特表 2023-536085 スルホン化ＤＮＡの精製

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-23

(54)【発明の名称】スルホン化ＤＮＡの精製

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20230816BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20230816BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230816BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20230816BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 114Z

C12N15/10 112Z

C12N15/10 110Z

C12Q1/6806 Z

C12M1/00 A

C12M1/26

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023505706

(86)(22)【出願日】2021-07-29

(85)【翻訳文提出日】2023-01-26

(86)【国際出願番号】 US2021043769

(87)【国際公開番号】W WO2022039904

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】63/058,179

(32)【優先日】2020-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518065773

【氏名又は名称】エグザクト サイエンシーズ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ラグランド，エヴァン エム．

(72)【発明者】

【氏名】ギャグラット，ズービン

(72)【発明者】

【氏名】ドマニコ，マイケル ジェイ．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029AA23

4B029BB20

4B029CC02

4B029CC04

4B029CC10

4B029CC13

4B029HA01

4B029HA10

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QS15

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、化学修飾された、具体的には、スルホン化されたＤＮＡの精製のための方法及びシステムを提供する。加えて、本開示は、シリカビーズなどのシリカ支持体を使用した、スルホン化ＤＮＡの精製、及び、シリカ表面にスルホン化ＤＮＡを結合するための酸性条件を改善した、バイサルファイト変換のための方法及びシステムを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

酸性結合溶液中でスルホン化ＤＮＡとシリカ支持体とを組み合わせることを含み、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが、前記シリカ支持体に結合される、方法。

【請求項2】

前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記シリカ支持体が、磁性である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、５未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、２．０～４である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記酸性結合溶液が、カオトロピック塩を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）及びグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記方法が、一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、前記スルホン化ＤＮＡを生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記スルホン化試薬が、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

ｉ）スルホン化ＤＮＡに結合されたシリカ支持体を洗浄することと、
ｉｉ）前記スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化して、脱スルホン化ＤＮＡを形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体から前記脱スルホン化ＤＮＡを溶出することと、のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

非スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートすることが、前記スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有するスルホン化反応溶液中で行われる、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が、前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の実質的に全てが、前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が、サイズ排除濾過によって前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記酸性結合溶液が、前記スルホン化反応溶液中の前記スルホン化ＤＮＡに酸性成分を添加することによって形成される、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記酸性成分が、酸性溶液である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記酸性成分が、酸性の酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン溶液のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記酸性成分が、カオトロピック塩を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ ＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

脱スルホン化ＤＮＡを調製する方法であって、
ｉ）一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、スルホン化反応混合物中でスルホン化ＤＮＡを生成することと、
ｉｉ）前記スルホン化反応混合物を、
ａ）酸性成分、
ｂ）カオトロピック塩、及び
ｃ）シリカ支持体と組み合わせて、
酸性結合溶液を形成することであって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが、前記シリカ支持体に結合される、前記形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡを前記酸性結合溶液から分離することと、
ｉｖ）前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化されている条件下で、分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することと、を含む、前記方法。

【請求項21】

前記非スルホン化ＤＮＡが、１つ以上の非メチル化シトシンヌクレオチドを含み、前記脱スルホン化ＤＮＡが、１つ以上のデオキシウラシルヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化されている条件下で、分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することが、スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化溶液と組み合わせることを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記脱スルホン化溶液が、前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡと組み合わされる、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

カオトロピック塩を含む酸性結合溶液中にスルホン化ＤＮＡ及びシリカ支持体を含む組成物であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが、前記シリカ支持体に結合される、前記組成物。

【請求項25】

前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記酸性結合溶液が、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

前記酸性結合溶液が、クエン酸緩衝液を含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記酸性結合溶液が、亜硫酸水素塩を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項29】

前記亜硫酸水素塩が、亜硫酸水素アンモニウムである、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、５未満である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項31】

前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、２．０～４である、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

ｉ）バイサルファイト試薬溶液またはバイサルファイト試薬溶液を調製するための成分と、
ｉｉ）シリカ支持体と、
ｉｉｉ）スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する酸性成分と、を含む、キット。

【請求項33】

前記バイサルファイト試薬溶液が、スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）を超えるｐＨを有する、請求項３２に記載のキット。

【請求項34】

前記酸性成分が、酸性溶液である、請求項３２に記載のキット。

【請求項35】

前記酸性成分が、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載のキット。

【請求項36】

カオトロピック塩を更に含む、請求項３２に記載のキット。

【請求項37】

前記酸性成分が、カオトロピック塩を含む、請求項３６に記載のキット。

【請求項38】

前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、請求項３６に記載のキット。

【請求項39】

前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、請求項３２に記載のキット。

【請求項40】

前記シリカ支持体が、磁性である、請求項３２に記載のキット。

【請求項41】

前記酸性成分の前記ｐＨが、５未満である、請求項３２に記載のキット。

【請求項42】

前記酸性成分の前記ｐＨが、２．０～４である、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

酸性結合溶液中でスルホン化ＤＮＡとシリカ支持体とを組み合わせることを含む方法であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、スルホン化ＤＮＡが、前記シリカ支持体に結合され、前記シリカ支持体が、好ましくは、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含み、前記シリカ支持体が、好ましくは磁性である、前記方法。

【請求項44】

前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、５未満、好ましくは４未満、好ましくは約２．０～４である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記酸性結合溶液が、カオトロピック塩を含み、前記カオトロピック塩が、好ましくは塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）及びグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記方法が、一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、前記スルホン化ＤＮＡを生成することを更に含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記スルホン化試薬が、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

ｉ）スルホン化ＤＮＡに結合されたシリカ支持体を洗浄することと、
ｉｉ）前記スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化して、脱スルホン化ＤＮＡを形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体から前記脱スルホン化ＤＮＡを溶出することと、のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項４３～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

非スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートすることが、前記スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有するスルホン化反応溶液中で行われる、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が、前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の実質的に全てが、前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記スルホン化反応溶液の前記少なくとも一部が、サイズ排除濾過によって前記スルホン化ＤＮＡから除去される、請求項５０または５１に記載の方法。

【請求項53】

前記酸性結合溶液が、前記スルホン化反応溶液中の前記スルホン化ＤＮＡに酸性成分を添加することによって形成される、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記酸性成分が、酸性溶液である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記酸性成分が、酸性の酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸溶液のうちの少なくとも１つを含む、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記酸性成分が、カオトロピック塩を含み、前記カオトロピック塩が、好ましくは、ＧｕＨＣｌ ＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

脱スルホン化ＤＮＡを調製する方法であって、
ｉ）一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、スルホン化反応混合物中でスルホン化ＤＮＡを生成することと、
ｉｉ）前記スルホン化反応混合物を、
ａ）酸性成分、
ｂ）カオトロピック塩、及び
ｃ）シリカ支持体と組み合わせて、
酸性結合溶液を形成することであって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが、前記シリカ支持体に結合される、前記形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡを前記酸性結合溶液から分離することと、
ｉｖ）前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化される条件下で、分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することと、含み、
好ましくは、前記非スルホン化ＤＮＡが、１つ以上の非メチル化シトシンヌクレオチドを含み、前記脱スルホン化ＤＮＡが、１つ以上のデオキシウラシルヌクレオチドを含む、前記方法。

【請求項58】

前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化される条件下で分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することが、スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化溶液と組み合わせることを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記脱スルホン化溶液が、前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡと組み合わされる、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

カオトロピック塩を含む酸性結合溶液中にスルホン化ＤＮＡ及びシリカ支持体を含む組成物であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合され、
前記カオトロピック塩が、好ましくは、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含み、前記酸性結合溶液が、好ましくは、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、前記組成物。

【請求項61】

前記酸性結合溶液が、亜硫酸水素塩、好ましくは亜硫酸水素アンモニウムを含む、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記酸性結合溶液のｐＨが５未満、好ましくは２．０～４である、請求項６０または請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

ｉ）バイサルファイト試薬溶液が好ましくは、スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）を超えるｐＨを有する、前記バイサルファイト試薬溶液または前記バイサルファイト試薬溶液を調製するための成分と、
ｉｉ）シリカ支持体と、
ｉｉｉ）前記スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する、酸性成分、好ましくは酸性溶液と、を含み、前記酸性成分が、好ましくは酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液、のうちの少なくとも１つ、好ましくはクエン酸緩衝液含む、キット。

【請求項64】

カオトロピック塩を更に含み、好ましくは、前記酸性成分がカオトロピック塩を含み、好ましくは、前記カオトロピック塩がＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、請求項６３に記載のキット。

【請求項65】

前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、請求項６３または６４に記載のキット。

【請求項66】

前記シリカ支持体が、磁性である、請求項６３～６５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項67】

前記酸性成分のｐＨが、５未満であり、好ましくは、前記酸性成分のｐＨが、２．０～４である、請求項６３～６６のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年７月２９日に出願された米国仮出願第６３／０５８，１７９号の優先権を主張する。

【0002】

本開示は、スルホン化ＤＮＡの精製に関する。加えて、本開示は、ＤＮＡのバイサルファイト変換、ならびに支持体（例えば、シリカ支持体）を有するスルホン化ＤＮＡの改善された精製、ならびにスルホン化ＤＮＡを支持体に結合するための酸性条件の使用のための方法及びシステムに関する。

【0003】

〔背景技術〕
ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡ、具体的にはＤＮＡのシトシン環にメチル基を添加し、それによって遺伝子の機能を修飾することによって生じるエピジェネティック機構である。ＤＮＡメチル化部位の検出及びマッピングは、エピジェネティック遺伝子調節を理解し、がん及び他の疾患状態の発生及び進行に関与する異常なＤＮＡメチル化を検出するために不可欠である。

【0004】

メチル化部位のマッピングは、現在、ＤＮＡ中の５－メチルシトシンの検出のためのＦｒｏｍｍｍｅｒらにより記述されるバイサルファイト法（参照により、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８２７－３１（１９９２））、またはその変形により達成される。５－メチルシトシンをマッピングするバイサルファイト法は、５－メチルシトシンではなくシトシンが亜硫酸水素塩と反応するという観察に基づいている。通常、この反応は、シトシンを亜硫酸水素と反応させてスルホン化シトシンを形成するステップと、スルホン化ウラシルをもたらすスルホン化反応中間体の自発的な脱アミノ化と、ウラシルをアルカリ条件下で脱スルホン化してウラシルを形成するステップと、を含む、一連のステップを含む。ウラシルと５－メチルシトシンとの塩基対の差異は、アデニンとのウラシル塩基対及びグアニンとの５－メチルシトシン塩基の検出を容易にする。したがって、様々な方法で、例えば、バイサルファイトゲノム配列決定（Ｇｒｉｇｇ Ｇ，＆ Ｃｌａｒｋ Ｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９４）１６：４３１－３６、Ｇｒｉｇｇ Ｇ，ＤＮＡ Ｓｅｑ．（１９９６）６：１８９－９８）、または例えば、米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているようなメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により、メチル化されたシトシンを非メチル化シトシンと区別することができる。反応条件、試薬の濃度等における多数の変形は、バイサルファイト変換について当該技術分野で既知であり、各変形は、ＤＮＡ回収率及び脱アミノ化レベルの差異をもたらし得る。

【0005】

一般に、バイサルファイト処理方法は、塩基対分析のための、精製され変換されたＤＮＡ試料を生成するための、洗浄ステップ及び緩衝液交換を含む。様々なアプローチは、例えば、スピンカラム、エタノール精製、及び固体支持体などのステップを促進する。しかしながら、シリカスピンカラムまたはエタノール精製を使用する方法は、多くの場合、シトシンメチル化の手段としてのバイサルファイト法の有用性を損なう試料の損失をもたらす。固体支持体を使用したいくつかの改善が開発されているが、これらの方法は、入力として大量のＤＮＡを必要とし、試料の損失及び再現性の問題にも悩まされる。加えて、従来の方法は、多くの場合、完了するために数日の時間を要し、変換されたＤＮＡの効率的な変換及び回収をもたらさない。したがって、従来の方法は、ＤＮＡメチル化の定性的尺度のみを提供する。

【0006】

ＤＮＡのバイサルファイト変換を最適化しようとする場合、一般に、バイサルファイト修飾反応自体、すなわち、ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシンをスルホン化するステップに注目してきた。得られたスルホン化ＤＮＡの回収を改善するいくつかの方法は、カオトロピック塩濃度を増加させることに注目し、それによって水とＤＮＡとの水素結合を破壊し、シリカ－ＤＮＡ相互作用を促進する。他の方法は、結合緩衝液を単純化することによって、（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３１５，８５３号にあるように）シトシンが豊富なＤＮＡの回復率の低下に対処し、アルコール及びトリスなどの添加剤が除去される。

【0007】

〔発明の概要〕
本明細書に開示されるシステム及び方法は、特にシトシンが豊富な標的のために、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡ回収を増加させ、バイサルファイト処理プロセスにおける変動に対する堅牢性を改善し、幅広い試料タイプのＤＮＡ回収を増加させる。本方法は、水素結合の破壊に加えて、シリカ－ＤＮＡ相互作用を促進するようにＤＮＡ電荷を中和することを含む。

【0008】

酸性溶液中のシリカ支持体にスルホン化ＤＮＡを結合することを含む方法が本明細書に開示され、酸性溶液は、スルホン化ＤＮＡの等電点ｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｐＨは５未満である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、２．５～４である。酸性溶液は、カオトロピック塩または薬剤を更に含み得る。いくつかの実施形態において、カオトロピック塩は、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である。

【0009】

本方法は、変性された非スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、スルホン化ＤＮＡを生成することを更に含み得る。本明細書で使用される場合、「スルホン化試薬」という用語は、好ましくは、非メチル化シトシンヌクレオチドをウラシルスルホネートヌクレオチドに選択的に変換する試薬を指す。いくつかの実施形態において、スルホン化試薬は、亜硫酸水素アンモニウムである。

【0010】

本方法は、スルホン化ＤＮＡに結合されたシリカ支持体を洗浄すること、スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化して脱スルホン化ＤＮＡを形成すること、及びシリカ支持体から脱スルホン化ＤＮＡを溶出することのうちの少なくとも１つまたは全てを更に含み得る。いくつかの実施形態において、洗浄は、アルコール、例えば、エタノールで行われる。いくつかの実施形態において、脱スルホン化は、アルカリ条件下でのスルホン化ＤＮＡのインキュベーションを含み、いくつかの実施形態において、スルホン化ＤＮＡが検出アッセイ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に直接添加され、その結果、スルホン化ＤＮＡが検出アッセイを実施する条件下で脱スルホン化される。いくつかの実施形態において、溶出は、高熱による処理を含む。

【0011】

この技術は、以下の実施形態を更に包含し、以下の実施形態によって例証される。

【0012】

１．酸性結合溶液中でスルホン化ＤＮＡとシリカ支持体とを組み合わせることを含み、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合される、方法。

【0013】

２．前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の方法。

【0014】

３．前記シリカ支持体が、磁性である、実施形態１に記載の方法。

【0015】

４．前記酸性結合溶液のｐＨが、５未満である、実施形態１に記載の方法。

【0016】

５．前記酸性結合溶液のｐＨが２．０～４である、実施形態４に記載の方法。

【0017】

６．前記酸性結合溶液が、カオトロピック塩を含む、実施形態１に記載の方法。

【0018】

７．前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）及びグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）の少なくとも１つを含む、実施形態６に記載の方法。

【0019】

８．前記方法が、一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、前記スルホン化ＤＮＡを生成することを更に含む、実施形態１に記載の方法。

【0020】

９．前記スルホン化試薬が、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、実施形態８に記載の方法。

【0021】

１０．ｉ）スルホン化ＤＮＡに結合されたシリカ支持体を洗浄することと、
ｉｉ）前記スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化して脱スルホン化ＤＮＡを形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体から前記脱スルホン化ＤＮＡを溶出することと、のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態１に記載の方法。

【0022】

１１．非スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートすることが、前記スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有するスルホン化反応溶液中で行われる、実施形態８に記載の方法。

【0023】

１２．酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が前記スルホン化ＤＮＡから除去される、実施形態１１に記載の方法。

【0024】

１３．前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の実質的に全てが、前記スルホン化ＤＮＡから除去される、実施形態１２に記載の方法。

【0025】

１４．前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が、サイズ排除濾過によって前記スルホン化ＤＮＡから除去される、実施形態１２に記載の方法。

【0026】

１５．前記酸性結合溶液が、前記スルホン化反応溶液中の前記スルホン化ＤＮＡに酸性成分を添加することによって形成される、実施形態１１に記載の方法。

【0027】

１６．前記酸性成分が、酸性溶液である、実施形態１５に記載の方法。

【0028】

１７．前記酸性成分が、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１６に記載の方法。

【0029】

１８．前記酸性成分が、カオトロピック塩を含む、実施形態１５に記載の方法。

【0030】

１９．前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ ＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１８に記載の方法。

【0031】

２０．脱スルホン化ＤＮＡを調製する方法であって、
ｉ）一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、スルホン化反応混合物中でスルホン化ＤＮＡを生成することと、
ｉｉ）前記スルホン化反応混合物を
ａ）酸性成分、
ｂ）カオトロピック塩、及び
ｃ）シリカ支持体と組み合わせて
酸性結合溶液を形成することであって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合される、前記形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡを前記酸性結合溶液から分離することと、
ｉｖ）前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化されている条件下で、分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することと、を含む、前記方法。

【0032】

２１．前記非スルホン化ＤＮＡが、１つ以上の非メチル化シトシンヌクレオチドを含み、前記脱スルホン化ＤＮＡが、１つ以上のデオキシウラシルヌクレオチドを含む、実施形態２０に記載の方法。

【0033】

２２．前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化される条件下で分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することが、スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化溶液と組み合わせることを含む、実施形態２０に記載の方法。

【0034】

２３．前記脱スルホン化溶液が、前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡと組み合わされる、実施形態２２に記載の方法。

【0035】

２４．カオトロピック塩を含む酸性結合溶液中にスルホン化ＤＮＡ及びシリカ支持体を含む組成物であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合される、前記組成物。

【0036】

２５．前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、実施形態２４に記載の組成物。

【0037】

２６．前記酸性結合溶液が、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２４に記載の組成物。

【0038】

２７．前記酸性結合溶液が、クエン酸緩衝液を含む、実施形態２６に記載の組成物。

【0039】

２８．前記酸性結合溶液が、亜硫酸水素塩を含む、実施形態２４に記載の組成物。

【0040】

２９．前記亜硫酸水素塩が、亜硫酸水素アンモニウムである、実施形態２８に記載の組成物。

【0041】

３０．前記酸性結合溶液の前記ｐＨが５未満である、実施形態２４に記載の組成物。

【0042】

３１．前記酸性結合溶液の前記ｐＨが、２．０～４である、実施形態３０に記載の組成物。

【0043】

３２．ｉ）バイサルファイト試薬溶液またはバイサルファイト試薬溶液を調製するための成分と、
ｉｉ）シリカ支持体と、
ｉｉｉ）スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する酸性成分と、を含む、キット。

【0044】

３３．前記バイサルファイト試薬溶液が、スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）を超えるｐＨを有する、実施形態３２に記載のキット。

【0045】

３４．前記酸性成分が、酸性溶液である、実施形態３２に記載のキット。

【0046】

３５．前記酸性成分が、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、実施形態３３に記載のキット。

【0047】

３６．カオトロピック塩を更に含む、実施形態３２に記載のキット。

【0048】

３７．前記酸性成分が、カオトロピック塩を含む、実施形態３６に記載のキット。

【0049】

３８．前記カオトロピック塩が、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３６に記載のキット。

【0050】

３９．前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、実施形態３２に記載のキット。

【0051】

４０．前記シリカ支持体が磁性である、実施形態３２に記載のキット。

【0052】

４１．前記酸性成分の前記ｐＨが５未満である、実施形態３２に記載のキット。

【0053】

４２．前記酸性成分の前記ｐＨが、２．０～４である、実施形態４１に記載のキット。

【0054】

４３．酸性結合溶液中でスルホン化ＤＮＡとシリカ支持体を組み合わせることを含む方法であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合され、前記シリカ支持体が、好ましくは、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含み、前記シリカ支持体が、好ましくは磁性である、前記方法。

【0055】

４４．前記酸性結合溶液の前記ｐＨが５未満、好ましくは４未満、好ましくは約２．０～４である、実施形態４３に記載の方法。

【0056】

４５．前記酸性結合溶液がカオトロピック塩を含み、前記カオトロピック塩が好ましくは塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）及びグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）の少なくとも１つを含む、実施形態４３または実施形態４４に記載の方法。

【0057】

４６．前記方法が、一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして前記スルホン化ＤＮＡを生成することを更に含む、実施形態４３～４５のいずれかに記載の方法。

【0058】

４７．前記スルホン化試薬が、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、実施形態４６に記載の方法。

【0059】

４８．ｉ）スルホン化ＤＮＡに結合されたシリカ支持体を洗浄することと、
ｉｉ）前記スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化して脱スルホン化ＤＮＡを形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体から前記脱スルホン化ＤＮＡを溶出することと、のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態４３～４７のいずれかに記載の方法。

【0060】

４９．非スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートすることが、前記スルホン化ＤＮＡの前記ｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有するスルホン化反応溶液中で行われる、実施形態４８に記載の方法。

【0061】

５０．前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の少なくとも一部が前記スルホン化ＤＮＡから除去される、実施形態４９に記載の方法。

【0062】

５１．前記酸性結合溶液中で前記スルホン化ＤＮＡと前記シリカ支持体とを組み合わせる前に、前記スルホン化反応溶液の実質的に全てが、前記スルホン化ＤＮＡからを除去される、実施形態５０に記載の方法。

【0063】

５２．前記スルホン化反応溶液の前記少なくとも一部が、サイズ排除濾過によって前記スルホン化ＤＮＡから除去される、実施形態５０または５１に記載の方法。

【0064】

５３．前記酸性結合溶液が、前記スルホン化反応溶液中の前記スルホン化ＤＮＡに酸性成分を添加することによって形成される、実施形態４９～５２のいずれかに記載の方法。

【0065】

５４．前記酸性成分が、酸性溶液である、実施形態５３に記載の方法。

【0066】

５５．前記酸性成分が、酸性の酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸溶液のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５３または５４に記載の方法。

【0067】

５６．前記酸性成分が、カオトロピック塩を含み、前記カオトロピック塩が、好ましくは、ＧｕＨＣｌ ＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、実施形態５３～５５のいずれかに記載の方法。

【0068】

５７．脱スルホン化ＤＮＡを調製する方法であって、
ｉ）一本鎖非スルホン化ＤＮＡまたは部分的スルホン化ＤＮＡをスルホン化試薬と共にインキュベートして、スルホン化反応混合物中でスルホン化ＤＮＡを生成することと、
ｉｉ）前記スルホン化反応混合物を：
ａ）酸性成分、
ｂ）カオトロピック塩、及び
ｃ）シリカ支持体、と組み合わせて
酸性結合溶液を形成することであって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡの等電点（ｐＨ（Ｉ））以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合される、前記形成することと、
ｉｉｉ）前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡを前記酸性結合溶液から分離することと、
ｉｖ）前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化される条件下で分離されたスルホン化ＤＮＡを処理すること、含み、
好ましくは、前記非スルホン化ＤＮＡは１つ以上の非メチル化シトシンヌクレオチドを含み、前記脱スルホン化ＤＮＡは１つ以上のデオキシウラシルヌクレオチドを含む、前記方法。

【0069】

５８．前記スルホン化ＤＮＡが脱スルホン化される条件下で分離されたスルホン化ＤＮＡを処理することが、スルホン化ＤＮＡを脱スルホン化溶液と組み合わせることを含む、実施形態５７に記載の方法。

【0070】

５９．前記脱スルホン化溶液が、前記シリカ支持体に結合されたスルホン化ＤＮＡと組み合わされる、実施形態５８に記載の方法。

【0071】

６０．カオトロピック塩を含む酸性結合溶液中にスルホン化ＤＮＡ及びシリカ支持体を含む組成物であって、前記酸性結合溶液が、前記スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有し、前記スルホン化ＤＮＡが前記シリカ支持体に結合され、
前記カオトロピック塩が、好ましくは、ＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含み、前記酸性結合溶液が、好ましくは、酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液のうちの少なくとも１つを含む、前記組成物。

【0072】

６１．前記酸性結合溶液が、亜硫酸水素塩、好ましくは亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態６０に記載の組成物。

【0073】

６２．前記酸性結合溶液の前記ｐＨが５未満、好ましくは２．０～４である、実施形態６０または実施形態６１に記載の組成物。

【0074】

６３．ｉ）バイサルファイト試薬溶液が好ましくは、スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）を超えるｐＨを有する、前記バイサルファイト試薬溶液またはバイサルファイト試薬溶液を調製するための成分と、
ｉｉ）シリカ支持体と、
ｉｉｉ）スルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する、酸性成分、好ましくは酸性溶液と、を含み、前記酸性成分が、好ましくは酢酸、グリシン、リンゴ酸、ギ酸、またはクエン酸緩衝液、のうちの少なくとも１つ、好ましくはクエン酸緩衝液含む、キット。

【0075】

６４．カオトロピック塩を更に含み、好ましくは、前記酸性成分がカオトロピック塩を含み、好ましくは、前記カオトロピック塩がＧｕＨＣｌ及びＧＩＴＣのうちの少なくとも１つを含む、実施形態６３に記載のキット。

【0076】

６５．前記シリカ支持体が、粒子、ビーズ、及び繊維のうちの少なくとも１つを含む、実施形態６３または６４に記載のキット。

【0077】

６６．前記シリカ支持体が、磁性である、実施形態６３～６５のいずれか１項に記載のキット。

【0078】

６７．前記酸性成分の前記ｐＨが、５未満であり、好ましくは、前記酸性成分のｐＨが、２．０～４である、実施形態６３～６６のいずれか１項に記載のキット。

【0079】

本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの特定の好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、試料、例えば、生体試料から単離される。例えば、いくつかの好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、がんを有するか、またはがんを有する疑いのある対象などのヒト対象からの試料から、例えば、血漿試料、便試料、または対象からの他の試料から単離される。他の実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、合成物である。好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、塩基対ＤＮＡ鎖が分離して一本鎖を形成する変性条件（例えば、アルカリ条件、高温など）に二本鎖ＤＮＡを曝露することによって形成される。いくつかの実施形態において、脱スルホン化ＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ中の１つ以上のメチル化ＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）を測定するために測定される。例えば、本明細書（例えば、表１～７、図３、７～１３、１５Ａ、及び１５Ｂ、１６、及び１８に開示されているＭＤＭを含む、実験セクションまたは図面中）で名付けられたＤＮＡのうちのいずれかは、任意のタイプの試料（例えば、血漿、便、組織等）から、単独で、または組み合わせて、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６等の任意の部分的組み合わせで、検出または測定され得る。

【0080】

本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の図面に照らして明らかになるであろう。

【0081】

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本明細書に開示される方法を含むバイサルファイト処理方法の一実施形態の概要である。

【0082】

〔図２〕提案されている結合機構の概略図である。

【0083】

〔図３〕６つの異なるマーカーＤＮＡについて回収された結合ｐＨ対Ｌｏｇ鎖のグラフを提供する。

【0084】

〔図４〕変換されたシトシンのパーセント対最大結合ｐＨのグラフである。各ＤＮＡ鎖の変換されたシトシンのパーセント（ウラシルスルホン酸塩ヌクレオチド／全ヌクレオチド）を、最大鎖回収に必要とされる最高推定結合ｐＨに対してプロットした。これらの点の線形フィッティングを示す。

【0085】

〔図５〕同じプライマー／プローブの組み合わせを使用するＤＮＡ鎖の、変換されたシトシンのパーセント対最大結合ｐＨのグラフである。ＤＮＡのうちの３つ（ＢＭＰ３、β－アクチン（「ＢＴＡＣＴ」）、及びＮＤＲＧ４鎖）を修飾して、特定のＤＮＡの各バリアントについて同じプライマー及びプローブ結合配列を保持するが、そのＤＮＡ鎖の他の領域に異なる数の非メチル化Ｃを含有するＤＮＡのセットを作製した。この相関の強度を更に例示するために、線を配列の各セットにフィッティングさせた。

【0086】

〔図６〕非調整結合ｐＨ（Ａ）または低結合ｐＨ（Ｂ）を使用した、全ＤＮＡ後転換及びクリーンアップのグラフを示す。

【0087】

〔図７〕４つの異なるＤＮＡ配列（ＬＡＳＳ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＬＲＲＣ４、及びＺＤＨＨＣ１）についての非調整結合ｐＨ（上段）または低結合ｐＨ（下段）に対して回収されたについて便試料体積（ｍＬ）対回収された鎖のグラフである。ＺＤＨＨＣ１ＤＮＡを２回試験した。

【0088】

〔図８Ａ〕低ｐＨ及び非調整ｐＨで実施した結合反応からの、異なるロットの亜硫酸水素アンモニウムからの鎖回収を示す表を提供する。

【0089】

〔図８Ｂ〕低ｐＨ及び非調整ｐＨで実施した結合反応からの、異なる濃度の亜硫酸水素アンモニウムからの鎖回収を示す表を提供する。

【0090】

〔図９〕低ｐＨ及び非調整ｐＨで行われた結合反応に存在する汚染物質の効果を示す表を提供する。

【0091】

〔図１０〕非調整のｐＨ結合反応を使用して様々なシリカビーズを使用した、回収した鎖のログを示す表を提供する。

【0092】

〔図１１〕実施例１に記載される低ｐＨ結合反応を使用して種々のシリカビーズを使用して回収された鎖のログを示す表を提供する。

【0093】

〔図１２〕４．８５～２．１３の範囲の酸性ｐＨ（「ＢＮＤｐＨ」）に調整された結合反応を使用して回収された鎖を示す表を提供する。

【0094】

〔図１３〕非調整または低ｐＨ結合反応を使用して、異なるサイズのＤＮＡ分子、及び異なる濃度のＤＮＡ分子について回収された鎖を示す表を提供する。

【0095】

〔図１４〕プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３により提供される反応条件を比較した表を示す。

【0096】

〔図１５Ａ〕プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した、鎖回収を比較する表を示す。

【0097】

〔図１５Ｂ〕プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した、鎖回収を比較する表を示す。

【0098】

〔図１６〕プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した異なるメチル化マーカーＤＮＡについて、図１５Ａ～１５Ｂに示される鎖回収のペアワイズの対比を有する表を示す。

【0099】

〔図１７〕プロトコル２の回収対プロトコル１またはプロトコル３を使用した回収の比として示される、異なるメチル化マーカーＤＮＡについて、図１６に示される鎖回収を比較するグラフを示す。各データポイントの「プロトコルＸ」は、そのデータポイントのプロトコル１または３のいずれかを表す。

【0100】

〔図１８〕結合ステップ中に未調整のｐＨを使用する、またはグリシン、クエン酸、リンゴ酸、もしくはギ酸緩衝液を使用して、示されるスルホン化ＤＮＡのシリカビーズへの結合中にｐＨを低減する、異なるＤＮＡの回収を比較する表を示す。

【0101】

定義
本セクション及び本明細書の開示全体で使用されるセクションの見出しは、単に組織的な目的のためだけであり、限定することを意図するものではない。

【0102】

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。追加の定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。

【0103】

本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、以下の用語は、文脈により別途明確に指示されない限り、本明細書に明示的に関連する意味を持つ。「一実施形態において」という語句は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を指す場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。更に、「別の実施形態において」という語句は、本明細書で使用される場合、異なる実施形態を指す場合もあるが、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らない。したがって、以下で記載されるように、本技術の様々な実施形態は、本技術の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わされ得る。

【0104】

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含有する」、及びそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドな経過句、用語、または単語であることが意図される。更に、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、包括的「または」演算子であり、文脈により別途明確に指示されない限り、「及び／または」という用語と同等である。「に基づく」という用語は、文脈により別途明確に指示されない限り、排他的なものではなく、記載されていない追加の因子に基づくことを可能にする。

【0105】

単数形「１つの」、「及び」、及び「その」は、文脈で明確に別段指示されない限り、複数の参照を含む。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態を企図する。

【0106】

「から本質的になる」という移行句は、本出願の特許請求の範囲において使用する場合、Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ ＵＳＰＱ ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）に述べられているように、特許請求の範囲を、特許請求された発明の特定の物質またはステップ「及び基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼすことのないもの」に限定する。例えば、「本質的にからなる」組成物は、列挙された要素が、存在するものの、汚染物質が、純粋な組成物、すなわち列挙された構成要素「からなる」組成物と比較して列挙された組成物の機能を変化させないレベルで、列挙されていない汚染物質を含有し得る。

【0107】

本明細書における数値範囲の列挙のために、それらの間に同じ程度の精度で介在する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲については、数字７及び８は、６及び９に加えて企図され、６．０～７．０の範囲については、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。

【0108】

本明細書で別途定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載される分子生物学及びタンパク質ならびに核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法及びそれらの技法は、当該技術分野において周知でありかつ一般的に使用されるものである。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合、本明細書で提供される定義は、辞書または外部の定義よりも優先される。更に、文脈によって別途必要とされる場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0109】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ断片」または「低分子ＤＮＡ」または「短鎖ＤＮＡ」は、約２００塩基対またはヌクレオチド長以下からなるＤＮＡを意味する。

【0110】

本明細書で使用される場合、例えばＣｐＧ遺伝子座におけるシトシンのメチル化状態に関して使用される「メチル化」または「メチル化された」は、一般に、シトシン塩基の５位のメチル基の存在または非存在（すなわち、特定のシトシンが５－メチルシトシンであるかどうか）を指す。メチル化は、例えば、例えば、亜硫酸水素塩による処理によるウラシルへの変換に対する特定のＣ残基の感受性（またはその欠如）を決定することによって、シトシンのメチル化状態の分析のための日常的な方法によって証明されるように、直接決定され得る。例えば、非メチル化（例えば、試料中の非メチル化シトシンの大部分または全てがウラシルに変換される条件下で）された場合に、その残基を変換することが予想される方法で試料を亜硫酸水素塩で処理したときに、ウラシルに変換されない試料中のシトシン残基は、一般に「メチル化される」と見なされ得る。

【0111】

本明細書で使用される場合、「メチルシトシン」、「メチルＣ」、「メチル化シトシン」、「メチル化Ｃ」、及び「ＭｅＣ」という用語は、互換的に使用され、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５hｍＣ）の両方を包含する。

【0112】

「バイサルファイト試薬」という用語は、本明細書に開示されるように、メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを区別するのに有用な、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む試薬を指す。前記処理の方法は、当該技術分野で既知である（例えば、各々が、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５及びＷＯ２０１３／１１６３７５）。いくつかの実施形態において、バイサルファイト処理は、限定するものではないが、ｎ－アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などの変性溶媒の存在下、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、変性溶媒は、１％～３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。いくつかの実施形態において、亜硫酸水素塩反応は、限定するものではないが、クロマン誘導体、例えば、６－ヒドロキシ－２，５，７，８、－テトラメチルクロマン２－カルボン酸またはトリヒドロキシベンゾン酸等のスカベンジャー、及びそれらの誘導体、例えば、ガリン酸の存在下で行われる（参照によりその全体が組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照されたい）。ある特定の好ましい実施形態において、バイサルファイト反応は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／１１６３７５号に記載されるように、亜硫酸水素アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）とも称される亜硫酸水素アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｔｅ）による処理を含む。

【0113】

本明細書で使用される場合、「スルホン化ＤＮＡ」は、スルホン化試薬、例えば、バイサルファイト試薬での処理の結果としてスルホン化されたシトシンまたはウラシルを含むＤＮＡを指す。スルホン化ＤＮＡは、部分的にスルホン化されてもよく、これにより、ＤＮＡは、ウラシルスルホネートを形成するためにスルホン化されていない非メチル化シトシン（複数可）を含むか、またはＤＮＡは、すべての非メチル化（または他の方法で保護されていない）シトシンがウラシルスルホネートを形成するためにスルホン化されるように、完全にスルホン化されてもよい。スルホン化ＤＮＡはまた、例えば、標準的な核酸合成化学を使用して、バイサルファイト試薬で処理されたＤＮＡを模倣するようにＤＮＡ合成されてもよい。例えば、ＤＮＡ鎖をヌクレオチドモノマーから合成して、１つ以上のウラシルスルホネートヌクレオチドを含む鎖を形成してよい。

【0114】

本明細書で使用される場合、「非スルホン化ＤＮＡ」は、シトシンがウラシルスルホネートヌクレオチドに変換される条件下で、スルホン化試薬、例えば、バイサルファイト試薬で処理されていないＤＮＡを指す。非スルホン化ＤＮＡは、１つ以上の非メチル化シトシンヌクレオチドを含んでもよい。好ましい実施形態において、非スルホン化ＤＮＡは、ウラシルスルホネートヌクレオチドを含まない。

【0115】

本明細書において、ＤＮＡを固体支持体に結合させるための溶液または条件に関して使用される場合、「低ｐＨ」という用語は、ＤＮＡ、例えば、スルホン化ＤＮＡが結合される固体支持体のｐＨ（Ｉ）以下のｐＨを有する結合溶液または条件を指す。いくつかの実施形態において、低ｐＨ結合条件は、酸性成分、例えば、酸性ｐＨを有する緩衝液と組み合わせた、結合剤、例えば、塩酸グアニジン等のカオトロピック塩を含む結合溶液を使用することによってもたらされる。いくつかの実施形態において、酸性成分は、結合混合物がスルホン化ＤＮＡと組み合わされる前に結合剤と予め混合されるが、いくつかの実施形態において、酸性成分は、結合剤がスルホン化ＤＮＡと組み合わされる前または後にスルホン化ＤＮＡと組み合わされる。

【0116】

本明細書において、スルホン化ＤＮＡを固体支持体に結合させるための溶液または条件に関して使用される場合、「非調整ｐＨ」、「標準ｐＨ」、及び「高ｐＨ」という用語は、互換的に使用され、スルホン化ＤＮＡ及び結合剤、例えば、ＧｕＨＣｌのみを含む結合溶液のｐＨと比較して、結合溶液または条件のｐＨを低減させるための酸性成分を含まない結合反応溶液または条件を指す。一般に、調整されていないｐＨ結合溶液は、固体支持体、特にシリカ支持体のｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、非調整ｐＨ結合溶液は、ＤＮＡの試料、スルホン化ＤＮＡ、及び結合剤、例えば、ＧｕＨＣｌをスルホン化するために使用されるスルホン化試薬の一部または全てを含む混合物である。いくつかの実施形態において、非調整結合溶液のｐＨは、スルホン化試薬単独のｐＨまたはその付近である。

【0117】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。例えば、ヒト遺伝子または染色体またはヒト染色体に関連する配列を含有すると疑われる試料は、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、広範な中期染色体）、ゲノムＤＮＡ（溶液中にあるか、またはサザンブロット分析などのための固体支持体に結合されている）、ＲＮＡ（溶液中にあるか、またはノーザンブロット分析などための固体支持体に結合されている）、ｃＤＮＡ（溶液中にあるか、または固体支持体に結合されている）、無細胞ＤＮＡ（例えば、血漿からの循環無細胞ＤＮＡ、血漿、尿、便などの体液からの断片化ＤＮＡ）、エクソソームまたは他の微小胞から、例えば体液などから単離されたＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、試料とは、標本または培養物（例えば、微生物培養物）を含むことを意味し、他の実施形態において、試料、生物学的試料及び環境試料の両方（例えば、標的配列、遺伝子またはテンプレートを含むことが疑われる）を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、試料は、合成起源の試料を含み得る。試料は、精製されていないか、または部分的もしくは完全に精製されていても、または他の方法で処理されていてもよい。核酸を「含有する疑いがある」サンプルは、標的核酸分子を含有するか、または含有しないことある。

【0118】

本技術は、使用または分析される生体試料の種類によって制限されない。本技術は、組織（例えば、組織（例えば、心臓、肝臓、脳、肺、胃、腸、脾臓、腎臓、膵臓、及び生殖器官）、腺、皮膚、及び筋肉）、細胞（例えば、血液細胞（例えば、リンパ球または赤血球）、筋肉細胞、腫瘍細胞、及び皮膚細胞）、ガス、体液（例えば、血液またはその一部、血清、血漿、尿、精液、唾液など）、またはヒト（例えば、成人、乳児、または胚）から得られた固体（例えば、便）試料、または動物（例えば、牛、家禽、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウマなど）を含むが、これらに限定されない、様々な生物学的試料に有用である。いくつかの実施形態において、生体試料は、固形食品及び／または飼料製品及び／または成分、例えば、乳製品、野菜、肉及び肉副産物、ならびに廃棄物であり得る。生物学的試料は、家畜の様々なファミリーの全て、ならびに野生（ｆｅｒａｌ）動物または野生（ｗｉｌｄ）動物から得られてもよく、限定するものではないが、例えば、有蹄動物、クマ、魚、ウサギ目、げっ歯類、き脚類などが含まれる。

【0119】

生体試料としては、生検及び組織切片（例えば、生検もしくは腫瘍、成長、発疹、感染の切片、もしくはパラフィン包埋切片）、医療もしくは病院試料（例えば、血液試料、唾液、口腔拭い液、脳脊髄液、胸水、乳、初乳、リンパ液、痰、嘔吐物、胆汁、精液、卵母細胞、頸部細胞、羊水、尿、便、毛髪、及び汗を含むが、これらに限定されない）、実験室試料（例えば、細胞内分画）、ならびに法医学的試料（例えば、血液もしくは組織（例えば、スパッタもしくは残留物）、核酸を含む毛髪及び皮膚細胞）、ならびに考古学的試料（例えば、化石生物、組織、もしくは細胞）も含む。

【0120】

環境試料には、表面物質、土壌、水（例えば、淡水または海水）、藻類、地衣類、地質試料、核酸を含有する空気含有材料、結晶、及び産業試料、ならびに食品及び乳製品加工器具、装置、機器、器具、使い捨て及び非使い捨てアイテムから得られた試料などの環境材料が含まれるが、これらに限定されない。

【0121】

試料は、任意の所望の方法または好適な方法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、各々があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０００，１４６号、及び同第１０，０４７，３９０号に記載されている方法及びシステムを使用して、体液、便、または他の試料から直接分析される。

【0122】

しかしながら、上述の例は、本技術に適用可能な試料（例えば、標的配列、遺伝子またはテンプレート（例えば、本技術の組成物及び方法を使用してそれらの存在または非存在を決定することができる）を含むと疑われる）タイプを限定するものと解釈されるものではない。

【0123】

「標的」という用語は、核酸検出または分析方法に関連して使用される場合、例えば、標的核酸を含有することが疑われる試料中で検出または分析されるヌクレオチドの特定の配列を有する核酸を指す。いくつかの実施形態において、標的は、メチル化状態を決定することが望ましい特定の配列を有する核酸である。ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、「標的」は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーによって結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は、試料中に存在し得る他の核酸配列から選別されるように求められる。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。「試料テンプレート」という用語は、標的の存在について分析される試料に由来する核酸を指す。

【0124】

「テンプレート」という用語は、フラップ構造の核酸鎖、例えば、侵襲的切断構造に関して使用される場合、上流及び下流の核酸または核酸領域がハイブリダイズして侵襲的切断構造を形成する核酸鎖を指す。テンプレート鎖は、例えば、ＰＣＲフラップエンドヌクレアーゼアッセイにおいてポリメラーゼによるプライマーの伸長のためのテンプレートとして機能し得るが、この用語の使用は、重合アッセイまたは反応に限定されない。

【0125】

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意の核酸含有分子を指す。この用語は、限定するものではないが、４つのアセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュ－ドイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシル－メチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチル－アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュ－ドウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイリノシン、２，２－ジメチル－グアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアデニン、３－メチル－シトシン、５－メチルイソシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－ホルミルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシ－アミノ－メチル－２－チオウラシル、ベ－タ－Ｄマンノイルキュ－オシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５‘－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュ－ドウラシル、キュ－オシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュ－ドウラシル、キュ－オシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリン、を含む、任意の既知のＤＮＡ及びＲＮＡの塩基アナログを含む配列を包含する。

【0126】

核酸配列または分子は、ゲノムまたは合成由来のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表す。したがって、核酸配列は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、混合ｓｓＤＮＡ、混合ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡになったｄｓＤＮＡを（例えば、溶解、変性、ヘリカーゼなどを介して）、Ａ－、Ｂ－、またはＺ－ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、混合ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡになったｄｓＲＮＡ（例えば、融解、変性、ヘリカーゼなどを介して）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはタンパク質核酸（ＰＮＡ）であり得る。

【0127】

本技術は、利用される核酸の種類または供給源（例えば、配列または分子（例えば、標的配列及び／またはオリゴヌクレオチド））によって限定されない。例えば、核酸配列は、増幅または作製された配列（例えば、合成（例えば、重合（プライマー伸長（例えば、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドプライマー技術））及び逆転写（例えば、ＤＮＡへのＲＮＡの転写）を介した核酸配列の増幅または作製）及び／または増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、サイクリングプローブ技術、Ｑ－ベータレプリカーゼ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、分岐ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）、ハイブリッドキャプチャ、及びヘリカーゼ依存的増幅）であってもよい。

【0128】

本明細書で使用される場合、「プロセス対照」という用語は、抽出後に測定されて、プロセスの効率を評価し、成功または失敗モードを決定することができる、標的ＤＮＡの抽出前に試料に添加される外因性分子、例えば、外因性核酸を指す。使用されるプロセス対照核酸の性質は、通常、アッセイタイプ及び測定される材料に依存する。例えば、使用されるアッセイが、二本鎖ＤＮＡまたはその中の変異の検出及び／または定量化のためのものである場合、二本鎖ＤＮＡプロセス対照は、典型的には、抽出前に試料にスパイクされる。同様に、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを監視するアッセイの場合、使用されるプロセス対照は、典型的には、ＲＮＡ転写物または合成ＲＮＡのいずれかである。プロセス対照は、典型的には、プロセスの効率性の評価、及びプロセス及びプロセスステップの成功または失敗の判定を支援する。

【0129】

非標的ＤＮＡに関して本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、標的ＤＮＡを含有する供給源または試料以外の供給源から単離され、精製される非標的ＤＮＡを指す。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２１２，３９２号に記載されているように、例えば、精製された魚ＤＮＡは、ヒト標的ＤＮＡを含む試料に関して外因性ＤＮＡである。外因性ＤＮＡは、標的ＤＮＡとは異なる生物由来である必要はない。例えば、商業的に得られる精製された魚ＤＮＡは、特定の魚由来の試料中の標的核酸を検出するように構成された反応に添加される場合、外因性である。好ましい実施形態において、外因性ＤＮＡは、外因性ＤＮＡが添加される反応において標的核酸を検出及び／または定量化するように構成されたアッセイによって検出されないように選択される。

【0130】

本明細書で使用される場合、「魚ＤＮＡ」という用語は、例えば、米国特許第９，２１２，３９２号に記載されるように、魚から単離されたバルク（例えば、ゲノム）ＤＮＡを指す。バルク精製魚ＤＮＡは、市販されており、例えば、タラ及び／またはニシン精子ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはサケＤＮＡ（ＵＳＢ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の形態で提供される。「魚ＤＮＡ」は、例えば、別々に合成されているか、または魚ゲノムの他のＤＮＡから分離された、単離された形態、形態の魚由来の特定の遺伝子とは異なる。

【0131】

本明細書で使用される場合、「ゼブラフィッシュＤＮＡ」という用語は、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏから単離されるか、またはインビトロで（例えば、酵素的に、合成的に）作成され、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏからのＤＮＡに見出されるヌクレオチドの配列を有するＤＮＡを指す。好ましい実施形態において、ゼブラフィッシュＤＮＡは、検出可能な対照ＤＮＡとして添加されるメチル化ＤＮＡ、例えば、試料プロセスステップを通じたＤＮＡ回収を検証するためのプロセス対照である。特に、ヒト試料に対するプロセス対照としてのゼブラフィッシュＤＮＡの使用を説明する、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０１７７１０Ａ１に記載されるように、ＲＡＳＳＦ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡは、例えば、ヒト試料に対するプロセス対照として使用される。本明細書で使用される場合、「ＺＦＲＡＳＳＦ１」は、ゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１遺伝子の少なくとも一部を含むプロセス対照を指す。

【0132】

本明細書で使用される場合、「回収」及び「回収された」という用語は、核酸鎖に関して使用される場合、プロセス（例えば、完全なバイサルファイト変換プロセス）の後、または１つ以上のプロセスステップ（例えば、核酸のマトリックス結合、それに続く結合鎖の溶出）の後、試料中で測定されたＤＮＡ鎖の量または数を指す。いくつかの実施形態において、回収された鎖は、参照値、例えば、プロセス前の試料中に添加されるかもしくは存在すると予想される鎖の量もしくは数、または参照試料中に測定されるかもしくは存在すると予想される量と比較される。

【0133】

本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。核酸精製システム及び反応アッセイの文脈では、そのような送達システムは、ある場所から別の場所への試薬及びデバイス（例えば、適切な容器内のカオトロピック塩、粒子、緩衝剤、変性剤、オリゴヌクレオチド、フィルターなど）及び／またはサポート用具（例えば、サンプル処理またはサンプル保管容器、手順を実行するための書面による指示など）の保管、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／またはサポート用具を含有する１つ以上の囲い（例えば、箱）を含む。本明細書で使用される場合、「分けられたキット」という用語は、各々が全キット構成要素の一部を含有する２つ以上の別々の容器を備える送達システムを指す。本容器は、一緒にまたは別々に目的のレシピエントに送達され得る。例えば、第１の容器は、試料収集のための材料及び緩衝剤を含み得、第２の容器は、捕捉オリゴヌクレオチド及び変性剤を含み得る。「分けられたキット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法の第５２０条（ｅ）の下で規制される分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含することを意図するが、これに限定されない。実際に、各々がキット全体の構成要素の一部分を含有する２つ以上の別個の容器を備える任意の送達システムは、「分けられたキット」という用語に含まれる。対照的に、「組み合わされたキット」は、単一の容器（例えば、所望の構成要素のそれぞれを収容する単一の箱）中に反応アッセイの構成要素のすべてを含有する送達システムを指す。「キット」という用語は、断片化されたキット及び組み合わされたキットの両方を含む。

【0134】

本明細書で使用される場合、用語「システム」は、特定の目的のために使用される物品の集合体を指す。いくつかの実施形態において、物品は、例えば物品上、紙上、オンライン（例えば、ウェブサイトまたはウェブアドレスにおいて）、または記録可能な媒体（例えば、ディスケット、ＣＤ、ＤＶＤ、フラッシュドライブなど）に提供される情報として、使用説明書を含む。いくつかの実施形態において、説明書は、オンラインのロケーション、例えば、説明を閲覧、聴取、及び／またはダウンロードするためのウェブサイトにユーザを導く。いくつかの実施形態において、命令または他の情報は、例えば、コンピュータのため、またはスマートフォンなどのモバイルデバイスのためのアプリケーション（「アプリ」）として提供される。

【0135】

本明細書で使用される場合、「情報」という用語は、事実またはデータの任意の集合体を指す。限定されないが、インターネットを含むコンピュータシステム（複数可）を使用して記憶または処理される情報に関して、この用語は、任意のフォーマット（例えば、アナログ、デジタル、光学など）で記憶される任意のデータを指す。本明細書で使用される場合、「対象に関する情報」という用語は、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、核酸配列、遺伝子、対立遺伝子頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型に相関する表現型などを含むが、これらに限定されない、ゲノムに関する情報を指す。「対立遺伝子頻度情報」は、対立遺伝子の同一性、対立遺伝子の存在と対象（例えば、ヒト対象）の特徴との間の統計的相関、個体または集団における対立遺伝子の存在または非存在、１つ以上の特定の特徴を有する個体に存在する対立遺伝子の可能性のパーセンテージなどを含むが、これらに限定されない、対立遺伝子頻度に関する事実またはデータを指す。

【0136】

〔発明を実施するための形態〕
好ましい方法及び材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び材料が本開示の実施または試験に使用され得る。本明細書において言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することは意図されない。

【0137】

本明細書で提供される技術は、スルホン化試薬で処理されたＤＮＡの修飾後回収を改善するための方法に関する。特に、本技術は、スルホン化ＤＮＡを荷電表面、例えば、シリカ表面または支持体、例えば、アッセイウェルまたはスライドの表面、繊維、粒子、ビーズなどに結合させる方法を提供する。本技術は、特定の材料及び形態の支持体、例えば、ビーズの形態のシリカに関して考察されるが、本技術は、他の支持材料、及び繊維、粒子、チューブなどを含む任意の形態または構成の支持体に適用可能であることが理解されるであろう。

【0138】

本方法は、スルホン化ＤＮＡのビーズへの高度に安定した結合を促進する条件を提供する。これは、当業者であれば、ＤＮＡとビーズとの相互作用を破壊することが予想される、脱スルホン化の非常に塩基性な反応条件にもかかわらず、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡの効率的な回収を促進する。本明細書で提供される革新的なステップの組み合わせによって、本技術は、投入されたＤＮＡの回収率を改善した、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを調製するための方法を提供する。

【0139】

この技術は、以下に説明する実験結果に関連し、実験例で展開されている。これらの例は、核酸のメチル化状態の分析に使用される試薬の開発及び試験を説明する。特に、本技術は、結合緩衝液のｐＨが、シリカ及びウラシルスルホネートが豊富なＤＮＡの両方の等電点ｐＨ（Ｉ）未満となるような酸性ｐＨを有する結合溶液に関するものであり、それによって、スルホン化ＤＮＡのシリカへの結合を促進する。

【0140】

一般的なスルホン化試薬には、亜硫酸水素ナトリウム及び亜硫酸水素アンモニウムが含まれる。以下の例では、亜硫酸水素アンモニウムが使用されるが、この技術の原理は、分子全体に電荷、例えば、非常に負の電荷を生成する方法で処理された任意のＤＮＡに容易に適用可能である。例えば、他のスルホン化試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム）で処理されたＤＮＡは、本技術で使用できることがわかる。

【0141】

スルホン化反応のｐＨは、酸の添加なしで、典型的にはシリカのｐＨ（Ｉ）を超えるｐＨ（図２に概略的に示されるように）を有し、かつスルホン化ＤＮＡのｐＨ（Ｉ）以上のｐＨを有する亜硫酸水素アンモニウムによって主に決定される。しかしながら、結合反応のｐＨがシリカ（または他の支持材料）及び／またはＤＮＡのｐＨ（Ｉ）を上回る場合、静電反発は、ＤＮＡのシリカへの完全な結合を妨げ得る。本技術は、特定の作用機序に限定されないが、例えば、スルホン化ＤＮＡ－シリカビーズ混合物に酸を添加することによって酸性ｐＨで結合反応を行うことは、シリカを中和し、ＤＮＡのウラシルスルホン酸基をプロトン化し、それによって静電反発を低減し、シリカ－スルホン化ＤＮＡ相互作用を促進し得ることが観察される。

【0142】

本技術との使用に好適なＤＮＡは、特定の方法によって単離されたＤＮＡに限定されず、好適なＤＮＡは、市販のキット、カラムなどの使用を含む、いくつかの方法で調製され得る。試料から、例えば対象からのＤＮＡを単離する例示的な方法が以下に記載される。

【0143】

便ＤＮＡ単離
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、便試料から単離されてもよい。本発明の技術と共に使用するのに好適な便からＤＮＡを単離する例示的な実施形態は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０００，１４６号に見出される。簡潔に述べると、便試料を緩衝剤と共にホモジナイズし、固体を、例えば遠心分離によって除去し、標的ＤＮＡ（複数可）に相補的なオリゴヌクレオチドを含む粒子またはビーズを使用して、得られた清明化された上清から特異的標的ＤＮＡを捕捉する。捕捉オリゴヌクレオチドに結合した標的ＤＮＡを、例えば、磁場を使用して磁気ビーズを収集することによって、溶液から分離し、捕捉したＤＮＡを、任意選択で、例えば、変性条件を使用して、捕捉オリゴヌクレオチドから溶出する前に緩衝液で洗浄する。

【0144】

細胞株及び細胞培地ＤＮＡ
細胞株について、無細胞ゲノムＤＮＡは、例えば、「Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ ｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）」を使用して、細胞馴化培地から単離され得る。キットのプロトコルに従って、血漿の代わりに１ｍＬの細胞馴化培地（ＣＣＭ）を使用し、キットの手順に従って処理される。溶出体積は１００μＬであり、そのうち、７０μＬは、一般に、バイサルファイト変換に使用される。

【0145】

血液または血漿ＤＮＡ
４ｍＬの血漿試料から、例えばヒト血液試料からのＤＮＡを単離するための例示的な手順は以下のとおりである：
・４ｍＬの血漿試料に、３００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合する。

【0146】

・血漿－プロテイナーゼＫ混合物に、３μＬの１μｇ／１μＬの魚ＤＮＡを添加する。

【0147】

・２ｍＬの血漿溶解緩衝液を血漿に添加する。

【0148】

血漿溶解緩衝液とは、以下のものである。

【0149】

－４．３Ｍのグアニジンチオシアネート
－１０％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、分枝）
（４５ｍＬの４．８Ｍグアニジンチオシアネートと組み合わせた５．３ｇのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）
・混合物を５５℃で１時間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。

【0150】

・追加して混合：
ｏ３ｍＬの血漿溶解緩衝液
ｏ２００μＬ磁気シリカ結合ビーズ（１６μｇ／μＬのビーズ）
ｏ２ｍＬの１００％イソプロパノールを添加する
（任意選択で、各添加後に混合し、及び／または任意選択で、溶解緩衝液及びイソプロパノールを予め混合してから混合物に添加する）
・３０℃で３０分間、５００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。

【0151】

・磁石上にチューブを置き、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。

【0152】

・結合ビーズを含む容器に７５０μＬのＧｕＨＣｌ－ＥｔＯＨを添加し、混合する。

【0153】

ＧｕＨＣｌ－ＥｔＯＨ洗浄緩衝液は以下である：
－３Ｍ ＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）
－５７％ ＥｔＯＨ（エチルアルコール）
・４００ｒｐｍで１分間振盪する。

【0154】

・サンプルをディープウェルプレートまたは２ｍＬのマイクロ遠心チューブに移す。

【0155】

・磁石上にチューブを置き、１０分間ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。

【0156】

・ビーズに、１０００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、８０％のＥｔＯＨ）を添加し、振盪しながら、３０℃で３分間インキュベートする。

【0157】

・磁石上にチューブを置き、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。

【0158】

・５００μＬの洗浄緩衝液をビーズに添加し、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。

【0159】

・磁石上にチューブを置き、ビーズを収集させる。上清を吸引して廃棄する。

【0160】

・２５０μＬの洗浄緩衝液を添加し、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。

【0161】

・磁石上にチューブを置き、ビーズを収集させる。残りの緩衝液を吸引して廃棄する。

【0162】

・２５０μＬの洗浄緩衝液を添加し、振盪しながら３０℃で３分間インキュベートする。

【0163】

・磁石上にチューブを置き、ビーズを収集させる。残りの緩衝液を吸引して廃棄する。

【0164】

・ビーズを、振盪しながら７０℃で１５分間乾燥させる。

【0165】

・１２５μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）をビーズに添加し、振盪しながら６５℃で２５分間インキュベートする。

【0166】

・磁石上にチューブを置き、１０分間ビーズを収集させる。

【0167】

・ＤＮＡを含有する上清を吸引し、新しい容器またはチューブに移す。

【0168】

ＤＮＡスルホン化及び精製
典型的なバイサルファイト処理方法では、バイサルファイト処理ステップにおいて、非メチル化シトシン塩基は脱アミノ及びスルホン化を受け、負に帯電したウラシルスルホン酸塩となる（図１）。変換試薬を除去するために、スルホン化ＤＮＡ試料は、アルコール沈殿または例えばゲル濾過によって単離され得る。スルホン化ＤＮＡはまた、カオトロピック塩、例えば、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）またはグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）などのグアニジン塩を、例えば、約６～７Ｍの濃度で添加することによって、シリカなどの支持体、例えば、反応容器のシリカコーティング表面、シリカ粒子または繊維、常磁性シリカビーズなどに結合してもよい。変性ＤＮＡの固体マトリックスへの結合を促進するための他のカオトロピック結合剤としては、ヨウ化物、過塩素酸塩、及びトリクロロ酢酸塩が挙げられる。

【0169】

（本技術の低ｐＨ結合ステップを伴わない）ＤＮＡのバイサルファイト処理の典型的な方法は以下のとおりである：
Ｉ．亜硫酸水素アンモニウムを用いたＤＮＡのスルホン化
１．各チューブに、６４μＬのＤＮＡ、７μＬの１ＮのＮａＯＨ、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．２５ｍｇ／ｍＬの魚ＤＮＡを含有する９μＬの担体溶液を組み合わせる。

【0170】

２．４２℃で２０分間インキュベートする。

【0171】

３．４５％の亜硫酸水素アンモニウムを１２０μＬ添加し、６６℃で７５分間インキュベートする。

【0172】

４．４℃で１０分間インキュベートする。
ＩＩ．磁気ビーズを使用した脱スルホン化
材料
・磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＭａｇｎｅＳｉｌ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＡＳ１０５０、１６μｇ／μＬ）。

【0173】

・結合緩衝液：６．５～７Ｍの塩酸グアニジン。

【0174】

・変換後洗浄緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣl（ｐＨ８．０）を有する８０％エタノール。

【0175】

・脱スルホン化緩衝液：７０％のイソプロピルアルコール、０．１ＮのＮａＯＨを脱スルホン化緩衝液のために選択した。

【0176】

試料は、任意の適切なデバイスまたは技術を使用して混合され、基本的に以下に記載されるような温度及び混合速度で試料を混合またはインキュベートする。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を、試料の混合またはインキュベーションに使用することができる。例示的な脱スルホン化は以下のとおりである。
１．ビーズストックをボルテックスボトルで１分間完全に混合する。
２．５０μＬのビーズを、２．０ｍＬのチューブ（例えば、ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）に分取する。
３．結合緩衝液７５０μＬをビーズに添加する。
４．ステップＩから１５０μＬのスルホン化ＤＮＡを添加する。
５．混合する（例えば、３０℃で３０分間、１０００ＲＰＭ）。
６．磁石スタンドにチューブを置き、５分間放置する。チューブをスタンド上に置いた状態で、上清を取り除いて廃棄する。
７．１，０００ｕＬの洗浄緩衝液を添加する。混合する（例えば、３０℃で３分間、１０００ＲＰＭ）。
８．磁石スタンドにチューブを置き、５分間放置する。チューブをスタンド上に置いた状態で、上清を取り除いて廃棄する。
９．２５０ｕＬの洗浄緩衝液を添加する。混合する（例えば、３０℃で３分間、１０００ＲＰＭ）。
１０．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り除き、廃棄する。
１１．２００μＬの脱スルホン化緩衝液を添加する。混合する（例えば、３０℃で５分間、１０００ＲＰＭ）。
１２．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り除き、廃棄する。
１３．２５０ｕＬの洗浄緩衝液を添加する。混合する（例えば、３０℃で３分間、１０００ＲＰＭ）。
１４．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り除き、廃棄する。
１５．チューブに２５０ｕＬの洗浄緩衝液を添加する。混合する（例えば、３０℃で３分間、１０００ＲＰＭ）。
１６．チューブを磁気ラックに置き、１分後に上清を取り除き、廃棄する。
１７．すべてのチューブを、蓋を開けた状態で、３０℃で１５分間インキュベートする。
１８．磁気ラックからチューブを取り外し、７０μＬの溶出緩衝液を直接ビーズに添加する。
１９．ビーズを溶出緩衝液（例えば、４０℃で４５分間、１０００ＲＰＭ）でインキュベートする。
２０．チューブを磁気ラックに約１分間置き、上清を取り出して保存する。

【0177】

次いで、以下に記載されるように、変換されたＤＮＡを、検出アッセイ、例えば、事前増幅及び／またはフラップエンドヌクレアーゼアッセイで使用する。

【0178】

磁気シリカビーズ
本明細書で提供される技術は、ＤＮＡメチル化の定量的測定のためのバイサルファイト処理及びＤＮＡの単離に関する。いくつかの実施形態において、磁気ビーズは、ＤＮＡ、例えば、磁性コア及びシリカコーティングを含むビーズの処理及び単離のために使用される。シリカコーティングはＤＮＡに結合し、磁性コアは、磁石を使用してビーズ（及び結合したＤＮＡ）を濃縮及び単離するための効率的な方法を提供する。いくつかの実施形態において、シリカコーティングされた磁気ビーズは、ＭａｇｎｅＳｉｌ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；カタログ番号ＡＳ１２２０またはＡＳ６４０Ａ，Ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）である。

【0179】

本技術は、特定の種類の磁気ビーズに限定されない。本明細書に記載の技術の実施形態は、核酸に対する親和性を有する任意の磁気ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）を使用する。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、磁鉄鉱（例えば、Ｆｅ_３Ｏ_４）コアと、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）を含むコーティングとを有する。核酸がビーズに結合される溶液のビーズ構造（例えば、サイズ、多孔度、形状）及び組成は、異なるタイプ（例えば、一本鎖、二本鎖、または他の形態もしくは立体配座におけるＤＮＡまたはＲＮＡ、天然源に由来する核酸、化学的に合成され、酵素的に合成され（例えば、ＰＣＲによって））及び核酸のサイズ（例えば、例えば、２００以下の塩基からなる、小さなオリゴマー、プライマー、ゲノム、プラスミド、断片）を選択的に結合するように変化させることができる。ビーズのこれらの特徴は、核酸のビーズへの結合及び溶出に影響する。関連技術は、例えば、米国特許第６，１９４，５６２号、同第６，２７０，９７０号、同第６，２８４，４７０号、同第６，３６８，８００号、同第６，３７６，１９４号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、オルガノシラン（ＵＳＰａｔ．Ｎｏ．４，５５４，０８８に記載のように）、カルボキシル化ポリアクリレート（ＵＳＰａｔ．Ｎｏ．５，６４８，１２４に記載のように）、セルロース（米国特許出願第１０／９５５，９７４号に記載のように）、ヒドロキシシラン（米国特許出願第１１／４５９，５４１号に記載のように）、及び疎水性脂肪族リガンド（米国特許出願第１２／２２１，７５０号に記載のように）、でコートされた磁気ビーズも企図される。

【0180】

この技術は、特定のサイズの磁気ビーズに限定されない。したがって、本技術の実施形態は、いくつかの異なるサイズの磁気ビーズを使用する。より小さいビーズは、吸着のために（重量単位で）より多くの表面積を提供するが、より小さいビーズは、より大きなビーズと比較して、ビーズコアに組み込むことができる磁性材料の量が制限される。いくつかの実施形態において、粒子は、ビーズが使用される技術に適した定義された平均または中央値のサイズを有するサイズの範囲にわたって分布する。いくつかの実施形態において、粒子は、比較的狭い単峰粒径分布である。

【0181】

いくつかの実施形態において、本技術で使用するビーズは、粒子の外側からアクセス可能な細孔を有する。かかる細孔は、粒子の内部に核酸、例えばＤＮＡ断片を受け入れ、細孔の内面に結合するのに十分に大きい制御されたサイズ範囲を有する。細孔は、核酸を結合することができる大きな表面積を提供するように設計されている。更に、一態様において、本技術は、特定の核酸（例えば、ＤＮＡ）結合及び／または単離の方法に限定されない。したがって、いくつかの実施形態において、バイサルファイト反応に関連する技術の態様は、他の好適なＤＮＡ単離の方法（例えば、沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、スピンカラム）など）と組み合わせられる。

【0182】

ビーズ（及び結合材料）は、磁場を使用して混合物から除去される。いくつかの実施形態において、磁場に加えて他の形態の外力が、本技術による生物学的標的物質を単離するために使用される。例えば、好適な追加の形態の外力には、重力濾過、真空濾過、及び遠心分離が含まれるが、これらに限定されない。

【0183】

本技術の実施形態は、外部磁場を印加して、複合体を媒体から除去する。そのような磁場は、いくつかの異なる既知の手段のうちのいずれか１つを使用して媒体内で適切に生成することができる。例えば、ビーズを含有する溶液の容器の外面上に磁石を配置することができ、粒子が溶液中を移動し、磁石に隣接する容器の内面上に集まるようにする。次いで、溶液が容器からデカントされ、廃棄される間、粒子が磁石によって生成された磁場によって容器内に保持されるように、磁石を容器の外面上の位置に保持することができる。次に、第２の溶液を容器に添加し、粒子が第２の溶液に移動するように磁石を除去することができる。あるいは、磁化可能なプローブを溶液中に挿入し、プローブを磁化させることで、粒子が溶液中に浸漬したプローブの端部に堆積することができる。次いで、プローブを、磁化されたまま、第２の溶液に浸漬したまま、溶液から取り除くことができ、磁場は、粒子が第２の溶液に入ることを可能にすることを停止した。上記で一般的に説明された磁気除去及び移動技術の両方で使用されるように設計された磁石には、商業的な供給源が存在する。例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｇｎｅｔｉｇｈｔ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、またはＤｙｎａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から入手可能な、ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＳｔａｎｄまたはＰｏｌｙ Ａ Ｔｒａｃｔ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ＴＭ Ｍｕｌｔｉ－Ｍａｇｎｅｔを参照されたい。いくつかの実施形態は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に取り込まれる、米国特許出願第１３／０８９１１６号による磁気デバイスの使用を含む。更に、いくつかの実施形態は、（例えば、米国特許第５，６４７，９９４号及び第５，７０２，９５０号に記載されるように）「ジェットチャネル」またはピペット端部磁石分離の使用を企図する。いくつかの実施形態は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒシステムによって例示されるように、浸漬プローブアプローチ（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，４４７，７２９及び６，４４８，０９２に記載されるように）の使用を企図する。

【0184】

ＤＮＡ鎖の定量
本明細書に記載の例では、鎖回収を、フラップエンドヌクレアーゼアッセイを使用して測定した。例えば、血液から試料核酸を抽出するための、ならびにバイサルファイト変換されたＤＮＡ及び未変換ＤＮＡの鎖を定量するための例示的な方法は、例えば、米国特許第１０，６４８，０２５号に記載されており、これは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0185】

ＱｕＡＲＴＳアッセイ
本技術に従って生成されたＤＮＡ鎖を定量する例示的な方法は、ＱｕＡＲＴＳフラップアッセイ技術である。ＱｕＡＲＴＳ技術は、ポリメラーゼベースの標的ＤＮＡ増幅プロセスと侵襲的な切断ベースのシグナル増幅プロセスを組み合わせる。この技術は、例えば、米国特許出願第８，３６１，７２０、同８，７１５，９３７号、同８，９１６号，３４４号、同９，２１２，３９２号、及び米国特許出願第１５／８４１，００６号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＱｕＡＲＴＳ反応によって生成された蛍光シグナルは、リアルタイムＰＣＲと同様の方法で監視され、試料中の標的核酸の量の定量化を可能にする。

【0186】

例示的なＱｕＡＲＴＳ反応は、典型的には、約４００～６００ｎｍｏｌ／Ｌ（例えば、５００ｎｍｏｌ／Ｌ）の各プライマー及び検出プローブ、約１００ｎｍｏｌ／Ｌの侵襲的オリゴヌクレオチド、約６００～７００ｎｍｏｌ／Ｌの各ＦＲＥＴカセット（例えば、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．によって市販されているＦＡＭ、例えば、ＢｉｏＳｅｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているＨＥＸ、及び例えば、ＢｉｏＳｅｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているＱｕａｓａｒ ６７０）、６．６７５ｎｇ／μＬのＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）２．０、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）、３０μＬの反応体積中の１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの３－（ｎ－モルホルフィノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、７．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ_２、及び２５０μｍｏｌ／Ｌの各ｄＴＰＮを含む。例示的なＱｕＡＲＴＳサイクリング条件は、以下の表に示される通りである。いくつかの用途では、定量化サイクル（Ｃ_ｑ）の分析は、試料中の標的ＤＮＡ鎖の最初の数（例えば、コピー数）の尺度を提供する。

【0187】

【表1】

【0188】

大量のバイサルファイト変換ＤＮＡの多重標的化事前増幅
投入された試料からバイサルファイト処理されたＤＮＡの大部分または全てを事前増幅するために、大量の処理されたＤＮＡが、単一の、大量の多重増幅反応で使用され得る。例えば、ＤＮＡは、細胞株（例えば、ＤＦＣＩ０３２細胞株（腺癌）、Ｈ１７５５細胞株（神経内分泌））から、例えば、上記のように、Ｍａｘｗｅｌｌ Ｐｒｏｍｅｇａ血液キット＃ＡＳ１４００を使用して抽出される。ＤＮＡは、例えば上記のように、バイサルファイト変換される。

【0189】

事前増幅は、例えば、７．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、０．３ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．８ｍＭのＫＣｌ、０．１μｇ／μＬのＢＳＡ、０．０００１％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０００１％のＩＧＥＰＡＬＣＡ－６３０、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、１２標的について、等モル量（例えば、各プライマーの２００～５００ｎＭの範囲を含むが、これらに限定されない）、または異なる標的領域の増幅効率を均衡させるように調整された個々のプライマー濃度の、１２プライマー対／２４プライマー）、０．０２５単位／μＬのＨｏｔＳｔａｒｔ ＧｏＴａｑ濃度、及び２０～５０体積％のバイサルファイト処理された標的ＤＮＡ（例えば、１０μＬの標的ＤＮＡを５０μＬの反応混合物中に、または５０μＬの標的ＤＮＡを１２５μＬの反応混合物中に）を含有する反応混合物中で行われる。熱サイクル時間及び温度は、反応物及び増幅容器の体積に適切であるように選択される。例えば、反応は以下のようにサイクルされ得る。

【0190】

【表2】

【0191】

熱サイクル後、増幅反応前のアリコート（例えば、１０μＬ）を、魚ＤＮＡの有無にかかわらず、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ中で５００μＬに希釈する。希釈された増幅前ＤＮＡ（例えば、１０μＬ）のアリコートが、例えば、上述のように、ＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップアッセイで使用される。各々があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，０９７号、２０１６年１０月２６日に出願された米国特許出願第１５／３３５，０９６号、２０１６年１０月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／５８８７５号、及び米国特許第ＵＳ１０，６４８，０２５号も参照されたい。

【0192】

本技術は、フラップエンドヌクレアーゼアッセイの使用に限定されず、異なる実施形態において、バイサルファイト変換されたＤＮＡを分析する任意の方法が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、分析は、直接配列決定、パイロシーケンシング、メチル化感受性一本鎖立体構造分析（ＭＳ－ＳＳＣＡ）、高分解能溶解分析、メチル化感受性一本ヌクレオチドプライマー伸長（ＭＳ－ＳｎｕＰＥ）、塩基特異的切断／質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによる）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、マイクロアレイ分析、制限消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ）分析）、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ、ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、またはメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）を含む。これら及び他の方法は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる、例えば、Ｆｒａｇａ ＭＦ ＆ Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍ（２００２），“ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３（３）：６３２，６３４，６３６－４９、Ｅｌ－ＭａａｒｒｉＯ（２００３），“Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５４４：１９７－２０４、Ｌａｉｒｄ ＰＷ（２００３），“Ｔｈｅ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ３（４）：２５３－６６、Ｃａｌｌｉｎａｎ ＰＡ ＆ Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＡＰ（２００６），“Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ”，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５（９０００１）：Ｒ９５－１０１を参照されたい。

【0193】

実験
実施例１
バイサルファイト変換されたＤＮＡの回収に対する結合ｐＨの効果
以下に記載される実施例では、一本鎖ＤＮＡテンプレートを、上記の例示的なスルホン化ステップに記載されるように、亜硫酸水素アンモニウム（ＡＢＳ）でスルホン化した。ＤＮＡのスルホン化後、サイズ排除濾過によってスルホン化反応溶液を除去し、スルホン化ＤＮＡを、低（１９ｍＭ Ｋ＋）、中（２２８ｍＭ Ｋ＋）及び高（４７４ｍＭ Ｋ＋）濃度で酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）と組み合わせた。対照として、スルホン化ＤＮＡテンプレートの一部を、酢酸カリウムの代わりに亜硫酸水素塩溶液に戻した。

【0194】

その後、各試料をカオトロープ及びシリカビーズと共にインキュベートし、結合を促進した。以下の表１は、亜硫酸水素塩溶液が、各テンプレートの高い塩濃度に起因して結合反応を阻害したことを例証する。結合ｐＨは４．８～４．９であった。

【0195】

【表3】

【0196】

様々なシトシン含有量の６つのＤＮＡテンプレート（マーカー）（以下の表２を参照）をバイサルファイト処理し、次いで、５．０～３．４の範囲のｐＨを有する結合溶液を使用してシリカに結合させた。

【0197】

【表4】

【0198】

結果を図３に示す。最大対数鎖回収に必要なｐＨは、各マーカーによって変化し、配列の変換されたシトシンのパーセント（すなわち、処理前の非メチル化シトシンヌクレオチドであり、結合ステップにおけるウラシルスルホネートヌクレオチドである鎖内の全ヌクレオチドのパーセント）と相関するように思われる。非メチル化シトシンの含有量が高く、したがって結合ステップでウラシルスルホネートに変換された塩基の含有量が高いＤＮＡは、最大鎖回収のためにより低いｐＨを必要とした。

【0199】

合計１７個の異なるＤＮＡ配列を、上記と同じ様式で試験した。各ＤＮＡの変換されたシトシンのパーセントを、最大鎖回収に必要とされる最高推定結合ｐＨに対してプロットした。これらの点の線形フィッティング（図４）は、０．７６のＲ^２を有し、変換されたシトシンのパーセントと結合ｐＨとの間の関係が強いことを示唆した。

【0200】

変換されたシトシンパーセントと結合ｐＨとの間の相関の強度を更に例示するために、図３のＤＮＡ鎖のうちの３つ（ＢＭＰ３、β－アクチン（バイサルファイト処理アクチン、または「ＢＴＡＣＴ」）、及びＮＤＲＧ４）を修飾して、各試験配列について同じプライマー及びプローブ結合配列を保持するが、その配列の他の領域において異なる数の非メチル化Ｃを有するＤＮＡのセットを生成した。各セットの配列について、捕捉した鎖の測定値に直線をフィッティングさせた（図５）。４つ全てのフィッティング（図４及び５）の傾き及び切片は、類似していた。

【0201】

ＤＮＡ試料の種類の比較
低ｐＨ（クエン酸緩衝液）及び非調整ｐＨ（標準条件）で行われた結合反応からの鎖回収を、複数の試料タイプ：合成ＤＮＡの一本鎖１２６量体鎖（「１２６」）、精製された細胞株ＤＮＡ（「ＥＣＬＤ」）をスパイクした便試料から単離したＤＮＡ、及びメチル化ＤＮＡ（「ＨＭＳ」）に高いシグナルを与えると以前に特徴付けられた便試料から単離したＤＮＡについて比較し、試料タイプ及び結合条件の各組み合わせについて６回の複製を以下の表３に示し、鎖回収結果を示した。便試料からの全てのＤＮＡを、上記の捕捉プロセスで単離し、合成１２６量体ＤＮＡ鎖を、キャリアとして外来性魚ＤＮＡと組み合わせた。

【0202】

【表5】

【0203】

【表6】

【0204】

表３の結果は、低ｐＨ結合反応の使用が、これらの試料タイプの各々について類似または増強された鎖回収を生成したことを示す。

【0205】

低（１×）または高（１０×）ヌクレオソームマトリックスを含む代理血液試料を調製した。ヌクレオソームＤＮＡを、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、カタログ番号５３５０４）を使用して、ＨＣＴ１１６細胞から調製した。メチル化ＤＮＡマーカー（ＭＤＭ）陽性血漿試料を模倣するために、ヌクレオソームＤＮＡを、ＬＢｇａｒｄ（登録商標）血液チューブ（Ｅｘａcｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して健康なドナーから採取したプールされた血漿中にスパイクした、またはＳＥＲＡＣＯＮ陰性希釈液中にスパイクした。ヌクレオソームマトリックス調製物の使用は、ＭＤＭ陽性ＤＮＡが、がん陽性患者からの試料において予想されるものと同様のサイズ分布を有することを保証する。

【0206】

試料を、上記の血漿抽出手順を使用して、またはＱＩＡＳＹＭＰＨＯＮＹ ＤＳＰ循環ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＤＮＡを抽出するように処理した。次いで、抽出されたＤＮＡ試料をバイサルファイト処理し、上記の標準（非調整ｐＨ）結合反応液（ＡＢＳ反応に添加される７ＭのＧｕＨＣｌ結合緩衝液）、及び低ｐＨ結合反応液（１３３ｍＭのクエン酸塩緩衝液を有する７ＭのＧｕＨＣｌ、ｐＨ２．２結合緩衝液）中で結合させた。

【0207】

１４個のＤＮＡの比較は、ｔ検定と比較した場合、１５／３４条件についての鎖回収の増加を示した（下記の表４、５、６、及び７）。全体的に、低い結合ｐＨは、様々な試料タイプについて鎖回収を増加させた。

【0208】

【表7】

【0209】

【表8】

【0210】

【表9】

【0211】

【表10】

【0212】

便試料からの清明化された上清から単離されたＤＮＡ
４～１４ｍＬｓ（標準）の範囲の試料投入体積を有する細胞株ＤＮＡスパイクされた便試料を処理して細胞株ＤＮＡを捕捉し、次いで、バイサルファイト処理し、標準ｐＨ（図６Ａ）及び低結合ｐＨ結合（図６Ｂ）溶液を使用して単離した。図６Ａ及び６Ｂの比較は、低い結合ｐＨでの全ＤＮＡ及び鎖回収の改善された直線性を示す。非調整（標準）及び低結合ｐＨのために使用される試料は、異なる量のスパイクされたＤＮＡテンプレートを有し、したがって、示される全鎖回収は、結合条件にわたって直接比較されるべきではない。

【0213】

非調整または低ｐＨ結合条件を使用して、便試料の各体積（ｍＬ）から回収したＤＮＡの量を、図７の８つのパネルに示す。

【0214】

異なるロットの亜硫酸水素アンモニウムの効果
４つの亜硫酸水素アンモニウム（５６％）ロットを、非調整及び低結合ｐＨ条件で対照させて試験した。ＡＢＳロットは経年によって異なり、最も古いものは９年で、ｐＨが最も低く、亜硫酸水素アンモニウムは年間２パーセントも分解する可能性がある。鎖回収は、ｐＨ調整なしで、最も古い材料が最も高い回収率を有し、ロットにわたって変化した（図８Ａ）。低い結合ｐＨでは、回収アラインメントが改善された。

【0215】

亜硫酸水素アンモニウム濃度の影響
亜硫酸水素アンモニウムを５７～４３％の濃度で滴定した後、低結合ｐＨ（クエン酸緩衝液）で結合した合成ＤＮＡテンプレートで、またはｐＨ調整なしで試験した。５６．６％を基準値として、示されたマーカーＤＮＡの各々について、より低いＡＢＳ濃度に対する結合の％差を計算した。結果を、図８Ｂの表に示す。ＡＢＳ濃度にわたる鎖回復アラインメントは、低い結合ｐＨで改善された。

【0216】

製造中に導入された未知の結合溶液（７Ｍグアニジン－ＨＣｌ）の汚染物質は、選択マーカーの回収を抑制することが見出された。低結合ｐＨ及び非調整鎖回収を、汚染物質を有するものと有しないものと比較した場合、低結合ｐＨ条件は、非調整結合条件と比較して回収の低下を減少させた。（図９）。

【0217】

異なる製造者のビーズを使用した回収
複数のベンダーからのシリカビーズを、結合時に非調整ｐＨで、または低い結合ｐＨでバイサルファイト変換に使用するために試験し、結果はそれぞれ、図１０及び１１に示される。いくつかのビーズは、非調整結合ｐＨでは鎖回復を示さなかったが（図１０）、結合ｐＨが低下して回復が改善されたことを示した（図１１）。ビーズ濃度は、図１０の最初のスクリーニングに対して等しくなるように調整しなかったが、図１１に示される試験についてアラインさせた。

【0218】

ｐＨ範囲にわたるＤＮＡ回収
酸性条件は、ＤＮＡテンプレートの酸加水分解による鎖回復の損失を引き起こす可能性がある。４．９～２．１の範囲で結合ｐＨを調べた場合、鎖回収は、約ｐＨ３．９～約２．５で最も一貫していた（図１２参照）。

【0219】

ＤＮＡサイズ及び濃度の影響
ＤＮＡサイズ及び濃度は、組織、血液、及び便などの試料タイプにわたって、及び試料タイプ内で変化し得る。この実験では、仔牛の胸腺ＤＮＡを２００ｂｐ、３．６反応、及び２０ｋｂｐのサイズで３００、２７００、及び５４００ｎｇ／ランに滴定した。ＤＮＡ試料を１２６ｂｐの合成標的分子でスパイクし、スルホン化ＤＮＡの捕捉のために非調整結合ｐＨ及び低結合ｐＨを用いて亜硫酸水素塩で処理した。結果を、図１３に示す。

【0220】

ＤＮＡサイズが減少し、濃度が増加するにつれて、鎖回収は、非調整結合ｐＨ化学にて有意に減少した。低結合ｐＨ化学を有する鎖回収は、非調整結合ｐＨよりも大幅（最大３７４％）に改善された。加えて、変動係数（ＣＶ）は、低結合ｐＨ化学で改善された。

【0221】

実施例２
３つの結合プロトコルの比較
以下の実施例では、スルホン化ＤＮＡをシリカに結合するための３つの異なる手順を比較する。

【0222】

プロトコル１は、スルホン化反応を７Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の結合溶液と組み合わせた標準プロトコルであるが、ｐＨを低下させるための酸は添加されない。

【0223】

プロトコル２では、スルホン化反応混合物を、７ＭのＧｕＨＣｌ、１３３ｍＭクエン酸塩、ｐＨ２．２の結合溶液と組み合わせる。

【0224】

プロトコル３では、スルホン化反応混合物を、７ＭのＧｕＨＣｌの結合溶液と組み合わせるが、ｐＨを低下させるための酸は添加されない。

【0225】

記載される各手順において、ビーズ結合スルホン化ＤＮＡは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３１５，８５３号に記載されるように、固体支持体上で脱スルホン化される。

【0226】

変換プロトコルは、ハミルトンＳＴＡＲｌｅｔ自動ピペッティングシステムのパフォーマンスに対して以下に説明されるが、同等の機器を使用して手動で実行できる。

【0227】

プロトコル１
この手順は、標的ＤＮＡに相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを含む配列特異的捕捉ビーズを使用した、試料、例えば、便試料から捕捉されたＤＮＡの処理を記載する。
変性：
１．捕捉ビーズペレットを洗浄するには、９０ｎｇ／μＬのＢＳＡを２０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１００ｍＭのＮａＯＨを１６０μＬ添加する。

【0228】

２．４３℃で、１５００ＲＰＭで４５秒間混合して、インキュベートする。

【0229】

３．混合せずに、４３℃で更に１９分１５秒をインキュベートする（合計２０分）。

【0230】

４．マグネット上で５分間結合する。

【0231】

５．変性した試料８０μＬを新しいディープウェルプレートに移す。
スルホン化：
１．変性試料に５７％（重量／重量）の亜硫酸水素アンモニウム（ＡＢＳ）１２０μＬを添加する。

【0232】

２．６５．５℃のヒーターシェーカー上で、１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0233】

３．混合せずに更に７２分間インキュベートする（合計７５分間）。
スルホン化ＤＮＡ結合：
１．試料に７ＭのＧｕＨＣｌ結合溶液７５０μＬを添加する。

【0234】

２．ピペットを介してビーズストックを５サイクル混合し、１６ｍｇ／ｍＬの常磁性シリカビーズ５０μＬを各試料に添加する。

【0235】

３．３０．５℃で、１２００ＲＰＭ混合で３０分間インキュベートする。

【0236】

４．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
アルコール洗浄１及び２：
１．ビーズペレットに８０％のエタノール（ＥｔＯＨ）１ｍＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0237】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0238】

３．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。

【0239】

４．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ２５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0240】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0241】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
脱スルホン化：
１．ビーズペレットに７０％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）２００μＬ、１０５ｍＭのＮａＯＨを添加する。

【0242】

２．３０．５℃で、１２００ＲＰＭの混合で７分間インキュベートする。

【0243】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
アルコール洗浄３及び４：
１．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ２５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0244】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0245】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。

【0246】

４．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ２５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0247】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0248】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
乾燥ビーズ及び溶出ＤＮＡ：
１．ビーズペレットを１２００ＲＰＭで混合しながら７１．５℃で１５分間インキュベートし、乾燥させる。

【0249】

２．１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）７０μＬ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを乾燥ビーズに添加する。

【0250】

３．６６．５℃で１２００ＲＰＭ混合して２５分間インキュベートする。

【0251】

４．磁石上に８分間置いて、ビーズを冷却し、結合する。

【0252】

５．変換されたＤＮＡはアッセイの準備ができている。

【0253】

プロトコル２
この手順は、標的ＤＮＡに相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを含む配列特異的捕捉ビーズを使用した、試料、例えば、便試料から捕捉されたＤＮＡの処理を記載する。
変性：
１．捕捉ビーズペレットを洗浄するために、３６ｎｇ／μＬのＢＳＡを５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１６０ｍＭのＮａＯＨ５０μＬを添加する。

【0254】

２．３２．５℃で、１５００ＲＰＭで混合して３分間インキュベートする。

【0255】

３．磁石上で５分間結合する。

【0256】

４．変性した試料８０μＬを新しいディープウェルプレートに移す。
スルホン化：
１．変性試料に５２重量／重量％のＡＢＳ１２０μＬを添加する。

【0257】

２．６２．５℃のヒーターシェーカーに置き、１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0258】

３．振盪せずに更に８５分間インキュベートする（合計８８分間）。
スルホン化ＤＮＡ結合：
１．７ＭのＧｕＨＣｌ７５０μＬ、１３３ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ２．２の結合溶液を試料に添加する。

【0259】

２．ピペットを介してビーズストックを５サイクル混合し、１６ｍｇ／ｍＬの常磁性シリカビーズ５０μＬを各試料に添加する。

【0260】

３．３２．５℃で、１２００ＲＰＭ混合しながら１５分間インキュベートする。

【0261】

４．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
アルコール洗浄１及び２：
１．ビーズペレットに７５％のＩＰＡ１ｍＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）の変換洗浄液を添加する。

【0262】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0263】

３．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。

【0264】

４．ビーズペレットに７５％のＩＰＡ２５０μＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）の変換洗浄液を添加する。

【0265】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0266】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
脱スルホン化：
１．ビーズペレットに７０％のＩＰＡ２００μＬ、３０ｍＭのＮａＯＨを添加する。

【0267】

２．３２．５℃で、１２００ＲＰＭの混合で３分間インキュベートする。

【0268】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
アルコール洗浄３及び４：
１．ビーズペレットに７５％のＩＰＡ２５０μＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）の変換洗浄液を添加する。

【0269】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0270】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。

【0271】

４．ビーズペレットに７５％のＩＰＡ２５０μＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）の変換洗浄液を添加する。

【0272】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0273】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して破棄する。
乾燥ビーズ及び溶出ＤＮＡ：
１．ビーズペレットを７１．５℃にて１２００ＲＰＭで混合しながら１５分間インキュベートし、乾燥させる。

【0274】

２．３ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）７０μＬ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを乾燥ビーズに添加する。

【0275】

３．６６．５℃にて１２００ＲＰＭで混合し、２５分間インキュベートする。

【0276】

４．マグネット上に２５分間置いて、ビーズを冷却して結合する。

【0277】

５．変換されたＤＮＡはアッセイの準備ができている。

【0278】

プロトコル３
この手順は、カオトロープ媒介性シリカ支持体への結合を使用した、試料、例えば、血漿から抽出されたＤＮＡの処理を説明する。以下の変性ステップの前に、ＤＮＡを支持体から溶出させる。
変性：
１．抽出した７５μＬのＤＮＡ試料に、９０ｎｇ／μのＬＢＳＡ１１μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１１μＬの１．０ＭのＮａＯＨを添加する。

【0279】

２．１２００ＲＰＭ混合しながら、室温で１分間インキュベートする。
スルホン化：
１．変性試料に５２重量／重量％のＡＢＳ１２０μＬを添加する。

【0280】

２．ヒーターシェーカー上に置いて、６５．５℃で、３分間１２００ＲＰＭで混合する。

【0281】

３．混合せずに更に７２分間インキュベートする（合計７５分間）。
スルホン化ＤＮＡ結合：
１．７ＭのＧｕＨＣｌ結合溶液７５０μＬを試料に添加する。

【0282】

２．ピペットを介してビーズストックを５サイクル混合し、１６ｍｇ／ｍＬの常磁性シリカビーズ５０μＬを各試料に添加する。

【0283】

３．３０．５℃にて１２００ＲＰＭで混合し、で３０分間インキュベートする。

【0284】

４．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を廃棄物に吸引する。
アルコール洗浄１及び２：
１．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ１ｍＬ、１０ｍＭのＴｒｉs（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0285】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0286】

３．磁石上に５分間置いてビーズを結合し、上清を廃棄物に吸引する。

【0287】

４．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ２５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0288】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0289】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して廃棄する。
脱スルホン化：
１．ビーズペレットに、７５％のＩＰＡ２００μＬ、８７．５ｍＭのＮａＯＨを添加する。

【0290】

２．３０．５℃にて、１２００ＲＰＭの混合で７分間インキュベートする。

【0291】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して廃棄する。
アルコール洗浄３及び４：
１．ビーズペレットに８０％のＥｔＯＨ２５０μＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0292】

２．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0293】

３．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して廃棄する。

【0294】

４．ビーズペレットに２５０μＬの８０％ＥｔＯＨ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）の変換洗浄液を添加する。

【0295】

５．１２００ＲＰＭで３分間混合する。

【0296】

６．磁石上に２分間置いてビーズを結合し、上清を吸引して廃棄する。
乾燥ビーズ及び溶出ＤＮＡ：
１．ビーズペレットを７１．５℃にて１２００ＲＰＭで混合しながら１５分間インキュベートし、乾燥させる。

【0297】

２．４ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）８０μＬ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを乾燥ビーズに添加する。

【0298】

３．６６．５℃にて１２００ＲＰＭ混合し、２５分間インキュベートする。

【0299】

４．磁石上に２０分間置いてビーズを冷却して結合する
５．変換されたＤＮＡはアッセイの準備ができている。
上述の条件をまとめ、図１４の表に比較した。

【0300】

上述の治療プロトコルを比較するために、ゲノムＤＮＡを、Ｍａｘｗｅｌｌシステム（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．、Ｆｉｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ）、及びＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．、カタログ番号ＡＳＢ１４００）を使用して、いずれも製造業者の説明書に従って、細胞株ＯＥ３３細胞（食道癌）から抽出した。調製したＤＮＡを、全ての３つのプロトコルで使用し、各プロトコルの変性ステップに、介在するＤＮＡ捕捉ステップなしで直接添加した。プロトコル１、２、及び３の各々についての鎖回収を、２６．７、１７．８、１１．８７、７．９１、５．２７、３．５２ｎｇ／μＬの濃度のＤＮＡについて試験した。各条件の４つの複製物を試験した。調製したＤＮＡで試験した配列は、メチル化マーカー遺伝子ＺＮＦ５６８、ＢＭＰ３、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＮＤＲＧ４、ＶＡＶ３、及びＺＮＦ６８２であった。詳細なデータを図１５Ａ及び１５Ｂに示す。

【0301】

図１６は、異なるメチル化マーカーＤＮＡについて図１５Ａ～１５Ｂに示されるデータに基づいて、プロトコル１及びプロトコル３（両方とも結合に対してｐＨ調整なし）と比較したプロトコル２（低ｐＨ結合を使用した）からの鎖回収の対比較を有する表を示す。

【0302】

図１７は、示されるＤＮＡ濃度でのプロトコル２対プロトコル１またはプロトコル３（「プロトコルＸ」として集合的にグループ化される）を使用したパーセンテージ変化を示すグラフを示す。破線は、１００％、すなわち、プロトコル２及びプロトコルＸを使用した等しい回収率を示す。プロトコル１がより高い鎖回収を与えた、試験したより低ＤＮＡ濃度でのＶＡＶ３マーカーＤＮＡを除いて、他の２つのプロトコル（いずれも標準的な、非調整ｐＨ結合条件を使用した）の両方と比較して、プロトコル２の方法（低ｐＨ結合条件を使用した）ではより高い鎖回収率が見られた。

【0303】

緩衝液比較
プロトコル２を、ＧｕＨＣｌ結合溶液中のグリシン、クエン酸塩、リンゴ酸塩、またはギ酸塩緩衝液を使用するように改変されたスルホン化ＤＮＡ結合ステップ方法と共に、上記のように使用した。

【0304】

非緩衝対照反応は、結合ステップで緩衝液を添加しないＧｕＨＣｌを使用した。結果を図１８に示す。

【0305】

特許、特許出願、記事、書籍、論文、製造者の説明書、製品筐体、及びインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本出願で引用されるすべての文献及び同様の資料は、任意の目的のためにそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本明細書に記載された様々な実施形態が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。参照により援用される際にこれらの用語の定義が本発明の教示に提供される定義と異なるようにみえるときに、本発明の教示に提供される定義は、優先されるものとする。

【0306】

記載される本科学技術の組成物、方法、及び用途の種々の修正形態及び変形形態は、記載されるような本科学技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には明白である。本科学技術を特定の例示的な実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲に記載されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学、診断学、薬理学、生化学、医学、または関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあるよう意図されている。

【図面の簡単な説明】

【0307】

【図1】本明細書に開示される方法を含むバイサルファイト処理方法の一実施形態の概要である。

【図2】提案されている結合機構の概略図である。

【図3】６つの異なるマーカーＤＮＡについて回収された結合ｐＨ対Ｌｏｇ鎖のグラフを提供する。

【図4】変換されたシトシンのパーセント対最大結合ｐＨのグラフである。各ＤＮＡ鎖の変換されたシトシンのパーセント（ウラシルスルホン酸塩ヌクレオチド／全ヌクレオチド）を、最大鎖回収に必要とされる最高推定結合ｐＨに対してプロットした。これらの点の線形フィッティングを示す。

【図5】同じプライマー／プローブの組み合わせを使用するＤＮＡ鎖の、変換されたシトシンのパーセント対最大結合ｐＨのグラフである。ＤＮＡのうちの３つ（ＢＭＰ３、β－アクチン（「ＢＴＡＣＴ」）、及びＮＤＲＧ４鎖）を修飾して、特定のＤＮＡの各バリアントについて同じプライマー及びプローブ結合配列を保持するが、そのＤＮＡ鎖の他の領域に異なる数の非メチル化Ｃを含有するＤＮＡのセットを作製した。この相関の強度を更に例示するために、線を配列の各セットにフィッティングさせた。

【図6】非調整結合ｐＨ（Ａ）または低結合ｐＨ（Ｂ）を使用した、全ＤＮＡ後転換及びクリーンアップのグラフを示す。

【図7】４つの異なるＤＮＡ配列（ＬＡＳＳ４、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＬＲＲＣ４、及びＺＤＨＨＣ１）についての非調整結合ｐＨ（上段）または低結合ｐＨ（下段）に対して回収されたについて便試料体積（ｍＬ）対回収された鎖のグラフである。ＺＤＨＨＣ１ＤＮＡを２回試験した。

【図8】Ａは、低ｐＨ及び非調整ｐＨで実施した結合反応からの、異なるロットの亜硫酸水素アンモニウムからの鎖回収を示す表を提供する。Ｂは、低ｐＨ及び非調整ｐＨで実施した結合反応からの、異なる濃度の亜硫酸水素アンモニウムからの鎖回収を示す表を提供する。

【図9】低ｐＨ及び非調整ｐＨで行われた結合反応に存在する汚染物質の効果を示す表を提供する。

【図10】非調整のｐＨ結合反応を使用して様々なシリカビーズを使用した、回収した鎖のログを示す表を提供する。

【図11】実施例１に記載される低ｐＨ結合反応を使用して種々のシリカビーズを使用して回収された鎖のログを示す表を提供する。

【図12】４．８５～２．１３の範囲の酸性ｐＨ（「ＢＮＤｐＨ」）に調整された結合反応を使用して回収された鎖を示す表を提供する。

【図13】非調整または低ｐＨ結合反応を使用して、異なるサイズのＤＮＡ分子、及び異なる濃度のＤＮＡ分子について回収された鎖を示す表を提供する。

【図14】プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３により提供される反応条件を比較した表を示す。

【図15A】プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した、鎖回収を比較する表を示す。

【図15B】プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した、鎖回収を比較する表を示す。

【図16】プロトコル１、プロトコル２、及びプロトコル３を使用した異なるメチル化マーカーＤＮＡについて、図１５Ａ～１５Ｂに示される鎖回収のペアワイズの対比を有する表を示す。

【図17】プロトコル２の回収対プロトコル１またはプロトコル３を使用した回収の比として示される、異なるメチル化マーカーＤＮＡについて、図１６に示される鎖回収を比較するグラフを示す。各データポイントの「プロトコルＸ」は、そのデータポイントのプロトコル１または３のいずれかを表す。

【図18】結合ステップ中に未調整のｐＨを使用する、またはグリシン、クエン酸、リンゴ酸、もしくはギ酸緩衝液を使用して、示されるスルホン化ＤＮＡのシリカビーズへの結合中にｐＨを低減する、異なるＤＮＡの回収を比較する表を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【国際調査報告】