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特表2023-535407「ＣＴＬ－ｓｅｑ」（ＣＲＩＳＰＲ Ｔａｇ Ｌｉｎｅａｒ－ｓｅｑ）と称するヌクレアーゼオン／オフターゲット編集位置を指定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-17
(54)【発明の名称】「ＣＴＬ－ｓｅｑ」（ＣＲＩＳＰＲ Ｔａｇ Ｌｉｎｅａｒ－ｓｅｑ）と称するヌクレアーゼオン／オフターゲット編集位置を指定するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230809BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230809BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20230809BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20230809BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/11 Z
C12Q1/6876 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504254
(86)(22)【出願日】2021-07-22
(85)【翻訳文提出日】2023-03-01
(86)【国際出願番号】 US2021042733
(87)【国際公開番号】W WO2022020567
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】63/055,460
(32)【優先日】2020-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505092968
【氏名又は名称】インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】マクニール，マシュー
(72)【発明者】
【氏名】ターク，ロルフ
(72)【発明者】
【氏名】レティグ，ギャレット
(72)【発明者】
【氏名】ブラック，エレン
(72)【発明者】
【氏名】スン，ヨンミン
(72)【発明者】
【氏名】セーラー，クリス
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ユー
(72)【発明者】
【氏名】ガンダーソン，キース
(72)【発明者】
【氏名】キニー，カイル
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA11
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR63
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
本明細書に記載されるのは、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法であって、（ａ）ガイド配列ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖、１つまたは複数のタグ配列、およびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを細胞に同時送達するステップと、
（ｂ）二本鎖切断が起こるのに十分な時間、前記細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）前記細胞からゲノムＤＮＡを単離し、前記ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化した前記ゲノムＤＮＡを、ユニバーサルアダプター配列を含有する固有の分子インデックスに連結するステップと、
（ｄ）前記タグおよびユニバーサルアダプター配列を標的とするプライマーを使用して、連結した前記ＤＮＡ断片を増幅して、増幅配列の第１セットを生成するステップと、
（ｅ）Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールを標的とするユニバーサル配列決定プライマーを使用して増幅配列の前記第１セットを増幅し、増幅配列の第２セットを生成するステップと、
（ｆ）プールした配列を配列決定し、配列決定データを取得するステップと、
（ｇ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記ユニバーサル配列決定プライマーが、前記Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ユニバーサル配列決定プライマーが、前記Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ユニバーサル配列決定プライマーが、前記Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された１３－ｍｅｒテールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（ｇ）が、プロセッサで、（ｉ）前記配列データを参照ゲノムに整列させること、
（ｉｉ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定すること、および
（ｉｉｉ）配置、分析、および結果データをカスタム形式のファイル、表、または図として出力することを実行することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ｅ）の後に、（ｅ１）増幅配列の前記第２セットを正規化して、濃度正規化したライブラリーを生成し、前記正規化ライブラリーをその他の試料と共にプールして、プールしたライブラリーを生成するステップをさらに含み、ステップ（ｆ）～（ｉ）を続行する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（ｄ）がサプレッションＰＣＲ法を使用する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ酵素、Ｃａｓ発現ベクター、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓＲＮＰ複合体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ９酵素、Ｃａｓ９発現ベクター、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９ＲＮＰ複合体を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞がヒトまたはマウスの細胞を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記時間が、約２４時間～約９６時間である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
複数のタグ配列が同時送達される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記タグ配列が、５２塩基対を含む二本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の相補的な上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項の方法を使用して特定または指定されたオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位。
【請求項17】
５２塩基対タグ配列を設計する方法であって、プロセッサで、（ａ）ＧＣ含量４０～９０％、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃの１３ヌクレオチド配列を無作為に生成するステップと、
（ｂ）特定のゲノムに完全に整列する配列、またはホモポリマーもしくはＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフである配列を除去して、１３－ｍｅｒのセットを取得するステップと、
（ｃ）１つ以下のＣＣまたはＧＧジヌクレオチドモチーフを含有する前記１３－ｍｅｒ配列のサブセットを選択するステップと、
（ｄ）前記１３－ｍｅｒサブセット配列の４つを繋げて、無作為な５２－ｍｅｒ配列を形成するステップと、
（ｅ）無作為な前記５２－ｍｅｒ配列をゲノムに整列させるステップと、
（ｆ）前記ゲノムと類似性を有する無作為な前記５２－ｍｅｒ配列を除去して、５２－ｍｅｒ配列のサブセットを生成するステップと、
（ｈ）５２－ｍｅｒ配列の前記サブセットを出力し、相補鎖を生成して、二本鎖の５２塩基対タグ配列を生成するステップと、
を実行することを含む、前記方法。
【請求項18】
前記ゲノムがヒトまたはマウスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記５２塩基対タグ配列が、前記ゲノムに相補的ではない、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項20】
前記５２塩基対タグ配列のプライマーを設計するステップをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記５２塩基対タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに前記５２塩基対タグ配列の１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記５２塩基対タグ配列、前記５２塩基対タグ配列の相補体、または前記５２塩基対タグ配列のプライマーを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
請求項１７～２２に記載の方法を使用して設計された１つまたは複数の５２塩基対タグ配列。
【請求項24】
前記５２塩基対タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の前記上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、請求項２３に記載の５２塩基対タグ配列。
【請求項25】
請求項２３に記載の５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーおよびアダプタープライマーを設計するための方法であって、プロセッサで、（ａ）タグ配列の前記上部および下部鎖に部分的に相補的なタグプライマーを設計するステップと、
（ｂ）前記アダプター配列の上部鎖に部分的に相補的なアダプタープライマーを設計するステップと、
を実行することを含み、
前記タグプライマーが、５’ユニバーサルテール配列を含み、
前記アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールに相補的な配列を含む、前記方法。
【請求項26】
前記５’ユニバーサルテール配列が、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）、遺伝子座特異的セグメント、３’末端からのリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）、予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）、または予め設計された１３－ｍｅｒ配列に相補的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的な前記プライマーが、前記ＳＰ１配列（配列番号７）に相補的なテール配列を含み、前記アダプタープライマーが、前記Ｔａｇ－ｐＴＯＰもしくはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーの前記ＳＰ２配列（配列番号８）テールに相補的な配列を含むか、または前記タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的な前記プライマーが、前記ＳＰ２配列（配列番号８）に相補的なテール配列を含み、前記アダプタープライマーが、前記Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーの前記ＳＰ１配列（配列番号７）テールに相補的な配列を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項28】
タグ配列の前記上部および下部鎖に相補的な前記プライマーならびに前記アダプター配列の前記上部鎖に相補的なプライマーを用いた核酸分子の増幅が、前記タグ配列の一部、ｓｇＤＮＡ配列、および前記アダプター配列を含むＰＣＲ産物を生成する、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記フォワードおよびリバースタグプライマーならびに前記アダプタープライマーの配列を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記５２塩基対タグ配列および前記５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーが設計され、前記プライマーが部分的に相補的である可能性が高いかどうか、プライマー二量体を形成する傾向があるかどうかを予測するアルゴリズムを使用して選択される、請求項１７～２１および２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
請求項２２～２５で記載した方法を使用して設計された前記５２塩基対タグ配列に部分的に相補的な１つまたは複数のプライマーおよび１つまたは複数のアダプタープライマー。
【請求項32】
前記プライマーが、配列番号３、４の配列および前記アダプタープライマーを含み、前記アダプタープライマーが、配列番号５の配列を含む、請求項３１に記載のプライマー。
【請求項33】
オンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を特定するための、１つまたは複数の二本鎖５２塩基対タグ配列の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０５５，４６０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０５５，４６０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の参照
本出願は、米国特許法施行規則第１．８２１条（ｃ）に従って、配列表のコンピュータ可読形式と共に出願される。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル、「０１３６７０－９０５６－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１９－ＪＵＬ－２０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は２７３配列を含有しており、２０２１年７月１９日に作成され、１５３キロバイトのファイルサイズであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法施行規則第１．８２１条（ｃ）に従って、配列表のコンピュータ可読形式と共に出願される。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル、「０１３６７０－９０５６－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿１９－ＪＵＬ－２０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は２７３配列を含有しており、２０２１年７月１９日に作成され、１５３キロバイトのファイルサイズであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本明細書に記載されるのは、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法である。
本明細書に記載されるのは、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法である。
【背景技術】
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、遺伝暗号への変化の簡単な導入を可能にすることによってゲノミクスに革命をもたらした。Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓタンパク質が結合したＲＮＡオリゴヌクレオチド配列（リボヌクレオタンパク質；ＲＮＰを形成する）によって標的に誘導され、そこで酵素がＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。天然の細胞機構は、一般的に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）分子経路を使用してＤＳＢを修復する。オンおよびオフターゲットの位置で生じるＮＨＥＪを介して修復されたＤＮＡは、インデル（挿入／削除）を含有していることが多く、これは突然変異を引き起こし、コードされる遺伝子の機能を変化させることがある。したがって、これらの位置を特定することは、生物学的表現型に対するオンおよびオフターゲット編集の影響を解析するために重要である。
【0005】
現在のところ、ＣＲＩＳＰＲまたはその他のヌクレアーゼのオフターゲット編集位置を特定または指定するための「絶対的基準」となる方法は存在していない。多くの方法が開発されている。これらの方法は、ＤＳＢで組み立てられた内因性修復機構の検出（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ－Ｓｅｑ［１］）、宿主細胞ゲノムへのＤＮＡタグ配列の組み込み（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ；米国特許第９，８２２，４０７号を参照のこと）、ｉＧＵＩＤＥ［２、３］）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの切断（ＢＬＩＳＳ［４］、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ［５］、ＳｉｔｅＳｅｑ［６］）を含む様々な戦略を使用する。
【0006】
細胞または細胞ベース（ｉｎ ｖｉｖｏと称することもある）および生化学的（ｉｎ ｖｉｔｒｏと称することもある）オフターゲットアッセイの指定系には、それぞれ利点がある。ＤＮＡに結合したタンパク質およびエピジェネティックマークは、ヌクレアーゼ活性の機能を変更するので、細胞または細胞ベースの方法が実際の編集標的をより良好に特定できることが示唆されている［７］。しかし、生化学的方法は、細胞または細胞ベースの方法では特定されない部位を指定するので、生化学的方法がより包括的であり得ることが示唆されている［５、６］。それにも関わらず、これらの現在のツールは、感度が不完全な傾向がある［５、６］（図１を参照のこと）。
【0007】
必要とされているのは、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を検出および指定するための方法である。
【発明の概要】
【0008】
本明細書で記載した一実施形態は、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法であって、（ａ）ガイド配列ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖、１つまたは複数のタグ配列、およびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを細胞に同時送達するステップと、（ｂ）二本鎖切断が起こるのに十分な時間、細胞をインキュベートするステップと、（ｃ）細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化したゲノムＤＮＡを、ユニバーサルアダプター配列を含有する固有の分子インデックスに連結するステップと、（ｄ）タグおよびユニバーサルアダプター配列を標的とするプライマーを使用して、連結したＤＮＡ断片を増幅して、増幅配列の第１セットを生成するステップと、（ｅ）Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールを標的とするユニバーサル配列決定プライマーを使用して、増幅された配列の第１セットを増幅し、増幅配列の第２セットを生成するステップと、（ｆ）プールした配列を配列決定し、配列決定データを取得するステップと、（ｇ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定するステップとを含む方法である。一態様では、ユニバーサル配列決定プライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する。別の態様では、ユニバーサル配列決定プライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する。別の態様では、ユニバーサル配列決定プライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された１３－ｍｅｒテールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する。別の態様では、ステップ（ｇ）は、プロセッサで、（ｉ）配列データを参照ゲノムに整列させること、（ｉｉ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定すること、（ｉｉｉ）配置、分析、および結果データをカスタム形式のファイル、表、または図として出力することを実行することを含む。別の態様では、この方法は、ステップ（ｅ）の後に、（ｅ１）増幅配列の第２セットを正規化して、濃度正規化したライブラリーを生成し、正規化したライブラリーをその他の試料と共にプールして、プールしたライブラリーを生成するステップをさらに含み、ステップ（ｆ）～（ｉ）を続行する。別の態様では、ステップ（ｄ）はサプレッションＰＣＲ法を使用する。別の態様では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、内因的に発現したＣａｓ酵素、Ｃａｓ発現ベクター、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓＲＮＰ複合体を含む。別の態様では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、内因的に発現したＣａｓ９酵素、Ｃａｓ９発現ベクター、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９ＲＮＰ複合体を含む。別の態様では、細胞はヒトまたはマウス細胞を含む。別の態様では、時間は約２４時間～約９６時間である。別の態様では、複数のタグ配列が同時送達される。別の態様では、タグ配列は、５２塩基対を含む二本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を含む。別の態様では、タグ配列は５’末端リン酸基、ならびに１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む。別の態様では、タグ配列は、配列番号１～２または７～２６８の相補的な上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む。
【0009】
本明細書で記載した他の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して特定または指定されたオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位である。
【0010】
本明細書で記載した別の実施形態は、５２塩基対タグ配列を設計するための方法であって、プロセッサで、（ａ）ＧＣ含量４０～９０％、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃの１３ヌクレオチド配列を無作為に生成するステップと、（ｂ）特定のゲノムに完全に整列する配列、またはホモポリマーもしくはＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフである配列を除去して、１３－ｍｅｒのセットを取得するステップと、（ｃ）１つ以下のＣＣまたはＧＧジヌクレオチドモチーフを含有する１３－ｍｅｒ配列のサブセットを選択するステップと、（ｄ）１３－ｍｅｒサブセット配列の４つを繋げて、無作為な５２－ｍｅｒ配列を形成するステップと、（ｅ）無作為な５２－ｍｅｒ配列をゲノムに整列させるステップと、（ｆ）ゲノムと類似性を有する無作為な５２－ｍｅｒ配列を除去して、５２－ｍｅｒ配列のサブセットを生成するステップと、（ｈ）５２－ｍｅｒ配列のサブセットを出力し、相補鎖を生成して、二本鎖の５２塩基対タグ配列を生成するステップとを実行することを含む方法である。一態様では、ゲノムはヒトまたはマウスである。別の態様では、５２塩基対タグ配列は、ゲノムに相補的ではない。別の態様では、この方法は、５２塩基対タグ配列のためのプライマーを設計するステップをさらに含む。別の態様では、５２塩基対タグ配列は５’末端リン酸基、ならびに５２塩基対タグ配列の１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む。別の態様では、この方法は、５２塩基対タグ配列、５２塩基対タグ配列の相補体、または５２塩基対タグ配列のためのプライマーを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む。
【0011】
本明細書で記載した他の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して設計された１つまたは複数の５２塩基対タグ配列である。一態様では、５２塩基対タグ配列は、配列番号１～２または７～２６８の上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む。
【0012】
本明細書で記載した別の実施形態は、請求項２３に記載の５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーおよびアダプタープライマーを設計するための方法であって、プロセッサで、（ａ）タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なタグプライマーを設計するステップと、（ｂ）アダプター配列の上部鎖に部分的に相補的なアダプタープライマーを設計するステップとを実行することを含み、タグプライマーが、５’ユニバーサルテール配列を含み、アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールに相補的な配列を含む方法である。一態様では、５’ユニバーサルテール配列は、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）、遺伝子座特異的セグメント、３’末端からのリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）、予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）、または予め設計された１３－ｍｅｒ配列に相補的である。別の態様では、タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーは、ＳＰ１配列（配列番号７）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰもしくはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ２配列（配列番号８）テールに相補的な配列を含むか、またはタグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーは、ＳＰ２配列（配列番号８）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１配列（配列番号７）テールに相補的な配列を含む。別の態様では、タグ配列の上部および下部鎖に相補的なプライマーならびにアダプター配列の上部鎖に相補的なプライマーを用いた核酸分子の増幅は、タグ配列の一部、ｓｇＤＮＡ配列、およびアダプター配列を含むＰＣＲ産物を生成する。別の態様では、この方法は、フォワードおよびリバースタグプライマーならびにアダプタープライマーの配列を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む。別の態様では、５２塩基対タグ配列および５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーが設計され、プライマーが部分的に相補的である可能性が高いかどうか、プライマー二量体を形成する傾向があるかどうかを予測するアルゴリズムを使用して選択される。
【0013】
本明細書で記載した他の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して設計された５２塩基対タグ配列に部分的に相補的な１つまたは複数のプライマーおよび１つまたは複数のアダプタープライマーである。一態様では、プライマーは、配列番号３、４の配列およびアダプタープライマーを含み、アダプタープライマーは、配列番号５の配列を含む。
【0014】
本明細書で記載した別の実施形態は、オンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を特定するための、１つまたは複数の二本鎖５２塩基対タグ配列の使用である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】３つの生物学的複製物に共通のリードの割合を白い領域で示し、一方、２つの複製物に共通であるか、または１つの複製物に存在するリードを黒い領域で示す図である。表１は、４つの異なるｇＲＮＡのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ［３］に基づいた指定を９６ウェル形式で３連で示す。ｇＲＮＡ複合体は、等モル量のＡｌｔ－Ｒ ｃｒＲＮＡ－ＸＴとＡｌｔ－Ｒ ｔｒａｃｒＲＮＡとを混合することによって生成された。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）を使用して、Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にｇＲＮＡ１０μＭおよびｄｓＯＤＮ ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑタグ０．５μＭをトランスフェクトした。７２時間後、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。ゲノムＤＮＡを断片化し、ＬｏｔｕｓＤＮＡライブラリー調製キット（ＩＤＴ）を使用してアダプターを連結した。ライブラリーは、挿入したタグから連結したアダプターまでの増幅によって生成された［３］。次に、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームでペアエンド方式で配列決定した。
【図2】ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑが、ｒｈＡｍｐＳｅｑ標的化増幅によって検証できるよりも多くのオフターゲット位置を見つけることを示す図である。提示された結果は、ＷＴ Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にｇＲＮＡ配列（内部名：ＡＲ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＭＸ１、ＧＲＨＰＲ、ＨＰＲＴ３８０８７、ＨＰＲＴ３８２８５、ＶＥＧＦＡ）を送達する場合の３３１個のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ指定部位の集合体である。各ガイドは参照ゲノム全体が整列した１つのｒｈＡｍｐＳｅｑパネルによって設計され、標的化されたので、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、参照ゲノムに整列したリード全体の≧０．１％に割り当てられたオフターゲットを指定した。その後の実験では、ｇＲＮＡが再び同じ細胞に送達され、編集がｒｈＡｍｐＳｅｑでアッセイされた。処置された状態で、≧１％で未処置対照試料以上のインデルが観察された場合、標的は「編集済み」と呼ばれた。
【図3】ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑタグの組み込み率が変化することを例示する図である。図は、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、およびＥＭＸ１遺伝子を標的とするガイド配列のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ指定オン／オフターゲット遺伝子座を標的とするｒｈＡｍｐＳｅｑパネルにおけるＩｎＤｅｌ編集を有する１１８個の固有のＣａｓ９オン／オフターゲット部位のタグ組み込みのパーセンテージ（編集％に正規化）を示す。各ガイドは、３４塩基対のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ、ｄｓＯＤＮタグと共に、Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にヌクレオフェクションによって同時送達された。７２時間後にＤＮＡを抽出し、ｒｈＡｍｐＳｅｑマルチプレックスＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑで配列決定し、カスタムパイプラインによって分析した。正規化されたタグ組み込み率は、タグ配列を含有する各標的で配列決定されたリードを参照ゲノムとは異なる対立遺伝子を含有するリード全体で除したパーセンテージとして計算される（Ｃａｓ９編集を示す）。
【図4】異質な配列タグに対するｒｈＡｍｐＳｅｑプライマーの設計を示す図である。イラストは、ｒｈＡｍｐＳｅｑ設計パイプラインを使用した設計工程のステップを示しており、上部（１）および下部（２）鎖に対するフォワードプライマーの設計、不要なプライマーの破棄、および５’重複を有するが、３’重複配列を有さず、したがって、上部／下部鎖プライマー二量体がヘアピンになるタグ標的プライマーの選択（３）を含む。
【図5】重複するプライマー設計を構築するために使用したｒｈＡｍｐＳｅｑ設計パイプラインの概要を示す図である。パイプラインでは、公知の配列が各タグ配列の５’末端および３’末端に追加され、入力は品質管理され、アッセイ（図４Ａに示す）は各タグの上部および下部鎖に対して設計される。各タグ鎖を標的とするプライマーは、同じタグを標的とするプライマー間でＲＮＡヌクレオチドの３’の少なくとも４ヌクレオチドが重複しないように対になっており、プライマー対はランク付けされて選択される。ｈｇ３８およびｍｍ３８の頭字語は、それぞれヒトおよびマウスのゲノムの種類を表す。
【図6】重複するプライマーがＰＣＲアンプリコンを生成する場合のヘアピン形成を示す図である。この図は、ＰＣＲ産物の３’および５’末端に相補的な５’プライマーテール末端を有する重複プライマー領域からの望ましくない短いアンプリコンの代表的な標的配列およびヘアピンＰＣＲ産物を示す。
【図7】明示された単一タグ（配列番号９～４０）または表５に記載したタグのプール（配列番号９～４０、４５～２６８）が組み込まれた標的部位の数（黒い棒）を示す図である。縞模様の棒（ＣＴＬｍａｘ）は、単一タグ（配列番号９～４０）の組合せを使用した場合に理論的に見つけることができる標的部位の最大数を示す（最大３２部位のうち２３部位）。プールＡ１は単一タグ全て（配列番号９～４０）を含有する。プールＢ１～６はそれぞれ異なる１６個のタグ（配列番号４５～２６８）を含有する。プールＣ１は試験したタグ全て（配列番号９～４０、４５～２６８）を含有する。組み込み現象は、社内のデータ分析ツールを使用して判定した。
【図8】明示された単一タグ（配列番号９～４０）または表５に記載したタグのプール（配列番号９～４０、４５～２６８）が組み込まれた標的部位の数（黒い棒）を示す図である。縞模様の棒（ＣＴＬｍａｘ）は、単一タグ（配列番号９～４０）の組合せを使用した場合に理論的に見つけることができる標的部位の最大数を示す（最大５３部位のうち４７部位）。プールＡ１は単一タグ全て（配列番号９～４０）を含有する。プールＢ１～６はそれぞれ異なる１６個のタグ（配列番号４５～２６８）を含有する。プールＣ１は試験したタグ全て（配列番号９～４０、４５～２６８）を含有する。組み込み現象は、社内のデータ分析ツールを使用して判定した。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書に記載されるのは、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を検出および指定するための方法である。細胞内状態の情報は、従来のｉｎ ｖｉｖｏ指定方法に基づいて構築することによって維持される。固有の予め定義された配列タグのセットを同時送達することによって、感度が増大する。一態様では、予め定義された固有タグのセットの同時送達は、１３～８０塩基対の範囲であってもよい。別の態様では、同時送達された予め定義されたタグのセットは、１３塩基対タグ配列タグ、２６塩基対タグ配列タグ、３９塩基対タグ配列タグ、５２塩基対タグ配列タグ、６５塩基対タグ配列タグ、または７８塩基対タグ配列タグから構成されていてもよい。別の態様では、固有の予め定義されたタグは、５２塩基対タグ配列タグのセットである（配列タグの長さが増加すると、ｒｈＰｒｉｍｅｒが良好なプライマー着地部位を見つける能力が向上する）。この制限は、ヒトおよびマウスのゲノムとは異なる多様なタグ配列を使用することによって軽減されると考えられる。ＲＮＡａｓｅＨ２（パイロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ））を使用して標的に正確にアニーリングしたプライマーのブロックを解除するＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のｒｈＡｍｐ技術を構築することによって特異性が向上し、これによって偽プライミングの発生率が低くなる。５’末端に予想されるタグ配列を含有するリードを使用して標的を指定することだけで、特異性はさらに高まり得る。この方法にサプレッションＰＣＲを組み込むことで、使い安くなる。従来のｉｎ ｖｉｖｏ法（例えば、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑおよびｉＧＵＩＤＥ）は、タグの上部および下部鎖にアニーリングして伸長することによって増幅するために、並列ＰＣＲ反応（２プール増幅）を必要とする。ここでは、サプレッションＰＣＲを使用して、問題のある二量体配列を引き起こすことなく、両方のプールを同時に増幅することができる。
【0017】
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｄｓＤＮＡタグは、ヌクレオフェクションを使用して、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、１つのガイドＲＮＡと共に同時送達された。このような教示については、本明細書に参照として組み込まれた米国特許第９，８２２，４０７号を参照のこと。４つの異なるガイドＲＮＡ全てをこの様式で試験した。細胞内で、発現したＣａｓ９とガイドＲＮＡとの間でリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）が形成し、二本鎖切断を導入する。修復された切断部分は、同時送達されたタグを含有することができる。送達後、細胞をインキュベートして、得られたＤＮＡを抽出した。標的増幅は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロトコルに従って実施され、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ分析パイプライン（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｒｙｅｅｌａｂ／ｇｕｉｄｅｓｅｑ）の修正版でアッセイされた。指定された標的を、３つの生物学的複製物（固有のガイドＲＮＡ＋タグの同時送達）間で比較した。指定した標的全てが生物学的複製全てに共通しているわけではない（共通／指定した標的全体：それぞれ７／３１、６／１９、２／４、３／５、表１を参照のこと）。しかし、任意の標的に起因する全リードの９０％超は、共通の標的に起因していた（平均、図１を参照のこと）。
【0018】
【表1-1】
【0019】
【表1-2】
【0020】
さらに、指定された標的は、直交法を使用して複製したり検出したりできないことがある。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法を使用して、ＧＵＩＤＥ－ＳｅｑＤＮＡタグは、ヌクレオフェクションを使用して、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に６つのガイドそれぞれと共に同時送達された（各タグは１つのガイドＲＮＡと共に送達される）。ｒｈＡｍｐＳｅｑマルチプレックスアンプリコンパネルは、指定された標的を増幅するように設計されており、本発明者らは生物学的複製物における編集を定量化した。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑによって指定された３３１の標的のうち、ｒｈＡｍｐＳｅｑで検証できたのは４１（１２％）だけであった（図２を参照のこと）。
【0021】
ＮＨＥＪ修復で使用される、安定的に発現するＣＲＩＳＰＲ細胞株にガイドＲＮＡと共に同時送達されたｄｓＤＮＡタグ配列は、様々な割合で組み込まれる。ここで、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｄｓＤＮＡタグは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、６つのガイドそれぞれと共に同時送達された。別の態様では、ＮＨＥＪ修復で使用されるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰと共に同時送達されたｄｓＤＮＡタグ配列は、様々な割合で組み込まれる。ここで、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｄｓＤＮＡタグは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、６つのガイドそれぞれと共に同時送達された。ｒｈＡｍｐＳｅｑパネルは指定された標的を増幅するために開発され、生物学的複製物において、カスタム分析パイプラインを使用してタグ組み込み率が分析された。これらの結果は、標的に応じて、編集されたゲノムコピーの０～８５％でタグが組み込まれることを示す（図３を参照のこと）。いかなる理論にも拘束されないが、この率は配列の状況によって変化すると仮定される。
【0022】
本明細書に記載されるのは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのｒｈＡｍｐＳｅｑ（商標）技術、サプレッションＰＣＲ、および宿主ゲノム内のヌクレアーゼのオフターゲット編集位置を指定する新しい異質なＤＮＡ配列設計を組み合わせることによって、シグナル対ノイズ比を向上する方法である。
【0023】
この方法では、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡまたは２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖、および１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）タグ配列が細胞に送達される。複数のタグを同時送達すると、オフターゲット部位でのタグ統合を向上することができる（以下を参照のこと）。タグ配列は、宿主ゲノムとは著しく異なる（すなわち、異質な）配列内容を有する。ヌクレアーゼがＤＳＢを導入した後、ＮＨＥＪ修復がタグ配列を標的部位に挿入し、公知のプライマー着地部位を形成する。細胞が、ＤＳＢを修復し、おそらくさらに分裂する時間を経た後（７２時間後など）、ゲノムＤＮＡが単離され、断片化され（例えば、Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）せん断、酵素ベースのせん断、Ｔｎ５など）、固有の分子指数（ＵＭＩ）を含有するユニバーサルアダプター配列が断片化されたＤＮＡに連結され、連結されていない物質が除去される。次に、プライマーをタグおよびユニバーサルアダプター配列に標的化することによって、ＤＮＡ断片が増幅される（１回目ＰＣＲ）。ユニバーサルプライマーを使用して、試料指数（ＰＣＲ２）が追加され、増幅された物質は濃度正規化され、他の試料と共にプールされ、プールされた物質をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（または同様の）機器で配列決定される。配列決定されたリードは参照ゲノムに整列され、多数のリードがマップした遺伝子座は、オン／オフターゲット位置を指定することができる。
【0024】
異質な配列は、４０～９０％のＧＣ含有量、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃを有する無作為な１３－ｍｅｒ配列＞１Ｍを生成することによって設計された。配列のリストから、ヒト（ＧＲＣｈ３８．ｐ２；ｈｇ３８）もしくはマウス（ＧＲＣｈ３８．ｐ４；ｍｍ３８）参照ゲノムに対して完全に整列した配列、または厄介なモチーフ配列（ホモポリマー、ほとんどのＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフ）を有した配列が除去され、４７９配列が得られた。
【0025】
本明細書で記載した５２塩基対タグ配列を設計するために、ＣまたはＧジヌクレオチド≦１を含有する４９個の１３－ｍｅｒオリゴ配列を選択し、４つの１３－ｍｅｒ配列の１０，０００個の固有の組合せを生成した。連結した各配列の長さ（例えば、ソフトウェアを使用して４つの１３－ｍｅｒ配列を一列にして貼り付ける）は、５２ヌクレオチドである。次に、各５２ヌクレオチドタグ配列を、ｂｗａ－ｐｓｍと呼ばれるｂｗａの内部修正版を使用して、ヒト（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）およびマウス（ＧＲＣｈｍ３８．ｐ４）ゲノムに対して整列させた。ｂｗａ－ｐｓｍの実行は、定義された閾値までの全ての可能な二次的な一致を返す。ヒトまたはマウスのゲノムと類似性がない、群として機能することを意図した一連のタグ配列（配列番号１～２）が設計された（最大シードサイズ：７、シード編集距離：２、最大編集距離：２１、最大ギャップオープン：２、最大ギャップ伸長：３、ミスマッチペナルティ：１、ギャップオープンペナルティ：１、ギャップ伸長ペナルティ：１）。
【0026】
重複するｒｈＡｍｐＳｅｑＶ１プライマー（配列番号３～４）は、タグの上部および下部鎖、ならびにアダプター配列（配列番号６）の５’末端に相補的に設計された（図４）。タグ特異的プライマー（配列番号３～４）は、ＳＰ１およびＳＰ２プライマー配列（配列番号７～８）に一致する５’ユニバーサルテール配列、遺伝子座特異的セグメント、３’末端からのリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、ならびに３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）を含有する。アダプター特異的プライマー（配列番号５）は、５’－Ｐ５アダプター配列（配列番号６）の５’末端を標的とし、アダプター配列は固有分子指数（ＵＭＩ）配列を含有する（表２）。プライマーは、このようなアニーリングされたタグのプラスおよびマイナス鎖を標的とするように設計されており、これらのプライマーが予想外に二量体を形成する場合、形成された産物がヘアピンを形成し、利用可能な反応鋳型からオリゴを除去する（例えば、サプレッションＰＣＲ）（図６Ａ～Ｂ）。タグを標的とするプライマー配列は、ＩＤＴ（公開ＵＩを備えたアルゴリズムの内部コピー：ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｃｃｏｕｎｔ？ＲｅｔｕｒｎＵＲＬ＝／ｓｉｔｅ／ｏｒｄｅｒ／ｄｅｓｉｇｎｔｏｏｌ／ｉｎｄｅｘ／ＲＨＡＭＰＳＥＱ）によって設計および実行された独自の設計アルゴリズムに基づいて選択され、目的の鋳型配列を増幅するのに最適に実施されるプライマーペアを選択する（図５）。プライマー配列は、他の全タグ配列ならびにヒトおよびマウスの一次ゲノムアセンブリの両方への非特異的結合について評価したところ、ユニバーサルアダプター配列およびヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡの存在を組み合わせた場合に、オフターゲットアンプリコンを形成する可能性が低いことが確認された。
【0027】
プライマーは、１つのタグ特異的プライマー（上部または下部鎖）がアダプター特異的プライマー（配列番号５）と対になる対で機能することが望ましかった。これによって、サプレッションＰＣＲ法を使用して増幅すると、タグ、ｇＤＮＡ、およびアダプター配列の一部を含有する分子の増幅が引き起こされる（図４）。
【0028】
【表2】
【0029】
本明細書で記載した一実施形態は、精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定するための方法であって、（ａ）ガイド配列ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖および１つまたは複数のタグ配列を細胞に同時送達するステップと、（ｂ）一定時間細胞をインキュベートするステップと、（ｃ）細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化したゲノムＤＮＡを、ユニバーサルアダプター配列を含有する固有の分子インデックスに連結するステップと、（ｄ）タグおよびユニバーサルアダプター配列を標的とするプライマーを使用して、連結したＤＮＡ断片を増幅して、増幅配列の第１セットを生成するステップと、（ｅ）Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールを標的とするユニバーサル配列決定プライマーを使用して増幅配列の第１セットを増幅し、増幅配列の第２セットを生成するステップと、（ｆ）プールした配列を配列決定し、配列決定データを取得するステップと、（ｇ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定するステップとを含む方法である。一実施形態では、ユニバーサル配列決定プライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）テールを標的とし、増幅配列の第２のセットを生成する。別の実施形態では、ユニバーサル配列決定プライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔの予め設計された非相同配列（表６、配列番号２６９～２７３）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する。さらに別の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された１３－ｍｅｒテールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する。一実施形態では、ステップ（ｇ）は、プロセッサで、（ｉ）配列データを参照ゲノムに整列させること、（ｉｉ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定すること、および（ｉｉｉ）配置、分析、および結果データを表または図として出力することを実行することを含む。別の実施形態では、この方法は、ステップ（ｅ）の後に、（ｅ１）増幅配列の第２セットを正規化して、濃度正規化したライブラリーを生成し、正規化したライブラリーをその他の試料と共にプールして、プールしたライブラリーを生成するステップをさらに含み、ステップ（ｆ）～（ｉ）を続行する。一態様では、ステップ（ｄ）はサプレッションＰＣＲ法を使用する。別の態様では、細胞はＣａｓ酵素を構成的に発現するか、Ｃａｓ発現ベクターを同時送達されるか、Ｃａｓタンパク質を同時送達されるか、またはＣａｓＲＮＰ複合体を同時送達される。別の態様では、細胞はＣａｓ９酵素を構成的に発現するか、Ｃａｓ９発現ベクターを同時送達されるか、Ｃａｓ９タンパク質を同時送達されるか、またはＣａｓ９ＲＮＰ複合体を同時送達される。別の態様では、細胞はヒトまたはマウス細胞を含む。別の態様では、時間は約２４時間～約９６時間である。別の態様では、複数のタグ配列が同時送達される。別の態様では、タグ配列は、５２塩基対を含む二本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を含む。別の態様では、タグ配列は５’末端リン酸基、ならびに１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む。別の態様では、タグ配列は、配列番号９～４０または４５～２６８の上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む。
【0030】
本明細書で記載した別の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して特定または指定されたオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位である。
【0031】
本明細書で記載した別の実施形態は、５２塩基対タグ配列を設計する方法であって、プロセッサで、（ａ）ＧＣ含量４０～９０％、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃの１３ヌクレオチド配列を無作為に生成するステップと、（ｂ）特定のゲノムに完全に整列する配列、またはホモポリマーもしくはＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフである配列を除去し、１３－ｍｅｒのセットを取得するステップと、（ｃ）１つ以下のＣＣまたはＧＧジヌクレオチドモチーフを含有する１３－ｍｅｒ配列のサブセットを選択するステップと、（ｄ）１３－ｍｅｒサブセット配列の４つを繋げて、無作為な５２－ｍｅｒ配列を形成するステップと、（ｅ）無作為な５２－ｍｅｒ配列をゲノムに整列させるステップと、（ｆ）ゲノムと類似性を有する無作為な５２－ｍｅｒ配列を除去して、５２－ｍｅｒ配列のサブセットを生成するステップと、（ｈ）５２－ｍｅｒ配列のサブセットを出力し、相補鎖を生成して、二本鎖の５２塩基対タグ配列を生成するステップとを実行することを含む方法である。一態様では、ゲノムはヒトまたはマウスである。一態様では、５２塩基対タグ配列は、ゲノムに相補的ではない。別の態様では、この方法は、５２塩基対タグ配列のためのプライマーを設計するステップをさらに含む。別の態様では、５２塩基対タグ配列は５’末端リン酸基、ならびに５２塩基対タグ配列の１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む。別の態様では、この方法は、５２塩基対タグ配列、５２塩基対タグ配列の相補体、または５２塩基対タグ配列のためのプライマーを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む。
【0032】
本明細書で記載した別の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して設計された１つまたは複数の５２塩基対タグ配列である。一態様では、５２塩基対タグ配列は、配列番号９～４０または４５～２６８の相補的上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む。
【0033】
本明細書で記載した別の実施形態は、本明細書で記載した５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーおよびアダプタープライマーを設計するための方法であって、プロセッサで、（ａ）タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーを設計するステップと、（ｂ）アダプター配列の上部鎖に部分的に相補的なアダプタープライマーを設計するステップとを実行することを含み、タグプライマーが、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）に相補的な５’ユニバーサルテール配列、遺伝子座特異的セグメント、３’末端のリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、および３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）を含み、アダプタープライマーが、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）に相補的な配列を含む方法である。一態様では、タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーは、ＳＰ１配列に相補的な配列を含み、アダプタープライマーは、ＳＰ２配列に相補的な配列を含むか、またはタグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーは、ＳＰ２配列に相補的な配列を含み、アダプタープライマーは、ＳＰ１配列に相補的な配列を含む。別の態様では、タグ配列の上部および下部鎖に相補的なプライマーならびにアダプター配列の上部鎖に相補的なプライマーを用いた核酸分子の増幅は、タグ配列の一部、ｓｇＤＮＡ配列、およびアダプター配列を含むＰＣＲ産物を生成する。別の態様では、この方法は、フォワードおよびリバースタグプライマーならびにアダプタープライマーの配列を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む。
【0034】
本明細書で記載した別の実施形態では、５２塩基対タグ配列および５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーが設計され、プライマーが部分的に相補的である可能性が高いかどうか、プライマー二量体を形成する傾向があるかどうかを予測するアルゴリズムを使用して選択される。
【0035】
本明細書で記載した別の実施形態は、本明細書で記載した方法を使用して設計された５２塩基対タグ配列に部分的に相補的な１つまたは複数のプライマーおよび１つまたは複数のアダプタープライマーである。一態様では、５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーは、配列番号３、４の配列を含み、アダプタープライマーは、配列番号５の配列を含む。
【0036】
本明細書で記載した別の実施形態は、オンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を特定するための１つまたは複数の二本鎖５２塩基対タグ配列の使用である。
【0037】
本明細書で記載した組成物、製剤、方法、工程、および用途に対して、それらの任意の実施形態または態様の範囲から逸脱することなく、適切に改変および適応を行うことができることは、当業者には明らかであろう。提供した組成物および方法は例示的なものであり、特定の実施形態のいずれかの範囲を限定することを意図するものではない。本明細書で開示した様々な実施形態、態様、および選択肢は全て、任意の変形または反復で組み合わせることができる。本明細書で記載した方法および工程の範囲は、本明細書で記載した実施形態、態様、選択肢、実施例、選択の実際の、または可能な組合せ全てを含む。本明細書で記載した方法は、任意の構成要素またはステップを省略するか、本明細書で開示した任意の構成要素またはステップを置換するか、または本明細書の他の場所で開示した任意の構成要素またはステップを含むことができる。実施形態は、様々なハードウェア、ソフトウェア、および電子構成要素の組合せを含み、そうでなければそれらによって実行され得ることも理解されたい。例えば、様々な言語のソフトウェアと同様に、様々なマイクロプロセッサおよび特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）を利用することができる。また、サーバーおよび様々な計算機器を使用することができ、１つまたは複数の処理ユニット、１つまたは複数のコンピュータ可読媒体、１つまたは複数の入力／出力インターフェイス、および構成要素を接続する様々な接続（例えば、システムバス）を含むことができる。参照により組み込まれる特許または出版物のいずれかの用語の意味が、本開示で使用した用語の意味と矛盾する場合、本開示の用語または語句の意味が支配的である。さらに、本明細書は単に例示的な実施形態を開示および説明するものである。本明細書で引用した特許および出版物は全て、その特定の教示について参照により本明細書に組み込まれる。
【0038】
本明細書で記載した本発明の様々な実施形態および態様は、以下の項によって要約される：
【0039】
項１．精度および感度が向上したオンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を同定および指定する方法であって、
（ａ）ガイド配列ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖、１つまたは複数のタグ配列、およびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを細胞に同時送達するステップと、
（ｂ）二本鎖切断が起こるのに十分な時間、細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化したゲノムＤＮＡを、ユニバーサルアダプター配列を含有する固有の分子インデックスに連結するステップと、
（ｄ）タグおよびユニバーサルアダプター配列を標的とするプライマーを使用して、連結したＤＮＡ断片を増幅して、増幅配列の第１セットを生成するステップと、
（ｅ）Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールを標的とするユニバーサル配列決定プライマーを使用して増幅配列の第１セットを増幅し、増幅配列の第２セットを生成するステップと、
（ｆ）プールした配列を配列決定し、配列決定データを取得するステップと、
（ｇ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定するステップとを含む方法。
項２．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１に記載の方法。
項３．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１または２に記載の方法。
項４．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された１３－ｍｅｒテールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５．ステップ（ｇ）が、プロセッサで、
項６．配列データを参照ゲノムに整列させること、
（ａ）（ｉｉ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定すること、および
（ｂ）（ｉｉｉ）配置、分析、および結果データをカスタム形式のファイル、表、または図として出力することを実行することを含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項７．ステップ（ｅ）の後に、
（ａ）（ｅ１）増幅配列の第２セットを指定して、濃度正規化したライブラリーを生成するステップと、正規化したライブラリーをその他の試料と共にプールして、プールしたライブラリーを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）～（ｉ）を続行する、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項８．ステップ（ｄ）がサプレッションＰＣＲ法を使用する、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
項９．ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ酵素、Ｃａｓ発現ベクター、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓＲＮＰ複合体を含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
項１０．ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ９酵素、Ｃａｓ９発現ベクター、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９ＲＮＰ複合体を含む、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
項１１．細胞がヒトまたはマウスの細胞を含む、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
項１２．時間が、約２４時間～約９６時間である、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項１３．複数のタグ配列が同時送達される、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項１４．タグ配列が、５２塩基対を含む二本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を含む、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１５．タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項１６．タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の相補的な上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１７．項１～１５のいずれか一項の方法を使用して特定または指定されたオンおよびオフターゲットＣＲＳＰＲ編集部位。
（ａ）ガイド配列ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２部ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖、１つまたは複数のタグ配列、およびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを細胞に同時送達するステップと、
（ｂ）二本鎖切断が起こるのに十分な時間、細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化したゲノムＤＮＡを、ユニバーサルアダプター配列を含有する固有の分子インデックスに連結するステップと、
（ｄ）タグおよびユニバーサルアダプター配列を標的とするプライマーを使用して、連結したＤＮＡ断片を増幅して、増幅配列の第１セットを生成するステップと、
（ｅ）Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールを標的とするユニバーサル配列決定プライマーを使用して増幅配列の第１セットを増幅し、増幅配列の第２セットを生成するステップと、
（ｆ）プールした配列を配列決定し、配列決定データを取得するステップと、
（ｇ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定するステップとを含む方法。
項２．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１に記載の方法。
項３．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）テールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１または２に記載の方法。
項４．ユニバーサル配列決定プライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢｏｔプライマーの予め設計された１３－ｍｅｒテールを標的とし、増幅配列の第２セットを生成する、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５．ステップ（ｇ）が、プロセッサで、
項６．配列データを参照ゲノムに整列させること、
（ａ）（ｉｉ）オン／オフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集遺伝子座を特定すること、および
（ｂ）（ｉｉｉ）配置、分析、および結果データをカスタム形式のファイル、表、または図として出力することを実行することを含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項７．ステップ（ｅ）の後に、
（ａ）（ｅ１）増幅配列の第２セットを指定して、濃度正規化したライブラリーを生成するステップと、正規化したライブラリーをその他の試料と共にプールして、プールしたライブラリーを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）～（ｉ）を続行する、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項８．ステップ（ｄ）がサプレッションＰＣＲ法を使用する、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
項９．ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ酵素、Ｃａｓ発現ベクター、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓＲＮＰ複合体を含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
項１０．ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、内因的に発現したＣａｓ９酵素、Ｃａｓ９発現ベクター、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９ＲＮＰ複合体を含む、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
項１１．細胞がヒトまたはマウスの細胞を含む、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
項１２．時間が、約２４時間～約９６時間である、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項１３．複数のタグ配列が同時送達される、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項１４．タグ配列が、５２塩基対を含む二本鎖デオキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を含む、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１５．タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項１６．タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の相補的な上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１７．項１～１５のいずれか一項の方法を使用して特定または指定されたオンおよびオフターゲットＣＲＳＰＲ編集部位。
【0040】
項１８．５２塩基対タグ配列を設計する方法であって、プロセッサで、
（ａ）ＧＣ含量４０～９０％、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃの１３ヌクレオチド配列を無作為に生成するステップと、
（ｂ）特定のゲノムに完全に一致する配列、またはホモポリマーもしくはＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフである配列を除去し、１３－ｍｅｒのセットを取得するステップと、
（ｃ）１つ以下のＣＣまたはＧＧジヌクレオチドモチーフを含有する１３－ｍｅｒ配列のサブセットを選択するステップと、
（ｄ）１３－ｍｅｒサブセット配列の４つを繋げて、無作為な５２－ｍｅｒ配列を形成するステップと、
（ｅ）無作為な５２－ｍｅｒ配列をゲノムに整列させるステップと、
（ｆ）ゲノムと類似性を有する無作為な５２－ｍｅｒ配列を除去して、５２－ｍｅｒ配列のサブセットを生成するステップと、
（ｇ）５２－ｍｅｒ配列のサブセットを出力し、相補鎖を生成して、二本鎖５２塩基対タグ配列を生成するステップとを実行することを含む方法。
項１９．ゲノムがヒトまたはマウスである、項１７に記載の方法。
項２０．５２塩基対タグ配列が、ゲノムに相補的ではない、項１７または１８に記載の方法。
項２１．５２塩基対タグ配列のプライマーを設計するステップをさらに含む、項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２２．５２塩基対タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに５２塩基対タグ配列の１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
項２３．５２塩基対タグ配列、５２塩基対タグ配列の相補体、または５２塩基対タグ配列のプライマーを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
項２４．項１７～２２の方法を使用して設計された１つまたは複数の５２塩基対タグ配列。
項２５．５２塩基対タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項２３に記載の５２塩基対タグ配列。
（ａ）ＧＣ含量４０～９０％、最大ホモポリマー長Ａ：２、Ｃ：３、Ｇ：２、Ｔ：２、加重ホモポリマー率＜２０、自己折りたたみＴｍ＜５０°Ｃ、および自己二量体Ｔｍ＜５０°Ｃの１３ヌクレオチド配列を無作為に生成するステップと、
（ｂ）特定のゲノムに完全に一致する配列、またはホモポリマーもしくはＧＧもしくはＣＣジヌクレオチドモチーフである配列を除去し、１３－ｍｅｒのセットを取得するステップと、
（ｃ）１つ以下のＣＣまたはＧＧジヌクレオチドモチーフを含有する１３－ｍｅｒ配列のサブセットを選択するステップと、
（ｄ）１３－ｍｅｒサブセット配列の４つを繋げて、無作為な５２－ｍｅｒ配列を形成するステップと、
（ｅ）無作為な５２－ｍｅｒ配列をゲノムに整列させるステップと、
（ｆ）ゲノムと類似性を有する無作為な５２－ｍｅｒ配列を除去して、５２－ｍｅｒ配列のサブセットを生成するステップと、
（ｇ）５２－ｍｅｒ配列のサブセットを出力し、相補鎖を生成して、二本鎖５２塩基対タグ配列を生成するステップとを実行することを含む方法。
項１９．ゲノムがヒトまたはマウスである、項１７に記載の方法。
項２０．５２塩基対タグ配列が、ゲノムに相補的ではない、項１７または１８に記載の方法。
項２１．５２塩基対タグ配列のプライマーを設計するステップをさらに含む、項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２２．５２塩基対タグ配列が、５’末端リン酸基、ならびに５２塩基対タグ配列の１番目と２番目、２番目と３番目、５０番目と５１番目、および５１番目と５２番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
項２３．５２塩基対タグ配列、５２塩基対タグ配列の相補体、または５２塩基対タグ配列のプライマーを含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
項２４．項１７～２２の方法を使用して設計された１つまたは複数の５２塩基対タグ配列。
項２５．５２塩基対タグ配列が、配列番号１～２または７～２６８の上部および下部鎖対を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項２３に記載の５２塩基対タグ配列。
【0041】
項２６．項２３に記載の５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーおよびアダプタープライマーを設計するための方法であって、プロセッサで、
（ａ）タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なタグプライマーを設計するステップと、
（ｂ）アダプター配列の上部鎖に部分的に相補的なアダプタープライマーを設計するステップとを実行することを含み、
（ｃ）ここで、
（ｄ）タグプライマーが、５’ユニバーサルテール配列を含み、
（ｅ）アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールに相補的な配列を含む方法。
項２７．５’ユニバーサルテール配列が、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）、遺伝子座特異的セグメント、３’末端からのリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）、予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）、または予め設計された１３－ｍｅｒ配列に相補的である、項２５に記載の方法。
項２８．タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーが、ＳＰ１配列（配列番号７）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰもしくはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ２配列（配列番号８）テールに相補的な配列を含むか、またはタグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーが、ＳＰ２配列（配列番号８）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１配列（配列番号７）テールに相補的な配列を含む、項２５または２６に記載の方法。
項２９．タグ配列の上部および下部鎖に相補的なプライマーならびにアダプター配列の上部鎖に相補的なプライマーを用いた核酸分子の増幅が、タグ配列の一部、ｓｇＤＮＡ配列、およびアダプター配列を含むＰＣＲ産物を生成する、項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
項３０．フォワードおよびリバースタグプライマーならびにアダプタープライマーの配列を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
項３１．５２塩基対タグ配列および５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーが設計され、プライマーが部分的に相補的である可能性が高いかどうか、プライマー二量体を形成する傾向があるかどうかを予測するアルゴリズムを使用して選択される、項１７～２１および２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なタグプライマーを設計するステップと、
（ｂ）アダプター配列の上部鎖に部分的に相補的なアダプタープライマーを設計するステップとを実行することを含み、
（ｃ）ここで、
（ｄ）タグプライマーが、５’ユニバーサルテール配列を含み、
（ｅ）アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのテールに相補的な配列を含む方法。
項２７．５’ユニバーサルテール配列が、ＳＰ１またはＳＰ２配列（配列番号７、８）、遺伝子座特異的セグメント、３’末端からのリボヌクレオチド（ｒＮ）６ヌクレオチド、３’末端ミスマッチ、３’末端ブロック（３’－Ｃ３スペーサー）、予め設計された非相同配列（配列番号２６９～２７３）、または予め設計された１３－ｍｅｒ配列に相補的である、項２５に記載の方法。
項２８．タグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーが、ＳＰ１配列（配列番号７）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰもしくはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ２配列（配列番号８）テールに相補的な配列を含むか、またはタグ配列の上部および下部鎖に部分的に相補的なプライマーが、ＳＰ２配列（配列番号８）に相補的なテール配列を含み、アダプタープライマーが、Ｔａｇ－ｐＴＯＰまたはＴａｇ－ｐＢＯＴプライマーのＳＰ１配列（配列番号７）テールに相補的な配列を含む、項２５または２６に記載の方法。
項２９．タグ配列の上部および下部鎖に相補的なプライマーならびにアダプター配列の上部鎖に相補的なプライマーを用いた核酸分子の増幅が、タグ配列の一部、ｓｇＤＮＡ配列、およびアダプター配列を含むＰＣＲ産物を生成する、項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
項３０．フォワードおよびリバースタグプライマーならびにアダプタープライマーの配列を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップをさらに含む、項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
項３１．５２塩基対タグ配列および５２塩基対タグ配列に部分的に相補的なプライマーが設計され、プライマーが部分的に相補的である可能性が高いかどうか、プライマー二量体を形成する傾向があるかどうかを予測するアルゴリズムを使用して選択される、項１７～２１および２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【0042】
項３２．項２２～２５で記載した方法を使用して設計された５２塩基対タグ配列に部分的に相補的な１つまたは複数のプライマーおよび１つまたは複数のアダプタープライマー。
項３３．プライマーが、配列番号３、４の配列およびアダプタープライマーを含み、アダプタープライマーが、配列番号５の配列を含む、項３２に記載のプライマー。
項３４．オンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を特定するための１つまたは複数の二本鎖５２塩基対タグ配列の使用。
項３３．プライマーが、配列番号３、４の配列およびアダプタープライマーを含み、アダプタープライマーが、配列番号５の配列を含む、項３２に記載のプライマー。
項３４．オンおよびオフターゲットＣＲＩＳＰＲ編集部位を特定するための１つまたは複数の二本鎖５２塩基対タグ配列の使用。
【0043】
参考文献
1.Wienert et al., “Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-seq,” Science 364(6437): 286-289 (2019).
2.Nobles et al., “IGUIDE: An improved pipeline for analyzing CRISPR cleavage specificity,” Genome Biol. 20(14): 4-9 (2019).
3.Tsai et al., “GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases,” Nature Biotechnol. 33(2): 187-197 (2015).
4.Yan et al., “BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks,” Nature Commun. 8: 15058 (2017).
5.Tsai et al., “CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets,” Nature Methods 14(6): 607-614 (2017).
6.Cameron et al., “Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage,” Nature Methods 14(6): 600-606 (2017).
7.Char and Moosburner, “Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library- on-library approach,” Nature Methods 12(9): 823-826 (2015).
8.Rand et al., “Headloop suppression PCR and its application to selective amplification of methylated DNA sequences,” Nucleic Acids Res. 33(14): e127 (2005).
1.Wienert et al., “Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-seq,” Science 364(6437): 286-289 (2019).
2.Nobles et al., “IGUIDE: An improved pipeline for analyzing CRISPR cleavage specificity,” Genome Biol. 20(14): 4-9 (2019).
3.Tsai et al., “GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases,” Nature Biotechnol. 33(2): 187-197 (2015).
4.Yan et al., “BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks,” Nature Commun. 8: 15058 (2017).
5.Tsai et al., “CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets,” Nature Methods 14(6): 607-614 (2017).
6.Cameron et al., “Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage,” Nature Methods 14(6): 600-606 (2017).
7.Char and Moosburner, “Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library- on-library approach,” Nature Methods 12(9): 823-826 (2015).
8.Rand et al., “Headloop suppression PCR and its application to selective amplification of methylated DNA sequences,” Nucleic Acids Res. 33(14): e127 (2005).
【実施例】
【0044】
実施例１
この実験は、５２塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡタグおよび様々な遺伝子配列を使用すると、タグの組み込みの効率が増加することを示す。使用した配列を表３～５に示す。二本鎖タグは、上部鎖および相補的な下部鎖のハイブリダイゼーションによって生成された（表３～４；配列番号９～４０または４５～２６８）。Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個の異なるタグ設計を別々に導入した。あるいは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個のタグのプールまたは１１２タグの１プールのいずれかを導入した。ガイドＲＮＡは１０μＭの濃度でエレクトロポレーションされたが、単一タグまたはプールされたタグは最終濃度０．５μＭで送達された。タグの組み込みレベルは、ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマー（配列番号３～４）を使用した標的化増幅によって判定され、ＥＭＸ１ガイドＲＮＡの公知のオンおよびオフターゲット部位を濃縮した。ＥＭＸ１のｒｈＡｍｐＳｅｑプールは、経験的に決定されたオンおよびオフターゲット遺伝子座を表す３２部位で構成されている。増幅された産物はＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑで配列決定され、タグの組み込みレベルはカスタムソフトウェアを使用して判定された。この実施例は、タグの組み込み効率が、最大３２部位のうち６（ＣＴＬ０２１）から１３（ＣＴＬ１６９、ＣＴＬ０７９、ＣＴＬ００２）部位の範囲で、単一タグ構築物間で個々に異なり、したがって配列に依存することを示す（単一タグ、図７）。単一タグの結果を数学的に結合することによって、２３部位の仮想数が計算された（ＣＴＬｍａｘ、図７）。タグのプールを組み合わせるとタグ組み込みの可能性が高まるという仮説が試験され、実証された（プールされたタグ、表、図７）。プールＡ１は、単一タグ（表５を参照）で表されたタグで構成され、最大３２部位のうち２１のタグ組み込み現象が検出され、単一タグのいずれかによって実現されたものより高いことが実証された。同様に、プールＢ３は、最大３２部位のうち２１部位でタグの組み込みを示した。再度、プール間の変動性が示され（プールされたタグ、図７）、タグ設計の最適化が潜在的にタグ組み込みを最大化できることを示唆している。
この実験は、５２塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡタグおよび様々な遺伝子配列を使用すると、タグの組み込みの効率が増加することを示す。使用した配列を表３～５に示す。二本鎖タグは、上部鎖および相補的な下部鎖のハイブリダイゼーションによって生成された（表３～４；配列番号９～４０または４５～２６８）。Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個の異なるタグ設計を別々に導入した。あるいは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個のタグのプールまたは１１２タグの１プールのいずれかを導入した。ガイドＲＮＡは１０μＭの濃度でエレクトロポレーションされたが、単一タグまたはプールされたタグは最終濃度０．５μＭで送達された。タグの組み込みレベルは、ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマー（配列番号３～４）を使用した標的化増幅によって判定され、ＥＭＸ１ガイドＲＮＡの公知のオンおよびオフターゲット部位を濃縮した。ＥＭＸ１のｒｈＡｍｐＳｅｑプールは、経験的に決定されたオンおよびオフターゲット遺伝子座を表す３２部位で構成されている。増幅された産物はＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑで配列決定され、タグの組み込みレベルはカスタムソフトウェアを使用して判定された。この実施例は、タグの組み込み効率が、最大３２部位のうち６（ＣＴＬ０２１）から１３（ＣＴＬ１６９、ＣＴＬ０７９、ＣＴＬ００２）部位の範囲で、単一タグ構築物間で個々に異なり、したがって配列に依存することを示す（単一タグ、図７）。単一タグの結果を数学的に結合することによって、２３部位の仮想数が計算された（ＣＴＬｍａｘ、図７）。タグのプールを組み合わせるとタグ組み込みの可能性が高まるという仮説が試験され、実証された（プールされたタグ、表、図７）。プールＡ１は、単一タグ（表５を参照）で表されたタグで構成され、最大３２部位のうち２１のタグ組み込み現象が検出され、単一タグのいずれかによって実現されたものより高いことが実証された。同様に、プールＢ３は、最大３２部位のうち２１部位でタグの組み込みを示した。再度、プール間の変動性が示され（プールされたタグ、図７）、タグ設計の最適化が潜在的にタグ組み込みを最大化できることを示唆している。
【0045】
【表3-1】
【0046】
【表3-2】
【0047】
実施例２
この実験は、５２塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡタグおよび様々な遺伝子配列を使用すると、タグ組み込みの効率が増加することを実証している。使用した配列を表３～５に示す。二本鎖タグは、上部鎖および相補的な下部鎖（配列番号９～４０または４５～２６８）のハイブリダイゼーションによって生成された。Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＡＲ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個の異なるタグ設計を別々に導入した。あるいは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＡＲ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６タグのプールまたは１１２タグの１プールのいずれかを導入した。ガイドＲＮＡは１０μＭの濃度でエレクトロポレーションされたが、単一タグまたはプールされたタグは最終濃度０．５μＭで送達された。タグの組み込みレベルは、ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマー（配列番号３～４）を使用した標的化増幅によって判定され、ＡＲガイドＲＮＡの公知のオンおよびオフターゲット部位を濃縮した。ＡＲのｒｈＡｍｐＳｅｑプールは、経験的に決定されたオンおよびオフのターゲット遺伝子座を表す５３部位で構成されている。増幅された産物はＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑで配列決定され、タグの組み込みレベルはカスタムソフトウェアを使用して判定された。この実施例は、タグの組み込み効率が、最大５３部位のうち３５（ＣＴＬ０８５、ＣＴＬ１３４）から４１（ＣＴＬ００２）部位の範囲で、単一タグ構築物間で個々に異なり、したがって配列に依存することを示す（単一タグ、表５、図８）。
この実験は、５２塩基対の長さの二本鎖ＤＮＡタグおよび様々な遺伝子配列を使用すると、タグ組み込みの効率が増加することを実証している。使用した配列を表３～５に示す。二本鎖タグは、上部鎖および相補的な下部鎖（配列番号９～４０または４５～２６８）のハイブリダイゼーションによって生成された。Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＡＲ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６個の異なるタグ設計を別々に導入した。あるいは、Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＡＲ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡと一緒に、１６タグのプールまたは１１２タグの１プールのいずれかを導入した。ガイドＲＮＡは１０μＭの濃度でエレクトロポレーションされたが、単一タグまたはプールされたタグは最終濃度０．５μＭで送達された。タグの組み込みレベルは、ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマー（配列番号３～４）を使用した標的化増幅によって判定され、ＡＲガイドＲＮＡの公知のオンおよびオフターゲット部位を濃縮した。ＡＲのｒｈＡｍｐＳｅｑプールは、経験的に決定されたオンおよびオフのターゲット遺伝子座を表す５３部位で構成されている。増幅された産物はＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑで配列決定され、タグの組み込みレベルはカスタムソフトウェアを使用して判定された。この実施例は、タグの組み込み効率が、最大５３部位のうち３５（ＣＴＬ０８５、ＣＴＬ１３４）から４１（ＣＴＬ００２）部位の範囲で、単一タグ構築物間で個々に異なり、したがって配列に依存することを示す（単一タグ、表５、図８）。
【0048】
単一タグの結果を数学的に結合することによって、４７部位の仮想数が計算された（ＣＴＬｍａｘ、図８）。タグのプールを組み合わせるとタグ組み込みの可能性が高まるという仮説が試験され、実証された（プールされたタグ、表５、図８）。プールＢ４（表５を参照のこと）は、最大５３部位のうち４４のタグ組み込み現象が検出され、単一タグのいずれかによって実現されたものより高いことを実証した。再度、プール間の変動性が示され（プールされたタグ、表５、図８）、タグ設計の最適化が潜在的にタグ組み込みを最大化できることを示唆している。
【0049】
【表4-1】
【0050】
【表4-2】
【0051】
【表4-3】
【0052】
【表4-4】
【0053】
【表4-5】
【0054】
【表4-6】
【0055】
【表4-7】
【0056】
【表4-8】
【0057】
【表4-9】
【0058】
【表5】
【0059】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】