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特表2023-535570エンテロウイルスに対する広域スペクトル抗ウイルス薬及びその応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-18

(54)【発明の名称】エンテロウイルスに対する広域スペクトル抗ウイルス薬及びその応用

(51)【国際特許分類】

A61K 38/04 20060101AFI20230810BHJP

C07K 7/08 20060101ALI20230810BHJP

A61K 38/16 20060101ALI20230810BHJP

A61P 31/14 20060101ALI20230810BHJP

【ＦＩ】

A61K38/04

C07K7/08 ZNA

A61K38/16

A61P31/14

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504474

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2023-01-20

(86)【国際出願番号】 CN2021081723

(87)【国際公開番号】W WO2022021902

(87)【国際公開日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】202010735992.8

(32)【優先日】2020-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520266513

【氏名又は名称】中国科学院武漢病毒研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】周渓

(72)【発明者】

【氏名】方媛

(72)【発明者】

【氏名】邱洋

(72)【発明者】

【氏名】呉迪

(72)【発明者】

【氏名】黄ムハン

(72)【発明者】

【氏名】舒テン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA09

4C084BA18

4C084BA19

4C084BA23

4C084CA59

4C084DC32

4C084NA14

4C084ZB331

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045DA55

4H045EA29

(57)【要約】

本発明で提供されるポリペプチド阻害剤の核心配列の１つは配列番号１に示され、膜透過ペプチドを含むポリペプチドの配列は配列番号２に示される。本発明で提供されるポリペプチドは、エンテロウイルス２Ｃタンパク質の多量体化を標的とし、エンテロウイルス２Ｃタンパク質を標的とする他の阻害剤と比較して、阻害効率が高く、安全性が良く、エンテロウイルスの予防と制御のための新しい戦略を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の配列を有する広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤。
（Ｘ１）Ｅ（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｒ（Ｘ５）（Ｘ６）（Ｘ７）（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）ＥＡＬＦＱで示される配列Ｉ、
（ただし、Ｘ１は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
Ｘ２は、チロシン（Ｙ）及びアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、
Ｘ３は、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）及びアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、
Ｘ４は、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、
Ｘ５は、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、
Ｘ６は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択され、
Ｘ７は、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｘ８は、グリシン（Ｇ）及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択され、
Ｘ９は、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択され、
Ｘ１０は、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
Ｘ１１は、イソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）からなる群から選択される）或いは
配列Ｉに少なくとも１つのアミノ酸が欠失、付加又は置換された配列である配列ＩＩ、或いは
配列Ｉ又は配列ＩＩに記載されたアミノ酸配列と少なくとも５０％相同性を有し、かつエンテロウイルス活性を阻害する配列である配列III、或いは
配列Ｉ又は配列ＩＩ又は配列IIIの相補的配列である配列IV。

【請求項2】

配列番号１又は配列番号２４に示される配列を有するか、或いはそれらのＤ立体配置のポリペプチドである、広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１又は配列番号２４に示される配列を含む、エンテロウイルスを阻害するポリペプチド。

【請求項4】

前記配列が配列番号２又は配列番号２０に示される、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項5】

配列番号２１に示される配列のポリペプチドのＮ末端に１～５個のアミノ酸を付加したもの、或いは
配列番号２１に示される配列のポリペプチドのＮ末端に１～１３個のアミノ酸を削減するか又はＣ末端に修飾したもの、或いは
上記のいずれかのポリペプチドのＤ立体配置である、広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド。

【請求項6】

膜透過ペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

配列番号３～２０のいずれか１項に示される配列を有することを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

エンテロウイルス阻害剤の調製における、請求項１～３、５～７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項9】

エンテロウイルス感染を治療又は予防するための医薬品の調製における、請求項１～３、５～７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項10】

前記エンテロウイルスには、ヒトエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ＥＶ）、コクサッキーウイルスＡ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＡｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）などが含まれるが、これらに限定されない、請求項８又は９に記載の使用。

【請求項11】

前記のエンテロウイルス感染による疾患には、手足口病、心筋炎、ヘルペス性アンギナ、無菌性髄膜炎、脳炎、ウイルス性風邪などが含まれる、請求項９に記載の使用。

【請求項12】

ウイルス疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、エンテロウイルス２Ｃタンパク質の多量体化を標的として阻害する製剤の、使用。

【発明の詳細な説明】

【相互参照】

【0001】

この出願は、２０２０年０７月２８日に中国特許庁に出願され、出願番号２０２０１０７３５９９２．８、発明の名称「エンテロウイルス２Ｃタンパク質を標的とする広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤及びその応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容が援用により本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、生物医学の技術分野に関し、より具体的には、エンテロウイルスに対する広域スペクトル抗ウイルス薬及びその応用に関する。

【背景技術】

【0003】

エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）は、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）のエンテロウイルス属に属するプラスセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスであり、主にヒトエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ＥＶ）、コクサッキーウイルスＡ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＡｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）などを包含する。エンテロウイルス感染は世界中に広く分布しており、臨床症状として軽度の微熱、疲労、気道疾患から、ヘルペス性アンギナ、手足口病、及び重度の無菌性髄膜炎、心筋炎、脳炎、ポリオ灰白髄炎などに至るまで、複雑で多様である。現在、エンテロウイルス感染を効果的に治療又は防御するための対症療法薬は不足している。

【0004】

ヘルペス性アンギナは、主にコクサッキーウイルスＡ群２型（ＣＶＡ２）、ＣＶＡ４、ＣＶＡ６、ＣＶＡ９、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ２２型、及びＢ群１型（ＣＶＢ１）、ＣＶＢ２、ＣＶＢ３、ＣＶＢ４、ＣＶＢ５型により引き起こされる。ヘルペス性アンギナには、しばしば急激に発熱し、熱が低度又は中等度である場合が多いが、たまに４０℃以上に達し、痙攣を起こすことさえある。発熱期間は約２～４日である。年長の患児には、のどの痛みを訴えることがあり、嚥下を影響する可能性がある。乳幼児には、よだれ、拒食、イライラが現れることがある。頭痛、腹痛又は筋肉痛を伴うことがあり、５歳以下の小児の約２５％に嘔吐が伴うことがある。典型的な症状は、咽頭に現れ、咽頭の充血として現れ、発症後２日以内に口腔粘膜に数個（少なければ１～２個、多くければ１０個以上に達する）の小さな（直径１～２ｍｍ）灰白色のヘルペスが出現、周囲が赤くなる。２～３日後、紅潮が強まり拡大し、ヘルペスが破裂して黄色の潰瘍を形成する。この種の粘膜発疹は、扁桃腺の前柱でより一般的であり、軟口蓋、口蓋垂、扁桃腺にも位置する可能性があるが、歯茎や頬粘膜に影響を及ぼさない。病気の経過は通常４～６日で、場合によっては２週間に延長される。

【0005】

手足口病は、主にエンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）、ＣＶＡ６、ＣＶＡ８、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６、ＣＶＢ３及びＣＶＢ５により引き起こされる。手足口病の一般的な臨床症状は、急性の発熱、口の痛み、食欲不振、口腔粘膜の散在性ヘルペス又は潰瘍であり、舌、頬粘膜及び硬い額などに位置する場合が多く、軟口蓋、歯肉、扁桃腺及び咽頭にも影響を及ぼす可能性がある。手、足、臀部、腕、脚に斑状丘疹が現れ、後にヘルペスに変わり、ヘルペスの周囲に炎症性紅潮が見られる場合があり、ヘルペス内の液体は少ない。手足部に多く、手のひらの裏にもある。皮膚発疹の数は、数個から数十個までである。消失後に痕跡を残さず、色素沈着がない。一部の手足口病の患児には、最初の症状としてヘルペス性アンギナが現れ、その後、手のひら、足の裏、臀部などの部位に赤い皮膚発疹が現れることがある。病気の経過が急速に進むと、少数の患児には手足口病から重度の無菌性髄膜炎、脳炎などを発症することがある。発熱、頭痛、吐き気、嘔吐後の脳膜刺激症状として現れ、体温の変動が大きく、多数の症例には微熱であるが、４０℃以上になることもあり、病気の経過で二峰性の発熱型がしばしば見られる。その他の症状として、のどの痛み、筋肉痛、皮膚発疹、羞明、下痢、リンパ節の腫れなどがあり、少数の症例には軽度の麻痺などが現れることがある。

【0006】

心筋炎は、主にＣＶＢ１－６１及びＥｃｈｏｖｉｒｕｓにより引き起こされる。ウイルス性心筋炎は、患者の臨床症状が病変の範囲と部位に依存し、軽症の場合は無症状で、重症の場合は心不全、心原性ショック及び突然死が現れることがある。多くの場合、発症の１～３週間前に上気道や腸の感染症の既往歴があり、発熱、体の痛み、のどの痛み、倦怠感、吐き気、嘔吐、下痢などの症状として発症し、その後、動悸、胸の圧迫感、胸の痛み又は前胸部の痛み、めまい、呼吸困難、浮腫が現れ、なお、アダムス・ストークス症候群などの症状が現れる恐れもある。少数の患者には心不全又は心原性ショックを発症する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

エンテロウイルスは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスで、ゲノムサイズが約７．５ｋｂで、ポリタンパク質をコードできる大きなＯＲＦを含む。ポリタンパク質は、４つの構造タンパク質（ＶＰ１－ＶＰ４）と７つの非構造タンパク質（２Ａ－２Ｃ及び３Ａ－３Ｄ）に加水分解される。２Ｃタンパク質は、エンテロウイルス（ＥＶ７１、ＣＶＡ、ＣＶＢ及びＥｃｈｏｖｉｒｕｓなどを含む）で保存性の高い非構造タンパク質であり、相同性多量体の形で存在する。エンテロウイルス２Ｃタンパク質はＲＮＡヘリカーゼ活性を持ち、古典的なスーパーファミリー３（ＳＦ３）ヘリカーゼである。ＥＶ７１とＰＶに関する多数の研究により、２Ｃのヘリカーゼ活性がウイルスの複製と増殖に必要であり、２Ｃタンパク質の多量体化がそのヘリカーゼ機能に不可欠であることが証明されている。そこで、本発明では、２Ｃの多量体化領域に対してポリペプチド薬物を設計し、その多量体化形成を阻害してヘリカーゼの機能を阻害し、最終的にウイルス複製を阻害するという目的を達成するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明で提供されるポリペプチドは、高効率、広域スペクトルの抗ウイルス活性を有する。本発明によれば、ＥＶ７１、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ４、ＣＶＡ６、ＣＶＡ１０、ＣＶＢ３、ＣＶＢ５、Ｅｃｈｏ１１などのエンテロウイルスの予防と制御のための新しい戦略を提供すると同時に、抗ヒトエンテロウイルスポリペプチド小分子薬の開発を加速するための新しい理論的基礎も提供する。

【0009】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ウイルス疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、エンテロウイルス２Ｃタンパク質の多量体化を標的として阻害する製剤の応用を提供することを目的とする。

【0010】

本発明は、広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤を提供することを別の目的とする。前記阻害剤の核心配列は配列番号２１に示され、具体的には、配列番号１又は配列番号２４に示されることがあり、また、それに膜透過ペプチドを付加した配列はそれぞれ配列番号２、配列番号２０に示される。

【0011】

本発明は、エンテロウイルス阻害剤の調製における上記ポリペプチド阻害剤の使用を提供することを他の目的とする。

【0012】

上記発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術案を提供する。

【0013】

下記の配列を有する広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤：
（Ｘ１）Ｅ（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｒ（Ｘ５）（Ｘ６）（Ｘ７）（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）ＥＡＬＦＱで示される配列Ｉ
（ただし、Ｘ１は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
Ｘ２はチロシン（Ｙ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、
Ｘ３は、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）及びアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、
Ｘ４は、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、
Ｘ５は、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、
Ｘ６は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択され、
Ｘ７は、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択され、
Ｘ８はグリシン（Ｇ）及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択され、
Ｘ９は、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択され、
Ｘ１０は、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
Ｘ１１はイソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）からなる群から選択される）、或いは
配列番号２１に示される配列、或いは
配列Ｉに少なくとも１つのアミノ酸が欠失、付加又は置換された配列である配列ＩＩ、或いは配列Ｉ又は配列ＩＩに記載されたアミノ酸配列と少なくとも５０％相同性を有し、かつエンテロウイルス活性を阻害する配列である配列III、或いは
配列Ｉ又は配列ＩＩ又は配列IIIに記載された配列の相補的配列であるIV。

【0014】

本発明に記載された「アミノ酸」には、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸が含まれる。当業者に知られているアミノ酸の種類はすべて本発明の保護範囲内である。

【0015】

上記の配列は、ＲＥＹＮ（Ｘ４）Ｒ（Ｘ５）（Ｘ６）（Ｘ７）（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）ＥＡＬＦＱで示される配列、配列番号２２に示される配列であることが好ましい。前記配列はＲＥＹＮ（Ｘ４）Ｒ（Ｘ５）（Ｘ６）（Ｘ７）Ｇ（Ｘ９）Ｔ（Ｘ１１）ＥＡＬＦＱで示される配列、配列番号２３に示される配列であることがさらに好ましい。

【0016】

本発明の具体的な実施形態では、配列は配列番号１又は配列番号２４に示され、また、両者とも膜透過ペプチドを付加することができ、配列番号１に示される配列に膜透過ペプチドを付加した配列は配列番号２に示され、配列番号２４に示される配列に膜透過ペプチドを付加した配列は配列番号２０に示される。

【0017】

また、本発明の保護内容には、配列番号１又は配列番号２４に示される配列を含有するエンテロウイルスを阻害するポリペプチド配列が含まれ、また、ポリペプチドＲＱ（配列番号２）又はＢ－ＲＱ（配列番号２０）に示されるように、異なる膜透過配列を置換したり、ポリペプチド修飾を行ったり、非天然アミノ酸の設計及び改造を行ったりした後にエンテロウイルス活性を阻害する阻害剤も含まれる。

【0018】

本発明においては、配列番号２１～２３のいずれかに示される配列のポリペプチドは、本発明の核心ポリペプチドであり、そのＮ末端にアミノ酸を付加又は欠失したポリペプチド、又はそのＣ末端に修飾したポリペプチド、又はこれらのポリペプチドのＤ立体配置は、エンテロウイルスの阻害剤の調製において、又はエンテロウイルス感染を治療又は予防するための医薬品の調製において応用することができる。

【0019】

好ましくは、核心ポリペプチドに対する上記の修飾改造は以下の通りである：
そのＮ末端に１～５個のアミノ酸を付加したもの、１～１３個のアミノ酸を欠失したもの、Ｃ末端に修飾したもの、又はこれらのポリペプチドのＤ立体配置は、いずれも核心ポリペプチドと同じ阻害活性を有する。具体的には、アミノ酸を付加するには、そのＮ末端にＳ、Ｅ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸を付加させることがあり、例えばＬＩジペプチドやＳＥＬＩテトラペプチドを付加する。アミノ酸を欠失するには、そのＮ末端に１～１３個のアミノ酸（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又は１３個）を順次欠失させることができる。Ｃ末端に修飾するには、Ｃ末端にアミノ酸Ａ（βＡ）、Ｋ、並びにＰＥＧ４（テトラポリエチレングリコール）、Ｃ１６（パルミチン酸）及びＣｈｏｌ（コレステロール）などを修飾することができる。本発明における具体的な修飾タイプとしては、まずＣ末端にＡＫジペプチドを修飾し、次にＰＥＧ４、Ｃ１６及びＣｈｏｌなどを付加、欠失（ＰＥＧ４、Ｃ１６及びＣｈｏｌの間にＡ/Ｋを付加してもよい）することが普通であり、例えばＡＫ－Ｃ１６、ＡＫ－ＰＥＧ４－Ｋ－Ｃ１６、ＡＫ－Ｃｈｏｌである。本発明の具体的な実施形態では、本発明は、配列番号１に示される配列を例として上記の修飾や改造を行ってなされたものであるが、同様に、配列番号２４に示される配列に基づいて行うこともできる。

【0020】

本発明に係る阻害剤としては、これらの阻害活性を有するポリペプチドに基づいて膜透過ペプチドを付加すればなされる。膜透過ペプチドを構築する方法としては、例えば、膜透過ペプチド＋リンカーペプチド＋本発明で提供される活性ポリペプチドのような、膜透過ペプチドと本発明における阻害活性を有するポリペプチドをリンカーペプチドを介して連結する従来の手段である。なお、Ｃ末端に修飾されたものは、膜透過ペプチドを付加しなくてもよい。

【0021】

なお、当該分野における従来の手段で得られる上記の配列も、本発明に含まれる。前記の従来の手段には、人工合成、原核又は真核で上記タンパク質を含有する組換えタンパク質を発現することが含まれるが、これらに限定されない。

【0022】

広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤の使用には、配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、又は上述したそのＮ末端にアミノ酸を付加又は欠失したポリペプチド、又はそのＣ末端に修飾したポリペプチド、又はこれらのポリペプチドのＤ立体配置を利用し、エンテロウイルスの阻害剤として調製するための使用、又はエンテロウイルス感染を治療又は予防するための薬剤として調製するための使用が含まれる。

【0023】

好ましくは、上記の使用における前記エンテロウイルスには、ヒトエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ＥＶ）、コクサッキーウイルスＡ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＡｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）などを含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）エンテロウイルス属が含まれるが、これらに限定されない。

【0024】

上記の使用におけるエンテロウイルス感染による疾患には、手足口病、心筋炎、ヘルペス性アンギナ、無菌性髄膜炎、脳炎、ウイルス性風邪などが含まれる。

【発明の効果】

【0025】

本発明は、従来技術と比較して、以下の利点を有する：

【0026】

本発明に係るポリペプチド及びその誘導体は、エンテロウイルス２Ｃの多量体化を阻害することによりそのヘリカーゼ機能を阻害することができ、新しいタイプのエンテロウイルス治療薬であり、新しい標的を対するものであり、抗ウイルス薬耐性などに重要な意義を有する。

【0027】

本発明により選別されたＲＱポリペプチドは、高効率の抗ウイルス活性を有する。これは、エンテロウイルスの予防と制御のための新しい戦略を提供すると同時に、抗ヒトエンテロウイルスポリペプチド小分子薬の開発を加速するための新しい理論的基礎も提供する。また、ＲＱシリーズのポリペプチドは、明確な抗ウイルスメカニズムを有するので、その応用の安全性と最適化アプローチの明確性が保証され、今後のさらなる開発に有利である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、ポリペプチドＳＱ、ＬＱ及びＲＱの細胞毒性測定の結果を示す。

【図2】図２は、ポリペプチドＲＱがＲＤ、Ｖｅｒｏ、ｈｕｈ７、２９３Ｔ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定結果を示す。

【図3】図３は、ポリペプチドＬＱ、ＳＱがＶｅｒｏ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定結果を示す。

【図4】図４は、ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＣＶＡ１６を阻害する効率の測定結果を示す。

【図5】図５は、ポリペプチドＲＱがＥＶ７１の２Ｃヘリカーゼ活性を阻害する結果を示す。

【図6】図６は、ポリペプチドＲＱがＥＶ７１及びＣＶＡ１６の２Ｃヘリカーゼ活性を阻害する結果を示す。

【図7】図７は、ポリペプチドＲＱがＥＶ７１の２Ｃタンパク質の多量体化を阻害する結果を示す。

【図8】図８は、ポリペプチドＲＱの膜透過効率の検出結果を示す。

【図9】図９は、様々な細胞におけるポリペプチドＲＱの毒性の測定結果を示す。

【図10】図１０は、ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＣＶＢ３を阻害する効率の測定結果を示す。

【図11】図１１は、ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＥｃｈｏ１１を阻害する効率の測定結果を示す。

【図12】図１２は、ポリペプチドＲＱがマウス体内においてＥＶ７１に対して示した抗ウイルス活性の検出結果を示す。

【図13】図１３は、ポリペプチドＲＱの改造体の抗ウイルス活性の検出結果を示す。

【図14】図１４は、ポリペプチドＲＱの修飾体の抗ウイルス活性の検出結果を示す。

【図15】図１５は、ポリペプチドＲＱ－ＤＲＩがＲＤ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定結果を示す。

【図16】図１６は、ＲＤ細胞でのポリペプチドＢ－ＲＱの毒性の検出結果を示す。

【図17】図１７は、ポリペプチドＢ－ＲＱがＲＤ細胞においてＣＶＢ３及びＥｃｈｏ１１を阻害する効率の測定結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明は、エンテロウイルスに対する広域スペクトル抗ウイルス薬及びその応用（エンテロウイルス２Ｃタンパク質を標的とする広域スペクトル抗エンテロウイルスのポリペプチド阻害剤及びその応用）を開示し、当業者なら、本明細書の内容を参照して、プロセスパラメータを適切に改善して実現することができる。なお、すべての同様の置換や修正は当業者にとって明らかであり、本発明に含まれると見なされることに留意する必要がある。本発明に係るポリペプチド阻害剤、抗ウイルス薬及び応用は、好ましい実施形態を通じて説明したが、本発明の技術を実現して応用するためには、本発明の内容、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載されたポリペプチド阻害剤、抗ウイルス薬及び応用に対して修正又は適切な変更及び組み合わせを行う可能性があることは当業者なら自明である。

【0030】

本発明では、ＥＶ７１ウイルスを例として、それに対する本発明で提供されるポリペプチドの阻害効果を検証する。本発明に係る阻害剤は、特別に、エンテロウイルス２Ｃタンパク質を標的として設計されたものであり、エンテロウイルス２Ｃタンパク質を有するウイルスである限り、有効である。前記ウイルスの例としては、コクサッキーウイルスＡ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＡｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ群（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。スペースの都合で割愛する。

【0031】

本発明における、エンテロウイルス２Ｃタンパク質に対して設計された阻害タンパク質の配列の１つは、核心配列として配列番号１に示されるＲＥＹＮＮＲＳＡＩＧＮＴＩＥＡＬＦＱであり、また、それを生体内で機能させるためには、該核心タンパク質に膜透過ペプチドを連結する。このように得られた膜透過ペプチドが連結されたポリペプチドは、配列番号２に示されるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＲＥＹＮＮＲＳＡＩＧＮＴＩＥＡＬＦＱであり、ポリペプチドＲＱと命名した。

【0032】

また、本出願人は、エンテロウイルス２Ｃタンパク質に対して膜透過ペプチドを含む、下記の配列を有する他の２つの阻害ポリペプチドを設計した。

【0033】

ポリペプチドＬＱと命名した配列番号３：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＬＩＲＥＹＮＮＲＳＡＩＧＮＴＩＥＡＬＦＱ

【0034】

ポリペプチドＳＱと命名した配列番号４：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＳＥＬＩＲＥＹＮＮＲＳＡＩＧＮＴＩＥＡＬＦＱ

【0035】

ＥＶ７１の２Ｃタンパク質は多量体化の能力があり、その多量体化は２Ｃがヘリカーゼ機能を正しく発揮することに重要な役割を果たす。本出願人は、２Ｃ多量体化ドメインの構造組成と配列特性に基づいて、２Ｃタンパク質の多量体化に必要な核心配列の１つであるＲＥＹＮＮＲＳＡＩＧＮＴＩＥＡＬＦＱ（配列番号１）に対して、一連のポリペプチド配列を設計した。本出願人は、スクリーニングにより、ポリペプチドＲＱがより高いウイルス阻害能を有することを見出した。試験により、ＲＱが効率的に細胞に侵入することができ、そしてインビトロで２Ｃタンパク質の正しい多量体化を阻害し、２Ｃタンパク質のヘリカーゼ機能を阻害することができることが確認された。また、本出願人は、ＲＱに基づいてその構造を改造し、一連の改造体を構築し、そしてこれらの改造体もより良い抗ウイルス能力を有することを見出した。
本発明に関するポリペプチドを表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

本発明においては、ポリペプチド配列におけるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ）は膜透過ペプチドであり、ＧＳＧはリンカーペプチドであり、各ポリペプチドのアミノ酸配列から前記膜透過ペプチドとリンカーペプチドを除いた配列は核心ポリペプチド配列又はその部分配列である。配列番号３及び４に示される配列ポリペプチドは、膜透過ペプチド＋リンカーペプチド＋配列番号１に示される配列の核心ポリペプチドのＮ末端にＬＩ及びＳＥＬＩを付加したポリペプチドである。配列番号５～１５に示される配列ポリペプチドは、膜透過ペプチド＋リンカーペプチド＋配列番号１に示される配列の核心ポリペプチドのＮ末端に１～１２個のアミノ酸を順次に削減したポリペプチドである。配列番号１６～１８に示される配列ポリペプチドは、配列番号１に示される配列の核心ポリペプチドのＣ末端にアミノ酸Ａ（βＡ）、Ｋ、及びＰＥＧ４（テトラポリエチレングリコール）、Ｃ１６（パルミチン酸）及びＣｈｏｌ（コレステロール）を修飾したポリペプチドである。配列番号１９に示される配列ポリペプチドは、配列番号１に示される配列の核心ポリペプチドのＤ立体配置である。配列番号２０に示される配列ポリペプチドは、膜透過ペプチド＋リンカーペプチド＋配列番号２４に示される配列の核心ポリペプチドである。

【実施例】

【0038】

本発明の各実施例におけるポリペプチドには、陰性対照を設置して、本発明で提供されるポリペプチドの核心配列が相対的抗ウイルス効果を有することを証明する。

【0039】

本発明で提供されるポリペプチド及びその応用に使用される原料及び試薬は、いずれも市販されている。

【0040】

以下、実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。
実施例１：Ｖｅｒｏ細胞におけるポリペプチドＲＱ、ＬＱ及びＳＱの毒性

【0041】

１．実験材料
ＶｅｒｏＥ６細胞、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）はプロモーター社から購入した。

【0042】

ポリペプチドＳＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号４に示され、ポリペプチドＬＱは南京ジェンスクリプト公司（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）により合成され、その配列が配列番号３に示される。ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0043】

２．実験過程
抗ウイルスの過程で、ポリペプチドはウイルスを阻害するだけでなく、細胞に対して毒性を示さないことを保証する必要がある。そのため、細胞毒性試験によりこの指標を検出し、何も処理されていない細胞を対照群とした。

【0044】

手順は次の通りである：
（１）９６ウェル細胞プレートにＶｅｒｏ細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ敷いた。

【0045】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終のポリペプチド濃度がそれぞれ０．０７３２４２μＭ、０．１４６４８４μＭ、０．２９２９６９μＭ、０．５８５９３８μＭ、１．１７１８７５μＭ、２．３４３７５μＭ、４．６８７５μＭ、９．３７５μＭ、１８．７５μＭ、３７．５μＭ、７５μＭ、１５０μＭとなるように、一定濃度勾配のポリペプチドＲＱ又はＬＱ又はＳＱを加えた。

【0046】

（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後にサンプルを採取し、各ウェルに生細胞検出剤ＣＣＫ－８を１０μｌずつ加え、均一に混合した。

【0047】

（４）３７℃で２時間放置した。

【0048】

（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０の吸光度値を検出した。

【0049】

結果を図１、表２～４に示す。未処理細胞の細胞生存率を１００％として、各ポリペプチドのＣＣ５０を算出した。ＲＱのＣＣ₅₀は＞１５０μＭ（図１Ａ）、ＬＱのＣＣ₅₀は＞１５０μＭ（図１Ｂ）、ＳＱのＣＣ₅₀は１３４．３μＭ（図１Ｃ）であった。

【0050】

【表2】

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

実施例２：ポリペプチドＲＱがＲＤ、Ｖｅｒｏ、ｈｕｈ７、２９３Ｔ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定

【0054】

１．実験材料
ＲＤ細胞、ＶｅｒｏＥ６細胞、ｈｕｈ７細胞、２９３Ｔ細胞、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、ＯｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）はＷｕＨａｎＵ－ＭｅＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．，Ｃｏ．から購入した。ＲＮＡ及びｑＲＴ－ＰＣＲを抽出する過程で使用された水はＤＥＰＣ水である。実験全体はＲＮａｓｅなしの環境で行われた。

【0055】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。膜透過ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ）は対照として南京ジェンスクリプト株式会社により合成された。

【0056】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにそれぞれ異なる細胞を敷いた。

【0057】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地（各ウェルの２％血清のＤＭＥＭ培地の添加量を０．５ｍｌとした。）に交換し、各ウェルに１×１０⁶ＰＦＵ／ｍＬのＥＶ７１ウイルスを５μｌ加えた。

【0058】

（３）１時間後、最終濃度０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの異なるポリペプチド（ＲＱ又はＴＡＴ対照）をそれぞれ加え、ポリペプチド無添加群を対照とした。

【0059】

（４）ＥＶ７１ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0060】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0061】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0062】

（７）ウェル中の溶液を取り出してＲＮＡ抽出カラムに移し、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0063】

（８）チューブから回収した溶液をカラムに再度供して、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0064】

（９）ＲＮＡ洗浄緩衝液１を加え、１２０００ｇで３０秒間遠心した。

【0065】

（１０）ＲＮＡ洗浄緩衝液２を加え、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0066】

（１１）工程（１０）を繰り返した。

【0067】

（１２）空カラムを１２０００ｇで２分間遠心し、残留のＲＮＡ洗浄緩衝液を完全に除去した。

【0068】

（１３）５０μｌのＤＥＰＣ水を加え、１２０００ｇで２分間遠心した。

【0069】

（１４）２μｌのＲＮＡサンプルを採取し、ｏｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキットで蛍光定量実験を行った。

【0070】

結果を図２、表５～９に示す。異なる細胞におけるポリペプチドＲＱの抗ＥＶ７１効果試験の結果は以下の通りであった。ＲＤ細胞におけるＩＣ₅₀が１．３５μＭ（図２Ａ）、Ｖｅｒｏ細胞におけるＩＣ₅₀が０．６６μＭ（図２Ｂ）、ｈｕｈ７細胞におけるＩＣ₅₀が０．４１μＭ（図２Ｃ）、２９３Ｔ細胞におけるＩＣ₅₀が３μＭ（図２Ｄ）であり、膜透過ペプチドＴＡＴ対照はＶｅｒｏ細胞において抗ＥＶ７１効果が見られなかった（図２Ｅ）。

【0071】

【表5】

【0072】

【表6】

【0073】

【表7】

【0074】

【表8】

【0075】

【表9】

【0076】

実施例３：ポリペプチドＬＱ、ＳＱがＶｅｒｏ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定

【0077】

１．実験材料
ＶｅｒｏＥ６細胞、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、ＯｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）はＷｕＨａｎＵ－ＭｅＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．，Ｃｏ．から購入した。ＲＮＡ及びｑＲＴ－ＰＣＲを抽出する過程で使用された水がＤＥＰＣ水であった。実験全体はＲＮａｓｅなしの環境で行われた。

【0078】

ポリペプチドＬＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号３に示される。ポリペプチドＳＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号４に示される。

【0079】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにＶｅｒｏＥ６細胞を敷いた。

【0080】

【0081】

（３）１時間後、最終濃度０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの異なるポリペプチド（ＬＱ又はＳＱ）をそれぞれ加え、ポリペプチド無添加群を対照とした。

【0082】

（４）ＥＶ７１ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0083】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0084】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0085】

（７）ウェル中の溶液を取り出してＲＮＡ抽出カラムに移し、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0086】

（８）チューブから回収した溶液をカラムに再度供して、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0087】

（９）ＲＮＡ洗浄緩衝液１を加え、１２０００ｇで３０秒間遠心した。

【0088】

（１０）ＲＮＡ洗浄緩衝液２を加え、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0089】

（１１）工程（１０）を繰り返した。

【0090】

（１２）空カラムを１２０００ｇで２分間遠心し、残留のＲＮＡ洗浄緩衝液を完全に除去した。

【0091】

（１３）５０μｌのＤＥＰＣ水を加え、１２０００ｇで２分間遠心した。

【0092】

（１４）２μｌのＲＮＡサンプルを採取し、ｏｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキットで蛍光定量実験を行った。

【0093】

結果を図３、表１０～１１に示す。Ｖｅｒｏ細胞におけるＬＱポリペプチドのＩＣ₅₀が２．２６μＭ（図３Ａ）、Ｖｅｒｏ細胞におけるＳＱポリペプチドのＩＣ₅₀が１０．３μＭ（図３Ｂ）であった。

【0094】

以上の結果、それらポリペプチドはいずれも２Ｃタンパク質に対して設計された阻害タンパク質であるが、ウイルスに対する阻害効率に有意差があり、ポリペプチドＲＱは、Ｖｅｒｏ細胞におけるＩＣ₅₀が０．６６μＭであり、阻害効率がＬＱポリペプチド及びＳＱポリペプチドよりも有意に高かった。

【0095】

【表10】

【0096】

【表11】

【0097】

実施例４：ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＣＶＡ１６を阻害する効率の測定

【0098】

１．実験材料
ＲＤ細胞。ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、ＯｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）はＷｕＨａｎＵ－ＭｅＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．，Ｃｏ．から購入した。ＲＮＡ及びｑＲＴ－ＰＣＲを抽出する過程で使用された水がＤＥＰＣ水であった。実験全体はＲＮａｓｅなしの環境で行われた。

【0099】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0100】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにＲＤ細胞を敷いた。

【0101】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地（各ウェルの２％血清のＤＭＥＭ培地の添加量を０．５ｍｌとした。）に交換し、各ウェルに１×１０⁶ＰＦＵ／ｍＬのＣＶＡ１６ウイルスを５μｌ加えた。

【0102】

（３）１時間後、最終濃度０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの異なるポリペプチドをそれぞれ加えた。ポリペプチド無添加群を対照とした。

【0103】

（４）ＣＶＡ１６ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0104】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0105】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0106】

（７）ウェル中の溶液を取り出してＲＮＡ抽出カラムに移し、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0107】

（８）チューブから回収した溶液をカラムに再度供して、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0108】

（９）ＲＮＡ洗浄緩衝液１を加え、１２０００ｇで３０秒間遠心した。

【0109】

（１０）ＲＮＡ洗浄緩衝液２を加え、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0110】

（１１）工程（１０）を繰り返した。

【0111】

（１２）空カラムを１２０００ｇで２分間遠心し、残留のＲＮＡ洗浄緩衝液を完全に除去した。

【0112】

（１３）５０μｌのＤＥＰＣ水を加え、１２０００ｇで２分間遠心した。

【0113】

（１４）２μｌのＲＮＡサンプルを採取し、ｏｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキットで蛍光定量実験を行った。

【0114】

ＲＤ細胞におけるポリペプチドＲＱの抗ＣＶＡ１６効果試験の結果を表１２、図４に示す。ＩＣ₅₀が２．１６μＭであった。

【0115】

【表12】

【0116】

実施例５：ＲＱがＥＶ７１２Ｃヘリカーゼ活性を阻害すること

【0117】

１．実験材料
ＭＢＰ－ＥＶ７１２Ｃタンパク質を融合発現するバキュロウイルス。ツマジロクサヨトウ細胞（Ｓｆ９）はＣｈｉｎａＣｅｎｔｅｒｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）から入手した。培地（ＳＦ－ＨＭ）は倍進社から購入した。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）フィラーはＮＥＢから購入した。Ａｍｉｃｏｎ Μｌｔｒａ－３０ＫＤａ（限外ろ過チューブ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。結合緩衝液（ｐＨ７．４）：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ－メルカプトエタノール、体積比５％の無水エタノール、体積比１０％のグリセリン。溶出緩衝液：１０ｍＭのマルトース溶液。ｐＨ７．５の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液を使用した。

【0118】

ＨＥＸ蛍光標識された長さ４２ｎｔのＲＮＡ一本鎖、ＨＥＸ標識ＲＮＡ鎖に相補的な長さ５４ｎｔのＲＮＡ一本鎖。

【0119】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0120】

２．実験過程
２．１ＥＶ７１２Ｃタンパク質のインビトロでの発現と精製
（１）ＭＢＰ－ＥＶ７１２Ｃタンパク質を発現するバキュロウイルスを密度８０～９０％のＳｆ９細胞（Ｔ７５）６本に１ｍｌずつ加えた。２７．５℃に放置して３日間感染させた。細胞がウイルス感染の明らかな症状を示すまで置いた（細胞が大きく丸くなり、大量に懸濁した。）。元の培地でＳｆ９細胞を吹き飛ばし、１０００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、精製されたＭＢＰ融合タンパク質の結合緩衝液１５ｍｌで細胞を再懸濁した。

【0121】

（２）Ｓｆ９細胞を透明になるまで超音波破砕（２５０Ｗ、１５～２０ｍｉｎ）し、１．５ｍｌの遠心チューブに分注し、１２０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、上清を１５ｍｌの遠心チューブに入れ、氷上に置いた。

【0122】

（３）２～３ｍｌのアミロースレジンをクロマトカラムに加え、まず３０ｍｌのｄｄＨ２Ｏで洗浄し、次に３０ｍｌの結合緩衝液でフィラーのバランスをとれた。洗浄過程でフィラー間に気泡が入らないように注意した。

【0123】

（４）目的タンパク質を含む上清をフィラーのバランスのとれたカラムにゆっくりと加え、タンパク質サンプルの流速が７～８秒／滴になるように、定常流量ポンプの流速を５０又は６０に設置した。１５ｍｌの上清をカラムに３回供した。

【0124】

（５）結合後、１００ｍｌの結合緩衝液でフィラーを洗浄し、定常流量ポンプの流速を１３０にし、不純物のタンパク質を洗い流した。

【0125】

（６）洗浄後、１０ｍＭのマルトース溶離液でフィラーを溶出し、定常流量ポンプの流速を１０にし、収集した溶離液（目的タンパク質を含む）を３０ＫＤ限外ろ過チューブに加え、７２００ｇ、４℃で遠心分離し、限外ろ過して目的タンパク質を濃縮させた（約２００～３００μｌ、濃度は約１ｍｇ／ｍｌであった）。

【0126】

（７）限外ろ過終了後、５０ｍＭ、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳで目的タンパク質の緩衝系を交換した（ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨで３～４回限外ろ過した）。

【0127】

（８）２μｌの精製後のタンパク質サンプルを採取してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、残りのタンパク質を－８０℃に保存しておいた。

【0128】

ＭＢＰタグを持つＥＶ７１２Ｃタンパク質の精製ができた。

【0129】

２．２ＲＱがインビトロでＥＶ７１２Ｃタンパク質のヘリカーゼ活性を阻害すること
（１）濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌのＨＥＸ標識鎖を使用し、同濃度の相補鎖ＲＮＡを加え、アニールによりＨＥＸ標識を有する二本鎖ｄｓＲＮＡ基質を調製した。

【0130】

（２）アニール過程：反応系を７５℃で３分間保持し、１分間に１℃低下する速度で反応系温度を２５℃まで低下させ、２５℃で２分間保持した。

【0131】

（３）標準的な巻き戻し実験反応系に従って、目的タンパク質と二本鎖基質をよく配合した。５μｇのＲＱポリペプチドとＴＡＴ対照をそれぞれ加え、単一及び二本鎖の対照を設置した。一本鎖の場合、サンプルを７５℃で３分間煮沸し、氷上に２分間置く必要があった。

【0132】

（４）配合した体系を均一に混合した後、３７℃に置き、５０分間反応させた。

【0133】

（５）反応後の混合物を電気泳動した。

【0134】

（６）最後にＴｙｐｈｏｏｎ９５００を使用して直接スキャンし、ＨＥＸ信号を得た。

【0135】

電気泳動中、一本鎖は二本鎖よりも電気泳動速度が速かった。従って、ＭＢＰ－２Ｃタンパク質が二本鎖ｄｓＲＮＡ基質を開いて一本鎖ＲＮＡを放出するヘリカーゼ活性を有する場合、このレーンには２つの上下バンドとして表示する。７５℃で煮沸して作製した一本鎖ＲＮＡ（レーン２）は陽性対照とした。タンパク質無添加反応（レーン１）は陰性対照とした。図５のレーン３に示すように、ＥＶ７１２Ｃはヘリカーゼ活性を有し、二本鎖ｄｓＲＮＡ基質を巻き戻すことができたが、ＲＱの添加は２Ｃのヘリカーゼ活性を阻害し（レーン５）、ＴＡＴ対照は２Ｃのヘリカーゼ活性に影響しなかった（レーン４）。以上の結果は、ＲＱがＥＶ７１２Ｃのヘリカーゼ機能を確実に阻害できたことを示した。
実施例６：ＲＱがＥＶ７１及びＣＶＡ１６２Ｃヘリカーゼ活性を阻害すること

【0136】

１．実験材料
精製されたＭＢＰ－ＥＶ７１２Ｃタンパク質。ＭＢＰ－ＣＶＡ１６２Ｃタンパク質を融合発現するバキュロウイルス、ツマジロクサヨトウ細胞（Ｓｆ９）はＣｈｉｎａＣｅｎｔｅｒｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）から入手した。培地（ＳＦ－ＨＭ）は倍進社から購入した。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）フィラーはＮＥＢから購入した。Ａｍｉｃｏｎ Μｌｔｒａ－３０ＫＤａ（限外ろ過チューブ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。結合緩衝液（ｐＨ７．４）として、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ－メルカプトエタノール、体積比５％の無水エタノール、体積比１０％のグリセリンを使用した。溶出緩衝液として１０ｍＭのマルトース溶液を使用した。ｐＨ７．５の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液。

【0137】

ＨＥＸ蛍光標識された長さ４２ｎｔのＲＮＡ一本鎖、ＨＥＸ標識ＲＮＡ鎖に相補的な長さ５４ｎｔのＲＮＡ一本鎖。

【0138】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0139】

２．実験過程
２．１ＣＶＡ１６２Ｃタンパク質のインビトロでの発現と精製
（１）ＭＢＰ－ＣＶＡ１６２Ｃタンパク質を発現するバキュロウイルスを密度８０～９０％のＳｆ９細胞（Ｔ７５）６本に１ｍｌずつ加えた。２７．５℃に放置して３日間感染させた。細胞がウイルス感染の明らかな症状を示すまで待った（細胞が大きく丸くなり、大量に懸濁した。）。元の培地でＳｆ９細胞を吹き飛ばし、１０００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、精製されたＭＢＰ融合タンパク質の結合緩衝液１５ｍｌで細胞を再懸濁した。

【0140】

（２）Ｓｆ９細胞を透明になるまで超音波破砕（２５０Ｗ、１５－２０ｍｉｎ）し、１．５ｍｌの遠心チューブに分注し、１２０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、上清を１５ｍｌの遠心チューブに入れ、氷上に置いた。

【0141】

【0142】

【0143】

（５）結合後、１００ｍｌの結合緩衝液でフィラーを洗浄し、定常流量ポンプの流速を１３０にし、不純物のタンパク質を洗い流した。

【0144】

【0145】

【0146】

（８）２μｌの精製後のタンパク質サンプルを採取してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、残りのタンパク質を－８０℃に保存しておいた。

【0147】

ＭＢＰタグを持つＥＶ７１２Ｃタンパク質の精製ができた。

【0148】

２．２ＲＱがインビトロでＥＶ７１及びＣＶＡ１６２Ｃタンパク質のヘリカーゼ活性を阻害すること
（１）濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌのＨＥＸ標識鎖を使用し、同濃度の相補鎖ＲＮＡを加え、アニールによりＨＥＸ標識を有する二本鎖ｄｓＲＮＡ基質を調製した。

【0149】

（２）アニール過程：反応系を７５℃で３分間保持し、１分間に１℃低下する速度で反応系温度を２５℃まで低下させ、２５℃で２分間保持した。

【0150】

（３）標準的な巻き戻し実験反応系に従って、目的タンパク質と二本鎖基質をよく配合した。５μｇのＲＱポリペプチドとＴＡＴ対照をそれぞれ加え、単一及び二本鎖対照を設置した。一本鎖の場合、サンプルを７５℃で３分間煮沸し、氷上に２分間置く必要があった。

【0151】

（４）配合した系を均一に混合した後、３７℃に置き、５０分間反応させた。

【0152】

（５）反応後の混合物を電気泳動した。

【0153】

（６）最後にＴｙｐｈｏｏｎ９５００を使用して直接スキャンし、ＨＥＸ信号を得た。

【0154】

図６Ａに示すように、ＲＱは用量依存的にＥＶ７１２Ｃのヘリカーゼ活性を阻害することが分かった。図６Ｂに示すように、ＲＱは用量依存的にＣＶＡ１６２Ｃのヘリカーゼ活性を阻害することが分かった。
実施例７：ＲＱがＥＶ７１２Ｃタンパク質の多量体化を阻害すること

【0155】

１．実験材料
精製されたＭＢＰ－ＥＶ７１２Ｃタンパク質。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬクロマトカラムはＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入した。アミコンウルトラ遠心式フィルターはＭｅｒｃｋ社から購入した。ＢｉｏＬｏｇｉｃＤｕｏＦｌｏｗｓｙｓｔｅｍはＢｉｏ－Ｒａｄ社から購入した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）。

【0156】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0157】

２．実験過程
（１）精製されたＭＢＰ－ＥＶ７１２Ｃをアミコンウルトラ遠心式フィルターで１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0158】

（２）濃縮後の２Ｃタンパク質と２０μＭのＲＱポリペプチドを混合して氷上で１ｈインキュベートし、対照として２Ｃと同等体積のｄｄＨ₂Ｏを混合してインキュベートしたものを用いた。

【0159】

（３）上記サンプルを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）で平衡化した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬクロマトカラムにロードし、ＢｉｏＬｏｇｉｃＤｕｏＦｌｏｗｓｙｓｔｅｍで流速を１ｍＬ／ｍｉｎに制御した。

【0160】

（４）紫外線（ＵＶ）信号によりタンパク質がクロマトカラムを通過する時間を記録し、タンパク質の分子量の変化を分析した。

【0161】

図７に示すように、２Ｃタンパク質のみをｄｄＨ₂Ｏと共培養した場合、２Ｃは多量体を形成してシステムから迅速に溶出し（薄い色の線）、溶出時間のピークは８ｍｉｎであった（左側の薄い色のピーク）。ＲＱを２Ｃと共培養した場合（濃い色の線）、２Ｃ多量体の溶出時間のピークは大幅に変化し（左側の濃い色のピーク）、右側の濃い色のピークは遊離のＲＱポリペプチドであった。以上の結果は、ＲＱと２Ｃの共培養が２Ｃ多量体の形成を阻害したことを示した。
実施例８：ポリペプチドＲＱの膜透過効率の検出

【0162】

１．材料
ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。免疫蛍光プレート（ＮＥＳＴ）はプロモーター社から購入した。ＰＢＳ、ＤＡＰＩ、パラホルムアルデヒドは迪躍創新株式会社から購入した。

【0163】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0164】

２．実験過程
実験は２つのグループに分けられ、ＥＶ７１ウイルスの添加がポリペプチドの細胞への侵入に与える影響を避けるため、一組の実験にはＥＶ７１ウイルスを添加してからポリペプチドＲＱを添加した。もう一組の実験にはウイルスを添加せずにポリペプチドのみを添加した。また、各群には陰性対照を設置した。

【0165】

免疫蛍光の手順は次の通りである。
（１）免疫蛍光専用ディッシュにＲＤ細胞１ｍｌを敷き、３０％のコンフルエンスまで増殖した時点でサンプルを採取した。

【0166】

（２）培地を吸引して廃置し、１ｍｌの０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳで残留培地を洗い流し、５ｍｉｎずつ３回洗浄した。

【0167】

（３）４％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、４ｇのパラホルムアルデヒドを１００ｍｌのＰＢＳに溶解した。配合した４％パラホルムアルデヒド１ｍｌを各ディッシュに加え、細胞を固定するために５分間反応させた。

【0168】

（４）４％パラホルムアルデヒドを吸引し廃置し、さらに１ｍｌの０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳを加えて残留パラホルムアルデヒドを洗い流し、５ｍｉｎずつ３回洗浄した。

【0169】

（５）１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ディッシュに加え、１５分間反応させた。

【0170】

（６）反応液を吸引し、１ｍｌの０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳを再度加えて残留反応液を洗い流し、５ｍｉｎずつ３回洗浄した。

【0171】

（７）ディッシュを蛍光顕微鏡下に置いて観察した。

【0172】

蛍光標識（ＦＩＴＣ）を有するポリペプチドを利用し、ＲＤ細胞における膜透過効率を検出した。２群の実験を設置した。第１群はＦＩＴＣ－ＲＱをそれぞれ加えた未処理の対照群であり、第２群はＥＶ７１感染後にＦＩＴＣ－ＲＱをさらに加えた感染ＥＶ７１群であった。２群の実験を同時に行い、ウイルスＭＯＩ＝０．１、ポリペプチドの添加濃度を１μＭとした。ポリペプチドを添加してから１２時間後にサンプルを採取し、細胞を固定して免疫蛍光実験を行った。結果は、感染又は非感染の条件下でポリペプチドが細胞に入ることができ、良好な膜透過能を有することを示した。

【0173】

図８に示すように、ウイルス無添加及びウイルス添加細胞でポリペプチドの細胞への侵入が観察され、ポリペプチドＲＱが良好な膜透過能を有することが証明された。
実施例９：様々な細胞におけるポリペプチドＲＱの毒性測定

【0174】

１．実験材料
ＲＤ細胞、Ｈｕｈ７細胞、２９３Ｔ細胞。ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）はプロモーター社から購入した。

【0175】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0176】

２．実験過程
（１）９６ウェル細胞プレートに異なる細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ敷いた。

【0177】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終ポリペプチド濃度がそれぞれ０．０７３２４２μＭ、０．１４６４８４μＭ、０．２９２９６９μＭ、０．５８５９３８μＭ、１．１７１８７５μＭ、２．３４３７５μＭ、４．６８７５μＭ、９．３７５μＭ、１８．７５μＭ、３７．５μＭ、７５μＭ、１５０μＭ、３００μＭとなるように、一定濃度勾配のポリペプチドＲＱを加えた。

【0178】

（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後にサンプルを採取し、各ウェルに生細胞検出剤ＣＣＫ－８を１０μｌずつ加え、均一に混合した。

【0179】

（４）３７度で２時間放置した。

【0180】

（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０の吸光度値を検出した。

【0181】

結果を図９、表１３～１５に示す。未処理細胞の細胞生存率を１００％として、異なる細胞における各ＲＱのＣＣ₅₀を算出した。ＲＤ細胞におけるＣＣ₅₀は＞１５０μＭ（図９Ａ）、Ｈｕｈ細胞におけるＣＣ₅₀は＞３００μＭ（図９Ｂ）、２９３Ｔ細胞におけるＣＣ₅₀＞３００μＭ（図１Ｃ）であった。

【0182】

【表13】

【0183】

【表14】

【0184】

【表15】

【0185】

実施例１０：ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＣＶＢ３を阻害する効率の測定
１．実験材料
ＲＤ細胞。ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、ＯｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）はＷｕＨａｎＵ－ＭｅＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．，Ｃｏ．から購入した。ＲＮＡ及びｑＲＴ－ＰＣＲを抽出する過程で使用された水がＤＥＰＣ水であった。実験全体はＲＮａｓｅなしの環境で行われた。

【0186】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0187】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにＲＤ細胞を敷いた。

【0188】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地（各ウェルの２％血清のＤＭＥＭ培地の添加量を０．５ｍｌとした。）に交換し、各ウェルに１×１０⁶ＰＦＵ／ｍＬのＣＶＢ３ウイルスを５μｌ加えた。

【0189】

（３）１時間後、最終濃度０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭのポリペプチドをそれぞれ加えた。ポリペプチド無添加群を対照とした。

【0190】

（４）ＣＶＢ３ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0191】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0192】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0193】

（７）ウェル中の溶液を取り出してＲＮＡ抽出カラムに移し、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0194】

（８）チューブから回収した溶液をカラムに再度供して、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0195】

（９）ＲＮＡ洗浄緩衝液１を加え、１２０００ｇで３０秒間遠心した。

【0196】

（１０）ＲＮＡ洗浄緩衝液２を加え、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0197】

（１１）工程（１０）を繰り返した。

【0198】

（１２）空カラムを１２０００ｇで２分間遠心し、残留のＲＮＡ洗浄緩衝液を完全に除去した。

【0199】

（１３）５０μｌのＤＥＰＣ水を加え、１２０００ｇで２分間遠心した。

【0200】

（１４）２μｌのＲＮＡサンプルを採取し、ｏｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキットで蛍光定量実験を行った。

【0201】

ＲＤ細胞におけるポリペプチドＲＱの抗ＣＶＢ３効果試験の結果を表１６、図１０に示す。ＩＣ₅₀が２．３１μＭであった。

【0202】

【表16】

【0203】

実施例１１：ポリペプチドＲＱがＲＤ細胞においてＥｃｈｏ１１を阻害する効率の測定

【0204】

【0205】

ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0206】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにＲＤ細胞を敷いた。

【0207】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地（各ウェルの２％血清のＤＭＥＭ培地の添加量を０．５ｍｌとした。）に交換し、各ウェルに１×１０⁶ＰＦＵ／ｍＬのＥｃｈｏ１１ウイルスを５μｌ加えた。

【0208】

【0209】

（４）Ｅｃｈｏ１１ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0210】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0211】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0212】

（７）ウェル中の溶液を取り出してＲＮＡ抽出カラムに移し、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0213】

（８）チューブから回収した溶液をカラムに再度供して、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0214】

（９）ＲＮＡ洗浄緩衝液１を加え、１２０００ｇで３０秒間遠心した。

【0215】

（１０）ＲＮＡ洗浄緩衝液２を加え、１２０００ｇで１分間遠心した。

【0216】

（１１）工程（１０）を繰り返した。

【0217】

（１２）空カラムを１２０００ｇで２分間遠心し、残留のＲＮＡ洗浄緩衝液を完全に除去した。

【0218】

（１３）５０μｌのＤＥＰＣ水を加え、１２０００ｇで２分間遠心した。

【0219】

（１４）２μｌのＲＮＡサンプルを採取し、ｏｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキットで蛍光定量実験を行った。

【0220】

ＲＤ細胞におけるポリペプチドＲＱの抗Ｅｃｈｏ１１効果試験の結果を表１７、図１１に示す。ＩＣ₅₀が０．３７μＭであった。

【0221】

【表17】

【0222】

実施例１２：ポリペプチドＲＱがマウス体内においてＥＶ７１に対して示した抗ウイルス活性の検出

【0223】

１．実験材料
生まれたばかりの１日齢のＩＣＲ哺乳マウス。ポリペプチドＲＱは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号２に示される。

【0224】

２．実験過程
（１）２７匹の１日齢のＩＣＲ哺乳マウスを無作為に３つのグループに分けた。１群の１０匹の哺乳マウスにウイルス攻撃を加え同量のＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ）を注射して陽性対照とし、１群の９匹の哺乳マウスの群にウイルス攻撃を加えてからＲＱを注射し、１群の８匹の哺乳マウスの群にウイルス攻撃も投薬もせずに陰性対照とした。これらの１９匹の哺乳マウスに腹腔注射により１０⁷ＰＦＵの用量でＥＶ７１によるウイルス攻撃を加えた。

【0225】

（２）ウイルス攻撃と同時に、一つの群には治療群として２０ｍｇ／ｋｇのＲＱポリペプチドを腹腔注射し、もう一つの群には対照群として同量のＰＢＳを注射した。

【0226】

（３）ポリペプチド及びＰＢＳをウイルス攻撃後７日目まで１２時間ごとに連続して注射した。

【0227】

（４）哺乳マウスの臨床症状と死亡情况を２１日目まで観察した。

【0228】

（５）臨床症状を臨床採点システムにより判断した。０点は健康、１点はゆっくりとした猫背の動き、２点は片肢の衰弱、３点は片肢の麻痺、４点は両肢の麻痺、５点は死亡である。

【0229】

結果として、図１２Ａに示すように、陰性対照群（Ｍｏｃｋ）の哺乳マウスはすべて生存し、ウイルス攻撃のみした非投薬群の哺乳マウスは１０日目に５匹死亡し、死亡率が５０％であったのに対し、ＲＱ投与群の哺乳マウスはすべて生存した。図１２Ｂに示すように、ウイルス攻撃のみした非投薬群は攻撃後投与群よりも臨床スコアが有意に高かった。以上の結果から、ＲＱが致死量のＥＶ７１に感染した哺乳マウスを効果的に治療し、その死亡を防ぐことができたことが示された。
実施例１３：ポリペプチドＲＱの改造体の抗ウイルス活性の検出

【0230】

１．実験材料
ポリペプチドＥＱ（配列番号５に示される）、ＹＱ（配列番号６に示される）、ＮＱ（配列番号７に示される）、ＲＳＱ（配列番号８に示される）、ＳＡＱ（配列番号９に示される）、ＡＱ（配列番号１０に示される）、ＩＱ（配列番号１１に示される）、ＧＱ（配列番号１２に示される）、ＮＴＱ（配列番号１３に示される）、ＴＱ（配列番号１４に示される）、ＩＥＱ（配列番号１５に示される）。前記配列はすべて商業的に合成された。ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）はプロモーター社から購入した。

【0231】

２．実験過程
（１）９６ウェル細胞プレートにＲＤ細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ敷いた。

【0232】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

【0233】

（３）２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用してポリペプチド薬物を２倍比勾配で希釈し、希釈濃度を０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭとし、１ウェルあたり１００μｌで新しい９６ウェルプレートに加え、濃度ごとに３つの複製ウェルを設置した。

【0234】

（４）希釈したウイルスを上記ウェルに１ウェルあたり１００μＬずつ加え、無薬物・無ウイルスウェルと、無薬物・ウイルス添加ウェルとをそれぞれ対照として設置し、ウイルスの最終濃度を０．１ＭＯＩとした。

【0235】

（４）細胞を敷いた９６ウェルプレートに混合物を移し、２４時間培養を続けた後、ＣＣＫ８キットを用いてウイルスに対するポリペプチドの阻害活性を測定した。

【0236】

（５）ウイルス感染に対する異なる濃度のポリペプチドの阻害率を算出した。計算式は、ポリペプチド阻害率＝（薬物ウェル－ウイルスウェル）×１００％／（無薬物ウェル－ウイルスウェル）であった。

【0237】

表１８～２１、図１３に示すように、ＣＣＫ８法によりポリペプチドのウイルス阻害活性を測定したところ、ＥＱのＩＣ₅₀が１．８３μＭ、ＹＱのＩＣ₅₀が１．９６μＭ、ＮＱのＩＣ₅₀が１．９０μＭ、ＲＳＱのＩＣ₅₀が２．６０μＭ、ＳＡＱのＩＣ₅₀が２．９０μＭ、ＡＱのＩＣ₅₀が２．９９μＭ、ＩＱのＩＣ₅₀が１．６４μＭ、ＧＱのＩＣ₅₀が１．７８μＭ、ＮＴＧのＩＣ₅₀が２．２８μＭ、ＴＱのＩＣ₅₀が１．７６μＭ、ＩＥＱのＩＣ₅₀が２．４８μＭであった。ＴＡＴ対照は抗ウイルス活性を示さなかった。

【0238】

【表18】

【0239】

【表19】

【0240】

【表20】

【0241】

【表21】

【0242】

実施例１４：ポリペプチドＲＱの修飾体の抗ウイルス活性の検出

【0243】

１．実験材料
ポリペプチドＲＱ－ＰＡ（配列番号１６に示される）、ＲＱ－ＰＥＧ４－ＰＡ（配列番号１７に示される）、ＲＱ－ＣＨＯＬ（配列番号１８に示される）。前記配列はすべて商業的に合成された。ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）はプロモーター社から購入した。

【0244】

２．実験過程
（１）９６ウェル細胞プレートにＲＤ細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ敷いた。

【0245】

（２）７０％～８０％のコンフルエンスまで増殖したら、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２％血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

【0246】

（３）２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用してポリペプチド薬物を２倍比勾配で希釈し、希釈濃度を０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１ウェルあたり１００μｌとし、新しい９６ウェルプレートに加え、濃度ごとに３つの複製ウェルを設置した。

【0247】

（４）希釈したウイルスを上記ウェルに１ウェルあたり１００μＬずつ加え、無薬物・無ウイルスウェルと、無薬物・ウイルス添加ウェルとをそれぞれ対照として設置し、ウイルスの最終濃度が０．１ＭＯＩであった。

【0248】

【0249】

（５）ウイルス感染に対する異なる濃度のポリペプチドの阻害率を算出した。計算式はポリペプチド阻害率＝（薬物ウェル－ウイルスウェル）×１００％／（無薬物ウェル－ウイルスウェル）であった。

【0250】

表２２、図１４に示すように、ＣＣＫ８法によりポリペプチドのウイルス阻害活性を測定したところ、ＲＱ－ＰＡのＩＣ₅₀が３．５８μＭ、ＲＱ－ＰＥＧ４－ＰＡのＩＣ₅₀が３．４７μＭ、ＲＱ－ＣＨＯＬのＩＣ₅₀が４．２５μＭであった。

【0251】

【表22】

【0252】

実施例１５：ＲＱ－ＤＲＩがＲＤ細胞においてＥＶ７１を阻害する効率の測定
１．実験材料
ＲＤ細胞。ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、ＯｎｅｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）はＷｕＨａｎＵ－ＭｅＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．，Ｃｏ．から購入した。ＲＮＡ及びｑＲＴ－ＰＣＲを抽出する過程で使用された水がＤＥＰＣ水であった。実験全体はＲＮａｓｅなしの環境で行われた。

【0253】

ポリペプチドＲＱ－ＤＲＩは南京ジェンスクリプト公司により合成され、その配列が配列番号１９に示される。

【0254】

２．実験過程
（１）２４ウェルプレートにそれぞれ異なる細胞を敷いた。

【0255】

【0256】

【0257】

（４）ＥＶ７１ウイルス感染２４時間後にサンプルを採取し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。

【0258】

（５）上清を捨て、ウェルに３５０μｌのＴＲＫ分解液を加え、シェーカーに５分間置いた。

【0259】

（６）さらに、ウェルに３５０μｌの７０％エタノール（ＤＥＰＣ）を加え、シェーカーに５分間置いた。