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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-21
(54)【発明の名称】抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体及びその医薬的使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230814BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230814BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230814BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230814BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230814BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 N
A61P35/00
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523317
(86)(22)【出願日】2021-03-16
(85)【翻訳文提出日】2023-02-28
(86)【国際出願番号】 CN2021080981
(87)【国際公開番号】W WO2022001189
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】202010597133.7
(32)【優先日】2020-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523052085
【氏名又は名称】英諾湖医薬（杭州）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】邱均専
(72)【発明者】
【氏名】王振生
(72)【発明者】
【氏名】孫▲カイ▼
(72)【発明者】
【氏名】周漫
(72)【発明者】
【氏名】陳均勇
(72)【発明者】
【氏名】孫鍵
(72)【発明者】
【氏名】区日山
【テーマコード（参考）】
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB36
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
免疫反応を活性化するための薬物、特に癌を治療するための関連薬物の製造に有用である抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体及びそのヒト化抗体を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖と軽鎖を含む抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、７４、８２、９０、９８及び１０６から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８３、９１、９９及び１０７から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４、９２、１００及び１０８から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、７０、７８、８６、９４、１０２及び１１０から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５、１０３及び１１１から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６、１０４、及び１１２から選択される１つであり、
前記抗原結合断片の重鎖及び軽鎖は、それぞれ前記抗体の重鎖及び軽鎖に跨るＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９、９７及び１０５から選択される１つであり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３、１０１、及び１０９から選択される１つであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記重鎖及び軽鎖はヒト化されており、前記ヒト化後の重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１５、１１７及び１１９から選択される１つであり、
前記ヒト化後の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１６、１１８及び１２０から選択される１つであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記ヒト化後の重鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１２９及び１３０から選択される１つであり、前記ヒト化後の軽鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、１２４、１２６及び１３１から選択される１つであることを特徴とする請求項３に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列。
【請求項6】
ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、Ｔリンパ球を活性化する薬物、又はＴリンパ球におけるＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現を上昇させる薬物を含むが、これらに限定されない薬物の製造における、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項7】
モノクローナル抗体と結合部位とを含むモノクローナル抗体コンジュゲートであって、前記モノクローナル抗体は、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記結合部位は、放射性核種、薬物、毒素、サイトカイン、サイトカイン受容体断片、酵素、ルシフェリン、及びビオチンから選択される１種又は複数種であることを特徴とするモノクローナル抗体コンジュゲート。
【請求項8】
ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、Ｔリンパ球を活性化する薬物、又はＴリンパ球におけるＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現を上昇させる薬物を含むが、これらに限定されない薬物の製造における、請求項７に記載のモノクローナル抗体コンジュゲートの使用。
【請求項9】
腫瘍の予防及び／又は治療及び／又は補助的な治療のための薬物の製造における請求項７に記載のモノクローナル抗体コンジュゲートの使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍及び免疫薬の分野に属し、具体的には、抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体及びその医薬的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＧＩＴＲはグルココルチコイドによって誘導されるＴＮＦＲ関連タンパク質であり、ＴＮＦＲＳＦ１８又はＣＤ３５７とも呼ばれ、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｔｒｅｇ細胞には高いレベルで発現しているが、ナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞には低いレベルで発現している[Shimizuら，（2002），Nat. Immunol. 3：135-42；Nocentiniら，（2009），Adv. Exp. Med. Biol. 647：156-73；McHughetら，（2002），Immunity 16：311-23；Nocentiniら，（2005），Eur J Immunol 35：1016-1022]。活性化後、ナイーブＴ細胞とＴｒｅｇＴ細胞はＧＩＴＲの発現を迅速に向上させた（Shimizuら，（2002），Nat. Immunol. 3：135-42；Krauszら，（2007，Scientific World Journal 7：533-66）。活性化された先天性免疫細胞（例えば天然キラー細胞、マクロファージや樹状細胞（ＤＣ）にも低レベルから中レベルのＧＩＴＲ発現がある[Clouthierら，（2014），Growth Factor Rev. 25：91-106]。ＧＩＴＲのリガンド（ＧＩＴＲＬ）はＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であり、Ｂ細胞、マクロファージや樹状細胞（ＤＣ）を含む内皮細胞及び活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に所定量の発現が観察された[Yuら，（2003），Biochem. Biophys. Res. Commun.310：433-438；Toneetら，（2003），Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：15059-15064]。
【0003】
ＧＩＴＲＬ又はＧＩＴＲアゴニスト抗体とＧＩＴＲとの相互作用により、ＧＩＴＲは刺激され、ＴＣＲにより誘導されるＴ細胞増殖とサイトカイン産生の作用を増強し[Ronchettiら，（2004），Eur. J. Immunol. 34：613-622；Toneら，（2003），Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：15059-15064；Stephensら，（2004），J. Immunol. 173：5008-5020]、また、エフェクターＴ細胞のＴｒｅｇ細胞媒介免疫抑制作用に対する感受性を低下させることができる[Ronchettiら，（2007），Eur. J. Immunol. 37：1165-1169；Stephensら，（2004），J. Immunol. 173：5008-5020]。ＧＩＴＲの活性化はＴＮＦＲに関連する因子２（ＴＲＡＦ２）と５（ＴＲＡＦ５）を動員し、そして転写因子ＮＦ－κＢとＭＡＰキナーゼで誘導されるシグナル伝達経路を誘導して活性化し[Snelletら，（2011），Immunol. Rev. 244：197-217；Snellら，（2010），J. Immunol. 185：7223-34]、また、抗アポトーシスのＢｃｌ－ＸＬタンパク質の転写を誘導し、細胞活性化作用によるＴ細胞の死を減少させることができる[Ronchettiら，（2004），Eur. J. Immunol. 34：613-622；Esparzaら，（2006），J. Biol. Chem. 281：8555-64]。ＧＩＴＲの活性化はさらにＮＦκＢに依存するＴＲＡＦ６の活性化及びＩＬ－９の産生を招くことができ、それによって、ＤＣ細胞の機能を増強し、Ｔリンパ細胞の細胞毒性反応を活性化することができる[Kimら，（2015），Nat. Med. 21：1010-7]。ＧＩＴＲ信号伝達もＦｏｘＰ３の分解[Cohenetら，（2010），PLoS ONE 5：10436；Schaerら，（2013），Cancer Immunology Research 1：320-331]、及びｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のリン酸化[Joethamら，（2012），J Biol. Chem. 287：17100-17108]を促進することができ、これにより、Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制機能がさらに抑制される。また、抗ＧＩＴＲ抗体がＴｒｅｇ細胞のＢ細胞媒介抗体産生作用に対する抑制効果を逆転することも報告されている[Cavaら，（2004），J. Immunol. 173：3542-3548]。
【0004】
前臨床研究により、ＧＩＴＲシグナル伝達経路の活性化は腫瘍の除去作用を顕著に増強できることが明らかになった。その効果は免疫エフェクター細胞の活性化に依存し[Ramirezら，（2006），J Immunol 176：6434-6442；Boczkowskiら，（2009），Cancer Gene Ther. 16：900-911；Mitsuiら，（2010），Clin. Cancer Res. 16：2781-91]、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制活性の除去又は抑制にも依存する[Cohenら，（2010），PLoS ONE 5: e10436；Coeら，（2010），Cancer Immunol. Immunother. 59：1367-77；Xiaoら，（2015），Nat. Commun. 6：8266]。ＧＩＴＲ活性化抗体を単独で使用すると、腫瘍組織へのＴｒｅｇ細胞の進入を減少させ、腫瘍内のＴｒｅｇ細胞にｆｏｘｐ３の発現を失わせ、これにより、腫瘍内のＴｒｅｇ細胞の免疫抑制作用を局所的に除去することができる。最終的に、腫瘍微小環境では、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比率が向上し、Ｔｅｆｆ細胞の活性と機能が増強される（Cohenら，（2010），PLoS ONE 5：e10436）。卵巣癌モデルでは、抗ＧＩＴＲ抗体と抗ＰＤ－１抗体の併用療法は全体的に患者の生存率を向上させることができ、治療後９０日で腫瘍のないマウスは２０％に達した。マウス腫瘍内に進入した白血球（ＴＩＬ）を解析した結果、ＣＤ４＋とＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の数は顕著に増加し、また、Ｔｒｅｇ免疫調節細胞の数は顕著に減少した[Luら，（2014），J. Transl. Med. 12：36-47]。単剤治療の効果はこのＧＩＴＲ抗体に対してあまり顕著ではないが、それと抗ＣＴＬＡ４抗体の併用投与はＭｅｔｈＡとＣＴ２６の腫瘍モデルにおいて顕著に増強された相乗的な抗腫瘍作用が現れた[Koら，（2005），J. Exp. Med. 202：885-91；Mitsuiら，（2010），Clin. Cancer Res. 16：2781-91]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
これに基づいて、本発明は、ハイブリドーマ技術により、ＧＩＴＲ及び免疫細胞活性を活性化し、かつＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの相互作用を遮断することができる優れた効果を有する抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体を得て、そして、関連抗体に対してヒト化改変を行うことに成功した。前記抗体は、免疫反応を刺激、増強するための薬物の製造、並びに癌関連薬物の治療において応用の将来性が期待できる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、重鎖と軽鎖を含む抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、７４、８２、９０、９８及び１０６から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８３、９１、９９及び１０７から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４、９２、１００及び１０８から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、７０、７８、８６、９４、１０２及び１１０から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５、１０３及び１１１から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６、１０４、及び１１２から選択される１つであり、
前記抗原結合断片の重鎖及び軽鎖は、それぞれ前記抗体の重鎖及び軽鎖に跨るＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、７４、８２、９０、９８及び１０６から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１１、１９、２７、３５、４３、５１、５９、６７、７５、８３、９１、９９及び１０７から選択される１つであり、
前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４、９２、１００及び１０８から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、７０、７８、８６、９４、１０２及び１１０から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５、１０３及び１１１から選択される１つであり、
前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６、１０４、及び１１２から選択される１つであり、
前記抗原結合断片の重鎖及び軽鎖は、それぞれ前記抗体の重鎖及び軽鎖に跨るＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0007】
さらに、本発明は、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９、９７及び１０５から選択される１つであり、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３、１０１、及び１０９から選択される１つであることを特徴とする上記の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９、９７及び１０５から選択される１つであり、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３、１０１、及び１０９から選択される１つであることを特徴とする上記の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0008】
さらに、本発明は、
上記の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖のヒト化改変であって、前記ヒト化改変された重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１５、１１７及び１１９から選択される１つであり、
前記ヒト化改変された軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１６、１１８及び１２０から選択される１つであるヒト化改変を開示する。
さらに、本発明は、前記ヒト化改変された重鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１２９及び１３０から選択される１つであり、
前記ヒト化改変された軽鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、１２４、１２６及び１３１から選択される１つである上記のヒト化改変された抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を開示する。
上記の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖のヒト化改変であって、前記ヒト化改変された重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１５、１１７及び１１９から選択される１つであり、
前記ヒト化改変された軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１６、１１８及び１２０から選択される１つであるヒト化改変を開示する。
さらに、本発明は、前記ヒト化改変された重鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２３、１２５、１２７、１２８、１２９及び１３０から選択される１つであり、
前記ヒト化改変された軽鎖の全長アミノ酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、１２４、１２６及び１３１から選択される１つである上記のヒト化改変された抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を開示する。
【0009】
さらに、本発明は、上記の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を開示する。
【0010】
さらに、本発明は、Ｔリンパ球を活性化する薬物、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、又はＴリンパ球におけるＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現を上昇させる薬物の製造における上記の抗ＧＩＴＲ断片の使用を開示する。
【0011】
さらに、本発明は、モノクローナル抗体と結合部とを含み、前記モノクローナル抗体は請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記結合部は、放射性核種、薬物、毒素、サイトカイン、サイトカイン受容体断片、酵素、ルシフェリン、及びビオチンから選択される１種又は複数種であるモノクローナル抗体コンジュゲートを開示する。
【0012】
さらに、本発明は、Ｔリンパ球を活性化する薬物、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、又はＴリンパ球におけるＩＬ－２及びＩＦＮ－γの発現を上昇させる薬物の製造における上記のモノクローナル抗体コンジュゲートの使用を開示する。
【0013】
さらに、本発明は、腫瘍の予防及び／又は治療及び／又は補助的な治療のための薬物の製造における上記のモノクローナル抗体コンジュゲートの使用を開示する。
【発明の効果】
【0014】
本発明の進歩性は以下のとおりである。本発明では、哺乳動物細胞発現系を用いて組み換えＧＩＴＲを作製し、これを抗原としてマウスを免疫し、マウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマ細胞を得る。大量のハイブリドーマ細胞の数回のクローニングとスクリーニングにより、いくつかのモノクローナルハイブリドーマ細胞株を得る。これらのハイブリドーマ細胞株はＧＩＴＲと特異的かつ高親和性で結合するモノクローナル抗体を産生でき、混合リンパ細胞反応中のＩＬ－２、ＩＮＦ－γの分泌を促進でき、また、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を有効に遮断でき、しかも、ＲＴ－ＰＣＲにより抗体の軽鎖と重鎖の可変領域をコードする遺伝子をクローニングし、相補性決定領域グラフト法を採用してヒト化抗体を構築する。インビトロ機能試験により、これらのヒト化ＧＩＴＲ抗体は特異的かつ高親和性でＧＩＴＲタンパク質と結合でき、Ｔ細胞からのサイトカインＩＬ－２とＩＮＦ－γの分泌を著しく促進でき、しかも、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断できることを明らかにした。以上の実験結果は、本発明の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、又は、本発明の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むモノクローナル抗体コンジュゲートは、Ｔリンパ球を活性化する薬物、Ｔリンパ球のＩＬ－２及びＩＮＦ－γの発現を上昇させる薬物、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、及び腫瘍の予防及び治療又は補助的な治療のための薬物の製造において応用の将来性が期待できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲ－ｍＦｃタンパク質に結合するときのＥＣ５０をＥＬＩＳＡ方法で検出するものである。
【図2】ヒト化ＧＩＴＲ抗体が細胞膜上のＧＩＴＲに結合するときのＦＡＣＳアッセイの結果を示している。
【図3】ＧＩＴＲ－ＬとＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞との結合に対するヒト化ＧＩＴＲ抗体の遮断作用を示している。
【図4】２９３Ｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦｋｂ－ｌｕｃ細胞レポーター遺伝子アッセイに基づくヒト化抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ活性化活性を示している。
【図5】ヒト化ＧＩＴＲ抗体が架橋せずにＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞を活性化してサイトカインＩＬ２を放出させる結果を示している。
【図6】ヒト化ＧＩＴＲ抗体が架橋された状態でＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞を活性化してサイトカインＩＬ２を放出させる結果を示している。
【図7】ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカインＩＬ２産生に対するヒト化ＧＩＴＲ抗体の影響を示している。
【図8】ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカインＩＦＮ－γ産生に対するヒト化ＧＩＴＲ抗体の影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、具体的な実施形態を用いて、本発明の技術的解決手段をさらに説明する。当業者によって明らかなように、前記実施例が単に本発明の理解を助けるものであり、本発明を特に限定するものとは見なすべきではなく、下記の実施例で使用される実験方法は、特に断らない限り、いずれも通常の方法であり、下記の実施例で使用される材料や試薬などは、特に断らない限り、商業的に入手することができ、本発明に係る抗体のアミノ酸は表１～３に示される。
【0017】
【表1】
【0018】
【表2】
【0019】
【表3】
【0020】
【表4】
【0021】
【表5】
【0022】
【表6】
【0023】
【表7】
【0024】
【表8】
【0025】
実施例１
抗ＧＩＴＲハイブリドーマ抗体の産生
東大生物社製の発現精製したヒト化ＧＩＴＲ（ＥＣＤ）－ｍＦｃ（Kim et al., 2007，Oncol Rep. 18: 1189）融合タンパク質を抗原として、等体積の完全フロイントアジュバント（Sigma，Cat No: F5581）と十分に乳化した後、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（昭衍（蘇州）新薬研究センター有限公司より購入）を５０μｇ／匹の抗原免疫量で皮下免疫した。その後、２週間ごとに、同じ用量の抗原と不完全フロイントアジュバント（Sigma，Cat No: F5506）を十分に乳化した後、マウスを３回皮下免疫した。３回免疫した後、マウスの血清力価を測定し、融合の３日前に腹腔を通じて追加免疫を行った。ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（Sigma，Cat No: 7181）を融合剤として、マウスの脾臓細胞とＳＰ２／０細胞を４：１の割合で混合した。１ウェルあたり０．１ｍＬの１Ｘ ＨＡＴ培地（Invitrogen，Cat No: 21060-017）を含む９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に融合した細胞を加えた。３日目に、ＨＴ ０．１ｍＬ（Invitrogen，Cat No: 11067-030）培地を加え、７日目に９６ウェルプレート内の培地を吸引し、新鮮なＨＴ培地を０．２ｍＬ補充した。９日目には、上清を採取して次のＥＬＩＳＡ検出とＦＡＣＳ検出に用いた。
抗ＧＩＴＲハイブリドーマ抗体の産生
東大生物社製の発現精製したヒト化ＧＩＴＲ（ＥＣＤ）－ｍＦｃ（Kim et al., 2007，Oncol Rep. 18: 1189）融合タンパク質を抗原として、等体積の完全フロイントアジュバント（Sigma，Cat No: F5581）と十分に乳化した後、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（昭衍（蘇州）新薬研究センター有限公司より購入）を５０μｇ／匹の抗原免疫量で皮下免疫した。その後、２週間ごとに、同じ用量の抗原と不完全フロイントアジュバント（Sigma，Cat No: F5506）を十分に乳化した後、マウスを３回皮下免疫した。３回免疫した後、マウスの血清力価を測定し、融合の３日前に腹腔を通じて追加免疫を行った。ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（Sigma，Cat No: 7181）を融合剤として、マウスの脾臓細胞とＳＰ２／０細胞を４：１の割合で混合した。１ウェルあたり０．１ｍＬの１Ｘ ＨＡＴ培地（Invitrogen，Cat No: 21060-017）を含む９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に融合した細胞を加えた。３日目に、ＨＴ ０．１ｍＬ（Invitrogen，Cat No: 11067-030）培地を加え、７日目に９６ウェルプレート内の培地を吸引し、新鮮なＨＴ培地を０．２ｍＬ補充した。９日目には、上清を採取して次のＥＬＩＳＡ検出とＦＡＣＳ検出に用いた。
【0026】
実施例２
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びレポーター遺伝子アッセイに基づくポリクローナルハイブリドーマのスクリーニング解析
これらのアッセイの目的は、ＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの相互作用を遮断し、ＧＩＴＲ分子の活性を著しく活性化することができるポリクローナルハイブリドーマをスクリーニングし、その中から、高い結合力と高い刺激活性を有するポリクローナルハイブリドーマを選択してサブクローニングを行い、所望のモノクローナルハイブリドーマ抗体を得ることである。
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びレポーター遺伝子アッセイに基づくポリクローナルハイブリドーマのスクリーニング解析
これらのアッセイの目的は、ＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの相互作用を遮断し、ＧＩＴＲ分子の活性を著しく活性化することができるポリクローナルハイブリドーマをスクリーニングし、その中から、高い結合力と高い刺激活性を有するポリクローナルハイブリドーマを選択してサブクローニングを行い、所望のモノクローナルハイブリドーマ抗体を得ることである。
【0027】
高いＥＬＩＳＡ力価を持つ免疫マウスの脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と融合し、７日間培養した後、ハイブリドーマ細胞に対して、まずＥＬＩＳＡアッセイとＦＡＣＳアッセイを行い、ＧＩＴＲに結合できる陽性ハイブリドーマを発見してスクリーニングした後、２９３Ｔルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて、機能的応答反応を有するポリクローナルハイブリドーマをスクリーニングした。この操作は合計４０数個のＧＩＴＲとの結合が強いポリクローナルハイブリドーマ抗体を同定し、レポーター遺伝子アッセイを行った後、その中の結合力と刺激活性が顕著なポリクローナルハイブリドーマを選択して、次のサブクローンスクリーニングを行った。ＧＩＴＲとの結合が強いハイブリドーマ細胞を液体窒素にて凍結保存した。
【0028】
ＥＬＩＳＡ検出
ＧＩＴＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Corning，Cat No: 9018）を被覆し、４℃で一晩放置し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、ブロック緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Sigma，Cat No: V90093））を加えて、１時間インキュベートし、９６ウェルプレートを３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を加えて１時間インキュベートし、３回洗浄した。１ウェル当たり１：１００００倍希釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Thermo，Cat No: 31432）１００μＬを加え、室温で１時間インキュベートした後、３回洗浄した。１ウェル当たりＴＭＢ（北京百奥賽博社製、Cat No: ES-002）１００μＬを加えて３分間発色し、１００μＬ／ウェルの停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を加えて反応を停止し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダを用いて各サンプルのＯＤ４５０×シグナルを測定した。
ＧＩＴＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃで９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Corning，Cat No: 9018）を被覆し、４℃で一晩放置し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、ブロック緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Sigma，Cat No: V90093））を加えて、１時間インキュベートし、９６ウェルプレートを３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を加えて１時間インキュベートし、３回洗浄した。１ウェル当たり１：１００００倍希釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Thermo，Cat No: 31432）１００μＬを加え、室温で１時間インキュベートした後、３回洗浄した。１ウェル当たりＴＭＢ（北京百奥賽博社製、Cat No: ES-002）１００μＬを加えて３分間発色し、１００μＬ／ウェルの停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を加えて反応を停止し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダを用いて各サンプルのＯＤ４５０×シグナルを測定した。
【0029】
抗体結合力のＦＡＣＳ解析
上記のＥＬＩＳＡ検出で陽性となったハイブリドーマ上清５０μＬを２９３Ｔ－ＧＩＴＲ細胞５０μＬと混合し（１×１０５細胞／ウェル）、Ｕ字底９６ウェルプレートに加えて１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）で２回遠心洗浄した後、１：４００倍希釈したＰＥ標識ヒツジ抗マウス二次抗体（Biolegend，Cat No: 405307）を加え、３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ＢＤ Ｃ６フローサイトメータで２９３Ｔ－ＧＩＴＲ細胞のＰＥシグナルを検出した。
上記のＥＬＩＳＡ検出で陽性となったハイブリドーマ上清５０μＬを２９３Ｔ－ＧＩＴＲ細胞５０μＬと混合し（１×１０５細胞／ウェル）、Ｕ字底９６ウェルプレートに加えて１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）で２回遠心洗浄した後、１：４００倍希釈したＰＥ標識ヒツジ抗マウス二次抗体（Biolegend，Cat No: 405307）を加え、３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ＢＤ Ｃ６フローサイトメータで２９３Ｔ－ＧＩＴＲ細胞のＰＥシグナルを検出した。
【0030】
抗体遮断作用のＦＡＣＳ解析
ＢＤ Ｃ６を用いたＦＡＣＳ解析を行い、ビオチン標識ヒト化ＧＩＴＲリガンドのＪｕｒｋａｔ－ｈＧＩＴＲ細胞への結合に対するハイブリドーマ抗体の遮断作用を決定した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＧＩＴＲ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳを含むＰＢＳ）に懸濁した。希釈したハイブリドーマ抗体を細胞懸濁液に添加し、９６ウェルプレートにて４℃で１時間インキュベートした。ビオチン標識ヒトＧＩＴＲリガンドタンパク質を９６ウェルプレートのウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後の９６ウェルプレートを３回洗浄し、マウス抗ビオチンＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ、カタログ番号：４０９００４）を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。９６ウェルプレート中の細胞を３回洗浄し、最後にＢＤ Ｃ６で解析した。
ＢＤ Ｃ６を用いたＦＡＣＳ解析を行い、ビオチン標識ヒト化ＧＩＴＲリガンドのＪｕｒｋａｔ－ｈＧＩＴＲ細胞への結合に対するハイブリドーマ抗体の遮断作用を決定した。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＧＩＴＲ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳを含むＰＢＳ）に懸濁した。希釈したハイブリドーマ抗体を細胞懸濁液に添加し、９６ウェルプレートにて４℃で１時間インキュベートした。ビオチン標識ヒトＧＩＴＲリガンドタンパク質を９６ウェルプレートのウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後の９６ウェルプレートを３回洗浄し、マウス抗ビオチンＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ、カタログ番号：４０９００４）を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。９６ウェルプレート中の細胞を３回洗浄し、最後にＢＤ Ｃ６で解析した。
【0031】
Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞のレポーター遺伝子アッセイに基づくハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の免疫活性化における作用の確認の解析
抗ＧＩＴＲハイブリドーマ上清に対して、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞株を用いてレポーター遺伝子のＦＡＣＳ解析を行った。１つの反応につき、２５０００ Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞を用いて、これらの細胞を９６ウェル培養プレートの各ウェルに加え、次に、ハイブリドーマ上清５０μＬを各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６２０）５０μＬで細胞を分解し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋを用いて発光条件下でシグナルを読み取った。
抗ＧＩＴＲハイブリドーマ上清に対して、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞株を用いてレポーター遺伝子のＦＡＣＳ解析を行った。１つの反応につき、２５０００ Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞を用いて、これらの細胞を９６ウェル培養プレートの各ウェルに加え、次に、ハイブリドーマ上清５０μＬを各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２６２０）５０μＬで細胞を分解し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋを用いて発光条件下でシグナルを読み取った。
【0032】
実施例３
ポリクローナルハイブリドーマ細胞のサブクローニング、ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ細胞の増幅培養及び抗体精製、並びにモノクローナルハイブリドーマ抗体のＤＮＡ配列解析
サブクローニングの目的は、モノクローナルハイブリドーマ細胞を作成して、モノクローナル抗体クローンを得ることである。本発明のサブクローニング方法は、限界希釈の手順に基づいて、９６ウェルプレートで１ウェルあたり単一のクローンを産生するハイブリドーマ細胞を得ることである。得られた単一のクローンに他の細胞成分がないように、複数回（３回）のサブクローニングを行った。各回のサブクローニングに対して、すべてＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びレポーター遺伝子活性化活性の検出を行った。３回のサブクローニング後、ＧＩＴＲ結合能と刺激活性を高く維持するモノクローナル細胞については、一部は凍結保存に用いられ、他の一部は精製のために十分な量のモノクローナル抗体を得るために、細胞増幅培養及び更なるアッセイに用いられた。
ポリクローナルハイブリドーマ細胞のサブクローニング、ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ細胞の増幅培養及び抗体精製、並びにモノクローナルハイブリドーマ抗体のＤＮＡ配列解析
サブクローニングの目的は、モノクローナルハイブリドーマ細胞を作成して、モノクローナル抗体クローンを得ることである。本発明のサブクローニング方法は、限界希釈の手順に基づいて、９６ウェルプレートで１ウェルあたり単一のクローンを産生するハイブリドーマ細胞を得ることである。得られた単一のクローンに他の細胞成分がないように、複数回（３回）のサブクローニングを行った。各回のサブクローニングに対して、すべてＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びレポーター遺伝子活性化活性の検出を行った。３回のサブクローニング後、ＧＩＴＲ結合能と刺激活性を高く維持するモノクローナル細胞については、一部は凍結保存に用いられ、他の一部は精製のために十分な量のモノクローナル抗体を得るために、細胞増幅培養及び更なるアッセイに用いられた。
【0033】
４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３を含む計１４種類の抗ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ細胞の培養及び抗体精製を行った。ハイブリドーマ細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２％のＬ－グルタミン、１％の調節用ＮａＨＣＯ３溶液を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（GIBCO；Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）で培養した。次に、選択されたハイブリドーマ細胞を無血清培地に適応させ、プロティン－Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて上清から抗体を精製した。ＰＢＳで洗浄した後、結合された抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出し、次いでｐＨを２．０Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。Ｕｌｔｒａ－１５遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）は緩衝液交換と抗体濃縮に用いられている。
【0034】
実施例４
精製した４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３のハイブリドーマ抗ｈＧＩＴＲモノクローナル抗体に対し、更なるＧＩＴＲ結合力、ＧＩＴＲリガンドに対する遮断作用、レポーター遺伝子に基づくＧＩＴＲ活性化活性、及びサル由来ＧＩＴＲとの交差結合特性のアッセイ解析を行い、実験はＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞を用いたレポーター遺伝子活性化に基づく解析を行った。
精製した４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３のハイブリドーマ抗ｈＧＩＴＲモノクローナル抗体に対し、更なるＧＩＴＲ結合力、ＧＩＴＲリガンドに対する遮断作用、レポーター遺伝子に基づくＧＩＴＲ活性化活性、及びサル由来ＧＩＴＲとの交差結合特性のアッセイ解析を行い、実験はＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞を用いたレポーター遺伝子活性化に基づく解析を行った。
【0035】
ＥＬＩＳＡ方法とＦＡＣＳ方法に基づくアッセイ解析
用いた方法は上記の実施例２に記載の方法と似ているが、ここでのアッセイでは、測定濃度の精製抗体を用いており、連続希釈した抗体濃度とそれに対応する結果を用いて、ＥＣ５０とＩＣ５０の値を算出することができる点が異なる。表４～７に１４種類の抗体のアッセイ結果を示す。また、サル由来ＧＩＴＲとの交差結合特性の解析では、選択された１４種類の抗体がサル由来ＧＩＴＲと交差結合反応を示した。
用いた方法は上記の実施例２に記載の方法と似ているが、ここでのアッセイでは、測定濃度の精製抗体を用いており、連続希釈した抗体濃度とそれに対応する結果を用いて、ＥＣ５０とＩＣ５０の値を算出することができる点が異なる。表４～７に１４種類の抗体のアッセイ結果を示す。また、サル由来ＧＩＴＲとの交差結合特性の解析では、選択された１４種類の抗体がサル由来ＧＩＴＲと交差結合反応を示した。
【0036】
【表9】
【0037】
【表10】
【0038】
【表11】
【0039】
【表12】
【0040】
実施例５
Ｊｕｒｋａｔ細胞のＩＬ－２サイトカイン放出の活性化におけるハイブリドーマＧＩＴＲ抗体の活性アッセイ
ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の免疫活性化活性を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞のＩＬ２サイトカイン放出はＧＩＴＲシグナル伝達経路活性化の評価指標の１つとして用いられている。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞培養は、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０で行った。培養前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により常温で被覆して、一晩放置した。プレートのウェルを洗浄した後、ブロック緩衝液を２００μＬ添加し、３７℃で１時間ブロックしてインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて、１時間インキュベートした。さらにＰＢＳでプレートを洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェルあたり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）を測定した。結果を表８に示す。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のＩＬ－２サイトカイン放出の活性化におけるハイブリドーマＧＩＴＲ抗体の活性アッセイ
ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の免疫活性化活性を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞のＩＬ２サイトカイン放出はＧＩＴＲシグナル伝達経路活性化の評価指標の１つとして用いられている。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞培養は、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０で行った。培養前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により常温で被覆して、一晩放置した。プレートのウェルを洗浄した後、ブロック緩衝液を２００μＬ添加し、３７℃で１時間ブロックしてインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて、１時間インキュベートした。さらにＰＢＳでプレートを洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェルあたり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）を測定した。結果を表８に示す。
【0041】
【表13】
【0042】
実施例６
ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化及びサイトカイン産生に対するハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の影響のアッセイ
さらにＧＩＴＲシグナル経路の活性化におけるハイブリドーマＧＩＴＲ抗体の活性を評価するために、本研究では、初代リンパエフェクター細胞を用いて免疫細胞からのＩＬ２及びＩＦＮγサイトカインの放出に対する抗体の促進作用を測定した。ＣＤ４ Ｔ細胞の陰性選択精製キット及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培養液を用いて、ヒト化ＰＢＭＣを基にしてさらに精製して、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を得た。Ｔ細胞を精製する前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により常温で被覆し、一晩放置した。プレートのウェルを洗浄した後、ブロック緩衝液２００μＬを添加し、３７℃で１時間ブロックしてインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、ＣＤ４ Ｔ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェル当たり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取した後、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ）を用いてＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）とＩＦＮ－γ（産生番号：ＤＹ２８５）を測定した。結果を表９に示す。
ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化及びサイトカイン産生に対するハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の影響のアッセイ
さらにＧＩＴＲシグナル経路の活性化におけるハイブリドーマＧＩＴＲ抗体の活性を評価するために、本研究では、初代リンパエフェクター細胞を用いて免疫細胞からのＩＬ２及びＩＦＮγサイトカインの放出に対する抗体の促進作用を測定した。ＣＤ４ Ｔ細胞の陰性選択精製キット及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培養液を用いて、ヒト化ＰＢＭＣを基にしてさらに精製して、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を得た。Ｔ細胞を精製する前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により常温で被覆し、一晩放置した。プレートのウェルを洗浄した後、ブロック緩衝液２００μＬを添加し、３７℃で１時間ブロックしてインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、ＣＤ４ Ｔ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェル当たり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取した後、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ）を用いてＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）とＩＦＮ－γ（産生番号：ＤＹ２８５）を測定した。結果を表９に示す。
【0043】
【表14】
【0044】
実施例７
ＧＩＴＲハイブリドーマモノクローナル抗体ｃＤＮＡクローニング及び配列解析
４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３という１４種類の抗ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体に対してＤＮＡ配列検出を行った。その対応するアミノ酸配列の解析結果を表１、表２、及び表３に示す。
ＧＩＴＲハイブリドーマモノクローナル抗体ｃＤＮＡクローニング及び配列解析
４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３という１４種類の抗ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体に対してＤＮＡ配列検出を行った。その対応するアミノ酸配列の解析結果を表１、表２、及び表３に示す。
【0045】
ＧＩＴＲ抗体の可変領域遺伝子のクローニング解析は以下のステップを含む。ＴＲＩｚｏｎ（Cwbiotech，Cat No: CW0580）を用いて、ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ細胞株を分解し、ハイブリドーマ細胞の総ＲＮＡを抽出した。ＨｉＦｉ Ｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Cwbiotech，Cat No: CW2569）を用いて、ハイブリドーマ細胞のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをテンプレートとし、縮重プライマーを用いてＰＣＲ法（Kettleborough et al.（1993）Eur. J Immunology 23: 206-211；Strebe et al.（2010）Antibody Engineering 1:3-14）により抗体の重鎖と軽鎖の可変領域遺伝子を増幅した。反応はＳ１０００ＴＭサーマルサイクラー（Bio-Rad，CAT#：184-2000）で、９４℃、１．５分間変性；５０℃、１分間アニール；７２℃で１分間合成のように３０サイクル行われた。３０サイクル目が終了した後、反応混合物を７２℃でさらに７分間インキュベートして伸長させた。
ＰＣＲ混合物を０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１％アガロース／Ｔｒｉｓ－ボレートゲル中で電気泳動した。ゲルから所望の大きさのＤＮＡ断片（重鎖と軽鎖は約４００ｂｐ）を切り出し、精製した。精製したＰＣＲ産物３μｌをｐＭＤ－１８Ｔベクター（Takara，CAT#：D101Aにクローニングし、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、プレートに塗布して、３７℃で一晩培養した。培養プレートから単一のクローンを選んで、拡大培養後、プラスミドを抽出し、抗体の遺伝子配列を測定した。抗体の遺伝子配列により、その相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域を解析した。
ＰＣＲ混合物を０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１％アガロース／Ｔｒｉｓ－ボレートゲル中で電気泳動した。ゲルから所望の大きさのＤＮＡ断片（重鎖と軽鎖は約４００ｂｐ）を切り出し、精製した。精製したＰＣＲ産物３μｌをｐＭＤ－１８Ｔベクター（Takara，CAT#：D101Aにクローニングし、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、プレートに塗布して、３７℃で一晩培養した。培養プレートから単一のクローンを選んで、拡大培養後、プラスミドを抽出し、抗体の遺伝子配列を測定した。抗体の遺伝子配列により、その相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域を解析した。
【0046】
抗体の重鎖と軽鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は表１と表２に示されている。抗体の重鎖と軽鎖の可変領域の全長アミノ酸配列は表３に示されている。対応するハイブリドーマクローンからは、４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３という１４種類の抗体の可変領域配列が増幅され（表を参照）、これらの可変領域配列は、対応する軽鎖可変配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３、１０１及び１０９と、対応する重鎖可変配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９、９７、及び１０５と、を有する。これらの抗体は、ＧＩＴＲを刺激し、Ｔ細胞の活性化及びサイトカインの放出を増加させるなど、ある所望の機能を示す。
【0047】
実施例８
ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体のヒト化
４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３という１４種類の抗ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体に対して、総合的な解析と比較（ＧＩＴＲ結合力、ＧＩＴＲリガンドに対する遮断作用、ＧＩＴＲと免疫細胞に対する活性化活性、抗体のＤＮＡ配列などを含む）を行ったところ、その中から１０Ｅ１１、４Ｅ４、４Ｂ１１及び３Ｆ５という４つを選択し、更なるＧＩＴＲ抗体のヒト化改変を行った。
ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体のヒト化
４Ｅ１、８Ｈ４、４Ｅ４、３Ｆ５、４Ｃ１、７Ｄ７、７Ｅ１１、１０Ｅ１１、３Ｇ１２、４Ｂ１１、５Ｆ１、５Ｆ６、１３Ｇ１２及び９Ｂ３という１４種類の抗ＧＩＴＲモノクローナルハイブリドーマ抗体に対して、総合的な解析と比較（ＧＩＴＲ結合力、ＧＩＴＲリガンドに対する遮断作用、ＧＩＴＲと免疫細胞に対する活性化活性、抗体のＤＮＡ配列などを含む）を行ったところ、その中から１０Ｅ１１、４Ｅ４、４Ｂ１１及び３Ｆ５という４つを選択し、更なるＧＩＴＲ抗体のヒト化改変を行った。
【0048】
ＧＩＴＲ抗体のヒト化設計には相補性決定領域グラフト法が使用された。まず、ＩＭＧＴデータベースにおいて、マウス由来の１０Ｅ１１、４Ｅ４、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域との相同性が最も高いヒト胚細胞系抗体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）配列をそれぞれ検索した。１０Ｅ１１抗体の軽鎖可変領域のヒト化に選択された胚細胞系はＩＧＫＶ３－１５＊０１であり、重鎖可変領域のヒト化にはＩＧＨＶ５－１０－１＊０１が選択された。４Ｅ４抗体の軽鎖可変領域のヒト化に選択された胚細胞系はＩＧＫＶ２－２８＊０１であり、重鎖可変領域のヒト化にはＩＧＨＶ１－２＊０６が選択された。４Ｂ１１抗体の軽鎖のヒト化にはＩＧＫＶ３－１１＊０１が選択され、重鎖のヒト化にはＩＧＨＶ１－３＊０１が選択された。３Ｆ５抗体の軽鎖のヒト化にはＩＧＫＶ２－２４＊０１が選択され、重鎖のヒト化にはＩＧＨＶ１－２＊０２が選択された。マウス由来抗体のＣＤＲ領域を残し、マウス由来抗体のフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列をヒト胚細胞系抗体のフレームワーク領域の配列に置換した。次に、マウス由来抗体の構造モデルを作成し、ヒト由来抗体と対応するマウス由来抗体の構造モデル中のそれぞれの異なるアミノ酸部位を１つずつ比較し、フレームワーク領域のある部位にヒトのアミノ酸配列を採用してもＣＤＲ領域の空間構造の破壊又は変化がない場合には、その部位にヒトのアミノ酸配列を使用し、そうでない場合には、その部位に対応するマウス由来配列を使用した（すなわち、マウス由来配列に復帰突然変異）。構造シミュレーションにより、１０Ｅ１１、４Ｅ４、４Ｂ１１及び３Ｆ５ヒト化抗体のフレームワーク領域のアミノ酸の一部をマウス由来配列に復帰突然変異させた。
【0049】
これにより、上記のテンプレート中のヒト抗体のＣＤＲアミノ酸配列が、マウスの４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗体のＣＤＲのアミノ酸配列に置換される。また、上記のテンプレートのヒト抗体ＶＨ及びＶＬのフレームワークにマウスの４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗体のＶＨ及びＶＬの必須アミノ酸配列を移植して、機能性ヒト化抗体を得た。また、４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５のＶＨ及びＶＬについては、上記のテンプレートのヒト抗体のフレームワークアミノ酸のいくつかの部位がマウス４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗体中の対応するアミノ酸配列に逆変異している。
【0050】
１０Ｅ１１抗体のヒト化重鎖の２４位のＧｌｙはＡｌａに復帰突然変異し、２８位のＳｅｒはＰｒｏに復帰突然変異し、２９位のＰｈｅはＶａｌに復帰突然変異し、３０位のＴｈｒはＳｅｒに復帰突然変異し、４８位のＭｅｔはＩｌｅに復帰突然変異し、６９位のＩｌｅはＰｈｅに復帰突然変異し、７３位のＬｙｓはＩｌｅに復帰突然変異し、９３位のＡｌａはＳｅｒに復帰突然変異した。１０Ｅ１１抗体のヒト化軽鎖の４９位のＴｙｒはＳｅｒに復帰突然変異した。４Ｅ４抗体のヒト化重鎖の４８位のＭｅｔはＩｌｅに復帰突然変異し、６７位のＶａｌはＡｌａに復帰突然変異し、６９位のＭｅｔはＬｅｕに復帰突然変異し、７１位のＡｒｇはＶａｌに復帰突然変異し、７３位のＴｈｒはＬｙｓに復帰突然変異した。４Ｅ４抗体のヒト化軽鎖の２位のＩｌｅはＶａｌに復帰突然変異した。４Ｂ１１抗体のヒト化重鎖の２７位のＴｙｒはＰｈｅに復帰突然変異し、４８位のＭｅｔはＩｌｅに復帰突然変異し、６７位のＶａｌはＡｌａに復帰突然変異し、６９位のＩｌｅはＬｅｕに復帰突然変異し、７１位のＡｒｇはＳｅｒに復帰突然変異し、７３位のＴｈｒはＬｙｓに復帰突然変異した。４Ｂ１１抗体のヒト化軽鎖の４９位のＴｙｒはＬｙｓに復帰突然変異した。３Ｆ５抗体のヒト化重鎖の４８位のＭｅｔはＩｌｅに復帰突然変異し、６７位のＶａｌはＡｌａに復帰突然変異し、６９位のＭｅｔはＬｅｕに復帰突然変異し、７１位のＡｒｇはＶａｌに復帰突然変異し、７３位のＴｈｒはＬｙｓに復帰突然変異した。３Ｆ５抗体のヒト化軽鎖の４６位のＬｅｕはＡｒｇに復帰突然変異した。
【0051】
１０Ｅ１１ヒト化抗体の重鎖と軽鎖の可変領域アミノ酸の配列番号は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９である。４Ｅ４ヒト化抗体の重鎖と軽鎖の可変領域アミノ酸の配列番号は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４である。４Ｂ１１ヒト化抗体の重鎖と軽鎖の可変領域アミノ酸の配列番号は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６である。３Ｆ５ヒト化抗体の重鎖と軽鎖の可変領域アミノ酸の配列番号は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８である。１０Ｅ１１、４Ｅ４、４Ｂ１１及び３Ｆ５ヒト化抗体をＩｇＧ１サブタイプとして構築し、ヒト化４Ｅ４、１０Ｅ１１及び４Ｂ１１のヒト由来ＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）バージョン、ヒト化１０Ｅ１１のｈＩｇＧ１（３Ａ）バージョン及びヒト化１０Ｅ１１と３Ｆ５抗体のｈＩｇＧ４バージョン：ｈ１０Ｅ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ１０Ｅ１１－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１－ｈＩｇＧ４及びｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ４を産生した。アミノ酸配列は、上記の表３に示すように、ｈ４Ｅ４－ＩｇＧ１［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２１（全長重鎖）と１２２（全長軽鎖）］、ｈ１０Ｅ１１－ＩｇＧ１［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２７及び１２８（全長重鎖）と１３１（全長軽鎖））、ｈ１０Ｅ１１－ＩｇＧ１（３Ａ）［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２９（全長重鎖）と１３１（全長軽鎖））、ｈ１０Ｅ１１－ＩｇＧ４［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１３０（全長重鎖）と１３１（全長軽鎖））、ｈ４Ｂ１１－ＩｇＧ１［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２３（全長重鎖）と１２４（全長軽鎖））とｈ３Ｆ５－ＩｇＧ１［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２５（全長重鎖）と１２６（全長軽鎖））を含む。
【0052】
ヒト化４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗体の構築と発現
ヒト化抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡを合成し、それを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen，CAT：#V-790）にクローニングした。各種類のヒト化重鎖と軽鎖発現プラスミド１００μｇを用いてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞（２００ｍＬ，１０６／ｍＬ）にトランスフェクションし、６日間培養した。その後、プロティン－Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて上清中のヒト化抗体を精製した。
ヒト化抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡを合成し、それを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen，CAT：#V-790）にクローニングした。各種類のヒト化重鎖と軽鎖発現プラスミド１００μｇを用いてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞（２００ｍＬ，１０６／ｍＬ）にトランスフェクションし、６日間培養した。その後、プロティン－Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて上清中のヒト化抗体を精製した。
【0053】
実施例９
ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳを用いてヒト化抗体とＧＩＴＲとの結合を決定し、ＦＡＣＳを用いてＧＩＴＲリガンドに対する遮断活性を測定し、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞レポーター遺伝子アッセイに基づいてヒト化抗体の免疫活性化反応をアッセイして解析した。
ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳを用いてヒト化抗体とＧＩＴＲとの結合を決定し、ＦＡＣＳを用いてＧＩＴＲリガンドに対する遮断活性を測定し、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢ細胞レポーター遺伝子アッセイに基づいてヒト化抗体の免疫活性化反応をアッセイして解析した。
【0054】
ヒト化抗体の産生及び精製後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳに基づく結合解析及びＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞によるＧＩＴＲ－Ｌ遮断解析により、抗体の結合及び特異性を決定した。使用される方法は、上記の実施例２及び４に記載の方法と同様である。
【0055】
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイでは、ヒト化抗体はＧＩＴＲに顕著な結合を示し、図１に示すように、ＥＬＩＳＡ方法を用いてヒト化抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲ－ｍＦｃタンパク質に結合するときのＥＣ５０を検出した。ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体は、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ４、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１及びｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１を含む。図の上部には、一連のヒト化抗体又は対照ｈＩｇＧ１濃度の範囲における光吸収値が示されている。Ｘ軸に示すように、各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０００２ｎｇ／ｍＬ及び０．００００２ｎｇ／ｍＬである。図の下部にある表は、試験抗体ごとに計算されたＥＣ５０を示している。図に示すように、すべてのヒト化抗体はプレートに被覆されたＧＩＴＲ－ｍＦｃと有意な結合を示し、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１及びｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）はより強い結合力を示した。
【0056】
図２はＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞におけるＦＡＣＳに基づくＧＩＴＲへの結合を示している。下部のパネルには、それぞれのヒト化抗体のＥＣ５０が提供されている。４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１と１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１はＦＡＣＳ解析に基づく主要な結合物である。ヒト化ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ４、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒト由来ＩｇＧ１）を含む。図の上部は、一連のヒト化抗体又は対照ｈＩｇＧ１濃度の範囲における平均蛍光指標値を示している。下部には、試験抗体ごとに計算されたＥＣ５０が表示されている。その結果、すべてのヒト化抗体はＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞との顕著な結合を示した。また、ヒト化ｈ４Ｅ４とｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）抗体は最も主要な接着剤である。Ｘ軸に示すように、各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ及び０．００２ｎｇ／ｍＬである。
【0057】
図３はＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞におけるＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合に対するヒト化抗体の遮断を示している。使用されたＧＩＴＲ－Ｌの濃度は０．２５μｇ／ｍｌであり、試験されるＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ４、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒト由来ＩｇＧ１）を含む。Ｘ軸に示すように、各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、６．４ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ及び０．２５６ｎｇ／ｍＬである。その結果、すべてのヒト化ＧＩＴＲ抗体はＧＩＴＲ－ＬとＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞との結合に対して所定の遮断活性を示した。ヒト化ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）とｈ３Ｆ５抗体はより良い遮断作用がある。
【0058】
図４は２９３Ｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦｋｂ－ｌｕｃ細胞レポーター遺伝子アッセイに基づくヒト化抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ活性化活性を示している。試験される抗ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒト由来ＩｇＧ１）を含む。各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、６．４ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ及び０．２５６ｎｇ／ｍＬである。その結果、すべてのヒト化抗体は２９３Ｔ－ＧＩＴＲ－ＮＦｋｂ－ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対して強い活性化活性を有することが明らかになった。試験されるヒト化抗体間の活性は類似していた。
【0059】
実施例１０
Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ ＩＬ－２放出解析を用いたヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の活性化アッセイ
ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の活性化活性をアッセイするために、まず、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞におけるＧＩＴＲシグナル経路に対する抗体の刺激作用により抗体を評価した。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ、２９３Ｔ－ＯＫＴ３、２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ及び２９３Ｔ細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０で培養した。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ（１ウェル当たり１ｘ１０５細胞）細胞５０μｌと２９３Ｔ－ＯＫＴ３（１ウェル当たり２ｘ１０４細胞）細胞５０μｌと２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ又は２９３Ｔ（１ウェルあたり２ｘ１０４細部）細胞５０μｌを９６ウェルプレートの単一のウェルに添加した。希釈したＧＩＴＲ抗体の存在の有無に関わらず、３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）を測定した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ ＩＬ－２放出解析を用いたヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の活性化アッセイ
ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ抗体の活性化活性をアッセイするために、まず、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞におけるＧＩＴＲシグナル経路に対する抗体の刺激作用により抗体を評価した。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ、２９３Ｔ－ＯＫＴ３、２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ及び２９３Ｔ細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０で培養した。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ（１ウェル当たり１ｘ１０５細胞）細胞５０μｌと２９３Ｔ－ＯＫＴ３（１ウェル当たり２ｘ１０４細胞）細胞５０μｌと２９３Ｔ－ＣＤ３２Ａ又は２９３Ｔ（１ウェルあたり２ｘ１０４細部）細胞５０μｌを９６ウェルプレートの単一のウェルに添加した。希釈したＧＩＴＲ抗体の存在の有無に関わらず、３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を採取してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）を測定した。
【0060】
図５はヒト化抗－ＧＩＴＲ抗体が架橋せずにＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞を活性化してＩＬ２を放出させる結果を示している。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞は２９３Ｔ－ＯＫＴ３細胞中のＯＫＴ３によりある程度刺激された。試験される抗ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒト由来ＩｇＧ１）を含む。各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、６．４ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ及び０．２５６ｎｇ／ｍＬである。周知するように、すべてのヒト化抗体は、架橋することなく、Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞のＩＬ２放出をある程度刺激することができる。
【0061】
図６はヒト化抗ＧＩＴＲ抗体が架橋された状態でＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞を活性化してＩＬ２を放出させる結果を示している。架橋因子は、２９３Ｔ－ＣＤ３２ａ細胞で発現されるＣＤ３２ａである。Ｊｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞は２９３Ｔ－ＯＫＴ３細胞中のＯＫＴ３によりある程度刺激された。試験される抗ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒト由来ＩｇＧ１）を含む。各抗体の試験濃度は、それぞれ、２００００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、６．４ｎｇ／ｍＬ、１．２８ｎｇ／ｍＬ及び０．２５６ｎｇ／ｍＬである。周知するように、すべてのヒト化抗体は架橋によりＪｕｒｋａｔ－ＧＩＴＲ細胞（特にｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１）のＩＬ２放出に対してより強い刺激活性を示した。
【0062】
実施例１１
ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生に対するヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の影響
リンパ球のエフェクター細胞におけるＧＩＴＲシグナル伝達経路を刺激するＧＩＴＲハイブリドーマ抗体の活性を評価した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中のＣＤ４＋陰性選択キットを使用して、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により被覆して、一晩放置した。温度。ウェルを洗浄し、ブロック緩衝液２００μＬを添加してブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳでプレートを洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェルあたり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離して上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ）を使用してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）とＩＦＮ－γ（発生番号：ＤＹ２８５）を測定した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生に対するヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の影響
リンパ球のエフェクター細胞におけるＧＩＴＲシグナル伝達経路を刺激するＧＩＴＲハイブリドーマ抗体の活性を評価した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中のＣＤ４＋陰性選択キットを使用して、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。前日に、９６ウェルプレートを室温でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－００５－００８）とヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－００６－０７１）により被覆して、一晩放置した。温度。ウェルを洗浄し、ブロック緩衝液２００μＬを添加してブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で４０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１６－００３７－８５）をウェルに加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳでプレートを洗浄した後、希釈したＧＩＴＲ抗体の有無に関わらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェル（１ウェルあたり１×１０５細胞）に加えた。３７℃で４８又は７２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離して上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ）を使用してＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２０２）とＩＦＮ－γ（発生番号：ＤＹ２８５）を測定した。
【0063】
図７はＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ２産生に対するヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の影響を示している。試験される抗ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１）を含む。各抗体の試験濃度は、それぞれ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ及び０．０２ｎｇ／ｍＬである。図に示されるように、ヒト化１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び４Ｅ４抗体（特にｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１）は、初代ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカインＩＬ２産生に対して顕著な刺激作用があり、一方、ヒト化３Ｆ５抗体はこの解析において比較的低い活性を示した。
【0064】
図８はＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生に対するヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の影響を示している。試験される抗ＧＩＴＲ抗体はｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１（３Ａ）、ｈ１０Ｅ１１（ＡＶ）－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｅ４－ｈＩｇＧ１、ｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１、ｈ３Ｆ５－ｈＩｇＧ１及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１）を含む。各抗体の試験濃度は、それぞれ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ及び０．０２ｎｇ／ｍＬである。図に示されるように、ヒト化１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び４Ｅ４抗体（特にｈ４Ｂ１１－ｈＩｇＧ１）は、初代ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカインＩＦＮ－γ産生に対して顕著な刺激作用があり、一方、ヒト化３Ｆ５抗体はこの解析において低い活性を示した。その結果、図７のＩＬ２産生と類似したパターンが特定された。すなわち、ヒト化１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び４Ｅ４抗体は、ＩＬ２産生による初代ＣＤ４ Ｔ細胞の刺激に顕著な作用がある。一方、ヒト化３Ｆ５抗体は比較的低い活性化活性を示した。
【0065】
実施例１２
ヒト化４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗ＧＩＴＲ抗体のＢｉａｃｏｒｅ動力学解析
ヒト化抗体の結合特性を特徴付けるために、ＧＩＴＲと抗ＧＩＴＲ抗体との結合動力学をＢｉａｃｏｒｅ３０００で測定し、１Ｈｚのデータ収集レートで記録した。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ－１００８－３８）を１０ｍＭ ｐＨ５．０酢酸ナトリウムで希釈し、アミン結合キット（ＧＥ、ＢＲ１００５０）を用いてＣＭ５バイオセンサチップの参照フローセルと実験フローセルに約１５０００ＲＵまで固定化した。各サイクルの開始時に、希釈した試験抗体（１．５μｇ／ｍＬ）を実験フローセルに１分間注入して捕捉した。ＧＩＴＲ分析物シリーズの製造方法は以下のとおりである。原液を流動緩衝液で１００ｎＭに希釈した後、同一緩衝液中で０．７８ｎＭに２倍連続希釈した。分析物を３０μＬ／分の流速で３分間連続して参照フローセルと実験フローセルに注入した。次に、ランニング緩衝液（０．０５％ Ｐ２０含有ＰＢＳ）を３０μＬ／分の流速で１０分間流した。各サイクルの終了時に、１０ｍＭ ｐＨ１．７グリシン－ＨＣｌ緩衝液を１０μＬ／ｍｉｎの流速で３分間注入することによりバイオセンサ表面を再生した。分析物サンプルを注入するごとに（すなわちサイクルごとに）、同時に記録された応答を参照表面から減算し、次いで、単一の参照ランニング緩衝液サンプルから応答を減算することによって、実験用バイオセンサの表面から得られた結合応答について二重参照を行った。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェアを使用して、滴定シリーズ全体の二重参照センシングマップをＬａｎｇｍｕｉｒモデル（１：１）にフィッティングすることにより、結合速度定数と解離速度定数（ｋａとｋｄ）を同時に決定することができる。解離定数ＫＤは、決定された速度定数から関係式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａにより計算される。表１０に示すように、ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体はヒトＧＩＴＲに高い親和性で結合する。特にヒト化４Ｂ１１と１０Ｅ１１である。
ヒト化４Ｅ４、１０Ｅ１１、４Ｂ１１及び３Ｆ５抗ＧＩＴＲ抗体のＢｉａｃｏｒｅ動力学解析
ヒト化抗体の結合特性を特徴付けるために、ＧＩＴＲと抗ＧＩＴＲ抗体との結合動力学をＢｉａｃｏｒｅ３０００で測定し、１Ｈｚのデータ収集レートで記録した。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ－１００８－３８）を１０ｍＭ ｐＨ５．０酢酸ナトリウムで希釈し、アミン結合キット（ＧＥ、ＢＲ１００５０）を用いてＣＭ５バイオセンサチップの参照フローセルと実験フローセルに約１５０００ＲＵまで固定化した。各サイクルの開始時に、希釈した試験抗体（１．５μｇ／ｍＬ）を実験フローセルに１分間注入して捕捉した。ＧＩＴＲ分析物シリーズの製造方法は以下のとおりである。原液を流動緩衝液で１００ｎＭに希釈した後、同一緩衝液中で０．７８ｎＭに２倍連続希釈した。分析物を３０μＬ／分の流速で３分間連続して参照フローセルと実験フローセルに注入した。次に、ランニング緩衝液（０．０５％ Ｐ２０含有ＰＢＳ）を３０μＬ／分の流速で１０分間流した。各サイクルの終了時に、１０ｍＭ ｐＨ１．７グリシン－ＨＣｌ緩衝液を１０μＬ／ｍｉｎの流速で３分間注入することによりバイオセンサ表面を再生した。分析物サンプルを注入するごとに（すなわちサイクルごとに）、同時に記録された応答を参照表面から減算し、次いで、単一の参照ランニング緩衝液サンプルから応答を減算することによって、実験用バイオセンサの表面から得られた結合応答について二重参照を行った。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェアを使用して、滴定シリーズ全体の二重参照センシングマップをＬａｎｇｍｕｉｒモデル（１：１）にフィッティングすることにより、結合速度定数と解離速度定数（ｋａとｋｄ）を同時に決定することができる。解離定数ＫＤは、決定された速度定数から関係式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａにより計算される。表１０に示すように、ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体はヒトＧＩＴＲに高い親和性で結合する。特にヒト化４Ｂ１１と１０Ｅ１１である。
【0066】
【表15】
【0067】
以上の実施例の結果から、本発明の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、又は、本発明の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むモノクローナル抗体コンジュゲートは、ＧＩＴＲシグナル伝達を活性化する薬物、Ｔリンパ球を活性化する薬物、Ｔリンパ球のＩＬ－２及びＩＮＦ－γの発現を上昇させる薬物、ＧＩＴＲ－ＬとＧＩＴＲとの結合を遮断する薬物、及び腫瘍の予防及び治療又は補助的な治療のための薬物の製造において応用の将来性が期待できることが明らかになった。
【0068】
なお、以上は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとって明らかなように、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良を加えることができ、これらの改良も本発明の特許範囲とみなすことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】