特表 2023-535576 ｅＥＦ１Ａ２の遺伝子治療ベクターおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-18

(54)【発明の名称】ｅＥＦ１Ａ２の遺伝子治療ベクターおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230810BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230810BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230810BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20230810BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230810BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230810BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230810BHJP

   A61K 38/18 20060101ALN20230810BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

A61K48/00

A61K35/76

A61P25/08

A61P25/00

A61P21/00

C12N15/12 ZNA

A61K38/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504517

(86)(22)【出願日】2021-07-21

(85)【翻訳文提出日】2023-03-01

(86)【国際出願番号】 EP2021070455

(87)【国際公開番号】W WO2022018171

(87)【国際公開日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】63/055,775

(32)【優先日】2020-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521047960

【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス エルティーディー

【氏名又は名称原語表記】ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｌｔｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ワディントン サイモン ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】カルダ ラジヴィンダー

(72)【発明者】

【氏名】ハルツォク クリストファー ディーン

(72)【発明者】

【氏名】エング ジョアン

(72)【発明者】

【氏名】サクラメント チェスター

(72)【発明者】

【氏名】ショルジ ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】リックス デイビッド

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA18

4C084DB52

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA061

4C084ZA062

4C084ZA941

4C084ZA942

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA08

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA06

4C087ZA94

(57)【要約】

本明細書では、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントを発現するためのベクターとして組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを使用した、神経疾患のための遺伝子治療が提供される。ｒＡＡＶビリオンは、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ヒトシナプシン１（ｈＳＹＮ）プロモーターを使用してもよい。キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントであってもよい。他のプロモーターまたはキャプシドを使用してもよい。さらに、ｒＡＡＶビリオンの大脳内および／または静脈内などによる治療方法、ならびにその他の組成物および方法が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キャプシドおよびベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、前記ベクターゲノムが、プロモーターに作動可能に連結されたｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【請求項2】

前記プロモーターが、ニューロン特異的プロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項3】

前記プロモーターが、汎神経細胞プロモーターである、請求項１または請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項4】

前記プロモーターが、シナプシン１プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項5】

前記シナプシン１プロモーターが、ヒトシナプシン１（ｈＳＹＮ）プロモーターである、請求項４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項6】

前記ｈＳＹＮプロモーターが、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項7】

前記ｈＳＹＮプロモーターが、配列番号３と少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項8】

前記ｈＳＹＮプロモーターが、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項9】

前記プロモーターが、ｅＳＹＮプロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項10】

前記ｅＳＹＮプロモーターが、配列番号６４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項11】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項12】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項13】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項14】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項15】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項16】

前記ｅＥＦ１Ａ２タンパク質が、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項17】

前記プロモーターが、シナプシン１プロモーターである、請求項１５に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項18】

前記シナプシン１プロモーターが、ヒトシナプシン１（ｈＳＹＮ）プロモーターである、請求項１７に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項19】

前記ｈＳＹＮプロモーターが、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項20】

前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１または１１～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項21】

前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＡＧプロモーターが、配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１、１１～１５、または２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項22】

前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターが、配列番号１６または１７と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１、１１～１５、または２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項23】

前記ベクターゲノムが、ポリアデニル化（ポリＡ）部位を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項24】

前記ポリＡ配列が、ｂＧＨポリアデニル化部位である、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項25】

前記ｂＧＨポリアデニル化部位が、配列番号５３と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項26】

前記ポリＡ配列が、ｈＧＨポリアデニル化部位である、請求項２３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項27】

前記ｈＧＨポリアデニル化部位が、配列番号５４と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２６に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項28】

前記ベクターゲノムが、ＷＰＲＥ（ｘ）エレメントを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項29】

前記ＷＰＲＥ（ｘ）エレメントが、配列番号４２と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２８に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項30】

前記ＷＰＲＥ（ｘ）エレメントが、配列番号４１または配列番号４３と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２８に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項31】

前記ベクターゲノムが、コザック配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項32】

前記コザック配列が、配列番号１０である、請求項３１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項33】

前記ベクターゲノムが、配列番号３２～４０の一つまたは複数と少なくとも９５％の同一性を共有する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項34】

前記ベクターゲノムが、配列番号４１～４９の一つまたは複数と少なくとも９５％の同一性を共有する３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項35】

前記ベクターゲノムが、配列番号１９または配列番号２０と少なくとも９５％同一の配列を有する５’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項36】

前記ベクターゲノムが、配列番号２１または配列番号６３と少なくとも９５％同一の配列を有する３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項37】

前記ＣＡＧプロモーターが、配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項38】

前記キャプシドが、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントである、請求項１～３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項39】

前記キャプシドが、配列番号１５と少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項40】

前記ベクターゲノムが、発現カセットを含み、前記発現カセットが、５’から３’の順序で、
ａ．ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｂ．ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ－ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｃ．Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｄ．ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｅ．ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｆ．ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｇ．Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｈ．ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｉ．ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ－ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｊ．ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｋ．ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ／ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ （グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｌ．ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｍ．Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｎ．ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｏ．ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｐ．ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン－Ｏｃ；
ｑ．ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｒ．ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｓ．ＣＭＶプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｔ．ＣＭＶプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｕ．ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ｖ．ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｗ．ｈＳＹＮプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｘ．ＣＡＧプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｙ．ＣＡＧプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｚ．ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔ；
ａａ．ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｂｂ．ｈＳＹＮプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；
ｃｃ．ＣＡＧプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ；または
ｄｄ．ＣＡＧプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓ
を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項41】

前記ベクターゲノムが、配列番号５５～５８または配列番号６５～６８のいずれか一つと少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、前記ポリヌクレオチド配列から本質的になるか、または前記ポリヌクレオチド配列からなる、請求項１～４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項42】

その必要のある対象において神経疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、請求項１～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項43】

前記対象が、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子に一つまたは複数の変異を有するか、または有する疑いがある、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記神経疾患または障害が、てんかんを含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記神経疾患または障害が、知的障害を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記神経疾患または障害が、自閉症を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記投与する工程が、脳室内投与を含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記投与する工程が、静脈内投与を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記投与する工程が、脳室内投与および静脈内投与の両方を同時または順次含む、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記対象が哺乳動物である、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

未処置の対照対象と比較して、前記対象における神経学的パフォーマンスの低下を防止する、請求項４２～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記方法が、筋力および／または運動技能を改善し、任意選択的に筋力および／または運動技能が、インバーテッドグリッド試験またはロータロッド試験を使用して評価される、請求項２４～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

その必要のある対象の脳内でｅＥＦ１Ａ２を発現させる方法であって、請求項１～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項54】

前記方法が、前脳においてより高い発現を引き起こし、任意選択的に、前記発現が、ｈＳＹＮプロモーター、コザック配列、ｅＥＦ１Ａ２導入遺伝子、および／またはヒトグロブリンポリアデニル化配列（ｈＧＨ）を含むベクターゲノムを含む参照ベクターと比較される、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記方法が、皮質においてより高い発現を引き起こし、任意選択的に、前記発現が、ｈＳＹＮプロモーター、コザック配列、ｅＥＦ１Ａ２導入遺伝子、および／またはヒトグロブリンポリアデニル化配列（ｈＧＨ）を含むベクターゲノムを含む参照ベクターと比較される、請求項５３に記載の方法。

【請求項56】

前記ｒＡＡＶビリオンの前記ベクターゲノムが、コザック配列を含まない、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ｒＡＡＶビリオンの前記ベクターゲノムが、ヒトグロブリンポリアデニル化配列（ｈＧＨ）を含まない、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ｒＡＡＶビリオンの前記ベクターゲノムが、ウシグロブリンポリアデニル化配列（ｂＧＨ）を含む、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記対象が、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子に一つまたは複数の変異を有するか、または有する疑いがある、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記対象が、神経疾患または障害に罹患しているか、またはそのリスクがある、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記神経疾患または障害が、てんかんを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記神経疾患または障害が、知的障害を含む、請求項６０または請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記神経疾患または障害が、自閉症を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記投与する工程が、脳室内投与を含む、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記投与する工程が、静脈内投与を含む、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記投与する工程が、脳室内投与および静脈内投与の両方を同時または順次含む、請求項５３～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記対象が哺乳動物である、請求項５３～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

未処置の対照対象と比較して、前記対象における神経学的パフォーマンスの低下を防止する、請求項５３～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記方法が、筋力および／または運動技能を改善し、任意選択的に筋力および／または運動技能が、インバーテッドグリッド試験またはロータロッド試験を使用して評価される、請求項５３～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

請求項１～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む、医薬組成物。

【請求項71】

請求項１～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンと、使用説明書とを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０５５，７７５号の優先利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＲＯＰＡ＿０１９＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約１０１キロバイトで、２０２１年７月２０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

背景
ＥＥＦ１Ａ２遺伝子は、タンパク質合成、アポトーシスの抑制、およびアクチン機能と細胞骨格構造の調節に関与するタンパク質である真核生物伸長因子１、アルファ－２（ｅＥＦ１Ａ２）をコードする。マウスおよびヒトのオルソログは、４６３アミノ酸位置のうちの４６２で同一性を共有する。ＥＥＦ１Ａ２は、卵巣癌で過剰発現するため、潜在的な発癌遺伝子である。卵巣癌に関する研究では、ＥＥＦ１Ａ２をコードするレンチウイルスベクターを実験的に使用して、不死化卵巣表面上皮（ＩＯＳＥ）細胞を形質導入し、それによって、ｅＥＦ１Ａ２が非腫瘍形成性の前駆細胞における腫瘍形成を促進することを実証した。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１２３（８）：１７６１－１７６（２００８）（非特許文献１）。

【0004】

ＥＥＦ１Ａ２は、中枢神経系（ＣＮＳ）、ならびに心臓および筋肉において高度に発現する。マウスでのＥｅｆ１ａ２の完全喪失は、運動神経変性を引き起こす。これは、遺伝子型がｗｓｔと称される、「廃棄物」と呼ばれる表現型である。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７：４６０１９（２０１７）（非特許文献２）。ヒトＥＥＦ１Ａ２遺伝子の点変異は、最近、てんかん、知的障害、および／または自閉症を様々に引き起こすことが実証されている。Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２６（１８）：３５４５－３５５２（２０１７）（非特許文献３）；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ．４（４）：４６５－７４（２０１６）（非特許文献４）；Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．８７（４）：３５６－６１（２０１５）（非特許文献５）。

【0005】

細菌人工染色体（ＢＡＣ）上に野生型Ｅｅｆ１ａ２を担持するトランスジェニックマウスを用いた実験により、野生型Ｅｅｆｌ１ａ２が、発生中に存在する場合、ｗｓｔ遺伝子型を補完することが確認された。Ｎｅｗｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２８２：２８９１－５０（２００７）（非特許文献６）。

【0006】

ＥＥＦ１Ａ２関連疾患は稀である。ＥＥＦ１Ａ２に変異があると特定されたのは、世界中で約１００人のみである。疾患の病因は未だ十分に理解されていない。したがって、野生型ＥＥＦ１Ａ２の出生後発現による疾患表現型の救済が達成されるか否かは不明である。さらに、ＣＮＳへの遺伝子治療の送達は困難かつ予測不可能である。

【0007】

ＥＥＦ１Ａ２関連疾患に対する治療についての満たされていないニーズがある。本明細書中で提供する遺伝子治療によってこのニーズに対処する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１２３（８）：１７６１－１７６（２００８）

【非特許文献2】Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７：４６０１９（２０１７）

【非特許文献3】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２６（１８）：３５４５－３５５２（２０１７）

【非特許文献4】Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ．４（４）：４６５－７４（２０１６）

【非特許文献5】Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．８７（４）：３５６－６１（２０１５）

【非特許文献6】Ｎｅｗｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２８２：２８９１－５０（２００７）

【発明の概要】

【0009】

概要
本発明は、概して、ｅＥＦ１Ａ２をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的バリアントのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの送達を用いた神経疾患または障害のための遺伝子治療に関する。

【0010】

一態様では、本開示は、キャプシドおよびベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、当該ベクターゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。プロモーターは、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ヒトシナプシン１（ｈＳＹＮ）プロモーターであってもよい。キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントであってもよい。他のプロモーターまたはキャプシドを使用してもよい。

【0011】

別の態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンまたはその医薬組成物を、対象に投与することを含む、その必要のある対象において神経疾患または障害を治療および／または予防する方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、大脳内および／または静脈内に投与され得る。

【0012】

別の態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンまたはその医薬組成物を、対象に投与することを含む、その必要のある対象の脳でｅＥＦ１Ａ２を発現させる方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、大脳内および／または静脈内に投与され得る。

【0013】

さらなる態様では、本開示は、ポリヌクレオチド（例えば、ベクターゲノム）、医薬組成物、キット、および他の組成物および方法を提供する。

【0014】

様々な他の態様および実施形態が、続く詳細な説明において開示されている。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、疾患に関連する点変異を示すｅＥＦ１Ａ２のドメイン図を示す。

【図2】図２は、ベクターゲノムの非限定的な例のベクター図を示す。

【図3】図３は、ベクターゲノムの非限定的な例のベクター図を示す。

【図4】図４は、ベクターゲノムの非限定的な例のベクター図を示す。

【図5】図５は、ベクターゲノムの非限定的な例のベクター図を示す。

【図6】図６は、ベクターゲノムの非限定的な例のベクター図を示す。

【図7】図７は、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－ｅＥＦ１Ａ２－２Ａ－ｅＧＦＰまたは対照を、新生児の大脳内（ＩＣ）または静脈内（ＩＶ）に注射した後のマウスの免疫蛍光顕微鏡写真を示す。スケールバー、３００μｍ。

【図8A】図８Ａは、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－ｅＥＦ１Ａ２－２Ａ－ｅＧＦＰまたは対照を、新生児の大脳内（ＩＣ）または静脈内（ＩＶ）に注射した後のマウスの免疫組織化学的分析を示す。

【図8B】図８Ｂは、同じスライドの拡大図を示す。スケールバー、３００μｍ。

【図9-1】図９Ａは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスの生存を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。図９Ｂは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスの体重減少を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。図９Ｃは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスのロータロッド試験を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。図９Ｄは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスのインバーテッドグリッド試験を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。

【図9-2】図９Ｅは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスのｅＥＦ１Ａ２発現を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。スケールバー、１２５μｍ。図９Ｆは、未処置のｗｓｔ／ｗｓｔ（ヌル）マウスのｅＥＦ１Ａ２発現を、大脳内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）、または両方の組み合わせ（ＩＣ＋ＩＶ）で処置したマウスと比較して示す。

【図10-1】図１０Ａ～図１０Ｋは、図２（「Ｖ１」）、図３（「Ｖ２」）、図４ （「Ｖ３」）および図６（「Ｖ４」）に示すベクターゲノムを含む、ＡＡＶ９ベクターを、２ｅ１０^１１ｖｇ／動物で投与した場合の比較を示す。図１０Ａは、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４遺伝子治療で処置された、ＦＢＳ処置野生型、ｗｓｔ／ｗｓｔ、脳室内処置ｗｓｔ／ｗｓｔ動物のカプラン・マイヤー生存プロットを示す。図１０Ｂは、マウスの体重を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。動物は、出生後３５日まで毎日、その後は、定時犠牲点Ｐ６０または人道的エンドポイントの１５％体重減少まで毎週計量された。図１０Ｃは、Ｐ１５日目のインバーテッドグリッドによる筋力評価を示す。図１０Ｄは、Ｐ１５日目のロータロッドによる筋力評価を示す。

【図10-2】図１０Ａ～図１０Ｋは、図２（「Ｖ１」）、図３（「Ｖ２」）、図４ （「Ｖ３」）および図６（「Ｖ４」）に示すベクターゲノムを含む、ＡＡＶ９ベクターを、２ｅ１０^１１ｖｇ／動物で投与した場合の比較を示す。図１０Ｅは、Ｐ２３日目のインバーテッドグリッドによる筋力評価を示す。図１０Ｆは、Ｐ２３日目のロータロッドによる筋力評価を示す。

【図10-3】図１０Ａ～図１０Ｋは、図２（「Ｖ１」）、図３（「Ｖ２」）、図４ （「Ｖ３」）および図６（「Ｖ４」）に示すベクターゲノムを含む、ＡＡＶ９ベクターを、２ｅ１０^１１ｖｇ／動物で投与した場合の比較を示す。図１０Ｇは、野生型ＦＢＳ（製剤緩衝液）を生理学的基準として用いたフリーフローティング免疫組織化学による、脳全体にわたるｅＥＦ１Ａ２の代表的な免疫染色を示す（群当たりｎ＝４～５、スケールバー２５０μｍ）。図１０Ｈは、ｅＥＦ１Ａ２を共発現するニューロン（ＮｅｕＮマーカー）の皮質脳領域における代表的な免疫組織蛍光を示す（群当たりｎ＝４．５、２００μｍ）。

【図10-4】図１０Ａ～図１０Ｋは、図２（「Ｖ１」）、図３（「Ｖ２」）、図４ （「Ｖ３」）および図６（「Ｖ４」）に示すベクターゲノムを含む、ＡＡＶ９ベクターを、２ｅ１０^１１ｖｇ／動物で投与した場合の比較を示す。図１０Ｉは、脳におけるｅＥＦ１Ａ２の代表的な免疫ブロットを示し、定量化は、Ｖ４ベクターと比較して、中脳、小脳、および後脳領域でより高い発現を有するすべての遺伝子治療ベクターで達成された脳全体のｅＥＦ１Ａ２発現を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。図１０Ｊは、前脳におけるヒトｅＥＦ１Ａ２転写物発現のｑＰＣＲを示し、Ｖ１ベクターで最も高いｍＲＮＡ発現を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。図１０Ｋは、皮質におけるヒトｅＥＦ１Ａ２皮質発現のｑＰＣＲを示し、Ｖ１ベクターで最も高いｍＲＮＡ発現を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。

【図11A】図１１Ａは、ＦＢＳ処置野生型、ＦＢＳ処置Ｄ２５２Ｈ／＋、ノックアウト（Ｄ２５２Ｈ－／－）、脳室内Ｖ３遺伝子治療処置Ｄ２５２Ｈ－／－（野生型ＦＢＳｎ＝１２、Ｄ２５２Ｈ／＋ＦＢＳｎ＝５、Ｄ２５２Ｈ－／－ＦＢＳｎ＝４および２ｘ１０^１１ｖｇ／仔、Ｖ３処置ｎ＝５）のカプラン・マイヤー生存プロットを示す。

【図11B】図１１Ｂは、経時的な体重を示す（データ平均、±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、一元配置分散分析、およびダネットの多重比較）。

【図11C】図１１Ｃは、ロータロッドによる運動評価を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびダネットの多重比較）。

【図12-1】図１２Ａは、Ｖ３高用量（２×１０^１１ｖｇ／仔、ｎ＝５）を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３、Ｖ３低用量（２×１０^１０ｖｇ／仔、ｎ＝５）を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３、製剤緩衝液を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３対照（ｎ＝３）、および製剤緩衝液を受けている野生型対照（ｎ＝６）のカプラン・マイヤー生存プロットを示す。図１２Ｂは、経時的な体重を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。図１２Ｃは、握力測定による運動評価を示すＰ２２－２５（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。図１２Ｄは、Ｐ２３での握力測定を示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびテューキーの多重比較）。

【図12-2】図１２Ｅは、ロータロッドによる運動評価を示すＰ２２－２５（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。図１２Ｆは、Ｐ２４でのロータロッドデータを示す（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびテューキーの多重比較）。図１２Ｇは、Ｐ２１－２５の神経学的スコアを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

発明の詳細な説明
定義
セクション見出しは、組織目的のみを目的としており、記述された主題を特定の態様または実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。

【0017】

別途定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。また、本明細書中に記載する材料、方法、および実施例は、例証に過ぎず、限定することを意図するものではない。

【0018】

本明細書中に記載する全ての刊行物および特許は、各々の個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義を含めて本出願が優先される。しかし、本明細書中で引用される任意の参照文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成する、または世界の任意の国で共通の一般知識の一部を形成するという承認、または任意の形態の提案とされるものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

【0019】

本記載では、別段の示唆がない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、整数の十分の一および百分の一など）を含むと理解されるべきである。用語「約」は、数字または数の直前にある場合、その数字または数がプラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、別段の示唆がない限り、列挙された構成要素のうちの「一つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。代替物（例、「または」）の使用は、代替物のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。用語「および／または」は、選択肢の一方または両方を意味すると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義で使用される。

【0020】

本明細書中で使用される場合、用語「同一性」および「同一である」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に関して、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムにより生成されたアライメントなどの、その「クエリー」配列と「対象」配列とのアライメントにおける、正確に一致している残基のパーセンテージを指す。同一性は、特に明記しない限り、対象配列の全長にわたって計算される。したがって、クエリー配列が、対象配列と整列しているときに、対象配列中の残基の少なくともｘ％（切り捨て）が、クエリー配列中の対応する残基と完全に一致するように整列される場合、クエリー配列は、対象配列と「少なくともｘ％の同一性を共有する」。対象配列が可変位置（例、Ｘで示される残基）を有する場合、クエリー配列中の任意の残基へのアライメントは、一致としてカウントされる。

【0021】

本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する一つまたは複数の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含む組換えベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングすることができる。あるいは、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現するように安定的に操作された宿主細胞を使用して、感染性粒子中にパッケージングすることができる。

【0022】

本明細書中で使用される場合、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。本明細書中で使用される場合、粒子が、異種ポリヌクレオチド（即ち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常、これは、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。このように、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ベクターがＡＡＶベクター粒子内に含まれるため、必然的にＡＡＶベクターの産生を含む。

【0023】

本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、真核細胞においてポリヌクレオチドからのＲＮＡ転写の開始を促進することが可能なポリヌクレオチド配列を指す。

【0024】

本明細書中で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ベクター（例、ｒＡＡＶビリオン）によりパッケージングされたポリヌクレオチド配列を指し、隣接配列（ＡＡＶ中、逆位末端反復）を含む。用語「発現カセット」および「ポリヌクレオチドカセット」は、隣接ＩＴＲ 配列間のベクターゲノムの部分を指す。「発現カセット」は、ベクターゲノムが、発現を駆動するエレメント（例、プロモーター）に作動可能に連結された遺伝子産物をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むことを意味する。

【0025】

本明細書中で使用される場合、用語「必要としている患者」または「必要としている対象」は、本明細書中に開示する組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムを用いた治療または寛解に適している疾患、障害、または状態のリスクのあるまたは罹患している患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、中枢神経系に関連する障害と診断された患者または対象であってもよい。対象は、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子内の突然変異、またはＥＥＦ１Ａ２遺伝子のすべてもしくは一部の欠失、または遺伝子調節配列を有してもよく、これらはｅＥＦ１Ａ２タンパク質の異常な発現を引き起こす。「対象」および「患者」は、本明細書中では互換的に使用される。本明細書中に記載する方法により治療される対象は、成人または子供であってよい。対象は年齢において広範であり得る。

【0026】

本明細書中で使用される場合、用語「バリアント」または「機能的バリアント」は、互換的に、親タンパク質の一つまたは複数の所望の活性を保持する親タンパク質と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するタンパク質を指す。

【0027】

本明細書中で使用される場合、「遺伝的破壊」は、遺伝子における機能の部分的または完全な喪失あるいは異常な活性を意味する。例えば、対象は、対象の少なくとも一部の細胞（例、神経細胞）において、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質の発現を減少させる、またはｅＥＦ１Ａ２タンパク質の喪失もしくは異常機能をもたらす、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子における発現または機能における遺伝的破壊を被り得る。

【0028】

本明細書中で使用される場合、「治療する」は、疾患または障害の一つまたは複数の症状を寛解させることを指す。用語「予防する」は、疾患もしくは障害の一つまたは複数の症状の発症を遅延もしくは中断すること、またはｅＥＦ１Ａ２関連神経疾患もしくは障害の進行を遅らせることを指す。

【0029】

ＥＥＦ１Ａ２タンパク質またはポリヌクレオチド
本開示は、伸長因子１－アルファ２（ｅＥＦ１Ａ２）タンパク質に関連する組成物および使用方法を企図する。図１に例証されるＥＥＦ１Ａ２における様々な変異は、てんかん、知的障害、および／または自閉症を含む神経学的障害と関連することが知られている。遺伝性変異およびデノボ変異の両方が観察されている。一部の症例では、ヘテロ接合性ミスセンス変異が、疾患を起こすのに十分である。

【0030】

ｅＥＦ１Ａ２のポリペプチド配列は以下の通りである。
ＭＧＫＥＫＴＨＩＮＩＶＶＩＧＨＶＤＳＧＫＳＴＴＴＧＨＬＩＹＫＣＧＧＩＤＫＲＴＩＥＫＦＥＫＥＡＡＥＭＧＫＧＳＦＫＹＡＷＶＬＤＫＬＫＡＥＲＥＲＧＩＴＩＤＩＳＬＷＫＦＥＴＴＫＹＹＩＴＩＩＤＡＰＧＨＲＤＦＩＫＮＭＩＴＧＴＳＱＡＤＣＡＶＬＩＶＡＡＧＶＧＥＦＥＡＧＩＳＫＮＧＱＴＲＥＨＡＬＬＡＹＴＬＧＶＫＱＬＩＶＧＶＮＫＭＤＳＴＥＰＡＹＳＥＫＲＹＤＥＩＶＫＥＶＳＡＹＩＫＫＩＧＹＮＰＡＴＶＰＦＶＰＩＳＧＷＨＧＤＮＭＬＥＰＳＰＮＭＰＷＦＫＧＷＫＶＥＲＫＥＧＮＡＳＧＶＳＬＬＥＡＬＤＴＩＬＰＰＴＲＰＴＤＫＰＬＲＬＰＬＱＤＶＹＫＩＧＧＩＧＴＶＰＶＧＲＶＥＴＧＩＬＲＰＧＭＶＶＴＦＡＰＶＮＩＴＴＥＶＫＳＶＥＭＨＨＥＡＬＳＥＡＬＰＧＤＮＶＧＦＮＶＫＮＶＳＶＫＤＩＲＲＧＮＶＣＧＤＳＫＳＤＰＰＱＥＡＡＱＦＴＳＱＶＩＩＬＮＨＰＧＱＩＳＡＧＹＳＰＶＩＤＣＨＴＡＨＩＡＣＫＦＡＥＬＫＥＫＩＤＲＲＳＧＫＫＬＥＤＮＰＫＳＬＫＳＧＤＡＡＩＶＥＭＶＰＧＫＰＭＣＶＥＳＦＳＱＹＰＰＬＧＲＦＡＶＲＤＭＲＱＴＶＡＶＧＶＩＫＮＶＥＫＫＳＧＧＡＧＫＶＴＫＳＡＱＫＡＱＫＡＧＫ（配列番号１）。

【0031】

一部の実施形態では、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質は、配列番号：１）と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。

【0032】

一部の実施形態では、本開示は、キャプシドおよびベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、ベクターゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、キャプシドおよびベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、ベクターゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＴＴＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号２）。

【0033】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されてもよい。

【0034】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＴＴＧＴＡＡＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＡＧＡＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＡ（配列番号４）。

【0035】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＧＧＡＣＡＣＧＴＴＧＡＴＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＧＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＧＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＴＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＡＴＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＣＧＣＴＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴＣＣＣＧＡＴＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＣＣＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＴＡＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＣＡＣＴＣＣＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＧＡＴＡＣＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＡＴＡＴＴＧＣＡＴＧＴＡＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧＧＣＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＡ（配列番号５）。

【0036】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＡＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴＡＧＡＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＴＡＡＧＴＡＣＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＴＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＴＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＣＣＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＴＡＴＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＣＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＧＧＡＴＡＧＧＡＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＴＡＴＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＧＴＧＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＣＣＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＧＴＡＧＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＡＡＡＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣＡＡＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＧＣＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＡＧＡＣＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＣＡＡＡＣＧＧＴＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＴＡＡＧＴＧＡ（配列番号６）。

【0037】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＡＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＴＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＡＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＡＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＡＡＴＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＡＡＧＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＡ（配列番号７）。

【0038】

ｅＥＦ１Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＧＧＣＡＣＧＴＴＧＡＴＡＧＣＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＧＡＴＡＡＡＣＧＡＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＡＴＡＴＣＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＣＧＴＡＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＡＴＡＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＴＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡ（配列番号８）。

【0039】

任意選択的に、ベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号１０）を含むがこれに限定されないコザック配列を含んでもよい。コザック配列は、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列と重複してもよい。例えば、ベクターゲノムは、以下と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列（コザック下線あり）を含んでもよい。
ｇｃｃａｃｃＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＴＴＡＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号９）。

【0040】

一部の実施形態では、コザック配列は、以下のうちのいずれか一つを含むまたはからなる代替コザック配列である。
（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号１１）；
ＡＧＮＮＡＵＧＮ；
ＡＮＮＡＵＧＧ；
ＡＣＣＡＵＧＧ；
ＧＡＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２）。

【0041】

一部の実施形態では、ベクターゲノムは、コザック配列を含まない。

【0042】

ベクターゲノム
本開示のＡＡＶビリオンは、ベクターゲノムを含む。ベクターゲノムは、発現カセット（またはポリヌクレオチド配列の発現を要求しない遺伝子編集用途のためのポリヌクレオチドカセット）を含んでもよい。任意の適切な逆位末端反復（ＩＴＲ）を使用してもよい。ＩＴＲは、キャプシドと同じ血清型由来であってもよく、または異なる血清型由来であってもよい（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲが使用され得る）。

【0043】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号１８）

【0044】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＧＴＡ（配列番号１９）

【0045】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＧＴＡ（配列番号２０）

【0046】

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号２１）

【0047】

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号６３）

【0048】

一部の実施形態では、ベクターゲノムは、例えば、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である一つまたは複数のフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）配列を含む。
ＧＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＡＡＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＣＣＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＴＧ（配列番号２２）；
ＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣ（配列番号２３）；または
ＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＴＣ（配列番号２４）。

【0049】

プロモーター
一部の実施形態では、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。

【0050】

本開示は、様々なプロモーターの使用を企図する。本開示の実施形態で有用なプロモーターとしては、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはＣＭＶエンハンサーと、ニワトリベータ－アクチンプロモーターおよびウサギベータ－グロビン遺伝子の一部（ＣＡＧ）とから構成されるプロモーター配列が挙げられる。一部の場合では、プロモーターは合成プロモーターであってもよい。例示的な合成プロモーターが、Ｓｃｈｌａｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０７（６）：２５３８－４３（２０１０）により提供されている。一部の実施形態では、プロモーターは、以下と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
ＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ（配列番号１４）

【0051】

一部の実施形態では、ｅＥＦ１Ａ２タンパク質、またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。誘導性プロモーターは、薬剤の添加もしくは蓄積に応答して、または薬剤の除去、分解、もしくは希釈に応答して、ポリヌクレオチド配列を転写的に発現させる、または転写的に発現させないように構成され得る。薬剤は薬物であってもよい。薬剤は、テトラサイクリンまたはその誘導体の一つであってもよく、これには限定されないが、ドキシサイクリンが含まれる。一部の場合では、誘導性プロモーターは、ｔｅｔ－ｏｎプロモーター、ｔｅｔ－ｏｆｆプロモーター、化学的に調節されたプロモーター、物理的に調節されたプロモーター（即ち、光の存在もしくは非存在に、または低温もしくは高温に応答するプロモーター）である。誘導性プロモーターには、重金属イオン誘導性プロモーター（マウス乳腺腫瘍ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは様々な成長ホルモンプロモーターなど）、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来のプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターのこのリストは非限定的である。

【0052】

場合によっては、プロモーターは、非神経細胞よりもニューロンで発現を駆動することができるプロモーターなどの組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファインターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）を含むがこれに限定されない、任意の様々なニューロン特異的プロモーターから選択される。場合によっては、プロモーターはユビキタスプロモーターである。「ユビキタスプロモーター」は、実験条件または臨床条件下で組織特異的ではないプロモーターを指す。一部の場合では、ユビキタスプロモーターは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１－アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、ニワトリベータ－アクチン、およびヒトベータ－アクチンプロモーターのいずれか一つである。

【0053】

一部の実施形態では、プロモーター配列は、表３から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号３、１４、１６～１７、および２５～３０と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0054】

【表3】

【0055】

好ましい実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0056】

プロモーターのさらなる例示的な例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体エンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の最初期プロモーター、およびＬＴＲエレメントを含む様々なレトロウイルスプロモーターである。多種多様な他のプロモーターが公知であり、当技術分野において一般的に利用可能であり、多くのそのようなプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの配列データベースにおいて利用可能である。

【0057】

他の調節エレメント
一部の場合では、本開示のベクターは、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナル、２Ａペプチドコード配列、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、およびＨＰＲＥ（Ｂ型肝炎転写後調節エレメント）からなる群から選択される一つまたは複数の調節エレメントをさらに含む。

【0058】

一部の実施形態では、ベクターはＣＭＶエンハンサーを含む。

【0059】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数のエンハンサーを含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー配列、ＧＡＰＤＨエンハンサー配列、β－アクチンエンハンサー配列、またはＥＦ１－αエンハンサー配列である。前述の配列は、当技術分野において公知である。例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサーの配列は、以下のとおりである。
ＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡ（配列番号３１）

【0060】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数のイントロンを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ウサギグロビンイントロン配列、ニワトリβ－アクチンイントロン配列、合成イントロン配列、またはＥＦ１－αイントロン配列である。

【0061】

特定の実施形態では、ベクターはポリＡ配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロビンポリＡ配列、ヒト成長ホルモンポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、ＰＧＫポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、またはＴＫポリＡ配列である。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）であってもよい。

【0062】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数の転写物安定化エレメントを含む。特定の実施形態では、転写物安定化エレメントは、ＷＰＲＥ配列、ＨＰＲＥ配列、足場付着領域、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲである。特定の実施形態では、ベクターは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む。

【0063】

一部の実施形態では、ベクターは、表４から選択される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３２～４０のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0064】

【表4】

【0065】

一部の実施形態では、ベクターは、表５から選択される３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号４１～４９のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0066】

【表5】

【0067】

一部の実施形態では、ベクターは、表６から選択されるポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号５０～５４のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0068】

【表6】

【0069】

例示的ベクターゲノムは、配列番号５５～５８または６５～６８として提供される図２～５に示される。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５５～５８または６５～６８のいずれか一つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、場合により、小文字のＩＴＲ配列を伴うまたは伴わない。コード配列は下線付きである。代替ベクターゲノム配列は、配列番号６５～６８として提供される。

Ｖ１－ベクターゲノム－３，１４４ｂｐ（図２）（配列番号５５）
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Ｖ２－ベクターゲノム－３，０３５ｂｐ（図３）（配列番号５６）
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Ｖ３－ベクターゲノム－３，２６３ｂｐ（図４）（配列番号５７）
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Ｖ４－ベクターゲノム－４，２９９ｂｐ（図５）（配列番号５８）
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【0070】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0071】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ－ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0072】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0073】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0074】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0075】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0076】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0077】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0078】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ－ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0079】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＨｕＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0080】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ／ｅＭＬＰエンハンサー、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0081】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0082】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、Ｓｙｎプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0083】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0084】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0085】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＢＡプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン－Ｏｃを含む。

【0086】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0087】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＥＦ１αプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0088】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＭＶプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0089】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＭＶプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0090】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0091】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0092】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0093】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＡＧプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0094】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＡＧプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0095】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡＧＨ－Ｂｔを含む。

【0096】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0097】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ｈＳＹＮプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0098】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＡＧプロモーター、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0099】

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＣＡＧプロモーター、コザック、ｅＥＦ１Ａ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびｐＡＧＨ－Ｈｓを含む。

【0100】

アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さであり、二つの１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の公知のバリアントがあり、抗原エピトープにより分類される場合、血清型と呼ばれることもある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００ １８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを導くシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置からｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７）のディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と連動して二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から四つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製を最終的に担う複数の酵素特性を持つ。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、それは、三つのキャプシドタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連するキャプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置付けられる。ＡＡＶのライフサイクルと遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）で概説されている。

【0101】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的となる独自の特色を持つ。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を許容する。さらに、ＡＡＶはゆっくりと分裂する細胞と分裂しない細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として、これらの細胞の生存期間にわたり本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中でクローン化ＤＮＡとして挿入され、これによって組換えゲノムの構築が実現可能となる。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムのキャプシド化を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部または全部（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をトランスで提供してもよい。ＡＡＶの別の重要な特色は、ＡＡＶが極度に安定した強力なウイルスであることである。アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を軽減する。ＡＡＶは凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。

【0102】

ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶバリアントまたは血清型由来であってもよく、ＡＡＶバリアントまたは血清型には、ＡＡＶ－１、 ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶｒｈ１０が含まれるが、これらに限定されない。シュードタイプ化されたｒＡＡＶの産生は、例えば、国際特許公開第０１／８３６９２号に開示されている。他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、キャプシド変異を伴うｒＡＡＶなども企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当技術分野において公知である。

【0103】

場合によっては、ｒＡＡＶは自己相補的なゲノムを含む。本明細書で定義されるように、「自己相補的」または「二本鎖」ゲノムを含むｒＡＡＶは、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．に記載されるように、ｒＡＡＶのコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように構成されるように操作されたｒＡＡＶを指す。自己相補的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、ＤＮＡ合成とは独立した効率的な形質導入を促進する。Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．８（１６）：１２４８－５４（２００１）。本開示は、感染（形質導入のような）時に、ｒＡＡＶゲノムの第二の鎖の細胞介在性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの二つの相補的な半分が、すぐに複製および転写ができる一つの二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するので、場合によっては、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶの使用を企図する。ｒＡＡＶにおいて見出される完全コード容量（４．７～６ｋｂ）の代わりに、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶは、その量の約半分（およそ２．４ｋｂ）だけを保持することが理解されよう。

【0104】

他の場合では、ｒＡＡＶベクターは一本鎖ゲノムを含む。本明細書中で定義されるように、「単一標準」ゲノムは、自己相補的ではないゲノムを指す。大半の場合では、非組換えＡＡＶは一本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ｒＡＡＶは、細胞の効率的な形質導入を達成するためにｓｃＡＡＶであるべきといういくつかの指標があった。本開示は、しかし、ｒＡＡＶベクターの他の遺伝子改変が、標的細胞において最適な遺伝子転写を得るために有益であり得るという理解から、自己相補的ゲノムではなく、一本鎖ゲノムを有するかもしれないｒＡＡＶベクターを企図している。一部の場合では、本開示は、マウス眼の前眼部への効率的な遺伝子導入を達成することが可能な一本鎖ｒＡＡＶベクターに関する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｙｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（８）：ｅ０１８２４７３（２０１７）を参照のこと。

【0105】

一部の場合では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４である。シュードタイプ化されたｒＡＡＶの産生は、例えば、国際特許公開第０１／８３６９２号に開示されている。他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、キャプシド変異を伴うｒＡＡＶなども企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。一部の場合では、ｒＡＡＶベクターは血清型ＡＡＶ９である。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９であり、一本鎖ゲノムを含む。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９であり、自己相補的ゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ２ゲノムを含み、その結果、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ－２／９ベクター、ＡＡＶ－２／６ベクター、またはＡＡＶ－２／８ベクターである。

【0106】

最も良く知られているＡＡＶに対する完全長配列およびキャプシド遺伝子の配列は、米国特許第８，５２４，４４６号に提供され、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0107】

ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ配列を含んでよく、またはそれらは野生型ＡＡＶ配列に対する一つまたは複数の改変を含んでもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、キャプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３内に、一つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、置換、欠失、または挿入を含む。特定の実施形態では、改変は、ＡＡＶベクターが対象に提供される場合、低下した免疫原性を提供する。

【0108】

ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶがニューロン、またはより具体的にはドパミン作動性ニューロンなどの対象の特定標的組織に標的化されるように改変されてもよい。例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ Ｎｉｇｒａ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ．Ｇｅｎｅｓ．２０１７年２月８日を参照のこと。また、米国特許第６，１８０，６１３号および米国特許公開第ＵＳ２０１２００８２６５０Ａ１号も参照のこと。その両方の開示は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは対象の黒質に直接注射される。

【0109】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ２キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ２キャプシドは、例えば、以下などの参照ＡＡＶ２キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５９）

【0110】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ９ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、例えば、以下などの参照ＡＡＶ９キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１５）

【0111】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ ｒＡＡＶビリオンまたはその好中球性バリアントであり、例えば、国際特許公開第２０１５／０３８９５８Ａ１号および国際特許公開第２０１７／１００６７１Ａ１号において開示されているものなどであるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶキャプシドは、配列ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号６１）またはＫＦＰＶＡＬＴ（配列番号６２）からの少なくとも４つの連続アミノ酸を含んでもよく、例えば、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８および５８９をコードする配列の間に挿入される。

【0112】

キャプシドの多くは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドは、例えば、以下などの参照ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号６０）

【0113】

本開示のｒＡＡＶビリオンに使用される更なるＡＡＶキャプシドには、国際特許公開第２００９／０１２１７６Ａ２号および国際特許公開第２０１５／１６８６６６Ａ２号において開示されているものが含まれる。

【0114】

医薬組成物およびキット
一態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンと、一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。

【0115】

例えば、注射による投与の目的のために、様々な溶液、例えば滅菌水溶液などを用いることができる。このような水溶液は、所望により緩衝されてもよく、液体希釈剤は、生理食塩水またはグルコースによって最初に等張することができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容可能な塩としてのｒＡＡＶの溶液は、０．００１％または０．０１％の例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ－６８などの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油中で調製されてもよい。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。この関連で、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準技術により容易に取得可能である。

【0116】

注射可能な使用に適した医薬品形態としては、これらに限定されないが、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、形態は滅菌されており、容易に注射可能な（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）程度に流動的でなければならない。製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0117】

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙された様々な他の成分と、適した溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを組み込み、それに続く濾過滅菌により調製され得る。一般的に、分散剤は、滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌された注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、活性成分に加えて、事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

【0118】

別の態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンと、使用説明書と、含む、キットを含む。

【0119】

使用方法
ある態様において、本開示は、細胞においてｅＥＦ１Ａ２活性を増加させる方法を提供し、この方法は、細胞を本開示のｒＡＡＶと接触させることを含む。別の態様では、本開示は、対象におけるｅＥＦ１Ａ２活性を増加させる方法を提供し、この方法は、本開示のｒＡＡＶに投与することを含む。一部の実施形態では、細胞および／または対象は、ｅＥＦ１Ａ２の発現レベルおよび／または活性が欠損しており、および／またはｅＥＦ１Ａ２における機能喪失突然変異を含む。細胞は、ニューロン、例えば、ドパミン作動性ニューロンであってもよい。

【0120】

一部の実施形態では、本方法は、細胞培養および／またはインビボでのニューロンの生存を促進する。

【0121】

治療方法
別の態様では、本開示は、疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本開示のｒＡＡＶビリオンを対象に投与することを含む。一部の実施形態では、疾患または障害は、神経疾患または障害である。一部の実施形態では、対象は、ｅＥＦ１Ａ２発現または機能における遺伝的破壊を被る。一部の実施形態では、疾患または障害は、ｅＥＦ１Ａ２欠損症および／またはｅＥＦ１Ａ２－関連神経疾患（ＯＭＩＭ番号６１７３０９、６１６３９３、６１６４０９）表現型スペクトル、例えば、知的障害、精神遅滞、てんかん性脳症および自閉症スペクトル障害である。

【0122】

ＡＡＶを介したｅＥＦ１Ａ２タンパク質のＣＮＳへの送達は、寿命を延長し、神経変性を予防し、神経行動学的欠損、変性てんかん性運動障害性脳症、てんかん、およびジストニアを予防または減弱させる可能性がある。

【0123】

併用治療も本発明により企図される。本発明の方法の標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイドまたは局所的減圧薬）との組み合わせが、新規の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。場合によっては、対象は、本明細書に記載されるｒＡＡＶの投与に対する免疫反応を防止または低減するためにステロイドで治療され得る。

【0124】

治療有効量のｒＡＡＶベクター、例えば、脳室内（ＩＣＶ）または大槽内（ＩＣＭ）注射は、脳重量で、約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１５ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量である。または静脈内送達用量は、体重で１２１３－１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲である。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。

【0125】

例えば、特定の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１ｅ１０ｖｇ、約２ｅ１０ｖｇ、約３ｅ１０ｖｇ、約４ｅ１０ｖｇ、約５ｅ１０ｖｇ、約６ｅ１０ｖｇ、約７ｅ１０ｖｇ、約８ｅ１０ｖｇ、約９ｅ１０ｖｇ、約１ｅ１２ｖｇ、約２ｅ１２ｖｇ、約３ｅ１２ｖｇ、約４ｅ１２ｖｇ、または約５ｅ１２ｖｇの用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。

【0126】

一部の実施形態では、例えば、ＩＣＶ注射が行われる場合、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、１ｅ１０ｖｇ／半球～１ｅ１３ｖｇ／半球の範囲、または約１ｅ１０ｖｇ／半球、約１ｅ１１ｖｇ／半球、約１ｅ１２ｖｇ／半球、または約１ｅ１３ｖｇ／半球の用量である。一部の実施形態では、例えば、ＩＣＭ注射が行われる場合、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、合計１ｅ１０ｖｇ～合計１ｅ１４ｖｇの範囲、または合計約１ｅ１０ｖｇ、合計約１ｅ１１ｖｇ、合計約１ｅ１２ｖｇ、合計約１ｅ１３ｖｇ、または合計約１ｅ１４ｖｇの用量である。

【0127】

一部の実施形態では、治療用組成物は、注入された治療用組成物の体積当たり、約１ｅ９、１ｅ１０、または１ｅ１１を超えるｒＡＡＶベクターのゲノムを含む。実施形態の場合では、治療用組成物は、１ｍＬ当たりおよそ１ｅ１０、１ｅ１１、１ｅ１２、または１ｅ１３を超えるｒＡＡＶベクターのゲノムを含む。ある特定の実施形態では、治療用組成物は、１ｍＬ当たり約１ｅ１４、１ｅ１３または１ｅ１２未満のｒＡＡＶベクターのゲノムを含む。

【0128】

患者の機能改善、臨床的有益性または有効性の証拠は、発作頻度（ミオクローヌス性および全身性強直間代発作）の減少、ＵＫ－ＷＨＯ小児頭囲、身長および体重パーセンタイルチャートを使用した脳の成長および体の成長などの代替マーカーの分析によって評価され得る。小児発作一覧表や投薬記録など、標準的な疾患評価尺度を使用して、認知、運動、発話、言語機能を測定する。ピーボディ発達運動尺度２（ＰＤＭＳ－２）およびベイリー乳幼児発達尺度３を含む認知・発達評価を、子供の障害のレベルに応じて適用する。粗大運動機能測定（ＧＦＭＦ－８８）、小児障害評価表（ＰＥＤＩ）。これらの尺度、あるいは類似の尺度、ならびに患者の申告によるＱＯＬに関する成果として、３段階評価（平均持続時間の減少、変化なし、増加）のＣａｒｅｇｉｖｅｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｓｅｉｚｕｒｅ Ｄｕｒａｔｉｏｎ（ＣＧＩＣＳＤ）、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＰｅｄｓＱＬ（商標））およびＶｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ－２ｎｄ などが疾患の構成要素の改善を実証し得る。ベースラインおよび治療後の脳磁気共鳴画像は、ミエリン化および脳容積の改善を示すことがある。心筋症、大動脈欠損症、および心室中隔欠損症を含む、常染色体優性ＥＥＦ１Ａ２－関連神経発達障害を有する患者では、心臓欠陥が観察されている（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｃａｒｖｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０； ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＥＥＦ１Ａ２のホモ接合型バリアントは、全体的な発達遅延、てんかん、発育不全、拡張型心筋症、および早期死亡を伴う単一血統で特定された（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。心臓状態の測定は、ベースラインの心電図および心エコー図を通してモニタリングされ得る。

【0129】

臨床的有益性は、寿命の延長、正常な神経発達のマイルストーンの達成、てんかん発作活動（ミオクローヌス性、間代性、全身性強直間代性、および／またはてんかん性痙攣を含む）の頻度または大きさの減少、舞踏病アテトーゼ、ジストニア、および／または運動失調症などの筋緊張低下または運動障害の改善、またはこれらの発症の欠如として観察され得る。神経保護効果および／または神経回復効果の証拠は、発達全体にわたるミエリン化の程度、脳梁の厚さ、および皮質および／または小脳萎縮の程度を特徴付けることによって、磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）で明らかであり得る。脳波（ＥＥＧ）活動の有益な変化は、多焦点放電および／または全般的なスパイク活動の減少によって明らかであろう。

【0130】

一部の実施形態では、例えば、静脈内投与が行われる場合、治療的に有効なｒＡＡＶベクターの量は、対象の総体重で約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ～１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の用量である。例えば、特定の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇの用量である。心臓の有益性の証拠には、心エコー図での安定した心機能が含まれ得る。

【0131】

組成物の投与
組成物の有効用量の投与は、限定されないが、全身的、局所的、直接注射、静脈内、脳内、脳脊髄内、くも膜下腔内、大槽内、被殻内、海馬内、黄斑内、線条体内（被殻および／または尾状核）、皮質内、または脳室内投与を含む、当技術分野の標準的な経路によるものであってよい。場合によっては、投与は、静脈内、脳内、脳脊髄、くも膜下腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内（被殻および／または尾状核）、または脳室内注射を含む。投与は、トレンデレンブルク傾斜を伴う、または伴わないくも膜下腔内注射によって行われてもよい。

【0132】

一部の実施形態では、本開示は、有効用量の本発明のｒＡＡＶおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるように、循環系中への投与であり得る。全身投与は、注射、注入、または移植を通じた親（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与を含む。

【0133】

特に、本発明のｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、以下に限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）または脳脊髄液（ＣＳＦ）への注射、および／または脳への直接の注射が含まれる。

【0134】

一部の実施形態では、本開示の方法は、脳室内、大槽内、くも膜下腔内、または脳実質内の送達を含む。注入は、注入ポンプを使用して、専用カニューレ、カテーテル、シリンジ／針を使用して行われてもよい。任意選択的に、注射部位の標的化は、ＭＲＩガイドイメージングを用いて達成されてもよい。投与は、有効量のｒＡＡＶビリオン、またはｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物のＣＮＳへの送達を含み得る。これらは、例えば、片側脳室内注入法、両側脳室内注入法、トレンデレンブルク傾斜手順を伴う大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｍａｇｎａ）注入、またはトレンデレンブルク傾斜処置を伴わない大槽内注入、トレンデレンブルク傾斜処置を伴うくも膜下腔内注入、またはトレンデレンブルク傾斜処置を伴わないくも膜下腔内注入を介して達成され得る。本開示の組成物は、さらに静脈内投与されてもよい。

【0135】

ＣＮＳへの直接送達には、脳室内、片側または両側、特定の神経細胞領域、あるいは神経細胞標的を含むより一般的な脳領域を標的とすることが考えられる。個々の患者の脳室内空間、脳領域および／または神経標的の選択、ならびにその後のＡＡＶの術中送達は、多数の撮像技術（ＭＲＩ、ＣＴ、ＭＲＩマージと組み合わせたＣＴ）を使用して、任意の数のソフトウェア計画プログラム（例えば、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｌｅａｒｐｏｉｎｔ Ｎｅｕｒｏｎａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｒａｉｎｌａｂ、Ｎｅｕｒｏｉｎｓｐｉｒｅなど）を採用することによって達成することができる。脳室内空間または脳領域の標的化および送達には、標準的な定位固定フレーム（Ｌｅｋｓｅｌｌ、ＣＲＷ）の使用が関与するか、または術中ＭＲＩの有無に関わらず、フレームレスアプローチを使用することができる。ＡＡＶの実際の送達は、ＡＡＶベクターの吸着を防止するために、材料で被覆した内側ルーメンを有する、または有さない針またはカニューレを通した注射による場合がある（例えば、Ｓｍａｒｔｆｌｏｗカニューレ、ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓカニューレ）。送達デバイスは、シリンジを、事前にプログラムされた注入速度および容量を有する自動注入またはマイクロ注入ポンプとインターフェイスで接続する。シリンジ／針の組み合わせ、または針のみは、定位固定フレームと直接インターフェイスで接続されてもよい。注入は、一定の流量、または対流性強化送達による変動速度を含み得る。

【実施例】

【0136】

実施例１：プロモーターの選択
ニューロンにおけるｅＥＦ１Ａ２の発現を回復させるプロモーターを選択するために、野生型新生児マウスにおける生体内分布試験を実施した。ヒトシナプシン（ｈＳＹＮ）プロモーターは、表１に示すように、他のすべての候補プロモーターと比較して、神経系対する優れた選択性および強力なニューロン発現を示した。驚くべきことに、ｈＳＹＮプロモーターは、試験されたｅＳＹＮおよび他のプロモーターよりも高いニューロン選択性を示した。

【0137】

【表6】

【0138】

実施例２：ＥＥＦ１Ａ２ノックアウトマウスモデルのＡＡＶ９遺伝子治療レスキュー
ＥＥＦ１Ａ２遺伝子の変異に影響を受けた対象（例えば、子供）のための新しい治療方法を開発した。真核生物翻訳伸長因子１アルファ２（ｅＥＦ１Ａ２）は、アミノアシル転写ＲＮＡをタンパク質合成のためにリボソームに送達するために不可欠である。ＥＥＦ１Ａ２遺伝子の変異は、重度の知的障害、自閉症、およびてんかんと関連している。現在有効な治療法はない。ＥＥＦ１Ａ２ノックアウトマウスモデル（消耗（ｗａｓｔｅｄ）マウス）は、十分に特徴解析されている。消耗（ｗｓｔ／ｗｓｔ）マウスは、離乳後に歩行障害および振戦を呈し、その後、２３日齢までに麻痺および運動ニューロンの変性が見られるようになった。このマウスモデルを使用して、発明者らは、遺伝子治療によりタンパク質の機能を回復できるかどうかを試験した。ヒトＥＥＦ１Ａ２ ｃＤＮＡ（ｈＳｙｎ－ｅＥＦ１Ａ２）の発現を駆動するために、汎ニューロンプロモーターであるヒトシナプシンを使用してアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）を設計した。インビボで構築物の発現を追跡するために、ｅＧＦＰマーカー遺伝子が含まれていた。免疫蛍光法（図７）は、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－ｅＥＦ１Ａ２－Ｔ２Ａ－ｅＧＦＰの新生児ＩＣまたはＩＶ注射後の神経細胞標的化を明らかにした。免疫組織化学染色（図８）は、ｒＡＡＶ（ｅＥＦ１Ａ２－２Ａ－ｅＧＦＰまたはｅＧＦＰマーカー単独の両方について）の単回注射から両方の投与経路後にＣＮＳにおける広範な導入遺伝子発現を確認した。

【0139】

遺伝子治療ベクターは、消耗（ｗｓｔ／ｗｓｔ）マウスの治療に有効であることが証明された。Ｅｅｆ１ａ２^－／－ノックアウトマウス（ｗｓｔ／ｗｓｔ）は、ＩＣを注射するとほとんどが生存し（３／４）、ＩＣおよびＩＶの両方を注射するとすべてが生存した（図９Ａ）。未処置マウスは、Ｐ２３で死亡した。ＩＣまたはＩＣ／ＩＶマウスは、同様にＷＴマウスと比較して体重減少を示さなかったのに対し、未処置の対照マウスは、Ｐ２３で死亡につながる体重減少を呈した（図９Ｂ）。ロータロッドおよびインバーテッドグリッド分析では、処置後のパフォーマンスの低下は見られなかった（図９Ｃおよび図９Ｄ）。結果は、二元配置分散分析およびダネットの多重比較検定のいずれによっても有意であった。

【0140】

ｅＥＦ１Ａ２発現は、野生型、ＩＣ、および併用治療において脳全体にわたって観察された（図９Ｅおよび図９Ｆ）。ｅＥＦ１Ａ２発現は、野生型、ＩＣ、および併用治療群の脊髄組織に存在した。しかし、発現は、未処置の消耗群およびＩＶ処置群（Ｆ）では存在しなかった。

【0141】

実施例３：ＥＥＦ１Ａ２^{Ｄ２５２Ｈ}、またはＥＥＦ１Ａ２^Ｇ７０Ｓ、またはＥＥＦ１Ａ２^{Ｅ１２２Ｋ}マウスモデルのＡＡＶ９遺伝子治療レスキュー
図２～図５および図６に示すベクター設計の有効性、ならびに様々なコドン最適化を比較して、優れた有効性を有するベクターを識別する。実験は、ヒトに見られる三つの変異（Ｄ２５２Ｈ、Ｇ７０Ｓおよび／またはＥ１２２Ｋ）および／または重度の神経変性表現型（Ｄｅｌ．２２．ｅｘ３）を有するマウスモデルを再現するマウスモデルで実施される。実験は、ｅＥＦ１Ａ２をコードするＡＡＶベクターが生存、体重減少、および行動表現型を救うことができることを確認するために、新生児マウス、および成体までの後期発達段階の両方で実施される。神経行動検査に対する有益な効果の評価には、回転シリンダ（ロータロッド）でのパフォーマンス、吊り下げられたワイヤ表面にしがみつく能力（ワイヤーハング試験）、フットフォールト試験、インバーテッドグリッド行動、握力、および通常の探索活動または異常行動（例えば、「痙攣行動」）の観察を含む、オープンフィールドでの行動が含まれる。ＡＡＶ９－ｅＥＦ１Ａ２を注射したマウスの神経行動機能を評価するために、未処置の対照と比較して、後肢の握り、歩行、脊柱後弯症、および棚に沿って歩く能力の分析を含む、一連の検査で集合的な神経スコアを取得することができる。寿命が延長されたＤｅｌ．２２．ｅｘ３（または異常なＥＥＧを有する他のマウス系統）マウスにおける発作の頻度および脳波（ＥＥＧ）の変化は、ＣＮＳにおける異常な電気活動を軽減する有益な効果を明らかにする。生化学的および組織学的解析により、ｅＥＦ１Ａ２発現レベルおよびＣＮＳ内の分布に対するベクター設計の優れた有効性が確認されている。組織分析には、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる新鮮な組織、および免疫標識によるＣＮＳの固定切片におけるｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ベクターコピー数、および導入遺伝子タンパク質発現の検出が含まれる。

【0142】

実施例４：ＥＥＦ１Ａ２欠乏のＷＳＴ／ＷＳＴマウスモデルにおける、中枢神経系へのヒトＥＥＦ１Ａ２タンパク質のＡＡＶ９を介した送達の効果
ｅＥＦ１Ａ２関連障害の代表的なモデルは、ＥＥｆ１Ａ２遺伝子の第一のエクソンおよびすべてのプロモーター要素の自然欠失が、ｅＥＦ１Ａ２ヌル（ｗｓｔ／ｗｓｔ）をもたらす、消耗マウスモデルである。未処置の動物では、ｗｓｔ／ｗｓｔマウスの３１％がＰ２０－２２の間に死亡し、生き残ったｗｓｔ／ｗｓｔマウスは、体重の減弱、振戦、それに続いて体重減少を示し、残りはすべて２４日目までに死亡した。未処置の動物は、握力の低下およびロータロッドのパフォーマンスの低下も示す可能性があり、最も長く生き延びた動物では、振戦、進行性麻痺、および体重減少が見られる。我々のｗｓｔ／ｗｓｔコロニーの動物は、より深刻で、より急性に衰弱し、より早期に死亡しているように見える。Ｐ２３にインバーテッドグリッド潜時が低下することによって、握力障害を観察した。ｗｓｔ／ｗｓｔ動物がＰ２４までしか生存しなかったため、ｗｓｔ／ｗｓｔを野生型動物と有意に区別するためのロータロッドパフォーマンスの低下は観察されていない。

【0143】

材料および方法
動物福祉
すべての動物実験は、英国内務省および１９８６年の動物（科学的手順）法に準拠し、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンの倫理審査委員会のガイドラインの範囲内で実施された。本試験で使用するｗｓｔ／ｗｓｔ ｅＥＦ１Ａ２ヌルマウスモデルは、以前に説明した（Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９５：４４６３－８（１９９８））。ヘテロ接合マウスを時間交配させて、混合遺伝子型同腹仔を生成した。仔をプライマー（プライマーＥＥＦ１Ａ２ Ｍｕｔ Ｆ ５’ＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣ ３’，ＥＥＦ１Ａ２ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒ ５’ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴ ３’，ＥＥＦ１Ａ２ ＷＴ Ｆ ５’ＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧ ３’）を使用してＰ０で遺伝子型を決定した。

【0144】

ＡＡＶ９－ｅＥＦ１Ａ２ベクターまたは対照物質の投与は、Ｐ０で新生児ホモ接合体ｗｓｔ／ｗｓｔまたはＷＴ同腹仔に対する両側脳室内注射により行われ、動物は、人道的エンドポイント（体重減少≧１５％）または時限犠牲点Ｐ６０まで追跡された。脳室内注射は、前述したようにＰ０－１マウスの側脳室に向けられた（Ｎｅｗｂｅｒｙ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６４：２９５－３０３（２００５））。３３ゲージ針（ハミルトン）を、注射部位に垂直に深さ３ｍｍまで挿入し、５μｌのベクターを５秒かけて側脳室に投与した。仔は速やかに雌親に戻された。群サイズは、遺伝子治療を行ったｗｓｔ／ｗｓｔマウスが６、７腹から対照の同腹仔が１４～１６であった。

【0145】

行動研究
マウスは定期的に計量され、一般的な健康状態の変化および人道的エンドポイントを満たすことについて評価された。ロータロッドの行動試験、およびインバーテッドグリッド試験をＰ２３で実施した。すべての行動試験は、動物治療群に対して盲検化された研究者によって実施された。マウスを、４～４０ｒ．ｐ．ｍ．の連続加速下で、最大５分間、ロータロッド（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（登録商標））上に置いた。マウスがロッドから落ちた時間を、各試験日に各動物について３回の試行（落下までの潜時）で記録した。インバーテッドグリッド試験は、３０ｃｍの高さの透明なプラスチックの箱の上に置いたステンレス鋼グリッド（４１×２５ｃｍ）上にマウスを置くことが含まれた。インバーテッドグリッドから落ちる潜時を最大５分で記録した。試験の各日にマウス当たり３回、インバーテッドグリッド試験を繰り返した。

【0146】

マウス組織の組織学的および免疫組織化学的解析
マウスを、ＰＢＳを使用した終末経心腔的灌流によって殺処分した。収集された組織（脳および内臓器官）を半分にし、異なる処理技術を可能にした。免疫組織化学に使用した脳を、４％ＰＦＡに４８時間、後固定し、３０％スクロース溶液に移し、切片化まで４^℃で凍結保護した。脳を、凍結ミクロトーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）ＨＭ４３０）に、厚さ４０μｍで、いずれかの冠状面に取り付けた。全脳免疫組織化学のために２４０μｍ間隔で選択された脳切片を用いて、フリーフローティング免疫組織化学ベースの分析を実施した。簡潔に述べると、フリーフローティング切片を、１５％の正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））－０．１％トリトン－Ｘ（ＴＢＳ－Ｔ）（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を含むトリス緩衝生理食塩水で、室温で１時間ブロックし、１０％の正常ヤギ血清－ＴＢＳ－Ｔ中の一次抗体ウサギｅＥＦ１Ａ２（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標））で、４℃で一晩、インキュベートした。翌日、切片をそれぞれ種特異的二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））と共に、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄した後、ベクタステインアビジン－ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））と共にインキュベートする。反応を、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ（登録商標））で可視化した。ＤＡＢ反応を、氷冷１ｘＴＢＳを使用して停止し、切片を洗浄して、二重コーティングされたゼラチン化ガラススライドに取り付けた。取り付けられた切片を風乾し、１００％エタノールで１０分間、脱水溶液（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（商標）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標））で３０分間脱水した後、カバースリップ用の封入剤（ＤＰＸ、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（登録商標））で被覆した。

【0147】

免疫蛍光法では、脳切片を１５％のヤギ血清で３０分間ブロックし、次いで、１０％の正常なヤギ血清ＴＢＳ－Ｔ ０．３％で希釈した一次抗体（ウサギｅＥＦ１Ａ２ １：１０００ Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）およびマウスＮｅｕＮ １：１０００ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）と共に４℃で一晩インキュベートした。 切片を１ｘＴＢＳで洗浄し、１０％の正常なヤギ血清で希釈したＡｌｅｘａ ４８８およびＡｌｅｘａ ５９４（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で標識したそれぞれの種特異的二次抗体と共に、室温で２時間インキュベートした。ＮＶ４ｅｉをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で２分間染色した。脳切片を、二重コーティングされたスライド上に取り付け、Ｆｌｕｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用してカバースリップした。

【0148】

光顕微鏡および蛍光イメージングは、ライカＤＦＣ４２０カメラシステムにリンクされたライカＤＭ ４０００を使用して実施された。共焦点画像を、ライカＴＣＳ ＳＰ５ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡を使用して捕捉した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（国立衛生研究所）を用いて画像を分析した。

【0149】

イムノブロット
Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）組織ライザーを使用して、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を補充した氷冷０．３２Ｍのスクロース中でマウス脳組織からタンパク質を抽出し、４度で１５分間遠心分離した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で測定した。１０μｇのタンパク質を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））で変性させた。タンパク質を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ（商標）Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））で分離し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））に移した。Ｂｉｏｒａｄ（登録商標）ブロッキング緩衝液で室温で１時間ブロッキングした後、膜を一次抗体ウサギｅＥＦ１Ａ２（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）、１：１０００）およびマウスＧＡＰＤＨ（Ａｂ Ｃａｍ（登録商標）、１：１０，０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を、二次的ＳｔａｒＢｒｉｇｈｔ（商標）Ｂｌｕｅ ５２０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３０００）およびＳｔａｒＢｒｉｇｈｔ（商標）Ｂｌｕｅ７００ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３０００）と共にインキュベートした。 免疫反応性タンパク質は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））を用いて可視化した。ロードされたサンプルｎ＝４～５生物学的複製

【0150】

ｑＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡ転写物発現解析
ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ（商標）ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））で抽出した脳ホモジネート（前脳、皮質ｎ＝４～５生物学的複製／群）から抽出し、Ｏｍｅｇａ Ｆｌｕｏｓｔａｒ（商標）で定量化した。混入ＤＮＡを、ＤＮＡｓｅ Ｉ精製キット（ＮＥＢ（登録商標））を使用して全ＲＮＡ（１μｇ）から除去した後、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））を用いて逆転写を行った。次いで、１０ｎｇのＤＮＡまたは合成ｃＤＮＡを使用して、マルチプレックスｈＥＥＦ１Ａ２およびｍＧＡＰＤＨ ＲＴ－ｑＰＣＲ（ｅＥＦ１Ａ２＿＿Ｆｗｄ１：ＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＡＡ、ｅＥＦ１Ａ２＿Ｒｅｖ１：ＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＴ、ｅＥＦ１Ａ２＿Ｐｒｏｂｅ：ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣおよび マウスＧＡＰＤＨ Ｆｏｒ：ＡＣＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣ、Ｒｅｖ：ＴＡＧＴＧＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧ、Ｐｒｏｂｅ：ＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡをＬｕｎａ Ｔａｑｍａｎ（商標）ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮＥＢ（登録商標））と共にＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で実施した。ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用し、相対的倍率変化を計算した。

【0151】

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）バージョン８を使用して、各実験に合わせてカスタマイズされた統計解析を実施した。インビボ実験設計およびサンプルサイズは、ＮＣ３Ｒガイダンスおよび出力計算を使用して設計した。動物実験のほとんどの解析については、一元配置または二元配置分散分析を、ボンフェローニまたはテューキーの多重比較のいずれかを用いて実施した。

【0152】

結果
図１０Ａ～図１０Ｋは、図２（「Ｖ１」；配列番号５５）、図３（「Ｖ２」；配列番号５６）、図４（「Ｖ３」；配列番号５７）および図６（「Ｖ４」、配列番号５８）に示すベクターゲノムを含む、ＡＡＶ９ベクターを２ｅ１０^１１ｖｇ／動物で投与した場合の比較を示す。

【0153】

図１０Ａ Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４遺伝子治療で処置されたＦＢＳ処置野生型、ｗｓｔ／ｗｓｔ、脳室内処置ｗｓｔ／ｗｓｔ動物のカプラン・マイヤー生存プロット（２ｘ１０^１１ｖｇ／仔、全遺伝子治療処置群ｎ＝６、野生型ＦＢＳｎ＝１４、ｗｓｔ／ｗｓｔ ＦＢＳ＝１７。遺伝子治療処置を受けた動物はすべて、有意な延命を示した（平均延命Ｖ１＝４．４日、ｐ＝０．００１、Ｖ２＝３．８日 ｐ＝０．００１４、Ｖ３ １０．７日 ｐ＜０．０００１、Ｖ４＝４．４日 ｐ＝０．００１ Ｌｏｇｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。図１０Ｂ マウス動物の体重（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を、生後３５日まで毎日、その後、時限犠牲点Ｐ６０または人道的エンドポイントの１５％体重減少まで毎週計量した。図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、および図１０Ｆ インバーテッドグリッド試験およびロータロッドによる筋力評価（群当たりｎ＝４～７、各動物は１５日および２３日齢で３回試験した）。これらの試験では、ロータロッドのｗｓｔ／ｗｓｔおよび野生型ＦＢＳ対照群間で有意差は観察されなかった。ｗｓｔ／ｗｓｔ ＦＢＳ動物では、野生型と比較して、Ｐ２３で有意な握力の低下が観察され、これらの行動結果に遺伝子治療ベクターの効果は見られなかった（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析）。図１０Ｇ 野生型ＦＢＳを生理学的参照としたフリーフローティング免疫組織化学法による、脳全体のｅＥＦ１Ａ２の代表的な免疫染色（群当たりｎ＝４～５、スケールバー２５０μｍ） Ｖ１－４を注射したすべてのｗｓｔ／ｗｓｔ動物は、脳全体でｅＥＦ１Ａ２を発現し、Ｖ３で最も濃い染色および最も高い発現が観察された。図１０Ｈ ｅＥＦ１Ａ２を共発現するニューロン（ＮｅｕＮマーカー）の皮質脳領域における代表的な免疫組織蛍光（群当たりｎ＝４．５、２００μｍ）。すべてが、野生型と比較して高い発現を伴うニューロン発現プロファイルを示す。蛍光強度によって観察された最も高い発現は、すべての皮質層を通して発現を示すＶ３であった。すべての画像は、一定の画像設定で取り込まれた。Ｖ２およびＶ４では、皮質層４および５でより離散的な発現が観察された。図１０Ｉ 脳全体でｅＥＦ１Ａ２発現を示す、定量化を伴う脳におけるｅＥＦ１Ａ２の代表的な免疫ブロットは、Ｖ４ベクターと比較して、中脳、小脳、および後脳領域においてより高い発現を有する、すべての遺伝子治療ベクターで達成された（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。図１０Ｊ Ｖ１ベクターで最も高いｍＲＮＡ発現を示す、前脳におけるヒトｅＥＦ１Ａ２転写物発現に対するｑＰＣＲ（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。図１０Ｋ Ｖ１ベクターで最も高いｍＲＮＡ発現を示す、前脳におけるヒトｅＥＦ１Ａ２皮質発現に対するｑＰＣＲ（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、二元配置分散分析）。

【0154】

結論
これらの実験は、四つのベクターすべてが、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子にホモ接合性ヌル変異を有するマウスモデル（マウスではｗｓｔと呼ばれる）において、ｅＥＦ１Ａ２の発現を回復できることを実証する。驚くべきことに、ベクターＶ１、Ｖ２、およびＶ３は、ｗｓｔ／ｗｓｔマウスの生存を、Ｐ２３を超えて、効果的かつ有意に延長することができる。（図１０Ａ）。さらに、実験は、脳、特に前脳（図１０Ｊ）および皮質（図１０Ｋ）におけるｅＥＦ１Ａ２導入遺伝子の発現が、Ｖ１、Ｖ２またはＶ４よりもＶ３において大きいことを予想外に示している。理論に拘束されるものではないが、５’ＵＴＲ（配列番号３４）および／または３’ＵＴＲ（配列番号４８）を含むことは、予想に反して、遺伝子発現を治療的に増加させ、生存を延長するようである。

【0155】

実施例５：ＥＥＦ１Ａ２疾患のＤ２５２Ｈマウスモデルにおける、中枢神経系へのヒトＥＥＦ１Ａ２タンパク質のＡＡＶ９を介した送達の効果
組織特異的翻訳伸長因子ｅＥＦ１Ａ２をコードするＥＥＦ１Ａ２におけるヘテロ接合性デノボ変異は、しばしば重度のてんかんおよび知的障害を含む、神経発達障害を引き起こすことが示されている。約５０種類のミスセンス変異が特定されているが、明らかな機能喪失変異は存在しない。しかし、大きなヘテロ接合性欠失は、生命に適合することが知られている。ミスセンスＤ２５２Ｈ変異を引き起こす疾患を担持するノックインｅＥＦ１Ａ２マウスモデルは、同じ遺伝的背景を持つヌルホモ接合体よりも深刻な影響を受け、体重の減弱、神経スコアの増加、およびＰ２３までの死亡を示す。ミスセンス変異に対してヘテロ接合性のマウスは、行動異常は示さないが、一過性の握力障害を伴う体格および運動機能において性特異的欠損を有する。ｄｅｌ２２ｅｘ３ヌルマウスモデルと並んで、このＤ２５２Ｈ新規マウスの表現型解析は、Ｄ２５２Ｈ変異を支持し、機能獲得をもたらす（Ｄａｖｉｅｓ，Ｆａｉｔｈ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０２０））。本実施例は、ヘテロ接合性およびホモ接合性のＤ２５２Ｈマウスの両方における遺伝子治療研究について説明する。

【0156】

材料および方法
処置マウスおよび未処置マウスの生存および体重は、発症過程にわたってモニタリングされた。行動試験も、Ｐ１８－２４日齢の間に実施された。

【0157】

動物福祉
すべての動物実験は、英国内務省および１９８６年の動物（科学的手順）法に準拠し、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンの倫理審査委員会のガイドラインの範囲内で実施された。ヘテロ接合性Ｄ２５２Ｈ ｅＥＦ１Ａ２ノックインマウスを時間交配させて、混合遺伝子型同腹仔を生成した。仔は、プライマー５”－３”ＡＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＧＴ，ＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧを使用して、Ｐ０で遺伝子型決定した。ＰＣＲ増幅後、試料をＨｉｎ１ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による制限消化にかけた。

【0158】

試験物質および対照物質の投与
新生児ホモ接合性ノックインマウス（Ｄ２５２Ｈ－／－）に対し、５μＬのＶ３ベクターまたは製剤緩衝液（ＦＢ）物品の投与を、１．８×１０^１１ｖｇ／仔の用量で片側脳室内注射により達成した。試験物質またはＦＢ対照物質を、以下によって説明された注入部位座標を用いて、３３ゲージのハミルトン針（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を介して、野生型およびヘテロ接合体Ｄ２５２Ｈに投与した。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９１：５１８６３ （２０１４）。ラムダ縫合は、新生仔において識別可能であり、意図される注射部位は、ラムダ縫合から眼球への２／５、矢状縫合から約０．８ｍｍ～１ｍｍ外側、ラムダとブレグマの中間の位置である。注射後、仔は雌親に戻された。

【0159】

体重
個々の動物の体重をＰ１－Ｐ３２から収集し、その後毎週収集した。１５％以上の体重減少は、安楽死の人道的エンドポイントに達する。

【0160】

行動試験
すべての行動試験アッセイは、動物治療群に対して盲検化された研究者によって実施された。ロータロッド試験：Ｐ１８－２４からロータロッド訓練／試験を実施した。マウスを、４～４０ｒ．ｐ．ｍ．の連続加速度で、最大２分間、ロータロッド（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上に置いた。マウスがロッドから落ちた時間を、各試験日に各動物について３回の試行（落下までの潜時）で記録した。インバーテッドグリッド試験：インバーテッドグリッド試験は、３０ｃｍの高さの透明なプラスチックの箱の上に置くステンレス鋼グリッド（４１×２５ｃｍ）上にマウスを置くことが含まれる。インバーテッドグリッドから落ちる潜時を最大２分で記録する。試験の各日に、マウス当たり３回、インバーテッドグリッド試験を繰り返す。

【0161】

結果
図１１Ａ～図１１Ｃは、未処理のＤ２５２Ｈ－／－マウスの表現型を示す。図１１Ａ：ＦＢＳ処置野生型、ノックアウト（Ｄ２５２Ｈ－／－）、脳室内Ｖ３遺伝子治療処置Ｄ２５２Ｈ－／－（２ｘ１０^１１ｖｇ／仔、Ｖ３処置＝２、Ｖ４処置＝１、野生型ＦＢＳｎ＝５、Ｄ２５２Ｈ－／－ＦＢＳ＝３のカプラン・マイヤー生存プロット。図１１Ｂ マウスの体重（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。図１１Ｃ ロータロッドによる運動評価（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびダネットの多重比較）。

【0162】

結論
これらの実験は、Ｖ３を有するＤ２５２Ｈ－／－マウスにおけるｅＥＦ１Ａ２のＡＡＶ９を介した発現が、未処置のＤ２５２Ｈ－／－対照と比較して生存率を高め得ることを示す。さらに、Ｄ２５２Ｈ－／－ホモ接合性マウスでは、ロータロッドのパフォーマンスは一貫して低いものの、Ｄ２５２Ｈ－／－ Ｖ３処置マウスでは経時的に一貫して改善傾向が観察される。アプリオリに定義された長期安全性／忍容性試験では、Ｄ２５２Ｈ／＋ヘテロ接合性マウスにおけるＶ３の脳室内投与後のｅＥＦ１Ａ２の過剰発現は、生存または機能的転帰測定に有害な影響を与えるようには見えない。ホモ接合性およびヘテロ接合性のＤ２５２Ｈマウスの両方で進行中の解析は、このｅＥＦ１Ａ２欠損モデルにおけるＡＡＶ９を介したｅＥＦ１Ａ２過剰発現の長期的な影響をさらに特徴付ける。

【0163】

実施例６：ＥＥＦ１Ａ２疾患のＤＥＬ２２ＥＸ３マウスモデルにおける、中枢神経系へのヒトＥＥＦ１Ａ２タンパク質のＡＡＶ９を介した送達の効果
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９生成されたＤｅｌ．２２．ｅｘ．３ ｅＥＦ１Ａ２マウスモデルを生成して、ｅＥＦ１Ａ２発現をノックアウトした（Ｄａｖｉｅｓ，Ｆａｉｔｈ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０２０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９変異誘導から生成されたＥｅｆ１ａ２のエクソン３内の２２塩基対の欠失は、ヌル変異をもたらした。これらのＤｅｌ２２ｅｘ３マウスは、発症後（約２１～２５日）、早期発症の運動ニューロン変性と麻痺に加え、致命的なてんかん発作という臨床的に相対する症状に苦しみ、あまり長く生存できない重度の表現型を呈する。本実施例は、ホモ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３ ｅＥＦ１Ａ２ヌルマウスにおける遺伝子治療研究を記述するものである。

【0164】

材料および方法
処置されたマウスおよび未処置マウスの生存および体重を、発達過程にわたって監視した。行動試験も、Ｐ２１－２５日齢のクリティカルウィンドウの間で実施された。

【0165】

動物福祉
すべての動物実験は、英国内務省および１９８６年の動物（科学的手順）法に準拠し、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンの倫理審査委員会のガイドラインの範囲内で実施された。ヘテロ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３マウスを時間交配させて、混合遺伝子型の同腹仔を生成した。仔をプライマー５”－３”５’－ＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＴ－３’ および５’－ＴＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴ－３’を使用してＰ０で遺伝子型決定した。

【0166】

試験物質および対照物質の投与
Ｖ３ベクターまたは製剤緩衝液（ＦＢＳ）１０μＬ（各半球５μＬ、両側）の脳室内注射を、２×１０^１１ｖｇ／仔（Ｖ３高用量）または２×１０^１０ｖｇ／仔（Ｖ３低用量）の用量で、新生児ホモ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３マウス（Ｄｅｌ２２ｅｘ３）に投与した。対照としての製剤緩衝液（ＦＢＳ、５μＬ、両側）を、野生型およびホモ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３マウスに３３ゲージのハミルトン針（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標），Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を介して、以下に描写された注射部位座標を用いて投与した。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９１：５１８６３ （２０１４）。ラムダ縫合は、新生仔において識別可能であり、意図される注射部位は、ラムダ縫合から眼球への２／５、矢状縫合から約０．８ｍｍ～１ｍｍ外側、ラムダとブレグマの中間の位置である。注射後、仔は雌親に戻された。

【0167】

体重
個々の動物の体重をＰ１－Ｐ３０は毎日収集し、その後毎週収集した。１５％以上の体重減少を、安楽死に対する人道的エンドポイントの基準として使用した。

【0168】

行動試験
Ｐ２１－２５日目（Ｐ２１は訓練日とみなされる）に、ロータロッドの訓練および試験が行われた。すべての行動アッセイは、動物治療群に対して盲検化された研究者によって実施された。マウスを、４～４０ ｒ．ｐ．ｍ．の連続加速度で、最大２分間、ロータロッド（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上に置いた。マウスがロッドから落ちた時間を、各試験日に各動物について３回の試行（落下までの潜時）で記録した。

【0169】

握力メーター（Ｂｉｏｓｅｂ（登録商標））を使用して、Ｐ２１－２５の間の肢筋力を測定した（Ｐ２１は訓練日とみなされる）。すべての四肢または前肢の握力を三回測定し、各試験の間に１分間の休憩を入れ、マウスが休ませるようにした。各試験では、マウスを尾の付け根で保持し、前肢または四肢すべてで掴むまでグリッド上に降ろした。

【0170】

神経スコア
レッジ試験：各マウスを、空のケージの棚に配置し、自由に探索させた。マウスがケージの端に沿って歩き、その中に着地するのを観察し、それに応じて採点した：０＝自信をもった歩き方と良い着地、１＝歩行中につまずきとぐらつき、２＝つまずきとぐらつき、棚から滑るが持ち直す、３＝棚に沿って歩くことができない

【0171】

後肢の掴み試験：マウスの尾の付け根近くを掴み、１０秒間空中に吊るした。後肢の位置を観察し、以下のように採点した：０＝後肢は一貫して腹部から外側を向いている、１＝後肢を身体側にわずかに引き寄せる動作が吊るされた時間の５０％以上、２＝後肢を腹部の方へ下向きにしているのが吊るされた時間の５０％以上、３＝後肢を完全に引き寄せて腹部に触れているのが吊るされた時間の５０％以上。

【0172】

歩行試験：動物を平らな表面上に置き、その頭部が治験責任医師とは反対に向け、歩行する様子を後方から観察し、行動を以下のように採点した：０＝マウスは正常に動く、体重は全肢で支持される、腹部は地面に触れない、両方の後肢が均等に参加している、１＝軽度の振戦が観察される、骨盤のわずかな隆起またはわずかなぐらつきが認められる、２＝重度の振戦、骨盤の隆起または顕著なぐらつき、３＝動きがばらばら、骨盤の隆起および重度のぐらつきを伴うつまずき。マウスは全く動かない場合もある。

【0173】

脊柱後弯症検査：マウスを平坦な表面上に置き、歩行中に側面から観察し、以下のように採点した：０＝歩きながら脊椎を簡単にまっすぐにできる、１＝軽度の脊柱後弯症（脊椎の湾曲）だが、歩行時、ほとんどまっすぐにできる、２＝脊椎を完全にまっすぐにできず、軽度だが持続的な脊柱後弯症を維持する、３＝歩行時または座位時に、顕著な脊柱後弯症を維持する。

【0174】

握力測定：肢の筋力は、握力計（Ｂｉｏｓｅｂ（登録商標））を使用して、Ｐ２１－２５齢で測定され、また、Ｐ３０齢およびＰ６０齢で測定される。前肢の握力を三回測定し、各試験の間に１分間の休憩を入れ、マウスが休ませるようにする。各試験では、マウスを尾の付け根で保持し、前肢で掴むまでグリッド上に降ろす。

【0175】

結果
図１２Ａ Ｖ３高用量（２×１０^１１ｖｇ／仔 ｎ＝５）を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３マウス、Ｖ３低用量（２×１０^１０ｖｇ／仔 ｎ＝５）を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３マウス、製剤緩衝液（ｎ＝３）を受けているＤｅｌ２２ｅｘ３対照、および製剤緩衝液（ｎ＝６）を受けている野生型対照のカプラン・マイヤー生存プロット。図１２Ｂ 経時的なマウスの体重（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。図１２Ｃ Ｐ２２－２５での握力測定による運動評価（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）
図１２Ｄ Ｐ２３での握力測定。（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびテューキーの多重比較）。図１２Ｅ Ｐ２２－２５でのロータロッドによる運動評価（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）
図１２Ｆ Ｐ２４でのロータロッド（データ平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、二元配置分散分析、およびテューキーの多重比較）。
図１２Ｇ Ｐ２１－２５の神経学的スコア。

【0176】

結論
この実験は、Ｖ３を有するホモ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３マウスにおけるｅＥＦ１Ａ２のＡＡＶ９を介した発現による用量関連の利益を実証する。治療効果は、生後３６日目（これまでの最終評価時点）までの生存年齢の延長、体重増加、握力およびロータロッドによって測定される筋力および運動行動、ならびに神経学的スコアの正常な悪化の改善によって示される。Ｖ３高用量処置動物では、最大でも生後２５日目までしか生存しない未治療のホモ接合性Ｄｅｌ２２ｅｘ３対照と比較して、より長期の生後３６日目までの生存が観察される。また、Ｖ３低用量群では、対照と比較して、生存期間も生後２８日目まで延長される。Ｖ３高用量群では、野生型同腹仔対照に匹敵する体重増加がある。握力測定は、未処置の対照では筋力の低下を示し、野生型動物では年齢の増加と共に握力の増加を示す。Ｖ３高用量処置動物では、未処置の対照と比較して、Ｐ２２－２５まで持続する握力増加が見られる。生後２３日目に、Ｖ３高用量処置マウスは、野生型同腹仔と同等に、有意に強い握力測定（ｐ＝０．００４６）を示す。Ｖ３低用量では効果は認められない。ロータロッド落下の潜時は、未処置およびＶ３低用量と比較して、生後２２～２５日目のＶ３高用量で持続的なパフォーマンスを示し、両方とも年齢と共に低下の傾向を示す。生後２４日目に、Ｖ３高用量処置動物は、未処置と比較して、有意に高いロータロッドパフォーマンスを示し（ｐ＝０．００１６）、野生型同腹仔と同等である。Ｖ３低用量群には効果は認められない。ＡＡＶ９－ｅＥＦ１Ａ２の有益性に関する追加の証拠は、Ｖ３処置動物の神経学的スコアに見出すことができる。Ｄｅｌ２２．ｅｘ３未処理対照の神経スコアは、Ｐ２１－２５の年齢と共に増加し、神経行動学的低下と一致する。これは、Ｖ３高用量処置動物が、生後２１～２５日に野生型同腹仔と同等であるため、観察されない。また、Ｖ３低用量群でも、少なくともＰ２４まで、Ｄｅｌ２２ｅｘ３未処理動物と比較して、持続的に低い神経スコアが観察される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12-1】

【図12-2】

【配列表】

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【国際調査報告】