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特表2023-535895単一ナノ粒子の高次元フィンガープリント及び多重化デジタルアッセイにおけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-22
(54)【発明の名称】単一ナノ粒子の高次元フィンガープリント及び多重化デジタルアッセイにおけるその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20230815BHJP
C09K 11/08 20060101ALI20230815BHJP
C09K 11/61 20060101ALI20230815BHJP
C09K 11/85 20060101ALI20230815BHJP
C09K 11/78 20060101ALI20230815BHJP
G01N 33/532 20060101ALI20230815BHJP
B82Y 20/00 20110101ALN20230815BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 B
C09K11/08 G ZNM
C09K11/61
C09K11/85
C09K11/78
G01N33/532 B
B82Y20/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023502915
(86)(22)【出願日】2021-08-04
(85)【翻訳文提出日】2023-02-20
(86)【国際出願番号】 AU2021050849
(87)【国際公開番号】W WO2022027097
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】2020902731
(32)【優先日】2020-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512089667
【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・テクノロジー・シドニー
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＳＹＤＮＥＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ジン，ダヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，ジアジア
(72)【発明者】
【氏名】リャオ，ジアヤン
【テーマコード（参考）】
2G043
4H001
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA02
2G043EA01
2G043FA02
2G043FA03
2G043KA08
2G043KA09
2G043LA03
2G043NA01
4H001XA03
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4H001YA67
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4H001YA69
4H001YA70
4H001YA71
(57)【要約】
本開示は、概して、ナノスケールでのコーディング能力を高めるために、いくつかの異なる技術を使用して、単一アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法に関する。本開示は、ナノ粒子のフィンガープリントをデコードするための時間分解広視野イメージング及びディープラーニング技術にも関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法であって、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントを操作するステップを含む方法。
【請求項2】
前記励起状態集団の前記立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントの操作は、前記ナノ粒子における界面エネルギー移行（ＩＥＭ）を変更することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＩＥＭは、前記ナノ粒子を、異なる励起波長にさらすことによって変更される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ナノ粒子は、ＵＣＮＰである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム、エルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムの１つ又は複数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム及び／又はエルビウムを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＵＣＮＰは、フッ化アルカリ、酸化物又はオキシ硫化物から選択されるホスト材料を含有する、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記フッ化アルカリは、ＮａＧｄＦ４、Ｃａ２Ｆ、ＮａＹＦ４、ＬｉＹＦ４、ＮａＬｕＦ４、ＬｉＬｕＦ４又はＫＭｎＦ３であり、及び前記酸化物は、Ｙ２Ｏ３である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＵＣＮＰは、コア－マルチシェルＵＣＮＰである、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記コア－マルチシェルＵＣＮＰは、コア、移行層及び増感層を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記移行層は、Ｙｂ３＋を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記増感層は、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記コアは、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋及び／又はＴｍ３＋を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記コアは、Ｙｂ３＋及びＥｒ３＋又はＹｂ３＋及びＴｍ３＋を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＵＣＮＰは、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ及びコア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰから選択される、請求項４～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＵＣＮＰは、約１５％未満、又は約１０％未満、又は約５％未満の変動係数（ＣＶ）値を有する、請求項４～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
多重アッセイにおける発光プローブを特定するための多重アッセイ方法であって、前記発光プローブを刺激して発光を生じさせることと、前記発光の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を測定することとを含む方法。
【請求項18】
前記多重アッセイは、サスペンションアレイである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
複数の発光プローブを刺激して発光を生じさせることと、前記発光の前記立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を測定することと、前記立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間の違いに基づいて１つ又は複数のプローブを特定することとをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記発光の前記立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間は、１つ又は複数のコードを提供する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記発光プローブは、ナノタグ、球、粒子又はキャリアである、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記発光プローブは、１つ又は複数のナノ粒子を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記発光プローブは、第１の態様に関連して上記された１つ又は複数のナノ粒子を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
多重アッセイを実施するための方法であって、前記多重アッセイは、プローブとして、異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する複数のナノ粒子を使用することを含み、前記プローブは、その異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間に基づいて互いに区別される、方法。
【請求項25】
前記発光プローブは、第１の態様に関連して上記された１つ又は複数のナノ粒子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを作製するための方法であって、（ａ）複数の異なる種類のナノ粒子を提供することであって、それぞれの異なる種類のナノ粒子は、別個の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する、提供すること、
（ｂ）スペクトル的に別個のナノ粒子の前記ライブラリーを提供するために、各種類内の前記ナノ粒子の以下のパラメータ：
前記ナノ粒子のコアサイズ；
コア中のエミッタイオン及び増感剤イオンの濃度；
増感層の厚さ；
前記増感層中の増感剤イオンの濃度；並びに
パッシベーション層の存在又は不存在
の１つ又は複数を変化させること
を含む方法。
【請求項27】
少なくとも３つの異なる種類のナノ粒子が作製され、及び各種類は、少なくとも１０の異なるタイプのナノ粒子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ナノ粒子は、ＵＣＮＰである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
前記異なる種類のＵＣＮＰは、活性化剤及び／又は増感剤の異なる組合せを有する種類のＵＣＮＰである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム、エルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムの１つ又は複数を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム及び／又はエルビウムを含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＵＣＮＰは、フッ化アルカリ、酸化物又はオキシ硫化物から選択されるホスト材料を含有する、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記フッ化アルカリは、ＮａＧｄＦ４、Ｃａ２Ｆ、ＮａＹＦ４、ＬｉＹＦ４、ＮａＬｕＦ４又はＬｉＬｕＦ４、ＫＭｎＦ３であり、及び前記酸化物は、Ｙ２Ｏ３である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記複数の異なる種類のＵＣＮＰは、コア－マルチシェルＵＣＮＰを有する少なくとも１つの種類を含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記コア－マルチシェルＵＣＮＰは、コア、移行層及び増感層を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記移行層は、Ｙｂ３＋を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記増感層は、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項38】
前記コアは、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋及び／又はＴｍ３＋を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記コアは、Ｙｂ３＋及びＥｒ３＋又はＹｂ３＋及びＴｍ３＋を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記複数の異なる種類のＵＣＮＰは、以下：コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰ及びβ－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰを含む、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記ＵＣＮＰは、約１５％未満、又は約１０％未満、又は約５％未満の変動係数（ＣＶ）値を有する、請求項２６～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記パラメータの全ては、変化される、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
請求項２６～４２のいずれか一項に記載の方法によって得られるときのスペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリー。
【請求項44】
請求項４３に記載のスペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーの、多重アッセイにおける使用であって、前記ナノ粒子は、プローブとして使用される、使用。
【請求項45】
前記プローブは、少なくともその発光プロファイルの異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間に基づいて互いに区別される、請求項４４に記載の使用。
【請求項46】
前記プローブは、広視野時間分解顕微鏡法又はディープラーニングを使用してデコードされる、請求項４４又は４５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
開示の分野
[0001] 本開示は、概して、ナノスケールでのコーディング能力を高めるために、いくつかの異なる技術を使用して、単一アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法に関する。本開示は、ナノ粒子のフィンガープリントをデコードするための時間分解広視野イメージング及びディープラーニング技術にも関する。
[0001] 本開示は、概して、ナノスケールでのコーディング能力を高めるために、いくつかの異なる技術を使用して、単一アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法に関する。本開示は、ナノ粒子のフィンガープリントをデコードするための時間分解広視野イメージング及びディープラーニング技術にも関する。
【背景技術】
【0002】
開示の背景
[0002] 本明細書全体にわたる従来技術のいずれの議論も、このような従来技術が広く知られていること又はこの分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認として決して考えられてはならない。
[0002] 本明細書全体にわたる従来技術のいずれの議論も、このような従来技術が広く知られていること又はこの分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認として決して考えられてはならない。
【0003】
[0003] ナノテクノロジーの最終的な目標は、前例のない精度で構造を操作し、単一ナノ粒子レベルで必要とされるパラメータに正確に一致するようにその機能を調整することである。容量が増大した光多重化は、大容量データストレージ、偽造防止、大量情報通信から、単一検査における複数の単一分子分析物のハイスループットスクリーニング及び複数の細胞コンパートメントの超解像度イメージングにわたる次世代の実現技術の現行の開発を促進することになる。
【0004】
[0004] スーパー容量光多重化では、直交次元において多重化コード（例えば、強度、色、偏光及び減衰時間）を構築し、それらを顕微鏡レベル及びナノスケールのキャリアに割り当て、直交光次元において十分な精度で、それらをハイスループットでデコードできることが要求される。光学バーコードを保有する材料のサイズは、望ましくは、顕微鏡レベルの範囲からナノスコピック範囲に引き下げることができるが、それは、放出光子の全体量（輝度）を犠牲にし、したがって検出可能なコードの数、例えば通常３～４色チャネル又は輝度レベルが制限される。ナノスケールの物体から放出されるシグナルの量は、指数関数的に減少する可能性があり、その大きさは、光回折限界を下回ることが多い。これにより、従来のフィルタ光学及び検出プロセスでは、十分なスペクトル－空間解像度でそれらをデコードすることができない。
【0005】
[0005] この満たされていない必要性は、均一なナノスコピックキャリアの作製において製造戦略及び正確な制御を追求するという材料科学にとって大きい課題をもたらし、さらに、フォトニクスコミュニティは、放出光子の数を最大にし、発光色（スペクトル）、寿命、偏光及び角運動量など、複数の直交次元で生成され得る光情報の多様性を探求することが要求される。
【0006】
[0006] ランタニドをドープしたアップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ）は、低エネルギーの近赤外光子を吸収して、可視及びＵＶ領域の高エネルギー発光を放出する。単一ＵＣＮＰは、均一であり、何時間にもわたって光安定性であり、生細胞での単一ナノ粒子追跡実験を可能にする。最近、各単一ＵＣＮＰのコア－シェル－シェル設計は、８Ｗ／ｃｍ３の低照射量下で毎秒約２００の光子を放出することが報告されており、強度均一ＵＣＮＰにより単一分子（デジタル）イムノアッセイが可能にされた。ＵＣＮＰの色ベースの多重化は、ドーパント、コア－シェル構造又は励起パルス持続時間を調整することによって実現され得るが、全ての色ベースのアプローチは、スペクトル領域におけるクロストークによって本質的に制限される。ミクロスフェアアレイのアンサンブル寿命測定、深部組織腫瘍イメージングのための時間領域造影剤及び高セキュリティレベル偽造防止の用途では、大きい進歩が遂げられている。単一ナノ粒子の感受性による寿命多重化が可能であったが、比較的低い輝度及び点走査型共焦点顕微鏡法では、読出しスループットが制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
開示の概要
[0007] 第１の態様では、本開示は、アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法を提供し、本方法は、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントを操作するステップを含む。
[0007] 第１の態様では、本開示は、アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法を提供し、本方法は、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントを操作するステップを含む。
【0008】
[0008] 励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントの操作は、ナノ粒子における界面エネルギー移行を変更することによって達成され得る。
【0009】
[0009] 界面エネルギー移行は、ナノ粒子を異なる励起波長にさらすことによって変更され得る。
【0010】
[0010] ナノ粒子は、ＵＣＮＰであり得る。
【0011】
[0011] ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム、エルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムの１つ又は複数を含み得る。
【0012】
[0012] ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム及び／又はエルビウムを含み得る。
【0013】
[0013] ＵＣＮＰは、フッ化アルカリ、酸化物又はオキシ硫化物から選択されるホスト材料を含有し得る。
【0014】
[0014] フッ化アルカリは、ＮａＧｄＦ４、Ｃａ２Ｆ、ＮａＹＦ４、ＬｉＹＦ４、ＮａＬｕＦ４又はＬｉＬｕＦ４、ＫＭｎＦ３であり得、及び酸化物は、Ｙ２Ｏ３であり得る。これらの材料の混合物も企図される。一実施形態では、ホスト材料は、ＮａＹＦ４である。
【0015】
[0015] ＵＣＮＰが結晶性である場合、ＮａＹＦ４は、六方相又は任意の他の結晶相であり得る。
【0016】
[0016] ＵＣＮＰは、コア－マルチシェルＵＣＮＰであり得る。
【0017】
[0017] コア－マルチシェルＵＣＮＰは、コア、移行層及び増感層を含み得る。
【0018】
[0018] 移行層は、Ｙｂ３＋を含み得る。
【0019】
[0019] 増感層は、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を含み得る。
【0020】
[0020] コアは、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋及び／又はＴｍ３＋を含み得る。
【0021】
[0021] コアは、Ｙｂ３＋及びＥｒ３＋又はＹｂ３＋及びＴｍ３＋を含み得る。
【0022】
[0022] ＵＣＮＰは、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ及びコア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰから選択され得る。
【0023】
[0023] ＵＣＮＰは、約１５％未満、又は約１０％未満、又は約５％未満の変動係数（ＣＶ）値を有し得る。
【0024】
[0024] 第２の態様では、本発明は、多重アッセイにおける発光プローブを特定するための多重アッセイ方法を提供し、本方法は、発光プローブを刺激して発光を生じさせることと、発光の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を測定することとを含む。
【0025】
[0025] 多重アレイは、サスペンションアレイであり得る。
【0026】
[0026] 本方法は、複数の発光プローブを刺激して発光を生じさせることと、発光の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を測定することと、立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間の違いに基づいて１つ又は複数のプローブを特定することとをさらに含み得る。
【0027】
[0027] 発光の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間は、１つ又は複数のコードを提供し得る。
【0028】
[0028] 発光プローブは、ナノタグ、球、粒子又はキャリアであり得る。
【0029】
[0029] 発光プローブは、１つ又は複数のナノ粒子を含み得る。
【0030】
[0030] 発光プローブは、第１の態様に関連して上記された１つ又は複数のナノ粒子を含み得る。
【0031】
[0031] 第３の態様では、本発明は、多重アッセイを実施するための方法を提供し、多重アッセイは、プローブとして、異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する複数のナノ粒子を使用することを含み、プローブは、その異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間に基づいて互いに区別される。
【0032】
[0032] 発光プローブは、第１の態様に関連して上記された１つ又は複数のナノ粒子を含み得る。
【0033】
[0033] 第４の態様では、本発明は、スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）複数の異なる種類のナノ粒子を提供することであって、それぞれの異なる種類のナノ粒子は、別個の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する、提供すること、
（ｂ）スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを提供するために、各種類内のナノ粒子の以下のパラメータ：
ナノ粒子のコアサイズ；
コア中のエミッタイオン及び増感剤イオンの濃度；
増感層の厚さ；
増感層中の増感剤イオンの濃度；並びに
パッシベーション層の存在又は不存在
の１つ又は複数を変化させること
を含む方法を提供する。
（ａ）複数の異なる種類のナノ粒子を提供することであって、それぞれの異なる種類のナノ粒子は、別個の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する、提供すること、
（ｂ）スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを提供するために、各種類内のナノ粒子の以下のパラメータ：
ナノ粒子のコアサイズ；
コア中のエミッタイオン及び増感剤イオンの濃度；
増感層の厚さ；
増感層中の増感剤イオンの濃度；並びに
パッシベーション層の存在又は不存在
の１つ又は複数を変化させること
を含む方法を提供する。
【0034】
[0034] 一実施形態では、少なくとも３つの異なる種類のナノ粒子が作製され、及び各種類は、少なくとも１０の異なるタイプのナノ粒子を含む。
【0035】
[0035] ナノ粒子は、ＵＣＮＰであり得る。
【0036】
[0036] 異なる種類のＵＣＮＰは、活性化剤及び／又は増感剤の異なる組合せを有する種類のＵＣＮＰであり得る。
【0037】
[0037] ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム、エルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムの１つ又は複数を含み得る。
【0038】
[0038] ＵＣＮＰは、ネオジム、イッテルビウム、ツリウム及び／又はエルビウムを含み得る。
【0039】
[0039] ＵＣＮＰは、フッ化アルカリ、酸化物又はオキシ硫化物から選択されるホスト材料を含有し得る。
【0040】
[0040] フッ化アルカリは、ＮａＧｄＦ４、Ｃａ２Ｆ、ＮａＹＦ４、ＬｉＹＦ４、ＮａＬｕＦ４又はＬｉＬｕＦ４、ＫＭｎＦ３であり得、及び酸化物は、Ｙ２Ｏ３であり得る。これらの材料の混合物も企図される。一実施形態では、ホスト材料は、ＮａＹＦ４である。
【0041】
[0041] ＵＣＮＰが結晶性である場合、ＮａＹＦ４は、六方相又は任意の他の結晶相であり得る。
【0042】
[0042] 一実施形態では、複数の異なる種類のＵＣＮＰは、コア－マルチシェルＵＣＮＰを有する少なくとも１つの種類を含む。
【0043】
[0043] コア－マルチシェルＵＣＮＰは、コア、移行層及び増感層を含み得る。
【0044】
[0044] 移行層は、Ｙｂ３＋を含み得る。
【0045】
[0045] 増感層は、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋を含み得る。
【0046】
[0046] コアは、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋及び／又はＴｍ３＋を含み得る。
【0047】
[0047] コアは、Ｙｂ３＋及びＥｒ３＋又はＹｂ３＋及びＴｍ３＋を含み得る。
【0048】
[0048] 一実施形態では、複数の異なる種類のＵＣＮＰは、以下：コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰ及びβ－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰを含む。
【0049】
[0049] ＵＣＮＰは、約１５％未満、又は約１０％未満、又は約５％未満の変動係数（ＣＶ）値を有し得る。
【0050】
[0050] 一実施形態では、パラメータの全ては、変化される。
【0051】
[0051] 第５の態様では、本発明は、第４の態様の方法によって得られるときのスペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを提供する。
【0052】
[0052] 第６の態様では、本発明は、第５の態様のスペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーの、多重アッセイにおける使用を提供し、ナノ粒子は、プローブとして使用される。
【0053】
[0053] プローブは、少なくともその発光プロファイルの異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間に基づいて互いに区別され得る。
【0054】
[0054] プローブは、広視野時間分解顕微鏡法又はディープラーニングを使用してデコードされ得る。
【図面の簡単な説明】
【0055】
図面の簡単な説明
、ピークモーメント
及び減衰時間
である。（ｈ～ｊ）Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（ｈ）、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（ｉ）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（ｊ）における代表的なＵＣＮＰの写真であり、ＮＩＲ励起下におけるそのアップコンバージョン色を示す。
【図1】[0055]直交次元において光情報を有する単分散ＵＣＮＰの作成であり、（ａ）典型的な形態均一コア－シェルナノ粒子の一種のβ－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋のＴＥＭ画像である。（ｂ及びｃ）９７６ｎｍの励起下における、Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋をドープしたＵＣＮＰのアンサンブルアップコンバージョン発光スペクトル（ｂ）及び寿命プロファイル（ｃ）である。（ｄ）ＨＡＤＦＦ－ＳＴＥＭ観察であり、異なる層にＮｄ３＋、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋がドープされたナノ粒子のコア－マルチシェル構造を示す。（ｅ）コア－マルチシェルナノ粒子のエネルギーレベル図であり、カスケード光子エネルギーの増感、移動及び変換プロセス：８０８ｎｍにおけるＮｄ３＋増感、９７６ｎｍにおけるＹｂ３＋媒介性の界面エネルギー移行（ＩＥＭ）及び典型的なＹｂ３＋－Ｅｒ３＋系におけるより高エネルギーの可視発光への近赤外光子のアップコンバージョンを示す。（ｆ及びｇ）８０８ｎｍ及び９７６ｎｍの励起下における、Ｎｄ３＋、Ｙｂ３＋、Ｅｒ３＋をドープしたＵＣＮＰのアンサンブルアップコンバージョン発光スペクトル（ｆ）及び寿命曲線（ｇ）である。
【図2】[0056]アップコンバージョンエネルギー移動スキーム及び材料エンジニアリングによる時間領域τ２プロファイルの制御であり、（ａ）τ２プロファイルの調整のために使用される５つの戦略、すなわちコアサイズ、コア中の増感剤及びエミッタの濃度、増感層の厚さ、増感層中の増感剤の濃度並びにパッシベーション層の説明である。（ｂ～ｄ）ＮＩＲ励起下における、３つのシリーズのサンプル、すなわちＹｂ－Ｔｍシリーズ（ｂ）、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（ｃ）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（ｄ）のτ２プロファイルの調整である。点線は、１／ｅの正規化強度（Ｉ１／ｅ）を示す。（ｅ～ｇ）Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（ｅ）、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（ｆ）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（ｇ）について、パネル（ｂ～ｄ）の曲線に従って計算される立ち上がり時間
【数1】
【数2】
【数3】
【図3】[0057]τ２－ドットの共焦点及び広視野キャラクタリゼーションである。（ａ～ｄ）共焦点顕微鏡による単一ナノ粒子イメージング（ａ）、輝度分布（ｂ）、５．５×１０６Ｗ／ｃｍ２で８０８ｎｍのＣＷ励起における単一ドットの長期光安定性（ｃ）及び（５．４６ｋＷ／ｃｍ２でＣＷレーザーを変調することにより）８０８ｎｍのパルス励起下における（ｅ）の単一ドット１～６の対応する寿命曲線（ｄ）である。（ｅ）広視野顕微鏡法のために時間分解ｓＣＭＯＳカメラを用いた、過渡的蛍光シグナル検出原理の概略図である。（ｆ及びｇ）直径２８μｍのビーム領域内における、τ２－ドット着色マイクロポリスチレンビーズ（ｆ）及び単一τ２－ドット（ｇ）の時間分解された６番目、１６番目、２８番目及び４８番目のフレームの比較である。（ｈ）（ｆ）の点線の正方形で示される単一τ２－ドット着色ビーズの寿命曲線である。（ｉ）（ｇ）の黄色及び濃オレンジ色の点線の正方形で示される、単一及びアンサンブルのτ２－ドットの寿命曲線である。データは、全てランダムバッチのτ２－ドット（τ２－１３）に関連する。
【図4】[0058]１４個のバッチのτ２－ドットからの時間領域光フィンガープリントであり、（ａ）単一τ２－ドットからの寿命曲線統計値である。斜線部は、各タイプのτ２－ドットからの２０を超える単一ドットの寿命曲線をカバーする。色付きの実線は、各タイプのτ２－ドットの平均寿命曲線を表す。（ｂ及びｅ）Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（９個）のτ２－ドット及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（５個）のτ２－ドットの平均単一ナノ粒子寿命フィンガープリントの強度正規化表示である。（ｃ及びｆ）９つのバッチのＹｂ－Ｔｍサンプルτ２－１～τ２－９（ｃ）及び４つのバッチのＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒサンプルτ２－１０～τ２－１４（ｆ）の単一粒子減衰指標（τＤ）分布分析のヒストグラムである。（ｄ及びｇ）サンプルτ２－１～τ２－９（ｄ）及びτ２－１０～τ２－１４（ｇ）の減衰及び立ち上がり指標（τＤ及びτＲ）の散布図である。いずれの指標（τＤ及びτＲ）も、最大強度の１／ｅにおける時間モーメントであると定義される。
【図5】[0059]ディープラーニングを用いた単一τ２－ドットのフィンガープリントのデコーディングであり、（ａ）分類タスクに使用されるニューラルネットワークの説明である。（ｂ及びｃ）Ｙｂ－Ｔｍシリーズτ２－１～τ２－９ドット（ｂ）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズτ２－１０～τ２－１４ドット（ｃ）の分類結果である（可視化のために、各タイプの単一ドットを表すために擬似色が使用される）。（ｄ及びｅ）各タイプのドットについて、６つの訓練セット及び１つの検証セットのデータベースとの相互検証により得られた平均分類精度である。
【図6】[0060]単一τ２－ドットの光フィンガープリントのライブラリーを様々な応用で使用する可能性の実証であり、（ａ）異なる立ち上がり－減衰フィンガープリントを有する３つのタイプのτ２－ドットセキュリティインクの使用による時間領域偽造防止である。（ｂ）５つの標的病原体の一本鎖ＤＮＡ（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ－１６及びＥＶ）を定量するために５つのタイプのτ２－ドットプローブを用いる多重化単一分子デジタルアッセイである。９６ウェルプレート上でのプローブ－ＤＮＡコンジュゲーション手順を示す概略図である。（ｃ）アップコンバージョン構造照明顕微鏡法（Ｕ－ＳＩＭ）により解像された３つのタイプのτ２－ドットである。
【図7】[0061]マイクロビーズのＳＥＭ画像である。τ２－１３ナノ粒子でタグ化される前（ａ）及びタグ化された後（ｂ）の５μｍのポリスチレンビーズのＳＥＭ写真である。スケールバー：１μｍ。
【図8】[0062]単一粒子性を確認する、τ２－１３ドットの広視野光学画像及びＳＥＭ画像の相関である。（ａ）８０８ｎｍレーザー下での広視野光学画像、（ｂ）同じ領域の対応するＳＥＭ画像。
【図9】[0063]共焦点顕微鏡法の概略図である（ＳＭＦ、シングルモードファイバー；ＭＭＦ、マルチモードファイバー；Ｌ１、コリメーションレンズ；Ｌ２、集光レンズ；ＨＷＰ、半波長板；ＰＢＳ、偏光ビームスプリッタ；ＦＭ、可動鏡；ＤＭ、ダイクロイックミラー；Ｏｂｊ、対物レンズ；ＳＰＦ、ショートパスフィルタ；ＳＰＡＤ、単一光子アバランシェダイオード；ＣＣＤ、電荷結合素子）。
【図10】[0064]広視野蛍光イメージングセットアップの概略図である（ＳＭＦ、シングルモードファイバー；ＭＭＦ、マルチモードファイバー；Ｌ１及びＬ６：コリメーションレンズ；Ｌ２及びＬ３並びにＬ７及びＬ８：ビーム拡大用レンズ；Ｌ４及びＬ９：チューブレンズ；ＤＭ１及びＤＭ２：ダイクロイックミラー；Ｏｂｊ：対物レンズ；Ｌ５：集光レンズ；ＳＰＦ：ショートパスフィルタ；ＦＭ、可動鏡）。
【図11】[0065]サブ回折イメージングのための時間分解構造化照明顕微鏡法である。ＳＭＦ、シングルモードファイバー；Ｌ１：コリメーションレンズ；Ｌ２及びＬ３：ビーム拡大用レンズ；Ｍ：銀鏡；ＤＭＤ：デジタルマイクロミラーデバイス；Ｌ４～Ｌ６：リレーレンズ；ＤＭ：ダイクロイックミラー；Ｏｂｊ：対物レンズ；Ｌ７：集光レンズ；ＳＰＦ：ショートパスフィルタ）。
【図12】[0066]Ｙｂ－Ｎｄ－Ｔｍシリーズサンプル（１５～２６）のＴＥＭ写真及びサイズヒストグラムである。スケールバー：１００ｎｍ。
【図13】[0067]Ｙｂ－Ｎｄ－Ｅｒシリーズサンプル（２７～４２）のＴＥＭ写真及びサイズヒストグラムである。スケールバー：２００ｎｍ。
【図14】[0068]Ｙｂ－Ｔｍシリーズサンプル（１～１４）のＴＥＭ写真及びサイズヒストグラムである。スケールバー：２００ｎｍ。
【図15】[0069]Ｎｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットの共焦点顕微鏡画像及び統計的強度である。５．５×１０６Ｗ／ｃｍ２のパワー密度で８０８ｎｍの励起下における、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットの全スペクトルのルミネセンス発光の共焦点顕微鏡による定量的測定である。スケールバー：１μｍ。
【図16】[0070]８０８ｎｍの励起下において、τ２－１０についてＳＰＡＤにより収集された単一ナノ粒子の輝度のパワー依存性曲線である。２本の点線は、５．５×１０３Ｗ／ｃｍ２（広視野イメージングの場合）及び７．６×１０６Ｗ／ｃｍ２（共焦点イメージングの場合）のパワー密度における発光強度を示す。
【図17】[0071]広視野顕微鏡法においてシミュレートされた励起場である。パターンは、２次元ガウス形状であり、発光マップパターンのフィッティングから測定されるスポットサイズは、ｘが２９．８９μｍであり、ｙが２８．４４μｍである。
【図18】[0072]Ｎｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットの励起パワー依存性である。広視野顕微鏡法におけるＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットサンプルの全スペクトル領域のアップコンバートされた発光のレーザーパワー依存性である。
【図19】[0073]τ２－ドットの減衰時間ヒストグラムである。各ヒストグラムのそばの数字は、広視野顕微鏡法における平均減衰時間±減衰時間ＣＶである。寿命イメージングシーケンスは、０～２００μｓの８０８ｎｍ励起パルスレーザー下において取得された。
【図20】[0074]異なるサンプルのτ２プロファイルの類似性である。（ａ）τ２－１及びτ２－２の寿命曲線、並びに（ｂ）τ２－１１及びτ２－１２の寿命曲線であり、寿命のフィンガープリントが互いに非常に重なっていることを示す。
【図21】[0075]（ａ）５０回のランダム相互検証後の７つのバッチのＹｂ－Ｎｄ－Ｅｒのτ２－ドットサンプルの平均分類精度である。（ｂ）上記の７つのτ２－ドットの同じイメージング条件での広視野顕微鏡法における単一ナノ粒子の強度である。平均輝度は、１００個を超えるナノ粒子のカウントに基づいて達成された。（ｃ）サンプル４０の２０個を超える単一ナノ粒子からの寿命曲線統計値である。比較的弱い発光強度を有するサンプル４０を添加することにより、７つのバッチのＵＣＮＰを訓練すると、これらの７つのサンプルの分類精度は、約９０％である。一方で、サンプル４０の分類精度は、最低である。
【発明を実施するための形態】
【0056】
詳細な説明
[0076] 本明細書に関連して、「約」という用語は、当業者が、同じ機能又は結果を達成するという観点から、記載された値と均等であると考え得る数の範囲を指すと理解される。
[0076] 本明細書に関連して、「約」という用語は、当業者が、同じ機能又は結果を達成するという観点から、記載された値と均等であると考え得る数の範囲を指すと理解される。
【0057】
[0077] 本明細書に関連して、「１つの（a）」及び「１つの（an）」という用語は、１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の、冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【0058】
[0078] 本明細書を通して、文脈が他に必要としない限り、「含む（comprise）」という語又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる」などの変化形は、記載された要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されるであろう。したがって、本明細書に関連して、「含む」という用語は、「主に含むが、必ずしも単独で含むわけではない」を意味する。
【0059】
[0079] 本発明者らは、界面エネルギー移行、濃度依存性、エネルギー移動及び表面クエンチャーの単離を含むアップコンバージョンスキームにより、励起状態集団の立ち上がり、減衰及びピークモーメントを含む、単一アップコンバージョンナノ粒子からの時間領域発光プロファイル（τ２プロファイル）が任意に調整され得ることを発見した。これにより、ナノスケールでのコーディング能力の著しい増大が可能になる。励起波長、発光色及びτ２プロファイルを含む少なくとも３つの直交次元がナノスケール誘導体τ２－ドットに構築され得ることも見出された。これらの高次元光シグニチャは、単一粒子ナノタグの膨大なライブラリーを構築するために予め選択することができる。これらの高次元光フィンガープリントは、サブ回折限界データストレージ、セキュリティインクから、ハイスループット単一分子デジタルアッセイ及び超解像度イメージングにわたる応用のための新しい領域を提供する。
【0060】
寿命エンジニアリングにおけるτ２プロファイルの制御及び界面エネルギー移行の役割
[0080] 本出願人は、活性コア＠不活性シェルＵＣＮＰ及び活性コア＠エネルギー移行シェル＠増感シェル＠不活性シェルＵＣＮＰの両方の形態が高度に制御され得ることと、単一ＵＣＮＰが広視野顕微鏡法において十分に明るくなると、時間領域においてその特徴的な光シグニチャを示すこととを実証した。驚くべきことに、各バッチのＵＣＮＰの減衰時間だけでなく、単一ナノ粒子からの励起状態集団の立ち上がり時間、減衰時間及びピークモーメントも調整可能である。本発明者らは、多界面エネルギー移動プロセス及び直交励起波長により、立ち上がり時間、減衰時間及びピークモーメントがさらに操作され得ることを見出した。したがって、一態様では、本発明は、アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法を提供し、本方法は、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントを操作することを含む。一実施形態では、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントの操作は、ナノ粒子における界面エネルギー移行（ＩＥＭ）を変更することによって達成され得る。一実施形態では、ＩＥＭは、ナノ粒子を異なる励起波長にさらすことによって達成され得る。
[0080] 本出願人は、活性コア＠不活性シェルＵＣＮＰ及び活性コア＠エネルギー移行シェル＠増感シェル＠不活性シェルＵＣＮＰの両方の形態が高度に制御され得ることと、単一ＵＣＮＰが広視野顕微鏡法において十分に明るくなると、時間領域においてその特徴的な光シグニチャを示すこととを実証した。驚くべきことに、各バッチのＵＣＮＰの減衰時間だけでなく、単一ナノ粒子からの励起状態集団の立ち上がり時間、減衰時間及びピークモーメントも調整可能である。本発明者らは、多界面エネルギー移動プロセス及び直交励起波長により、立ち上がり時間、減衰時間及びピークモーメントがさらに操作され得ることを見出した。したがって、一態様では、本発明は、アップコンバージョンナノ粒子の時間領域発光プロファイルを調整するための方法を提供し、本方法は、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントを操作することを含む。一実施形態では、励起状態集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントの操作は、ナノ粒子における界面エネルギー移行（ＩＥＭ）を変更することによって達成され得る。一実施形態では、ＩＥＭは、ナノ粒子を異なる励起波長にさらすことによって達成され得る。
【0061】
[0081] 励起集団の立ち上がり、減衰及び／又はピークモーメントの操作におけるＩＥＭの役割を実証するために、形態均一性（ＣＶ＜５％）を有する一連のコア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ（図１２）及びβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰ（図１ｄ及び図１３）を作製した。コア－マルチシェルＵＣＮＰの複雑な設計により、図１ｅに示されるように、単一ナノ粒子内のエネルギー移動プロセスにおける任意の制御が可能になる：Ｎｄ３＋及びＹｂ３＋イオンが共ドープされたシェルは、８０８ｎｍの励起を増感させ、わずかな割合のＹｂ３＋イオンを含有するエネルギー移行シェルは、緑色及び赤色バンドでアップコンバートされた発光を放出する従来のＹｂ３＋、Ｅｒ３＋共ドープコアに対して吸収エネルギーを伝えることに関与し（図１ｆを参照されたい）、不活性シェルは、表面クエンチャーへのエネルギー移行を防止し、及び単一ナノ粒子の光学的均一性を改善するために使用される。複数のシェルは、８０８ｎｍの励起下において、一次増感剤Ｎｄ３＋から二次増感剤Ｙｂ３＋への界面エネルギー移行（ＩＥＭ）プロセスを大幅に遅らせることができる。ＩＥＭは、アップコンバージョン発光の時間遅延上昇曲線で表示される、励起状態集団のゆっくりした蓄積において重要な役割を果たす。このＩＥＭ効果を検証するために、９７６ｎｍ及び８０８ｎｍレーザーをそれぞれ用いて、Ｙｂ３＋及びＮｄ３＋イオンを選択的に励起させ、同じ発光スペクトルを観察した（図１ｆ）。しかしながら、τ２プロファイルにおいて有意差が観察された（図１ｇ）。これに関して、ＩＥＭプロセスが関与する場合、Ｅｒ３＋励起状態集団がプラトーに達するまでの立ち上がり時間は、２００μｓから９５０μｓまで延長される。
【0062】
[0082] 立ち上がり時間、減衰時間及びピークモーメントを調整できることは、この次元を多重化アッセイで使用する可能性を開く。したがって、別の態様では、本発明は、多重アッセイにおける発光プローブを特定するための多重アッセイ方法を提供し、本方法は、発光プローブを刺激して発光を生じさせることと、発光の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を測定することとを含む。さらなる態様では、本発明は、多重アッセイを実施するための方法を提供し、多重アッセイは、プローブとして、異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する複数のナノ粒子を使用することを含み、プローブは、その異なる立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間に基づいて互いに区別される。
【0063】
直交光フィンガープリントのコード化
[0083] ＵＣＮＰのτ２プロファイルを調整できることを利用することにより、本出願人は、一連の時間領域光フィンガープリントを作成し、ＵＣＮＰに存在するエミッタの励起状態集団を作るための５つの戦略を実行することにより、異なるバッチのτ２－ドットのライブラリーを構築した。したがって、さらなる態様では、本発明は、スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）複数の異なる種類のナノ粒子を提供することであって、それぞれの異なる種類のナノ粒子は、別個の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する、提供すること、
（ｂ）スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを提供するために、各種類内のナノ粒子の以下のパラメータ：
ナノ粒子のコアサイズ；
コア中のエミッタイオン及び増感剤イオンの濃度；
増感層の厚さ；
増感層中の増感剤イオンの濃度；並びに
パッシベーション層の存在又は不存在
の１つ又は複数を変化させること
を含む方法を提供する。
[0083] ＵＣＮＰのτ２プロファイルを調整できることを利用することにより、本出願人は、一連の時間領域光フィンガープリントを作成し、ＵＣＮＰに存在するエミッタの励起状態集団を作るための５つの戦略を実行することにより、異なるバッチのτ２－ドットのライブラリーを構築した。したがって、さらなる態様では、本発明は、スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）複数の異なる種類のナノ粒子を提供することであって、それぞれの異なる種類のナノ粒子は、別個の立ち上がり時間、ピークモーメント及び／又は減衰時間を有する発光プロファイルを有する、提供すること、
（ｂ）スペクトル的に別個のナノ粒子のライブラリーを提供するために、各種類内のナノ粒子の以下のパラメータ：
ナノ粒子のコアサイズ；
コア中のエミッタイオン及び増感剤イオンの濃度；
増感層の厚さ；
増感層中の増感剤イオンの濃度；並びに
パッシベーション層の存在又は不存在
の１つ又は複数を変化させること
を含む方法を提供する。
【0064】
[0084] 例示的なライブラリーは、光フィンガープリントの３つの直交次元（励起波長、発光波長及び寿命）を表示する、表１に記載されるような３つのシリーズのＵＣＮＰに基づく。Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（図１ａ～１ｃ）は、９７６ｎｍで励起させることができ、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（図１ｄ～１ｇ）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｔｍは、９７６ｎｍ及び８０８ｎｍレーザー励起の両方が可能である。図１ａ及び図１４のＴＥＭ画像は、均一な球形β－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋コア＠不活性シェルナノ粒子（変動係数（ＣＶ）＜５％）を示す。９７６ｎｍの励起では、ナノ粒子は、青色、赤色及び近赤外（ＮＩＲ）スペクトルバンドで発光し、これは、Ｔｍ３＋の多様な遷移に割り当てられる（図１ｂ）。これらの励起状態（１Ｇ４、１Ｄ２、３Ｈ４）は、全てマイクロ秒の時間スケールでプロファイルの立ち上がり成分及び減衰成分の両方を示す（図１ｃ）。このプロファイルにより、それぞれの異なるバッチのナノ粒子は、かなり複雑な多成分寿命挙動を特徴とする独特な光フィンガープリントになる。
【0065】
【表1】
【0066】
[0085] 図２ａに示されるように、戦略は、コアサイズ、コア中のエミッタ及び増感剤Ｙｂ３＋のドーピング濃度、コア／増感層の厚さ及び増感層中のＹｂ３＋のドーピング濃度の調整並びにパッシベーション不活性層の付加を含む。
【0067】
[0086] ライブラリーの作製において、これらの戦略の１つ又は複数が採用され得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、５つの戦略の全てが採用される。５つの戦略の全てを用いて（表１を参照されたい）、９７６ｎｍ又は８０８ｎｍのＮＩＲ励起下において微細に調整可能なτ２プロファイルを示す、１４個（図２ｂの１→１４）、１２個（図２ｃの１５→２６）及び１６個（図２ｄの２７→４２）のバッチの３つのシリーズのτ２－ドットを合成した。同じドーピングシリーズからのサンプルは、非常に類似した発光色、すなわちＹｂ－Ｔｍシリーズでは青色（図２ｈ）、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｔｍシリーズでは紫がかった青色（図２ｉ）、Ｎｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズでは黄色がかった緑色（図２ｊ）を示すが、その寿命プロファイルは、時間領域で非常に異なって表示される。図２ｅ～２ｇの値は、各バッチのτ２－ドットサンプルを特定する際、立ち上がり時間、ピークモーメント及び減衰時間分布の広いダイナミックレンジをさらに定量的にマッピングする。
【0068】
[0087] 好ましくは、ステップ（ａ）のナノ粒子は、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰ及びコア－シェルβ－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰから選択される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）のナノ粒子は、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰ、コア－マルチシェルβ－ＮａＹＦ４：Ｎｄ３＋，Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ＵＣＮＰ及びコア－シェルβ－ＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｔｍ３＋ＵＣＮＰであり、したがって、ライブラリーは、表１に示されるように３つのＵＣＮＰタイプに基づく。しかしながら、当業者は、その光学的均一性及び光フィンガープリントの調整可能性（例えば、スペクトルにおいて）が、本明細書で議論される要件を満たす限り、ライブラリーが他のＵＣＮＰ、実際にはより一般的にナノ粒子に基づき得ることを認識するであろう。
【0069】
単一τ２－ドットの光学的均一性
[0088] 本出願人は、異なるバッチのτ２－ドットにおいてコード化することができる寿命プロファイルのダイナミックレンジが広いにもかかわらず、コード化された各光フィンガープリント間の違いがアンサンブルレベルで隠され得ることを見出した。したがって、単一ナノ粒子分光法を採用して、単一τ２－ドットの光学的均一性を検証するべきである。ここでは、Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（τ２－１～τ２－９）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（τ２－１０～τ２－１４）の１４個のバッチのτ２－ドット（すなわち表１のτ２－１～τ２－１４）を選択して、単一ナノ粒子レベルでのデコーディング実験を実施した。共焦点顕微鏡法セットアップ（図９）を用いて、単一ナノ粒子の光学的キャラクタリゼーション結果（図３ａ及び３ｂ）は、高度の輝度（例えば、τ２－１３では毎秒８１，５２０光子カウント）、光学的均一性（ＣＶ８．１％）（図１５の他の４個のバッチのＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットを参照されたい）及び単一τ２－ドットの安定性（図３ｃ）を示し、長期のイメージング及び光フィンガープリントのデコーディングに理想的である。図３ｄに示されるように、独特の検出可能なフィンガープリントは、全ての単一τ２－ドットに問題なく割り当てられている。より印象的なことに、単一ドットの特徴的な寿命フィンガープリントは、同じ合成バッチからのものである限り、一貫して均一である。
[0088] 本出願人は、異なるバッチのτ２－ドットにおいてコード化することができる寿命プロファイルのダイナミックレンジが広いにもかかわらず、コード化された各光フィンガープリント間の違いがアンサンブルレベルで隠され得ることを見出した。したがって、単一ナノ粒子分光法を採用して、単一τ２－ドットの光学的均一性を検証するべきである。ここでは、Ｙｂ－Ｔｍシリーズ（τ２－１～τ２－９）及びＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒシリーズ（τ２－１０～τ２－１４）の１４個のバッチのτ２－ドット（すなわち表１のτ２－１～τ２－１４）を選択して、単一ナノ粒子レベルでのデコーディング実験を実施した。共焦点顕微鏡法セットアップ（図９）を用いて、単一ナノ粒子の光学的キャラクタリゼーション結果（図３ａ及び３ｂ）は、高度の輝度（例えば、τ２－１３では毎秒８１，５２０光子カウント）、光学的均一性（ＣＶ８．１％）（図１５の他の４個のバッチのＮｄ－Ｙｂ－Ｅｒのτ２－ドットを参照されたい）及び単一τ２－ドットの安定性（図３ｃ）を示し、長期のイメージング及び光フィンガープリントのデコーディングに理想的である。図３ｄに示されるように、独特の検出可能なフィンガープリントは、全ての単一τ２－ドットに問題なく割り当てられている。より印象的なことに、単一ドットの特徴的な寿命フィンガープリントは、同じ合成バッチからのものである限り、一貫して均一である。
【0070】
広視野時間分解顕微鏡法
[0089] 共焦点走査顕微鏡法により、最大で１０６Ｗ／ｃｍ２の照明パワーは、各ピクセルを走査して全ての単一ナノ粒子を励起させることができるが、その走査モードは、デコーディングプロセスのスループットを著しく制限する。したがって、広視野顕微鏡は、時間分解イメージングのためにインテンシファイア結合ＣＭＯＳカメラと共に開発された（図１０）。広視野顕微鏡法において、中程度の連続波励起パワー密度（５．４６ｋＷ／ｃｍ２）は、各τ２－ドットの輝度をほぼ２桁犠牲にする（図１６）が、広視野顕微鏡法は、点走査共焦点セットアップと比較してデコーディングスループットをはるかに高める。図３ｅに示されるように、時間分解イメージングのシーケンスは、７５のフレーム（ｎ＝７５）からなり、それぞれ５０μｓの時間ゲートウィンドウ期間（Δｔ）を記録する。
[0089] 共焦点走査顕微鏡法により、最大で１０６Ｗ／ｃｍ２の照明パワーは、各ピクセルを走査して全ての単一ナノ粒子を励起させることができるが、その走査モードは、デコーディングプロセスのスループットを著しく制限する。したがって、広視野顕微鏡は、時間分解イメージングのためにインテンシファイア結合ＣＭＯＳカメラと共に開発された（図１０）。広視野顕微鏡法において、中程度の連続波励起パワー密度（５．４６ｋＷ／ｃｍ２）は、各τ２－ドットの輝度をほぼ２桁犠牲にする（図１６）が、広視野顕微鏡法は、点走査共焦点セットアップと比較してデコーディングスループットをはるかに高める。図３ｅに示されるように、時間分解イメージングのシーケンスは、７５のフレーム（ｎ＝７５）からなり、それぞれ５０μｓの時間ゲートウィンドウ期間（Δｔ）を記録する。
【0071】
単一τ２－ドットのナノスケール光多重化
[0090] 従来のミクロンサイズのビーズと比較して、ナノスコピックサイズのτ２－ドットにおいて作成される光コードは、コーディング情報の容量を著しく増大させることができ、これにより、スーパー容量光多重化は、光回折限界よりも小さい領域に取り込まれる。この機会及び課題を説明するために、５μｍのポリスチレンビーズをτ２－１３ドットで着色し（図７）、その時間分解アップコンバージョン画像を広視野顕微鏡下で収集した。直径２８μｍの照明領域内において、典型的な画像は、ミクロンサイズのビーズを１０未満のみ含むが（図３ｆ）、対照的に、数百個の単一τ２－１３ドットが同じ領域内に存在する（図３ｇ）。それぞれの単一ミクロンビーズは、滑らかなτ２プロファイルを示す（図３ｈ）が、単一τ２ドットからの曲線（図３ｉ）は、各５０μｓ時間ゲートウィンドウ内の検出可能なシグナルの量が限られているために、いくらかの有意レベルのノイズを有する。
[0090] 従来のミクロンサイズのビーズと比較して、ナノスコピックサイズのτ２－ドットにおいて作成される光コードは、コーディング情報の容量を著しく増大させることができ、これにより、スーパー容量光多重化は、光回折限界よりも小さい領域に取り込まれる。この機会及び課題を説明するために、５μｍのポリスチレンビーズをτ２－１３ドットで着色し（図７）、その時間分解アップコンバージョン画像を広視野顕微鏡下で収集した。直径２８μｍの照明領域内において、典型的な画像は、ミクロンサイズのビーズを１０未満のみ含むが（図３ｆ）、対照的に、数百個の単一τ２－１３ドットが同じ領域内に存在する（図３ｇ）。それぞれの単一ミクロンビーズは、滑らかなτ２プロファイルを示す（図３ｈ）が、単一τ２ドットからの曲線（図３ｉ）は、各５０μｓ時間ゲートウィンドウ内の検出可能なシグナルの量が限られているために、いくらかの有意レベルのノイズを有する。
【0072】
高次元フィンガープリントの抽出
[0091] 広視野時間分解顕微鏡を用いて、各バッチからの２０を超える単一τ２－ドットの寿命曲線を測定した。その寿命プロファイルは、図４ａに示される。照度分布（図１７）及びパワー依存性強度（図１８）に起因して、ドットごとに寿命曲線のいくらかの検出可能な変動があるが、各τ２－ドットの顕著な特徴及び広いダイナミックレンジにわたるその寿命の調整可能性が明白である（図４ｂ及び４ｅ）。分布統計値（図４ｃ及び４ｆ）を通して、τ２－ドットの大部分は、そのτＤ値が均一に分散しており、ＣＶが小さく（＜１０％、図１９）、各集団間の重複の度合いが小さく、デコーディングプロセスに有利であることが分かった。τ２－２対τ２－３、τ２－４対τ２－５、τ２－８対τ２－９及びτ２－１３対τ２－１４を含む４対のτ２－ドット集団は、著しい重複を示す。際立ったことに、寿命フィンガープリントプロファイルから抽出された１つ又は複数の指標、すなわちτＲを付加することにより、２対の集団（τ２－４対τ２－５、τ２－８対τ２－９）は、十分に区別され得る（図４ｄ）。
[0091] 広視野時間分解顕微鏡を用いて、各バッチからの２０を超える単一τ２－ドットの寿命曲線を測定した。その寿命プロファイルは、図４ａに示される。照度分布（図１７）及びパワー依存性強度（図１８）に起因して、ドットごとに寿命曲線のいくらかの検出可能な変動があるが、各τ２－ドットの顕著な特徴及び広いダイナミックレンジにわたるその寿命の調整可能性が明白である（図４ｂ及び４ｅ）。分布統計値（図４ｃ及び４ｆ）を通して、τ２－ドットの大部分は、そのτＤ値が均一に分散しており、ＣＶが小さく（＜１０％、図１９）、各集団間の重複の度合いが小さく、デコーディングプロセスに有利であることが分かった。τ２－２対τ２－３、τ２－４対τ２－５、τ２－８対τ２－９及びτ２－１３対τ２－１４を含む４対のτ２－ドット集団は、著しい重複を示す。際立ったことに、寿命フィンガープリントプロファイルから抽出された１つ又は複数の指標、すなわちτＲを付加することにより、２対の集団（τ２－４対τ２－５、τ２－８対τ２－９）は、十分に区別され得る（図４ｄ）。
【0073】
ディープラーニングアプローチ
[0092] ディープラーニングは、高度に非線形のデータセットを分類する高い能力を示す、新たに出現した技術である。ここでは、高度に光学的に均一な単一ナノ粒子の制御された成長と、その後の画像解析との両方により、単一ドットの寿命フィンガープリントを得るための機会が提供され、これによりディープラーニングで機械を訓練するための大きい高品質データセットが生成され得る。時間依存性の画像フレームのシーケンスを収集することにより、０～３７５０μｓの７５の時点において、訓練のための入力のデータソースとして正規化τ２プロファイルの値を抽出した。ここで、単一ナノ粒子からのイメージングデータのみを選択することにより、収集したままの画像を最初に前処理した。図５ａに示されるように、各バッチのτ２－ドットの特徴被覆度（分類境界）を定義するために、畳み込みネットワークと、２つの層（ＦＣ１及びＦＣ２）を有する全結合ネットワークとを使用した。
[0092] ディープラーニングは、高度に非線形のデータセットを分類する高い能力を示す、新たに出現した技術である。ここでは、高度に光学的に均一な単一ナノ粒子の制御された成長と、その後の画像解析との両方により、単一ドットの寿命フィンガープリントを得るための機会が提供され、これによりディープラーニングで機械を訓練するための大きい高品質データセットが生成され得る。時間依存性の画像フレームのシーケンスを収集することにより、０～３７５０μｓの７５の時点において、訓練のための入力のデータソースとして正規化τ２プロファイルの値を抽出した。ここで、単一ナノ粒子からのイメージングデータのみを選択することにより、収集したままの画像を最初に前処理した。図５ａに示されるように、各バッチのτ２－ドットの特徴被覆度（分類境界）を定義するために、畳み込みネットワークと、２つの層（ＦＣ１及びＦＣ２）を有する全結合ネットワークとを使用した。
【0074】
[0093] 独立して２つのシリーズによる１４個のバッチのτ２－ドット（τ２－１～９及びτ２－１０～１４）のデータベースによって機械を訓練し、確立されたニューラルネットワークに、全ての単一τ２－ドットを認識することを要求する。これを行うために、最初に、各タイプのτ２－ドットサンプルから７つのセットの時間分解画像シーケンスを収集し、各画像データは、単一τ２－ドットのデータ事前選択後、５０～２００個の単一ナノ粒子の寿命フィンガープリントを含む。各タイプのτ２－ドットからの任意の６つのセットのイメージングデータを使用して、最初にニューラルネットワークを確立するために機械を訓練し、検証分析物として最後のデータセットを使用する。各τ２－ドットサンプルの可視化された典型的な結果セットは、図５ｂ及び５ｃに示される。少量のまだらなドット（例えば、τ２－２及びτ２－１１の画像）は、エラー認識を表し、これは、主に同様の寿命曲線特徴を有するサンプルによって引き起こされる（図２０）。次に、訓練及び検証の実験をさらに５０回実行し、毎回ランダムに、検証標的として１つのデータセットを、及びニューラルネットワークを訓練するために他の６つのセットを選択し、その結果、図５ｄ及び５ｅに示される分類精度の統計的分布がエラーバーと共に得られた。各τ２－ドットサンプルについて平均分類精度が達成され、値は、全て１に近づいた。ナノスケール多重化の容量は、単一ナノ粒子の輝度及びノイズ背景によって有意に決定することができ、これは、比較的低輝度のτ２－ドットサンプルバッチに対して比較的広いτ２プロファイルの分布を説明し、したがって機械知能により達成可能な認識結果の精度が低くなる（図２１）。それにもかかわらず、この実験は、各τ２－ドットの寿命プロファイルが、ディープラーニングによって支援されるナノスケールのスーパー容量光多重化に使用される大きい可能性を確認する。
【0075】
τ２－ドットの潜在的な応用
[0094] ナノスケールのスーパー容量光多重化は、多数の応用のための新しい領域を開く。時間領域τ２－プロファイルを使用すると、図６ａに示されるように、同じ色を放出する異なるバッチの材料を用いて新世代の動的偽造防止セキュリティインクを開発することができる。別の比類なき可能性は、ナノスケールのスーパー容量多重化をハイスループットの単一分子アッセイのために使用することであり、これは、ミクロスフェアに基づく従来のサスペンションアレイアッセイよりも優れている。原理実験の証明の結果として、図６ｂでは、５種の病原性ＤＮＡ配列（表２を参照されたい） － Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ－１６）及びエボラウイルス（ＥＶ）を同時に検出するために、５種類のτ２－ドットを設計及び機能化した。広視野顕微鏡を通して及び対照群と比較して、各τ２－ドットは、非常に特異的であると結論付けられた。さらに、図５ｃに示されるように、異なる寿命プロファイルを有するτ２－ドットの広視野画像は、１８５．５ｎｍの解像度を有するアップコンバージョン構造－照明顕微鏡法（Ｕ－ＳＩＭ）（図１１）についての本発明者らの最新の開発を使用して超解像され得ることが実証される。
[0094] ナノスケールのスーパー容量光多重化は、多数の応用のための新しい領域を開く。時間領域τ２－プロファイルを使用すると、図６ａに示されるように、同じ色を放出する異なるバッチの材料を用いて新世代の動的偽造防止セキュリティインクを開発することができる。別の比類なき可能性は、ナノスケールのスーパー容量多重化をハイスループットの単一分子アッセイのために使用することであり、これは、ミクロスフェアに基づく従来のサスペンションアレイアッセイよりも優れている。原理実験の証明の結果として、図６ｂでは、５種の病原性ＤＮＡ配列（表２を参照されたい） － Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ－１６）及びエボラウイルス（ＥＶ）を同時に検出するために、５種類のτ２－ドットを設計及び機能化した。広視野顕微鏡を通して及び対照群と比較して、各τ２－ドットは、非常に特異的であると結論付けられた。さらに、図５ｃに示されるように、異なる寿命プロファイルを有するτ２－ドットの広視野画像は、１８５．５ｎｍの解像度を有するアップコンバージョン構造－照明顕微鏡法（Ｕ－ＳＩＭ）（図１１）についての本発明者らの最新の開発を使用して超解像され得ることが実証される。
【0076】
【表2】
【0077】
材料及び方法
ＵＣＮＰの合成
[0095] ＮａＹＦ４コアナノ粒子は、共沈法を用いて合成した１。典型的な手順では、６ｍＬのオレイン酸及び１５ｍＬの１－オクタデセンと共に、異なるドープ率を有する１ｍｍｏｌのＲＥＣｌ３（ＲＥ＝Ｙ、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｅｒ、Ｔｍ）を激しく攪拌しながら５０ｍｌの３つ口丸底フラスコに添加した。得られた混合物を１５０℃で４０分間加熱して、ランタニドオレイン酸錯体を形成した。溶液を５０℃に冷却し、３０分間激しく攪拌しながら、２．５ｍｍｏｌのＮａＯＨ及び４ｍｍｏｌのＮＨ４Ｆを含有する６ｍＬのメタノール溶液を添加した。次に、アルゴン流下で混合物をゆっくり１５０℃まで加熱して３０分間保持し、メタノール及び残留水を除去した。次に、溶液をアルゴン流下において３００℃で１．５時間急速加熱した後、室温まで冷却した。得られたコアナノ粒子を収集し、シクロヘキサン／エタノール／メタノールで数回洗浄した後、５ｍｇ／ｍＬの濃度でシクロヘキサン中に再分散させた。上記と同じ方法を用いて、異なるドーピング濃度を有する３つのシリーズのコアナノ粒子を合成した（ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｔｍ；ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｎｄ，Ｔｍ；ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒ）。
ＵＣＮＰの合成
[0095] ＮａＹＦ４コアナノ粒子は、共沈法を用いて合成した１。典型的な手順では、６ｍＬのオレイン酸及び１５ｍＬの１－オクタデセンと共に、異なるドープ率を有する１ｍｍｏｌのＲＥＣｌ３（ＲＥ＝Ｙ、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｅｒ、Ｔｍ）を激しく攪拌しながら５０ｍｌの３つ口丸底フラスコに添加した。得られた混合物を１５０℃で４０分間加熱して、ランタニドオレイン酸錯体を形成した。溶液を５０℃に冷却し、３０分間激しく攪拌しながら、２．５ｍｍｏｌのＮａＯＨ及び４ｍｍｏｌのＮＨ４Ｆを含有する６ｍＬのメタノール溶液を添加した。次に、アルゴン流下で混合物をゆっくり１５０℃まで加熱して３０分間保持し、メタノール及び残留水を除去した。次に、溶液をアルゴン流下において３００℃で１．５時間急速加熱した後、室温まで冷却した。得られたコアナノ粒子を収集し、シクロヘキサン／エタノール／メタノールで数回洗浄した後、５ｍｇ／ｍＬの濃度でシクロヘキサン中に再分散させた。上記と同じ方法を用いて、異なるドーピング濃度を有する３つのシリーズのコアナノ粒子を合成した（ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｔｍ；ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｎｄ，Ｔｍ；ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒ）。
【0078】
[0096] ＮａＯＨ／ＮＨ４Ｆ溶液を添加した後、反応溶液をゆっくり１５０℃まで加熱して３０分間保持するステップまで、上記の手順を用いて前駆体を作製した。さらに３００℃まで加熱してナノ結晶成長を誘発する代わりに、溶液を室温まで冷却してシェル前駆体を得た。
【0079】
[0097] レイヤーバイレイヤーエピタキシャル成長法により、コア－シェル及びコア－マルチシェルナノ粒子を作製した。予め合成したＮａＹＦ４コアナノ粒子をシェル修飾のためのシードとして使用した。３ｍｌのＯＡ及び８ｍｌのＯＤＥを含む５０ｍｌのフラスコに、０．２ｍｍｏｌの作製したままのコアナノ結晶を添加した。混合物をアルゴン下で３０分間、１５０℃まで加熱してから、さらに３００℃まで加熱した。次に、一定量の作製したままのシェル前駆体を反応混合物に注入し、３００℃で２分間熟成させた後、同じ注入及び熟成サイクルを数回行い、異なるシェル厚さを得た。最後に、スラリーを室温まで冷却し、形成されたコア－シェルナノ結晶を、コアナノ結晶のために使用した同じ手順に従って精製した。上記のエピタキシャル成長法によってコア－マルチシェルナノ粒子も作製し、コア－シェルナノ粒子をシードとして使用した。
【0080】
τ２－ドット（τ２－１３）タグ付きマイクロビーズの作製
[0098] ブタノール中８％（ｖ／ｖ）のクロロホルム溶液１３７μｌで５μｌ（１０％ｗ／ｖ）のＰＳビーズを膨潤させることにより、ポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズ（ｄ＝５μｍ；Sigma-Aldrich）溶液を処理した。４０μｌ（８ｍｇ／ｍｌ）のシクロヘキサン中のτ２－１３ドットを上記のＰＳ懸濁液に添加した。τ２－ドットを添加した後、溶液をボルテックスした。２５℃で３時間インキュベートした後、ビーズをエタノールとシクロヘキセンで交互に４回洗浄した。洗浄した後、τ２－ドット埋め込みビーズをエタノール中に分散させてから、光学的測定のためのカバースリップの表面で１滴のビーズを空気乾燥させた。
[0098] ブタノール中８％（ｖ／ｖ）のクロロホルム溶液１３７μｌで５μｌ（１０％ｗ／ｖ）のＰＳビーズを膨潤させることにより、ポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズ（ｄ＝５μｍ；Sigma-Aldrich）溶液を処理した。４０μｌ（８ｍｇ／ｍｌ）のシクロヘキサン中のτ２－１３ドットを上記のＰＳ懸濁液に添加した。τ２－ドットを添加した後、溶液をボルテックスした。２５℃で３時間インキュベートした後、ビーズをエタノールとシクロヘキセンで交互に４回洗浄した。洗浄した後、τ２－ドット埋め込みビーズをエタノール中に分散させてから、光学的測定のためのカバースリップの表面で１滴のビーズを空気乾燥させた。
【0081】
材料のキャラクタリゼーション
[0099] ナノ粒子の形態キャラクタリゼーションは、１２０ｋＶの加速電圧のJEOL TEM-1400及び２００ｋＶ電圧のJEOL TEM-2200FSの透過型電子顕微鏡により実施した。炭素コートした銅グリッド上に滴下させることにより、シクロヘキサン分散ＵＣＮＰを画像化した。ＰＳビーズの表面形態キャラクタリゼーション（図７を参照されたい）及び光－電子顕微鏡相関実験（図８を参照されたい）は、２０．００ｋＶで動作されるZeiss Supra 55VP走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて実施した。
[0099] ナノ粒子の形態キャラクタリゼーションは、１２０ｋＶの加速電圧のJEOL TEM-1400及び２００ｋＶ電圧のJEOL TEM-2200FSの透過型電子顕微鏡により実施した。炭素コートした銅グリッド上に滴下させることにより、シクロヘキサン分散ＵＣＮＰを画像化した。ＰＳビーズの表面形態キャラクタリゼーション（図７を参照されたい）及び光－電子顕微鏡相関実験（図８を参照されたい）は、２０．００ｋＶで動作されるZeiss Supra 55VP走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて実施した。
【0082】
サンプルスライドの作製
[00100] 単一ナノ粒子測定のためのサンプルスライドを作製するために、超音波処理によりカバースリップを純粋なエタノールで洗浄した後、空気乾燥させた。２０μｌのシクロヘキサン中のτ２－ドット（０．０１ｍｇ／ｍｌ）をカバースリップの表面に滴下した。空気乾燥させた後、カバースリップを清浄なガラススライド上に置き、測定前に穏やかな力で気泡を押し出した。
[00100] 単一ナノ粒子測定のためのサンプルスライドを作製するために、超音波処理によりカバースリップを純粋なエタノールで洗浄した後、空気乾燥させた。２０μｌのシクロヘキサン中のτ２－ドット（０．０１ｍｇ／ｍｌ）をカバースリップの表面に滴下した。空気乾燥させた後、カバースリップを清浄なガラススライド上に置き、測定前に穏やかな力で気泡を押し出した。
【0083】
共焦点イメージング及び寿命測定
[00101] 図９に示されるように、単一τ２－ドットの強度及び寿命測定のためにステージ走査共焦点顕微鏡を構築した。８０８ｎｍのシングルモード偏光レーザーの励起源は、１００×対物レンズ（UPLanSApo100X、油浸、ＮＡ＝１．４０、Olympus Inc., JPN）を通してサンプルに焦点を合わせた。サンプルからの発光を同じ対物レンズにより集め、システムの最初のエアリーディスクと一致するコアサイズを有する光ファイバーに再度焦点を合わせた。ショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ、ZT785spxxr-UF1、Chroma Inc., USA）及びショートパスフィルタ（ＳＰＦ、ET750sp-2p8、Chroma Inc., USA）により、蛍光シグナルをレーザーからフィルタリングした。単一光子計数アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ、SPCM-AQR-14-FC、Excelitas Inc., USA）をマルチモードファイバー（ＭＭＦ、M42L02、Thorlabs Inc., USA）に接続して、発光強度を検出した。３Ｄピエゾステージを移動させることにより、走査を達成した。全ての単一ナノ粒子は、共焦点走査顕微鏡画像においてガウススポットを示した。各ガウススポットの最大輝度値（光子カウント）を使用して、その単一ナノ粒子の輝度を表した。２０を超える単一ナノ粒子を評価して、平均輝度を計算した。
[00101] 図９に示されるように、単一τ２－ドットの強度及び寿命測定のためにステージ走査共焦点顕微鏡を構築した。８０８ｎｍのシングルモード偏光レーザーの励起源は、１００×対物レンズ（UPLanSApo100X、油浸、ＮＡ＝１．４０、Olympus Inc., JPN）を通してサンプルに焦点を合わせた。サンプルからの発光を同じ対物レンズにより集め、システムの最初のエアリーディスクと一致するコアサイズを有する光ファイバーに再度焦点を合わせた。ショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ、ZT785spxxr-UF1、Chroma Inc., USA）及びショートパスフィルタ（ＳＰＦ、ET750sp-2p8、Chroma Inc., USA）により、蛍光シグナルをレーザーからフィルタリングした。単一光子計数アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ、SPCM-AQR-14-FC、Excelitas Inc., USA）をマルチモードファイバー（ＭＭＦ、M42L02、Thorlabs Inc., USA）に接続して、発光強度を検出した。３Ｄピエゾステージを移動させることにより、走査を達成した。全ての単一ナノ粒子は、共焦点走査顕微鏡画像においてガウススポットを示した。各ガウススポットの最大輝度値（光子カウント）を使用して、その単一ナノ粒子の輝度を表した。２０を超える単一ナノ粒子を評価して、平均輝度を計算した。
【0084】
[00102] 寿命測定のために、ダイオードレーザーを変調して、２００μｓの励起パルスを生成した。光子計測ＳＰＡＤを連続的にオンにして、長寿命の発光を捕捉した。各時点について、ゲート幅は、５μｓであり、蓄積回数は、１００００回である。多機能データ取得デバイス（USB-6343、National Instruments）及び専用LabVIEWプログラムを用いて、パルス励起、時間ゲートデータ収集及び共焦点走査を制御及び同期させた。
【0085】
広視野スペクトル及び寿命測定
[00103] 図１０に示されるように、τ２－ドットの蛍光寿命画像シーケンスを取得するために、広視野蛍光顕微鏡を構築した。シングルモードダイオード励起固体レーザー（LU0808M250、Lumics Inc., GER、８０８ｎｍ、励起パワー密度５．４６ｋＷ／ｃｍ２）を使用し、レーザービームを３倍に拡大した後、τ２－ドットを励起させた。τ２－ドットの発光を高ＮＡ対物レンズ（UPLanSApo100X、油浸、ＮＡ＝１．４０、Olympus Inc., JPN）により収集し、ショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ１、ZT785spxxr-UF1、Chroma Inc., USA）及びショートパスフィルタ（ＳＰＦ、ET750sp-2p8、Chroma Inc., USA）によりレーザー反射から分離し、次にチューブレンズにより時間分解ｓＣＭＯＳカメラ（iStar sCMOS、Andor Inc., UK）に焦点を合わせた。カメラは、ＢＮＣケーブルを介して励起レーザービームのパルス変調器としても機能する。カメラのキネティクスモード及び２５０ＨｚのIntegrate-On-Chip（ＩＯＣ）を適用することにより、０～２００μｓのレーザー励起パルス下において、０μｓから３７５０μｓまで５０μｓの時間ゲートで７５フレームの寿命画像シーケンスを取得した。ＩＯＣモードにより、シグナル対ノイズ比が大幅に改善された蛍光シグナルの蓄積が可能となった。９７６ｎｍの励起下でτ２－ドットの蛍光寿命画像シーケンスを測定するために、シングルモード９７６ｎｍレーザー（BL976-PAG900、Thorlabs Inc., USA、励起パワー密度８．７ｋＷ／ｃｍ２）を励起光としてセットアップに追加した。コリメーション後、励起ビームを２．５倍に拡大し、次にショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ２、T875spxrxt-UF1、Chroma Inc., USA）によって反射させ、対物レンズを通してサンプルスライドに焦点を合わせた。蛍光シグナルは、フリップミラーを切り換えることによってマルチモードファイバー（ＭＭＦ、M24L02、Thorlabs Inc., USA）に結合させ、アップコンバージョン発光スペクトルを測定するために小型モノクロメーター（iHR550、Horiba Inc., JPN）によって検出することもできる。スペクトル領域は、４００～７５０ｎｍの範囲であった。
[00103] 図１０に示されるように、τ２－ドットの蛍光寿命画像シーケンスを取得するために、広視野蛍光顕微鏡を構築した。シングルモードダイオード励起固体レーザー（LU0808M250、Lumics Inc., GER、８０８ｎｍ、励起パワー密度５．４６ｋＷ／ｃｍ２）を使用し、レーザービームを３倍に拡大した後、τ２－ドットを励起させた。τ２－ドットの発光を高ＮＡ対物レンズ（UPLanSApo100X、油浸、ＮＡ＝１．４０、Olympus Inc., JPN）により収集し、ショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ１、ZT785spxxr-UF1、Chroma Inc., USA）及びショートパスフィルタ（ＳＰＦ、ET750sp-2p8、Chroma Inc., USA）によりレーザー反射から分離し、次にチューブレンズにより時間分解ｓＣＭＯＳカメラ（iStar sCMOS、Andor Inc., UK）に焦点を合わせた。カメラは、ＢＮＣケーブルを介して励起レーザービームのパルス変調器としても機能する。カメラのキネティクスモード及び２５０ＨｚのIntegrate-On-Chip（ＩＯＣ）を適用することにより、０～２００μｓのレーザー励起パルス下において、０μｓから３７５０μｓまで５０μｓの時間ゲートで７５フレームの寿命画像シーケンスを取得した。ＩＯＣモードにより、シグナル対ノイズ比が大幅に改善された蛍光シグナルの蓄積が可能となった。９７６ｎｍの励起下でτ２－ドットの蛍光寿命画像シーケンスを測定するために、シングルモード９７６ｎｍレーザー（BL976-PAG900、Thorlabs Inc., USA、励起パワー密度８．７ｋＷ／ｃｍ２）を励起光としてセットアップに追加した。コリメーション後、励起ビームを２．５倍に拡大し、次にショートパスダイクロイックミラー（ＤＭ２、T875spxrxt-UF1、Chroma Inc., USA）によって反射させ、対物レンズを通してサンプルスライドに焦点を合わせた。蛍光シグナルは、フリップミラーを切り換えることによってマルチモードファイバー（ＭＭＦ、M24L02、Thorlabs Inc., USA）に結合させ、アップコンバージョン発光スペクトルを測定するために小型モノクロメーター（iHR550、Horiba Inc., JPN）によって検出することもできる。スペクトル領域は、４００～７５０ｎｍの範囲であった。
【0086】
ディープラーニングのためのデータ処理及びネットワーク
[00104] 単一ナノ粒子に基づく機械学習を実施するために、データ処理を実施して、収集された画像内の単一ナノ粒子を選択した。７５フレームの画像から最も明るいフレーム（最大平均輝度）を選択した。次に、各輝点のピークピクセルを見出した。各ピークについて、ピークを中心に４０ピクセル×４０ピクセルの関心領域（ＲＯＩ）を切り取った。各ＲＯＩにおいて、画像をＯＴＳＵ閾値で分割し、バイナリーマスクを得た。２つの隣接するピークがバイナリーマスクにおいて接続され得ることを考慮して、バイナリーマスクで流域セグメンテーションを使用して各ピークの境界を得た。最後に、スポットの全てをそのピーク強度によりソートし、全てのスポットをそのピーク強度に従って４つのグループ（Ｑ１～Ｑ４）に分けた。Ｑ１～Ｑ４は、グループを分類するための４つの強度閾値を表す。ピーク強度が単一粒子の強度の統計的範囲内にある場合、スポットを単一ナノ粒子としてカウントした（例えば、τ２－１３について、８０００±１０００、Ｑ２グループに等しい）。凝集スポットを全て除去した後、単一ナノ粒子のみを含む画像を得た。その後、画像シーケンスを複数の単一ナノ粒子シーケンスに変換した。例えば、画像シーケンス内で１００個の粒子が単一ナノ粒子として特定された場合、この画像シーケンスを１００個の粒子シーケンスに分解した。
[00104] 単一ナノ粒子に基づく機械学習を実施するために、データ処理を実施して、収集された画像内の単一ナノ粒子を選択した。７５フレームの画像から最も明るいフレーム（最大平均輝度）を選択した。次に、各輝点のピークピクセルを見出した。各ピークについて、ピークを中心に４０ピクセル×４０ピクセルの関心領域（ＲＯＩ）を切り取った。各ＲＯＩにおいて、画像をＯＴＳＵ閾値で分割し、バイナリーマスクを得た。２つの隣接するピークがバイナリーマスクにおいて接続され得ることを考慮して、バイナリーマスクで流域セグメンテーションを使用して各ピークの境界を得た。最後に、スポットの全てをそのピーク強度によりソートし、全てのスポットをそのピーク強度に従って４つのグループ（Ｑ１～Ｑ４）に分けた。Ｑ１～Ｑ４は、グループを分類するための４つの強度閾値を表す。ピーク強度が単一粒子の強度の統計的範囲内にある場合、スポットを単一ナノ粒子としてカウントした（例えば、τ２－１３について、８０００±１０００、Ｑ２グループに等しい）。凝集スポットを全て除去した後、単一ナノ粒子のみを含む画像を得た。その後、画像シーケンスを複数の単一ナノ粒子シーケンスに変換した。例えば、画像シーケンス内で１００個の粒子が単一ナノ粒子として特定された場合、この画像シーケンスを１００個の粒子シーケンスに分解した。
【0087】
[00105] PyTorchパッケージ（https://pytorch.org/）を用いて、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）をパイソンで実行した。ディープラーニングの入力として、単一ナノ粒子の正規化された時間領域蛍光強度シーケンスを抽出した。１４のτ２－ドットの全てに対して上述のデータ処理を実施した。各τ２－ドットについて、約５００の単一ナノ粒子を訓練セットとしてランダムに選択した。ここで、その寿命の特徴及びタイプは、既知であった。約１００個の単一ナノ粒子を検証セットとして使用した。ネットワークアーキテクチャを決定する際、５つの重要な態様が存在した：１）畳み込みネットワークにおける層の数；２）各１Ｄ畳み込み層におけるフィルタの数；３）活性化関数を使用するかどうか；４）各全結合（ＦＣ）層におけるニューロンの数；５）ドロップアウト正則化スキームの保持確率。１０個のフィルタを有する１つの畳み込み層と、それぞれについて１０個のニューロンを有する２つの全結合層とのネットワーク構造から始めた。
【0088】
[00106] まず、１０～１０００の範囲で各全結合層においてニューロンの数を決定した。１０個のフィルタを有する１つの畳み込み層を仮定すると、各ＦＣ層のニューロンの数が約５００である場合、ネットワークは、満足できる結果を得た。上記の２つのＦＣ層を仮定して、畳み込み層の数及び各層のフィルタの数の決定を開始した。第１の層に５０個のフィルタ及び第２の層に２０個のフィルタを有する２つの畳み込み層を使用すると、ネットワークは、満足できる結果を得た。次に、上記の畳み込み層を仮定して、各ＦＣ層のニューロンの数をさらに調整し、各層において１００～２００個のニューロンで満足できる結果が得られることを見出した。上記の誘導により、ネットワーク構造は、第１の層に５０個のフィルタ及び第２の層に２０個のフィルタを有する２つの畳み込み層、それに続く各層に１００個のニューロンを有する２つのＦＣ層として一時的に決定された。このネットワーク構造を用いて、活性化関数又は／及びドロップアウトスキームを導入した場合のネットワーク性能を検証した。この手順において、ＲｅＬＵ、ＲｅＬＵ６及びＲＲｅＬＵの３つの活性化関数が検証された。ドロップアウトスキームの保持確率は、０．５～０．９の範囲で決定された。上記のネットワーク調整後、ＦＣ層のニューロンの数の調整に戻り、以下のような最終ネットワークアーキテクチャが得られた。
【0089】
[00107] フィンガープリント検索ネットワークは、２つの畳み込みネットワーク及び２つの全結合ネットワークを含んでいた。２つの１Ｄ畳み込み層は、要素ごとの関数ＲｅＬＵ６（ｘ）＝ｍｉｎ（ｍａｘ（０，ｘ），６）を使用した。第１の１Ｄ畳み込み層には、サイズ３のカーネルを使用する５０個のフィルタが存在し、ストライドサイズが２であった。第２の１Ｄ畳み込み層は、サイズ２のカーネルを有する２０個のフィルタを有し、ストライドサイズが１であった。２つの全結合ネットワークは、第１の層に１５０（ＦＣ１）ニューロン及び第２の層に１００（ＦＣ１）ニューロンを有する２つの層を含み、各層について、要素ごとの関数も使用した。全結合部分に対して８０％の保持確率を有するドロップアウト正則化スキームを適用した。訓練中、入力の２進数に対応する指標を有する出力層ニューロンは、「１」に設定され、他のニューロン活性化は、「０」に保持された。確率的勾配降下（ＳＧＤ）アルゴリズムの変形（「Adam」）を適用し、サイズ２００のランダムにシャッフルされたバッチを通してネットワークのパラメータを訓練した。カテゴリークロスエントロピー損失、学習率０．００５を使用し、ネットワークを５０エポックにわたって訓練した。
【0090】
[00108] 畳み込みニューラルネットワークの分類有効性は、ランダムにサンプリングされた５０回の実験の分類精度の平均及び偏差によって評価した。各サンプルの７つのセットの画像シーケンスを有し、訓練及び試験の５０回の実験を実行して、平均誤差及び偏差を算出する。各実験において、試験粒子に対して１つのセットの画像シーケンスをランダムに選択した。１４個のバッチのナノ粒子の場合、１４の画像シーケンスを選択した。残りの画像シーケンス内の単一ナノ粒子のデータは、訓練アルゴリズムセクションにおいて訓練セットとして使用した。ここで、それらの寿命特徴は、利用可能であるが、モデル誤差を算出するまでラベルが不明であった。１回の訓練及び試験プロセス後、１４の画像シーケンスの試験誤差が得られた。誤差の平均及び偏差は、５０のランダムな選択を通して算出された。
【0091】
偽造防止実験
[00109] ３つのタイプのτ２－ドットの使用による時間領域偽造防止は、サンプル平面上の励起パターンの空間変調に基づいた。デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を空間光変調器として広視野光学系に追加して、ＡＢＣアルファベットの励起パターンを生成した。レーザービームは、ビームのコリメーション及び拡大後にＤＭＤを照射した。次に、照射されたアルファベットパターンがサンプル平面上に画像化された。
[00109] ３つのタイプのτ２－ドットの使用による時間領域偽造防止は、サンプル平面上の励起パターンの空間変調に基づいた。デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を空間光変調器として広視野光学系に追加して、ＡＢＣアルファベットの励起パターンを生成した。レーザービームは、ビームのコリメーション及び拡大後にＤＭＤを照射した。次に、照射されたアルファベットパターンがサンプル平面上に画像化された。
【0092】
ＤＮＡアッセイ実験
[00110] ＤＮＡオリゴヌクレオチドとのバイオコンジュゲーション前に、合成後の表面修飾を用いて、τ２－ドットを親水性及び生体適合性に変えた。親水性ブロックポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレートホスフェートメタクリレート（ＰＯＥＧＭＡ－ｂ－ＰＭＡＥＰ）で構成されるブロックコポリマーとの配位子交換によって表面修飾を実施した２。典型的な手順において、５００μｌのＯＡコートされたτ２－ドット（２０ｍｇ／ｍＬ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に分散させた。次に、ＴＨＦ中のＯＡキャップされたτ２－ドットを２ｍＬのＴＨＦ中の５ｍｇのコポリマー（末端がカルボキシル基である）と混合した。上記の混合物を１分間超音波処理した後、室温で一晩、振とう器内でインキュベートした。ポリマーでコートされたτ２－ドットを１４８６０ｒｐｍで２０分間の水による洗浄／遠心分離により４回精製して、カルボキシル基修飾τ２－ドットを得た。上清を除去し、ＤＮＡとのさらなるコンジュゲーションのためにナノ粒子を水中に分散させた。
[00110] ＤＮＡオリゴヌクレオチドとのバイオコンジュゲーション前に、合成後の表面修飾を用いて、τ２－ドットを親水性及び生体適合性に変えた。親水性ブロックポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレートホスフェートメタクリレート（ＰＯＥＧＭＡ－ｂ－ＰＭＡＥＰ）で構成されるブロックコポリマーとの配位子交換によって表面修飾を実施した２。典型的な手順において、５００μｌのＯＡコートされたτ２－ドット（２０ｍｇ／ｍＬ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に分散させた。次に、ＴＨＦ中のＯＡキャップされたτ２－ドットを２ｍＬのＴＨＦ中の５ｍｇのコポリマー（末端がカルボキシル基である）と混合した。上記の混合物を１分間超音波処理した後、室温で一晩、振とう器内でインキュベートした。ポリマーでコートされたτ２－ドットを１４８６０ｒｐｍで２０分間の水による洗浄／遠心分離により４回精製して、カルボキシル基修飾τ２－ドットを得た。上清を除去し、ＤＮＡとのさらなるコンジュゲーションのためにナノ粒子を水中に分散させた。
【0093】
[00111] 短い２４塩基の長さの５対の病原体関連遺伝子配列（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ－１６、ＥＶ）を選択した。カルボジイミド化学のプロトコルを用いて、ポリマーのカルボキシル基をプローブＤＮＡ分子のアミン基とコンジュゲートさせた。５つのグループのカルボキシル－τ２－ドットは、室温で３０分間わずかに振とうさせながら、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２ｍＭ、ｐＨ７．２）中のＥＤＣ（カルボキシル－τ２－ドットに対して１００倍のモル比）によって再活性化させた。５つのグループのＮＨ２－ＤＮＡ（１００ｕＭ）を、それぞれ３時間の反応のために６００ｒｐｍで振とうさせながら上記の溶液に添加した。活性化カルボキシル－τ２－ドットを１４６８０ｒｐｍサイクルで２回洗浄／遠心分離してＥＤＣを除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁させて、プローブＤＮＡ－ポリマー－τ２－ドットを得た。
【0094】
[00112] ２００μＬのＰＢＳ緩衝液中の約０．５μｇ／ｍＬの濃度のストレプトアビジンを５対の９６ウェルプレート上にコートし、室温で４時間インキュベートした。その後、上清を除去し、２００μＬのＰＢＳ中の２００ｐｍｏｌのビオチン化捕捉ＤＮＡをウェルに添加し、さらなる固定化のために４℃で一晩インキュベートした。反応後にプレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、次に２００μＬの１％カゼインを含むブロッキング緩衝液を各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。実験ウェルの５つに２００ｕＬのＴｒｉｓ緩衝液中の標的ＤＮＡを添加し、室温で２時間インキュベートしたが、５つの対応する対照ウェルには、標的ＤＮＡを含まないＴｒｉｓ緩衝液を添加した。Ｔｒｉｓ緩衝液により３回洗浄した後、Ｔｒｉｓ中に０．１％のカゼイン及び５ｍＭのＮａＦを含有する反応緩衝液中の１００μＬの相補的ＤＮＡ機能化τ２－ドットを添加して、１時間反応させた。次に、ウェルを３回洗浄し、ウェルを最終的に１００μｌのＴｒｉｓ－５ｍＭのＮａＦ中に溶解させた後、画像を検出した。
【0095】
ＳＩＭイメージング実験
[00113] 広視野超解像度技術としての構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、サンプル平面上の励起パターンの空間変調に基づいた。この研究では、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ、DLP 4100、Texas Instruments Inc., USA）を空間光変調器として使用し、励起パターンを生成した。ＤＭＤは、チップ上の１０２４×７６８のマイクロミラーのアレイを含んでいた。各マイクロミラーのサイズは、１３．６８×１３．６８μｍ２であった。マイクロミラーのそれぞれについて、物理的サイズは、９１％の充填率のために１３．６８μｍよりもわずかに小さかった。各マイクロミラーは、その対角線に沿って２つの位置：傾き±１２°に傾けて、入射光ビームを光路からそらすことができる。これらのマイクロミラーを独立して制御し、入射光の振幅を変調して任意の照明パターンを生成することができる。
[00113] 広視野超解像度技術としての構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、サンプル平面上の励起パターンの空間変調に基づいた。この研究では、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ、DLP 4100、Texas Instruments Inc., USA）を空間光変調器として使用し、励起パターンを生成した。ＤＭＤは、チップ上の１０２４×７６８のマイクロミラーのアレイを含んでいた。各マイクロミラーのサイズは、１３．６８×１３．６８μｍ２であった。マイクロミラーのそれぞれについて、物理的サイズは、９１％の充填率のために１３．６８μｍよりもわずかに小さかった。各マイクロミラーは、その対角線に沿って２つの位置：傾き±１２°に傾けて、入射光ビームを光路からそらすことができる。これらのマイクロミラーを独立して制御し、入射光の振幅を変調して任意の照明パターンを生成することができる。
【0096】
[00114] 図１１に示されるように、時間分解ＳＩＭの光学系は、適切に変更された従来の広視野蛍光顕微鏡（図１０）に基づいて構築された。超解像度画像シリーズの再構築において、３つの異なる角度方向（θ１＝０°、θ２＝６０°及びθ３＝１２０°）及び３つの異なる位相シフト（φ１＝０°、φ２＝１２０°及びφ３＝２４０°）に対応する９つの照明パターンで９つの生画像シリーズを取得した。次に、これらのシリーズの各フレームについて、これらの生画像に高速フーリエ変換アルゴリズムを適用することにより、９つの全ての周波数スペクトルを得た。スペクトルの分離後、９つの全ての周波数成分をその真の位置にシフトして、最終的なＳＩＭ画像を再構築した。データは、全てフリーオープンソースのＳＩＭ画像再構築プラグインfairSIMと共にImageJ/Fijiを用いて再構築した。
【0097】
参考文献
１．Liu, E. et al. Three-dimensional controlled growth of monodisperse sub-50 nm heterogeneous nanocrystals. Nat. Commun. 7, 10254 (2016).
２．Duong, H.T.T. et al. Systematic investigation of functional ligands for colloidal stable upconversion nanoparticles. RSC Adv. 8, 4842-4849 (2018).
１．Liu, E. et al. Three-dimensional controlled growth of monodisperse sub-50 nm heterogeneous nanocrystals. Nat. Commun. 7, 10254 (2016).
２．Duong, H.T.T. et al. Systematic investigation of functional ligands for colloidal stable upconversion nanoparticles. RSC Adv. 8, 4842-4849 (2018).
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【国際調査報告】