特表 2023-535695 コロナウイルス感染症の治療及び予防のための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-21

(54)【発明の名称】コロナウイルス感染症の治療及び予防のための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230814BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230814BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230814BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230814BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230814BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230814BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20230814BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230814BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20230814BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230814BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/13 ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C12N15/85 Z

C12N5/10

C12N7/02

C12N15/12

C07K14/705

A61K39/395 V

A61K38/02

A61K9/12

A61K9/72

A61P31/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504023

(86)(22)【出願日】2021-07-20

(85)【翻訳文提出日】2023-02-06

(86)【国際出願番号】 US2021042372

(87)【国際公開番号】W WO2022020353

(87)【国際公開日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】63/053,817

(32)【優先日】2020-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/150,686

(32)【優先日】2021-02-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】399052796

【氏名又は名称】デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】トールチア， ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】フリーマン， ゴードン ジェイ．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA24

4C076AA93

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB25

4C076BB31

4C076CC07

4C076CC35

4C076FF70

4C084AA02

4C084BA41

4C084DC23

4C084MA13

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB33

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085DD33

4C085DD62

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG04

4C085GG08

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、部分的には、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための組成物及び方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチド又はその断片、ヒンジポリペプチド、及び断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン又はその断片を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドであって、前記ＡＣＥ２細胞外ドメインが、酵素的に不活性であり、前記Ｆｃドメイン又はその断片が、Ｆｃγ受容体に対して減弱した結合親和性を有する、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項2】

前記ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドが、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドが、Ｈ３７４、Ｈ３７８、Ｒ２７３、Ｈ３４５、Ｈ３４５、Ｈ５０５、Ｈ５０５、Ｒ１６９、Ｗ２７１、及びＫ４８１からなる群から選択される残基位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドが、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対して、Ｈ３７４Ｎ、Ｈ３７８Ｎ、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、Ｈ５０５Ｌ、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対するＨ３７４Ｎ又はＨ３７８Ｎ置換である、３又は４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項6】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対するＨ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ置換である、３又は４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、Ｈ５０５Ｌアミノ酸置換である、請求項３又は４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項8】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑアミノ酸置換である、請求項３又は４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項9】

前記ＡＣＥ２細胞外ドメインが、コロナウイルスに対する親和性を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される、請求項９に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項11】

前記Ｆｃドメインが、前記ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合を低減又は排除する、野生型Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項12】

前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＩＩａ受容体である、請求項１１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項13】

前記Ｆｃドメインが、表５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４抗体に由来する、請求項１１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項15】

前記Ｆｃドメインが、Ｌ２３５及びＰ３２９からなる群から選択される残基位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項16】

前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｓ２２８Ｐ又はＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項17】

前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項18】

前記Ｆｃドメインが、配列番号３３～３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項19】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１抗体に由来する、請求項１１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項20】

前記Ｆｃドメインが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３２９Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項21】

前記Ｆｃドメインが、配列番号３７～４２又は配列番号５５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項22】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２抗体に由来する、請求項１１に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項23】

前記Ｆｃドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項24】

ヒンジ領域が、表２、３、又は４のアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項25】

前記ヒンジ領域が、プロリン又はシステイン－プロリンジペプチドからなる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項26】

配列番号４８、４９、５６、又は５７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項28】

配列番号５０、５１、５８、又は５９と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸。

【請求項29】

請求項２７又は２８に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項30】

前記ベクターが、発現ベクターである、請求項２９に記載のベクター。

【請求項31】

請求項２９又は３０に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項32】

前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項３１に記載の細胞。

【請求項33】

コロナウイルスを隔離する方法であって、コロナウイルスを含む流体を、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと接触させることを含み、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、前記コロナウイルスに結合し、それによって、前記コロナウイルスを隔離する、方法。

【請求項34】

前記隔離されたコロナウイルスが、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドに結合することができない、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

コロナウイルスが細胞によって発現される内因性ＡＣＥ２ポリペプチドに結合するのを阻害する方法であって、前記細胞と連通している流体を、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと接触させることを含み、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、前記コロナウイルスに結合し、それによって、前記コロナウイルスが内因性に発現されるＡＣＥ２ポリペプチドに結合するのを阻害する、方法。

【請求項36】

前記流体が、間質液、血液、血漿、血清、粘液、脳脊髄液、又はリンパ液である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

コロナウイルス感染症を有する対象又はそれを有する疑いのある対象を治療するための方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項38】

感染のリスクがある対象におけるコロナウイルス感染症を予防する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【請求項39】

対象におけるコロナウイルス感染症の抗体依存性感染増強を治療又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～２６のいずれか一項に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項40】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記対象が、哺乳動物である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記対象が、ヒトである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記投与が、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内、経口、吸入、噴霧、及び経皮からなる群から選択される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ａ．前記コロナウイルスが、他のコロナウイルスを中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性があり、
ｂ．前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、
ｃ．前記コロナウイルスが、コロナウイルスワクチンによって付与された免疫に耐性があり、
ｄ．前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって付与された免疫に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、
ｅ．前記コロナウイルスが、以前のコロナウイルス感染症によって付与された自然免疫に耐性があり、
ｆ．前記コロナウイルスが、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症によって付与された自然免疫に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、
ｇ．前記コロナウイルスが、Ｓタンパク質におけるＥ４８４置換を保有し、
ｈ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＮ５０１置換を保有し、
ｉ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＫ４１７置換を保有し、
ｊ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４及びＮ５０１置換を保有し、
ｋ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４Ｋ置換を保有し、
ｌ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４Ｑ置換を保有し、
ｍ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＮ５０１Ｙ置換を保有し、
ｎ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＫ４１７Ｎ置換を保有し、
ｏ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有し、
ｐ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４、Ｎ５０１、及びＫ４１７置換を保有し、
ｑ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＥ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有し、
ｒ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＬ４５２置換を保有し、
ｓ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＬ４５２Ｒ置換を保有し、
ｔ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＴ４７８置換を保有し、
ｕ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＴ４７８Ｋ置換を保有し、
ｖ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＬ４５２及びＴ４７８置換を保有し、
ｗ．前記コロナウイルスが、前記Ｓタンパク質におけるＬ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有し、
ｘ．前記コロナウイルスが、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、「イギリスバリアント」、又はアルファバリアントとしても知られるＢ．１．１．７系統に由来し、
ｙ．前記コロナウイルスが、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、「イギリスバリアント」、又はアルファバリアントとしても知られる前記Ｂ．１．１．７系統であり、
ｚ．前記コロナウイルスが、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、又はベータバリアントとしても知られるＢ．１．３５１系統（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）に由来し、
ａａ．前記コロナウイルスが、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、又はベータバリアントとしても知られる前記Ｂ．１．３５１系統（前記Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）であり、
ｂｂ．前記コロナウイルスが、「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、系統Ｐ．１、又はガンマバリアントとしても知られるＢ．１．１．２４８系統（前記Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）に由来し、
ｃｃ．前記コロナウイルスが、「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、系統Ｐ．１、又はガンマバリアントとしても知られる前記Ｂ．１．１．２４８系統（前記Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）であり、
ｄｄ．前記コロナウイルスが、Ｂ．１．６１７系統に由来し、
ｅｅ．前記コロナウイルスが、Ｂ．１．６１７．１系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）に由来し、
ｆｆ．前記コロナウイルスが、前記Ｂ．１．６１７．１系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）であり、
ｇｇ．前記コロナウイルスが、デルタバリアントとしても知られるＢ．１．６１７．２系統（他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）に由来し、
ｈｈ．前記コロナウイルスが、デルタバリアントとしても知られる前記Ｂ．１．６１７．２系統（他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）であり、
ｉｉ．前記コロナウイルスが、Ｂ．１．６１７．３系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）に由来し、かつ／又は
ｊｊ．前記コロナウイルスが、前記Ｂ．１．６１７．３系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）である、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５３，８１７号、及び２０２１年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５０，６８６号の利益を主張し、各出願の全容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされた新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）は、世界的なパンデミックの際に、何十万人もの人々が病気になり、又は死亡した。ワクチンは開発されているが、臨床翻訳には少なくとも１８ヶ月かかり、大規模な臨床研究で安全性及び有効性の両方を実証するという課題に直面している。ワクチンの有効性及び利用可能性に応じて、感染及び死亡がその後しばらく継続する可能性がある。

【0003】

既存の抗ウイルス小分子及び疾患修飾免疫調節物質の臨床試験が進行中であるが、それらの安全性、有効性、及び任意の潜在的な有効性の大きさは依然として不明である。中和抗体も開発されており、大規模に提供され得る受動免疫療法の可能性を提供している。中和抗体は有望なアプローチであるが、その有効性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質上の別個のエピトープに結合し、スパイクタンパク質がその細胞表面受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合するのを防ぐそれらの能力に依存する。別個のスパイクタンパク質エピトープへの抗体の結合の依存は、ＡＣＥ２結合を保持しながら抗体の結合を阻害するスパイクタンパク質配列の変化が、ウイルスが中和を回避することを可能にする可能性があることを意味する。したがって、中和抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体バリアントに対して有効ではない可能性があり、これは特に、中和抗体による広範囲の治療がウイルスに進化的圧力を及ぼす場合、感染した個人の大規模な集団で生じ得る。同様に、中和抗体は、遺伝的浮動を受けた将来のＡＣＥ２指向性新規コロナウイルスに対して有効ではない可能性がある。

【0004】

更に、肺合併症は、ＣＯＶＩＤ－１９の罹患率及び死亡率の主な要因である。急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む肺合併症の病因は、複雑で多因子性であるが、抗体依存性感染増強（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ、ＡＤＥ）として知られる免疫病理学的現象が、ＡＲＤＳを有するＣＯＶＩＤ－１９患者における寄与メカニズムとして仮定されている。ＡＤＥは、中和抗体が実際に、Ｆｃγ受容体を発現する免疫細胞のウイルス感染又は過剰刺激を促進することによって、感染及び炎症を悪化させ得るいくつかのウイルス症候群で見られる現象である（Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：３３９－４２；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６８：３４０－３６４）。
したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の治療及び予防のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の薬理学的阻害剤に対する高い必要性が、依然としてある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：３３９－４２

【非特許文献2】Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６８：３４０－３６４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、不活性な可溶性ＡＣＥ２タンパク質が、少なくとも部分的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが内因性ＡＣＥ２に結合するのを競合的に阻害し、それによって、ウイルスが細胞に侵入するのを防ぐという発見に基づいている。

【0007】

本発明の一態様は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを提供し、ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチド又はその断片、ヒンジポリペプチド、及び断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン又はその断片を含む。ＡＣＥ２細胞外ドメインは、酵素的に不活性であり、Ｆｃドメイン又はその断片は、Ｆｃγ受容体に対して減弱した結合親和性を有する。

【0008】

多数の実施形態が更に提供され、これらは、本発明のいずれかの態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わされ得る。例えば、一実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドは、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドは、Ｈ３７４、Ｈ３７８、Ｒ２７３、Ｈ３４５、Ｈ３４５、Ｈ５０５、Ｈ５０５、Ｒ１６９、Ｗ２７１、及びＫ４８１からなる群から選択される残基位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。更に別の実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインポリペプチドは、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対して、Ｈ３７４Ｎ、Ｈ３７８Ｎ、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、Ｈ５０５Ｌ、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。更に別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対するＨ３７４Ｎ又はＨ３７８Ｎ置換である。別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドに対するＨ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ置換である。更に別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、Ｈ５０５Ｌアミノ酸置換である。更に別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑアミノ酸置換である。別の実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、コロナウイルスに対する親和性を有する。更に別の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合を低減又は排除する、野生型Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＩＩａ受容体である。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、表５のアミノ酸配列を含む。なお、実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４抗体に由来する。更に別の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３５及びＰ３２９からなる群から選択される残基位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ又はＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む。更に別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む。更に別の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３３～３６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体に由来する。更に別の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３２９Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。更に別の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３７～４２又は配列番号５５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ２抗体に由来する。更に別の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態では、ヒンジ領域は、表２、３、又は４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒンジ領域は、プロリン又はシステイン－プロリンジペプチドからなる。

【0009】

本発明の別の態様は、配列番号４８、４９、５６、又は５７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを提供する。

【0010】

本発明の更に別の態様は、上記の態様のいずれかのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0011】

別の態様では、配列番号５０、５１、５８、又は５９と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。多数の実施形態が更に提供され、これらは、本発明のいずれかの態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わされ得る。例えば、一実施形態は、直前の態様のいずれかの核酸分子を含むベクターを提供する。別の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。更に別の実施形態では、直前の実施形態のいずれかのベクターを含む細胞が提供される。別の実施形態は、直前の実施形態のいずれかのベクターを含む細胞を提供する。更に別の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。

【0012】

本発明の別の態様は、コロナウイルスを隔離する方法を提供し、コロナウイルスを含む流体を、上記の態様のいずれか１つに記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと接触させることを含み、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、コロナウイルスに結合し、それによって、コロナウイルスを隔離する。

【0013】

多数の実施形態が更に提供され、これらは、本発明のいずれかの態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わされ得る。例えば、一実施形態では、隔離されたコロナウイルスは、完全長のＡＣＥ２ポリペプチドに結合することができない。一実施形態では、流体は、間質液、血液、血漿、血清、粘液、脳脊髄液、又はリンパ液である。本明細書に記載の方法の別の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。

【0014】

本発明の更に別の態様は、コロナウイルスが細胞によって発現される内因性ＡＣＥ２ポリペプチドに結合するのを阻害する方法を提供し、本方法は、細胞と連通している流体を、上記態様のいずれか１つに記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと接触させることを含み、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、コロナウイルスに結合し、それによって、コロナウイルスが内因性に発現されるＡＣＥ２ポリペプチドに結合するのを阻害する。一実施形態では、流体は、間質液、血液、血漿、血清、粘液、脳脊髄液、又はリンパ液である。別の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。別の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。更に別の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。

【0015】

別の態様は、コロナウイルス感染症を有する対象又はそれを有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、対象に、上記態様のいずれか１つに記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。一実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。別の実施形態では、対象は、哺乳動物である。別の実施形態では、対象は、ヒトである。更に別の実施形態では、投与は、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内、経口、吸入、噴霧、及び経皮からなる群から選択される。

【0016】

更に別の態様では、感染のリスクがある対象におけるコロナウイルス感染症を予防するための方法が提供され、本方法は、対象に、有効量の上記態様のいずれか１つに記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与することを含む。一実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。別の実施形態では、対象は、哺乳動物である。別の実施形態では、対象は、ヒトである。更に別の実施形態では、投与は、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内、経口、吸入、噴霧、及び経皮からなる群から選択される。

【0017】

本発明の別の態様は、対象におけるコロナウイルス感染症の抗体依存性感染増強を治療又は予防する方法を提供し、本方法は、対象に治療有効量の上記態様のいずれか１つに記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与することを含む。

【0018】

多数の実施形態が更に提供され、これらは、本発明のいずれかの態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わされ得る。例えば、一実施形態では、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染症及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症からなる群から選択される。一実施形態では、対象は、哺乳動物である。別の実施形態では、対象は、ヒトである。更に別の実施形態では、投与は、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内、経口、吸入、噴霧、及び経皮からなる群から選択される。

【0019】

多数の追加の実施形態が提供され、これらは、本発明のいずれかの態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わされ得る。例えば、一実施形態では、コロナウイルスは、他のコロナウイルスを中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性があり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、コロナウイルスワクチンによって付与される免疫に耐性があり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチンによって付与される免疫に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、以前のコロナウイルス感染症によって付与された自然免疫に耐性があり、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症によって付与された自然免疫に耐性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、Ｓタンパク質にＥ４８４置換を保有し、Ｓタンパク質にＮ５０１置換を保有し、Ｓタンパク質にＫ４１７置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４及びＮ５０１置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｑ置換を保有し、Ｓタンパク質にＮ５０１Ｙ置換を保有し、Ｓタンパク質にＫ４１７Ｎ置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４、Ｎ５０１、及びＫ４１７置換を保有し、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有し、Ｓタンパク質にＬ４５２置換を保有し、Ｓタンパク質にＬ４５２Ｒ置換を保有し、Ｓタンパク質にＴ４７８置換を保有し、Ｓタンパク質にＴ４７８Ｋ置換を保有し、Ｓタンパク質にＬ４５２及びＴ４７８置換を保有し、Ｓタンパク質にＬ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有し、Ｂ．１．１．７系統（２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、「イギリスバリアント」、若しくはアルファバリアントとしても知られる）に由来し、Ｂ．１．１．７系統（２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、「イギリスバリアント」、若しくはアルファバリアントとしても知られる）であり、Ｂ．１．３５１系統（２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはベータバリアント（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）としても知られる）に由来し、Ｂ．１．３５１系統（２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはベータバリアント（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）としても知られる）であり、Ｂ．１．１．２４８系統（「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、系統Ｐ．１、若しくはガンマバリアント（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）としても知られる）に由来し、Ｂ．１．１．２４８系統（「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、系統Ｐ．１、若しくはガンマバリアント（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）としても知られる）であり、Ｂ．１．６１７系統に由来し、Ｂ．１．６１７．１系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）に由来し、Ｂ．１．６１７．１系統（Ｅ４８４Ｑを保有する）であり、Ｂ．１．６１７．２系統（デルタバリアント（他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）としても知られる）に由来し、Ｂ．１．６１７．２系統（デルタバリアント（他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）としても知られる）であり、Ｂ．１．６１７．３系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）に由来し、かつ／又はＢ．１．６１７．３系統（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの三次元図である。

【図2A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する２つのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの能力を特徴付ける。図２Ａは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に強く結合することを示す結合曲線である。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度は、μｇ／ｍｌで測定される。図２Ｂは、図２Ａに示される結合曲線と同じであるが、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度は、モル濃度で測定される。

【図2B】同上。

【図3】２つのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を中和する能力を特徴付けるグラフを含む。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞へのウイルス侵入を阻害する。

【図4A】固定化された組換えヒトＦｃγＲＩＩａに対する２つのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの親和性と、固定化された組換えヒトＦｃγＲＩＩａに対する精製されたポリクローナルヒトＩｇＧの親和性とを比較する。図４Ａは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２が、ヒトＩｇＧと比較して著しく減弱したＦｃγＲＩＩａ結合を示す結合曲線である。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度は、μｇ／ｍｌで測定される。図４Ｂは、図４Ａに示される結合曲線と同じであるが、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度は、モル濃度で測定される。

【図4B】同上。

【図5】ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＡＣＥ２酵素活性を、野生型ＡＣＥ２細胞外ドメインを含む２つのＡＣＥ２－Ｆｃ融合体のＡＣＥ２酵素活性と比較する。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は酵素活性を示さないが、一致した野生型ＡＣＥ２－Ｆｃ融合体は酵素活性を示す。

【図6A】ルシフェラーゼ及びＧＦＰレポーター遺伝子の両方を含む偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を中和するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の能力を特徴付ける。ＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞を、標的として使用した。図６Ａでは、ルシフェラーゼ発現を検出する発光アッセイによって感染を測定した。図６Ｂでは、ＧＦＰの発現を検出する蛍光顕微鏡によって、２９３Ｔ細胞の感染を可視化した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１とＤＦ－ＣＯＶ－０２の両方がＡＣＥ２発現２９３Ｔ細胞へのウイルス侵入を阻害し、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ＤＦ－ＣＯＶ－０２よりも強力に中和する。

【図6B】同上。

【図7】野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和し、ヒト誘導多能性幹細胞に由来するヒト２型肺胞細胞（ｉＡＴ２）の感染を防止するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の能力を特徴付ける。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるｉＡＴ２細胞の感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２Ｎ－タンパク質に対する蛍光標識抗体によって検出され、フローサイトメトリーによって測定された。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２はいずれも感染を阻害したが、陰性対照のＦｃ融合体（ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）は阻害しなかった。

【図8】腹腔内注射を介して投与した場合のハムスターにおけるＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の薬物動態（ＰＫ）曲線を示すグラフである。ＤＦ－ＣＯＶ－０１の血清中半減期（ｔ_１／２）は、ＤＦ－ＣＯＶ－０２の半減期よりも長い。ＤＦ－ＣＯＶ－０２の分布容積（Ｖ_ｄ）は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１の分布容積よりも大きい。ＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりも高度に末梢組織に浸透すると考えられている。

【図9A】インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の活性を特徴付ける。シリアハムスターを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内負荷し、１日１回の４０ｍｇ／ｋｇのＤＦ－ＣＯＶ－０１、又は１日２回の２０ｍｇ／ｋｇのＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、ＤＦ－ＣＯＶ－０４、若しくはビヒクル対照（ＰＢＳ）のいずれかで合計３日間処置した。図９Ａは、３日目の中咽頭のウイルス力価を比較し、図９Ｂは、３日目の鼻甲介のウイルス力価を比較し、図９Ｃは、３日目の肺の力価を比較し、図９Ｄは、３日目の各群におけるハムスターの体重を（０日目の各個体の体重に対して）ビヒクル対照（ＰＢＳ）で処置したハムスターと比較し、図９Ｅは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１で処置したハムスターの経時的な体重をビヒクル対照（ＰＢＳ）で処置したハムスターと比較する。ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ビヒクル対照（ＰＢＳ）と比較して、中咽頭力価、鼻甲介力価、及び肺力価を低下させた。体重減少は、ハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の兆候である。ＤＦ－ＣＯＶ－０１で処置したハムスターは、ビヒクル対照（ＰＢＳ）で処置したハムスターと比較して、３日目でより高い平均体重を有した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１で処置した数匹のハムスターは、全てのハムスターが屠殺された３日目までに、減少した体重が回復し始めた。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図9D】同上。

【図9E】同上。

【図10A】ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の概略図及び三次元図を含む。図１０Ａは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１を示し、これは、サイレントＩｇＧ４－ＳＰＬＥ Ｆｃドメインに融合された酵素的に不活性な完全長ＡＣＥ２細胞外ドメインであるＡＣＥ２－ＮＮ（１８－７４０）とのＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である。図１０Ｂは、ＤＦ－ＣＯＶ－０２を示し、これは、サイレントＩｇＧ４－ＳＰＬＥ Ｆｃドメインに融合された酵素的に不活性なＡＣＥ２メタロペプチダーゼドメインＡＣＥ２－ＮＮ（１８－６１２）とのＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である。ＡＣＥ２細胞外ドメインの膜近位ストークは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１の柔可撓性を増強し得ることが理解され得る。ＤＦ－ＣＯＶ－０２がより小さく、その末梢組織浸透は、このより小さい分子量及びより小さい流体力学的半径によって増強され得ることも理解され得る。

【図10B】同上。

【図11】ＤＦ－ＣＯＶ－０３の概略図を含み、これは、サイレントＩｇＧ１－ＬＡＬＡ Ｆｃドメインに融合された酵素的に不活性なＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインＡＣＥ２－ＮＮ（１８－６１５）とのＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である。ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインのヒンジ領域よりも可撓性であり、可撓性Ｇ４ＡＧ４人工リンカー配列もまた含まれる。

【図12A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質に結合する２つのＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインのアミノ末端とカルボキシ末端との間の距離を比較する三次元図、並びにこの比較に基づいて設計されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合体の概略図を含む。図１２Ａでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質ＲＢＤに結合するＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインの２つの結晶構造のＲＢＤ（ＰＤＢ：６Ｍ０Ｊ）を、完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質構造（ＰＤＢ：６Ｘ２Ｂ）の「アップ（ｕｐ）」立体構造における２つのＲＢＤと重ね合わせた。ＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインのアミノ末端間の距離は４０Åと測定され、ＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインのカルボキシ末端間の距離は９３Åと測定された。図１２Ｂは、ＤＦ－ＣＯＶ－０４の概略図であり、これは、サイレントＩｇＧ１－ＬＡＬＡ Ｆｃドメインに融合された酵素的に不活性なＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインＡＣＥ２－ＮＮ（１８－６１５）とのＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である。このポリペプチドのＡＣＥ２及びＦｃドメインの配向は逆であり、ＦｃドメインはＡＣＥ２ドメインに対してアミノ末端である。ＤＦ－ＣＯＶ－０４の２つのＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインが、同じウイルスＳタンパク質上の２つのＲＢＤに同時に結合する場合、リンカーは、よりエネルギー的に有利であるより短い距離にまたがることが必要であり得る。したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃと、Ｆｃドメインのカルボキシ末端に位置するＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインとの融合体は、ウイルス中和の効力を改善することができる。

【図12B】同上。

【図13A】偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を中和するＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の能力を特徴付ける。ＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞を標的として使用し、ルシフェラーゼレポーターの発現を検出する発光アッセイによって、感染を測定する。図１３Ａは、μｇ／ｍＬの濃度での中和曲線を含む。図１３Ｂは、ナノモル濃度単位の濃度での中和曲線を含む。ＤＦ－ＣＯＶ－０１が最も強力にウイルスを中和し（ＩＣ５０ １．８ｎＭ）、ＤＦ－ＣＯＶ－０４も強力にウイルスを中和した（ＩＣ５０ ４．４ｎＭ）。ＤＦ－ＣＯＶ－０２及びＤＦ－ＣＯＶ－０３は、ウイルスをあまり中和しなかった（ＩＣ５０がそれぞれ１０ｎＭ及び１５ｎＭ）。

【図13B】同上。

【図14A】ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質に結合する能力を特徴付ける。図１４Ａは、μｇ／ｍＬの濃度での結合曲線を含み、図１４Ｂは、ナノモル単位の濃度での結合曲線を含む。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、Ｓタンパク質に、同等に結合する。ＤＦ－ＣＯＶ－０３は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２よりもＳタンパク質に対するアビディティがわずかに高い。驚くべきことに、ＤＦ－ＣＯＶ－０４は、このアッセイによって測定した場合、ＤＦ－ＣＯＶ－０２及びＤＦ－ＣＯＶ－０３よりも強力なバイアル中和を示したにもかかわらず、Ｓ－タンパク質に対して低いアビディティを有する。

【図14B】同上。

【図15A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質に対するＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の結合親和性を測定する。親和性は、固定化されたＤＦ－ＣＯＶ化合物及び溶液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質を用いたバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）によって決定した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＤＦ－ＣＯＶ－０３及びＤＦ－ＣＯＶ－０４よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対して高い親和性を有した。

【図15B】同上。

【図16A】噴霧後のＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の安定性を特徴付ける。各化合物を振動式メッシュネブライザー（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｍｅｓｈ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）で噴霧し、次いで、マイクロ遠心チューブに回収した。固定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質への噴霧化合物の結合を、噴霧前に採取した試料の結合と比較した（ベースライン）。結合は、抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体を介して検出された。４つ全てのＤＦ－ＣＯＶ化合物について、噴霧試料と非噴霧試料との間のＳタンパク質結合アビディティに有意差はなかった（ベースライン）。

【図16B】同上。

【図16C】同上。

【図16D】同上。

【図17】シリアハムスターにおけるＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の血清中半減期を比較する。８ｍｇ／ｋｇの各ＤＦ－ＣＯＶ化合物を、時間ゼロで別々の群の３匹のハムスターに腹腔内注射することによって投与した。静脈採血は、４、８、２４、４８、及び７２時間で実施し、各試料について、ＤＦ－ＣＯＶ化合物の血清中濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１の血清中半減期が最も長く、５２時間であった。他の３つのＡＣＥ２－Ｆｃ設計置換は、およそ１６時間、１３時間、及び７時間というはるかに短い半減期を有した。

【図18】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内負荷し、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、ＤＦ－ＣＯＶ－０４、又はビヒクル対照（ＰＢＳ）のいずれかで処置したシリアハムスターの毎日の体重傾向を比較する。

【図19A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療モデルにおいてハムスターを治療するＤＦ－ＣＯＶ－０１の能力を示す。ハムスターは、１×１０^４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で負荷され、１２時間後に処置される。図１９Ａは、治療の概略図を提供し、図１９Ｂは、結果を提供する。

【図19B】同上。

【図20A】ＤＦ－ＣＯＶ化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントへの結合特性を示す。図２０Ａは、数値データを提供し、図２０Ｂは、滴定曲線を提供する。

【図20B-1】同上。

【図20B-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明は、不活性な可溶性ＡＣＥ２タンパク質が、少なくとも部分的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが内因性ＡＣＥ２に結合するのを競合的に阻害し、それによって、ウイルスが細胞に侵入するのを防ぐという発見に基づいている。本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を強力に阻害し、好ましい薬物動態を有する。

【0022】

表面受容体細胞外ドメインをＦｃドメインに融合することは、表面受容体の半減期を延長させ、それらを薬物として使用することを可能にする一般的な方法である。受容体Ｆｃ融合体の例としては、とりわけ、エタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アレフェセプト、及びリロナセプトが挙げられる。これらの薬物の半減期は、３～１５日である。Ｆｃドメインへの融合は、Ｆｃドメインが二量体を形成するため、その結合パートナーへの受容体のアビディティを増加させる追加の利点を有し、したがって、２つの受容体ドメインが薬物の各分子上に存在し、その結合アビディティを増加させる。Ｆｃ融合体は、新生児型Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって内皮細胞を横切ってシャペロンされ、したがって、一般に、より高い末梢組織濃度を示すため、血管構造を横切って容易に移動する。

【0023】

ＡＣＥ２は、１回貫通（ｓｉｎｇｌｅ－ｐａｓｓ）膜タンパク質であり、その細胞外ドメインをＩｇＧのＦｃドメインに融合して、Ｆｃ融合を作製することができる。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を利用して、コロナウイルスによる細胞の感染を阻害するという概念は、以前に実証されていた。２００４年、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＭｏｏｒｅらは、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合体が、インビトロで、およそ２ｎＭのＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ偽ウイルスによる標的細胞の感染を強力に阻害することができることを示した（（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１９）：１０６２８－３５）。より最近では、２０２０年２月、中国のＳｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｅｉらは、これらの所見を確認し、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合体が、０．１μｇ／ｍＬ未満又は０．５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を更に強力に阻害することを示した（（２０２０）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２０７０）。これらの前臨床研究は、可溶性ＡＣＥ２－Ｆｃが細胞表面ＡＣＥ２とうまく競合して標的細胞の感染を防ぐことができることを示している。低ナノモル濃度から亜ナノモル濃度の範囲のこのＩＣ５０は、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質との間の非常に強い相互作用を意味する。ＡＣＥ２－ＦｃのＩＣ５０は、中和モノクローナル抗体のＩＣ５０と同様である。例えば、Ｗａｎｇらは、最近、約０．５ｎＭの同様のＩＣ５０を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を報告した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１：２２５）。本発明によって包含される融合タンパク質は、Ｆｃγ受容体に対する親和性が低下したＦｃドメイン断片に融合された酵素的に死んだＡＣＥ２細胞外ドメインを使用することによって更に進む。

【0024】

本明細書に更に記載されるように、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの利点を有し、これには、１）薬物動態が有効な投与（例えば、皮下投薬）を可能にするための外来治療及び予防の許容、２）不活性ＡＣＥ２がＲＡＡＳ経路の阻害からの低血圧を回避するための血行動態的副作用の回避、３）サイレントＦｃドメインが自然免疫細胞の感染及び天然に見られるＡＤＥの妨害のリスクを低減するための抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）リスクの緩和、及び４）定義されたエピトープが中和抗体及びワクチンとは異なり依存されないためのＡＣＥ２指向性新型コロナウイルスの有効な標的化、が含まれる。

【0025】

Ｉ．定義
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」とは、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。

【0026】

「投与する」という用語は、薬剤が意図された機能を実行することを可能にする投与経路を含むように意図されている。使用可能な身体の治療のための投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など）、経口、吸入、噴霧、及び経皮経路が挙げられる。注射は、ボーラス注射であり得るか、又は持続注入であり得る。投与経路に応じて、薬剤は、意図された機能を実行する能力に有害な影響を及ぼす可能性のある自然な条件から薬剤を保護するために、選択された材料でコーティングされ得るか、又は選択された材料で配置され得る。薬剤は、単独で、又は薬学的に許容される担体と併せて投与され得る。薬剤は、インビボで活性形態に変換されるプロドラッグとして投与することもできる。

【0027】

本明細書で別途特定されない限り、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体の天然に存在する形態（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）及び組換え抗体（例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに多重特異性抗体、並びに前述の全ての断片及び誘導体（これらの断片及び誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する）を広範に包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質又は化学的部分を含み得る。

【0028】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨが別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、それらがＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価ポリペプチドを形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：７７８を参照のこと）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ配列及びＶＬ配列は、完全ＩｇＧポリペプチド又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結され得る。ＶＨ及びＶＬは、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用した免疫グロブリンのＦａｂ断片、Ｆｖ断片、又は他の断片の生成にも使用され得る。ダイアボディ等の一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用して発現され、それにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３）を参照のこと）。

【0029】

なお更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的又は非共有結合的会合によって形成されるより大きい免疫接着ポリペプチドの一部であり得る。かかる免疫接着ポリペプチドの例としては、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１）、並びに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、タンパク質サブユニットペプチド、及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）が挙げられる。Ｆｃ断片などの抗体部分は、それぞれ、全抗体のパパイン消化又はペプシン消化などの従来の技法を使用して、全抗体から調製され得る。更に、抗体、抗体部分、及び免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載の標準の組換えＤＮＡ技法を使用して得られ得る。

【0030】

本明細書で使用される場合、「抗体依存性感染増強（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ、ＡＤＥ）」という用語は、抗体補助ウイルスの細胞への侵入によって引き起こされる疾患又は状態（すなわち、コロナウイルス感染症）の悪化を指す。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に特異的に結合する中和抗体のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）によって認識され得る。Ｆｃγ受容体がＦｃドメインに結合すると、受容体は、抗体及び結合したウイルスの細胞内への侵入を媒介する。次いで、ウイルスが細胞内で破壊される代わりに、ウイルスの侵入は、細胞の感染及び炎症の増加をもたらす。典型的には、ＡＤＥは、ＦｃγＩＩａ受容体によって媒介される。

【0031】

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ｃなど）を指す。

【0032】

「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、疾患、障害、又は状態を有しないが、それを発症するリスクがあるか、又はそれに罹患しやすい対象における疾患、障害、又は状態を発症する可能性を低下させることを指す。

【0033】

「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’及び３’非翻訳領域）を指す。

【0034】

「相補的」という用語は、２つの核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の２つの領域間の相補的な配列の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合に第１の領域に逆平行の第２の核酸領域の残基と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合に第１の鎖に逆平行の第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、同じ又は異なる核酸の第２の領域に相補的である。いくつかの実施形態では、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それによって、第１の部分及び第２の部分が逆平行様式で配置された場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。いくつかの実施形態では、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「阻害すること」という用語及びその文法的等価物は、特定の作用、機能、又は相互作用の低減、制限、及び／又は遮断を指す。所与の出力又はパラメータのレベルの減少は、出力又はパラメータの絶対不在を意味し得るが、意味する必要はない。本発明は、出力又はパラメータを完全に排除する方法を必要とせず、それに限定されない。所与の出力又はパラメータは、本明細書及び実施例で考察される免疫組織化学的アッセイ、分子生物学的アッセイ、細胞生物学的アッセイ、臨床的アッセイ、及び生化学的アッセイを含むが、これらに限定されない当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。「促進すること」、「増加させること」という反意用語、及びそれらの文法的等価物は、阻害又は低減について記載されたものと反対である所与の出力又はパラメータのレベルの増加を指す。

【0036】

本明細書で使用される場合、「相互作用する」又は「相互作用」という用語は、２つの分子（例えば、タンパク質、核酸）又はその断片が、２つの相互作用する分子又はその断片を互いに物理的に近接させるように、互いに十分な物理的親和性を示すことを意味する。相互作用の極端な場合は、２つのエンティティの継続的かつ安定的な近接をもたらす化学結合の形成である。物理的な親和性のみに基づいた相互作用は、通常、化学的に結合した相互作用よりも動的であるが、２つの分子を共局在化するのに同等に効果的であり得る。物理的親和性及び化学結合の例としては、電荷差、疎水性、水素結合、ファンデルワールス力、イオン力、共有結合、及びそれらの組み合わせに起因する力が挙げられるが、これらに限定されない。相互作用のドメイン、断片、タンパク質、又はエンティティ間の近接状態は、一過的、永続的、可逆的、又は不可逆的であり得る。いずれにしても、それは、２つのエンティティの自然なランダムな動きに起因する接触とは対照的であり、識別可能である。典型的には、必ずしもそうではないが、「相互作用」は、相互作用のドメイン、断片、タンパク質、又はエンティティ間の結合によって示される。相互作用の例としては、抗原と抗体、リガンドと受容体、酵素と基質との間の特異的相互作用などが挙げられる。

【0037】

一般に、かかる相互作用は、当該分子の一方又は両方の活性をもたらす（それにより、生物学的効果がもたらされる）。活性は、それらの分子の一方又は両方の直接活性（例えば、シグナル伝達）であり得る。代替的に、相互作用における一方又は両方の分子は、それらのリガンドへの結合を阻止される場合があり、それ故に、リガンド結合活性（例えば、そのリガンドに結合し、免疫応答を誘発又は阻害する）に関して不活性で保持される。かかる相互作用を阻害することにより、相互作用に関与する１つ以上の分子の活性の破壊がもたらされる。かかる相互作用を増強することは、当該物理的接触を延長するか、又はその可能性を高めることであり、当該活性の可能性を延長するか、又はその可能性を高めることである。

【0038】

２つの分子又はその断片間の「相互作用」は、いくつかの方法によって決定することができる。例えば、相互作用は、機能アッセイによって決定することができる（ツーハイブリッドシステムなど）。タンパク質－タンパク質相互作用はまた、２つの相互作用パートナー間の親和性結合に基づいて、様々な生物物理学的及び生化学的アプローチによって決定され得る。当該技術分野で一般に知られているかかる生化学的方法には、タンパク質親和性クロマトグラフィー、親和性ブロッティング、免疫沈降などが含まれるが、これらに限定されない。相互作用の強度又は質を反映する２つの相互作用タンパク質の結合定数は、当該技術分野で既知の方法を使用して決定することもできる。Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ，（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５９：９４－１２３を参照されたい。

【0039】

本明細書で使用される場合、「キット」とは、本発明によって包含されるヒト又はヒト化ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの発現を特異的に検出又は調節するための少なくとも１つの試薬（例えば、プローブ）を含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）である。本キットは、本発明によって包含される方法を行うためのユニットとして販売促進、流通、又は販売され得る。

【0040】

本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、上方制御及び下方制御、例えば、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性の増強又は阻害を含む。

【0041】

「単離されたタンパク質」とは、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、及び培養培地（細胞から単離される場合又は組換えＤＮＡ技法によって産生される場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質が由来する細胞若しくは組織源由来の細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質が、それが単離される又は組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離される、ポリペプチド又はその断片の調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の非ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質（本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される）、約２０％未満、約１０％未満、又は５％未満を有するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片の調製物を含む。融合タンパク質又はその断片（例えば、その生物学的に活性な断片）が組換え産生される場合、これは、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満に相当する。

【0042】

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むように意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得る。本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」という用語は、ヌクレオチド配列が、他のヌクレオチド配列（ヒトゲノムＤＮＡの核酸に天然に隣接し得る他の配列）を含まない核酸分子を指すように意図されている。

【0043】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼした場合、その配列に作動可能に連結される。転写制御配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を連結するために、隣接してリーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列の場合、作動可能に連結されるとは、それらの配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。

【0044】

核酸について、「実質的相同性」という用語は、２つの核酸又はそれらの指定された配列が、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、最適にアライメント及び比較された場合、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であることを示す。代替的に、実質的相同性は、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。

【0045】

２つの配列間の同一性パーセントは、それらの２つの配列の最適アライメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有された同一の位置の数の関数（すなわち、同一性（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。

【0046】

２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａを使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。ＣＭＰマトリックス、及びギャップ重み４０、５０、６０、７０、又は８０、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１ １７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される場合もある。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及びギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４ ４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定され得る。

【0047】

本発明によって包含される核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、関連配列を特定するために、公開データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」として更に使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ １０のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明によって包含される核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明によって包含されるタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。比較のためのギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９ ３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際に、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る（ＮＣＢＩウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能である）。

【0048】

核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知の他の技法（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）を含む標準技法によって、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたときに、「単離される」又は「実質的に純粋にされる」。

【0049】

「転写されたポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写物」は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合核酸の転写、及びＲＮＡ転写物（存在する場合）の正常な翻訳後プロセシング（例えば、スプライシング）、及びＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全て又は一部分と相補的又は相同であるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はかかるＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの類似体）である。

【0050】

「小分子」という用語は、当該技術分野の用語であり、約１０００分子量未満又は約５００分子量未満の分子を含む。一実施形態では、小分子は、ペプチド結合を排他的に含まない。別の実施形態では、小分子は、オリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示的な小分子化合物としては、限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケチド）（Ｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３）、及び天然産物抽出物ライブラリが挙げられる。別の実施形態では、これらの化合物は、非ペプチド性有機小分子化合物である。更なる実施形態では、小分子は、生合成のものではない。

【0051】

「特異的結合」という用語は、所定の抗原に対する抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、分析物としての目的の抗原とリガンドとしての抗体を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０^－７Ｍ未満、例えば、およそ１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ若しくは１０^－１０Ｍ未満、又はそれよりも低い親和性（Ｋ_Ｄ）で結合し、所定の抗原若しくは密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、又は１０．０倍以上である親和性で、所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用され得る。選択的結合は、別の抗原を上回る、ある抗原の結合を識別する抗体の能力を指す相対的な用語である。

【0052】

本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質又はポリペプチドの機能的な部分、セグメント、又は領域を意味する。「相互作用ドメイン」は、別のタンパク質、タンパク質断片、又は単離されたドメインに対するそのタンパク質、タンパク質断片、又は単離されたドメインの物理的親和性に関与するタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片の一部分、セグメント、又は領域を具体的に指す。

【0053】

特に明記されていない場合、本明細書で使用される「化合物」という用語には、ペプチド、核酸、炭水化物、天然物抽出物ライブラリ、有機分子（例えば、小さな有機分子）、無機分子（例えば、限定されないが、化学物質、金属、及び有機金属分子を含む）が含まれるが、これらに限定されない。

【0054】

本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」、又は「バリアント」という用語には、限定されないが、ＡＣＥ２ポリペプチドと実質的に相同である領域を含むポリペプチドが含まれ、様々な実施形態では、同一のサイズのアミノ酸配列にわたって、又はアラインメントが当該技術分野で既知のコンピュータホモロジープログラムによって行われるアラインメント配列と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性であるか、あるいはそのコード核酸が、ストリンジェント、中程度にストリンジェント、若しくは非ストリンジェントな条件下で、成分タンパク質をコードする配列にハイブリダイズすることができる。それぞれ、アミノ酸の置換、欠失、及び付加による、天然に存在するタンパク質の修飾の結果であり、誘導体が（必ずしも同程度ではないが）天然に存在するタンパク質の生物学的機能を依然として示す、タンパク質を意味する。かかるタンパク質の生物学的機能は、例えば、本発明に提供されるように、好適で利用可能なインビトロアッセイによって調べることができる。

【0055】

本明細書で使用される「機能的に活性な」という用語は、このポリペプチド（すなわち、断片又は誘導体）が関連する実施形態によれば、タンパク質の構造的、調節的、又は生化学的機能を有するポリペプチド（すなわち、断片又は誘導体）を指す。

【0056】

「機能保存的バリアント」とは、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、あるアミノ酸と同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸との置換を含むが、これに限定されない、ポリペプチドの全体的な立体配座及び機能を改変することなく変化したものである。保存されたものとして示されるもの以外のアミノ酸は、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性パーセントが変化し得るように、タンパク質中で異なり得、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法等のアライメントスキームに従って決定される、７０％～９９％であり得る。「機能保存的バリアント」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される場合、少なくとも６０％、若しくは少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、更には少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつそれが比較される天然又は親タンパク質と同じ若しくは実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドも含む。

【0057】

「ポリペプチド断片」又は「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端で内部的に、若しくはそのカルボキシル末端で、又は代替的に両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８、若しくは１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０、若しくは５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、又は少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００以上のアミノ酸長である。それらは、例えば、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０以上の長さであり得、及び／又はそれを含み得る。代替的に、それらは、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、かかる範囲を超えず、かつ／又はかかる範囲を除外し得る。

【0058】

本明細書で使用される「相同」とは、同じ核酸鎖の２つの領域間又は２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両領域におけるヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有されている場合、それらの領域は、その位置で相同である。第１の領域は、各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有されている場合、第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有されている２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。一例として、ヌクレオチド配列５’－ＡＴＴＧＣＣ－３’を有する領域及びヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＧＧＣ－３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それによって、それらの部分の各々のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、同じヌクレオチド残基によって占有される。いくつかの実施形態では、それらの部分の各々の全てのヌクレオチド残基位置が、同じヌクレオチド残基によって占有される。

【0059】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明によって包含される組換え発現ベクターなどの本発明によって包含される核酸が導入された細胞を指すことが意図されている。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことを理解されたい。変異又は環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。

【0060】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸を指す。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。

【0061】

「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質がタンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される、抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質の調製を含む。一実施形態では、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満の（乾燥重量で）化学的前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質の調製物を含む。

【0062】

「活性」という用語は、タンパク質に関連して使用される場合、これらに限定されないが、生物学的プロセス及び細胞機能、別の分子若しくはその部分と相互作用する又はそれに結合する能力、特定の分子への結合親和性又は特異性、インビトロ又はインビボの安定性（例えば、タンパク質分解速度）、抗原性及び免疫原性、酵素活性などで示される活性を含む、特定のタンパク質によって示される若しくはそれと関連する任意の生理学的又は生化学的活性を意味する。かかる活性は、当業者には明らかであろうが、様々な好適な方法のいずれかによって検出又はアッセイされ得る。

【0063】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、適用可能な場合、本明細書で互換的に使用される。それらは、化学的に修飾され（例えば、翻訳後修飾され）得る。例えば、それらは、グリコシル化され得るか、又は修飾アミノ酸残基を含み得る。これらはまた、ポリペプチドがかかる配列を天然に含まない細胞からの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によって修飾され得る。これらは、タグでタグ付けされている場合がある。本発明で使用するためのポリペプチド／タンパク質は、実質的に単離された形態であり得る。ポリペプチド／タンパク質は、担体又は希釈剤と混合することができ、これらは、ポリペプチドの意図された目的を妨げず、かつ依然として実質的に単離されたものとみなされることが理解されるであろう。本発明で使用するためのポリペプチド／タンパク質は、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、調製物中にそのポリペプチドを概して含み、調製物中に５０重量％超（例えば、８０重量％、９０重量％、９５重量％、又は９９重量％）のポリペプチドが本発明のポリペプチドである。

【0064】

「ハイブリッドタンパク質」、「ハイブリッドポリペプチド」、「ハイブリッドペプチド」、「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」、及び「融合ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、指定されたポリペプチドに天然には結合されていない１つ以上のポリペプチド分子に共有結合した特定のポリペプチド分子を有する天然には存在しないタンパク質を意味する。したがって、「ハイブリッドタンパク質」は、共有結合によって一緒に結合された２つの天然に存在するタンパク質又はその断片であり得る。「ハイブリッドタンパク質」はまた、２つの人工ポリペプチドを一緒に共有結合させることによって形成されるタンパク質であり得る。必ずというわけではないが、典型的には、２つ以上のポリペプチド分子が、ペプチド結合によって一緒に結合又は融合され、単一の非分岐ポリペプチド鎖を形成する。

【0065】

本明細書で使用される「タグ」という用語は、その最も広い意味で理解されることを意味し、これらに限定されないが、任意の好適な酵素標識、蛍光標識、又は放射性標識、及び好適なエピトープを含まれ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｔ７、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、カルモジュリン結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ｓｔｒｅｐタグ、ＫＴ３エピトープ、ＥＥＦエピトープ、緑色蛍光タンパク質、及びそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。

【0066】

「アンジオテンシンＩ変換酵素２」としても知られる「ＡＣＥ２」という用語は、アンジオテンシンＩ変換酵素と有意な相同性を有するジペプチジルカロキシジペチダーゼを指す。そのタンパク質は、アンジオテンシンＩをアンジオテンシン１～９に、アンジオテンシンＩＩをアンジオテンシン１～７に変換する（Ｄｏｎｏｇｈｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，８７（５）：Ｅ１－９、Ｔｉｐｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７５（４３）：３３２３８－４３、Ｖｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７（１７）：１４８３８－４３）。ＡＣＥ２タンパク質はまた、高効率でアペリン１３及びダイノルフィン１３を加水分解する（Ｖｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００２））。ＡＣＥ２は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすウイルス（ＳＡＲＳ ＣｏＶ－１）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２６：４５０－４５４）及びＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ ＣｏＶ－２（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ，Ａｐｒ １６；１８１（２）：２７１－２８０．ｅ８）を含む、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質に効率的に結合する。

【0067】

「完全長ＡＣＥ２ポリペプチド」又は「野生型ＡＣＥ２ポリペプチド」という用語は、以下と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。

【化1】

【0068】

「ＡＣＥ２」という用語は、その断片、バリアント（例えば、アレルバリアント）、及び誘導体を含むことが意図されている。代表的なヒトＡＣＥ２ ｃＤＮＡ及びヒトＡＣＥ２タンパク質配列は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。ヒトＡＣＥ２アイソフォームには、転写物ＮＭ＿００１３７１４１５．１によってコードされるタンパク質ＮＰ＿００１３５８３４４．１、転写物ＮＭ＿０２１８０４．３によってコードされるタンパク質ＮＰ＿０６８５７６．１、及び転写物ＡＹ３５８７１４．１によってコードされるプロテインＡＡＱ８９０７６．１が含まれる。ヒト以外の生物中のＡＣＥ２オルソログの核酸配列及びポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０１６９４２９７９．１－ＸＰ＿０１６７９８４６８．１；及びＸＭ＿０１６９４２９８０．１－ＸＰ＿０１６７９８４６９．１）、アカゲザル（ＮＭ＿００１１３５６９６．１－ＮＰ＿００１１２９１６８．１；ＸＭ＿０２８８４１８２５．１－ＸＰ＿０２８６９７６５８．１；及びＸＭ＿０１５１２６９５８．２－ＸＰ＿０１４９８２４４４．２）、イヌ（ＮＭ＿００１１６５２６０．１－ＮＰ＿００１１５８７３２．１；ＸＭ＿０１４１１１３２９．２－ＸＰ＿０１３９６６８０４．１；ＸＭ＿０２２４１５５０６．１－ＸＰ＿０２２２７１２１４．１；及びＸＭ＿００５６４０９９２．２－ＸＰ＿００５６４１０４９．１）、ウシ（ＮＭ＿００１０２４５０２．４－ＮＰ＿００１０１９６７３．２；ＸＭ＿００５２２８４２８．４－ＸＰ＿００５２２８４８５．１；ＸＭ＿０１５４６１７８５．２－ＸＰ＿０１５３１７２７１．１；ＸＭ＿００５２２８４２９．４－ＸＰ＿００５２２８４８６．１；及びＸＭ＿０２４９８７８５０．１－ＸＰ＿０２４８４３６１８．１）、マウス（ＮＭ＿００１１３０５１３．１－ＮＰ＿００１１２３９８５．１；及びＮＭ＿０２７２８６．４－ＮＰ＿０８１５６２．２）、ラット（ＮＭ＿００１０１２００６．１－ＮＰ＿００１０１２００６．１）、ニワトリ（ＸＭ＿４１６８２２．５－ＸＰ＿４１６８２２．２）、カエル（ＸＭ＿００２９３８２４７．４－ＸＰ＿００２９３８２９３．２）、ゼブラフィッシュ（ＮＭ＿００１００７２９７．１－ＮＰ＿００１００７２９８．１；ＸＭ＿００５１６９３５９．４－ＸＰ＿００５１６９４１６．１；及びＸＭ＿００５１６９３６０．４－ＸＰ＿００５１６９４１７．１３．２）、及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＮＭ＿００１０２９２８２．６－ＮＰ＿００１０２４４５３．１）が含まれる。

【0069】

「断片結晶化可能ドメイン（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」又は「Ｆｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ抗体の断片結晶化可能領域を指す。このドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合し、抗体の細胞内在化を可能にする。

【0070】

本明細書で使用される場合、「ＡＣＥ－２指向性コロナウイルス」という用語は、ＡＣＥ２タンパク質を使用して細胞に侵入するコロナウイルスのサブセットを指す。世界的に重要な３つのウイルスを含む少なくとも７つのコロナウイルスが、ＡＣＥ２を利用することが知られている：ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、２００４年の重症急性呼吸器症候群の発生に関与するウイルス、及びＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに関与するウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２６（６９６５）：４５０－５４、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ，１８１（２）：２７１－８０ ｅ８）。

【0071】

「コロナウイルス感染症の診断」という用語は、個体におけるコロナウイルス若しくはそのサブタイプ、コロナウイルスポリペプチド若しくは当該コロナウイルスポリペプチドをコードする核酸分子、又はコロナウイルス抗原に特異的に結合する抗体の存在又は不在を決定するための、本発明の方法、システム、及びコードの使用を含む。この用語はまた、個体における疾患活動性のレベルを評価するための方法、システム、及びコードを含む。

【0072】

特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝子コード（以下に示される）によって定義されるタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝子コードによって定義される核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。

【表1】

【0073】

遺伝子コードの重要な周知の特徴は、その冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大半には、１つより多くのコーディングヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上で例証される）。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。かかるヌクレオチド配列は、全ての生物における同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ある特定の生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳し得るが）、機能的に同等であるとみなされる。更に、時折、プリン又はピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見られ得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。

【0074】

前述を考慮して、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの核酸（又はその任意の部分）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するための遺伝コードを使用して、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を駆動するために使用され得る。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列について、ポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列が遺伝子コードから推定され得る（その冗長性のため、任意の所与のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列がもたらされる）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における説明及び／又は開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明及び／又は開示も含むとみなされるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列の説明及び／又は開示は、アミノ酸配列をコードすることができる全ての可能なヌクレオチド配列の説明及び／又は開示も含むとみなされるべきである。

【0075】

最後に、本発明によって包含されるＡＣＥ２融合ポリペプチド及びその断片の核酸及びアミノ酸の配列情報は、当該技術分野で既知であり、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）などの公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。表１～８に、例示的な核酸及びアミノ酸配列が提供される。

表１
配列番号１：Ｈ３７４Ｎ Ｈ３７８Ｎ置換を有するＡＣＥ２細胞外ドメインのアミノ酸配列（残基１８～７４０）

【化2】

配列番号２：Ｈ３７４Ｎ Ｈ３７８Ｎ置換を有するＡＣＥ２細胞外ドメインのサブセット（残基１８～７０８）

【化3】

配列番号３：Ｈ３７４Ｎ Ｈ３７８Ｎ置換を有するＡＣＥ２細胞外ドメインのサブセット（残基１８～６１５）

【化4】

配列番号４：Ｈ３７４Ｎ Ｈ３７４Ｎ置換を有するＡＣＥ２細胞外ドメインのサブセット（残基１８～６１２）

【化5】

表２：Ｓ２２８Ｐ置換及び他のリンカーを有するＩｇＧ４に由来するヒンジ
配列番号５
ＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号６
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号７
ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号８

【化6】

配列番号９
ＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号１０
ＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号１１
ＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号１２
ＰＣＰＰＣＰ
配列番号１３
ＣＰＰＣＰ
配列番号１４
ＰＰＣＰ
配列番号１５
ＰＣＰ
配列番号５２（第１の残基がＧであることを除いて、配列番号５と同様）
ＧＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号５３（Ｇ４ＡＧ４リンカー）
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ
配列番号５４（Ｇ４ＡＧ４ＡＧ４リンカー）
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧ

表３：ＩｇＧ１に由来するヒンジ
配列番号１６
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号１７
ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号１８
ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号１９
ＳＣＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号２０
ＣＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号２１
ＤＫＴＨＴＣＰ
配列番号２２
ＫＴＨＴＣＰ
配列番号２３
ＴＨＴＣＰ
配列番号２４
ＨＴＣＰ
配列番号２５
ＴＣＰ

表４：ＩｇＧ２に由来するヒンジ
配列番号２６
ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号２７
ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号２８
ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号２９
ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号３０
ＣＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号３１
ＶＥＣＰＰＣＰ
配列番号３２
ＥＣＰＰＣＰ

表５：Ｆｃドメイン
配列番号３３：Ｌ２３５Ｅ置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメイン

【化7】

配列番号３４：Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメイン

【化8】

配列番号３５：ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメイン

【化9】

配列番号３６：ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ａ置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメイン

【化10】

配列番号３７：Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ１

【化11】

配列番号３８：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ１

【化12】

配列番号３９：Ｎ２９７Ａ置換を有するＩｇＧ１

【化13】

配列番号４０：Ｎ２９７Ｄ置換を有するＩｇＧ１

【化14】

配列番号４１：Ｐ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ１

【化15】

配列番号４２：Ｐ３２９Ａ置換を有するＩｇＧ１

【化16】

配列番号５５：Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ１（「ＥＥＭ」の代わりに「ＤＥＬ」を有することを除いて、配列番号３７と同様）

【化17】

表６：参照ＩｇＧ Ｆｃ及び定常ドメイン
配列番号４３：ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号４４：ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４５：ヒトＩｇＧ１定常領域（Ｅｕ番号付け）

【化18】

配列番号４６：ヒトＩｇＧ２定常領域（Ｅｕ番号付け）

【化19】

配列番号４７：ヒトＩｇＧ４定常領域（Ｅｕ番号付け）

【化20】

｜｜＝これらのＩｇＧ４ヒンジ残基（Ｙ及びＧ）はＥｕ番号を持たない

表７
配列番号４８：ＤＦ－ＣＯＶ－０１アミノ酸配列

【化21】

＊配列番号６０：ＡＣＥ２アミノ酸配列

【化22】

＊ＡＣＥ２の代表的な配列は、配列番号６０として提供されているアミノ酸末端リーダーを斜字体で示し、ＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）（アミノ酸１８～６１５）を太字で示す。アミノ酸６１５に対するＡＣＥ２カルボキシ末端の部分（６１６～７６８）は、コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）と称されている（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７：１４４４－１４４８）。この用語は、ＡＣＥ２の膜近傍ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含むこの領域が、腎臓の膜貫通タンパク質であるコレクトリンと類似性を共有するという事実に関する（Ｈａｍｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２１２：１－１１）。特に、配列アラインメントは、ＡＣＥ２のアミノ酸６１４～カルボキシ末端が、コレクトリンのアミノ酸２１～２４１と４７．８％同一性を共有することを実証する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１３２－１７１３９）。代表的な配列番号６０では、コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）は太字で示されていない。ＣＬＤの膜近傍（細胞外）部分であるアミノ酸６１６～７４０には下線が引かれており、ＣＬＤの膜貫通部分及び細胞質部分には下線が引かれていない。
配列番号４９：ＤＦ－ＣＯＶ－０２アミノ酸配列

【化23】

配列番号５６：ＤＦ－ＣＯＶ－０３アミノ酸配列（［ＡＣＥ２（１８～６１５）－ＮＮ］－［Ｇ４ＡＧ４］－［ＩｇＧ１ヒンジ］－［ｈＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）Ｆｃ］）［ＩｇＧ１ヒンジが太字かつ斜字体で示されている］

【化24】

配列番号５７：ＤＦ－ＣＯＶ－０４アミノ酸配列（［ＩｇＧ１ヒンジ］－［ｈＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）Ｆｃ］－［Ｇ４ＡＧ４ＡＧ４］－［ＡＣＥ２（１８～６１２）－ＮＮ］）［ＩｇＧ１ヒンジが太字かつ斜字体で示されている］

【化25】

表８：ＤＦ－ＣＯＶ核酸配列
配列番号５０：完全ＤＦ－ＣＯＶ－０１ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＡＴＴＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＣＣＡＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＴＡＧＡＧＧＡＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＧＴＡＣＧＣＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＡＣＡＴＧＴＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＧＡＡＡＧＣＣＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＡＡＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＴＡＴＧＧＣＣＴＡＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＣＣＣＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＧＣＧＴＡＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＧＡＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＣＡＡＡＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＧＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＴＴＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＣＡＡＧＴＡＡ
配列番号５１：完全ＤＦ－ＣＯＶ－０２ヌクレオチド配列
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配列番号５８：完全ＤＦ－ＣＯＶ－０３ヌクレオチド配列
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配列番号５９：完全ＤＦ－ＣＯＶ－０４ヌクレオチド配列
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＊表１～７には、タンパク質のオルソログ、並びに、表１又は表５～７に列挙されている任意の配列番号のアミノ酸配列又はその一部分とそれらの全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が含まれている。かかるポリペプチドは、本明細書に更に記載される全長ポリペプチドの機能を有し得る。
＊ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンがウリジンで置き換えられたもの）、コードされたタンパク質のオルソログをコードする核酸分子、並びに表８に列記されるいずれかの配列番号の核酸配列又はその一部分と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ超の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列が表８に含まれる。かかる核酸分子は、本明細書に更に記載される全長核酸の機能を有し得る。
＊表６には、「Ｅｕ」番号付けシステム（これは本明細書に記載のＦｃドメイン置換にも使用される）を使用して番号付けされた完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４配列である配列番号４５～４７が含まれている。番号付けは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメインについて同じである。しかし、ヒンジ領域は異なる長さであるため、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン内の番号付けは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４において異なる。ＥＵ番号付けシステムは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔシステムの代わりに使用することができる（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ ａｎｄ Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３：７８－８５を参照されたい）。

【0076】

ＩＩ．薬剤及び組成物
ａ．核酸
本発明によって包含される一態様は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。一実施形態では、本発明の核酸は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードし、それによって、ウイルスが細胞表面上に発現する内因性ＡＣＥ２に結合するのを競合的に阻害し、当該ポリペプチドが、１）ＡＣＥ２細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又はその断片、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、２）Ｆｃドメイン又はその断片、Ｆｃドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片、配列番号３３～４２若しくは５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、及び３）ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片と、Ｆｃドメイン又はその断片との間の介在ヒンジポペプチドを含み、ヒンジポペプチドは、配列番号５～３２若しくは５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得る。

【0078】

本発明によって包含される核酸分子は、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードし、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片、ヒンジポリペプチド、及びＦｃドメイン又はその断片を含む。核酸によってコードされるＡＣＥ２細胞外ドメイン若しくはその断片は、表１に示されるアミノ酸配列、あるいは表１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％以上（例えば、約９８％）相同であるアミノ酸配列又はその一部分（すなわち、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、若しくはそれ超のアミノ酸残基）を有し、核酸が、核酸分子によってコードされるポリペプチドが、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎに対応する位置でのアミノ酸置換を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸分子によってコードされるポリペプチドが、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、及びＨ５０５Ｌに対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑに対応する位置にアミノ酸置換を更に含む。上記のアミノ酸置換は、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドに対するものである。いくつかの実施形態では、核酸は、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドのアミノ酸１８～６００、１８～６１５、１８～７０８、又は１８～７４０を含むＡＣＥ２細胞外ドメインをコードする。

【0079】

本発明によって包含される核酸分子によってコードされるＦｃドメイン又はその断片は、表５に示されるアミノ酸配列、あるいは表５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％以上（例えば、約９８％）相同であるアミノ酸配列又はその一部分（すなわち、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、若しくはそれ超のアミノ酸残基）を有する。Ｆｃドメイン又はその断片は、その核酸配列に、Ｆｃ受容体（すなわち、ＦｃγＩＩａＲ）結合が減弱したＦｃポリペプチドをもたらすバリアントを含み得る。例えば、Ｓ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅ点置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片は、ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）へのＦｃ結合を減弱させ得る。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｓ２２８又はＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅアミノ酸置換を含む。ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合するＦｃドメイン又はその断片を減弱又は排除することができる他の置換には、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｘ、及び／又はＰ３２９Ｇ変異体が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及び／又はＰ３２９Ｇアミノ酸置換を含む。更に他の実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｌ２３４Ａ及びＮ２９７Ａ又はＮ２９７Ｄアミノ酸置換を含む。更に他の実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ａ又はＮ２９７Ｄアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇアミノ酸置換を含む。アミノ酸置換は、完全長ＩｇＧ Ｆｃドメインに対するものである。いくつかの実施形態では、ヒンジポリペプチドは、Ｆａｂアーム交換を減弱させる変異を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、表２のアミノ酸配列を含み、その各々が、Ｓ２２８Ｐ置換を含む。一般に、Ｓ２２８Ｐ置換は、ＩｇＧ４抗体において自然に生じるＦａｂアーム交換を阻害し、Ｓ２２８Ｐは、Ｆｃγ受容体結合に対して影響を及ぼさない。ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１よりもＦｃγ受容体に対する親和性が低く、Ｌ２３５Ｅ置換はこの親和性を更に低下させる。Ｆｃドメイン又はその断片は、Ｆｃ受容体に結合するＦｃドメイン又はその断片を減弱又は排除するための追加の置換（例えば、Ｌ２３５Ｅ置換）を更に含むことができる。

【0080】

他のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードし、したがって、表１～７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とは異なる核酸配列を有する核酸分子又はその断片が本発明に含まれる。更に、異なる種（例えば、ヒト類）由来のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードし、したがって、表１－７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明によって包含される範囲内であることが意図される。例えば、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするチンパンジー核酸配列は、ヒトＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのヌクレオチド配列に基づいて特定され得る。

【0081】

一実施形態では、本発明の核酸分子は、表１及び表５～７に示されるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質又はその一部分をコードし、そのため、融合タンパク質又はその一部分がコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合することができ、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に対する結合親和性が低下しているか又は全くない。各々のかかる生物学的特性を測定するための方法及びアッセイは、当該技術分野で周知であり、代表的で非限定的な実施形態が、以下の実施例及び上記の定義に記載されている。

【0082】

本明細書で使用される場合、「十分に相同な」という言語は、タンパク質又はその一部分（すなわち、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片）がコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合するように、表１～７に示されるアミノ酸配列又はその断片と同一若しくは同等の最小数のアミノ酸残基（例えば、表１～７に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基と同様の側鎖を有するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はその一部分を指す。

【0083】

別の実施形態では、タンパク質は、表１～７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列全体又はその断片と少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同である。

【0084】

いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合核酸分子によってコードされるタンパク質の部分は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの生物学的に活性な部分である。本明細書で使用される場合、「ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの生物学的に活性な部分」という用語は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス）に結合するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの一部分（すなわち、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片）を含むことが意図されている。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドの他の活性を有しない。

【0085】

標準的な結合アッセイ、例えば、本明細書に記載される免疫沈降及び酵母ツーハイブリッドアッセイ、又は機能アッセイ（例えば、ＲＮＡｉ又は過剰発現実験）を実施して、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片が完全長ＡＣＥ２ポリペプチドのコロナウイルス結合活性を維持する能力を決定することができる。

【0086】

本発明は、遺伝子コードの縮重のために（したがって、同じポリペプチド又はその断片をコードするために）、表１～７に示されるアミノ酸配列又はその断片をコードするヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を更に包含する。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、表１～７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその断片、又は表１～７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその断片、又は表１～７に示されるアミノ酸配列と少なくとも１、２、３、５、若しくは１０個のアミノ酸、ただし、３０、２０、１５個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸は、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、又は７０アミノ酸長よりも短い、目的の完全長ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの一部分をコードする核酸配列からなる。

【0087】

当業者は、表１～７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその断片への変異によって導入され、それによって、改変ポリペプチドの機能的能力を変更することなく、コードされるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらし得ることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換は、配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの活性を著しく変更することなく、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの配列（例えば、表１～７に示される配列又はその断片）から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド活性（すなわち、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）への結合）に必要とされる。しかしながら、他のアミノ酸残基（例えば、マウスとヒトとの間で保存されていないか、又は半保存されたアミノ酸残基）は、活性に必須ではなくてもよく、したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの活性を変更することなく改変しやすい可能性が高い。

【0088】

したがって、本発明によって包含される別の態様は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、表１～７に示されるアミノ酸配列又はその断片とはアミノ酸配列が異なるが、本明細書に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのコロナウイルス結合活性を保持する。一実施形態では、核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、タンパク質が、１つ以上の修飾ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドドメインを欠いている（例えば、ヒンジ又はＦｃドメインは欠けていてもよいが、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、コロナウイルスへの結合を担うため、必然的に存在する）。定義セクションで記載されるように、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの構造－機能関係は既知であり、そのため、当業者であれば、ＡＣＥ２ドメインのコロナウイルス結合活性を保持しながら、変異され得る又はその他変更され得る領域を容易に理解する。

【0089】

「配列同一性又は相同性」とは、本明細書で使用される場合、２つのポリペプチド分子間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置が、アデニンによって占められている場合、それらの分子は、その位置で相同であるか、又は配列同一である。２つの配列間の相同性又は配列同一性のパーセントは、この２つの配列によって共有される一致するか又は相同性の同一の位置の数を、比較した位置の数で割り、１００倍した関数である。例えば、２つの配列における位置の１０のうちの６が同じである場合、その２つの配列は、６０％相同性であるか、又は６０％の配列同一性を有する。一例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性又は配列同一性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるようにアラインメントするときに比較が行われる。特に指定されない限り、「ループアウト領域」（例えば、配列のうちの１つにおける欠失又は挿入から生じるもの）は、例えば、ミスマッチとしてカウントされる。

【0090】

２つの配列間の配列の比較及び相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用して実行することができる。複数のアラインメントパラメータは、ＧＡＰ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０を含む。ＤＮＡアラインメントの場合、ペアワイズアラインメントパラメータは、Ｈｔｕｐｌｅ＝２、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｗｉｎｄｏｗ＝４、及びＤｉａｇｏｎａｌ ｓａｖｅｄ＝４であってもよい。タンパク質アライメントの場合、ペアワイズアラインメントパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、Ｗｉｎｄｏｗ＝５、及びＤｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ＝５であってもよい。

【0091】

一実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、並びにギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さ重み付け１、２、３、４、５、又は６のいずれかを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定される。更に別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及びギャップ重み付け４０、５０、６０、７０、又は８０及び長さ重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定される。別の実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（オンラインで入手可能）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。

【0092】

表１～７に示されるタンパク質ドメインに相同なドメインを含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を、ポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列若しくはその断片又は相同ヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準技法によって、表１～７に示されるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列若しくはその断片又は相同性ヌクレオチド配列に導入され得る。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分岐状側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。代替的に、別の実施形態では、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのコード配列の全て又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、本明細書に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの活性を保持する変異体を特定することができる。表１～７に示される１つ以上のポリペプチドドメイン又はその断片をコードするヌクレオチド配列の変異誘発後、コードされたタンパク質は、（本明細書に記載のように）組換え発現されてもよく、タンパク質の活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して決定することができる。

【0093】

ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのレベルは、転写された分子又はタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知の方法のうちのいずれかによって評価することができる。かかる方法の非限定的な例には、タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、及び核酸増幅法が挙げられる。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのレベルは、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することによって、翻訳されたタンパク質の量を測定することによって、又は遺伝子産物の活性を測定することによって確認される。発現レベルは、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、又はタンパク質活性（これらはいずれも標準技法を使用して測定され得る）を検出することを含む様々な方式で監視され得る。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、又は酵素活性）レベルの定量化を含むか、又は代替的に、具体的には対照レベルと比較した遺伝子発現レベルの質的評価であり得る。検出されるレベルのタイプは、文脈から明らかであろう。

【0095】

特定の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのｍＲＮＡ発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を使用して、生体試料中のインサイチュ及びインビトロ形式の両方によって決定され得る。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、生体液及びそれらの単離物、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体を含むように意図されている。多くの発現検出方法は、単離されたＲＮＡを使用する。インビトロ方法については、ｍＲＮＡの単離に対して選択されない任意のＲＮＡ単離技法を、細胞からのＲＮＡの精製に利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７－１９９９を参照）。加えて、大量の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）のシングルステップＲＮＡ単離プロセスなどの当業者に周知の技術を使用して容易に処理され得る。

【0096】

単離されたｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイで使用され得る。

【0097】

１つの形式では、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で試行し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、プローブと接触させる。代替の形式では、プローブは、固体表面上に固定され、ｍＲＮＡは、例えば、遺伝子チップアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触する。当業者は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合物のｍＲＮＡの発現レベルを検出する際に使用するために、既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応させることができる。

【0098】

試料中のＡＣＥ２－Ｆｃ融合物のｍＲＮＡ発現レベルを決定するための代替の方法は、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）、又は任意の他の核酸増幅法、その後の当業者に周知の技術を使用した増幅された分子の検出による、核酸増幅のプロセスを伴う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合の核酸分子の検出に特に有用である。本明細書で使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域（それぞれ、プラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆）をアニーリングすることができ、その間に短い領域を含有し得る核酸分子の対であると定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０～３０ヌクレオチド長であり、約５０～２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で、かつ適切な試薬を用い、かかるプライマーは、プライマーによって隣接されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。

【0099】

インサイチュ法については、検出の前にｍＲＮＡを細胞から単離する必要はない。かかる方法において、細胞又は組織試料は、既知の組織学的方法を使用して調製／処理される。次いで、試料を支持体、典型的にはスライドガラス上に固定し、次いで、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させる。

【0100】

ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの絶対的な発現レベルに基づいて決定を行う代替として、決定は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの正規化された発現レベルに基づいてもよい。発現レベルは、その発現を、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド遺伝子（例えば、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子）の発現と比較することによって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの絶対的な発現レベルを補正することによって正規化される。正規化に好適な遺伝子としては、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、又は上皮細胞特異的遺伝子が挙げられる。この正規化により、ある試料、例えば対象試料中の発現レベルを、別の試料、例えば、正常試料、又は異なる供給源からの試料間で比較することが可能になる。

【0101】

ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのレベル又は活性はまた、発現されたポリペプチドを検出又は定量化することによって、検出及び／又は定量化され得る。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、当業者に周知のいくつかの手段のうちのいずれかによって、検出及び定量化され得る。これらには、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなどの分析的生化学的方法、又は流体若しくはゲル沈降反応、免疫拡散（単一若しくは二重）、免疫電気泳動、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティングなどの様々な免疫学的方法が含まれ得る。当業者は、細胞がＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを発現するかどうかを決定する際に使用するための既知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。

【0102】

ｂ．組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の別の態様は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド（又はその一部分）をコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）の使用に関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むように意図されている。一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合核酸分子を含むアデノウイルスベクターが使用される。

【0103】

本発明によって包含される組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的とするヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系での、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されることを意味するよう意図されている。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現対照要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図されている。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞でのヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの及びある特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされた融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを産生することができる。

【0104】

本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの発現のために設計することができる。例えば、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現され得る。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に更に考察されている。代替的に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳され得る。

【0105】

原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉで行われる。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を増加させる、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるという３つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、及びそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのコード配列を、ｐＧＥＸ発現ベクターにクローニングして、Ｎ末端からＣ末端へ、ＧＳＴ－トロンビン切断部位－ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするベクターを作製する。融合タンパク質は、グルタチオンアガロース樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＳＴに融合されていない組換えＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、トロンビンによる融合タンパク質の切断によって回収することができる。

【0106】

好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０－８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０－ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。

【0107】

Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９－１２８）。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８）。本発明の核酸配列のかかる変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行われ得る。

【0108】

別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅでの発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。

【0109】

代替的に、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞で発現させることができる。昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。

【0110】

更に別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス制御要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章及び第１７章を参照されたい。

【0111】

別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的制御要素は、当該技術分野で既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特に、Ｔ細胞受容体プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリンプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、並びに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されたプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。

【0112】

本発明によって包含される別の態様は、本発明によって包含される組換え発現ベクター又は核酸が導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解される。変異又は環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。

【0113】

宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞若しくは哺乳類細胞（例えば、Ｆａｏ肝細胞、原発性肝細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はＣＯＳ細胞）において発現することができる。他の好適な宿主細胞が当業者に既知である。

【0114】

ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技法によって原核又は真核細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔を含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認識されている技術を指すよう意図されている。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクトすることに好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）及び他の研究室マニュアルに見出すことができる。

【0115】

細胞培養物は、宿主細胞、培地、及び他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当該技術分野で周知である。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片が分泌され、細胞とそのポリペプチドを含む培地との混合物から単離され得る。代替的に、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片は、細胞質的に保持され、細胞が採取され、溶解され、融合タンパク質が単離され得る。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及びＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片の特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製を含むタンパク質を精製するための当該技術分野で既知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、又はその両方から単離され得る。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片は、異種ポリペプチドに融合され得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、対応する非融合ＡＣＥ２ポリペプチドよりも長い半減期を有する。他の実施形態では、異種タグは、当該技術分野で既知の標準的な方法に従って、精製目的（例えば、エピトープタグ）のために使用され得る。

【0117】

したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの全て又は選択された部分をコードするヌクレオチド配列を使用して、微生物又は真核生物の細胞プロセスを介してタンパク質の組換え形態を産生することができる。発現ベクターなどのポリヌクレオチド構築物に配列をライゲートし、真核生物（酵母、鳥類、昆虫、若しくは哺乳類）又は原核生物（細菌細胞）のいずれかの宿主に形質転換又はトランスフェクトすることは、標準的な手順である。本発明による微生物手段又は組織培養技術によって、組換えＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片を調製するために、同様の手順、又はその修飾を用いることができる。

【0118】

別の変形形態では、タンパク質産生は、インビトロ翻訳システムを使用して達成され得る。インビトロ翻訳システムは、一般に、ＲＮＡ分子のタンパク質への翻訳に必要な少なくとも最小要素を含む無細胞抽出物である翻訳システムである。インビトロ翻訳システムは、典型的には、少なくともリボソーム、ｔＲＮＡ、開始剤メチオニルｔＲＮＡＭｅｔ、翻訳に関与するタンパク質又は複合体（例えば、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、キャップ結合（ＣＢ）複合体（キャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）及び真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）を含む）を含む。様々なインビトロ翻訳システムは、当該技術分野で周知であり、市販のキットが含まれる。インビトロ翻訳システムの例としては、ウサギ網状赤血球溶解物、ウサギ卵母細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、昆虫細胞溶解物、及びコムギ胚芽抽出物などの真核生物溶解物が挙げられる。溶解物は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．、及びＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．などの製造元から市販されている。インビトロ翻訳システムは、典型的には、酵素、翻訳因子、開始因子、及び伸長因子、化学試薬、及びリボソームなどの巨大分子を含む。加えて、インビトロ転写システムが使用され得る。かかるシステムは、典型的には、少なくともＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、リボヌクレオチド、及び任意の必要な転写開始因子、伸長因子、及び終結因子を含む。インビトロの転写及び翻訳は、ワンポット反応（ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で共役され、１つ以上の単離されたＤＮＡからタンパク質を産生することができる。

【0119】

ある特定の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片は、化学的に、無細胞システムでリボソーム的に、又は細胞内でリボソーム的に合成され得る。化学合成は、様々な当該技術分野で認識されている方法を使用して行うことができ、段階的固相合成、ペプチド断片のコンフォメーション補助再ライゲーションによる半合成、クローニング又は合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーション、及び化学ライゲーションが含まれる。ネイティブ化学ライゲーションは、２つの非保護ペプチドセグメントの化学選択的反応を用いて、一過性のチオエステル結合中間体を産生する。次いで、一過性のチオエステル結合中間体は、ライゲーション部位に天然のペプチド結合を有する完全長のライゲーション産物を提供するための再配列を自発的に行う。完全長のライゲーション産物は、無細胞合成によって産生されるタンパク質と化学的に同一である。完全長のライゲーション産物は、許される限り、リフォールディング及び／又は酸化されて、天然のジスルフィド含有タンパク質分子を形成することができる（例えば、米国特許第６，１８４，３４４号及び同第６，１７４，５３０号、並びにＴ．Ｗ．Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．４，ｐ ４２０、Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．２４６，ｐ １１４９、Ａ．Ｗｌｏｄａｗｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．２４５，ｐ ６１６、Ｌ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｖｏｌ．３０，ｐ ７４０２、Ｍ．Ｓｃｌｍｏｌｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．：ｖｏｌ．４０，ｐ １８０－１９３、Ｋ．Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．２６４，ｐ ９０、Ｒ．Ｅ．Ｏｆｆｏｒｄ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｊ．Ｂ．Ｈｏｏｋ，Ｇ．Ｐｏｓｔｅ，Ｅｄｓ．，（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）ｐｐ．２５３－２８２、Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：ｖｏｌ．２６７，ｐ ３８５２、Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｖｏｌ．３０，ｐ ４１５１、Ｔ．Ｋ．Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２５４４－１２５４８、Ｍ．Ｓｃｈｎｌｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．，３２５６，ｐ ２２１、及びＫ．Ａｋａｊｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）３３：１８４を参照されたい）。

【0120】

哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、わずかな細胞のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができることが既知である。これらの組み込み体を特定及び選択するために、一般に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性）をコードする遺伝子が目的とする遺伝子と共に宿主細胞に導入される。選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与するものが含まれるが、これらに限定されない。選択可能なマーカーをコードする核酸は、宿主細胞に、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするものと同じベクター上で導入され得るか、又は別個のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存する一方で、他の細胞は死ぬ）。

【0121】

本発明によって包含される宿主細胞、例えば、培養物中の原核宿主細胞又は真核宿主細胞を使用して、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）することができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を使用して、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを産生するための方法を更に提供する。一実施形態では、本方法は、本発明の宿主細胞（ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが産生されるまで、好適な培地で培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを培地又は宿主細胞から単離することを更に含む。

【0122】

ｃ．ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド
本発明はまた、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の原因病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳの原因病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）に結合し、ウイルスが細胞表面上で内因的に発現するＡＣＥ２に結合するのを競合的に阻害する、可溶性、精製及び／又は単離された形態のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを提供する。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＣＥ２ポリペプチドの細胞外ドメイン又はその一部分、並びに免疫グロブリンポリペプチド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４ポリペプチド）のＦｃドメイン又はその断片を含むことができる。ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片、及びＦｃドメインは、ヒンジポリペプチドによって分離されている。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片、及びＦｃドメインは、単一のプロリン、又はシステイン－プロリンジペプチドによって分離されている。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸は、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又はその断片、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、配列番号５～３２又は５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むヒンジのアミノ酸配列、及びＦｃドメインと少なくとも７０％、８０％、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又はその断片、配列番号３３～４２又は５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、本明細書に記載の方法に従って使用するためのものであり得る。

【0123】

一態様では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドにおけるＨ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎアミノ酸置換に類似するアミノ酸置換を含む、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸置換を有する、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片を含むか、又は１～約２０個の追加の保存的アミノ酸置換を有し、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎアミノ酸置換を含む、配列番号１～４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎに対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、Ｒ２７３Ｑ、Ｈ３４５Ａ、Ｈ３４５Ｌ、Ｈ５０５Ａ、及びＨ５０５Ｌに対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、Ｒ１６９Ｑ、Ｗ２７１Ｑ、及びＫ４８１Ｑに対応する位置にアミノ酸置換を含む。上記のアミノ酸置換は、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドに対するものである。いくつかの実施形態では、核酸は、完全長ＡＣＥ２ポリペプチドのアミノ酸１８～６００、１８～６１５、１８～７０８、又は１８～７４０を含むＡＣＥ２細胞外ドメインをコードする。

【0124】

ＡＣＥ２細胞外ドメインの酵素活性を低下させる点置換が本明細書で企図される。いくつかの実施形態では、ポイント置換は、ＡＣＥ２活性のより大きな減少をもたらし、一方、他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）に対するＡＣＥ２の結合アビディティを低下させる。Ｓタンパク質への強い結合の保持が必要である。

【0125】

明確にするために、配列番号１～４は、アミノ酸残基位置３５７及び３６１にアスパラギン残基を含む。これらの残基は、コロナウイルスへの結合を阻害することなく、ＡＣＥ２ポリペプチドの酵素活性を低減又は排除する。本明細書に記載のいずれかのＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片であるポリペプチドのアミノ酸配列はまた、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン又はその断片、アミノ酸配列又はその断片と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％同一であり得る。

【0126】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドもまた、Ｆｃドメイン断片を含む。インタクトなＩｇＧ抗体のＦｃドメインは、そのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）への結合によって、抗体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞貪食などの抗体エフェクター機能を担う（Ｋａｎｄ ａｎｄ Ｊｕｎｇ（２０１９）Ｅｘｐ．＆Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，５１：１３８－４６；Ｍｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，９１：１０３－１１；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：１０１－１０）。組換えＦｃドメインは、ＦｃドメインがＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合しないか、又は少なくとも減弱したＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）結合活性を有するように操作することができる（Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２０１９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：Ａｒｔ．１２９６；Ｓｈｏｔｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２９（１０）：４５７－６６）。加えて、Ｆｃドメイン又はその断片は、治療用ポリペプチド（すなわち、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド）に組み込まれた場合、循環における寿命の延長などの追加の利益を提供するが、これらに限定されない（Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２０１９））。

【0127】

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３３～４２又は５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に対する結合親和性が減少している。Ｆｃドメインにおけるアミノ酸置換は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に対する結合親和性を低下させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３２９Ｇ、又はそれらの組み合わせを有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来するＦｃドメイン断片を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇアミノ酸置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来するＦｃドメイン断片を含む。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来し、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇアミノ酸置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来し、Ｐ３２９Ｇアミノ酸置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来し、Ｌ２３５Ｅアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来し、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来し、Ｎ２９７Ｄアミノ酸置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来し、Ｎ２９７Ａアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインに由来し、Ｎ２９７Ｑアミノ酸置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、野生型ＩｇＧ２ Ｆｃドメインに由来する。全体を通して、アミノ酸残基の番号付けは、完全長タンパク質又はドメイン（すなわち、完全長ＡＣＥ２ポリペプチド又は完全長ＩｇＧ Ｆｃドメイン）に対するものである。本明細書に記載のいずれかのＦｃドメイン断片ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、ヒトＦｃドメインアミノ酸配列又はその断片と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％同一であり得る。

【0128】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのＡＣＥ２細胞外ドメイン及びＦｃドメイン断片は、細胞外ドメイン及びＦｃドメインを分離する追加のポリペプチドに融合され得る。「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「ヒンジポリペプチド」という用語は、かかる介在ポリペプチドを指すように互換的に使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＦｃドメインのアイソタイプに対応するヒンジ領域。例えば、ＩｇＧ４ヒンジ配列を使用する場合、Ｓ２２８Ｐ置換は、Ｆａｂアーム交換を最小化することができる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、表２～４のうちのいずれかの配列番号のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に対するＦｃ断片の結合親和性を低減するＦｃドメインにおけるアミノ酸置換に類似するアミノ酸残基を含むであろう。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、減少したＦａｂアーム交換と関連するＩｇＧ４ ＦｃドメインにおけるＳ２２８Ｐアミノ酸置換に類似するアミノ酸を含むヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むヒンジ領域と、Ｌ２３５Ｅアミノ酸置換を含むＦｃ断片と、を含み、ポリペプチドが、ＩｇＧ４－ＳＰＬＥ Ｆｃドメインを有すると言われる。いくつかの実施形態では、Ｌ２３５Ｅ置換は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に対するＩｇＧ４ Ｆｃドメインの減少した親和性を付与する。

【0129】

一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を有するＡＣＥ２細胞外ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＦｃドメイン断片と、を含む。別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ置換を含む配列番号４のアミノ酸配列を有するＡＣＥ２細胞外ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＦｃドメイン断片と、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号４８、４９、５６、又は５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号４８、４９、５６、又は５７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号５０、５１、５８、又は５９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。

【0130】

本明細書に記載の任意のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）に対する結合親和性を有し、ＡＣＥ２酵素活性が低減又は排除され、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）へのＦｃドメイン又はその断片の結合が低減又は排除される。モノクローナル抗体は、関連するウイルス間の交差反応性を示すことがあるが、それらは、典型的には、それらが産生されたウイルスに対してより高いアビディティを示し、多くの場合、再操作及び最適化されない限り、新規の関連するウイルスに対して部分的にしか中和することができない。対照的に、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＡＣＥ２依存性コロナウイルスが結合する実際の受容体の最適化された可溶性形態であり、したがって、細胞表面受容体としてＡＣＥ２を利用する任意の将来の新規のコロナウイルスの競合阻害剤として機能するはずである。

【0131】

ある特定の実施形態では、ＡＣＥ２酵素活性の低減又は排除、並びにＦｃ受容体へのＦｃドメイン又はその断片の結合の低減は、完全長ＡＣＥ２ポリペプチド又は野生型Ｆｃドメイン又はその断片に対して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、少なくとも２５倍、少なくとも２６倍、少なくとも２７倍、少なくとも２８倍、少なくとも２９倍、少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍、少なくとも３９倍、少なくとも４０倍、少なくとも４１倍、少なくとも４２倍、少なくとも４３倍、少なくとも４４倍、少なくとも４５倍、少なくとも４６倍、少なくとも４７倍、少なくとも４８倍、少なくとも４９倍、少なくとも５０倍、少なくとも５１倍、少なくとも５２倍、少なくとも５３倍、少なくとも５４倍、少なくとも５５倍、少なくとも５６倍、少なくとも５７倍、少なくとも５８倍、少なくとも５９倍、少なくとも６０倍、少なくとも６１倍、少なくとも６２倍、少なくとも６３倍、少なくとも６４倍、少なくとも６５倍、少なくとも６６倍、少なくとも６７倍、少なくとも６８倍、少なくとも６９倍、少なくとも７０倍、少なくとも７１倍、少なくとも７２倍、少なくとも７３倍、少なくとも７４倍、少なくとも７５倍、少なくとも７６倍、少なくとも７７倍、少なくとも７８倍、少なくとも７９倍、少なくとも８０倍、少なくとも８１倍、少なくとも８２倍、少なくとも８３倍、少なくとも８４倍、少なくとも８５倍、少なくとも８６倍、少なくとも８７倍、少なくとも８８倍、少なくとも８９倍、少なくとも９０倍、少なくとも９１倍、少なくとも９２倍、少なくとも９３倍、少なくとも９４倍、少なくとも９５倍、少なくとも９６倍、少なくとも９７倍、少なくとも９８倍、少なくとも９９倍、少なくとも１００倍、又は任意の包括的範囲で（例えば、５倍～２０倍）低減される。

【0132】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと、約２５％未満、又は代替的に１５％未満、又は代替的に５％未満の夾雑生体高分子又はポリペプチドと、を含む組成物を企図する。

【0133】

本発明は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその断片の産生、検出、又は特徴付けに関連する組成物（例えば、核酸、ベクター、宿主細胞など）を更に提供する。かかる組成物は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの発現及び／又は活性を調節する化合物として機能し得る。

【0134】

本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｆｃドメイン又はその断片を含む融合タンパク質であり、これは、その溶解度及び生物学的利用能を増加させ、かつ／又はその精製、同定、検出、及び／若しくは構造的特徴付けを容易にする。いくつかの実施形態では、融合パートナーが血漿中の融合タンパク質の安定性を増強し、かつ／又は全身的な生物学的利用能を増強する、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを発現することが有用であり得る。本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドに組み込まれ得る例示的な追加のドメインとしては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ、ポリＨｉｓ－Ａｓｐ、又はＦＬＡＧ融合タンパク質及びタグが挙げられる。追加の例示的なドメインとしては、シグナルペプチド、２Ｉ型分泌系標的化ペプチド、トランスサイトーシスドメイン、核局在化シグナルなどの、インビボでのタンパク質局在化を変化させるドメインが挙げられる。様々な実施形態では、本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、１つ以上の異種融合体を含み得る。ポリペプチドは、複数コピーの同じ融合ドメインを含んでもよく、又は２つ以上の異なるドメインへの融合を含んでもよい。融合は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、又はポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方で生じ得る。融合タンパク質の構築を容易にするために、又は融合タンパク質のタンパク質発現又は構造的制約を最適化するために、本発明のポリペプチドと融合ドメインとの間のリンカー配列を含むことも本発明の範囲内である。別の実施形態では、ポリペプチドは、タンパク質発現後又はその後にタグを除去するために、本発明の融合ポリペプチドとポリペプチドとの間のプロテアーゼ切断部位を含むように構築され得る。好適なエンドプロテアーゼの例としては、例えば、第Ｘａ因子及びＴＥＶプロテアーゼが挙げられる。

【0135】

更に別の実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、蛍光標識で標識されて、それらの検出、精製、又は構造的特徴付けが容易になり得る。例示的な実施形態では、本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａ Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シトリン、及びイソギンチャクモドキ由来赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）を含む、検出可能な蛍光シグナルを生成する異種ポリペプチド配列に融合され得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分が、酵素的に死んでいるか又は酵素活性が低下しているが、コロナウイルス及びＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）によって認識されないＦｃ断片に結合することができるように、表１、表５、又は表７に示されるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分が、酵素的に死んでいるか又は酵素活性が低下しているが、コロナウイルスに結合することができるように、表１に示されるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド又はその一部分が、Ｆｃポリペプチドの野生型配列に対して増加した安定性を有し、かつ／又はＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合しないように、表５に示されるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、表１に示されるアミノ酸配列又はその断片を含み、その各々が、野生型ＡＣＥ２ポリペプチドにおけるＨ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎアミノ酸置換に類似するアミノ酸置換を含むか、あるいは表１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列又はその断片を含み、その各々が、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎアミノ酸置換を含む。明確にするために、表１に示されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基位置３５７及び３６１にアスパルガニン残基を含む。これらの残基は、ＡＣＥ２酵素活性を低減又は排除するが、コロナウイルスのＡＣＥ２結合を阻害しない。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドはまた、Ｆｃドメイン若しくはその断片、表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその断片、又は表１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列若しくはその断片を含む。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのＡＣＥ２ドメイン及びＦｃドメイン、又はその断片は、ヒンジ領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、表２、３、又は４に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はその断片、ポリペプチドは、その断片がＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合する能力を減弱させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、その断片がＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合する能力を減弱させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むであろう。

【0137】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、コロナウイルス感染症の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減又は排除するように設計され得る。例えば、Ｆｃドメイン又はその断片が、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質に結合し、Ｆｃドメインのアミノ酸配列又はその断片を、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）へのその断片の結合を低減するように最適化することができる。ヒンジ領域は、Ｆｃドメイン又はその断片がＦｃ受容体に結合する能力を減弱させるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、そのヒンジにＦａｂアーム交換を低減するアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２８Ｐ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２－Ｆｃ受容体は、ヒンジ領域又はＦｃドメイン若しくはその断片におけるアミノ酸置換（例えば、Ｌ２３５Ｅ）を含み、これは、Ｆｃドメイン若しくはその断片がＦｃ受容体に結合する能力を低減又は排除する。

【0138】

本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端又は付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて、粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ－ｉｎ）、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを用いることによって、インフレームで一緒にライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成され得る。代替的に、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これがアニール及び再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。更に、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がインフレームで連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。

【0139】

本発明は、ＡＣＥ２細胞外ドメイン及びＦｃドメインのアミノ酸配列ホモログを含む融合タンパク質にも関する。ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン及びＦｃドメインのホモログは、変異誘発（例えば、それぞれヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン及びＦｃドメインの別個の点変異又は切断）によって生成され得る。本明細書で使用される場合、「ホモログ」という用語は、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン及び／又はＦｃドメインポリペプチドのバリアント形態を指す。一実施形態では、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有するホモログによる対象の治療は、天然に存在する形態のＡＣＥ２細胞外ドメイン及び／又はＦｃドメイン若しくはその断片による治療に対して、対象におけるより少ない副作用を有し得る。

【0140】

代替的な実施形態では、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメイン若しくはその断片のホモログは、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメイン若しくはその断片の変異体（例えば、切断変異体）のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって特定され得る。一実施形態では、ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメインバリアントの多様化ライブラリが、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、多様化遺伝子ライブラリによってコードされる。修飾ＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメインバリアントの多様化ライブラリは、潜在的なＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメイン配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、又は代替的にＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメインのセット又はその断片、その中の配列を含むより大きい融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ用）として発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって産生され得る。様々な方法が存在し、これを使用して、縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメイン若しくはその断片、ホモログのライブラリを産生することができる。縮重遺伝子配列の化学的合成が自動ＤＮＡ合成機で行われ、その後、合成遺伝子が適切な発現ベクターにライゲートされ得る。遺伝子の縮重セットの使用により、ある混合物では、潜在的なＡＣＥ２細胞外ドメイン又はＦｃドメイン若しくはその断片、配列の所望のセットをコードする配列の全ての提供が可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７）を参照されたい）。

【0141】

ＩＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、本発明は、表１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、表５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含み、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／又は希釈剤と共に製剤化された、薬学的に許容される組成物を提供する。一実施形態では、薬学的に許容される組成物は、表７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む。

【0142】

以下で詳細に説明されるように、本発明によって包含される薬学的組成物は、以下のために適合されたものを含め、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化されてもよい。（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液としての皮下、筋肉内、又は静脈内注射によるもの、（３）局所投与、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、若しくはスプレーとしてのもの、（４）膣内若しくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、又はフォームとしてのもの、あるいは（５）エアロゾル、例えば、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物、又は固体粒子。

【0143】

「治療効果」という用語は、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所又は全身効果を指す。したがって、この用語は、動物若しくはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、若しくは予防、又は望ましい身体若しくは精神発達及び状態の増強における使用を目的とした任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、いずれの治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の局所又は全身効果をもたらすかかる物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度等に依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある特定の化合物が、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。

【0144】

本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、合理的なベネフィット／リスク比で、治療効果、例えば、コロナウイルス感染症の症状（例えば、発熱、咳、のどの痛み、疲労、息切れ、呼吸困難、頻呼吸、低酸素症など）の減少又は緩和をもたらすのに有効なＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの量を意味する。

【0145】

本明細書において、「薬学的に許容される」という語句は、理にかなった医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適なそれらの薬剤、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために用いられる。

【0146】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、ある臓器又は身体の一部分から別の臓器又は身体の一部分へと、対象の化学物質を運ぶか、又は輸送することに関与する薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能することができる材料の例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース、（２）デンプン類、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン、（３）セルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）トラガカント末（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばカカオバター及び坐剤ワックス、（９）油類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油、（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール、（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質、が挙げられる。

【0147】

湿潤剤、乳化剤及びラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味料及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。

【0148】

薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロール等、及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。

【0149】

本発明によって包含される方法に有用な製剤には、経口、鼻、局所（頬及び舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル及び／又は非経口投与に好適な製剤が挙げられる。製剤は、単位剤形で簡便に提供されてもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単回剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主、特定の投与態様に応じて変化する。単回剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント～約９９パーセント（例えば、約５パーセント～約７０パーセント、又は約１０パーセント～約３０パーセント）の有効成分の範囲であろう。

【0150】

これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを、担体及び任意選択的に１つ以上の副成分と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、呼吸脱共役剤を、液体担体、又は微粉化した固体担体、又はその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、製品を成形することによって調製される。

【0151】

経口投与に好適な製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（フレーバーベース、通常、スクロース及びアカシア若しくはトラガカントを使用する）、粉末、顆粒の形態で、又は水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型若しくは油中水型液体乳剤として、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）（不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアを使用する）として、及び／又は口腔洗浄剤等としてのものであってもよく、各々が有効成分として所定量の呼吸脱共役剤を含む。化合物は、ボーラス、舐剤又はペーストとして投与することもできる。

【0152】

経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、有効成分を、１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下のいずれか、（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（８）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ、（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物、並びに（１０）着色剤と混合する。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物はまた、ラクトース又は乳糖のような賦形剤、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤としても使用され得る。

【0153】

錠剤は、任意選択的に１つ以上の副成分と共に、圧縮又は成形することにより作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤又は分散剤を使用して調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状ペプチド又はペプチド模倣薬の混合物を好適な機械で成形することにより作製することができる。

【0154】

錠剤、及び他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒は、任意選択的に、刻み目が付けられているか、又は腸溶性コーティング及び薬学的製剤の分野で知られている他のコーティング等のコーティング及びシェルを伴って調製することができる。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用して、その中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、又は使用直前に滅菌水若しくはいくつかの他の滅菌注射媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌されてもよい。これらの組成物はまた、任意選択的に不透明化剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含んでもよく、有効成分のみを放出する組成物、又は、任意選択的に遅延様式で、胃腸管の特定の部分で放出する組成物であってもよい。使用可能な包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。有効成分は、適切な場合、上記の賦形剤の１つ以上を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。

【0155】

経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される乳濁液、微乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルを含む。有効成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有し得る。

【0156】

不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、香味料、着色料、芳香剤及び保存剤などのアジュバントも含むことができる。

【0157】

懸濁液は、活性薬剤に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びそれらの混合物等の懸濁化剤を含有し得る。

【0158】

直腸又は膣投与のための製剤は、坐剤として提示されてもよく、坐剤は、１つ以上の呼吸脱共役剤（ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス、若しくはサリチル酸塩を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤若しくは担体（これらは、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸又は膣腔で融解して活性薬剤を放出する）とを混合することによって調製されてもよい。

【0159】

膣投与に好適な製剤には、好適であることが当該技術分野で知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤も挙げられる。

【0160】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの局所投与、噴霧投与、又は経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤が含まれる。活性成分は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、及び必要とされる可能性のある保存料、緩衝剤、又は噴射剤と混合することができる。

【0161】

軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、呼吸脱共役剤に加えて、賦形剤、例えば、動物性及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含むことができる。

【0162】

粉末及びスプレーは、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドに加えて、賦形剤（例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物）を含むことができる。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素などの通常の噴射剤、並びにブタン及びプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を追加で含むことができる。

【0163】

代替的に、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを、エアロゾルによって投与することができる。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物、又は固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液を使用することができる。超音波ネブライザーは、薬剤が、化合物の分解を引き起こし得る剪断にさらされることを最小化する。

【0164】

通常、水性エアロゾルは、薬剤の水溶液又は懸濁液を、従来の薬学的に許容される担体及び安定剤と共に製剤化することによって作製される。担体及び安定剤は、特定の化合物の要求によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）ｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ｓ、又はポリエチレングリコール）、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン等の無害なタンパク質、グリシン等のアミノ酸、緩衝液、塩、糖又は糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般に、等張性溶液から調製される。

【0165】

経皮パッチは、身体への呼吸脱共役剤の制御された送達を提供するという追加の利点を有する。かかる剤形は、治療薬を適切な媒体に溶解又は分配することによって作製することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通るペプチド模倣薬の流れを増大させることもできる。かかる流れの速度は、速度を制御する膜を提供するか、又はペプチド模倣薬をポリマーマトリックス若しくはゲルに分散させることのいずれかによって制御することができる。

【0166】

眼科製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本発明の範囲内にあると考えられる。

【0167】

非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、１つ以上の呼吸脱共役剤を、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張性水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液若しくは乳剤、又は使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成可能な滅菌粉末と組み合わせて含み、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象レシピエントの血液と等張性にする溶質、又は懸濁化剤又は増ちょう剤を含有していてもよい。

【0168】

本発明の薬学的組成物に用いられ得る好適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用により維持され得る。

【0169】

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、注射可能な薬剤形態の長期吸収がもたらされ得る。

【0170】

場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、難水溶性である結晶性又は非晶質の液体懸濁液を使用することにより達成され得る。その場合、薬物の吸収速度は溶解速度に依存し、次に溶解速度は結晶サイズと結晶形態に依存する可能性がある。代替的に、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁することにより達成される。

【0171】

注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中でＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物とポリマーの比率、及び使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、生体組織に適合するリポソーム又はマイクロ乳剤中に薬物を取り込むことによっても調製される。

【0172】

本発明によって包含される呼吸脱共役剤を医薬品としてヒト及び動物に投与する場合、それらは、例えば、０．１～９９．５％（例えば、０．５～９０％）の有効成分を、そのまま又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物として投与され得る。

【0173】

本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、対象に対して毒性であることなく、特定の対象、組成物、及び投与態様にとって所望な治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るように、本発明によって包含される方法によって決定され得る。

【0174】

本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子療法ベクターとして使用され得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、又は定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４－３０５７を参照）によって対象に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含み得る。代替的に、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、例えば、レトロウイルスベクターの場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。

【0175】

本発明は、以下の実施例によって更に例証され、これらは、限定するものと解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容、並びに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0176】

ＩＶ．本発明の更なる使用及び方法
本明細書に記載の組成物は、様々な診断用途、予後用途、及び治療用途で使用することができる。診断方法、予後方法、治療方法、又はそれらの組み合わせなどの本明細書に記載の任意の方法では、本方法の全てのステップは、単一の作用物質によって、又は代替的に、複数の作用物質によって実施され得る。例えば、診断は、治療処置を提供する作用物質によって直接実施され得る。代替的に、治療剤を提供する人は、診断アッセイが実施されるように要求することができる。診断医及び／又は治療介入者は、診断アッセイ結果を解釈して、治療戦略を決定することができる。同様に、かかる代替プロセスは、予後アッセイなどの他のアッセイに適用することができる。

【0177】

ａ．スクリーニング法
本発明の一態様は、細胞及び非細胞ベースのアッセイを含むスクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、これらのアッセイは、非細胞アッセイを使用して、コロナウイルスに対するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの結合親和性を決定すること、又は細胞培養アッセイを使用して、感染及び／若しくはＡＤＥに対してＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが有する禁止効果を決定することによって、コロナウイルスがＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドによる治療に単独で又は他のウイルス療法と組み合わせて応答する可能性があるかどうかを特定するための方法を提供する。

【0178】

例えば、直接結合アッセイでは、結合が複合体中の標識タンパク質又は分子を検出することによって決定され得るように、ＡＣＥ２融合ポリペプチド（又はそれらのそれぞれの標的ポリペプチド又は標的分子）が放射性同位体又は酵素標識にカップリングされ得る。例えば、標的は、直接的又は間接的のいずれかで、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、又は^３Ｈで標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出され得る。代替的に、標的は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の産物への変換の決定によって検出され得る。バイオマーカーと基質との間の相互作用の決定が標準の結合又は酵素分析アッセイを使用して達成される場合もある。上述のアッセイ方法の１つ以上の実施形態では、ポリペプチド又は分子を固定化して、タンパク質又は分子の一方又は両方の複合体形成されていない形態からの複合体形成された形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。

【0179】

ＡＣＥ２－Ｆｃの標的への結合は、反応物を収容するのに好適な任意の容器内で達成され得る。かかる容器の非限定的な例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が挙げられる。本明細書に記載の抗体の固定化された形態は、多孔性、微孔性（約１ミクロン未満の平均細孔径を有する）又はマクロ多孔性（約１０ミクロン超の平均細孔径を有する）材料、例えば、膜、セルロース、ニトロセルロース、又はガラス繊維；ビーズ、例えば、アガロース若しくはポリアクリルアミド若しくはラテックス製のもの；又は皿、プレート、若しくはウェルの表面、例えば、ポリスチレン製のもの等の固相に結合した抗体も含み得る。

【0180】

代替の実施形態では、コロナウイルスと完全長ＡＣＥ２ポリペプチドとの間の相互作用を調節する薬剤の能力を決定することは、本発明によって包含されるＡＣＥ２融合ポリペプチドがコロナウイルスの感染性を調節する能力を決定することによって達成され得る。

【0181】

本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって特定されたＡＣＥ２－Ｆｃに更に関する。したがって、本明細書に記載されるように特定されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを適切な動物モデルなどで更に使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤が動物モデルに使用されて、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。代替的に、本明細書に記載されるように特定された抗体が動物モデルに使用されて、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。

【0182】

ｂ．予測医療
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、及び臨床試験の監視が予後（予測）目的で使用され、それによって個体を予防的に治療する、予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、又は組織）との関連でコロナウイルスの量及び／又は活性レベルを決定し、それによって、ウイルスに感染した個体が、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドでの治療に応答する可能性が高いかどうかを決定するための診断アッセイに関する。かかるアッセイは、予後目的若しくは予測目的のみに使用されてもよく、又は治療介入と組み合わせて使用されてもよく、それによって、コロナウイルス感染症と関連する症状の発症前又は発症後の個体を予防的に治療することができる。当業者であれば、任意の方法が、表、図、実施例、及びその他本明細書に記載のものなどの、本明細書に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのうちの１つ以上（例えば、組み合わせ）を使用することができることを理解するであろう。

【0183】

本発明の別の態様は、本明細書に記載のバイオマーカーの発現又は活性に対する薬剤（すなわち、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド）の影響を監視することに関する。これら及び他の薬剤については、以下のセクションに更に詳細に記載されている。

【0184】

当業者は、ある特定の実施形態では、本発明の方法が、コンピュータプログラム及びコンピュータシステムを実装することも理解するであろう。例えば、コンピュータプログラムを使用して、本明細書に記載のアルゴリズムを実行することができる。コンピュータシステムはまた、本発明の方法を実装する際にコンピュータシステムによって使用することができる複数のバイオマーカーシグナルの変化／プロファイルを含む本発明によって包含される方法によって生成されるデータを記憶し、操作することができる。ある特定の実施形態では、コンピュータシステムは、バイオマーカー発現データを受信し、（ｉｉ）データを記憶し、（ｉｉｉ）本明細書に記載の任意の数の様式でデータを比較し（例えば、適切な対照と比較した分析）、がん性又は前がん性組織からの有益なバイオマーカーの状態を決定する。他の実施形態では、コンピュータシステムは、（ｉ）決定された発現バイオマーカーレベルを閾値と比較し、（ｉｉ）上述のバイオマーカーレベルが閾値を有意に調節されるか（例えば、閾値を上回るか、又は下回るか）、又は上述の適応症に基づく表現型の指標を出力する。

【0185】

ある特定の実施形態では、かかるコンピュータシステムも本発明の部分とみなされる。多数のタイプのコンピュータシステムを使用して、バイオインフォマティクス及び／又はコンピュータ技術分野の当業者によって所持される知識に従って、本発明の分析方法を実装することができる。かかるコンピュータシステムの動作中に、いくつかのソフトウェアコンポーネントをメモリにロードすることができる。ソフトウェアコンポーネントは、当該技術分野で標準であるソフトウェアコンポーネントと、本発明に特有のコンポーネント（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０，１２３３－１２４０に記載されるｄＣＨＩＰソフトウェア、当該技術分野で既知の放射基底関数に基づく機械学習アルゴリズム（ＲＢＭ））の両方を含んでいてもよい。

【0186】

本発明の方法はまた、使用される特定のアルゴリズムを含め、方程式の記号入力及び処理の高レベル仕様を可能にする数学的ソフトウェアパッケージでプログラム化又はモデル化されてもよく、それによって、個々の方程式及びアルゴリズムを手順的にプログラミングする必要性からユーザを解放する。かかるパッケージには、例えば、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（ネイティック、マサチューセッツ）製のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（シャンペーン、イリノイ）製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、又はＭａｔｈＳｏｆｔ（シアトル、ワシントン）製のＳ－Ｐｌｕｓが挙げられる。

【0187】

ある特定の実施形態では、コンピュータは、バイオマーカーデータを保存するためのデータベースを含む。かかる記憶されたプロファイルは、後の時間点で目的の比較を実行するために、アクセスされ使用され得る。例えば、対象の非感染組織に由来する試料のバイオマーカー発現プロファイル、及び／又は同じ種の関連する集団における目的の情報遺伝子座の集団に基づく分布から生成されるプロファイルが保存され、その後、その対象のがん性組織又はその対象のがん性であると疑われる組織に由来する試料のプロファイルと比較することができる。

【0188】

本明細書に記載される例示的なプログラム構造及びコンピュータシステムに加えて、当業者には、他の代替的なプログラム構造及びコンピュータシステムが容易に明らかになるであろう。したがって、上述のコンピュータシステム及びプログラム構造から趣旨的又は範囲的のいずれかに逸脱しないかかる代替システムは、添付の特許請求の範囲内であると理解されることが意図されている。

【0189】

ｃ．診断アッセイ
本発明は、部分的には、生体試料が、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのうちの１つ以上による治療に応答する可能性が高いコロナウイルスに感染しているかどうかを正確に分類するための方法、システム、及びコードを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、統計アルゴリズム及び／又は経験的データ（例えば、表、図、実施例、及びその他本明細書に記載のものなどの本明細書に記載のバイオマーカーの量又は活性）を使用して、本明細書によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドによる治療に応答するか又は応答しないであろうコロナウイルス感染症と関連する又はそのリスクがあるとして試料（例えば、対象由来の）を分類するのに有用である。

【0190】

本明細書に記載のコロナウイルスの量又は活性を検出し、したがって、ある試料が、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドによる治療に応答する可能性が高いか又は応答する可能性が低いかどうかを分類するのに有用な例示的な方法は、試験対象から生体試料を得ることと、生体試料を薬剤（例えば、生体試料中のバイオマーカーの量若しくは活性を検出することができる、抗体若しくはその抗原結合断片のようなタンパク質結合剤、又はオリゴヌクレオチドのような核酸結合剤）と接触させることと、を伴う。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片が使用され、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ超のかかる抗体又は抗体断片が組み合わせで（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで）又は順次に使用され得る。ある特定の例では、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。例えば、単一の学習統計的分類子システムを使用して、予測値又は確率値、及びバイオマーカーの存在又はレベルに基づくものとして試料を分類することができる。単一の学習統計的分類子システムの使用により、典型的には、試料を、例えば、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の感受性、特異性、陽性予測値、陰性予測値、及び／又は全体的な精度を有する免疫療法レスポンダー又はプログレッサー試料である可能性が高いと分類する。

【0191】

他の好適な統計的アルゴリズムが当業者に周知である。例えば、学習統計的分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的とするマーカーのパネル）に適合し、かかるデータセットに基づいて決定することができる機械学習アルゴリズム技法を含む。いくつかの実施形態では、分類ツリー（例えば、ランダムフォレスト）等の単一の学習統計的分類子システムが使用される。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の学習統計的分類子システムの組み合わせが、好ましくは直列で使用される。学習統計的分類子システムの例としては、帰納的学習（例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、ブーストツリー等の決定／分類ツリー）、確率的に近似的に正しい（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの適用、信念ネットワークにおけるベイズ学習等）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、及び時間差学習等の既知の環境における受動的学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、学習行動値関数、強化学習の適用等）、並びに遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを使用したものが挙げられるが、これらに限定されない。他の学習統計的分類子システムは、サポートベクトルマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応型回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、試料の分類結果を臨床医（例えば、腫瘍学者）に送信することを更に含む。

【0192】

別の実施形態では、対象の診断に続いて、診断に基づいて、個体に、治療有効量のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを投与する。

【0193】

一実施形態では、本方法は、対照生体試料（例えば、コロナウイルス感染症を有しない対象又はその感染がＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドによるウイルス隔離を受けやすい対象由来の生体試料、処置前の期間中の対象由来の生体試料、又は処置中若しくは処置後の対象由来の生体試料）を得ることを更に伴う。

【0194】

ｄ．予後アッセイ
本明細書に記載の診断法は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドに応答する可能性が高い又は応答する可能性が低いコロナウイルス感染症を有する又はそのリスクがある対象を特定するために更に利用され得る。前述の診断アッセイ又は以下のアッセイなどの本明細書に記載のアッセイを利用して、コロナウイルスに感染している対象又は感染するリスクがある対象を特定するために利用することができる。代替的に、予後アッセイを利用して、肺炎などのコロナウイルス感染症と関連する障害を有する対象又はそれを発症するリスクがある対象を特定することができる。更に、本明細書に記載の予後アッセイを使用して、対象にＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを投与して、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと関連する疾患又は障害を治療することができるかどうかを決定することができる。

【0195】

ｅ．処理方法
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の原因病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を含む、コロナウイルス感染症のリスクがある（又はそれに罹患しやすい）対象を治療する、予防方法及び治療方法の両方を提供する。いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、コロナウイルスに感染した対象又はそれに感染するリスクがある対象に投与される。投与されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの細胞表面受容体であるＡＣＥ２の薬理学的に最適化された可溶性形態であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合することによって、ウイルス感染の競合阻害剤として機能し、細胞表面ＡＣＥ２への付着を防ぐ。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９患者における急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を引き起こすか又はその重症度を悪化させ得る、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を妨げるＦｃ断片を含む。

【0196】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する酵素的に活性なＡＣＥ２の治療用途の欠点は、Ｆｃ融合形式であるかどうかにかかわらず、血行動態的な副作用及び電解質異常の可能性である。野生型ＡＣＥ２は、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系（ＲＡＡＳ）経路の成分であるアンジオテンシンＩＩを分解する外酵素であり、したがって、体内の血圧、体液、及び電解質バランス（主にナトリウム）を調節する天然のＲＡＡＳ阻害剤である。野生型ＡＣＥ２を利用する治療薬は、特により高い用量で、ＲＡＡＳ阻害の生理学的効果を反映する副作用を引き起こすことが予想されるか、又は相対量の枯渇状態にある急性の病気であるか、又は腎血管性狭窄若しくは心不全などのＲＡＡＳ依存症をもたらす慢性状態を有する患者において予想される。ＲＡＡＳ阻害による副作用には、低血圧、血液量減少症、腎損傷、血圧低下が含まれ、低ナトリウム血症又は電解質変化をもたらす可能性がある。したがって、重症化し得る集団であるＣＯＶＩＤ－１９患者のＡＣＥ２治療は、用量制限の副作用をもたらす可能性があり、これは、治療及び予防の両方の場面での活性ＡＣＥ２の使用に対する懸念を引き起こす。

【0197】

酵素的に活性な組換えＡＣＥ２細胞外ドメイン（Ｆｃ融合形式ではない）は、病理学的ＲＡＡＳ活性化による高血圧の治療のために開発されている。健常なボランティアの第Ｉ相無作為化用量漸増試験では、それは血圧又は心拍数に対して影響を及ぼさず、試験した用量では十分に耐容性であった（Ｈａｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，５２（９）：７８３－９２）。しかし、多くが重症であるＣＯＶＩＤ－１９患者におけるその生理学的効果は、健常なボランティアにおけるその効果を反映していない可能性がある。更に、ウイルスの競合阻害に必要な用量は、前述のＲＡＡＳ媒介性高血圧症の第Ｉ相試験で検討された用量よりも多い可能性があるため、重症ではないＣＯＶＩＤ－１９患者であっても、有害な血行動態作用や低ナトリウム血症を経験する可能性があることが懸念される。

【0198】

酵素的に活性なＡＣＥ２薬剤の副作用は、ＲＡＡＳシステムが活性である場合に最も顕著であろう。これは、次の２つの場面で起こり得る：１）脱水又は敗血症などの血管内容量減少（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の状態；又は２）腎動脈狭窄、心不全、又は肝硬変（肝不全）などのＲＡＡＳ活性化の慢性状態（Ａｔｌａｓ，Ｓ．Ａ．，（２００７）Ｊ．Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ Ｐｈａｒｍ．，１３（８ Ｓｕｐｐｌ Ｂ）：９－２０、Ｈｒｉｃｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０８（７）：３７３－６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７（１４）：１４１１－２０、Ａｒｒｏｙｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｐｈｒｏｌ．，７（９）：５１７－２６１）。これらの慢性的な状態は、重篤なＣＯＶＩＤ－１９を発症する可能性がより高い退役軍人を含めた高齢者に一般的である（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１３（３）：ｅ０１９３９９６、Ｅｉｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｒａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｑ．，５（４）：１３）。これらの併存状態は、臨床的には無症状であることが多いため、活性ＡＣＥ２に曝露される前に、個体がこれらの素因的状態のうちの１つを有することは明らかではない場合があり、薬物が、低血圧又は高カリウム血症などの危険な電解質異常を引き起こす可能性がある。したがって、これらの懸念は、治療及び予防の両方の場面での活性ＡＣＥ２の使用に関連する。

【0199】

実際、酵素的に活性な組換えＡＣＥ２細胞外ドメイン（Ｆｃ融合形式ではない）は、ＲＡＡＳの病理学的過剰活性化による高血圧の治療として開発されている（Ｈａｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，５２（９）：７８３－９２）。しかし、前述のように、ＲＡＡＳ阻害の生理学的効果は、制御された環境での健常なボランティアではなく、ＲＡＡＳシステムが活性である場合に最も明らかであろう。更に、ウイルスの競合阻害に必要な用量は、本治験で検討されたものよりも多い可能性がある。したがって、この治験は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防のための酵素的に活性なＡＣＥ２の安全性に関する懸念を軽減するものではない。

【0200】

ＩｇＧ Ｆｃドメインによって付与される延長された半減期は、皮下投与を可能にする。注射ごとに数百ミリグラムが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害するための十分な投薬により投与され得る。最高濃度到達時間は、静脈内投薬と比較した場合、皮下投与される生物製剤の方が長いが、これは、より大きな初期負荷用量、続いて、より少ない維持用量を投与することによって一般的に説明される。反復投薬が必要な場合は、典型的には半減期で行われるため、注射は３日ごとよりも頻繁である必要ではないであろう。製品の展開に関して、ＦＤＡに承認された皮下注射用のＦｃ融合タンパク質は、多くの場合、注射の準備ができたプレフィルドシリンジ（ｐｒｅ－ｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）で入手可能である。タンパク質薬物の皮下注射のためのプレフィルドシリンジは、典型的には、冷蔵で１２～２４ヶ月間安定であり、輸送のための冷蔵を必要としない。

【0201】

本発明は、酵素的に不活性なＡＣＥ２細胞外ドメインを含む。ＡＣＥ２に２つの点変異（Ｈ３７４Ｎ＆Ｈ３７８Ｎ）を含めることにより、その酵素活性が顕著に低下することが知られている（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３６（７０４７）：１１２－６）。重要なことに、これらの点変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への結合に影響を及ぼさない。これらの点変異を含むＡＣＥ２－ＮＮ－Ｆｃ融合タンパク質は、依然として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスによる標的細胞の感染を強力に阻害する（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２０７０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉＡＣＥ２－ＦｃのＩＣ５０は、０．１μｇ／ｍＬ未満、又は０．５ナノモル濃度未満であった。

【0202】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合体を投与することによって、コロナウイルス感染症の治療又は予防と関連するいくつかの利点がある。本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＲＡＡＳ阻害剤ではない酵素的に不活性なＡＣＥ２ドメインを用いるため、これらの副作用を誘発しない。したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、病院内の急性疾患患者にも、監視されていないコミュニティ環境での慢性状態の個体にも安全に投与される。これにより、治療剤に加えて、予防剤としての使用が可能になる。副作用のリスクが低いため、酵素的に不活性なＡＣＥ２を使用すると、より高い最高血清中濃度が許容されるようになる。より高用量のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症の競合的阻害及びＡＣＥ２の競合的阻害を改善し、同時に、より少ない頻度の投薬も可能にし（すなわち、投薬間の間隔を増加させる）、したがって、非病院環境における展開の実用性を向上させる。

【0203】

加えて、ヒトに感染することが知られている７つのコロナウイルス（ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のうち、世界的に重要な２つのウイルスを含む３つのコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＮＬ６３）がＡＣＥ２を利用することが知られている：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、２００４年の重症急性呼吸器症候群の発生に関与するウイルス、及びＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに関与するウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２６（６９６５）：４５０－５４、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ，１８１（２）：２７１－８０ ｅ８）。したがって、ＡＣＥ２が一次表面受容体（それを介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が細胞に感染する）であるため、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＣＥ２を受容体として利用する任意のコロナウイルスに結合し、将来の新型コロナウイルスを含む。対照的に、中和モノクローナル抗体、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンは、特に、広範囲にわたる治療及びワクチン接種がウイルスに進化的圧力を及ぼす場合、集団において生じる将来の新型コロナウイルス又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体バリアントに対して有効ではない可能性がある。これは、治療用中和抗体及びワクチン接種によって誘導される抗体が、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）上の規定のエピトープに結合するため、ＡＣＥ２結合を保持しながら抗体結合を回避するように変異し得るためである。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、それを必要とする対象に投与され、薬理学的に最適化された形態のＡＣＥ２自体であるため、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質への低減した結合を示す変異したＲＢＤを有するウイルスもまた、標的細胞への結合の低減及び感染性の減少を示すであろう。

【0204】

ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の不活性ＡＣＥ２細胞外ドメインは、肺内の内因性ＡＣＥ２の活性を妨げるか又はそれに影響を及ぼさないことを強調することが重要である。可溶性ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＲＤＳに対してＡＣＥ２が保護し得るＡＲＤＳの重症度に影響を及ぼさない（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５））。

【0205】

本発明によって包含される融合タンパク質は、中和抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む治療と関連する合併症を回避する。例えば、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、中和抗体がウイルス症候群における感染症及び炎症を逆説的に悪化させる現象である。ＡＤＥは、デング熱において最もよく特徴付けられ、最初の感染で生じた内因性中和抗体は、典型的には、第２の感染が抗体により部分的に中和される異なる血清型のウイルスによる場合、第２の感染でウイルス症候群が悪化する（Ｔｉｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６（１）：６９－８６、Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．，１３（６）：３８７－９８、Ｋｈａｎｄｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：５９７）。この現象は、Ｆｃγ受容体依存性である。抗体は、まず、ウイルスに結合し、次いで、免疫細胞上のＦｃγ受容体に結合し、ウイルス侵入を媒介し、免疫細胞を活性化する（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９４（５））。これにより、免疫細胞におけるウイルス複製と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６などの炎症性サイトカインの放出との両方がもたらされる（Ｂｏｏｎｎａｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８２（８）：３９３９－５１）。これらのサイトカインは、組織損傷、ショック、肺病理、及びＡＲＤＳとも関連している。

【0206】

ＨＩＶ及びエボラウイルス、並びにコロナウイルスには、ＡＤＥに関する証拠が存在する（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ，２６（２４）：３０７８－８５、Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２３２４－３０、Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（１３）：７５３９－４４、Ｃｏｒａｐｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６（１１）：６６９５－７０５、Ｈｏｈｄａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６０（１）：４９－５５、Ｖｅｎｎｅｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４（３）：１４０７－９、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，４５１（２）：２０８－１４、Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ，２５（４）：７２９－４０、Ｊａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８５（２０）：１０５８２－９７）。スパイクタンパク質のＲＢＤに結合するコロナウイルス中和抗体は、Ｆｃγ受容体の結合を介してＡＤＥを媒介し、膜融合及び感染を促進するスパイクタンパク質の立体構造変化を誘発し得る（Ｃｏｒａｐｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｈｏｈｄａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｖｅｎｎｅｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｊａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）、Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９４（５）：ｅ０２０１５－１９）、Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ，１７６（５）：１０２６－３９ ｅ１５）。

【0207】

相関する臨床データは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及びＣＯＶＩＤ－１９の両方を悪化させるＡＤＥの役割を支持する（Ｊａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）、Ｃａｏ（２０２０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０（５）：２６９－７０、Ｔｅｔｒｏ（２０２０）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．，２２（２）：７２－７３、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，６６（４）：２９１－９６、Ｂｉｃｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｍｅｄＲｘｉｖ、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｉｄ／ｃｉａａ３４４）、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）。ＩｇＧ２に同等に結合する（Ｈ１３１）ため、内因性ＩｇＧ２によって部分的に遮断され得るＦｃγＲＩＩａアレルは、保護的であった。ＩｇＧ１は、ウイルス感染によって誘発される主なＩｇＧアイソタイプである。別の言い方をすれば、Ｒ１３１ ＦｃγＲＩＩａアレルに対してホモ接合性の患者、したがって、抗ウイルスＩｇＧ抗体に結合する可能性がより高い患者は、最悪の転帰を有した。これと、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａ受容体ではなくＦｃγＲＩＩａ受容体が、インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶのＡＤＥに十分であるという知見とは、ＩｇＧ１抗体が、ＡＤＥを介して感受性の患者におけるＳＡＲＳの経過を悪化させたことを示す（Ｊｕａｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）。

【0208】

最近、武漢大学の２００人を超えるＣＯＶＩＤ－１９患者を対象とした研究では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性ＩｇＧレベルがより高い患者は、ＩｇＧレベルが低い患者よりも重篤な疾患を経験する可能性がより高いことがわかった（Ｂｉｃｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）。逆に、この研究では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性ＩｇＭレベルが高い患者は、ＩｇＭレベルが低い患者よりも重篤ではない疾患を有する可能性がより高かった。ＩｇＧは、Ｆｃγ受容体に結合することができるが、ＩｇＭは結合することができない。この研究はまた、好中球対リンパ球比が高いことが、特に高ＩｇＧレベルの患者において、重篤な疾患と相関することも見出した。好中球は、高レベルのＦｃγＲＩＩａを発現することが知られている。より高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＩｇＧレベルとより重篤な疾患との関連性は、１７０人を超える患者を含む第２の研究によって確認された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０））。これらの所見を要約すると、Ｆｃγ受容体を活性化することができるより高いレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を有することは、より重篤なＣＯＶＩＤ－１９疾患と相関し、逆に、Ｆｃγ受容体を活性化することができないより高いレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を有することは、あまり重篤ではないＣＯＶＩＤ－１９と相関する。ＦｃγＲＩＩａを発現する好中球の割合がより高いことは、特に、高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体及びより高い割合の好中球の両方を有する患者において、より悪いＣＯＶＩＤ－１９とも相関する。合わせて、これらの臨床的な相関関係は、ＡＤＥがＣＯＶＩＤ－１９の重症度に寄与している可能性を示唆し、ＣＯＶＩＤ－１９は、常に肺炎症、及び多くの場合ＡＲＤＳを特徴とする。

【0209】

ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＡＤＥのリスクを軽減するために、顕著に減弱されたＦｃγ受容体結合を有するＦｃドメインを利用する。いくつかの実施形態では、最小量のＦｃγ受容体結合を示すことが知られている２つの操作されたＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ置換（ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ）及びＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｌ２３５Ｅ置換（ＩｇＧ４－ＳＰＬＥ）を含む。例えば、ＩｇＧ４－ＳＰＬＥは、ＦｃγＲＩＩａへの結合をほとんど示さないが、ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、高濃度で最小限のＦｃγＲＩＩａ結合を示す（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２９（１０）：４５７－６６）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン断片は、ＦｃγＲＩＩａ結合を最小化するために、ＩｇＧ４－ＳＰＬＥ置換を含む。なぜなら、上述のように、これは、ＡＤＥと最も関連しているＦｃγ受容体であるからである。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲ結合が顕著に減弱された操作されたＩｇＧ Ｆｃドメインが使用される。例えば、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ点置換を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを使用することができ、Ｌ２３５Ｅ置換は、ＦｃγＲ結合を減弱させる。ＦｃγＲＩ結合は数桁減少し、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩへの結合は無視できるほどである。新生児型Ｆｃ受容体への結合が維持され、薬物動態に好ましい。したがって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｆｃγ受容体に対する親和性が低く、ＡＤＥのリスクを減少させる。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４－ＳＰＬＥの使用は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド自体からのＡＤＥのリスクを軽減するだけでなく、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、内因性免疫病理学的ＩｇＧ抗体によって媒介される進行中のＡＤＥを中断することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片、Ｐ３２９Ｇ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片、Ｎ２９７Ｄ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片、Ｎ２９７Ａ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片、並びにＮ２９７Ｑ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメイン断片から選択され得る。ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを使用して、ＡＤＥのリスクを軽減し、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが、内因性免疫病理学的ＩｇＧ抗体によって媒介される進行中のＡＤＥを中断させることを可能にすることができる。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、十分な末梢組織濃度で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤに結合するこれらの内因性抗体とうまく競合し、遮断する。これにより、Ｆｃγ受容体に結合することによってＡＤＥを促進させ得る抗体に結合するビリオンの数が減少する。

【0211】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＡＤＥの病態生理学的メカニズムを中断し、ウイルス感染の直接的な競合的阻害によって肺におけるビリオンの数を減少させることを通して、ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＡＲＤＳを予防し、その重症度を低減し、及び／又はそれを治療する。

【0212】

本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、様々なカップリング剤を使用して異種薬剤とコンジュゲートすることができ、これらに限定されないが、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を含む、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用される。例えば、炭素標識１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。

【0213】

別の態様では、本発明は、抗ウイルス薬などの治療的部分にコンジュゲートされたＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを特色とする。コンジュゲートされたＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、治療有用性に加えて、診断的又は予後的に、臨床検査手順の一部として組織におけるポリペプチドレベルを監視して、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するのに有用であり得る。検出は、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的に結合）することによって促進され得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈが挙げられる。本明細書で使用される場合、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドに関して「標識される」という用語は、検出可能な物質、例えば、放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））をＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドにカップリングすることによって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの直接標識、並びに検出可能な物質との反応性によるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの間接的標識を包含するように意図されている。

【0214】

本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドコンジュゲートを使用して、所与の生物学的応答を修飾することができる。治療的部分が古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素、又はその活性断片（例えば、アブリン、リシンＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、又はジフテリア毒素）、タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子又はインターフェロン－γ）、又は生物学的応答調整因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、又は他のサイトカイン若しくは成長因子）が含まれ得る。

【0215】

１．予防的方法
一態様では、本発明は、対象に、コロナウイルスに結合するＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を投与し、それによって、ウイルスがＡＣＥ２に結合し、細胞に侵入するのを阻害することによって、対象におけるコロナウイルス感染症を予防するための方法を提供する。予防剤の投与は、コロナウイルス感染症の特徴的な症状の兆候の前に起こり得、そのため、感染が予防されるか、又は代替的に、感染の症状が低減又は排除される。Ｆｃ断片を含む融合タンパク質の半減期が延長されるため、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、外来環境での皮下注射によって投与することができる。これにより、ＣＯＶＩＤ－１９に感染している軍人、退役軍人、又は民間人の現場又はコミュニティの環境での治療が可能になり、感染拡大の速度が低下し、入院が減少し、曝露された又はリスクのある個人の予防が可能になる。

【0216】

加えて、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの投与は、予防的に投与を受ける対象がコロナウイルスに曝露され、コロナウイルスに対する適応免疫応答を発現する場合、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減又は排除することができる。

【0217】

２．治療方法
本発明の別の態様は、本発明によって包含されるＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを投与することによって、コロナウイルスに感染した対象を治療する方法に関する。融合ポリペプチドは、コロナウイルスの内因性ＡＣＥ２への結合を競合的に阻害し、それによって、ウイルスによる細胞の更なる感染を防止する。

【0218】

本明細書で使用される場合、「薬剤」及び「治療剤」という用語は、対象に投与され得るか、又はコロナウイルスの内因性ＡＣＥ２ポリペプチドへの結合を阻害し、かつ／又はコロナウイルス感染症の抗体依存性感染増強を低減若しくは排除するために細胞培養物に適用され得るＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む任意の化合物又は組成物として広く定義される。

【0219】

本発明の治療方法は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を、表１に示されるアミノ酸配列を有するＡＣＥ２細胞外ドメインと、表２、３、若しくは４に示されるアミノ酸配列を有するヒンジポリペプチド又はシステイン－プロリン若しくはプロリンアミノ酸ヒンジと、表５に示されるアミノ酸を有するＦｃドメイン断片と、を含む本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと接触させることを含む。

【0220】

本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、コロナウイルスの内因性ＡＣＥ２への結合を競合的に阻害し、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドが細胞内へのウイルス侵入量を調節するという事実によって、細胞内におけるコロナウイルス活性の総量も調節する（すなわち、ウイルス複製）。加えて、治療濃度でＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを使用すると、ウイルスへの結合について内因的に発現された抗コロナウイルス抗体を打ち負かし、それによって、対象におけるＡＤＥを低減又は排除する。

【0221】

一実施形態では、薬剤は、コロナウイルスと内因性ＡＣＥ２又は他の結合パートナーとの相互作用を阻害又は増強する。別の実施形態では、薬剤は、コロナウイルスを隔離し、それによって、内因性抗体がウイルスに結合するのを防ぐ。内因性抗体がコロナウイルスに結合するのを低減又は排除することによって、感染の抗体依存性感染増強が低減又は排除される。

【0222】

いくつかの実施形態では、ＤＦ－ＣＯＶ化合物は、抗体及び／又はワクチンに耐性であるコロナウイルスバリアントの治療として使用される。かかるバリアントが、現在出現しつつある。公的に入手可能なデータでは、「南アフリカバリアント」は、ワクチンに対する幾分の耐性、並びにＥｌｉ Ｌｉｌｌｙのバムラニビマブに対する完全な耐性を含む、いくつかの臨床的に関連するモノクローナル抗体に対する顕著な耐性を示す。追加のデータは、これが、「ブラジルバリアント」にも存在するウイルスＳタンパク質の受容体結合ドメインにおけるＥ４８４Ｋ置換に起因することを示唆する。

【0223】

これらの方法は、インビトロで（例えば、細胞培養物を薬剤と接触させることによって、細胞培養物が、コロナウイルスに接触した時点でコロナウイルスに感染しているか、若しくはコロナウイルスに曝露されるであろう）、又は代替的に、インビボで体液を薬剤と接触させることによって（例えば、薬剤を対象に投与することによって）実施され得る。したがって、本発明は、コロナウイルスに感染している個体、又は細胞へのウイルス侵入を阻害する薬剤から恩恵を受けるであろうコロナウイルスに感染するリスクがある個体を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、コロナウイルス感染症の抗体依存性感染増強を阻害又は低減するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドを投与することを含む。

【0224】

コロナウイルス感染症を治療するための任意の特定の治療剤の有効性は、治療を受けている対象から得られた２つ以上の試料を比較することによって監視することができる。一般に、第１の試料は、療法を開始する前に対象から得られ、１つ以上の試料は治療中に得られる。かかる使用では、療法の前にコロナウイルス感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を有する対象由来の細胞のベースライン発現が決定され、次いで、コロナウイルス感染症を有する対象由来の細胞のベースライン状態の変化が、療法の過程中監視される。代替的に、治療中に得られた２つ以上の連続した試料は、治療前のベースライン試料を必要とせずに使用することができる。かかる使用では、対象から得られた第１の試料をベースラインとして使用して、ウイルス量が対象において増加又は減少しているかどうかを決定する。

【0225】

加えて、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドは、例えば、抗ウイルス剤、抗マラリア剤、抗炎症剤、鎮痛剤（例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェンなど）、及び小分子治療薬（レムデシビルを含むが、これに限定されない）と組み合わせて投与され得る。

【0226】

Ｖ．キット
本発明は、コロナウイルス感染症を治療するためのキットも包含する。本発明によって包含されるキットは、本明細書に提供されるように、開示される本発明の方法において開示される本発明のキット又はＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの使用を、開示又は記載する教材も含み得る。キットは、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の成分を含み得る。例えば、キットは、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド（例えば、シリンジ、滅菌済みバイアル、及び／又は滅菌試薬）を投与する手段を追加で含んでもよい。キットは、開示される本発明の方法での使用が認められている緩衝液及び他の試薬を追加で含み得る。非限定的な例としては、担体タンパク質又は洗剤等の非特異的結合を減少させる薬剤が挙げられる。

【実施例】

【0227】

実施例１：材料及び方法
ＤＦ－ＣＯＶコンストラクトの設計及び産生
ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、以下のように設計された。ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）のアミノ酸配列は、ユニバーサルタンパク質データベース（ＵｎｉＰｒｏｔ）から入手した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１については、完全なＡＣＥ２細胞外ドメイン（アミノ酸１８～７３０）を使用した。ＤＦ－ＣＯＶ－０２については、ＡＣＥ２細胞外ドメインのサブセット（アミノ酸１８～６１５）を使用した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の両方について、触媒ヒスチジン３７４及び３７８を変異させて（Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ）、ＡＣＥ２細胞外ドメインを酵素的に不活性にした。これらのＡＣＥ２細胞外ドメインの配列を、ＵｎｉＰｒｏｔから得られたヒトＩｇＧ４ヒンジ領域及びＦｃドメインのアミノ酸配列のアミノ末端に付加した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の両方において、ＩｇＧ４ヒンジ領域及びＦｃドメインは、ＦＡＢ－アーム交換、Ｆｃγ受容体結合、及びＣ１ｑ結合を減少させることが知られている点置換：Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３４Ｅ（以下、ＩｇＧ４－ＳＰＬＥと称する）を含む。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２に使用される正確なヒンジ領域及びＦｃドメイン配列を、以下に別々に列挙する。ＤＦ－ＣＯＶ－０１を構築するために、以下に列挙される適切なＡＣＥ２細胞外ドメインを、以下に列挙される適切なヒンジ領域のアミノ末端に直接付加した。ＤＦ－ＣＯＶ－０２を構築するために、以下に列挙される適切なＡＣＥ２細胞外ドメインを、以下に列挙される適切なヒンジ領域のアミノ末端に付加し、単一のグリシン残基を、ＡＣＥ２細胞外ドメインとヒンジ領域との間に挿入した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２をコードするヌクレオチド配列を、コンピュータによる逆転写及びコドン最適化によって得た。シグナルペプチドＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳをコードするヌクレオチド配列を、重鎖ヌクレオチド配列及び軽鎖ヌクレオチド配列の両方のすぐ５’に付加した。

【0228】

ヌクレオチド配列を合成し、ｐＬＥＶ１２３発現ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ）にクローニングし、配列をＰＣＲ増幅、続いてＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認した。次いで、ベクターをＰＣＲによって増幅し、増幅したＤＮＡを、品質評価のためにアガロースゲル上に流し、その配列を、トランスフェクションに進める前に、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって再び確認した。タンパク質の生成及び精製は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａの標準操作手順によって行った。簡潔に述べると、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、振とうフラスコ内の懸濁液中に播種し、無血清の化学的に定義された培地を使用して拡大した。トランスフェクションの日に、拡大した細胞を、新鮮な培地を有する新しいフラスコ内に播種した。発現ベクターを、ＣＨＯ細胞内に一過性にトランスフェクトした。細胞を、フェドバッチ（ｂａｔｃｈ－ｆｅｄ）培養として１４日間維持した。一時的な産生からの馴化培地を回収し、遠心分離及び濾過によって清澄化した。上清を、結合緩衝液で予め平衡化したプロテインＡカラム上に充填した。ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をゼロに測定するまで、洗浄緩衝液をカラムに通した。標的タンパク質を低ｐＨ緩衝液で溶出し、画分を収集し、各画分のＯＤ２８０値を記録した。標的タンパク質を含有する画分をプールし、０．２μｍの膜フィルターを通して濾過した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０値及び計算された吸光係数から計算した。標的タンパク質のキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）分析は、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。低エンドトキシンレベルを確認するために、発色性Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ法（Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、精製生成物の複製試料を定量化した。

【0229】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２スパイクタンパク質結合アッセイ
ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ－タンパク質）への結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３及び３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）中の５μｇ／ｍＬの組換え三量体化安定化、融合前安定化、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，参照番号４６３２８）で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用して、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（Ｇｉｂｃｏから購入し、Ｓｉｇｍａから購入した０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を補充したリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．４）中で３回洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の５％（重量／体積）のミルク中でのインキュベーションによってブロッキングした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ＰＢＳ－ＢＳＡ（０．５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中のＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の段階２倍希釈液を、ＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルに３連で添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ＰＢＳ－ＢＳＡ中で１：５０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４－０５）を、全てのウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を添加し（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム，ＫＰＬ Ｉｎｃ．）、続いて５０体積％の１Ｍ リン酸の停止溶液を添加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質へのＤＦ－ＣＯＶ結合の程度を表す４５０ｎｍでの光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して、各ウェルについて決定した。

【0230】

ＦｃγＲＩＩａ結合アッセイ
組換えヒトＦｃγＲＩＩａへのＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の結合を、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍＬの組換えヒトＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｈ１６７）タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，９５９５－ＣＤ－０５０）で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用して、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、プレートを、ＰＢＳ中の５％（重量／体積）のミルク中でのインキュベーションによってブロッキングした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ＰＢＳ－ＢＳＡ中のＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又はヒトＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，参照番号４６６７２及び番号４６６７３）の段階２倍希釈液を、ＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルに３連で添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０４２－０５）を、ＰＢＳ－ＢＳＡ中で１：５０００希釈し、全てのウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を添加し（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム，ＫＰＬ Ｉｎｃ．）、続いて５０体積％の１Ｍ リン酸の停止溶液を添加した。ＦｃγＲＩＩａへの結合の程度を表す４５０ｎｍでの光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して、各ウェルについて決定した。

【0231】

ＡＣＥ２酵素活性アッセイ
蛍光測定酵素活性アッセイによって、ＡＣＥ２酵素活性の評価を行った。ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又はヒトＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，参照番号４６６７２＆番号４６６７３）の２倍段階希釈液を、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒプレート中の０．１％ ＢＳＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．５を含む１００μＬの反応緩衝液中で希釈した。Ｍｃａ－ＹＶＡＤＡＰＫ（Ｄｎｐ）－ＯＨ蛍光発生ペプチド基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＥＳ００７）を、５０μＭの濃度で添加した。反応の進行を、３７℃で維持されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して、蛍光（励起３２２ｎｍ、発光３８１ｎｍ）によって監視した。蛍光の変化を使用して、反応速度を計算した。反応速度を使用して、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＡＣＥ２酵素活性を、野生型ＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃのものと比較した。

【0232】

偽型ウイルス中和試験
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の発現を防止するための変異と、標的細胞におけるルシフェラーゼの発現を指示するためのルシフェラーゼ遺伝子と、を含む複製欠陥ＨＩＶ－１骨格を使用して、偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を生成した。ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞を、２つのプラスミドで共トランスフェクトした：１つは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のいずれかの発現ベクターであり、もう１つは、Ｅｎｖ欠損ＨＩＶ－１ゲノムを保有する。トランスフェクションの４８時間後にウイルス粒子を含む上清を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ７０濃縮器を使用して濃縮し、－８０℃で凍結保存した。ヒトＡＣＥ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡ－ｈＡＣＥ２）で２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって、標的細胞を生成した。ＡＣＥ２でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間後に標的細胞として使用した。ヒトＡＣＥ２受容体で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対して偽ウイルスの滴定を行い、感染アッセイにおいて１秒当たり５０，０００カウント（ｃｐｓ）を生成するのに必要なウイルスの量を決定した。適切な量の偽ウイルスを、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合体の段階希釈液と室温で１時間プレインキュベートした後、ヒトＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞に添加した。偽ウイルスを含む培地を、２４時間後に新鮮な完全培地に交換した。更に２４時間後、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるルシフェラーゼの検出によって感染を定量化し、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。

【0233】

薬物動態試験
シリアハムスターを計量し、次いで、８ｍｇ／ｋｇのＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２を皮下注射した。続いて、注射後４時間、８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で、伏在静脈から５０μＬ～１００μＬの静脈血を得た。これらの伏在血液試料からの血清は、後の分析のために凍結した。血清試料中のＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液中の５μｇ／ｍＬの組換え三量体化安定化、注入前安定化、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、参照番号４６３２８）で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用して、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、プレートを、ＰＢＳ中の５％（重量／体積）のミルク中でのインキュベーションによってブロッキングした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ＰＢＳ－ＢＳＡ（０．５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中の血清試料の段階２倍希釈液を、ＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルに３回添加し、室温で３０分間インキュベートした。これを、既知の濃度のＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の試料と並行して行って、標準曲線を定義した。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ＰＢＳ－ＢＳＡ中で１：５０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４－０５）を、全てのウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を添加し（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム、ＫＰＬ Ｉｎｃ．）、続いて５０体積％の１Ｍ リン酸の停止溶液を添加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質へのＤＦ－ＣＯＶ結合の程度を表す４５０ｎｍでの光学密度を、各ウェルについて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して決定した。標準曲線の線形範囲内にある血清希釈液のＯＤ４０５を利用して、適切な希釈係数を考慮した上で、各時点でのＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の血清中濃度を計算した。

【0234】

抗体依存性感染増強アッセイ
ＦｃγＲＩＩａを発現するがＡＣＥ２を発現しない標的細胞の感染を促進する試薬の能力は、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を促進するそれらの能力のモデルとして使用することができる。複製欠陥ＨＩＶ－１ベクターが、レポーターとしてのルシフェラーゼではなく、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を含んでいたことを除いて、偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを産生し、上記のように精製した。ＡＤＥを促進する試薬の能力を評価するために、偽型ウイルスを、適切な試薬：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的中和抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，＃４０５９２－ＭＭ５７、若しくはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ａ０２０３８）、無関係なアイソタイプ対照抗体、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合体の段階希釈液と、室温で１時間インキュベートする。次いで、これを、ヒトＦｃγＲＩＩａを発現するように形質転換され、かつフローサイトメトリーによってＡＣＥ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現しないことが実証されたＪｕｒｋａｔ細胞の培養物に添加した。５％ ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベーションした後、偽ウイルスを含む培地を、新鮮な完全な培地と交換する。同じ条件下で更に２４時間インキュベーションした後、Ｃｅｌｉｇｏイメージングサイトメーターを使用して、定量的免疫蛍光顕微鏡法を使用してＧＦＰ発現を決定することによって、感染を定量化する。感染は、ＧＦＰ発現によって測定されるように、抗体依存性感染増強（抗ウイルス抗体によって媒介される、Ｆｃ受容体を発現する標的細胞へのウイルス侵入）を示す。

【0235】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的抗体によって促進されるＡＤＥを阻害するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の能力を評価するために、上記のように偽型ウイルスを産生及び精製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２ ＲＢＤ特異的抗体とＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合体のいずれかとの様々なモル比で、室温で１時間インキュベートした。上記のように、これは、ヒトＦｃγＲＩＩａを発現するように形質転換され、かつフローサイトメトリーによってＡＣＥ２を発現しないことが実証されたＪｕｒｋａｔ細胞の培養物に添加した。５％ ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベーションした後、偽ウイルスを含む培地を、新鮮な完全な培地と交換する。同じ条件下で更に２４時間インキュベーションした後、Ｃｅｌｉｇｏイメージングサイトメーターを使用して、定量的免疫蛍光顕微鏡法を使用してＧＦＰ発現を決定することによって、感染を定量化する。ＧＦＰ発現によって測定される感染は、ＡＤＥを示し、無関係なＦｃ融合体を含む条件と比較した場合、ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２を含む条件における感染の減少の程度は、ＡＤＥ阻害の測定基準として機能する。

【0236】

ＡＤＥの測定基準としてウイルス侵入を評価することに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２ ＲＢＤ特異的抗体、アイソタイプ対照抗体、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合タンパク質のいずれかとオプソニン化された偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫複合体によるＦｃγＲＩＩａ活性化を評価することができる。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、偽型ウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２ ＲＢＤ特異的抗体のオプソニン化を遮断し、ＦｃγＲＩＩａ活性化を媒介するそれらの能力について評価することもできる。ＧＦＰレポーターを発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを上記のように作製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２ ＲＢＤ特異的抗体、アイソタイプ対照抗体、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合タンパク質の段階希釈液と、室温で１時間インキュベートする。ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２がウイルスのオプソニン化及び得られたＦｃγＲＩＩａの活性化を遮断する能力を評価する実験の場合、偽ウイルスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２ ＲＢＤ特異的抗体と、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合体のいずれかとの様々なモル比で、室温で１時間インキュベートする。これらの実験条件の各々におけるＦｃγＲＩＩａ活性化は、キットの推奨プロトコルに従って実施されるＰｒｏｍｅｇａ ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ ＡＤＣＰバイオアッセイ（Ｇ９９０１）を使用して評価される。発光は、ＦｃγＲＩＩａ活性化の測定基準として機能し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して、各ウェルについて決定される。

【0237】

インビボでの有効性研究
６～８週齢の雄及び雌のハムスターを、ケタミン－キシラジン麻酔下での鼻腔内滴下によって、１００μＬの条件培地（ＵＳＡ－ＷＡ０１－２０２０株、ＢＥＩＲｅｓｏｕｒｃｅｓの３継代のＶｅｒｏ）中の１ミリリットル当たり１０３～１０５のプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で感染させた。同日、ハムスターを計量し、８ｍｇ／ｋｇのＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又はビヒクル対照として等量のＰＢＳを皮下注射した。負荷の直前に始めて３日間続く中咽頭スワブを、ウイルス輸送培地に１日１回採取した。安楽死及び剖検は、それぞれ半数の動物に対して、ウイルス力価が最も高い日及び最も重篤な肺病理を有する日である負荷後３日目及び７日目に実施した。これらの時点で、ウイルス滴定及び組織病理学のために、肺を含む複数の組織が採取される。ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞単層プラークアッセイによって決定した。６ウェルのＣｏｓｔａｒ組織培養処理プレート中で１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍＬのＥａｇｌｅＭＥＭ培地中で、Ｖｅｒｏ細胞単層を８０％コンフルエンシーまで増殖させた。ウイルス輸送培地中の試料の一連の１０倍希釈液を、９６ウェルプレートで調製し、１００μＬの各試料を、Ｖｅｒｏ細胞単層を含む別個の適切なウェルに添加した。各プレートを揺動させて接種物を均等に分配し、次いで、これらの培養物を、５％ ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で６０～９０分間インキュベートした。次いで、接種物を含む培地を除去し、単層をＰＢＳで洗浄した。等量の１０％のウシ胎仔血清を補充したＥａｇｌｅのＭＥＭ媒介物と、沸騰させ４２℃まで予冷した１％ アガロース溶液とを含むアガロースオーバーレイを、洗浄した各Ｖｅｒｏ単層上に添加し、１５分間冷却し、次いで、５％ ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で４日間インキュベートした。次いで、プレートを、同様に調製した完全なＭＥＭ培地／アガロースオーバーレイ中のニュートラルレッドの１：１０，０００希釈液で染色した。３７℃、５％ ＣＯ_２の雰囲気下、一晩インキュベートした後、プラークをカウントした。接種物の希釈液を使用して、プラークカウントを、最初の接種試料の１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）に変換した。

【0238】

実施例２：インビトロにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２へのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの結合の評価
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａによる産生）に結合するＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの能力を、インビトロで評価した。簡潔には、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質へのＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を、９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートをミルクタンパク質でブロッキングし、洗浄し、ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の段階２倍希釈液を適切なウェルに添加した。プレートを再度洗浄し、ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の結合をペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって検出した。比色ペルオキシダーゼ基質を添加した後、光学密度プレートリーダーを使用して結合を測定した。結合（光学密度）を、ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の濃度の関数としてプロットし、結合曲線を生成した（図２Ａ及び図２Ｂ）。結合は、以前に生成された野生型ＡＣＥ２－Ｆｃ融合体のものと比較することができる。非特異的Ｆｃ融合体（ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）は、陰性対照として機能し得る。

【0239】

実施例３：インビトロでのＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドの酵素活性を評価する
ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＡＣＥ２酵素活性の評価は、市販の蛍光発生ＡＣＥ２基質（Ｍｃａ－ＹＶＡＤＡＰＫ（Ｄｎｐ）－ＯＨ）を利用した蛍光測定酵素活性アッセイによって行われる。このアッセイは、以前に記載されているように行われる（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３６（７０４７）：１１２－６）。簡潔には、反応は、３７℃で０．１％のＢＳＡ、１ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２を含むＡＣＥ２酵素活性に有利なｐＨ７．５緩衝液中で行われる。蛍光の変化は、酵素活性を示し、蛍光プレートリーダーを使用して監視される。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＡＣＥ２酵素活性は、以前に産生された野生型の酵素的に活性なＡＣＥ２－Ｆｃ融合体のものと比較される。非特異的Ｆｃ融合体は、陰性対照として機能する。

【0240】

酵素活性について、反応速度（蛍光変化の導関数）を、様々な濃度のＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は対照について比較する。

【0241】

実施例４：ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、インビトロで天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスによるｉＰＳＣ（ｉＡＴ２細胞）に由来するヒト肺胞２型細胞の感染を阻害する。
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスモデルによるヒト２型肺胞細胞感染のモデルは、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した２型肺胞細胞（ＡＴ２）であるｉＡＴ２細胞を利用する。これらの細胞及び気液界面２Ｄ培養物は、以前に記載されているように調製される（Ｋｒｉｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ，ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０６．０３．１３２６３９ｖ１）。

【0242】

実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ｉＡＴ２細胞のインビトロ予防及び治療処置。
以下の２つの研究が行われる：（１）予防試験（ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染と同時に投与され、その後もｉＡＴ２培養物で維持される）、及び（２）治療試験（ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の１日後にｉＡＴ２培養物に投与され、その後もｉＡＴ２培養物で維持される）。両方の実験について、ウイルス力価は、感染後４日目の定量的ＲＴ－ＰＣＲによって定量化される。ウイルス力価は、処置なしで、１日目～４日目まで測定可能に増加する。これらの２つの研究の各々における処置は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１若しくはＤＦ－ＣＯＶ－０２又は陰性対照として利用される非特異的Ｆｃ融合体のいずれかの２倍段階希釈を含む。

【0243】

培養物中のウイルス力価を定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定し、ｉＡＴ２肺細胞の感染を、ウイルスＮタンパク質の定量的免疫蛍光顕微鏡法によって評価する。ウイルス力価データに基づいて２つの別個の中和曲線を生成し、Ｎタンパク質の発現を免疫蛍光によって定量化する。これらの曲線の各々から計算される主要なデータは、（１）本システムにおけるＤＦ－ＣＯＶウイルス中和のＩＣ５０、及び（２）ＤＦ－ＣＯＶがウイルスを完全に又はほぼ完全に中和する濃度である。

【0244】

実施例６：ＡＣＥ２を形質導入した２９３細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス感染のＤＦ－ＣＯＶ媒介性阻害
以下に詳述するように、標準的な偽ウイルス中和試験を実施して、不活性なＡＣＥ２ドメインとＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＩＩａ受容体）に結合しないＦｃドメイン断片とを含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドと、ＲＢＤ抗体及びＰＤＬ－１ Ｆｃポリペプチドとの間のウイルス中和を比較した。

【0245】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを使用して、バイオセイフティレベル（ＢＳＬ）－２条件下でのＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２による中和を評価する。ホタルルシフェラーゼを発現する複製欠陥ＨＩＶ－１骨格を使用して、偽ウイルスを生成した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を欠くウイルスを対照として生成した。偽ウイルスを使用して、ヒトＡＣＥ２（２９３Ａ／ＡＣＥ２）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させた。偽ウイルスの２倍段階希釈を、様々な濃度のＤＦ－ＣＯＶ－０１若しくはＤＦ－ＣＯＶ－０２又は対照としての非特異的Ｆｃ融合とインキュベートした。感染後、細胞をインキュベートし、回収した細胞の溶解物に対してルシフェラーゼアッセイを行って、ウイルス感染を定量化した。

【0246】

偽ウイルス感染の代理としての発光を、ＤＦ－ＣＯＶ－０１若しくはＤＦ－ＣＯＶ－０２又は関連する対照の濃度の関数としてプロットし、ウイルス中和曲線を生成した（図３）。本システムにおけるＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２ウイルス中和のＩＣ５０、及びＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２ウイルスが完全に又はほぼ完全に中和された濃度を、この曲線を使用して計算した。

【0247】

実施例７：ＤＦ－ＣＯＶのＦｃγＲＩＩａへの結合と、ＡＣＥ２－ＦｃのＩｇＧ１ Ｆｃへの結合との比較
ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃγＲＩＩａ結合を、以前に記載されているように、表面プラズモン共鳴を使用して、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する以前に作製されたＡＣＥ２－Ｆｃの結合と比較する（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２９（１０）：４５７－６６）。簡潔には、市販の組換えＨｉｓ標識ＦｃγＲＩＩａ細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、確立されたキットプロトコルを使用して、抗Ｈｉｓ捕捉抗体で予めコーティングされたＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定する。Ｂｉａｃｏｒｅ分析中、１００ｎＭの濃度のＨｉｓ標識ＦｃγＲＩＩａをＨＢＳ－Ｐ＋泳動用緩衝液に適用する。続いて、ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２又はＩｇＧ１ Ｆｃを有するＡＣＥ２－Ｆｃを１００ｎＭの濃度で股関節に適用する。会合相及び解離相は、標準プロトコルによって監視され、結合定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアによって計算され、それを利用して、ＤＦ－ＣＯＶに対するＦｃγＲＩＩａ結合及びＡＣＥ２－ＦｃとＩｇＧ Ｆｃドメインとの相対親和性を比較する。このプロトコルは、表面プラズモン共鳴の代わりにＥＬＩＳＡ分析を使用するように変更され得る。

【0248】

実施例８：ＦｃγＲＩＩａへのＤＦ－ＣＯＶ結合と、ポリクローナルヒトＩｇＧへのＡＣＥ２－Ｆｃ結合との比較
ＥＬＩＳＡによって、ＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃγＲＩＩａ結合を、ポリクローナルヒトＩｇＧと比較した。簡潔には、組換えヒトＦｃγＲＩＩａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定した。ＥＬＳＩＡプレートをブロッキングし、ＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＰＢＳ－ＢＳＡ中のＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又はポリクローナルヒトＩｇＧ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の段階希釈液を、３連で適切なウェルに適用し、室温で３０分間インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ中でＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した後、全てのウェルを、ＰＢＳ－ＢＳＡ中で１：５０００希釈されたセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートをＢｉｏＴｅｋ ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用してＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を添加し（ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム、ＫＰＬ Ｉｎｃ．）、続いて５０体積％の１Ｍ リン酸の停止溶液を添加した。ＦｃγＲＩＩａへのＤＦ－ＣＯＶ又はヒトＩｇＧ結合の程度を表す４５０ｎｍの光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを使用して、各ウェルについて決定した（図４Ａ及び図４Ｂ）。

【0249】

実施例９：ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、インビトロでＡＤＥを遮断する。
ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２がＡＤＥを遮断する能力を評価するために、インビトロでＭＥＲＳ－ＣｏＶ中和抗体によって誘導されるＡＤＥを実証した、以前に記載されているものと同様のモデルシステムが用いられる（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０））。まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する中和抗体が、インビトロでＡＤＥを促進することができるかどうかを決定する。これを達成するために、ＦｃγＲＩＩａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現する市販のＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞として使用する。Ｊｕｒｋａｔは、ヒトタンパク質アトラス（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１３０２３４－ＡＣＥ２／ｔｉｓｓｕｅ／Ｔ－ｃｅｌｌｓ）を使用したＴ細胞ＲＮＡｓｅｑデータの検索に基づいてＡＣＥ２を発現せず、したがって、これらの細胞は、ＡＤＥによって感染が媒介されない限り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスによる感染の影響を受けにくいはずである。これらの細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの存在下で培養する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現は、ウイルス侵入を示す。これらの共培養物に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合が知られている様々な濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を添加する。いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的中和抗体が、現在市販されており（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ａ０２０３８－ＳＡＲＳ＿ＣｏＶ＿２＿Ｓｐｉｋｅ＿Ｓ１＿Ａｎｔｉｂｏｄｙ＿ＨＣ２００１＿Ｈｕｍａｎ＿Ｃｈｉｍｅｒｉｃ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｃｏｖ－ｓｐｉｋｅ－４０５９２－ｍｍ５７）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するものが含まれる。これらの抗体がＦｃγＲＩＩａ媒介性ウイルス侵入を介してＡＤＥを誘導する能力を、フローサイトメトリーを使用して、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞におけるＧＦＰの蛍光を測定することによって評価する。このシステムでは、様々な市販の抗体をアッセイすることができる。ＦｃγＲＩＩａ Ｊｕｒｋａｔ細胞単独、又は抗体ではなく偽ウイルスとインキュベートしたＦｃγＲＩＩａ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、対照試料と比較する。

【0250】

これらの市販のＦｃγＲＩＩａ Ｊｕｒｋａｔ細胞の使用は、ＦｃγＲＩＩａ活性化のレポーターとして機能するように操作されているため、追加の利点を有する。免疫複合体によるＦｃγＲＩＩａクラスタリングは、これらの細胞におけるルシフェラーゼレポーターの発現を誘発する。したがって、ＧＦＰ発現を測定することによってウイルス侵入を評価することに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスと中和抗体との免疫複合体によるＦｃγＲＩＩａ活性化も測定することができる。ＦｃγＲＩＩａ Ｊｕｒｋａｔ細胞単独、又は抗体ではなく偽ウイルスとインキュベートしたＦｃγＲＩＩａ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、対照試料と比較することができる。ＦｃγＲＩＩａ依存性ウイルス侵入、免疫複合体によるＦｃγＲＩＩａ活性化、又はその両方を確実に測定することができる。このシステムを使用して、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２による処置は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する同様の既製ＡＣＥ２－Ｆｃよりも少ないＡＤＥ（ウイルス侵入及び／又はＦｃγＲＩＩａ活性化によって測定される）をもたらすことができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤに特異的な中和抗体によって誘導されるＡＤＥを遮断することができることを示す。

【0251】

偽ウイルス侵入は、フローサイトメトリーを使用して、標的細胞におけるＧＦＰ発現によって測定される。ＦｃγＲＩＩａの活性化は、プレートリーダーを使用して、ＦｃγＲＩＩａレポーターとして操作されるこれらの標的細胞の発光によって測定される。

【0252】

実施例１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のインビボモデルにおけるウイルス力価の減少、並びに肺病理の改善におけるＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の有効性の決定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を減少させるＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の能力は、ヒト疾患の多くの特徴を示すハムスター感染負荷モデルで評価される。このモデルを検証するために、ＢＳＬ－３動物施設で、約５０匹のハムスターに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内負荷した。臨床疾患は、一過性の発熱と無気力を伴い、軽度であるが、重篤な症状はない。口腔スワブは、負荷後３日目に一貫して感染性ウイルスを含み、ウイルス排出を定量化する手段を提供する。ウイルスの臓器負荷は、３日目には呼吸器で高くなるが、負荷後７日目又は２１日目には検出されない。表９は、負荷後３日目の１０匹のハムスターからの組織及び中咽頭スワブにおける力価を提供する。

【表2】

【0253】

組織病理学的評価により、負荷後３日目に中等度の重度の急性気管支間質性肺炎が発現し、感染性ウイルスが欠如しているにもかかわらず、７日目に重症化したことが明らかになった。これらの病変は非常に一貫しており、肺病変（例えば、肺線維症）の解消をより良く特徴付けるための実験が進行中である。

【0254】

６～８週齢の雄及び雌のハムスターは、ケタミン－キシラジン麻酔下での鼻腔内滴下により、１００μｌの量の１０^３～１０^５ｐｆｕのウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ０１－２０２０株の３継代のＶｅｒｏ）に感染する。ウイルス負荷の前日から動物を臨床的に注意深く監視し、体重を毎日記録し、皮下に埋め込まれたＬｉｆｅ Ｃｈｉｐ（Ｄｅｓｔｒｏｎ－Ｆｅａｒｉｎｇ）から体温を毎日２回記録し、臨床評価及びスコアリング（４ポイントスケール）を毎日２回記録する。この監視及び生理学的データは、毒性を評価するために使用される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、ハムスターにおいて無症状性であり、したがって、臨床評価及び感染からのスコアリングのみにおいて、正常からの逸脱は予想されない。

【0255】

研究結果のデータを収集するために、中咽頭スワブを、負荷の直前に始めて３日間続く中咽頭スワブを毎日１回、ウイルス輸送培地に採取する。安楽死及び剖検は、それぞれ、ウイルス力価が最も高い日及び肺病理が最も重度の日である負荷後の３日目及び７日目に、別々の実験で実施される。これらの時点で、ウイルス滴定及び組織病理学のために、肺を含む複数の組織が採取される。

【0256】

ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ウイルス負荷と同時に皮下投与され、各処置群においてＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２の用量を漸増させて３つの処置群において投与される。投与量は、他の受容体Ｆｃ融合体及び抗体に合わせて、６０％の血管外及び４０％の血管内分布を仮定して、動物の細胞外液中の特定の濃度の薬物を達成するように計算される。治療群を標的とする特定の濃度は、（１）インビトロでの偽ウイルス中和のためのＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２のＩＣ５０に相当する濃度、（２）インビトロでの偽ウイルスの完全又はほぼ完全な中和を達成するために必要な濃度に相当する濃度、及び（３）インビトロでの偽ウイルスの完全又はほぼ完全な中和を達成するために必要な濃度の数倍（例えば、２倍～１０倍）の濃度である。各処置群は、６匹の動物からなる。生理食塩水で処理した６匹の動物の対照群が、各実験でビヒクル対照として含まれる。実験は、３日目及び７日目のエンドポイントで繰り返される。３日目のエンドポイント実験を使用して、ウイルス力価に対するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の効果を評価する。７日目のエンドポイント実験は、肺病理に対するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の効果を評価する。３日目の処置群と対照群との間で、鼻甲介、中咽頭、及び肺のウイルス力価を比較する。処置群及び対照群における３日目及び７日目の肺組織病理は、委員会認定の獣医病理学者によって評価される。

【0257】

データは、変動を制御するためにｌｏｇ１０変換に供される。各実験について、６匹の動物を、上で詳述したように各処置群に無作為に割り当て（４つの群：低ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２用量、中ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２用量、高ＤＦ－ＣＯＶ－０１又はＤＦ－ＣＯＶ－０２用量、及びビヒクル対照）、各群で等分散を仮定する。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、０．１０の両側有意水準で検査を行い、Ｄｕｎｎｅｔｔのアプローチを使用して、活性薬剤の各々をビヒクル対照と比較し、検査の多重性についてｐ値を効率的に調整する。この試験は、対照とは異なる少なくとも１つの治療群を特定するのに９０％を超える検出力（ｐｏｗｅｒ）を有する。

【0258】

１日２回の臨床評価スコアは、毒性を評価することができる。スコアは、閾値化を介してバイナリ変数に変換される。１群当たり６匹のマウスでは、対照の１２％と比較して、８８％の処置動物で生じる毒性を検出するための８３％の検出力がある。このような比較は、０．１０の両側有意水準で実施されたＦｉｓｈｅｒ正確検定に基づいている。

【0259】

実施例１１：非ヒト霊長類におけるＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の毒性の評価
表１０に概説されるように、標準的な１４日間の毒性試験設計で、血液サンプリングを用いて循環薬物レベルを測定した。臨床試験において、皮下投与アームに加えて静脈内投与アームを含むオプションを維持するための安全性データを提供するために、皮下及び静脈内投与経路の両方が別々の群で利用される。

【表3】

【0260】

実施例１２：ＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりも優れた組織曝露を有する
ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の酵素活性を、野生型ＡＣＥ２細胞外ドメインを含む対応するＡＣＥ２－Ｆｃ融合体の酵素活性と比較した。結果は、一致した野生型ＡＣＥ２－Ｆｃ融合体が酵素活性を示すが、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＡＣＥ２酵素活性を示さないことを示した（図５）。

【0261】

偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を中和するＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の能力は、ルシフェラーゼ及びＧＦＰのレポーター遺伝子の両方を含むウイルス粒子を使用して、ＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞を標的として特徴付けた。ルシフェラーゼ発現（図６Ａ）及びＧＦＰ発現（図６Ｂ）の両方の結果は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２の両方が、ＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞へのウイルス侵入を阻害し、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ＤＦ－ＣＯＶ－０２よりも強力に中和することを示した。

【0262】

上記のように、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、インビトロで、ＤＦ－ＣＯＶ－０２よりも優れたウイルス中和活性を有するが、驚くべきことに、ＤＦ－ＣＯＶ－０２は、特定の実験において、インビボで、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりも優れたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する活性を有する（図７）。これは、図８の薬物動態曲線から計算したより大きな分布容積によって証明されるように、ＤＦ－ＣＯＶ－０２のより良い末梢組織浸透に起因すると考えられる。したがって、ＤＦ－ＣＯＶ－０１などの完全なＡＣＥ２細胞外ドメインを利用する大きなＡＣＥ２－Ｆｃ融合体は、いくつかの実験では、末梢組織浸透がより良好であるため、ウイルス中和が必要な組織においてより良好な薬物曝露を有する、より小さいＡＣＥ２－Ｆｃ融合体よりも劣っている。かかる組織浸透は、状況によっては、有用であり得る。

【0263】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の活性を、インビボで更に特徴付けた。これに関連して、図９Ａは、中咽頭ウイルス力価を比較し、図９Ｂは、鼻甲介ウイルス力価を比較し、図９Ｃは、肺力価を比較し、図９Ｄは、特定の日における体重を比較し、図９Ｅは、経時的な体重を比較する。ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、中咽頭力価、鼻甲介力価、及び肺力価を減少させ、また、ハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症状である体重減少から保護した。これらの実験結果と一致して、いくつかの実施形態では、ＤＦ－ＣＯＶ－０１が、好ましい構築物である。

【0264】

実施例１３：追加の構築物、ＤＦ－ＣＯＶ－０３及びＤＦ－ＣＯＶ－０４、並びにそれらの特性
追加の構築物として、ＤＦ－ＣＯＶ－０３及びＤＦ－ＣＯＶ－０４を設計し、発現させた。表７に、それらの配列が提供される。様々な構築物の例示的な描写として、図１０Ａ～図１２Ｂが提供され、ここで、図１０Ａは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１を示し、図１０Ｂは、ＤＦ－ＣＯＶ－０２を示し、図１１は、ＤＦ－ＣＯＶ－０３を示し、図１２Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質ＲＢＤに結合するＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメインを有し、完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質構造のオーバーレイを示し、図１２Ｂは、ＤＦ－ＣＯＶ－０４を示す。

【0265】

驚くべきことに、その結果は、ＤＦ－ＣＯＶ－０４のように、ＡＣＥ２及びＦｃドメインの配向を逆転させることによって、中和が改善されることを示した（図１３）。また、驚くべきことに、その結果は、図１３（及び図６）におけるインビトロでのウイルス中和の相対的効力が、ウイルスＳタンパク質への結合親和性と相関しないことを示した（図１４）。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２はいずれも、ウイルスＳタンパク質に対して同一のアビディティを有するが、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、インビトロで、ＤＦ－ＣＯＶ－０２よりも強力に中和する。ＤＦ－ＣＯＶ－０３は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりもウイルスＳタンパク質に対する結合アビディティが高いが、中和効力が低い。逆に、ＤＦ－ＣＯＶ－０４は、ＤＦ－ＣＯＶ－０２及びＤＦ－ＣＯＶ－０３よりも強力に中和するが、より低い結合親和性を有する。

【0266】

実施例１４：構築物の結合親和性、安定性、及び機能
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質に対するＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の結合親和性を、ＤＦ－ＣＯＶ化合物を固定化し、溶液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質を用いたバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）によって決定した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１及びＤＦ－ＣＯＶ－０２は、ＤＦ－ＣＯＶ－０３及びＤＦ－ＣＯＶ－０４よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対して高い親和性を有した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。

【0267】

これらの結果に基づいて、いくつかの実施形態では、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、好ましい化合物であり、少なくとも、それは、（１）（図１５Ａ及び図１５Ｂで測定されるように）化合物２及び３よりもウイルスＳ－タンパク質に対して高いアビディティを有すること、（２）他の化合物よりも疑ウイルス中和試験においてＩＣ５０が低いこと、（３）他の化合物よりもハムスターにおける血清中半減期が長いこと、及び（４）ハムスターモデルでは、他の化合物よりも、中咽頭、中咽頭、及び肺のウイルス力価を低下させ、他の化合物よりも多くの体重減少から保護するという予想外の発見に起因する。

【0268】

加えて、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の各々を、振動式メッシュネブライザーで噴霧し、次いで、マイクロ遠心チューブに回収した。固定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質への噴霧化合物の結合を、噴霧前に採取した試料の結合と比較した。結合は、抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体を介して検出された。４つ全てのＤＦ－ＣＯＶ化合物について、噴霧試料と非噴霧試料との間のＳタンパク質結合アビディティに有意差はなかった（図１６Ａ～図１６Ｄ）。

【0269】

その結果に基づいて、いくつかの実施形態では、投与経路は、ＩＶ又は吸入（噴霧）のいずれかである。図１６Ａ～図１６Ｄは、化合物が噴霧されたときに安定であることを示す（噴霧後のウイルスＳタンパク質に対するアビディティの減少はない）。その化合物は、噴霧された後に偽ウイルスを中和することができるとも考えられている。

【0270】

図１７は、ＡＣＥ２のペプチダーゼドメイン（ＰＤ）及びコレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）の両方を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であるＤＦ－ＣＯＶ－０１が、ＣＬＤが省略され、その他は同一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であるＤＦ－ＣＯＶ－０２よりも、長い半減期を有するという予想外の発見を示す。ＣＬＤの代わりにＡＣＥ２ ＰＤをＦｃドメインから分離する人工可撓性リンカーを含むＤＦ－ＣＯＶ－０３もまた、ＣＬＤ含有ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりも短い半減期を有する。ＡＣＥ２ ＰＤがＦｃドメインのＣ末端に付加され、人工可撓性リンカーによって分離されている（ＡＣＥ２ ＣＬＤを含まない）ＤＦ－ＣＯＶ－０４もまた、短い半減期を有した。

【0271】

ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ＡＣＥ２ ＣＬＤ（ＡＣＥ２のアミノ酸６１６～７４０）の膜近傍（細胞外）部分を含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である。予想外に、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ＤＦ－ＣＯＶ－０２（ＣＬＤが省略され、その他は同一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である）よりもはるかに長い血清中半減期を有することが決定された。ＤＦ－ＣＯＶ－０１はまた、ＤＦ－ＣＯＶ－０３（ＣＬＤの代わりに人工可撓性リンカーが置換されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である）及びＤＦ－ＣＯＶ－０４（ＡＣＥ２及びＦｃドメインの配向が逆転し、ＣＬＤも省略されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合体である）よりもはるかに長い血清中半減期を有した（以下の実施例を参照）。加えて、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、－０２、－０３、及び－０４の直接比較（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）では、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、肺ウイルス力価を低下させ、感染による体重減少を緩和することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する有効性をインビボで実証した唯一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であった。

【0272】

上述のように、ＤＦ－ＣＯＶ化合物間の血清中半減期の差は予想外であった。理論に縛られることなく、ＣＬＤの存在は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１における２つのＡＣＥ２ドメインの二量体化を促進し、ＡＣＥ２ドメインの相互の会合は、それらをＦｃドメインから遠ざけ、それによって、それによって、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の立体障害を低減すると考えられている。ＦｃＲｎは、ピノサイトーシスされたタンパク質が加水分解される、体内の内皮細胞及び他の細胞のリソソームに結合してシャペロンすることにより、分子を含むＦｃドメインの半減期を延長させる。このシャペロン活性は、内皮及び上皮細胞層にわたるＦｃＲｎ含有化合物の効率的なトランスサイトーシスを可能にするとも考えられている。

【0273】

低温電子顕微鏡法によって得られた完全長ＡＣＥ２の公開された構造（例えば、ＰＤＢ構造６Ｍ１８及び６Ｍ１Ｄ）は、完全長ＡＣＥ２が二量体として存在することを示す（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７：１４４４－１４４８）。対照的に、ＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）単独の以前の構造は、二量体化が検出されなかった（例えば、Ｔｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７９９６－１８００７のＣＬＤを各々欠くＰＤＢ構造１Ｒ４２、１Ｒ４Ｌ、及び２ＡＪＦ）。完全長ＡＣＥ２の二量体化は、その研究で「頸部」ドメイン（アミノ酸６１６～７２６）と称された膜近傍ＣＬＤの一部分によって媒介されることが見出された。分子種のサブセットでは、ＰＤの一部分も直接二量体化を媒介することが見出されたが、精製されたＡＣＥ２ ＰＤを用いた研究で二量体化が存在しないことは、ＣＬＤの存在が二量体化に必要であることを示すであろう。

【0274】

完全長ＡＣＥ２のこの構造は、可撓性アームと考えることができるＤＦ－ＣＯＶ－０１の２つのＡＣＥ２ドメインが、互いにある程度会合して「二量体」を形成し、そのため、ＤＦ－ＣＯＶ－０１の２つのＡＣＥ２ドメインの相互の会合が、ＤＦ－ＣＯＶ－０１ Ｆｃドメインへの近接を制限し、したがって、それらの立体障害を制限し得ると考えられることを示す。この立体障害の不在は、ＦｃＲｎの結合を促進すると考えられる。

【0275】

ＣＬＤを欠き、その他は同一のＡＣＥ２－ＦｃであるＤＦ－ＣＯＶ－０２は、一貫して、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりもはるかに短い血清中半減期を有することが見出された。ＤＦ－ＣＯＶ－０２のＡＣＥ２ドメインはＣＬＤを欠いているため、それらは互いに会合することは予想されず、自由にＤＦ－ＣＯＶ－０２のＦｃドメインの近傍で弱く会合するか、又は空間を占有し、ＦｃＲｎ結合を立体的に妨げると考えられる。

【0276】

更に、ＤＦ－ＣＯＶ－０３は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１よりもはるかに短い血清中半減期を有していた。ＤＦ－ＣＯＶ－０２と同様に、ＤＦ－ＣＯＶ－０３ではＣＬＤが省略されている。しかしながら、ＤＦ－ＣＯＶ－０２とは異なり、人工可撓性リンカーが、ＡＣＥ２ ＰＤとＦｃドメインのヒンジドメインとの間の位置に挿入されている。より可撓性のＩｇＧ１ヒンジドメインも、ＤＦ－ＣＯＶ－０３で利用される。合わせて、これにより、ＡＣＥ２ ＰＤをＦｃドメインから分離する長く柔軟なアミノ酸配列が得られる。ＰＤをＦｃドメインから分離する長く柔軟な配列が、この位置にＣＬＤを含むＤＦ－ＣＯＶ－０１によって示されるより長い半減期を付与するのに不十分であるという事実は、ＣＬＤの配列同一性が、ＡＣＥ２－Ｆｃの血清中半減期を支配する上で重要であることを強調し、これは、ＣＬＤ含有ＡＣＥ２ドメインが互いに会合する傾向があり、それらのＦｃドメインへの近接性及び立体障害を制限することに起因すると考えられる。ＤＦ－ＣＯＶ－０３のＡＣＥ２ドメインは、Ｆｃドメインに対して柔軟に配向できるようになるが、それらは依然として、自由にＦｃドメインの近傍で弱く会合するか、又は空間を占有し、したがって、ＦｃＲｎ結合を立体的に妨げる。

【0277】

ＡＣＥ２ ＰＤがＦｃドメインのＣ末端に付加され、人工可撓性リンカーによって分離されている（ＡＣＥ２ ＣＬＤを含まない）ＤＦ－ＣＯＶ－０４もまた、短い半減期を有した。

【0278】

図１８は、ＤＦ－ＣＯＶ－０１が、疾患重症度のメトリックである体重減少を制限した唯一の化合物であることを実証し、これは、日々の体重傾向によって実証されるように、ビヒクル対照群とは異なり、体重の回復を実証した。Ｇｅｉｓｓｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を用いた混合効果モデル及びＰｒｉｓｍ ｖ９ソフトウェアパッケージにおけるＳｉｄａｋの多重比較検定を利用した。図９に提示され、上記の少なくとも実施例１２で考察された実験からのデータのこの追加の分析は、ＡＣＥ２のＣＬＤを含むＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であるＤＦ－ＣＯＶ－０１が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２処置ハムスターで疾患重症度を緩和することができる唯一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であったことを更に実証する。ＣＬＤが省略され、その他は同一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合体であるＤＦ－ＣＯＶ－０２は、疾患の重症度を減弱させることができなかった。ＣＬＤの代わりにＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）をＦｃドメインから分離する人工可撓性リンカーを含むＤＦ－ＣＯＶ－０３もまた、疾患重症度を減弱させることができなかった。ＡＣＥ２ ＰＤがＦｃドメインのＣ末端に付加され、人工可撓性リンカーによって分離された（ＡＣＥ２ ＣＬＤを含まない）ＤＦ－ＣＯＶ－０４は、してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質三量体に対してＤＦ－ＣＯＶ－０１と同等の結合親和性を有するにもかかわらず、疾患の重症度を減弱させることもできなかった（図１５Ａを参照）。このデータは、ＤＦ－ＣＯＶ－０１が全身投与された場合、他のＤＦ－ＣＯＶ化合物と比較して優れた抗ウイルス活性を有することを示唆している。他のＤＦ－ＣＯＶ化合物は、異なる経路によって（例えば、吸入を介して）又はより高い用量で全身投与された場合、抗ウイルス活性を示し得る。

【0279】

図１９Ａ及び図１９Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療モデルのハムスターを治療するＤＦ－ＣＯＶ－０１の能力を示し、ここでは、１×１０^４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を負荷して１２時間後にハムスターが処置される。半数のハムスター（２０）が、腹腔内注射によって投与される単回用量の１５０ｍｇ／ｋｇのＤＦ－ＣＯＶ－０１で処置され、他の半数（２０）が、プラセボ（ＰＢＳ）の腹腔内注射で処置された。毎日、体重を記録した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１による処置は、プラセボと比較して、統計的に非常に有意な体重減少の低減をもたらし、疾患の重症度を緩和することを示した。Ｇｅｉｓｓｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を用いた混合効果モデル及びＳｉｄａｋの多重比較検定（Ｐｒｉｓｍ ｖ９ソフトウェアパッケージ）を利用した。したがって、ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、感染に対する予防を提供するのではなく、疾患を治療することが実証される。ＤＦ－ＣＯＶ－０１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症による体重減少を低減し、疾患の重症度を緩和したことを示す。

【0280】

実験では、別個の群のハムスターに、３日間毎日、同等の用量のＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、又はＤＦ－ＣＯＶ－０４が投与され、ＤＦ－ＣＯＶ－０１が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対するインビボ活性を実証した唯一の化合物であった。ＤＦ－ＣＯＶ－０４が、わずかに高いＩＣ５０を有するが、ＤＦ－ＣＯＶ－０１と同様にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質に対して高い結合親和性を有するにもかかわらず、このモデルにおいて活性を示さなかったという事実は、他のＤＦ－ＣＯＶ化合物に対するＤＦ－ＣＯＶ－０１の優位性が、その高い結合親和性と中和効力だけ、おそらくより高い半減期又は他の要因からの薬物曝露以外の要因によるものであると考えられていることを示唆する。

【0281】

実施例１５：ウイルスバリアントへの結合の評価
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の発現を防止するための変異と、標的細胞におけるルシフェラーゼの発現を指示するためのルシフェラーゼ遺伝子と、を含む複製欠陥ＨＩＶ－１骨格を使用して、偽ウイルスを生成する。ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞を２つのプラスミドで共トランスフェクトする：１つは、（ウイルスバリアントからの）偽ウイルスススパイクタンパク質の発現ベクターであり、もう１つは、Ｅｎｖ欠損ＨＩＶ－１ゲノムを保有する。トランスフェクションの４８時間後にウイルス粒子を含む上清を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ７０濃縮器を使用して濃縮し、－８０℃で凍結保存する。ヒトＡＣＥ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡ－ｈＡＣＥ２）で２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって、標的細胞を生成する。ＡＣＥ２でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間後に標的細胞として使用する。ヒトＡＣＥ２受容体で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対して偽ウイルスの滴定を行い、感染アッセイにおいて１秒当たり５０，０００カウント（ｃｐｓ）を生成するのに必要なウイルスの量を決定する。適切な量の偽ウイルスを、ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、又は無関係なＦｃ融合体の段階希釈液と室温で１時間プレインキュベートした後、ヒトＡＣＥ２を発現する２９３Ｔ細胞に添加する。偽ウイルスを含む培地を、２４時間後に新鮮な完全培地に交換する。更に２４時間後、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるルシフェラーゼの検出によって感染を定量化し、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取る。

【0282】

本明細書で実施及び記載される結合実験の場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２バリアントからの組換えＳ１タンパク質への結合を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４バイオレイヤー干渉法システムを使用して評価した。ＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、又はＤＦ－ＣＯＶ－０４を、製造元が推奨するプロトコルに従って、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に固定化した。Ｓ１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を、泳動用緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を使用して、１．２３～１００ｎＭに希釈し、９６ウェルプレートに移した。ＤＦ－ＣＯＶ ＡＣＥ２－Ｆｃ化合物が固定化されたセンサーを、希釈されたＳ１タンパク質を含むウェルに５分間浸漬して会合を測定し、次いで、泳動用緩衝液に１０分間浸漬して解離を測定した。Ｓ１タンパク質又は泳動用緩衝液に浸漬されたＤＦ－ＣＯＶ化合物を含まないセンサーからのシグナルを、参照として使用した。動態分析は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）データ分析ＨＴバージョン１２．０ソフトウェアを使用して行い、曲線を、１：１結合モードを使用して適合させた。

【0283】

ワクチン接種された患者からのモノクローナル抗体及び血清による中和からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－０２バリアントの回避が、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内の変異の結果として、ウイルスのＲＢＤへのこれらの抗体の結合の減少又は喪失に起因することが実証されている（Ｐｌａｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２１－０３７７７－９）。したがって、個々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントにおけるＳ－タンパク質内のＲＢＤ変異及び他の変異を含む、組換えＳ１タンパク質への結合の評価を使用して、ＤＦ－ＣＯＶ化合物が結合するかどうか、及びそのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを中和すると予測されるかどうかを決定することができる。かかるアプローチを使用して、アルファ（Ｂ．１．１．７）及びベータ（Ｂ．１．３５１）コロナウイルス由来の組換えＳ１タンパク質を使用することを含めて、代表的なウイルスバリアントについて結合を評価した。同様の結合評価は、様々な他のウイルスバリアントに適用することができ、例えば、他のコロナウイルスを中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性のあるもの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができるモノクローナル抗体による中和に耐性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント、コロナウイルスワクチンによって付与される免疫に耐性のあるもの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって付与される免疫に耐性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント、以前のコロナウイルス感染症によって付与される自然免疫に耐性のあるもの、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症によって付与される自然免疫に耐性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント、Ｓ－タンパク質にＥ４８４置換を保有するもの、Ｓ－タンパク質にＮ５０１置換を保有し、Ｓタンパク質にＫ４１７置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＥ４８４及びＮ５０１置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｑ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＮ５０１Ｙ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＫ４１７Ｎ置換を保有するコロナウイルス、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＥ４８４、Ｎ５０１、及びＫ４１７置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＥ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＬ４５２置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＬ４５２Ｒ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＴ４７８置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＴ４７８Ｋ置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＬ４５２及びＴ４７８置換を保有するもの、Ｓタンパク質にＬ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有するもの、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、「イギリスバリアント」、若しくはアルファバリアントとしても知られるＢ．１．１．７系統の子孫、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１、若しくは「イギリスバリアント」、若しくはアルファバリアントとしても知られるＢ．１．１．７系統であるもの、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはベータバリアントとしても知られる（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）Ｂ．１．３５１系統の子孫、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２、「南アフリカＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはベータバリアントとしても知られる（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、及びＫ４１７Ｎ置換を保有する）Ｂ．１．３５１系統であるもの、系統Ｐ．１、「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはガンマバリアントとしても知られる（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）Ｂ．１．１．２４８系統の子孫、系統Ｐ．１、「ブラジルＣＯＶＩＤ－１９バリアント」、若しくはガンマバリアントとしても知られる（Ｓタンパク質受容体結合ドメイン以外の他の置換に加えて、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ置換を保有する）Ｂ．１．１．２４８系統であるもの、Ｂ．１．６１７系統の子孫、Ｂ．１．６１７．１系統の子孫（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）、Ｂ．１．６１７．１系統であるもの（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）、デルタバリアント（受容体結合ドメイン内外の他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）としても知られるＢ．１．６１７．２系統の子孫、デルタバリアント（受容体結合ドメイン内外の他のＳタンパク質変異に加えて、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋ置換を保有する）としても知られるＢ．１．６１７．２系統であるもの、Ｂ．１．６１７．３系統の子孫（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）、及び／又はＢ．１．６１７．３系統であるもの（Ｅ４８４Ｑ置換を保有する）が含まれるが、これらに限定されない。

【0284】

図２０Ａ及び図２０Ｂは、ＤＦ－ＣＯＶ化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントへの結合特性を示す。固定化されたＤＦ－ＣＯＶ－０１、ＤＦ－ＣＯＶ－０２、ＤＦ－ＣＯＶ－０３、及びＤＦ－ＣＯＶ－０４の、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、及び親Ｂ．１系統（Ｄ６１４Ｇ）由来の可溶性組換えＳ１タンパク質への結合を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を介して評価した。Ｂ．１．３５１系統は、Ｅ４８４Ｋ置換を含み、これは、公開された研究では、バムラニビマブ（Ｌｙ－ＣｏＶ５５５）を含む、いくつかの治療用モノクローナル抗体の結合を阻害することが知られており、このバリアントをインビトロで中和することができない。同様に、ＲＥＧＮ－ＣＯＶ２カクテルにおける２つの抗体のうちの１つであるＲＥＧＮ１０９３３は、公開された研究では、Ｂ．１．３５１に対する中和効力の顕著な低下を示すことが知られている。Ｂ．１．３５１系統は、ワクチン耐性を示すことも知られている。４つ全てのＤＦ－ＣＯＶ化合物は、Ｂ．１．１．７及びＢ．１．３５１の両方の系統由来のＳ１タンパク質に強く結合した。実際、ＤＦ－ＣＯＶ化合物の各々について、バリアントＳ１タンパク質に対する結合親和性は、親Ｂ．１Ｓ１タンパク質に対するものよりも高かった。これらの結果は、ベータバリアント（Ｂ．１．３５１）が、いくつかのモノクローナル抗体に耐性であり、いくつかのワクチンに耐性を有することが知られている（これは、ウイルスＳ－タンパク質の受容体結合ドメインにおけるＥ４８４位及びＫ４１７位のアミノ酸置換によって駆動されることが知られている）ことから、重要である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ ５９３：１３０－１３５ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｂ．１．３５１はモノクローナル抗体耐性を記載し、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｃｅｌｌ １８４：２３４８－２３６１はワクチン耐性を記載する）。ワクチン接種を受けた患者由来のモノクローナル抗体及び血清に対する耐性を示す他の懸念されるバリアント（例えば、Ｐ．１バリアント）も、これらの位置にアミノ酸置換を有する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２９：７４７－７５１）。

【0285】

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書のいずれの定義も含む本出願が支配する。

【0286】

Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）のワールドワイドウェブｔｉｇｒ．ｏｒｇ及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖによって管理されているもの等の公開データベースのエントリと相関する受入番号を参照する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【0287】

等価物
当業者であれば、通常範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確定することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B-1】

【図20B-2】

【配列表】

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【国際調査報告】