▶ ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・ワン，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-18
(54)【発明の名称】表面の付着物が低減されたバイオプロセス
(51)【国際特許分類】
C07K 1/34 20060101AFI20230810BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20230810BHJP
【ＦＩ】
C07K1/34
C07K1/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023502976
(86)(22)【出願日】2021-07-14
(85)【翻訳文提出日】2023-03-10
(86)【国際出願番号】 US2021041508
(87)【国際公開番号】W WO2022015779
(87)【国際公開日】2022-01-20
(31)【優先権主張番号】63/052,048
(32)【優先日】2020-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】323008992
【氏名又は名称】ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・ワン，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ジョシュア・エス・カッツ
(72)【発明者】
【氏名】スーザン・エル・ジョーダン
(72)【発明者】
【氏名】ハディ・ファレス
(72)【発明者】
【氏名】ベンジャミン・イェザー
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA23
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、（ａ）タンパク質及び式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩの重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスに関する。
【化１】
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩの重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）タンパク質及び式Ｉ：【化1】
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化2】
の重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）前記水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセス。
【請求項2】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００、１８ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
ステップ（ｂ）は、前記水溶液を濾過することを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００、１８ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項6】
フィルターは、ＰＶＤＦフィルター、ＰＥＳフィルター、ポリプロピレンフィルター、セルロースフィルター、ナイロンフィルター及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項7】
前記フィルターは、ＰＶＤＦフィルター又はＰＥＳフィルターである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成は、前記フィルターを通過しても実質的に同じままである、請求項４に記載のプロセス。
【請求項9】
ステップ（ｂ）は、前記水溶液をクロマトグラフィーカラムを通過させることを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項10】
クロマトグラフィー樹脂は、スルホプロピル修飾架橋アガロース、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、４級アンモニウム修飾架橋アガロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項11】
前記クロマトグラフィー樹脂は、スルホプロピル修飾架橋アガロース、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又は４級アンモニウム修飾架橋アガロースである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項12】
前記水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成は、前記クロマトグラフィーカラムを通過しても実質的に同じままである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項13】
ステップ（ｂ）は、前記水溶液を輸送することを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項14】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項15】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００である、請求項１４に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、バイオプロセスにおいて表面の付着物を低減するためにポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生物製剤、タンパク質から誘導された医薬品又は他の生物学的に誘導された高分子は、従来の低分子薬と比較して選択性が向上しており、且つ副作用が低減されていることから、医薬品の重要な種類として急速に発展している。タンパク質材料は比較的破壊されやすい性質を有しており、そのため、治療に有益であると同時に、加工、流通及び投与に耐えるのに十分な安定性を有する生物活性物質を開発することは依然として大きな難題である。界面活性剤を使用することによって、タンパク質が界面に吸着することを防ぐか又は溶液中で保護構造を形成することにより、溶液中のタンパク質を安定化及び保護することができる。ところが界面活性剤は、生物製剤の製造プロセスの多くの工程に適さないことが多く、そのため、プロセスのかなり終盤（例えば、最終製剤化）まで添加されない。例えば界面活性剤は表面に不可逆的に吸着され、その結果として表面の付着物となり、細孔／膜／フィルターが目詰まりし、溶液中の界面活性剤濃度が低下し、溶液中又は更に下流側で界面活性剤がタンパク質を保護する能力が制限されることで、バイオプロセスを妨げる可能性がある。更に、付着物及び目詰まりによって清掃のための中断時間が長くなり、プロセスの処理量及び生産性が低下する可能性もある。生物製剤を、界面活性剤によって遮蔽されていない表面（例えば、クロマトグラフィーカラム又はフィルター）に到達させ、及び／又はその表面と相互作用させることが必要となる状況もある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は：（ａ）タンパク質及び式Ｉ：
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
の重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスを提供する。
【化1】
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化2】
の重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスを提供する。
【0004】
本明細書に示す概念の理解を促すために添付の図面において実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】尾部長の異なる界面活性剤を用いて、生理食塩水中界面活性剤を０．０３ｍｇ／ｍＬ及び界面活性剤を０．０５ｍｇ／ｍＬとして、室温下で２４時間振盪を行った後にＤＬＳで測定したＩｇＧ（２０ｍｇ／ｍＬ）の凝集率を示すものである。
【図2】尾部長の異なる界面活性剤を用いて、生理食塩水中界面活性剤を０．０３ｍｇ／ｍＬ及び界面活性剤を０．０５ｍｇ／ｍＬとして、振盪を行う前にＤＬＳで測定したＩｇＧ（２０ｍｇ／ｍＬ）の凝集率を示すグラフである。
【図3A】試験に供した６種のＦＭ１０００誘導体及びＩｇＧの代表的なＤＳＴのグラフを示すものである。
【図3B】全体の表面張力の低下に対する、最初の減衰に由来する表面張力低下の割合を示すものである。
【図3C】最初の減衰時の表面張力低下を、最初の減衰の特性時間で規格化したものである。
【図3D】２回目の減衰に起因する表面張力低下を示すものである。
【図3E】２回目の減衰の特性時間を示すものである。
【図4-1】ＱＣＭ－Ｄデータを示すものである。図４Ａは、界面活性剤のみ又はＩｇＧのみの相対吸着質量を示すものである。図４Ｂは、界面活性剤のみ又はＩｇＧのみで洗い流された割合を示すものである。図４Ｃは、まずＩｇＧ及び界面活性剤の吸着質量と、界面活性剤のみの吸着質量との差を求め、次いでこれを、ＩｇＧのみの試料の吸着質量で規格化した、吸着したＩｇＧの相対量（１００任意単位）を示すものである。図４Ｄは、洗い流すことができるＩｇＧ及び界面活性剤の合計質量の割合を示すものである。
【図5-1】尾部長の増加に伴うＩｇＧ及び界面活性剤の吸着過程を図示したものである。各図解の組において、左側は、短い尾部長を有する界面活性剤及びＩｇＧを示し、中央は中間の尾部長を有する界面活性剤及びＩｇＧを示し、右側は長い尾部長を有する界面活性剤及びＩｇＧを示している。図５Ａは、ＤＳＴによって明らかになった界面活性剤の初期吸着（最初の減衰）を図示したものである。図５Ｂは、ＱＣＭ－Ｄによって明らかになった競合吸着を図示したものである。図５Ｃは、ＤＳＴによって明らかになった平衡時の吸着（２回目の減衰）を図示したものである。図５Ｄは、ＱＣＭ－Ｄによって明らかになった可逆的吸着を図示したものである。
【図6】ＰＶＤＦフィルターを通過した界面活性剤の回収を示すものである。図６Ａ及び図６Ｂは、濾過の異なる時点で採取した試料のＦＭ１０００及びＰＭ８０のクロマトグラムの例を示すものである。グラフの右側のｍｇ単位の重量は濾液の累積重量を表し、濾液の累積重量が約２０００ｍｇになるまで分取した分のクロマトグラムを表している。
【図7】ＰＥＳフィルターを通過した界面活性剤の回収を示すものである。図７Ａ及び図７Ｂは、濾過の異なる時点で採取した試料のＦＭ１０００及びＰＳ８０のクロマトグラムの例を示すものである。グラフの右側のｍｇ単位の重量は濾液の累積重量を表し、濾液の累積重量が約２０００ｍｇになるまで分取した分のクロマトグラムを表している。
【図8】スルホプロピル修飾架橋アガロース（ＳＰ ＨＰ）カラムを通過した界面活性剤の回収を示すものである。図８Ａ及び図８Ｂは、溶出の異なる時点で採取した試料のＦＭ１０００及びＰＳ８０のクロマトグラムの例を示すものである。グラフの右側のｍｇ単位の重量は溶出液の累積重量を表し、溶出液の累積重量が約３０００ｍｇになるまで分取した分のクロマトグラムを表している。
【発明を実施するための形態】
【0006】
前述の概要及び以下の詳細な説明は例示及び説明に過ぎず、添付の特許請求の範囲において定義する本発明を限定するものではない。任意の１つ又は複数の実施形態の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【0007】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」又はこれらの任意の他の変形は、非排他的な包含も網羅することを意図している。例えば、構成要素のリストを含むプロセス、方法、物品又は装置は、必ずしもこれらの構成要素のみに限定されず、明示的に列挙されていないか又はこのようなプロセス、方法、物品若しくは装置に本来備わっている他の構成要素を含んでいてもよい。更に、そうでないことが明示的に述べられていない限り、「又は」は、包括的な又はを意味し、排他的な又はを意味しない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（又は存在し）且つＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）且つＢが真である（又は存在する）並びにＡ及びＢが両方とも真である（又は存在する）。
【0008】
また、「ａ」又は「ａｎ」の使用は、本明細書に記載される要素及び成分を記載するために用いられる。これは、便宜上及び本発明の範囲の一般的な意味を与えるために行われるに過ぎない。この記載は、１つ又は少なくとも１つを包含すると解釈すべきであり、単数はまた、それが別の意味を有することが明らかでない限り複数も含む。
【0009】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先される。本明細書に記載するものと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。更に、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図していない。
【0010】
量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲又は好ましい上限値及び／若しくは好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられている場合、これは、範囲が別個に開示されているかどうかに関わらず、範囲の任意の上限又は好ましい値と、範囲の任意の下限又は好ましい値との任意の対から形成されるあらゆる範囲を具体的に開示していると理解すべきである。本明細書においてある数値の範囲が記載されている場合、特に明記しない限り、その範囲は、その終点並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことを意図する。例えば、「１～１０」という範囲が記載されている場合、この記載されている範囲は、「１～８」、「３～１０」、「２～７」、「１．５～６」、「３．４～７．８」、「１～２及び７～１０」、「２～４及び６～９」、「１～３．６及び７．２～８．９」、「１～５及び１０」、「２及び８～１０」、「１．５～４及び８」の範囲及び同種の範囲を包含すると解釈すべきである。
【0011】
本明細書において例示的に説明する本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１又は複数の構成要素、１又は複数の制限の非存在下に好適に実施することができる。本明細書においては、組成物及び方法を、様々な成分又はステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語で記載するが、特に明記しない限り、この組成物及び方法は、該様々な成分又はステップ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」こともできる。
【0012】
後述の実施形態の詳細を扱う前に、幾つかの用語を定義又は明確化する。
【0013】
「表面」及び「界面」という用語は、本明細書においては互換的に使用される。
【0014】
数平均分子量は、試料の総重量を試料に含まれる分子の個数で除したものと定義される。
【0015】
本明細書において使用される「界面活性剤／タンパク質濃度比」という用語は、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度対タンパク質の濃度の比を意味する。本開示においては、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度及びタンパク質の濃度を重量／体積比（例えば、ｍｇ／ｍｌ）で表す。
【0016】
ポリアルコキシ化合物は、構造－（－Ａ－Ｏ）ｍ－（式中、ｍは３以上であり、Ａは無置換アルキル基である）を有する１つ又は複数の基を含む化合物である。Ａ基は、直鎖状、分岐状、環状又はこれらの組合せであってもよい。様々な－（－Ａ－Ｏ）－基中の各種Ａ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
【0017】
脂肪酸化合物は、１つ又は複数の脂肪酸基を含む化合物である。脂肪酸基は、８個以上の炭素原子を含み、そのそれぞれが該基の１個又は複数個の他の炭素原子に結合している基である。ポリアルコキシ脂肪酸化合物は、ポリアルコキシ化合物と脂肪酸化合物の両方である化合物である。
【0018】
ヒドロカルビル基は、水素原子及び炭素原子を含む基である。無置換ヒドロカルビル基は、水素原子及び炭素原子のみを含む。置換ヒドロカルビル基は、水素及び炭素以外の１個又は複数個の原子を含む１つ又は複数の置換基を含む。
【0019】
タンパク質は、その重合単位がアミノ酸の重合単位である、重合体である。アミノ酸は、ペプチド結合によって互いに結合されている。タンパク質は、１種又は複数種のアミノ酸残基の重合単位を２０個以上含む。タンパク質という用語は、直鎖状ポリペプチド鎖だけでなく、ポリペプチド鎖を含むより複雑な構造も包含する。
【0020】
タンパク質の分子が、連続液体媒体全体に溶解した個々の分子の形態で分布している場合、タンパク質は、該液体媒体中の溶液である（又は、同義として、液体媒体中に溶解されている）とみなされる。連続液体媒体が、連続液体媒体の重量を基準として６０重量％以上の量の水を含有する場合、タンパク質は水中に溶解しているとみなされる。
【0021】
化学基は、４．５～８．５のｐＨ値が存在し、そのｐＨ値の水と接触すると、存在するこの化学基の５０モル％以上がイオン性形態をとる場合、この化学基はイオン性基である。
【0022】
緩衝剤は、（ｉ）プロトンを受け取ってその化合物の共役酸を形成する能力を有し、その化合物の共役酸のｐＫａが１０未満である化合物、又は（ｉｉ）プロトンを放出する能力を有し、その化合物のｐＫａが４を超える化合物のどちらかである。
【0023】
本明細書において使用される「ＦＭ１０００」という用語は、式Ｉ（式中、Ｒ１はＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－であり、ｎは１であり、Ｘ１及びＸ２はどちらもＮＨであり、Ｒ２は、－ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５）であり、Ｒ３は、おおよその数平均分子量が１０００となり、且つＰＯ対ＥＯの比が約３：１９となる、ＣＨ３で末端封止されたＰＯ及びＥＯ単位の共重合体である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を意味する。ＦＭ１０００は、炭素数１４の長さの疎水性尾部（ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））を有する。
【0024】
本明細書において使用される「８ＦＭ１０００」という用語は、炭素数が８である疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体を意味する。即ち、８ＦＭ１０００は、Ｒ１がＣＨ３－（ＣＨ２）５－ＣＨ２－であることを除いて、化学式がＦＭ１０００と同一である。同様に、本明細書において使用される「１０ＦＭ１０００」という用語は、炭素数が１０である疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体を意味する、即ち、１０ＦＭ１０００は、Ｒ１がＣＨ３－（ＣＨ２）７－ＣＨ２－であることを除いて、化学式がＦＭ１０００と同一であり；本明細書において使用される「１２ＦＭ１０００」という用語は、炭素数が１２である疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体を意味する、即ち、１２ＦＭ１０００は、Ｒ１がＣＨ３－（ＣＨ２）９－ＣＨ２－であることを除いて、化学式がＦＭ１０００と同一であり；本明細書において使用される「１６ＦＭ１０００」という用語は、炭素数が１６である疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体を意味する、即ち、１６ＦＭ１０００は、Ｒ１がＣＨ３－（ＣＨ２）１３－ＣＨ２－であることを除いて、化学式がＦＭ１０００と同一であり；本明細書において使用される「１８ＦＭ１０００」という用語は、炭素数が１８である疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体を意味する、即ち、１８ＦＭ１０００は、Ｒ１がＣＨ３－（ＣＨ２）１５－ＣＨ２－であることを除いて、化学式がＦＭ１０００と同一である。
【0025】
「ＦＭ１０００」及び「１４ＦＭ１０００」という用語は本明細書においては互換的に使用される。
【0026】
本開示は（ａ）タンパク質及び式Ｉ：
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
の重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスを提供する。
【化3】
（式中、Ｒ１－Ｃ（＝Ｏ）は、脂肪酸アシル基であり、Ｒ２は、Ｈ又は置換若しくは無置換のヒドロカルビル基であり、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、０又は１～５の整数であり、Ｒ３は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化4】
の重合した単位を含む高分子基である）のポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む水溶液を提供することと、
（ｂ）この水溶液をバイオプロセスに付すことと、
を含むプロセスを提供する。
【0027】
本明細書において使用される「バイオプロセス」という用語は、アップストリーム（例えば、生化学的生産又は合成）からのタンパク質を、純度及び品質要件に適合させるために処理する、タンパク質バイオプロセスのダウンストリーム部分を意味する。バイオプロセスは、保管、輸送及び精製を含む。
【0028】
幾つかの実施形態において、バイオプロセスは、輸送、濾過、クロマトグラフィー及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【0029】
ステップ（ａ）において提供される水溶液は、その中に溶解している（例えば、水中に溶解している）タンパク質及び式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として０．００１ｍｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ又は０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１ｍｇ／ｍｌ又は０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として１ｍｇ／ｍｌ以下又は０．５ｍｇ／ｍｌ以下又は０．２ｍｇ／ｍｌ以下又は０．１ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０８ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０６ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０５ｍｇ／ｍｌ以下である。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として少なくとも０．００１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．００２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．００５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０３ｍｇ／ｍｌである。
【0030】
幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中のタンパク質の濃度は、水溶液の総体積を基準として０．０００１ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ又は０．０００１ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌ又は０．０００１ｍｇ／ｍｌ～１５０ｍｇ／ｍｌ又は０．００１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ又は０．０１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ又は０．１ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌ又は０．１ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌ又は０．１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中のタンパク質の濃度は、水溶液の総体積を基準として３００ｍｇ／ｍｌ以下又は２５０ｍｇ／ｍｌ以下又は２００ｍｇ／ｍｌ以下又は１５０ｍｇ／ｍｌ以下又は１００ｍｇ／ｍｌ以下又は８０ｍｇ／ｍｌ以下又は５０ｍｇ／ｍｌ以下又は４０ｍｇ／ｍｌ以下又は３０ｍｇ／ｍｌ以下又は２０ｍｇ／ｍｌ以下又は１０ｍｇ／ｍｌ以下である。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）における水溶液中のタンパク質の濃度は、水溶液の総体積を基準として少なくとも０．０００１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．００１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．００２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．００５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも２ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも１０ｍｇ／ｍｌである。本開示においては、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度及びタンパク質の濃度を重量／体積比（例えば、ｍｇ／ｍｌ）で表す。
【0031】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤のＲ１は、好ましくは、置換若しくは無置換の脂肪族基である。置換脂肪族基の中でも、好ましい置換基はヒドロキシルである。より好ましくは、Ｒ１は、無置換脂肪族基であり；より好ましくは、Ｒ１は、無置換アルキル基である。好ましくは、Ｒ１は、９～２２個の炭素原子又は９～１８個の炭素原子又は９～１６個の炭素原子又は１０～１７個の炭素原子又は１１～１７個の炭素原子又は１１～１５個の炭素原子又は１０～１４個の炭素原子又は１１～１３個の炭素原子を有する直鎖アルキル基である。幾つかの実施形態では、Ｒ１は、ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－又はＣＨ３－（ＣＨ２）９－ＣＨ２－である。幾つかの実施形態では、Ｒ１は、ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－である。
【0032】
幾つかの実施形態では、（ｎが０ではない場合）、Ｘ１はＮＨである。幾つかの実施形態では、Ｘ２はＮＨである。
【0033】
幾つかの実施形態では、ｎは、０又は１、２、３、４若しくは５である。幾つかの実施形態では、ｎは、０又は１である。幾つかの実施形態では、ｎは１である。幾つかの実施形態では、ｎは０である。
【0034】
幾つかの実施形態では、ｎは０ではなく、Ｒ２は、２０個以下の原子；好ましくは１５個以下の原子を有する。好ましくは、Ｒ２が水素ではない場合、Ｒ２は、１個又は複数個の炭素原子を含む。好ましくは、Ｒ２は、水素又は無置換の炭化水素基であり；より好ましくは、Ｒ２は、水素、無置換アルキル基又はその唯一の置換基が無置換の芳香族炭化水素基であるアルキル基である。無置換アルキル基の中ではメチルが好ましい。その唯一の置換基が無置換芳香族炭化水素基であるアルキル基の中では、－ＣＨ２－（Ｃ６Ｈ５）が好ましく、ここで－（Ｃ６Ｈ５）はベンゼン環である。好ましくは、Ｒ２は、天然に存在するアミノ酸の側鎖を表す。
【0035】
幾つかの実施形態では、Ｒ３の数平均分子量は、６００～５０００ダルトン、好ましくは８００～３０００ダルトンである。好ましくは、Ｒ３基は、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の統計的共重合体又は（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のブロック共重合体であり；より好ましくは、Ｒ３基は、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の統計的共重合体である。好ましくは、－Ｒ３は、構造－Ｒ４－ＣＨ３を有し、ここでＲ４は、構造（ＩＩ）及び構造（ＩＩＩ）の重合単位を含む高分子基である。好ましくは、Ｒ４は、構造（ＩＩ）及び構造（ＩＩＩ）以外の他の重合単位を含まない。
【0036】
構造（ＩＩ）の単位対構造（ＩＩＩ）の単位のモル比（本明細書においては「ＰＯ／ＥＯ比」）を特徴付けることは有用である。好ましくは、ＰＯ／ＥＯ比は、０．０１：１～２：１、より好ましくは０．０５：１～１：１、特に０．１：１～０．５：１である。本明細書において使用される「ＰＯ」という用語は構造（ＩＩ）の単位を意味し、「ＥＯ」という用語は構造（ＩＩＩ）の単位を意味する。
【0037】
幾つかの実施形態では、Ｒ１は、ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－であり、ｎは０であり、Ｘ２は、ＮＨであり、Ｒ３は、おおよその数平均分子量が約１０００ダルトンであり、ＰＯ対ＥＯの比が約３：１９である、ＣＨ３で末端封止されたＰＯ及びＥＯ単位の共重合体である。
【0038】
幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、イオン性基を有しない。
【0039】
幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００、１８ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００である。
【0040】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、国際公開第２０１７／０４４３６６号パンフレットに開示されている方法により製造することができ、当該明細書全体をあらゆる目的で参照により本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【0041】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、任意の好適な方法により製造することができる。好ましい方法は、構造ＮＨ２－Ｒ３を有する化合物を、構造Ｖ：
の化合物及び構造ＶＩ：
（式中、Ｘ３は、Ｏ、Ｓ又はＮＨである）の化合物から選択される化合物と反応させることである。好ましいＲ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３及びｎは、先に記載したものと同義である。好ましくは、Ｘ３はＯである。
【化5】
の化合物及び構造ＶＩ：
【化6】
（式中、Ｘ３は、Ｏ、Ｓ又はＮＨである）の化合物から選択される化合物と反応させることである。好ましいＲ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ３及びｎは、先に記載したものと同義である。好ましくは、Ｘ３はＯである。
【0042】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の幾つかの実施形態のより好ましい製造方法は以下の通りである。第１段階において、次に示すように、塩化アシルをアミノ酸と反応させることにより、カルボキシル基を有する脂肪酸アミドが生成する。
【化7】
【0043】
次いで、第２段階において、以下に示すように、カルボキシル基を有する脂肪酸アミドをアミン末端ポリアルコキシ化合物と反応させる：
（式中、ＰＯは構造（ＩＩ）であり、ＥＯは構造（ＩＩＩ）である）。
【化8】
（式中、ＰＯは構造（ＩＩ）であり、ＥＯは構造（ＩＩＩ）である）。
【0044】
本開示に含まれる好ましいタンパク質は、モノクローナル抗体、成長因子、インスリン、免疫グロブリン、ポリクローナル抗体、抗体薬物複合体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、ホルモン、酵素、ポリペプチド、ペプチドの融合体、グリコシル化タンパク質、抗原、抗原サブユニット及びこれらの組合せからなる群から選択される。好ましいタンパク質は、疾患若しくは病状を治療するか又ワクチンとして機能する治療有効性を有する。治療用タンパク質の例は、免疫グロブリン－Ｇ（ＩｇＧ）、アダリムマブ、インターフェロンα、ベバシズマブ、ヒト成長ホルモン、リツキシマブ、ヒト血清アルブミン、インスリン、エリスロポエチンα、ペムブロリズマブ、エタネルセプト、フィルグラスチム、ニボルマブ、トラスツズマブ、デュルバルマブ、インターロイキン－２、インフリキシマブ、絨毛性ゴナドトロピン、アベルマブ、デノスマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、トレメリムマブ、第ＶＩＩＩ因子、インターフェロンβ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アバタセプト、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ペグフィルグラスチム、セクキヌマブ、ストレプトキナーゼ、セツキシマブ、オマリズマブ、ラムシルマブ、ウロキナーゼ、セルトリズマブペゴル、デュピルマブ、ゴリムマブ、アルデスロイキン、モルグラモスチム、ペグインターフェロンα－２ｂ、チスレリズマブ、フォリトロピンα、ゲボキズマブ、ゴリムマブ、スパルタリズマブ、カナキヌマブ、フォラルマブ、バルリルマブ、ニモツズマブ、エリスロポエチンβ、エボロクマブ、ペガルギミナーゼ（ｐｅｇａｒｇｉｍｉｎａｓｅ）、ベルメキマブ、カロツキシマブ、ダラツムマブ、エクリズマブ、オンツキシズマブ、アダリムマブ、カムレリズマブ、エノブリツズマブ、インターロイキン－１２、リリルマブ、パニツムマブ、ガチポツズマブ、レラトリマブ、アンデカリキシマブ、ベリムマブ、カビラリズマブ、イサシツズマブゴビテカン（ｉｓａｃｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、モナリズマブ、パンクレアチン、ペルツズマブ、トリパリマブ、イネビリズマブ、オファツムマブ、ペピネマブ、シンチリマブ、アリロクマブ、ミラツズマブ、ニダニリマブ（ｎｉｄａｎｉｌｉｍａｂ）、ソタテルセプト、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベバシズマブβ、イサツキシマブ、オルロタマブ（ｏｒｌｏｔａｍａｂ）、チソツマブベドチン、ベンラリズマブ、コシベリマブ、エマクツズマブ、ガニツマブ、ナルソプリマブ、ピディリズマブ、サリルマブ、トラスツズマブエムタンシン、アネツマブラブタンシン、ベルチリムマブ、ブリナツモマブ、グセルクマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、アレムツズマブ、エミベツズマブ、フィクラツズマブ、イファボツズマブ、ミリキズマブ、ナタリズマブ、ラコツモマブ、シルツキシマブ、チミグツズマブ（ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブデルクステカン、ビメキズマブ、ブロダルマブ、セトレリマブ、ファルレツズマブ、オピネルセプト、リロナセプト、トムゾツキシマブ、ウレルマブ、アスクリンバクマブ、ブロルシズマブ、クラザキズマブ、クサツズマブ、ダロツズマブ、イナルマブ、イトリズマブ及びマルゲツキシマブである。医療用診断薬として使用することができる、又は食品組成物に有益な作用を有する、又はクリーニング（ｃｌｅａｎｉｎｇ）組成物若しくはコーティング配合物に組み込むことができるタンパク質もまた、企図される。幾つかの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリンである。幾つかの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、ウシ免疫グロブリンＧである。
【0045】
本明細書において使用される「水溶液」という用語は、溶媒が、水を、溶媒の総重量を基準として少なくとも９０重量％含む溶液を意味する。幾つかの実施形態では、溶媒は、アセトン、エタノール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及び２－ブタノンなどの有機溶媒を更に含む。幾つかの実施形態では、溶媒は、水及び有機溶媒を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる。幾つかの実施形態では、溶媒は、溶媒の総重量を基準として、水を少なくとも９２重量％又は少なくとも９４重量％又は少なくとも９６重量％又は少なくとも９８重量％又は少なくとも９９重量％含む。幾つかの実施形態では、溶媒は、水から本質的になるか又は水からなる。幾つかの実施形態では、溶媒は、水である。幾つかの実施形態では、水溶液は、有機溶媒を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、水溶液の液体媒体は、水から本質的になるか又は水からなる。
【0046】
水溶液は、任意選択的に、１種又は複数の追加の成分を含む。追加の成分は、水、タンパク質及び式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤以外の化合物である。好ましい追加の成分は、糖、糖アルコール、塩、緩衝剤、アミノ酸若しくはアミノ酸の塩又はこれらの混合物である。この種の追加の成分が存在する場合、好ましくは、全ての追加の成分の総量は、水溶液の総体積を基準として３００ｍｇ／ｍｌ以下又は２５０ｍｇ／ｍｌ以下又は２００ｍｇ／ｍｌ以下又は１５０ｍｇ／ｍｌ以下又は１００ｍｇ／ｍｌ以下又は８０ｍｇ／ｍｌ以下又は６０ｍｇ／ｍｌ以下又は４０ｍｇ／ｍｌ以下又は３０ｍｇ／ｍｌ以下又は２０ｍｇ／ｍｌ以下又は１０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【0047】
水溶液に含有させるのに好ましい糖は、スクロース、グルコース、マンノース、トレハロース、マルトース、ブドウ糖、デキストラン又はこれらの混合物である。水溶液に含有させるのに好ましい糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール又はキシリトールである。
【0048】
水溶液に含有させるのに好ましい塩は、水素、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム若しくはアンモニウム又はこれらの混合物から選択される陽イオンを有する。好ましい塩は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸、カルボン酸、酢酸、クエン酸若しくは硫酸又はこれらの混合物から選択される陰イオンを有する。好ましい緩衝剤は、水素、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム若しくはアンモニウム又はこれらの混合物から選択される陽イオンを有する。
【0049】
水溶液に含有させるのに好ましいアミノ酸及びその塩は、リジン、グリシン、プロリン、アルギニン、ヒスチジン及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【0050】
幾つかの実施形態では、水溶液は、他の界面活性剤を実質的に含まない。本明細書において使用される「他の界面活性剤」という用語は、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤とは異なる界面活性剤を意味する。幾つかの実施形態では、他の界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、水溶液は、ポリソルベート界面活性剤を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、水溶液は、ポロキサマー界面活性剤を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、水溶液中の他の界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として０．０１ｍｇ／ｍｌ以下又は０．００５ｍｇ／ｍｌ以下又は０．００２ｍｇ／ｍｌ以下又は０．００１ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下又は０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下である。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、水溶液中に存在する唯一の界面活性剤である。
【0051】
幾つかの実施形態では、ステップ（ｂ）におけるバイオプロセスは、濾過である、即ち、ステップ（ａ）で提供された水溶液がステップ（ｂ）において濾過されることにより、濾液の水溶液が生成する。この種のステップ又はプロセスにおいては、水溶液を、夾雑タンパク質（例えば、宿主タンパク質、核酸、タンパク質凝集物など）の少なくとも一部を除去するためにフィルターを通過させる。水溶液中のタンパク質及び式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、フィルターを一緒に通過して濾液を生成し、一方、夾雑タンパク質はフィルターに保持される。
【0052】
幾つかの実施形態では、フィルターは、ＰＶＤＦフィルター、ＰＥＳフィルター、ポリプロピレンフィルター、セルロースフィルター、ナイロンフィルター及びこれらの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、フィルターはＰＶＤＦフィルターである。幾つかの実施形態では、フィルターはＰＥＳフィルターである。通常、フィルターは、分離膜を備える。本明細書において使用される「分離膜」という用語は、水溶液中の成分をその分子量又はサイズに基づき分離するための濾過処理に使用される多孔質膜を意味する。本明細書において使用される「ＰＶＤＦフィルター」という用語は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）から作製された分離膜を有するフィルターを意味する。本明細書において使用される「ＰＥＳフィルター」という用語は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から作製された分離膜を有するフィルターを意味する。本明細書において使用される「ポリプロピレンフィルター」という用語は、ポリプロピレンから作製された分離膜を有するフィルターを意味する。本明細書において使用される「セルロースフィルター」という用語は、セルロースから作製された分離膜を有するフィルターを意味する。本明細書において使用される「ナイロンフィルター」という用語は、ナイロンから作製された分離膜を有するフィルターを意味する。
【0053】
幾つかの実施形態では、フィルター又はその中の分離膜の細孔径は、約０．１μｍ～約１μｍ又は約０．１μｍ～約０．５μｍである。幾つかの実施形態では、フィルター又はその中の分離膜の細孔径は、約０．２μｍである。幾つかの実施形態では、濾過プロセスは、室温下に実施される。幾つかの実施形態では、濾過プロセスは、限外濾過及び／又は透析濾過を除くものである。
【0054】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、分離膜によるタンパク質の吸収又は損失を効果的に防止できることが見出された。更に、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の分離膜による吸収又は損失も少量であるか又は最小限である。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、濾過に付すためにフィルターに供給された水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の総重量を基準として、少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９２％又は少なくとも９５％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％がフィルターを通過する。
【0055】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、濾過に付すためにフィルターに供給されたタンパク質の総重量を基準として、少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９２％又は少なくとも９５％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％がフィルターを通過する。
【0056】
幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）において提供された水溶液中の界面活性剤／タンパク質の濃度比は、濾液の水溶液中の界面活性剤／タンパク質の濃度比と実質的に等しい、即ち、水溶液中の界面活性剤／タンパク質の濃度比は、フィルターを通過しても実質的に変わらない。幾つかの実施形態では、濾液の水溶液中の界面活性剤／タンパク質の濃度比は、ステップ（ａ）において提供された水溶液中の界面活性剤／タンパク質の濃度比の±５％又は±１０％又は±１５％又は±２０％の範囲内にある。
【0057】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、分子量の異なるポリマー成分の混合物である。通常、ステップ（ａ）において提供される水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成（混合物中のポリマー成分及びそれらのそれぞれの濃度）は、濾液の水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成と実質的に同じである、即ち、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成は、フィルターを通過しても実質的に同じままである。
【0058】
幾つかの実施形態では、ステップ（ｂ）におけるバイオプロセスはクロマトグラフィーである、即ち、ステップ（ａ）において提供された水溶液は、ステップ（ｂ）において、夾雑タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質、核酸、タンパク質凝集物など）の少なくとも一部をタンパク質から分離することができるように、クロマトグラフィーカラムに収容されているクロマトグラフィー樹脂（固定相）を通過する。幾つかの実施形態では、タンパク質はクロマトグラフィーカラムに保持され、一方、夾雑タンパク質はクロマトグラフィーカラムを通過する。この種の実施形態において、クロマトグラフィーの後に、保持されているタンパク質をクロマトグラフィーカラムから回収又は除去するために、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤を含む回収用水溶液を使用することができる。幾つかの実施形態では、回収用水溶液は、緩衝液である。
【0059】
幾つかの実施形態では、夾雑タンパク質はクロマトグラフィーカラムに保持され、一方、水溶液中のタンパク質及び式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤はクロマトグラフィーカラムを通過する。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィープロセスは室温下に実施される。
【0060】
クロマトグラフィープロセスを行う間、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤はクロマトグラフィーカラムを通過する。クロマトグラフィー樹脂によって吸収されるか又は損失する式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は少量であるか又は最小限である。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、クロマトグラフィーカラムに供給された水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の総重量を基準として、少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９２％又は少なくとも９５％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％がクロマトグラフィーカラムを通過する。
【0061】
通常、ステップ（ａ）において提供される水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成は、クロマトグラフィーカラムを通過した水溶液（即ち、溶出液）中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成と実質的に同じである、即ち、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の組成は、クロマトグラフィーカラムを通過しても実質的に同じままである。
【0062】
クロマトグラフィーカラムの中にはクロマトグラフィー樹脂（固定相）が収容されている。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、スルホプロピル修飾架橋アガロース、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、４級アンモニウム修飾架橋アガロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂及びこれらの組合せからなる群から選択される。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは、元々は細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁で見付かった４９ｋＤａの表面タンパク質であることを当業者は理解している。疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の例としては、ブチル置換基を有するアガロースが挙げられる。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、スルホプロピル修飾架橋アガロースである。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａである。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、４級アンモニウム修飾架橋アガロースである。
【0063】
幾つかの実施形態では、バイオプロセスは輸送である、即ち、バイオプロセスは、容器内で又は導管を通じて水溶液を輸送することを含む。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、１２ＦＭ１０００、ＦＭ１０００及びこれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、ＦＭ１０００である。幾つかの実施形態では、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約０．１ｍｇ／ｍｌ又は約０．０２ｍｇ／ｍｌ～約０．０８ｍｇ／ｍｌ又は約０．０２ｍｇ／ｍｌ～約０．０６ｍｇ／ｍｌ又は約０．０３ｍｇ／ｍｌ～約０．０５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、水溶液中の式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積を基準として約０．０３ｍｇ／ｍｌである。
【0064】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、輸送時の水溶液中のタンパク質の凝集を効果的に低減できることが見出された。幾つかの実施形態では、輸送終了時の水溶液は、水溶液中のタンパク質の総重量を基準として、単量体タンパク質を少なくとも８０重量％又は単量体タンパク質を少なくとも８５重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９０重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９２重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９４重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９６重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９８重量％又は単量体タンパク質を少なくとも９９重量％含む。
【0065】
多くの態様及び実施形態を上に説明してきたが、これらは例示に過ぎず、限定するものではない。本明細書を読んだ後、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく他の態様及び実施形態が可能であることを理解する。
【実施例】
【0066】
本明細書に記載する概念を以下の実施例において更に説明するが、実施例は、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【0067】
タンパク質は、水と、空気、油及び固体表面との間の界面に吸着することが知られており、これが凝集及び変性に繋がることが多い。更に、輸送中によく発生する激しい揺れが、この有害な作用を悪化させる可能性がある。これらの治療用タンパク質を安定化させるための幾つかの方法として、糖、塩、アミノ酸、界面活性剤などの医薬品添加物を使用することが挙げられる。界面活性剤は、溶液中のタンパク質を安定化及び保護するのに特に有用であり、これは次の２つのメカニズムを介する：（１）タンパク質が変性及び凝集し得る表面上の空間を得るためにタンパク質との競合に打ち勝つ、競合吸着として知られるもの、並びに（２）界面活性剤が、タンパク質と直接相互作用することによってタンパク質の構造を安定化させるか、又は凝集を引き起こし得るタンパク質－タンパク質相互作用を防ぐ、選択的会合（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。
【0068】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これらのメカニズムはどちらも安定化において何らかの役割を果たすが、一般には、第１のメカニズムが主要であると考えられている。タンパク質の安定化に使用されているポリソルベート２０及び８０などの上市されている現行の界面活性剤は、この種の界面活性剤を含まない製剤と比較してタンパク質の凝集を低下させる。タンパク質及び界面活性剤の溶液を６５℃で等温保持した場合に、１４ＦＭ１０００は、ポリソルベート２０及び８０よりも、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）凝集体の成長速度を低下させる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、１４ＦＭ１０００による成果は、動的表面張力（ＤＳＴ）測定で示されるように、水－空気界面や水－油界面などの様々な界面に速やかに移動して吸着される能力に由来するらしいと考えられている。
【0069】
界面活性剤のタンパク質安定化能力を理解するため及びタンパク質安定化効果を変化させる界面活性剤の構造特性を判別するために、炭素数が８～１８の範囲にある疎水性尾部長を有する６種のＦＭ１０００誘導体を合成し、試験を行った。実験を通して、モデルタンパク質治療薬であるＩｇＧを安定化させる界面活性剤の能力に疎水性尾部長が大きく影響することが見出された。疎水性尾部長は界面活性剤が吸着する速度及び吸着の可逆性に影響を及ぼす。炭素数１４の疎水性尾部などの中程度の長さの疎水性尾部（即ち、１４ＦＭ１０００）は、表面張力を最も速く且つ大きく低下させ、且つ吸着の可逆性が最も高い。このような高速動力学は、界面活性剤のＩｇＧを安定化させる能力と相関しており、１４ＦＭ１０００は、凝集を最小限に抑える作用が最大である。本開示は、界面活性剤の疎水性尾部長とタンパク質安定化との間にある構造及び機能の関係性を解明するものである。
【0070】
材料
塩化ミリストイル、水素型の強酸性イオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－１２０及びカルボニルジイミダゾールはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。カチオン型（ＯＨ－）イオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ－７８はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドはＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。Ｌ－フェニルアラニンは、ＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から購入した。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ１０００は、Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）から入手した。ポリソルベート８０及びポリソルベート２０はＳｉｇｍａから購入した。全ての化学物質は、受け取った状態のまま、更に精製することなく使用した。
塩化ミリストイル、水素型の強酸性イオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－１２０及びカルボニルジイミダゾールはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。カチオン型（ＯＨ－）イオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ－７８はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドはＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。Ｌ－フェニルアラニンは、ＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から購入した。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ１０００は、Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）から入手した。ポリソルベート８０及びポリソルベート２０はＳｉｇｍａから購入した。全ての化学物質は、受け取った状態のまま、更に精製することなく使用した。
【0071】
シリコーン板（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃ６－１５０）はＤｕＰｏｎｔより供給されているものを用いた。点滴袋は、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．より入手し、切り開いて中に入っている生理食塩水を空にし、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、乾燥させた。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）及びポリエチレン（ＰＥ）の板は全て、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｐ．から、厚さ０．５ｍｍ、寸法１５０×１５０ｍｍ～３００×３００ｍｍの範囲にあるものを入手した。３．５×１ｃｍの小片に切断してから、全ての表面を様々な溶液に浸漬した。
【0072】
ＰＶＤＦフィルターはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、直径３３ｍｍ、０．２μｍ）から入手し、ＰＥＳフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、直径３３ｍｍ、０．２２μｍ）から入手した。スルホプロピル修飾架橋アガロースカラム及びＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのクロマトグラフィーカラムはＣｙｔｉｖａから入手し、全て容量１ｍＬのものを用いた。
【0073】
水はＭｉｌｌｉＱグレードとした。工業グレードのウシＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）をＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）から購入した。ウシＩｇＧを０．９ｗｔ％生理食塩水に４０ｍｇ／ｍＬで溶解し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過し、対応する濃度に希釈した。
【0074】
炭素数１４の疎水性尾部を有するＦＭ１０００誘導体（ＦＭ１０００又は１４ＦＭ１０００）の合成：
ステップ１：スターラーバーを備えた５００ｍＬの丸底フラスコに、Ｌ－フェニルアラニン（０．０５００ｍｏｌ、８．２６ｇ）、ＤＩ（脱イオン）水（２５０ｍＬ）中水酸化ナトリウム（０．０５００ｍｏｌ、２．００ｇ）及びトリエチルアミン（０．０５４０ｍｏｌ、７．５６ｍＬ）を加えた。これを溶解するまでＲＴ（室温）で１分間撹拌した。次いで、塩化ミリストイル（０．０５００ｍｏｌ、１３．６ｍＬ）をゆっくりと加えた。反応混合物をＲＴで１時間撹拌した。次いで濃ＨＣｌ ５ｍＬをゆっくりと加えた。酸を添加することにより生成したオフホワイト色の析出物を吸引濾過により回収し、水５００ｍＬで洗浄し、一晩乾燥させた。次いで、生成物を沸騰している酢酸エチル１５００ｍＬに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムを濾去し、酢酸エチルをロータリーエバポレーターで除去した。次いで、生成物を沸騰しているヘキサンに溶解し、冷凍室でゆっくりと冷却した。その間に形成された白色の析出物を吸引濾過により回収した。ＮＭＲから不純物であるミリスチン酸が確認されたため、生成物を再び沸騰しているヘキサンに溶解し、冷凍室でゆっくりと冷却した。その間に形成された白色の析出物を吸引濾過により回収した。得られた白色粉末を真空デシケーターで一晩乾燥させた（７．９７４１ｇ、４３％）。
ステップ１：スターラーバーを備えた５００ｍＬの丸底フラスコに、Ｌ－フェニルアラニン（０．０５００ｍｏｌ、８．２６ｇ）、ＤＩ（脱イオン）水（２５０ｍＬ）中水酸化ナトリウム（０．０５００ｍｏｌ、２．００ｇ）及びトリエチルアミン（０．０５４０ｍｏｌ、７．５６ｍＬ）を加えた。これを溶解するまでＲＴ（室温）で１分間撹拌した。次いで、塩化ミリストイル（０．０５００ｍｏｌ、１３．６ｍＬ）をゆっくりと加えた。反応混合物をＲＴで１時間撹拌した。次いで濃ＨＣｌ ５ｍＬをゆっくりと加えた。酸を添加することにより生成したオフホワイト色の析出物を吸引濾過により回収し、水５００ｍＬで洗浄し、一晩乾燥させた。次いで、生成物を沸騰している酢酸エチル１５００ｍＬに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムを濾去し、酢酸エチルをロータリーエバポレーターで除去した。次いで、生成物を沸騰しているヘキサンに溶解し、冷凍室でゆっくりと冷却した。その間に形成された白色の析出物を吸引濾過により回収した。ＮＭＲから不純物であるミリスチン酸が確認されたため、生成物を再び沸騰しているヘキサンに溶解し、冷凍室でゆっくりと冷却した。その間に形成された白色の析出物を吸引濾過により回収した。得られた白色粉末を真空デシケーターで一晩乾燥させた（７．９７４１ｇ、４３％）。
【0075】
ステップ２：スターラーバーを備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、ｎ－ミリストイルフェニルアラニン（ステップ１の生成物）（０．００１００ｍｏｌ、０．３７５ｇ）及びＤＣＭ（ジクロロメタン、１０ｍＬ）を加えた。丸底フラスコにセプタムで栓をし、Ｎ２でパージした。次いでＣＤＩ（１，１’－カルボニルジイミダゾール、０．００１２０ｍｏｌ、０．１９４ｇ）を反応混合物に加え、再びセプタムで栓をし、混合物を再びＮ２でパージした。次いで、反応混合物をＲＴで４時間撹拌した。次いで、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ１０００（０．００１２０ｍｏｌ、１．１７ｇ）を溶融し、シリンジで反応混合物に加えた。反応混合物をＲＴで６８時間撹拌した。次いで、ＤＣＭをロータリーエバポレーターで蒸発させ、メタノール１５０ｍＬを、メタノールで前洗浄したイオン交換樹脂であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ－７８カチオン型（ＯＨ－）イオン交換樹脂及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ－１２０水素型強酸性イオン交換樹脂と一緒に加えた。この混合物をＲＴで２時間撹拌した。フリットを使用して真空濾過を行うことにより樹脂を除去した。真空濾過により得られた溶液からメタノールを留去した。次いで、生成物を４００ｍＬの１０％メタノール／ＤＣＭに溶解し、ＳｉＯ２プラグを通過させた。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮することにより白色のロウ状物を得、これを６０℃の真空オーブンで一晩乾燥させた（１．６ｇ、４９％）。
【0076】
振盪試験
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製し、ＩｇＧを２０ｍｇ／ｍＬ含むものとした。界面活性剤を含まない対照試料を調製した。尾部長の異なる界面活性剤を０．０３又は０．０５ｍｇ／ｍＬ含む他の試料も振盪試験用に調製した。界面活性剤は、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とした。８、１０、１２、１４、１６及び１８は、それぞれ界面活性剤の尾部長（炭素原子数）を意味する。本明細書において使用される「尾部長」という用語は、Ｒ１の長さを意味する。例えば１４ＦＭ１０００は、炭素数１４の疎水性尾部長を有する（ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））。
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製し、ＩｇＧを２０ｍｇ／ｍＬ含むものとした。界面活性剤を含まない対照試料を調製した。尾部長の異なる界面活性剤を０．０３又は０．０５ｍｇ／ｍＬ含む他の試料も振盪試験用に調製した。界面活性剤は、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とした。８、１０、１２、１４、１６及び１８は、それぞれ界面活性剤の尾部長（炭素原子数）を意味する。本明細書において使用される「尾部長」という用語は、Ｒ１の長さを意味する。例えば１４ＦＭ１０００は、炭素数１４の疎水性尾部長を有する（ＣＨ３－（ＣＨ２）１１－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））。
【0077】
撹拌によりＩｇＧタンパク質の凝集を誘発した。試料を４連として、Ｔｈｅｒｍｏ往復振盪機上で１８８往復／分で室温下に２４時間振盪した。約１ｍＬ容の８×４３ｍｍのガラスバイアル（Ｋｉｍｂｌｅ、品番６０８３１Ｄ－８４３）に試験用試料をそれぞれ０．７ｍＬ入れ、Ｐｉｅｒｃａｂｌｅ ＴＰＥ Ｌｙｏ Ｃａｐｃｌｕｓｔｅｒ－９６（Ｍｉｃｒｏｎｉｃ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）栓で施栓した。バイアルは特注の（ｃｕｓｔｏｍ）アルミニウムホルダーに９６ウェル配置で配列した。振盪後の試料をＷｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ ＩＩ装置（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析することにより、界面活性剤が撹拌により誘発される凝集を防止する効果を確認した。これに加えて、振盪前の同じ試料を「無振盪」対照（即ち、「０時間振盪」）としてＤＬＳで分析した。各ウェルを５回ずつ走査し、取得時間は５秒／回とした。正則化を用いたフィッティングを行うことにより、ＩｇＧの集団のサイズ及び流体力学的半径を求めた。１０ｎｍを超える集団をＩｇＧ凝集体と見なし、これに従い、レイリー球（Ｒａｙｌｅｉｇｈ ｓｐｈｅｒｅ）を仮定して、強度百分率を質量百分率に換算することにより、質量パーセントで定量化した。
【0078】
この振盪試験は、界面活性剤がタンパク質を安定化させる能力を理解するために用いるものであり、振盪によって疎水性表面を常時揺動させることにより不安定化が加速するようにした。また、撹拌は、ＩｇＧの凝集を増加させる輸送条件に似ている。図１及び２において、左端のバーは、界面活性剤を含まない対照試料を表す。図１は、２４時間振盪後のＩｇＧの凝集を示すものであり、図２は、振盪前のＩｇＧの凝集を示すものである。図２に示すように、無振盪の対照では、試験を行った全ての界面活性剤の２種類の濃度において、ＩｇＧの凝集は基本的に０％である。図１から、水溶液の総体積を基準として０．０３ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度の１４ＦＭ１０００が、ＩｇＧタンパク質の凝集を効果的に防止できることが示された。更に図１から、水溶液の総体積を基準として０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度の１２ＦＭ１０００も、ＩｇＧタンパク質の凝集を効果的に防止できることが示された。
【0079】
概して、中程度の尾部長はＩｇＧの凝集を防止する作用が最も高く、それよりも短い又は長い尾部長では、ＩｇＧの凝集が増加することが分かった。ＩｇＧの凝集を０．０３ｍｇ／ｍＬ及び０．０５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤濃度間で比較すると、より高い界面活性剤濃度（０．０５ｍｇ／ｍＬ）においては、１２ＦＭ１０００でも凝集はほぼ０％であったが、より低い濃度である０．０３ｍｇ／ｍＬでは、若干の凝集（１～２％）が観察されたことが分かった。８ＦＭ１０００及び１０ＦＭ１０００界面活性剤を用いた試料は、０．０３ｍｇ／ｍＬでは多量（４～７％）に凝集した。より高い濃度である０．０５ｍｇ／ｍＬにおいては、８ＦＭ１０００では、より低い濃度での凝集とほぼ同量の凝集が見られたが、１０ＦＭ１０００では凝集が減少（２～３％）した。この、ＩｇＧの凝集が１０ＦＭ１０００濃度の増加に伴い低下することは、１２ＦＭ１０００濃度を同じように増加した場合に見られる傾向と類似している。１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００は、どちらも凝集が約２～３％であり、試験を行った２種類の濃度間では大きく変化しなかった。
【0080】
動的表面張力測定
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製した。界面活性剤は、それぞれ、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とし、タンパク質はＩｇＧとした。７種類の試料を調製し、１種は０．９％生理食塩水中にＩｇＧを１０ｍｇ／ｍＬ含み、他の６種の試料はそれぞれ０．９％生理食塩水中に各種界面活性剤を０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で含むものとした。
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製した。界面活性剤は、それぞれ、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とし、タンパク質はＩｇＧとした。７種類の試料を調製し、１種は０．９％生理食塩水中にＩｇＧを１０ｍｇ／ｍＬ含み、他の６種の試料はそれぞれ０．９％生理食塩水中に各種界面活性剤を０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で含むものとした。
【0081】
表面張力測定は、Ｔｅｃｌｉｓ Ｔｒａｃｋｅｒペンダントドロップ式界面張力計（Ｔｅｃｌｉｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｉｖｒｉｅｕｘ ｄ’Ａｚｅｒｇｕｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてＲＴで実施した。２５ｍｌ容のキュベットに試料を満たした。１８ゲージのＪ字ニードルを用いて気泡を形成した。装置のフィードバック制御を用いて小滴の面積が一定になるようにした。気泡の輪郭をＬａｐｌａｃｅの式にフィッティングさせることにより表面張力を求めた。試料の表面張力を３連で３０００秒間（１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００、１８ＦＭ１０００及びＩｇＧ）又は６０００秒間（８ＦＭ１０００及び１０ＦＭ１０００）モニタリングした。最初は０．１秒毎に測定を行った。１０秒後以降は１秒毎に測定を行った。
【0082】
動的表面張力（ＤＳＴ）測定は、物質が界面に吸着して再配列する速度論を理解するのに有用である。空気／水界面のＤＳＴを、０．０５ｍｇ／ｍＬの各界面活性剤及び１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧについて測定した（図３Ａ参照）。界面への吸着及び再配列の動力学を定性的に表すように、各ＤＳＴ曲線を二重指数関数的減衰関数にフィッティングした（式１）。σ（ｔ）は、時間ｔにおける表面張力であり、σｅｑは、平衡状態又は無限時間後の表面張力である。更に、τ１は、より速い方の減衰の特性時間であり、θ１は、この最初の減衰に起因する表面張力の低下である。τ２及びθ２は、より遅い方の減衰のそれに相当する。
【数1】
【0083】
式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、親水性の頭部（－Ｒ３）及び疎水性の尾部（－Ｒ１）が再配列して表面に吸着されると考えられている。式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤は、初期の吸着と、おそらくその親水性の高分子頭部（－Ｒ３）に起因する何らかの形の立体配置調整（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）と、による２種類の表面張力減衰をもたらすと仮定すると、最初の減衰は、界面活性剤の表面への初期吸着に対応し（τ１、θ１）、２回目の減衰は、界面活性剤分子がそれらの立体配置を平衡時の配向へと変化させることに対応する（τ２、θ２）と考えられる。高分子の親水性頭部及び炭化水素の疎水性尾部（－Ｒ１）が立体配置を調整している可能性がある。
【0084】
１４ＦＭ１０００は、最初の減衰における表面張力低下率が最大であることが判明した（図３Ｂ）。１４ＦＭ１０００と比較して、尾部長が長く又は短くなると、最初の減衰に由来する表面張力低下率は小さくなる。これは、１４ＦＭ１０００の尾部長に起因して、初期吸着が、他の界面活性剤と比較して最大になることを示している。更に、初期の低下をその低下の時定数で規格化すると、図３Ｃから分かるように、１４ＦＭ１０００は表面張力を最短の時間で最も大きく低下させる。つまり１４ＦＭ１０００は、表面への最初の到達が他と比較してはるかに速い。
【0085】
興味深いことに、２回目の減衰に由来する表面張力の低下量を見ると、逆の傾向がある：尾部がより短い及びより長い（１４ＦＭ１０００と比較して）ものは、いずれも、２回目の減衰における表面張力の低下が最も大きかった（図３Ｄ参照）。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、この傾向は、より長い及びより短い尾部では、平衡に達するまでに立体配置をより大きく変化させることが必要となることに由来する可能性がある。尾部がより長い場合、疎水性尾部は、平衡時の配向で吸着されることができるように、その大部分を再配列させなければならない。試験に供した全ての界面活性剤において、親水性頭部は、ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）、ＰＰＯ（ポリプロピレンオキシド）又はフェニルアラニン領域のいずれかを介して吸着され、それによって表面張力を大きく低下させている可能性がある。この親水性頭部の吸着は、尾部が短い方が、尾部自体の疎水性がそれほど高くないため、より顕著になる可能性がある。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、１４ＦＭ１０００が速やかに吸着するのは、疎水性尾部が、大きく再配列する必要がないほど十分に短いことに由来する可能性があり、その一方で、平衡時にＰＥＯ、ＰＰＯ又はフェニルアラニンを強く（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）吸着させないほど十分な疎水性も有する。そのため、再配列による表面張力低下が非常に小さい。２回目の減衰の特性時間（τ２）は、疎水性尾部長が増加するに従い短くなる（図３Ｅ参照）。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これは、より疎水性の高い尾部は、再配列して、その（より高い）エネルギーを最小化しようとする熱力学的駆動力がより強いためである。２回目の減衰の特性時間に関するこの傾向には、高分子親水性頭部の再配列も影響を与えている可能性があり、これは、尾部の疎水性が低く（短く）なるほど重要になると思われる。高分子親水性頭部は分子量が大きいため、尾部と比較すると、立体配置を変化させるのにかなり長い時間を要し、この再配列に要する時間がτ２の傾向に影響を与えている可能性がある。図３から、１４ＦＭ１０００が、表面張力を速やか且つ大幅に初期低下させる理想的な疎水性尾部長を有することが実証された。
【0086】
１４ＦＭ１０００が吸着する量及び速度により、表面に吸着しようとするＩｇＧとの競合に打ち勝つ能力が高まり、最終的にＩｇＧの凝集を阻止すると考えられる。更に、ＤＳＴデータ及び凝集データを合わせると、より長い及びより短い（１４ＦＭ１０００と比較して）尾部は、表面への吸着がより遅いために、ＩｇＧが疎水性表面に吸着して凝集する時間ができ、より多くのＩｇＧが凝集することを示している。１４ＦＭ１０００が、タンパク質凝集を阻止する性能に関し、ポリソルベート２０及び８０よりも優れている理由は、このように高速吸着する動力学（ｑｕｉｃｋ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ）にあるとも考えられる。更に、もし式Ｉのポリアルコキシ脂肪酸アシル界面活性剤がＩｇＧと入れ替わることができるとすれば、そうなるように表面により速く到達することができる界面活性剤は、より多くのタンパク質と入れ替わり、それによって更なる凝集を防ぐと考えられる。興味深いことに、８ＦＭ１０００は、約５秒後以降の全ての測定時においてＩｇＧよりも表面張力値が高くなる唯一の界面活性剤である（図３Ａ参照）。これは、８ＦＭ１０００が表面を覆う速さがＩｇＧよりも遅いか又はＩｇＧと同程度であることを示唆しており、このことがおそらく、試験を行ったどちらの濃度でも８ＦＭ１０００がＩｇＧの凝集を十分に防げない理由を表している。
【0087】
散逸測定を組み合わせた水晶振動子マイクロバランス
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製した。界面活性剤は、それぞれ、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とし、タンパク質はＩｇＧとした。試料溶液は、生理食塩水中に界面活性剤のみを０．０５ｍｇ／ｍＬで含むか、又は生理食塩水中にＩｇＧのみを１ｍｇ／ｍＬで含むか、又は生理食塩水中に界面活性剤０．０５ｍｇ／ｍＬ及びＩｇＧ１ｍｇ／ｍＬの組合せを含むように調製した。
試料は全て０．９ｗｔ％生理食塩水（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ９ｇ）中で調製した。界面活性剤は、それぞれ、８ＦＭ１０００、１０ＦＭ１０００、１２ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００とし、タンパク質はＩｇＧとした。試料溶液は、生理食塩水中に界面活性剤のみを０．０５ｍｇ／ｍＬで含むか、又は生理食塩水中にＩｇＧのみを１ｍｇ／ｍＬで含むか、又は生理食塩水中に界面活性剤０．０５ｍｇ／ｍＬ及びＩｇＧ１ｍｇ／ｍＬの組合せを含むように調製した。
【0088】
エネルギー散逸測定機能を付与した水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ）（ＱＣＭ－Ｄ）による測定を、ＱＳｅｎｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｏｔｈｅｎｂｅｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）にて、ＳｉＯ２でコーティングされた水晶振動子（型番ＱＳＸ ３０３）を用いて実施した。試料溶液を水晶振動子上に１５０μＬ／分の速度で平衡に達するまで流し、吸着された物質の量を求めた。次いで、０．９ｗｔ％生理食塩水溶液を水晶振動子上に１５０μＬ／分の速度で平衡に達するまで流すことにより、振動子上に吸着した後に洗い流すことができた界面活性剤及び／又はタンパク質の量を求めた。３次高調波の変化をモニタリングし、吸着質量が振動数の変化に比例すると仮定したＳａｕｅｒｂｒｅｙ式に従い、相対的な吸着質量を求めた。界面活性剤のみ又は界面活性剤及びＩｇＧの溶液については、開始後の最初の１０～４０分間の平均をとることにより、相対吸着質量を決定した。生理食塩水による洗浄を行う前の相対吸着質量を求め、生理食塩水で４０分間洗浄した後の平均吸着質量の変化と比較することにより、洗浄率を求めた。更に、１０～４０分間の吸着質量の平均値と、ＩｇＧを含まない各界面活性剤に関する値との差を求めることにより、ＩｇＧの吸着率を算出した（図４Ｃ）。全てのデータを、ＩｇＧのみの試料を用いた場合の平均吸着質量で規格化した（１００任意単位）。
【0089】
ＱＣＭ－Ｄを用いて、シリコーンでコーティングされた水晶振動子の共振周波数の変化をモニタリングすることにより、疎水性の固体表面に吸着しているＩｇＧ及び界面活性剤の質量を明らかにする。更に、洗浄試験を利用することにより、吸着が可逆性なのか又は不可逆性なのかを理解し、界面活性剤及びＩｇＧが表面とどのように相互作用するかを解明する。界面活性剤０．０５ｍｇ／ｍＬのみの試料溶液を振動子表面上に流し、共振振動数の経時変化を測定した。概して、界面活性剤の尾部長が長くなるほど、吸着される界面活性剤の量は増加する（図４Ａ参照）。
【0090】
次いで、０．９ｗｔ％生理食塩水溶液を振動子表面上に流すことにより、洗い流すことが可能な、可逆的に脱着できる界面活性剤の量を測定した。１４ＦＭ１０００よりも尾部が長くなるほど、洗い流すことができる界面活性剤は少なくなることが分かった（図４Ｂ参照）。８ＦＭ１０００から１４ＦＭ１０００までは、尾部が長いほど、洗い流すことができる界面活性剤の割合は高くなる（図４Ｂ参照）。より短い及びより長い尾部（１４ＦＭ１０００と比較して）を有する界面活性剤は、表面上で界面活性剤が再配列することにより、不可逆的に吸着される量が高くなると考えられる。これは、ＤＳＴ測定の結果と一致している。ＩｇＧは可逆的に吸着する量が最も少ないことも分かった。図４Ａ及び４Ｂは、界面活性剤のみの試料及びＩｇＧのみの試料に関するＱＣＭ－Ｄ測定結果である。
【0091】
ＩｇＧ及び界面活性剤の両方を含む試料溶液を振動子表面上に流した。界面活性剤のみの試料を流した場合と比較して、ＩｇＧが吸着されるため、吸着される質量は増加すると考えられる。図４Ｃに示すように、概して、界面活性剤の尾部が長くなるほど吸着されるＩｇＧは少なかったが、１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００の場合は、吸着されるＩｇＧがやや増加した。これはおそらく、これらに関するＤＳＴで観測されたように、吸着速度がより遅く、時間が早いうちはＩｇＧが１６ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００との競合に打ち勝つことができたためである。図４Ｃは、まず、界面活性剤のみの試料の吸着質量を、界面活性剤及びＩｇＧの両方を含む対応する試料の吸着質量から差し引き、次いでこの差し引いた結果を、ＩｇＧのみの試料の吸着質量で除することにより、ＩｇＧの相対的な吸着量を求めたものである（即ち、差し引いた結果をＩｇＧのみの試料の吸着質量で規格化した（１００任意単位））。このデータは、１４ＦＭ１０００が、速やかに吸着されることによってＩｇＧの吸着を阻止し、及び／又は既に吸着されているＩｇＧが不可逆的に吸着される前に入れ換わるのに最適な尾部長を有しているという、ＤＳＴから得られた結論と一致している。更に、ＩｇＧ及び界面活性剤を一緒に洗い流した場合、本発明者らは、ここでもまた、より長い尾部長を有する界面活性剤又はＩｇＧ（より短い尾部長を有する界面活性剤を使用した場合）が不可逆的に吸着するため、１４ＦＭ１０００界面活性剤の可逆的吸着が、尾部長がより長い又は短いものと比較して最大であることを確認した（図４Ｄ参照）。
【0092】
振盪試験並びにＤＳＴ及びＱＣＭ－Ｄ実験から、ＩｇＧの吸着及びその後の凝集を防止する能力に影響を与えると考えられている各界面活性剤の疎水性尾部長が、界面活性剤が吸着する速度、量及び可逆性に影響を与えることが実証された（図５参照）。界面活性剤の初期吸着に関しては、８ＦＭ１０００などの短い尾部は、表面に向かう力が最小であり、したがってほとんど吸着しない。更に、１８ＦＭ１０００などのより長い尾部は、最初の減衰時における吸着が遅いため、ＩｇＧも吸着される。１４ＦＭ１０００又は他の中間の長さの尾部を有する界面活性剤は、初期の吸着が高速且つ強力である（図５Ａ参照）。中間の長さの尾部を有する界面活性剤１４ＦＭ１０００は速やかに吸着できるため、表面への吸着においてＩｇＧとの競合に打ち勝つことができ、再配列することなく表面張力を大きく低下させる。より短い尾部を有する界面活性剤（例えば、８ＦＭ１０００）は、おそらく表面張力を低下させるために立体配置を再配列する必要があるため、それほど強力に吸着されない。したがってＩｇＧは、これらとの競合に打ち勝つことができ、表面上で凝集を開始する。それとは対照的に、１８ＦＭ１０００及び他のより長い尾部は表面に向かう力が強く、ＩｇＧとの競合に打ち勝つが、十分な１８ＦＭ１０００が到達できる前に一部のＩｇＧが既に凝集している（図５Ｂ参照）。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、８ＦＭ１０００の疎水性尾部は疎水性が十分ではなく、そのため、おそらくフェニルアラニン、ＰＰＯ又はＰＥＯ単位などの界面活性剤の他の部分も吸着されると考えられる。また、１８ＦＭ１０００の疎水性尾部は立体配置を変化させる可能性があるので、長い尾部は表面上で効果的に集合することになる。これが、表面での可逆性に影響を与える平衡時の吸着を招く（図５Ｃ参照）。最後に、ＱＣＭ－Ｄにおける生理食塩水による洗浄で示されたように、１４ＦＭ１０００の吸着はより可逆性が高い（図５Ｄ参照）。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これは、２回目の減衰時における表面張力の低下が小さいことと関連していると考えられ、１４ＦＭ１０００をより強力に（ｍｏｒｅ）表面に張り付け得る立体配置の変化がより小さいことを示唆している。他方、８ＦＭ１０００や１８ＦＭ１０００などの界面活性剤並びにＩｇＧは、安定化しようとして、より不可逆的に吸着する。また、生理食塩水による洗浄は、輸送時などにおける任意の動き又は振盪による表面積の変化を模擬しており、１４ＦＭ１０００は、新たに形成された表面上にＩｇＧを凝集させないように保護すること、及びそれ以外の過渡的な表面に張り付かないことに関し最も優れたものとなることを示唆している。
【0093】
１４ＦＭ１０００は、表面にかなり速やかに吸着することができ、それにより、ＩｇＧの吸着、したがって凝集を防ぐことが見出された。１４ＦＭ１０００は、試験に供した他の界面活性剤と比較して、初期吸着速度が最も速い。尾部の短い界面活性剤は吸着が遅く、また、表面にかなり吸着する訳ではないので、ＩｇＧの吸着が可能になってしまう。一方、尾部の長い界面活性剤も同様に吸着が遅く、ＩｇＧの吸着及び凝集を可能にしてしまい、その平衡時の吸着は強力である。更に、１４ＦＭ１０００は吸着の可逆性が最も高い界面活性剤であり、そのため、おそらく、過渡的な表面に速やかに脱着及び吸着する能力が高く、したがって、それぞれの新しい疎水性表面上でＩｇＧを保護し、凝集を防ぐ。界面活性剤及びタンパク質安定化に関わる構造及び活性の関係を理解することは、タンパク質治療薬の安定性及び有用性を向上させる界面活性剤の設計に役立つ。
【0094】
接触角測定
１０ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００（ＦＭ１０００）及び１８ＦＭ１０００のタンパク質付着防止活性を調査するために、様々なポリマー表面上で接触角測定を実施し、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）及びポリソルベート２０（ＰＳ２０）と比較した。バイオプロセスにおいて、生物製剤は多くのポリマー表面（管、フィルター、保管容器など）に曝され、生物製剤はそこに吸着される可能性がある。それにより、高価な材料が損失し、生物製剤が凝集するリスクが高まるのみならず、治療薬の構造が乱れ、その機能が乱れる可能性もある。界面活性剤は、界面における高速動力学を介して、表面への付着を防ぐことができる。（Ｗａｎｇ Ｗ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２００５ Ｊａｎ．３１；２８９（１－２）：１－３０）。
１０ＦＭ１０００、１４ＦＭ１０００（ＦＭ１０００）及び１８ＦＭ１０００のタンパク質付着防止活性を調査するために、様々なポリマー表面上で接触角測定を実施し、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）及びポリソルベート２０（ＰＳ２０）と比較した。バイオプロセスにおいて、生物製剤は多くのポリマー表面（管、フィルター、保管容器など）に曝され、生物製剤はそこに吸着される可能性がある。それにより、高価な材料が損失し、生物製剤が凝集するリスクが高まるのみならず、治療薬の構造が乱れ、その機能が乱れる可能性もある。界面活性剤は、界面における高速動力学を介して、表面への付着を防ぐことができる。（Ｗａｎｇ Ｗ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２００５ Ｊａｎ．３１；２８９（１－２）：１－３０）。
【0095】
接触角測定において、表面の親水性を、水滴とその下にある表面が成す角度を測定することにより評価した。角度が高いほど表面の疎水性が高いことを表し、角度がより低いことは、親水性表面と水との親和性を表す。様々なバイオプロセス用素材を代表するように選択した異なる表面を、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む生理食塩水溶液、生理食塩水又は生理食塩水中の界面活性剤及びＩｇＧの混合物に浸した。本明細書において使用する生理食塩水は、０．９ｗｔ％生理食塩水溶液（ＭｉｌｌｉＱ水１０００ｍＬ中ＮａＣｌ ９ｇ）である。表面は、対照である生理食塩水では、その本来の挙動に近くなり、接触角はより高くなる傾向にあるが、これをＩｇＧのみ（生理食塩水中）に浸すと、親水性の被覆が形成され、接触角測定値は低くなる。異なる濃度の界面活性剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬ）を含む生理食塩水溶液に関し得られた接触角の値は、生理食塩水対照の値及びＩｇＧ対照の値の間にある。生理食塩水対照により近い値は、界面活性剤がタンパク質の付着を防止する能力を有することを表し、ＩｇＧ対照により近い値は、表面へのタンパク質の吸着を防げなかったことを示す。中間の界面活性剤濃度では、部分的なタンパク質の付着が観測された。１４ＦＭ１０００の活性を、より短い又はより長い疎水性尾部を有する誘導体（１０ＦＭ１０００及び１８ＦＭ１０００）及びポリソルベートと比較した。
【0096】
界面活性剤溶液は全て生理食塩水中で調製した。界面活性剤２０～４０ｍｇを生理食塩水１０～２０ｍＬに溶解することにより、２ｍｇ／ｍＬのストック溶液を調製した。これらを全て、界面活性剤が完全に溶解するまで６０℃で撹拌した。次いで、溶液を更に使用する前に室温に戻した。ＩｇＧストック溶液も同様に、生理食塩水中で、通常は４０ｍｇ／ｍＬ（生理食塩水１５０～２２５ｍＬ中６～９ｇ）で調製し、タンパク質が溶解するように激しく撹拌した。ＩｇＧ溶液は全て０．２μｍのポリエーテルスルホンフィルター（ＰＥＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で濾過した後、希釈して最終配合物とした。
【0097】
ＩｇＧ対照、生理食塩水対照並びにＩｇＧ（２０ｍｇ／ｍＬ）及び界面活性剤を含む生理食塩水溶液（界面活性剤濃度範囲０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬ）を、バイアル中で総体積が１５ｍＬとなるように調製した。最終溶液は全て生理食塩水中で調製した。異なる表面を有する小片を溶液中に室温で２４時間浸漬した後、窒素中で乾燥させた。Ｏｓｓｉｌａ装置のカメラと明視野との間に配置した表面の上に水滴（３μＬ×４～６滴）を滴下することにより接触角測定を実施した。静止した滴の画像をＯｓｓｉｌａソフトウェア（ｖ．１．１．０２）で取り込んだ。平均接触角を抽出するための解析もＯｓｓｉｌａソフトウェア（ｖ．３．０．６）を用いて実施した。各表面毎に、４～６滴の平均値をＪＭＰソフトウェア（ｖ．１５）を用いて求めた。結果を表１～４に示す。
【0098】
【表1】
【0099】
【表2】
【0100】
【表3】
【0101】
【表4】
【0102】
表１～４の注釈：（１）生理食塩水対照を除く全ての溶液は、ＩｇＧを２０ｍｇ／ｍＬで含むものとした。（２）生理食塩水対照は、ＩｇＧも界面活性剤も含まない０．９％生理食塩水とした。（３）ＩｇＧ対照は、界面活性剤を含まず、０．９％生理食塩水中にＩｇＧを２０ｍｇ／ｍＬで含むものとした。（４）ＰＶＣはポリ塩化ビニルである。（５）ＰＥＳ、ＰＥ、ＰＶＤＦ、ＰＶＣ、シリコーン及びＰＴＦＥは、表面の高分子素材を意味する。
【0103】
フィルター及びクロマトグラフィーカラム表面での損失の測定
ダウンストリーム処理において、生物学的治療薬は、多様な精製ステップに付される。これは多くのクロマトグラフィーカラム及びフィルターから構成され、ここで相互作用が増えることがタンパク質の吸着又は凝集に繋がる可能性がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ－Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ．ＡＡＰＳ ｓｅｒｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０２１．ＩＳＳＮ ２２１０－７３７１）。ポリソルベートなどの界面活性剤はこれらのタンパク質の安定化を助けることができるが、通常は表面に吸着されてしまうため、製剤の後処理で添加される（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ－２０ ｗｉｔｈ ａｓｅｐｔｉｃ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｍＡｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２５（２），７３５－７４１；Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０，９９（６），２６２０－２６２７）。この問題に対し、予め濾過膜を界面活性剤で飽和させておくことから構成される解決策が提案されている。しかしながら、フィルター内に保持されている量の緩衝剤がタンパク質製品を希釈することに繋がりかねないため、これは必ずしも実現可能ではない。したがって、この予防策では、界面活性剤及び製品の両方を含有する溶液を、後者が希釈されて（Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０，９９（６），２６２０－２６２７）、高価な製品の損失及び収率低下を招くことがないように、勢いよく流す（ｆｌｕｓｈ）ことが必要となる可能性がある。
ダウンストリーム処理において、生物学的治療薬は、多様な精製ステップに付される。これは多くのクロマトグラフィーカラム及びフィルターから構成され、ここで相互作用が増えることがタンパク質の吸着又は凝集に繋がる可能性がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ－Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ．ＡＡＰＳ ｓｅｒｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０２１．ＩＳＳＮ ２２１０－７３７１）。ポリソルベートなどの界面活性剤はこれらのタンパク質の安定化を助けることができるが、通常は表面に吸着されてしまうため、製剤の後処理で添加される（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ－２０ ｗｉｔｈ ａｓｅｐｔｉｃ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｕｒｉｎｇ ｍＡｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２５（２），７３５－７４１；Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０，９９（６），２６２０－２６２７）。この問題に対し、予め濾過膜を界面活性剤で飽和させておくことから構成される解決策が提案されている。しかしながら、フィルター内に保持されている量の緩衝剤がタンパク質製品を希釈することに繋がりかねないため、これは必ずしも実現可能ではない。したがって、この予防策では、界面活性剤及び製品の両方を含有する溶液を、後者が希釈されて（Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０，９９（６），２６２０－２６２７）、高価な製品の損失及び収率低下を招くことがないように、勢いよく流す（ｆｌｕｓｈ）ことが必要となる可能性がある。
【0104】
したがって、バイオプロセスにおいて界面活性剤をうまく機能させるためには、フィルター及びカラム材料に付着しにくい分子を探し出すことが望ましい。他の重要な要素は、界面活性剤が精製用の表面にぶつかった後もその活性を確実に保持する完全性を調べることである。ここで、界面活性剤溶液を広く使用されているフィルター（ＰＶＤＦ、ＰＥＳ）及びカラム（スルホプロピル修飾架橋アガロース、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ及び４級アンモニウム修飾架橋アガロース）に勢いよく流し、濾液及び溶出液を液体クロマトグラフィーで分析した。１４ＦＭ１０００並びにより短い及びより長い尾部を有するその誘導体の溶出をポリソルベート８０（ＰＳ８０）の溶出と比較した。ポリソルベート８０のクロマトグラムを分析すると、最初に一部が回収され、その後の完全な回収に関しては一貫性が見られないことが判明した。
【0105】
表面損失試験において、水中で１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤ストック溶液を調製し、これをｍｉｌｌｉＱ水で希釈することにより、０．０３ｍｇ／ｍＬ（３０ｐｐｍ）の溶液を調製した。シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ Ｌｕｅｒ－ＬｏｋＴＭ ３ｍＬ又は１０ｍＬ）を使用して、フィルター又はクロマトグラフィーカラムに溶液を通過させた。シリンジ表面に界面活性剤が保持される可能性が認められたので、これらを全てシリンジの３倍の体積の０．０３ｍｇ／ｍＬ界面活性剤溶液で予備洗浄した。洗浄後のシリンジを未使用の界面活性剤溶液で満たし、溶液約１００～２００ｍｇを低容量インサート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を収容したバイアル（１２×３２ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に送り込んだ。最初の試料は常に、その後に得られる濾液との比較用対照とするため、フィルター又はカラムを通過させることなくシリンジから直接回収した。フィルター試験においては、シリンジにニードル（ＢＤ ２１Ｇ、０．８ｍｍ×５０ｍｍ）を取り付け、溶液をインサートの底に送り込みやすくした。対照を回収した後、ニードル内を空気で置換して残っている溶液を空にし、フィルターの出口に取り付けた。更に濾液を約１００～２００ｍｇの間隔を空けてバイアルに回収し、溶液の重量を正確に求めるためにその前後でバイアルの重量を測定した。カラム実験においては、カラムを約１５カラム体積の水で予備洗浄することにより保存溶液を除去し、状態調整した。次いでここに、予備洗浄した（フィルターと同様に界面活性剤溶液で濯ぐ）、界面活性剤溶液０．０３ｍｇ／ｍＬを含むシリンジを取り付け、溶液を推奨速度１ｍＬ／分で送液するように設定された垂直配置のシリンジポンプ（Ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶出を実施した。フィルター試験と同様の間隔で試料を回収し、溶液の重量を正確に求めた。
【0106】
界面活性剤の定量を、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（ｖ ７．３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で制御される荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を取り付けた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｖａｎｑｕｉｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて実施した。全ての試料を２０℃に設定したオートサンプラーのチャンバーに充填した。ＡｃｃｌａｉｍＴＭ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３×１５０ｍｍ、粒径３μｍ）を使用し、ｐＨ５に固定した１０ｍＭの水中酢酸アンモニウム（ＬＣ－ＭＳグレード、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びアセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を含む移動相を用いて分離を行った。溶出を０．６ｍＬ／分に設定し、水性移動相９０％から開始した後、アセトニトリルを９５％まで増加させ、この２種の溶液の移行を２分間かけて行った。界面活性剤は、非常に有機性の高い移動相の存在下で溶出した。界面活性剤の濃度が０．０６ｍｇ／ｍＬ～０．０００５ｍｇ／ｍＬの範囲にあるストック溶液も同じ方法で測定することにより検量線を作成し、これを使用して濾液の分取液から界面活性剤を定量した。全ての試料のクロマトグラムからＭｉｌｌｉＱ水のシグナルを差し引いた。全ての解析をＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアで行い、その後、Ｅｘｃｅｌ及びＪＭＰ ｖ．１５で計算した。結果を図６～９に示す。
【0107】
図６は、ＰＶＤＦフィルターを通過させた場合の界面活性剤の損失を示すものである。ＦＭ１０００のピークは大きく変化せず、ＰＳ８０は４つのピークとして現れ、そのうち右側の２つはフィルターを通過した直後から存在したが、左側の２つは濾過により様々に変化した（図６Ｂ参照）。これは、ＰＳ８０組成物の一部の成分（右側の２つのピークで表されるもの）はＰＶＤＦフィルターに吸着されないが、ＰＳ８０組成物の他の成分（左側の２つのピークで表されるもの）は、ＰＶＤＦフィルターに吸着されて失われることを示している。したがって、ＰＳ８０の組成及び特性は濾過中に変化する。これと比較すると、ＦＭ１０００はＰＶＤＦフィルターを均一なピークで通過した（図６Ａ参照）。これは、ＦＭ１０００の組成及び特性が濾過によって変化しないことを示している。
【0108】
図７は、ＰＥＳフィルターを通過させた場合の界面活性剤の損失を示すものである。ＦＭ１０００のピークは大きく変化せず、ＰＳ８０は４つのピークとして現れ、そのうち右側の２つはフィルターを通過した直後から存在したが、左側の２つは濾過により様々に変化した（図７Ｂ参照）。これは、ＰＳ８０組成物の一部の成分（右側の２つのピークで表されるもの）はＰＥＳフィルターに吸着されないが、ＰＳ８０組成物の他の成分（左側の２つのピークで表されるもの）は、ＰＥＳフィルターに吸着されて失われることを示している。したがって、ＰＳ８０の組成及び特性は濾過中に変化する。これと比較すると、ＦＭ１０００はＰＥＳフィルターを均一なピークで通過した（図７Ａ参照）。これは、ＦＭ１０００の組成及び特性が濾過によって変化しないことを示している。
【0109】
図８は、スルホプロピルで修飾した架橋アガロース（ＳＰ ＨＰ）クロマトグラフィーカラムを通過させた場合の界面活性剤の損失を示すものである。ＦＭ１０００のピークは大きく変化せず、ＰＳ８０は４つのピークとして現れ、そのうち右側の２つは、カラムを通過した後、左側の２つよりもはるかに早い時点から存在していた（図８Ｂ参照）。これは、ＰＳ８０組成物の一部の成分（右側の２つのピークで表されるもの）はスルホプロピル修飾架橋アガロースカラムに吸着されないが、ＰＳ８０組成物の他の成分（左側の２つのピークで表されるもの）は、スルホプロピル修飾架橋アガロースカラムに吸着されて失われることを示している。したがって、ＰＳ８０の組成及び特性はクロマトグラフィー中に変化する。これと比較すると、ＦＭ１０００はスルホプロピル修飾架橋アガロースカラムを均一なピークで通過した（図８Ａ参照）。これは、ＦＭ１０００の組成及び特性がクロマトグラフィー中に変化しないことを示している。
【0110】
図９は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーカラムを通過させた場合の界面活性剤の損失を示すものである。ＦＭ１０００のピークは大きく変化せず、ＰＳ８０は４つのピークとして現れ、そのうち右側の２つは、カラムを通過した後、左側の２つよりもはるかに早い時点から存在していた（図９Ｂ参照）。これは、ＰＳ８０組成物の一部の成分（右側の２つのピークで表されるもの）はＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに吸着されないが、ＰＳ８０組成物の他の成分（左側の２つのピークで表されるもの）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに吸着されて失われることを示している。したがって、ＰＳ８０の組成及び特性はクロマトグラフィー中に変化する。これと比較すると、ＦＭ１０００はＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを均一なピークで通過した（図９Ａ参照）。これは、ＦＭ１０００の組成及び特性がクロマトグラフィー中に変化しないことを示している。
【0111】
図１０は、４級アンモニウム修飾架橋アガロース（Ｑ ＨＰ）クロマトグラフィーカラムを通過させた場合の界面活性剤の損失を示すものである。ＦＭ１０００のピークは大きく変化せず、ＰＳ８０は４つのピークとして現れ、そのうち右側の２つは、カラムを通過した後、左側の２つよりもはるかに早い時点から存在していた（図１０Ｂ参照）。これは、ＰＳ８０組成物の一部の成分（右側の２つのピークで表されるもの）は４級アンモニウム修飾架橋アガロースカラムに吸着されないが、ＰＳ８０組成物の他の成分（左側の２つのピークで表されるもの）は、４級アンモニウム修飾架橋アガロースカラムに吸着されて失われることを示している。したがって、ＰＳ８０の組成及び特性はクロマトグラフィー中に変化する。これと比較すると、ＦＭ１０００は４級アンモニウム修飾架橋アガロースカラムを均一なピークで通過した（図１０Ａ参照）。これは、ＦＭ１０００の組成及び特性がクロマトグラフィー中に変化しないことを示している。
【0112】
界面活性剤の量を９０ｗｔ％に到達させるために必要な界面活性剤溶液の体積を見極めるために分析を行った。つまり、濾液／溶出液中に含まれている界面活性剤の累積量を分析し、どの時点（濾液／溶出液の体積）で、界面活性剤（界面活性剤溶液に含まれるもの）の累積量が、フィルター／カラムに供給した界面活性剤（界面活性剤溶液に含まれていたもの）の総量の９０ｗｔ％に到達するかを見定めた。結果を表５にまとめる。
【0113】
表５の最上段は界面活性剤の種類を示し、左の列はフィルター又はクロマトグラフィーカラムの種類を示す。表中の量は、濾液／溶出液中から回収された界面活性剤が９０±１ｗｔ％に到達するまでに必要な濾液／溶出液の体積（ｍＬ単位）を表す。体積が多いほど、濾液／溶出液から界面活性剤を回収するまでに長い時間を要する。表５の体積値は、濾液／溶出液の分取液中の各成分のＨＰＬＣ－ＣＡＤピークを積算した後、濾過しなかった又はカラムを通過させなかった試料中の量を１００％として、その値で除することにより求めた。体積値は、各運転の閾値である９０ｗｔ％に到達した最初の分取液を記録した。
【0114】
【表5】
【0115】
概要又は実施例において上に記載された行為の全てが必要であるわけではないこと、特定の行為の一部が必要とされない場合があること及び１つ以上の更なる行為が、記載されているものに加えて行われ得ることに留意されたい。更にまた、行為が列挙される順番は、必ずしも行為が行われる順番ではない。
【0116】
上述の本明細書では、概念を特定の実施形態に関連して説明してきた。しかしながら、当業者であれば、様々な修正形態及び変更形態が、以下の特許請求の範囲に示した本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解するであろう。したがって、本明細書は、限定的意味ではなく例示的なものと見なすべきであり、こうした改変は全て、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
【0117】
利益、他の利点及び問題の解決策について、特定の実施形態に関し上に説明してきた。しかしながら、利益、利点、問題の解決策及び任意の利益、利点又は解決策を生じさせ得る又はより顕著にならせ得る任意の特徴は、特許請求の範囲のいずれか又は全ての決定的に重要な、必要な又は不可欠な特徴として解釈されるべきではない。
【0118】
明確にするために、別個の実施形態に関連させて本明細書に記載された特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態で提供され得ることも理解すべきである。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態に関連させて記載した様々な特徴は、別々に又は任意の部分的な組合せでも提供され得る。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】