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特表2023-535433ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体製剤およびその調製方法ならびに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-17
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体製剤およびその調製方法ならびに使用
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230809BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230809BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230809BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230809BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230809BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230809BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230809BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230809BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230809BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230809BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230809BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 T
A61K9/08 ZNA
A61K47/18
A61K47/26
A61K47/10
A61K47/12
A61P37/02
A61P35/00
C07K16/46
C07K16/18
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504418
(86)(22)【出願日】2021-07-22
(85)【翻訳文提出日】2023-03-16
(86)【国際出願番号】 CN2021107878
(87)【国際公開番号】W WO2022017468
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】202010720248.0
(32)【優先日】2020-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】519274183
【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ ティエンイー
(72)【発明者】
【氏名】マー イートン
(72)【発明者】
【氏名】ワン インチュエ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076DD01
4C076DD38
4C076DD42
4C076DD46
4C076DD51Z
4C076EE23
4C076FF36
4C076FF61
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体を含む製剤に関し、特にＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤およびキレート剤を含む医薬製剤に関する。さらに、本発明は、疾患の治療または予防のためのこれらの製剤の使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、（ｉｉ）緩衝剤、
（ｉｉｉ）安定化剤、および
（ｉｖ）界面活性剤、
を含む液体抗体製剤であって、
式中、前記ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質は、
（ａ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、および
（ｂ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ－ＣＬ、
を含むか、またはそれからなり、
式中、
前記ＶＨは重鎖可変領域を示す、
前記ＣＨは重鎖定常領域を示す、
前記ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３および任意のＣＨ４を含む、
前記ＣＨ１、前記ＣＨ２、前記ＣＨ３および前記ＣＨ４は、重鎖定常領域のドメイン１、２、３および４をそれぞれ示す、
前記Ｘは存在しなくてもよい、または存在する場合にリンカーを示す、
前記ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位を示す、
前記ＶＬは軽鎖可変領域を示す、
前記ＣＬは軽鎖定常領域を示し、
場合により、前記ＣＨ１と前記Ｆｃとの間にヒンジ領域が存在し、
ここで、前記ＶＨＨは、配列番号６に含まれる３つの相補性決定領域（ＶＨＨ ＣＤＲ）を含み、かつ／または、前記ＶＨは、配列番号２に示される重鎖可変領域ＶＨの３つの相補性決定領域ＨＣＤＲを含み、かつ／または、前記ＶＬは、配列番号８に示される軽鎖可変領域ＶＬの３つの相補性決定領域ＬＣＤＲを含み、
好ましくは、前記液体抗体製剤は、（ｖ）キレート剤をさらに含み、
好ましくは、前記液体抗体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有し、例えば、６．０±０．２または６．２±０．２のｐＨを有し、好ましくは、約６．０のｐＨを有する、
液体抗体製剤。
【請求項2】
前記液体抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質は、約１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの濃度であり、好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１に記載の液体抗体製剤。
【請求項3】
前記液体抗体製剤は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝系から選択される緩衝系を含み、好ましくは、前記緩衝剤は、約５ｍＭ～５０ｍＭの濃度であり、好ましくは、約５ｍＭ～３０ｍＭの濃度であり、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭの濃度である、
請求項１または２に記載の液体抗体製剤。
【請求項4】
前記安定化剤は、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトールおよびそれらの組み合わせ）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、マルトースおよびそれらの組み合わせ）、アミノ酸（例えば、アルギニン、アルギニン塩酸塩、メチオニン、グリシン、プロリンおよびそれらの組み合わせ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、例えば、前記安定化剤は、
－ソルビトール、マンニトール、およびそれらの組み合わせから選択されるポリオールと、
－スクロース、トレハロース、マルトース、およびそれらの組み合わせから選択される糖類と、
－アルギニン塩酸塩、メチオニン、グリシン、プロリンおよびそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸、から選択される１つまたは複数を含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項5】
前記安定化剤は、（ｉ）約１２０ｍＭ～２００ｍＭのアルギニン、好ましくは、約１５０ｍＭ～１８０ｍＭ、例えば１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、もしくは１８０ｍＭのアルギニン、または
（ｉｉ）ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍＭであり、前記ソルビトールが約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、または
（ｉｉｉ）約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、好ましくは、約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、または
（ｉｖ）スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭ、例えば７０、７５、８０、８５、もしくは９０ｍＭであって、かつ前記スクロースが約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｍｇ／ｍＬのである組み合わせ、を含み、
好ましくは、前記アルギニンはアルギニン塩酸塩である、
請求項１～４のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項6】
前記液体抗体製剤における界面活性剤は、ポリソルベート系界面活性剤、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、およびそれらの組み合わせから選択され、好ましくはポリソルベート－８０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項7】
前記界面活性剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度であり、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、もしくは０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項8】
前記キレート剤は、カルボン酸型キレート剤であり、好ましくは、エデト酸二ナトリウムである、請求項１～７のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項9】
前記キレート剤は、約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１２、０．０１４、もしくは０．０１８ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～８のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項10】
前記ＶＨＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＨＨ ＣＤＲ１、ＶＨＨ ＣＤＲ２およびＶＨＨ ＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＶＨＨ ＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨＨ ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨＨ ＣＤＲ３は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、前記ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むかそれからなり、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むかそれからなり、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むかそれからなり、
かつ／または、前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
請求項１～９のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項11】
前記ＶＨＨは、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、前記ＶＨは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、前記ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項12】
前記式（Ｉ）におけるＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、前記式（ＩＩ）におけるＶＬ－ＣＬは、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、好ましくは、
前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、前記式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、配列番号７に示される配列を含むかまたはそれからなる、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項13】
前記ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞において組換え発現される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項14】
前記液体製剤は注射剤であり、好ましくは皮下注射もしくは静脈内注射に使用され、または輸液剤であり、例えば静脈内注入に使用される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の液体抗体製剤であって、前記液体抗体製剤は、（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１５０ｍＭ～１８０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍＭ～１００ｍＭであり、かつ前記ソルビトールが約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであって、かつ前記スクロースが約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、
ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
または、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～１５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１６０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、かつ前記ソルビトールが約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、前記スクロースが約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．３ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、
ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
または、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約１６５ｍＭのアルギニン塩酸塩、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約２３．６６ｍｇ／ｍＬのソルビトール、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｖ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約４２．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、含む、液体抗体製剤。
【請求項16】
前記製剤は、保存後、例えば２５℃で少なくとも２ヶ月間、または４０℃±２℃で１ヶ月間保存した後に安定であり、かつ好ましくは、以下：（ｉ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークの変化値が１％よりも小さく、かつ／または製剤が９６％よりも大きい純度、好ましくは９７％、もしくは９８％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉ）非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークの変化値が２％よりも小さく、かつ／または製剤が９５％よりも大きい純度、好ましくは９６％、もしくは９７％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉｉ）ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、保存０日目の初期値に対して、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分および塩基性成分）の変化値の合計が４０％を超えない、かつ／または主成分の変化値が２０％を超えない、例えば４０℃±２℃で１ヶ月間保存した後、変化値の合計が約４０％を超えない（例えば、３０％を超えない）、および／または主成分の変化値が約２０％を超えない（例えば、１５％を超えない）、または２５℃で２ヶ月間保存した後、変化値の合計が約２０％（例えば、約１５％）を超えない、または主成分の変化値が約１５％を超えない（例えば、約１０％を超えない）、ならびに
（ｉｖ）ＥＬＩＳＡ法により測定される場合、保存０日目の初期値に対して、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の相対結合活性が７０％～１３０％、例えば９０％～１１０％である、という特徴の１つまたは複数を有し、
または、前記製剤は、５℃±３℃で少なくとも６ヶ月間保存した後に安定であり、かつ好ましくは、以下：
（ｉ）純度に関して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークは≧９５．０％であり、
（ｉｉ）純度に関して、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークは≧９０．０％であり、
（ｉｉｉ）電荷変異体に関して、ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、主成分は≧５８．０％であり、
（ｉｖ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の相対結合活性が７０％～１３０％であり、ならびに
（ｖ）ｐＨ値が５．８～６．４である、という特徴の１つまたは複数を有する、
請求項１～１５のいずれか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤を固化させることで得られ、例えば、注射用凍結乾燥粉末の形態である、固体抗体製剤。
【請求項18】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤、または請求項１７に記載の固体抗体製剤を含む、送達装置。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤、または請求項１７に記載の固体抗体製剤を含み、静脈内注射または筋肉内注射に使用される、薬剤充填済み注射器。
【請求項20】
対象においてＬＡＧ－３および／またはＰＤ－Ｌ１経路を阻害することで免疫抑制作用を低減または排除する送達装置、薬剤充填済み注射器もしくは薬物の製造における、請求項１～１６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤または請求項１７に記載の固体抗体製剤の使用。
【請求項21】
対象において、腫瘍を治療または予防する送達装置、薬剤充填済み注射器もしくは薬物の製造における、請求項１～１６のいずれか１項に記載の液体抗体製剤または請求項１７に記載の固体抗体製剤の使用であって、前記腫瘍は、例えば胃腸管のがんである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、出願日が２０２０年７月２３日の中国特許出願２０２０１０７２０２４８０の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
本願は、出願日が２０２０年７月２３日の中国特許出願２０２０１０７２０２４８０の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
技術分野
本発明は、抗体製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３と同時に結合する二重特異性抗体を含む医薬製剤、特に安定な液体製剤、凍結乾燥製剤と再構成された安定な液体製剤、および前記医薬製剤を調製するための方法、ならびに前記医薬製剤の治療的かつ／または予防的使用に関する。
本発明は、抗体製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３と同時に結合する二重特異性抗体を含む医薬製剤、特に安定な液体製剤、凍結乾燥製剤と再構成された安定な液体製剤、および前記医薬製剤を調製するための方法、ならびに前記医薬製剤の治療的かつ／または予防的使用に関する。
【背景技術】
【0003】
医薬品の安定性は、医薬品の有効性および安全性を確保する重要な指標の一つである。良好な製剤処方の取得は、貯蔵期間に医薬品の有効性および安全性を維持することを確保するための重要な条件である。しかし、抗体自体およびその分解経路の複雑さのため、現在、抗体安定性の最適化に必要な製剤条件を予測することがまだできない。特に、異なる抗体は通常、非常に異なるＣＤＲ配列、抗体構造を有し、これらの配列と構造の相違は、異なる抗体が溶液で異なる安定性特性を有することにつながると考えられる。したがって、ヒト用抗体への安全性および有効性における厳しい要求に基づき、それぞれの抗体に対して最適な製剤処方の最適化を個別に行う必要がある。
【0004】
ＬＡＧ－３は、主に活性化されたT細胞およびNK細胞の細胞膜表面に発現し、免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷活性を抑制する役割を果たす。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路は、免疫系による腫瘍除去を抑制する臨床的に広く実証された主要なメカニズムの一つである。ＬＡＧ－３／ＭＨＣ IIシグナル経路およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路を同時に標的とすることは、臨床応用において一定の相乗効果を有することも証明されている。そのため、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路およびＬＡＧ－３／ＭＨＣ IIを同時に阻害できる二重特異抗体の設計は、非常に大きな臨床応用価値を有する。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、ＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬製剤を提供することで、上記の要件を満たす。本発明の抗体製剤は、複数の安定性影響要因に対して、いずれも優れた安定性を示す。
【0006】
一態様において、そのため、本発明は、（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３の二重特異性抗体、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）安定化剤、および（ｉｖ）界面活性剤を含む液体抗体製剤を提供する。好ましくは、当該液体抗体製剤は、（ｖ）キレート剤をさらに含む。
【0007】
一実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３の二重特異性抗体の構造は、図１に示すように、ここで、抗原Ａは、ＬＡＧ－３であり、抗原Ｂは、ＰＤ－Ｌ１であり、その構造は、
（ｉ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、および
（ｉｉ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ－ＣＬ、
を含み、
式中、
ＶＨは重鎖可変領域を示す、
ＣＨは重鎖定常領域を示す、
ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３および任意のＣＨ４を含む、
ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４は、重鎖定常領域のドメイン１、２、３および４をそれぞれ示す、
Ｘは存在しなくてもよく、または存在する場合にリンカーを示す、
ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位を示す、
ＶＬは軽鎖可変領域を示す、
ＣＬは軽鎖定常領域を示す、
場合により、ＣＨ１とＦｃとの間にヒンジ領域が存在する。
（ｉ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、および
（ｉｉ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ－ＣＬ、
を含み、
式中、
ＶＨは重鎖可変領域を示す、
ＣＨは重鎖定常領域を示す、
ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３および任意のＣＨ４を含む、
ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４は、重鎖定常領域のドメイン１、２、３および４をそれぞれ示す、
Ｘは存在しなくてもよく、または存在する場合にリンカーを示す、
ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位を示す、
ＶＬは軽鎖可変領域を示す、
ＣＬは軽鎖定常領域を示す、
場合により、ＣＨ１とＦｃとの間にヒンジ領域が存在する。
【0008】
一実施例において、本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、次の表に示す配列を含む：
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【0009】
前記ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、ＰＣＴ出願号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４（国際出願日：２０２０年１月２３日）に開示された二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰである。
【0010】
一実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞において組換えて発現される。
【0011】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、約１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬの濃度であり、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである。
【0012】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤は、約５ｍＭ～５０ｍＭの濃度である。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤は、約５ｍＭ～３０ｍＭの濃度であり、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭの濃度である。一実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤であり、好ましくは、前記緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤である。一実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤であり、好ましくは、前記緩衝剤は、ヒスチジンとヒスチジン塩酸塩とからなる。好ましい一実施形態において、前記緩衝剤は、約５ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、例えば５ｍＭ～１５ｍＭ、例えば約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤である。別の実施形態において、本発明の製剤に使用されるヒスチジン緩衝剤は、例えば約０．８５ｍｇ／ｍＬのヒスチジンと約０．９７ｍｇ／ｍＬのヒスチジン塩酸塩とからなる。
【0013】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における安定化剤は、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトールおよびそれらの組み合わせ）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、マルトースおよびそれらの組み合わせ）、アミノ酸（例えば、アルギニン塩酸塩、メチオニン、グリシン、プロリンおよびそれらの組み合わせもしくはその塩）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。一実施形態において、前記安定化剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬのソルビトール、例えば１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬのソルビトールを含む。別の実施形態において、前記安定化剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、好ましくは、約４０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬのスクロースを含む。一実施形態において、前記安定化剤は、例えば、約５０ｍＭ～２００ｍＭ、例えば６０ｍＭ～１８０ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニンを含む。好ましくは、前記アルギニンは、アルギニン塩酸塩である。
【0014】
一実施形態において、前記安定化剤は、アルギニンを単一成分として、前記アルギニンは、約１２０ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは、約１５０ｍＭ～１８０ｍＭ、例えば１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０ｍＭ、より好ましくは、約１６０ｍＭ～１７０ｍＭである。好ましくは、前記アルギニンは、アルギニン塩酸塩である。
【0015】
一実施形態において、前記安定化剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｍｇ／ｍＬのソルビトールと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせを含む。好ましくは、前記アルギニンは、アルギニン塩酸塩である。
【0016】
一実施形態において、前記安定化剤は、スクロースを単一成分として、前記スクロースは、約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍｇ／ｍＬである。
【0017】
一実施形態において、前記安定化剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５ｍｇ／ｍＬのスクロースと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせを含む。好ましくは、前記アルギニンは、アルギニン塩酸塩である。
【0018】
一実施形態において、前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。一実施形態において、前記界面活性剤は、ポリソルベート系界面活性剤、ポロキサマー、ポリエチレングリコールから選択される。一実施形態において、前記界面活性剤はポリソルベート系界面活性剤から選択される。一具体的な実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤はポリソルベート－８０である。
【0019】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度である。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、もしくは０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【0020】
一実施形態において、本発明の液体製剤におけるキレートは、カルボン酸型キレート剤である。一実施形態において、前記キレート剤は、エデト酸二ナトリウム、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシンから選択される。一実施形態において、前記キレート剤はエデト酸二ナトリウムから選択される。
【0021】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤におけるキレート剤は、約０．００５ｍｇ／ｍＬ～０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度である。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤におけるキレート剤は、約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば、約０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１２、０．０１４、もしくは０．０１８ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【0022】
一実施形態において、前記液体製剤は、約５．５～６．５のｐＨ値を有する。幾つかの実施形態において、前記液体製剤は、約５．５～６．５のうちの任意値のｐＨ値を有し、例えば、約５．６、５．８、６．０、６．２、６．４である。好ましくは、前記製剤は、５．８～６．４のｐＨを有し、例えば、６．０±０．２または６．２±０．２のｐＨを有し、好ましくは６．０のｐＨを有する。
【0023】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ～１５ｍＭ、より好ましくは、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１５０ｍＭ～１８０ｍＭ、例えば１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０ｍＭ、好ましくは、約１６０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニン、または約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｍｇ／ｍＬのソルビトールと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせ、または約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５ｍｇ／ｍＬのスクロースと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせ、もしくは
（ｉｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば０．３ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含み
好ましくは、前記液体抗体製剤は、（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１２、０．０１４、もしくは０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムをさらに含み、
ここで、前記液体製剤は、約５．５～６．５のｐＨを有し、好ましくは、約５．８～６．４のｐＨを有し、例えば、６．０±０．２または６．２±０．２のｐＨを有し、例えば、約６．０である。
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ～１５ｍＭ、より好ましくは、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１５０ｍＭ～１８０ｍＭ、例えば１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０ｍＭ、好ましくは、約１６０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニン、または約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｍｇ／ｍＬのソルビトールと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせ、または約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、例えば７０、７５、８０、８５、９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ、例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５ｍｇ／ｍＬのスクロースと、約６０ｍＭ～１００ｍＭ、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｍＭ、好ましくは、約７０ｍＭ～９０ｍＭのアルギニンとの組み合わせ、もしくは
（ｉｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば０．３ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、を含み
好ましくは、前記液体抗体製剤は、（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１２、０．０１４、もしくは０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムをさらに含み、
ここで、前記液体製剤は、約５．５～６．５のｐＨを有し、好ましくは、約５．８～６．４のｐＨを有し、例えば、６．０±０．２または６．２±０．２のｐＨを有し、例えば、約６．０である。
【0024】
好ましい一実施形態において、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１５０ｍＭ～１８０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍＭ～１００ｍＭであり、かつ前記ソルビトールが約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであって、かつ前記スクロースが約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、 ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
好ましい一実施形態において、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～１５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１６０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、かつ前記ソルビトールが約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、前記スクロースが約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．３ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、 ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
好ましい一実施形態において、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約１６５ｍＭのアルギニン塩酸塩、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約２３．６６ｍｇ／ｍＬのソルビトール、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｖ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約４２．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、含む。
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１５０ｍＭ～１８０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍＭ～１００ｍＭであり、かつ前記ソルビトールが約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約６０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであって、かつ前記スクロースが約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、 ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
好ましい一実施形態において、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、
（ｉｉ）約５ｍＭ～１５ｍＭのヒスチジン緩衝剤、
（ｉｉｉ）約１６０ｍＭ～１７０ｍＭのアルギニン、もしくは
ソルビトールとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、かつ前記ソルビトールが約１５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、もしくは
約７０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬのスクロース、もしくは
スクロースとアルギニンとの組み合わせであって、前記アルギニンが約７０ｍＭ～９０ｍＭであって、前記スクロースが約３５ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬである組み合わせ、
（ｉｖ）約０．３ｍｇ／ｍＬ～０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および
（ｖ）約０．００８ｍｇ／ｍＬ～０．０１８ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、を含み、 ここで、前記液体製剤は、約５．８～６．４のｐＨを有する液体抗体製剤、
好ましい一実施形態において、前記液体抗体製剤は、
（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約１６５ｍＭのアルギニン塩酸塩、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約２３．６６ｍｇ／ｍＬのソルビトール、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｉｉ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、もしくは
（ｉｖ）約２０ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約８０ｍＭのアルギニン塩酸塩、約４２．００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウムを、ｐＨ約６．０で、含む。
【0025】
本発明の液体製剤は、例えば、少なくとも２４ヶ月またはそれ以上の期間など、長期間にわたり安定に保存することができる。一実施形態において、本発明の液体製剤は、約－８０℃～約４５℃、例えば、－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３８℃、約４０℃、約４２℃もしくは約４５℃の条件下で、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間もしくはそれ以上の期間で安定して保存することができる。
【0026】
一実施形態において、本発明の液体製剤は、少なくとも２４ヶ月間安定に保存することができる。さらに別の実施形態において、本発明の液体製剤は、少なくとも４０℃で安定である。さらに別の実施形態において、本発明の液体製剤は、約２℃～８℃で少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは２４ヶ月間安定している。一実施形態において、本発明の液体製剤は、室温または例えば約２５℃で、少なくとも２ヶ月間、好ましくは少なくとも３ヶ月間、より好ましくは６ヶ月間安定している。さらに別の実施形態において、本発明の液体製剤は、約４０℃で少なくとも２週間、好ましくは少なくとも１ヶ月間安定している。
【0027】
一実施形態において、製剤の外観、可視異物、タンパク質含有量、濁度、純度、界面活性剤含有量、相対結合活性、かつ／または電荷変異体の変化を検出することにより、製剤の安定性を示すことができる。一実施形態において、高温ストレスの強制実験において、例えば４０℃±２℃で少なくとも１週間、２週間もしくは好ましくは１ヶ月間保存した後、または加速実験において、例えば２５℃±２℃で少なくとも１ヶ月間または２ヶ月間保存した後、または長期実験において、例えば５℃±３℃で少なくとも２ヶ月間または３ヶ月間保存した後、または振とう実験において（例えば室温、遮光、６５０ｒ／ｍｉｎの条件下で５日間振とうする）、かつ／または凍結融解実験において（例えば、－３０℃／室温で凍結融解を６回繰り返す）、本発明の液体製剤の安定性を検出することができる。一実施形態において、初期値、例えば保存０日目の初期値、または振とうや凍結融解実験前の初期値に対して、本発明の液体製剤の安定性を検出する。
【0028】
一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、目視で本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、本発明の液体製剤は外観で澄明から薄い乳白光まで保持しており、無色から薄い黄色の液体であり、かつ異物がない。一実施形態において、透明度測定器により目視で検査すると、製剤には可視異物がない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、タンパク質含有量の変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、例えば、紫外線分光光度（ＵＶ）法による場合、初期値に対して、タンパク質含有量の変化率は２０％を超えない、好ましくは１０％を超えない、例えば７％～８％であり、より好ましくは５％、２％もしくは１％を超えない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、本発明の液体製剤の濁度変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、例えばＯＤ３５０ｎｍ法により検出される場合、初期値に対して、変化値は０．０６を超えない、好ましくは０．０５を超えない、より好ましくは０．０４を超えない、０．０２を超えない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、本発明の液体製剤の純度変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、サイズ排除－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）による場合、初期値に対して、モノマーの純度の変化値（または主ピークの変化値）は１０％を超えない、例えば５％、４％または３％を超えない、例えば変化値は２％を超えない、好ましくは１％を超えない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、本発明の液体製剤の純度変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、非還元型ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法による場合、初期値に対して、モノマーの純度の変化値（または主ピークの変化値）の低下は１０％を超えない、例えば５％、４％、３％、２％もしくは１％を超えない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により、本発明の液体製剤の安定性を検出し、ここで、初期値に対して、抗体の電荷変異体（主成分、酸性成分および塩基性成分）の変化値の合計は５０％を超えない、例えば４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％を超えない、および／もしくは主成分の変化値は２０％、１５％、１０％、８％もしくは５％を超えない。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、直接ＥＬＩＳＡ法により、本発明の液体製剤の安定性を検出し、ここで、初期値に対して、抗体の相対結合活性は７０％～１３０％、例えば７０、８０、９０、９３、９５、９８、１００、１０３、１０５、１０８、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０％、好ましくは９０％～１１０％である。一実施形態において、保存後、または振とう実験後、または凍結融解実験後、高速液体クロマトグラフィー-蛍光検出法（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）により、ポリソルベート８０の含有量を検出し、ポリソルベート８０の含有量は、０．２ｍｇ／ｍＬ～０．８ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３ｍｇ／ｍＬ～０．７ｍｇ／ｍＬである。
【0029】
一実施形態において、本発明の液体製剤は、保存後、例えば２５℃で少なくとも２ヶ月間、または４０℃±２℃で１ヶ月間保存した後に安定であり、かつ好ましくは以下の特徴の１つまたは複数を有する：保存０日目の初期値に対して、
（ｉ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークの変化値が１％よりも小さく、かつ／または製剤が９６％よりも大きい純度、好ましくは９７％、もしくは９８％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉ）非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークの変化値が２％よりも小さく、及び／又は９６％よりも大きい純度、好ましくは９７％、もしくは９８％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉｉ）ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分および塩基性成分）の変化値の合計が４０％を超えない、かつ／または主成分の変化値が２０％を超えない、
例えば、４０℃±２℃で１ヶ月間保存した後、変化値の合計が約４０％を超えない（例えば、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％を超えない）、および／または主成分の変化値が２０％を超えない（例えば、１５％、１２％、１０％、８％を超えない）、または
例えば、２５℃で２ヶ月間保存した後、変化値の合計が約２０％を超えない（例えば、１５％、１４％、１３％、１２％を超えない）、または主成分の変化値が約１５％を超えない（例えば、１０％、８％、７％、６％、５％を超えない）、ならびに
（ｉｖ）ＥＬＩＳＡ法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の相対結合活性が７０％～１３０％、例えば、９０、９３、９５、９８、１００、１０３、１０５、１０８、１１０、１１５、１２０％であり、
一実施形態において、本発明の液体製剤は、保存後、例えば５℃±３℃で少なくとも６ヶ月間保存した後に安定であり、かつ好ましくは、以下の特徴の１つまたは複数を有する：
（ｉ）純度に関して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークは≧９５．０％であり、
（ｉｉ）純度に関して、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークは≧９０．０％であり、
（ｉｉｉ）電荷変異体に関して、ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、主成分は≧５８．０％であり、
（ｉｖ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の生物学的活性が７０％～１３０％であり、
（ｖ）ｐＨ値が５．８～６．４である。
（ｉ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークの変化値が１％よりも小さく、かつ／または製剤が９６％よりも大きい純度、好ましくは９７％、もしくは９８％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉ）非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークの変化値が２％よりも小さく、及び／又は９６％よりも大きい純度、好ましくは９７％、もしくは９８％よりも大きい純度を有し、
（ｉｉｉ）ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分および塩基性成分）の変化値の合計が４０％を超えない、かつ／または主成分の変化値が２０％を超えない、
例えば、４０℃±２℃で１ヶ月間保存した後、変化値の合計が約４０％を超えない（例えば、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％を超えない）、および／または主成分の変化値が２０％を超えない（例えば、１５％、１２％、１０％、８％を超えない）、または
例えば、２５℃で２ヶ月間保存した後、変化値の合計が約２０％を超えない（例えば、１５％、１４％、１３％、１２％を超えない）、または主成分の変化値が約１５％を超えない（例えば、１０％、８％、７％、６％、５％を超えない）、ならびに
（ｉｖ）ＥＬＩＳＡ法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の相対結合活性が７０％～１３０％、例えば、９０、９３、９５、９８、１００、１０３、１０５、１０８、１１０、１１５、１２０％であり、
一実施形態において、本発明の液体製剤は、保存後、例えば５℃±３℃で少なくとも６ヶ月間保存した後に安定であり、かつ好ましくは、以下の特徴の１つまたは複数を有する：
（ｉ）純度に関して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定される場合、主ピークは≧９５．０％であり、
（ｉｉ）純度に関して、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定される場合、主ピークは≧９０．０％であり、
（ｉｉｉ）電荷変異体に関して、ｉＣＩＥＦ法により測定される場合、主成分は≧５８．０％であり、
（ｉｖ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法により測定される場合、製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の生物学的活性が７０％～１３０％であり、
（ｖ）ｐＨ値が５．８～６．４である。
【0030】
一態様において、本発明の液体製剤は医薬製剤であり、好ましくは注射剤であり、より好ましくは皮下注射剤もしくは静脈内注射剤である。一実施形態において、前記液体製剤は静脈内輸液剤である。
【0031】
別の態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤に対して固化処理を行うことで得られる固体抗体製剤を提供する。前記固化処理は、例えば、結晶法、噴霧乾燥法または冷凍乾燥法により実施される。好ましい一実施形態において、前記固体抗体製剤は、例えば、注射用凍結乾燥粉末の形態である。固体抗体製剤は、使用前に適切な溶媒に再構成されることにより、本発明の再構成製剤を形成することができる。前記再構成製剤も、本発明の液体抗体製剤である。一実施形態において、前記適切な溶媒は、注射用水、注射用有機溶媒から選択され、注射用油、エタノール、プロピレングリコールなど、もしくはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0032】
一態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤を含む送達装置を提供する。一実施形態において、本発明の送達装置は、本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤を含む薬剤充填済み注射器の形態で提供され、例えば、静脈内、皮下、皮内もしくは筋肉内注射、静脈内注入に用いられる。
【0033】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤を対象に投与するステップを含むＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を、例えば哺乳類などの対象に送達する方法を提供し、前記送達は、例えば、薬剤充填済み注射器を利用する送達装置により実施される。
【0034】
さらに別の態様において、本発明は、ＬＡＧ－３とＰＤ－Ｌ１シグナル経路を同時に標的として、腫瘍を治療または予防する送達装置、薬剤充填済み注射器もしくは医薬を製造するための、本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤の使用を提供し、前記腫瘍は、例えば結腸がん、結腸直腸がんもしくは直腸がんなどの胃腸管のがんを含むが、これに限定されない。
【0035】
本発明は、対象に本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤または当該液体抗体製剤もしくは固体抗体製剤を含む送達装置（例えば、薬剤充填済み注射器）または医薬を投与することにより、対象においてＬＡＧ－３かつ／またはＰＤ－Ｌ１シグナル経路を阻害してＬＡＧ－３かつ／またはＰＤ－Ｌ１の免疫抑制作用を低減または排除する方法をさらに提供する。
【0036】
本発明は、対象に本発明の液体抗体製剤または固体抗体製剤または当該液体抗体製剤もしくは固体抗体製剤を含む送達装置（例えば、薬剤充填済み注射器）または医薬を投与することにより、対象の疾患、例えば上記腫瘍を治療する方法をさらに提供する。
【0037】
本発明の他の実施形態は、後述する詳細な説明を参照することにより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
以下の図面と合わせて読めば、次に詳細に記載される本発明の好ましい実施形態がより良く理解される。本発明を説明するために、図面には現在の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の精確な配置と手段に限定されないと理解すべきである。
【図1】本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３の二重特異性抗体構造である。
【図2】処方スクリーニング実験純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）の変化トレンド図（４０℃±２℃）である。
【図3】処方スクリーニング実験濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）の変化トレンド図（４０℃±２℃）である。
【図4】処方スクリーニング実験電荷変異体－酸性成分（ｉＣＩＥＦ法）の変化傾向図（４０℃±２℃）である。
【図5】処方スクリーニング実験電荷変異体－主成分（ｉＣＩＥＦ法）の変化トレンド図（４０℃±２℃）である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明を詳しく説明するに先立ち、前記方法および条件は変更可能であるため、本発明は、本明細書における特定の方法および実験条件に限定されないと理解しておくべきである。なお、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定する意図はない。
【0040】
定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられるすべての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記用語を定義する。
別に定義しない限り、本明細書に用いられるすべての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記用語を定義する。
【0041】
「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。
【0042】
「かつ／または」という用語は、２つまたは複数のオプションの接続に使用される場合、オプションのうちのいずれか１項またはオプションのうちのいずれか２項もしくは複数項を指すと理解すべきである。
【0043】
本明細書に使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「含む」ことが言及される場合、当該具体的な配列からなる抗体可変領域を含むことも意図する。
【0044】
本明細書において、「抗体」という用語は、抗原結合部位を含むタンパク質を指すように最も広い意味で使用され、様々な構造の天然抗体および人工抗体を包含し、無傷抗体および抗体の抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。
【0045】
「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」および「無傷抗体」という用語は、ジスルフィド結合を介して互いに接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む天然に存在する糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、間に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））が介在している超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）にさらに分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列されている。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示している。
【0046】
「抗体製剤」という用語は、活性成分としての抗体の生物活性が効果的に発揮できる形態であるとともに、当該製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。このような抗体製剤は通常、滅菌のものである。通常、抗体製剤には、薬学的に許容可能な賦形剤が含まれる。「薬学的に許容可能な」賦形剤は、製剤に使用される活性成分の有効投与量が対象に送達できるように、被験哺乳動物に適当に投与可能な試薬である。賦形剤の濃度は、投与方式に対応し、例えば、注射に許容可能な濃度であってもよい。
【0047】
「ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体製剤」という用語は、本明細書で「本発明の抗体製剤」とも略称され、活性成分とするＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質と薬学的に受容可能な賦形剤とを含む調製物を指す。ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質と薬学的に受容可能な賦形剤を組合せた後、活性成分とするＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質はヒトまたは非ヒト動物に対する治療用または予防用投与に適する。本発明の抗体製剤は、例えば、すぐに使用できる薬剤充填済み注射器のような水性形態の液体製剤に調製されてもよく、または、使用直前に生理的に許容可能な溶液に溶解かつ／または懸濁させることで再構成（すなわち、再溶解）される凍結乾燥製剤に調製されてもよい。幾つかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質製剤は液体製剤形態である。
【0048】
「安定な」抗体製剤は、製剤における抗体が特定条件下で保存された後、または振とうされた後、または繰り返し凍結融解された後に許容可能な程度の物理的安定性かつ／または化学的安定性を保持しているものを指す。抗体製剤に含まれる抗体は保存、振とうまたは繰り返し凍結融解の後にその化学構造を１００％維持できない可能性があるが、通常、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％の抗体の構造または機能が維持されると、抗体製剤が「安定」であると考えられる。幾つかの具体的な実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質製剤は、製造、調製、輸送と長期保存中に検出されないほど低い抗体の凝集または分解または化学的修飾を示すため、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質の生物活性の損失が非常に少なく、またはなく、高い安定性を示している。幾つかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質は保存、振とうかつ／または繰り返し凍結融解の後に、その物理的または化学的安定性を実質的に保持している。好ましくは、本発明の液体製剤は、室温または４０℃で少なくとも２週間安定し、かつ／または２５℃で少なくとも２ヶ月間安定し、かつ／または２℃～８℃で少なくとも６ヶ月間安定することができる。
【0049】
この分野では、タンパク質の安定性の測定に使用できる解析技術が複数知られており、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７-３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ（１９９１）ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９-９０（１９９３）を参照する。選定された温度および選定された保存時間で安定性を測定することができる。例えば、予期される製剤の貯蔵期間に基づいて保存時間を選択することができる。場合により、加速安定性試験を使用することができる。幾つかの実施形態において、抗体製剤に対して種々のストレス試験を実施することで安定性試験が行われる。これらの試験は、製造、保存または輸送期間に調製された抗体製剤の遭遇可能な苛酷条件を表してもよく、非製造、保存または輸送期間に抗体製剤における抗体の不安定性を加速可能な条件を表してもよい。例えば、高温苛酷における抗体安定性を測定するために、調製されたＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質製剤をガラス瓶に充填することができる。
【0050】
一定期間の保存後、または一定期間の振とう後または複数回の繰り返し凍結融解後に、製剤は、凝集、沈殿、混濁かつ／または変性を示さず、または非常に少ない凝集、沈殿、混濁かつ／または変性を示していると、抗体が製剤において「その物理的安定性を保持している」と考えることができる。製剤における抗体の凝集により、患者の免疫反応を潜在的に増加させ、安全性の問題を引き起こすがあり得る。したがって、製剤における抗体の凝集を最小化するか、または凝集を防止する必要がある。光散乱法は、製剤における可視凝集物の測定に用いることができる。ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、製剤における可溶性凝集物の測定に用いることができる。また、目視で製剤の外観、色かつ／または清澄度を検査し、ＯＤ３５０ｎｍ法により製剤の濁度を検出し、あるいは非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により製剤の純度を測定することで、製剤の安定性を示すことができる。一実施形態において、特定の温度で特定の期間保存した後、または振とうした後または繰り返し凍結融解した後の製剤における抗体モノマーの百分率を測定することにより、製剤の安定性を測定し、ここで、製剤における抗体モノマーの百分率が大きいほど、製剤の安定性が高くなる。
【0051】
「許容可能な程度の」物理的安定性は、特定の温度で特定の時間保存した後、振とうした後または繰り返し凍結融解した後に、製剤において少なくとも約９０％のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質モノマーが検出されることを示すことができる。幾つかの実施形態において、特定の温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月もしくはそれ以上の期間保存した後、許容可能な程度の物理的安定性は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質モノマーを示す。物理的安定性を評価する場合に、医薬製剤を保存する特定の温度は、約－８０℃～約４５℃のいずれか１つの温度であってもよく、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃～８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃もしくは約４５℃で保存する。例えば、約４０℃±２℃で１ヶ月間または４週間保存した後、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤は、安定であると見なされる。約２５℃で２ヶ月保存した後に、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤が安定的であると考えられる。約５℃で６ヶ月間保存した後、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤は、安定であると見なされる。
【0052】
一定期間の保存後、または一定期間の振とう後または複数回の繰り返し凍結融解後に、製剤における抗体が顕著な化学的変化を示さないと、抗体が製剤において「その化学的安定性を保持している」と考えることができる。化学的不安定性のほとんどは、抗体の共有結合修飾形態（例えば、抗体の電荷変異体）が形成されたことに由来する。例えば、アスパラギン酸異性化、ＮおよびＣ末端修飾により塩基性変異体を形成することができ、脱アミド化、シアル酸化および糖化により酸性変異体を形成することができる。化学的安定性は、抗体の化学的変化形態を検出かつ／または定量することで評価することができる。例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）またはイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により、製剤における抗体の電荷変異体を検出することができる。一実施形態において、特定の温度で特定の時間保存した後、または振とう後または複数回の繰り返し凍結融解後に、製剤における抗体の電荷変異体の百分率の変化値を測定することにより、製剤の安定性を測定し、ここで、当該変化値が小さいほど、製剤の安定性が高くなる。
【0053】
「許容可能な程度」の化学的安定性は、特定の温度で特定の時間保存した後、または一定時間の振とう後または複数回の繰り返し凍結融解後に、製剤における電荷変異体（例えば、主成分または酸性成分または塩基性成分）の百分率の変化値が４０％を超えない、例えば３０％を超えない、２０％を超えない、または電荷変異体（主成分、酸性成分および塩基性成分）の百分率変化値の合計が６０％を超えない、例えば５０％を超えない、３０％を超えない、または主成分含有量が５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上であることを示すことができる。幾つかの実施形態において、特定の温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間もしくはそれ以上の期間保存した後、許容可能な程度の化学的安定性は、主成分である電荷変異体の百分率の変化値が約５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１５％以下、または電荷変異体の百分率変化値の合計が約６０％、５０％もしくは３０％以下であることを示すことができる。化学的安定性を評価する場合に、医薬製剤を保存する温度は、約－８０℃～約４５℃のいずれか１つの温度であってもよく、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃～８℃、約５℃、約２５℃もしくは約４５℃で保存する。例えば、５℃で２４ヶ月間保存した後、主成分である電荷変異体の百分率の変化値が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％もしくは０．１％未満であると、医薬製剤は、安定的であると見なすことができる。２５℃で２ヶ月間保存した後、主成分である電荷変異体の百分率の変化値が約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％もしくは０．１％未満であると、医薬製剤は、安定的であると見なすこともできる。４０℃で１ヶ月間保存した後、主成分である電荷変異体の百分率の変化値が約５０％、４０％、３０％、２０％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、５％もしくは４％未満であると、医薬製剤は、安定的であると見なすこともできる。
【0054】
「凍結乾燥製剤」という用語は、液体製剤の冷凍乾燥処理により得られ、または取得可能な組成物を指す。好ましくは、それは５％よりも少ない、好ましくは３％よりも少ない水含有量を有する固体組成物である。
【0055】
「再構成製剤」という用語は、固体製剤（例えば、凍結乾燥製剤）を生理的に許容可能な溶液に溶解かつ／または懸濁させることで得られた液体製剤を指す。
【0056】
本明細書で使用される「室温」という用語は、１５℃～３０℃、好ましくは２０℃～２７℃、より好ましくは２５℃の温度を指す。
【0057】
「ストレス条件」とは、例えば、高温、振とうおよび凍結融解など、許容できない抗体タンパク質の不安定化をもたらす、化学的かつ／または物理的に抗体タンパク質に不利な環境を指す。「高温ストレス」は、抗体製剤を室温またはそれ以上の温度（例えば４０℃±２℃）で置いて一定期間保存することを指す。高温ストレス加速試験によって、抗体製剤の安定性を検査することができる。
【0058】
本明細書に使用されるように、「非経口投与」という用語は、経腸および局所投与以外の投与方法を指し、通常、注射もしくは注入によるものであり、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、嚢下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外と胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の安定的なＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質製剤が対象に非経口投与される。一実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質製剤が皮下、皮内、筋肉内もしくは静脈内注射方法により対象に投与される。
【0059】
Ｉ．抗体製剤
本発明は、（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）安定化剤と、（ｉｖ）界面活性剤とを含む安定な液体抗体製剤を提供する。前記抗体製剤は、約５．５～６．５のｐＨを有する。好ましくは、当該液体抗体製剤は、（ｖ）キレート剤をさらに含む。好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は注射製剤形態である。
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体
本発明の抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、ＰＣＴ出願号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４（国際出願日：２０２０年１月２３日）に開示された二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰである。一実施形態において、当該ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞の組換え発現により産生される。好ましくは、本発明の液体製剤における前記抗体は、顕著な抗腫瘍活性を示している。例えば、ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担がんマウスモデルにおいて、本発明の抗体製剤を投与することにより、顕著な腫瘍抑制効果を生成することができる。
本発明の抗体製剤に含まれる抗体またはその抗原結合断片の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境、および製剤が使用される特定の目的によって変化することができる。幾つかの実施形態において、抗体製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体を含むことができる液体製剤であり、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
本発明は、（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）安定化剤と、（ｉｖ）界面活性剤とを含む安定な液体抗体製剤を提供する。前記抗体製剤は、約５．５～６．５のｐＨを有する。好ましくは、当該液体抗体製剤は、（ｖ）キレート剤をさらに含む。好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は注射製剤形態である。
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体
本発明の抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、ＰＣＴ出願号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４（国際出願日：２０２０年１月２３日）に開示された二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰである。一実施形態において、当該ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞の組換え発現により産生される。好ましくは、本発明の液体製剤における前記抗体は、顕著な抗腫瘍活性を示している。例えば、ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担がんマウスモデルにおいて、本発明の抗体製剤を投与することにより、顕著な腫瘍抑制効果を生成することができる。
本発明の抗体製剤に含まれる抗体またはその抗原結合断片の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境、および製剤が使用される特定の目的によって変化することができる。幾つかの実施形態において、抗体製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体を含むことができる液体製剤であり、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体は、２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、より好ましくは、約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【0060】
（ｉｉ）緩衝剤
緩衝剤は、溶液のｐＨを許容可能な範囲に維持することができる試薬である。幾つかの実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、本発明の製剤を約５．５～６．５のｐＨ範囲に制御することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の製剤は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝系、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝系、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝系、リン酸塩緩衝系から選択される緩衝系を含み、好ましくはヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝系である。
幾つかの実施形態において、本発明の製剤に使用される緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤であり、特にヒスチジンとヒスチジン塩酸塩とからなる緩衝系である。
緩衝剤は、溶液のｐＨを許容可能な範囲に維持することができる試薬である。幾つかの実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、本発明の製剤を約５．５～６．５のｐＨ範囲に制御することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の製剤は、ヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝系、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝系、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝系、リン酸塩緩衝系から選択される緩衝系を含み、好ましくはヒスチジン－ヒスチジン塩酸塩緩衝系である。
幾つかの実施形態において、本発明の製剤に使用される緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤であり、特にヒスチジンとヒスチジン塩酸塩とからなる緩衝系である。
【0061】
（ｉｉｉ）安定化剤
本発明に使用される適切な安定化剤は、糖類、ポリオール、アミノ酸およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。安定化剤としての糖類は、スクロース、トレハロース、マルトースおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。安定化剤としてのポリオールは、ソルビトール、マンニトールおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。安定化剤としてのアミノ酸は、アルギニン、アルギニン塩酸塩、メチオニン、グリシン、プロリンおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の液体製剤はアルギニンを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤はアルギニンとソルビトールとの組み合わせを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースとアルギニンとの組み合わせを安定化剤として含む。
一実施形態において、前記アルギニンはアルギニン塩酸塩である。
本発明に使用される適切な安定化剤は、糖類、ポリオール、アミノ酸およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。安定化剤としての糖類は、スクロース、トレハロース、マルトースおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。安定化剤としてのポリオールは、ソルビトール、マンニトールおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。安定化剤としてのアミノ酸は、アルギニン、アルギニン塩酸塩、メチオニン、グリシン、プロリンおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の液体製剤はアルギニンを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤はアルギニンとソルビトールとの組み合わせを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースを安定化剤として含む。
一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースとアルギニンとの組み合わせを安定化剤として含む。
一実施形態において、前記アルギニンはアルギニン塩酸塩である。
【0062】
（ｉｖ）界面活性剤
本明細書に使用されるように、「界面活性剤」という用語は、両親媒性構造を有する有機物質を指し、すなわち、それらは、反対の溶解性傾向を持つ基からなり、通常、油溶性の炭化水素鎖および水溶性のイオン基からなる。
一実施形態において、本発明の液体製剤における界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、アルキルポリ（オキシレン）である。本発明の製剤に包含可能な特定の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、もしくはポリソルベート４０のようなポリソルベート、およびポロキサマーなどを含む。好ましい一実施形態において、本発明の液体製剤は、ポリソルベート－８０を界面活性剤として含む。
幾つかの実施形態において、本発明の液体製剤に使用可能な界面活性剤は、ポリソルベート系界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ポロキサマーおよびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体製剤に含まれる界面活性剤の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境、および製剤が使用される特定の目的によって変化することができる。
本明細書に使用されるように、「界面活性剤」という用語は、両親媒性構造を有する有機物質を指し、すなわち、それらは、反対の溶解性傾向を持つ基からなり、通常、油溶性の炭化水素鎖および水溶性のイオン基からなる。
一実施形態において、本発明の液体製剤における界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、アルキルポリ（オキシレン）である。本発明の製剤に包含可能な特定の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、もしくはポリソルベート４０のようなポリソルベート、およびポロキサマーなどを含む。好ましい一実施形態において、本発明の液体製剤は、ポリソルベート－８０を界面活性剤として含む。
幾つかの実施形態において、本発明の液体製剤に使用可能な界面活性剤は、ポリソルベート系界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ポロキサマーおよびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体製剤に含まれる界面活性剤の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境、および製剤が使用される特定の目的によって変化することができる。
【0063】
（ｖ）他の賦形剤
本発明の抗体液体製剤には、場合により他の賦形剤が含まれる。前記他の賦形剤は、例えば、抗微生物剤、静電防止剤、酸化防止剤、キレート剤、ゼラチンなどを含む。これらの賦形剤、その他の既知の医薬賦形剤、かつ／または本発明の製剤に適用される添加剤は、この分野で公知されているものであり、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第４版、Ｒｏｗｅら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （２００３）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２００５）」に挙げられたものである。
本明細書で用いられるように、「キレート剤」という用語は、中心原子とキレートを形成できることを意味し、キレートの生成により錯体の安定性が大幅に向上する。
一実施形態において、本発明の液体製剤におけるキレートは、カルボン酸型キレート剤である。一実施形態において、前記キレート剤は、エデト酸二ナトリウム、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシンから選択される。一実施形態において、前記キレート剤はエデト酸二ナトリウムから選択される。
本発明の抗体液体製剤には、場合により他の賦形剤が含まれる。前記他の賦形剤は、例えば、抗微生物剤、静電防止剤、酸化防止剤、キレート剤、ゼラチンなどを含む。これらの賦形剤、その他の既知の医薬賦形剤、かつ／または本発明の製剤に適用される添加剤は、この分野で公知されているものであり、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第４版、Ｒｏｗｅら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （２００３）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２００５）」に挙げられたものである。
本明細書で用いられるように、「キレート剤」という用語は、中心原子とキレートを形成できることを意味し、キレートの生成により錯体の安定性が大幅に向上する。
一実施形態において、本発明の液体製剤におけるキレートは、カルボン酸型キレート剤である。一実施形態において、前記キレート剤は、エデト酸二ナトリウム、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシンから選択される。一実施形態において、前記キレート剤はエデト酸二ナトリウムから選択される。
【0064】
ＩＩ．製剤の調製
本発明は、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を含む安定な製剤を提供する。本発明の製剤に使用されるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質は、抗体を生産するための当該分野で既知の技術により調製されてもよい。例えば、抗体を組換えによって調製することができる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、２９３細胞またはＣＨＯ細胞において組換えによって調製される。
現在、抗体は、医薬の活性成分として幅広く適用されている。治療用抗体を薬用レベルまで精製するための技術は、この分野で公知されているものである。例えば、Ｔｕｇｃｕら（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９９（２００８）５９９-６１３．）により、タンパク質Ａ捕捉ステップの後にイオン交換クロマトグラフィー（アニオンＩＥＸかつ／またはカチオンＣＥＸクロマトグラフィー）を利用するモノクローナル抗体の３カラム精製方法が記載されている。Ｋｅｌｌｅｙら（Ｗｅａｋ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０１（２００８）５５３-５６６）により、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーの後に弱分配性アニオン交換樹脂を利用する２カラム精製方法が記載されている。
本発明は、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を含む安定な製剤を提供する。本発明の製剤に使用されるＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質は、抗体を生産するための当該分野で既知の技術により調製されてもよい。例えば、抗体を組換えによって調製することができる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、２９３細胞またはＣＨＯ細胞において組換えによって調製される。
現在、抗体は、医薬の活性成分として幅広く適用されている。治療用抗体を薬用レベルまで精製するための技術は、この分野で公知されているものである。例えば、Ｔｕｇｃｕら（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９９（２００８）５９９-６１３．）により、タンパク質Ａ捕捉ステップの後にイオン交換クロマトグラフィー（アニオンＩＥＸかつ／またはカチオンＣＥＸクロマトグラフィー）を利用するモノクローナル抗体の３カラム精製方法が記載されている。Ｋｅｌｌｅｙら（Ｗｅａｋ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０１（２００８）５５３-５６６）により、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーの後に弱分配性アニオン交換樹脂を利用する２カラム精製方法が記載されている。
【0065】
一般的に、組換えにより産生されたモノクローナル抗体は、抗体製剤調製用の十分な繰り返し性および適切な純度を有する医薬物質を提供するために、通常の精製方法により精製することができる。例えば、抗体が組換え発現細胞から培地に分泌された後、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎの限外ろ過装置により、当該発現系からの上清液を濃縮することができる。その後、例えば、クロマトグラフィー、透析と親和性精製などの方法により抗体の精製を行うことができる。タンパク質Ａは、親和性リガンドとしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４型抗体の精製に適用される。例えば、イオン交換クロマトグラフィーなど、他の抗体精製方法を使用してもよい。十分な純度の抗体を得た後に、当該分野で既知の方法により、抗体が含まれる製剤を調製することができる。
例えば、（１）発酵終了後、上清が得られるように発酵液を遠心分離して清澄化させて細胞などの不純物を除去するステップと、（２）親和性クロマトグラフィー（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４型抗体に対して特異的な親和性を有するタンパク質Ａカラム）により抗体を捕捉するステップと、（３）ウィルスの不活化を行うステップと、（４）（一般的にＣＥＸカチオン交換クロマトグラフィーを採用することができる）精製することにより、タンパク質における不純物を除去するステップと、（５）（ウイルス力価を例えば４ｌｏｇ１０以上低減させるように）ウィルスをろ過するステップと、（６）（タンパク質をその安定性に寄与する製剤緩衝液に置換して注射用に適切な濃度に濃縮するために用いることができる）限外ろ過／浸透ろ過するステップと、により調製することができる。例えば、Ｂ．Ｍｉｎｏｗ、Ｐ．Ｒｏｇｇｅ、Ｋ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．６、２０１２、ｐｐ．４８～５７を参照する。
例えば、（１）発酵終了後、上清が得られるように発酵液を遠心分離して清澄化させて細胞などの不純物を除去するステップと、（２）親和性クロマトグラフィー（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４型抗体に対して特異的な親和性を有するタンパク質Ａカラム）により抗体を捕捉するステップと、（３）ウィルスの不活化を行うステップと、（４）（一般的にＣＥＸカチオン交換クロマトグラフィーを採用することができる）精製することにより、タンパク質における不純物を除去するステップと、（５）（ウイルス力価を例えば４ｌｏｇ１０以上低減させるように）ウィルスをろ過するステップと、（６）（タンパク質をその安定性に寄与する製剤緩衝液に置換して注射用に適切な濃度に濃縮するために用いることができる）限外ろ過／浸透ろ過するステップと、により調製することができる。例えば、Ｂ．Ｍｉｎｏｗ、Ｐ．Ｒｏｇｇｅ、Ｋ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．６、２０１２、ｐｐ．４８～５７を参照する。
【0066】
ＩＩＩ．製剤の解析方法
バイオ製品の安定性研究は、一般的に、実際の保存条件下でのリアルタイム安定性研究（長期安定性研究）、加速安定性研究および強制条件試験研究を含む。安定性研究は、研究目的および製品自身の特性に基づいて研究条件を模索し最適化し、様々な影響因子（例えば、温度、繰り返し凍結融解、振動など）に対して、長期、加速かつ／または強制条件試験などの安定性研究計画を策定すべきである。加速および強制条件試験は、保存条件から短期的に逸脱された場合および極端な場合での製品の安定性状況を把握すると共に、有効期間および保存条件の決定のために裏付けデータを提供することに役立つ。
抗体製剤の保存、振とうまたは繰り返し凍結融解の過程において、抗体は凝集、分解または化学的修飾が生じることで、抗体不均一性（サイズ不均一性および電荷不均一性を含む）および凝集物と断片などにつながり、抗体製剤の品質に影響を与える恐れがある。したがって、抗体製剤の安定性を監視する必要がある。
この分野では、抗体製剤の安定性の検出に利用可能な方法が複数知られている。例えば、還元型ＣＥ－ＳＤＳ、非還元型ＣＥ－ＳＤＳとＳＥＣ－ＨＰＬＣなどの方法により、抗体製剤の純度を解析して抗体の凝集レベルを評価することができ、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）とイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）などにより、抗体製剤における電荷変異体を解析することができる。なお、製剤の外観を目視で検出することにより、製剤の安定性を迅速に判断することができる。ＯＤ３５０ｎｍ法により製剤の濁度変化を測定することもできるが、当該方法は可溶性および不溶性凝集物の量に関する情報を示すことができる。なお、紫外線分光光度法（ＵＶ法）により、製剤におけるタンパク質含有量の変化を検出することができる。
バイオ製品の安定性研究は、一般的に、実際の保存条件下でのリアルタイム安定性研究（長期安定性研究）、加速安定性研究および強制条件試験研究を含む。安定性研究は、研究目的および製品自身の特性に基づいて研究条件を模索し最適化し、様々な影響因子（例えば、温度、繰り返し凍結融解、振動など）に対して、長期、加速かつ／または強制条件試験などの安定性研究計画を策定すべきである。加速および強制条件試験は、保存条件から短期的に逸脱された場合および極端な場合での製品の安定性状況を把握すると共に、有効期間および保存条件の決定のために裏付けデータを提供することに役立つ。
抗体製剤の保存、振とうまたは繰り返し凍結融解の過程において、抗体は凝集、分解または化学的修飾が生じることで、抗体不均一性（サイズ不均一性および電荷不均一性を含む）および凝集物と断片などにつながり、抗体製剤の品質に影響を与える恐れがある。したがって、抗体製剤の安定性を監視する必要がある。
この分野では、抗体製剤の安定性の検出に利用可能な方法が複数知られている。例えば、還元型ＣＥ－ＳＤＳ、非還元型ＣＥ－ＳＤＳとＳＥＣ－ＨＰＬＣなどの方法により、抗体製剤の純度を解析して抗体の凝集レベルを評価することができ、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）とイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）などにより、抗体製剤における電荷変異体を解析することができる。なお、製剤の外観を目視で検出することにより、製剤の安定性を迅速に判断することができる。ＯＤ３５０ｎｍ法により製剤の濁度変化を測定することもできるが、当該方法は可溶性および不溶性凝集物の量に関する情報を示すことができる。なお、紫外線分光光度法（ＵＶ法）により、製剤におけるタンパク質含有量の変化を検出することができる。
【0067】
ＩＶ．製剤の使用
ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を含む本発明の抗体製剤は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、腫瘍などの疾患を予防または治療するために用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）または感染である。幾つかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、または直腸がんである。
本発明は、哺乳動物にＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を送達するための医薬の調製における本発明の製剤の使用も提供する。本発明は、本発明の製剤を１つまたは複数の上記疾患および障害の治療または予防に使用する方法をさらに提供する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
様々な経路で本発明の抗体製剤を対象または患者に投与することができる。例えば、投与は、注入もしくは注射器により行われてもよい。したがって、一態様において、本発明は、本発明の抗体製剤（例えば、薬剤充填済み注射器）を含む送達装置（例えば、注射器）を提供する。患者は、主な活性成分としてＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を、有効量、すなわち疾病または病的状態を治療、改善または予防するのに十分な量で受ける。
本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。
ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を含む本発明の抗体製剤は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、腫瘍などの疾患を予防または治療するために用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）または感染である。幾つかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、または直腸がんである。
本発明は、哺乳動物にＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を送達するための医薬の調製における本発明の製剤の使用も提供する。本発明は、本発明の製剤を１つまたは複数の上記疾患および障害の治療または予防に使用する方法をさらに提供する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
様々な経路で本発明の抗体製剤を対象または患者に投与することができる。例えば、投与は、注入もしくは注射器により行われてもよい。したがって、一態様において、本発明は、本発明の抗体製剤（例えば、薬剤充填済み注射器）を含む送達装置（例えば、注射器）を提供する。患者は、主な活性成分としてＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体タンパク質を、有効量、すなわち疾病または病的状態を治療、改善または予防するのに十分な量で受ける。
本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。
【0068】
【表3】
【0069】
当該完全ヒト化抗体の長期安定保存に適用され、かつ簡単で使いやすい注射剤の製剤処方を開発するために、４０℃強制および２５℃加速安定性実験により、当該抗体の品質に対する異なる製剤処方の影響を考察した結果、その安定に有利な製剤処方をスクリーニングした。パイロット規模で長期安定性研究（５℃±３℃）により処方の有効性を証明する。研究全体で使用される材料および方法は、以下の通りである。
【0070】
材料および方法
【表4】
【表5】
【0071】
１．３．製剤安定性の検出項目および検出方法
研究全体において、検出項目は、主に、（１）外観および可視異物の存在の有無を検出すること、（２）紫外線（ＵＶ法）により製剤におけるタンパク質含有量を測定すること、（３）ＯＤ３５０ｎｍ法により製剤の濁度を検出すること、（４）サイズ排除－高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピークの面積の和に対する主ピークの面積の百分率で示すこと、（５）非還元型ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピークの面積の和に対する主ピークの面積の百分率で示すこと、（６）ｉＣＩＥＦ法により抗体製剤における電荷変異体を測定し、主成分、酸性成分および塩基性成分の百分率で示すこと、（７）直接ＥＬＩＳＡ測定法により抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３抗原に対するＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３二重抗体の相対結合活性を測定するか、またはルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法により抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３抗原に対するＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３二重抗体の生物学的活性を測定すること、（８）ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法によりポリソルベート８０含有量を検出すること、を含む。
研究全体において、検出項目は、主に、（１）外観および可視異物の存在の有無を検出すること、（２）紫外線（ＵＶ法）により製剤におけるタンパク質含有量を測定すること、（３）ＯＤ３５０ｎｍ法により製剤の濁度を検出すること、（４）サイズ排除－高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピークの面積の和に対する主ピークの面積の百分率で示すこと、（５）非還元型ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピークの面積の和に対する主ピークの面積の百分率で示すこと、（６）ｉＣＩＥＦ法により抗体製剤における電荷変異体を測定し、主成分、酸性成分および塩基性成分の百分率で示すこと、（７）直接ＥＬＩＳＡ測定法により抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３抗原に対するＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３二重抗体の相対結合活性を測定するか、またはルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法により抗体製剤におけるＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３抗原に対するＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３二重抗体の生物学的活性を測定すること、（８）ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法によりポリソルベート８０含有量を検出すること、を含む。
【0072】
可視異物の検出
国家薬典委員会、中華人民共和国薬典（２０１５年版、四部通則０９０４「可視異物検査法」、北京：中国医薬科技出版社、２０１５）に記載される方法に従い、透明度測定器（天津天大天発製、型番ＹＢ－２）および不溶性微粒子検出器（天津天大発製、型番ＧＷＪ－８により、試料における可視異物を検査した。
国家薬典委員会、中華人民共和国薬典（２０１５年版、四部通則０９０４「可視異物検査法」、北京：中国医薬科技出版社、２０１５）に記載される方法に従い、透明度測定器（天津天大天発製、型番ＹＢ－２）および不溶性微粒子検出器（天津天大発製、型番ＧＷＪ－８により、試料における可視異物を検査した。
【0073】
タンパク質含有量の測定
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶー１８００）またはマルチチャンネル微量分光光度計（アメリカＴｈｅｒｍｏ製、型番Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００）により、試料におけるタンパク質含有量を測定した。
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶー１８００）またはマルチチャンネル微量分光光度計（アメリカＴｈｅｒｍｏ製、型番Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００）により、試料におけるタンパク質含有量を測定した。
【0074】
濁度の測定
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶ－１８００）により、３５０ｎｍにおける試料の吸光度を測定し、試料の濁度を決定した。
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶ－１８００）により、３５０ｎｍにおける試料の吸光度を測定し、試料の濁度を決定した。
【0075】
純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）
サイズ排除－クロマトグラフィカラムにより分離し、流動相がリン酸塩緩衝液（３．１２ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物、８．７７ｇの塩化ナトリウムと３４．８４ｇのアルギニンを秤量し、超純水で溶解した後に塩酸でｐＨを６．８に調節して１０００ｍＬに定容した）であり、クロマトグラフィーカラム保護液が０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３であり、注入量が５０μＬであり、流速が０．５ｍＬ／分であり、採取時間が３０分間であり、カラム温度が２５℃であり、検出波長が２８０ｎｍである。測定試料を試料希釈剤（０．８５ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、０．９７ｍｇ／ｍＬのヒスチジン塩酸塩、３５．１１ｍｇ／ｍＬのアルギニン塩酸塩、０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、０．１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０）で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、供試品溶液とする。製剤緩衝液を取って上記と同様に希釈した後、ブランク溶液とした。ブランク溶液、供試品溶液をそれぞれ５０μＬ取って液体クロマトグラフに注入し、検出を開始した。
サイズ排除－クロマトグラフィカラムにより分離し、流動相がリン酸塩緩衝液（３．１２ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物、８．７７ｇの塩化ナトリウムと３４．８４ｇのアルギニンを秤量し、超純水で溶解した後に塩酸でｐＨを６．８に調節して１０００ｍＬに定容した）であり、クロマトグラフィーカラム保護液が０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３であり、注入量が５０μＬであり、流速が０．５ｍＬ／分であり、採取時間が３０分間であり、カラム温度が２５℃であり、検出波長が２８０ｎｍである。測定試料を試料希釈剤（０．８５ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、０．９７ｍｇ／ｍＬのヒスチジン塩酸塩、３５．１１ｍｇ／ｍＬのアルギニン塩酸塩、０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、０．１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０）で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、供試品溶液とする。製剤緩衝液を取って上記と同様に希釈した後、ブランク溶液とした。ブランク溶液、供試品溶液をそれぞれ５０μＬ取って液体クロマトグラフに注入し、検出を開始した。
【0076】
純度（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）
キャピラリーゲル電気泳動法により検出した。キャピラリーはコーティングのないキャピラリーであり、内径が５０μｍであり、全長が３０．２ｃｍであり、有効長が２０．２ｃｍである。電気泳動前にそれぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。測定試料をｐＨ６．５の希釈剤（ｐＨ６．５のクエン酸-リン酸塩緩衝液を２００μＬ吸引して４００μＬの１０％のドデシル硫酸ナトリウムに加え、水を加えて１mLに定容する）で０．６ｍｇ／ｍＬに希釈する。希釈した後の試料９５μＬを取り、ここで、還元型試料にβ－メルカプトエタノール５μＬを加え、非還元型試料に２５０ｍｍｏｌ／ＬのＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）を５μＬ加え、十分に混合した後に７０℃条件で１０分間加熱し、冷却した後に試料管に移した。サンプリング電圧は、いずれも-５ｋＶであり、サンプリング時間は、いずれも２０秒であり、分離電圧は、いずれも-１２ｋＶであり、解析時間は、いずれも２５分間である。
キャピラリーゲル電気泳動法により検出した。キャピラリーはコーティングのないキャピラリーであり、内径が５０μｍであり、全長が３０．２ｃｍであり、有効長が２０．２ｃｍである。電気泳動前にそれぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。測定試料をｐＨ６．５の希釈剤（ｐＨ６．５のクエン酸-リン酸塩緩衝液を２００μＬ吸引して４００μＬの１０％のドデシル硫酸ナトリウムに加え、水を加えて１mLに定容する）で０．６ｍｇ／ｍＬに希釈する。希釈した後の試料９５μＬを取り、ここで、還元型試料にβ－メルカプトエタノール５μＬを加え、非還元型試料に２５０ｍｍｏｌ／ＬのＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）を５μＬ加え、十分に混合した後に７０℃条件で１０分間加熱し、冷却した後に試料管に移した。サンプリング電圧は、いずれも-５ｋＶであり、サンプリング時間は、いずれも２０秒であり、分離電圧は、いずれも-１２ｋＶであり、解析時間は、いずれも２５分間である。
【0077】
電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）
イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉＣＩＥＦ法）により検出した。キャピラリーは、内径が１００μｍで、全長が５ｃｍである。試料を３ｍｏｌ／Ｌの尿素-０．５％のＭＣ（ヒドロキシメチルセルロース）溶液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、３ｍｏｌ／Ｌの尿素-０．５％のＭＣ溶液が７０μＬで、両性電解質（ｐＨ３～１０）３μＬ、ｐＩ５．８５、９．４６Ｍａｋｅｒ（等電点マーカー）がそれぞれ０．３μＬで、５ｍｏｌ／ＬのＮＤＳＢ（３－［（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアミン］プロパン－１－スルホン酸塩）が５μＬで、０．５ｍｏｌ／ＬのＴａｕｒｉｎｅ（タウリン）が２μＬで、試料の最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬであり、フォーカス電圧が３ｋＶであり、フォーカス時間が５分間である。製剤緩衝液と同様に操作してブランク溶液を得た。
イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉＣＩＥＦ法）により検出した。キャピラリーは、内径が１００μｍで、全長が５ｃｍである。試料を３ｍｏｌ／Ｌの尿素-０．５％のＭＣ（ヒドロキシメチルセルロース）溶液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、３ｍｏｌ／Ｌの尿素-０．５％のＭＣ溶液が７０μＬで、両性電解質（ｐＨ３～１０）３μＬ、ｐＩ５．８５、９．４６Ｍａｋｅｒ（等電点マーカー）がそれぞれ０．３μＬで、５ｍｏｌ／ＬのＮＤＳＢ（３－［（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアミン］プロパン－１－スルホン酸塩）が５μＬで、０．５ｍｏｌ／ＬのＴａｕｒｉｎｅ（タウリン）が２μＬで、試料の最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬであり、フォーカス電圧が３ｋＶであり、フォーカス時間が５分間である。製剤緩衝液と同様に操作してブランク溶液を得た。
【0078】
相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）
抗ＬＡＧ－３末端の結合活性
ＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）でＳＡタンパク質を１．０μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、３７℃で２時間インキュベートし、タンパク質を９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。プレートを洗浄した後に、ブロッキング溶液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ、３００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ ＬＡＧ－３を２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ：リン酸塩緩衝液＋トウェイン２０、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）で０．５μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後にプレートを洗浄した。２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで測定すべき試料を４０μｇ／ｍＬまで希釈し、４倍の勾配で１２番目の濃度まで希釈した。勾配希釈された供試品を洗浄されたマイクロプレートに１００μＬ／ウェルで入れて、陰性ウェルを設置して希釈液のみを加え、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識の二次抗体を希釈し（１３００００倍希釈、１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間反応させた。プレートを洗浄した後に、１００μＬのＴＭＢ発色液を入れ、１５分間発色させてから、１ウェル当たり１００μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を入れて反応を終了させた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸として、各勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料とＬＡＧ－３の相対結合活性を反映した。
抗ＬＡＧ－３末端の結合活性
ＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）でＳＡタンパク質を１．０μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、３７℃で２時間インキュベートし、タンパク質を９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。プレートを洗浄した後に、ブロッキング溶液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ、３００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ ＬＡＧ－３を２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ：リン酸塩緩衝液＋トウェイン２０、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）で０．５μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後にプレートを洗浄した。２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで測定すべき試料を４０μｇ／ｍＬまで希釈し、４倍の勾配で１２番目の濃度まで希釈した。勾配希釈された供試品を洗浄されたマイクロプレートに１００μＬ／ウェルで入れて、陰性ウェルを設置して希釈液のみを加え、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識の二次抗体を希釈し（１３００００倍希釈、１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間反応させた。プレートを洗浄した後に、１００μＬのＴＭＢ発色液を入れ、１５分間発色させてから、１ウェル当たり１００μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を入れて反応を終了させた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸として、各勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料とＬＡＧ－３の相対結合活性を反映した。
【0079】
抗ＰＤ－Ｌ１末端の結合活性
ＰＢＳでＳＡタンパク質を１．０μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、３７℃で２時間インキュベートし、タンパク質を９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。プレートを洗浄した後に、ブロッキング溶液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ、３００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ ＰＤ－Ｌ１を２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後にプレートを洗浄した。２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで測定試料を６０μｇ／ｍＬまで希釈し、４倍の勾配で１２番目の濃度まで希釈した。勾配希釈された供試品を洗浄されたマイクロプレートに１００μＬ／ウェルで入れて、陰性ウェルを設置して希釈液のみを加え、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えてＨＲＰ標識の二次抗体を希釈し（１０００００倍希釈、１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間反応させた。プレートを洗浄した後に、１００μＬのＴＭＢ発色液を入れ、１５分間発色させてから、１ウェル当たり１００μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を入れて反応を終了させた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸として、各勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料とＰＤ－Ｌ１の相対結合活性を反映した。
ＰＢＳでＳＡタンパク質を１．０μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、３７℃で２時間インキュベートし、タンパク質を９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。プレートを洗浄した後に、ブロッキング溶液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ、３００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ ＰＤ－Ｌ１を２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５μg／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後にプレートを洗浄した。２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで測定試料を６０μｇ／ｍＬまで希釈し、４倍の勾配で１２番目の濃度まで希釈した。勾配希釈された供試品を洗浄されたマイクロプレートに１００μＬ／ウェルで入れて、陰性ウェルを設置して希釈液のみを加え、３７℃の恒温インキュベーターで１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えてＨＲＰ標識の二次抗体を希釈し（１０００００倍希釈、１００μＬ／ウェル）、３７℃で３０分間反応させた。プレートを洗浄した後に、１００μＬのＴＭＢ発色液を入れ、１５分間発色させてから、１ウェル当たり１００μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を入れて反応を終了させた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸として、各勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料とＰＤ－Ｌ１の相対結合活性を反映した。
【0080】
ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法
ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法（蛍光法）により測定試料のポリソルベート８０含有量を測定した。クロマトグラフカラムは、ＳＵＰＥＬＣＯメーカーＫｎｉｔｔｅｄ Ｒｅａｃｔｏｒ ｃｏｉｌクロマトグラフカラム（５ｍ×０．５ｍｍ ＩＤ）、移動相：０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５％のアセトニトリル、５．０μｍｏｌ／ＬのＮＰＮ（Ｎ－フェニル－１－ナフチルアミン）、１５ｐｐｍのＢｒｉｊ溶液（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル溶液）。検出条件：流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ、励起波長３５０ｎｍ、発光波長４２０ｎｍ、カラム温度３０℃、溶出時間３分間、注入体積１０μＬ。運行が完了した後に検量線法により完成品におけるポリソルベート８０の含有量を計算する。
ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法（蛍光法）により測定試料のポリソルベート８０含有量を測定した。クロマトグラフカラムは、ＳＵＰＥＬＣＯメーカーＫｎｉｔｔｅｄ Ｒｅａｃｔｏｒ ｃｏｉｌクロマトグラフカラム（５ｍ×０．５ｍｍ ＩＤ）、移動相：０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５％のアセトニトリル、５．０μｍｏｌ／ＬのＮＰＮ（Ｎ－フェニル－１－ナフチルアミン）、１５ｐｐｍのＢｒｉｊ溶液（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル溶液）。検出条件：流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ、励起波長３５０ｎｍ、発光波長４２０ｎｍ、カラム温度３０℃、溶出時間３分間、注入体積１０μＬ。運行が完了した後に検量線法により完成品におけるポリソルベート８０の含有量を計算する。
【0081】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞測定法
抗ＬＡＧ－３末端の生物学的活性
ＭＨＣＩＩ ＡＰＣ ｃｅｌｌｓ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、製品番号：１００９９－１４１）、９９％のＤＭＥＭ－高糖培地（製品番号：１１９９５－０４０））でＭＨＣＩＩ ＡＰＣ細胞を０．４×１０６個／ｍＬに調整し、ＨＡ－ｐｅｐｔｉｄｅ（製品番号：ＰＰ－１９０１－１３）を４０μｇ／ｍＬに希釈し、両者を１：１等体積で混合し、実験レイアウトで１００μＬ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに播種し、（１８ｈ～２２ｈ）一晩培養した。ＬＡＧ－３ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、製品番号：１００９９－１４１）、９９％のＤＭＥＭ－高糖培地（製品番号：１１９９５－０４０）でＪｕｒｋａｔ－ＬＡＧ－３－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２（製品番号ＣＳ１９４８１２）を３．０×１０６個／ｍＬに調整し、試料を８０．００μｇ／ｍＬに希釈し、そして４倍勾配希釈し、合計１０の濃度点（０．３ｎｇ／ｍＬ～８００００ｎｇ／ｍＬ）であった。９６ウェルプレートにおける培地を吸引し、処理された試料とＪｕｒｋａｔ－ＬＡＧ－３－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２細胞（それぞれ４０μＬ／ウェル）を加え、７ｈ培養し続ける。細胞培養プレートを室温に平衡させた後、ウェルあたり８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ発色液（室温に平衡させておく）を加え、１０ｍｉｎ反応させた。Ｍａｘ ｉ３型マイクロプレートリーダーの自作ソフトウェアにより、既定のレイアウトに基づき、読み取りプログラムを設定して全波長の化学発光値を読み取った。試料の濃度を横軸として、Ｆｏｌｄ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料と抗ＬＡＧ－３末端の生物学的活性を反映した。
抗ＬＡＧ－３末端の生物学的活性
ＭＨＣＩＩ ＡＰＣ ｃｅｌｌｓ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、製品番号：１００９９－１４１）、９９％のＤＭＥＭ－高糖培地（製品番号：１１９９５－０４０））でＭＨＣＩＩ ＡＰＣ細胞を０．４×１０６個／ｍＬに調整し、ＨＡ－ｐｅｐｔｉｄｅ（製品番号：ＰＰ－１９０１－１３）を４０μｇ／ｍＬに希釈し、両者を１：１等体積で混合し、実験レイアウトで１００μＬ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに播種し、（１８ｈ～２２ｈ）一晩培養した。ＬＡＧ－３ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＦＢＳ（ウシ胎児血清、製品番号：１００９９－１４１）、９９％のＤＭＥＭ－高糖培地（製品番号：１１９９５－０４０）でＪｕｒｋａｔ－ＬＡＧ－３－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２（製品番号ＣＳ１９４８１２）を３．０×１０６個／ｍＬに調整し、試料を８０．００μｇ／ｍＬに希釈し、そして４倍勾配希釈し、合計１０の濃度点（０．３ｎｇ／ｍＬ～８００００ｎｇ／ｍＬ）であった。９６ウェルプレートにおける培地を吸引し、処理された試料とＪｕｒｋａｔ－ＬＡＧ－３－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２細胞（それぞれ４０μＬ／ウェル）を加え、７ｈ培養し続ける。細胞培養プレートを室温に平衡させた後、ウェルあたり８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ発色液（室温に平衡させておく）を加え、１０ｍｉｎ反応させた。Ｍａｘ ｉ３型マイクロプレートリーダーの自作ソフトウェアにより、既定のレイアウトに基づき、読み取りプログラムを設定して全波長の化学発光値を読み取った。試料の濃度を横軸として、Ｆｏｌｄ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料と抗ＬＡＧ－３末端の生物学的活性を反映した。
【0082】
抗ＰＤ－Ｌ１末端の結合活性
Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１０％ウシ胎児血清、９０％ ＲＰＭＩ１６４０培地（製品番号：ＳＨ３０８０９．０１））でＣＨＯＫ１－ＰＤＬ１（製品番号ＣＳ１８７１０８）細胞を０．３×１０６個／ｍＬに調整し、実験レイアウトで１００μＬ／ウェルを９６ウェル培養プレートに播種し、１６ｈ～２０ｈ単層培養した。Ａｓｓａｙ ＢｕｆｆｅｒでＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２／ＰＤ１（製品番号ＣＳ１８７１０２）細胞を０．６×１０６個／ｍＬに調整し、試料を１２．００μｇ／ｍＬに希釈し、２．６倍勾配希釈し、合計１０の濃度点（２．２ｎｇ／ｍＬ～１２０００ｎｇ／ｍＬ）であった。９６ウェルプレートにおける培地を吸引し、処理された試料とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２／ＰＤ１細胞（それぞれ４０μＬ／ウェル）を加え、６ｈ培養し続ける。細胞培養プレートを室温に平衡させた後、ウェルあたり８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ発色液（室温に平衡させておく）を加え、１０ｍｉｎ反応させた。Ｍａｘ ｉ３型マイクロプレートリーダーの自作ソフトウェアにより、既定のレイアウトに基づき、読み取りプログラムを設定して全波長の化学発光値を読み取った。試料の濃度を横軸として、Ｆｏｌｄ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料と抗ＰＤ－Ｌ１末端の生物学的活性を反映した。
Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１０％ウシ胎児血清、９０％ ＲＰＭＩ１６４０培地（製品番号：ＳＨ３０８０９．０１））でＣＨＯＫ１－ＰＤＬ１（製品番号ＣＳ１８７１０８）細胞を０．３×１０６個／ｍＬに調整し、実験レイアウトで１００μＬ／ウェルを９６ウェル培養プレートに播種し、１６ｈ～２０ｈ単層培養した。Ａｓｓａｙ ＢｕｆｆｅｒでＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２／ＰＤ１（製品番号ＣＳ１８７１０２）細胞を０．６×１０６個／ｍＬに調整し、試料を１２．００μｇ／ｍＬに希釈し、２．６倍勾配希釈し、合計１０の濃度点（２．２ｎｇ／ｍＬ～１２０００ｎｇ／ｍＬ）であった。９６ウェルプレートにおける培地を吸引し、処理された試料とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２／ＰＤ１細胞（それぞれ４０μＬ／ウェル）を加え、６ｈ培養し続ける。細胞培養プレートを室温に平衡させた後、ウェルあたり８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ発色液（室温に平衡させておく）を加え、１０ｍｉｎ反応させた。Ｍａｘ ｉ３型マイクロプレートリーダーの自作ソフトウェアにより、既定のレイアウトに基づき、読み取りプログラムを設定して全波長の化学発光値を読み取った。試料の濃度を横軸として、Ｆｏｌｄ値を縦軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア四つのパラメータフィッティング曲線を利用してＥＣ５０と試料ＥＣ５０との比を算出し、測定試料と抗ＰＤ－Ｌ１末端の生物学的活性を反映した。
【実施例】
【0083】
実施例１．ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ－３二重抗体の調製と精製
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４の記載に基づき、ＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３と同時に結合する二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰを取得する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４は、ここで、全体で本明細書に参照として組み込まれた。
簡単に説明すると、抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に組換え発現され、そしてろ過、クロマトグラフィー、ウイルスの不活化、ろ過などのプロセスによって精製された。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４の記載に基づき、ＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３と同時に結合する二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰを取得する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３９６４は、ここで、全体で本明細書に参照として組み込まれた。
簡単に説明すると、抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に組換え発現され、そしてろ過、クロマトグラフィー、ウイルスの不活化、ろ過などのプロセスによって精製された。
【0084】
実施例２．処方スクリーニング試験
２．１ 実験手順
合計４つの処方を設計したが、詳しい処方情報は表１に示されている。各処方の緩衝液を調製し、実施例１の精製された本発明の二重特異性抗体タンパク質を限外ろ過によってそれぞれの処方溶液に置換した。置換完了後、各処方のタンパク質濃度を約２０ｍｇ／ｍLまで希釈し、ポリソルベート８０を入れた。濾過した後にバイアル瓶に分注し、プラグで蓋をしてから、安定性を考察した。検出項目は、外観、可視異物、タンパク質含有量（ＵＶ法）、濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）、ポリソルベート８０含有量（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法および非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）、電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）、相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）である。
２．１ 実験手順
合計４つの処方を設計したが、詳しい処方情報は表１に示されている。各処方の緩衝液を調製し、実施例１の精製された本発明の二重特異性抗体タンパク質を限外ろ過によってそれぞれの処方溶液に置換した。置換完了後、各処方のタンパク質濃度を約２０ｍｇ／ｍLまで希釈し、ポリソルベート８０を入れた。濾過した後にバイアル瓶に分注し、プラグで蓋をしてから、安定性を考察した。検出項目は、外観、可視異物、タンパク質含有量（ＵＶ法）、濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）、ポリソルベート８０含有量（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法および非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）、電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）、相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）である。
【表6】
【0085】
具体的な実験条件およびサンプリング計画は表２を参照する。
【表7】
【0086】
２．２ 判断基準
処方スクリーニング実験は、表３に示された基準で品質判断を行う
処方スクリーニング実験は、表３に示された基準で品質判断を行う
【表8】
【0087】
２．３ 実験結果
処方スクリーニング実験の４０℃安定性考察結果は表４に示され、処方スクリーニング実験純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）の変化傾向は図２に示され、濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）の変化傾向は図３に示され、電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）の変化傾向は図４～５に示される。４０℃±２℃の条件で１ケ月放置し、各処方の外観、可視異物は、いずれも合格した。タンパク質含有量（ＵＶ法）、ポリソルベート８０含有量（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）、純度（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）と相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）は、いずれも明らかな変化がなかった。処方４の純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）は低下し、主に重合体と断片の増加として示され、残りの処方の純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）は、明らかな変化がなかった。各処方の濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）は、いずれも上昇したが、処方１の上昇幅は、比較的に小さかった。各処方の電荷変異体－酸性成分（ｉＣＩＥＦ法）は上昇し、主成分は低下し、塩基性成分は、いずれも明らかな変化がなく、ここで、処方１の電荷変異体－酸性成分、主成分の変化幅は、比較的に小さかった。
処方スクリーニング実験の４０℃安定性考察結果は表４に示され、処方スクリーニング実験純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）の変化傾向は図２に示され、濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）の変化傾向は図３に示され、電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）の変化傾向は図４～５に示される。４０℃±２℃の条件で１ケ月放置し、各処方の外観、可視異物は、いずれも合格した。タンパク質含有量（ＵＶ法）、ポリソルベート８０含有量（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）、純度（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）と相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）は、いずれも明らかな変化がなかった。処方４の純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）は低下し、主に重合体と断片の増加として示され、残りの処方の純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）は、明らかな変化がなかった。各処方の濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）は、いずれも上昇したが、処方１の上昇幅は、比較的に小さかった。各処方の電荷変異体－酸性成分（ｉＣＩＥＦ法）は上昇し、主成分は低下し、塩基性成分は、いずれも明らかな変化がなく、ここで、処方１の電荷変異体－酸性成分、主成分の変化幅は、比較的に小さかった。
【0088】
【表9-1】
【表9-2】
【0089】
処方スクリーニング実験の２５℃安定性考察結果の詳細は、表５に示されている。２５℃±２℃の条件で２ケ月放置し、各処方の外観、可視異物は、いずれも合格した。タンパク質含有量（ＵＶ法）、濁度（ＯＤ３５０ｎｍ法）、ポリソルベート８０含有量（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ法）、純度と相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）は、いずれも明らかな変化がなかった。各処方の電荷変異体－酸性成分（ｉＣＩＥＦ法）は上昇し、主成分は低下し、塩基性成分は、いずれも明らかな変化がなく、ここで、処方４の電荷変異体－酸性成分、主成分の変化幅は、比較的に大きかった。
【表10-1】
【表10-2】
【0090】
実施例３．長期安定性考察試験
実施例２の実験結果を総合し、処方１を選択してパイロット長期安定性考察を行った。パイロットで処方１（２０．０ｍｇ／ｍＬの組換え抗リンパ球活性化遺伝子ー３（ＬＡＧ－３）と抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）二重特異性抗体、０．８５ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、０．９７ｍｇ／ｍＬのヒスチジン塩酸塩、３５．１１ｍｇ／ｍＬのアルギニン塩酸塩、０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．８～６．４）に従って３ロットの製剤完成品を生産し、５℃±３℃で長期安定性考察を行い、それぞれ０、３、６ヶ月にサンプリング検出を行った。結果は表６に示されている。結果によると、当該処方におけるタンパク質の安定性が良好であり、各バッチ間で有意差がなく、実際の生産プロセスの品質基準を満たすことが示されている。
実施例２の実験結果を総合し、処方１を選択してパイロット長期安定性考察を行った。パイロットで処方１（２０．０ｍｇ／ｍＬの組換え抗リンパ球活性化遺伝子ー３（ＬＡＧ－３）と抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）二重特異性抗体、０．８５ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、０．９７ｍｇ／ｍＬのヒスチジン塩酸塩、３５．１１ｍｇ／ｍＬのアルギニン塩酸塩、０．０１ｍｇ／ｍＬのエデト酸二ナトリウム、０．５０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．８～６．４）に従って３ロットの製剤完成品を生産し、５℃±３℃で長期安定性考察を行い、それぞれ０、３、６ヶ月にサンプリング検出を行った。結果は表６に示されている。結果によると、当該処方におけるタンパク質の安定性が良好であり、各バッチ間で有意差がなく、実際の生産プロセスの品質基準を満たすことが示されている。
【表11-1】
【表11-2】
【0091】
実施例４．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍活性
ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ（ＭＪ－１）結腸がん細胞が接種されているＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス（ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデル、ＭＣ３８／ＰＤ－Ｌ１モデルと略称）を利用して、本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮＬＰ（すなわち、実施例１で調製されたＩＧＮ－ＬＰ）の抗腫瘍作用を測定した。
皮下接種でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデルを構築した。腫瘍が出現すると群分けをし、異なる抗体を投与して治療し、投与期間に各群マウスの腫瘍体積と体重の変化を監視した。投与頻度は週に２回で、２週間にわたり、合計で５回投与した。監視頻度はいずれも週に２回であり、４週間にわたり連続的に監視し、投与量と投与方法は下記の通りである。投与終了後に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、下記の通りである。ＴＧＩ％＝１００％×（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－治療群の腫瘍体積）／（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積）。ここで、ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積の平均値は８０ｍｍ３である。
ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ（ＭＪ－１）結腸がん細胞が接種されているＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス（ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデル、ＭＣ３８／ＰＤ－Ｌ１モデルと略称）を利用して、本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮＬＰ（すなわち、実施例１で調製されたＩＧＮ－ＬＰ）の抗腫瘍作用を測定した。
皮下接種でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデルを構築した。腫瘍が出現すると群分けをし、異なる抗体を投与して治療し、投与期間に各群マウスの腫瘍体積と体重の変化を監視した。投与頻度は週に２回で、２週間にわたり、合計で５回投与した。監視頻度はいずれも週に２回であり、４週間にわたり連続的に監視し、投与量と投与方法は下記の通りである。投与終了後に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、下記の通りである。ＴＧＩ％＝１００％×（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－治療群の腫瘍体積）／（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積）。ここで、ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積の平均値は８０ｍｍ３である。
【0092】
マウス：ＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス、雌性、７～８週齢（腫瘍細胞接種時のマウス週齢）、体重１８ｇ～２０ｇ、上海南方模式生物科技股分有限公司より購入された。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間馴化した。
細胞：上海和元生物より購入されたマウス結腸がん細胞ＭＣ３８（上海和元生物、ＨＹＣ０１１６）にヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（南京銀河生物医薬有限公司）を組み込み、ヒトＰＤ－Ｌ１を含むＭＣ３８細胞が得られ、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）で培養し、後続のインビボ実験に備えるために、ＭＣ３８培養要求を厳格に遵守して通常の継代培養を行った。遠心分離（４００ｇ／分、５分間）により細胞を収集し、滅菌ＲＰＭＩ １６４０基本培地において細胞を再懸濁し、細胞密度を５×１０６個／ｍＬに調整した。ＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウスの右背部を剃毛し、０．２ｍＬ／匹でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞接種後から５日目に、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍の平均体積が７６ｍｍ３～８０ｍｍ３の範囲にあるマウスを選択し、腫瘍体積によってランダムに群分けした。下記の投与方法により、抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体を単独で使用する場合の抗腫瘍活性を検出した。
細胞：上海和元生物より購入されたマウス結腸がん細胞ＭＣ３８（上海和元生物、ＨＹＣ０１１６）にヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（南京銀河生物医薬有限公司）を組み込み、ヒトＰＤ－Ｌ１を含むＭＣ３８細胞が得られ、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）で培養し、後続のインビボ実験に備えるために、ＭＣ３８培養要求を厳格に遵守して通常の継代培養を行った。遠心分離（４００ｇ／分、５分間）により細胞を収集し、滅菌ＲＰＭＩ １６４０基本培地において細胞を再懸濁し、細胞密度を５×１０６個／ｍＬに調整した。ＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウスの右背部を剃毛し、０．２ｍＬ／匹でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞接種後から５日目に、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍の平均体積が７６ｍｍ３～８０ｍｍ３の範囲にあるマウスを選択し、腫瘍体積によってランダムに群分けした。下記の投与方法により、抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体を単独で使用する場合の抗腫瘍活性を検出した。
【0093】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）は、特許ＺＬ２０１７１０６５７６６５．３の方法で取得される。
抗ＬＡＧ－３抗体（ＡＤＩ－３１８５３）は、特許出願ＷＯ２０１９／１２９１３７の方法で取得される。
抗ＬＡＧ－３抗体（ＡＤＩ－３１８５３）は、特許出願ＷＯ２０１９／１２９１３７の方法で取得される。
【0094】
投与：マウスを１１群に分け（１群あたり６匹マウス）、各群に対して下記の投与量でそれぞれ抗体を皮下注射した。
（１）ヒトＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、１５ｍｇ／ｋｇ、
（２）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（３）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（４）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（５）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ、
（６）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（７）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（８）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Nb－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（９）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、３ｍｇ／ｋｇ、
（１０）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、６ｍｇ／ｋｇ、
（１１）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、１２ｍｇ／ｋｇ。
（１）ヒトＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、１５ｍｇ／ｋｇ、
（２）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（３）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（４）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（５）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ、
（６）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（７）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（８）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Nb－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（９）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、３ｍｇ／ｋｇ、
（１０）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、６ｍｇ／ｋｇ、
（１１）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、１２ｍｇ／ｋｇ。
【0095】
ヒトＩｇＧはＥｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏにより得られたヒトＩｇＧ調製物である。
腫瘍細胞接種後から５日目、９日目、１２日目、１５日目および１８日目に、各群のマウスに上記投与量で上記の抗体をそれぞれ投与した。
腫瘍細胞接種後から５日目、９日目、１２日目、１５日目および１８日目に、各群のマウスに上記投与量で上記の抗体をそれぞれ投与した。
【0096】
分析：実験期間にわたり、腫瘍、体重を週に２回計測した。腫瘍が端点まで成長すると（腫瘍体積が３０００ｍｍ３を上回る）、またはマウスに２０％以上の体重減少が認められると、マウスに安楽死を実施する。ノギスを用いて腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）を測定し、Ｖ＝Ｌ＊Ｗ２／２により腫瘍体積を算出する。各群のマウスに対し腫瘍サイズと時間のグラフを作成する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計的有意性を判定する。Ｐ値＜０．０５である場合は、全ての分析に統計的有意性がある。
【0097】
実験結果は下記表に示され、ＩｇＧ対照（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、抗ＬＡＧ－３または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独もしくは組合せ投与と比較すれば、本願の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＧＮＬＰの単独投与は、腫瘍の成長が明らかに抑制されることが示されている。
【表12】
【0098】
以上では本発明の具体的な実施形態を説明したが、当業者であれば理解できるように、これらは、単なる例示に過ぎず、本発明の原理と実質から逸脱することなく、これらの実施形態に対する複数の変更または修正を行うことができる。そのため、本発明の保護範囲は、添付される特許請求の範囲によって限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】