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特表2023-536143ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、並びに関連の組成物、用途及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-23
(54)【発明の名称】ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、並びに関連の組成物、用途及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/715 20060101AFI20230816BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230816BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/545 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/535 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/57 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/495 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/525 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/515 20060101ALI20230816BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230816BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230816BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230816BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230816BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/19 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230816BHJP
【ＦＩ】
C07K14/715
C07K19/00 ZNA
C07K16/00
C07K14/52
C07K14/545
C07K14/55
C07K14/54
C07K14/535
C07K14/57
C07K14/495
C07K14/525
C07K14/515
A61K38/20
A61K39/395 V
A61P37/02
A61P35/00
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/19
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023506124
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(85)【翻訳文提出日】2023-03-24
(86)【国際出願番号】 KR2021009835
(87)【国際公開番号】W WO2022025643
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】10-2020-0094232
(32)【優先日】2020-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513243723
【氏名又は名称】メディトックス インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チェ， ウンシク
(72)【発明者】
【氏名】パク， ヒョンギュ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084DA12
4C084NA14
4C084ZB07
4C084ZB26
4C085AA33
4C085BB31
4C085CC22
4C085EE03
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA51
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
精製が迅速簡便であって効率的であるだけではなく、増大されたＦｃＲｎ結合能や、増大されたＦｃγＲ結合能のような治療剤として望ましいとされる特性を示すヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、及びそれと係わる組成物、用途及び方法が開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体である、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項2】
λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）の変異体は、Ｃ末端セリンが欠失されたものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項3】
κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）の変異体、λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）の変異体、またはそれらそれぞれは、重鎖不変部位ＣＨ１とジスルフィド結合を形成するシステインが、セリン、アラニンまたはバリンで置換されたものである、請求項１または２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項4】
第１ポリペプチドのＣ末端、または第２ポリペプチドのＣ末端のうち１以上に、第３目的タンパク質をさらに含むものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項5】
単一特異性または多重特異性を有する、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項6】
該目的タンパク質は、リガンド、受容体、サイトカイン、酵素またはペプチドである、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項7】
該受容体は、サイトカイン受容体である、請求項６に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項8】
該サイトカインは、インターロイキン－１（ＩＬ１）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、インターロイキン－３（ＩＬ３）、インターロイキン－４（ＩＬ４）、インターロイキン－５（ＩＬ５）、インターロイキン－６（ＩＬ６）、インターロイキン－１１（ＩＬ１１）、インターロイキン－１３（ＩＬ１３）、インターロイキン－１５（ＩＬ１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ１８）、インターロイキン－２３（ＩＬ２３）、インターロイキン－３１（ＩＬ３１）、インターロイキン－３３（ＩＬ３３）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、インターロイキン－３６（ＩＬ３６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ガンマ－インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び腫瘍懐死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）で構成されたグループのうちから選択される１以上である、請求項７に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項9】
該第１目的タンパク質と該第２目的タンパク質のうち一つは、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、他の一つは、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）である、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項10】
該第１目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、該第１リンカは、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体であり、該第２目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）であり、該第２リンカは、λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体である、請求項９に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項11】
インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）及びインターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）は、それぞれそれらの細胞外領域である、請求項９または１０に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項12】
該第３目的タンパク質として、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）またはタイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものである、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項13】
該第１ポリペプチドのＣ末端と、該第２ポリペプチドのＣ末端のうち一つに、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものである、請求項１２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項14】
該第２ポリペプチドのＣ末端に、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものである、請求項１３に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項15】
該第１ポリペプチドのＣ末端と、該第２ポリペプチドのＣ末端のいずれにも、タイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものである、請求項１２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項16】
該第１ Ｆｃ部位及び該第２ Ｆｃ部位は、ヘテロ二量体の形成が促進されるように、ＣＨ３領域が変異されたものである、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項17】
該第１ Ｆｃ部位及び該第２ Ｆｃ部位のＣＨ３領域は、ノブ・イントゥ・ホール変異を含むものである、請求項１６に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項18】
該リンカは、Ｆｃ部位内ヒンジのＮ末端に結合されるものである、請求項１ないし１７のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項19】
該ポリペプチドのＣ末端と、目的タンパク質との間に、第３リンカをさらに含むものである、請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項20】
該第３リンカは、ＧＳリンカである、請求項１９に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項21】
該免疫グロブリンは、ＩｇＧである、請求項１ないし２０のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項22】
有効成分として、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、及び製薬上許容される担体を含む、製薬組成物。
【請求項23】
免疫関連の疾患または障害を予防または治療するためのものである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
免疫関連の疾患または障害は、癌、自家免疫疾患または炎症性疾患である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
１以上の治療剤をさらに含む、請求項２２ないし２４のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項26】
該治療剤は、免疫チェックポイント抑制剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
該免疫チェックポイント抑制剤は、ＰＤ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及びＣＴＬＡ４阻害剤のうち１以上のものである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を含む、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するためのものである、組成物。
【請求項29】
目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するためのκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体の用途。
【請求項30】
κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用する、方法。
【請求項31】
目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製造方法。
【請求項32】
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）の親和度に基づいて精製する段階を含む、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の精製方法。
【請求項33】
１）免疫グロブリン親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、２）κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、
３）λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合能を増大させる方法。
【請求項35】
目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の半減期を増大させる方法。
【請求項36】
目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲ結合能を増大させる方法。
【請求項37】
目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の抗体依存的細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｆｃ融合技術（Fc fusion technology）に係り、さらに詳細には、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（heterodimeric Fc fusion proteins）、及びそれと係わる組成物、用途及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンＦｃ融合技術
ヒト免疫グロブリン（典型的に、ＩｇＧ）のＦｃ残基に、目的タンパク質（protein of interest）を結合するＦｃ融合技術は、生物学的活性タンパク質の治療的性質を改善させる有用なツールである。該目的タンパク質にＦｃ領域が結合された融合タンパク質は、ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）に結合し、エンドソーム分解（endosomal degradation）を低減させることにより、血中半減期を延長させる。また、該Ｆｃ領域は、免疫細胞に対するＦｃγ受容体（receptor）の反応を媒介させ、融合タンパク質の免疫エフェクタ機能（immune effector function）を増大させることができる。
ヒト免疫グロブリン（典型的に、ＩｇＧ）のＦｃ残基に、目的タンパク質（protein of interest）を結合するＦｃ融合技術は、生物学的活性タンパク質の治療的性質を改善させる有用なツールである。該目的タンパク質にＦｃ領域が結合された融合タンパク質は、ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）に結合し、エンドソーム分解（endosomal degradation）を低減させることにより、血中半減期を延長させる。また、該Ｆｃ領域は、免疫細胞に対するＦｃγ受容体（receptor）の反応を媒介させ、融合タンパク質の免疫エフェクタ機能（immune effector function）を増大させることができる。
【0003】
自然に発生するＩｇＧのＦｃ領域は、ホモ二量体（homodimer）を形成する傾向がある。従って、Ｆｃ融合技術に基づき、治療タンパク質を開発する最も簡単な方法は、生物学的に活性である目的タンパク質（すなわち、リガンド、細胞外領域受容体、サイトカイン（cytokine））をＦｃ領域に結合させ、適切な宿主細胞で発現させ、ホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質（homodimeric Fc fusion protein）を生産することであり、それは、ＩｇＧＦｃに特異的な親和度試薬（affinity reagent）を利用し、容易に分離し出すことができる。
【0004】
ある状況においては、ヘテロ二量体Ｆｃ融合が要求される。サイトカインとその受容体とを含む多くのタンパク質は、自然にヘテロ二量体として存在して機能し、一部タンパク質は、治療目的に選択されるパートナータンパク質とヘテロ二量体として生成されるとき、増大された薬理学的性質を示す。
【0005】
ヒトＩｇＧ１形態の非対称形二重抗体（asymmetric bispecific antibody）を構成するためのノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）突然変異技術は、ノブ・ノブ及びホール・ホールのホモ二量体、並びに単量体のような多くの副産物の発生を伴う。そのような副産物を除去し、ヘテロ二量体を確保するための精製は、複雑な工程を要求する。特に、ヘテロ二量体の物理化学的性質が、ホモ二量体及び単量体と類似している場合、該ヘテロ二量体を、ヒト治療剤として使用するのに適するレベルに分離精製するのに非常に大きな困難が伴う。それを克服するための戦略として、抗体の場合、該ヘテロ二量体の物理化学的性質を、ホモ二量体及び単量体と区別されるようにする抗体可変部位（variable region）エンジニアリング、ヘテロ二量体の軽鎖部位を、それぞれκ軽鎖とλ軽鎖とによって構成することにより、κ軽鎖及びλ軽鎖の特異的樹脂（resin）を活用し、ヘテロ二量体を純粋分離する方法（例：国際公開ＷＯ２０１６－１４６５９４号）が知られている。しかしながら、抗体とは異なり、自然相に存在する異なる２個のタンパク質を、非対称的にＦｃに結合させたヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の場合、ヘテロ二量体分離のためのタンパク質配列エンジニアリングに多くの制約が存在する。
【0006】
インターロイキン－１（ＩＬ－１）
インターロイキン－１（ＩＬ－１）は、感染反応及び炎症反応において、単核食細胞を含む、多様な細胞タイプによっても生産される強力な炎症誘発性（pro-inflammatory）サイトカインである。ＩＬ－１ファミリーは、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む７個の作用剤（agonist）、及びＩＬ－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１Ｒａ）を含む３個の自然発生受容体拮抗剤によって構成される。２個のＩＬ－１受容体（ＩＬ－１ＲタイプＩ及びＩＬ－１ＲタイプＩＩ）が確認された。この２つの受容体は、３個形態のＩＬ－１ファミリー分子といずれも相互作用することができる。ＩＬ－１ＲＩは、ＩＬ－１－誘導細胞活性を媒介させるが、ＩＬ－１／ＩＬ－１ＲＩ複合体は、それ自体でもって信号伝達を行うことができず、第２受容体鎖、ＩＬ－１Ｒ付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）の関与に依存的である。ＩＬ１－信号伝達以外に、ＩＬ１ＲＡｃＰは、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介するＩＬ３３の効果を媒介させ、ＩＬ１Ｒｒｐ２／ＩＬ１ＲＡｃＰ複合体を介するＩＬ３６の効果を媒介させるのに決定的役割をおこなう。ＩＬ－１は、リウマチ関節炎や骨関節炎のような関節、骨及び筋肉の疾患；家族性地中海熱のような遺伝性全身自己炎症疾患；全身の青少年特発性関節炎や、成人型スチル（still）病のような全身自己炎症疾患；痛風及び第２型糖尿病のような一般的な炎症性疾患；心筋梗塞のような急性発病虚血性疾患；及び癌のような多様な疾患に関与すると知られている。ＩＬ－１活性を遮断するための多数の治療法が許可されて開発されている。ＩＬ－１ターゲッティングは、１９９３年、アナキンラ（anakinra）（Kineret（アムジェン））の導入で始まった。アナキンラは、天然ＩＬ－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１Ｒａ）の組み換え形態であり、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βのいずれの活性も遮断する。抗体または可溶性受容体でもってＩＬ－１を中和させることも効果的であると判明され、可溶性誘引受容体リロナセプト（rilonacept）（Arcalyst（Regeneron））と抗ＩＬ－１β中和単一クローン抗体カナキヌマブ（canakinumab）（Ilaris（ノバルティス））とが許可された。また、国際公開ＷＯ２０１４／１２６５８２号は、ヒトＩＬ－１Ｒ１及びヒトＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外領域を含むものの、ＩＬ－１Ｒ１領域とＩＬ－１ＲＡｃＰ領域とが、それぞれヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の他の突然変異体に融合されたヘテロ二量体タンパク質を開示している。
インターロイキン－１（ＩＬ－１）は、感染反応及び炎症反応において、単核食細胞を含む、多様な細胞タイプによっても生産される強力な炎症誘発性（pro-inflammatory）サイトカインである。ＩＬ－１ファミリーは、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む７個の作用剤（agonist）、及びＩＬ－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１Ｒａ）を含む３個の自然発生受容体拮抗剤によって構成される。２個のＩＬ－１受容体（ＩＬ－１ＲタイプＩ及びＩＬ－１ＲタイプＩＩ）が確認された。この２つの受容体は、３個形態のＩＬ－１ファミリー分子といずれも相互作用することができる。ＩＬ－１ＲＩは、ＩＬ－１－誘導細胞活性を媒介させるが、ＩＬ－１／ＩＬ－１ＲＩ複合体は、それ自体でもって信号伝達を行うことができず、第２受容体鎖、ＩＬ－１Ｒ付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）の関与に依存的である。ＩＬ１－信号伝達以外に、ＩＬ１ＲＡｃＰは、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介するＩＬ３３の効果を媒介させ、ＩＬ１Ｒｒｐ２／ＩＬ１ＲＡｃＰ複合体を介するＩＬ３６の効果を媒介させるのに決定的役割をおこなう。ＩＬ－１は、リウマチ関節炎や骨関節炎のような関節、骨及び筋肉の疾患；家族性地中海熱のような遺伝性全身自己炎症疾患；全身の青少年特発性関節炎や、成人型スチル（still）病のような全身自己炎症疾患；痛風及び第２型糖尿病のような一般的な炎症性疾患；心筋梗塞のような急性発病虚血性疾患；及び癌のような多様な疾患に関与すると知られている。ＩＬ－１活性を遮断するための多数の治療法が許可されて開発されている。ＩＬ－１ターゲッティングは、１９９３年、アナキンラ（anakinra）（Kineret（アムジェン））の導入で始まった。アナキンラは、天然ＩＬ－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１Ｒａ）の組み換え形態であり、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βのいずれの活性も遮断する。抗体または可溶性受容体でもってＩＬ－１を中和させることも効果的であると判明され、可溶性誘引受容体リロナセプト（rilonacept）（Arcalyst（Regeneron））と抗ＩＬ－１β中和単一クローン抗体カナキヌマブ（canakinumab）（Ilaris（ノバルティス））とが許可された。また、国際公開ＷＯ２０１４／１２６５８２号は、ヒトＩＬ－１Ｒ１及びヒトＩＬ－１ＲＡｃＰの細胞外領域を含むものの、ＩＬ－１Ｒ１領域とＩＬ－１ＲＡｃＰ領域とが、それぞれヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の他の突然変異体に融合されたヘテロ二量体タンパク質を開示している。
【0007】
インフラマソーム（inflammasome）
インフラマソーム（inflammasome）は、病源菌または細胞損傷に反応し、ＩＬ－１βとＩＬ－１８との分泌を促進し、炎症性細胞死（pyroptosis）を誘発する細胞内タンパク質複合体である。該インフラマソームによるＩＬ－１βとＩＬ－１８との分泌は、主に骨髄性細胞（myeloid cell）から起こり、炎症性細胞死が誘発される場合、ガスダーミンポア（gasdermin pore）を介するアラーミン（alarmin）タンパク質であるＩＬ－１αとＨＭＧＢ１との分泌も促進される。正常なインフラマソームは、先天免疫に重要な役割を担当するが、インフラマソームの非正常的活性は、炎症疾患、退行性神経疾患、癌のような各種疾患の原因として作用する。インフラマソーム活性と関連する疾病の治療戦略としては、１）Ｎｌｒｐ３のようなインフラマソームセンサ（sensor）タンパク質阻害、２）ガスダーミンポア形成及びサイトカイン分泌を媒介する酵素であるカスパーゼ（caspase）の阻害、３）エフェクタタンパク質の阻害などがある。特に、エフェクタタンパク質阻害は、上位信号経路と無関係に、インフラマソームによる炎症反応を制御することができるために、多様な関連疾患において効能を有すると期待される。
インフラマソーム（inflammasome）は、病源菌または細胞損傷に反応し、ＩＬ－１βとＩＬ－１８との分泌を促進し、炎症性細胞死（pyroptosis）を誘発する細胞内タンパク質複合体である。該インフラマソームによるＩＬ－１βとＩＬ－１８との分泌は、主に骨髄性細胞（myeloid cell）から起こり、炎症性細胞死が誘発される場合、ガスダーミンポア（gasdermin pore）を介するアラーミン（alarmin）タンパク質であるＩＬ－１αとＨＭＧＢ１との分泌も促進される。正常なインフラマソームは、先天免疫に重要な役割を担当するが、インフラマソームの非正常的活性は、炎症疾患、退行性神経疾患、癌のような各種疾患の原因として作用する。インフラマソーム活性と関連する疾病の治療戦略としては、１）Ｎｌｒｐ３のようなインフラマソームセンサ（sensor）タンパク質阻害、２）ガスダーミンポア形成及びサイトカイン分泌を媒介する酵素であるカスパーゼ（caspase）の阻害、３）エフェクタタンパク質の阻害などがある。特に、エフェクタタンパク質阻害は、上位信号経路と無関係に、インフラマソームによる炎症反応を制御することができるために、多様な関連疾患において効能を有すると期待される。
【0008】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）
ヒトの腫瘍には、癌細胞だけではなく、腫瘍成長を抑制する細胞毒性Ｔ細胞（cytotoxic T cell）、自然殺害細胞（natural killer cell）のような免疫細胞が観察され、また、腫瘍成長を促進させる免疫抑制細胞である調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ（regulatory T cell））、ＭＤＳＣ（myeloid-derived suppressor cell）なども共に観察される。ＭＤＳＣは、慢性炎症（chronic inflammation）による骨髄性細胞（myeloid）の非正常的分化によって生じ、慢性炎症を誘発するＩＬ－１、ＩＬ－６のような炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）、及びケモカインが、ＭＤＳＣの発生及び腫瘍内浸潤に核心的役割を担当する。腫瘍内の免疫細胞及び免疫抑制細胞の分布及び活性は、腫瘍免疫環境あるいはＴＩＭＥ（tumor immune microenvironment）と呼ばれ、ＰＤ－１抗体のような免疫抗癌剤の反応に大きく寄与すると知られている。腫瘍内腫瘍免疫抑制細胞であるＭＤＳＣとＴｒｅｇは、多様なメカニズムを介し、細胞毒性Ｔ細胞と自然殺害細胞との機能を低下させると知られており、特に、それら免疫抑制細胞と、癌細胞から分泌されるサイトカインであるＴＧＦ－β（transforming growth factor β）が免疫抑制に核心的役割を担当すると明らかにされた。最近では、マウス及びヒトにおいて、ＴＧＦ－β阻害が免疫抗癌剤の反応を大きく改善させると報告された。しかしながら、ＴＧＦ－βは、抗炎症性サイトカイン（anti-inflammatory cytokine）であり、ＴＧＦ－β１の欠損は、マウスにおいて、深刻な炎症疾患を誘発し、癌細胞において、ＴＧＦ－β信号伝達経路を阻害する場合、ＭＤＳＣの腫瘍内浸潤が増大すると報告された。形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β：transforming growth factor beta；）受容体ファミリーは、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩＩによって構成されており、特に、ＴＧＦ－βＲＩＩは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３に高親和度で結合し、ＴＧＦ－β２には、相対的に低い結合能で結合すると知られている。
ヒトの腫瘍には、癌細胞だけではなく、腫瘍成長を抑制する細胞毒性Ｔ細胞（cytotoxic T cell）、自然殺害細胞（natural killer cell）のような免疫細胞が観察され、また、腫瘍成長を促進させる免疫抑制細胞である調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ（regulatory T cell））、ＭＤＳＣ（myeloid-derived suppressor cell）なども共に観察される。ＭＤＳＣは、慢性炎症（chronic inflammation）による骨髄性細胞（myeloid）の非正常的分化によって生じ、慢性炎症を誘発するＩＬ－１、ＩＬ－６のような炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）、及びケモカインが、ＭＤＳＣの発生及び腫瘍内浸潤に核心的役割を担当する。腫瘍内の免疫細胞及び免疫抑制細胞の分布及び活性は、腫瘍免疫環境あるいはＴＩＭＥ（tumor immune microenvironment）と呼ばれ、ＰＤ－１抗体のような免疫抗癌剤の反応に大きく寄与すると知られている。腫瘍内腫瘍免疫抑制細胞であるＭＤＳＣとＴｒｅｇは、多様なメカニズムを介し、細胞毒性Ｔ細胞と自然殺害細胞との機能を低下させると知られており、特に、それら免疫抑制細胞と、癌細胞から分泌されるサイトカインであるＴＧＦ－β（transforming growth factor β）が免疫抑制に核心的役割を担当すると明らかにされた。最近では、マウス及びヒトにおいて、ＴＧＦ－β阻害が免疫抗癌剤の反応を大きく改善させると報告された。しかしながら、ＴＧＦ－βは、抗炎症性サイトカイン（anti-inflammatory cytokine）であり、ＴＧＦ－β１の欠損は、マウスにおいて、深刻な炎症疾患を誘発し、癌細胞において、ＴＧＦ－β信号伝達経路を阻害する場合、ＭＤＳＣの腫瘍内浸潤が増大すると報告された。形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β：transforming growth factor beta；）受容体ファミリーは、ＴＧＦ－βＲＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩ、ＴＧＦ－βＲＩＩＩによって構成されており、特に、ＴＧＦ－βＲＩＩは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３に高親和度で結合し、ＴＧＦ－β２には、相対的に低い結合能で結合すると知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本開示の目的は、精製が迅速簡便であって効率的であるだけではなく、増大されたＦｃＲｎ結合能や増大されたＦｃγＲ結合能のような望ましいとされる治療特性を示すヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するためのものである。
本開示の他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる組成物を提供するためのものである。
本開示のさらに他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる用途を提供するためのものである。
本開示のさらに他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる方法を提供するためのものである。
本開示の他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる組成物を提供するためのものである。
本開示のさらに他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる用途を提供するためのものである。
本開示のさらに他の目的は、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わる方法を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示の第１態様は、
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、
ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体であるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、
ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体であるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【0011】
本開示の第２態様は、有効成分として、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、及び製薬上許容される担体を含む製薬組成物を提供する。
【0012】
本開示の第３態様は、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を含む、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するための組成物を提供する。
【0013】
本開示の第４態様は、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するためのκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体の用途を提供する。
【0014】
本開示の第５態様は、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用する方法を提供する。
【0015】
本開示の第６態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製造方法を提供する。
【0016】
本開示の第７態様は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）との親和度に基づいて精製する段階を含む、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の精製方法を提供する。
本開示の第８態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合能を増大させる方法を提供する。
本開示の第８態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合能を増大させる方法を提供する。
【0017】
本開示の第９態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の半減期を増大させる方法を提供する。
【0018】
本開示の第１０態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲ結合能を増大させる方法を提供する。
【0019】
本開示の第１１態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の抗体依存的細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させる方法を提供する。
【発明の効果】
【0020】
本開示によれば、精製が迅速簡便であって効率的であるだけではなく、増大されたＦｃＲｎ結合能及び／または増大されたＦｃγＲ結合能のような治療剤として望ましいとされる特性を示す、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、及びそれと係わる組成物、用途及び方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】異なる２個のタンパク質を結合させたＦｃ融合タンパク質製造方法の模式図である。
【図2】ＩＬ－１受容体Ｆｃ融合タンパク質製造方法の模式図である。
【図3A】ヘテロ二量体ＩＬ－１トラップであるＩＬ１ＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果である。
【図3B】ヘテロ二量体ＩＬ－１トラップであるＩＬ１Ｔの大きさ排除クロマトグラフィ分析結果である。
【図4A】κλヘテロ二量体ＩＬ－１トラップであるＰＥＴ１０１の精製段階別の主要産物及び副産物の模式図である。
【図4B】ＰＥＴ１０１精製段階別溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果である。
【図4C】ＰＥＴ１０１精製段階別溶出液のＰＥＴ１０１一次精製溶出液の大きさ排除クロマトグラフィ分析結果（図４Ｃ（Ａ））、及びＰＥＴ１０１三次精製溶出液の大きさ排除クロマトグラフィ分析結果（図４Ｃ（Ｂ））である。
【図5】ＰＥＴ１０１の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）分析結果である。
【図6】ＥＬＩＳＡを利用したＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１、カナキヌマブ、リロナセプトのヒトＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7A】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したＰＥＴ１０１のヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7B】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したＰＥＴ１０１のサルＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7C】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したＰＥＴ１０１のマウスＩＬ－１α、マウスＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7D】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したリロナセプトのヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7E】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したリロナセプトのサルＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7F】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したリロナセプトのマウスＩＬ－１α、マウスＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7G】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したカナキヌマブのヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7H】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したカナキヌマブのサルＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図7I】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したカナキヌマブのマウスＩＬ－１α、マウスＩＬ－１βに対する結合能分析結果である。
【図8】ＩＬ－１レポータ細胞株における、ＰＥＴ１０１、リロナセプト、カナキヌマブのＩＬ－１α信号経路抑制能分析結果（Ａ）及びＩＬ－１β信号経路抑制能分析結果（Ｂ）である。
【図9】Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株における、ＰＥＴ１０１、リロナセプト、カナキヌマブのＩＬ－１β媒介ＩＬ－６分泌抑制能分析結果である。
【図10】リロナセプトとＩＬ１ＴとＰＥＴ１０１とのタンパク質熱安定性分析結果である。
【図11A】３７℃で４週間、ＰＥＴ１０１のＰＢＳ内における安定性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを利用して分析した結果である。
【図11B】３７℃で４週間、ＰＥＴ１０１のＰＢＳ内における安定性を、大きさ排除クロマトグラフィ（Ｂ）を利用して分析した結果である。
【図12A】ヒトＦｃＲｎに対するＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１のＢＬＩセンソグラム結果である。
【図12B】ヒトＦｃＲｎに対するリロナセプト、カナキヌマブのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図13A】ヒトＦｃγＲＩに対するＰＥＴ１０１、リロナセプトのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図13B】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対するＰＥＴ１０１、リロナセプトのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図14】ＰＥＴ１０１、リロナセプトの投与濃度によるヒトＩＬ－１β媒介マウスＩＬ－６分泌抑制能分析結果である。
【図15】ＰＥＴ１０１、リロナセプトの投与後時間によるヒトＩＬ－１β媒介マウスＩＬ－６分泌抑制能分析結果である。
【図17A】ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性保有ヘテロ二量体トラップ１１８Ｔ３の模式図（Ａ）、及び還元条件及び非還元条件における、１１８Ｔ３精製産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（Ｂ）である。
【図17B】ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性保有κλヘテロ二量体トラップ１１８Ｔ３ｖ０１の模式図（Ａ）、及び還元条件及び非還元条件における、１１８Ｔ３ｖ０１段階別精製産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（Ｂ）である。
【図18】ＥＬＩＳＡを利用した、ヒトＩＬ－１β（Ａ）及びヒトＩＬ－１８（Ｂ）に対する１１８Ｔ３、１１８Ｔ３ｖ０１の結合分析結果である。
【図19】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した１１８Ｔ３ｖ０１のヒトＩＬ－１β、ヒトＩＬ－１８に対する同時結合能分析結果である。
【図20】１１８Ｔ３ｖ０１から、ＩＬ１８ＢＰ１個を除去した１１８Ｔ３Ｂの模式図（Ａ）、及び還元条件及び非還元条件における、１１８Ｔ３Ｂ段階別精製産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（Ｂ）である。
【図21A】ヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１β、サルＩＬ－１β、マウスＩＬ－１βに対する１１８Ｔ３ＢのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図21B】サルＩＬ－１β、マウスＩＬ－１βに対する１１８Ｔ３ＢのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図21C】ヒトＩＬ－１８、サルＩＬ－１８、マウスＩＬ－１８に対する１１８Ｔ３ＢのＢＬＩセンソグラム結果である。
【図22】ＩＬ－１リポーター細胞株における、１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３ＢとのヒトＩＬ－１β（Ａ）及びヒトＩＬ－１８（Ｂ）の信号伝達経路抑制能分析結果である。
【図23】ＩＬ－１／ＴＧＦ－β二重特異性保有ヘテロ二量体ＰＥＴ３０１の模式図（Ａ）、及び還元条件及び非還元条件における、ＰＥＴ３０１の精製段階別産物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（Ｂ）である。
【図24A】ＥＬＩＳＡを利用した、ヒトＩＬ－１β（Ａ）及びヒトＴＧＦ－β１（Ｂ）に対するＰＥＴ３０１の結合分析結果である。
【図24B】ＥＬＩＳＡを利用した、ヒトＴＧＦ－β３（Ａ）及びヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）に対するＰＥＴ３０１の結合分析結果である。
【図25A】ＩＬ－１リポーター細胞株を利用した、ＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β抑制能分析結果（Ａ）、及びＴＧＦ－βリポーター細胞株を利用した、ＰＥＴ３０１のヒトＴＧＦ－β１抑制能分析結果（Ｂ）である。
【図25B】ＴＧＦ－βリポーター細胞株を利用した、ヒトＴＧＦ－β３抑制能分析結果（Ａ）及びヒトＴＧＦ－β２抑制能分析結果（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
定義
取り立てて定義しない限り、本明細書において使用された技術的及び科学な的用語は、本開示が属する分野において一般的に使用されるところと同一の意味を有する。本開示の理解のために、下記定義が適用され、単数形で使用される用語は、複数形を含み、その逆も同様である。
取り立てて定義しない限り、本明細書において使用された技術的及び科学な的用語は、本開示が属する分野において一般的に使用されるところと同一の意味を有する。本開示の理解のために、下記定義が適用され、単数形で使用される用語は、複数形を含み、その逆も同様である。
【0023】
本願で使用される、用語である「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、天然タンパク質のアミノ酸配列、または１以上のアミノ酸残基の欠失、置換、付加及び／または挿入のような１以上の突然変異を有するアミノ酸配列を有する長鎖のペプチドを称するために相互交換的に使用されうる。
【0024】
用語「融合タンパク質」は、共に共有結合された２個以上の部分を有するタンパク質を称し、ここで、各部分は、異なるタンパク質から誘導される。
【0025】
用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ部位」及び「Ｆｃ領域」は、抗体分子中のヒンジ部、またはその一部、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域によってなる部分を言う。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、ＥＵナンバリング（ＥＵ ＩＮＤＥＸとも呼ばれる）でもって、例えば、２２６番目のシステインからＣ末端まで、または２３０番目のプロリンからＣ末端までを意味するが、それらに限定されるものではない。該Ｆｃ部位は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４単一クローン抗体などを、ペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で部分消化した後、タンパク質Ａカラムまたはタンパク質Ｇカラムに吸着された分画を再溶出することにより、適切に取得されうる。
【0026】
用語「ヘテロ二量体」とは、アミノ酸配列が異なる２個のポリペプチドによって構成されるポリペプチドを意味する。
【0027】
用語「リンカ」は、１以上の分子、例えば、１以上の成分領域間に挿入されうる核酸、アミノ酸または非ペプチド残基を意味する。例えば、該リンカは、操作を容易にするために、成分間に関心ある望ましい部位を提供するのにも使用される。該リンカは、また、宿主細胞から融合タンパク質の発現を増進させ、成分がその最適の三次構造を取り、かつ／あるいは標的分子と適切に相互作用することができるように、立体障害を低減させるためにも提供される。リンカ配列は、受容体成分に自然に連結された１以上のアミノ酸を含むものでもあるか、あるいは融合タンパク質の発現を増進させるために、関心ある望ましい部位を提供するために、成分領域が最適の三次構造を形成するようにし、かつ／あるいは成分とその標的分子との相互作用を増進させるために使用される添加された配列でもある。望ましくは、該リンカは、融合タンパク質内のそれぞれの機能性成分の構造に干渉せず、融合タンパク質成分の柔軟性を増大させる。
【0028】
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質
本開示の一態様は、
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、
ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）または変異体であるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
本開示の一態様は、
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、
ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）または変異体であるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【0029】
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の精製上の問題を克服するために、本発明者らは、異なる２個の目的タンパク質のＣ末端と、Ｆｃ領域のヒンジ領域Ｎ末端との間に、それぞれ抗体κ軽鎖不変部位（ＣＬκ）及び抗体λ軽鎖不変部位（ＣＬλ）を導入したκλＦｃ融合タンパク質技術を考案した。本開示によるκλＦｃ融合タンパク質技術は、商業的に生産されるＣＬκ特異的樹脂及びＣＬλ特異的樹脂を活用し、迅速であって簡単にヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を高純度で分離することを可能にさせる。
【0030】
ＣＬκ領域及びＣＬλ領域は、それぞれ約１２．５ｋＤａの分子量を有しており、それらの導入によるＦｃ融合タンパク質の分子量増加は、約２５ｋＤａほどのレベルと予想される。本開示によるκλＦｃ融合タンパク質技術は、融合タンパク質の分子量、安定性及び安全性に大きい変化を起こさせずにも、ヘテロ二量体の分離精製の便宜性及び効率を向上させることができる。
【0031】
一態様において、ＣＬλ変異体は、Ｃ末端セリン（Ｓｅｒ）が欠失されたものでもある。具体的には、Ｃ末端セリン（Ｓｅｒ）は、カバット（Kabat）ナンバリング基準として、２１５番位置にあるものでもある。
【0032】
一態様において、ＣＬκ変異体及び／またはＣＬλ変異体は、重鎖不変部位ＣＨ１とジスルフィド（disulfide）結合を形成するシステイン（Ｃｙｓ）が、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）で置換されたものでもある。具体的には、重鎖不変部位ＣＨ１とジスルフィド結合を形成するシステイン（Ｃｙｓ）は、カバットナンバリング基準として、２１４番位置にあるものでもある。
【0033】
図１において、（Ａ）は、異なる２個のタンパク質（タンパク質１，２）を単一鎖で連結したポリペプチドを、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ（immunoglobulin G））のＦｃ領域ヒンジ（hinge）領域Ｎ末端に結合させたインラインホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質（in-line homodimeric Fc fusion protein）を示し、（Ｂ）は、ＩｇＧＦｃ領域ヒンジ領域Ｎ末端に、異なる２個のタンパク質をそれぞれ連結したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（heterodimeric Fc fusion protein）を示し、（Ｃ）は、ＩｇＧＦｃのＣＨ３領域に、ヘテロ二量体形成を促進させる突然変異を導入したノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（KiH heterodimeric Fc fusion protein）を示し、（Ｄ）は、異なる２個のタンパク質を、それぞれヒト免疫グロブリンκ軽鎖（kappa light chain）不変部位（ＣＬκ）及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖（lambda light chain）不変部位（ＣＬλ）に単一鎖で連結した後、Ｆｃ領域ヒンジ部位Ｎ末端に結合させたκλヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（κλ-Fc fusion protein）を示し、（Ｅ）は、ＦｃのＣＨ３領域に、ヘテロ二量体形成を促進させる突然変異を導入したノブ・イントゥ・ホールκλヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（KiH κλ-Fc fusion protein）を示す。図１において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、従来技術に該当し、（Ｄ）及び（Ｅ）、特に、（Ｅ）は、本開示の範囲内に属するものである。
【0034】
一態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１ポリペプチドのＣ末端、または第２ポリペプチドのＣ末端のうち１以上に、第３目的タンパク質を追加して含むものでもある。
【0035】
一態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、単一特異性（mono-specificity）または多重特異性（multi-specificity）を有するものでもある。用語「単一特異性」は、１つの標的（target）に特異的に結合可能であることを意味し、「多重特異性」は、２個以上の区別される標的に特異的に結合可能であることを意味する。例えば、融合タンパク質は、第１標的に特異的に結合可能な領域、及び第２標的に特異的に結合可能な領域を含む二重特異性（bi-specificity）である。
【0036】
一態様において、前記目的タンパク質は、リガンド、受容体、サイトカイン、酵素またはペプチドでもある。具体例において、該受容体は、サイトカイン受容体でもある。具体例において、該サイトカイン及び／または該受容体は、自然にヘテロ二量体において存在して機能するものでもあり、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ１）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、インターロイキン－３（ＩＬ３）、インターロイキン－４（ＩＬ４）、インターロイキン－５（ＩＬ５）、インターロイキン－６（ＩＬ６）、インターロイキン－１１（ＩＬ１１）、インターロイキン－１３（ＩＬ１３）、インターロイキン－１５（ＩＬ１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ１８）、インターロイキン－２３（ＩＬ２３）、インターロイキン－３１（ＩＬ３１）、インターロイキン－３３（ＩＬ３３）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、インターロイキン－３６（ＩＬ３６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ガンマ－インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び腫瘍懐死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）によって構成されたグループのうちから選択される１以上のものでもあるが、それらに制限されるものではない。
【0037】
具体的な例として、本発明者らは、Ｆｃに結合させた２個のポリペプチドを同時に有する融合タンパク質の形成比率が高く、精製が相対的に容易であると予想される３種（インラインホモ二量体（図１Ａ）、ＫｉＨヘテロ二量体（図１Ｃ）、ＫｉＨκλヘテロ二量体（図１Ｅ））を利用し、自然上においてヘテロ二量体によってなるＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１ＲＡｃＰ）の細胞外部位を結合させたＦｃ融合タンパク質を構成した。図２において、（Ａ）は、ＩＬ－１受容体の細胞外部位を、図１のＡ構造により、Ｆｃに結合させたＩＬ－１特異的インラインホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質であり、ＩＬ－１特異的インラインホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質の例示として、リロナセプトと同一配列を有する融合タンパク質（従来技術）を構成したものであり、（Ｂ）は、ＩＬ－１受容体の細胞外部位を、図１の（Ｃ）構造によってＦｃに結合させたＩＬ－１特異的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（ＩＬ１Ｔ）（従来技術）を構成したものであり、（Ｃ）は、ＩＬ－１特異的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の例示であり、ＩＬ－１受容体の細胞外部位を図１のＥ構造により、ＣＬκ及びＣＬλに連結した後、Ｆｃに結合させたＩＬ－１特異的κλヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（ＰＥＴ１０１）（本開示の一具体例）を構成したものである。
【0038】
前述の具体例のように、第１目的タンパク質と第２目的タンパク質とのうち一つは、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、他の一つは、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）でもある。例えば、該第１目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、第１リンカは、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体であり、該第２目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）であり、第２リンカは、λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体でもある。例えば、該インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）及び該インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）は、それぞれそれらの細胞外領域（ectodomain）でもある。
【0039】
他の具体的例として、本発明者らは、インフラマソームエフェクタサイトカインＩＬ－１α，ＩＬ－１β，ＩＬ－１８の同時阻害剤を開発するために、ＩＬ－１受容体Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端部位に、自然上のヒトＩＬ－１８阻害タンパク質であるＩＬ１８ＢＰ（interleukin-18-binding protein）を融合させた形態の二重阻害剤を構成した。ＩＬ－１阻害剤のうち、インラインホモ二量体リロナセプトは、約２５０ｋＤａの分子量を有しており、ＩＬ１８ＢＰの融合時、さらなる分子量増加による組織透過性低減の問題が生じうる。従って、本発明者らは、相対的に分子量が小さいヘテロ二量体ＩＬ－１阻害剤ＩＬ１ＴとＰＥＴ１０１とを、ＩＬ１８ＢＰと融合させた形態のＩＬ－１／ＩＬ－１８二重阻害剤を作製した。
【0040】
さらに他の具体的例として、本発明者らは、ＩＬ－１の阻害が、ＴＧＦ－β阻害による炎症及びＭＤＳＣ形成を低減させ、抗癌効能を増大させる可能性があるということに着眼し、ＰＥＴ１０１を基とするＩＬ－１／ＴＧＦ－β二重阻害剤を作製した。具体的には、ヒトＩＬ－１とＴＧＦ－βとに二重特異性を保有するＦｃ融合タンパク質を製造するために、ＰＥＴ１０１のＦｃ領域Ｃ末端に、ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外部分（extracellular domain）が結合された形態のＰＥＴ３０１構造体をデザインした（図２３（Ａ））。
【0041】
従って、一具体例によれば、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第３目的タンパク質として、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）またはタイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものでもある。
【0042】
具体的には、第１ポリペプチドのＣ末端と、第２ポリペプチドのＣ末端とのうち一つに、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものでもある。さらに具体的には、第２ポリペプチドのＣ末端に、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものでもある。
【0043】
他の例において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１ポリペプチドのＣ末端と、第２ポリペプチドのＣ末端とのいずれ二も、タイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものでもある。
【0044】
一態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１ Ｆｃ部位及び第２ Ｆｃ部位がヘテロ二量体の形成が促進されるように、ＣＨ３領域が変異されたものでもある。該ヘテロ二量体形成を促進させるための変異が当業界に知られており、それら変異は、特別な制限なしにも含まれる。例えば、第１ Ｆｃ部位及び第２ Ｆｃ部位のＣＨ３領域は、ノブ・イントゥ・ホール変異を含むものでもある。
【0045】
一態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１リンカ、第２リンカ、またはそれらのいずれもが、Ｆｃ部位ヒンジのＮ末端に結合されたものでもある。「ヒンジ」は、野生型抗体重鎖において、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結（例えば、カバットＥＵ番号体系により、大体において位置２１６から大体において位置３２０、または大体において位置２２６から大体において位置２３０）する抗体重鎖ポリペプチドの部分を示すものであり、一般的に、２５個以下のアミノ酸残基を有して会合される結合部位が独立して動くように可撓性を有する。例えば、該ヒンジは、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ，ＨＴＣＰＸＣＰまたはＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘは、ＳまたはＰである）を有するものでもあるが、それらに制限されるものではない。
【0046】
一態様において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドのＣ末端と、第３目的タンパク質との間に、第３リンカを追加して含むものでもある。具体例において、リンカ残基は、２個ないし１００個のアミノ酸長を有するペプチドリンカである。例示的なリンカは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ，Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｇｌｙ（Ｇ）ｎ及びＧｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカのような少なくとも２個のアミノ酸残基を有する線形ペプチドを含む。ＧＳリンカは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＳＧ）ｎ、（Ｇ２Ｓ）ｎ、Ｇ２Ｓ２Ｇ、（Ｇ２ＳＧ）ｎ、（Ｇ３Ｓ）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎＧｎ及びＧＳＧ４ＳＧ４ＳＧを含むが、それらに制限されるものでなく、ここで、ｎは１以上である。特定例において、該リンカは、（Ｇ４Ｓ）２でもある。
【0047】
一態様において、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ由来、それらの組み合わせ（combination）、またはそれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域でもある。具体的には、ＩｇＧＦｃ領域であり、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域であるが、それに制限されるものではない。
【0048】
組成物、用途及び方法
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わり、以上で記述された内容は、下記の組成物、用途、方法などにも同一に適用される。
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と係わり、以上で記述された内容は、下記の組成物、用途、方法などにも同一に適用される。
【0049】
本開示の他の態様は、有効成分として、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、及び製薬上許容される担体を含む製薬組成物が提供される。
【0050】
製薬上許容される担体は、組成物を強化させたり安定化させたりするか、あるいは組成物の製造を容易にする。製薬上許容される担体は、生理学上相溶性である溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗バクテリア剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。
【0051】
本開示の製薬組成物は、関連技術分野に公知された多様な方法によっても投与される。投与経路及び／または投与方式は、目的とする結果によって異なる。投与が、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であるか、あるいは標的部位に隣接するようにも投与される。製薬上許容される担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適さなければならない。該組成物は、滅菌されたものであり、流体でなければならない。該組成物は、凍結乾燥された形態でもある。等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、及び塩化ナトリウムを組成物内に含めることができる。本発明の製薬組成物は、関連技術分野に広く公知され、一般的に実施される方法によっても製造される。
【0052】
製薬組成物における有効成分の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物及び投与方式につき、目的とする治療反応を達成するのに効果的な有効成分の量が得られるように異なりうる。選択された投与量レベルは、多様な薬動学的因子、例えば、使用された本開示の特定組成物、または投与経路、投与時間、排出速度、治療持続期間、組み合わされて使用された他の薬物、化合物及び／または物質、治療する患者の年齢・性別・体重・状態・全般的健康及び以前病歴、並びにその他因子によって異なる。非制限的な例として、該投与量は、約０．０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに一般的には、０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。例示的な治療療法は、１週ごとに１回、または２週ごとに１回、または毎月１回、あるいは３ヵ月ないし６ヵ月ごとに１回の投与を伴う。
【0053】
一態様において、前記組成物は、免疫関連の疾患または障害を予防または治療するためのものでもある。具体例において、免疫関連の疾患または障害は、癌、自家免疫疾患または炎症性疾患でもある。
【0054】
一態様において、前記組成物は、１以上の治療剤を追加して含むものでもある。具体例において、該治療剤は、免疫チェックポイント抑制剤（immune checkpoint inhibitor）、例えば、ＰＤ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及びＣＴＬＡ４阻害剤のうち１以上のものでもある。
【0055】
本開示のさらに他の態様は、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を含む、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するための組成物を提供する。
【0056】
本開示のさらに他の態様は、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用するためのκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体の用途を提供する。
【0057】
本開示のさらに他の態様は、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体を、目的タンパク質と免疫グロブリンＦｃ部位とを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質において、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカに使用する方法を提供する。
【0058】
本開示のさらに他の態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製造方法を提供する。
【0059】
本開示のさらに他の態様は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）との親和度に基づいて精製する段階を含む、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の精製方法を提供する。具体例において、該精製方法は、
１）免疫グロブリン親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、
２）κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、
３）λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、を含むものでもある。
１）免疫グロブリン親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、
２）κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、
３）λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）親和度クロマトグラフィを遂行する段階と、を含むものでもある。
【0060】
多様なＦｃ変異体は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）に対する結合を増大させ、血清半減期を増大させるところにも使用される。Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合は、抗体あるいはＦｃ融合タンパク質がエンドサイトーシス（endocytosis）されたとき、エンドソーム（endosome）による分解（degradation）を防ぎ、ｐＨ依存的解離を介し、血液に再放出されるように誘導することにより、長い薬物半減期、高い血液内露出のような抗体及びＦｃ融合タンパク質の薬動学的特性を媒介させる。しかしながら、多くのＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域と結合タンパク質との干渉（interference）により、抗体対比で、ＦｃＲｎ結合が低いという特徴を示し、低いＦｃＲｎ結合強度は、Ｆｃ融合タンパク質の短い半減期と相関関係を有する。
【0061】
本発明者らは、κλＦｃ融合タンパク質技術が、精製の長所以外にも、ＣＬκ領域及びＣＬλ領域をヒンジ領域Ｎ末端に位置させることにより、Ｆｃ領域と結合タンパク質との距離を増大させ、互いによる干渉を減らし、ＦｃＲｎ結合の長所を有することができることに着眼し、それを実験を介して確認した。
【0062】
それより、本開示のさらに他の態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合能を増大させる方法を提供する。
【0063】
また、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体ｍ、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の半減期を増大させる方法を提供する。
【0064】
抗体のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ以外にも、免疫細胞表面のＦｃガンマ受容体（Fcγ receptor）と結合することにより、抗体の免疫エフェクタ機能を媒介させる。本発明者らは、κλＦｃ融合タンパク質技術がＦｃＲｎだけではなく、Ｆｃガンマ受容体結合の長所を有する可能性について試験した結果、増大されたＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａに対する結合能を有することを確認した。
【0065】
抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞毒性細胞が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。該ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａに対する増大された結合は、ＡＤＣＣ活性増大を誘導する。
【0066】
それにより、本開示のさらに他の態様は、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲ結合能を増大させる方法が提供される。
【0067】
また、目的タンパク質とＦｃ部位とのリンカとして、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体をそれぞれ導入する段階を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の抗体依存的細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させる方法を提供する。
【0068】
以下、本開示について、具体的な実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、それらは、本開示の理解の一助とするためのものであるのみ、本開示の範囲をいかようにも制限するものではない。
【0069】
比較例１：ＩＬ－１特異性保有ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（ＩＬ１Ｔ）の製造
図２（Ｂ）の構成を有するＩＬ－１特異的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を具現するために、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１：immunoglobulin G1）のＦｃ領域（配列番号１）に、ノブ・イントゥ・ホール突然変異技術を適用し、ノブ突然変異保有Ｆｃ（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ（配列番号２））とホール突然変異保有Ｆｃ（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（配列番号３））とのポリペプチドを暗号化する遺伝子配列を確保した。ヒトＩＬ－１Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＭ８８４２３．１）の信号配列（signal peptide）と細胞外部分とを構成するアミノ酸残基１ないし３３３、またはヒトＩＬ－１ＲＡｃＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ２５４２１．１）の信号配列と細胞外部分とを構成するアミノ酸残基１ないし３５９のアミノ酸残基を暗号化する遺伝子配列は、化学的に合成され（Integrated DNA Technologies、ＩＡ、米国）、それぞれのベクターにクローニングした。ＩＬ－１Ｒ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）（配列番号４）と、ＩＬ－１ＲＡｃＰ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）（配列番号５）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターは、それぞれＰ００１、Ｐ００２と称した。
図２（Ｂ）の構成を有するＩＬ－１特異的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を具現するために、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１：immunoglobulin G1）のＦｃ領域（配列番号１）に、ノブ・イントゥ・ホール突然変異技術を適用し、ノブ突然変異保有Ｆｃ（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ（配列番号２））とホール突然変異保有Ｆｃ（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（配列番号３））とのポリペプチドを暗号化する遺伝子配列を確保した。ヒトＩＬ－１Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＭ８８４２３．１）の信号配列（signal peptide）と細胞外部分とを構成するアミノ酸残基１ないし３３３、またはヒトＩＬ－１ＲＡｃＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ２５４２１．１）の信号配列と細胞外部分とを構成するアミノ酸残基１ないし３５９のアミノ酸残基を暗号化する遺伝子配列は、化学的に合成され（Integrated DNA Technologies、ＩＡ、米国）、それぞれのベクターにクローニングした。ＩＬ－１Ｒ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）（配列番号４）と、ＩＬ－１ＲＡｃＰ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）（配列番号５）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターは、それぞれＰ００１、Ｐ００２と称した。
【0070】
Ｐ００１ベクターとＰ００２ベクターとの同時形質転換（co-transfection）をチャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary）由来細胞株であるＥｘｐｉＣＨＯ-ＳTM（Ａ２９１２７（Gibco））において遂行し、この一時発現（transient expression）を介して発現されたヘテロ二量インターロイキン－１トラップ（heterodimeric IL-1 trap）をＩＬ１Ｔと称した。一時発現過程に使用される全ての試薬は、製造社（Gibco）のマニュアルによって準備し、マニュアル内の最大力価生産プロトコルによって遂行された。Sartoclear Dynamics登録商標 ＬａｂＶ（ＳＤＬＶ－１０００－４０Ｃ－Ｅ（Sartorius））フィルタシステムを利用し、１２日目培養液を濾過し、続けて、ＨｉＴｒａｐ MabSelect ＳｕＲｅ（１１００３４９３（ＧＥ Healthcare））精製カラムを利用して精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Centrifugal Filter Unit（Merck Millipore）を利用し、サンプル濃縮を行った。最終精製完了産物は、サンプル固有の吸光係数（extinction coefficient）と分子量とを基に濃度を定量した。該精製産物は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）とサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ：size exclusion chromatography）とを利用して分析を行った（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非還元（non-reducing）条件と還元（reducing）条件とで行われ、クマシブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）染色を介し、各サイズのバンドを確認した（図３Ａ）。還元条件においては、約７０ｋＤａにおいて、ＩＬ－１Ｒ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）単量体とＩＬ－１ＲＡｃＰ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）単量体との混合物が確認された。非還元条件において、約１５０ｋＤａにおいて、ヘテロ二量体とホモ二量体との混合物と推定される産物が確認され、約７０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認された（図３Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィ分析には、Agilent Ｂｉｏ ＳＥＣ－３ ＨＰＬＣカラム（５１９０－２５１１（Agilent））が装着されたAlliance登録商標 ＨＰＬＣ－ｅ ２６９５ Separations Module（Ｗａｔｅｒｓ、２６９５）が使用された。分析結果、７．１４２分の停滞時間において、ヘテロ二量体（ＩＬ１Ｔ）とホモ二量体との混合物が８２．８８％存在することが確認され、５．４７０分と６．３４４分との停滞時間において、凝集体（aggregates）が検出され、７．８９３分の停滞時間においては、単量体混合物が検出された（図３Ｂ）。
【0071】
実施例１：ＩＬ－１特異性保有κλヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（ＰＥＴ１０１）製造
κλＦｃ融合タンパク質技術が適用されたＩＬ－１特異性保有ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質製造のために、ＩＬ－１Ｒ細胞外部位とヒンジ領域との間に、抗体軽鎖κ不変部位を導入し（配列番号６）、ＩＬ－１ＲＡｃＰ細胞外部位とヒンジ領域との間に、抗体軽鎖λ不変部位を導入した（配列番号７）。該過程において不要なアセンブリを防ぐために、自然上のκとλとの不変部位Ｃ末端に存在するシステインは、セリンで置換した。そのような構成に作製されたＩＬ－１Ｒ－ＣＬκ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）とＩＬ－１ＲＡｃＰ－ＣＬλ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）とのアミノ酸配列（配列番号８、配列番号９）を暗号化する発現ベクターを、それぞれＰ００３及びＰ００４と言い、ＥｘｐｉＣＨＯ-Ｓ細胞株において同時形質転換（co-transfection）を進めて生成されるヘテロ二量体をＰＥＴ１０１と称した。
κλＦｃ融合タンパク質技術が適用されたＩＬ－１特異性保有ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質製造のために、ＩＬ－１Ｒ細胞外部位とヒンジ領域との間に、抗体軽鎖κ不変部位を導入し（配列番号６）、ＩＬ－１ＲＡｃＰ細胞外部位とヒンジ領域との間に、抗体軽鎖λ不変部位を導入した（配列番号７）。該過程において不要なアセンブリを防ぐために、自然上のκとλとの不変部位Ｃ末端に存在するシステインは、セリンで置換した。そのような構成に作製されたＩＬ－１Ｒ－ＣＬκ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）とＩＬ－１ＲＡｃＰ－ＣＬλ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）とのアミノ酸配列（配列番号８、配列番号９）を暗号化する発現ベクターを、それぞれＰ００３及びＰ００４と言い、ＥｘｐｉＣＨＯ-Ｓ細胞株において同時形質転換（co-transfection）を進めて生成されるヘテロ二量体をＰＥＴ１０１と称した。
【0072】
ＰＥＴ１０１の精製過程別及び精製段階別に予想される主要産物及び副産物を、図４Ａに表示した。詳細に説明すれば、比較例１と同一方式で、親和度クロマトグラフィ（affinitychromatography）基盤精製を行った。一次精製産物につき、KappaSelect樹脂（１７５４５８０１（ＧＥ Healthcare））と、それに続くLambdaFabSelect樹脂（１７５４８２０１（ＧＥ Healthcare））とを利用した親和度クロマトグラフィを遂行した。一次（MabSelect）、二次（KappaSelect）、三次（LambdaFabSelect）の精製産物の透析、濃縮、定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、サイズ排除クロマトグラフィ分析は、比較例１で言及した方式で行った。MabSelect一次精製溶出液の非還元条件ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果において、約７０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認され、三次精製まで完了した場合、単量体が除去され、約１８０ｋＤａのＰＥＴ１０１と予想されるタンパク質が確認された（図４Ｂの「１」）。サイズ排除クロマトグラフィを利用した純度分析において、一次精製産物は、ヘテロ二量体、ホモ二量体、単量体などが存在し、二量体のピークは、停滞時間６．８３６秒で確認され、該混合物の面積は、８７．５７％と確認された（図４Ｂの「２」）。一次精製産物において、ヘテロ二量体分離のために、二次（KappaSelect）、三次（LambdaFabSelect）の親和度クロマトグラフィ連続精製を行った。最終精製産物であるLambdaFabSelect三次精製産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果において、単量体は、確認されず、ヘテロ二量体推定産物のピークが確認された（図４Ｂの「３」）。サイズ排除クロマトグラフィ分析において、ヘテロ二量体推定産物のピークは、６．８３８分の停滞時間を有して溶出され、最終精製産物の純度は、９９．３１％で確認された（図４Ｂの「３」）。
【0073】
試験例１：ＰＥＴ１０１ヘテロ二量体含量分析
実施例１で得られたＰＥＴ１０１最終精製産物におけるヘテロ二量体の含量を確認するために、ヘテロ二量体とホモ二量体とを分離することができる疎水性相互作用クロマトグラフィ（hydrophobic interaction chromatography）分析を行った。クロマトグラフィカラムとしては、ＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－１０カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Thermo Fisher Scientific））を使用した。ホモ二量体分析のために、ＩＬ－１Ｒ－ＣＬκ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３ホモ二量体（ＰＥＴ１０１ノブκκ）及びＩＬ－１ＲＡｃＰ－ＣＬλ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３ホモ二量体（ＰＥＴ１０１ホールλλ）を、実施例１で言及した方式で発現精製し、ＰＥＴ１０１最終精製産物と比較した。疎水性相互作用クロマトグラフィにおいて、図５でのように、ＰＥＴ１０１ノブββホモ二量体が最も先に溶出されることを確認し、その後、ＰＥＴ１０１最終精製産物、ＰＥＴ１０１ホールββホモ二量体の順序で溶出されることを確認した。ＰＥＴ１０１最終精製産物において、ホモ二量体ではないヘテロ二量体（ＰＥＴ１０１κλ）の比率は、９８．０２％と測定され、実施例１で言及された精製過程を介し、高純度のヘテロ二量体分離が可能であるということを立証した。
実施例１で得られたＰＥＴ１０１最終精製産物におけるヘテロ二量体の含量を確認するために、ヘテロ二量体とホモ二量体とを分離することができる疎水性相互作用クロマトグラフィ（hydrophobic interaction chromatography）分析を行った。クロマトグラフィカラムとしては、ＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－１０カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Thermo Fisher Scientific））を使用した。ホモ二量体分析のために、ＩＬ－１Ｒ－ＣＬκ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３ホモ二量体（ＰＥＴ１０１ノブκκ）及びＩＬ－１ＲＡｃＰ－ＣＬλ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３ホモ二量体（ＰＥＴ１０１ホールλλ）を、実施例１で言及した方式で発現精製し、ＰＥＴ１０１最終精製産物と比較した。疎水性相互作用クロマトグラフィにおいて、図５でのように、ＰＥＴ１０１ノブββホモ二量体が最も先に溶出されることを確認し、その後、ＰＥＴ１０１最終精製産物、ＰＥＴ１０１ホールββホモ二量体の順序で溶出されることを確認した。ＰＥＴ１０１最終精製産物において、ホモ二量体ではないヘテロ二量体（ＰＥＴ１０１κλ）の比率は、９８．０２％と測定され、実施例１で言及された精製過程を介し、高純度のヘテロ二量体分離が可能であるということを立証した。
【0074】
試験例２：酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）を利用したＩＬ－１βに対する結合能分析
ＩＬ－１特異性保有Ｆｃ融合タンパク質３種（リロナセプト、ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１）のヒトＩＬ－１βに対する結合分析を、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。結合能比較のために、ヒトＩＬ－１β抗体カナキヌマブを対照物質として使用した。９６ハーフウェル免疫吸着検査用プレート（３６９０（Corning））を、３０ｎｇ／ウェル濃度でもって、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））で処理し、４℃で一晩中コーティングを進めた。翌日、Phosphate Buffered Saline with Tween－２０（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ１１９２（ＰＢＳＴ））を利用し、プレート洗浄を行った。本分析の全ての洗浄過程は、ＡｑｕａＭａｘ ２０００プレートウォッシャ（０３１０－５３６３（Molecular Devices））を利用して行った。ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１、リロナセプト、カナキヌマブは、適切な濃度に、１％（ｗ／ｖ）脱脂乳含有ＰＢＳＴにおいて希釈し、各ウェルに処理し、１時間常温で結合を誘導して、３回プレート洗浄を進めた。その後、ペルオキシダーゼが結合された抗ヒトＩｇＧＦｃ塩素抗体（３１４１３（Invitrogen））を１％（ｗ／ｖ）脱脂乳含有ＰＢＳＴにおいて希釈（１：１０，０００）して結合を誘導し、ＰＢＳＴ ３回洗浄後、暗室において、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））の常温処理を介する発色反応を誘導した。その後、１Ｎ硫酸（２５５（DUKSAN））で処理し、反応を終了させ、ＳｐｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダ（１０１９２－２２０（Molecular Devices））を利用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＰＥＴ１０１は、ＩＬ１Ｔ、リロナセプトとヒトＩＬ－１βとにつき、類似したＥＣ５０値を示しながら結合すると確認された（図６）。同じモール濃度で処理する場合、カナキヌマブが高いＯＤ４５０値を示すが、それは、二価抗体であるカナキヌマブのアビディティ（avidity）効果のためであると見られる（図６）。本試験の結果は、ヒトＩＬ－１受容体とＦｃヒンジ領域Ｎ末端との間に導入されたＣＬκ領域及びＣＬλ領域が、ヒトＩＬ－１受容体とヒトＩＬ－１βとの結合に影響を及ぼさないということを示唆する。
ＩＬ－１特異性保有Ｆｃ融合タンパク質３種（リロナセプト、ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１）のヒトＩＬ－１βに対する結合分析を、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。結合能比較のために、ヒトＩＬ－１β抗体カナキヌマブを対照物質として使用した。９６ハーフウェル免疫吸着検査用プレート（３６９０（Corning））を、３０ｎｇ／ウェル濃度でもって、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））で処理し、４℃で一晩中コーティングを進めた。翌日、Phosphate Buffered Saline with Tween－２０（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ１１９２（ＰＢＳＴ））を利用し、プレート洗浄を行った。本分析の全ての洗浄過程は、ＡｑｕａＭａｘ ２０００プレートウォッシャ（０３１０－５３６３（Molecular Devices））を利用して行った。ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１、リロナセプト、カナキヌマブは、適切な濃度に、１％（ｗ／ｖ）脱脂乳含有ＰＢＳＴにおいて希釈し、各ウェルに処理し、１時間常温で結合を誘導して、３回プレート洗浄を進めた。その後、ペルオキシダーゼが結合された抗ヒトＩｇＧＦｃ塩素抗体（３１４１３（Invitrogen））を１％（ｗ／ｖ）脱脂乳含有ＰＢＳＴにおいて希釈（１：１０，０００）して結合を誘導し、ＰＢＳＴ ３回洗浄後、暗室において、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））の常温処理を介する発色反応を誘導した。その後、１Ｎ硫酸（２５５（DUKSAN））で処理し、反応を終了させ、ＳｐｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダ（１０１９２－２２０（Molecular Devices））を利用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＰＥＴ１０１は、ＩＬ１Ｔ、リロナセプトとヒトＩＬ－１βとにつき、類似したＥＣ５０値を示しながら結合すると確認された（図６）。同じモール濃度で処理する場合、カナキヌマブが高いＯＤ４５０値を示すが、それは、二価抗体であるカナキヌマブのアビディティ（avidity）効果のためであると見られる（図６）。本試験の結果は、ヒトＩＬ－１受容体とＦｃヒンジ領域Ｎ末端との間に導入されたＣＬκ領域及びＣＬλ領域が、ヒトＩＬ－１受容体とヒトＩＬ－１βとの結合に影響を及ぼさないということを示唆する。
【0075】
試験例３：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：surface plasmon resonance）を介する結合定数測定
ＰＥＴ１０１のＩＬ－１αとＩＬ－１βとに対する結合力をさらに定量的に分析するために、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を利用し、表面プラズモン共鳴分析を行った。結合定数測定には、Series Ｓ ＣＭ５センサチップ（ＢＲ１００５３０（ＧＥ Healthcare））を使用し、Human Antibody Capture Kit（ＢＲ１００８３９（ＧＥ Healthcare））に含まれた抗ヒトＦｃ抗体に対し、アミンカップリングキット（ＢＲ１０００５０（ＧＥ Healthcare））を利用し、製造社マニュアルにより、センサチップに、抗ヒトＦｃ抗体の固定（immobilization）を行った。抗ヒトＦｃ抗体が固定されたＣＭ５センサのフローセル１は、空白セルとして使用し、フローセル２，３，４には、それぞれ１００ｎＭ ＰＥＴ１０１（１８μｇ／ｍｌ）、１００ｎＭリロナセプト（２５μｇ／ｍｌ）、１００ｎＭカナキヌマブ（１５μｇ／ｍｌ）を、１０μｌ／分流速で１分間ローディングした。全てのフローセルの準備完了後、０．２５，０．５，１，２，４，８ｎＭのヒトＩＬ－１α（２００－ＬＡ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、ヒトＩＬ－１β（２０１－ＬＢ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、マウスＩＬ－１α（４００－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、マウスＩＬ－１β（４０１－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、サル（Rhesus macaque）ＩＬ－１β（１３１８－ＲＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原を、３０μｌ／分の流速で投入し、４分間結合反応を行い、続けて、３０μｌ／分の流速で、１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（ＢＲ１００６６９（ＧＥ Healthcare））のみを投入し、１０分間解離反応を行った。獲得された各センサグラム（sensorgram）は、空白セルと比較し、正常化（normalization）及び節減（subtraction）を行い、親和度を計算した。該親和度の計算には、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Healthcare）を使用し、１：１ラングミュア結合モデル（langmuir model）分析を介し、結合速度定数と解離速度定数とを計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数（Ｋｄ）を結合速度定数（Ｋａ）で除した値であり、ＰＥＴ１０１は、ヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１β、サルＩＬ－１βには、それぞれ６．９７ｐＭ、３．４６ｐＭ、１．４３ｐＭの高レベルのＫＤ値を有することを確認し、マウスＩＬ－１α、マウスＩＬ－１βには、１９．４２ｐＭ、３０４．５４ｐＭのＫＤ値を有することを確認した（図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃ、表１）。リロナセプトは、ＰＥＴ１０１と類似した結合パターンを示しながら測定された結合定数は、表１の通りである（図７Ｄ、図７Ｅ及び図７Ｆ）。ヒトＩＬ－１β特異的抗体カナキヌマブは、ヒトＩＬ－１βにつき、６８．３９ｐＭのＫＤ値を有し、ヒトＩＬ－１αには、結合せず、マウス抗原に対する種間交差結合能がないと確認された（図７Ｇ、図７Ｈ及び図７Ｉ、表１）。カナキヌマブのサルＩＬ－１βに対して測定されたＫＤ値は、２．８４７μＭと、急速に解離されるパターンを示し、非常に低い結合能を有すると分析された（図７Ｇ、図７Ｈ及び図７Ｉ、表１）。
ＰＥＴ１０１のＩＬ－１αとＩＬ－１βとに対する結合力をさらに定量的に分析するために、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を利用し、表面プラズモン共鳴分析を行った。結合定数測定には、Series Ｓ ＣＭ５センサチップ（ＢＲ１００５３０（ＧＥ Healthcare））を使用し、Human Antibody Capture Kit（ＢＲ１００８３９（ＧＥ Healthcare））に含まれた抗ヒトＦｃ抗体に対し、アミンカップリングキット（ＢＲ１０００５０（ＧＥ Healthcare））を利用し、製造社マニュアルにより、センサチップに、抗ヒトＦｃ抗体の固定（immobilization）を行った。抗ヒトＦｃ抗体が固定されたＣＭ５センサのフローセル１は、空白セルとして使用し、フローセル２，３，４には、それぞれ１００ｎＭ ＰＥＴ１０１（１８μｇ／ｍｌ）、１００ｎＭリロナセプト（２５μｇ／ｍｌ）、１００ｎＭカナキヌマブ（１５μｇ／ｍｌ）を、１０μｌ／分流速で１分間ローディングした。全てのフローセルの準備完了後、０．２５，０．５，１，２，４，８ｎＭのヒトＩＬ－１α（２００－ＬＡ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、ヒトＩＬ－１β（２０１－ＬＢ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、マウスＩＬ－１α（４００－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、マウスＩＬ－１β（４０１－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原、サル（Rhesus macaque）ＩＬ－１β（１３１８－ＲＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））抗原を、３０μｌ／分の流速で投入し、４分間結合反応を行い、続けて、３０μｌ／分の流速で、１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（ＢＲ１００６６９（ＧＥ Healthcare））のみを投入し、１０分間解離反応を行った。獲得された各センサグラム（sensorgram）は、空白セルと比較し、正常化（normalization）及び節減（subtraction）を行い、親和度を計算した。該親和度の計算には、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Healthcare）を使用し、１：１ラングミュア結合モデル（langmuir model）分析を介し、結合速度定数と解離速度定数とを計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数（Ｋｄ）を結合速度定数（Ｋａ）で除した値であり、ＰＥＴ１０１は、ヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１β、サルＩＬ－１βには、それぞれ６．９７ｐＭ、３．４６ｐＭ、１．４３ｐＭの高レベルのＫＤ値を有することを確認し、マウスＩＬ－１α、マウスＩＬ－１βには、１９．４２ｐＭ、３０４．５４ｐＭのＫＤ値を有することを確認した（図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃ、表１）。リロナセプトは、ＰＥＴ１０１と類似した結合パターンを示しながら測定された結合定数は、表１の通りである（図７Ｄ、図７Ｅ及び図７Ｆ）。ヒトＩＬ－１β特異的抗体カナキヌマブは、ヒトＩＬ－１βにつき、６８．３９ｐＭのＫＤ値を有し、ヒトＩＬ－１αには、結合せず、マウス抗原に対する種間交差結合能がないと確認された（図７Ｇ、図７Ｈ及び図７Ｉ、表１）。カナキヌマブのサルＩＬ－１βに対して測定されたＫＤ値は、２．８４７μＭと、急速に解離されるパターンを示し、非常に低い結合能を有すると分析された（図７Ｇ、図７Ｈ及び図７Ｉ、表１）。
【表1】
【0076】
試験例４：レポータ細胞株を利用したＩＬ－１信号伝達経路抑制能評価
ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））は、分泌型レポータタンパク質である分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：secreted embryonic alkaline phosphatase）を、ヒトＩＬ－１α、ＩＬ－１βにより、濃度依存的に分泌する（https://www.invivogen.com/hek-blue-il1b）。前記細胞株において、ＩＬ－１とＩＬ－１阻害物質とを同時処理し、培養液内ＳＥＡＰを定量することにより、信号伝達経路の抑制能を測定した。ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株を、ＤＭＥＭ（１１９６５－０９２（Gibco））＋１０％ ＦＢＳ（１６１４０－０７１（Gibco））の培地内で培養した。細胞を，９６ウェルプレート（１６７００８（Thermo Fisher Scientific））において、完全培養培地内に、１×１０４細胞／ウェルにプレーティングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で一晩中培養した。無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１α（１０１２８－ＨＮＣＨ（Sino Biological））またはヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））と、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された０．０００１０２４ｎＭ、０．０００５１２ｎＭ、０．００２５６ｎＭ、０．０１２８ｎＭ、０．０６４ｎＭ、０．３ｎＭ２、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭのＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）を、１：１の比率で、３０分間予備混合した。この場合、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１αまたはヒトＩＬ－１βと、０．００００５１２ｎＭ、０．０００２５６ｎＭ、０．００１２８ｎＭ、０．００６４ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ ＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）が混合された形態で存在し、先に、一晩中の培養を介して準備された細胞培養プレートの培養液を吸引し、予備混合された培地を、ウェル当たり１００μｌになるように細胞に処理した後、５時間、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で培養した。その上澄み液を分析し、ＳＥＡＰレポータ遺伝子分析キット（Ｔ１０１７（Invitrogen））を利用し、ＩＬ－１阻害物質のＩＬ－１β信号伝達経路の抑制能を決定した。ただし、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１αまたはヒトＩＬ－１βのみ処理して測定された発光値の平均値を、ＳＥＡＰ分泌量１００％に換算し、処理される物質と同じ体積のＰＢＳ（１００１０（Gibco））を処理して測定された発光値の平均値を、ＳＥＡＰ分泌量０％に換算し、全ての値を計算した。ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株におけるＩＬ－１α抑制能分析結果、ＰＥＴ１０１は、０．２９３ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認し、リロナセプトは、０．３０８ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図８（Ａ））。その場合、カナキヌマブは、効果的な抑制を誘導することができなかった（図８（Ａ））。同一細胞におけるヒトＩＬ－１β抑制能分析結果、ＰＥＴ１０１は、０．２７５ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認し、リロナセプトは、０．２４３ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図８（Ｂ））。４ｎＭのＰＥＴ１０１またはリロナセプトが処理される場合、約９９．５％のＳＥＡＰ分泌抑制が、レポータ細胞株において確認されたが、４ｎＭカナキヌマブ処理条件においては、約３０％のＳＥＡＰ分泌抑制だけが確認された（図８（Ｂ））。
ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））は、分泌型レポータタンパク質である分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：secreted embryonic alkaline phosphatase）を、ヒトＩＬ－１α、ＩＬ－１βにより、濃度依存的に分泌する（https://www.invivogen.com/hek-blue-il1b）。前記細胞株において、ＩＬ－１とＩＬ－１阻害物質とを同時処理し、培養液内ＳＥＡＰを定量することにより、信号伝達経路の抑制能を測定した。ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株を、ＤＭＥＭ（１１９６５－０９２（Gibco））＋１０％ ＦＢＳ（１６１４０－０７１（Gibco））の培地内で培養した。細胞を，９６ウェルプレート（１６７００８（Thermo Fisher Scientific））において、完全培養培地内に、１×１０４細胞／ウェルにプレーティングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で一晩中培養した。無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１α（１０１２８－ＨＮＣＨ（Sino Biological））またはヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））と、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された０．０００１０２４ｎＭ、０．０００５１２ｎＭ、０．００２５６ｎＭ、０．０１２８ｎＭ、０．０６４ｎＭ、０．３ｎＭ２、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭのＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）を、１：１の比率で、３０分間予備混合した。この場合、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１αまたはヒトＩＬ－１βと、０．００００５１２ｎＭ、０．０００２５６ｎＭ、０．００１２８ｎＭ、０．００６４ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ ＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）が混合された形態で存在し、先に、一晩中の培養を介して準備された細胞培養プレートの培養液を吸引し、予備混合された培地を、ウェル当たり１００μｌになるように細胞に処理した後、５時間、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で培養した。その上澄み液を分析し、ＳＥＡＰレポータ遺伝子分析キット（Ｔ１０１７（Invitrogen））を利用し、ＩＬ－１阻害物質のＩＬ－１β信号伝達経路の抑制能を決定した。ただし、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１αまたはヒトＩＬ－１βのみ処理して測定された発光値の平均値を、ＳＥＡＰ分泌量１００％に換算し、処理される物質と同じ体積のＰＢＳ（１００１０（Gibco））を処理して測定された発光値の平均値を、ＳＥＡＰ分泌量０％に換算し、全ての値を計算した。ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株におけるＩＬ－１α抑制能分析結果、ＰＥＴ１０１は、０．２９３ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認し、リロナセプトは、０．３０８ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図８（Ａ））。その場合、カナキヌマブは、効果的な抑制を誘導することができなかった（図８（Ａ））。同一細胞におけるヒトＩＬ－１β抑制能分析結果、ＰＥＴ１０１は、０．２７５ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認し、リロナセプトは、０．２４３ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図８（Ｂ））。４ｎＭのＰＥＴ１０１またはリロナセプトが処理される場合、約９９．５％のＳＥＡＰ分泌抑制が、レポータ細胞株において確認されたが、４ｎＭカナキヌマブ処理条件においては、約３０％のＳＥＡＰ分泌抑制だけが確認された（図８（Ｂ））。
【0077】
試験例５：Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株を利用したＩＬ－１信号伝達経路抑制能評価
Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株は、ＩＬ－１βに反応性を示し、ホスホイノシチド３－リン酸化酵素（ＰＩ３Ｋ：phosphoinositide3-kinase）とインターロイキン－１関連リン酸化酵素－４（ＩＲＡＫ４：interleukin-1 receptor-associated kinase 4）との活性化を介し、インターロイキン－６（ＩＬ－６：interleukin-6）の分泌を誘導する（Hiroyuki Eda et al. Cell Biol Int. 2011）。該メカニズムを利用して人為的に作製された、レポータ細胞株ではないヒト肺癌細胞株において、ＰＥＴ１０１の効能評価を行った。Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株（ＣＣＬ－１８５（ＡＴＣＣ））は、ＲＰＭＩ－１６４０（ＬＭ００１－０３（Welgene））＋１０％ ＦＢＳ（１６１４０－０７１（Gibco））の培地内で培養した。細胞を、９６ウェルプレートにおいて、前述のような完全血清培地内に、２×１０５細胞／ウェルにプレーティングした後、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で７時間培養し、細胞付着を誘導した。次に、培地をウェルから除去し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地（ＬＭ００１－０３（Welgene））１００μｌを投入し、１８時間、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で断食させた。無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地内において、３０分間、室温で予備混合された最終濃度１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））と、適切な濃度のＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）とが、それぞれのウェルに１００μｌ処理された。処理３時間後、マウスＩＬ－６ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用し、上澄み液内ＩＬ－６の量を、製造社のマニュアルによって定量した。ＩＬ－６定量を介するＡ５４９細胞株のＩＬ－１β阻害能評価結果、ＰＥＴ１０１は、４４ｐＭ ＥＣ５０値を有すると確認され、リロナセプトは、それと類似した３７ｐＭのＥＣ５０値を有すると確認された。カナキヌマブは、同一条件において、２６７８ｐＭのＥＣ５０値を有すると確認された（図９）。
Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株は、ＩＬ－１βに反応性を示し、ホスホイノシチド３－リン酸化酵素（ＰＩ３Ｋ：phosphoinositide3-kinase）とインターロイキン－１関連リン酸化酵素－４（ＩＲＡＫ４：interleukin-1 receptor-associated kinase 4）との活性化を介し、インターロイキン－６（ＩＬ－６：interleukin-6）の分泌を誘導する（Hiroyuki Eda et al. Cell Biol Int. 2011）。該メカニズムを利用して人為的に作製された、レポータ細胞株ではないヒト肺癌細胞株において、ＰＥＴ１０１の効能評価を行った。Ａ５４９非小細胞性肺癌細胞株（ＣＣＬ－１８５（ＡＴＣＣ））は、ＲＰＭＩ－１６４０（ＬＭ００１－０３（Welgene））＋１０％ ＦＢＳ（１６１４０－０７１（Gibco））の培地内で培養した。細胞を、９６ウェルプレートにおいて、前述のような完全血清培地内に、２×１０５細胞／ウェルにプレーティングした後、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で７時間培養し、細胞付着を誘導した。次に、培地をウェルから除去し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地（ＬＭ００１－０３（Welgene））１００μｌを投入し、１８時間、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２湿潤培養器で断食させた。無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地内において、３０分間、室温で予備混合された最終濃度１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））と、適切な濃度のＩＬ－１阻害物質（ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブ）とが、それぞれのウェルに１００μｌ処理された。処理３時間後、マウスＩＬ－６ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用し、上澄み液内ＩＬ－６の量を、製造社のマニュアルによって定量した。ＩＬ－６定量を介するＡ５４９細胞株のＩＬ－１β阻害能評価結果、ＰＥＴ１０１は、４４ｐＭ ＥＣ５０値を有すると確認され、リロナセプトは、それと類似した３７ｐＭのＥＣ５０値を有すると確認された。カナキヌマブは、同一条件において、２６７８ｐＭのＥＣ５０値を有すると確認された（図９）。
【0078】
試験例６：ＰＥＴ１０１の熱安定性（thermal stability）分析
ＰＥＴ１０１の熱安定性（thermalstability）分析は、Protein Thermal ShiftTM Dye Kit（４４６１１４６（Applied Biosystems））を利用し、製造社マニュアルによって行われた。測定結果、リロナセプト、ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１は、それぞれ５６℃、５６℃、５５℃の類似したＴｍ値を有することを確認した（図１０）。
ＰＥＴ１０１の熱安定性（thermalstability）分析は、Protein Thermal ShiftTM Dye Kit（４４６１１４６（Applied Biosystems））を利用し、製造社マニュアルによって行われた。測定結果、リロナセプト、ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１は、それぞれ５６℃、５６℃、５５℃の類似したＴｍ値を有することを確認した（図１０）。
【0079】
試験例７：３７℃条件におけるＰＥＴ１０１の安定性分析
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１００１０（Gibco））に溶解されたＰＥＴ１０１の安定性分析は、３７℃条件で行われた。１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＴ１０１は、３７℃条件でインキュベーションし、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、２８日目に、サンプルは、－８０℃に移し、実施例１で言及された方式でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った（図１１Ａ）。還元条件と非還元条件との分析結果において、断片化（fragmentation）現象及び凝集（aggregation）現象は、確認されていない。サイズ排除クロマトグラフィを利用した凝集体の存在有無を分析した結果、停滞時間約６．２分ごろに、凝集体のピークが確認され、３７℃、７日目のサンプルまでは非常に低いピークが感知され（図１１Ｂ）、Empowerソフトウェア（Waters）を利用した面積分析において、測定されていない（表２）。３７℃、１０日目のサンプルにおいては、ＰＥＴ１０１が９９．１２％存在し、凝集体は、０．８８％が確認された（表２）。３７℃、２８日目のサンプルにおいては、ＰＥＴ１０１が９８．８５％存在し、凝集体は、１．１５％が確認された（表２）。
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１００１０（Gibco））に溶解されたＰＥＴ１０１の安定性分析は、３７℃条件で行われた。１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＴ１０１は、３７℃条件でインキュベーションし、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、２８日目に、サンプルは、－８０℃に移し、実施例１で言及された方式でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った（図１１Ａ）。還元条件と非還元条件との分析結果において、断片化（fragmentation）現象及び凝集（aggregation）現象は、確認されていない。サイズ排除クロマトグラフィを利用した凝集体の存在有無を分析した結果、停滞時間約６．２分ごろに、凝集体のピークが確認され、３７℃、７日目のサンプルまでは非常に低いピークが感知され（図１１Ｂ）、Empowerソフトウェア（Waters）を利用した面積分析において、測定されていない（表２）。３７℃、１０日目のサンプルにおいては、ＰＥＴ１０１が９９．１２％存在し、凝集体は、０．８８％が確認された（表２）。３７℃、２８日目のサンプルにおいては、ＰＥＴ１０１が９８．８５％存在し、凝集体は、１．１５％が確認された（表２）。
【表2】
【0080】
試験例８：ＰＥＴ１０１のＦｃＲｎ結合能評価
ＦｃＲｎに対するＰＥＴ１０１とリロナセプトとの結合能評価は、ＢＬＩ（bio-layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で分析された。ＨＩＳ１Ｋ（anti-penta－ＨＩＳ）バイオセンサ（１８－５１２０（ForteBio））が使用され、分析用バッファは、１０ｘ Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））とＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））とを１：９で混合し、最終ｐＨを６．０に製造し、ランニングバッファとして使用した。分析プレートの回転速度は、全ての条件において１，０００ｒｐｍで進めた。Ｈｉｓタグを含んでいるヒトＦｃＲｎ（ＦＣＭ－Ｈ８２Ｗ４（AcroBiosystems））を２μｇ／ｍｌ濃度にランニングバッファに希釈し、バイオセンサにローディングした。３１．２５～１０００ｎＭ ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブは、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、１２０秒で進め、続けて、該ランニングバッファにおいて、解離時間を１２０秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した。Ｋａ（０秒～１２０秒）値とＫｄ（１２０秒～１２５秒）値は、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出され、それを基に、平衡解離定数（ＫＤ）値を決定した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
ＦｃＲｎに対するＰＥＴ１０１とリロナセプトとの結合能評価は、ＢＬＩ（bio-layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で分析された。ＨＩＳ１Ｋ（anti-penta－ＨＩＳ）バイオセンサ（１８－５１２０（ForteBio））が使用され、分析用バッファは、１０ｘ Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））とＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））とを１：９で混合し、最終ｐＨを６．０に製造し、ランニングバッファとして使用した。分析プレートの回転速度は、全ての条件において１，０００ｒｐｍで進めた。Ｈｉｓタグを含んでいるヒトＦｃＲｎ（ＦＣＭ－Ｈ８２Ｗ４（AcroBiosystems））を２μｇ／ｍｌ濃度にランニングバッファに希釈し、バイオセンサにローディングした。３１．２５～１０００ｎＭ ＩＬ１Ｔ、ＰＥＴ１０１、リロナセプトまたはカナキヌマブは、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、１２０秒で進め、続けて、該ランニングバッファにおいて、解離時間を１２０秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した。Ｋａ（０秒～１２０秒）値とＫｄ（１２０秒～１２５秒）値は、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出され、それを基に、平衡解離定数（ＫＤ）値を決定した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【0081】
試験例９：Ｆｃガンマ受容体に対するＰＥＴ１０１の結合能評価
Ｆｃガンマ受容体に対するＰＥＴ１０１の結合能評価は、ＢＬＩ（bio-layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で分析した。ＨＩＳ１Ｋ（anti－penta－ＨＩＳ）バイオセンサ（１８－５１２０（ForteBio））を使用し、分析用バッファは、１０× Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））を、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））に希釈し、ランニングバッファとして製造して使用し、分析プレートの回転速度は、１，０００ｒｐｍで進めた。Ｈｉｓタグを含んでいるヒトＦｃγＲＩ（１２５７－ＦＣ（Ｒ＆Ｄ Systems））またはヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（４３２５－ＦＣ（Ｒ＆Ｄ Systems））を、２μｇ／ｍｌ濃度にランニングバッファに希釈し、バイオセンサにローディングした。結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、８０～１，２８０ｎＭ ＰＥＴ１０１またはリロナセプトに対し、１２０秒間の結合を進め、続けて、該ランニングバッファにおいて、１２０秒間の解離を進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した。ＦｃγＲＩに係わるＫＤは、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出し、該分析において、曲線当て嵌め（curve fitting）を行った区間は、Ｋａ（０秒～１２０秒）とＫｄ（１２０秒～２４０秒）とである。その場合、ＰＥＴ１０１とリロナセプトとのＦｃγＲＩに係わるＫＤ値は、それぞれ１９．８２ｎＭ、４５．７９ｎＭと確認された（図１３Ａ）。ＦｃγＲＩＩＩＡに係わるＫＤは、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出され、該分析において、曲線当て嵌めを遂行した区間は、Ｋａ（０秒～１２０秒）とＫｄ（１２０秒～１２５秒）とである。その場合、ＰＥＴ１０１とリロナセプトとのＦｃγＲＩＩＩＡに係わるＫＤ値は、それぞれ６６１ｎＭ、９１３ｎＭとで確認された（図１３Ｂ）。
Ｆｃガンマ受容体に対するＰＥＴ１０１の結合能評価は、ＢＬＩ（bio-layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で分析した。ＨＩＳ１Ｋ（anti－penta－ＨＩＳ）バイオセンサ（１８－５１２０（ForteBio））を使用し、分析用バッファは、１０× Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））を、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））に希釈し、ランニングバッファとして製造して使用し、分析プレートの回転速度は、１，０００ｒｐｍで進めた。Ｈｉｓタグを含んでいるヒトＦｃγＲＩ（１２５７－ＦＣ（Ｒ＆Ｄ Systems））またはヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（４３２５－ＦＣ（Ｒ＆Ｄ Systems））を、２μｇ／ｍｌ濃度にランニングバッファに希釈し、バイオセンサにローディングした。結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、８０～１，２８０ｎＭ ＰＥＴ１０１またはリロナセプトに対し、１２０秒間の結合を進め、続けて、該ランニングバッファにおいて、１２０秒間の解離を進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した。ＦｃγＲＩに係わるＫＤは、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出し、該分析において、曲線当て嵌め（curve fitting）を行った区間は、Ｋａ（０秒～１２０秒）とＫｄ（１２０秒～２４０秒）とである。その場合、ＰＥＴ１０１とリロナセプトとのＦｃγＲＩに係わるＫＤ値は、それぞれ１９．８２ｎＭ、４５．７９ｎＭと確認された（図１３Ａ）。ＦｃγＲＩＩＩＡに係わるＫＤは、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して算出され、該分析において、曲線当て嵌めを遂行した区間は、Ｋａ（０秒～１２０秒）とＫｄ（１２０秒～１２５秒）とである。その場合、ＰＥＴ１０１とリロナセプトとのＦｃγＲＩＩＩＡに係わるＫＤ値は、それぞれ６６１ｎＭ、９１３ｎＭとで確認された（図１３Ｂ）。
【0082】
試験例１０：ＰＥＴ１０１の投与濃度によるインビボ中和能評価
ＰＥＴ１０１の濃度によるインビボ中和能評価実験（ｎ＝５／グループ）のために、個体当たり約２０ｇの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６メスを使用した。動物実験進行と係わり、全ての実験手続きは、開始以前、メディトックス動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ：Institutional Animal Care and Use Committee）承認下で進められた。ＰＥＴ１０１のインビボ中和能評価は、以前の文献で確立された方法を利用して進められ、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、ヒトまたはサルのＩＬ－１αまたはＩＬ－１βを投与したとき、マウス血液内ＩＬ－６が増加される現象を利用した（Economides et al., Nat Med. 2003 & Lacy et al. mAbs. 2015）。具体的には、マウスに、人為的に外因性ヒトＩＬ－１βを投入した後、ＩＬ－６増加を、ＰＥＴ１０１がどれほど抑制することができるかということをリロナセプトと比較分析した。まず、０．００１（０．３倍）、０．００３（１倍）、０．０１（３倍）、０．０３（１０倍）、０．１（３０倍）、０．３（１００倍）、１（３００倍）ｍｇ／ｋｇのＰＥＴ１０１、または０．００１４（０．３倍）、０．００４７（１倍）、０．１４（３倍）、０．４６５（１０倍）、０．１４０（３０倍）、０．４６５（１００倍）、１．４０（３００倍）ｍｇ／ｋｇのリロナセプトが、マウスに皮下（ｓ．ｃ．）投与された（カッコ中の数値＝抗ＩＬ－１トラップモル数／後で投与される３００ｎｇ／ｋｇに該当するヒトＩＬ－１βモル数）。皮下投与２４時間後、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））が、腹腔（ｉ．ｐ．）投与方式で、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）で投与された。投与２時間後、各マウスの血清が確保された。マウス血清のＩＬ－６定量は、マウスＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用して行われた。抗ＩＬ－１トラップの投与なしに、同量のＰＢＳだけ皮下投与を進め、２４時間後、同量のＰＢＳを腹腔投与して確保された血清の定量されたＩＬ－６値を０％に計算し、抗ＩＬ－１トラップの投与なしに、同量のＰＢＳだけ皮下投与を進め、２４時間後、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ） ＩＬ－１βを腹腔投与して確保された血清の定量されたＩＬ－６値を１００％に計算する。それを基に、各グループの定量値は、抑制能（％）に変換された。分析結果、ＰＥＴ１０１のＥＣ５０値は、３．３２μｇ／ｋｇであり、リロナセプトのＥＣ５０値は、１０．５２μｇ／ｋｇであり、ＰＥＴ１０１がリロナセプト対比で、約３．１７倍すぐれた活性が確認された（図１４）。投与されたＩＬ－１β対比で、ＰＥＴ１０１またはリロナセプトを３倍（モル数基準）過量投与した場合、ＰＥＴ１０１は、約８０％の抑制能を示す一方、リロナセプトは、約５０％の抑制能を示す（図１４）。
ＰＥＴ１０１の濃度によるインビボ中和能評価実験（ｎ＝５／グループ）のために、個体当たり約２０ｇの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６メスを使用した。動物実験進行と係わり、全ての実験手続きは、開始以前、メディトックス動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ：Institutional Animal Care and Use Committee）承認下で進められた。ＰＥＴ１０１のインビボ中和能評価は、以前の文献で確立された方法を利用して進められ、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、ヒトまたはサルのＩＬ－１αまたはＩＬ－１βを投与したとき、マウス血液内ＩＬ－６が増加される現象を利用した（Economides et al., Nat Med. 2003 & Lacy et al. mAbs. 2015）。具体的には、マウスに、人為的に外因性ヒトＩＬ－１βを投入した後、ＩＬ－６増加を、ＰＥＴ１０１がどれほど抑制することができるかということをリロナセプトと比較分析した。まず、０．００１（０．３倍）、０．００３（１倍）、０．０１（３倍）、０．０３（１０倍）、０．１（３０倍）、０．３（１００倍）、１（３００倍）ｍｇ／ｋｇのＰＥＴ１０１、または０．００１４（０．３倍）、０．００４７（１倍）、０．１４（３倍）、０．４６５（１０倍）、０．１４０（３０倍）、０．４６５（１００倍）、１．４０（３００倍）ｍｇ／ｋｇのリロナセプトが、マウスに皮下（ｓ．ｃ．）投与された（カッコ中の数値＝抗ＩＬ－１トラップモル数／後で投与される３００ｎｇ／ｋｇに該当するヒトＩＬ－１βモル数）。皮下投与２４時間後、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））が、腹腔（ｉ．ｐ．）投与方式で、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）で投与された。投与２時間後、各マウスの血清が確保された。マウス血清のＩＬ－６定量は、マウスＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用して行われた。抗ＩＬ－１トラップの投与なしに、同量のＰＢＳだけ皮下投与を進め、２４時間後、同量のＰＢＳを腹腔投与して確保された血清の定量されたＩＬ－６値を０％に計算し、抗ＩＬ－１トラップの投与なしに、同量のＰＢＳだけ皮下投与を進め、２４時間後、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ） ＩＬ－１βを腹腔投与して確保された血清の定量されたＩＬ－６値を１００％に計算する。それを基に、各グループの定量値は、抑制能（％）に変換された。分析結果、ＰＥＴ１０１のＥＣ５０値は、３．３２μｇ／ｋｇであり、リロナセプトのＥＣ５０値は、１０．５２μｇ／ｋｇであり、ＰＥＴ１０１がリロナセプト対比で、約３．１７倍すぐれた活性が確認された（図１４）。投与されたＩＬ－１β対比で、ＰＥＴ１０１またはリロナセプトを３倍（モル数基準）過量投与した場合、ＰＥＴ１０１は、約８０％の抑制能を示す一方、リロナセプトは、約５０％の抑制能を示す（図１４）。
【0083】
試験例１１：ＰＥＴ１０１の投与時間によるインビボ中和能評価
ＰＥＴ１０１の経時的なインビボ中和能評価実験（ｎ＝５／グループ（総１６グループ））のために、個体当たり約２０ｇの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６メスを使用した。動物実験進行と係わり、全ての実験手続きは、開始以前、メディトックス動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）承認下に進められた。実験は、マウスにＰＥＴ１０１を投与した後、多様な時間において、人為的にヒトＩＬ－１βを投入して生成されるＩＬ－６の量を定量する方式で進められ、具体的には、投与後の１日目、２日目、３日目、６日目に残存するＰＥＴ１０１が、ＩＬ－６をどれほど抑制することができるかということを、リロナセプトと比較分析した。まず、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＥＴ１０１または１０ｍｇ／ｋｇリロナセプトを、マウスに皮下（ｓ．ｃ．）投与した。皮下投与、１日後、２日後、３日後、６日後、ＰＢＳまたはヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））を腹腔（ｉ．ｐ．）投与方式で、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）で投与した。投与２時間後、各マウスの血清を確保し、マウス血清のＩＬ－６の定量は、マウスＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用し、試験例５で言及された方式で行われた。定量分析結果、ＰＢＳ（ｓ．ｃ．）＋ＰＢＳ（ｉ．ｐ．）を投与したグループにおいては、時間にかかわらず、０～６ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ－６が定量された（図１５）。それは、正常Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの血液に、ＩＬ－６が存在しないか、あるいは微量存在すると解釈される（図１５）。ＰＢＳ（ｓ．ｃ．）＋ｈＩＬ－１β（ｉ．ｐ．）投与の場合、投与されたヒトＩＬ－１βが、マウスＩＬ－６の発現を誘導し、３，３５２～３，７６９ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が定量された。ＰＥＴ１０１が投与された場合、３日目まで、ＩＬ－６の誘導を完壁に抑制し、ＰＥＴ１０１投与６日後、ヒトＩＬ－１βを処理した条件においては、約２，００５ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が定量された（図１５）。リロナセプト投与群の場合、１日目でのみ、ＩＬ－６の誘導が完壁に抑制され、２日目、３日目、６日目に、それぞれ８ｐｇ／ｍｌ、３１ｐｇ／ｍｌ、２，３４８ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が血液において測定された（図１５）。本分析を介し、ＰＥＴ１０１は、マウス体内において、ヒトＩＬ－１βを抑制する効能の持続性側面において、リロナセプト対比で、優位にあるということを確認した（図１５）。
ＰＥＴ１０１の経時的なインビボ中和能評価実験（ｎ＝５／グループ（総１６グループ））のために、個体当たり約２０ｇの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６メスを使用した。動物実験進行と係わり、全ての実験手続きは、開始以前、メディトックス動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）承認下に進められた。実験は、マウスにＰＥＴ１０１を投与した後、多様な時間において、人為的にヒトＩＬ－１βを投入して生成されるＩＬ－６の量を定量する方式で進められ、具体的には、投与後の１日目、２日目、３日目、６日目に残存するＰＥＴ１０１が、ＩＬ－６をどれほど抑制することができるかということを、リロナセプトと比較分析した。まず、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＥＴ１０１または１０ｍｇ／ｋｇリロナセプトを、マウスに皮下（ｓ．ｃ．）投与した。皮下投与、１日後、２日後、３日後、６日後、ＰＢＳまたはヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））を腹腔（ｉ．ｐ．）投与方式で、３００ｎｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）で投与した。投与２時間後、各マウスの血清を確保し、マウス血清のＩＬ－６の定量は、マウスＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４０６（Ｒ＆Ｄ Systems））を利用し、試験例５で言及された方式で行われた。定量分析結果、ＰＢＳ（ｓ．ｃ．）＋ＰＢＳ（ｉ．ｐ．）を投与したグループにおいては、時間にかかわらず、０～６ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ－６が定量された（図１５）。それは、正常Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの血液に、ＩＬ－６が存在しないか、あるいは微量存在すると解釈される（図１５）。ＰＢＳ（ｓ．ｃ．）＋ｈＩＬ－１β（ｉ．ｐ．）投与の場合、投与されたヒトＩＬ－１βが、マウスＩＬ－６の発現を誘導し、３，３５２～３，７６９ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が定量された。ＰＥＴ１０１が投与された場合、３日目まで、ＩＬ－６の誘導を完壁に抑制し、ＰＥＴ１０１投与６日後、ヒトＩＬ－１βを処理した条件においては、約２，００５ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が定量された（図１５）。リロナセプト投与群の場合、１日目でのみ、ＩＬ－６の誘導が完壁に抑制され、２日目、３日目、６日目に、それぞれ８ｐｇ／ｍｌ、３１ｐｇ／ｍｌ、２，３４８ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６が血液において測定された（図１５）。本分析を介し、ＰＥＴ１０１は、マウス体内において、ヒトＩＬ－１βを抑制する効能の持続性側面において、リロナセプト対比で、優位にあるということを確認した（図１５）。
【0084】
試験例１２：サイノモルガス・サルを利用したＰＥＴ１０１の霊長類ＰＫ分析
ＰＥＴ１０１のサイノモルガス・サルを利用したＰＫ分析を行った。対照物質としては、リロナセプトを利用した。ＰＥＴ１０１、リロナセプトを、皮下（ｓ．ｃ．）投与経路で３ｍｇ／ｋｇ投与した（ｎ＝３／グループ）。０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１日、２日、３日、６日、１０日、１４日、２１日、２８日に、血液サンプルを確保し、血漿分離を行った。血漿内のＰＥＴ１０１、リロナセプトの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。簡略に、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（３５９０（Corning））に、１μｇ／ｍｌ高親和度キメリック抗ヒト－ＩＬ－１Ｒマウス抗体を、４℃で一晩中保管することによってコーティングを行い、翌日、ＰＢＳＴでプレート洗浄を行い、常温で１時間、３％ ＢＳＡ溶液（Sigma）を利用してブロッキングを進め、引き続くＰＢＳＴ洗浄を行った。それぞれの時間において確保された血漿は、適切に希釈し、コーティングされた抗ヒト－ＩＬ－１Ｒウサギ抗体に対する結合反応を誘導した。ＰＢＳＴを利用した洗浄後、高親和度キメリック抗ヒト－ＩＬ－１ＲＡｃＰウサギ抗体で処理し、１時間、常温で結合反応を誘導した。ＰＢＳＴを利用して洗浄を進め、ペルオキシダーゼ接合された抗ウサギＩｇＧ抗体（７０７４Ｓ（Cell Signaling Technology））で処理し、常温で１時間結合を誘導した。ＰＢＳＴを利用し、３回プレート洗浄を遂行し、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））で処理し、常温である暗室において、２０分間、反応を誘導した。１Ｎ硫酸溶液（２５５（DUKSAN））で処理し、反応を終了させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘマルチモードプレートリーダ（ｉ３ｘ（Molecular Devices））を利用し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＰＥＴ１０１とリロナセプトとの標準定量試料を作製し、定量に使用し、各濃度を含むナイーブサイノモルガス血清から生成された標準曲線を介し、各時間別に、分析物質の濃度を定量した。３ｍｇ／ｋｇ皮下投与において、ＰＥＴ１０１とリロナセプトは、それぞれ約５９．３時間、約６２．５時間の類似したレベルの半減期（Ｔ１／２）を有することを確認した（表３）。しかしながら、ＰＥＴ１０１の血中濃度・時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ（area under the curve from time 0 to infinity））は、リロナセプト対比で、２．１７倍に測定され、サル体内薬物露出において優位にあることが確認された（図１６、表３）。
ＰＥＴ１０１のサイノモルガス・サルを利用したＰＫ分析を行った。対照物質としては、リロナセプトを利用した。ＰＥＴ１０１、リロナセプトを、皮下（ｓ．ｃ．）投与経路で３ｍｇ／ｋｇ投与した（ｎ＝３／グループ）。０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１日、２日、３日、６日、１０日、１４日、２１日、２８日に、血液サンプルを確保し、血漿分離を行った。血漿内のＰＥＴ１０１、リロナセプトの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。簡略に、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（３５９０（Corning））に、１μｇ／ｍｌ高親和度キメリック抗ヒト－ＩＬ－１Ｒマウス抗体を、４℃で一晩中保管することによってコーティングを行い、翌日、ＰＢＳＴでプレート洗浄を行い、常温で１時間、３％ ＢＳＡ溶液（Sigma）を利用してブロッキングを進め、引き続くＰＢＳＴ洗浄を行った。それぞれの時間において確保された血漿は、適切に希釈し、コーティングされた抗ヒト－ＩＬ－１Ｒウサギ抗体に対する結合反応を誘導した。ＰＢＳＴを利用した洗浄後、高親和度キメリック抗ヒト－ＩＬ－１ＲＡｃＰウサギ抗体で処理し、１時間、常温で結合反応を誘導した。ＰＢＳＴを利用して洗浄を進め、ペルオキシダーゼ接合された抗ウサギＩｇＧ抗体（７０７４Ｓ（Cell Signaling Technology））で処理し、常温で１時間結合を誘導した。ＰＢＳＴを利用し、３回プレート洗浄を遂行し、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））で処理し、常温である暗室において、２０分間、反応を誘導した。１Ｎ硫酸溶液（２５５（DUKSAN））で処理し、反応を終了させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘマルチモードプレートリーダ（ｉ３ｘ（Molecular Devices））を利用し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＰＥＴ１０１とリロナセプトとの標準定量試料を作製し、定量に使用し、各濃度を含むナイーブサイノモルガス血清から生成された標準曲線を介し、各時間別に、分析物質の濃度を定量した。３ｍｇ／ｋｇ皮下投与において、ＰＥＴ１０１とリロナセプトは、それぞれ約５９．３時間、約６２．５時間の類似したレベルの半減期（Ｔ１／２）を有することを確認した（表３）。しかしながら、ＰＥＴ１０１の血中濃度・時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ（area under the curve from time 0 to infinity））は、リロナセプト対比で、２．１７倍に測定され、サル体内薬物露出において優位にあることが確認された（図１６、表３）。
【表3】
【0085】
比較例２：ＩＬ－１とＩＬ－１８との二重特異性保有ヘテロ二量体ポリペプチド（１１８Ｔ３）製造
まず、ＩＬ１ＴのＦｃ領域Ｃ末端部位に、ヒトＩＬ１８ＢＰを融合させたヘテロ二量体を作製した（図１７Ａの（Ａ））。ヒトＩＬ１８ＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ７６３７４．１）を構成するアミノ酸残基３１～１９４の遺伝子配列を化学的に合成し（Integrated ＤＮＡ Technologies、ＩＡ、米国）、それぞれの発現のためのベクターにクローニングした。具体的には、ＩＬ１Ｒ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１０）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１１）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターの同時形質転換（co－transfection）によって発現されるヘテロ二量体を１１８Ｔ３という（図１７Ａの（Ａ））。１１８Ｔ３の一時発現は、比較例１と同一方式によって進められ、１２日目培養液は、Sartoclear Dynamics登録商標 ＬａｂＶ（ＳＤＬＶ－１０００－４０Ｃ－Ｅ（Sartorius））フィルタシステムを利用して濾過された後、ＨｉＴｒａｐ MabSelect ＳｕＲｅ（１１００３４９３（ＧＥ Healthcare））精製カラムを利用して精製された。最終精製産物は、比較例１と同一方式により、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を利用して分析した（図１７Ａの（Ｂ））。分析結果、還元条件においては、約１１０ｋＤａにおいて、単量体混合物が確認され、非還元条件においては、約２２０ｋＤａにおいて、ヘテロ二量体とホモ二量体との混合物と推定される産物と共に、約１１０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認された（図１７Ｂの（Ｂ））。
まず、ＩＬ１ＴのＦｃ領域Ｃ末端部位に、ヒトＩＬ１８ＢＰを融合させたヘテロ二量体を作製した（図１７Ａの（Ａ））。ヒトＩＬ１８ＢＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ７６３７４．１）を構成するアミノ酸残基３１～１９４の遺伝子配列を化学的に合成し（Integrated ＤＮＡ Technologies、ＩＡ、米国）、それぞれの発現のためのベクターにクローニングした。具体的には、ＩＬ１Ｒ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１０）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１１）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターの同時形質転換（co－transfection）によって発現されるヘテロ二量体を１１８Ｔ３という（図１７Ａの（Ａ））。１１８Ｔ３の一時発現は、比較例１と同一方式によって進められ、１２日目培養液は、Sartoclear Dynamics登録商標 ＬａｂＶ（ＳＤＬＶ－１０００－４０Ｃ－Ｅ（Sartorius））フィルタシステムを利用して濾過された後、ＨｉＴｒａｐ MabSelect ＳｕＲｅ（１１００３４９３（ＧＥ Healthcare））精製カラムを利用して精製された。最終精製産物は、比較例１と同一方式により、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を利用して分析した（図１７Ａの（Ｂ））。分析結果、還元条件においては、約１１０ｋＤａにおいて、単量体混合物が確認され、非還元条件においては、約２２０ｋＤａにおいて、ヘテロ二量体とホモ二量体との混合物と推定される産物と共に、約１１０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認された（図１７Ｂの（Ｂ））。
【0086】
実施例２：ＩＬ－１とＩＬ－１８との二重特異性保有κλヘテロ二量体ポリペプチド（１１８Ｔ３ｖ０１）製造
ＰＥＴ１０１のＦｃ領域Ｃ末端部位に、ヒトＩＬ１８ＢＰを融合させたヘテロ二量体を作製した（図１７Ｂの（Ａ））。具体的には、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１２）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１３）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターの同時形質転換（co－transfection）によって発現されるヘテロ二量体を１１８Ｔ３ｖ０１という（図１７Ｂの（Ａ））。詳細には、実施例１で言及された方式でもって発現を進めた後１２日目に養液を回収し、Sartoclear Dynamics登録商標 ＬａｂＶ（ＳＤＬＶ－１０００－４０Ｃ－Ｅ（Sartorius））フィルタシステムを利用して濾過を行った後、ＨｉＴｒａｐ MabSelect ＳｕＲｅ（１１００３４９３（ＧＥ Healthcare））精製カラムを利用し、親和度クロマトグラフィ（affinity chromatography）基盤の精製を進めた。一次精製産物につき、KappaSelect樹脂（１７５４５８０１（ＧＥ Healthcare））と、引続くLambdaFabSelect樹脂（１７５４８２０１（ＧＥ Healthcare））とを利用した親和度クロマトグラフィを遂行した。一次（MabSelect）精製産物、二次（KappaSelect）精製産物、三次（LambdaFabSelect）精製産物の透析、濃縮、定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、実施例１で言及された方式によって遂行された。MabSelect一次精製溶出液の非還元条件ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果において、約１３０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認され、三次精製まで完了した場合、単量体が確認されず、約２５０ｋＤａにおいて、１１８Ｔ３ｖ０１と推定される二量体産物が確認された（図１７Ｂの（Ｂ））。
ＰＥＴ１０１のＦｃ領域Ｃ末端部位に、ヒトＩＬ１８ＢＰを融合させたヘテロ二量体を作製した（図１７Ｂの（Ａ））。具体的には、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－（Ｇ４Ｓ）２－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１２）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１３）とに該当するポリペプチドを発現することができるベクターの同時形質転換（co－transfection）によって発現されるヘテロ二量体を１１８Ｔ３ｖ０１という（図１７Ｂの（Ａ））。詳細には、実施例１で言及された方式でもって発現を進めた後１２日目に養液を回収し、Sartoclear Dynamics登録商標 ＬａｂＶ（ＳＤＬＶ－１０００－４０Ｃ－Ｅ（Sartorius））フィルタシステムを利用して濾過を行った後、ＨｉＴｒａｐ MabSelect ＳｕＲｅ（１１００３４９３（ＧＥ Healthcare））精製カラムを利用し、親和度クロマトグラフィ（affinity chromatography）基盤の精製を進めた。一次精製産物につき、KappaSelect樹脂（１７５４５８０１（ＧＥ Healthcare））と、引続くLambdaFabSelect樹脂（１７５４８２０１（ＧＥ Healthcare））とを利用した親和度クロマトグラフィを遂行した。一次（MabSelect）精製産物、二次（KappaSelect）精製産物、三次（LambdaFabSelect）精製産物の透析、濃縮、定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、実施例１で言及された方式によって遂行された。MabSelect一次精製溶出液の非還元条件ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果において、約１３０ｋＤａにおいて、アセンブリされていない単量体が確認され、三次精製まで完了した場合、単量体が確認されず、約２５０ｋＤａにおいて、１１８Ｔ３ｖ０１と推定される二量体産物が確認された（図１７Ｂの（Ｂ））。
【0087】
試験例１３：酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）を利用したＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体のヒトＩＬ－１β、ヒトＩＬ－１８結合能分析
ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体である１１８Ｔ３と１１８Ｔ３ｖ０１とのヒトＩＬ－１β及びヒトＩＬ－１８に対する結合分析を、試験例２と同一方式でもって、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。分析結果、１１８Ｔ３と１１８Ｔ３ｖ０１は、類似したヒトＩＬ－１β結合能を有するということを確認し（図１８（Ａ））、ヒトＩＬ－１８結合能も、類似しているということを確認した（図１８（Ｂ））。
ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体である１１８Ｔ３と１１８Ｔ３ｖ０１とのヒトＩＬ－１β及びヒトＩＬ－１８に対する結合分析を、試験例２と同一方式でもって、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。分析結果、１１８Ｔ３と１１８Ｔ３ｖ０１は、類似したヒトＩＬ－１β結合能を有するということを確認し（図１８（Ａ））、ヒトＩＬ－１８結合能も、類似しているということを確認した（図１８（Ｂ））。
【0088】
試験例１４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介する１１８Ｔ３ｖ０１の結合特性分析
１１８Ｔ３ｖ０１が、ヒトＩＬ－１βとヒトＩＬ－１８とに同時に結合するか否かということを確認するために、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を利用し、表面プラズモン共鳴分析を行った。以下の分析において使用された全てのサンプルに、希釈のために、かつ移動相として、１ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（ＢＲ１００６６９（ＧＥ Healthcare））を使用した。詳細には、Human Antibody Capture Kit（ＢＲ１００８３９（ＧＥHealthcare））に含まれた抗ヒトＦｃ抗体を、アミンカップリングキット（ＢＲ１０００５０（ＧＥHealthcare））を利用し、製造社マニュアルにより、Series Ｓ ＣＭ５センサチップ（ＢＲ１００５３０（ＧＥ Healthcare））に固定した。抗ヒトＦｃが固定されたセンサに、１００ｎＭ １１８Ｔ３ｖ０１（２５μｇ／ｍｌ）を、１０μｌ／分流速で、１分間ローディングし、２分間、平衡状態を維持し、センサ表面に１７６６．１ＲＵの１１８Ｔ３ｖ０１がローディングされることを確認した（図１９）。その後、続けて、３分間、２００ｎＭヒトＩＬ－１８（１０１１９－ＨＮＣＥ（Sino Biological））の結合反応を誘導させ、５分間、解離反応を誘導させ、平衡状態であるとき、ヒトＩＬ－１８は、１３４．５ＲＵが結合することを確認した（図１９）。続けて、２００ｎＭヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））の結合反応と解離反応とを、それぞれ３分間、５分間進め、ヒトＩＬ－１βは、１３７．５ＲＵ結合することを確認した。表面プラズモン共鳴分析におけるＲＵ値は、センサ表面にローディングされた物質の質量に比例し、１ＲＵは、１ｐｇ／ｍｍ２の物質がセンサに固定されたり、相互作用によって結合されたりすることを意味する。１１８Ｔ３ｖ０１の分子量は、約２５０ｋＤａであり、ヒトＩＬ－１βとヒトＩＬ－１８は、分子量が約１８．４ｋＤａである（図１９）。それを基に、１個の１１８Ｔ３ｖ０１タンパク質は、１．０３個のヒトＩＬ－１８と結合し、同時に１．０６個のヒトＩＬ－１βと結合することを確認した（図１９）。１１８Ｔ３ｖ０１は、Ｆｃ領域Ｃ末端に、ヒトＩＬ－１８と結合することができるヒトＩＬ１８ＢＰタンパク質２個が結合されているが、それらのうち１個のみがＩＬ－１８と結合すると確認された（図１９）。それは、結合された２個のＩＬ１８ＢＰタンパク質間に、立体障害（sterich indrance）が生じていることを示唆する。
１１８Ｔ３ｖ０１が、ヒトＩＬ－１βとヒトＩＬ－１８とに同時に結合するか否かということを確認するために、Biacore Ｔ２００（ＧＥ Healthcare）を利用し、表面プラズモン共鳴分析を行った。以下の分析において使用された全てのサンプルに、希釈のために、かつ移動相として、１ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（ＢＲ１００６６９（ＧＥ Healthcare））を使用した。詳細には、Human Antibody Capture Kit（ＢＲ１００８３９（ＧＥHealthcare））に含まれた抗ヒトＦｃ抗体を、アミンカップリングキット（ＢＲ１０００５０（ＧＥHealthcare））を利用し、製造社マニュアルにより、Series Ｓ ＣＭ５センサチップ（ＢＲ１００５３０（ＧＥ Healthcare））に固定した。抗ヒトＦｃが固定されたセンサに、１００ｎＭ １１８Ｔ３ｖ０１（２５μｇ／ｍｌ）を、１０μｌ／分流速で、１分間ローディングし、２分間、平衡状態を維持し、センサ表面に１７６６．１ＲＵの１１８Ｔ３ｖ０１がローディングされることを確認した（図１９）。その後、続けて、３分間、２００ｎＭヒトＩＬ－１８（１０１１９－ＨＮＣＥ（Sino Biological））の結合反応を誘導させ、５分間、解離反応を誘導させ、平衡状態であるとき、ヒトＩＬ－１８は、１３４．５ＲＵが結合することを確認した（図１９）。続けて、２００ｎＭヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））の結合反応と解離反応とを、それぞれ３分間、５分間進め、ヒトＩＬ－１βは、１３７．５ＲＵ結合することを確認した。表面プラズモン共鳴分析におけるＲＵ値は、センサ表面にローディングされた物質の質量に比例し、１ＲＵは、１ｐｇ／ｍｍ２の物質がセンサに固定されたり、相互作用によって結合されたりすることを意味する。１１８Ｔ３ｖ０１の分子量は、約２５０ｋＤａであり、ヒトＩＬ－１βとヒトＩＬ－１８は、分子量が約１８．４ｋＤａである（図１９）。それを基に、１個の１１８Ｔ３ｖ０１タンパク質は、１．０３個のヒトＩＬ－１８と結合し、同時に１．０６個のヒトＩＬ－１βと結合することを確認した（図１９）。１１８Ｔ３ｖ０１は、Ｆｃ領域Ｃ末端に、ヒトＩＬ－１８と結合することができるヒトＩＬ１８ＢＰタンパク質２個が結合されているが、それらのうち１個のみがＩＬ－１８と結合すると確認された（図１９）。それは、結合された２個のＩＬ１８ＢＰタンパク質間に、立体障害（sterich indrance）が生じていることを示唆する。
【0089】
実施例３：ＩＬ－１とＩＬ－１８との二重特異性保有κλヘテロ二量体最適化（１１８Ｔ３Ｂ）
試験例１４において、１１８Ｔ３ｖ０１に存在するヒトＩＬ１８ＢＰタンパク質２個のうち１個は、ターゲット結合に参与していないということを確認した。不要に結合された１個のＩＬ１８ＢＰを除去し、分子量を減らすために、ノブ部分のＩＬ１８ＢＰを除去した１１８Ｔ３Ｂを作製した（図２０（Ａ））。１１８Ｔ３Ｂを発現するために、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）（配列番号８）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１３）とをコーディングする発現ベクターでもって、比較例１で言及された方式で発現が行われ、実施例１で言及された方式で精製が行われた（図２０（Ｂ））。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果、還元条件において、約９０ｋＤａと約１３０ｋＤａとの単量体が確認され、非還元条件において、三次精製後、単量体が除去され、約２２０ｋＤａにおいて、１１８Ｔ３Ｂヘテロ二量体と推定される高純度物質が確保されたことを確認した（図２０（Ｂ））。
試験例１４において、１１８Ｔ３ｖ０１に存在するヒトＩＬ１８ＢＰタンパク質２個のうち１個は、ターゲット結合に参与していないということを確認した。不要に結合された１個のＩＬ１８ＢＰを除去し、分子量を減らすために、ノブ部分のＩＬ１８ＢＰを除去した１１８Ｔ３Ｂを作製した（図２０（Ａ））。１１８Ｔ３Ｂを発現するために、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）（配列番号８）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７ｄｅｌ）－ＩＬ１８ＢＰ（配列番号１３）とをコーディングする発現ベクターでもって、比較例１で言及された方式で発現が行われ、実施例１で言及された方式で精製が行われた（図２０（Ｂ））。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果、還元条件において、約９０ｋＤａと約１３０ｋＤａとの単量体が確認され、非還元条件において、三次精製後、単量体が除去され、約２２０ｋＤａにおいて、１１８Ｔ３Ｂヘテロ二量体と推定される高純度物質が確保されたことを確認した（図２０（Ｂ））。
【0090】
試験例１５：ＩＬ－１とＩＬ－１８とに対する１１８Ｔ３Ｂの結合能評価
ヒトＩＬ－１α（２００－ＬＡ（Ｒ＆Ｄ Systems））、ヒトＩＬ－１β（２０１－ＬＢ（Ｒ＆Ｄ Systems））、サルＩＬ－１β（１３１８－ＲＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））、マウスＩＬ－１β（４０１－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））、ヒトＩＬ－１８（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））、サルＩＬ－１８（２５４８－ＲＭ（Ｒ＆ＤSystems））、マウスＩＬ－１８（５００７３－ＭＮＣＥ（Sino Biological））に対する１１８Ｔ３Ｂの結合能評価は、ＢＬＩ（bio－layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で行われた。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Capture（ＡＨＣ）バイオセンサ（ForteBio、１８－５０６３）が使用され、分析用バッファは、１０ｘ Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））を、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））で希釈し、ランニングバッファに製造して使用し、分析プレートの回転速度は、１，０００ｒｐｍで進めた。１１８Ｔ３Ｂは、２０μｇ／ｍｌ濃度で、ランニングバッファに希釈し、バイオセンサに５分間ローディングした。０．２５～８ｎＭのヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１β、サルＩＬ－１β、マウスＩＬ－１βは、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、３００秒で進めら、続けて、ランニングバッファでもって、解離時間を１，２００秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。１～６４ｎＭのヒトＩＬ－１８、サルＩＬ－１８、マウスＩＬ－１８は、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、３００秒で進められ、続けて、ランニングバッファにおいて、解離時間を６００秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した（図２１Ｃ）。Ｋａ値とＫｄ値は、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して測定し、それを基に、平衡解離定数（ＫＤ）値を決定した（図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃ）。
ヒトＩＬ－１α（２００－ＬＡ（Ｒ＆Ｄ Systems））、ヒトＩＬ－１β（２０１－ＬＢ（Ｒ＆Ｄ Systems））、サルＩＬ－１β（１３１８－ＲＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））、マウスＩＬ－１β（４０１－ＭＬ（Ｒ＆Ｄ Systems））、ヒトＩＬ－１８（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））、サルＩＬ－１８（２５４８－ＲＭ（Ｒ＆ＤSystems））、マウスＩＬ－１８（５００７３－ＭＮＣＥ（Sino Biological））に対する１１８Ｔ３Ｂの結合能評価は、ＢＬＩ（bio－layer interferometry）分析装備であるＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（ForteBio）を利用し、３０℃条件で行われた。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Capture（ＡＨＣ）バイオセンサ（ForteBio、１８－５０６３）が使用され、分析用バッファは、１０ｘ Kinetics Buffer（１８－１０４２（ForteBio））を、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１００１０（Gibco））で希釈し、ランニングバッファに製造して使用し、分析プレートの回転速度は、１，０００ｒｐｍで進めた。１１８Ｔ３Ｂは、２０μｇ／ｍｌ濃度で、ランニングバッファに希釈し、バイオセンサに５分間ローディングした。０．２５～８ｎＭのヒトＩＬ－１α、ヒトＩＬ－１β、サルＩＬ－１β、マウスＩＬ－１βは、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、３００秒で進めら、続けて、ランニングバッファでもって、解離時間を１，２００秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。１～６４ｎＭのヒトＩＬ－１８、サルＩＬ－１８、マウスＩＬ－１８は、結合速度定数（Ｋａ）を測定するために、結合時間は、３００秒で進められ、続けて、ランニングバッファにおいて、解離時間を６００秒で進め、解離速度定数（Ｋｄ）を決定した（図２１Ｃ）。Ｋａ値とＫｄ値は、Ｏｃｔｅｔ分析用ソフトウェア（ForteBio）において、１：１結合モデルを介して測定し、それを基に、平衡解離定数（ＫＤ）値を決定した（図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃ）。
【0091】
試験例１６：レポータ細胞株を利用した、ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体のＩＬ－１、ＩＬ－１８信号伝達経路抑制能評価
ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体である１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３ＢとのヒトＩＬ－１β信号伝達経路抑制能評価のために、試験例４で言及された、ヒトＩＬ－１βレポータ細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））及び実験方法を利用した。分析結果、１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３Ｂは、それぞれ１２３ｐＭ、１３５ｐＭの類似したＥＣ５０値を有することを確認した（図２２（Ａ））。１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３ＢとのヒトＩＬ－１８に対する抑制能を分析するために、ＩＬ－１８レポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｈｍｉｌ１８（Invivogen））を利用し、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１８（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））を使用し、試験例４と同一方法で分析を進めた。分析結果、１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３Ｂは、それぞれ、３９２ｐＭ、３０５ｐＭの類似したＥＣ５０値を有することを確認した（図２２（Ｂ））。
ＩＬ－１／ＩＬ－１８二重特異性ヘテロ二量体である１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３ＢとのヒトＩＬ－１β信号伝達経路抑制能評価のために、試験例４で言及された、ヒトＩＬ－１βレポータ細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））及び実験方法を利用した。分析結果、１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３Ｂは、それぞれ１２３ｐＭ、１３５ｐＭの類似したＥＣ５０値を有することを確認した（図２２（Ａ））。１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３ＢとのヒトＩＬ－１８に対する抑制能を分析するために、ＩＬ－１８レポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｈｍｉｌ１８（Invivogen））を利用し、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１８（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））を使用し、試験例４と同一方法で分析を進めた。分析結果、１１８Ｔ３ｖ０１と１１８Ｔ３Ｂは、それぞれ、３９２ｐＭ、３０５ｐＭの類似したＥＣ５０値を有することを確認した（図２２（Ｂ））。
【0092】
実施例４：ＩＬ－１とＴＧＦ－βとの二重特異性保有κλヘテロ二量体ポリペプチド（ＰＥＴ３０１）製造
ヒトＴＧＦβＲＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＺ５８３７７．１）の細胞外部位を構成するアミノ酸残基２４ないし１８４のアミノ酸残基を暗号化する遺伝子配列を、化学的に合成した（Integrated ＤＮＡ Technologies、ＩＡ、米国）。合成された遺伝子は、ＸｈｏＩ制限部位、ＸｂａＩ制限部位を介し、それぞれの発現のためのベクターにクローニングして得られた陽性クローンは、ＤＮＡシークエンシングを介して検証された。具体的には、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７Ａ）－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１４）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７Ａ）－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１５）とに該当するポリペプチドを発現するベクターの同時形質転換により、生産細胞株で発現されるヘテロ二量体をＰＥＴ３０１と言う（図２３（Ａ））。ＩＬ－１／ＴＧＦ－β二重特異性ヘテロ二量体は、比較例１で言及された方式によって一時発現が行われ、実施例１で言及された方式で精製が行われた。各精製段階別産物は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を利用して分析が行われた（図２３（Ｂ））。分析結果、還元条件においては、約１１０ｋＤａにおいて、単量体が確認され、非還元条件においては、三次精製後、単量体が除去され、約２２０ｋＤａにおいて、ＰＥＴ３０１ヘテロ二量体と推定される産物が確認された（図２３（Ｂ））。
ヒトＴＧＦβＲＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＺ５８３７７．１）の細胞外部位を構成するアミノ酸残基２４ないし１８４のアミノ酸残基を暗号化する遺伝子配列を、化学的に合成した（Integrated ＤＮＡ Technologies、ＩＡ、米国）。合成された遺伝子は、ＸｈｏＩ制限部位、ＸｂａＩ制限部位を介し、それぞれの発現のためのベクターにクローニングして得られた陽性クローンは、ＤＮＡシークエンシングを介して検証された。具体的には、ＩＬ１Ｒ－κ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｋ４４７Ａ）－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１４）と、ＩＬ１ＲＡｃＰ－λ定常領域－hinge region－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４４７Ａ）－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１５）とに該当するポリペプチドを発現するベクターの同時形質転換により、生産細胞株で発現されるヘテロ二量体をＰＥＴ３０１と言う（図２３（Ａ））。ＩＬ－１／ＴＧＦ－β二重特異性ヘテロ二量体は、比較例１で言及された方式によって一時発現が行われ、実施例１で言及された方式で精製が行われた。各精製段階別産物は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を利用して分析が行われた（図２３（Ｂ））。分析結果、還元条件においては、約１１０ｋＤａにおいて、単量体が確認され、非還元条件においては、三次精製後、単量体が除去され、約２２０ｋＤａにおいて、ＰＥＴ３０１ヘテロ二量体と推定される産物が確認された（図２３（Ｂ））。
【0093】
試験例１７：酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）を利用したＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β、ヒトＴＧＦ－βに対する結合能分析
ＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β、ヒトＴＧＦ－βに対する結合分析を、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。９６ウェル免疫吸着検査用プレート（３５９０（Corning））に、６０ｎｇ／ウェル濃度で、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））、ヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Systems、７７５４－ＢＨ）またはヒトＴＧＦ－β３（８４２０－Ｂ３（Ｒ＆Ｄ Systems））をコーティングした。翌日、Phosphate Buffered Saline with Tween－２０（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ１１９２（ＰＢＳＴ））を利用し、プレート洗浄を行った。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：bovine serum albumin）が添加されたＰＢＳＴを利用してブロッキングを行い、常温で１時間インキュベーションした後、３回プレート洗浄を進めた。ＰＥＴ３０１は、適切な濃度に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈し、各ウェルにおいて処理され、１時間、常温で結合を誘導し、３回プレート洗浄を進めた。ペルオキシダーゼが結合された抗ヒトＩｇＧＦｃ塩素抗体（３１４１３（Invitrogen））を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈（１：１０，０００）し、結合を誘導し、ＰＢＳＴを利用し、３回洗浄を行い、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））を反応させた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度を基に、ＥＣ５０値をPrism７ソフトウェア（GraphPad Software）を利用して算出した（図２４Ａの（Ａ）、図２４Ａの（Ｂ）、図２４Ｂの（Ａ）、表４）。
ＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β、ヒトＴＧＦ－βに対する結合分析を、ＥＬＩＳＡ法を利用して行った。９６ウェル免疫吸着検査用プレート（３５９０（Corning））に、６０ｎｇ／ウェル濃度で、ヒトＩＬ－１β（１０１３９－ＨＮＡＥ（Sino Biological））、ヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Systems、７７５４－ＢＨ）またはヒトＴＧＦ－β３（８４２０－Ｂ３（Ｒ＆Ｄ Systems））をコーティングした。翌日、Phosphate Buffered Saline with Tween－２０（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ１１９２（ＰＢＳＴ））を利用し、プレート洗浄を行った。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：bovine serum albumin）が添加されたＰＢＳＴを利用してブロッキングを行い、常温で１時間インキュベーションした後、３回プレート洗浄を進めた。ＰＥＴ３０１は、適切な濃度に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈し、各ウェルにおいて処理され、１時間、常温で結合を誘導し、３回プレート洗浄を進めた。ペルオキシダーゼが結合された抗ヒトＩｇＧＦｃ塩素抗体（３１４１３（Invitrogen））を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈（１：１０，０００）し、結合を誘導し、ＰＢＳＴを利用し、３回洗浄を行い、ＴＭＢ基質溶液（３４０２８（Thermo Fisher Scientific））を反応させた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度を基に、ＥＣ５０値をPrism７ソフトウェア（GraphPad Software）を利用して算出した（図２４Ａの（Ａ）、図２４Ａの（Ｂ）、図２４Ｂの（Ａ）、表４）。
【0094】
ＰＥＴ３０１とヒトＴＧＦ－β２との結合能の分析は、９６ウェル免疫吸着検査用プレート（３５９０（Corning））に、６０ｎｇ／ウェル濃度にＰＥＴ３０１をコーティングして行った。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴにおいて、常温１時間、ブロッキングを進め、適切な濃度のヒトＴＧＦ－β２（１００－３５Ｂ（Peprotech））は、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈し、常温で１時間結合反応を誘導し、抗ＴＧＦ－β２ビオチン標識抗体（biotinylated antibody）（ＢＡＦ３０２（Ｒ＆Ｄ Systems））で処理し、常温で１時間、結合反応を誘導した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Systems）で処理し、常温で３０分間、結合反応を誘導し、その後の過程は、前述のところと同じ方式で遂行した（図２４Ｂの（Ｂ）、表４）。
【0095】
分析結果、ＰＥＴ３０１は、ヒトＩＬ－１β、ヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β３につき、それぞれ０．２２６ｎＭ、０．７９９ｎＭ、０．３５７ｎＭのＥＣ５０値を有し、それら抗原に高親和度を有することを確認した（表４）。ＰＥＴ３０１は、ヒトＴＧＦ－β２に、３．０８１ｎＭのＥＣ５０値を有し、相対的に低い親和度を有すると確認された（表４）。
【表4】
【0096】
試験例１８：レポータ細胞株を利用した、ＰＥＴ３０１のＩＬ－１とＴＧＦ－βとの信号伝達経路抑制能評価
ＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β信号伝達経路抑制能評価は、試験例４で言及された方式と同一に、ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））を使用して進められた。分析結果、ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株においてＰＥＴ３０１は、１．０５６ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図２５Ａの（Ａ））。ＰＥＴ３０１のヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β２、ヒトＴＧＦ－β３に対する抑制能を分析するために、ＴＧＦ－βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｔｇｆｂ（Invivogen））を使用し、細胞株の活性化のために、１ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β１（７７５４－ＢＨ（Ｒ＆Ｄ Systems））、１０ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β２（１００－３５Ｂ（Peprotech））または１ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β３（８４２０－Ｂ３（Ｒ＆Ｄ Systems））を使用した。ＰＥＴ３０１のＴＧＦ－β抑制能分析には、Quanti-BlueTMソリューション（ｒｅｐ－ｑｂｓ（Invivogen））を使用し、ＳＥＡＰの発現を定量した。分析結果、ＰＥＴ３０１は、ヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β３につき、それぞれ３０ｐＭ、８９ｐＭのＥＣ５０値を有し、ヒトＴＧＦ－β２は、効率的に抑制することができないことを確認した（図２５Ａの（Ｂ）、図２５Ｂの（Ａ）、（Ｂ））。
ＰＥＴ３０１のヒトＩＬ－１β信号伝達経路抑制能評価は、試験例４で言及された方式と同一に、ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｉｌ１ｂ（Invivogen））を使用して進められた。分析結果、ＩＬ－１βレポータＨＥＫ２９３細胞株においてＰＥＴ３０１は、１．０５６ｎＭのＥＣ５０値を有することを確認した（図２５Ａの（Ａ））。ＰＥＴ３０１のヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β２、ヒトＴＧＦ－β３に対する抑制能を分析するために、ＴＧＦ－βレポータＨＥＫ２９３細胞株（ｈｋｂ－ｔｇｆｂ（Invivogen））を使用し、細胞株の活性化のために、１ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β１（７７５４－ＢＨ（Ｒ＆Ｄ Systems））、１０ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β２（１００－３５Ｂ（Peprotech））または１ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ－β３（８４２０－Ｂ３（Ｒ＆Ｄ Systems））を使用した。ＰＥＴ３０１のＴＧＦ－β抑制能分析には、Quanti-BlueTMソリューション（ｒｅｐ－ｑｂｓ（Invivogen））を使用し、ＳＥＡＰの発現を定量した。分析結果、ＰＥＴ３０１は、ヒトＴＧＦ－β１、ヒトＴＧＦ－β３につき、それぞれ３０ｐＭ、８９ｐＭのＥＣ５０値を有し、ヒトＴＧＦ－β２は、効率的に抑制することができないことを確認した（図２５Ａの（Ｂ）、図２５Ｂの（Ａ）、（Ｂ））。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25A】
【図25B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１目的タンパク質、第１リンカ及び免疫グロブリンの第１ Ｆｃ部位を含む第１ポリペプチドと、ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２目的タンパク質、第２リンカ及び免疫グロブリンの第２ Ｆｃ部位を含む第２ポリペプチドと、を含み、
前記第１目的タンパク質と前記第２目的タンパク質は、互いに異なるタンパク質であり、
前記第１リンカ及び前記第２リンカは、それぞれκ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体、及びλ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体である、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項2】
λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）の変異体は、Ｃ末端セリンが欠失されたものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項3】
κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）の変異体、λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）の変異体、またはそれらそれぞれは、重鎖不変部位ＣＨ１とジスルフィド結合を形成するシステインが、セリン、アラニンまたはバリンで置換されたものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項4】
第１ポリペプチドのＣ末端、または第２ポリペプチドのＣ末端のうち１以上に、第３目的タンパク質をさらに含むものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項5】
単一特異性または多重特異性を有する、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項6】
該目的タンパク質は、リガンド、受容体、サイトカイン、酵素またはペプチドである、請求項１に記載の ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項7】
該受容体は、サイトカイン受容体である、請求項６に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項8】
該サイトカインは、インターロイキン－１（ＩＬ１）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、インターロイキン－３（ＩＬ３）、インターロイキン－４（ＩＬ４）、インターロイキン－５（ＩＬ５）、インターロイキン－６（ＩＬ６）、インターロイキン－１１（ＩＬ１１）、インターロイキン－１３（ＩＬ１３）、インターロイキン－１５（ＩＬ１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ１８）、インターロイキン－２３（ＩＬ２３）、インターロイキン－３１（ＩＬ３１）、インターロイキン－３３（ＩＬ３３）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、インターロイキン－３６（ＩＬ３６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ガンマ－インターフェロン（ＩＦＮ－γ）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び腫瘍懐死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）で構成されたグループのうちから選択される１以上である、請求項７に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項9】
該第１目的タンパク質と該第２目的タンパク質のうち一つは、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、他の一つは、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）である、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項10】
該第１目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）であり、該第１リンカは、κ型軽鎖不変部位（ＣＬκ）、またはその変異体であり、該第２目的タンパク質は、インターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）であり、該第２リンカは、λ型軽鎖不変部位（ＣＬλ）、またはその変異体である、請求項９に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項11】
インターロイキン－１受容体タイプ１（ＩＬ１Ｒ１）及びインターロイキン－１受容体付属タンパク質（ＩＬ１ＲＡｃＰ）は、それぞれそれらの細胞外領域である、請求項９に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項12】
該第３目的タンパク質として、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）またはタイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項13】
該第１ポリペプチドのＣ末端と、該第２ポリペプチドのＣ末端のうち一つに、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものである、請求項１２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項14】
該第２ポリペプチドのＣ末端に、インターロイキン－１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）を含むものである、請求項１３に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項15】
該第１ポリペプチドのＣ末端と、該第２ポリペプチドのＣ末端のいずれにも、タイプＩＩ形質転換成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を含むものである、請求項１２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項16】
該第１ Ｆｃ部位及び該第２ Ｆｃ部位は、ヘテロ二量体の形成が促進されるように、ＣＨ３領域が変異されたものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項17】
該第１ Ｆｃ部位及び該第２ Ｆｃ部位のＣＨ３領域は、ノブ・イントゥ・ホール変異を含むものである、請求項１６に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項18】
該リンカは、Ｆｃ部位内ヒンジのＮ末端に結合されるものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項19】
該ポリペプチドのＣ末端と、目的タンパク質との間に、第３リンカをさらに含むものである、請求項１に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項20】
該第３リンカは、ＧＳリンカである、請求項１９に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
【国際調査報告】