(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-17
(54)【発明の名称】低ジアセチル酵母
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20230809BHJP
C12C 11/02 20060101ALI20230809BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20230809BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20230809BHJP
C12N 15/61 20060101ALN20230809BHJP
C12N 15/01 20060101ALN20230809BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230809BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 G
C12C11/02
C12N15/54 ZNA
C12N15/60
C12N15/61
C12N15/01 Z
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022580234
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2023-01-18
(86)【国際出願番号】 EP2021067882
(87)【国際公開番号】W WO2022002960
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】20183134.4
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520229688
【氏名又は名称】カールスバーグ アグシャセルスガーブ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】レングラー，クローズ
(72)【発明者】
【氏名】カッツ，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】フォースター，ヨッヒェン
(72)【発明者】
【氏名】フェネシー，ロス
(72)【発明者】
【氏名】グジャルマンセン，クレス
(72)【発明者】
【氏名】チャイルヤン，アンナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4B128
【Ｆターム（参考）】
4B065AA79X
4B065AA79Y
4B065AC14
4B065BB14
4B065BB16
4B065BB26
4B065BD16
4B065BD18
4B065CA05
4B065CA06
4B065CA09
4B065CA17
4B065CA27
4B065CA29
4B065CA42
4B128CP38
(57)【要約】
本発明は、発酵中に低レベルのジアセチルを生産する有用な特性を有するサッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株に関する。これらの株を用いてモルトおよび／または穀類に基づく飲料を生成する方法、ならびにこの方法により生成される飲料もまた、提供される。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
そのゲノム内で、ａ．ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子であって、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子；ならびに
ｂ．ＩＬＶ３をコードする少なくとも５の機能遺伝子、例えば少なくとも６の機能遺伝子であって、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子。
をコードする酵母株。
【請求項2】
前記酵母株はそのゲノム内で、ＩＬＶ５をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも５の機能遺伝子をコードし、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、請求項１に記載の酵母株。
【請求項3】
ＩＬＶ２、ＩＬＶ３および／またはＩＬＶ５をコードする前記遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項4】
ＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１および／またはＢＡＴ２をコードする前記遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項5】
前記酵母株は異種ＤＮＡを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項6】
前記酵母株は遺伝子操作の工程を受けていない、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項7】
前記酵母株はＩＬＶ３をコードする最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～６の機能遺伝子を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項8】
前記酵母株は、ＩＬＶ５をコードする、最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～５の機能遺伝子を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項9】
前記酵母株は、ＩＬＶ６をコードする最大で４の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ６をコードする各遺伝子はＳＥＱＩＤＮＯ：３３のＳｃＩＬＶ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＳｅＩＬＶ６、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項10】
前記酵母株はＢＡＴ１をコードする少なくとも３の機能遺伝子、例えば少なくとも４の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ１をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のＳｃＢＡＴ１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のＳｅＢＡＴ１、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項11】
前記酵母株はＢＡＴ２をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えば少なくとも５の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のＳｃＢＡＴ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のＳｅＢＡＴ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項12】
ＩＬＶ２およびＩＬＶ６をコードする前記酵母株における機能遺伝子の合計は、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする機能遺伝子の合計より低い、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項13】
ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２の前記酵母株における機能遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、または例えば少なくとも３である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項14】
ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２およびＩＬＶ６の前記酵母株における機能遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．２、例えば少なくとも１．４、例えば少なくとも１．６、例えば少なくとも１．８または例えば少なくとも２である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項15】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項16】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項17】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項18】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項19】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項20】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項21】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項22】
前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で、０．４０°プラート、例えば０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しなかった最早時点である、請求項２１に記載の酵母株。
【請求項23】
前記試験液は、前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項24】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項25】
前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しなかった最早時点である、請求項２４に記載の酵母株。
【請求項26】
前記試験液は、前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項27】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、次の２４時間で前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項28】
前記時点は、次の２４時間で、前記試験液の外観エキス含量が、０．４０°プラート、例えば０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しない最早時点である、請求項２７に記載の酵母株。
【請求項29】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項30】
前記時点は前記試験液の外観エキス含量が、次の１２時間で、０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しない最早時点である、請求項２９に記載の酵母株。
【請求項31】
前記試験液は前記最早時点で最大で１１５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項32】
前記酵母株は発酵試験液を生成することができ、前記試験液は、インキュベーションの開始後５日以内の任意の時点で、最大で２６５ｐｐｂのジアセチルを含み、７～８００万の酵母細胞／ｍｌの範囲が前記試験液に添加される、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項33】
前記酵母株は、前記試験液における、最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項34】
前記酵母株は、前記試験液において、最大で１６℃の温度で、最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項35】
前記酵母株は、前記試験液における所定の時間の間のインキュベーション後に、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第１の発酵試験液を生成することができ、前記所定の時間は、同じ条件下でインキュベートされるＷ－３４／７８酵母株が、前記試験液におけるインキュベーション後に最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第２の発酵試験液を生成するのに必要とされる時間よりも少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間少ない、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項36】
前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中でインキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる、請求項２１～３５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項37】
前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中で、４～６日の範囲の間、例えば、およそ４日間インキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる請求項２１～３６のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項38】
前記酵母株は、メリビオースを唯一の炭素源として有する培地上で増殖することができる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項39】
前記試験液は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項40】
前記試験液はおよそ１６°プラートの外観エキス含量を有する麦汁である、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項41】
前記試験液は少なくとも４０ｇ／ｋｇのマルトースを含む、請求項２１～４０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項42】
前記発酵は１２℃～１８℃の範囲の温度で起こる、請求項２１～４１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項43】
前記発酵は最大で１６℃の温度で起こる、請求項２１～４２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項44】
前記発酵は、７，０００，０００～２０，０００，０００生酵母細胞／ｍＬ試験液の範囲での接種後に起こる、請求項２１～４３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項45】
前記水性抽出物は最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間、前記酵母株により発酵される、請求項２１～４４のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項46】
前記水性抽出物は少なくとも１２°プラート、例えば少なくとも１５°プラートの外観エキス含量を有する、請求項２１～４５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項47】
前記水性抽出物は麦汁である、請求項２１～４６のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項48】
前記水性抽出物は最大で３５００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で３０００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で２５００ｍｇ／Ｌのアミノ酸を含む、請求項２１～４７のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項49】
前記発酵水性抽出物は最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４０ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２１～４８のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項50】
前記発酵水性抽出物は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、請求項２１～４９のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項51】
前記発酵水性抽出物は少なくとも４％ＡＢＶ、例えば少なくとも５％ＡＢＶのアルコール含量を有する、請求項２１～５０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項52】
前記発酵水性抽出物は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む、請求項２１～５１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項53】
前記発酵水性抽出物は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む、請求項２１～５２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項54】
前記発酵水性抽出物は少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５．例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５のイソブタノール対プロパノール比を含む、請求項２１～５３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項55】
発酵水性抽出物を生成する方法であって、ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は請求項１～５４のいずれか一項に記載される、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程
を含む方法。
【請求項56】
請求項５５に記載の方法により調製された発酵水性抽出物。
【請求項57】
飲料を生成するための方法であって、ｉ．請求項５５に記載の発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程
を含む、方法。
【請求項58】
加工処理の前記工程は、下記の１つ以上を含む、請求項５７に記載の方法：ｉ．濾過、
ｉｉ．炭酸化、
ｉｉｉ．熟成、または
ｉｖ．瓶詰め。
【請求項59】
請求項５７～５８のいずれか一項に記載の方法により調製された飲料。
【請求項60】
前記飲料は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む、請求項５９に記載の飲料。
【請求項61】
前記飲料は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む、請求項５９～６０のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項62】
前記飲料はビールである、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の飲料。
【請求項63】
前記抽出物または前記飲料は少なくとも３．０、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５のイソブタノール対プロパノール比を有する、請求項５６に記載の発酵水性抽出物または請求項５９～６２のいずれか一項に記載の飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ビール生産の分野、特に、ラガー・ビール生産の分野に関する。より特定的には、発明は低ジアセチル酵母を提供し、これは、ビール生産中、特に、ラガー・ビールの生産における高速で効率的な発酵に特に有用である。
【背景技術】
【0002】
ラガー・ビールはしばしば、新鮮で清浄な香味プロファイルにより特徴付けられる。ジアセチルは多くの発酵製品の香味プロファイルに寄与する。しかしながら、その典型的なバターのような香味はラガースタイルビールでは異臭と考えられ、この化合物の除去は醸造所における時間およびエネルギー消費に大きな影響を有する。
【0003】
ラガー・ビールは通常、麦汁－炭水化物に富む液体－のラガー酵母による発酵により調製される。ラガー酵母は一般に、上面発酵酵母といくつかの点で異なる。ラガー酵母は一般に、サッカロマイセス・パストリアヌス種に属す。頻繁に、ラガー酵母は「下面発酵酵母」とも呼ばれ、というのも、それらは、発酵中底に沈降するからである。酵母の沈降、または綿状沈殿はまた、処理時間に影響する可能性があり、というのも、酵母は、次回の醸造のためにそれを収集するには、十分沈降する必要があるからである。そんなに綿状にならない（徐々に沈降する）ラガー酵母のためには、これは冷却を必要とし、よって、追加の処理時間という結果になる。さらに、ラガー酵母株は一般に、７℃～１８℃の範囲の温度で最も良好に使用される。一般に、サッカロマイセス・セレビシエ種に属する、上面発酵酵母と対照的に、ラガー酵母はメリビオースを唯一の炭素源として使用することができ、典型的には、３７℃で増殖できない。
【0004】
発酵中、ジアセチルは酵母細胞によって排出されるアセト乳酸の非酵素的酸化により形成されるが、しかしながら、熟成期間中、ジアセチルは酵母細胞により再び取り込まれ、代謝される。発酵管理の一部は、確実に、完成したビールが設定閾値未満のジアセチルを含むよう着手される。完成したビール中のジアセチル含量を低減させる問題はラガー・ビールでとりわけ顕著であり、というのも、発酵がより低い温度で起こり、これにより、ラガー酵母によるジアセチルのより遅い再取り込みおよび代謝という結果になる。
【0005】
ビールにおけるジアセチルの味覚認識の下限は一般に、５０ｐｐｂのジアセチルであると考えられ、完成したビールにおいてジアセチル濃度をこのレベルに低減させる必要性は従来、醸造プロセスが完了する前に、ラガー・ビールの熟成に必要とされるかなりの量の余分な時間を付加する。
【発明の概要】
【0006】
以上で概説されるように、従来のサッカロマイセス・パストリアヌスラガー酵母株による７℃～１８℃の温度での麦汁の発酵では、味覚認識の５０ｐｐｂ限界を軽く超える麦汁中のジアセチルレベルという結果になる。その結果として、これらのレベルを低減させ、確実に、完成したビールのジアセチル含量を設定閾値未満にするために、酵母によるいくらか追加の熟成日数が必要とされていた。
【0007】
興味深いことに、本発明はサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株の新規ハイブリッドバリアントを提供し、これらは、低レベルのジアセチルを生成し、および／または前記ジアセチルを発酵中、１８℃以下で直ちに消費し、その結果として、これらの株により生成されるビールは熟成のための時間をほとんど必要としない。特に、麦汁を発明の酵母株により発酵させる場合、総ジアセチルレベルは、糖発酵が完了した時点で、すなわち発酵中、糖レベルがおおよそ安定した時点で≦６０ｐｐｂ、好ましくは≦５０ｐｐｂである。一般に、現在のラガー株と比較すると、少なくとも１日または少なくとも２日の発酵時間の低減が観察される。
【0008】
本発明はまた、Ｓ．パストリアヌス酵母株を使用することにより、１８℃以下での発酵後のビールの熟成にほとんど時間を必要としない、飲料を生成する方法を提供し、それは、心地よい味覚を有する。
【0009】
１つの態様では、本発明は発酵水性抽出物を生成する方法を提供し、前記方法は下記工程を含む：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は前記発酵試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は１８℃以下、好ましくは１２～１６℃の温度で起こる、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は前記発酵試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は１８℃以下、好ましくは１２～１６℃の温度で起こる、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
【0010】
本明細書では、「水性抽出物」という用語は、モルトおよび／または穀物粒の水性抽出物、例えば、麦汁を示すために使用され、これは飲料、例えばビールを製造するために使用され、一方、「試験液」という用語は、発酵のために使用される微生物の特性を評価するために使用されるより厳格に規定される組成を有する溶液を示す。
【0011】
別の態様では、本発明は飲料を生成するための方法を提供し、前記方法は下記工程を含む：
ｉ．モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ．サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、工程；
ｉｉｉ．工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程；ならびに
ｉｖ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程。
ｉ．モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ．サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、工程；
ｉｉｉ．工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程；ならびに
ｉｖ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程。
【0012】
別の態様では、本発明は飲料を生成するための方法を提供し、前記方法は下記工程を含む：
ｉ．モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ．サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；
ｉｉｉ．工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程；ならびに
ｉｖ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程であって、加工処理の工程は、下記の１つ以上を含む、工程：
１．濾過、
２．炭酸化、
３．熟成、または
４．瓶詰め。
ｉ．モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ．サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；
ｉｉｉ．工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程；ならびに
ｉｖ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程であって、加工処理の工程は、下記の１つ以上を含む、工程：
１．濾過、
２．炭酸化、
３．熟成、または
４．瓶詰め。
【0013】
別の態様では、本発明は酵母株を提供し、前記酵母株は、少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有する試験液中での前記酵母株のインキュベーション後、発酵試験液を生成することができ、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】（Ａ）１６℃および（Ｂ）１８℃での５０Ｌトライアルからの、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１および対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７とインキュベートした麦汁のジアセチルおよび°プラートレベルを示す。図１Ｃは図１Ｂと同じだが、ＺＤＡ１株のみ、および総ジアセチルについての異なる軸を用いた、１８℃でのプロットである。結果は実施例１において記載される。
【図2】１６°での１０ＨＬトライアルからの、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１および対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７とインキュベートした麦汁のジアセチルレベルを示す（図２Ａ）。°プラートが、加えて、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１（図２Ｂ）に対して示される。結果は実施例４において記載される。
【図3】本発明による酵母株ＺＤＡ２（８９－８４３９３ ＺＤＡ Ｆ１）により調製されたビールと比較した９つの異なる市販のビールにおけるイソブタノールあたりのプロパノールの比を示す。全てのビールが５％ＡＢＶに近い。
【図4A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図4B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図4C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図4D】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図4E】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図4F】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図5A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ６タンパク質配列の配列比較を示す。
【図5B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ６タンパク質配列の配列比較を示す。
【図5C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ６タンパク質配列の配列比較を示す。
【図6A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ３タンパク質配列の配列比較を示す。
【図6B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ３タンパク質配列の配列比較を示す。
【図6C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ３タンパク質配列の配列比較を示す。
【図6D】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ３タンパク質配列の配列比較を示す。
【図6E】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ３タンパク質配列の配列比較を示す。
【図7A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ５タンパク質配列の配列比較を示す。
【図7B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ５タンパク質配列の配列比較を示す。
【図7C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ５タンパク質配列の配列比較を示す。
【図7D】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＩＬＶ５タンパク質配列の配列比較を示す。
【図8A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ１タンパク質配列の配列比較を示す。
【図8B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ１タンパク質配列の配列比較を示す。
【図8C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ１タンパク質配列の配列比較を示す。
【図8D】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ１タンパク質配列の配列比較を示す。
【図8E】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ１タンパク質配列の配列比較を示す。
【図9A】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図9B】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図9C】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図9D】ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２間のＢＡＴ２タンパク質配列の配列比較を示す。
【図10】１６℃での商業規模トライアルからの、酵母株ＺＤＡ２および対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７とインキュベートした麦汁の°プラートおよびジアセチルレベルを示す。結果は実施例８において記載される。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
本明細書では、「１つの（ａ）」は、それが使用される文脈によって、１つ以上を意味することができる。
本明細書では、「１つの（ａ）」は、それが使用される文脈によって、１つ以上を意味することができる。
【0016】
本明細書では、「およそ」という用語は本明細書では、±１０％、好ましくは±５％、さらにより好ましくは±２％を意味する。
【0017】
「ビール」という用語は、本明細書では、麦汁の発酵により調製された飲料を示す。好ましくは、前記発酵は酵母により実施される。
【0018】
「グリーン・ビール」という用語は、本明細書では、好ましくは酵母による麦汁の発酵後に直接得られる溶液を示す。よって、「グリーン・ビール」はラガーリング前に得られる。言い換えれば、グリーン・ビールは、糖発酵が完了した直後に得られる溶液である。一般的に言って、ビールは香味および芳香の完熟に到達した時にはもはや「グリーン」とは考えられない。
【0019】
「ジアセチル」という用語は、本明細書では、下記式の化学化合物を示す：
【化1】
【0020】
試料中のジアセチルの濃度は、欧州醸造委員会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）法ＥＢＣ９．２４．２に従い、ガスクロマトグラフィーにより測定することができ、これは、総ジアセチルを決定するための、６０℃で９０分間の試料のインキュベーション期間を含み、前駆体アセト乳酸および遊離ジアセチルの総合計が反映される。本開示を通して、ここで開示される酵母株により生成されるジアセチルについて記載する場合、「ジアセチル」という用語は別記されない限り「総ジアセチル」を示す。よって、試料のジアセチル濃度は総ジアセチル濃度、すなわち前駆体アセト乳酸および遊離ジアセチルの総合計を示す。
【0021】
「穀類」という用語は、本明細書では、可食粒が得られるイネ科の任意の植物、例えばコムギ、アワ、コメ、オオムギ、カラスムギ、ライ麦、ライコムギ、ソルガム、およびトウモロコシを示す。
【0022】
「グレイン」という用語は、本明細書では、内部種子とも呼ばれる、穀類穎花を含む穀類の種子を示す。加えて、グレインは外穎および内穎を含み得る。ほとんどのオオムギ品種において、外穎および内穎は穎花に付着しており、脱穀後、グレインの一部となる。しかしながら、裸オオムギ品種もまた生じる。これらにおいて、穎花は外穎および内穎を有さず、コムギのように脱穀されて遊離する。「グレイン」および「カーネル」という用語は本明細書で同じ意味で使用される。
【0023】
「麦汁」という用語により、モルトおよび／または穀物粒および任意で追加のアジャンクトの液体抽出物が意味される。麦汁は一般に、熱水によるマッシング後のビール粕から残留糖および他の化合物を抽出するプロセスにおいて、マッシング、任意で続いて「スパージング」により得られる。スパージングは、典型的には、ろ過槽、マッシュフィルタ、または別の装置において実施され、ビール粕からの抽出水の分離が可能になる。マッシング後に得られる麦汁は一般に「第一麦汁」と呼ばれ、一方、スパージング後に得られる麦汁は一般に「第二麦汁」と呼ばれる。特定されない場合、麦汁という用語は第一麦汁、第二麦汁、または両方の組み合わせであってもよい。従来のビール生産中、麦汁はホップと一緒に煮沸される。ホップなしの麦汁はまた、「スィート麦汁」とも呼ばれ得、一方、ホップと共に煮沸させた麦汁は「煮沸麦汁」または単純に麦汁と呼ばれ得る。
【0024】
「水性抽出物」という用語は、本明細書では、モルトおよび／または穀物粒の任意の水性抽出物を示す。よって、この非限定的な例は所定量の発酵性糖を有する麦汁とすることができる。
【0025】
「発酵水性抽出物という用語」は、本明細書では、微生物、例えば酵母株と共にインキュベートし、糖発酵が完了した場合の、任意の水性抽出物を示す。糖発酵は、発酵中、°プラートにより測定される糖レベルがもはや著しく低減されない時点で完了したと考えられる。好ましくは、糖発酵は、糖レベルが２４時間の期間中０．５°プラートを超えて変化しなかった時、または、糖レベルが、１２時間の期間中０．２５°プラートを超えて変化しなかった時、完了したと考えることができる。発酵水性抽出物は例えば、発酵させたモルトおよび／または穀類系抽出物とすることができる。
【0026】
「試験液」という用語は、本明細書では、任意の水性液体または溶液を示す。試験液は、あらかじめ決められたレベルの特定化合物を含み得る。よって、この非限定的な例は特定の糖含量を有する麦汁とすることができる。
【0027】
「発酵試験液」という用語は、本明細書では、微生物、例えば酵母株とインキュベートし、糖発酵が完了した任意の試験液を示す。
【0028】
「°プラート」という用語は、本明細書では、プラートスケールで測定された密度を示す。プラートスケールは、ビールまたは麦汁の密度を抽出物の重量パーセンテージの観点から測定するための、経験的に導かれた比重計スケールである。スケールは密度を１００ｇの麦汁あたりのグラム抽出物として表す。プラートは例えば、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製のＡｌｃｏｌｙｚｅｒまたはハンドヘルド装置を用いて測定することができる。
【0029】
「外観エキス含量」は、本明細書では、°プラートで測定した所定のビールまたは麦汁の密度を示す。密度は、糖含量により主に決定されるので、外観エキス含量は溶液または抽出物の糖含量を示す。溶液の外観エキス含量は、例えば、ハンドヘルドＡｎｔｏｎ－ＰＡＡＲシリアル番号ＤＭを用いて測定することができる。
【0030】
「アルコール度数（ＡＢＶ）」という用語は、本明細書では、所定の体積のアルコール飲料中のアルコール（エタノール）の量を示す（体積パーセントとして表される）。それは、２０℃の１００ｍＬの溶液中に存在する純粋エタノールのミリリットル数として規定される。ＡＢＶはＡｌｃｏｌｙｚｅｒを用いて測定することができる。
【0031】
「ＲＤＦ」または「真性発酵度合い」という用語は、本明細書では、麦汁中の糖が発酵されてビール中のアルコールとなった度合いを示し、発酵度とも呼ばれる。ＲＤＦは発酵されたエキスのパーセンテージを表す。５０～６０％のＲＤＦはそれらの元のエキスの４０％超が未発酵なままであるフルボディのビールを表し、一方、８０％を超えるＲＤＦはそれらの元のエキスの２０％未満が未発酵のままである高希薄化ビールを表す。食感は大部分はＲＤＦパーセンテージによって決まり；ＲＤＦパーセンテージが高くなるほど、ビールはより軽く、よりドライになる。
【0032】
「綿状沈殿」という用語は、本明細書では、微粒子、例えば酵母細胞が凝集して綿状物にされるプロセスを示す。次いで、綿状物が液体上面まで浮き（クリーミング）、液体の底面まで沈降し（沈降）、または容易に液体から濾過され得る。酵母専門家およびブルーワーはしばしば、酵母綿状沈殿挙動を、発酵プロセス中に酵母株について観察される綿状沈殿の程度に従い、「高」、「中」、または「低」と分類する。高綿状株は懸濁した酵母がより少ないよりブライトなビールを生産することができ、濾過がより容易になる。綿状沈殿はより低い温度により増加させることができ、そのため、低綿状酵母では、追加の冷却工程が、発酵が完了した後に必要とされる可能性がある。そのため、高綿状酵母は低綿状酵母と比較すると処理時間を低減させる可能性があり、というのも、よりブライトな、容易に濾過されたビールを達成するのに、冷却が必要とされないからである。綿状沈殿は例えば、発酵後の溶液中の酵母細胞の数を計数することにより、例えば、発酵水性抽出物または試験液を含む容器の上３／４部分からとった試料中の酵母細胞の数を計数することにより決定することができる。
【0033】
「発酵」という用語は、本明細書では、水性抽出物または試験液を微生物、例えば酵母株と共にインキュベートすることを示す。
【0034】
「モルト」という用語は、本明細書では、モルト化した穀物粒を示す。「緑モルト」という用語はキルン乾燥の工程に供されていない発芽穀物粒を示す。いくつかの実施形態では、緑モルトは、粉砕緑モルトである。「キルン乾燥モルト」という用語は、本明細書では、キルン乾燥により乾燥された発芽穀物粒を示す。いくつかの実施形態では、キルン乾燥モルトは粉砕キルン乾燥モルトである。一般に、前記穀物粒は制御された環境条件下で発芽させられている。
【0035】
「炭素源」という用語は、本明細書では、任意の有機分子を示し、これはエネルギーを酵母に提供すること、および、細胞生合成のための炭素を提供することができる。特に、前記炭素源は、炭水化物であってもよく、より好ましくは、炭素源は単糖、二糖、三糖、四糖および／または短いオリゴ糖であってもよい。酵母により発酵させることができる炭素源はしばしば、発酵性糖と呼ばれ、例えば、限定はされないが、グルコース、フルクトース、マルトース、マルトトリオースおよびスクロースが挙げられる。
【0036】
アミノ酸は本明細書では、ＩＵＰＡＣ１文字および３文字コードを使用して命名することができる。別記されない限り、「アミノ酸」という用語は標準アミノ酸を示す。
【0037】
「機能遺伝子」という用語は、本明細書では、転写され、翻訳されると、遺伝子は内在性である、野生株の対応する遺伝子によりコードされるタンパク質と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％配列同一性を有するタンパク質を発現する遺伝子を示す。機能遺伝子により発現されるタンパク質は、遺伝子は内在性である、野生株の対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的相同体でなければならず、すなわち、それは同じ型の酵素活性を有さなければならず、前記活性は、遺伝子は内在性である、野生株の対応する遺伝子によりコードされるタンパク質と同様のレベルになければならない。特に、「機能遺伝子」という用語は、ほとんど～全く酵素活性を有さないトランケートされたタンパク質産物をコードする遺伝子を包含しない。好ましくは「遺伝子」という用語は、本明細書では、機能遺伝子を示す。
【0038】
「機能コピー数」という用語は、本明細書では、酵母株内の機能遺伝子の総数を示す。「機能コピー数」は本明細書では「活性コピー数」と同じ意味で使用される。
【0039】
「機能的相同体」という用語は、本明細書では、基準ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的機能を共有するポリペプチドを示す。一般に、前記機能的相同体はまた、基準ポリペプチドとかなりの配列同一性を共有する。好ましくは、基準ポリペプチドの機能的相同体は、基準タンパク質と同じ生物学的機能を有し、基準ポリペプチドと高レベルの配列同一性を共有するポリペプチドである。
【0040】
「天然プロモーター」という用語は、本明細書では、そのヌクレオチド配列が、遺伝子は内在性である、野生株のプロモーターに対し少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％配列同一性を有するプロモーターを示す。よって、その天然プロモーター下で発現された遺伝子は通常内在性レベルで発現される。
【0041】
「配列同一性」という用語は、本明細書では、それらの対配列比較に基づく、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間、すなわち候補配列（例えば、変異配列）と基準配列（例えば、野生型配列）の間の関連性を記載する。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）において実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏ／． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは１０のギャップ開始ペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）代替行列である。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅのアウトプット（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）がパーセント同一性として使用され、下記のように計算される：（同一残基×１００）／（アライメントの長さ－アライメントにおけるギャップの総数）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムはまた、基準配列以外の配列内の所定のアミノ酸が基準配列の所定の位置に対応するかどうかを決定するために使用される。本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降において実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０、上記）を使用して決定される。使用されるパラメータは１０のギャップ開始ペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、およびＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）代替行列である。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅのアウトプット（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）がパーセント同一性として使用され、下記のように計算される：（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ－アライメントにおけるギャップの総数）。配列同一性は常に、全長基準配列と比較して測定され、すなわち、ギャップまたはミスマッチのないトランケートされたタンパク質は、基準配列に対し１００％配列同一と考えられない。
【0042】
「突然変異」という用語は、本明細書では、遺伝子のコードおよび非コード領域における挿入、欠失、置換、トランスバージョン、および点変異を含む。点変異は１つの塩基対の変更に関する可能性があり、未熟成終止コドン、フレームシフト突然変異、スプライス部位の突然変異またはアミノ酸置換という結果となり得る。突然変異を含む遺伝子は「突然変異遺伝子」と呼ばれ得る。前記突然変異遺伝子が、野生型と異なる配列を有するポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドは「突然変異ポリペプチド」および／または「突然変異タンパク質」と呼ばれ得る。突然変異ポリペプチドは、それが野生型配列とは異なるアミノ酸配列を含む場合、突然変異を保有していると記載され得る。
【0043】
「欠失」という用語は、本明細書では全遺伝子、または遺伝子の一部のみ、または染色体の一部分の欠失であり得る。
【0044】
「終止コドン」という用語は、本明細書では、遺伝コードにおけるヌクレオチドトリプレットを示し、これはｍＲＮＡ内で、翻訳の終結という結果になる。「終止コドン」という用語は、本明細書ではまた、ｍＲＮＡ内の終止コドンをコードする遺伝子内のヌクレオチドトリプレットを示す。ＤＮＡ内の終止コドンは、典型的には、下記配列の１つを有する：ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡ。
【0045】
「増殖」という用語は、本明細書で酵母と関連して使用されるように、酵母細胞が増加するプロセスを示す。よって、酵母細胞が増殖している間、酵母細胞の数は増加する。酵母細胞の数は任意の有用な方法により決定され得る。
【0046】
「利用することができる」という用語は、本明細書では、特定化合物を細胞生合成のために炭素および／または窒素源として使用する酵母の能力を示す。
【0047】
酵母株
本開示は、少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物中でインキュベートした場合、驚いたことに、１８℃以下での発酵中、低レベルの総ジアセチルを生成し、および／または、ジアセチルを直ちに消費する、酵母株、例えばサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株に関する。
本開示は、少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物中でインキュベートした場合、驚いたことに、１８℃以下での発酵中、低レベルの総ジアセチルを生成し、および／または、ジアセチルを直ちに消費する、酵母株、例えばサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株に関する。
【0048】
ビールの生産のために異なる型の酵母が使用され、最も顕著なのは、サッカロマイセス・パストリアヌスおよびサッカロマイセス・セレビシエである。ラガー・ビールは典型的には、サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母を使用して発酵される。よって、本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌスは、例えば、ラガー・ビールの生産に有用な任意の酵母であってもよい。特に、サッカロマイセス・パストリアヌスは下面発酵酵母株であり得る。サッカロマイセス・パストリアヌスはＳ．セレビシエとＳ．ユーバヤヌスの間のハイブリッドであることが好ましい。前記サッカロマイセス・パストリアヌスはマルトースおよびメリビオースを利用することができることがまた好ましい。よって、好ましくは、サッカロマイセス・パストリアヌスは酵母株であり、これはＳ．セレビシエとＳ．ユーバヤヌスの間のハイブリッドである。前記サッカロマイセス・パストリアヌスはマルトースおよびメリビオースを利用することができることがまた好ましい。
【0049】
１つの態様では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は前記試験液の外観エキス含量が、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる。
【0050】
よって、本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は好ましくは、下記工程を含む方法において試験される場合、発酵試験液を生成することができ：
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に、１８℃以下、好ましくは１２～１８℃、より好ましくは１６℃の温度で、インキュベートする工程
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が、前記インキュベーション中、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に、１８℃以下、好ましくは１２～１８℃、より好ましくは１６℃の温度で、インキュベートする工程
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が、前記インキュベーション中、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は試験液中での前記酵母株とのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は以下で記載される試験液のいずれかであってもよく、好ましくは、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、発酵試験液は、前記試験液中での前記酵母株とのインキュベーション後、先行する２４時間で、前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しなかった、例えば０．４０°プラート超減少しなかった、例えば０．３０°プラート超減少しなかった、例えば０．２０°プラート超減少しなかった最早時点で、以下で記載される最大レベルのジアセチルを含み、前記発酵は、以下で特定される温度で起こる。特に、前記試験液の外観エキス含量は、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった。
【0052】
前記最大レベルのジアセチルは、前記試験液の外観エキス含量が前記°プラート超減少しなかった最早時点で、好ましくは最大で６０ｐｐｂ、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルである。特に、前記最早時点でのジアセチルの前記レベルは最大で４５ｐｐｂであり得る。
【0053】
以上で記載される通り、酵母の特性を同定する場合、インキュベーションは好ましくは、最大で１８℃の温度で、例えば１２℃～１８℃の範囲または１４～１６℃の範囲にある温度で実施される。特に、前記インキュベーションはおよそ１６℃の温度で実施され得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有する試験液中での前記酵母株のインキュベーション後、発酵試験液を生成することができ、前記発酵試験液は、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後先行する１２時間で、前記試験液の外観エキス含量が０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる。
【0055】
よって、本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は好ましくは、下記工程を含む方法において試験される場合、発酵試験液を生成することができ：
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度で、インキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中の先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度で、インキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中の先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は以下で記載される試験液のいずれかであってもよく、発酵試験液は、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後先行する２４時間で、前記試験液の外観エキス含量が０．２５°プラート超減少しなかった、例えば０．２０°プラート超減少しなかった、例えば０．１５°プラート超減少しなかった、例えば０．１０°プラート超減少しなかった最早時点で、以下で記載される最大レベルのジアセチルを含み、前記発酵は、以下で特定される温度で起こる。特に、前記試験液の外観エキス含量は先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった。
【0057】
前記最大レベルのジアセチルは、前記試験液の外観エキス含量が前記°プラート超減少しなかった最早時点で、好ましくは最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルである。特に、前記最早時点でのジアセチルの前記最大レベルは５０ｐｐｂであり得る。
【0058】
前記インキュベーションは好ましくは最大で１８℃の温度で、例えば１２℃～１８℃の範囲の温度で実施される。特に、前記インキュベーションはおよそ１６℃の温度で実施され得る。
【0059】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる。
【0060】
よって、本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、下記工程を含む方法において試験される場合、好ましくは、発酵試験液を生成することができ：
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程、
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度でインキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中、次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む。
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程、
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度でインキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中、次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は以下で記載される試験液のいずれかであってもよく、発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後、次の２４時間で、０．５０°プラート超減少しない、例えば０．４０°プラート超減少しない、例えば０．３０°プラート超減少しない、例えば０．２０°プラート超減少しない最早時点で、以下で記載される最大レベルのジアセチルを含み、前記発酵は、以下で特定される温度で起こる。特に、前記試験液の外観エキス含量は次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない。
【0062】
前記最大レベルのジアセチルは、前記試験液の外観エキス含量が前記°プラート超減少しなかった最早時点で、好ましくは、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で１１５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で１１０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルである。特に、前記最早時点での前記最大レベルのジアセチルは１１０ｐｐｂであり得る。特に、前記最早時点での前記最大レベルのジアセチルは５５ｐｐｂであり得る。
【0063】
前記インキュベーションは好ましくは最大で１８℃の温度で、例えば１２℃～１８℃の範囲の温度で実施される。特に、前記インキュベーションはおよそ１６℃の温度で実施され得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる。
【0065】
よって、本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、下記工程を含む方法において試験される場合、好ましくは、発酵試験液を生成することができ：
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程、
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度でインキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中、次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含む。
ａ）試験液を提供する工程であって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である工程、
ｂ）前記サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株を前記試験液と共に最大で１８°の温度でインキュベートする工程、
ｃ）前記試験液の外観エキス含量が前記インキュベーション中、次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点を決定する工程、ならびに
ｄ）前記最早時点でのジアセチルのレベルを決定する工程、
前記試験液は前記最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は以下で記載される試験液のいずれかであってもよく、発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない、例えば０．２０°プラート超減少しない、例えば０．１５°プラート超減少しない、例えば０．１０°プラート超減少しない最早時点で、以下で記載される最大レベルのジアセチルを含み、前記発酵は、以下で特定される温度で起こる。特に、前記試験液の外観エキス含量は次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない。
【0067】
前記最大レベルのジアセチルは好ましくは、前記試験液の外観エキス含量が前記°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で１１５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で１１０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で１０５ｐｐｂのジアセチルである。特に、前記最早時点での前記最大レベルのジアセチルは１１０ｐｐｂ、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチルであり得る。
【0068】
前記インキュベーションは好ましくは最大で１８℃の温度で、例えば１２℃～１８℃の範囲の温度で実施される。特に、前記インキュベーションはおよそ１６℃の温度で実施され得る。
【0069】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は酵母とのインキュベーションの開始後５日以内の任意の時点で、最大で２６５ｐｐｂのジアセチルを含み、インキュベーションは最大で１８℃の温度で実施され、７～１５００万の範囲の生酵母細胞／ｍｌが前記試験液に添加される。
【0070】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は前記酵母株との最大で６日間のインキュベーション後、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。特に、前記発酵試験液は、前記酵母株との最大で５日間のインキュベーション後、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み得る。特に、前記発酵試験液は、前記酵母株との最大で４日間のインキュベーション後、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み得る。
【0071】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液との最大で５日間、最大で１６℃の温度でのインキュベーション後、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む。特に、前記発酵試験液は、前記酵母株との最大で４日間、最大で１６℃の温度でのインキュベーション後、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含み得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中でインキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる。
【0073】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中で、４～６日の範囲の間インキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる。特に、前記酵母株は前記試験液中で、およそ４日間インキュベートすることができる。
【0074】
非常に好ましい実施形態では、酵母株は、下記ができる酵母株であり：
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；ならびに
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
発酵は本明細書において実施例６で記載されるように起こる。
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、好ましくは最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の２４時間で０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；ならびに
－試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することであって、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含むこと；
発酵は本明細書において実施例６で記載されるように起こる。
【0075】
いくつかの実施形態では、酵母株は高綿状沈殿を有する。綿状沈殿は、例えば、発酵後の懸濁細胞であり得る。「懸濁細胞」は一般に、発酵試験液を含む容器の上３／４、例えば上２／３、例えば上半分からとった試料中の酵母細胞を計数することにより決定される。発酵が円錐筒タンク内で実施される場合、前記試料は好ましくは円錐上方で取られる。発酵後の溶液中の低い数の細胞は高綿状沈殿を示す。
【0076】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は前記酵母株の試験液中でのインキュベーション後に、発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、溶液中、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で８００万細胞／ミリリットルを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株はメリビオースを唯一の炭素源として有する培地上で増殖することができる。
【0078】
好ましい実施形態では、本明細書で開示される酵母株は遺伝子組み換えでない生物である。よって、好ましい実施形態では、前記酵母株は遺伝子操作の工程を受けていない。
【0079】
試験液
いくつかの実施形態では、試験液はおよそ１６°プラートの外観エキス含量を有する麦汁である。いくつかの実施形態では、試験液は少なくとも４０ｇ／ｋｇのマルトースを含む。
いくつかの実施形態では、試験液はおよそ１６°プラートの外観エキス含量を有する麦汁である。いくつかの実施形態では、試験液は少なくとも４０ｇ／ｋｇのマルトースを含む。
【0080】
試験液は一般に少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物である。よって、試験液は特に麦汁であってもよい。試験液は好ましくは、１２～１８°プラートの範囲の外観エキス含量、より好ましくは、およそ１６°プラートの外観エキス含量を有し得る。試験液は、０．２０ｍｇ／Ｌ～０．４０ｍｇ／Ｌの範囲の亜鉛をさらに含むことができ、ｐＨは、４．０～６．０の範囲に調整され得る。
【0081】
試験液の１つの例は、１２－２５ｇ／Ｌの範囲のグルコース、６０－８０ｇ／Ｌの範囲のマルトース、１５－２０ｇ／Ｌの範囲のマルトトリオース、０．２０ｍｇ／Ｌ～０．４０ｍｇ／Ｌの範囲の亜鉛、１１０－２５０ｍｇ／Ｌの範囲の遊離αアミノ態窒素（ＦＡＮ）および０．６～０．８のバリン／ＦＡＮ比を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、試験液はピルスナーモルトから、潜在的オオムギアジャンクトが添加されて製造される。
【0083】
遺伝子型
本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、上記見出し「酵母株」を有するセクションで記載されるように、ジアセチルレベルが低減された発酵試験液を生成することができる表現型を有する。
本発明によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、上記見出し「酵母株」を有するセクションで記載されるように、ジアセチルレベルが低減された発酵試験液を生成することができる表現型を有する。
【0084】
前記表現型特徴に加えて、本発明による酵母株は好ましくは、本明細書において以下で記載される遺伝子型の１つ以上を有し得る。
【0085】
ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２は、ピルビン酸からＬ－バリンの合成に関与する。ジアセチルの自然産生がこのプロセスにおいて起こり得る。
【0086】
アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（ＩＬＶ６）およびアセト乳酸シンターゼ触媒サブユニット（ＩＬＶ２）はピルビン酸をαアセト乳酸に変換する。
【0087】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＩＬＶ５）はαアセト乳酸の２，３ヒドロキシ－イソ吉草酸への変換を触媒する。
【0088】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩＬＶ３）は２，３ヒドロキシ－イソ吉草酸の２－ケトイソラテレート（２－ｋｅｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｒａｔｅ）への変換を触媒する。
【0089】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ１）はミトコンドリアにおける２－ケトイソラテレート（２－ｋｅｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｒａｔｅ）のＬ－バリンへの変換を触媒し、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ２）はサイトゾルにおける前記反応を触媒する。
【表1】
【表2】
【0090】
酵母細胞が正確な数の遺伝子を「有する」場合、前記細胞は示された数を超える遺伝子は含まないことが理解される。同様に、酵母細胞がＸＸ～ＹＹ遺伝子の範囲で「有する」場合、前記酵母細胞はＹＹを超える遺伝子は含まない。
【0091】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＩＬＶ２をコードする最大で５の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ２をコードする最大で４の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ２をコードする１～５の範囲の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ２をコードする１～４の範囲の遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２または、これと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する相同体をコードする。発明の酵母株はＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子を有し、例えば、酵母株は、ＩＬＶ２をコードする１～２の範囲、例えば厳密に２の機能遺伝子を有し得ることが好ましい。好ましくは、前記機能遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする。１つの実施形態では、前記機能遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２、好ましくはＳｃＩＬＶをコードする。１つの実施形態では前記機能遺伝子はＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ２をコードし、ＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ２の配列は図４で提供される。
【0092】
いくつかの実施形態では、酵母株は、ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードし；ＩＬＶ３をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする少なくとも５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする少なくとも６の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードし；ならびにＩＬＶ５をコードする少なくとも３の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも５の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする。
【0093】
いくつかの実施形態では、酵母株は、ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードし；ならびに、ＩＬＶ３をコードする、５～９の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ３をコードする、５～７の範囲、例えば６の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードし；ならびにＩＬＶ５をコードする、４～８の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ５をコードする、４～６の範囲、例えば５の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする。
【0094】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＩＬＶ６をコードする最大で４の遺伝子、例えば、機能ＩＬＶ６をコードする２～４の範囲の遺伝子を有し、ＩＬＶ６をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のＳｃＩＬＶ６またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＳｅＩＬＶ６またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする。
【0095】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＩＬＶ５をコードする少なくとも２の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ５をコードする、少なくとも４の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ５をコードする、少なくとも５の遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％までの配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードする。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は機能ＩＬＶ５をコードする、最大で２０の遺伝子、例えば最大で１５の遺伝子、例えば最大で１０の対立遺伝子を有し、機能ＩＬＶ５をコードする遺伝子は前記のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は機能ＩＬＶ５をコードする、５～２０の範囲の対立遺伝子、例えば５～１５の対立遺伝子、例えば５～１０の遺伝子を有し、機能ＩＬＶ５をコードする遺伝子は前記のいずれかであってもよい。
【0096】
１つの実施形態では、酵母株はＩＬＶ５をコードする、４～８の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ５をコードする、４～６の範囲、例えば５の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする。１つの実施形態では、酵母株はＩＬＶ５をコードする、４～８の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ５をコードする、４～６の範囲、例えば５の機能遺伝子を有し、各遺伝子はＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ５をコードし、ＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ５の配列は図７で提供される。
【0097】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＩＬＶ３をコードする、少なくとも３の遺伝子、例えば機能ＩＬＶ３をコードする、少なくとも４の遺伝子、例えば、機能ＩＬＶ３をコードする、少なくとも６の遺伝子を有し、機能ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、または、これと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する相同体をコードする。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、ＩＬＶ３をコードする、最大で２０の対立遺伝子、例えば最大で１５の対立遺伝子、例えば最大で１０の対立遺伝子を有し、機能ＩＬＶ３をコードする各遺伝子は前記のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＩＬＶ３をコードする、５～２０の範囲の対立遺伝子、例えば５～１５の対立遺伝子、例えば５～１０遺伝子を有し、機能ＩＬＶ３をコードする遺伝子は前記のいずれかであってもよい。
【0098】
１つの実施形態では、発明の酵母は、ＩＬＶ３をコードする、５～９の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ３をコードする、５～７の範囲、例えば６の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする。１つの実施形態では、発明の酵母は、ＩＬＶ３をコードする、５～９の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ３をコードする、５～７の範囲、例えば６の機能遺伝子を有し、各遺伝子はＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ３をコードし、ＺＤＡ１、ＺＤＡ２および／またはＺＤＡ３のＩＬＶ３の配列は図６で提供される。
【0099】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は機能ＢＡＴ１をコードする、少なくとも３の遺伝子、例えば、機能ＢＡＴ１をコードする少なくとも４の遺伝子、例えば機能ＢＡＴ１をコードする少なくとも５の遺伝子を有し、機能ＢＡＴ１をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のＳｃＢＡＴ１またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のＳｅＢＡＴ１またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードする。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、ＢＡＴ１をコードする、最大で２０の遺伝子、例えば最大で１５の遺伝子、例えば最大で１０の遺伝子を有し、ＢＡＴ１をコードする各遺伝子は前記のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は機能ＢＡＴ１をコードする、５～２０の範囲の対立遺伝子、例えば５～１５の対立遺伝子、例えば５～１０の対立遺伝子を有し、機能ＢＡＴ１をコードする各対立遺伝子は前記のいずれかであってもよい。
【0100】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は機能ＢＡＴ２をコードする少なくとも４の遺伝子、例えば機能ＢＡＴ２をコードする少なくとも５の遺伝子、例えば機能ＢＡＴ２をコードする少なくとも６の遺伝子を有し、機能ＢＡＴ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のＳｃＢＡＴ２またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードし、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のＳｅＢＡＴ２またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、最大９９％の配列同一性を共有する機能的相同体をコードする。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＢＡＴ２をコードする、最大で２０の遺伝子、例えば最大で１５の遺伝子、例えば最大で１０の遺伝子を有し、機能ＢＡＴ２をコードする遺伝子は前記のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、機能ＢＡＴ２をコードする、５～２０の範囲の遺伝子、例えば５～１５の遺伝子、例えば５～１０の遺伝子を有し、機能ＢＡＴ２をコードする各遺伝子は前記のいずれかであってもよい。
【0101】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する。
【0102】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する。
【0103】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する。
【0104】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する。
【0105】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する。
【0106】
いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・パストリアヌス酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する。
【0107】
本発明のいくつかの実施形態では、機能ＩＬＶ２および機能ＩＬＶ６をコードする遺伝子の合計は機能ＩＬＶ５および機能ＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計より低く、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ３およびＩＬＶ５は前記のいずれかであってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、機能ＩＬＶ２をコードする遺伝子の合計は機能ＩＬＶ５および機能ＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計より低く、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３は前記のいずれかであってもよい。１つの実施形態では、機能ＩＬＶ２および機能ＩＬＶ６をコードする遺伝子の合計は機能ＩＬＶ５、機能ＩＬＶ３、機能ＢＡＴ１および機能ＢＡＴ２をコードする遺伝子の合計より低く、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５；ＢＡＴ１およびＢＡＴ２は前記のいずれかであってもよい。言い換えれば、いくつかの実施形態では、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計はＩＬＶ２およびＩＬＶ６をコードする遺伝子の合計より高い。よって、いくつかの実施形態では、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計はＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２をコードする遺伝子の合計より高い。
【0108】
いくつかの実施形態では、ＩＬＶ２遺伝子対ＩＬＶ５およびＩＬＶ３遺伝子の遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３であり、前記ＩＬＶ２、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３遺伝子は、それぞれ、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３のいずれかをコードする。
【0109】
いくつかの実施形態では、ＩＬＶ２およびＩＬＶ６遺伝子対ＩＬＶ５およびＩＬＶ３遺伝子の遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．２、例えば少なくとも１．４、例えば少なくとも１．６、例えば少なくとも１．８または例えば少なくとも２であり、前記ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３遺伝子は、それぞれ、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３のいずれかをコードする。
【0110】
いくつかの実施形態では、ＩＬＶ２対ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２の遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６であり、前記ＩＬＶ２、ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２遺伝子は、それぞれ、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２のいずれかをコードする。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＩＬＶ２およびＩＬＶ６対ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２の遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４であり、前記ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２遺伝子は、それぞれ、前記機能ＩＬＶ２、ＩＬＶ６、ＩＬＶ５、ＩＬＶ３、ＢＡＴ１およびＢＡＴ２のいずれかをコードする。
【0112】
モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物およびその生成方法
発明は上記見出し「酵母株」を有するセクションで記載されるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株、ならびに、前記酵母株を使用して、モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物を調製する方法を提供する。
発明は上記見出し「酵母株」を有するセクションで記載されるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株、ならびに、前記酵母株を使用して、モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物を調製する方法を提供する。
【0113】
発酵水性抽出物を生成する方法を提供することが発明の一態様であり、前記方法は下記工程を含み：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は本明細書において以上で、セクション「酵母株」において記載される酵母株のいずれかであってもよい、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させる工程、
よって、発酵水性抽出物が得られる。
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は本明細書において以上で、セクション「酵母株」において記載される酵母株のいずれかであってもよい、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させる工程、
よって、発酵水性抽出物が得られる。
【0114】
水性抽出物は、モルトおよび／または穀物粒の任意の水性抽出物であってもよい。よって、この非限定的例は麦汁である。水性抽出物は、例えば、本明細書において下記のこのセクションで記載されるようにマッシングおよび任意でスパージングにより、モルトの抽出物を調製することにより調製され得る。
【0115】
モルトはモルト化した穀物粒、例えばオオムギ粒である。「モルト化」という用語により、制御された環境条件下で起こるプロセスにおけるカーネルの浸漬および発芽、任意で、続いて乾燥工程を含むプロセスであると理解される。前記乾燥工程は好ましくは、高温での発芽カーネルのキルン乾燥とすることができる。キルン乾燥に供した緑モルト、特にＷＯ２０１８／００１８８２号において記載されるプロセスにより得られたモルトもまた使用することができる。
【0116】
モルト化は、カーネル改変を引き起こす多くの酵素の合成、カーネル栄養分を動員する、および、他のデポリメラーゼを活性化するために死胚乳のデンプンおよび細胞壁を主に脱重合するプロセスに重要である。その後の乾燥プロセスにおいて、香味および色は、化学褐色化反応のために、少なくとも部分的に生成される。
【0117】
浸漬は当業者に公知の任意の従来の方法により実施され得る。１つの非限定的例は乾燥および湿潤条件を交互にしての、１０℃～２５℃の範囲の温度での浸漬を含む。発芽は当業者に公知の任意の従来の方法により実施され得る。１つの非限定的例は、１０～２５℃の範囲の温度で、任意で温度を１～４時間の範囲で変化させての発芽を含む。浸漬および発芽はまた、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１８／００１８８２号に記載されるように組み合わせ法で実施され得る。
【0118】
キルン乾燥は、従来の温度、例えば少なくとも７５℃、例えば８０～９０℃の範囲、例えば８０～８５℃の範囲で実施され得る。よって、モルトは、例えば、Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ． （１９８１）およびＨｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９８２）により記載される方法のいずれかにより生成され得る。しかしながら、モルトを生成するための任意の他の好適な方法、例えば、特殊モルトの生成方法、例えば、限定はされないが、モルトを焙煎する方法もまた、本発明と共に使用され得る。
【0119】
モルトは例えばミリングによりさらに処理され得る。ミリングは乾燥状態で実施することができ、すなわち、モルトは乾燥状態で、または、緑モルトが使用される場合湿潤状態で粉砕される。
【0120】
モルト、例えば、粉砕モルトはマッシングすることができ、前記モルトの水性抽出物が得られる。飲料を調製するための開始液は、モルトの水性抽出物、例えば、マッシングにより調製されたモルトの水性抽出物であってもよい。
【0121】
よって、本発明によるモルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物を調製するための方法は、モルトおよび任意で追加のアジャンクトをマッシングすることにより、水性抽出物、例えば麦汁を生成する工程を含み得る。前記マッシング工程はまた、任意でスパージングを含むことができ、したがって前記マッシング工程は、スパージング工程を含むマッシング工程、または、スパージング工程なしのマッシング工程であってもよい。
【0122】
一般に、水性抽出物の生成はモルトおよび／またはカーネルのミリングにより開始される。追加のアジャンクトが添加される場合、これらはまた、それらの性質によって粉砕され得る。アジャンクトが穀類である場合、それは、例えば、粉砕され得るが、一方、シロップ、糖などは、一般に粉砕されない。ミリングはマッシング相でのカーネル粒子への水アクセスを促進する。マッシング中、モルト化中に開始された基質の酵素脱重合が継続され得る。
【0123】
一般に、水性抽出物は、粉砕モルトおよび水を合わせて、インキュベートすることにより、すなわち、マッシングプロセスにおいて調製される。マッシング中、モルト／液体組成物には、追加の炭水化物リッチアジャンクト組成物、例えば粉砕オオムギ、トウモロコシ、またはコメアジャンクトが補充され得る。モルト化されていない穀類アジャンクトは通常、活性酵素をほとんど、または、全く含まず、モルトまたは外因性酵素を補充して、多糖脱重合などに必要な酵素を提供することが重要となる。
【0124】
マッシング中、粉砕モルトおよび／または粉砕カーネルおよび任意で追加のアジャンクトは、液体部、例えば水とインキュベートされる。インキュベーション温度は一般に、一定に維持される（等温マッシング）か、または徐々に増加され、例えば、連続様式で増加される。どちらの場合にも、モルト／カーネル／アジャンクト中の可溶性物質が前記液体部中に解放される。その後の濾過により、水性抽出物および残留固体粒子が分離され、後者はまた、「カーネル粕」と呼ばれる。このように得られた水性抽出物はまた、「第一麦汁」と呼ばれ得る。追加の液体、例えば水が、スパージングとも呼ばれるプロセス中にカーネル粕に添加され得る。スパージングおよび濾過後、「第二麦汁」が得られ得る。さらなる麦汁が手順を繰り返すことにより調製され得る。麦汁の調製のための好適な手順の非限定的な例がＢｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ． （１９８１およびＨｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９８２）により記載される。
【0125】
上記のように、水性抽出物はまた、モルト化されていないカーネルのみをマッシングすることにより調製され得る。モルト化されていないカーネルは、麦汁生成に有益な酵素、例えば細胞壁を分解することができる酵素またはデンプンを糖に脱重合することができる酵素を欠き、またはこれを限られた量でしか含まない。よって、最大８０％、例えば９０％または例えば１００％までのモルト化されていないカーネル、例えばオオムギ粒がマッシングのために使用される発明の実施形態では、１つ以上の好適な、外部醸造酵素がマッシュに添加されることが好ましい。好適な酵素はリパーゼ、デンプン分解酵素（例えばアミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１－４）－および／または（１－３，１－４）－β－グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えばアラビノキシラナーゼ（ａｒａｂｉｎｏｘｙｌａｎａｓｅ））、および／またはプロテアーゼ、または前記酵素の１つ以上を含む酵素混合物、例えばＣｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）であってもよい。
【0126】
水性抽出物はまた、モルト化された、および、モルト化されていないカーネルの混合物を使用することにより調製され得、その場合、１つ以上の好適な酵素が調製中に添加され得る。モルトが使用される実施形態においてさえ、酵素はまた、添加され得る。より特定的には、カーネルは、マッシングのために、モルトと一緒に任意の組み合わせで使用することができ－外部醸造酵素ありまたはなし－例えば、限定はされないが、カーネル：モルトの割合＝およそ１００：０、またはおよそ７５：２５、またはおよそ５０：５０、またはおよそ２５：７５である。
【0127】
マッシング後に得られる水性抽出物はまた、「スィート麦汁」とも呼ばれ得る。従来の方法では、スィート麦汁はホップありまたはなしで煮沸され、その後、煮沸麦汁と呼ばれ得る。
【0128】
水性抽出物は加熱または煮沸することができ、その後、これは発明の酵母による発酵に供せられる。発明の１つの態様では、第二およびさらなる麦汁は合わせることができ、よって、加熱または煮沸に供せられ得る。水性抽出物は、任意の好適な時間量、例えば６０分～１２０分の範囲の間、加熱または煮沸することができる。
【0129】
モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物の結末は、モルトおよび／または穀物粒の水性抽出物中に存在する発酵性糖の量および型、ならびに発酵中に使用される酵母株の特性に著しく依存する。
【0130】
本発明のいくつかの実施形態では、前記水性抽出物は、少なくとも１２°プラート、例えば少なくとも１５°プラート、例えば５－１５°プラートの範囲、例えば１０－２０°プラートの範囲、例えば１５－２５°プラートの範囲の外観エキス含量を有する。
【0131】
いくつかの実施形態では、前記水性抽出物は、最大で６日、例えば最高５日間、例えば最高４日間、例えば最高３日間、前記酵母株により発酵される。
【0132】
本発明の酵母株の追加の利点は、それらが、低レベルのアミノ酸を有する麦汁の発酵に有用であることであり得る。よって、いくつかの実施形態では、前記水性抽出物は、最大で３５００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で３０００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で２５００ｍｇ／Ｌのアミノ酸を含む。
【0133】
よって、水性抽出物、例えば麦汁は以上で記載されるように調製され得る。モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物は、本発明による前記酵母株による前記水性抽出物の発酵により調製され得る。
【0134】
いくつかの好ましい実施形態では、前記発酵水性抽出物はグリーン・ビールである。
【0135】
一般論として、アルコール性発酵水性抽出物－例えばビール－は、モルト化されたおよび／またはモルト化されていないカーネルから製造することができる。モルトは、ホップおよび酵母に加えて、飲料、例えばビールの香味および色に寄与する。さらに、モルトは、発酵性糖源および酵素として機能する。モルト化および醸造のための好適な方法の例の非限定的記載が、例えば、Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ． （１９８１）およびＨｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９８２）による刊行物において見られ得る。カーネル、モルトおよびビール製品の分析のための多くの、定期的に更新される方法が使用可能であり、例えば、限定はされないが、米国穀物化学者学会（１９９５）、米国醸造化学者学会（１９９２）、欧州醸造所協定（１９９８）、および醸造研究所（１９９７）である。多くの特定の手順が所定の醸造所のために使用され、最も重要な変更は地方の消費者の好みに関連することが認識される。ビールを生産する任意のそのような方法は本発明と共に使用され得る。
【0136】
麦汁からビールを生産する第１の工程は好ましくは、本明細書において以上で記載される前記麦汁を加熱すること、続いて麦汁冷却および任意でワールプールレストのその後の相を含む。
【0137】
発明の方法はモルトおよび／または穀物粒の水性抽出物を本発明による酵母株により発酵させる工程を含む。前記発酵は未発酵水性抽出物または酵母のための発酵性糖を依然として含む発酵水性抽出物の発酵であってもよい。よって、いくつかの実施形態では、前記発酵は本質的にマッシングの完了の直後または麦汁の加熱後に実施され得る。
【0138】
発酵は、本発明による酵母、すなわち、本明細書において以上で記載される特性の１つ以上を有する酵母を含む発酵タンクにおいて実施され得る。
【0139】
数日の長さの発酵プロセス中、香味物質が発生する。酵母株が特定化合物を変換することができない場合、これらは、発酵工程ｉｉｉ）後に依然として存在するであろう。
【0140】
いくつかの実施形態では、発酵工程ｉｉｉ）は以下で特定される温度のいずれかで起こり、水性抽出物は以下で記載される酵母細胞数のいずれかとインキュベートされており、発酵水性抽出物は以下で記載される最大レベルのジアセチルを含み、発酵が最長５日、例えば最長４日、例えば最長３日後に完了する。特に、発酵は最長４日後に完了する。
【0141】
特定の実施形態では、発明の酵母株を使用する発酵は、同じ条件下でＷ－３４／７８酵母株を用いて実施された発酵よりも少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間早く、完了し、ジアセチルは６０ｐｐｂ、例えば５０ｐｐｂ未満となる。
【0142】
前記発酵は好ましくは最大で１８℃の温度で、例えば１２℃～１８℃の範囲の温度で実施される。特に、前記発酵はおよそ１６℃の温度で実施され得る。
【0143】
前記最大レベルのジアセチルは好ましくは、発酵が完了した時に、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルである。特に、発酵完了時でのジアセチルの前記レベルは最大で６０ｐｐｂである。
【0144】
前記発酵は好ましくは、水性抽出物を少なくとも６００万生酵母細胞／ミリリットル、例えば少なくとも１０００万生酵母細胞／ミリリットル、例えば少なくとも１４００万生酵母細胞／ミリリットル、例えば７－８００万の範囲の生酵母細胞／ミリリットル、例えば１４－１６００万の範囲の生酵母細胞／ミリリットルと共にインキュベートすることにより実施される。特に、前記発酵は、水性抽出物を、およそ１５００万酵母細胞／ミリリットルと共にインキュベートすることにより実施され得る。
【0145】
いくつかの実施形態では、前記発酵水性抽出物は、少なくとも４％ＡＢＶ、例えば少なくとも５％ＡＢＶ、例えば少なくとも６％ＡＢＶ、例えば少なくとも７％ＡＢＶのアルコール含量を有する。
【0146】
いくつかの実施形態では、前記発酵水性抽出物は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、前記発酵水性抽出物は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で７ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、前記発酵水性抽出物は、有益なイソブタノール対プロパノール比を含む。特に、イソブタノール対プロパノール比は、少なくとも１．５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５であってもよい。
【0149】
いくつかの実施形態では、発明の酵母を用いて得られた発酵水性抽出物は、同じ％ＡＢＶで、Ｗ－３４／７８酵母株または酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いて同じ条件下で実施された発酵よりも、少なくとも１．５％、例えば２％低い真性発酵度合い（ＲＤＦ）を有する。
【0150】
モルトおよび／または穀類に基づく飲料およびその生成方法
本明細書において以上で記載される、モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物はさらに処理され、飲料とされ得る。
本明細書において以上で記載される、モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物はさらに処理され、飲料とされ得る。
【0151】
発明の一態様は、モルトおよび／または穀類に基づく飲料を生成する方法を提供することであり、前記方法は下記工程を含む：
ｉ．本明細書において以上で、セクション「モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物およびその生成方法」において記載される発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物をさらに加工処理して飲料にする工程。
ｉ．本明細書において以上で、セクション「モルトおよび／または穀類に基づく発酵水性抽出物およびその生成方法」において記載される発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物をさらに加工処理して飲料にする工程。
【0152】
本発明のいくつかの実施形態では、モルトおよび／または穀類に基づく飲料は水などの液体で希釈される。
【0153】
任意で、水を使用して、モルトおよび／または穀類に基づく飲料を希釈し、よって、例えば、エタノール含量を調整することができる。本発明の１つの実施形態では水：モルトおよび／または穀類に基づく飲料の割合は０．１～５部水対１部モルトおよび／または穀類に基づく飲料の範囲とすることができる。
【0154】
さらなるプロセスは例えばまた、モルトおよび／または穀類に基づく飲料の冷却および／または濾過を含み得る。また、添加物が添加され得る。さらに、ＣＯ２が添加され得る。最後に、モルトおよび／または穀類に基づく飲料、例えばビールは低温殺菌および／または濾過され得、その後、それはパッケージされる（例えば、瓶詰めまたは缶詰め）。
【0155】
好ましい実施形態では、飲料はビールである。
【0156】
本発明の一態様では、水性抽出物を本発明による前記酵母株を用いて発酵させることにより生成されたモルトおよび／または穀類に基づく飲料は心地よい味覚を有する。
【0157】
本発明による酵母を用いた発酵により生成されたモルトおよび／または穀類に基づく飲料の味覚は、例えば、専門家ビール味覚パネルにより、分析され得る。好ましくは、前記パネルはビール香味の試飲および説明において、アルデヒド、紙のような味覚、古い味覚、エステル、高級アルコール、脂肪酸および硫黄成分に特に焦点を合わせて訓練される。
【0158】
一般に、味覚パネルは、３～３０の範囲のメンバー、例えば５～１５の範囲のメンバー、好ましくは８～１２の範囲のメンバーから構成される。味覚パネルは、様々な香味の存在、例えば紙のような、酸化、エージングされた、及びパンのような香味、ならびにエステル、高級アルコール、硫黄成分の香味およびビールのボディを評価することができる。ビールの全体の味覚は一般に、味覚パネルにより、いくつかの異なる特性に基づき１～９のスケールで格付けされ、５を超える平均格付けはビールが許容される味覚を有することを示す。
【0159】
本発明はまた、以上で記載される方法により調製された、モルトおよび／または穀類に基づく飲料を提供する。
【0160】
いくつかの実施形態では、飲料は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、飲料は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む。
【0162】
一般に、発明の酵母株を使用して調製された発酵水性抽出物または飲料は、イソブタノール対プロパノールの特定比、例えば、図２において示される比と同様の比を有する。よって、発酵水性抽出物または飲料がイソブタノール対プロパノールのこの特定比を有する場合、発酵水性抽出物または飲料は発明の酵母株を用いた発酵により生成されたことが示される。特に、前記イソブタノール対プロパノール比は、少なくとも１．５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．１、例えば少なくとも５．２、例えば少なくとも５．３、例えば少なくとも５．４、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５であってもよい。
【0163】
アイテム
発明は、下記アイテムによりさらに規定され得る：
１．発酵水性抽出物を生成する方法であって、下記工程を含む、方法：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
発明は、下記アイテムによりさらに規定され得る：
１．発酵水性抽出物を生成する方法であって、下記工程を含む、方法：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
【0164】
２．そのゲノム内で、下記をコードする酵母株
ａ．ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子であって、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子；ならびに
ｂ．ＩＬＶ３をコードする、少なくとも５の機能遺伝子、例えば少なくとも６の機能遺伝子であって、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子。
ａ．ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子であって、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子；ならびに
ｂ．ＩＬＶ３をコードする、少なくとも５の機能遺伝子、例えば少なくとも６の機能遺伝子であって、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子。
【0165】
３．モルトおよび／または穀類の水性抽出物中でのインキュベーションで、発酵水性抽出物を生成することができる酵母株であって、前記発酵水性抽出物は少なくとも２．０のイソブタノール対プロパノール比を含む、酵母株。
【0166】
４．アイテム２～３のいずれか一つによる酵母株であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂの総ジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、酵母株。
【0167】
５．アイテム１または４による方法または酵母株であって、前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が先行する２４時間で０．４０°プラート、例えば、０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しなかった最早時点である、方法または酵母株。
【0168】
６．アイテム１および４－５のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記試験液は前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、方法または酵母株。
【0169】
７．発酵水性抽出物を生成する方法であって、下記工程を含む方法：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
【0170】
８．アイテム２～６のいずれか一つによる酵母株であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂの総ジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、酵母株。
【0171】
９．アイテム７～８のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しなかった最早時点である、方法または酵母株。
【0172】
１０．アイテム７～８のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記試験液は、前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、方法または酵母株。
【0173】
１１．発酵水性抽出物を生成する方法であって、下記工程を含む方法：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、次の２４時間で前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、次の２４時間で前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
【0174】
１２．アイテム２～６および８～１０のいずれか一つによる酵母株であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、次の２４時間で前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂの総ジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、酵母株。
【0175】
１３．アイテム１１～１２のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記時点は、次の２４時間で、前記試験液の外観エキス含量が、０．４０°プラート、例えば０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しない最早時点である、方法または酵母株。
【0176】
１４．発酵水性抽出物を生成する方法であって、下記工程を含む方法：
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程。
【0177】
１５．アイテム２～６、８～１０および１２～１３のいずれか一つによる酵母株であって、前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂの総ジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、酵母株。
【0178】
１６．アイテム１４～１５のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記時点は前記試験液の外観エキス含量が、次の１２時間で、０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しない最早時点である、方法または酵母株。
【0179】
１７．アイテム１１～１５のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記試験液は前記最早時点で最大で１１５ｐｐｂのジアセチルを含む、方法または酵母株。
【0180】
１８．アイテム１および４～１７のいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記試験液は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、方法または酵母株。
【0181】
１９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、工程ｉｉ）の試験液または試験液はおよそ１６°プラートの外観エキス含量を有する麦汁である、方法または酵母株。
【0182】
２０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、工程ｉｉ）の試験液または試験液は少なくとも４０ｇ／ｋｇのマルトースを含む、方法または酵母株。
【0183】
２１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、工程ｉｉ）における前記発酵または前記発酵は１２℃～１８℃の範囲の温度で起こる、方法または酵母株。
【0184】
２２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、工程ｉｉ）における前記発酵または前記発酵は最大で１６℃の温度で起こる、方法または酵母株。
【0185】
２３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、工程ｉｉ）における前記発酵または前記発酵は、７，０００，０００～２０，０００，０００生酵母細胞／ｍＬ試験液の範囲の接種後に起こる、方法または酵母株。
【0186】
２４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記水性抽出物は前記酵母株により、最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間発酵される、方法または酵母株。
【0187】
２５．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記水性抽出物は少なくとも１２°プラート、例えば少なくとも１５°プラートの外観エキス含量を有する、方法または酵母株。
【0188】
２６．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記水性抽出物は麦汁である、方法または酵母株。
【0189】
２７．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記水性抽出物は、最大で３５００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で３０００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で２５００ｍｇ／Ｌのアミノ酸を含む、方法または酵母株。
【0190】
２８．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４０ｐｐｂのジアセチルを含む、方法または酵母株。
【0191】
２９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、方法または酵母株。
【0192】
３０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は少なくとも４％ＡＢＶ、例えば少なくとも５％ＡＢＶのアルコール含量を有する、方法または酵母株。
【0193】
３１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む、方法または酵母株。
【0194】
３２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む、方法または酵母株。
【0195】
３３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記発酵水性抽出物は、少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５のイソブタノール対プロパノール比を含む、方法または酵母株。
【0196】
３４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は発酵試験液を生成することができ、前記試験液は、インキュベーションの開始後５日以内の任意の時点で、最大で２６５ｐｐｂのジアセチルを含み、７～８００万の範囲の酵母細胞が前記試験液に添加される、方法または酵母株。
【0197】
３５．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、前記試験液における、最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、方法または酵母株。
【0198】
３６．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、前記試験液において、最大で１６℃の温度で、最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、方法または酵母株。
【0199】
３７．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は前記試験液における所定の時間の間のインキュベーション後に、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第１の発酵試験液を生成することができ、前記所定の時間は、同じ条件下でインキュベートされるＷ－３４／７８酵母株が、前記試験液におけるインキュベーション後に最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第２の発酵試験液を生成するのに必要とされる時間よりも少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間少ない、方法または酵母株。
【0200】
３８．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中でインキュベートした場合、少なくとも４．０、例えば少なくとも４．７ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる、方法または酵母株。
【0201】
３９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中で、４～６日の範囲の間、例えば、およそ４日間インキュベートした場合、少なくとも４．０、例えば少なくとも４．７ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる、方法または酵母株。
【0202】
４０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、メリビオースを唯一の炭素源として有する培地上で増殖することができる、方法または酵母株。
【0203】
４１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ２をコードする最大で５の対立遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0204】
４２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ２をコードする最大で４の遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0205】
４３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ２をコードする最大で２の遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0206】
４４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ２をコードする、１～２の範囲、例えば厳密に２の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0207】
４５．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ２をコードする、１～２の範囲、例えば厳密に２の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0208】
４６．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ６をコードする最大で４の遺伝子を有し、ＩＬＶ６をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のＳｃＩＬＶ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＳｅＩＬＶ６、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0209】
４７．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ６をコードする最大で４の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ６をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のＳｃＩＬＶ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＳｅＩＬＶ６、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0210】
４８．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ５をコードする少なくとも４の遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも５の遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0211】
４９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、そのゲノム内で、ＩＬＶ５をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも５の機能遺伝子をコードし、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0212】
５０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ５をコードする、最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～５の機能遺伝子を有する、方法または酵母株。
【0213】
５１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ５をコードする、４～８の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ５をコードする、４～６の範囲、例えば５の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0214】
５２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、ＩＬＶ３をコードする少なくとも３の遺伝子、例えば少なくとも４の遺伝子を有し、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0215】
５３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ３をコードする最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～６の機能遺伝子を有する、方法または酵母株。
【0216】
５４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＩＬＶ３をコードする、５～９の範囲の機能遺伝子、例えば、ＩＬＶ３をコードする、５～７の範囲、例えば６の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する前記のいずれかの機能的相同体をコードする、方法または酵母株。
【0217】
５５．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＢＡＴ１をコードする少なくとも３の遺伝子、例えば少なくとも４の遺伝子を有し、ＢＡＴ１をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のＳｃＢＡＴ１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のＳｅＢＡＴ１、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0218】
５６．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＢＡＴ１をコードする少なくとも３の機能遺伝子、例えば少なくとも４の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ１をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のＳｃＢＡＴ１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のＳｅＢＡＴ１、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0219】
５７．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＢＡＴ２をコードする少なくとも４の遺伝子、例えば少なくとも５の遺伝子を有し、ＢＡＴ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のＳｃＢＡＴ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のＳｅＢＡＴ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0220】
５８．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株はＢＡＴ２をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えば少なくとも５の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のＳｃＢＡＴ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のＳｅＢＡＴ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、方法または酵母株。
【0221】
５９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ２およびＩＬＶ６をコードする前記酵母株における遺伝子の合計はＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計より低い、方法または酵母株。
【0222】
６０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ２をコードする前記酵母株における遺伝子の合計はＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする遺伝子の合計より低い、方法または酵母株。
【0223】
６１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２の前記酵母株における遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５または例えば少なくとも３である、方法または酵母株。
【0224】
６２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２の前記酵母株における機能遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３である、方法または酵母株。
【0225】
６３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２およびＩＬＶ６の前記酵母株における遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．２、例えば少なくとも１．４、例えば少なくとも１．６、例えば少なくとも１．８または例えば少なくとも２である、方法または酵母株。
【0226】
６４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３対ＩＬＶ２およびＩＬＶ６の前記酵母株における機能遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．２、例えば少なくとも１．４、例えば少なくとも１．６、例えば少なくとも１．８または例えば少なくとも２である、方法または酵母株。
【0227】
６５．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ２、ＩＬＶ３および／またはＩＬＶ５をコードする遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、方法または酵母株。
【0228】
６６．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、ＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１および／またはＢＡＴ２をコードする遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、方法または酵母株。
【0229】
６７．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、方法または酵母株。
【0230】
６８．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、方法または酵母株。
【0231】
６９．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、方法または酵母株。
【0232】
７０．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、方法または酵母株。
【0233】
７１．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、方法または酵母株。
【0234】
７２．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、方法または酵母株。
【0235】
７３．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は異種ＤＮＡを含まない、方法または酵母株。
【0236】
７４．前記アイテムのいずれか一つによる方法または酵母株であって、前記酵母株は遺伝子操作の工程を受けていない、方法または酵母株。
【0237】
７５．前記アイテムのいずれか一つによる方法により調製された発酵水性抽出物。
【0238】
７６．飲料を生成するための方法であって、下記工程を含む、方法：
ｉ．前記アイテムのいずれか一つに従い発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程。
ｉ．前記アイテムのいずれか一つに従い発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程。
【0239】
７７．アイテム７６による方法であって、加工処理の工程は、下記の１つ以上を含む、方法：
ｉ．濾過、
ｉｉ．炭酸化、
ｉｉｉ．熟成、または
ｉｖ．瓶詰め。
ｉ．濾過、
ｉｉ．炭酸化、
ｉｉｉ．熟成、または
ｉｖ．瓶詰め。
【0240】
７８．アイテム７６～７７のいずれか一つによる方法により調製された飲料。
【0241】
７９．アイテム７８による飲料であって、前記飲料は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む、飲料。
【0242】
８０．アイテム７８～７９のいずれか一つによる飲料であって、前記飲料は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む、飲料。
【0243】
８１．アイテム７８～８０のいずれか一つによる飲料であって、前記飲料はビールである、飲料。
【0244】
８２．アイテム７５による発酵水性抽出物またはアイテム７８－８１のいずれか一つによる飲料であって、前記抽出物または前記飲料は、少なくとも３．０、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５のイソブタノール対プロパノール比を有する、抽出物または飲料。
【0245】
８３．酵母株であって、前記酵母株は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有する試験液中での前記酵母株のインキュベーション後、発酵試験液を生成することができ、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、前記抽出物中での前記酵母株のインキュベーション後先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む、酵母株。
【0246】
８４．アイテム８３によるサッカロマイセス・パストリアヌス酵母株であって、酵母株はアイテム１～７２のいずれか一つにおいて規定される通りである、酵母株。
【0247】
実施例
材料および方法
麦汁調製
一般に、下記実験例で使用する麦汁は、７０％のピルスナーモルトおよび３０％のオオムギアジャンクトを２．７Ｌの水／ｋｇモルトにおいてマッシングすることにより製造した。
材料および方法
麦汁調製
一般に、下記実験例で使用する麦汁は、７０％のピルスナーモルトおよび３０％のオオムギアジャンクトを２．７Ｌの水／ｋｇモルトにおいてマッシングすることにより製造した。
【0248】
マッシングレジームを下記表１に示した：
このマッシングレジームの変更により、依然として発酵に好適な麦汁が生成され得る。
【表3】
【0249】
マッシング後、麦汁を６０分間、煮沸させた。確実に、麦汁が発酵に好適なものとなるには、好ましくは、下記範囲内の含量を有するべきである：
・グルコース １２－２５ｇ／Ｌ
・マルトース ６０－８０ｇ／Ｌ
・マルトトリオース １５－２０ｇ／Ｌ
・亜鉛 ０．１６～０．１８ｍｇ／Ｌ
・遊離αアミノ態窒素（ＦＡＮ） １１０－２５０ｍｇ／Ｌ
・バリン／ＦＡＮ ０．６～０．８
・グルコース １２－２５ｇ／Ｌ
・マルトース ６０－８０ｇ／Ｌ
・マルトトリオース １５－２０ｇ／Ｌ
・亜鉛 ０．１６～０．１８ｍｇ／Ｌ
・遊離αアミノ態窒素（ＦＡＮ） １１０－２５０ｍｇ／Ｌ
・バリン／ＦＡＮ ０．６～０．８
【0250】
参考のために、７０％のピルスナーモルトおよび３０％のオオムギアジャンクトから製造した麦汁の平均含量を下記表２において提供する。下記パラメータのいくつかの外側にある麦汁は、依然として、良好なビールを生成すると予測される。
【表4】
【0251】
酵母の綿状沈殿を助けるために、下記実施例のいくつかにおいて記載されるように、追加の亜鉛が麦汁に発酵前に添加され得る。
【0252】
ドロップレットＰＣＲ
ゲノムＤＮＡを二倍体酵母株および一倍体胞子クローンから、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅゲノムＤＮＡ精製キットを使用して、調製した。各最終ＤＮＡ調製物の濃度を５０ｎｇ／マイクロリットルＤＮＡにミリＱ水を使用して調整した。ＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。
ゲノムＤＮＡを二倍体酵母株および一倍体胞子クローンから、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅゲノムＤＮＡ精製キットを使用して、調製した。各最終ＤＮＡ調製物の濃度を５０ｎｇ／マイクロリットルＤＮＡにミリＱ水を使用して調整した。ＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。
【0253】
ＢｉｏｒａｄドロップレットＰＣＲ（ＱＸ２００）およびサッカロマイセス・ユーバヤヌスおよびサッカロマイセス・セレビシエＩＬＶ２遺伝子にアニールするように設計されたプローブを使用する。これらのプローブを使用して、一倍体胞子クローンおよび対照二倍体酵母株におけるゲノムＤＮＡを標的にした。この方法を使用して、発明者らは２つのバリアントＩＬＶ２遺伝子間の比を定量的に決定することができた。Ｓ．ユーバヤヌスおよびＳ．セレビシエＩＬＶ２アレルを区別するために、ＴａｑＭａｎアッセイに基づく種特異的デジタルＰＣＲ反応を設計した。このために、標的特異性プライマーをＳ．ユーバヤヌスおよびＳ．セレビシエについてのＩＬＶ２遺伝子の相同領域において設計し、同じフォワードおよびリバースプライマーが、両方のＩＬＶ２種コピーを同時に増幅できることが意味される。種特異的プローブを単一ヌクレオチド以外同一となるように設計し、Ｓ．ユーバヤヌスおよびＳ．セレビシエ型のＩＬＶ２アレル間の識別が可能になった。Ｓ．セレビシエについての種特異的プローブはＳ．セレビシエＩＬＶ２野生型配列におけるヌクレオチド位置１５１５でＴを有し、一方、Ｓ．ユーバヤヌスについての種特異的プローブはＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２野生型配列におけるヌクレオチド位置１５１５でＣを有する。下記プライマーおよびプローブが、Ｓ．ユーバヤヌスＩＬＶ２アレルとＳ．セレビシエＩＬＶ２アレルの間で区別するために開発された：
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２の両方を同時に増幅する標的特異性ＩＬＶ２プライマー：
標的特異性フォワードプライマー（５’－ＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
標的特異性リバースプライマー（５’－ＧＴＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＴ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２コピーの間の識別を可能にする種特異的プローブ：
Ｓ．セレビシエＩＬＶ２アレル特異的プローブ（５’－ＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＣ－３’）（ＳＥＱＩＤ：３）－５’ＦＡＭおよび３’ＢＨＱ１で標識される
Ｓ．ユーバヤヌスＩＬＶ２アレル特異的プローブ（５’－ＡＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）－５’ＨＥＸおよび３’ＢＨＱ１で標識される
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２の両方を同時に増幅する標的特異性ＩＬＶ２プライマー：
標的特異性フォワードプライマー（５’－ＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
標的特異性リバースプライマー（５’－ＧＴＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＴ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２コピーの間の識別を可能にする種特異的プローブ：
Ｓ．セレビシエＩＬＶ２アレル特異的プローブ（５’－ＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＣ－３’）（ＳＥＱＩＤ：３）－５’ＦＡＭおよび３’ＢＨＱ１で標識される
Ｓ．ユーバヤヌスＩＬＶ２アレル特異的プローブ（５’－ＡＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴ－３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）－５’ＨＥＸおよび３’ＢＨＱ１で標識される
【0254】
ドロップレットデジタルＰＣＲ ＱＸ２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ｄｄＰＣＲを、製造者により提供される指示に従い実施した。分析目的で、酵母株の５μｌの精製ｇＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ ＤＮＡ濃度）を、プローブのための１１μｌの２ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｎｏ．ｄＵＴＰ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、９００ｎＭの標的特異性ＰＣＲフォワードプライマー、９００ｎＭの標的特異性ＰＣＲリバースプライマー、２５０ｎＭのＳ．セレビシエＩＬＶ２アレル特異的プローブおよび２５０ｎＭのＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２アレル特異的プローブを含む１７－μｌ ＰＣＲ混合物に添加した。反応混合物をＡｕｔｏＤＧドロップレット生成器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上にロードし、ドロップレット生成を製造者のマニュアルに従い実施した。ドロップレットエマルジョンを、標準ＰＣＲ条件を使用して熱サイクルさせた：９５℃で１０分間変性、９４℃で３０秒間および５５℃で１分間の４０サイクルのＰＣＲ、ならびに９８℃で１０分間の最終伸長、その後、８℃でのマイクロタイタープレートの保存。ドロップレットでのＰＣＲ増幅を、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して確認し、データを、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して分析した。
【0255】
総ＩＬＶ２遺伝子コピー数の検出
第１ラウンドで、Ｓ．ユーバヤヌスとＳ．セレビシエＩＬＶ２の間の比を各単一胞子クローン由来の精製ゲノムＤＮＡ上で直接分析した。同じ親酵母由来にもかかわらず、いくつかの胞子クローンは異なるＩＬＶ２遺伝的構造を有した。いくつかの胞子クローンは、１００％Ｓ．セレビシエＩＬＶ２遺伝子胞子クローンのみを有すると考えられる。ほとんどの親ラガー酵母は、三または四倍体であるので（Ｗａｈｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ， ２０１４）、１００％Ｓ．セレビシエＩＬＶ２胞子クローンはおよそ１－３コピーを有し得ると仮定することができる。両方の型のＩＬＶ２、例えば５０／５０を有する胞子クローンについては、胞子クローンにおける各型の１コピー、または、親酵母における２＋２が仮定されるであろう。６７／３３に近い比を有する株は、Ｓ．セレビシエの１コピーおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２の２コピーを意味するであろう。
第１ラウンドで、Ｓ．ユーバヤヌスとＳ．セレビシエＩＬＶ２の間の比を各単一胞子クローン由来の精製ゲノムＤＮＡ上で直接分析した。同じ親酵母由来にもかかわらず、いくつかの胞子クローンは異なるＩＬＶ２遺伝的構造を有した。いくつかの胞子クローンは、１００％Ｓ．セレビシエＩＬＶ２遺伝子胞子クローンのみを有すると考えられる。ほとんどの親ラガー酵母は、三または四倍体であるので（Ｗａｈｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ， ２０１４）、１００％Ｓ．セレビシエＩＬＶ２胞子クローンはおよそ１－３コピーを有し得ると仮定することができる。両方の型のＩＬＶ２、例えば５０／５０を有する胞子クローンについては、胞子クローンにおける各型の１コピー、または、親酵母における２＋２が仮定されるであろう。６７／３３に近い比を有する株は、Ｓ．セレビシエの１コピーおよびＳ．ユーバヤヌスＩＬＶ２の２コピーを意味するであろう。
【0256】
１００％に近いＳ．セレビシエＩＬＶ２を有する胞子クローンにおけるコピー数のより正確な推定を可能にするために、トライアルを純粋外部Ｓ．ユーバヤヌスＤＮＡを試料に追加またはスパイクインすることにより繰り返し、スパイクイン後のＳ．セレビシエ／Ｓ．ユーバヤヌス分布を得た。スパイクイン後にＳ．ユーバヤヌスにむかって強くシフトした比ＳｃＩＬＶ２／ＳｅＩＬＶ２はＳ．セレビシエＩＬＶ２の低コピーを示し、比がＳ．ユーバヤヌスＤＮＡに向かってほとんどシフトせず、依然として、高Ｓ．セレビシエＩＬＶ２に独占されている場合、元の胞子クローンは多くのＳ．セレビシエＩＬＶ２コピーを有することが示されるであろう。
【0257】
スパイキングを、５０ｎｇ／マイクロリットルＤＮＡの各試料を同じ濃度５０ｎｇ／マイクロリットルのＳ．ユーバヤヌスＤＮＡと、５０／５０比（１０マイクロリットル試料＋１０マイクロリットルＳ．ユーバヤヌスＤＮＡ）でブレンドするように実施した。
【0258】
ドロップレットＱＰＣＲ推定法は、存在する総ＩＬＶ２コピーを定量的に反映するが、特別なＳＮＰまたはフレームシフト突然変異の存在のために、いくらかの不活化ＩＬＶ２アレルが存在するかどうかを明らかにすることはできない。そのような突然変異は、最初にその後のゲノムＤＮＡシークエンシングにより、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングまたは次世代シークエンシングにより検出することができる。
【0259】
綿状沈殿のためのスクリーニング
酵母胞子クローンの綿状沈殿能力を評価するために、それらを最初に、通常の麦汁中、室温で数日間増殖させた。各株について２ｍｌの培養物を２ｍｌ反応管に移し、完全にボルテックスし、細胞を１０分間沈降させた。カルシウム依存性綿状沈殿を決定するために、２ｍｌの前に言及した培養物から細胞を収集し、２回５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、その後、２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭコハク酸および１００ｍＭ ＫＯＨ、カルシウムなし（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ １９９６）に再懸濁させた。ｐＨをｐＨ４．０に調整し、これは麦汁培養物の最終ｐＨ値に類似する。細胞懸濁液を再び完全にボルテックスし、細胞を５分間沈降させた。結果を写真で文書化した。
酵母胞子クローンの綿状沈殿能力を評価するために、それらを最初に、通常の麦汁中、室温で数日間増殖させた。各株について２ｍｌの培養物を２ｍｌ反応管に移し、完全にボルテックスし、細胞を１０分間沈降させた。カルシウム依存性綿状沈殿を決定するために、２ｍｌの前に言及した培養物から細胞を収集し、２回５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、その後、２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭコハク酸および１００ｍＭ ＫＯＨ、カルシウムなし（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ １９９６）に再懸濁させた。ｐＨをｐＨ４．０に調整し、これは麦汁培養物の最終ｐＨ値に類似する。細胞懸濁液を再び完全にボルテックスし、細胞を５分間沈降させた。結果を写真で文書化した。
【0260】
磁気撹拌を有するシリンダーを使用した、麦汁発酵における胞子クローンの総ジアセチルの測定
胞子クローンおよび対照酵母を、３日間、２ｍｌ液体ＹＰＤ中、Ｓｔｕａｒｔ ＳＢ２回転ユニット（ｗｗｗ．ｓｔｕａｒｔ－ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．ｃｏｍ）上で前増殖させた。１６プラートの２５ｍｌの低温殺菌標準ピルスナー麦汁のバッフルなしの振盪フラスコに、２ｍｌの前培養物を接種させ、室温で、振盪テーブル上、５日間の中間振盪を用いて増殖させ、高密度固定相培養物に到達した。
胞子クローンおよび対照酵母を、３日間、２ｍｌ液体ＹＰＤ中、Ｓｔｕａｒｔ ＳＢ２回転ユニット（ｗｗｗ．ｓｔｕａｒｔ－ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．ｃｏｍ）上で前増殖させた。１６プラートの２５ｍｌの低温殺菌標準ピルスナー麦汁のバッフルなしの振盪フラスコに、２ｍｌの前培養物を接種させ、室温で、振盪テーブル上、５日間の中間振盪を用いて増殖させ、高密度固定相培養物に到達した。
【0261】
ビール発酵を前に記載されるようにガラスシリンダー内で実施した（Ｇｕｉｔｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。発酵を、２００ｍＬのピルスナー麦汁を含み、逆ガラスビーカー（Ｄｕｒａｎ）を用いてシリンダー上面で密閉され、二酸化炭素の漏出、および分析のための容易なサンプリングアクセスが可能にされた２５０ｍＬトールガラスメスシリンダー（３３１×３９×３９ｍｍ；Ｄｕｒａｎ）内で実施した。発酵を、マグネチックバーを撹拌Ｖａｒｉｏｍａｇ撹拌プラットフォーム上で、冷蔵庫（タイプＴＳ ６０６－Ｇ／４－ｉのインキュベーターキャビネット）内１６℃で使用して１５０ｒｐｍで連続撹拌しながら実施した。酵母細胞数をセロメータ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｘｃｅｌｏｍ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を用いて推定し、１５００万細胞／ｍｌ麦汁の率で播種（ピッチ）し、発酵成績を、代謝ＣＯ２放出に起因する重量減少を測定することによりモニタした。１０ｍｌ試料を発酵中、第２、３および４日に、ジアセチル分析のために収集した。試料を１９００ｇで１０分間遠心分離し、上清をフリーザー内－２０℃で、さらなる使用まで保存した。発酵は、発酵シリンダーのさらなる重量減少が測定できなかった時に、完了したと考えた。我々は総ジアセチルを、ガスクロマトグラフィーにより、欧州醸造委員会方法ＥＢＣ９．２４．２に従い測定し、それは総ジアセチルを決定するための、試料の６０℃で９０分間のインキュベーション期間を含み、前駆体アセト乳酸および遊離ジアセチルの総合計を反映する。
【0262】
酵母株
Ｈｙｂｒｉｄ酵母７サッカロマイセス・パストリアヌスはラガー生産株であり、高綿状沈殿を有し、発酵の終わりに、追加の冷却なしで酵母の収集が可能である。Ｈｙｂｒｉｄ酵母７が現発明の酵母に対する基準として使用される。
Ｈｙｂｒｉｄ酵母７サッカロマイセス・パストリアヌスはラガー生産株であり、高綿状沈殿を有し、発酵の終わりに、追加の冷却なしで酵母の収集が可能である。Ｈｙｂｒｉｄ酵母７が現発明の酵母に対する基準として使用される。
【0263】
ＺＤＡ１は発明の酵母である。
【0264】
ＺＤＡ２は発明の酵母である。
【0265】
ＺＤＡ３は発明の酵母である。
【0266】
Ｗ－３４／７８サッカロマイセス・パストリアヌスは、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ Ｈｅｆｅｂａｎｋ（ｉｎｆｏ＠ｈｅｆｅｂａｎｋ－ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ．ｄｅ）、ドイツからの市販のラガー酵母株である。この酵母はかなり効率的にジアセチルを低減させることが知られており、高綿状沈殿を示すが、上記麦汁中で発酵された場合、依然としてＨｙｂｒｉｄ酵母７株よりも著しく少ない。それが現発明の酵母に対する基準として使用される。Ｗ－３４／７８はまた、本明細書ではＷＳ３４／７８とも呼ばれる。
【0267】
実施例１－１６および１８℃での酵母株ＺＤＡ１および比較株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いた５０Ｌトライアル
対照酵母株に対する、新規ハイブリッド酵母株の発酵中のジアセチルレベルの違いを試験するために、５０Ｌビールを、材料および方法セクションで記載される、１５～１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を最終濃度０．３０ｍｇ／Ｌまで添加した。麦汁に、１２－１５００万生酵母細胞／ｍＬの麦汁を接種した。発酵を１６℃または１８℃で実施した。一般に、ラガーは１２℃～１６℃で発酵される。酵母が１８℃に耐えるならば、これは、発酵プロセスを加速するように作用することができる。試料を第０日、および、下記表で示される発酵中の様々な時点で得た。結果を下記表３および４に示し、図１Ａ～Ｃでプロットする。
対照酵母株に対する、新規ハイブリッド酵母株の発酵中のジアセチルレベルの違いを試験するために、５０Ｌビールを、材料および方法セクションで記載される、１５～１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を最終濃度０．３０ｍｇ／Ｌまで添加した。麦汁に、１２－１５００万生酵母細胞／ｍＬの麦汁を接種した。発酵を１６℃または１８℃で実施した。一般に、ラガーは１２℃～１６℃で発酵される。酵母が１８℃に耐えるならば、これは、発酵プロセスを加速するように作用することができる。試料を第０日、および、下記表で示される発酵中の様々な時点で得た。結果を下記表３および４に示し、図１Ａ～Ｃでプロットする。
【表5】
【表6】
【0268】
ビールは、ジアセチルレベルが５０ｐｐｂ未満であり、プラートが安定である（全ての発酵性糖が利用されている）場合、スペック内にあると言われる。対照酵母と比べて少なくとも同様の量のアルコールを生成しながら、スペック内にあるビールを可能な限り短い時間で得ることが利点である。
【0269】
１８℃でのジアセチルレベル
表３ならびに図１Ｂおよび１Ｃから見てわかるように、１８℃で発酵されると、酵母株ＺＤＡ１は、３日以内に発酵麦汁（グリーン・ビール）を生成することができ、ジアセチルレベルは５０ｐｐｂに近く、同時に、麦汁中に存在する全ての発酵性糖が利用された（これは、°プラートの降下が２４時間にわたり０．５０未満となったことにより明らかである）。対照的に、対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７は非常に高いジアセチルレベルで開始し（図１Ｂ）、ＺＤＡ１株が第３日に有したものと同様のレベルのジアセチルに到達するのに４日を必要とした。
表３ならびに図１Ｂおよび１Ｃから見てわかるように、１８℃で発酵されると、酵母株ＺＤＡ１は、３日以内に発酵麦汁（グリーン・ビール）を生成することができ、ジアセチルレベルは５０ｐｐｂに近く、同時に、麦汁中に存在する全ての発酵性糖が利用された（これは、°プラートの降下が２４時間にわたり０．５０未満となったことにより明らかである）。対照的に、対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７は非常に高いジアセチルレベルで開始し（図１Ｂ）、ＺＤＡ１株が第３日に有したものと同様のレベルのジアセチルに到達するのに４日を必要とした。
【0270】
外観エキス含量が先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点は、両方の株について第４日であると考えられた。第４日にＨｙｂｒｉｄ酵母７を用いて得られたグリーン・ビールはおよそ５６ｐｐｂのジアセチルを含み、一方、ＺＤＡ１を用いて得られたグリーン・ビールは２６ｐｐｂのみを含んだ。
【0271】
発酵を１６℃で実施した場合（表４および図１Ａ）、外観エキス含量が先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点は両方の株について第５日であった。その時、ＺＤＡ１株は、所望の５０ｐｐｍジアセチルレベルに到達したが、一方、対照酵母Ｈｙｂｒｉｄ酵母７は、５０ｐｐｍ未満のジアセチルレベルに到達するにはさらに２日発酵しなければならなかった。
【0272】
１６℃または１８℃での発酵後のイソブタノール対プロパノールおよびＳＯ２レベル
１６℃１８℃
ジアセチルおよびプラートに加えて、プロパノールおよびイソブタノールレベルを５０Ｌトライアルビールから製造した最終ビールにおいて測定した。最終ビールを５．０体積％のアルコール含量に、ＣＯ２を５．１ｇ／Ｌに調整し、３３ｃｌ緑色瓶に瓶詰めした。理論に縛られないが、プロパノールおよびイソブタノールは、分岐鎖アミノ酸経路内の制限された経路流、特に酵母の低ＩＬＶ２活性の指標であると考えられ、そのため、酵母株が低ジアセチル生産者である可能性を有するかどうかを評価する早道となる。高いイソブタノール対プロパノール比は、低ジアセチル生産酵母を示す。結果を下記表５に示す：
１６℃１８℃
ジアセチルおよびプラートに加えて、プロパノールおよびイソブタノールレベルを５０Ｌトライアルビールから製造した最終ビールにおいて測定した。最終ビールを５．０体積％のアルコール含量に、ＣＯ２を５．１ｇ／Ｌに調整し、３３ｃｌ緑色瓶に瓶詰めした。理論に縛られないが、プロパノールおよびイソブタノールは、分岐鎖アミノ酸経路内の制限された経路流、特に酵母の低ＩＬＶ２活性の指標であると考えられ、そのため、酵母株が低ジアセチル生産者である可能性を有するかどうかを評価する早道となる。高いイソブタノール対プロパノール比は、低ジアセチル生産酵母を示す。結果を下記表５に示す：
【表7】
【0273】
表５から見てわかるように、１６℃および１８℃の両方で、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１を用いた発酵から得られたグリーン・ビールは、対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いて得られたグリーン・ビールと比較して、より高いレベルのプロパノールを示した。ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１とインキュベートした麦汁はまた、Ｈｙｂｒｉｄ酵母７と比較して、より低いレベルのイソブタノールを有し、イソブタノール対プロパノール比において少なくとも６．８倍差が得られた。
【0274】
酵母株ＺＤＡ１を用いて得られたグリーン・ビールにおけるＳＯ２レベルは、対照株由来のグリーン・ビールより高かったことも観察された。これにより、最終ビールの保存の観点から利点が得られ得る。
【0275】
図３は、本発明によるＺＤＡ２酵母株を用いて生成させた「対照ボトル８９－８４３９３ＺＤＡ２」ビールと比較した、市販ビールのプロパノール対イソブタノール比を示す。「対照ボトル８９－８４３９３ＺＤＡ２」を５０Ｌトライアルで生成し、５％まで脱醸造させた（ｄｅｂｒｅｗｅｄ）。市販ビールは全てより低いプロパノール対イソブタノール比を有した。
【0276】
実施例２－１６℃での酵母株ＺＤＡ２およびＺＤＡ３を用いた５０Ｌトライアル
有利なジアセチルプロファイルを有する２つのさらなる酵母ハイブリッド株を同定し、実施例１のＺＤＡ１株と比較した。５０Ｌビールを材料および方法セクションで記載される、１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を０．３０ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。麦汁に、１４００万生酵母細胞／ｍｌ麦汁を接種した。接種のための酵母を５０Ｌ第一発酵から得、酵母細胞を発酵の終わりに収集し、第二５０Ｌ発酵トライアルに再ピッチするために使用した。これは大規模ビール生産が実施される方法に類似する。発酵を１６℃で実施した。試料を第０日に、および発酵中、下記表で示されるように得た。結果を下記表６に示す。
有利なジアセチルプロファイルを有する２つのさらなる酵母ハイブリッド株を同定し、実施例１のＺＤＡ１株と比較した。５０Ｌビールを材料および方法セクションで記載される、１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を０．３０ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。麦汁に、１４００万生酵母細胞／ｍｌ麦汁を接種した。接種のための酵母を５０Ｌ第一発酵から得、酵母細胞を発酵の終わりに収集し、第二５０Ｌ発酵トライアルに再ピッチするために使用した。これは大規模ビール生産が実施される方法に類似する。発酵を１６℃で実施した。試料を第０日に、および発酵中、下記表で示されるように得た。結果を下記表６に示す。
【表8】
【0277】
表６に示されるように、３つの候補全て（ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＺＤＡ３）が、第４日に５０ｐｐｂ未満のジアセチルレベルを示し、これは、外観エキス含量が、プラトーに到達した時間に対応する。さらに、ＺＤＡ３は、すでに第３日に５０ｐｐｂ未満のジアセチルレベルを有した。
【0278】
実施例３－味覚結果
実施例２で得られた発酵麦汁を、アルコール含量を５体積％に、ＣＯ２を５．１ｇ／Ｌに調整することにより、さらに処理し最終ビールとし、標準Ｄａｎｉｓｈ緑色３３ｃｌ瓶に瓶詰めした。ビールを１０テイスターからなる専門家ビール味覚パネルにより評価した。各味覚パネルメンバーは広く訓練され、特に各メンバーは、エステル、高級アルコール、硫黄成分の味覚特性およびビールのボディを評価するのに熟達していた。各味覚パネルメンバーは異なる香味ノートを評価した。特に、全体の味覚を１～９のスケールで評価し、下記表７で「主結果」として提供した。
実施例２で得られた発酵麦汁を、アルコール含量を５体積％に、ＣＯ２を５．１ｇ／Ｌに調整することにより、さらに処理し最終ビールとし、標準Ｄａｎｉｓｈ緑色３３ｃｌ瓶に瓶詰めした。ビールを１０テイスターからなる専門家ビール味覚パネルにより評価した。各味覚パネルメンバーは広く訓練され、特に各メンバーは、エステル、高級アルコール、硫黄成分の味覚特性およびビールのボディを評価するのに熟達していた。各味覚パネルメンバーは異なる香味ノートを評価した。特に、全体の味覚を１～９のスケールで評価し、下記表７で「主結果」として提供した。
【表9】
【0279】
表７に示されるように、酵母株全てにより生成されたビールの試料は少なくとも５．７（満足）と評価された。
【0280】
実施例４－１６℃での、酵母株ＺＤＡ１および比較株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いた１０ＨＬビールトライアル
この実施例の目的は、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１が、実施例１において５０Ｌスケールで観察されたのと同じ有利なジアセチルプロファイルを示すかどうかを調査することであった。１０ＨＬビールを材料および方法セクションで記載される、およそ１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９５のｐＨに調整し、亜鉛を０．８ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。麦汁に、少なくとも１５００万生酵母細胞／ｍＬ麦汁のハイブリッド酵母株ＺＤＡ１または対照ラガー酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を接種し、続いて、およそ１６℃で発酵させた。接種のための酵母を実施例２で記載される第一醸造物から得た。試料を第０日、および、下記結果表８で示される日に得た。結果を表８に示し、図２ＡおよびＢに図示する。
この実施例の目的は、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１が、実施例１において５０Ｌスケールで観察されたのと同じ有利なジアセチルプロファイルを示すかどうかを調査することであった。１０ＨＬビールを材料および方法セクションで記載される、およそ１６の°プラートを有する麦汁から調製した。発酵前に、麦汁を４．９５のｐＨに調整し、亜鉛を０．８ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。麦汁に、少なくとも１５００万生酵母細胞／ｍＬ麦汁のハイブリッド酵母株ＺＤＡ１または対照ラガー酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を接種し、続いて、およそ１６℃で発酵させた。接種のための酵母を実施例２で記載される第一醸造物から得た。試料を第０日、および、下記結果表８で示される日に得た。結果を表８に示し、図２ＡおよびＢに図示する。
【表10】
【0281】
酵母株ＺＤＡ１は、かなり低い初期レベルのジアセチルを生成し、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ１を用いて得られたグリーン・ビールは、第４日および第５日にジアセチルの味覚閾値（５０ｐｐｂ）に近くに達し、２８ｐｐｂまで下降した。しかしながら、対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いて得られたグリーン・ビールは、第７日に始めてこの閾値に達した（図２Ａ）。図２Ｂにより、酵母ハイブリッドＺＤＡ１を用いて得られたグリーン・ビール中の総ジアセチルレベルは、発酵性糖がほぼ完全に発酵したのとおよそ同時に、すなわち第４日にほぼ５０ｐｐｂになることが示される。
【0282】
実施例５－味覚結果
実施例４で得られた発酵麦汁をさらに処理し、アルコール含量を４．６体積％に、ＣＯ２を５．４ｇ／Ｌに調整することにより最終ビールとし、３３ｃｌ琥珀瓶に瓶詰めした。ビールを、１０テイスターからなる、デンマークおよびフランスにおける専門家ビール味覚パネルボットにより評価した。各味覚パネルメンバーは広く訓練され、特に各メンバーは、エステル、高級アルコール、硫黄成分の味覚特性およびビールのボディを評価するのに熟達していた。各味覚パネルメンバーは異なる香味ノートを評価した。特に、全体の味覚を１～９のスケールで評価し、「主結果」として下記表９で提供した。
実施例４で得られた発酵麦汁をさらに処理し、アルコール含量を４．６体積％に、ＣＯ２を５．４ｇ／Ｌに調整することにより最終ビールとし、３３ｃｌ琥珀瓶に瓶詰めした。ビールを、１０テイスターからなる、デンマークおよびフランスにおける専門家ビール味覚パネルボットにより評価した。各味覚パネルメンバーは広く訓練され、特に各メンバーは、エステル、高級アルコール、硫黄成分の味覚特性およびビールのボディを評価するのに熟達していた。各味覚パネルメンバーは異なる香味ノートを評価した。特に、全体の味覚を１～９のスケールで評価し、「主結果」として下記表９で提供した。
【表11】
【0283】
表９に示されるように、酵母株ＺＤＡ１により生成されたビールの試料を６．６（満足）に格付けしたが、これは対照株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いて生産させたビールをわずかに超える。
【0284】
実施例６－３つの対照ラガー酵母株を含む１６℃でのトライアル
この実験を、実施例２からの３つの新規酵母株を、追加の市販の酵母株、ならびに実施例１、２および４で使用される対照と比較するために実施した。４０Ｌのビールを材料および方法セクションで記載される麦汁から、５２℃での最初の保持を３０分としたという小さな変化を用いて調製した。発酵のために、°プラートを１５～１６とした。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を最終濃度０．３０ｍｇ／Ｌまで添加した。麦汁に、７５０万生酵母細胞／ｍｌのハイブリッド酵母株ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＺＤＡ３、ならびに、対照ラガー酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７、および対照ラガー酵母株Ｗ－３４／７８（これは、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ、ドイツから市販されている）を接種した。麦汁をおよそ１６℃で発酵させた。試料を第１日および下記結果表において示される日に得た。結果を表１０に示す。
この実験を、実施例２からの３つの新規酵母株を、追加の市販の酵母株、ならびに実施例１、２および４で使用される対照と比較するために実施した。４０Ｌのビールを材料および方法セクションで記載される麦汁から、５２℃での最初の保持を３０分としたという小さな変化を用いて調製した。発酵のために、°プラートを１５～１６とした。発酵前に、麦汁を４．９のｐＨに調整し、亜鉛を最終濃度０．３０ｍｇ／Ｌまで添加した。麦汁に、７５０万生酵母細胞／ｍｌのハイブリッド酵母株ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＺＤＡ３、ならびに、対照ラガー酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７、および対照ラガー酵母株Ｗ－３４／７８（これは、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ、ドイツから市販されている）を接種した。麦汁をおよそ１６℃で発酵させた。試料を第１日および下記結果表において示される日に得た。結果を表１０に示す。
【表12】
【0285】
このトライアルでは、３つの低ジアセチル株全て（ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＺＤＡ３）が第５日に５０ｐｐｂ未満のジアセチルレベルを示し、これは、試験した全ての酵母株について、外観エキス含量が、プラトーに到達した時間に対応し、一方、同じ日に、対照株のいずれも１１０ｐｐｂ未満のジアセチルレベルを示さなかった。外観エキス含量が先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点は、これらのトライアルの全てについて第６日であると考えられる。第６日に、低ジアセチル株全て（ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＺＤＡ３）が４５ｐｐｂ未満のジアセチルレベル（それぞれ、２４ｐｐｂ、２５ｐｐｂおよび１８ｐｐｂ）を有し、一方対照株（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７、Ｗ－３４／７０およびＷ－３４／７８）はより高いジアセチルレベルを有した（それぞれ、１１５ｐｐｂ、６２ｐｐｂおよび６２ｐｐｂ）。
【0286】
これらの結果は、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ酵母はＨｙｂｒｉｄ酵母７株および発明の株より綿状沈殿しないことを考慮すると、かなり注目に値する。発酵の終わりでの液体中の細胞数（酵母ペレット上方）は綿状沈殿の良好な尺度となる。これらのデータが上記表１０に液体中の細胞として示される（値が低いほど酵母はより多くの綿状となる）。高綿状沈殿は、酵母が、ビール生産のために次の麦汁に接種するために、生産タンクから収集されることになっている場合利点となる。酵母の綿状沈殿が低い場合、このプロセスはグリーン・ビールの最大２４時間までの冷却を必要とする。他方、高綿状沈殿により、発酵中、酵母と麦汁の間の接触が少なくなる可能性があり、それは、酵母がジアセチルを消費できる速度を低減させ、発酵時間を長くする可能性がある。
【0287】
そのため、本明細書で記載される実施例は、ジアセチルを５０ｐｐｂ未満まで、発酵性糖が消費されたのとおよそ同時に（またはさらには、それより前に）低減させることができ、同時に、１６℃でのそれらの高綿状沈殿のために、次のビール生産のために酵母を収集するのにグリーン・ビールの追加の冷却を必要としない、酵母株を提供する。
【0288】
さらに、低ジアセチル酵母株は容易に、イソブタノール対プロパノール比により同定することができることがわかり、というのも、それらは全て、６超であり、一方対照株は全て、１．４未満であるからである。
【0289】
実施例７－酵母株の遺伝子型判定
ゲノムの構築
５つのゲノムからの４つ（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７、ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＷ３４－７８）について、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰａｃｂｉｏプラットフォームからのＮＧＳデータを使用するタンデム分析アプローチを開発した。品質管理、濾過および構築を社内デザインによるパイプラインに従い実施した。ゲノムは全て、Ｐａｃｂｉｏプラットフォームにより生成されたデータを使用するＣａｎｕ１．９ソフトウェアを使用してデノボ構築した。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにより生成されたリードをＣａｎｕ１．９により生成されたアセンブリに対してマッピングし（Ｐｉｌｏｎ１．２２）、ドラフトアセンブリのコンセンサス正確さを改善した。ゲノムＺＤＡ３について、Ｉｌｌｕｍｉｎａデータがないために、Ｃａｎｕ１．９のみをさらなる構築改善なしで使用した。
ゲノムの構築
５つのゲノムからの４つ（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７、ＺＤＡ１、ＺＤＡ２およびＷ３４－７８）について、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰａｃｂｉｏプラットフォームからのＮＧＳデータを使用するタンデム分析アプローチを開発した。品質管理、濾過および構築を社内デザインによるパイプラインに従い実施した。ゲノムは全て、Ｐａｃｂｉｏプラットフォームにより生成されたデータを使用するＣａｎｕ１．９ソフトウェアを使用してデノボ構築した。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにより生成されたリードをＣａｎｕ１．９により生成されたアセンブリに対してマッピングし（Ｐｉｌｏｎ１．２２）、ドラフトアセンブリのコンセンサス正確さを改善した。ゲノムＺＤＡ３について、Ｉｌｌｕｍｉｎａデータがないために、Ｃａｎｕ１．９のみをさらなる構築改善なしで使用した。
【0290】
得られた構築ゲノムをＢＬＡＳＴクエリーにおいて使用した。
【0291】
ヒットのＢｌａｓｔおよび配列比較
遺伝子（ＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２）の各々について、Ｓ．セレビシエ遺伝子の対応するアミノ酸配列を、ＴＢＬＡＳｔＮアルゴリズムを使用して、５つのゲノムの各々に対する問い合わせ配列として使用した。最後に、ヒットを、問い合わせ配列の少なくとも６５－８０％配列同一性を有する、またはその長さの少なくとも４０％を占めるものを保持することにより、フィルタにかけた。ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の間のＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２のアミノ酸配列アライメントを、図４－９に示す。ＢＬＡＳＴ分析はＳ．ユーバヤヌス対応遺伝子に対し繰り返さなかった。というのも、フィルタリングの最終工程で、ヒットは６５％という低い配列同一性を有することができたからであり、よって、このセットアップで、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスの両方由来のヒットは全て、それらの間の高い類似性のために、捕らえられているだろう。ＭＵＳＣＬＥ（３．８）多重配列アライメントツールを使用してＢＬＡＳＴ分析により同定されたヒットを全て整列させた。
遺伝子（ＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２）の各々について、Ｓ．セレビシエ遺伝子の対応するアミノ酸配列を、ＴＢＬＡＳｔＮアルゴリズムを使用して、５つのゲノムの各々に対する問い合わせ配列として使用した。最後に、ヒットを、問い合わせ配列の少なくとも６５－８０％配列同一性を有する、またはその長さの少なくとも４０％を占めるものを保持することにより、フィルタにかけた。ＷＳ３４－７８、ｃｅｒ（サッカロマイセス・セレビシエ）、ｅｕｂ（サッカロマイセス・ユーバヤヌス）、Ｈｙｂｒｉｄ７（Ｈｙｂｒｉｄ酵母７）、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の間のＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２のアミノ酸配列アライメントを、図４－９に示す。ＢＬＡＳＴ分析はＳ．ユーバヤヌス対応遺伝子に対し繰り返さなかった。というのも、フィルタリングの最終工程で、ヒットは６５％という低い配列同一性を有することができたからであり、よって、このセットアップで、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスの両方由来のヒットは全て、それらの間の高い類似性のために、捕らえられているだろう。ＭＵＳＣＬＥ（３．８）多重配列アライメントツールを使用してＢＬＡＳＴ分析により同定されたヒットを全て整列させた。
【0292】
倍数性同定分析
倍数性同定分析を、ｓｐｐＩＤｅｒアルゴリズムの改良バージョンを展開することにより実施した。５つのゲノムのうち４つのＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームの短いリードを、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスの組み合わせ基準ゲノムに対してマッピングし、マッピング品質（ＭＱ）＞３を有するリードを保持し、組み合わせ基準ゲノムオーダーに分類し；次いで、組み合わせ基準ゲノムにわたるカバー度を計算した。次いで、カスタムスクリプトは各種の平均カバー度を計算し、組み合わせ基準ゲノムはウィンドウに分割された。
倍数性同定分析を、ｓｐｐＩＤｅｒアルゴリズムの改良バージョンを展開することにより実施した。５つのゲノムのうち４つのＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームの短いリードを、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスの組み合わせ基準ゲノムに対してマッピングし、マッピング品質（ＭＱ）＞３を有するリードを保持し、組み合わせ基準ゲノムオーダーに分類し；次いで、組み合わせ基準ゲノムにわたるカバー度を計算した。次いで、カスタムスクリプトは各種の平均カバー度を計算し、組み合わせ基準ゲノムはウィンドウに分割された。
【0293】
ＢＬＡＳＴ分析の技術欠点
株の表現型についてのゲノム上の差の効果を研究するためのＢＬＡＳＴの使用は、様々な欠点に苦しみ、最も重要なのは下記である：
ｉ）遺伝子および／または染色体レベルでの重複を評価することができないこと
ｉｉ）アセンブリにおけるエラーまたはアンビギュイティへの感受性
株の表現型についてのゲノム上の差の効果を研究するためのＢＬＡＳＴの使用は、様々な欠点に苦しみ、最も重要なのは下記である：
ｉ）遺伝子および／または染色体レベルでの重複を評価することができないこと
ｉｉ）アセンブリにおけるエラーまたはアンビギュイティへの感受性
【0294】
全てのゲノムアセンブリ方法が、倍数性の存在下、意味あるアセンブリの作製に問題を有している。これは、異なる染色体コピー由来の複数の領域が、単一足場に崩壊するという結果になる。原則として、状況は、遺伝子重複イベントが起こる場合、それほどひどくない。というのも、それらは、特定のアセンブリ方法および適正な実験セットアップを使用して同定されるからである。しかしながら、依然として、遺伝子重複は、とりわけ、異なるコピーにおいてゲノム上の差が全く存在しない、または制限されて存在する場合、アセンブリ段階で適正に検出できない可能性がかなり高い。第２の点に関しては、ＢＬＡＳＴは原則として、異なるバリアント、例えば機能性ＳＮＰおよび非機能性ＯＲＦに関するより詳細な情報を同定することができるであろう。しかしながら、アセンブリにおけるエラーまたはアンビギュイティは、多数の誤った要求－例えば偽ＳＮＰおよび不明瞭な遺伝子アーキテクチャを生成させる可能性がある。
【0295】
そのため、我々は、バリアントの単純ＢＬＡＳＴ同定と並行して、染色体倍数性、および遺伝子重複または欠失に起因する、シークエンシングデータにおける各ゲノム領域の観察された倍数性の推定を実施することを決定した。
【0296】
全体で、ハプロタイプ分解（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ）デノボアセンブリの生成は、今日、大きな課題のままである。ＮＧＳ技術（ＰａｃｂｉｏおよびＩｌｌｕｍｉｎａ）は大量のデータを生成させるが、エラーと真の配列バリアントの間の区別は依然として技術的に困難である。その上に、試料が倍数体化されている場合、真のバリアントを異なるゲノムコピーに割り当てる必要がある。これらの分析におけるアセンブリはハプロタイプ非対応アルゴリズムを使用して実施されており、よって、最終的に得られたアセンブリは、崩壊したハプロタイプゲノムを表した
【0297】
結果
結果を下記表１１に示す。
結果を下記表１１に示す。
【表13】
【0298】
括弧内の数は染色体のモード倍数性である。括弧のない数字は、その染色体上での遺伝子座決定の倍数性である。
【0299】
実施例８－酵母株ＺＤＡ２および比較株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いた商業規模醸造トライアル
この実施例の目的は、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ２が、商業規模醸造（およそ１８００ＨＬ）で適用された場合、前の実施例で観察されたのと同じ有利なジアセチルプロファイルを示すかどうかを調査することであり、ここで、酵母は収集され、再ピッチされる。
この実施例の目的は、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ２が、商業規模醸造（およそ１８００ＨＬ）で適用された場合、前の実施例で観察されたのと同じ有利なジアセチルプロファイルを示すかどうかを調査することであり、ここで、酵母は収集され、再ピッチされる。
【0300】
１８００ＨＬビールを、従来の注入マッシングにより得られたモルトおよびアジャンクトを含みおよそ１６の°プラートを有する麦汁から、調製した。発酵前に麦汁を４．９－５．０のｐＨに調整した。麦汁をＺＤＡ２および対照ラガー酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７の両方の世代８を用いて再ピッチし、およそ１６℃で発酵させた。試料を第０日および下記結果表１２で示され、図１０で示される日に取得した。
【表14】
【0301】
酵母株ＺＤＡ２は発酵を通してかなり低レベルのジアセチルを生成し、ハイブリッド酵母株ＺＤＡ２を用いて得られたグリーン・ビールは第６日にすでにジアセチル（５０ｐｐｂ）の味覚閾値に到達した。その時、プラートは最後の２４時間０．５超減少しなかった。対照酵母株Ｈｙｂｒｉｄ酵母７を用いて得られたグリーン・ビールは、第７日、プラートが２４時間にわたり０．５超減少しなかった後２日にジアセチルについての味覚閾値に到達しなかった（図１０）。その結果として、グリーン・ビールについての仕様は、ジアセチルおよびプラートの観点から、ＺＤＡ２酵母を使用すると基準酵母Ｈｙｂｒｉｄ酵母７と比較して、少なくとも２日早く到達した。
【0302】
興味深いことに、ＺＤＡ２酵母は真性発酵度合いに到達し（ＲＤＦ）、これはＨｙｂｒｉｄ酵母７より２％低かったが、一方、アルコールパーセンテージは２つのグリーンビールにおいてほとんど同様である。その結果として、ＺＤＡ酵母は同じ量のアルコールをより低い真性発酵度合いで生成することができ、これにより、より良好な食感を有するビールが得られる。ＺＤＡ２酵母についての、同じアルコールレベルで１．５－２．５％低いＲＤＦのこの傾向は、この実施例における第８世代に先行する発酵世代の全てにわたって観察された（表１３を参照されたい）。
【表15】
【0303】
実施例９－ハイブリッドＮａｎｏｐｏｒｅ－関連遺伝子のコピー数を計算するための醸造株のＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングおよびバイオインフォマティクス評価
株を、前に記載されるようにＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングについては、超高分子量ＤＮＡをＤｅｎｉｓらにより概説される方法を使用して調製した。
株を、前に記載されるようにＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングについては、超高分子量ＤＮＡをＤｅｎｉｓらにより概説される方法を使用して調製した。
【0304】
シークエンシングのためにＨＭＷ ｇＤＮＡを調製するために、試料をＺｙｍｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒカラムを使用して処理し、その後、品質および量についてｄｅＮｏｖｉｘ ｄｓＤＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ蛍光定量アッセイを使用してチェックした。
【0305】
全ての試料を多重化し、ライブラリをＳＱＫ－ＬＳＫ１０９化学、および、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＮａｔｉｖｅ Ｂａｒｃｏｄｅ ＥｘｔｅｎｓｉｏｎパックＥＸＰ－ＮＢＤ１０４およびＥＸＰ－ＮＢＤ１１４を使用して作成した。全ての必要な清浄化工程を、ＮＧＳのためにＣｌｅａｎ ＮＡ磁気ビーズを使用して実施した。ゲノムシークエンシングがＭｉｎＩＯｎ ＦｌｏｗＣｅｌｌｓ ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６Ｄ上で４８－７２時間にわたって起きた。
【0306】
生シークエンシングデータをｂｏｎｉｔｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ／ｂｏｎｉｔｏ）を使用してベースコールし、ｇｕｐｐｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｄａｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用してデマルチプレクスした。ハイブリッド－ゲノムアセンブリをＭａｒｓｕｒｃａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｌｅｋｓｅｙｚｉｍｉｎ／ｍａｓｕｒｃａ）をＮａｎｏｐｏｒｅ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｆａｓｔｑファイルと組合わせて使用して実施し、構築したゲノムをｐｒｏｋｋａ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓｅｅｍａｎｎ／ｐｒｏｋｋａ）を用いてアノテートした。対象となる遺伝子の配列包括度およびコピー数をｑｕａｌｉｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｑｕａｌｉｍａｐ．ｃｏｎｅｓａｌａｂ．ｏｒｇ／）を用いて計算し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｖ／）を使用して可視化した。
【0307】
リードマッピングおよびＳＮＰ検出をＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｗｏｒｋ Ｂｅｎｃｈ（バージョン１１）において実施した。簡単に言うと、トリミングしたリードを「インシリコ」酵母ハイブリッドゲノム（Ｓ．ユーバヤヌス（受入番号：ＧＣＡ＿００１２９８６．２５．１）およびＳ．セレビシエ（ＧＣＡ＿０００１４６０４５．２）ゲノムの連結を含んだ）に対してマッピングした。基礎バリアント検出ツールを使用して、一塩基多型（ＳＮＰ）および挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）を検出した。ここで、ＩＬＶ２遺伝子の機能コピー数は、ＺＤＡ酵母内の単一アレル上に存在する診断ＳＮＰに基づき推定することができるであろう。
【0308】
Ｓ．セレビシエＩＬＶ２遺伝子では、Ｃ’フレームシフトが存在し、これは、結果として生じるタンパク質（Ｌｅｕ５７５ｆｓ）を、このコドン内のＴヌクレオチド挿入のために、不活性化する。この度数でマッピングしたＩｌｌｕｍｉｎａリードの％は大体３３％であり、３つのＩＬＶ２ｓｃコピーのうちの１つが不活化されたことが示唆された。さらに、ユーバヤヌスＩＬＶ２アレルでは、Ｔヌクレオチド欠失がトランケーションの不活性化という結果になるフレームシフトという結果になることが観察された（Ｌｅｕ３０４ｆｓ）。ＩＬＶ２セレビシエ遺伝子のコピー数（ＣＮ）がわかると、前に記載されたリードマッピングに基づいて、他の遺伝子のコピー数の計算が可能になった。ＷＳ３４／７８ ＣＮの推定もまた、ＩＬＶ２コピー数は、高い類似性の株（ＷＳ３４／７０）は、等しいＳ．セレビシエおよびＳ．ユーバヤヌスゲノム含量を有する四倍体酵母であるという前の証拠に基づくというリードマッピングベースの推定に基づいた（Ｗａｌｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）。さらに、実施例１０では、ＩＬＶ２ユーバヤヌスアレルを除去すると、ＷＳ３４／７８は実際に、ＩＬＶ２ユーバヤヌス（ｅｕｙｂａｎｕｓ）アレルの２つのコピーを有したことが観察された（合計４のＩＬＶ２アレル、セレビシエアレルを含む）。これらの結果を表１４にまとめて示す。
【表16】
【0309】
基準ＷＳ３４７８株はＩＬＶ２遺伝子の４つの機能コピーを有し、一方、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２は各々、この遺伝子の２つの機能コピーのみを有する。加えて、ＷＳ３４７８は、ＩＬＶ３の４つの機能コピーおよびＩＬＶ５の３つの機能コピーを有し、一方、この数字は、それぞれ、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２株については、６および５となる。
【0310】
実施例１０－モデルブルーワー酵母Ｗ－３４／７８における遺伝子コピー数適合
この実験の全体的な目的は、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の遺伝子型を反映するように、モデル酵母株（サッカロマイセス・パストリアヌス亜種カールスベルゲンシス株（ＷＳ３４／７８）において関連遺伝子のコピー数を調整することであった。ＷＳ３４／７８はＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ、ドイツから市販されており、本明細書ではＷ－３４／７８とも呼ばれる。そうするために、株ＷＳ３４／７８における遺伝子は、表１５により、不活化されるか、または、加えて発現されなければならなかった。
この実験の全体的な目的は、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の遺伝子型を反映するように、モデル酵母株（サッカロマイセス・パストリアヌス亜種カールスベルゲンシス株（ＷＳ３４／７８）において関連遺伝子のコピー数を調整することであった。ＷＳ３４／７８はＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ、ドイツから市販されており、本明細書ではＷ－３４／７８とも呼ばれる。そうするために、株ＷＳ３４／７８における遺伝子は、表１５により、不活化されるか、または、加えて発現されなければならなかった。
【表17】
【0311】
不活性化を、対象となる遺伝子（すなわちＩＬＶ２）のコード配列を標的にする抵抗性付与抗生物質－カセットの助けにより実施した。ここで、コードＤＮＡ配列（ｃｄｓ）を、相同組換えを介して、遺伝子のＮ末端領域の９９ｂｐのみ、およびＣ末端領域の１０７ｂｐが残るやり方でループにした。遺伝子（すなわちＩＬＶ３およびＩＬＶ５）の過剰発現を真のゲノム前後関係を無傷のままとする方法で実施した、すなわち、ｃｄｓの大体上流１ｋｂｐ、ｃｄｓ、およびｃｄｓの下流０，５ｋｂｐを含むカセットをクローニングした。よって、カセットは天然プロモーターおよびターミネーター配列を含み、追加の遺伝子コピーの発現はおそらく自然制御下にある。さらに、酵母単一コピープラスミドを、コピー数が制御下にあるように使用した。
【0312】
ＷＳ３４／７８細胞のトランスフォーメーション
サッカロマイセス・パストリアヌス亜種カールスベルゲンシス株ＷＳ３４／７８の細胞を、Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｅｌ （ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００７．１７）により記載される方法に従いＤＮＡ取込みについてコンピテントにした。ルーチン的に、細胞を１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ－アンプリコンで形質転換させた。熱ショック処理の期間を、温度を４２℃で維持しながら、１５分に低減した。
サッカロマイセス・パストリアヌス亜種カールスベルゲンシス株ＷＳ３４／７８の細胞を、Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｅｌ （ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００７．１７）により記載される方法に従いＤＮＡ取込みについてコンピテントにした。ルーチン的に、細胞を１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ－アンプリコンで形質転換させた。熱ショック処理の期間を、温度を４２℃で維持しながら、１５分に低減した。
【0313】
発現カセットの生成
実施例９からの株ＷＳ３４／７８のＤＮＡ－配列情報に基づき、発現カセットを、ｃｄｓの上流大体１０００ｂｐおよびｃｄｓの下流５００ｂｐを含み、よって天然プロモーターおよびターミネーター配列を含む天然ＷＳ３４／７８ＤＮＡ－配列のＰＣＲ－増幅により作製した。アンプリコンの正確な長さは実施例で与えられる個々のプライマー配列から推定することができる。１０００ｂｐ、または５００ｂｐのｃｄｓ－隣接領域は対象となる遺伝子の真正／自然制御を可能にするはずである。クローン化ＰＣＲ－アンプリコン（プラスミド内／染色体に組み込まれる）をＳａｎｇｅｒ－ＤＮＡシークエンシングにより、単離プラスミドＤＮＡをシークエンシング反応のための鋳型として用いて、制御した。
実施例９からの株ＷＳ３４／７８のＤＮＡ－配列情報に基づき、発現カセットを、ｃｄｓの上流大体１０００ｂｐおよびｃｄｓの下流５００ｂｐを含み、よって天然プロモーターおよびターミネーター配列を含む天然ＷＳ３４／７８ＤＮＡ－配列のＰＣＲ－増幅により作製した。アンプリコンの正確な長さは実施例で与えられる個々のプライマー配列から推定することができる。１０００ｂｐ、または５００ｂｐのｃｄｓ－隣接領域は対象となる遺伝子の真正／自然制御を可能にするはずである。クローン化ＰＣＲ－アンプリコン（プラスミド内／染色体に組み込まれる）をＳａｎｇｅｒ－ＤＮＡシークエンシングにより、単離プラスミドＤＮＡをシークエンシング反応のための鋳型として用いて、制御した。
【0314】
発現カセットの染色体組込み
第１の工程において、発現カセットを、遺伝子発現モジュールを、組込みイベントのポジティブ選択を可能にする抗生物質耐性モジュールと融合することにより構築した。カセットを、ＷＳ３４／７８の染色体との相同組換えのためのＤＮＡ－ストレッチをコードするＰＣＲ－アンプリコンに融合した。組込みのための部位はＷＳ３４／７８のＰＡＤ１座位であった。というのも、この遺伝子はこの酵母において非機能性であり、よって、この遺伝子の置換は、香味プロファイルに何の影響も有さないからである。相同組換えのために使用される隣接領域は大体５００ｂｐの長さを有した。抗生物質の存在下で増殖した酵母クローンをＰＣＲ（すなわちコロニーＰＣＲ）により分析し、カセットの挿入を確認した。陽性クローンを、発現モジュールにおける突然変異についてさらに分析した。発現モジュールを包含するアンプリコンをＳａｎｇｅｒ－ＤＮＡシークエンシングにより制御した。
第１の工程において、発現カセットを、遺伝子発現モジュールを、組込みイベントのポジティブ選択を可能にする抗生物質耐性モジュールと融合することにより構築した。カセットを、ＷＳ３４／７８の染色体との相同組換えのためのＤＮＡ－ストレッチをコードするＰＣＲ－アンプリコンに融合した。組込みのための部位はＷＳ３４／７８のＰＡＤ１座位であった。というのも、この遺伝子はこの酵母において非機能性であり、よって、この遺伝子の置換は、香味プロファイルに何の影響も有さないからである。相同組換えのために使用される隣接領域は大体５００ｂｐの長さを有した。抗生物質の存在下で増殖した酵母クローンをＰＣＲ（すなわちコロニーＰＣＲ）により分析し、カセットの挿入を確認した。陽性クローンを、発現モジュールにおける突然変異についてさらに分析した。発現モジュールを包含するアンプリコンをＳａｎｇｅｒ－ＤＮＡシークエンシングにより制御した。
【0315】
プラスミドｐＹＥＳＶＩＩＩにおけるＩＬＶ－遺伝子のクローニング
プラスミドｐＹＥＳＶＩＩＩ（ＢＲＡＩＮ；）は、大腸菌において高コピー数で複製され、複製のＣＥＮ６複製起点のために、酵母細胞において単一コピープラスミドとして維持される大腸菌－酵母シャトルベクターである。発現カセットを、マルチクローニング部位にギブソン・アセンブリを使用してルーチン的に挿入した。
プラスミドｐＹＥＳＶＩＩＩ（ＢＲＡＩＮ；）は、大腸菌において高コピー数で複製され、複製のＣＥＮ６複製起点のために、酵母細胞において単一コピープラスミドとして維持される大腸菌－酵母シャトルベクターである。発現カセットを、マルチクローニング部位にギブソン・アセンブリを使用してルーチン的に挿入した。
【0316】
同じアレルの２つのコピーが挿入されなければならなかった場合、好ましくは対象となる遺伝子（ＧＯＩ）の１つのコピーは、真正ＤＮＡ－配列を有し、一方、第２のコピーのｃｄｓは、天然プロテイン配列を未変化のままとするやり方で変化させた。これは、酵母細胞における遺伝子発現を最適化するアルゴリズムを採用する化学遺伝子合成により達成された（コドン使用最適化）。これは酵母細胞へのプラスミドトランスフォーメーションでの組換えイベントの変更を低減させるために実施された。
【0317】
プラスミドからのＩＬＶ３の遺伝子の発現のために、タンデムコンストラクトが構築される（バイシストロニック発現）。ここで、単一プロモーターが、２つのＩＬＶ３コード配列の発現を支配する（１つは天然、１つは合成ｃｄｓ）。２つのコード配列は、リボソームスキッピングを可能にする２Ａ－ペプチドリンカーにより接合され、そのため、両方のｃｄｓが天然ＩＬＶ３プロモーターの制御下で翻訳される。２Ａ－ペプチド技術は、３アミノ酸タグ（ＮＰＧ）を付加することにより第１のタンパク質のＣ末端を変化させ、一方、その後のタンパク質のＮ末端はプロリンから開始する（Ｌｉｕ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， ２０１７； ＤＯＩ： １０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０２４６０－２）。
【0318】
大腸菌をインビトロ構築プラスミドで形質転換させ、プラスミドを形質転換体から単離し、制限消化およびＤＮＡ－シークエンシングにより制御し、続いてコンピテントＷＳ３４／７８細胞のトランスフォーメーションを実施した。
【表18】
【0319】
実施例／Ｓ．パストリアヌスＷＳ３４／７８の突然変異バリアント
組換え株
株＃２の生成
ＰＣＲのための鋳型：
プラスミドｐＹＥＳ５－Ｃｅｎ６－Ｓｈ．ｂｌｅ（ｓｃ）２．０（ＢＲＡＩＮ）、Ｓｈ．ｂｌｅカセットをコードする
ｇＤＮＡＳ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
使用したプライマー：
ＣＰＡ４３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４
ＣＰＡ４４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５
ＣＰＡ４９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６
ＣＰＡ５０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７
ＣＰＡ５１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８
ＣＰＡ５２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９
ｓｈ．ｂｌｅ－カセット（フラグメント１）を、プラスミドｐＹＥＳ５－Ｃｅｎ６－Ｓｈ．ｂｌｅ（サッカロマイセス・セレビシエ（ｓｃ））２．０（ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）から、プライマーＣＰＡ４３／４４を使用して増幅させた。ホモロジーアームを、ｇＤＮＡ株＃１由来のＩＬＶ２（サッカロマイセス・ユーバヤヌス（ｓｅ））隣接領域の、アレル－特異的プライマーＣＰＡ４９／５１（５’－隣接領域；フラグメント２）およびＣＰＡ５０／５２（３’－隣接領域；フラグメント３）を用いた増幅により生成させた。ＨＲ鋳型をオーバーラップエクステンションＰＣＲの助けにより、プライマーＣＰＡ４９／５０、およびフラグメント１＋２＋３を鋳型として使用して生成させた。相同組換えによるＩＬＶ２（ｓｅ）のアレル－特異的ノックアウトをＢＲＡＩＮ専売ＮＵＣＬＥＡＳＥ技術により補助した。これにより多くの株が得られ、これはＩＬＶ２（ｓｅ）座位で単一または二重組込みを有し、アガロースゲル上で視認可能であった。ＩＬＶ２（ｓｅ）の二重欠失を有する株を下流分析のために選択した。
ＩＬＶ２（ｓｅ）ノックアウトカセットの配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０
組換え株
株＃２の生成
ＰＣＲのための鋳型：
プラスミドｐＹＥＳ５－Ｃｅｎ６－Ｓｈ．ｂｌｅ（ｓｃ）２．０（ＢＲＡＩＮ）、Ｓｈ．ｂｌｅカセットをコードする
ｇＤＮＡＳ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
使用したプライマー：
ＣＰＡ４３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４
ＣＰＡ４４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５
ＣＰＡ４９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６
ＣＰＡ５０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７
ＣＰＡ５１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８
ＣＰＡ５２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９
ｓｈ．ｂｌｅ－カセット（フラグメント１）を、プラスミドｐＹＥＳ５－Ｃｅｎ６－Ｓｈ．ｂｌｅ（サッカロマイセス・セレビシエ（ｓｃ））２．０（ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）から、プライマーＣＰＡ４３／４４を使用して増幅させた。ホモロジーアームを、ｇＤＮＡ株＃１由来のＩＬＶ２（サッカロマイセス・ユーバヤヌス（ｓｅ））隣接領域の、アレル－特異的プライマーＣＰＡ４９／５１（５’－隣接領域；フラグメント２）およびＣＰＡ５０／５２（３’－隣接領域；フラグメント３）を用いた増幅により生成させた。ＨＲ鋳型をオーバーラップエクステンションＰＣＲの助けにより、プライマーＣＰＡ４９／５０、およびフラグメント１＋２＋３を鋳型として使用して生成させた。相同組換えによるＩＬＶ２（ｓｅ）のアレル－特異的ノックアウトをＢＲＡＩＮ専売ＮＵＣＬＥＡＳＥ技術により補助した。これにより多くの株が得られ、これはＩＬＶ２（ｓｅ）座位で単一または二重組込みを有し、アガロースゲル上で視認可能であった。ＩＬＶ２（ｓｅ）の二重欠失を有する株を下流分析のために選択した。
ＩＬＶ２（ｓｅ）ノックアウトカセットの配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０
【0320】
株＃３の生成
ＰＣＲのための鋳型：
ｇＤＮＡ Ｓ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
ＮＴＣ－ＤＮＡカセット（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）；ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ
使用したプライマー：
ＣＰＡ７０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１
ＣＰＡ７１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２
ＣＰＡ９１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３
ＣＰＡ９６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４
ＣＰＡ１１１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５
ＣＰＡ１１２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６
ＣＰＡ１１３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７
ＣＰＡ１１４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８
ＣＰＡ１２８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９
ＣＰＡ１２９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０
ＩＬＶ３（ｓｅ）発現カセット（生成物１）をｇＤＮＡ株＃１から、アレル－特異的プライマーＣＰＡ７０／７１を用いて増幅させた。次いで、生成物１を、プライマーＣＰＡ７０／１２９を用いてさらに増幅させ、生成物２を得た。ＮＴＣ－発現カセット（生成物３）の増幅を、プライマーＣＰＡ９１／９６、およびＮＴＣ－ＤＮＡ－Ｓｔｒｉｎｇを鋳型として用いて実施した。生成物４を生成物３のプライマーＣＰＡ９１／１２８を用いた増幅により生成させた。生成物３および生成物４をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを介して構築し、プライマーＣＰＡ７０／９１を用いて増幅させ、フラグメント１を作製した。ホモロジーアームを、プライマーＣＰＡ１１１／１１２（５’－隣接領域；フラグメント２）およびＣＰＡ１１３／１１４（３’－隣接領域；フラグメント３）を用いて、ｇＤＮＡ株＃１由来のＰＡＤ１隣接領域の増幅により、生成させた。最終ＩＬＶ３－ＮＴＣ組込みカセットをフラグメント１＋２＋３の構築、続いて、プライマーＣＰＡ１１１／１１４を用いた増幅により生成させた。株＃３を生成させるために、株＃２を最終ＩＬＶ３－ＮＴＣ組込みカセットで形質転換させた。
ＩＬＶ３（ｓｅ）の配列－ＮＴＣ組込みカセット：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１
ＰＣＲのための鋳型：
ｇＤＮＡ Ｓ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
ＮＴＣ－ＤＮＡカセット（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）；ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ
使用したプライマー：
ＣＰＡ７０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１
ＣＰＡ７１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２
ＣＰＡ９１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３
ＣＰＡ９６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４
ＣＰＡ１１１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５
ＣＰＡ１１２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６
ＣＰＡ１１３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７
ＣＰＡ１１４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８
ＣＰＡ１２８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９
ＣＰＡ１２９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０
ＩＬＶ３（ｓｅ）発現カセット（生成物１）をｇＤＮＡ株＃１から、アレル－特異的プライマーＣＰＡ７０／７１を用いて増幅させた。次いで、生成物１を、プライマーＣＰＡ７０／１２９を用いてさらに増幅させ、生成物２を得た。ＮＴＣ－発現カセット（生成物３）の増幅を、プライマーＣＰＡ９１／９６、およびＮＴＣ－ＤＮＡ－Ｓｔｒｉｎｇを鋳型として用いて実施した。生成物４を生成物３のプライマーＣＰＡ９１／１２８を用いた増幅により生成させた。生成物３および生成物４をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを介して構築し、プライマーＣＰＡ７０／９１を用いて増幅させ、フラグメント１を作製した。ホモロジーアームを、プライマーＣＰＡ１１１／１１２（５’－隣接領域；フラグメント２）およびＣＰＡ１１３／１１４（３’－隣接領域；フラグメント３）を用いて、ｇＤＮＡ株＃１由来のＰＡＤ１隣接領域の増幅により、生成させた。最終ＩＬＶ３－ＮＴＣ組込みカセットをフラグメント１＋２＋３の構築、続いて、プライマーＣＰＡ１１１／１１４を用いた増幅により生成させた。株＃３を生成させるために、株＃２を最終ＩＬＶ３－ＮＴＣ組込みカセットで形質転換させた。
ＩＬＶ３（ｓｅ）の配列－ＮＴＣ組込みカセット：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１
【0321】
組換えプラスミド
プラスミド＃１の構成
ベクター調製
プラスミド＃０（ｐＹＥＳＶＩＩＩ、ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）をマルチクローニング部位に存在するＰｍｅＩを使用して直線化した。精製前に、加水分解ベクターを脱リン酸化した。
プラスミド＃１の構成
ベクター調製
プラスミド＃０（ｐＹＥＳＶＩＩＩ、ＢＲＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）をマルチクローニング部位に存在するＰｍｅＩを使用して直線化した。精製前に、加水分解ベクターを脱リン酸化した。
【0322】
ベクターインサートの生成
ＰＣＲのための鋳型：
ｇＤＮＡ Ｓ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
使用したプライマー：
ＣＰＡ７４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２
ＣＰＡ７５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３
ＣＰＡ８６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４
ＣＰＡ８７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５
天然ＩＬＶ５－発現カセット（ｓｃ）をＷＳ３４／７８ｇＤＮＡから、アレル－特異的プライマーＣＰＡ７４／７５を使用して増幅させた。次いで、ベクターインサートを得られたＰＣＲ産物のプライマーＣＰＡ８６／８７を用いた増幅により生成させた。
ＰＣＲのための鋳型：
ｇＤＮＡ Ｓ．パストリアヌスＷＳ３４／７８、株＃１（表１６）
使用したプライマー：
ＣＰＡ７４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２
ＣＰＡ７５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３
ＣＰＡ８６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４
ＣＰＡ８７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５
天然ＩＬＶ５－発現カセット（ｓｃ）をＷＳ３４／７８ｇＤＮＡから、アレル－特異的プライマーＣＰＡ７４／７５を使用して増幅させた。次いで、ベクターインサートを得られたＰＣＲ産物のプライマーＣＰＡ８６／８７を用いた増幅により生成させた。
【0323】
ＩＬＶ５－発現ベクター（プラスミド＃１）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙを介して構築し、大腸菌ＤＨ１０βを反応生成物で形質転換させた。プラスミド調製後、発現カセットをＳａｎｇｅｒ－ＤＮＡシークエンシングにより分析した。
ＩＬＶ５（ｓｃ）発現カセットの配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６
ＩＬＶ５（ｓｃ）発現カセットの配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６
【0324】
実施例１１－モデルブルーワーの酵母ＷＳ３４／７８におけるさらなる遺伝子コピー数適合
この実験の目的は実施例１０と同様であり、すなわち、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の遺伝子型を反映するように関連遺伝子のコピー数を調整するためにさらに遺伝子改変されたＷＳ３４／７８酵母株を生成させることであった。
この実験の目的は実施例１０と同様であり、すなわち、ＺＤＡ１およびＺＤＡ２の遺伝子型を反映するように関連遺伝子のコピー数を調整するためにさらに遺伝子改変されたＷＳ３４／７８酵母株を生成させることであった。
【0325】
天然サッカロマイセス・セレビシエ遺伝子のＰＣＲ
Ｓ．セレビシエ遺伝子ＩＬＶ３、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２、およびＩＬＶ６を、それらの天然プロモーターおよびターミネーター領域と共に、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８（Ｗ３４／７８）ラガー酵母から、プライマーＳＥＱ ＩＤ ｎｏ６７～ＳＥＱ ＩＤ ｎｏ７４およびＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して増幅させた。天然プロモーターおよびターミネーターを標的にする領域を、前の文献（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， １９９５）に従い、開始コドンの上流およそ１０００塩基対（プロモーター）および終止コドンの下流４００塩基対（ターミネーター）選択した。ＰＣＲ反応のために鋳型として使用したゲノムＤＮＡをＷ３４／７８酵母から、Ｌｕｃｉｇｅｎ製のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ精製キットｆａｃｔ ＮｏＭＰＹ８０２００を使用し抽出した。
所望のＳ．セレビシエ遺伝子の上流および下流で増幅するために使用したプライマー：
ＳｃＩＬＶ３＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７
ＳｃＩＬＶ３＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８
ＳｃＢＡＴ１＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９
ＳｃＢＡＴ１＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０
ＳｃＢＡＴ２＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１
ＳｃＢＡＴ２＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２
ＳｃＩＬＶ６＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３
ＳｃＩＬＶ６＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４
Ｓ．セレビシエ遺伝子ＩＬＶ３、ＢＡＴ１、ＢＡＴ２、およびＩＬＶ６を、それらの天然プロモーターおよびターミネーター領域と共に、Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８（Ｗ３４／７８）ラガー酵母から、プライマーＳＥＱ ＩＤ ｎｏ６７～ＳＥＱ ＩＤ ｎｏ７４およびＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して増幅させた。天然プロモーターおよびターミネーターを標的にする領域を、前の文献（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， １９９５）に従い、開始コドンの上流およそ１０００塩基対（プロモーター）および終止コドンの下流４００塩基対（ターミネーター）選択した。ＰＣＲ反応のために鋳型として使用したゲノムＤＮＡをＷ３４／７８酵母から、Ｌｕｃｉｇｅｎ製のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｙｅａｓｔ ＤＮＡ精製キットｆａｃｔ ＮｏＭＰＹ８０２００を使用し抽出した。
所望のＳ．セレビシエ遺伝子の上流および下流で増幅するために使用したプライマー：
ＳｃＩＬＶ３＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７
ＳｃＩＬＶ３＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８
ＳｃＢＡＴ１＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９
ＳｃＢＡＴ１＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０
ＳｃＢＡＴ２＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１
ＳｃＢＡＴ２＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２
ＳｃＩＬＶ６＿Ｆ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３
ＳｃＩＬＶ６＿Ｒ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４
【0326】
大腸菌細胞へのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎによる、ＰＣＲフラグメントのプラスミドベクターへのクローニング
純粋ＰＣＲフラグメントを、ｋａｎＭＸＧ４１８抵抗性マーカーを含むセントロメア単一コピーベクターにクローン化した。場合によっては、遺伝子を組合わせて、１を超える遺伝子を含むプラスミドを作製した。Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｓｃａｒｆ．ｄｅ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｄｅｔａｉｌｓ．ｐｈｐ？ａｃｃｎｏ＝Ｐ３０６７３）からのｐＳＨ６７を、ＰｖｕＩＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて３７℃で６０分間直線化し、Ｃｒｅ－発現コンストラクトを除去した。次いで、直線化プラスミドをＴ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と２５℃で一晩連結させた。連結プラスミドをＮＥＢ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に形質転換させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）寒天プレート上に蒔いた。次いで、このプラスミドを、対象となる遺伝子の挿入のためのバックボーンとして使用した。
純粋ＰＣＲフラグメントを、ｋａｎＭＸＧ４１８抵抗性マーカーを含むセントロメア単一コピーベクターにクローン化した。場合によっては、遺伝子を組合わせて、１を超える遺伝子を含むプラスミドを作製した。Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｓｃａｒｆ．ｄｅ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｄｅｔａｉｌｓ．ｐｈｐ？ａｃｃｎｏ＝Ｐ３０６７３）からのｐＳＨ６７を、ＰｖｕＩＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて３７℃で６０分間直線化し、Ｃｒｅ－発現コンストラクトを除去した。次いで、直線化プラスミドをＴ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と２５℃で一晩連結させた。連結プラスミドをＮＥＢ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に形質転換させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）寒天プレート上に蒔いた。次いで、このプラスミドを、対象となる遺伝子の挿入のためのバックボーンとして使用した。
【0327】
ＰｖｕＩＩ－ＨＦはベクターを消化し、ＰＣＲ－増幅されたインサートをＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して構築した。３：１比のインサート対ベクターを使用し、反応物を５０℃で６０分間インキュベートした。次いで、反応物を、ＮＥＢ ５α大腸菌コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に形質転換させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に蒔いた。クローンをＬＢ液体培地上で、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）と共に増殖させ、プラスミドをＭｏｎａｒｃｈ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して抽出した。
【0328】
この研究において作製した単一コピープラスミドは下記であった：
１．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３
２．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３－ＳｃＢＡＴ１
３．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３－ＳｃＢＡＴ２
４．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ６
５．ｐＳＨ６７－ＳｃＢＡＴ２
１．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３
２．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３－ＳｃＢＡＴ１
３．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ３－ＳｃＢＡＴ２
４．ｐＳＨ６７－ＳｃＩＬＶ６
５．ｐＳＨ６７－ＳｃＢＡＴ２
【0329】
ベクターによる酵母トランスフォーメーション、および、構成された酵母
Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８および実施例１０からの株＃２（２つの欠失Ｓ．ユーバヤヌスＩＬＶ２遺伝子コピーを有するＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８、ＷＳ３４／７８［２ｘＩＬＶ２ｅｕ］：：ＺｅｏＲとも呼ばれる）酵母を、Ｂｅｎａｔｕｉｌ ｅｔ ａｌ． ２０１０により概説されるプロトコルに従い、プラスミドで電気穿孔により形質転換させた。いくつかの若干の変更がなされた：酵母を２５℃で増殖させ、電気穿孔後２－３時間に回収し、細胞をジェネテシンＧ４１８（２００μｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ寒天プレート上に蒔いた。
Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８および実施例１０からの株＃２（２つの欠失Ｓ．ユーバヤヌスＩＬＶ２遺伝子コピーを有するＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ３４／７８、ＷＳ３４／７８［２ｘＩＬＶ２ｅｕ］：：ＺｅｏＲとも呼ばれる）酵母を、Ｂｅｎａｔｕｉｌ ｅｔ ａｌ． ２０１０により概説されるプロトコルに従い、プラスミドで電気穿孔により形質転換させた。いくつかの若干の変更がなされた：酵母を２５℃で増殖させ、電気穿孔後２－３時間に回収し、細胞をジェネテシンＧ４１８（２００μｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ寒天プレート上に蒔いた。
【0330】
この研究で生成させた酵母は下記表１７で示される。
【表19】
【0331】
実施例１２－改変ＷＳ３４／７８株の発酵特性の評価
株を円筒形容器内で前に記載されるように発酵させた。細胞を２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇ４１８）を含む１０ｍｌの液体ＹＰＤ中で一晩増殖させ、その後、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む、２０ｍｌの前に記載したピルスナー麦汁に移した。細胞ピッチングを前に記載されるように、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むピルスナー麦汁中で実施した。プラート、ジアセチルおよび揮発性測定を発酵の第３、４および５日に実施した。第５日に、炭水化物プロファイルおよびエステルプロファイル試料を取得した。
株を円筒形容器内で前に記載されるように発酵させた。細胞を２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇ４１８）を含む１０ｍｌの液体ＹＰＤ中で一晩増殖させ、その後、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む、２０ｍｌの前に記載したピルスナー麦汁に移した。細胞ピッチングを前に記載されるように、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むピルスナー麦汁中で実施した。プラート、ジアセチルおよび揮発性測定を発酵の第３、４および５日に実施した。第５日に、炭水化物プロファイルおよびエステルプロファイル試料を取得した。
【0332】
試験した酵母株の遺伝子型が下記表１８で示される。
【表20】
【0333】
各酵母株を用いた発酵の結果を下記表１９および２０にまとめて示す。
【表21】
【表22】
【0334】
この実施例の遺伝子操作された株を抗生物質の存在下で発酵させ、そのため、上記結果は、株を工業的に、抗生物質の存在なしで発酵させる場合わずかに異なる可能性があることに注目すべきである。特に、株はより速い増殖速度を有する可能性があり、よって、発酵はより速く進行するであろう。同様に、最初に生成されたジアセチルの低減もまた、より速く進行すると予測される。
【0335】
第５日に試験液中で最低量の総ジアセチルを有する株は、単一コピープラスミド（ＦＧＭＯ００９４）由来の、ＩＬＶ２遺伝子の２コピーが欠失し、ＩＬＶ３の余分なコピーがゲノム的に組み入れられ、ＩＬＶ５の余分のコピーが発現された株であった。
【表23】
【0336】
参考文献
Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｂｅｎａｔｕｉｌ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｍ． Ｐｅｒｅｚ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂｅｌｋ， Ｃｈｕｎｇ－Ｍｉｎｇ Ｈｓｉｅｈ， Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ ２３， Ｉｓｓｕｅ ４， Ａｐｒｉｌ ２０１０， Ｐａｇｅｓ １５５－１５９， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｑ００２
Ｂｒｉｇｇｓ， Ｄ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｗｉｎｇ ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８１．
Ｄｅｎｉｓ Ｅ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ｓ， Ｍａｉｒｅｙ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ＤＯＩ １０．１０３８／ｐｒｏｔｅｘ．２０１８．０７６
Ｈｏｕｇｈ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｗｉｎｇ ｓｃｉｅｎｃｅ： Ｈｏｐｐｅｄ Ｗｏｒｔ ａｎｄ Ｂｅｅｒ， Ｖｏｌｕｍｅ ２． １９８２．
Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ａ， Ｂｏｅｋｈｏｕｔ Ｔ， Ｇｏｊｋｏｖｉｃ Ｚ， Ｋａｔｚ Ｍ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ‐Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｎｅ， ｂｅｅｒ ａｎｄ ｃｉｄｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｂｅｖｅｒａｇｅｓ Ｊ Ｉｎｓｔ Ｂｒｅｗ ２０１８ ＤＯＩ １０．１００２／ｊｉｂ．５１２
Ｍｕｍｂｅｒｇ Ｄ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｒ， Ｆｕｎｋ Ｍ
Ｙｅａｓｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ Ｇｅｎｅ １９９５：１５６：１１９－２２．
ｄｏｉ： １０．１０１６／０３７８－１１１９（９５）０００３７－７
Ｗａｌｔｈｅｒ Ａ， Ｈｅｓｓｅｌｂａｒｔ Ａ， Ｗｅｎｄｌａｎｄ Ｊ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ， ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ’ｓ Ｆｉｒｓｔ Ｐｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｇｅｒ Ｙｅａｓｔ Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） ２０１４：４：７８３－９３．
Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｂｅｎａｔｕｉｌ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｍ． Ｐｅｒｅｚ， Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂｅｌｋ， Ｃｈｕｎｇ－Ｍｉｎｇ Ｈｓｉｅｈ， Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ ２３， Ｉｓｓｕｅ ４， Ａｐｒｉｌ ２０１０， Ｐａｇｅｓ １５５－１５９， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｑ００２
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Ｄｅｎｉｓ Ｅ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ｓ， Ｍａｉｒｅｙ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ＤＯＩ １０．１０３８／ｐｒｏｔｅｘ．２０１８．０７６
Ｈｏｕｇｈ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｗｉｎｇ ｓｃｉｅｎｃｅ： Ｈｏｐｐｅｄ Ｗｏｒｔ ａｎｄ Ｂｅｅｒ， Ｖｏｌｕｍｅ ２． １９８２．
Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ａ， Ｂｏｅｋｈｏｕｔ Ｔ， Ｇｏｊｋｏｖｉｃ Ｚ， Ｋａｔｚ Ｍ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ‐Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｎｅ， ｂｅｅｒ ａｎｄ ｃｉｄｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｂｅｖｅｒａｇｅｓ Ｊ Ｉｎｓｔ Ｂｒｅｗ ２０１８ ＤＯＩ １０．１００２／ｊｉｂ．５１２
Ｍｕｍｂｅｒｇ Ｄ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｒ， Ｆｕｎｋ Ｍ
Ｙｅａｓｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ Ｇｅｎｅ １９９５：１５６：１１９－２２．
ｄｏｉ： １０．１０１６／０３７８－１１１９（９５）０００３７－７
Ｗａｌｔｈｅｒ Ａ， Ｈｅｓｓｅｌｂａｒｔ Ａ， Ｗｅｎｄｌａｎｄ Ｊ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ， ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ’ｓ Ｆｉｒｓｔ Ｐｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｇｅｒ Ｙｅａｓｔ Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） ２０１４：４：７８３－９３．
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
そのゲノム内で、ａ．ＩＬＶ２をコードする最大で２の機能遺伝子であって、ＩＬＶ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＳｃＩＬＶ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のＳｅＩＬＶ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子；ならびに
ｂ．ＩＬＶ３をコードする少なくとも５の機能遺伝子、例えば少なくとも６の機能遺伝子であって、ＩＬＶ３をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のＳｃＩＬＶ３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のＳｅＩＬＶ３、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、機能遺伝子
をコードする酵母株。
【請求項2】
前記酵母株はそのゲノム内でＩＬＶ５をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする少なくとも５の機能遺伝子をコードし、ＩＬＶ５をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＳｃＩＬＶ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のＳｅＩＬＶ５、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する機能的相同体をコードする、請求項１に記載の酵母株。
【請求項3】
ＩＬＶ２、ＩＬＶ３および／またはＩＬＶ５をコードする前記遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項4】
ＩＬＶ２、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＩＬＶ６、ＢＡＴ１および／またはＢＡＴ２をコードする前記遺伝子は、それらの天然プロモーターから発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項5】
前記酵母株は異種ＤＮＡを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項6】
前記酵母株は遺伝子操作の工程を受けていない、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項7】
前記酵母株はＩＬＶ３をコードする最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ３をコードする５～６の機能遺伝子を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項8】
前記酵母株は、ＩＬＶ５をコードする、最大で１５の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～１０の機能遺伝子、例えばＩＬＶ５をコードする４～５の機能遺伝子を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項9】
前記酵母株は、ＩＬＶ６をコードする最大で４の機能遺伝子を有し、ＩＬＶ６をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のＳｃＩＬＶ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のＳｅＩＬＶ６、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項10】
前記酵母株はＢＡＴ１をコードする少なくとも３の機能遺伝子、例えば少なくとも４の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ１をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のＳｃＢＡＴ１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のＳｅＢＡＴ１、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項11】
前記酵母株は、ＢＡＴ２をコードする少なくとも４の機能遺伝子、例えば少なくとも５の機能遺伝子を有し、ＢＡＴ２をコードする各遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のＳｃＢＡＴ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のＳｅＢＡＴ２、またはこれと少なくとも８０％配列同一性を共有する相同体をコードする、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項12】
ＩＬＶ２およびＩＬＶ６をコードする前記酵母株における機能遺伝子の合計は、ＩＬＶ５およびＩＬＶ３をコードする機能遺伝子の合計より低い、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項13】
ＩＬＶ２対ＩＬＶ５およびＩＬＶ３の前記酵母株における機能遺伝子比は少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、例えば少なくとも２．５、または例えば少なくとも３である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項14】
ＩＬＶ２およびＩＬＶ６対ＩＬＶ５およびＩＬＶ３の前記酵母株における機能遺伝子比は、少なくとも１、例えば少なくとも１．２、例えば少なくとも１．４、例えば少なくとも１．６、例えば少なくとも１．８または例えば少なくとも２である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項15】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項16】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項17】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ２遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項18】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子における突然変異またはその欠失を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項19】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子におけるフレームシフト突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項20】
前記酵母株は、１つ以上のＩＬＶ６遺伝子の発現低下または発現なしという結果になる突然変異を保有する、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項21】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記発酵試験液は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で０．５０°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項22】
前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が、先行する２４時間で、０．４０°プラート、例えば０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しなかった最早時点である、請求項２１に記載の酵母株。
【請求項23】
前記試験液は、前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項24】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２５°プラート超減少しなかった最早時点で、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項25】
前記時点は、前記試験液の外観エキス含量が先行する１２時間で０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しなかった最早時点である、請求項２４に記載の酵母株。
【請求項26】
前記試験液は、前記最早時点で、最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項27】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は、次の２４時間で前記試験液の外観エキス含量が０．５０°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項28】
前記時点は、次の２４時間で、前記試験液の外観エキス含量が、０．４０°プラート、例えば０．３０°プラート、例えば０．２０°プラート超減少しない最早時点である、請求項２７に記載の酵母株。
【請求項29】
前記酵母株は、試験液中でのインキュベーションで発酵試験液を生成することができ、前記試験液は少なくとも１０°プラートの外観エキス含量を有するモルトおよび／または穀類の抽出物であり、前記試験液は前記試験液の外観エキス含量が次の１２時間で０．２５°プラート超減少しない最早時点で、最大で１２０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で６５ｐｐｂのジアセチルを含み、前記発酵は最大で１８℃の温度で起こる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項30】
前記時点は前記試験液の外観エキス含量が、次の１２時間で、０．２０°プラート、例えば０．１５°プラート、例えば０．１０°プラート超減少しない最早時点である、請求項２９に記載の酵母株。
【請求項31】
前記試験液は前記最早時点で最大で１１５ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項32】
前記酵母株は発酵試験液を生成することができ、前記試験液は、インキュベーションの開始後５日以内の任意の時点で、最大で２６５ｐｐｂのジアセチルを含み、７～８００万の酵母細胞／ｍｌの範囲が前記試験液に添加される、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項33】
前記酵母株は、前記試験液における、最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項34】
前記酵母株は、前記試験液において、最大で１６℃の温度で、最大で５日、例えば最大で４日間のインキュベーション後に、最大で５０ｐｐｂのジアセチルを含む発酵試験液を生成することができる、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項35】
前記酵母株は、前記試験液における所定の時間の間のインキュベーション後に、最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第１の発酵試験液を生成することができ、前記所定の時間は、同じ条件下でインキュベートされるＷ－３４／７８酵母株が、前記試験液におけるインキュベーション後に最大で６０ｐｐｂのジアセチルを含む第２の発酵試験液を生成するのに必要とされる時間よりも少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間少ない、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項36】
前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中でインキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる、請求項２１～３５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項37】
前記酵母株は、前記酵母株を前記試験液中で、４～６日の範囲の間、例えば、およそ４日間インキュベートした場合、少なくとも４．０ｍＬ／Ｌエタノール／°プラートを生成させることができる請求項２１～３６のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項38】
前記酵母株は、メリビオースを唯一の炭素源として有する培地上で増殖することができる、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項39】
前記試験液は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項40】
前記試験液はおよそ１６°プラートの外観エキス含量を有する麦汁である、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項41】
前記試験液は少なくとも４０ｇ／ｋｇのマルトースを含む、請求項２１～４０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項42】
前記発酵は１２℃～１８℃の範囲の温度で起こる、請求項２１～４１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項43】
前記発酵は最大で１６℃の温度で起こる、請求項２１～４２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項44】
前記発酵は、７，０００，０００～２０，０００，０００生酵母細胞／ｍＬ試験液の範囲での接種後に起こる、請求項２１～４３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項45】
前記水性抽出物は最大で６日、例えば最大で５日、例えば最大で４日間、前記酵母株により発酵される、請求項２１～４４のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項46】
前記水性抽出物は少なくとも１２°プラート、例えば少なくとも１５°プラートの外観エキス含量を有する、請求項２１～４５のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項47】
前記水性抽出物は麦汁である、請求項２１～４６のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項48】
前記水性抽出物は最大で３５００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で３０００ｍｇ／Ｌ、例えば最大で２５００ｍｇ／Ｌのアミノ酸を含む、請求項２１～４７のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項49】
前記発酵水性抽出物は最大で６０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で５０ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４５ｐｐｂのジアセチル、例えば最大で４０ｐｐｂのジアセチルを含む、請求項２１～４８のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項50】
前記発酵水性抽出物は、前記最早時点での溶液において、最大で１０００万細胞／ミリリットル、例えば最大で９５０万細胞／ミリリットル、例えば最大で９００万細胞／ミリリットル、例えば最大で８５０万細胞／ミリリットルを含む、請求項２１～４９のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項51】
前記発酵水性抽出物は少なくとも４％ＡＢＶ、例えば少なくとも５％ＡＢＶのアルコール含量を有する、請求項２１～５０のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項52】
前記発酵水性抽出物は少なくとも２５ｍｇ／Ｌのプロパノール、例えば少なくとも３０ｍｇ／Ｌのプロパノールを含む、請求項２１～５１のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項53】
前記発酵水性抽出物は最大で８ｍｇ／Ｌのイソブタノール、例えば最大で６ｍｇ／Ｌのイソブタノールを含む、請求項２１～５２のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項54】
前記発酵水性抽出物は少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５．例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５のイソブタノール対プロパノール：比を含む、請求項２１～５３のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項55】
発酵水性抽出物を生成する方法であって、ｉ）モルトおよび／または穀類の水性抽出物を提供する工程；
ｉｉ）サッカロマイセス・パストリアヌス種の酵母株を提供する工程であって、前記酵母株は請求項１～５４のいずれか一項に記載される、工程；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）で提供される水性抽出物を工程ｉｉ）の前記酵母株により発酵させ、よって、発酵水性抽出物を得る工程
を含む方法。
【請求項56】
飲料を生成するための方法であって、ｉ．請求項５５に記載の発酵水性抽出物を調製する工程、ならびに
ｉｉ．前記発酵水性抽出物を加工処理して飲料にする工程
を含む、方法。
【請求項57】
加工処理の前記工程は、下記の１つ以上を含む、請求項５６に記載の方法：ｉ．濾過、
ｉｉ．炭酸化、
ｉｉｉ．熟成、または
ｉｖ．瓶詰め。
【手続補正書】
【提出日】2023-03-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】