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特表2023-536100代替の翻訳開始および翻訳停止に由来する多機能免疫グロブリンフォールドポリペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-23
(54)【発明の名称】代替の翻訳開始および翻訳停止に由来する多機能免疫グロブリンフォールドポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230816BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230816BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230816BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230816BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230816BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230816BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230816BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230816BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230816BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230816BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230816BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230816BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230816BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230816BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230816BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K19/00
C12P21/08
C12P21/02 Z
A61P35/00
A61P37/04
A61K47/68
A61K39/395 Y
A61K39/395 E
A61K39/395 G
A61K39/395 T
A61K39/395 U
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023505837
(86)(22)【出願日】2021-07-26
(85)【翻訳文提出日】2023-03-24
(86)【国際出願番号】 US2021043126
(87)【国際公開番号】W WO2022026358
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】63/056,785
(32)【優先日】2020-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517342844
【氏名又は名称】アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティー オブ アリゾナ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】クーンズ，マイケル・エス
(72)【発明者】
【氏名】リー，マーク・エス
(72)【発明者】
【氏名】バッタチャリア，ディープタ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064DA01
4B064DA13
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA60
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB31
4C085CC08
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書には、追加のポリペプチド配列との融合パートナーとして使用するための、ドメインの三次元βシート構造のループ領域に非天然Ｎ’末端およびＣ’末端を作製するように操作された代替免疫グロブリンドメインのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列が記載されている。そのようなポリペプチドは、試薬、研究ツール、または治療薬として使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドが、野生型のＮ末端およびＣ末端の融合、または、野生型のＮ末端とＣ末端とを連結する任意選択のリンカー、ならびに
新規のＮ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断、
を含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、上記ヌクレオチド配列。
【請求項2】
免疫グロブリンドメインが、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＭＨＣ分子、または他の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質由来の免疫グロブリンドメインを含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項3】
免疫グロブリンドメインが重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項4】
Ｎ’末端およびＣ’末端の一方または両方が、１つまたは複数の追加のポリペプチドと融合されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項5】
追加のポリペプチドが、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、共刺激分子、サイトカイン、または別のポリペプチドドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項6】
追加のポリペプチドが免疫グロブリンヒンジ領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項7】
追加のポリペプチドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン、もしくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリンと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、もしくはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せを含む；またはＴＣＲ分子：ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４、もしくはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ、のうちの１つまたは複数を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項8】
任意選択のリンカーがポリペプチドリンカーまたは化学リンカーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項9】
任意選択のリンカーが、ポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ポリグリシン－アラニンリンカー、ポリグリシン－セリンリンカー、またはポリグリシン－セリン－プロリンリンカーのうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項10】
任意選択のリンカーが、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数と８５％～９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項11】
任意選択のリンカーが、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項12】
切断が起こるループ領域が、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、Ｆ－Ｇ、または１つもしくは複数の介在性βストランンドを除去する他のループ連結を含む隣接するβストランンドを接続するループのうちの１つもしくは複数を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項13】
切断が起こるループ領域が、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、またはＦ－Ｇのうちの１つまたは複数を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項14】
切断が起こるループ領域がＣ－Ｃ’またはＡ－Ｂループを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項15】
ヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３と８５％～９９％の同一性を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項16】
ヌクレオチドが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドベクター。
【請求項18】
請求項１に記載の１つもしくは複数のヌクレオチド配列または請求項１７に記載のポリヌクレオチドベクターを含む、細胞。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされている、ポリペプチド。
【請求項20】
ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４と８５％～９９％の同一性を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【請求項21】
ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【請求項22】
１つまたは複数のジスルフィド結合を介して共有結合されている配列番号３２または３４のポリペプチドの二量体を含む、二価ポリペプチド複合体。
【請求項23】
配列番号３４を含む、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ポリペプチド。
【請求項24】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する方法であって、核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量のヌクレオチド配列を単離するステップと；ポリペプチドの発現を誘導するステップと；ポリペプチドを単離するステップと、を含む、上記方法。
【請求項25】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する手段であって、核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量のヌクレオチド配列を単離するステップと；ポリペプチドの発現を誘導するステップと；ポリペプチドを単離するステップと、を含む、上記手段。
【請求項26】
請求項２１に記載の方法または請求項２２に記載の手段によって生成される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【請求項27】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置方法。
【請求項28】
疾患または障害を処置するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量の使用であって、該ポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、上記使用。
【請求項29】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む、研究ツール。
【請求項30】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む、免疫化学試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２７日に出願された、米国仮出願第６３／０５６，７８５号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年７月２７日に出願された、米国仮出願第６３／０５６，７８５号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表についての言及
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｃ）に従い、コンピュータ可読形式の配列表とともに提出されている。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル「２１２４４３－９００７－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿２０－ＪＵＬ－２０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は、２０２１年７月２０日に作成され、５８配列を含み、８５．７キロバイトのファイルサイズを有しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｃ）に従い、コンピュータ可読形式の配列表とともに提出されている。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル「２１２４４３－９００７－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿２０－ＪＵＬ－２０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は、２０２１年７月２０日に作成され、５８配列を含み、８５．７キロバイトのファイルサイズを有しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本明細書には、追加のポリペプチド配列との融合パートナーとして使用するための、ドメインの三次元βシート構造のループ領域に非天然Ｎ’末端およびＣ’末端を作製するように操作された代替免疫グロブリンドメインのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列が記載されている。そのようなポリペプチドは、試薬、研究ツール、または治療薬として使用することができる。
本明細書には、追加のポリペプチド配列との融合パートナーとして使用するための、ドメインの三次元βシート構造のループ領域に非天然Ｎ’末端およびＣ’末端を作製するように操作された代替免疫グロブリンドメインのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列が記載されている。そのようなポリペプチドは、試薬、研究ツール、または治療薬として使用することができる。
【背景技術】
【0004】
免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインは、免疫グロブリン（抗体）、ＭＨＣ、および細胞受容体、例えば、とりわけ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、受容体、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、およびＰＤＬ１を含む、様々な異なるタンパク質の合成に欠かせない構成要素である。例えば、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１～４０５頁（１９８８）；Ｂｏｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９～３２０頁（１９９４）；ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８～５３９頁（１９９４）；Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：１１４５～１１５３頁（１９９９）；Ｈａｌａｂｙら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１２（７）：５６３～５７１（１９９９）；ならびにＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９：８５２～８６２頁（２００７）を参照されたい。これらの各々は、そのような教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。免疫グロブリン（抗体）は、Ｉｇドメインで構築されたタンパク質の代表例である。抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖分子および２つの軽鎖分子を含むヘテロ二量体である。重鎖および軽鎖はそれぞれ、高度に保存された定常領域と結合特異性を付与する可変領域から構成されている。重鎖および軽鎖はそれぞれ、βサンドイッチ構造モチーフを形成するβシートからなる三次サブドメインを有する一連の連結されたＩｇドメインから構成されている。βシートを形成する個々のβストランドは、ループ領域により接続されている。
【0005】
Ｉｇドメイン含有タンパク質は、試薬、研究ツール、または治療薬として有用であることが判明しているが、翻訳がＮ末端からＣ末端へと行われることから使用され得る方法には制限がある。必要とされているのは、免疫グロブリンドメインのループ領域内にリンカーまたは他のタンパク質ドメインを挿入し、複数の機能、例えば、試薬、研究ツール、または治療法を持つ新規タンパク質を作製することができる新規の免疫グロブリンドメインを構築するための方法である。
【発明の概要】
【0006】
本明細書に記載の一実施形態は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが、野生型のＮ末端およびＣ末端の融合または野生型のＮ末端とＣ末端とを連結する任意選択のリンカーと、新規のＮ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断とを含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、ヌクレオチド配列である。一態様では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＭＨＣ分子、または他の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質由来の免疫グロブリンドメインを含む。別の態様では、免疫グロブリンドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。別の態様では、Ｎ’末端およびＣ’末端の一方または両方が、１つまたは複数の追加のポリペプチドと融合されている。別の態様では、追加のポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、共刺激分子、サイトカイン、または別のポリペプチドドメインを含む。別の態様では、追加のポリペプチドは、免疫グロブリンヒンジ領域を含む。別の態様では、追加のポリペプチドドメインは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン、もしくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリンと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、もしくはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せを含む；またはＴＣＲ分子：ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４、もしくはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ、のうちの１つまたは複数を含む。別の態様では、任意選択のリンカーは、ポリペプチドリンカーまたは化学リンカーを含む。別の態様では、任意選択のリンカーは、ポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ポリグリシン－アラニンリンカー、ポリグリシン－セリンリンカー、またはポリグリシン－セリン－プロリンリンカーのうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドを含む。別の態様では、任意選択のリンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数と８５％～９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。別の態様では、任意選択のリンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドである。別の態様では、切断が起こるループ領域は、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、Ｆ－Ｇ、または１つもしくは複数の介在性βストランドを除去する他のループ連結を含む隣接するβストランンドを接続するループのうちの１つもしくは複数を含む。別の態様では、切断が起こるループ領域は、Ｃ’－Ｃ’’またはＡ－Ｂのループを含む。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３と８５％～９９％の同一性を有する。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３から選択される。
【0007】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。
【0008】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の１つもしくは複数のヌクレオチド配列または本明細書に記載のポリヌクレオチドベクターを含む細胞である。
【0009】
別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドである。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４と８５％～９９％の同一性を有する。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４から選択される。
【0010】
本明細書に記載の別の実施形態は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して共有結合されている配列番号３２または３４のポリペプチドの二量体を含む二価ポリペプチド複合体である。
【0011】
本明細書に記載の別の実施形態は、配列番号３４を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ポリペプチドである。
【0012】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数、または本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する方法であって、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量の本明細書に記載のヌクレオチド配列を単離するステップと；本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導するステップと；本明細書に記載のヌクレオチドによってコードされているポリペプチドを単離するステップと、を含む方法である。
【0013】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数、または本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する手段であって、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量の本明細書に記載のヌクレオチド配列を単離するステップと；本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導するステップと；本明細書に記載のヌクレオチドによってコードされているポリペプチドを単離するステップと、を含む手段である。
【0014】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の方法または手段によって生成されるヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドである。
【0015】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法である。
【0016】
本明細書に記載の別の実施形態は、ヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患または障害を処置するための、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数によってコードされているポリペプチドの有効量の使用である。
【0017】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む研究ツールである。
【0018】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む免疫化学試薬である。
【0019】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願の刊行物のコピーは、請求と必要な手数料の支払いによって官庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の例示的なＦａｂ断片の三次元構造を示す。軽鎖（マゼンタ）および重鎖（シアン）の定常領域および可変領域は、それぞれの領域が対の免疫グロブリンドメインで構成されており、１つのＩｇドメインが各鎖から付与されていることを際立たせるように表示されている。
【図3B】図３Ｂは、βストランドＡとβストランドＧの間にリンカーが配置されており、βストランドＣとＣ’の間のループ領域が切断されている、ＡｌｔＩｇのβシートの配置の模式図を示す。Ｎ’末端はこの場合βストランドＣ’にあり、Ｃ’末端はβストランドＣにある。
【図5A】図５Ａは、ＡｌｔＩｇ Ｆｖの四分系三次元モデル構造（ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）と野生型可変断片（Ｆｖ）の比較を示す。各Ｆｖドメインは、重鎖ドメインと軽鎖ドメインの両方から構成される。
【図6】図６は、軽鎖または重鎖のＮ’末端にそれぞれｍｙｃおよびＨＡタグを有し、またＣ’末端に６×Ｈｉｓタグを有する図５Ｂに示したＡｌｔＩｇ構築物に関するフロー式フルオロフォア結合免疫吸着アッセイ（ＦＦＬＩＳＡ）の結果を示す。培養培地（陰性対照）またはＡｌｔＩｇを発現するＭ１２細胞の上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体でコートしたポリスチレンビーズとともにインキュベートし、ＨＡまたはＭｙｃタグに対する蛍光色素コンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーにより蛍光強度を分析した。これらの結果は、ＡｌｔＩｇが可溶性分子として細胞から分泌されることを示唆している。構築物は結果の下に示す。
【図7A】図７Ａは、生体模倣刺激物質（Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ）（ＢＭｉＭＳ）の生成におけるＡｌｔＩｇ分子の使用の例を示す。ＢＭｉＭＳは、Ｔ細胞の活性化に不可欠な分子（例えば、ｐＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ－１）に直接融合された細胞表面抗原（例えば、Ｂ細胞リンパ腫上のＣＤ１９などの腫瘍抗原）に結合する抗体由来のＡｌｔＩｇ Ｆｖ領域から構成されている。この図は、活性化分子に直接融合させるためのＡｌｔＩｇ操作の使用が、Ｔ細胞による認識のために、どのように標的細胞膜に対して適切な空間的配向で刺激分子を位置決めするかを示す（例えば、ｐＭＨＣＩＩのＮ末端領域は腫瘍細胞表面から離れ、Ｔ細胞の方に向けられている）。このような配向性は、天然Ｆｖ領域への刺激分子のＮ末端からＣ末端融合では達成できなかった。
【図7B】図７Ｂは、ＡｌｔＩｇベースのＢＭｉＭＳに関するフロー式フルオロフォア結合免疫吸着アッセイ（ＦＦＬＩＳＡ）の結果を示す。ＢＭｉＭＳを発現するＭ１２細胞の培養培地または上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＡｌｔＩｇのＣ末端でＨｉｓタグを捕捉）でコートしたポリスチレンビーズとともにインキュベートし、指定した免疫分子に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーにより蛍光強度を分析した。これらの結果は、ＢＭｉＭＳが可溶性分子として細胞から分泌されることを示唆している。
【図8】図８は、ＢＭｉＭＳで染色したＲａｍｏｓ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。Ｒａｍｏｓ細胞を培養培地（陰性対照）またはＢＭｉＭＳを発現するＭ１２細胞の上清とともにインキュベートし、次いで、表示した免疫分子に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。これらの結果は、ＢＭｉＭＳ ＡｔｌＩｇがｉｎ ｖｉｔｒｏでＢ細胞リンパ腫（Ｒａｍｏｓ細胞）に結合することを示している。
【図9B】図９Ｂは、ｒｈｕＣＤ１９およびＢＭｉＭＳでコートされたプレートで１８時間培養した後のナイーブ５ｃ．ｃ７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－２ ＥＬＩＳＡの結果を示す。バーは、３連のウェルの平均±ＳＥＭを表す。
【図10B】図１０Ｂは、ＡｌｔＩｇβ－シートの配置の概略図を示しており、リンカーはβストランドＡとβストランドＧの間に配置されており、βストランドＡとＢの間のループ領域は切断されている。Ｎ’末端はこの場合βストランドＢにあり、Ｃ’末端はβストランドＡにある。
【発明を実施するための形態】
【0021】
詳細な説明
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法、およびそれらの技術は、当技術分野においては周知であり、一般的に使用されている。矛盾がある場合、定義を含む本開示が優先される。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様のまたは同等の方法および材料を、本明細書に記載の実施形態および態様の実施または試験において使用することができる。
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法、およびそれらの技術は、当技術分野においては周知であり、一般的に使用されている。矛盾がある場合、定義を含む本開示が優先される。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様のまたは同等の方法および材料を、本明細書に記載の実施形態および態様の実施または試験において使用することができる。
【0022】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」、「ヌクレオチド」、「ポリペプチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ベクター」という用語は、当業者の生化学者によって理解されるようなそれらの一般の意味を有する。標準的な一文字ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）、および標準的な一文字アミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＲ）が本明細書では使用される。
【0023】
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。本開示はまた、明示的に述べられているかどうかにかかわらず、本明細書に提示されている実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態を企図する。
【0024】
本明細書で使用される場合、本開示の文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および同様の用語は、本明細書において別途指示されるか文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるものとする。さらに、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、特に指定のない限り、「１つまたは複数」を意味する。
【0025】
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、接続的または離接的であり得る。
【0026】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、かなりの程度または重要な程度までを意味するが、完全にではないことを意味する。
【0027】
本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される「約」または「およそ」という用語は、明記した基準値に似た値、または当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内にある値を指し、これは、測定システムの制限など、どのように値が測定または決定されるかに部分的に依存する。一態様では、「約」という用語は、「約」という用語によって変更される値の最大±１０％の変動内にある、整数および分数成分の両方を含む任意の値を指す。あるいは、「約」は、当技術分野の慣例により、３またはそれ以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、生物学的システムまたはプロセスなどに関して、「約」という用語は、値の１桁以内を意味し、一部の実施形態では５倍以内を意味し、一部の実施形態では２倍以内であることを意味し得る。本明細書で使用される場合、記号「～」は「約」または「およそ」を意味する。
【0028】
本明細書で開示されるすべての範囲は、離散値としての両方の端点、ならびに範囲内で指定されたすべての整数および分数を含む。例えば、０．１～２．０の範囲には、０．１、０．２、０．３、０．４．．．２．０が含まれる。端点が「約」という用語で修飾されている場合、指定された範囲は、端点を含めた範囲内のまたは３以上の標準偏差内の任意の値の最大±１０％の変動まで拡大される。
【0029】
本明細書で使用される場合、「有効成分」または「医薬品有効成分」という用語は、薬理学的効果、多くの場合、有益な効果を提供する医薬製剤、有効成分、化合物、もしくは物質、組成物、またはそれらの混合物を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「対照」または「基準」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。「基準」または「対照」レベルは、測定結果を評価するためのベースラインまたはベンチマークとして用いられる、所定の値または範囲であり得る。「対照」はまた、対照実験または対照細胞も指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「用量」という用語は、少なくとも１回または複数回の投与で治療効果を開始または生じるのに十分な量を含有する、細胞を含む有効成分の製剤または組成物の任意の形態を意味する。「製剤」および「組成物」は、本明細書では交換可能に使用される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、統計的に有意な程度に、または当業者によって検出可能な程度に、障害の進行を防止または低減することを指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、実質的に非毒性であるが、体験しているかまたは対象が罹患しやすい疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を予防、処置、もしくはある程度改善する、対象に投与される十分な量の薬剤、組成物、または細胞（複数可）である。その結果により、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減もしくは緩和、または生物学的システムの任意の他の望ましい変化がもたらされ得る。有効量は、限定するものではないが、対象の年齢、サイズ、疾患の種類もしくは程度、疾患のステージ、投与経路、使用される補助療法の種類もしくは程度、進行中の疾患プロセス、および所望する処置の種類を含む、各対象に固有の要因に基づき得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は動物を指す。典型的には、対象は哺乳動物である。対象はまた、霊長類（例えば、ヒト、男性または女性；小児、青年、または成人）、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、魚、鳥などを指す。一実施形態では、対象は霊長類である。一実施形態では、対象はヒトである。
【0035】
本明細書で使用される場合、対象は、そのような対象がそのような処置から生物学的に、医学的に、または生活の質的に恩恵を受ける場合、「処置が必要」とされる。処置が必要とされる対象は、特に防止的処置または予防的処置の場合、必ずしも症状を示すとは限らない。
【0036】
本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」とは、患者によって現れるかまたは患者が罹患し得る疾患、障害、または生理学的状態に応答して行われる臨床上の介入を指す。処置の目的には、症状の緩和もしくは予防、疾患、障害もしくは状態の進行もしくは悪化の抑制もしくは停止、および／または疾患、障害もしくは状態の寛解が含まれる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語は、所与の生物学的プロセス、状態、症状、障害、もしくは疾患の低減もしくは抑制、または生物学的活性もしくはプロセスのベースライン活性の有意な減少を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」とは、障害もしくは疾患を含む生物学的プロセスの進行を予防、防止、抑制、抑圧、逆転、緩和、改善、もしくは阻害すること、または疾患を完全に除去することを指す。処置は、急性または慢性の方法で実施され得る。「処置」という用語はまた、疾患に罹患する前に、疾患またはそのような疾患に関連する症状の重症度を軽減することも指す。疾患、障害、またはそれらの症状を「抑圧する」または「改善する」ことには、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、そのような疾患、障害またはその症状の臨床的出現後に、対象に投与することが含まれる。疾患、障害またはそれらの症状の「予防」または「防止する」ことには、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、疾患、障害またはそれらの症状の発症前に、対象に投与することが含まれる。疾患または障害を「抑制する」ことには、本明細書に記載の細胞、組成物または化合物を、疾患またはそれらの障害が誘発された後、その臨床的外観または症状が現れる前に、対象に投与することが含まれる。
【0039】
本明細書には、代替免疫グロブリンドメイン（「ＡｌｔＩｇ」）を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドおよびポリペプチドが記載されている。免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドをとるタンパク質の最初の（Ｎ末端）および最後の（Ｃ末端）アミノ酸の位置を変え、リンカーおよび他のペプチドを挿入することにより、代替免疫グロブリン（「ＡｌｔＩｇ」）を構築することができる。ＡｌｔＩｇの例の一実施形態は、単一ポリペプチドとしての別のタンパク質をＡｌｔｌｇに融合させて、従来の方法では（すなわち、第２のタンパク質のＮ末端を天然ＩｇのＣ末端に融合させることでは）天然Ｉｇが第２のタンパク質に融合された場合に達成することができなかった、ＡｌｔＩｇの機能末端と第２のタンパク質の間の異なる空間的関係を達成することである。ＡｌｔＩｇを設計することにより、ＡｌｔＩｇのアミノ末端（Ｎ－）領域を第２のタンパク質のＮ末端領域の遠位に位置させ、一方、両タンパク質のカルボキシ末端（Ｃ－）領域は近位に位置させることができる。このような構築はタンパク質の翻訳がポリペプチドのＮ末端からＣ末端へと自然に起こり、一方の側が特定の機能（例えば、標的Ａと結合する抗体可変領域（Ｆｖ））を有し、他の部分が異なる機能（例えば、標的Ｂと結合するＦｖまたは他のタンパク質）を有する新規の二機能性ポリペプチドの設計および合成において、この自然の法則が操作上の問題をもたらすという理由から重要である。これが問題となり得る理由は、第１のタンパク質のＣ末端が第２のタンパク質のＮ末端に連結された１つの長いポリペプチドとして一緒に融合された２つのタンパク質の機能性末端の配向性に関するものである。リンカーを任意選択でＣ末端とＮ末端の間に加えて、間隔を調整したり可撓性を持たせたりすることができる。詳しくは、第１のタンパク質と第２のタンパク質の両方の機能性部位がそれらのＮ末端にある場合、そのような設計では、第２のタンパク質の機能性部位が第１のタンパク質に対して最適ではない直列方向に配置される。しかし、多くの可能性のある実験ツールまたは治療薬においては、２つのタンパク質の２つの機能性Ｎ末端を遠位末端に有することがより望ましい場合もある。問題は、従来の手段によるそのようなポリペプチドの構築が連続したポリペプチドでは不可能であり、タンパク質を連結する他の手段（例えば、化学リンカー、または操作された非共有結合タンパク質相互作用部位）が必要となることである。この問題は、互いに融合した２つのタンパク質が複数のサブユニットを構成する場合に、さらに困難となる。例えば、一端の腫瘍細胞上のエピトープに結合する抗体Ｆｖと、もう一端のＴ細胞によって検出され得るｐＭＨＣ分子とからなる二機能性タンパク質を操作するためには、２つの課題がある。１番目は、Ｆｖ上の抗原結合部位と、ｐＭＨＣ上のＴ細胞認識部位の両方が両タンパク質のＮ末端にあることである。したがって、ｐＭＨＣが自然なポリペプチド配向性でＦｖに連結されたならば、Ｆｖが腫瘍細胞に結合される場合、ｐＭＨＣもまたＴ細胞による認識のための外向きではなく、腫瘍細胞の方を向いている。第２の問題は、ＦｖおよびｐＭＨＣの両方がヘテロダイマーであり、１つのポリペプチドとして融合することがより困難であることである。
【0040】
本明細書に記載の構築物は、Ｉｇドメインの翻訳が開始され停止される場所を変え、以前の（天然の）Ｎ末端およびＣ末端の融合または得られるポリペプチド鎖の連続性を確保するための以前のＮ末端とＣ末端とを接続する可撓性リンカーを有する。図３Ａ－図３Ｂを参照されたい。このような改変を行うことにより、所望する目的のタンパク質のＣ末端がＡｌｔＩｇドメインの新規Ｎ’末端を持つ連続ポリペプチドとして翻訳され、通常は各タンパク質成分（例えば、ＡｌｔＩｇおよび従来のＦｖまたはｐＭＨＣ）のＮ末端領域であるものが互いに遠位にあるポリペプチドが作成され得る。あるいは、所望するタンパク質のＮ末端がＡｌｔＩｇのＣ’末端から連続ポリペプチドとして翻訳され、各タンパク質成分の異なる配向性が達成され得る。
【0041】
免疫グロブリンドメインを含有する任意のタンパク質を、ＡｌｔＩｇを構築するための最初のポリペプチドドメインとして使用することができる。Ｉｇドメイン含有タンパク質には、限定するものではないが、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＥＭＢＬ－ＥＢＩファミリーＰＦ０００４７、ｃｌａｎ ＣＬ００１１；ＮＣＢＩ保存タンパク質ドメインファミリーｃｄ０００９６、これらはそのような教示に関して本明細書に参照により組み込まれる））にあるものが挙げられ、抗体または免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）；Ｔ細胞受容体（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４）；抗原提示分子（クラスＩ ＭＨＣ、クラスＩＩ ＭＨＣ、β－２ミクログロブリン、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β－２ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ）；共受容体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）；抗原受容体アクセサリー分子（ＣＤ３－γ、－δ、および－ε鎖、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂ）；共刺激分子または阻害分子（ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１）；キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）；ＩｇＳＦ ＣＡＭ（ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ２サブセット）；サイトカイン受容体（インターロイキン－１受容体、コロニー刺激因子１受容体）；増殖因子受容体（血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、マスト／幹細胞増殖因子受容体前駆体（ＳＣＦＲ、ｃ－ｋｉｔ、ＣＤ１１７抗原））；受容体チロシンキナーゼ／ホスファターゼ（チロシン－プロテインキナーゼ受容体Ｔｉｅ－１前駆体、Ｉ１ａ型およびＩＩｂ型受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、限定するものではないが、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＵ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＦを含む）；Ｉｇ結合受容体（多量体免疫グロブリン受容体（ＰＩＧＲ）、一部のＦｃ受容体）；細胞骨格タンパク質（ミオチリン、ミオパラジン、パラジン、タイチン、オブスキュリン、ＭＹＯＭ１、ＭＹＯＭ２）；ＣＤ１４７；ＣＤ９０；ＣＤ７；ブチロフィリン（Ｂｔｎ）、および他のタンパク質が含まれる。例えば、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１～９１７頁（１９８７）；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１～４０５頁（１９８８）；Ｂｏｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２（４）：３０９～３２０頁（１９９４）；ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８～５３９頁（１９９４）；ＢｒｕｍｍｅｎｄｏｒｆおよびＲａｔｈｊｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ２（９）：９６３～１１０８頁（１９９５）；ＨａｌａｂｙおよびＭｏｒｎｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４６（４）：３８９～４００頁（１９９８）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＫｉｓｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８（２）：４５７～４７９頁（１９９８）；Ｌｉｔｍａｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０９～１４７頁（１９９９）；Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：１１４５～１１５３頁（１９９９）；Ｈａｌａｂｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（７）：５６３～５７１頁（１９９９）；Ｚｕｃｃｏｔｔｉら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９（Ｐｔ ７）：１２７０～１２７２頁（２００３）；ならびに、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９：８５２～８６２頁（２００７）を参照されたい。これらの各々は、そのような教示について参照により本明細書に組み込まれる。上述の免疫グロブリンドメインのいずれかを有する生物の種には、限定するものではないが、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、および他の哺乳動物が含まれる。
【0042】
多数のタンパク質、サブドメイン、またはペプチドを新しいＮ’末端またはＣ’末端でＡｌｔＩｇに融合させることができる。本明細書で論じた前述の免疫グロブリンドメインタンパク質のいずれかを融合させて、それぞれが特定の特異性を持つ１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを有するＡｌｔＩｇを作製することができる。さらに、ＡｌｔＩｇは、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、共刺激分子、サイトカイン、または他のポリペプチドドメインと融合させることができる。例示的なタンパク質には、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、またはそれらの組合せを含む、が含まれる。
【0043】
ＡｌｔＩｇ技術の１つの用途は、腫瘍抗原に結合し、公知の抗原性のｐＭＨＣ（例えば、抗ＣＭＶ Ｔ細胞などにより認識される）、共刺激分子（例えば、ＣＤ８０）、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ－１）、およびサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）のいずれかと融合されるＡｌｔＩｇを生成することである。Ｆｖは軽鎖（ＬＣ）Ｉｇフォールドおよび重鎖（ＨＣ）Ｉｇフォールドから構成されるヘテロ二量体であるので、ＡｌｔＩｇは、所定のＦｖに関するＬＣとＨＣの両方から作製され得る。それぞれを別のヘテロ二量体のサブユニット（例えば、天然ＦｖサブユニットまたはｐＭＨＣＩＩのαおよびβサブユニット）と融合させ、一端にＡｌｔＩｇＧ Ｆｖを有し、もう片方の一端にｐＭＨＣ、共刺激分子、または接着分子、またはサイトカインを有する試薬を生成することができる。本明細書で使用される場合、そのような構築物は、「生体模倣刺激物質」（「ＢＭｉＭＳ」）と呼ばれる。腫瘍細胞を、Ｔ細胞活性化に重要な４つの成分－抗原（ｐＭＨＣ）、共刺激、接着分子、シグナル伝達（サイトカイン経由）－を含むＢＭｉＭＳと接触させ、一般的なウイルス、例えば、ｈＣＭＶ、インフルエンザ、ワクシニアなどによる感染に起因してほとんどの個体に存在するＴ細胞集団により腫瘍細胞がターゲティングされやすくすることができる。他にも多数の用途が想定される。
【0044】
本明細書に記載の別の実施形態は、ＡｌｔＩｇを用いて作製された医薬化合物である。一実施形態では、医薬化合物はＢＭｉＭＳを含む。別の実施形態では、試薬は、抗腫瘍性ＡｌｔＩｇ Ｆｖを「ｅａｔ ｍｅ」シグナルとしてのカルレティキュリンに融合させることによって、腫瘍細胞が自然免疫細胞による食作用を受けやすくするために必要とされる重要シグナルで腫瘍細胞を標的とするように構築することができる。他の実施形態には、特定の細胞型または組織に薬物を送達するための抗薬物Ｆｖが含まれる
本明細書に記載の一実施形態は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが、野生型Ｎ末端およびＣ末端の融合またはそれらを連結する任意選択のリンカーと、新規Ｎ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断とを含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、ヌクレオチド配列である。一態様では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＭＨＣ分子、または他の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質由来の免疫グロブリンドメインを含む。別の態様では、免疫グロブリンドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。別の態様では、Ｎ’末端およびＣ’末端の一方または両方が、１つまたは複数の追加のポリペプチドと融合されている。別の態様では、追加のポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、サイトカイン、共刺激分子、または他のポリペプチドドメインを含む。別の態様では、追加のポリペプチドドメインは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン、もしくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリンと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、もしくはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せを含む；またはＴＣＲ分子：ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４、もしくはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ、のうちの１つまたは複数を含む。別の態様において、リンカーは、ポリペプチドリンカーまたは化学リンカーを含む。別の態様では、使用される場合、リンカーは、ポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ポリグリシン－アラニンリンカー、ポリグリシン－セリンリンカー、またはポリグリシン－セリン－プロリンリンカーのうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドを含む。別の態様では、リンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数に８５％～９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。別の態様では、リンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドである。別の態様では、切断が起こるループ領域は、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、もしくはＦ－Ｇ、または１つもしくは複数の介在性βストランドを除去する他のループ連結のうちの１つまたは複数を含む。別の態様では、切断が起こるループ領域は、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、またはＦ－Ｇのうちの１つまたは複数以上を含む。別の態様では、ループ領域はＣ’－Ｃ’’ループを含む。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３と８５％～９９％の同一性を有する。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３から選択される。
本明細書に記載の一実施形態は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが、野生型Ｎ末端およびＣ末端の融合またはそれらを連結する任意選択のリンカーと、新規Ｎ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断とを含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、ヌクレオチド配列である。一態様では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＭＨＣ分子、または他の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質由来の免疫グロブリンドメインを含む。別の態様では、免疫グロブリンドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。別の態様では、Ｎ’末端およびＣ’末端の一方または両方が、１つまたは複数の追加のポリペプチドと融合されている。別の態様では、追加のポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、サイトカイン、共刺激分子、または他のポリペプチドドメインを含む。別の態様では、追加のポリペプチドドメインは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン、もしくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリンと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、もしくはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せを含む；またはＴＣＲ分子：ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４、もしくはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ、のうちの１つまたは複数を含む。別の態様において、リンカーは、ポリペプチドリンカーまたは化学リンカーを含む。別の態様では、使用される場合、リンカーは、ポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ポリグリシン－アラニンリンカー、ポリグリシン－セリンリンカー、またはポリグリシン－セリン－プロリンリンカーのうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドを含む。別の態様では、リンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数に８５％～９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。別の態様では、リンカーは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドである。別の態様では、切断が起こるループ領域は、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、もしくはＦ－Ｇ、または１つもしくは複数の介在性βストランドを除去する他のループ連結のうちの１つまたは複数を含む。別の態様では、切断が起こるループ領域は、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、またはＦ－Ｇのうちの１つまたは複数以上を含む。別の態様では、ループ領域はＣ’－Ｃ’’ループを含む。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３と８５％～９９％の同一性を有する。別の態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３から選択される。
【0045】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。
【0046】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の１つもしくは複数のヌクレオチド配列または本明細書に記載のポリヌクレオチドベクターを含む細胞である。
【0047】
別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドである。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４と８５％～９９％の同一性を有する。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４から選択される。
【0048】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数、または本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する方法であって、本明細書に記載の核酸配列を含む核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量の本明細書に記載のヌクレオチド配列を単離するステップと；本明細書に記載の核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導するステップと；本明細書に記載の核酸配列によってコードされているポリペプチドを単離するステップと、を含む方法である。
【0049】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数、または本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する手段であって、本明細書に記載の核酸配列を含む核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量の本明細書に記載のヌクレオチド配列を単離するステップと；本明細書に記載の核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導するステップと；本明細書に記載の核酸配列によってコードされているポリペプチドを単離するステップと、を含む手段である。
【0050】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の方法または手段によって生成されるヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドである。
【0051】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法である。
【0052】
本明細書に記載の別の実施形態は、ヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患または障害を処置するための、本明細書に記載のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数によってコードされているポリペプチドの有効量の使用である。
【0053】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む研究ツールである。
【0054】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む免疫化学試薬である。
【0055】
本明細書に記載のポリヌクレオチドには、１つまたは複数のヌクレオチドが関与し得る置換、欠失、および／または付加を有するバリアントが含まれる。バリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方において改変され得る。コード領域における改変は、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸の置換、欠失、または付加を生じさせることができる。これらのうちで特に好ましいのは、結合の特性および活性を変えない、サイレントな置換、付加、および欠失である。
【0056】
本明細書に記載のさらなる実施形態には、（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、またはその縮重バリアント、相同バリアント、もしくはコドン最適化バリアント；（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、またはその縮重バリアント、相同バリアント、もしくはコドン最適化バリアント；（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかの相補体にハイブリダイズすることができ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のアミノ酸配列の機能性ポリペプチドを発現することができるヌクレオチド配列、と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、より好ましくは少なくとも約９０～９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子が含まれる。
【0057】
ＡｌｔＩｇをコードする基準ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９０～９９％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がＡｌｔＩｇをコードする基準ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大約１０点～１点の変異、付加または欠失を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一であることを意図する。
【0058】
言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも約９０～９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、基準配列中の最大１０％のヌクレオチドが欠失され得るか、別のヌクレオチドにより付加され得るか、置換され得るか、または基準配列中の全ヌクレオチドの最大１０％の数のヌクレオチドが基準配列に挿入され得る。基準配列のこれらの変異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で起こり得るか、あるいは基準配列内または基準配列内の１つもしくは複数の連続した基内のヌクレオチド間に個別に散在される、これらの末端位置の間の任意の場所で起こり得る。同様のことが、基準ポリペプチド配列と少なくとも約９０～９９％同一であるポリペプチド配列にも適用され得る。
【0059】
上記の場合、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。同様に２つ以上のアミノ酸配列も、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとペプチド配列であろうと、一般に、２つのアラインされた配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで割って１００を掛けたものとして説明される。核酸配列に関する近似アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９頁（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、増補版５ ３：３５３～３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５～６７６３頁（１９８６）によって正規化された、スコアリングマトリックスを使用し、ペプチド配列を用いて使用するために拡張することができる。核酸配列およびペプチド配列に関するこのアルゴリズムの実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（マディソン、ウィスコンシン州）によって、ＢＥＳＴＦＩＴユーティリティ・アプリケーションで提供されている。
【0060】
例えば、遺伝子コードの縮重により、当業者には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３で示した核酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子、またはその縮重バリアント、相同バリアント、またはコドン最適化バリアントがＡｌｔＩｇをコードすることが理解されよう。
【0061】
本明細書に記載のポリヌクレオチドには、本明細書に記載のポリペプチドの変異、変種、置換、付加、欠失、および特定の例をコードするものが含まれる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、”Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６～１３１０頁（１９９０）において提供されており、著者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど許容度があることを示唆している。
【0062】
したがって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２のポリペプチドの断片、誘導体、または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基、またはそれ以上）が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されている。このような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされているもの、あるいは（ｉｉ）アミノ酸残基の１つまたは複数が置換基（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０残基またはそれ以上）を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別のポリペプチドまたは化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）追加のアミノ酸が成熟ポリペプチド、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列に融合されているもの、であってもよいし、そうでなくてもよい。そのような断片、誘導体、および類似体は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあるものとみなされる。
【0063】
さらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２のポリペプチドの断片、誘導体、または類似体は、１つまたは複数の保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換され得る。一部の事例では、これらのポリペプチド、その断片、誘導体、または類似体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２に示したポリペプチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を有し、機能性タンパク質または非機能性タンパク質または酵素を含む。同様に、ポリペプチドへの付加または欠失は、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端で、または非保存領域内で行われ得る（発光的に保存されていないので、重要ではないと想定される）。
【0064】
本明細書に記載されているように、多くの場合、アミノ酸の置換、変異、付加、または欠失は、好ましくは、タンパク質の折り畳みもしくは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換、またはＮ末端もしくはＣ末端への付加もしくは欠失などのマイナーな性質のものである。もちろん、当業者が行うであろうアミノ酸の置換、付加、または欠失の数は、本明細書に記載されているものを含めた多くの要因に依存する。一般的に、任意の所与のポリペプチドの置換、付加または欠失の数は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、５、６、４、３、２または１を超えない。
【0065】
本明細書に記載の組成物、製剤、方法、プロセス、および用途に対する適切な改変および適応が、それらのいずれかの実施形態または態様の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明らかであろう。提供される組成物および方法は例示的なものであり、特定の実施形態のいずれかの範囲を限定することを意図してはいない。本明細書に開示されているすべての様々な実施形態、態様、および選択肢は、任意の変形または繰返しで組み合わせることができる。本明細書に記載の組成物、製剤、方法、およびプロセスの範囲には、本明細書に記載の実施形態、態様、選択肢、例、および優先性のすべての実際的または潜在的な組合せが含まれる。本明細書に記載の組成物、製剤、または方法は、本明細書に開示の任意の構成要素またはステップを省略することができ、本明細書に開示の任意の構成要素またはステップを置き換えることができ、または本明細書の他の箇所に開示された任意の構成要素またはステップを含んでいてもよい。本明細書に開示の組成物または製剤のいずれかの任意の成分の質量の、製剤中のいずれかの他の成分の質量に対する比、または製剤中の他の成分の総質量に対する比は、あたかも明示的に開示されているかのように本明細書により開示される。参照により組み込まれる特許または刊行物のいずれかにおけるいずれかの用語の意味が本開示で使用されている用語の意味と矛盾する場合、本開示の用語または語句の意味が優先される。さらに、本明細書は単に例示的な実施形態を開示および説明している。本明細書で引用されているすべての特許および刊行物は、それらの特定の教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【0066】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態および態様は、以下の項目によって要約される：
条項１．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが、野生型のＮ末端およびＣ末端の融合または野生型のＮ末端とＣ末端とを連結する任意選択のリンカーと、新規のＮ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断とを含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、ヌクレオチド配列。
条項１．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが、野生型のＮ末端およびＣ末端の融合または野生型のＮ末端とＣ末端とを連結する任意選択のリンカーと、新規のＮ’末端およびＣ’末端が得られるループ領域のうちの１つの内部での切断とを含む１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含む、ヌクレオチド配列。
【0067】
条項２．免疫グロブリンドメインが、免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＭＨＣ分子、または他の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質由来の免疫グロブリンドメインを含む、条項１に記載のヌクレオチド配列。
【0068】
条項３．免疫グロブリンドメインが重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む、条項１または２に記載のヌクレオチド配列。
【0069】
条項４．Ｎ’末端およびＣ’末端の一方または両方が、１つまたは複数の追加のポリペプチドと融合されている、条項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0070】
条項５．追加のポリペプチドが、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦＶ、細胞受容体、ｐＭＨＣ、共刺激分子、サイトカイン、または別のポリペプチドドメインを含む、条項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0071】
条項６．追加のポリペプチドが免疫グロブリンヒンジ領域を含む、条項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0072】
条項７．追加のポリペプチドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリン、もしくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５８、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－４、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１ヘテロ二量体、カルレティキュリンと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；サイトカイン：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、もしくはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ；ＭＨＣ対立遺伝子：ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β２－ミクログロブリン、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβ、もしくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ｂ１、Ｈ２－Ｋ１、Ｈ２－ＥＢβ、Ｈ２－ＥＫα、Ｈ２－ＥＫβと少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せを含む；またはＴＣＲ分子：ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４、もしくはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＴＣＲＡ、ＴＣＢ１、ＴＣＢ２、ＴＣＣ１、ＴＣＣ２、ＴＣＣ３、ＴＣＣ４と少なくとも９０％同一であるペプチド、それらの断片、もしくはそれらの組合せ、のうちの１つまたは複数を含む、条項１～４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0073】
条項８．リンカーがポリペプチドリンカーまたは化学リンカーを含む、条項１～７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0074】
条項９．リンカーが、ポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ポリグリシン－アラニンリンカー、ポリグリシン－セリンリンカー、またはポリグリシン－セリン－プロリンリンカーのうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドを含む、条項１～８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0075】
条項１０．リンカーが、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数と８５％～９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、条項１～９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0076】
条項１１．リンカーが、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のうちの１つまたは複数から選択されるポリペプチドである、条項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0077】
条項１２．ループ領域が、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、Ｆ－Ｇ、または１つもしくは複数の介在性βストランンドを除去する他のループ連結を含む隣接するβストランンドを接続するループのうちの１つもしくは複数を含む、条項１～１１のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0078】
条項１３．ループ領域が、免疫グロブリンβシートループＡ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ｃ’、Ｃ’－Ｃ’’、Ｃ－Ｄ、Ｃ’－Ｄ、Ｃ’’－Ｄ、Ｄ－Ｅ、Ｅ－Ｆ、またはＦ－Ｇのうちの１つまたは複数を含む、条項１～１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0079】
条項１４．ループ領域がＣ－Ｃ’またはＡ－Ｂループを含む、条項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0080】
条項１５．ヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３と８５％～９９％の同一性を有する、条項１～１４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0081】
条項１６．ヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３から選択される、条項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【0082】
条項１７．条項１～１６のいずれか一項に記載の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクター。
【0083】
条項１８．条項１に記載の１つもしくは複数のヌクレオチド配列または条項１７に記載のポリヌクレオチドベクターを含む細胞。
【0084】
条項１９．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【0085】
条項２０．ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４と８５％～９９％の同一性を有する、条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【0086】
条項２１．ポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４から選択される、条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【0087】
条項２２．１つまたは複数のジスルフィド結合を介して共有結合されている配列番号３２または３４のポリペプチドの二量体を含む二価ポリペプチド複合体。
【0088】
条項２３．配列番号３４を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ポリペプチド。
【0089】
条項２４．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する方法であって、核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量のヌクレオチド配列を単離するステップと；ポリペプチドの発現を誘導するステップと；ポリペプチドを単離するステップと、を含む方法。
【0090】
条項２５．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを製造する手段であって、核酸で細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップと；細胞を増殖させるステップと；任意選択で、追加量のヌクレオチド配列を単離するステップと；ポリペプチドの発現を誘導するステップと；ポリペプチドを単離するステップと、を含む手段。
【0091】
条項２６．条項２１に記載の方法または条項２２に記載の手段によって生成される、条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、または条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。
【0092】
条項２７．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法。
【0093】
条項２８．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む疾患または障害を処置するための、前記ポリペプチドの有効量の使用。
【0094】
条項２９．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む研究ツール。
【0095】
条項３０．条項１～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む免疫化学試薬。
【実施例】
【0096】
実施例１
ＡｌｔＩｇおよびＢＭｉＭＳ構築物
ＡｌｔＩｇおよびＢＭｉＭＳ構築物は、標準的な分子生物学技術を使用して生成した。抗ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体Ｂ４３の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）Ｆｖ断片のＡｌｔＩｇバージョンをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をＩＤＴから購入し、ｐＵＣ１８（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にクローニングし、配列決定し（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭＳＣＶベースのレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。ＢＭｉＭＳについては、ＡｌｔＩｇとインフレームでクローニングし、所望のＢＭｉＭＳをコードするのに適切なリンカーをコードするプライマーを用いて、ＡｌｔＩｇに対する融合パートナー（例えば、ｍＭＨＣＩＩ、ｍＣＤ８０、ｍＣＤ８６、およびｍＩＣＡＭ－１）をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）をｐＵＣ１８（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にクローニングし、配列決定し（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、次いで、ＭＳＣＶベースのレトロウイルス発現ベクターに所望のＡｌｔＩｇ遺伝子とサブクローニングした。
ＡｌｔＩｇおよびＢＭｉＭＳ構築物
ＡｌｔＩｇおよびＢＭｉＭＳ構築物は、標準的な分子生物学技術を使用して生成した。抗ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体Ｂ４３の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）Ｆｖ断片のＡｌｔＩｇバージョンをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をＩＤＴから購入し、ｐＵＣ１８（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にクローニングし、配列決定し（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭＳＣＶベースのレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。ＢＭｉＭＳについては、ＡｌｔＩｇとインフレームでクローニングし、所望のＢＭｉＭＳをコードするのに適切なリンカーをコードするプライマーを用いて、ＡｌｔＩｇに対する融合パートナー（例えば、ｍＭＨＣＩＩ、ｍＣＤ８０、ｍＣＤ８６、およびｍＩＣＡＭ－１）をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）をｐＵＣ１８（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にクローニングし、配列決定し（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、次いで、ＭＳＣＶベースのレトロウイルス発現ベクターに所望のＡｌｔＩｇ遺伝子とサブクローニングした。
【0097】
構築物ならびにそれらのヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列およびアミノ酸配列を示す。小文字は、ポリペプチド配列中の挿入されたヌクレオチドまたはリンカー領域を示す。
【0098】
ｍＡｂＢ４３Ｆｖ・ＨＣ・Ａｌｔｌｇ 配列番号１；５９７ＮＴ
【0099】
【化1】
【0100】
配列番号２；１９７ＡＡ
【0101】
【化2】
【0102】
ｍＡｂＢ４３Ｆｖ・ＬＣ・ＡｌｔＩｇ 配列番号３；５７０ＮＴ
【0103】
【化3】
【0104】
配列番号４；１８８ＡＡ
【0105】
【化4】
【0106】
ｓＣＤ８０－ｈＣＤ１９ＬＣＦｖ融合 配列番号５；１２０３ＮＴ
【0107】
【化5】
【0108】
配列番号６；３９２ＡＡ
【0109】
【化6】
【0110】
ｓＣＤ８０－ｈＣＤ１９ＨＣＦｖ融合 配列番号７；１２３３ＮＴ
【0111】
【化7】
【0112】
配列番号８；４０２ＡＡ
【0113】
【化8】
【0114】
ｓＣＤ８６－ｈＣＤ１９ＨＣＦｖ融合 配列番号９；１２２７ＮＴ
【0115】
【化9】
【0116】
配列番号１０；４００ＡＡ
【0117】
【化10】
【0118】
ｓＩＣＡＭ１－ｈＣＤ１９ＨＣＦｖ融合 配列番号１１；１９５３ＮＴ
【0119】
【化11】
【0120】
配列番号１２；６４２ＡＡ
【0121】
【化12】
【0122】
ｓｌＥｋα（ＭＨＣＩＩα）酸ジッパー－ｈＣＤ１９ＬＣＦｖ融合 配列番号１３；１２５４ＮＴ
【0123】
【化13】
【0124】
配列番号１４；４０９ＡＡ
【0125】
【化14】
【0126】
ｓｌＥｋβ（ＭＨＣＩＩβ）塩基ジッパー－ｈＣＤ１９ＨＣＦｖ融合 配列番号１５；１４５３ＮＴ
【0127】
【化15】
【0128】
配列番号１６；４６７ＡＡ
【0129】
【化16】
【0130】
ｍＡｂＢ４３ＦＶ－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ＨＣ ＡｌｔＩｇ 配列番号１７；６１８ＮＴ
【0131】
【化17】
【0132】
配列番号１８；１９７ＡＡ
【0133】
【化18】
【0134】
ｍＡｂＢ４３ＦＶ－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ＬＣ ＡｌｔＩｇ 配列番号１９；５９４ＮＴ
【0135】
【化19】
【0136】
配列番号２０；１９０ＡＡ
【0137】
【化20】
【0138】
ｓＣＤ８０－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ 配列番号２１；１２３３ＮＴ
【0139】
【化21】
【0140】
配列番号２２；４０３ＡＡ
【0141】
【化22】
【0142】
ｓＣＤ８０－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ＬＣ ＡｌｔＩｇ 配列番号２３；１２０６ＮＴ
【0143】
【化23】
【0144】
配列番号２４；３９４ＡＡ
【0145】
【化24】
【0146】
ｓＣＤ８６－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ＨＣ ＡｌｔＩｇ 配列番号２５；１２２７ＮＴ
【0147】
【化25】
【0148】
配列番号２６；４０１ＡＡ
【0149】
【化26】
【0150】
ｓＣＤ８６－ＡＢループオープンｈＣＤ１９ＬＣ Ａｌｔｌｇ 配列番号２７；１２００ＮＴ
【0151】
【化27】
【0152】
配列番号２８；３９２ＡＡ
【0153】
【化28】
【0154】
ポリペプチドリンカー配列
ポリペプチドリンカーを使用して、免疫グロブリンドメインのＮ末端とＣ末端を連結させ、新しいＮ’末端とＣ’末端に結合された融合タンパク質を連結させることができる。Ｎ末端とＣ末端を連結するリンカーは、約１５～約３０個のアミノ酸残基を含み得る。典型的には、リンカーは、約２０～３０個のアミノ酸残基（例えば、１８～３２個）であり、ポリグリシン、ポリアラニン、またはポリグリシン－セリンリンカー（例えば、配列番号３５～４７）を含む。３～６個のアミノ酸残基の内部リンカーを、融合ドメイン（例えば、配列番号４８～５２）の間で使用することができる。例示的なリンカーヌクレオチドおよびポリペプチド配列を以下に示す：
配列番号３５；６０ ＮＴ
ポリペプチドリンカーを使用して、免疫グロブリンドメインのＮ末端とＣ末端を連結させ、新しいＮ’末端とＣ’末端に結合された融合タンパク質を連結させることができる。Ｎ末端とＣ末端を連結するリンカーは、約１５～約３０個のアミノ酸残基を含み得る。典型的には、リンカーは、約２０～３０個のアミノ酸残基（例えば、１８～３２個）であり、ポリグリシン、ポリアラニン、またはポリグリシン－セリンリンカー（例えば、配列番号３５～４７）を含む。３～６個のアミノ酸残基の内部リンカーを、融合ドメイン（例えば、配列番号４８～５２）の間で使用することができる。例示的なリンカーヌクレオチドおよびポリペプチド配列を以下に示す：
配列番号３５；６０ ＮＴ
【0155】
【化29】
【0156】
配列番号３６；２０ ＡＡ
【0157】
【化30】
【0158】
配列番号３７；５７ ＮＴ
【0159】
【化31】
【0160】
配列番号３８；１９ ＡＡ
【0161】
【化32】
【0162】
配列番号３９；７５ ＮＴ
【0163】
【化33】
【0164】
配列番号４０；２５ ＡＡ
【0165】
【化34】
【0166】
配列番号４１；７２ ＮＴ
【0167】
【化35】
【0168】
配列番号４２；２４ ＡＡ
【0169】
【化36】
【0170】
配列番号４３；９０ ＮＴ
【0171】
【化37】
【0172】
配列番号４４；３０ ＡＡ
【0173】
【化38】
【0174】
配列番号４５；８７ ＮＴ
【0175】
【化39】
【0176】
配列番号４６；２９ ＡＡ
【0177】
【化40】
【0178】
配列番号４７；１８ ＮＴ
【0179】
【化41】
【0180】
配列番号４８；６ ＡＡ
【0181】
【化42】
【0182】
配列番号４９；１５ ＮＴ
【0183】
【化43】
【0184】
配列番号５０；５ ＡＡ
【0185】
【化44】
【0186】
配列番号５１；９ ＮＴ
【0187】
【化45】
【0188】
配列番号５２；３ ＡＡ
【0189】
【化46】
【0190】
配列番号５３；１２ ＮＴ
【0191】
【化47】
【0192】
配列番号５４；４ ＡＡ
【0193】
【化48】
【0194】
配列番号５５；１８ ＮＴ
【0195】
【化49】
【0196】
配列番号５６；６ ＡＡ
【0197】
【化50】
【0198】
配列番号５７；２４ ＮＴ
【0199】
【化51】
【0200】
配列番号５８；８ ＡＡ
【0201】
【化52】
【0202】
ｍＭＨＣＩＩ・抗ｈＣＤ１９ ＢＭｉＭＳ
マウスＭＨＣＩＩ Ｉ－Ｅｋで提示されるガのシトクロムＣペプチド８８－９３（ＭＣＣ）（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋ）を利用した。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣに融合されたＭＨＣＩＩａ（Ｉ－Ｅｋａ）をコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたＭＨＣＩＩｂ（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋｂ）をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ［１］）にサブクローニングした。
マウスＭＨＣＩＩ Ｉ－Ｅｋで提示されるガのシトクロムＣペプチド８８－９３（ＭＣＣ）（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋ）を利用した。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣに融合されたＭＨＣＩＩａ（Ｉ－Ｅｋａ）をコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたＭＨＣＩＩｂ（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋｂ）をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ［１］）にサブクローニングした。
【0203】
ｍＣＤ８０・抗ｈＣＤ１９ ＢＭｉＭＳ（ＣＤ８０はホモ二量体であることに注意されたい）
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたｍＣＤ８０をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣに融合されたｍＣＤ８０をコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ［１］）にサブクローニングした。
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたｍＣＤ８０をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣに融合されたｍＣＤ８０をコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ［１］）にサブクローニングした。
【0204】
ｍＣＤ８６・抗ｈＣＤ１９ ＢＭｉＭＳ（ＣＤ８６は単量体であることに注意されたい）
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣをコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたｍＣＤ８６をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（１））にサブクローニングした。
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣをコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたｍＣＤ８６をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（１））にサブクローニングした。
【0205】
ｍＩＣＡＭ－１・抗ｈＣＤ１９ ＢＭｉＭＳ（ＩＣＡＭ－１は単量体であることに注意されたい）。
【0206】
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣをコードする遺伝子を、「ｐＺ４」ゼオシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｚｅｏ耐性［１］）にサブクローニングした。抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＨＣに融合されたｍＩＣＡＭ－１をコードする遺伝子を、「ｐＰ２」ピューロマイシン耐性ＭＳＣＶベクター（ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（１））にサブクローニングした。
【0207】
実施例２
レトロウイルス形質導入
Ｍ１２ Ｂ細胞リンパ腫細胞株を以前に開示されているように生成した［２］。簡単に説明すると、それぞれの構築物について、１．３×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘ Ｅパッケージング細胞を完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に播種し、６ｃｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）中で一晩３７℃にて培養した。培地を交換し、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を製造業者の指示に従って使用し、細胞に１．５μｇの所望のレトロウイルス構築物をトランスフェクトした。培地を２４時間後に交換し、細胞を３２℃にシフトした。次いで、ウイルス上清を４８時間および７２時間で回収した。次いで、細胞株を作製するために使用したすべての構築物（例えば、ＡｌｔＩｇ ＬＣ＋ＡｌｔＩｇ ＨＣ）の上清をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １００ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して２５０μＬに濃縮した。次いで、１×１０６個の親Ｍ１２細胞を、４μｇ／ｍＬのポリブレン＋ウイルス上清を入れた１２ウェルプレートの１つのウェル内の２ｍＬ完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）に播種し、２時間３２℃で、Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ遠心分離機（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中２７００ｒｐｍにて回転した。培地をスピン感染直後に交換し、細胞を３７℃で一晩培養した後、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）および１００μｇ／ｍＬのゼオシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）で選択し、必要な場合には分割して薄く保ち、重い選択下においた。維持のために選択の５～７日後に薬物濃度を５μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび５０μｇ／ｍＬゼオシンまで下げた。
レトロウイルス形質導入
Ｍ１２ Ｂ細胞リンパ腫細胞株を以前に開示されているように生成した［２］。簡単に説明すると、それぞれの構築物について、１．３×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘ Ｅパッケージング細胞を完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に播種し、６ｃｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）中で一晩３７℃にて培養した。培地を交換し、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を製造業者の指示に従って使用し、細胞に１．５μｇの所望のレトロウイルス構築物をトランスフェクトした。培地を２４時間後に交換し、細胞を３２℃にシフトした。次いで、ウイルス上清を４８時間および７２時間で回収した。次いで、細胞株を作製するために使用したすべての構築物（例えば、ＡｌｔＩｇ ＬＣ＋ＡｌｔＩｇ ＨＣ）の上清をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １００ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して２５０μＬに濃縮した。次いで、１×１０６個の親Ｍ１２細胞を、４μｇ／ｍＬのポリブレン＋ウイルス上清を入れた１２ウェルプレートの１つのウェル内の２ｍＬ完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）に播種し、２時間３２℃で、Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ遠心分離機（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中２７００ｒｐｍにて回転した。培地をスピン感染直後に交換し、細胞を３７℃で一晩培養した後、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）および１００μｇ／ｍＬのゼオシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ社）で選択し、必要な場合には分割して薄く保ち、重い選択下においた。維持のために選択の５～７日後に薬物濃度を５μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび５０μｇ／ｍＬゼオシンまで下げた。
【0208】
実施例３
オープン型Ｃ－Ｃ’ループを持つＡｌｔＩｇのフロー式フルオロフォア結合免疫吸着アッセイ（ＦＦＬＩＳＡ）
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析のため上清を回収した。６．０μｍのストレプトアビジンでコートしたポリスチレンマイクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をビオチン化抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（クローンＨＩＳ．Ｈ８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でさらにコートし、洗浄し、培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）中で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４コンジュゲート抗マウスＭｙｃタグ（クローン９Ｅ１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８コンジュゲート抗マウスＨＡタグ（クローン１６Ｂ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７コンジュゲート抗マウス抗－Ｉ－Ｅｋ（クローン１４－４－４ｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、または抗ｍｌＣＡＭ－１（クローンＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でプローブ化し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図６および図７Ｂに示す。
オープン型Ｃ－Ｃ’ループを持つＡｌｔＩｇのフロー式フルオロフォア結合免疫吸着アッセイ（ＦＦＬＩＳＡ）
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析のため上清を回収した。６．０μｍのストレプトアビジンでコートしたポリスチレンマイクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をビオチン化抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（クローンＨＩＳ．Ｈ８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でさらにコートし、洗浄し、培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）中で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４コンジュゲート抗マウスＭｙｃタグ（クローン９Ｅ１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８コンジュゲート抗マウスＨＡタグ（クローン１６Ｂ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７コンジュゲート抗マウス抗－Ｉ－Ｅｋ（クローン１４－４－４ｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、または抗ｍｌＣＡＭ－１（クローンＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でプローブ化し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図６および図７Ｂに示す。
【0209】
実施例４
ＢＭｉＭＳによるＲａｍｏｓ細胞染色
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析するために上述のように上清を回収した。Ｒａｍｏｓ細胞を回収し、洗浄し、１×１０６個を培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をＰＥコンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（クローンＭ５／１４．１５．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）または抗ｍＩＣＡＭ－１（クローンＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図８に示す。
ＢＭｉＭＳによるＲａｍｏｓ細胞染色
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析するために上述のように上清を回収した。Ｒａｍｏｓ細胞を回収し、洗浄し、１×１０６個を培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をＰＥコンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（クローンＭ５／１４．１５．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）または抗ｍＩＣＡＭ－１（クローンＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図８に示す。
【0210】
実施例５
ＢＭｉＭＳによるナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の刺激
ＢＭｉＭＳがｈｕＣＤ１９に結合し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することができるかどうかについて判定するために実験を計画した。図９Ａを参照されたい。ｐＭＨＣＩＩベースのＢＭｉＭＳは、５ｃ．ｃ７ ＴＣＲによって認識されるＩ－Ｅｋ（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋ）に可撓性リンカーでつながれたガのシトクロムｃ８８－９３ペプチド（ＭＣＣ）を用いて作製した。パイロット実験については、９６ウェルプレートのウェルを４μｇ／ｍｌの組換えｈｕＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）でコートした。ウェルを洗浄し、次いで、ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳ、ＣＤ８０－ＢＭｉＭＳ、またはその両方を発現する細胞からの濃縮した上清とインキュベートした。次いで、５ｃ．ｃ７ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＲａｇＫＯ社）由来のナイーブ５ｃ．ｃ７＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をウェルで１８時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２を測定するため上清を回収した。ＩＬ－２は、ｈｕＣＤ１９のみ、またはｈｕＣＤ１９＋ＣＤ８０ ＢＭｉＭＳを入れたウェル内で培養した細胞により産生されることはなかった。ＩＬ－２は、ｈｕＣＤ１９＋ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳを入れたウェル内で培養されたＴ細胞により産生され、より高レベルのＩＬ－２が、ｈｕＣＤ１９＋ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳ＋ＣＤ８０－ＢＭｉＭＳでコートされたウェル内で培養されたＴ細胞により産生された。これらのデータは、ＣＤ１９に結合されたＢＭｉＭＳがＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することができるという証拠を提供するものである。図９Ｂを参照されたい。
ＢＭｉＭＳによるナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の刺激
ＢＭｉＭＳがｈｕＣＤ１９に結合し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することができるかどうかについて判定するために実験を計画した。図９Ａを参照されたい。ｐＭＨＣＩＩベースのＢＭｉＭＳは、５ｃ．ｃ７ ＴＣＲによって認識されるＩ－Ｅｋ（ＭＣＣ：Ｉ－Ｅｋ）に可撓性リンカーでつながれたガのシトクロムｃ８８－９３ペプチド（ＭＣＣ）を用いて作製した。パイロット実験については、９６ウェルプレートのウェルを４μｇ／ｍｌの組換えｈｕＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）でコートした。ウェルを洗浄し、次いで、ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳ、ＣＤ８０－ＢＭｉＭＳ、またはその両方を発現する細胞からの濃縮した上清とインキュベートした。次いで、５ｃ．ｃ７ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＲａｇＫＯ社）由来のナイーブ５ｃ．ｃ７＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をウェルで１８時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２を測定するため上清を回収した。ＩＬ－２は、ｈｕＣＤ１９のみ、またはｈｕＣＤ１９＋ＣＤ８０ ＢＭｉＭＳを入れたウェル内で培養した細胞により産生されることはなかった。ＩＬ－２は、ｈｕＣＤ１９＋ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳを入れたウェル内で培養されたＴ細胞により産生され、より高レベルのＩＬ－２が、ｈｕＣＤ１９＋ｐＭＨＣＩＩ－ＢＭｉＭＳ＋ＣＤ８０－ＢＭｉＭＳでコートされたウェル内で培養されたＴ細胞により産生された。これらのデータは、ＣＤ１９に結合されたＢＭｉＭＳがＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することができるという証拠を提供するものである。図９Ｂを参照されたい。
【0211】
実施例６
オープン型Ａ－Ｂループを持つＡｌｔＩｇのＦＦＬＩＳＡ
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析のために上清を回収した。６．０μｍのストレプトアビジンでコートしたポリスチレンマイクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をビオチン化抗Ｈｉｓタグ抗体（クローンＨＩＳ．Ｈ８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でさらにコートし、洗浄し、培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４コンジュゲート抗マウスＭｙｃタグ（クローン９Ｅ１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８コンジュゲート抗マウスＨＡタグ（クローン１６Ｂ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、またはＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）でプローブ化し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図１１に示す。
オープン型Ａ－Ｂループを持つＡｌｔＩｇのＦＦＬＩＳＡ
Ｍ１２細胞を完全ＲＰＭＩ（５％ＦＣＳ）中で集密度（１～２×１０６細胞／ｍＬ）まで培養し、分析のために上清を回収した。６．０μｍのストレプトアビジンでコートしたポリスチレンマイクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をビオチン化抗Ｈｉｓタグ抗体（クローンＨＩＳ．Ｈ８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でさらにコートし、洗浄し、培地（陰性対照）または０．２５０ｍＬの濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で５０ｍＬから０．２５０ｍＬまで濃縮）Ｍ１２細胞培養上清と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４コンジュゲート抗マウスＭｙｃタグ（クローン９Ｅ１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８コンジュゲート抗マウスＨＡタグ（クローン１６Ｂ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８０（クローン１６－１０Ａ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、またはＰＥコンジュゲート抗ｍＣＤ８６（クローンＧＬ－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）でプローブ化し、フローサイトメトリー［３］により分析した。結果を図１１に示す。
【0212】
実施例７
ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖおよび二価ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖ
ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖおよび二価ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖｓの構築物を、標準的な分子生物学技術を使用して生成する。図１３～図１４は、ＡｌｔＩｇをどのように使用してｓｃＦｖまたは二価ＡｌｔＩｇ－ＳｃＦｖを構築することができるかを示す。例えば、抗体（例えば、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ２ａ）のヒンジ領域は、任意選択のリンカーでＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖに融合させることができる。ヒンジ領域のシステインはジスルフィド結合を形成することが可能であり、新規の二価分子を生成することができる。これを目的の他の分子（例えば、ｐＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１）に融合することにより、二価のＢＭｉＭＳを作製することができる。
ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖおよび二価ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖ
ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖおよび二価ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖｓの構築物を、標準的な分子生物学技術を使用して生成する。図１３～図１４は、ＡｌｔＩｇをどのように使用してｓｃＦｖまたは二価ＡｌｔＩｇ－ＳｃＦｖを構築することができるかを示す。例えば、抗体（例えば、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ２ａ）のヒンジ領域は、任意選択のリンカーでＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖに融合させることができる。ヒンジ領域のシステインはジスルフィド結合を形成することが可能であり、新規の二価分子を生成することができる。これを目的の他の分子（例えば、ｐＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１）に融合することにより、二価のＢＭｉＭＳを作製することができる。
【0213】
例示的な構築物およびそれらのヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列およびアミノ酸配列を示す。小文字は、ポリペプチド配列中の挿入されたヌクレオチドまたはリンカー領域を示す。
【0214】
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖ．Ｉｇヒンジ 配列番号２９；９６３ＮＴ
【0215】
【化53】
【0216】
配列番号３０、３１３ＡＡ
【0217】
【化54】
【0218】
ｓＣＤ８０－Ｉｇヒンジ．ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ ＬＣＨＣ 配列番号３１；１７１３ＮＴ
【0219】
【化55】
【0220】
配列番号３２、５６３ＡＡ
【0221】
【化56】
【0222】
抗ｈＣＤ１９ ＡｌｔＩｇ－ｓｃＦｖ 配列番号３３；８８８ＮＴ
【0223】
【化57】
【0224】
配列番号３４；２８８ＡＡ
【0225】
【化58】
【0226】
参考文献
1. Kuhns and Davis, “Disruption of extracellular interactions impairs T cell receptor-CD3 complex stability and signaling,” Immunity 26: 357-369 (2007).
2. Lee et al., “A Mechanical Switch Couples T Cell Receptor Triggering to the Cytoplasmic Juxtamembrane Regions of CD3zetazeta,” Immunity 43:L 227-239 (2015).
3. Glassman et al., “The CD4 and CD3deltaepsilon Cytosolic Juxtamembrane Regions Are Proximal within a Compact TCR-CD3-pMHC-CD4 Macrocomplex,” J. Immunol. 196: 4713-4722 (2016).
1. Kuhns and Davis, “Disruption of extracellular interactions impairs T cell receptor-CD3 complex stability and signaling,” Immunity 26: 357-369 (2007).
2. Lee et al., “A Mechanical Switch Couples T Cell Receptor Triggering to the Cytoplasmic Juxtamembrane Regions of CD3zetazeta,” Immunity 43:L 227-239 (2015).
3. Glassman et al., “The CD4 and CD3deltaepsilon Cytosolic Juxtamembrane Regions Are Proximal within a Compact TCR-CD3-pMHC-CD4 Macrocomplex,” J. Immunol. 196: 4713-4722 (2016).
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】