎ（即ち、ＣＤ１９抗原に未遭遇）時のバックグラウンドにおけるｐＣＤ３ζリン酸化レベルが２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。且つ、ＣＤ１９抗原で特異的に刺激したあと、ｐＣＤ３ζのリン酸化は上昇後に低下した。また、ｐＣＤ３ζのリン酸化後期の低下速度は、Ｅ２８Ｚの方が２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに速かった。

【0107】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で１．５ｍｌ ＥＰチューブにて混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて
細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で培養し、一連のタイミングで冷却ＰＢＳによりＣＡＲのエンドサイトーシス反応を停止させた。その後、サンプルを回収して氷上に載置し、冷却ＰＢＳで１回洗浄した。そして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＭ６３ ｓｃＦｖ抗体を用いて染色し（４℃、３０ｍｉｎ）、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞膜上のＣＡＲのレベルをフローサイトメトリー測定した。結果は図１：ｅに示す通りであった。図より、２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲの膜上レベルは、急激に低下したあとゆっくりと回復し、上昇した。そのうち、２８Ｚ ＣＡＲの膜上レベルはＥ２８Ｚ ＣＡＲよりも低下が速く、その後の回復及び上昇も明らかにＥ２８Ｚ ＣＡＲより速かった。

【0108】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の６時間前に１×ＢＦＡを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にＰＢＳでサンプルを１回洗浄した。その後、４％ＰＦＡを用いて室温で５ｍｉｎ固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色を行い、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αを検出した。結果は図１：ｆ～ｈに示す通りであった。図より、Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９^＋細胞による特異的刺激後に産生したサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αがいずれも２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに少なかった。

【0109】

図１ｄと図１ｅを組み合わせることで、Ｅ２８Ｚ ＣＡＲのｐＣＤ３ζリン酸化レベルの低下が速かったのは、ＣＡＲの膜上レベルのダウンレギュレーションが原因ではないことが説明される。なぜなら、ＣＤ１９で特異的に刺激したあとの２８Ｚ ＣＡＲの膜上レベルは、反対にＥ２８Ｚ ＣＡＲよりも低下が速かったからである。

【0110】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で２ｈ、４ｈ培養した。このとき、完全培地には、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ
ＣＤ１０７ａ－ｅＦｌｕｏｒ６６０抗体及び１×モネンシン（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ抗体のエンドサイトーシスによる分解を防止する）を更に加えた。サンプル回収時には、冷却ＰＢＳを用いて反応を停止させ、ＰＢＳで１回洗浄したあとフローサイトメトリー測定を行った。結果は図１：ｉに示す通りであった。図より、Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原による特異的刺激後の脱顆粒反応速度が２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに速かった。

【0111】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の６時間前に１×ＢＦＡを加えてグランザイムの放出を阻害し、サンプル回収後にＰＢＳでサンプルを１回洗浄した。その後、４％ＰＦＡを用いて室温で５ｍｉｎ固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色を行い、グランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）を検出した。結果は図１：ｊに示す通りであった。図より、Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９^＋細胞による特異的刺激後に産生したグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）が２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに多かった。

【0112】

ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９^＋腫瘍細胞に対して毒性反応を示す。そこで、ＣＤ１９^－Ｋ５６２細胞を１６４０無血清培地に再懸濁したあと、１×ＣｅｌｌＴｒａｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｄｙｅで予め染色した（３７°ウォーターバス、３０ｍｉｎ）。続いて、１６４０無血清培地を１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、ＣＤ１９^＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９（ＩＲＥＳ ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞と１：１で混合して標的細胞とした。そして、ＣＡＲ－Ｔ細胞を当該混合型標的細胞と３：１、１：１、１：３の割合で混合し、丸底の９６ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、ＣＤ１９^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージとＣＤ１９^＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「ＣＤ１９^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージ／ＣＤ１９^＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージ」をＮとした。Ｎ値は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「Ｎ_０＝ＣＤ１９^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージ／ＣＤ１９^＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合Ｎ／Ｎ_０を算出した。即ち、殺傷率の式は「Ｌｙｓｉｓ（％）＝１－Ｎ／Ｎ_０」とした。結果は図１：ｋに示す通りであった。図より、ＣＤ１９^＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔの毒性は、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大きかった。

【0113】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ試薬キットの説明書に従い操作して、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ６７－ＡＰＣ抗体により染色してから、Ｋｉ６７の発現量をフローサイトメトリー測定した。結果は図１：ｌに示す通りであった。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあと、一定時間は終始２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも急速に増殖を続けた。

【0114】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＡＰＣ試薬キットの説明書に従って染色してから、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。結果は図１：ｍに示す通りであった。図より、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあとのアポトーシスレベルが、一定時間は終始２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも明らかに低いままであった。

【0115】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体により染色して、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の生存数を検
出した。結果は図１：ｎに示す通りであった。図より、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあとの生存数が２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも明らかに多かった。

【0116】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＰＤ－１－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＴＩＭ３－ＰＥ抗体により染色して、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＰＤ－１及びＴＩＭ３の発現状況を検出した。結果を図１：ｏ～ｐに示す。図より、ａｎｔｉ－ＣＤ１９
Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあとのＰＤ－１及びＴＩＭ３の発現状況が、７日後に２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも低くなった。これは、バックグラウンドに強いｐＣＤ３ζリン酸化レベルを有していたとしても（図１ｄ）、Ｅ２８Ｚ ＣＡＲがＴ細胞のｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ状態を引き起こさなかったことを意味している。

【0117】

無菌操作により、３×１０＾７／ｍｌのＲａｊｉ細胞－ＰＢＳ再懸濁液を準備した。そして、６週齢の各Ｂ－ＮＤＧ雌マウスの左側背部に１００μｌ・３百万個のＲａｊｉ細胞を皮下移植し、この時点をｄａｙ０とした。６日後に、Ｒａｊｉ皮下腫瘍が直径７～８ｍｍまで成長した時点でマウスをランダムに群分けし、各マウスの尾静脈に１００μｌ・８百万個のＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した。モデルについては図１：ｑを参照する。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、データを記録した。また、腫瘍面積＝長さ×広さとした。結果を図１：ｒに示す。結果から明らかなように、ｖｅｃｔｏｒ対照群のマウスは腫瘍の成長が最も速く、その次が２８Ｚ群であった。また、治療効果が最も良好だったのはＥ２８Ｚ群であり、Ｅ２８Ｚ群の治療効果は明らかに２８Ｚ群よりも高かった。

【実施例2】

【0118】

図２：ａに示すように、ＣＤ１９を標的とする２８Ｚ ＣＡＲ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲのＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ－ＣＤ１９）配列を、順にＳＳ１ ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に入れ替えた。即ち、それぞれ、メソテリンを標的とする２８Ｚ ＣＡＲ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲとなった。

【0119】

一次抗体Ｒａｔ ａｎｔｉ－ＨＡ及び二次抗体ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７抗体を用い、２８Ｚ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞膜表面におけるＣＡＲレベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図２：ｂに示す。グラフより、両者のＣＡＲ陽性率及び発現量（ＭＦＩ）に差は見られなかった。

【0120】

ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体を用いて、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びＥ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞につきフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図２：ｃに示す。グラフより、両者のＣＤ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は類似していた。

【0121】

１０万個のａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞とメソテリンを過剰発現したＫ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞株を１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の６時間前に１×ＢＦＡを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にＰＢＳでサンプルを１回洗浄した。その
後、４％ＰＦＡを用いて室温で５ｍｉｎ固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色を行い、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αを検出した。結果を図２：ｄ～ｆに示す。図より、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｋ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞による特異的刺激後に産生したサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αがいずれもａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに少なかった。

【0122】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とメソテリンを過剰発現したＫ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞株を１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＡＰＣ試薬キットの説明書に従って染色してから、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。結果を図２：ｇに示す。ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、Ｋ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞株で刺激したあとのアポトーシスレベルが、一定時間は終始ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも明らかに低いままであった。

【0123】

１０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞とメソテリンを過剰発現したＫ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞株を１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ
ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体により染色して、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の生存数を検出した。結果を図２：ｈに示す。図より、ａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、Ｋ５６２－Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞株で刺激したあとの生存数が２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔよりも明らかに多かった。

【0124】

ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^－Ｋ５６２細胞を１６４０無血清培地に再懸濁したあと、１×ＣｅｌｌＴｒａｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｄｙｅで予め染色した（３７°ウォーターバス、３０ｍｉｎ）。続いて、１６４０無血清培地を１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋Ｋ５６２＿ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＩＲＥＳ ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞と１：１で混合して標的細胞とした。そして、ＣＡＲ－Ｔ細胞を当該混合型標的細胞と３：１、１：１、１：３の割合で混合し、丸底の９６ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージとｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋Ｋ５６２＿ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋Ｋ５６２＿ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージ」をＮとした。Ｎ値は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「Ｎ_０＝ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ^＋、ｍＣｈｅｒｒｙ^－）のパーセンテージ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋Ｋ５６２＿ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ細胞（ＡＰＣ^－、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合Ｎ／Ｎ_０を算出した。即ち、殺傷率の式は「Ｌｙｓｉｓ（％）＝１－Ｎ／Ｎ_０」とした。結果を図２：ｉに示す。図より、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ^＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔの毒性は、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも大きかった。

【0125】

無菌操作により、２×１０＾７／ｍｌ ＰＡＮＣ－１細胞－ＰＢＳ再懸濁液を準備した。そして、６週齢の各Ｂ－ＮＤＧ雌マウスの左側背部に１００μｌ・２百万個のＰＡＮＣ－１細胞を皮下移植し、この時点をｄａｙ０とした。７日後に、ＰＡＮＣ－１皮下腫瘍が直径７～８ｍｍまで成長した時点でマウスをランダムに群分けし、各マウスの尾静脈に１００μｌ・６百万個のａｎｔｉ－ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した。モデルは図２：ｊに示す通りであった。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、データを記録した。また、腫瘍面積＝長さ×広さとした。結果を図２：ｋに示す。ｖｅｃｔｏｒ対照群と実験群である２８Ｚ群のマウスの腫瘍成長は最も速く、両者に差はなかった。一方、Ｅ２８Ｚ群は治療効果が比較的良好であり、統計的に有意な差があった。

【0126】

実験結果：
（１）Ｅ２８Ｚ及び２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、膜上レベル及びＣＤ４／ＣＤ８比が同等であった。

【0127】

（２）ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、Ｅ２８Ｚが分泌したサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ）は２８Ｚよりも明らかに低く、産生されたＧｒｚＢは２８Ｚよりも明らかに高かった。

【0128】

（３）ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、最初の短時間は、２８Ｚの方が表面ＣＡＲ（％）の低下速度がＥ２８Ｚよりも速く、表面ＣＡＲ（％）の回復速度についてもＥ２８Ｚより明らかに速かった。

【0129】

（４）ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してアポトーシスレベルを検出したところ、Ｅ２８Ｚと２８Ｚの比較において、最初は双方が同等であったが、その後は、Ｅ２８Ｚのアポトーシスレベルが２８Ｚよりも明らかに低下した。

【0130】

（５）ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して増殖能力（即ち、Ｋｉ６７の発現レベル）を検出したところ、Ｅ２８Ｚの増殖能力は２８Ｚよりも明らかに高かった。

【0131】

（７）ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して、増幅したＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数を検出したところ、時間の経過とともにＥ２８Ｚの数は２８Ｚよりも明らかに高くなった。

【0132】

（８）ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ１９^＋Ｋ５６２：ＣＤ１９^－Ｋ５６２を共培養するインビトロ殺傷実験において、高い投与量のＥ２８Ｚの殺傷能力は２８Ｚよりも明らかに高くなり得た。

【0133】

（９）マウス体内での抗腫瘍実験において、Ｅ２８Ｚの治療効果は２８Ｚよりも明らかに高くなり得た。

【0134】

以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的及び実質的になんら制限するものではない。指摘すべき点として、当業者であれば、本発明の方法を逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であって、これらの改良及び補足もまた本発明の保護の範囲内とみなすべきである。本専門分野に精通した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、追加及び変形の等価の変更は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記の実施例に対し実施される任意の等価の変更の修正、追加及び変形も
、本発明の技術方案の範囲に属する。

【図1.a】

【図1.b】

【図1.c】

【図1.d】

【図1.e】

【図1.f-h】

【図1.i】

【図1.j】

【図1.k】

【図1.l】

【図1.m】

【図1.n】

【図1.o】

【図1.p】

【図1.q】

【図1.r】

【図2.a】

【図2.b】

【図2.c】

【図2.d-f】

【図2.g】

【図2.h】

【図2.i】

【図2.j】

【図2.k】

【配列表】

2023535264000001.app

【国際調査報告】