特表 2023-535832 ＳＡＲＮＡとＭＲＮＡ調節剤によるＳＭＡの併用治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-21

(54)【発明の名称】ＳＡＲＮＡとＭＲＮＡ調節剤によるＳＭＡの併用治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20230814BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 31/499 20060101ALI20230814BHJP

   A61K 31/501 20060101ALI20230814BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230814BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230814BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20230814BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20230814BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P43/00 121

A61K31/7105

A61K31/7088

A61K31/7125

A61K31/499

A61K31/501

A61P25/00

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/88 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023506316

(86)(22)【出願日】2021-07-29

(85)【翻訳文提出日】2023-03-07

(86)【国際出願番号】 CN2021109146

(87)【国際公開番号】W WO2022022617

(87)【国際公開日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/106200

(32)【優先日】2020-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521339315

【氏名又は名称】ラクティゲン セラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リ， ロンチョン

(72)【発明者】

【氏名】カン， ムーリン

(72)【発明者】

【氏名】ウー， チエンチョン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA20

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZB212

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC41

4C086CB09

4C086EA16

4C086GA07

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZB21

4C086ZC75

(57)【要約】

本明細書は、（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬と、（ｂ）機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡとＳＭＮタンパク質の産生を増加するＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤の組み合わせに関連する方法と組成物、およびＳＭＡに関連する疾患または病気の治療におけるそれらの使用を提供する。ある実施の形態において、当該方法は、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を使用することで、ＳＭＡの症状を軽減することに関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の組み合わせを含む薬物組成物：
（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬、と
（ｂ）機能的ＳＭＮ２タンパク質の産生を増加する一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤（ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤）。

【請求項2】

上記のＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬中の少なくとも一つは、ｓａＲＮＡ、ｓａＲＮＡをコードする組換えベクターと小分子化合物から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

上記のＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬中の少なくとも一つはｓａＲＮＡであり、かつ上記のｓａＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、または一本鎖を含み、またはその混合物を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

上記の一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子化合物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

上記の一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤中の少なくとも一つは、ヌシネルセン、リスジプラムとブラナプラムから選ばれることを特徴とする請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

少なくとも一つのｓａＲＮＡは、下記のフラグメントと配列が少なくとも９０％同一である第１の鎖を含むことを特徴とする請求項２－３のいずれか一つに記載の組成物：
（ａ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１６３９から－１４８１までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）、
（ｂ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１０９０から－１００８までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）、
（ｃ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－９９４から－１８０までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）、または
（ｄ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１４４から－３７までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）。

【請求項7】

ｓａＲＮＡの第１の鎖は、長さ１６－３５個ヌクレオチドのＳＭＮ２遺伝子プロモーター領域のフラグメントと配列が、少なくとも７５％同一または相補であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

第１の鎖は長さが１６～３５ヌクレオチドであり、最適にアラインされた場合、その配列が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のいずれかと少なくとも７５％同一であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

上記のｓａＲＮＡの第１の鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１から選ばれるヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性または相補性を有することを特徴とする請求項６－７のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項10】

上記のｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性を有し、且つ上記のｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性を有することを特徴とする請求項６－７のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項11】

上記のｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含み、且つ上記のｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

上記のｓａＲＮＡの少なくとも一つのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項６－１１のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項13】

上記の組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリアを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

上記の少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリアは、水性キャリア、リポソーム、重合ポリマーとポリペプチドから選ばれることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

上記の組成物は、下記の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１又は１３に記載の組成物：
ａ）１－１５０ｎＭのｓａＲＮＡ、と
ｂ）１－５０ｎＭのＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤。

【請求項16】

個体に有効量の請求項１に記載の薬物組成物を投与することを特徴とする個体におけるＳＭＮ不全に関連する疾患を治療またはその発症もしくは進行を遅延する方法。

【請求項17】

上記の薬物組成物は以下を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法：
（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬、と
（ｂ）ＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性を調節することで機能的ＳＭＮ２タンパク質の産生を増加する一つまたは複数の試薬（ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤）；
ただし、上記のＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬中の少なくとも一つは、ｓａＲＮＡであり、且つ、上記の一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤中の少なくとも一つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。

【請求項18】

上記の一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤中の少なくとも一つは、ヌシネルセン、リスジプラムとブラナプラムから選ばれることを特徴とする請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

上記の個体は、ＳＭＡ疾患を有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

上記のＳＭＡを有する個体のＳＭＮ全長タンパク質の発現は、低下しまたは異常であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

少なくとも一つのｓａＲＮＡは、下記のフラグメントと配列が少なくとも９０％同一である第１の鎖を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法：
（ａ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１６３９から－１４８１までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）、
（ｂ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１０９０から－１００８までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）、
（ｃ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－９９４から－１８０までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）、または
（ｄ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１４４から－３７までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）。

【請求項22】

上記のｓａＲＮＡの第１の鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１から選ばれるヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性または相補性を有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

上記のｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性を有し、且つ上記のｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と、少なくとも７５％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２１－２２のいずれか一つに記載の方法。

【請求項24】

上記のｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含み、且つ上記のｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

上記のｓａＲＮＡの少なくとも一つのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項２１－２４のいずれか一つに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は常染色体劣性遺伝性疾患で、出生６，０００～８，０００人に約１人の割合で発生し、乳児死亡の主な遺伝的原因となっている。ＳＭＡは、染色体５ｑ１３．４上の運動神経細胞生存遺伝子（ＳＭＮ１）のテロメアコピーのホモ欠失または突然変異による運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質レベルの低下によって引き起こされる。

【0002】

ＳＭＮタンパク質は、二つのＳＭＮ遺伝子（ＳＭＮ１とＳＭＮ２）にコードされ、それらの実質的な区別は、それにコードされる配列のエクソン７のうちの一つのヌクレオチドにあり、ただし、ＳＭＮ２遺伝子におけるシトシン（Ｃ）は、チミン（Ｔ）になった（非特許文献１）。この重大な区別により、潜在的なスプライシングサイトが産生され、ＳＭＮ２遺伝子から転写された成熟なＳＭＮ ｍＲＮＡの約９０％でエクソン７のスキッピングが発生した。エクソン７欠失のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ（ＳＭＮ２Δ７）が、切断されたＳＭＮタンパク質を産生し、当該タンパク質は不安定で、かつ急速に分解される。ＳＭＡ患者には、ＳＭＮ１遺伝子が、ＳＭＮタンパク質を産生せず、かつＳＭＮ２に産生された全長ＳＭＮタンパク質の量は、失ったＳＭＮ１を補うには不十分であり、これにより、骨髄前角の運動ニューロンのアポトーシス死、骨格筋の萎縮、およびその結果としての衰弱が引き起こされる（非特許文献２）。ＳＭＡ患者の症状の重症度は、患者細胞におけるＳＭＮ２遺伝子のコピー数に依存し、コピーが多いほど症状が軽くなる（非特許文献３）。

【0003】

ＳＭＡの治療方法を開発するために、策略の一つは、スプライシング調節剤（ＳＭ）の使用で、スプライシング過程にエクソン７の包含を刺激することである。これに対して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）薬物とするＳｐｉｎｒａｚａ（登録商標）は、既に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された（非特許文献４と非特許文献５）。もう一つの薬物とするＲｉｓｄｉｐｌａｍ （ＲＧ７９１６）は、研究中の経口低分子薬であり、新薬申請（ＮＤＡ）をＦＤＡに提出されている（非特許文献６）。これら二つの薬物は、患者の生存期間を大幅に延長し、運動を改善することにより、ＳＭＡの治療に革命をもたらした。これらの改善にもかかわらず、治療を受けた患者、特に子供たちは、まだ正常な生活を送るにはほど遠い。いくつかのもっともらしい理由が、ＳＭの能力不足を説明する可能性がある。１つは天井効果であり、それが、治療によって回復される全長ＳＭＮ タンパク質の達成可能な最大レベルを制限した。ＳＭはＳＭＮ２転写に影響を与えないため、利用可能なＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの量は増加しない。ＳＭＮタンパク質を正常な生理学的レベルに戻すために、ＳＭがＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡを全長ｍＲＮＡに変換するｉｎ ｖｉｖｏ効率は、１００％に達することが最適であるが、これは現実には起こりそうにない理想的な効果である。したがって、ＳＭが患者に提供できる最大の効果は、ＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの利用可能性によって制限される。

【0004】

ＳＭＡを治療するもう一つの治療方法は、ＳＭＮ２の転写を刺激することによって、全長ＳＭＮタンパク質のレベルを増加することである。以前は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、酪酸ナトリウム、バルプロ酸）や非ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素、セレコキシブ、アルブテロール）などのさまざまなエピジェネティック修飾剤が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびマウスＳＭＡモデルでテストされたが、これらは顕著な臨床効果を示すことができなかった（非特許文献７）。それらの失敗の１つの解釈は、エピジェネティック修飾剤の標的特異性の欠如である。脊髄性筋萎縮症などのＳＭＮ不全に関連する疾患を治療するための改善された方法および組成物が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃｏｏｖｅｒｔ，Ｄ．Ｄ．ら、脊髄性筋萎縮症における生存運動ニューロンタンパク質（Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（１９９７）

【非特許文献2】Ｍｏｎａｎｉ，Ｕ．Ｒ．ら，ヒトセントロメア生存運動ニューロン遺伝子（ＳＭＮ２）は、Ｓｍｎ（－／－）マウスの胚性致死を救い、マウスの脊髄性筋萎縮症を引き起こす Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （２０００）

【非特許文献3】Ｈａｒａｄａ，Ｙ．ら，ＳＭＮ２コピー数と脊髄性筋萎縮症の臨床表現型との相関：３つのＳＭＮ２コピーは一部の患者を重症度から救わない（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＭＮ２ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：ｔｈｒｅｅ ＳＭＮ２ ｃｏｐｉｅｓ ｆａｉｌ ｔｏ ｒｅｓｃｕｅ ｓｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ（２００２）

【非特許文献4】Ｈｕａ，Ｙ．とＡ．Ｒ．Ｋｒａｉｎｅｒ．アンチセンスに媒介されるエクソンの包含．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）

【非特許文献5】Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．とＤ．Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ．２０１７年にＦＤＡによって承認されたオリゴヌクレオチド療法（ＦＤＡ－Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ２０１７）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａ（２０１７）

【非特許文献6】Ｒａｍｄａｓ，Ｓ．とＬ．Ｓｅｒｖａｉｓ．脊髄性筋萎縮症の新しい治療法：現在入手可能なデータのレビュー（Ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄａｔａ）．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏ（２０２０）

【非特許文献7】Ｌｕｎｋｅ，Ｓ．とＡ．Ｅｌ－Ｏｓｔａ．脊髄性筋萎縮症におけるエピジェネティック修飾とクロマチンリモデリングの新たな役割（Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（２００９）

【発明の概要】

【0006】

遺伝子調節配列（プロモーターをを含む）を標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）として知られるメカニズムを通じて、転写レベルで、配列特異的に標的遺伝子をアップレギュレートすることが示されている（Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．，ら、小さなｄｓＲＮＡは、ヒト細胞の転写活性化を誘導する（Ｓｍａｌｌ ｄｓＲＮＡｓ ｉｎｄｕｃｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）．ＰＮＡＳ（２００６））。このようなｄｓＲＮＡは、小さな活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と呼ばれる。参照により、その全体が本明細書に組み込まれる以前の特許公開（ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１２９０２５）は、ＳＭＮ２プロモーターを標的とする機能的ｓａＲＮＡの同定を記載し、かつ正常なヒト細胞およびＳＭＡ患者に由来する初代細胞におけるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現を誘導する活性を記載している。

【0007】

本開示の実施形態は、以下の驚くべき発見に部分的に基づいている：（ａ）細胞におけるＳＭＮ２遺伝子の発現を活性化またはアップレギュレートする一つまたは複数の小さな活性化リボ核酸（ｓａＲＮＡ）（本明細書には、「ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ」ともいう）と（ｂ）機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの産生を増加する一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤（本明細書には、「ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤」ともいう）の組み合わせが、全長ＳＭＮ２ ｍＲＮＡと全長ＳＭＮタンパク質のレベルの有意義な増加を達成することができる。この併用治療策略は、単剤療法と比較して治療効果を高めることができるため、ＳＭＡ患者などの治療結果を最大化することができる。

【0008】

一部の態様では、個体におけるＳＭＡなどのＳＭＮ不全に関連する疾患を治療するまたはその発症もしくは進行を遅延する薬物組成物を提供し、当該組成物は、以下の組み合わせを含む：（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬、および（ｂ）機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの産生を増加する一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤。

【0009】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬は、高分子および小分子を含む、そのような活性を有する任意の適切な試薬を含んでも良い。高分子の例としては、タンパク質、タンパク質複合体と糖タンパク質、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡとＰＮＡ（ペプチド核酸））がある。小分子の例としては、ペプチド、ペプチド模倣体（例えばペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機または有機金属化合物）がある。これらの薬剤のいずれも、本明細書に記載の方法によって連続または同時に組み合わせて使用することができる

【0010】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬は、少なくとも一つのｓａＲＮＡ（本明細書には、「ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ」ともいう）またはその組換えベクター、または少なくとも一つの小分子化合物である。特定な実施の形態において、ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬は、少なくとも一つのＳＭＮ２ ｓａＲＮＡである。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、または一本鎖を含み、またはそれらの混合物を含む。

【0011】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子、例えばピリダジン誘導体である。本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ヌシネルセン（Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ） （Ｓｐｉｎｒａｚａ（登録商標）、本明細書には、ＡＳＯ－１０－２７ともいう）、リスジプラム（Ｒｉｓｄｉｐｌａｍ）、リゴセルチブ（Ｒｉｇｏｓｅｒｔｉｂ）とブラナプラム（Ｂｒａｎａｐｌａｍ）から選ばれる。

【0012】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、第１の鎖を含み、それは、（ａ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１６３９から－１４８１までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）、（ｂ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１０９０から－１００８までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）、（ｃ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－９９４から－１８０までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）、または（ｄ）ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１４４から－３７まで領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）と少なくとも９０％同一である。

【0013】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの第１の鎖は、長さ１６－３５個ヌクレオチドのＳＭＮ２遺伝子プロモーター領域のフラグメントと、少なくとも７５％同一または相補である。

【0014】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ分子の第１の鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一または相補である。

【0015】

本開示のある実施の形態において、センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と、少なくとも７５％同一であり、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一である。

【0016】

本開示のある実施の形態において、センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつただし、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列を含む。

【0017】

本開示のある実施の形態において、少なくとも一つのヌクレオチドは、化学的に修飾されるヌクレオチドである。

【0018】

ある実施の形態において、本明細書に提供される組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容されるキャリア（例えば水性キャリア、リポソーム、重合ポリマーまたはポリペプチド）を含む。

【0019】

本開示のある実施の形態において、組成物は、１－１５０ｎＭのＳＭＮ２ ｓａＲＮＡと１－５０ｎＭのＡＳＯ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を含む。

【0020】

本開示のある実施の形態において、組成物は、１－１５０ｎＭのＳＭＮ２ ｓａＲＮＡと１－３０００ｎＭの小分子ピリダジン誘導体ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤（例えばリスジプラム）を含む。ある実施の形態において、組成物は、３００－２０００ｎＭリスジプラムを含む；処理前に得られたベースライン測定値若しくは未処理の細胞の集団と比較して、当該組成物は、処理された細胞中の全長ＳＭＮタンパク質の量を少なくとも１０％増加させる。さらなる実施の形態において、処理前に得られたベースライン測定値と比較して、本開示の組成物が、処理された細胞におけるＳＭＮ２Δ７の量を減少する。

【0021】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、ＤＳ０６－０００４（ＲＡＧ６－２８１ともいう）、ＤＳ０６－００３１（ＲＡＧ６－１２６６ともいう）またはＤＳ０６－００６７（ＲＡＧ６－２９３ともいう）である。

【0022】

本開示のある実施の形態は、個体におけるＳＭＮ不全に関連する疾患を治療するまたはその発症もしくは進行を遅延する方法に関し、当該方法は、個体に有効量の薬物組成物を投与することを含み、上記薬物組成物は、（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬、と（ｂ）機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの産生を増加する一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤を含む。本明細書に提供される方法のある実施の形態において、ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬はｓａＲＮＡ（本明細書には、「ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ」ともいう）またはその組換えベクター、または小分子化合物である。本明細書に提供される方法のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子化合物、例えばピリダジン誘導体である。本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ノシナゲンナトリウム（Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ） （Ｓｐｉｎｒａｚａ（登録商標）、本明細書には、ＡＳＯ－１０－２７ともいう）、リスジプラム（Ｒｉｓｄｉｐｌａｍ）、リゴセルチブ（Ｒｉｇｏｓｅｒｔｉｂ）とブラナプラム（Ｂｒａｎａｐｌａｍ）から選ばれる。

【0023】

本明細書に提供される方法のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、第１の鎖を含み、それは、ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１６３９から－１４８１までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）、ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１０９０から－１００８まで領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）、ＳＭＮ２遺伝子プロモーター－９９４から－１８０までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）またはＳＭＮ２遺伝子プロモーター－１４４から－３７までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）と少なくとも９０％同一である。

【0024】

本明細書に提供される方法のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの一つの鎖は、長さ１６－３５個ヌクレオチドのＳＭＮ２遺伝子プロモーター領域のフラグメントと、少なくとも７５％同一または相補である。

【0025】

本明細書に記載のいずれか実施の形態において、個体は、ＳＭＡ疾患を有する。さらなる実施の形態において、ＳＭＡを有する個体のＳＭＮ全長タンパク質の発現は、低下または異常である。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、ＳＭＮ２遺伝子構造、ｓａＲＮＡ標的位置とＰＣＲプライマー位置を示す。図１Ａは、ＳＭＮ２遺伝子構造およびその２ｋｂプロモーター領域を示す。ｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４、ＤＳ０６－００６７とＤＳ０６－００３１の標的サイトは、それぞれに、ＳＭＮ２ 転写開始部位（ＴＳＳ）に対して－２８１、－２９３と－１２６６の位置に示される。図１Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＳＭＮ２ＦＬ Ｆ＋ＳＭＮ２ＦＬ Ｒ，ＳＭＮΔ７ Ｆ＋ＳＭＮΔ７Ｒ）と半定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＳＭＮ－ｅｘｏｎ６－Ｆ＋ＳＭＮ－ｅｘｏｎ８－Ｒ）のＰＣＲプライマーの位置を示す。

【図2】図２は、ＳＭＮ１とＳＭＮ２遺伝子の間の差異と半定量ＲＴ－ＰＣＲ／ＤｄｅＩ消化アッセイの概略図を示す。ＳＭＮ２エクソン８のＧ→Ａバリアントは、ＤｄｅＩ制限酵素（Ａ）の認識サイトを作成する。ＰＣＲプライマーペアであるＳＭＮ－エクソン６－ＦとＳＭＮ－エクソン８－Ｒが、５０７ｂｐ産物（ＳＭＮ２ＦＬ）と４５３ｂｐ産物（ＳＭＮ２Δ７）を増幅する。ＳＭＮ１とＳＭＮ２産物を区別するために、ＤｄｅＩ消化により、ＳＭＮ２ＦＬ産物は、３９２ｂｐと１１５ｂｐのフラグメントに切断され（Ｂ）、かつＳＭＮ２Δ７産物は、３３８ｂｐと１１５ｂｐのフラグメントに切断された（Ｃ）。

【図3】図３Ａ～３Ｇは、ＧＭ０３８１３細胞における全長（ＳＭＮ２ＦＬ）およびエクソン７ スキップ（ＳＭＮ２Δ７）ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）、ＡＳＯ－１０－２７とリスジプラムの効果を示す。指定濃度のＡＳＯ－１０－２７、ｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とリスジプラムによって、ＧＭ０３８１３細胞を７２時間処理した。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。個別のＰＣＲ反応で、２対のプライマーを使用し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを確定した。図３Ａ－３Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図３Ｄは、半定量ＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２のＰＣＲ産物は、ＤｄｅＩ酵素によって消化され、かつ２％アガロースゲルにて分離された。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図３Ｅ－３Ｇは、図３ＤのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７レベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモック処理に対するＳＭＮ２ バンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、消化後ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（３９２ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、消化後ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（３３８ｂｐ）；ラダー：１００ｂｐ ＤＮＡマーカー。

【図4】図４Ａ～４Ｅは、ＧＭ００２３２細胞におけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果を示す。ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ００２３２細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットによって、処理された細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを得た後、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで確定した。図４Ａと４Ｄは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図４Ｂは、半定量ＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２のＰＣＲ産物は、ＤｄｅＩ酵素によって消化され、かつ２％アガロースゲルにて分離された。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図４Ｃと４Ｅは、図４ＢのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７レベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモック処理に対するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７バンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、消化後ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（３９２ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、消化後ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（３３８ｂｐ）、ＡＳＯ、ＡＳＯ－１０－２７。

【図5】図５Ａ～５Ｃは、Ｉ型ＳＭＡ細胞ＧＭ００２３２における全長ＳＭＮタンパク質の発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果を示す。ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ００２３２細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。処理された細胞からタンパク質を収穫し、ヒトＳＭＮタンパク質に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎロッティングアッセイにより免疫ブロットを行った。α／β－チューブリンに対する抗体もブロットして、タンパク質ローディングの対照として使用した。図５Ａは、モック処理およびＡＳＯ－１０－２７単独またはＤＳ０６－０００４との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図５Ｂは、モック処理およびＤＳ０６－０００４単独またはＡＳＯ－１０－２７との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図５Ｃは、図５Ａと５Ｂのバンド強度定量に由来するＳＭＮタンパク質レベルの相対的倍率変化を示す。値（ｙ軸）は、α／β－チューブリンのバンド強度に対して正規化したＳＭＮ タンパク質の相対バンド強度である。ＡＳＯ、ＡＳＯ－１０－２７。

【図6】図６Ａ～６Ｅは、ＧＭ０３８１３細胞におけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果を示す。ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ０３８１３細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットによって、処理された細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを得た後、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで確定した。図６Ａと６Ｄは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図６Ｂは、半定量ＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２のＰＣＲ産物は、ＤｄｅＩ酵素によって消化され、かつ２％アガロースゲルにて分離された。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図６Ｃと６Ｅは、図６ＢのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７レベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモック処理に対するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７バンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、消化後ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（３９２ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、消化後ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（３３８ｂｐ）、ＡＳＯ、ＡＳＯ－１０－２７。

【図7】図７Ａ～７Ｃは、ＩＩ型ＳＭＡ細胞ＧＭ０３８１３における全長ＳＭＮタンパク質の発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果を示す。ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ００２３２細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。処理された細胞からタンパク質を収穫し、ヒトＳＭＮタンパク質に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎロッティングアッセイにより免疫ブロットを行った。α／β－チューブリンに対する抗体もブロットして、タンパク質ローディングの対照として使用した。図７Ａは、モック処理およびＡＳＯ－１０－２７単独またはＤＳ０６－０００４との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図７Ｂは、モック処理およびＤＳ０６－０００４単独またはＡＳＯ－１０－２７との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図７Ｃは、図７Ａと７Ｂのバンド強度定量に由来するＳＭＮタンパク質レベルの相対的倍率変化を示す。値（ｙ軸）は、α／β－チューブリンのバンド強度に対して正規化したＳＭＮ タンパク質の相対バンド強度である。ＡＳＯ，ＡＳＯ－１０－２７。

【図8】図８Ａ～８Ｆは、ＧＭ００２３２細胞におけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびリスジプラムの組み合わせ効果を示す。リスジプラムとＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ００２３２細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯサンプルを、リスジプラムの担体対照として使用し、オリゴヌクレオチドの非存在下で、ｓａＲＮＡトランスフェクションの対照としてモック処理がトランスフェクトされた。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットによって、処理された細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを得た後、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで確定した。図８Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図８Ｂおよび８Ｃは、異なる濃度のＤＳ０６－０００４およびリスジプラムでコンボ処理した細胞における相対ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡレベルを示す。図８Ｄは、半定量ＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２のＰＣＲ産物は、ＤｄｅＩ酵素によって消化され、かつ２％アガロースゲルにて分離された。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図８Ｅと８Ｆは、図８ＤのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬレベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモックまたはＤＭＳＯ処理に対するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７のバンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、消化後ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（３９２ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、消化後ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（３３８ｂｐ）。

【図9】図９Ａ～９Ｂは、Ｉ型ＳＭＡ細胞ＧＭ００２３２における全長ＳＭＮタンパク質の発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびリスジプラムの組み合わせ効果を示す。リスジプラムとＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ００２３２細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯサンプルを、リスジプラムの担体対照として使用し、オリゴヌクレオチドの非存在下で、ｓａＲＮＡトランスフェクションの対照としてモック処理がトランスフェクトされた。処理された細胞からタンパク質を収穫し、ヒトＳＭＮタンパク質に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎロッティングアッセイにより免疫ブロットを行った。α／β－チューブリンに対する抗体もブロットして、タンパク質ローディングの対照として使用した。図９Ａは、ＤＭＳＯ処理およびリスジプラム単独またはＤＳ０６－０００４との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図９Ｂは、図９Ａのバンド強度定量に由来するＳＭＮタンパク質レベルの相対的倍率変化を示す。値（ｙ軸）は、α／β－チューブリンのバンド強度に対して正規化したＳＭＮ タンパク質の相対バンド強度である。

【図10】図１０Ａ～１０Ｆは、ＧＭ０３８１３細胞におけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびリスジプラムの組み合わせ効果を示す。リスジプラムとＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ０３８１３細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯサンプルを、リスジプラムの担体対照として使用し、オリゴヌクレオチドの非存在下で、ｓａＲＮＡトランスフェクションの対照としてモック処理がトランスフェクトされた。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットによって、処理された細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを得た後、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで確定した。図１０Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図１０Ｂおよび６Ｃは、異なる濃度のＤＳ０６－０００４およびリスジプラムでコンボ処理した細胞における相対ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡレベルを示す。図１０Ｄは、半定量ＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２のＰＣＲ産物は、ＤｄｅＩ酵素によって消化され、かつ２％アガロースゲルにて分離された。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図１０Ｅと１０Ｆは、図１０ＤのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬレベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモックまたはＤＭＳＯ処理に対するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７のバンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、消化後ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（３９２ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、消化後ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（３３８ｂｐ）。

【図11】図１１Ａ～１１Ｂは、ＩＩ型ＳＭＡ細胞ＧＭ０３８１３における全長ＳＭＮタンパク質の発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）およびリスジプラムの組み合わせ効果を示す。リスジプラムとＤＳ０６－０００４を個別にまたは組み合わせて、ＧＭ０３８１３細胞に指示濃度で７２時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯサンプルを、リスジプラムの担体対照として使用し、オリゴヌクレオチドの非存在下で、ｓａＲＮＡトランスフェクションの対照としてモック処理がトランスフェクトされた。処理された細胞からタンパク質を収穫し、ヒトＳＭＮタンパク質に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎロッティングアッセイにより免疫ブロットを行った。α／β－チューブリンに対する抗体もブロットして、タンパク質ローディングの対照として使用した。図１１Ａは、モック処理およびリスジプラム単独またはＤＳ０６－０００４との組み合わせで処理した細胞からのＳＭＮタンパク質発現を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの定量バンド強度に由来するＳＭＮタンパク質レベルの相対的倍率変化を示す。値（ｙ軸）は、α／β－チューブリンのバンド強度に対して正規化したＳＭＮ タンパク質の相対バンド強度である。

【図12】図１２Ａ～１２Ｅは、ＧＭ０３８１３細胞におけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡとｍＲＮＡタンパク質の発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－００３１とＤＳ０６－００６７）およびＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果を示す。ＤＳ０６－００３１またはＤＳ０６－００６７を、個別にまたはＡＳＯ－１０－２７と組み合わせて、ＧＭ０３８１３細胞に１０ｎＭで７２時間トランスフェクトした。対照処理としてのモックサンプルを、オリゴヌクレオチドの非存在下でトランスフェクトした。ｄｓＣｏｎ２は、無関係なオリゴヌクレオチド対照としてトランスフェクトされた。ＤＳ０６－３３２ｉは、ＳＭＮ２のｓｉＲＮＡであり、対照処理としてトランスフェクトされた。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットによって、処理された細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ｃＤＮＡを得た後、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲと半定量ＲＴ－ＰＣＲで確定した。処理された細胞からタンパク質を収穫し、ヒトＳＭＮタンパク質に対する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎブロッティングアッセイにより免疫ブロットを行った。α／β－チューブリンに対する抗体もブロットして、タンパク質ローディングの対照として使用した。図１２Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図１２Ｂは、半定量ＰＣＲによって確定された、かつ２％アガロースゲルにて分離されたＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。さらに、ＲＮＡローディングの対照として、ＴＢＰ遺伝子を増幅した。図１２Ｃは、図１２ＢのＰＣＲ産物バンド強度定量に由来するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡレベルを示す。値（ｙ軸）は、ＴＢＰのバンド強度に対して正規化したモック処理に対するＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７バンド強度である。ＳＭＮ２ＦＬ、ＳＭＮ２全長ＰＣＲ産物（５０７ｂｐ）；ＳＭＮΔ７、ＳＭＮエクソン７スキップＰＣＲ産物（４５３ｂｐ）。図１２Ｄは、ＳＭＮタンパク質発現のｗｅｓｔｅｒｎブロットを示す。図１２Ｅは、図１２Ｄの定量バンド強度に由来するＳＭＮタンパク質レベルの相対的倍率変化を示す。値（ｙ軸）は、α／β－チューブリンのバンド強度に対して正規化したＳＭＮ タンパク質の相対バンド強度である。

【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、ＳＭＡタイプＩＩＩマウス（ＰＮＤ７）における全長（ＳＭＮ２ＦＬ）およびエクソン７ スキップ（ＳＭＮ２Δ７）ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡおよびＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７またはリスジプラムの組み合わせ効果を示す。ＳＭＡタイプＩＩＩマウスの３つの群を次のように処理した：治療群１（ｎ＝３）－生後１日目（Ｐ１、１０μｇ）および生後３日目（Ｐ３、１０μｇ）にＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１を単独で投与する；治療群２（ｎ＝３）－ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１をＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７と組み合わせて投与する（Ｐ１、１０μｇおよびＰ３、１０μｇ）；および治療群３（ｎ＝３）－ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１およびリスジプラム（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）を指定濃度の側脳室注射（ＩＣＶ）で投与する。生理食塩水で処理されたマウスは、非処理対照とする。治療後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを逆転写に使用して、２つの組織（脳と肝臓）からＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを得、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで確定した。図１３Ａは、ＳＭＡタイプＩＩＩマウスの脳においてＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮΔ７のｍＲＮＡレベルを示す。図１３Ｂは、ＳＭＡ型ＩＩＩマウスの肝臓においてＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮΔ７のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡレベルを示す。図１３Ｃは、ＳＭＡ型ＩＩＩマウスの脊髄においてＲＴ－ｑＰＣＲによって確定されたＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮΔ７のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡレベルを示す。ＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡレベルは、Ｔｂｐ参照レベルに対して正規化した生理食塩水処理に対する３匹の動物／群（ｎ＝３～７）の平均値として示された。

【発明を実施するための形態】

【0027】

＜発明の詳細な説明＞
本発明は、ＳＭＮ２遺伝子発現を活性化／アップレギュレートし、完全長ＳＭＮ２の発現量を増加させることによって、ＳＭＮ不全に関連する疾患の治療効果を改善する方法に関する研究に基づく。

【0028】

本開示において、本発明者らはさらに、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤（例えばヌシネルセンのようなＡＳＯ）または小さなピリダジン誘導体（リスジプラムとブラナプラムを含むがこれらに限定されない）を併用し、ＳＭＡ患者細胞を治療することは、いずれかの化合物単独で達成できる量よりも有意に高いレベルの全長ＳＭＮ２ ｍＲＮＡおよびＳＭＮタンパク質を達成することができることを示す。単剤療法と比較して、この併用療法策略は、強化された治療効果、例えば、ＳＭＮ不全に関連する疾患と診断された患者の臨床症状の改善、または単剤療法に関連する望ましくない副作用の軽減、ないしＳＭＡ 患者などの患者の治療結果の最大化を提供できる。

【0029】

特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明を対象とする当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0030】

本願において、「一つ／一個」および「当該」などの単数形は、文脈において特に明確に指定されない限り、複数の指示対象を含む。

【0031】

＜定義＞
本明細書に使用されるように、用語「ＳＭＮ不全に関連する疾患」とは、何らかの原因によるＳＭＮ全長タンパク質の欠損に起因する疾患をいう。「ＳＭＮ不全に関連する疾患」は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、神経原性多発性先天性関節拘縮症（先天性ＡＭＣ）と筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むが、これらに限定されない。ＳＭＮ１（ヒト）の場合、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子リファレンスはＧｅｎｅＩＤ：６６０６である。

【0032】

「脊髄性筋萎縮症」または「ＳＭＡ」という用語は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）１～４型；近位脊髄筋萎縮；小児期発症ＳＭＡＩ型（ウェルドニッヒ－ホフマン病（Ｗｅｒｄｎｉｇ－Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｄｉｓｅａｓｅ））；ＩＩ型（中間型、慢性型）、ＩＩＩ型（クーゲルベルク・ヴェランダー病（Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ－Ｗｅｌａｎｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、または若年性脊髄性筋萎縮症）、および最近分類された成人発症型ＩＶ型を含むが、これらに限定されない。会議報告：国際ＳＭＡコンソーシアム会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＭＡ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｍｅｅｔｉｎｇ）．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．；２：４２３－４２８。用語ＳＭＡは、さらに遅発性ＳＭＡ（ＳＭＡ３型および４型、軽度ＳＭＡ、成人発症型ＳＭＡ、およびクーゲルベルク－ウェランダー病ともいう）も含む。用語ＳＭＡは、さらに、Ｘ関連疾患、呼吸窮迫を伴う脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡＲＤ）、脊髄および延髄筋萎縮症（ケネディ病、または球脊髄性筋萎縮症）、および遠位脊髄性筋萎縮症を含む他の形式のＳＭＡも含む。用語ＳＭＡは、Ａｒｎｏｌｄ，Ｗ．Ｄ．、Ｋａｓｓａｒ，Ｄ．＆Ｋｉｓｓｅｌ，Ｊ．Ｔ．の「脊髄性筋萎縮症：新しい治療時代の診断と管理（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ： Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｒａ）」Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎｅｒｖｅ（２０１５）；Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，Ｍ．Ｅ．Ｒ．の「生存運動ニューロン遺伝子におけるコピー数の変動：脊髄性筋萎縮症およびその他の神経変性疾患への影響（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（２０１６）に記載されているＳＭＡのすべての形態を含む。

【0033】

出生時または生後６か月までにＳＭＡの症状が見られる場合、その疾患はＳＭＡ１型（乳児発症またはウェルドニッヒ・ホフマン病（Ｗｅｒｄｎｉｇ－Ｈｏｆｆｍａｎｎ病）ともいう）と呼ばれる。乳児は通常、全身の筋力低下、弱い泣き声、呼吸困難を抱えている。飲み込みや吸啜が困難なことが多く、自力で座れるという発育段階には達していない。これらの乳児は、誤嚥や発育不良のリスクが高くなる。通常、これらの乳児は、ＳＭＮ２遺伝子のコピーを２つまたは３つ持つ（Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，Ｍ．Ｅ．Ｒ．の「生存運動ニューロン遺伝子におけるコピー数の変動：脊髄性筋萎縮症およびその他の神経変性疾患への影響（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（２０１６）その全体が本明細書に組み込まれる）。

【0034】

ＳＭＡが生後３か月から１５か月の間に、子供が独立して立ったり歩いたりできるようになる前に発症し、ＳＭＡ２型、または中間ＳＭＡまたはデュボウィッツ病（Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｄｉｓｅａｓｅ）と呼ばれる。ＳＭＡ２型の子供は、一般にＳＭＮ２遺伝子のコピーを３つ持つ（Ａｒｎｏｌｄ，Ｗ．Ｄ．、Ｋａｓｓａｒ，Ｄ．＆Ｋｉｓｓｅｌ，Ｊ．Ｔ．の「脊髄性筋萎縮症：新しい治療時代の診断と管理（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｒａ）」Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎｅｒｖｅ（２０１５）、その全体が本明細書に組み込まれる）。筋力低下は主に近位（体の中心に近い方）で起こり、上肢よりも下肢に多く係る。通常、顔と目の筋肉は影響を受けない。（Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，Ｍ．Ｅ．Ｒ．生存運動ニューロン遺伝子におけるコピー数の変動：脊髄性筋萎縮症およびその他の神経変性疾患への影響（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（２０１６）、その全体が本明細書に組み込まれる）。

【0035】

遅発性ＳＭＡ（ＳＭＡ３型および４型、軽度ＳＭＡ、成人発症型ＳＭＡ、およびクーゲルベルク－ウェランダー病ともいう）はさまざまなレベルの筋力低下をもたらす。３型ＳＭＡの患者は、ＳＭＮ２遺伝子のコピーを３～４つ持つ。ＳＭＡ３型（若年発症）は、ＳＭＡ全体の３０％を占める（Ａｒｎｏｌｄ，Ｗ．Ｄ．，Ｋａｓｓａｒ，Ｄ．＆Ｋｉｓｓｅｌ，Ｊ．Ｔ．脊髄性筋萎縮症：新しい治療時代の診断と管理（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｒａ）．Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎｅｒｖｅ（２０１５））。症状は通常、生後１８か月から成人期の間に現れる。影響を受けた個体は、独立した行動を達成する。ただし、これらの患者の近位筋力低下は、転倒や階段の上り下りの困難を引き起こす可能性がある。時間が経つにつれて、多くの人が立ったり歩いたりする能力を失うため、代わりに車椅子を使用して移動する。これらの患者のほとんどは、足の変形、脊柱側弯症、および呼吸筋の衰弱を発症する。

【0036】

４型ＳＭＡは遅発性であり、ＳＭＡ症例全体の５％未満を占める。これらの患者は、ＳＭＮ２遺伝子のコピーを４～８つ持つ（Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，Ｍ．Ｅ．Ｒ．生存運動ニューロン遺伝子におけるコピー数の変動：脊髄性筋萎縮症およびその他の神経変性疾患への影響（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（２０１６））。発症年齢は明確ではないが、通常３０歳以降である。４型は軽度のＳＭＡであるため、寿命は通常のままである。患者は運動のマイルストーンを達成し、生涯を通じて可動性を維持できる。

【0037】

本明細書で使用される「対象」および「個体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本開示の化合物で治療することができる任意の生物を意味する。用語「患者」は、幼児、子供、および成人を含む、人間の対象または個体を意味する。

【0038】

組成物の「治療有効量」は、所望の治療効果を達成するのに十分な量であり、したがって治癒または完全寛解を必要としない。本開示の実施の形態において、治療効果は、疾患指標のいずれかの改善であり、治療有効量は、治療を受けた個人の臨床的に重要な状態／症状の改善を引き起こすのに十分である。本明細書に使用される語句「治療有効量」と「有効量」とは、治療される個体の活動、機能および応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％低減し、最も好ましくは予防するのに十分な量を意味するために使用される。

【0039】

有効量は、対象のサイズおよび体重、疾患の種類、または本発明の特定の化合物などの要因に応じて変化しても良い。例えば、本発明の化合物の選択は、「有効量」を構成するものに影響を与える可能性がある。当業者は、過度の実験を行うことなく、本明細書に含まれる因子を研究し、本発明の化合物の有効量に関して決定することができる。

【0040】

投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を与える可能性がある。本発明の化合物は、ＳＭＮ不全に関連する疾患の発症前または発症後のいずれかに対象に投与することができる。さらに、数回に分けた用量を毎日または連続して投与してもよいし、用量をずらして投与してもよいし、用量を連続的に注入してもよいし、またはボーラス注射してもよい。さらに、本発明の化合物の投与量は、治療または予防状況の緊急性によって、比例的に増加または減少させることができる。本願の組成物を投与することができる投与量は、広い範囲内で変えることができ、もちろん、それぞれの場合の個体の需要に適合する。

【0041】

本明細書で使用される「治療」、「処理」、「治療方法」、または「療法」という用語は、医学分野で一般的に理解される意味を有し、したがって、治癒または完全な寛解を必要とせず、有益なまたは望ましい臨床結果を含む。そのような有益なまたは望ましい臨床結果の非限定的な例は、治療なしで期待される生存期間と比較して生存期間の延長、次の一つまたは複数を含む症状の軽減である：近位骨格筋の衰弱および萎縮、独立して座るまたは歩くことができない、嚥下困難、呼吸困難など。

【0042】

本明細書に使用されるように、病気を「予防する」または「遅延する」とは、病気の完全発症を阻止することを指す。

【0043】

用語「生物サンプル」とは、生物（例えば、ヒト対象）に由来する任意の組織、細胞、体液、または他の物質を指す。ある実施の形態において、生物サンプルは、血清または血液である。

【0044】

本明細書に使用されるように、用語「配列同一／配列同一性」または「配列相同／配列相同性」とは、ｓａＲＮＡの一つのオリゴヌクレオチド鎖（センスまたはアンチセンス）が、標的遺伝子プロモーター配列のテンプレート鎖またはコード鎖における領域と少なくとも８０％の類似性を有することを意味する。

【0045】

本開示の実施形態において、標的遺伝子はＳＭＮ２である。「標的配列」とは、標的遺伝子のプロモーター配列において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同または相補的である配列フラグメントを意味する。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を指し、本発明の文脈において、「標的遺伝子プロモーター配列と相補的である」とは、当該配列のコード鎖（テンプレート鎖ともいう）、すなわち、遺伝子のコード配列と同じ配列である核酸配列を指す。

【0046】

本明細書に使用されるように、用語「センス鎖」および「センスオリゴヌクレオチド鎖」は、交換可能であり、且つ小さな活性化リボ核酸（ｓａＲＮＡ）分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖は、ｓａＲＮＡの二重鎖中の標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖を含む第１の核酸鎖を指す。

【0047】

本明細書に使用されるように、用語「アンチセンス鎖」と「アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖」は、交換可能であり、且つｓａＲＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、センスオリゴヌクレオチド鎖と相補的なｓａＲＮＡの二重鎖中の第２の核酸鎖を指す。

【0048】

本明細書に使用されるように、用語「第１のオリゴヌクレオチド鎖」は、センス鎖またはアンチセンス鎖であっても良い。ｓａＲＮＡのセンス鎖とは、ｓａＲＮＡ二本鎖中の標的遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列のコード鎖と相同性を有するオリゴヌクレオチド鎖を指す。アンチセンス鎖は、ｓａＲＮＡ二本鎖中のセンス鎖と相補的なオリゴヌクレオチド鎖を指す。

【0049】

本明細書に使用されるように、用語「第２のオリゴヌクレオチド鎖」という用語はまた、センス鎖またはアンチセンス鎖であっても良い。第１のオリゴヌクレオチド鎖がセンス鎖である場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖はアンチセンス鎖である；第１のオリゴヌクレオチド鎖がアンチセンス鎖である場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖はセンス鎖である。

【0050】

本明細書に使用される用語「プロモーター」は、タンパク質をコードせず、タンパク質をコードする核酸配列またはＲＮＡをコードする核酸配列と空間的に関連することにより、それらの転写を調節する役割を果たす核酸配列を指す。通常、真核プロモーターは、１００から５，０００塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」の用語を限定することを意図しない。プロモーター配列は一般に、タンパク質コード配列またはＲＮＡコード配列の５’末端に位置するが、エクソンおよびイントロン配列にも存在する。

【0051】

本明細書に使用されるように、用語「コード鎖」は、標的遺伝子内の転写できないＤＮＡ鎖を指し、そのヌクレオチド配列は、転写によって生成されるＲＮＡの配列と同一である（ＲＮＡでは、ＤＮＡのＴはＵに置き換えられる）。本開示に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のコード鎖は、標的遺伝子のＤＮＡコード鎖と同じＤＮＡ鎖上のプロモーター配列を指す。

【0052】

本明細書に使用されるように、用語「テンプレート鎖」は、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡ鎖のもう一方の鎖を指し、それが、コード鎖に相補であり、且つそれをテンプレートとして、転写されたＲＮＡ塩基（Ａ－Ｕ、Ｇ－Ｃ）に相補するＲＮＡに転写することができる。転写過程には、ＲＮＡ ポリメラーゼは、テンプレート鎖に結合し、テンプレート鎖の３’→５’方向に沿って移動し、５’→３’方向のＲＮＡ 合成を触媒する。本開示に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のテンプレート鎖とは、標的遺伝子ＤＮＡテンプレート鎖と同一ＤＮＡ鎖に位置するプロモーター配列を指す。

【0053】

本明細書に使用されるように、用語「転写開始部位」またはＴＳＳは、遺伝子テンプレート鎖に転写の開始をマークするヌクレオチドを指す。転写開始部位は、プロモーター領域のテンプレート鎖に位置しても良い。遺伝子は、複数の転写開始部位を有しても良い。

【0054】

本明細書に使用されるように、用語「オーバーハング」は、二本鎖オリゴヌクレオチド内のいずれかの鎖を越えて伸びる他方の鎖から生じる１つまたは複数の非塩基対ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド鎖の末端（５’または３’）を指す。二本鎖の３’および／または５’末端を越えて伸びる一本鎖領域は、オーバーハングと呼ばれる。ある実施の形態において、オーバーハングの長さは０－６個ヌクレオチドである。０個ヌクレオチドのオーバーハングは、オーバーハングがないことを意味すると理解される。

【0055】

本明細書に使用されるように、用語「遺伝子活性化」、「遺伝子発現の活性化」、「遺伝子アップレギュレート」および「遺伝子発現のアップレギュレート」は互換的に使用でき、それは、遺伝子の転写レベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、クロマチン状態または構成、翻訳レベル、または細胞または生物系における活性または状態を測定することによって確定されるように、特定の核酸配列の転写、翻訳、発現または活性の増加またはアップレギュレーションを意味する。これらの活性または状態は、直接的または間接的に確定できる。さらに、「遺伝子活性化」または「遺伝子発現の活性化」は、そのような活性化のメカニズムに関係なく、核酸配列に関連する活性の増加を指す。例えば、遺伝子活性化は転写レベルで起こり、ＲＮＡへの転写を増加させ、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され、それによってタンパク質の発現が増加する。

【0056】

本明細書に使用されるように、用語「小さな活性化ＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」と「小さな活性化リボ核酸」は互換的に使用でき、標的遺伝子の発現をアップレギュレートすることができるリボ核酸分子を指す。それは、標的遺伝子の非コード核酸配列（プロモーター、エンハンサーなど）と配列相同性を有するリボヌクレオチド配列を含む第１の核酸鎖と、第１の鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む第２の核酸鎖から構成される二本鎖核酸分子であってもよい。ｓａＲＮＡはまた、分子内の２つの相補的領域によってヘアピン構造を形成することができ、合成されたまたはベクター発現された一本鎖ＲＮＡ分子から構成され得る；ただし、第１の領域は、遺伝子のプロモーターの標的配列と配列相同性を有するリボヌクレオチド配列を含み、かつ、第２の領域に含まれるリボヌクレオチド配列は第１の領域と相補的である。ｓａＲＮＡ分子の二重鎖領域の長さは、通常に約１０～約５０、約１２～約４８、約１４～約４６、約１６～約４４、約１８～約４２、約２０～約４０、約２２～約３８、約２４～約３６、約２６～約３４と約２８～約３２個塩基対であり、且つ通常に、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０個塩基対である。また、用語「小さな活性化ＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」と「小さな活性化リボ核酸」は、リボヌクレオチド以外の核酸も含み、これには修飾ヌクレオチドまたは類似体が含まれるが、これらに限定されない。

【0057】

本明細書に使用されるように、用語「合成」は、化学合成、インビトロ転写、ベクター発現など、ＲＮＡを合成または化学修飾できる任意の手段を含む、オリゴヌクレオチドが合成される方法を指す。

【0058】

＜ｓａＲＮＡとｍＲＮＡ調節剤の組み合わせの組成物＞
本開示のある実施の形態は、組成物を提供し、当該組成物は、（ａ）ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬、と（ｂ）機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの産生を増加する一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性調節剤を含む。

【0059】

患者へのこの組み合わせの投与は、ＳＭＮ不全に関連する疾患（例えば脊髄性筋萎縮症）を治療する、またはその発症を遅延する。ある実施の形態において、上記の組み合わせは、例えばＳＭＮ２の転写を活性化／アップレギュレートしつつ、エクソン７の包含のためのスプライシングを調節することで、全長ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの量を増加し、そして全長ＳＭＮタンパク質の量を増加する。ある実施の形態において、全長ＳＭＮ タンパク質は、ＳＭＮ不全に関連する疾患に関連する症状を軽減するのに十分な量まで増加する。ある実施の形態において、全長ＳＭＮタンパク質は、少なくとも１０％増加する。

【0060】

＜ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する試薬＞
ある実施の形態において、ＳＭＮ２遺伝子またはタンパク質の発現を増加する一つまたは複数の試薬の少なくとも一つは、ｓａＲＮＡである。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、ＳＭＮ２遺伝子が正常に発現される細胞において、ＳＭＮ２遺伝子の発現を活性化またはアップレギュレートする。

【0061】

典型的な実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの第１の鎖は、ＳＭＮ２遺伝子プロモーター領域の１６－３５個ヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも７５％の配列同一性または配列相補性を有するセグメントを含むことで、遺伝子の発現を活性化またはアップレギュレートすることを達成する。

【0062】

具体的に、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの第１の鎖は、ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１６３９から－１４８１までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２）、ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１０９０から－１００８までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７３）、ＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－９９４から－１８０までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７４）またはＳＭＮ２遺伝子プロモーターの－１４４から－３７までの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７５）と同一または相補性を有し、且つ少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％の同一または相補性を有する。より具体的に、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの１つの鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１から選択される任意のヌクレオチド配列と少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、または約９９％の同一性または相補性を有する。

【0063】

本開示において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、センス核酸フラグメントおよびアンチセンス核酸フラグメントを含む。センス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントは、ＲＮＡ活性化メカニズムによって細胞内でＳＭＮ２遺伝子の発現を促進する二本鎖核酸構造を形成することができる相補的領域を含む。ｓａＲＮＡのセンス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントは、２つの異なる核酸鎖上に存在してもよく、または同じ核酸鎖上に存在してもよい。センスとアンチセンス核酸フラグメントが、２つの鎖上に存在する場合、ｓａＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、長さ０～６個ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し、好ましくは、両方の鎖が長さ２または３個ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し、かつ好ましくは、オーバーハングのヌクレオチドはデオキシチミン（ｄＴ）である。ｓａＲＮＡのセンス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントは、同じ核酸鎖上に存在する場合、好ましくは、ｓａＲＮＡは一本鎖ヘアピン構造の核酸分子であり、ただし、センス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントの相補的領域は、二本鎖核酸構造を形成する。このようなｓａＲＮＡには、センス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントの長さは、１６－３５個ヌクレオチドであり、且つ、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個ヌクレオチドであっても良い。

【0064】

一つの実施の形態において、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％の同一性、または、約９９％の同一性を有し、且つそのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７５％または約９９％の同一性を有する。具体的に、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列を含み、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列からなり、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５７から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列である；本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列を含み、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列からなり、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８－３１４から選ばれるいずれかのヌクレオチド配列である。

【0065】

本開示のある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、センス核酸鎖とアンチセンス核酸鎖を含み、上記のセンス核酸鎖は、アンチセンス核酸の少なくとも一つの領域と相補する少なくとも一つの領域を含むことで、細胞内でＳＭＮ２遺伝子の発現を活性化できる二本鎖核酸構造を形成する。

【0066】

本開示のある実施の形態において、センス核酸鎖とアンチセンス核酸鎖は、二つの異なる核酸鎖にある。

【0067】

本開示のある実施の形態において、センス核酸フラグメントとアンチセンス核酸フラグメントは、同一な核酸鎖に位置し、ヘアピン一本鎖核酸分子を形成し、ただし、アンチセンス核酸フラグメントとセンス核酸の相補領域フラグメントが、二本鎖核酸構造を形成する。

【0068】

本開示のある実施の形態において、少なくとも一本の核酸鎖は、長さ０～６個ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。

【0069】

本開示のある実施の形態において、二本の核酸鎖の両方は、長さ２－３個ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。

【0070】

本開示のある実施の形態において、センスとアンチセンス核酸鎖の長さは、それぞれに、１６～３５個ヌクレオチドである。

【0071】

本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのすべてのヌクレオチドは、天然の、すなわち、化学的に修飾されていないヌクレオチドであってもよく、または少なくとも１つのヌクレオチドが化学的に修飾されたヌクレオチドであってもよく、化学修飾は、以下の修飾の１つまたは組み合わせである：
（１）ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのヌクレオチド配列におけるヌクレオチドのホスホジエステル結合に対する修飾；
（２）ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのヌクレオチド配列におけるリボースの２’－ＯＨの修飾；
（３）ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ のヌクレオチド配列の塩基に対する修飾。

【0072】

本開示のヌクレオチドまたはｓａＲＮＡの化学修飾は、当業者に周知であり、ホスホジエステル結合の修飾は、ホスホロチオエート修飾およびボロン化ホスフェート修飾を含む、ホスホジエステル結合における酸素の修飾を指す。どちらの修飾もＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ構造を安定化させ、塩基対に対する高い特異性と高い親和性を維持する。

【0073】

リボース修飾とは、ヌクレオチド ペントースの２’－ＯＨの修飾、すなわち、リボースのヒドロキシル位置への特定の置換基の導入を指し、例えば、２’－フルオロ修飾、２’－オキソメチル修飾、２’－オキシエチレンメトキシ修飾、２，４’－ジニトロフェノール修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－アミノ修飾、２’－デオキシ修飾。

【0074】

塩基修飾とは、ヌクレオチドの塩基の修飾、例えば、５’－ブロモウラシル修飾、５’－ヨードウラシル修飾、Ｎ－メチルウラシル修飾、２，６－ジアミノプリン修飾を意味する。

【0075】

これらの修飾は、ＳＭＮ２ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのバイオアベイラビリティを高め、標的配列に対する親和性を高め、細胞内のヌクレアーゼ加水分解に対する耐性を高める可能性がある。

【0076】

さらに、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡの細胞への侵入を容易にするために、核膜および核内の脂質二重層および遺伝子プロモーター領域から構成される細胞膜を介した作用を促進するように、上記の修飾に基づいて、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端にコレステロールなどの親油性基を導入することができる。

【0077】

本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、細胞と接触すると、細胞内のＳＭＮ２遺伝子の発現を好ましくは少なくとも１０％で有効的に活性化またはアップレギュレートする。

【0078】

本開示の一態様は、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む細胞を提供する。一つの実施の形態において、細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。そのような細胞は、細胞株または細胞株などのエクスビボであってもよいし、乳児、子供または成人を含むヒトなどの哺乳動物の体に存在していてもよい。

【0079】

本開示のもう一つの態様は、薬物組成物を提供し、それが、上記のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本発明の関わるＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤と、一つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアを含む。一つの実施の形態において、薬学的に許容されるキャリアは、水性キャリア、リポソーム、高分子ポリマー、およびポリペプチドのうちの１つまたは複数を含む。一つの実施の形態において、薬学的に許容されるキャリアは、水性キャリア、リポソーム、高分子ポリマー、およびポリペプチドのうちの１つまたは複数を含む。一つの実施の形態において、水性キャリアは、例えばＲＮａｓｅフリーの水、またはＲＮａｓｅフリーのバッファーである。当該組成物は、１－１５０ｎＭ、例えば１－１００ｎＭ、例えば１－５０ｎＭ、例えば１－２０ｎＭ、例えば１０－１００ｎＭ、１０－５０ｎＭ、２０－５０ｎＭ、２０－１００ｎＭ、例えば５０ｎＭの前記のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本発明に関わるＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。

【0080】

本開示のもう一つの態様は、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤と組み合わせた、本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ、本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、またはこんなＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が、細胞に発現された全長ＳＭＮタンパク質の量を増加する一つまたは複数の組成物の調製における使用を提供する。

【0081】

もう一つの態様において、本発明は、分離されたＳＭＮ２遺伝子 ｓａＲＮＡ標的サイトを提供し、それが、ＳＭＮ２遺伝子プロモーター領域に、任意の連続する１６－３５個ヌクレオチド配列、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７２－４７５から選ばれるいずれか一つの配列に任意の連続する１６－３５個ヌクレオチド配列を有する。特に、作用サイトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１のいずれかのヌクレオチド配列に示された配列を含み、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５－４７１のいずれかのヌクレオチド配列から選ばれる。

【0082】

もう一つの実施の形態は、本発明の化合物と治療性不活性キャリア、希釈剤または薬学的に許容される賦形剤を含む薬物組成物または薬物、および本発明の化合物を使用することでこんな組成物と薬物を調製する方法を提供する。ある実施の形態において、本発明のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、分けた薬物組成物にある。他の実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、同一な薬物組成物にある。

【0083】

本開示の組成物は、良好な医療行為に合致するように処方され、投薬され、投与される。これに関連して考慮すべき要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者の個体的な臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に知られているその他の要因を含む。

【0084】

本明細書に記載の小分子化合物のいずれか、例えば、リスジプラムまたはブラナプラムを含む組成物は、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ組成物とは別に、経口、局所（頬および舌下を含む）、直腸、膣、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、くも膜下腔内および硬膜外および鼻腔内、ならびに局所治療が望まれる場合には病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ組成物の場合、送達は、髄腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む非経口注入によるものであっても良い。一部の実施の形態において、本開示の組成物の投与は、任意的に、非経口注入（髄腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、脳室内、硝子体内または皮下投与を含む）、または経口投与、鼻腔内投与、吸入投与、膣投与、または直腸投与によって行って良い。

【0085】

本明細書に記載の小分子化合物、例えば、リスジプラムとブラナプラムは、例えば、錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、スプレー、坐剤、ゲル、エマルジョン、パッチなどの任意の便利な投与形態で投与することができる。そのような組成物は、医薬製剤において慣用的な成分、例えば、希釈剤、キャリア、ｐＨ調整剤、防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香味料、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、マスキング剤、酸化防止剤、およびさらなる活性剤を含んでもよい。こんな組成物はまた、さらに他の治療上価値のある物質を含むことができる。

【0086】

典型的な製剤は、本発明の化合物とキャリアまたは賦形剤とを混合することによって調製される。適切なキャリアおよび賦形剤は、当業者に周知であり、Ａｎｓｅｌ Ｈ．Ｃ．ら，《Ａｎｓｅｌの医薬品剤形および薬物送達システム》（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（２００４）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．ら，《レミントン：薬学の科学と実践》（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；およびＲｏｗｅ Ｒ．Ｃ，《医薬品添加剤のハンドブック》（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈｉｃａｇｏに詳細に記載されている。製剤は、また、薬物（すなわち、本発明の化合物またはその薬物組成物）の洗練された提示を提供するため、または薬物製品（すなわち薬物）の調製を補助するために、１つまたは複数の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、酸化防止剤、不透明剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、香料、希釈剤および他の既知の添加剤を含んでもよい。

【0087】

もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載のいずれか一つの実施の形態の組み合わせ、または本明細書に記載のいずれか一つの実施の形態の組成物が、個体におけるＳＭＮ不全に関連する疾患を治療する薬物の調製における使用を提供する。ある実施の形態の使用によって、ＳＭＮ不全に関連する疾患は、遺伝性神経筋疾患、好ましくは脊髄性筋萎縮症を含む。さらに、ある実施の形態の使用を提供し、ただし、個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。

【0088】

＜ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤＞
本明細書に使用されるように、用語「ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤」とは、機能的ＳＭＮ２ ｍＲＮＡと機能的ＳＭＮタンパク質の産生を増加させる、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡスプライシングまたは安定性の調節剤を指す。用語「ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤」は、例えば、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７のイントロン抑制スプライシング領域の効果を遮断することにより、機能的全長ＳＭＮタンパク質を作成するために必要なすべての情報が含まれるように、ＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシング方式を変える試薬を含む。ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、スプライソソームとＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの間の相互作用を安定化することによって所望のスプライシングおよびその後のタンパク質産生を増加させる試薬（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１８年１２月２７日；６１（２４）：１１０２１－１１０３６）と、ＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡとＵ１小型核内リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体によって形成される一過性二本鎖ＲＮＡ構造の安定化を促進する試薬（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２０１５ Ｊｕｌ；１１（７）：５１１－７）を含む。ある例には、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ のスプライシングを調節し、処理された転写産物にエクソン７を含ませる。また、本開示のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、スプライシング過程においてエキソン７が成熟ＳＭＮ ｍＲＮＡからスプライシングされるのを防止することによって、機能的ＳＭＮタンパク質レベルを増加させる能力を有する試薬を含む。本開示によるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、また、米国特許第１０，４３６，８０２号および米国特許第１０，４２０，７５３号に記載されているものも含み、これらの全体はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

【0089】

本開示によるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の例は、ピリダジン誘導体、例えばＷＯ２０１４０２８４５９Ａ１に記載されているものが含まれ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の具体的な例は、ブラナプラム（ＬＭＩ０７０ともいう）とリスジプラム（ＲＧ７９１６またはＲＯ７０３４０６７ともいう）を含む。

【0090】

【表1】

【0091】

本開示によるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の他の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、例えばＳＭＮ２遺伝子中のイントロン配列をアンチセンス標的、置換および／または破壊することができ、スプライシング過程においてＳＭＮ２全長（ＳＭＮ２ＦＬ）転写物（エクソン７を含む転写物）の産生を増強するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ある実施の形態において、ヌシネルセン（Ｓｐｉｎｒａｚａ（登録商標）として販売される）は、開示された組み合わせに従って使用するのに適している。

【0092】

＜ＳＭＡに関連する疾患を治療する方法＞
本発明のもう一つの態様は、個体のＳＭＮ不全に関連する疾患を治療するまたはその発症を遅延する方法に関し、当該方法は、個体へ治療有効量の本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ、本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、または本発明のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を投与することを含む。対象は、ヒトなどの哺乳動物であってもよい。対象は、幼児、子供、または成人であってもよい。一つの実施の形態において、不十分なＳＭＮ全長タンパク質発現またはＳＭＮ１遺伝子変異によって引き起こされる疾患は、例えば、ＳＭＡを含んでも良い。一つの実施の形態において、不十分なＳＭＮ全長タンパク質発現またはＳＭＮ１遺伝子変異によって引き起こされる疾患は、ＳＭＡである。一つの実施の形態において、本発明のＳＭＡは、Ｉ型ＳＭＡ、ＩＩ型ＳＭＡ、ＩＩＩ型ＳＭＡとＩＶ型ＳＭＡ含む。

【0093】

本発明の別の態様は、ＳＭＮ不全に関連する疾患を治療するまたはその発症を遅延するための薬物の調製における、本開示のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤と組み合わせた、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、または本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物の使用に関する。対象は、ヒトなどの哺乳動物であってもよい。対象は、幼児、子供、または大人であってもよい。一つの実施の形態において、ＳＭＮ不全に関連する疾患は、例えばＳＭＡを含む。一つの実施の形態において、本発明のＳＭＡは、Ｉ型ＳＭＡ、ＩＩ型ＳＭＡ、ＩＩＩ型ＳＭＡとＩＶ型ＳＭＡ含む。

【0094】

細胞中の全長ＳＭＮタンパク質の量を増加する製剤の調製における、本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤のいずれか一つの組み合わせ、または本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤いずれか一つの組み合わせの組成物の使用も提供する。ある実施の形態において、細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。ある実施の形態において、細胞はヒトに存在する。ある実施の形態において、ヒトは、ＳＭＮ不全に関連する疾患に引かれる症状を有する患者である。ある実施の形態において、組み合わせまたはその組成物は、ＳＭＮ不全に関連する疾患を効果的に治療する量で投与される。ある実施の形態において、ＳＭＮ不全に関連する疾患に引かれる症状は、遺伝性神経筋疾患、好ましくは脊髄性筋萎縮症に関連するものである。

【0095】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、全長ＳＭＮタンパク質の増加を達成し、それは、毒性または望ましくない副作用が減少した状態で、個別に使用されるいずれかの物質の同量の投与によって達成される量よりも多い。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、全長ＳＭＮタンパク質の増加を達成し、それは、個別に使用されるいずれかの物質の同量による治療の相加効果よりも大きい。ある実施の形態において、本明細書に記載の組み合わせの実施の形態に使用される場合、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたはＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、従来の治療で使用される量よりも少ない量で投与される。

【0096】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせの効果は、同量のいずれかの物質を個別に使用した場合の効果と比較して、より大きな臨床的改善を達成した。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせの効果は、同量のいずれかの物質を個別に使用した場合の効果と比較して、相加的な臨床的改善よりも大きな効果を達成した。

【0097】

本開示は、さらに細胞中の全長ＳＭＮタンパク質の量を増加する方法に関し、細胞へ、１）ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤と２）本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ、本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、または本明細書に記載のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたはＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物の少なくとも一つを組み合わせて投与することを含む。

【0098】

本明細書に提供される任意の実施の形態において、こんなＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、またはこんなＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたは本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を、直接に細胞に導入しても良く、またはＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を細胞に導入した後に細胞内でそれらを産生しても良く、上記細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。そのような細胞は、細胞株などのエクスビボであってもよいし、ヒトなどの哺乳動物の体内に存在していてもよい。一部の実施の形態において、ヒトは、ＳＭＮ不全に関連する疾患を有する患者または個体である。ある実施の形態において、本発明のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸、または上記のｓａＲＮＡまたはＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをコードする核酸を含む組成物は、少なくとも一つのＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を含む組成物と、単独にもＳＭＮ不全に関連する疾患の治療に影響することに十分な量で組み合わせて投与される。一つの実施の形態において、ＳＭＮ不全に関連する疾患は、ＳＭＡである。一つの実施の形態において、本開示のＳＭＡは、Ｉ型ＳＭＡ、ＩＩ型ＳＭＡ、ＩＩＩ型ＳＭＡとＩＶ型ＳＭＡ含む。

【0099】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、全長ＳＭＮタンパク質の増加を達成し、それは、個別に使用されるいずれかの物質の同量の投与によって達成される量よりも多い。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、単剤療法による治療と比較して、毒性が軽減され、および／または望ましくない副作用が軽減される。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、全長ＳＭＮタンパク質の増加を達成し、それは、個別に使用されるいずれかの物質の同量による治療の相加効果よりも大きい。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡまたはＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤のいずれか、または両方が、従来の単剤療法治療に使用される量よりも少ない量で投与される。

【0100】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、同量のいずれかの物質を個別に使用した場合の効果と比較して、より大きな臨床的改善を達成する。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、同量のいずれかの物質を個別に使用した場合の効果と比較して、より大きな追加的な臨床的改善を達成する。

【0101】

ある実施の形態において、ベースライン測定値は、本明細書に記載の治療を施す前に個体から得られた、本明細書に定義されている生物サンプルから得られる。ある実施の形態において、生物サンプルは、末梢血単核細胞、血漿、血清、皮膚組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。ある実施の形態において、末梢血単核細胞と皮膚のＳＭＮタンパク質レベルの増加は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンのレベルの増加と相関しており、血中または皮膚中のこれらのレベルの変化は、ＣＮＳのＳＭＮタンパク質レベルの変化を確定するための非侵襲的な代用として使用できることを示している。他の実施の形態において、ベースライン測定値と比較して、本明細書に提供される組み合わせは、全長ＳＭＮタンパク質の量を、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２１５％、少なくとも２２０％、少なくとも２２５％、少なくとも２３０％、少なくとも２３５％、少なくとも２４０％、少なくとも２４５％、少なくとも２５０％、少なくとも２５５％、少なくとも２６０％、少なくとも２６５％、少なくとも２７０％、少なくとも２７５％、少なくとも２８０％、少なくとも２８５％、少なくとも２９０％、少なくとも２９５％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３１５％、少なくとも３２０％、少なくとも３２５％、少なくとも３３０％、少なくとも３３５％、少なくとも３４０％、少なくとも３４５％、少なくとも３５０％、少なくとも３５５％、少なくとも３６０％、少なくとも３６５％、少なくとも３７０％、少なくとも３７５％、少なくとも３８０％、少なくとも３８５％、少なくとも３９０％、少なくとも３９５％、少なくとも４００％増加させる。

【0102】

本開示の文脈において、一つまたは複数のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡと一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の「組み合わせ投与」は、同時（すなわち、１５分以内、３０分以内、または１時間以内）、ほぼ同時（すなわち、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１０時間以内、または１２時間以内、２４時間以内）、或いは数日または数週間、例えば最大４週間または５週間遅延することができる。

【0103】

本開示の文脈において、一つまたは複数のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡを含む組成物と、一つまたは複数のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を含む組成物の「組み合わせ投与」は、同時または相同時間に（すなわち、１５分以内、３０分以内、１時間以内）、ほぼ同時またはほぼ相同時間に（すなわち、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内）、または数日または数週間、例えば最大４週間または５週間遅れて投与することができる。

【0104】

本開示の組成物を投与することができる投与量は、広い範囲内で変えることができ、もちろん、それぞれの場合の個々の要件に適合する。

【0105】

特定な実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤の組み合わせは、ＳＭＮ１遺伝子の不活化突然変異または欠失によって引き起こされる、および／またはＳＭＮ１遺伝子機能の喪失または欠陥に関連する疾患の治療、予防、進行の遅延および／または改善において、相加効果よりも大きい効果または相乗効果を示し、さらに疾患の病態生理学に関与する細胞の保護、特に脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療、予防、進行の遅延および／または改善を示す。

【0106】

ある実施の形態において、本開示による医薬組成物の初回用量は、対象が生後１週間未満、生後１ヶ月未満、生後３ヶ月未満、生後６ヶ月未満、１歳未満、２歳未満、１５歳未満、または１５歳以上のときに投与される。

【0107】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡを含む少なくとも一つの薬物組成物と、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を含む少なくとも一つの薬物組成物は、同時に、ほぼ同時にまたは異なる時間に組み合わせて投与される。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤を含む薬物組成物と、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡを含む薬物組成物は、互いに１時間以内、互いに２時間以内、互いに３時間以内、互いに４時間以内、互いに５時間以内、互いに６時間以内、互いに７時間以内、互いに７時間以内、互いに８時間以内、互いに９時間以内、互いに１０時間以内、互いに１１時間以内、互いに１２時間以内、互いに１日以内、互いに２日以内、互いに３日以内、互いに４日以内、互いに５日以内、互いに６日以内、互いに１週間以内、互いに２週間以内、互いに３週間以内、互いに４週間以内、または互いに５週間以内に同時投与される。単回用量はＳＭＮ２ ｓａＲＮＡのものであっても良く、かつ、単回０．１～１５ミリグラム用量、単回１ミリグラム用量、単回２ミリグラム用量、単回３ミリグラム用量、単回４ミリグラム用量、単回５ミリグラム用量、単回６ミリグラム用量、ｓｉｎｇｌｅ７ミリグラム用量、単回８ミリグラム用量、単回９ミリグラム用量、単回１０ミリグラム用量、単回１１ミリグラム用量、単回１２ミリグラム用量、単回１３ミリグラム用量、単回１４ミリグラム用量、または単回１５ミリグラム用量であってもよい。単回用量はＳＭＮ２ ｓａＲＮＡ調節剤のものであっても良く、かつ、単回０．１～１５ミリグラム用量、単回１ミリグラム用量、単回２ミリグラム用量、単回３ミリグラム用量、単回４ミリグラム用量、単回５ミリグラム用量、単回６ミリグラム用量、ｓｉｎｇｌｅ７ミリグラム用量、単回８ミリグラム用量、単回９ミリグラム用量、単回１０ミリグラム用量、単回１１ミリグラム用量、単回１２ミリグラム用量、単回１３ミリグラム用量、単回１４ミリグラム用量、または単回１５ミリグラム用量であってもよい。

【0108】

ある実施の形態において、単回４．８ミリグラム用量のＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ＡＳＯであり、かつ腰椎穿刺による髄腔内注射として投与される。ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ヌシネルセンである。ある実施の形態において、単回５．１６ミリグラム用量、単回５．４０ミリグラム用量、単回７．２ミリグラム用量、単回７．７４ミリグラム用量、単回８．１０ミリグラム用量、単回９．６ミリグラム用量、単回１０．３２ミリグラム用量、単回１０．８０ミリグラム用量、単回１１．３０ミリグラム用量、単回１２ミリグラム用量、単回１２．８８ミリグラム用量、単回１３．５ミリグラム用量、単回１４．１３ミリグラム用量、単回１０ミリグラム用量、単回１１ミリグラム用量、単回１２ミリグラム用量、単回１３ミリグラム用量、単回１４ミリグラム用量、単回１５ミリグラム用量、単回１６ミリグラム用量、単回１７ミリグラム用量、単回１８ミリグラム用量、単回１９ミリグラム用量または単回２０ミリグラム用量であっても良い。

【0109】

ある実施の形態において、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡおよび／またはＳＭＮ２ ｍＲＮＡの用量が腰椎穿刺による髄腔内注射として投与される場合、より小さなゲージの針を使用し、腰椎穿刺に関連する一つまたは複数の症状を軽減または改善できる。ある実施の形態において、腰椎穿刺に関連する症状は、腰椎穿刺後症候群、頭痛、背中の痛み、発熱、便秘、吐き気、嘔吐、および穿刺部位の痛みを含むが、これらに限定されない。ある実施の形態において、腰椎穿刺に２４または２５ゲージの針を使用すると、一つまたは複数の腰椎穿刺後の症状が軽減または改善される。ある実施の形態において、腰椎穿刺に２１、２２、２３、２４または２５ゲージの針を使用すると、腰椎穿刺後症候群、頭痛、背中の痛み、発熱、便秘、吐き気、嘔吐、および／または穿刺部位の痛みが軽減または改善される。

【0110】

提案された投与頻度は概算であり、例えば、ある実施の形態において、提案された投与頻度が１日目の投与と２９日目の２回目の投与である場合、ＳＭＡ患者は、最初の投与を受けてから２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４日後に２回目の投与を受けることができる。ある実施の形態において、提案された投与頻度が１日目の投与と１５日目の２回目の投与である場合、ＳＭＡ患者は、最初の投与を受けてから１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日後に２回目の投与を受けることができる。ある実施の形態において、提案された投与頻度が１日目の投与と８５日目の２回目の投与である場合、ＳＭＡ患者は、最初の投与を受けてから８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０日後に２回目の投与を受けることができる。

【0111】

ある実施の形態において、注射の用量および／または量は、患者の年齢、患者のＣＳＦ量、または患者の年齢および／または推定ＣＳＦ量に基づいて調整される。（例えば、Ｍａｔｓｕｚａｗａ Ｊ，Ｍａｔｓｕｉ Ｍ，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｔ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｇｕｒ Ｒ Ｃ，Ｂｉｌｋｅｒ Ｗ，Ｍｉｙａｗａｋｉ Ｔ．健康な乳児および小児における脳の灰白質および白質の加齢に伴う体積変化（Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｇｒａｙ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）．Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ ２００１年４月；１１（４）：３３５－３４２を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【実施例】

【0112】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、単に説明の目的で提供されており、本発明の範囲または内容を決して限定するものと解釈されるべきではない。

【0113】

＜実施例１：ＧＭ０３８１３細胞における全長およびエクソン７スキップ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）、ＡＳＯ（ヌシネルセン）、およびリスジプラムの効果＞
細胞処理に使用するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）、ヌシネルセン（ＡＳＯ－１０－２７）およびリスジプラムの最適濃度を確定するために、ｓａＲＮＡおよびＡＳＯを異なる濃度でＧＭ０３８１３細胞に個別にトランスフェクトした。リスジプラムをＤＭＳＯに溶解し、異なる濃度で培養ＧＭ０３８１３細胞に添加した。

【0114】

「ＧＭ０３８１３細胞」とは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから提供された線維芽細胞を指す。この細胞株は、脊髄性筋萎縮症、ＩＩ型；運動ニューロン１にはＳＭＡ２生存、テロメリック；ＳＭＮ１と記載される。関連する遺伝子はＳＭＮ１である；染色体の位置は５ｑ１２．２－ｑ１３．３であり、対立遺伝子バリアントは１つのエクソン７および８が欠失した、脊髄性筋萎縮症、タイプＩと記載される；特定された変異は、ＥＸ７－８ＤＥＬである。以下の対象の皮膚（腕）の線維芽細胞から得られた表現型データは、次のように特徴付けられる：臨床的に影響を受ける；満期の合併症のない妊娠後に生まれた；生後６ヶ月で寝返った；生後９ヶ月で話すことを学び始めた；生後１２か月までに、顕著な筋萎縮と筋力低下が見られた；深部腱反射の欠如；便秘；ドナー対象はＳＭＮ２遺伝子のコピーを３つ持っている；ＰＣＲ分析は、このドナー対象がＳＭＮ１遺伝子のエクソン７と８の欠失についてホモ接合体であることを示した；同様に影響を受けた兄弟（リポジトリにはない）；母親はＧＭ０３８１４（線維芽細胞）／ＧＭ２４４７４（ｉＰＳＣ）である；父親はＧＭ０３８１５（線維芽細胞）である；ＧＭ２３２４０（ｉＰＳＣ－レンチウイルス）およびＧＭ２４４６８（ｉＰＳＣ－エピソーム）を参照する；以前はＳＭＡ Ｉに分類されたが、発端者の発症特徴やＳＭＮ２投与量などのデータにより、ＳＭＡ ＩＩへの再分類が支持された。

【0115】

７２時間後、全細胞ＲＮＡを処理細胞から単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現は、ＳＭＮ２ＦＬまたはＳＭＮ２Δ７に特異的なプライマーペアを使用したＲＴ－ｑＰＣＲで評価された。ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現は、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７の両方を増幅するプライマーペアを使用した半定量的ＲＴ－ＰＣＲとそれに続くＤｄｅＩ消化（ＰＣＲ／消化）によっても評価された。ＰＣＲの結果、５０７ｂｐ（ＳＭＮ２ＦＬ）と４５３ｂｐ（ＳＭＮ２Δ７）の２つの産物バンドが得られた。消化後、両方のバンドが１１５ｂｐ減少し、図３Ｄのゲルに示されるように、３９２ｂｐ（ＳＭＮ２ＦＬ）および３３８ｂｐ（ＳＭＮ２Δ７）の２つの産物が得られた。図３Ａ～３Ｄは、それぞれＲＴ－ｑＰＣＲおよびＰＣＲ／消化によって評価された、ＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮΔ７ ｍＲＮＡにおける用量依存的変化を示す。図３Ｅ～３Ｇは、図３Ｄのバンドの強度を定量化したデータのグラフプロットである。

【0116】

図３Ａに示すように、１ｎＭでのＡＳＯ－１０－２７処理は、ＳＭＮ２ＦＬを１．５倍増加させ、５ｎＭで２．０倍のピーク増加を引き起こし、同時にＳＭＮ２Δ７を減少させたが、より高い用量では、ＳＭＮ２ＦＬのさらなる誘導またはＳＭＮ２Δ７のさらなる減少は引き起こされなかった。同様に、ＰＣＲ／消化分析は、細胞が１０ｎＭのＡＳＯで処理されたときにＳＭＮ２ＦＬの発現がそのピークに達し、ＳＭＮΔ７の発現が５ｎＭでほぼ最低値に近づいたことを示している（図３Ｅ）。１００ｎＭおよび１０００ｎＭでのリスジプラム処理は、ＳＭＮ２ＦＬのｍＲＮＡレベルを１．２倍および１．８倍増加させ、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ３６％および９８％減少させた（図３Ｃおよび３Ｇ）。ＡＳＯ－１０－２７やリスジプラムなどのＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤は、ＳＭＮ２スプライシングを調節してより多くのエクソン７を含めることでＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡを増加させるため、それらが誘導できるＳＭＮ２ＦＬの最大量は、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤によって変更されないＳＭＮ２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの利用可能な量に依存する。この見解と一致して、データは、ＡＳＯ－１０－２７およびリスジプラムによるスプライシング調節剤によるＳＭＮ２ＦＬの増加（最大２倍の増加）に対する上限効果を示している。

【0117】

対照的に、ｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）は、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７の両方の発現をＳＭＮ２ ｍＲＮＡモジュレーターよりも高いレベルに誘導し、かつ１ｎＭから５０ｎＭの範囲の濃度で用量依存的に変化し、最大の倍率変化はそれぞれ２．９倍および２．７倍であった。１００ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現をさらに増加させなかった（図３Ｂおよび３Ｆ）。ＰＣＲ／消化分析によって一貫した結果が得られた（図３Ｄおよび図３Ｆ）。

【0118】

ＳＭＮ２Δ７レベルを変換（減少）することによってＳＭＮ２ＦＬのレベルを増加させたＳＭＮ２ ｍＲＮＡモジュレーター（ＡＳＯ－１０－２７およびＲｉｓｄｉｐｌａｍ）とは異なり、本開示のＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、ＳＭＮ２転写に作用することによってＳＭＮ２ ｍＲＮＡレベルを増加させ、その結果、ＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７の両方が同時に増加する。図３に示されたデータは、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤とＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとの間の機構上の相違を明確に示している。

【0119】

＜実施例２：ＧＭ００２３２細胞における全長およびエクソン７スキップＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果＞
ｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせが、Ｉ型ＳＭＡ 細胞のＳＭＮ２ＦＬ誘導に及ぼす効果を高めるかどうかを確定するには、ＧＭ００２３２細胞に、ＤＳ０６－０００４とＡＳＯ－１０－２７を単独でまたは組み合わせて、異なる濃度で７２時間トランスフェクトした。ＳＭＮ２発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図４Ａおよび４Ｄ）およびＰＣＲ／消化（図４Ｂ、４Ｃおよび４Ｅ）によって処理細胞において評価された。

【0120】

「ＧＭ００２３２細胞」とは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから提供された線維芽細胞を指す。この細胞株は、脊髄性筋萎縮症Ｉ；ＳＭＡ１として記載される。ドナー対象は、ＳＭＮ２遺伝子のコピーを２つ持ち（Ｓｔａｂｌｅｙら２０１５、ＰＭＩＤ２６２４７０４３を含むいくつかの情報源からのデータ）、ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７および８の欠失についてホモ接合性である。関連する遺伝子はＳＭＮ１である；染色体位置は５ｑ１２．２－ｑ１３．３であり、対立遺伝子バリアントはエクソン７および８の欠失として記載される；脊髄性筋萎縮症、Ｉ型；特定された変異は、ＥＸ７－８ＤＥＬである。以下の対象の皮膚（腕）の線維芽細胞から得られた表現型データは、次のように特徴付けられる：進行性筋萎縮；深部腱反射の欠如；異常なＥＭＧ；ドナー対象はＳＭＮ２遺伝子のコピーを２つ持ち（Ｓｔａｂｌｅｙら２０１５、ＰＭＩＤ２６２４７０４３を含むいくつかの情報源からのデータ）、ＳＭＮ１ 遺伝子のエクソン７および８の欠失についてホモ接合性である。

【0121】

図４Ａに示されるように、１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮ２Δ７の減少と同時に、ＳＭＮ２ＦＬのそれぞれ１．３、１．８および１．９倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ１．７、２．４、および２．４倍増加させ、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ１．５、１．９、および２．１倍増加させた。

【0122】

細胞トランスフェクションで１ｎＭのＡＳＯ－１０－２７を漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）と組み合わせると、ＳＭＮ２ＦＬはそれぞれ２．２、２．６、２．９倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７はそれぞれ１．１、０．７、０．４倍変化した。さらに、細胞を５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ２．８、３．４、３．７倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７はそれぞれ０．０９、０．０５、０．０４倍変化した。さらに、細胞を２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．１、４．０、４．０倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７の発現が完全に排除された。ＳＭＮ２ＦＬを１．９倍誘導した２５ｎＭ ＡＳＯ－１０－２７単独治療と比較して、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４の組み合わせ治療は、ＳＭＮ２ＦＬを４倍増加させ、単独で使用した場合のＡＳＯ－１０－２７の効果を２倍にした。

【0123】

図４Ａに示されるＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、ＰＣＲ／ＤｄｅＩ消化をさらに検証したものである。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果と一致して、ＡＳＯ－１０－２７単独では、２５ｎＭでＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡが２．３倍増加し、ＡＳＯ－１０－２７（２５ｎＭ）とＤＳ０６－０００４（２５ｎＭ）の組み合わせは、ＳＭＮ２ＦＬの最大の誘導（４．１倍）と同時に、ＳＭＮ２Δ７の減少（０．１４倍）を引き起こした（図４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅ）。

【0124】

まとめると、図４に示されるデータは、ｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４単独が、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現、特にＳＭＮ２遺伝子のコピーを２つ有するＩ型ＳＭＡ細胞におけるＳＭＮ２ＦＬの発現の誘導において強力な活性を有することを示している。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをＡＳＯ－１０－２７と組み合わせた場合、ＳＭＮ２ＦＬの最大の誘導を達成できる。

【0125】

＜実施例３：ＧＭ００２３２細胞のＳＭＮタンパク質レベルに対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果＞
ＳＭＮ２遺伝子発現に対するＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４単独または組み合わせの効果をさらに検証するために、ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４で個別にまたは組み合わせてトランスフェクトされたＧＭ００２３２細胞でウェスタンブロッティングアッセイを実施した。図５Ａおよび５Ｃに示されるように、１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮタンパク質のそれぞれ１．４倍、２．３倍および２．９倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ１．２倍、１．３倍および１．７倍増加させた（図５Ｂおよび５Ｃ）。３５ｋＤａの予想サイズを有するタンパク質バンドは完全長のＳＭＮタンパク質である（図５Ａおよび５Ｂ）が、ＳＭＮΔ７タンパク質は急速に分解されるため、ウエスタンブロットには現れない（Ｌｅ，Ｔ．Ｔ．ら ＳＭＮΔ７、セントロメア生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）遺伝子の主要産物は、脊髄筋萎縮症のマウスの生存を延長し、完全長ＳＭＮと関連する（ＳＭＮＤｅｌｔａ７，ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ （ＳＭＮ２）ｇｅｎｅ，ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＳＭＮ）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２００５）。

【0126】

さらに、１ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．４、２．６、２．９倍誘導された（図５Ａ～５Ｃ、５Ａおよび５Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0127】

さらに、５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ３．１、３．０、３．３倍に誘導された（図５Ａ～５Ｃ、５Ａおよび５Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0128】

さらに、２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ３．１、３．３、２．６倍に誘導された（図５Ａ～５Ｃ、５Ａおよび５Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0129】

まとめると、これらのデータは、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４を組み合わせることで、どちらかを個別に使用した場合よりも高いレベルのＳＭＮタンパク質を誘導できることを証明した。

【0130】

＜実施例４：ＧＭ０３８１３細胞における全長およびエクソン７スキップＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果＞
ｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせが、ＩＩ型ＳＭＡ細胞のＳＭＮ２ＦＬ誘導に及ぼす効果を高めるかどうかを確定するために、ＧＭ０３８１３細胞に、ＤＳ０６－０００４およびＡＳＯ－１０－２７を単独でまたは組み合わせて、異なる濃度で７２時間トランスフェクトし、処理細胞におけるＳＭＮ２発現をＲＴ－ｑＰＣＲ（図６Ａおよび６Ｄ）およびＰＣＲ／消化（図６Ｂ、６Ｃおよび６Ｅ）によって評価した。図６Ａと６Ｄに示されるように、１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮ２Δ７の減少と同時に、ＳＭＮ２ＦＬのそれぞれ１．２、２．１および２．１倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ２．１、２．６、および２．２倍増加させ、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ２．５、２．５、および２．１倍増加させた。

【0131】

図６Ａおよび６Ｄに示すように、細胞を１ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ２．６、２．８、３．０倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ１．７、１．４、０．８倍誘導された。さらに、細胞を５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．３、４．２、４．８倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ０．２、０．２、０．１倍誘導された。さらに、細胞を２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．８、４．７、４．０倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７の発現が完全に排除された。ＳＭＮ２ＦＬを２．１倍誘導した２５ｎＭ ＡＳＯ－１０－２７単独治療と比較して、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４の組み合わせ治療は、ＳＭＮ２ＦＬを４．７倍増加させ、単独で使用した場合のＡＳＯ－１０－２７の効果を２倍以上にした。

【0132】

ＦＩＧ６Ａに示されるＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、半定量的ＲＴ－ＰＣＲとそれに続くＤｄｅＩ消化によってさらに検証された。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果と一致して、ＡＳＯ－１０－２７単独では、２５ｎＭでＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡが２．１倍増加し、ＡＳＯ－１０－２７（２５ｎＭ）とＤＳ０６－０００４（５ｎＭ）の組み合わせは、ＳＭＮ２ＦＬの最大の誘導（２．７倍）と同時に、ＳＭＮ２Δ７の減少（０．１８倍）を引き起こした（図６Ｂ、６Ｃ、および６Ｅ）。

【0133】

まとめると、図６に示されるデータは、ｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４単独が、ＳＭＮ３ ｍＲＮＡ発現、特にＳＭＮ２遺伝子のコピーを３つ有するＩＩ型ＳＭＡ細胞におけるＳＭＮ２ＦＬの発現の誘導において強力な活性を有することを示している。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをＡＳＯ－１０－２７と組み合わせた場合、ＳＭＮ２ＦＬの最大の誘導を達成した。このデータは、いずれかの薬剤による個別の処理によって誘導された同じＩＩ型ＳＭＡ細胞（ＧＭ０３８１３細胞）におけるＳＭＮタンパク質のレベルと比較して、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４の組み合わせは、ＩＩ型ＳＭＡ細胞（ＧＭ０３８１３細胞）でより高いレベルのＳＭＮタンパク質を誘導することを証明した。このデータはまた、未処理のＧＭ０３８１３細胞の集団と比較して、本開示による組み合わせで処理された細胞において誘導されたＳＭＮタンパク質のレベルを確立する。本明細書に記載されるように、ＧＭ０３８１３細胞は、ＳＭＮ２のコピーを２つ有し、ＳＭＡのモデルとして利用される。

【0134】

＜実施例５：ＧＭ０３８１３細胞のＳＭＮタンパク質レベルに対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果＞
ＳＭＮ２遺伝子発現に対するＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４単独または組み合わせの効果をさらに検証するために、ＡＳＯ－１０－２７およびＤＳ０６－０００４で個別にまたは組み合わせてトランスフェクトされたＧＭ０３８１３細胞でウェスタンブロッティングアッセイを実施した。図７Ａおよび７Ｃに示されるように、１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮタンパク質のそれぞれ１．２、１．５および１．９倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ１．５、１．５および１．６倍増加させた（図７Ｂおよび７Ｃ）。

【0135】

さらに、１ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ１．４、１．６、１．８倍誘導された（図７Ａ～７Ｃ、７Ａおよび７Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0136】

さらに、５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．０、２．２、２．４倍増加させた（図７Ａ～７Ｃ、７Ａおよび７Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0137】

さらに、２５ｎＭのＡＳＯ－１０－２７と漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭと２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．２、２．９、２．８倍増加させた（図７Ａ～７Ｃ、７Ａおよび７Ｂは、併用治療の２回の重複を含む）。

【0138】

まとめると、このデータは、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４を組み合わせると、ＩＩ型ＳＭＡ細胞でより高いレベルのＳＭＮタンパク質が誘導されることを証明した。このデータは、いずれかの薬剤による個別の処理によって誘導された同じＩＩ型ＳＭＡ細胞（ＧＭ０３８１３細胞）におけるＳＭＮタンパク質のレベルと比較して、ＡＳＯ－１０－２７とＤＳ０６－０００４の組み合わせは、ＩＩ型ＳＭＡ細胞（ＧＭ０３８１３細胞）でより高いレベルのＳＭＮタンパク質を誘導することを証明した。このデータはまた、未処理のＧＭ０３８１３細胞の集団と比較して、本開示による組み合わせで処理された細胞において誘導されたＳＭＮタンパク質のレベルを確立する。本明細書に記載されるように、ＧＭ０３８１３細胞は、ＳＭＮ２のコピーを２つ有し、ＳＭＡのモデルとして利用される。

【0139】

＜実施例６：Ｉ型ＳＭＡ Ｍ００２３２細胞における全長およびエクソン７スキップＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とリスジプラムの組み合わせ効果＞
ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡと小分子ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤であるリスジプラムの組み合わせが、Ｉ型ＳＭＡ細胞におけるＳＭＮ２ＦＬ誘導に対する効果を高めるかどうかを確定するために、ＧＭ００２３２細胞をＤＳ０６－０００４とリスジプラムで個別にまたは組み合わせて、異なる濃度で７２時間処理した。ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図８Ａ－８Ｃ）およびＰＣＲ／消化（図８Ｄ－８Ｆ）によって処理細胞において評価された。図８Ａ－８Ｃに示されるように、５０ｎＭ、２５０ｎＭおよび１２５０ｎＭのリスジプラムは、ＳＭＮ２Δ７の減少と同時に、ＳＭＮ２ＦＬのそれぞれ１．２、１．８および１．９倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ１．８、２．１、および２．０倍増加させ、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ１．６、１．６、および１．７倍増加させた。

【0140】

細胞を５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ２．２、２．６、２．５倍増加し、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ１．３、１．３、１．２倍増加した。さらに、細胞を２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．０、３．４、３．４倍増加し、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ０．３、０．３、０．３倍増加した。さらに、細胞を１２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．６、３．９、４．０倍増加し、ＳＭＮ２Δ７の発現が完全に排除された。ＳＭＮ２ＦＬを１．９倍誘導した１２５０ｎＭリスジプラム単独治療と比較して、リスジプラムとＤＳ０６－０００４の組み合わせ治療は、ＳＭＮ２ＦＬを４倍増加させ、単独で使用した場合のリスジプラムの効果を２倍以上にした。

【0141】

図８Ａに示されるＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、ＰＣＲ／ＤｄｅＩ消化をさらに検証したものである。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果と一致して、１２５０ｎＭのリスジプラム単独では、ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡが２．３倍増加し、リスジプラム（１２５０ｎＭ）とＤＳ０６－０００４（１ｎＭ）の組み合わせは、観察された最大のＳＭＮ２ＦＬ誘導（３．２倍）を引き起こした（図８Ｄ－８Ｆ）。

【0142】

まとめると、図８に示されるデータは、ｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４単独が、Ｉ型ＳＭＡ細胞におけるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現、特にＳＭＮ２ＦＬ発現の誘導において強力な活性を有することを示している。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをリスジプラムと組み合わせた場合、ＳＭＮ２ＦＬの最大の誘導を達成した。

【0143】

＜実施例７：ＧＭ００２３２細胞のＳＭＮタンパク質レベルに対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とリスジプラムの組み合わせ効果＞
Ｉ型ＳＭＡ細胞ＧＭ００２３２におけるＳＭＮ２遺伝子発現に対するリスジプラムおよびＤＳ０６－０００４の単独または組み合わせの効果をさらに検証するために、リスジプラム単独およびｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４との組み合わせでトランスフェクトされたＧＭ００２３２細胞でウェスタンブロッティングアッセイを実施した。図９Ａおよび９Ｂに示されるように、５０ｎＭ、２５０ｎＭおよび１２５０ｎＭのリスジプラムは、ＳＭＮタンパク質のそれぞれ１．７、１．９および２．６倍増加させた。

【0144】

５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．３、２．９、３．３倍に誘導された（図９Ａと９Ｂ）。

【0145】

さらに、２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．６、２．９、２．７倍に誘導された（図９Ａと９Ｂ）。

【0146】

さらに、１２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで細胞を処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ ２．４、２．７、２．７倍に誘導された（図９Ａと９Ｂ）。

【0147】

まとめると、これらのデータは、ＳＭＮ２発現の増加におけるｓａＲＮＡとリスジプラムの組み合わせ効果がタンパク質レベルで検証できることを証明した。

【0148】

＜実施例８：ＩＩ型ＳＭＡ ＧＭ０３８１３細胞における全長およびエクソン７スキップＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とリスジプラムの組み合わせ効果＞
ｓａＲＮＡとリスジプラムの組み合わせが、ＩＩ型ＳＭＡ細胞のＳＭＮ２ＦＬ誘導に及ぼす効果を高めるかどうかを確定するために、ＧＭ０３８１３細胞に、ＤＳ０６－０００４およびリスジプラムを単独でまたは組み合わせて、異なる濃度で７２時間トランスフェクトし、処理細胞におけるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲ（図１０Ａ－１０Ｃ）およびＰＣＲ／消化（図１０Ｄ－１０Ｆ）によって評価した。図１０Ａ－１０Ｃに示されるように、５０ｎＭ、２５０ｎＭおよび１２５０ｎＭのリスジプラムは、ＳＭＮ２Δ７の減少と同時に、ＳＭＮ２ＦＬのそれぞれ１．０、１．４および２．１倍の増加を引き起こした。１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭのＤＳ０６－０００４は、ＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ１．７、２．２、および２．３倍増加させ、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ１．８、２．３、および２．３倍増加させた。

【0149】

細胞を５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ１．９、２．５、２．３倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ１．２、１．７、１．４倍誘導された。さらに、細胞を２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ２．５、３．１、３．４倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７がそれぞれ０．４、０．６、０．６倍誘導された。さらに、細胞を１２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮ２ＦＬがそれぞれ３．２、３．６、３．３倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７の発現が完全に排除された。ＳＭＮ２ＦＬを２．１倍誘導した１２５０ｎＭ リスジプラム単独治療と比較して、リスジプラムとＤＳ０６－０００４の組み合わせ治療は、ＳＭＮ２ＦＬを３．６倍増加させ、単独で使用した場合のリスジプラムの効果をほぼ２倍にした。

【0150】

図１０Ａに示されるＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、ＰＣＲ／ＤｄｅＩ消化をさらに検証したものである。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果と一致して、１２５０ｎＭのリスジプラム単独では、ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡが２．１倍増加し、リスジプラム（１２５０ｎＭ）とＤＳ０６－０００４（２５ｎＭ）の組み合わせでは最大のＳＭＮ２ＦＬ誘導（３．８倍）を引き起こした（図１０Ｄ－１０Ｆ）。

【0151】

まとめると、図１０に示されるデータは、ｓａＲＮＡ ＤＳ０６－０００４単独が、ＩＩ型ＳＭＡ細胞におけるＳＭＮ２ ｍＲＮＡ発現、特にＳＭＮ２ＦＬの誘導において強力な活性を有することを示している。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡをリスジプラムと組み合わせると、ＳＭＮ２ＦＬの最大の増加は観察された。

【0152】

＜実施例９：ＩＩ型ＳＭＡ ＧＭ０３８１３細胞のＳＭＮタンパク質レベルに対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－０００４）とリスジプラムの組み合わせ効果＞
ＩＩ型ＳＭＡ細胞ＧＭ０３８１３におけるＳＭＮ２遺伝子発現に対するリスジプラムおよびＤＳ０６－０００４の単独または組み合わせの効果をさらに検証するために、リスジプラムとＤＳ０６－０００４で単独または組み合わせて処理したＧＭ０３８１３細胞でウェスタンブロッティングアッセイを実施した。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、５０ｎＭと２５０ｎＭのリスジプラムは、ＳＭＮタンパク質をそれぞれ１．１、１．７倍増加させた。

【0153】

細胞を５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ１．３、１．４、１．８倍誘導された（図１１Ａと１１Ｂ）。

【0154】

さらに、細胞を２５０ｎＭのリスジプラムと漸増濃度のＤＳ０６－０００４（１ｎＭ、５ｎＭ、および２５ｎＭ）との組み合わせで処理すると、ＳＭＮタンパク質がそれぞれ２．１、２．３、２．０倍誘導された（図１１Ａと１１Ｂ）。

【0155】

まとめると、このデータは、ＳＭＮ２発現の誘導におけるｓａＲＮＡとリスジプラムの組み合わせ効果がタンパク質レベルで検証できることを証明した。

【0156】

＜実施例１０：ＧＭ０３８１３細胞における全長およびエクソン７スキップＳＭＮ２ ｍＲＮＡの発現に対するｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－００３１とＤＳ０６－００６７）とＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ効果＞
ＡＳＯ－１０－２７と２つのｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－００３１とＤＳ０６－００６７で、これらの両方が、転写共役スプライシング調節メカニズムにより、ＩＩ型ＳＭＡ細胞で ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現よりも多くのＳＭＮ２Δ７を誘導したことを推定する）の組み合わせ効果を確定するために（図１２Ａおよび１２Ｂ）、ＧＭ０３８１３細胞に、ＤＳ０６－００３１またはＤＳ０６－００６７およびＡＳＯ－１０－２７を単独でまたは組み合わせて、１０ｎＭで７２時間トランスフェクトした。ＳＭＮ２発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図１２Ａ）および半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（図１２Ｂおよび１２Ｃ）によって処理細胞において評価された。図１２Ａに示すように、ＤＳ０６－００３１とＤＳ０６－００６７は、１０ｎＭでＳＭＮ２ＦＬをそれぞれ０．９と１．３倍、ＳＭＮ２Δ７をそれぞれ１．９と２．４倍変化させたのに対し、ＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７をそれぞれ１．４と０．３倍変化させた。

【0157】

細胞トランスフェクションでＤＳ０６－００３１またはＤＳ０６－００６７を１０ｎＭでＡＳＯ－１０－２７と組み合わせると、ＳＭＮ２ＦＬは２．０倍および３．２倍誘導され、ＳＭＮ２Δ７はそれぞれ０．３倍および０．０５倍減少した。

【0158】

図１２Ａに示されるＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、半定量的ＲＴ－ＰＣＲによってさらに検証された。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果と一致して、１０ｎＭのＡＳＯ－１０－２７は単独で、ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡを１．４倍増加させ、ＤＳ０６－００３１およびＤＳ０６－００６７と組み合わせると、ＳＭＮ２ＦＬが１．８倍および２．３倍増加し、同時にＳＭＮ２Δ７が０．３倍および０．０２倍減少した。

【0159】

さらに、ＳＭＮタンパク質レベルはウェスタンブロッティングアッセイによって評価された。ＳＭＮ２ＦＬ発現と一致して、単独で使用した場合の２．３倍の増加と比較して、ＤＳ０６－００３１およびＤＳ０６－００６７の存在下で、ＡＳＯ－１０－２７は、ＳＭＮタンパク質レベルの３．６倍および３．３倍の増加を引き起こした（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。

【0160】

まとめると、図１２に示されるデータは、ｓａＲＮＡ（ＤＳ０６－００３１およびＤＳ０６－００６７）単独が、ＳＭＮ２発現、特にＳＭＮΔ７の誘導において強力な活性を有することを示している。ＡＳＯ－１０－２７と組み合わせると、最大のＳＭＮ２ＦＬ誘導とＳＭＮ２Δ７減少を達成した。このデータは、特定のｓａＲＮＡによって誘導される転写活性化とその後のｐｒｅ－ｍＲＮＡの増加は、主にＳＭＮ２Δ７の増加によって反映されるが、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの増加は、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤（ＡＳＯなど）にエクソン７包含のための追加の基質を提供し、その結果、ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が大幅に強化されることをさらに示唆した。

【0161】

＜実施例１１：ＳＭＡタイプＩＩＩマウスにおけるＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７の発現に対する、ｓａＲＮＡ（ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１）とＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７またはリスジプラムの組み合わせ効果＞
ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１とＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７またはリスジプラムとの組み合わせ効果は、ＳＭＡタイプＩＩＩマウスでｉｎ ｖｉｖｏで評価された。新生児マウスは１０つの治療群に分けられた：

【0162】

治療群１：ＩＣＶ注射によるＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１投与（それぞれ１０μｇのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１をＰ１およびＰ３に２回注射）；

【0163】

治療群２：ＩＣＶ注射によるＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７投与（それぞれ１０μｇのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７をＰ１およびＰ３に２回注射）；

【0164】

治療群３：０．３ｍｇ／ｋｇの濃度でＰ１にＩＰ注射によるリスジプラム投与；

【0165】

治療群４：１ｍｇ／ｋｇの濃度でＰ１にＩＰ注射によるリスジプラム投与；

【0166】

治療群５：３ｍｇ／ｋｇの濃度でＰ１にＩＰ注射によるリスジプラム投与；

【0167】

治療群６：ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１とＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７の投与による組み合わせ療法。ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１はＰ１にＩＣＶ注射で投与され（１０μｇ）、ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７はＰ３にＩＣＶ注射で投与された（１０μｇ）；

【0168】

治療群７：ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７とＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１の投与による組み合わせ療法。ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７はＰ１にＩＣＶ注射で投与され（１０μｇ）、ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１はＰ３にＩＣＶ注射で投与された（１０μｇ）；

【0169】

治療群８：ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１とリスジプラムの組み合わせ療法。ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１はＰ１（１０μｇ）にＩＣＶ注射で注射し、リスジプラムはＩＰ注射でＰ３に０．３ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。

【0170】

治療群９：ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１とリスジプラムの組み合わせ療法。ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１はＰ１（１０μｇ）にＩＣＶ注射で注射し、リスジプラムはＩＰ注射でＰ３に１ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。

【0171】

ＳＭＡタイプＩＩＩマウスは、皮下（ＳＣ）注射を介して、Ｐ１（５μＬ）およびＰ３（５μＬ）に生理食塩水で２回治療された。Ｐ１とＰ３は、生後１日目と３日目を意味する；

【0172】

治療群１０：生理食塩水によるマウスの治療；ＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡレベルは、脳、肝臓、および脊髄の組織でＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化された。
Ｐ１とＰ３は、生後１日目と３日目を意味する。

【0173】

＜結果＞
図１３Ａに示すように、ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１（治療群１）は、対照（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の増加を１．２倍誘導し、脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡの発現をアップレギュレートしなかった。ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７（治療群２）は、対照（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．６倍の増加を誘導し、脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．７倍の減少を誘導した。濃度０．３ｍｇ／ｋｇ（治療群３）、１ｍｇ／ｋｇ（治療群４）、および３ｍｇ／ｋｇ（治療群５）のリスジパームはすべて、対照群と比較して脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現のそれぞれ１．１、１．３および１．０倍の増加を誘導し、対照群（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現のそれぞれ１．０倍の増加を誘導した。

【0174】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ治療（治療群６）は、対照群（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．８倍の増加、および対照群（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．８倍の減少を誘導した。

【0175】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１の組み合わせ治療（治療群７）は、対照群（治療群１０）と比較して脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の２．０倍の増加、および脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．６倍の減少を誘導した。

【0176】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１および０．３ｍｇ／ｋｇの濃度のリスジプラムの組み合わせ治療（治療群８）は、対照群（治療群１０）と比較して、脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．２倍および脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．０倍の増加をそれぞれ誘導した。

【0177】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１および１ｍｇ／ｋｇの濃度のリスジプラムの組み合わせ治療（治療群９）は、対照群（治療群１０）と比較して、脳内のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．３倍および脳内のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．０倍の増加をそれぞれ誘導した。

【0178】

図１３Ｂに示されるように、ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１（治療群１）は、肝臓におけるＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の増加を誘導しなかった。ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７（治療群２）は、対照（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．７倍の増加を誘導し、肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．９倍の減少を誘導した。濃度０．３ｍｇ／ｋｇ（治療群３）、１ｍｇ／ｋｇ（治療群４）、および３ｍｇ／ｋｇ（治療群５）のリスジパームはすべて、対照群（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現のそれぞれ１．１、１．３および１．０倍の増加を誘導し、対照群（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現のそれぞれ１．０倍の増加を誘導した。

【0179】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ治療（治療群６）は、対照群（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．０倍の増加と、対照群（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．９倍の減少を誘導した。

【0180】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１の組み合わせ治療（治療群７）は、対照群（治療群１０）と比較して肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．６倍の増加と、肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．０倍の変化を誘導した。

【0181】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１および０．３ｍｇ／ｋｇの濃度のリスジプラムの組み合わせ治療（治療群８）は、肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．６倍の増加および肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．１倍の増加をそれぞれ誘導した。

【0182】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１および１ｍｇ／ｋｇの濃度のリスジプラムの組み合わせ治療（治療群９）は、肝臓のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．５倍の増加および肝臓のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．１倍の増加をそれぞれ誘導した。

【0183】

図１３Ｃに示されるように、ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１（治療群１）は、脊髄におけるＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の増加を誘導しなかった。ＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７（治療群２）は、対照と比較して脊髄のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．３倍の増加を誘導し、脊髄のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の０．８倍の減少を誘導した。

【0184】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７の組み合わせ治療（治療群６）は、対照群と比較して脊髄のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の１．８倍の増加と、対照群と比較して脊髄のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．２倍の増加を誘導した。

【0185】

Ｐ１（１０μｇ）でのＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７ およびＰ３（１０μｇ）でのＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１の組み合わせ治療（治療群７）は、対照群と比較して脊髄のＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現の２．２倍の増加と、脊髄のＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の１．１倍の増加を誘導した。

【0186】

図１３Ａ～１３Ｃに示すように、ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡとＳＭＮ２ ｍＲＮＡ調節剤による組み合わせ治療は、ＳＭＮ２ＦＬ ｍＲＮＡ発現とＳＭＮ２Δ７ ｍＲＮＡ発現の増加をもたらす。

【0187】

＜材料と方法＞
（オリゴヌクレオチドの設計と合成）
ＤＳ０６－０００４（ＲＡＧ６－２８１としても知られる）、ＤＳ０６－００３１（ＲＡＧ６－１２６６としても知られる）、およびＤＳ０６－００６７（ＲＡＧ６－２９３としても知られる）を含むＳＭＮ２のｓａＲＮＡが、ＳＭＮ２の転写開始部位に対してそれぞれ－２８１、－１２６６および－２９３の位置でＳＭＮ２遺伝子プロモーターを標的とするように設計された（図１）。ＳＭＮ２ ｓａＲＮＡは、固相技術を用いてＫ＆Ａ ＤＮＡ合成機（Ｋ＆Ａ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ ＧｂＲ、Ｓｃｈａａｆｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。簡単に言えば、ホスホラミダイトモノマーを固体支持体に順次添加して、所望の全長オリゴヌクレオチドを生成する。塩基付加の各サイクルには、脱トリチル化、カップリング、酸化／チオール化、キャッピングの４つの化学反応が含まれる。合成後、固体支持体をスクリューキャップ微量遠心管に移した。１μＭの合成スケールでは、エタノール中の３３％メチルアミンと１ｍｌの水酸化アンモニウムの混合物を添加した。次いで、固体支持体を含有する管をオーブン内で６０℃～６５℃で２時間加熱し、次いで室温まで冷却させた。切断溶液を回収し、スピードバックで蒸発乾固した。まだ２’－ＴＢＤＭＳ基を保持している粗ＲＮＡオリゴヌクレオチドを０．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。１ｍｌのトリエチルアミン３ＨＦを加えた後、チューブに蓋をし、混合物を激しく振って完全に溶解させた。瓶をオーブンで６０℃から６５℃で３時間から３．５時間加熱した。管をオーブンから取り出し、室温まで冷却した。完全に脱シリル化されたオリゴヌクレオチドを含む溶液をドライアイスで冷却した。２ｍｌの氷冷ｎ－ブタノール（－２０℃）を０．５ｍｌずつ注意深く加えてオリゴヌクレオチドを沈殿させた。沈殿物を濾過し、１ｍｌの氷冷ｎ－ブタノールで洗浄し、次いで沈殿物を１Ｍ ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）に溶解した。次いで、ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムを使用する交換（ＩＥＸ）ＨＰＬＣによって粗オリゴヌクレオチドを精製した。また、フラクションの純度は、Ｃｏｌｕｍｎ ＤＮＡ Ｐａｃ^TM ＰＡ１００を使用したイオン交換（ＩＥＸ）ＨＰＬＣで分析した。脱塩精製一本鎖溶液の生成に続いて、２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって二重鎖を作製し、凍結乾燥して粉末にした。

【0188】

ＡＳＯ－１０－２７：ヌシネルセン（Ｓｐｉｎｒａｚａ（登録商標））としても知られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＡＳＯ－１０－２７は、最終アニーリング工程を省略した以外は上記と同じ技術を用いて合成した。ＡＳＯ－１０－２７は一本鎖かつ２’－Ｏ－２－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾ＡＳＯであり、それが、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン７でイントロン スプライシング サイレンサー（ＩＳＳ）を標的とすることにより、エクソン７包含を誘導する（ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２イントロンスプライシングサイレンサーのアンチセンスマスキングは、トランスジェニックマウスのＳＭＮ２スプライシングを修正する（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍａｓｋｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２ ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＳＭＮ２ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ））．“Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ（２００８））。ＡＳＯ－１０－２７の配列は：ｍｅＵ＊ｍｅＣ＊ｍｅＡ＊ｍｅＣ＊ｍｅＵ＊ｍｅＵ＊ｍｅＵ＊ｍｅＣ＊ｍｅＡ＊ｍｅＵ＊ｍｅＡ＊ｍｅＡ＊ｍｅＵ＊ｍｅＧ＊ｍｅＣ＊ｍｅＵ＊ｍｅＧ＊ｍｅＧであり、ここで、ｍｅ、２’ＭＯＥ、＊、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾、すべてのシトシン（Ｃｓ）は５’メチルシトシンである。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドは、細胞トランスフェクションのためにＲＮａｓｅを含まない水に懸濁されるか、またはインビボ注射のために適切な濃度に生理食塩水で希釈された。

【0189】

（細胞培養と処理）
ＧＭ００２３２（ＳＭＮ２遺伝子を２つ持つＳＭＡＩ型）およびＧＭ０３８１３（ＳＭＮ２遺伝子のコピーを３つ持つＳＭＡＩＩ型）を含むＳＭＡ患者由来の線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（カムデン、ニュージャージー州、米国）から入手した。これらの細胞を、１５％ウシ子牛血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した改変ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カリフォルニア州カールスバッド）で、５％ＣＯ₂および３７℃で培養した。ｓａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯを含むオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするために、細胞を６ウェルプレートに１×１０⁵細胞／ウェルの密度で播種し、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカー提供のリバース トランスフェクション プロトコールに従って使用して、さまざまな濃度のオリゴヌクレオチドで７２時間トランスフェクトした（特に指定しない限り）。ｓａＲＮＡ、ＳＭＮ２ ｓｉＲＮＡ（ＤＳ０６－３３２ｉ）、対照ｄｓＲＮＡ（ｄｓＣｏｎ２）、およびＡＳＯの配列を表１に示す。細胞のリスジプラム処理では、特に明記しない限り、ＤＭＳＯに溶解したリスジプラム（ＨＹ－１０９１０１、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ社、ニュージャージー州モンマスジャンクション）を所望の濃度で７２時間細胞に直接添加した。

【0190】

【表2】

【0191】

ノート：ｍ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）；ｍｅ、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）；ｆ、２’－フルオロ；＊、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾；下線付きのＣ、５’メチルシトシン；Ｖｐ，５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート

【0192】

（ＲＮＡの分離と逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ））
培養細胞からＲＮＡを分離するために、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ キット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）をマニュアルに従って使用して、処理した細胞から全細胞ＲＮＡを分離した。動物組織からＲＮＡを分離するために、組織を採取し、ＲＮＡ レイター（ＡＭ７０２１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で保存した。次に、ａｕｔｏ－ｐｕｒｅ９６ マシン（ＡＬＬＳＨＥＮＧ、中国）でＭａｇＰｕｒｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ ＬＱ キット（Ｍａｇｅｎ、Ｒ６６２１、中国）を使用して、全ＲＮＡ を分離した。得られたＲＮＡ（１μｇ）は、ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒを含むＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ キット（タカラ社、滋賀、日本）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写された。得られたｃＤＮＡは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラ社、滋賀、日本）試薬および全長（ＳＭＮ２ＦＬ）またはΔ７ ＳＭＮ２ ｍＲＮＡ（ＳＭＮ２Δ７）を特異的に増幅するプライマーを使用して、ＡＢＩ ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で増幅された（図１）。反応条件は：９５℃で３秒間（１サイクル）および６０℃で３０秒間（４０サイクル）。ＴＢＰ 遺伝子の増幅は、内部対照として使用した。すべてのプライマー配列を表２に示した。ＲＴとＲＴ－ｑＰＣＲ反応を表３と表４に示す。

【0193】

【表3】

【0194】

【表4】

【0195】

【表5】

【0196】

（半定量ＲＴ－ＰＣＲ／ＤｄｅＩ消化アッセイ）
１回の反応でＳＭＮ２ＦＬとＳＭＮ２Δ７の両方を増幅するために、ｃＤＮＡを、ＳＭＮ２のエキソン７にわたるプライマーを使用する半定量的ＲＴ－ＰＣＲによって増幅した（表５）（図２）。ＰＣＲ反応条件：９４℃で２分間（１サイクル）、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で３２秒間の３０サイクル、７２℃で最後の５分間の伸長。ＰＣＲ反応を表６に示す。ＳＭＮ１ ｍＲＮＡをＳＭＮ２からさらに区別するために、得られたＳＭＮのＰＣＲ産物をＤｄｅＩ制限酵素（Ｒ０１７５Ｌ、ＮＥＢ）で消化し、２％アガロースゲルで分離した。ＳＭＮ２のエクソン８のヌクレオチドバリアントにより、ＤｄｅＩ認識サイトがＳＭＮ２遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物に存在するが、ＳＭＮ１遺伝子からは存在しなく、ＤｄｅＩ消化は、ＳＭＮ２ＦＬおよびＳＭＮ２Δ７の両方から１１５ｂｐフラグメントを放出し、３つのフラグメント：５０７（ＳＭＮ１ＦＬ）、３３８（ＳＭＮ２Δ７）、３９２（ＳＭＮ２ＦＬ）および１１５ｂｐ（図２）を生じた。ＲＮＡローディング対照としてＴＢＰ遺伝子も増幅した。ＤｄｅＩ消化の反応条件は、３７℃６０分間、６５℃２０分間を１サイクル。ＤｄｅＩ消化反応を表７に示す。

【0197】

【表6】

【0198】

【表7】

【0199】

【表8】

【0200】

（Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング）
タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤を含む１×ＲＩＰＡバッファーを使用してトランスフェクトされた細胞から回収され、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ００１０、中国）によってタンパク質濃度が検出された。動物組織からタンパク質を分離するために、組織を採取し、１×ＲＩＰＡバッファーを使用して溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルを使用してタンパク質電気泳動を実施し（１０μｇタンパク質／ウェル）、次いでこれをポリフッ化ビニリデン（０．４５μｍ ＰＶＤＦ）膜に転写した。膜は、一次抗ＳＭＮ（ＣＳＴ、１９２７６、米国）または抗α／β－チューブリン（ＣＳＴ、２１４８ｓ、米国）抗体で４℃で一晩ブロットした。ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、膜を抗ＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合の二次抗体（ＣＳＴ、７０７４ｓおよび７０７６ｓ、米国）とともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴバッファーで３回、それぞれ１０分間洗浄し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｏｃｔｍ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）によって分析した。ＳＭＮタンパク質とα／β－チューブリンのバンド密度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。

【0201】

（動物の手順）
すべての動物の手順は、地方および州の規制と一致し、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、認定された実験室の担当者によって行われた。前述のＨｓｉｅｈ－Ｌｉら（（Ｈｓｉｅｈ－Ｌｉ，Ｈ．Ｍら 脊髄性筋萎縮症のマウスモデル（Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ（２０００））に説明されたように、マウスＳｍｎエキソン７をヒトＳＭＮ２の導入遺伝子（Ｓｍｎ－／－ＳＭＮ２＋／－）でホモ接合ノックアウトして作成したＳＭＡ様マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。生後０日目（Ｐ０）に尾の切り取りを収集し、足の入れ墨によって各子マウスを識別し、３つの特異的プライマーのセットを使用したＰＣＲ分析によって遺伝子型を特定した：Ｓ１、５’－ＡＴＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＣＴＣ－３’、およびＳ２、５’－ＧＴＡＧＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡ－３’（野生型対立遺伝子の１，１５０ｂｐバンド）およびＳ１およびＨ１、５’ＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣ－３’（変異型対立遺伝子の９５０ｂｐバンド）。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで検出した。重度のＳＭＡマウス（Ｓｍｎ－／－、ＳＭＮ＋／０）が産生された。マウスＳｍｎのヘテロ接合体（Ｓｍｎ１＋／－、ＳＭＮ２＋／－）の同腹仔を対照として使用した。

【0202】

（脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の準備）
ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｇ／ｍＬ）、とＰＥＧ２０００－ＤＭＰＥ（２０ｍｇ／ｍＬ）を１００％エタノールに溶解した脂質ストックを、１２ｍＬ／ｍｉｎの流速で、１：３の体積比で、マイクロ流体チップによってオリゴヌクレオチドストック（２０ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ４．０）と急速に混合した。ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２０００－ＤＭＰＥのモル比は５０：３８．５：１０：１．５である。次に、この予め形成されたベシクルを、透析チューブを使用して１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１２時間透析した。ＬＮＰの粒子サイズは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＮａｎｏＢｒｏｏｋ ９０Ｐｌｕｓ Ｚｅｔａを使用した動的光散乱によってテストされた。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｎ５０を使用してＡ２６０によってテストされた。

【0203】

（脳室内（ＩＣＶ）注射）
ＰＣＲ分析によって遺伝子型を特定するために、生後０日目（Ｐ０）に尾の切り取りを収集し、Ｉ型ＳＭＡマウス（Ｓｍｎ－／－、ＳＭＮ２＋／－）、ＩＩＩ型ＳＭＡマウス（Ｓｍｎ－／－、ＳＭＮ２＋／＋）、およびヘテロ接合体（Ｈｅｔ）対照（Ｓｍｎ１＋／－、ＳＭＮ２＋／－）として分けられた。両側脳室内（ＩＣＶ）注射は、Ｐ１およびＰ３の子犬用の２９ゲージ注射器（片側２μＬ、５ｍｇ／ｍｌ）を使用して、２％イソフルランを介して麻酔下でそれぞれ１．５ｍｍまたは３．６ｍｍの深さで行った。腹腔内（ＩＰ）注射を、新生マウスの下腹部領域に行った。表１には、ｓａＲＮＡ（ＬＮＰ－Ｒ６－０４Ｍ１）とＬＮＰ－ＡＳＯ－１０－２７の配列を示す。

【0204】

【表9-1】

【0205】

【表9-2】

【0206】

【表9-3】

【0207】

【表9-4】

【0208】

【表9-5】

【0209】

【表9-6】

【0210】

【表9-7】

【0211】

【表9-8】

【0212】

【表9-9】

【0213】

【表9-10】

【0214】

【表9-11】

【0215】

【表9-12】

【0216】

【表10】

【0217】

＜同等物および参照による組み込み＞
本明細書で引用されるすべての参考文献は、すべての目的で、個々の出版物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願、または特許が具体的かつ個別に示され、その全体が参照により組み込まれるのと同程度に、参照により組み込まれる。この参照による組み込みの声明は、出願人が、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って、すべての個々の出版物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願、または特許に関連することを意図し、それらが、それぞれに、たとえそのような引用が参照により専門の組み込みの声明に直接隣接していなくても、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に識別される。参照による組み込みの専門声明があれば、明細書内に含めることは、参照による組み込みのこの一般的なステートメントを決して弱めることはない。ここでの参考文献の引用は、参考文献が適切な先行技術であることを認めることを意図したものではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付についての認めを構成するものでもない。

【0218】

本発明は、好ましい実施形態および様々な代替実施形態を参照して特に示され、説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を加えることができることは、当業者によって理解される。

【0219】

（クロスリファレンス）
本願は、２０２０年７月３１日に提出されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１０６２００の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0220】

（テキストファイルとして提供される参照により組み込まれる配列表）
本明細書には、２０２１年７月３０日に作成され、サイズが８１Ｋｂのテキストファイル「ＳＭＮ２－Ｃｏｍｂｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５ ｆｉｎａｌ」として、配列表が提供される。当該テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【配列表】

2023535832000001.app

【国際調査報告】