▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-24
(54)【発明の名称】ワクチン組成物及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/12 20060101AFI20230817BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20230817BHJP
A61K 39/235 20060101ALI20230817BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230817BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230817BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230817BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230817BHJP
A61K 47/52 20170101ALI20230817BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230817BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230817BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230817BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20230817BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230817BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230817BHJP
A61K 47/40 20060101ALI20230817BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230817BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230817BHJP
【ＦＩ】
A61K39/12
A61K39/215
A61K39/235
A61P31/14
A61P31/12
A61K9/14
A61K47/69
A61K47/52
A61K9/51
A61K48/00
A61K39/39
A61K39/155
A61K47/02
A61K47/36
A61K47/40
C12N15/50
C07K14/165
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023506247
(86)(22)【出願日】2021-07-30
(85)【翻訳文提出日】2023-03-28
(86)【国際出願番号】 US2021044052
(87)【国際公開番号】W WO2022026917
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】63/059,845
(32)【優先日】2020-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マスード，タリーク・エフ
(72)【発明者】
【氏名】ポールムルガン，ラマサミー
(72)【発明者】
【氏名】シュクマル，ウダイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB22
4C076BB25
4C076BB27
4C076CC06
4C076CC41
4C076DD21
4C076DD29
4C076EE30
4C076EE39
4C076FF02
4C076FF27
4C076FF68
4C084AA13
4C084MA56
4C084MA57
4C084MA59
4C084NA13
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085AA04
4C085BA51
4C085BA57
4C085BA71
4C085BA77
4C085FF24
4C085GG10
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書で、とりわけ、ウイルスタンパク質又は前記ウイルスタンパク質をコードする核酸に結合しているナノ粒子を含む複合体が提供される。前記複合体を作製して使用する方法が提供される。複合体を含む組成物は、ウイルス感染症を処置及び／又は予防するために有益であることが企図される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸であって、肺ウイルスタンパク質若しくは核酸は前記ナノ粒子に結合している、肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸
を含む複合体。
【請求項2】
複数の肺ウイルスタンパク質又はその断片を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項3】
複数の肺ウイルスタンパク質が異なる肺ウイルスタンパク質を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項4】
肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする複数の核酸を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項5】
複数の核酸が異なる肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする、請求項４に記載の複合体。
【請求項6】
肺ウイルスがヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳと関連したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）又はヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項7】
肺ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項６に記載の複合体。
【請求項8】
肺ウイルスタンパク質又はその断片がＳタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質又はＥタンパク質である、請求項７に記載の複合体。
【請求項9】
金のコアが金－酸化鉄コアである、請求項１に記載の複合体。
【請求項10】
ナノ粒子が外層を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項11】
外層が金のコアに共有結合している、請求項１０に記載の複合体。
【請求項12】
外層が金のコアに非共有結合している、請求項１０に記載の複合体。
【請求項13】
外層がポリマーを含む、請求項１０に記載の複合体。
【請求項14】
外層がカチオン性多糖を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項15】
カチオン性多糖がキトサンを含む、請求項１４に記載の複合体。
【請求項16】
カチオン性多糖がキトサン－シクロデキストリンを含む、請求項１４に記載の複合体。
【請求項17】
肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子に共有結合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項18】
肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子の外層に共有結合している、請求項１０に記載の複合体。
【請求項19】
肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子に非共有結合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項20】
肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子の外層に非共有結合している、請求項１０に記載の複合体。
【請求項21】
核酸がデオキシリボ核酸である、請求項１に記載の複合体。
【請求項22】
核酸がリボ核酸である、請求項１に記載の複合体。
【請求項23】
直径が約２０ｎｍ～約８０ｎｍである、請求項１に記載の複合体。
【請求項24】
直径が約４０ｎｍである、請求項１に記載の複合体。
【請求項25】
請求項１に記載の複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物。
【請求項26】
安定剤、アジュバント及び保存剤の１つ以上をさらに含む、請求項２５に記載のワクチン組成物。
【請求項27】
経鼻投与のために製剤化されている、請求項２５に記載のワクチン組成物。
【請求項28】
肺ウイルス疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、請求項１に記載の複合体の治療的又は予防的に有効な量を対象に投与することを含む方法。
【請求項29】
複合体が鼻腔内経路によって投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
複合体が口腔鼻経路によって投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
複合体が肺に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
肺ウイルス疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、請求項２５に記載のワクチン組成物の治療的又は予防的に有効な量を対象に投与することを含む方法。
【請求項33】
組成物が鼻腔内経路を通して投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
組成物が口腔鼻経路を通して投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
組成物が肺に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
肺ウイルス疾患に感受性である対象を免疫化する方法であって、肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が生成されるような条件下で請求項１に記載の複合体を対象に投与することを含む方法。
【請求項37】
抗体がＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、ここに完全に及び全ての目的のために参照により組み込まれている、２０２０年７月３１日に出願された米国仮出願第６３／０５９，８４５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
世界保健機構は２０２０年３月１１日に、ＣＯＶＩＤ－１９がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれるコロナウイルスの新規系統によって引き起こされる世界的流行病であると発表した。このウイルスは、細胞内侵入を果たすためにウイルスが使用するアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体のより高いレベルを発現する細胞に感染することによって、ヒトで主に気道疾患及び肺炎を引き起こす。１～２
【0003】
簡潔には、体の適応免疫系は新規の侵入病原体を認識することを学習することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒト細胞表面のＡＣＥ２受容体の上にロックオンするためにその表面スパイク糖タンパク質（Ｓ）を使用する。２～３一旦中に入ると、ウイルスはその周囲の小胞と融合してそのリボ核酸（ＲＮＡ）を放出し、ウイルスＲＮＡはタンパク質に翻訳され、ウイルスアセンブリが起こり、より多くのウイルスが放出されて他の宿主細胞に感染する。４感染した患者は、免疫応答を次に開始することができ、それによって専門化した「抗原提示細胞」はウイルスを呑食し、その一部を提示してヘルパーＴ細胞を活性化する。ヘルパーＴ細胞は他の免疫応答を次に可能にする：Ｂ細胞はウイルスが細胞に感染することをブロックすることができる抗体を作り、さらに破壊のためのウイルスをマークし；細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を同定して破壊する。ウイルスを認識する長生きの「記憶」Ｂ及びＴ細胞は、以後数カ月又は数年の間体をパトロールすることができ、免疫を提供する。５
【0004】
ＣＯＶＩＤ－１９に対する処置及び予防は、直近の優先事項である：現在の世界的流行のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統は新規であり、ＣＯＶＩＤ－１９患者を処置及び保護することができる薬物又はワクチンの開発を助けるために、限定された臨床及び免疫学的情報しか利用できない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの防御を提供する安全で有効なワクチンを開発することが不可欠であり、差し迫った重要性がある。
【0005】
全てのワクチンは、疾患を引き起こさないが、個人が感染するならばウイルスをブロックする又は死滅させることができる免疫応答を引き起こす抗原に体を曝露させることを目指す。２０２０年４月３０日現在、世界中で８つの広範囲タイプの９０を超えるワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して開発されていた：（１）ウイルスワクチン（弱体化又は不活性化ウイルス）。（２）核酸ワクチン（ＤＮＡ又はＲＮＡをベースにした）。（３）ウイルスベクターワクチン（複製する及び複製しないウイルスベクター）。（４）タンパク質をベースにしたワクチン（タンパク質サブユニット及びウイルス様粒子）。これらの戦略に多くの相対的長所及び短所がある。６従来のワクチンアプローチ、例えば病原体の生弱毒化ワクチン、不活性化ワクチン、及びサブユニットワクチンは、疾患を引き起こすことなく天然の病原体を直接的に模倣することによって、様々な危険な疾患に対して永続的な防御を提供する。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は非常に速やかに及び地球規模で拡散している新規のウイルス系統であるので、伝統的なワクチン開発パイプラインは即時の解決方法を提供することができない。迅速な開発及び大規模な展開戦略が、それらの従来のアプローチのために必要とされる。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、それらの生物学的プロファイル及び臨床症状に関してＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスに類似している。７全てのこれらのウイルスで、Ｓタンパク質は中和抗体の主要な誘導因子である。８～１１ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質を発現する組換えアデノウイルスをベースとしたワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内に投与されるとき、全身性ＩｇＧ、分泌性ＩｇＡ及び肺常在記憶Ｔ細胞応答を誘導し、持続性中和免疫を提供して偽型化ＭＥＲＳウイルスを急上昇させ、それによって、このＩＮワクチンがＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する防御を付与することができることを示唆する。１２他の研究で、コロナウイルスの間での交差反応性の可能性を示唆するＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのＴ細胞エピトープ類似性に基づいて、ユニバーサルＣｏＶワクチンを開発する可能性が評価された。１３ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は高い遺伝子類似性をＳＡＲＳ－ＣｏＶと共有するので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのために開発されるワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２へ交差反応性を示すことができる。１３～１４ＭＥＲＳ－Ｃｏｖのヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質並びにＥタンパク質の潜在的Ｂ細胞エピトープは、Ｔ細胞及び中和抗体応答の両方を誘導する可能性のある免疫防御的エピトープとして示唆されてもいる。１５～１６ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに対するワクチンを使用する試みは、限定的な奏効しか達成していない。それらは有意な遺伝子相同性を保有するものの、いくつかの変異がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面抗原のアミノ酸配列にある。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びに他の肺ウイルスに対するワクチンを開発する必要性が当技術分野にある。当技術分野のこの及び他の必要性の解決方法が、本明細書で提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
（簡単な要約）
一態様では、以下を含む複合体が提供される：（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸であって、肺ウイルスタンパク質又は核酸はナノ粒子に結合している核酸。
一態様では、以下を含む複合体が提供される：（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸であって、肺ウイルスタンパク質又は核酸はナノ粒子に結合している核酸。
【0008】
一態様では、その実施形態を含む本明細書で提供される複合体、及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物が提供される。
【0009】
一態様では、肺ウイルス疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、その実施形態を含む本明細書で提供される複合体の治療的又は予防的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。
【0010】
別の態様では、肺ウイルス疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、その実施形態を含む本明細書で提供されるワクチン組成物の治療的又は予防的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。
【0011】
一態様では、肺ウイルス疾患に感受性である対象を免疫化する方法であって、その実施形態を含む本明細書で提供される複合体を、肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が生成されるような条件下で対象に投与することを含む方法が提供される。
【0012】
一態様では、それに結合している複数の核酸及びそれに結合している複数のタンパク質を含むナノ粒子が提供され、ここで、複数の核酸の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、複数のタンパク質の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質である。
【0013】
一態様では、その実施形態を含む本明細書で提供されるナノ粒子、及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物が提供される。
【0014】
一態様では、それを必要とする対象でＣＯＶＩＤ－１９を予防又は処置する方法であって、対象にその実施形態を含む本明細書で提供されるワクチンの有効量を含む組成物を投与すること、又はそれを必要とする対象にその実施形態を含む本明細書で提供されるナノ粒子を投与することを含む方法が提供される。
【0015】
実施形態では、それを必要とする対象でＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルス感染症を予防又は処置する方法であって、それを必要とする対象にその実施形態を含む本明細書で提供されるワクチン、又はその実施形態を含む本明細書で提供されるナノ粒子の有効量を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】肺免疫応答の活性化のための、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子（ＮＰ）を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチン送達の模式図である。
【図2A】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、ＰｏｌｙＧＩＯＮの透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図2B】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、ＰｏｌｙＧＩＯＮのエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析法を示す図である。
【図2C】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳのＲＮＡローディング効率を示す図である。
【図2D】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子のサイズについてのＤＬＳ分析を示す図である。
【図2E】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子のゼータ電位についてのＤＬＳ分析を示す図である。
【図2F】機能発現分析による、細胞でＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを送達する際のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ粒子及びそれらの効率の例示的インビトロ評価における、プルシアンブルー染色によるＡ５４９細胞におけるＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ｍＲＮＡの細胞内送達を示す図である。
【図3】ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰを使用したＦＬｕｃ－ｍＲＮＡの送達を受けた動物の光学生物発光イメージングを示す図である。マウスを毎日用量２μｇのＦＬｕｃ－ｍＲＮＡで処置し、処置の２４ｈ後に画像を得た。
【図4A】５用量のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ後の組織の例示的インビボマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）及び光学イメージング並びにエクスビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）における、対照及びＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡを使用して処置した動物のマイクロＣＴ画像を示す図である。
【図4B】５用量のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ後の組織の例示的インビボマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）及び光学イメージング並びにエクスビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）における、マイクロＣＴと同じ日に画像化された動物のＢＬＩを示す図である。
【図4C】５用量のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ後の組織の例示的インビボマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）及び光学イメージング並びにエクスビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）における、処置群の動物から抽出された組織のエクスビボＢＬＩを示す図である。
【図5】トランスフェクション、免疫応答、及び病原性を評価するのに提案されているアッセイを併記した、インビトロ及びインビボ実験作業フローの模式図である。
【図6】様々な形及びサイズのＡｕ－キトサンナノ粒子のＤＮＡローディング効率を示す図である。左及び中央のパネルは、直径０．０１５～０．５ｎｍのＡｕ－Ｎａｎｏｓｔａｒナノ粒子のデータを示し、右パネルは、直径０．０１５～０．５ｎｍのＡｕ－ナノスフェアナノ粒子のデータを示す。
【図7A】様々なサイズ及び形のＡｕ－ＣＨナノ粒子の、細胞内へのトランスフェクション効率に関する、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするＤＮＡをローディングしたＡｕ－ＣＨナノ粒子でトランスフェクトされた細胞の代表的な画像を示す図である。蛍光の強度はトランスフェクション効率を示している。
【図7B】様々なサイズ及び形のＡｕ－ＣＨナノ粒子の、細胞内へのトランスフェクション効率に関する、トランスフェクトされた細胞の蛍光強度を示す棒グラフである。
【図8A】哺乳動物細胞におけるＡｕ－ＮＳナノ粒子によるＤＮＡ用量依存性トランスフェクションにおける、様々な量のルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするＤＮＡをローディングしたＡｕ－ＣＨナノ粒子でトランスフェクトされた細胞の代表的な画像を示す図である。
【図8B】哺乳動物細胞におけるＡｕ－ＮＳナノ粒子によるＤＮＡ用量依存性トランスフェクションにおける、ナノ粒子上にローディングしたＤＮＡの量に依存した染色細胞のシフトを示す、Ｆｌｕｃ－ＥＧＦＰ－蛍光強度ヒストグラムに対するイベント数のグラフである。
【図8C】哺乳動物細胞におけるＡｕ－ＮＳナノ粒子によるＤＮＡ用量依存性トランスフェクションにおける、蛍光強度によって測定される、ＤＮＡをローディングしたナノ粒子のトランスフェクション効率及びローディングされたＤＮＡの用量依存性発現を示す棒グラフである。
【図9A】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、ＡｕＮＳ－キトサン及びＳＣ２ ＤＮＡの均一な形態を示すＦＥ－ＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図9B】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、ＡｕＮＳ－キトサン及びＳＣ２ ＤＮＡの均一な形態を示すＦＥ－ＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図9C】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、ＡｕＮＳ－キトサン及びＳＣ２ ＤＮＡの均一な形態を示すＦＥ－ＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図9D】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、ゲル遅延度アッセイによるＡｕＮＳ－キトサンのＤＮＡローディング効率の評価を示す図である。
【図9E】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、様々な比率でＳＣ２ワクチンをローディングしたＡｕＮＳのゼータ電位について測定したＤＬＳ結果を示す図である。
【図9F】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、様々な比率でＳＣ２ワクチンをローディングしたＡｕＮＳの粒径（ｎｍ）について測定したＤＬＳ結果を示す図である。
【図9G】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、生物発光イメージングによってｐｃＤＮＡ－ＦＬｕｃ－ｅＧＦＰプラスミドの送達により評価されるＡｕＮＳ－キトサンのトランスフェクション効率を示す図である。
【図9H】ＡｕＮＳ－ＣＳ ＮＰ上にローディングしたＳＣ２ＤＮＡワクチンのインビトロ特性分析における、ＡｕＮＳ－キトサによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトされたＳＣ２ Ｓタンパク質の発現についてのイムノブロット分析を示す図である。データは、平均±ＳＥＭで表されている。比較の有意性の判定には、示されているようにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。ｐ値＜０．０５の場合に、調整済みｐ値は統計的に有意であるとされ、統計的有意性を示すシンボルは以下の通りであった。ｎｓは有意差が無いことを表し、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１の有意性を表す。
【図10A】実験設計の模式図である。ＩＮ経路で投与した、対照ＤＮＡ又はＳＣ２－Ｓ ＤＮＡワクチンをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンで、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫処置し、血清を毎週収集し、ＣｏＶ－１及びＣｏＶ－２の精製タンパク質に対する抗ＳＣ２抗体について評価した。
【図10B】マウスから収集した血清中の抗ＳＣ２抗体レベルについてスクリーニングするための化学発光ベースのドットブロットイムノアッセイを示す図である。
【図10C】それらのそれぞれの定量的プロットを有する処置の様々な時点でＢＡＬＢ／ｃから収集した血清を用いた図１０Ｂのアッセイを示す図である。データは、平均±ＳＥＭで表されている。多重比較には、二元配置ＡＮＯＶＡを行い、Ｔｕｋｅｙのｔ検定で信頼区間を決定した。結果は、以下によって示されている。ｎｓは、有意差が無いこと、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図10D】それらのそれぞれの定量的プロットを有する処置の様々な時点でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから収集した血清を用いた図１０Ｂのアッセイを示す図である。データは、平均±ＳＥＭで表されている。多重比較には、二元配置ＡＮＯＶＡを行い、Ｔｕｋｅｙのｔ検定で信頼区間を決定した。結果は、以下によって示されている。ｎｓは、有意差が無いこと、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図11A】処置の様々な時点におけるＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＣ２抗体レベルについてスクリーニングするためのドットブロットイムノアッセイを示す図である。ＳＣ２の様々なバリアントに対する免疫応答を開始する際のワクチン投与ストラテジーの有効性を決定するために、ＳＣ２－ＳＡ突然変異体及びＳＣ２－ＷｕｈａｎバリアントのＳタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の細胞溶解物に対して血清をプロービングした。
【図11B】処置の様々な時点におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける抗ＳＣ２抗体レベルについてスクリーニングするためのドットブロットイムノアッセイを示す図である。ＳＣ２の様々なバリアントに対する免疫応答を開始する際のワクチン投与ストラテジーの有効性を決定するために、ＳＣ２－ＳＡ突然変異体及びＳＣ２－ＷｕｈａｎバリアントのＳタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の細胞溶解物に対して血清をプロービングした。
【図11C】一貫した抗体応答を示す、２つの異なった処置バッチ（各ｎ＝５）の血清中の抗ＳＣ２抗体レベルの応答を示す図である。
【図11D】ｐＤＮＡ／ｐＤＮＡ－ＳＣ２ＤＮＡワクチンをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスで生成された抗ＳＣ２抗体レベルと、ＳＣ２－Ｗ及びＳＣ２－ＳＡ Ｓタンパク質で操作された偽ウイルスに曝露された際の野生型及びＡＣＥ－２操作されたＣ５７ＢＬ／６Ｊで生成された抗ＳＣ２抗体レベルの比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意で無い）；ＡｕＮＳ－キトサンを使用したＳＣ２ Ｓタンパク質ＤＮＡワクチンのＩＮ免疫処置の後の抗体媒介性免疫応答を示す図である。
【図11E】ＥＬＩＳＡを使用した、処置の様々な時点における免疫処置マウスの血清の抗体応答の評価における、ＳＣ２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＡレベルに対するＥＬＩＳＡアッセイの測定を示す図である。データは、３～５頭のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３～５頭のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのプールした血清から生成された。粘膜及び細胞性免疫応答を評価するために、１４週目に全てのマウスにブースター用量を投与した。データは、平均±ＳＥＭで表されている。多重比較には、二元配置ＡＮＯＶＡを行い、Ｔｕｋｅｙのｔ検定で信頼区間を決定し、結果は、以下によって示されている。ｎｓは、有意差が無いこと、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図11F】ＥＬＩＳＡを使用した、処置の様々な時点における免疫処置マウスの血清の抗体応答の評価における、ＳＣ２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＧレベルに対するＥＬＩＳＡアッセイの測定を示す図である。データは、３～５頭のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３～５頭のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのプールした血清から生成された。粘膜及び細胞性免疫応答を評価するために、１４週目に全てのマウスにブースター用量を投与した。データは、平均±ＳＥＭで表されている。多重比較には、二元配置ＡＮＯＶＡを行い、Ｔｕｋｅｙのｔ検定で信頼区間を決定し、結果は、以下によって示されている。ｎｓは、有意差が無いこと、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図11G】ＥＬＩＳＡを使用した、処置の様々な時点における免疫処置マウスの血清の抗体応答の評価における、ＳＣ２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＭレベルに対するＥＬＩＳＡアッセイの測定を示す図である。データは、３～５頭のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３～５頭のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのプールした血清から生成された。粘膜及び細胞性免疫応答を評価するために、１４週目に全てのマウスにブースター用量を投与した。データは、平均±ＳＥＭで表されている。多重比較には、二元配置ＡＮＯＶＡを行い、Ｔｕｋｅｙのｔ検定で信頼区間を決定し、結果は、以下によって示されている。ｎｓは、有意差が無いこと、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図12A】ｍＲＮＡワクチンによって誘導される抗Ｓタンパク質ＩｇＡ応答を示す図である。
【図12B】ｍＲＮＡワクチンによって誘導される抗Ｓタンパク質ＩｇＧ応答を示す図である。
【図13A】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、細胞におけるＳＣ２形質導入の作用機序を示す図である。ＳＣ２ Ｓタンパク質及びＦｌｕｃ－ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスを操作し、これらの偽ウイルスを対照及びＡＣＥ２受容体発現細胞に形質導入し、それに続く感染力を生物発光イメージングを使用して定量化した。
【図13B】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、操作された偽ウイルスを使用してその中和効果について評価した抗ＳＣ２－Ｓタンパク質特異抗体のＤＮＡワクチン媒介誘導を示す図である。中和効果は、ＤＮＡワクチンで処置したマウスの血清に由来する中和抗体の存在下で、感染細胞内で偽ウイルス媒介ＺｓＧｒｅｅｎ発現を定量化することによってアセスメントした。
【図13C】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、操作された偽ウイルスを使用してその中和効果について評価した抗ＳＣ２－Ｓタンパク質特異抗体のＤＮＡワクチン媒介誘導を示す図である。中和効果は、ＤＮＡワクチンで処置したマウスの血清に由来する中和抗体の存在下で、感染細胞内で偽ウイルス媒介ＺｓＧｒｅｅｎ発現を定量化することによってアセスメントした。
【図13D】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、ワクチン接種後の様々な時点に収集された血清の中和効果を示す図である。市販の抗体を陽性（＋）対照として使用した。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３は、血清収集の時点、すなわち、それぞれ１週間後、２週間後、及び３週間後を示す。ＳＣ２－ＤＮＡワクチンのＩＮ投与によって誘導された中和抗体は、様々なバリアントのＳＣ２ Ｓタンパク質を提示するように操作されたレンチ偽ウイルス粒子を使用し、ＡＣＥ２受容体を発現するように操作されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でＦＬｕｃ－ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子を発現して、ウイルス感染性阻害について測定した。１８週目にＳＣ２－ＤＮＡワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清試料（ｎ＝３動物からのプール血清）を中和活性について、市販のＳＣ２スパイク抗体を比較してアッセイした。
【図13E】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、Ｓタンパク質ＳＣ２－Ｗｕｈａｎバリアントで操作されたレンチウイルス粒子に対して行った感染力の相対的阻害を示す図である。各点は、３頭のマウスから収集された、３つの技術的複製を伴う血清の平均を表す。データは、平均±ＳＥＭで表されている。示されるように、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、比較の有意性を判定した。調整済みｐ値は、ｐ値＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとされ、統計的な有意性を示すシンボルは、以下の通りであった。ｎｓは有意差が無いことを表し、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１の有意性を表す。
【図13F】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、Ｓタンパク質ＳＣ２－ＳＡ突然変異バリアントで操作されたレンチウイルス粒子に対して行った感染力の相対的阻害を示す図である。各点は、３頭のマウスから収集された、３つの技術的複製を伴う血清の平均を表す。データは、平均±ＳＥＭで表されている。示されるように、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、比較の有意性を判定した。調整済みｐ値は、ｐ値＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとされ、統計的な有意性を示すシンボルは、以下の通りであった。ｎｓは有意差が無いことを表し、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１の有意性を表す。
【図13G】ＳＣ２ Ｓタンパク質を偽ウイルスとして発現するレンチウイルスの、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に対する特異性の評価における、Ｓタンパク質ＳＣ２－Ｄ６１４Ｇ突然変異バリアントで操作されたレンチウイルス粒子に対して行った感染力の相対的阻害を示す図である。各点は、３頭のマウスから収集された、３つの技術的複製を伴う血清の平均を表す。データは、平均±ＳＥＭで表されている。示されるように、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、比較の有意性を判定した。調整済みｐ値は、ｐ値＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとされ、統計的な有意性を示すシンボルは、以下の通りであった。ｎｓは有意差が無いことを表し、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１の有意性を表す。
【図14A】ＨＥＫ２９３におけるＡｕＮＳ－キトサン及び光学生物発光（ＢＬＩ）によって画像化された細胞を使用したＦｌｕｃ ｍＲＮＡのインビトロ送達を示す図である。
【図14B】Ａ５４９におけるＡｕＮＳ－キトサン及び光学生物発光（ＢＬＩ）によって画像化された細胞を使用したＦｌｕｃ ｍＲＮＡのインビトロ送達を示す図である。
【図14C】２用量のＡｕＮＳ－キトサン－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ送達後の組織のインビボＢＬＩを示す図である。
【図14D】２用量のＡｕＮＳ－キトサン－ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ送達後の組織のエクスビボＢＬＩを示す図である。ホタルルシフェラーゼの有意な発現が肺にあり、これは、エクスビボ組織イメージング発見によって支持される。
【図15】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム構造及びｍＲＮＡワクチンの標的タンパク質がコードされている位置を示す図である。
【図16A】ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンでＩＮ処置したマウスの肺における免疫細胞の動員を示す図である。メモリー及び組織常在性のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するＤＮＡワクチンをアセスメントに使用した。肺常在性ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照ＤＮＡで処置したマウスと比較して、免疫処置したマウスの肺で増加した。Ｔ細胞サブタイプについて評価するために、処置の１４週間後に、肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節を解剖した（Ｔ細胞サブタイプ：ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８；マクロファージ：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ；樹状細胞：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ；Ｂ細胞：ＣＤ１９とＣＤ２２）。
【図16B】ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンでＩＮ処置したマウスの脾臓における常在性Ｔ細胞分布を示す図である。メモリー及び組織常在性のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するＤＮＡワクチンをアセスメントに使用した。肺常在性ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照ＤＮＡで処置したマウスと比較して、免疫処置したマウスの肺で増加した。Ｔ細胞サブタイプについて評価するために、処置の１４週間後に、肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節を解剖した（Ｔ細胞サブタイプ：ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８；マクロファージ：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ；樹状細胞：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ；Ｂ細胞：ＣＤ１９とＣＤ２２）。
【図16C】ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンでＩＮ処置したマウスの肺における常在性Ｔ細胞分布を示す図である。メモリー及び組織常在性のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するＤＮＡワクチンをアセスメントに使用した。肺常在性ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照ＤＮＡで処置したマウスと比較して、免疫処置したマウスの肺で増加した。Ｔ細胞サブタイプについて評価するために、処置の１４週間後に、肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節を解剖した（Ｔ細胞サブタイプ：ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８；マクロファージ：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ；樹状細胞：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ；Ｂ細胞：ＣＤ１９とＣＤ２２）。
【図16D】ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンでＩＮ処置したマウスの胸腺における常在性Ｔ細胞分布を示す図である。メモリー及び組織常在性のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するＤＮＡワクチンをアセスメントに使用した。肺常在性ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照ＤＮＡで処置したマウスと比較して、免疫処置したマウスの肺で増加した。Ｔ細胞サブタイプについて評価するために、処置の１４週間後に、肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節を解剖した（Ｔ細胞サブタイプ：ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８；マクロファージ：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ；樹状細胞：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ；Ｂ細胞：ＣＤ１９とＣＤ２２）。
【図16E】ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンでＩＮ処置したマウスのリンパ節における常在性Ｔ細胞分布を示す図である。メモリー及び組織常在性のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するＤＮＡワクチンをアセスメントに使用した。肺常在性ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照ＤＮＡで処置したマウスと比較して、免疫処置したマウスの肺で増加した。Ｔ細胞サブタイプについて評価するために、処置の１４週間後に、肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節を解剖した（Ｔ細胞サブタイプ：ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８；マクロファージ：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ；樹状細胞：ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ；Ｂ細胞：ＣＤ１９とＣＤ２２）。
【図17A】ｐＤＮＡ及びＳＣ２スパイクＤＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離されたＣＤ４５＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図17B】ｐＤＮＡ及びＳＣ２スパイクＤＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの肺から単離されたＣＤ４５＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図17C】ｐＤＮＡ及びＳＣ２スパイクＤＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺から単離されたＣＤ４５＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図17D】ｐＤＮＡ及びＳＣ２スパイクＤＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節から単離されたＣＤ４５＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図17E】ｐＤＮＡ及びＳＣ２スパイクＤＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの血液から単離されたＣＤ４５＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図18】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＤＮＡによるワクチン接種が流入領域リンパ節におけるＴ細胞及びＢ細胞の活性化をもたらすことを示す図である。
【図19A】ナノ粒子の外層を形成しうるポリマーの構造に関して、キトサン及びキトサン－シクロデキストリンの構造並びにシクロデキシトリン結合キトサン（ＣＤ－ＣＳ）を合成するための反応を示す図である。
【図19B】ナノ粒子の外層を形成しうるポリマーの構造に関して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（上パネル）及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）（下パネル）デンドリマーの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の様々な実施形態及び態様が本明細書で示され、記載されているが、そのような実施形態及び態様は例としてだけ提供されていることは当業者に明らかになる。本発明を逸脱しない範囲で、当業者は多くの変形形態、変更及び代替を今では思いつく。本明細書に記載される本発明の実施形態への様々な代替物を本発明の実施で用いることができることを理解すべきである。
【0018】
本明細書で使用されるセクション見出しは構成上の目的だけのためであり、記載される対象発明を限定するものと解釈されるべきでない。特許、特許出願、論文、書籍、マニュアル及び専門書を限定されずに含む本出願で引用される全ての文書又は文書の一部は、ここにあらゆる目的のために参照により完全に明示的に組み込まれる。
【0019】
本明細書で使用される略記号は、化学及び生物学の分野の範囲内のそれらの従来の意味を有する。本明細書で示される化学構造及び式は、化学技術分野で公知である化学原子価の標準規則により構築される。
【0020】
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、当分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ １９８９）を参照する。本明細書に記載されるものに類似している又は同等の任意の方法、装置及び材料を、本発明の実施で使用することができる。以下の定義は本明細書でしばしば使用されるある特定の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を限定するものでない。
【0021】
「核酸」は、一本鎖、二本鎖又は複数の鎖の形のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）及びそのポリマー、又はその相補体；又はヌクレオシド（例えば、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシド）を指す。実施形態では、「核酸」はヌクレオシドを含まない。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」などは、通常の及び慣例的な意味でヌクレオチドの線形配列を指す。用語「ヌクレオシド」は、通常の及び慣例的な意味で、核酸塩基及び五炭糖（リボース又はデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非限定的な例には、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン及びイノシンが含まれる。用語「ヌクレオチド」は、通常の及び慣例的な意味で、ポリヌクレオチドの単一の単位、すなわち単量体を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はその改変されたバージョンであってよい。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ並びに一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。核酸、例えば本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、任意のタイプのＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びガイドＲＮＡ、並びに任意のタイプのＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びミニサークルＤＮＡ、並びにそれらの任意の断片が含まれる。ポリヌクレオチドとの関連で用語「二重鎖」は、通常の及び慣例的な意味で二本鎖を指す。核酸は直鎖状又は分枝状であってよい。例えば、核酸はヌクレオチドの直鎖であってよいか、又は核酸は、例えば核酸がヌクレオチドの１つ以上の腕又は枝を含むように分枝状であってよい。任意選択で、分枝状核酸は繰り返して分枝状であり、デンドリマーなどのより高次の構造を形成する。
【0022】
例えばホスホチオエート主鎖を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語反応性部分は、共有結合、非共有結合又は他の相互作用を通して別の分子、例えば核酸又はポリペプチドと反応することが可能な任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合又は他の相互作用を通してナノ粒子の外層と反応する反応性部分を含むことができる。
【0023】
本用語は、参照核酸に類似した結合特性を有し、参照ヌクレオチドに類似した方法で代謝される、合成された、天然に存在する及び天然に存在しない公知のヌクレオチド類似体又は改変された主鎖残基若しくは結合を含む核酸を包含する。そのような類似体の例には、限定されずに、ホスホジエステル誘導体、例えばホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（リン酸基の酸素を置換する二重結合した硫黄を有するホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素又はＯ－メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照する）並びに５－メチルシチジン又はプソイドウリジン；並びにペプチド核酸主鎖及び結合などにおけるヌクレオチド塩基への改変が含まれる。他の類似体核酸には、正の主鎖；非イオン性主鎖、改変された糖及び非リボース主鎖を有するもの（例えば当技術分野で公知であるホスホロジアミデートモルホリノオリゴ又はロック核酸（ＬＮＡ））、例えば、米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、並びに第６章及び第７章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ、Ｓａｎｇｈｕｉ ＆ Ｃｏｏｋ編に記載されているものが含まれる。１つ以上の炭素環式の糖を含有する核酸も、核酸の１つの定義の中に含まれる。様々な理由、例えば、生理的環境で、又はバイオチップのプローブとしてそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために、リボース－リン酸主鎖の改変を実行することができる。天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができる；代わりに、異なる核酸類似体の混合物並びに天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができる。実施形態では、ＤＮＡ中でのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体又は両方の組合せである。
【0024】
核酸は、非特異的配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「非特異的配列」は、任意の他の核酸配列に相補的である又は部分的に相補的であるだけであるように設計されていない、一連の残基を含有する核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞又は生物体と接触させたときに阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。
【0025】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で一般的に構成される：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；及びチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である；代わりに、本用語はポリヌクレオチド分子自体に適用することができる。このアルファベット表示は中央処理ユニットを有するコンピュータのデータベースにインプットすることができ、機能的ゲノム研究及び相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションのために使用することができる。ポリヌクレオチドは、１つ以上の非標準ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチド類似体（複数可）及び／又は改変されたヌクレオチドを任意選択的に含むことができる。
【0026】
本明細書で使用される用語「相補体」は、相補的ヌクレオチド又はヌクレオチドの配列と塩基対形成が可能なヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）又はヌクレオチドの配列を指す。本明細書に記載されている通り、及び当技術分野で一般的に公知であるように、アデノシンの相補的（マッチする）ヌクレオチドはチミジンであり、グアノシンの相補的（マッチする）ヌクレオチドはシトシンである。したがって、相補体は、第２の核酸配列の対応する相補的ヌクレオチドと塩基対を形成するヌクレオチドの配列を含むことができる。相補体のヌクレオチドは、第２の核酸配列のヌクレオチドに部分的又は完全にマッチすることができる。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列の各ヌクレオチドに完全にマッチする場合、相補体は第２の核酸配列の各ヌクレオチドと塩基対を形成する。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列のヌクレオチドに部分的にマッチする場合、相補体のヌクレオチドの一部だけが第２の核酸配列のヌクレオチドと塩基対を形成する。相補配列の例にはコード及び非コード配列が含まれ、ここで、非コード配列はコード配列に相補的なヌクレオチドを含有し、したがってコード配列の相補体を形成する。相補配列のさらなる例はセンス及びアンチセンス配列であり、ここで、センス配列はアンチセンス配列に相補的なヌクレオチドを含有し、したがってアンチセンス配列の相補体を形成する。
【0027】
本明細書に記載されるように、配列の相補性は部分的であってよく、この場合核酸の一部だけが塩基対形成によりマッチし、又は完全であってよく、この場合全ての核酸が塩基対形成によりマッチする。したがって、互いに相補的である２つの配列は、特定のパーセンテージの同じヌクレオチドを有することができる（すなわち、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性）。
【0028】
用語「アミノ酸」は、天然に存在する及び合成のアミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸に類似した方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後に改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造と異なるが、天然に存在するアミノ酸に類似した方法で機能する構造を有する化合物を指す。用語「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然アミノ酸」は、天然に見出されないアミノ酸類似体、合成アミノ酸及びアミノ酸模倣体を指す。
【0029】
本明細書で、アミノ酸は、それらの一般に公知である３文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号によって呼ぶことができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの公認の１文字コードによって呼ぶことができる。
【0030】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すものとして本明細書で互換的に使用され、ここで、ポリマーは、実施形態ではアミノ酸からならない部分にコンジュゲートしていてもよい。本用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組換えで発現される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【0031】
アミノ酸又はヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（又は、５’末端）に対するその位置に基づいて参照配列中の各アミノ酸（又は、ヌクレオチド塩基）を順番に特定する番号によって表される。最適なアラインメントを決定するときに考慮しなければならない欠失、挿入、トランケーション、融合などのために、一般に、単にＮ末端から数えることによって決定される試験配列中のアミノ酸残基番号は、参照配列中のその対応する位置の番号と必ずしも同じであるとは限らない。例えば、整列させた参照配列に対してバリアントが欠失を有する場合、バリアントには欠失部位に参照配列中の位置に対応するアミノ酸はない。整列させた参照配列中に挿入がある場合、その挿入は参照配列中の番号付けされたアミノ酸位置に対応しない。トランケーション又は融合の場合、参照の又は整列させた配列中に、対応する配列中のいかなるアミノ酸にも対応しないひと続きのアミノ酸が存在する可能性がある。
【0032】
所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用されるとき、用語「に関して番号付けされた」又は「に対応する」は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列を参照配列と比較したときの特定の参照配列の残基の番号付けを指す。タンパク質中のアミノ酸残基は、それがタンパク質の中の所与の残基と同じ必須の構造上の位置を占めるとき、所与の残基に「対応する」。当業者は、異なる番号付け体系による他のタンパク質の中で、タンパク質（例えば、スパイクタンパク質）中の特定の位置に対応する残基の同一性及び位置を直ちに認める。例えば、タンパク質（例えば、スパイクタンパク質）で単純な配列アラインメントを実行することによって、タンパク質の特定の位置に対応する残基の同一性及び位置は、タンパク質に整列している他のタンパク質配列の中で同定される。例えば、選択されたタンパク質中の選択された残基は、選択された残基が１３８位のグルタミン酸と同じ必須の空間的又は他の構造的な関係を占めるとき、１３８位のグルタミン酸に対応する。一部の実施形態では、選択されたタンパク質をあるタンパク質と最大相同性のために整列させる場合、グルタミン酸１３８で整列している整列させた選択されたタンパク質中の位置は、グルタミン酸１３８に対応する。例えば、選択されたタンパク質の構造を１３８位のグルタミン酸と最大対応のために整列させ、全体の構造を比較する場合、一次配列アラインメントの代わりに、三次元構造アラインメントを使用することもできる。この場合、構造モデルでグルタミン酸１３８と同じ必須の位置を占めるアミノ酸は、グルタミン酸１３８残基に対応する。
【0033】
「保存的改変バリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的改変バリアント」は、同一であるか本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの変性のため、いくつかの核酸配列は任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変更することなく記載される対応するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、それらは保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧ以外）は、機能的に同一の分子を産するように改変することができることを認める。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される各配列に内在する。
【0034】
アミノ酸配列に関して、コード配列の中で単一のアミノ酸又は小さなパーセンテージのアミノ酸を改変、付加又は削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的改変バリアント」であることを当業者は認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。そのような保存的改変バリアントは、本開示の多形性バリアント、種間同族体及び対立遺伝子に加えるものであって、それらを排除しない。
【0035】
以下の８群の各々は、お互いの保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４））を参照する）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４））を参照する）。
【0036】
用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連で、ＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメータで使用して、又は手動アラインメント及び目視検査によって（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照する）測定したときに、同じであるか又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す（すなわち、比較ウインドウ又は指定領域にわたる最大対応のために比較し、整列させたときに、特定の領域にわたる約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性）。そのような配列は、それゆえ「実質的に同一である」と言われる。この定義は、試験配列の相補体も指し、又はそれに適用することもできる。この定義には、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有するものも含まれる。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、長さが少なくとも約２５個のアミノ酸又はヌクレオチドの領域、より好ましくは長さが５０～１００個のアミノ酸又はヌクレオチドの領域にわたって同一性が存在する。
【0037】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウにわたる２つの最適に整列させた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウの中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を与え、マッチした位置の数を比較ウインドウの中の位置の総数によって割り、その結果に１００を掛け算して配列同一性のパーセンテージを与えることによって計算される。
【0038】
本明細書で使用されるように、「比較ウインドウ」は、例えば、２つの配列を最適に整列させた後に連続した位置が同じ数の参照配列と配列を比較することができる、完全長配列又は２０～６００、約５０～約２００若しくは約１００～約１５０のアミノ酸若しくはヌクレオチドからなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によって、手動アラインメント及び目視検査によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５年の補遺）を参照する）実行することができる。
【0039】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２頁及びＡｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴにマッチするか又はそれを満たす、長さＷの短いワードをクエリー配列中で同定することによって、ハイスコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、前掲）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長させられる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチした残基の対のためのリワードスコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向へのワードヒットの延長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘが落ちる；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になる；又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして１１のワードレンス（Ｗ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワードレンス（Ｗ）、１０の予想（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５頁を参照する）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両方の鎖の比較を使用する。
【0040】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３～５７８７頁を参照する）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【0041】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけが異なる場合、ポリペプチドは一般的に第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記のようにストリンジェントな条件下で２つの分子又はそれらの相補体が互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、配列を増幅させるために同じプライマーを使用することができることである。
【0042】
抗体は、入り組んだ内部構造を有する大きく複雑な分子（約１５０，０００の分子量又は約１３２０アミノ酸）である。天然の抗体分子はポリペプチド鎖の２つの同一の対を含有し、各対は１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。各軽鎖及び重鎖は次に２つの領域からなる：標的抗原への結合に関与する可変（「Ｖ」）領域、及び免疫系の他の成分と相互作用する定常（「Ｃ」）領域。軽鎖及び重鎖可変領域（本明細書でそれぞれ軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインとも呼ばれる）は３次元空間で一緒になって、抗原（例えば、細胞表面の受容体）に結合する可変領域を形成する。各軽鎖又は重鎖可変領域の中に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短いセグメント（長さが平均で１０アミノ酸）がある。抗体可変ドメイン中の６つのＣＤＲ（軽鎖から３つ及び重鎖から３つ）は、３次元空間で一緒にたたまれて標的抗原の上へドッキングする実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置及び長さは、Ｋａｂａｔ、Ｅ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３、１９８７年、によって正確に規定されている。ＣＤＲに含有されていない可変領域の部分はフレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれ、それはＣＤＲのための環境を形成する。抗体をコードする認知された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ又はラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンと分類され、それらは次に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。
【0043】
用語「抗原」及び「エピトープ」は、免疫系の成分、例えば、抗体、Ｔ細胞受容体又は他の免疫受容体、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の上の受容体によって特異的に認識される分子（例えば、ポリペプチド）の部分を互換的に指す。本明細書で使用されるように、用語「抗原」は、抗原性エピトープ及びその抗原性断片を包含する。
【0044】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を有することができる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変重鎖」、「ＶＨ」又は「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し；用語「可変軽鎖」、「ＶＬ」又は「ＶＬ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂを含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【0045】
抗体の機能的断片の例には、完全抗体分子、抗体断片、例えばＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’及びそれらの任意の組合せ、又は標的抗原への結合が可能な免疫グロブリンペプチドの他の任意の機能的部分が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第４版、２００１を参照する）。当業者によって理解されるように、様々な方法、例えばペプシンなどの酵素によるインタクトな抗体の消化；又は新規合成によって、様々な抗体断片を得ることができる。しばしば抗体断片は、化学的に又は組換えＤＮＡ方法を使用して新規に合成される。したがって、用語抗体には、本明細書で使用されるように、完全体抗体の改変によって生成される抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法を使用して新規に合成されるもの（例えば、単鎖Ｆｖ）、又はファージディスプレイライブラリーを使用して同定されるものが含まれる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２頁を参照する）。用語「抗体」には、二価又は二重特異性の分子、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディも含まれる。二価及び二重特異性の分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７頁、Ｐａｃｋ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９頁、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等（１９９３）、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ ９０：６４４４頁、Ｇｒｕｂｅｒ等（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８頁、Ｚｈｕ等（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：７８１頁、Ｈｕ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５頁、Ａｄａｍｓ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０２６頁及びＭｃＣａｒｔｎｅｙ等（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１頁に記載されている。
【0046】
抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「と特異的に（又は選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質又はペプチドに言及する場合、しばしばタンパク質及び他の生物物質の不均一集団中のタンパク質の存在の決定因子である結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件の下で、特定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０～１００倍を超えて特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質へのその特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、選択される抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とはそうでない抗体のサブセットだけを得るように、ポリクローナル抗体を選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることによって達成することができる。特定のタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、タンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが通常使用される（特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマット及び条件の記載については、例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照する）。
【0047】
本明細書で使用される用語「スパイクタンパク質」又は「Ｓタンパク質」は、Ｓ糖タンパク質、Ｅ２、ペプロマータンパク質としても知られるスパイク糖タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はスパイクタンパク質の活性を維持する（例えばスパイクタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するスパイクタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、スパイクタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０ＤＴＣ２によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0048】
本明細書で使用される用語「エンベロープタンパク質」又は「Ｅタンパク質」は、ｓＭタンパク質としても知られるエンベロープ低分子膜タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はエンベロープタンパク質の活性を維持する（例えばエンベロープタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するエンベロープタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０ＤＴＣ４によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0049】
本明細書で使用される用語「膜タンパク質」又は「Ｍタンパク質」は、膜タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は膜タンパク質の活性を維持する（例えば膜タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する膜タンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、膜タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０ＤＴＣ５によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0050】
本明細書で使用される用語「ヌクレオカプシドタンパク質」又は「Ｎタンパク質」は、ヌクレオプロテインタンパク質、ＮＣタンパク質としても知られるヌクレオカプシドタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はヌクレオカプシドタンパク質の活性を維持する（例えばヌクレオカプシドタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するヌクレオカプシドタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ヌクレオカプシドタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０ＤＴＣ９によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0051】
本明細書で使用される用語「糖タンパク質Ｇタンパク質」又は「Ｇタンパク質」は、膜結合糖タンパク質、ｍＧタンパク質としても知られる主要表面糖タンパク質Ｇタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は糖タンパク質Ｇタンパク質の活性を維持する（例えば糖タンパク質Ｇタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する糖タンパク質Ｇタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、糖タンパク質Ｇタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０３４２３によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0052】
本明細書で使用される用語「糖タンパク質Ｆタンパク質」又は「Ｆタンパク質」は、融合糖タンパク質Ｆ０、融合糖タンパク質Ｆ２、介在セグメント、Ｐｅｐ２７、ペプチド２７、融合糖タンパク質Ｆ１としても知られる融合糖タンパク質タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は糖タンパク質Ｆタンパク質の活性を維持する（例えば糖タンパク質Ｆタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する糖タンパク質Ｆタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、糖タンパク質Ｆタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０３４２０によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0053】
本明細書で使用される用語「糖タンパク質ＳＨタンパク質」又は「ＳＨタンパク質」は、低分子量タンパク質１Ａとしても知られる低分子量疎水性タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は糖タンパク質ＳＨタンパク質の活性を維持する（例えば糖タンパク質ＳＨタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する糖タンパク質ＳＨタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、糖タンパク質ＳＨタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０ＤＯＥ５によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0054】
本明細書で使用される用語「血球凝集素－ノイラミニダーゼタンパク質」又は「ＨＮタンパク質」は、血球凝集素－ノイラミニダーゼの組換えか又は天然に存在する形、又は血球凝集素－ノイラミニダーゼタンパク質の活性を維持する（例えば血球凝集素－ノイラミニダーゼタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する血球凝集素－ノイラミニダーゼタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、血球凝集素－ノイラミニダーゼタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ２１５２６によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0055】
本明細書で使用される用語「融合糖タンパク質タンパク質」又は「Ｆタンパク質」は、融合糖タンパク質０の組換えか又は天然に存在する形、又は融合糖タンパク質の活性を維持する（例えば融合糖タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する融合糖タンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、融合糖タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０６８２８によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0056】
本明細書で使用される用語「マトリックスタンパク質」又は「Ｍタンパク質」は、マトリックスタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はマトリックスタンパク質の活性を維持する（例えばマトリックスタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するマトリックスタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、マトリックスタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０７８７３によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0057】
本明細書で使用される用語「カプシド糖タンパク質ＶＰ１」又は「ＶＰ１タンパク質」は、カプシドタンパク質ＶＰ１の組換えか又は天然に存在する形、又はカプシド糖タンパク質ＶＰ１の活性を維持する（例えばカプシド糖タンパク質ＶＰ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するカプシド糖タンパク質ＶＰ１と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、カプシド糖タンパク質ＶＰ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ６ＢＫ９５によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0058】
本明細書で使用される用語「カプシド糖タンパク質ＶＰ０」又は「ＶＰ０タンパク質」は、カプシドタンパク質ＶＰ０の組換えか又は天然に存在する形、又はカプシド糖タンパク質ＶＰ０の活性を維持する（例えばカプシド糖タンパク質ＶＰ０と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するカプシド糖タンパク質ＶＰ０と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、カプシド糖タンパク質ＶＰ０は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｄ４ＮＹＪ３によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0059】
本明細書で使用される用語「ヘキソンタンパク質」又は「ヘキソン」は、ヘキソンタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はヘキソンタンパク質の活性を維持する（例えばヘキソンタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するヘキソンタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ヘキソンタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＤＫＬ１によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0060】
本明細書で使用される用語「ペントンタンパク質」又は「ペントン」は、ペントンタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はペントンタンパク質の活性を維持する（例えばペントンタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するペントンタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ペントンタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ２Ｙ０Ｈ９によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0061】
本明細書で使用される用語「線維タンパク質」又は「線維」は、線維タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は線維タンパク質の活性を維持する（例えば線維タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する線維タンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、線維タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ０４５０１によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0062】
本明細書で使用される用語「プレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａ」は、カプシド頂点特異的成分ＩＩＩａ、ＣＶＳＣ、タンパク質ＩＩＩａ又はｐＩＩＩａとしても知られるプレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａの組換えか又は天然に存在する形、又はプレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａの活性を維持する（例えばプレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するプレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａと比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、プレヘキソン連結タンパク質ＩＩＩａは、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ２Ｙ０１０によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0063】
本明細書で使用される用語「プレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩ」は、プレタンパクＶＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ又はタンパク質ＶＩＩＩ－Ｎとしても知られるプレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩの組換えか又は天然に存在する形、又はプレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩの活性を維持する（例えばプレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するプレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩと比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、プレヘキソン連結タンパク質ＶＩＩＩは、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ７１ＢＷ３によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0064】
本明細書で使用される用語「ヘキソンインターレーシングタンパク質」は、タンパク質ＩＸとしても知られるヘキソンインターレーシングタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はヘキソンインターレーシングタンパク質の活性を維持する（例えばヘキソンインターレーシングタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するヘキソンインターレーシングタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、ヘキソンインターレーシングタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ７１ＢＷ３によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0065】
本明細書で使用される用語「主要表面糖タンパク質Ｇ」は、付着糖タンパク質Ｇ、膜結合糖タンパク質、ｍＧとしても知られる主要表面糖タンパク質Ｇの組換えか又は天然に存在する形、又は主要表面糖タンパク質Ｇの活性を維持する（例えば主要表面糖タンパク質Ｇと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する主要表面糖タンパク質Ｇと比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、主要表面糖タンパク質Ｇタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６ＷＢ９４によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0066】
本明細書で使用される用語「融合糖タンパク質Ｆ０」は、タンパク質Ｆとしても知られる融合糖タンパク質Ｆ０の組換えか又は天然に存在する形、又は融合糖タンパク質Ｆ０の活性を維持する（例えば融合糖タンパク質Ｆ０と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する融合糖タンパク質Ｆ０と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、融合糖タンパク質Ｆ０は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６ＷＢ９８によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0067】
本明細書で使用される用語「核タンパク質」又は「タンパク質Ｎ」は、ヌクレオカプシドタンパク質としても知られる核タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は核タンパク質の活性を維持する（例えば核タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する核タンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、核タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６ＷＢＡ１によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0068】
本明細書で使用される用語「低分子量疎水性タンパク質」又は「ＳＨタンパク質」は、低分子量疎水性タンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又は低分子量疎水性タンパク質の活性を維持する（例えば低分子量疎水性タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在する低分子量疎水性タンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、低分子量疎水性タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６ＷＢ９５によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0069】
本明細書で使用される用語「マトリックスタンパク質」又は「Ｍタンパク質」は、マトリックスタンパク質の組換えか又は天然に存在する形、又はマトリックスタンパク質の活性を維持する（例えばマトリックスタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するマトリックスタンパク質と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、マトリックスタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６ＷＢ９９によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0070】
本明細書で使用される用語「カプシドタンパク質ＶＰ１」は、カプシドタンパク質ＶＰ１の組換えか又は天然に存在する形、又はカプシドタンパク質ＶＰ１の活性を維持する（例えばカプシドタンパク質ＶＰ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するカプシドタンパク質ＶＰ１と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、カプシドタンパク質ＶＰ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｉ０Ｂ９３４によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0071】
本明細書で使用される用語「カプシドタンパク質ＶＰ２」は、カプシドタンパク質ＶＰ２の組換えか又は天然に存在する形、又はカプシドタンパク質ＶＰ２の活性を維持する（例えばカプシドタンパク質ＶＰ２と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲内の活性）そのバリアント若しくはホモログのいずれも含む。一部の態様では、バリアント又はホモログは、天然に存在するカプシドタンパク質ＶＰ２と比較して、全配列又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態では、カプシドタンパク質ＶＰ２は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ２７ＸＩ９によって識別されるタンパク質と実質的に同一である。
【0072】
用語「疾患」又は「状態」は、本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置することが可能な、対象の生存状態又は健康状態を指す。疾患は、自己免疫性、炎症性、がん、感染性、代謝性、発達上の、心血管、肝臓、腸管、内分泌、神経学的又は他の疾患であってよい。一部の例では、疾患は感染性の疾患（例えばコロナウイルス感染症）である。
【0073】
用語「感染症」又は「感染性疾患」は、細菌、ウイルス、真菌類又は任意の他の病原性微生物因子などの生物体が引き起こすことができる疾患又は状態を指す。実施形態では、感染性疾患は病原性ウイルスによって引き起こされる。病原性ウイルスは、細胞（例えばヒト細胞）に感染してその中で複製することができ、疾患を引き起こすウイルスである。実施形態では、感染性疾患はウイルス関連の疾患である。非限定的なウイルス関連の疾患には、肝ウイルス疾患（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎）、ヘルペスウイルス感染症（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、帯状疱疹）、フラビウイルス感染症、ジカウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、呼吸器ウイルス感染症（「肺ウイルス疾患」を引き起こす）（例えば、アデノウイルス感染症、インフルエンザ、重度の急性呼吸器症候群、コロナウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ））、胃腸ウイルス感染症（例えば、ノロウイルス感染症、ロタウイルス感染症、アストロウイルス感染症）、発疹性ウイルス感染症（例えば、麻疹、帯状ヘルペス、天然痘、風疹）、ウイルス出血性疾患（例えば、エボラ、ラッサ熱、デング熱、黄熱）、神経性ウイルス感染症（例えば、ウエストナイルウイルス感染症、ポリオ、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性脳炎、日本脳炎、狂犬病）及びヒトパピローマウイルス感染症が含まれる。実施形態では、ウイルス関連疾患は肺ウイルスによって引き起こされる。
【0074】
用語「肺ウイルス感染症」又は「肺ウイルス疾患」は、細胞に感染してその中で複製することができ、呼吸器系（例えば下部呼吸器系、上部呼吸器系及び肺）を侵す疾患又は症状を引き起こすことができるウイルスによって引き起こされる状態を指す。実施形態では、肺ウイルス感染症を引き起こすウイルスは、侵入口として鼻及び／又は口を用いて対象に侵入することができる。肺ウイルス感染症は、ヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳと関連したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）又はヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）を限定されずに含むウイルスが引き起こすことができる。肺ウイルス感染症は、表２に掲載される１つ以上の症状をもたらすことができる。
【0075】
用語「ウイルス」又は「ウイルス粒子」は、生物学分野におけるそれらのプレーンな通常の意味によって使用され、ウイルスゲノム（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖）、タンパク質（例えばカプシド）及び関連するタンパク質の保護コート、並びにエンベロープ型ウイルス（例えばヘルペスウイルス）の場合は、脂質及び任意選択的に宿主細胞膜の成分を含むエンベロープ、及び／又はウイルスタンパク質を含む粒子を指す。
【0076】
「ヒトコロナウイルス」又は「ＨＣｏＶ」は、ヒトの細胞に入って複製することができ、疾患（例えば気道感染症）を引き起こすことができる一群のＲＮＡウイルスを指す。実施形態では、コロナウイルスは正のセンスの一本鎖ＲＮＡ及びヌクレオカプシドを有するエンベロープ型のウイルスである。コロナウイルスはサイズが変動し、例えば直径が５０～２００ｎｍであってよい。実施形態では、コロナウイルスのウイルスエンベロープは脂質二重層で構成され、膜、エンベロープ及びスパイクタンパク質を含む。例えば、ＨｃｏＶはスパイクタンパク質が宿主細胞受容体に結合するときに宿主細胞に入る。ＨＣｏＶには、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連のコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及び重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が含まれる。例えば、細胞へのＨｃｏＶの侵入は、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ又はＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすことができる。
【0077】
用語「重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス２」又は「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすコロナウイルスの系統を指す。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は正のセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はベータコロナウイルス科に属し、そのメンバーには新千年紀に重度疾患の大発生を引き起こしている２つの他の人畜共通ウイルスが含まれる：重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２～２００３年に重度の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の流行を誘発したＳＡＲＳ－ＣｏＶにほぼ８０パーセントの遺伝子類似性を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１２年に開始してなお持続している中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の流行の原因であるＭＥＲＳ－ＣｏＶとの関係がより離れている。例えば、Ｙｕｋｉ等、２０２０、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．２１５、１０８４２７頁；Ｃｈｅｎ等２０２０、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．９２、４１８～４２３頁。用語「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ」は、ＳＡＲＳコロナウイルスを指す。用語「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ」には任意のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＭＥＲＳ－ＣｏＶが含まれる。
【0078】
「ＣＯＶＩＤ－１９」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患を指す。ＣＯＶＩＤ－１９は２～１４日間の潜伏期間を有し、症状には、例えば発熱、疲労、咳及び息切れ（例えば、呼吸困難）が含まれる。
【0079】
用語「重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス」又は「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１」は、重度の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすコロナウイルスの系統を指す。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１は、肺の中の上皮細胞に感染する、エンベロープ型の正のセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。実施形態では、ウイルスはアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体に結合することによって宿主細胞に入る。
【0080】
「ＭＥＲＳ－ＣｏＶ」は、中東呼吸器症候群関連のコロナウイルスを指す。例えば、Ｃｈｕｎｇ等、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ、２０１８。Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２５（５）：９５８～９６２頁（２０１９）を参照する。
【0081】
「中東呼吸器症候群」又は「ＭＥＲＳ」は、ＭＥＲＳ－コロナウイルスによって引き起こされる疾患を指す。
【0082】
ヒトオルトニューモウイルスとしても知られる「ヒトＲＳウイルス」又は「ＲＳＶ」は、ヒト細胞に感染し、呼吸器管を侵す症状を有する感染症を引き起こすことができるウイルスを指す。実施形態では、ＲＳＶは負のセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶは鼻又は目を通して伝播することができ、例えば上下気道の円柱状の上皮細胞に影響を及ぼすことができる。ＲＳＶの表面のＦタンパク質は、ウイルス及び宿主細胞膜を融合させるために使用することができ、このように宿主細胞の感染をもたらす。例えば、Ｆ及びＧ糖タンパク質は、ウイルス付着及び宿主細胞の感染のために使用される。ＲＳＶ感染が引き起こすことができる症状及び症候群には、肺炎、呼吸器不全、無呼吸、呼吸窮迫及び遠隔炎症が含まれる。
【0083】
「ヒトパラインフルエンザウイルス」又は「ＨＰＩＶ」は、細胞に感染してヒトパラインフルエンザを引き起こすことができるウイルスを指す。実施形態では、ＨＰＩＶは一本鎖のＲＮＡウイルスである。ＨＰＩＶには、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３型及びヒトパラインフルエンザウイルス４型が含まれる。例えば、ＨＰＩＶはウイルスと宿主細胞脂質膜の間の付着及び融合によって宿主細胞に感染する。例えば、ＨＰＩＶは、細胞侵入のためにエンベロープタンパク質及び融合タンパク質を用いて宿主細胞に付着し、融合することによって細胞に入ることができる。ＨＰＩＶ感染によって引き起こされる症状及び症候群には、下気道感染症、上気道感染症、細気管支炎、肺炎、神経疾患及び気道炎症が含まれる。
【0084】
「ヒトライノウイルス」又は「ＨＲＶ」は、ヒトに感染して感冒を引き起こすことができるウイルスを指す。ＨＲＶには、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ及びライノウイルスＣが含まれる。実施形態では、ＨＲＶは一本鎖の正センスＲＮＡウイルスである。実施形態では、ＨＲＶは呼吸器液滴又は媒介物のエアゾールによって伝播される。ＨＲＶ感染によって引き起こされる症候群及び症状には、感冒、咽喉炎、鼻水、鼻づまり、くしゃみ、咳、筋肉痛、疲労及び頭痛が含まれる。
【0085】
「アデノウイルス」又は「ＡＤＶ」は、細胞に感染することができ、広範囲の呼吸器症状を引き起こすことができるウイルスを指す。実施形態では、ＡＤＶは二本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープ型のウイルスである。実施形態では、ヒトＡＤＶ（ＨＡｄＶ）には、アデノウイルスＡ、アデノウイルスＢ、アデノウイルスＣ、アデノウイルスＤ、アデノウイルスＥ、アデノウイルスＦ及びアデノウイルスＧが含まれる。例えば、ＡＤＶの細胞侵入は、線維タンパク質のノブドメインの宿主細胞受容体への結合によって開始される。例えば、ペントンタンパク質はインテグリン分子と相互作用し、それによってアデノウイルスの侵入を刺激する。アデノウイルス感染によって引き起こされる症状及び症候群には、扁桃炎、細気管支炎及び肺炎が含まれる。
【0086】
本明細書で定義されるように、分子（例えばポリヌクレオチド又はタンパク質）の活性及び／又は機能に関する用語「阻害」、「阻害する」、「阻害すること」などは、阻害がない場合のタンパク質の活性又は機能と比較して、分子の活性又は機能に負の影響を及ぼすこと（例えば、減少又は低減すること）を意味する。したがって、阻害には、シグナル伝達又は酵素活性又はタンパク質若しくはポリヌクレオチドの量の刺激を少なくとも一部、部分的に若しくは完全にブロックすること、減少、阻止するか、又は活性化を遅らせるか不活性化すること、除感作又は下方制御することが含まれる。同様に、「阻害剤」は、例えば、標的生体分子に結合すること、その活性を部分的又は完全にブロックすること、減少すること、阻止すること、遅らせること、不活性化すること、除感作すること又は下方制御することによって、標的生体分子（すなわち自然から見出すことができる核酸、ペプチド、炭水化物、脂質又は任意の他の分子）を阻害する化合物である。疾患予防処置との関連で、阻害は疾患（例えばＣｏｖｉｄ－１９）又は疾患の症状の低減を指す。
【0087】
本明細書で使用されるように（及び当技術分野で良く理解されているように）、「処置すること」又は「処置」は、臨床結果を含む対象の状態の有益であるか又は所望の結果を得るための任意のアプローチも広く含む。有益であるか所望の臨床結果には、限定されずに、１つ以上の症状若しくは状態の軽減又は改善、疾患の程度の減少、疾患の状態を安定させること（すなわち、悪化させないこと）、疾患の伝播又は拡散の予防、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、疾患再発の減少、及び検出可能であるか検出不能である、部分的又は完全な寛解を含めることができる。言い換えると、本明細書で使用される「処置」には、疾患の任意の治癒、改善又は予防が含まれる。処置は、疾患の発生を阻止すること；疾患の拡散を阻害すること；疾患の症状を軽減すること、疾患の根本原因を完全若しくは部分的に取り除くこと、疾患の持続時間を短くすること、又はこれらの事物の組合せを実行することができる。
【0088】
本明細書で使用される「処置すること」及び「処置」には、予防的処置が含まれる。処置方法には、活性薬剤の治療的有効量を対象に投与することが含まれる。投与ステップは単回投与からなることができるか、一連の投与を含むことができる。処置期間の長さは、様々な因子、例えば状態の重症度、患者の年齢、活性薬剤の濃度、処置で使用する組成物の活性、又はそれらの組合せに依存する。処置又は予防のために使用される薬剤の有効投薬量は、特定の処置又は処置レジメンの過程で増減することができることも理解される。投薬量の変化は、当技術分野で公知である標準の診断アッセイがもたらし、明らかにすることができる。一部の場合には、長期投与が必要とされることがある。例えば、組成物は患者を処置するのに十分な量及び期間で対象に投与される。実施形態では、処置すること又は処置は、予防的処置でない。
【0089】
用語「予防する」は、患者における疾患又は疾患症状の発生の減少を指す。上記のように、予防は完全である（検出可能な症状がない）か、又は処置なしでおそらく起こるだろうより少ない症状が観察されるように部分的であってよい。
【0090】
本明細書で使用されるように、疾患の「症状」には、疾患と関連するあらゆる臨床又は検査で発現される徴候を含み、対象が感じるか観察することができるものに限定されない。
【0091】
物質又は疾患に関連した物質の活性若しくは機能との関連で、用語「関連した」又は「と関連した」は、その疾患は（全部又は一部が）、又はその疾患の症状は（全部又は一部が）物質又は物質の活性若しくは機能が引き起こすことができることを意味する。症状、例えば疾患又は状態と関連している症状との関連でこの用語が使用されるとき、それは、症状がその症状を示す対象に存在する疾患又は状態の指標となることができることを意味する。
【0092】
「患者」又は「それを必要とする対象」は、本明細書で提供される医薬組成物の投与によって処置することができる疾患又は状態を患っているかそれを起こしやすい生物を指す。非限定的な例には、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ及び他の非哺乳動物が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。
【0093】
「有効量」は、化合物が化合物の不在と比較して明記された目的を達成する（例えば、それが投与される効果を達成するか、疾患を処置するか、酵素活性を低減するか、酵素活性を増加させるか、シグナル伝達経路を低減するか、又は疾患若しくは状態の１つ以上の症状を軽減する）のに十分な量である。「有効量」の例は、疾患の１つ又は複数の症状の処置、予防又は低減に寄与するのに十分な量であり、それは「治療的有効量」と呼ぶこともできる。１つ又は複数の症状の「低減」（及び、この語句の文法的同等物）は、症状（複数可）の重症度若しくは頻度の減少又は症状（複数可）の排除を意味する。薬物の「予防的有効量」は、対象に投与されるときに意図された予防効果を有する、例えば、損傷、疾患、病状若しくは状態の開始（又は、再発）を阻止するか遅らせる、又は損傷、疾患、病状若しくは状態、若しくはそれらの症状の開始（又は、再発）の可能性を低減する薬物の量である。完全な予防効果は１用量の投与によって必ずしも発生するとは限らず、一連の投与の後にだけ発生する可能性がある。したがって、予防的有効量は、１回以上の投与で投与することができる。本明細書で使用されるように、「活性低下量」は、アンタゴニストの不在と比較して酵素の活性を低下させるのに必要なアンタゴニストの量を指す。本明細書で使用されるように、「機能破壊量」は、アンタゴニストの不在と比較して酵素又はタンパク質の機能を破壊するのに必要なアンタゴニストの量を指す。正確な量は処置の目的に依存し、公知の技術を使用して当業技術者が確定することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（第１～３巻、１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ、Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２００３、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓとＷｉｌｋｉｎｓを参照する）。
【0094】
本明細書に記載される任意の化合物について、治療的有効量は結合アッセイ又は細胞培養アッセイから最初に決定することができる。目標の濃度は、本明細書に記載されるか当分野で公知である方法を使用して測定したときに、本明細書に記載される方法を達成することが可能な活性化合物（複数可）の濃度である。
【0095】
当技術分野で周知であるように、ヒトで使用される治療的有効量は、動物モデルから決定することもできる。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であると見出された濃度を達成するように処方することができる。ヒトでの投薬量は、前記のように化合物の有効性をモニタリングし、投薬量を上下に調整することによって調整することができる。上記の方法及び他の方法に基づいてヒトで最大効能を達成するように用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【0096】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、前記のように障害を改善するのに十分な治療剤の量を指す。例えば、所与のパラメータのために、治療的有効量は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又は少なくとも１００％の増加又は低下を示す。治療的有効性は、「倍」の増加又は低下と表すこともできる。例えば、治療的有効量は対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれ以上の効果を有することができる。
【0097】
投薬量は、患者の必要量及び用いられる化合物によって変えることができる。患者に投与される用量は、本開示との関連で、患者で有益な治療的応答を経時的に達成するのに十分であるべきである。用量のサイズは、任意の有害副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。特定の状況のための適切な投薬量の決定は、治療医師の技能の範囲内である。一般的に、処置は、化合物の最適用量未満であるより小さい投薬量で開始される。その後、状況下の最適効果に到達するまで、投薬量は少量ずつ増加される。処置される特定の臨床適応に有効な投与化合物のレベルを提供するように、投薬の量及び間隔を個々に調整することができる。これは、個体の疾患状態の重症度に相応する治療レジメンを提供する。
【0098】
本明細書で使用されるように、用語「投与する」は、対象への経口投与、エアゾール、乾燥粉末、経鼻噴霧、坐薬、局所接触としての投与、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、病巣内、クモ膜下、鼻腔内又は皮下投与、又は徐放性装置、例えばミニ浸透圧ポンプの植え込みを意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、口内、舌下、口蓋、歯肉、経鼻、経腟、直腸又は経皮）を含む、任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内及び頭蓋内が含まれる。送達の他の様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、投与は列挙される活性剤以外のいかなる活性剤の投与も含まない。
【0099】
「同時投与」は、本明細書に記載される組成物が１つ以上の追加の療法の投与と同時に、直前に又は直後に投与されることを意味する。本明細書で提供される化合物は、患者に単独で投与することができるか、又は同時投与することができる。同時投与は、個々の化合物又は組合せた化合物（複数の化合物）の同時又は逐次的投与を含むものである。したがって、調製物は、必要に応じて他の活性物質と（例えば、代謝分解を低減させるために）組み合わせることもできる。本開示の組成物は局所経路により経皮的に送達することができ、又はアプリケータースティック、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗布剤、粉末及びエアゾールとして製剤化することができる。調製物は、吸入粘液溶解薬（例えば、当技術分野で公知のｒｈＤＮａｓｅ）と、又は吸入気管支拡張剤（短時間又は長時間作用ベータアゴニスト、短時間又は長時間作用抗コリン作働薬）、吸入コルチコステロイド又は吸入抗生物質と組み合わせ、相加効果又は相乗効果を提供することによってこれらの薬物の有効性を向上させることもできる。本発明の組成物は、局所経路により経皮的に送達すること、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、クリーム、軟膏、ナノ粒子、ペースト、ゼリー、塗布剤、粉末及びエアゾールとして製剤化することができる。経口調製物には、患者による摂取に好適である錠剤、丸剤、粉末、糖衣剤、カプセル、液体、ロゼンジ、カシェ剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等が含まれる。固形調製物には、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐薬及び分散顆粒が含まれる。液状調製物には、溶液、懸濁液及び乳剤、例えば水又は水／プロピレングリコール溶液が含まれる。本発明の組成物は、持続的放出及び／又は快適さを提供するための成分を追加的に含むことができる。そのような成分には、高分子量、アニオン性擬粘膜ポリマー、ゲル化多糖及び微細薬物担体基質が含まれる。これらの成分は、米国特許第４，９１１，９２０号；５，４０３，８４１号；５，２１２，１６２号；及び４，８６１，７６０号でより詳細に議論される。これらの特許の全内容は、全ての目的のために参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明の組成物は、体内での徐放性のためにマイクロスフェアとして送達することもできる。例えば、マイクロスフェアは皮下に徐々に放出する薬物含有マイクロスフェアの皮内注射を通して（Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．７：６２３～６４５頁、１９９５を参照する）；生分解性及び注射用ゲル製剤として（例えば、ＧａｏＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１２：８５７～８６３頁、１９９５を参照する）；又は経口投与のためのマイクロスフェアとして（例えば、Ｅｙｌｅｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：６６９～６７４頁、１９９７を参照する）投与することができる。別の実施形態では、本発明の組成物の製剤は、細胞膜と融合するか又は飲食運動で取り込まれるリポソームを用いて、すなわち細胞の表面膜タンパク質受容体に結合してエンドサイトーシスをもたらすリポソームに付着している受容体リガンドを用いることによって送達することができる。リポソームを使用することによって、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的な受容体リガンドを有するか、さもなければ特異臓器に優先的に向けられる場合、本発明の組成物の送達の焦点をインビボで標的細胞に合わせることができる。（例えば、Ａｌ－Ｍｕｈａｍｍｅｄ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１３：２９３～３０６頁、１９９６；Ｃｈｏｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６９８～７０８頁、１９９５；Ｏｓｔｒｏ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６～１５８７頁、１９８９を参照する）。
【0100】
用語「ワクチン」は、特定の疾患又は病原体への活性後天性免疫及び／又はそれの治療効果（例えば処置）を提供することができる組成物を指す。ワクチンは、病原体又は疾患、すなわち標的病原体又は疾患に対して対象で免疫応答を誘導することができる１つ以上の薬剤を一般的に含有する。免疫原性因子は、その因子を標的病原体又は疾患の存在の脅威又は指標として認識するように体の免疫系を刺激し、それによって、免疫系が以降の曝露の後に病原体のいずれもより容易に認識し、破壊することができるように免疫学的記憶を誘導する。ワクチンは予防的（例えば任意の天然の病原体による将来の感染症の、又は素因のある対象におけるがんの予想される発生の影響を阻止又は改善すること）、又は治療的（例えば、がんと診断された対象でがんを処置すること）であってよい。ワクチンの投与は、ワクチン接種と呼ばれる。一部の例では、ワクチン組成物は対象に核酸を、例えば抗原性分子（例えばペプチド）をコードするｍＲＮＡを提供することができる。対象においてワクチン組成物を通して送達される核酸は抗原性分子に発現されて、対象が抗原性分子に対して免疫を獲得することを可能にする。感染性疾患に対するワクチン接種との関連で、ワクチン組成物は、ある特定の病原体と関連している抗原性分子、例えば、病原体（例えば病原性の細菌又はウイルス）で発現されることが知られている１つ以上のペプチドをコードするｍＲＮＡを提供することができる。ウイルスワクチンとの関連で、ワクチン組成物は、免疫が求められるウイルスに特有のある特定のウイルスペプチド、例えば、ウイルス表面（例えば、カプシド）の上で実質的に排他的に又は高度に発現されるペプチドをコードするｍＲＮＡを提供することができる。対象は、ウイルスワクチン組成物によるワクチン接種の後、それを発現する細胞を特異的に死滅させるウイルスペプチドに対する免疫を有することができる。
【0101】
用語「アジュバント」は、免疫学の分野のそのプレーンな通常の意味に従って使用されて、ワクチンの成分として一般的に使用される物質を指す。アジュバントは、ワクチンの一部として１つ以上の特異抗原と一緒に対象に投与されるとき、対象で抗原特異的免疫応答を増加させることができる。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を加速させる。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を延長する。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を増強する。
【0102】
本明細書で使用される用語「免疫応答」は、限定されずに、免疫応答の標的である特異病原体又は特異的な種類の細胞への初期応答の後に適応免疫が免疫学的記憶を導き出し、以降の遭遇の後にその標的への増強された応答につながる「獲得免疫反応」としても知られる「適応免疫応答」を包含する。免疫学的記憶の誘導は、ワクチン接種の根拠を提供することができる。
【0103】
用語「免疫原性」又は「抗原性」は、免疫適格対象に投与されるとき、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、Ｂ細胞応答（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体の産生）、ＮＫ細胞応答又はその任意の組合せを誘導する化合物又は組成物を指す。したがって、免疫原性又は抗原性の組成物は、免疫適格対象で免疫応答を導き出すことが可能な組成物である。例えば、免疫原性又は抗原性の組成物は、免疫応答の標的である病原体又は特異的な種類の細胞と関連している１つ以上の免疫原性エピトープを含むことができる。さらに、免疫原性組成物は、エピトープ（複数可）を発現させるために使用することができる（したがって、標的の病原体又は細胞の種類と関連しているポリペプチド又は関連したポリペプチドに対して免疫応答を導き出すために使用することができる）抗原性ポリペプチドの、１つ以上の免疫原性エピトープをコードする単離された核酸構築物（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）を含むことができる。
【0104】
本明細書で提供される方法により、その全ては本明細書で互換的に使用される、本明細書で提供される薬剤、組成物又は複合体（例えば、複合体又はそれを含むワクチン組成物）の１つ以上の有効量を対象に投与することができる。用語「有効量」及び「有効投薬量」は、互換的に使用される。用語「有効量」は、所望の効果（例えば、核酸によって発現される免疫原性ペプチドを発現し、その免疫原性ペプチドの意図された結果を示すこと）をもたらすのに必要な任意の量と規定される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、当業者が経験的に決定することができる。投与のための投薬量範囲は、所望の効果、例えば、核酸のトランスフェクション、遺伝子発現のモジュレーション、遺伝子編集、幹細胞の誘導、免疫応答の誘導、その他をもたらすのに十分大きなものである。投薬量は、実質的な有害副作用、例えば望ましくない交差反応、過敏症反応などを引き起こすほどの大きさであるべきでない。一般的に、投薬量は年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患若しくは障害の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかによって異なることができ、当業者が決定することができる。いずれかの禁忌症が生じた場合、投薬量は個々の医師が調整することができる。投薬量は異なることができ、１日又は数日の間、毎日１回以上の投与で投与することができる。所与のクラスの医薬品のための適当な投薬量のための指針は、文献中に見出すことができる。例えば、所与のパラメータのために、有効量は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又は少なくとも１００％の増加又は低下を示すことができる。有効性は、「倍」の増加又は低下と表すこともできる。例えば、治療的有効量は対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれ以上の効果を有することができる。正確な用量及び処方は処置の目的に依存することができ、公知の技術を使用して当業技術者が確定することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（第１～３巻、１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ、編集者（２００３）、及びＰｉｃｋａｒ、Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照する）。
【0105】
本明細書で使用される「細胞」は、そのゲノムＤＮＡを保存又は複製するのに十分な代謝又は他の機能を実行する細胞を指す。細胞は、例えば、インタクトな膜の存在、特定の色素による染色、子孫を残す能力、又は、生殖体の場合、第２の生殖体と合体して生存能力のある子孫を残す能力を含む当技術分野で周知の方法によって同定することができる。細胞は、原核生物及び真核生物の細胞を含むことができる。原核細胞には、限定されずに細菌が含まれる。真核細胞には、限定されずに、酵母細胞並びに植物及び動物に由来する細胞、例えば哺乳動物、昆虫（例えば、ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）及びヒト細胞が含まれる。細胞は、それらが天然に非接着性であるか、又は例えばトリプシン処理によって表面に接着しないように処理されたとき、有益である可能性がある。
【0106】
「対照」又は「対照実験」は、そのプレーンな通常の意味により使用され、実験の対象又は試薬が、実験の手順、試薬又は変数の省略を除いて並行実験におけるように処理される実験を指す。一部の場合には、対照は、実験効果の評価において比較標準として使用される。一部の実施形態では、対照は、本明細書（実施形態及び実施例を含む）に記載される化合物がない場合のタンパク質の活性の測定である。
【0107】
本明細書で使用される用語「結合する」及び「結合している」は、そのプレーンな通常の意味により使用され、原子又は分子の間の結合を指す。結合は、共有結合（例えば、共有結合又はリンカーによる）又は非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合又はハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子間、双極子誘導双極子又はロンドン分散）、環スタッキング（パイ効果）、疎水性相互作用など）であってよい。
【0108】
「接触させる」はそのプレーンな通常の意味により使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば生体分子を含む化合物又は細胞）が反応、相互作用又は物理的に接触するのに十分に近接することを可能にするプロセスを指す。しかし、生じる反応生成物は、加えた試薬の間の反応から、又は反応混合物中で生成することができる、加えた試薬の１つ以上からの中間体から直接的に生成することができることを理解すべきである。
【0109】
用語「接触させる」は、２つの種が反応、相互作用又は物理的に接触することを可能にすることを含むことができ、ここで、２つの種は本明細書に記載される化合物及びタンパク質又は酵素であってよい。一部の実施形態では、接触させることは、本明細書に記載される化合物がシグナル伝達経路に関与するタンパク質又は酵素と相互作用することを可能にすることを含む。
【0110】
本明細書で使用されるように、２つの部分に言及するときの用語「コンジュゲートした」は、２つの部分（例えばナノ粒子外層及び核酸）が結合していることを意味し、ここで、２つの部分を連結する１つ又は複数の結合は、共有結合又は非共有結合であってよい。実施形態では、２つの部分は互いと共有結合している（例えば、直接的に、又は共有結合した中間物を通して）。実施形態では、２つの部分は非共有結合している（例えば、イオン結合（複数可）、ファンデルワールス結合（複数可）／相互作用、水素結合（複数可）、極性結合（複数可）又はそれらの組合せ若しくは混合を通して）。
【0111】
本明細書で使用されるように、用語「バイオコンジュゲート」及び「バイオコンジュゲートリンカー」は、「バイオコンジュゲート反応基」又は「バイオコンジュゲート反応性部分」の原子又は分子の間で生じる結合を指す。結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、本明細書で提供される第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、－ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又は－マレイミド）及び第２のバイオコンジュゲート反応基（例えば、スルフヒドリル、含硫アミノ酸、アミン、アミノ酸を含有するアミン側鎖又はカルボキシレート）の間のコンジュゲートは、直接的、例えば共有結合若しくはリンカー（例えば第２のリンカーの第１のリンカー）によるものであってよいか、又は間接的、例えば非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子間、双極子誘導双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（パイ効果）、疎水性相互作用など）によるものであってもよい。実施形態では、バイオコンジュゲート又はバイオコンジュゲートリンカーは、求核置換（例えば、アミン及びアルコールのハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、並びに炭素間及び炭素－ヘテロ原子の間の多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス－アルダー付加）を限定されずに含む、バイオコンジュゲート化学（すなわち、２つのバイオコンジュゲート反応基の結合）を使用して形成される。これら及び他の有益な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６；及びＦｅｅｎｅｙ等、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８２で議論される。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばスルフヒドリル）に共有結合する。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、ハロアセチル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばスルフヒドリル）に共有結合する。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、ピリジル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばスルフヒドリル）に共有結合する。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばアミン）に共有結合する。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばスルフヒドリル）に共有結合する。実施形態では、第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応基（例えばアミン）に共有結合する。
【0112】
本明細書でバイオコンジュゲート化学のために使用される有益なバイオコンジュゲート反応性部分には、例えば、以下のものが含まれる：
（ａ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルを限定されずに含むカルボキシル基及びその様々な誘導体；
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒド等に変換することができるヒドロキシル基
（ｃ）ハライドを後に求核基、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン又はアルコキシドイオンで置換し、それによってハロゲン原子の部位で新規の基の共有結合をもたらすことができるハロアルキル基；
（ｄ）ディールス－アルダー反応に関与することが可能である求ジエン体基、例えばマレイミド又はマレイミド基；
（ｅ）以降の誘導体化がカルボニル誘導体、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン若しくはオキシムの形成を通して、又はグリニヤール付加若しくはアルキルリチウム付加のような機構を通して可能であるようなアルデヒド又はケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するためのアミンとの後の反応のためのスルホニルハライド基；
（ｇ）ジスルフィドに変換し、ハロゲン化アシルと反応させるか又は金などの金属に結合するか、又はマレイミドと反応させることができるチオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化又は酸化することができるアミン又はスルフヒドリル基（例えば、システインに存在する）；
（ｉ）例えば環化付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン；
（ｊ）例えばアミン及びヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド；
（ｋ）核酸合成で有益なホスホラミダイト及び他の標準の官能基；
（ｌ）金属酸化ケイ素結合；及び
（ｍ）例えばホスフェートジエステル結合を形成するための反応性リン酸基（例えばホスフィン）への金属結合。
（ａ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルを限定されずに含むカルボキシル基及びその様々な誘導体；
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒド等に変換することができるヒドロキシル基
（ｃ）ハライドを後に求核基、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン又はアルコキシドイオンで置換し、それによってハロゲン原子の部位で新規の基の共有結合をもたらすことができるハロアルキル基；
（ｄ）ディールス－アルダー反応に関与することが可能である求ジエン体基、例えばマレイミド又はマレイミド基；
（ｅ）以降の誘導体化がカルボニル誘導体、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン若しくはオキシムの形成を通して、又はグリニヤール付加若しくはアルキルリチウム付加のような機構を通して可能であるようなアルデヒド又はケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するためのアミンとの後の反応のためのスルホニルハライド基；
（ｇ）ジスルフィドに変換し、ハロゲン化アシルと反応させるか又は金などの金属に結合するか、又はマレイミドと反応させることができるチオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化又は酸化することができるアミン又はスルフヒドリル基（例えば、システインに存在する）；
（ｉ）例えば環化付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン；
（ｊ）例えばアミン及びヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド；
（ｋ）核酸合成で有益なホスホラミダイト及び他の標準の官能基；
（ｌ）金属酸化ケイ素結合；及び
（ｍ）例えばホスフェートジエステル結合を形成するための反応性リン酸基（例えばホスフィン）への金属結合。
【0113】
（ｎ）銅触媒環化付加クリック化学を使用してアルキンに結合したアジド。
【0114】
（ｏ）ビオチンコンジュゲートはアビジン又はストレプトアビジンと反応してアビジン－ビオチン複合体又はストレプトアビジン－ビオチン複合体を形成することができる。
【0115】
バイオコンジュゲート反応基は、それらが本明細書に記載されるコンジュゲートの化学的安定性に関与しないように、又はそれに干渉しないように選択することができる。或いは、反応性官能基は、保護基の存在によって架橋反応への関与から保護することができる。実施形態では、バイオコンジュゲートは、不飽和結合の反応に由来する分子実体、例えばマレイミド及びスルフヒドリル基を含む。
【0116】
「検出可能な薬剤」又は「検出可能な部分」は、適当な手段、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、磁気共鳴画像化又は他の物理的手段によって検出可能な組成物、物質、エレメント又は化合物；又はその部分である。例えば、有益な検出可能な薬剤には、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４～１５８１１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、３２Ｐ、蛍光体（例えば蛍光性色素）、電子高密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、極小超常磁性酸化鉄（「ＵＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＵＳＰＩＯナノ粒子凝集体、超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＳＰＩＯナノ粒子凝集体、単結晶酸化鉄ナノ粒子、単結晶酸化鉄、ナノ粒子造影剤、リポソーム又はガドリニウムキレート（「Ｇｄ－キレート」）分子を含有する他の送達ビヒクル、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種（例えば炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、フッ素－１８、ルビジウム－８２）、フッ化デオキシグルコース（例えば、フッ素－１８標識）、任意のガンマ線放射性核種、陽電子放射性核種、放射標識グルコース、放射標識水、放射標識アンモニア、生体コロイド、マイクロバブル（例えばアルブミン、ガラクトース、脂質及び／又はポリマーを含むマイクロバブルシェルを含む；空気、重い気体（複数可）、パーフルオロカーボン、窒素、オクタフルオロプロパン、ペルフレキサン脂質マイクロスフェア、ペルフルトレン等を含むマイクロバブル気体コア）、ヨウ素化造影剤（例えばイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオキシラン、イオプロミド、ジアトリゾエート、メトリゾ酸、イオキサグラート）、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、蛍光体、２光子蛍光体又はハプテン及びタンパク質、又は例えば放射性標識を標的ペプチドと特異的に反応するペプチド又は抗体に組み込むことによって検出可能にすることができる他の実体が含まれる。検出可能な部分は、一価の検出可能な薬剤又は別の組成物と結合を形成することが可能である検出可能な薬剤である。
【0117】
本開示の実施形態によって画像化及び／又は標識剤として使用することができる放射性物質（例えば、放射性同位体）には、限定されずに、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４～１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ及び２２５Ａｃが含まれる。本開示の実施形態によって追加の画像化剤として使用することができる常磁性イオンには、限定されずに、遷移及びランタニド金属（例えば２１～２９、４２、４３、４４又は５７～７１の原子番号を有する金属）のイオンが含まれる。これらの金属には、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕのイオンが含まれる。
【0118】
本明細書で使用されるように、用語「オリゴマー」及び「ポリマー」は、複数の反復サブユニット（例えば、重合した単量体）を有する化合物を指す。用語「コオリゴマー」又は「コポリマー」は、２つ以上の異なる残基（本明細書で互換的に使用される単量体単位又は単量体）を含むオリゴマー又はポリマーを指す。オリゴマー中の単量体の数は、一般的にポリマー中の単量体の数未満である。したがって、一部の例では、オリゴマーは、１～約１０単量体、１～約２０単量体、１～約３０単量体、１～約４０単量体、１～約５０単量体、１～約１００単量体、１～約１５０単量体、１～約２００単量体、１～約２５０単量体、１～約３００単量体、１～約３５０単量体、１～約４００単量体、１～約４５０単量体又は１～約５００単量体の長さを有することができる。一部の例では、オリゴマーは、約５００未満の単量体、約４５０未満の単量体、約４００未満の単量体、約３５０未満の単量体、約３００未満の単量体、約２５０未満の単量体、約２００未満の単量体、約１５０未満の単量体、約１００未満の単量体、約５０未満の単量体、約４０未満の単量体、約３０未満の単量体、約２０未満の単量体又は約１０未満の単量体の長さを有することができる。ポリマーとの関連で、ポリマー中の単量体の数は、一般的にオリゴマー中の単量体の数より多い。したがって、一部の例では、ポリマーは、約５００～約１０００単量体、約５００～約２０００単量体、約５００～約３０００単量体、約５００～約４０００単量体、約５００～約５０００単量体、約５００～約６０００単量体、約５００～約７０００単量体、約５００～約８０００単量体、約５００～約９０００単量体、約５００～約１００００単量体、又は１００００より多い単量体の長さを有することができる。実施形態では、ポリマーはバイオポリマーである。本明細書で使用されるように、「バイオポリマー」は生体の細胞で生成されるポリマーを指す。実施形態では、ポリマーは多糖である。実施形態では、ポリマーはカチオン性多糖である。実施形態では、多糖は有機単量体（例えば単糖）の反復単位又は複数の異なる有機単量体の反復単位である。実施形態では、多糖は単糖（例えばグルコサミン、グルコース、メチルグルコシド等）の反復単位又は複数の異なる単糖の反復単位である。実施形態では、多糖はグリカンである。
【0119】
用語「重合性単量体」は、ポリマー化学の分野でのその意味によって使用され、他の単量体分子（同じであるか異なる他の重合性単量体など）に化学的に共有結合してポリマーを形成することができる化合物を指す。
【0120】
用語「ブロックコポリマー」はその通常の意味によって使用され、共有結合によって連結される重合単量体の２つ以上の部分（例えば、ブロック）を指す。実施形態では、ブロックコポリマーはポリマーの反復パターンである。実施形態では、ブロックコポリマーは周期的（例えば、反復パターン）配列に２つ以上の単量体を含む。例えば、ジブロックコポリマーは式：－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－を有し、式中、「Ｂ」は第１のサブユニットであり、「Ａ」は一緒に共有結合している第２のサブユニットである。したがって、トリブロックコポリマーは３つの異なるブロックを有するコポリマーであり、その２つは同じである（例えば、－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－）か、又は全３つは異なってもよく（例えば、－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｂ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－）、式中、「Ａ」は第１のサブユニットであり、「Ｂ」は第２のサブユニットであり、「Ｃ」は一緒に共有結合している第３のサブユニットである。
【0121】
「平均分子量」という語句は、溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を使用し、ポリスチレン標準を使用した分子量較正曲線を使用したゲル浸透クロマトグラフィー（別名、ＧＰＣ又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））によって決定されたポリマーの重量平均分子量を指す。
【0122】
本明細書で使用される「ナノ粒子」は、最長直径が１０００ナノメートル以下である粒子である。ナノ粒子の最長寸法は、本明細書でナノ粒子の長さと呼ぶことができる。ナノ粒子の最短寸法は、本明細書でナノ粒子の幅と呼ぶことができる。ナノ粒子は、任意の適当な物質で構成されてもよい。例えば、ナノ粒子コアは、適当な金属及びその金属酸化物（例えば、金属ナノ粒子コア）、炭素（例えば、有機ナノ粒子コア）、ケイ素及びその酸化物（例えば、ケイ素ナノ粒子コア）又はホウ素及びその酸化物（例えば、ホウ素ナノ粒子コア）、又はそれらの混合物を含むことができる。実施形態では、ナノ粒子は球体、桿状体、星状体、立方体、三角形、六角形、円柱、球円柱又は楕円体の形状を有する。ナノ粒子は、ナノ粒子コアのほとんど（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）又は全てをカバーする外層をさらに含むことができる。ナノ粒子の外層は、１つ以上の生体分子（例えば肺ウイルスタンパク質、前記肺ウイルスタンパク質をコードする核酸）に結合する部分を含むことができる。
【0123】
「無機ナノ粒子」は、炭素なしのナノ粒子を指す。例えば、無機ナノ粒子は、金属若しくはその金属酸化物（例えば、金ナノ粒子、鉄ナノ粒子）、ケイ素及びその酸化物（例えば、シリカナノ粒子）、又はチタン及びその酸化物（例えば、二酸化チタンナノ粒子）を指すことができる。実施形態では、無機ナノ粒子は金ナノ粒子である。無機ナノ粒子は、金属ナノ粒子であってよい。ナノ粒子が金属である場合、金属はチタン、ジルコニウム、金、銀、プラチナ、セリウム、ヒ素、鉄、アルミニウム又はケイ素であってよい。金属ナノ粒子は、チタン、ジルコニウム、金、銀又はプラチナ及びその適当な金属酸化物であってよい。実施形態では、ナノ粒子は酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化ヒ素、酸化鉄、酸化アルミニウム又は酸化ケイ素である。金属酸化物ナノ粒子は、酸化チタン又は酸化ジルコニウムであってよい。ナノ粒子は、チタンであってよい。ナノ粒子は、金であってよい。実施形態では、金属ナノ粒子は金ナノ粒子である。実施形態では、無機ナノ粒子は、炭素を含有する部分をさらに含むことができる。
【0124】
用語「アジュバント」は、免疫学の分野のそのプレーンな通常の意味に従って使用され、ワクチンの成分として一般的に使用される物質を指す。アジュバントは、ワクチンの一部として１つ以上の特異抗原と一緒に対象に投与されるとき、対象で抗原特異的免疫応答を増加させることができる。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を加速させる。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を延長する。実施形態では、アジュバントは抗原への免疫応答を増強する。
【0125】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書に記載される化合物で見出される特定の置換基によって、比較的無毒の酸又は塩基で調製される活性化合物の塩を含むものである。本開示の化合物が比較的酸性の官能性を有する場合は、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形を十分な量の所望の塩基と正味で、又は好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ又はマグネシウム塩、又は類似の塩が含まれる。本開示の化合物が比較的塩基性の官能性を有する場合は、酸付加塩は、そのような化合物の中性形を十分な量の所望の酸と正味で、又は好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、硫酸、硫酸一水素、ヨウ化水素酸又は亜リン酸などの無機酸に由来するもの、並びに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒の有機酸に由来する塩が含まれる。アルギン酸などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸又はガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ等、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７、６６、１～１９頁を参照する）。本開示のある特定の具体的な化合物は、化合物を塩基又は酸付加塩に変換させる、塩基性及び酸性の官能性を有する。
【0126】
「薬学的に許容される賦形剤」及び「薬学的に許容される担体」は、活性剤の対象への投与及び吸収を助ける物質を指し、患者に有意な有害毒性作用を引き起こすことなく、本開示の組成物に含ませることができる。薬学的に許容される賦形剤の非限定例には、水、ＮａＣｌ、正常な食塩水、乳酸加リンガー液、正常なスクロース、正常なグルコース、結合剤、フィラー、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、香料、塩溶液（リンガー液など）、アルコール、オイル、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、及び着色剤などが含まれる。そのような調製物は滅菌されてもよく、所望により、補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色剤、及び／又は本開示の化合物と有害反応を起こさない芳香族物質などと混合されてもよい。当業者は、他の医薬用賦形剤が本開示で有益であることを認める。
【0127】
用語「調製物」は、他の担体の有無にかかわらずに活性成分が担体によって囲まれ、したがってそれと合体しているカプセルを提供する担体としてのカプセル化材による、活性化合物の製剤化を含むものである。同様に、カシェ剤及びロゼンジが含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸剤、カシェ剤及びロゼンジは、経口投与のために好適な固体剤形として使用することができる。
【0128】
本明細書で使用される「相乗効果量」は、相乗効果（すなわち、相加効果より大きい効果）をもたらす、第１の量（例えば、本明細書で提供される化合物の量）及び第２の量（例えば、治療剤）の合計を指す。したがって、本明細書で互換的に使用される用語「相乗効果」、「相乗作用」、「相乗的」、「複合的相乗効果量」及び「相乗的治療効果」は、組合せで投与される化合物の測定される効果を指し、ここで、測定される効果は、単剤として単独で投与される本明細書で提供される化合物の各々の個々の効果の合計より大きい。
【0129】
実施形態では、相乗効果量は、治療剤と別々に使用されるときの本明細書で提供される化合物の量の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％であってよい。実施形態では、相乗効果量は、本明細書で提供される化合物と別々に使用されるときの治療剤の量の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％であってよい。
【0130】
複合体
本明細書では、とりわけ、１つ以上の肺ウイルスタンパク質又は肺ウイルスタンパク質をコードする１つ以上の核酸に結合しているナノ粒子を含む複合体が提供される。本明細書で使用される場合、「肺ウイルス」という用語は、細胞（例えば、ヒト細胞）内に侵入して複製し、肺及び／又は気道に影響を与える感染症（単数又は複数）を引き起こすウイルスを指す。例えば、肺ウイルス感染症は、息切れ（呼吸困難）、息苦しさ、疲労、咳、及び胸痛が挙げられるが、これらに限定されない症状を引き起こし得る。肺ウイルスによって引き起こされる臨床症候群としては、風邪、急性及び慢性気管支炎、細気管支炎、クループ、肺炎、喘息、気管支拡張症、肺炎、肺塞栓症、肺高血圧症、サルコイドーシス、睡眠時無呼吸、及び遠隔炎症作用を挙げることができる。複数の実施形態では、肺ウイルスは、表２に列挙されるような１つ以上の症候群を引き起こす。したがって、「肺ウイルスタンパク質」は、肺ウイルス（例えば、ヒトコロナウイルス、アデノウイルスなど）のゲノム内にコードされるタンパク質（例えば、スパイクタンパク質など）を指す。
本明細書では、とりわけ、１つ以上の肺ウイルスタンパク質又は肺ウイルスタンパク質をコードする１つ以上の核酸に結合しているナノ粒子を含む複合体が提供される。本明細書で使用される場合、「肺ウイルス」という用語は、細胞（例えば、ヒト細胞）内に侵入して複製し、肺及び／又は気道に影響を与える感染症（単数又は複数）を引き起こすウイルスを指す。例えば、肺ウイルス感染症は、息切れ（呼吸困難）、息苦しさ、疲労、咳、及び胸痛が挙げられるが、これらに限定されない症状を引き起こし得る。肺ウイルスによって引き起こされる臨床症候群としては、風邪、急性及び慢性気管支炎、細気管支炎、クループ、肺炎、喘息、気管支拡張症、肺炎、肺塞栓症、肺高血圧症、サルコイドーシス、睡眠時無呼吸、及び遠隔炎症作用を挙げることができる。複数の実施形態では、肺ウイルスは、表２に列挙されるような１つ以上の症候群を引き起こす。したがって、「肺ウイルスタンパク質」は、肺ウイルス（例えば、ヒトコロナウイルス、アデノウイルスなど）のゲノム内にコードされるタンパク質（例えば、スパイクタンパク質など）を指す。
【0131】
本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体はナノ粒子を含み、ナノ粒子は金のコアを含む。金のコアは、ウイルスタンパク質又はウイルスタンパク質をコードする核酸をナノ粒子に（例えば、間接的又は直接的な結合によって）結合しやすい。場合によっては、ウイルスタンパク質又は核酸は、例えば、共有結合リンカー（例えば、ペプチドリンカー、化学リンカー、バイオコンジュゲートリンカーなど）を介して、若しくはナノ粒子外層との結合を介して、ナノ粒子金のコアに間接的に結合してもよい。したがって、ある態様では、（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸であって、肺ウイルスタンパク質又は核酸がナノ粒子に結合している核酸を含む複合体が提供される。複数の実施形態では、複合体は、少なくとも１つの肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、及び肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする少なくとも１つの核酸を含む。
【0132】
複数の実施形態では、複合体は、複数の肺ウイルスタンパク質又はその断片を含む。複数の実施形態では、複数の肺ウイルスタンパク質は、異なる肺ウイルスタンパク質を含む。複数の実施形態では、複合体は、肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする複数の核酸を含む。複数の実施形態では、複数の核酸は、異なる肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする。複数の実施形態では、複合体は、複数の肺ウイルスタンパク質又はその断片、及び肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする複数の核酸を含む。
【0133】
複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳと関連したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、又はヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、アデノウイルス（ＡＤＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳに関連するコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）由来のタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）由来のタンパク質である。
【0134】
複数の実施形態では、ＨＲＳＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質Ｇ（受容体結合）、糖タンパク質Ｆ（膜融合）、又は糖タンパク質ＳＨである。複数の実施形態では、ＨＲＳＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質Ｇである。複数の実施形態では、ＨＲＳＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質Ｆである。複数の実施形態では、ＨＲＳＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質ＳＨである。複数の実施形態では、ＨＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ＨＮ四量体、Ｆタンパク質三量体、又はマトリックスタンパク質（Ｍ）である。複数の実施形態では、ＨＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質はＨＮ－四量体である。複数の実施形態では、ＨＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、Ｆタンパク質三量体である。複数の実施形態では、ＨＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、マトリックスタンパク質（Ｍ）である。複数の実施形態では、ＨＲＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ１、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ２、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ３、又はウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ４である。複数の実施形態では、ＨＲＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ１である。複数の実施形態では、ＨＲＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ２である。複数の実施形態では、ＨＲＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ３である。複数の実施形態では、ＨＲＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシド糖タンパク質ＶＰ４である。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ヘキソン（Ｈｅｘｏｎ）、ペントン（Ｐｅｎｔｏｎ）、ファイバー（Ｆｉｂｅｒ）、ＩＩＩａ、ＶＩＩＩ、又はＩＸである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質はヘキソンである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ペントンである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ファイバーである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ＩＩＩａである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ＶＩＩＩである。複数の実施形態では、ＡＤＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ＩＸである。複数の実施形態では、ＨＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、エンベロープ、膜、スパイクタンパク質、又はヌクレオキャプシドタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、エンベロープタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、膜タンパク質である。複数の実施形態では、ＨＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、スパイクタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ヌクレオキャプシドタンパク質である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、エンベロープ、膜、スパイクタンパク質、又はヌクレオキャプシドタンパク質である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、エンベロープタンパク質である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、膜タンパク質である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、スパイクタンパク質である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ヌクレオキャプシドタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質－Ｇ、融合タンパク質－Ｆ、核タンパク質－Ｎ、ＳＨ－タンパク質、又はマトリックスタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、糖タンパク質－Ｇである。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、融合タンパク質－Ｆである。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ヌクレオプロテイン－Ｎである。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ＳＨタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＭＰＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、マトリックスタンパク質である。複数の実施形態では、ＨＢｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質１（ＶＰ２）又はウイルスキャプシドタンパク質２（ＶＰ２）である。複数の実施形態では、ＨＢｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質１（ＶＰ２）である。複数の実施形態では、ＨＢｏＶ由来の肺ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質２（ＶＰ２）である。
【0135】
複数の実施形態では、肺ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はその断片は、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、又はＥタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はその断片は、Ｓタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はその断片は、Ｎタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はその断片は、Ｍタンパク質である。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はその断片は、Ｅタンパク質である。したがって、複数の実施形態では、核酸は、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、又はＥタンパク質をコードする。複数の実施形態では、核酸はＳタンパク質をコードする。複数の実施形態では、核酸はＮタンパク質をコードする。複数の実施形態では、核酸はＭタンパク質をコードする。複数の実施形態では、核酸はＥタンパク質をコードする。
【0136】
本明細書で提供される複合体について、複数の実施形態では、金のコアは、金－酸化鉄コアである。場合によっては、酸化鉄成分は、イメージング又は診断法（例えば、ＭＲＩ）のために使用されてもよい。
【0137】
本明細書で提供される複合体について、複数の実施形態では、ナノ粒子は、外層を金のコアに結合させることによって修飾される。したがって、複数の実施形態では、ナノ粒子は外層を含む。ナノ粒子の外層は、ウイルスタンパク質又はウイルスタンパク質をコードする核酸が（例えば、共有結合化学による静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）又は疎水性相互作用によって）ナノ粒子に結合され得る官能基を有する化合物（例えば、ポリマー、カチオン性多糖類）を含み得る。ウイルスタンパク質又は核酸を外層に共有結合させるために、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている共有結合法が使用され得る。
【0138】
複数の実施形態では、ナノ粒子の外層は、ナノ粒子コアに共有結合的に結合される（例えば、外層上のチオール基（－ＳＨ）の金のコアの表面への結合による）。複数の実施形態では、ナノ粒子の外層は、ナノ粒子コアに非共有結合的に結合する（例えば、金のコアとのイオン静電相互作用）。例えば、金のコアの負に帯電した表面は、イオン相互作用を介して正に帯電した外面（例えば、キトサン、キトサン－シクロデキストリン）に結合することができる。
【0139】
複数の実施形態では、外層はポリマーを含む。複数の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である。複数の実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。複数の実施形態では、ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。複数の実施形態では、ポリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である。複数の実施形態では、外層はカチオン性多糖類を含む。複数の実施形態では、カチオン性多糖類にはキトサンが含まれる。複数の実施形態では、カチオン性多糖類には、キトサン－シクロデキストリンが含まれる。したがって、一複数の実施形態では、外層は、非共有結合相互作用によってナノ粒子金のコアに結合しているキトサン多糖である。別の実施形態では、外層は、非共有相互作用によってナノ粒子金のコアに結合しているキトサン－シクロデキストリン多糖類である。
【0140】
複数の実施形態では、外層は、第一級アミン基を含むアミノ酸を含む。複数の実施形態では、外層は、チオール（－ＳＨ）基を含む。例えば、外層上のチオール基は、外層をナノ粒子コアに結合するために使用され得る。ナノ粒子の製造方法は、Ｓｕｋｕｍａｒ，Ｕ．Ｋ．；Ｂｏｓｅ，Ｒ．Ｊ．Ｃ．；Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｍ．；Ｂａｂｉｋｉｒ，Ｈ．Ａ．；Ａｆｊｅｉ，Ｒ．；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．；Ｚｅｎｇ，Ｙ．；Ｃｈａｎｇ，Ｅ．；Ｈａｂｔｅ，Ｆ．；Ｓｉｎｃｌａｉｒ， Ｒ．；Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．；Ｍａｓｓｏｕｄ，Ｔ．Ｆ．；Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｒ．，Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｏｌｄ－ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｔｏ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１９，２１８，１１９３４２．にさらに記載されており、これは、全ての目的のために、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【0141】
複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又はタンパク質をコードする核酸は、ナノ粒子に共有結合される。例えば、チオールで官能化された肺ウイルスタンパク質又は核酸は、ナノ粒子金のコアに吸着してもよい。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又は核酸は、ナノ粒子の外層に共有結合される。例えば、ナノ粒子外層は、ウイルスタンパク質又は該ウイルスタンパク質をコードする核酸上の第２の反応部分と共有結合を形成できる第１の反応部分を含んでもよい。例えば、ナノ粒子外層上のチオール基は、ウイルスタンパク質又は核酸上のチオール基と反応して、共有ジスルフィド結合を形成してもよい。例えば、共有結合反応部分で修飾された核酸又はタンパク質は、本明細書に記載され、当技術分野で既知の様々な結合方法を使用して、ナノ粒子外層に共有結合してもよい。
【0142】
複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又は核酸は、ナノ粒子に非共有結合している。例えば、肺ウイルスタンパク質又は核酸は、非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、疎水性相互作用）によってナノ粒子に結合し得る。例えば、官能化又は非官能化タンパク質は、疎水性相互作用を介してナノ粒子金のコアに結合してもよい。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質又は核酸は、ナノ粒子の外層に非共有結合で結合している。例えば、負に帯電した核酸は、非共有結合（例えば、イオン静電相互作用）によって正に帯電した外層（例えば、キトサン）に結合してもよい。
【0143】
複数の実施形態では、核酸はデオキシリボ核酸である。複数の実施形態では、核酸はリボ核酸である。核酸は、安定性及び／又は細胞透過性を高めるなどのために、化学的に修飾され得る。本明細書で提供される核酸は、１つ以上の反応性部分、例えば共有結合反応性部分を含み得る。反応性部分は、当技術分野において既知のポリマーリンカー（例えば、ポリエチレングリコールリンカー又は同等物）などの任意の適切なリンカーを使用して核酸に結合され得る。本明細書で使用される場合、「共有結合反応性部分」という用語は、第２の共有結合反応性部分（例えば、ポリマー（例えば、ポリマー外層）上の官能基）と化学反応して共有結合を形成することができる化学部分を指す。同様に、本明細書（その実施形態を含む）で提供される肺ウイルスタンパク質は、（例えば、安定性及び／又は細胞浸透性を高めるために）修飾され得る。複数の実施形態では、肺ウイルスタンパク質は、ナノ粒子（例えば、ナノ粒子コア、ナノ粒子外層）に結合する手段として、反応性部分（例えば、チオール基など）を含むように修飾され得る。
【0144】
複数の実施形態では、本明細書で提供される複合体は、検出可能な部分を含む。検出可能な部分は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載されるいずれかのものとすることができる。複数の実施形態では、検出可能な部分は、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、造影剤、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種、フルオロデオキシグルコース、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、フルオロフォア、ハプテン、タンパク質、蛍光部分、又はそれらの２つ以上の組合せである。複数の実施形態では、造影剤は、磁気共鳴画像造影剤、Ｘ線造影剤、又はヨウ化造影剤である。複数の実施形態では、検出可能な薬剤はフルオロフォア（例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン、又はそれらの類似体）である。複数の実施形態では、検出可能な薬剤は化学発光剤である。複数の実施形態では、検出可能な薬剤は放射性核種である。複数の実施形態では、検出可能な薬剤は放射性同位体である。複数の実施形態では、検出可能な薬剤は、常磁性分子又は常磁性ナノ粒子である。検出可能な部分は、ナノ粒子コア、ナノ粒子の外層、肺ウイルスタンパク質、又は核酸に結合することができる。複数の実施形態では、検出可能な部分は酵素（例えば検出可能なタンパク質（例えばルシフェラーゼ））である。複数の実施形態では、複合体は検出可能なタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）を含み、このタンパク質はナノ粒子に結合している。複数の実施形態では、複合体は、検出可能なタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を含み、核酸はナノ粒子に結合している。
【0145】
本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体は、サイズによってさらに特徴付けされ得る。本明細書で言及される場合、複合体（例えば、ナノ粒子（例えば、コア、コア及び外層）及び肺ウイルスタンパク質又は核酸）のサイズは、複合体の平均直径である。したがって、複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２５ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３５ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４５ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約５０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約５５ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約６０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約６５ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約７０ｎｍ～約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約７５ｎｍ～約８０ｎｍである。
【0146】
複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約７５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約７０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約６５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約６０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約５５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約４５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約３５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ～約２５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５又は８０ｎｍである。
【0147】
複数の実施形態では、複合体のサイズは約２０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは２０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約２５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは２５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約５５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは５５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約６０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは６０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約６５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは６５ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約７０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは７０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約７５である。複数の実施形態では、複合体のサイズは７５である。複数の実施形態では、複合体のサイズは約８０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは８０ｎｍである。
【0148】
複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３２ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３４ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３６ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３８ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４０ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４２ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４４ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４６ｎｍ～約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約４８ｎｍ～約５０ｎｍである。
【0149】
複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約４８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約４６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約４４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約４２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約３８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約３６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約３４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ～約３２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは、約３０ｎｍ、３２ｎｍ、３４ｎｍ、３８ｎｍ、４０ｎｍ、４２ｎｍ、４４ｎｍ、４８ｎｍ、又は５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約３８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは３８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４２ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４４ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４６ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約４８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは４８ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは約５０ｎｍである。複数の実施形態では、複合体のサイズは５０ｎｍである。
【0150】
複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズ（例えば、平均直径）は、約４ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約６ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約８ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約１０ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約１２ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約１４ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約１６ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約１８ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約２０ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約２２ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約２４ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約２６ｎｍ～約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約２８ｎｍ～約３０ｎｍである。
【0151】
複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約２８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約２６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約２４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約２２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約１８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約１６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約１４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約１２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約１０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ～約６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは、約４ｎｍ、６ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、１６ｎｍ、１８ｎｍ、２０ｎｍ、２２ｎｍ、２４ｎｍ、２６ｎｍ、２８ｎｍ、又は３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約１０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは１０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約１２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは１２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約１４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは１４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約１６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは１６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約１８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは１８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約２０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは２０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約２２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは２２ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約２４ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは２６ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約２８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは２８ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは約３０ｎｍである。複数の実施形態では、ナノ粒子コアのサイズは３０ｎｍである。
【0152】
ワクチン及び医薬組成物
本明細書で提供される複合体は、肺ウイルス感染症を予防するためのワクチン組成物において特に有効であると考えられる。本出願人は、本明細書に記載の複合体が核酸カーゴを肺に効果的に送達することを見出した。肺への複合体の送達は、核酸によってコードされるタンパク質に対する効果的な免疫応答をもたらす。したがって、ある態様では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物が提供される。
本明細書で提供される複合体は、肺ウイルス感染症を予防するためのワクチン組成物において特に有効であると考えられる。本出願人は、本明細書に記載の複合体が核酸カーゴを肺に効果的に送達することを見出した。肺への複合体の送達は、核酸によってコードされるタンパク質に対する効果的な免疫応答をもたらす。したがって、ある態様では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物が提供される。
【0153】
複数の実施形態では、ワクチン組成物は、安定剤、アジュバント、及び保存剤のうちの１つ以上をさらに含む。複数の実施形態では、ワクチン組成物は安定剤を含む。複数の実施形態では、ワクチン組成物はアジュバントを含む。複数の実施形態では、ワクチン組成物は保存剤を含む。
【0154】
複数の実施形態では、前記組成物は、経鼻投与のために製剤化されている。
【0155】
ある態様では、治療有効量の本明細書に記載の複合体（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物が提供される。複数の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、治療目的で使用される。一部の実施形態では、治療目的は、予防的な目的（疾患又は状態の発生を防止する目的）及び処置目的（既存の疾患又は状態を処置する目的）を包含する。医薬組成物は、肺ウイルス感染症（例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９）又はウイルス感染症に関連する状態を処置するために有効であると考えられる。複数の実施形態では、複合体は、対象に投与されると、免疫応答を誘導することができる、すなわち、免疫原性である。この免疫原性は、肺ウイルス由来の１つ以上の抗原ペプチド、又はカーゴ核酸によってコードされる１つ以上の抗原ペプチドが対象において発現されるときに、少なくとも部分的に誘導される場合がある。
【0156】
ウイルス感染症の予防及び処置の方法
本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体は、肺ウイルス感染症の処置又は予防するために特に有用である。本出願人は、この複合体が、肺ウイルスの侵入口（例えば、上気道及び下気道）及び影響を受ける領域（例えば、肺）で抗原特異的免疫応答を誘導することを見出した。したがって、ある態様では、肺ウイルス性疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス性疾患を処置又は予防する方法が提供され、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体の治療的又は予防的有効量を対象に投与することを含む。
本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体は、肺ウイルス感染症の処置又は予防するために特に有用である。本出願人は、この複合体が、肺ウイルスの侵入口（例えば、上気道及び下気道）及び影響を受ける領域（例えば、肺）で抗原特異的免疫応答を誘導することを見出した。したがって、ある態様では、肺ウイルス性疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス性疾患を処置又は予防する方法が提供され、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体の治療的又は予防的有効量を対象に投与することを含む。
【0157】
複数の実施形態では、複合体は鼻腔内経路によって投与される。複数の実施形態では、複合体は、口腔鼻経路によって投与される。複数の実施形態では、複合体は肺に投与される。
【0158】
ある態様では、肺ウイルス性疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス性疾患を処置又は予防する方法が提供され、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）で提供されるワクチン組成物の治療的又は予防的有効量を対象に投与することを含む。
【0159】
複数の実施形態では、ワクチン組成物は鼻腔内経路によって投与される。複数の実施形態では、ワクチン組成物は、口腔鼻経路によって投与される。複数の実施形態では、ワクチン組成物は肺に投与される。
【0160】
複数の実施形態では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体を含む組成物は、ワクチンが対象における疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）又は状態の発生の可能性を予防又は低減できるように、予防活性を有する。組成物が予防目的で使用される複数の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有していない動物、例えば、疾患又は状態と診断されていないヒト、若しくは疾患又は状態に関連する顕著な症状を有していないヒトである場合がある。
【0161】
複数の実施形態では、本明細書に記載される複合体を含む組成物は、予防的な目的で、特に感染の素因があると考えられているが現在ウイルス性疾患を患っていない対象において使用される。予防ワクチンは、素因のある対象に投与され、対象におけるウイルス性疾患の発生の可能性を予防又は低減することができる。
【0162】
複数の実施形態では、組成物は、疾患（例えば、肺バイアル（ｖｉａｌ）疾患）又は状態を処置するために組成物を使用できるような治療効果を有する。組成物は、１つ以上の抗ウイルス活性、例えば、ウイルス粒子数の減少、ウイルス複製及び感染力の減少及び／又は阻害を示すことができる。
【0163】
複数の実施形態では、本明細書で提供される複合体を含む組成物は、２つの別個の肺ウイルスタンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸配列を単一の組成物で送達することにより、治療効果及び予防効果の両方を提供することができる。したがって、複数の実施形態では、組成物は、（１）第１の免疫原性ウイルスタンパク質又はその断片を用いて、既存の肺ウイルス感染症又は状態に対してより即時の処置効果を誘導すること、及び（２）別の肺ウイルス疾患又は状態の将来の発生のために、第２の免疫原性ウイルスタンパク質又はその断片を用いて、対象に適応免疫を誘導することができる。したがって、複数の実施形態では、組成物は、各タンパク質が、それぞれ、独立して治療効果又は予防効果を示す、２つ以上の異なる肺ウイルスタンパク質又はそれをコードする核酸を含む複合体を含む。
【0164】
免疫応答を誘導する方法
ある態様では、肺ウイルス疾患に感受性である対象を免疫化する方法が提供され、本方法は、肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が産生されるような条件下で、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体を対象に投与することを含む。
ある態様では、肺ウイルス疾患に感受性である対象を免疫化する方法が提供され、本方法は、肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が産生されるような条件下で、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体を対象に投与することを含む。
【0165】
ある態様では、肺ウイルス性疾患に感受性である対象を免疫化する方法が提供され、本方法は、肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が産生されるような条件下で、本明細書（その実施形態を含む）で提供されるワクチン組成物を対象に投与することを含む。
【0166】
複数の実施形態では、抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体である。複数の実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。複数の実施形態では、抗体はＩｇＡ抗体である。複数の実施形態では、抗体はＩｇＭ抗体である。
【0167】
複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＣＯＶＩＤ－１９である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＭＥＲＳである。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＲＳＶ感染症である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＰＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＲＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＣｏＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＢｏＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＨＭＰＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患はＡＤＶ感染である。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患は、表２に列挙されるような１つ以上の症候群を引き起こす。複数の実施形態では、肺ウイルス性疾患は、遠隔炎症作用を引き起こす。
【0168】
免疫応答の誘導をモニタリングするための方法は、抗体力価を測定することによるものなど、当技術分野において周知である。
【0169】
投与方法
ある態様では、対象における肺ウイルス感染症を処置又は予防するために、本明細書（その実施形態を含む）で提供される組成物を対象に送達するための方法が提供される。複数の実施形態では、組成物は、（ａ）金のコアを含むナノ粒子と、（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸と、を含む複合体を含み、肺ウイルスタンパク質又は核酸はナノ粒子に結合している。複数の実施形態では、組成物は、対象において意図された効果の少なくとも一部を達成するのに十分な有効量で対象に投与することができる。
ある態様では、対象における肺ウイルス感染症を処置又は予防するために、本明細書（その実施形態を含む）で提供される組成物を対象に送達するための方法が提供される。複数の実施形態では、組成物は、（ａ）金のコアを含むナノ粒子と、（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸と、を含む複合体を含み、肺ウイルスタンパク質又は核酸はナノ粒子に結合している。複数の実施形態では、組成物は、対象において意図された効果の少なくとも一部を達成するのに十分な有効量で対象に投与することができる。
【0170】
組成物に関連して使用されるとき、「投与」、「投与すること」などは、両方とも直接投与を指し、これはインビトロでの細胞への投与、インビボでの細胞への投与、医療専門家による、又は対象による自己投与による対象への投与、及び／又は間接的投与であってもよく、本開示の組成物を処方する行為であり得る。典型的には、有効量が投与され、その量は当業者によって決定され得る。組成物（例えば、複合体）は、例えば、細胞培養培地への組成物の添加又はインビボでの注射によって、細胞に投与され得る。対象への投与は、例えば、吸入（例えば、鼻腔内経路、口腔鼻経路）を通して達成することができる。
【0171】
複数の実施形態では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される組成物は、肺医薬賦形剤を含む肺用医薬組成物として提供される。「肺医薬組成物」などの用語は、肺投与（例えば、鼻腔内経路、口腔鼻経路）を意図した医薬組成物を指す。「肺投与」などの用語は、通常の慣習的な意味で、吸入療法を達成するための投与（例えば、鼻腔内経路、口腔鼻経路）を指す。「吸入療法」などの用語は、吸入による肺への薬物の直接送達を指す。複数の実施形態では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される複合体は、吸入薬物送達システムによって肺に直接送達されるときに有効である。「肺液体製剤（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｌｉｑｕｉｄ）」という用語は、液体である肺医薬組成物を指す。「肺固形製剤（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｏｌｉｄ）」、「肺固形製剤（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｏｌｉｄ）」などの用語は、固形物（例えば、粉末）である肺医薬組成物を指す。
【0172】
複数の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、吸入薬物送達システムで提供される。複数の実施形態では、吸入薬物送達システムは、（ｉ）ネブライザー；（ｉｉ）加圧式定量噴霧吸入器（ｐＭＤＩ）；又は（ｉｉｉ）ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）である。ネブライザーは、活性剤が極性液体、例えば水に溶解又は懸濁しているという点で、ｐＭＤＩ及びＤＰＩの両方とは明らかに異なる。対照的に、ｐＭＤＩ及びＤＰＩは、非極性の揮発性噴射剤又は患者が吸入すると流動化するドライパウダーミックスに懸濁又は溶解した活性剤（ナノ粒子複合体など）を含むボーラス薬物送達デバイスである。ｐＭＤＩ及びＤＰＩは、ネブライザーと比較して処置時間を大幅に短縮した。「肺薬剤送達デバイス」などの用語は、医薬組成物の送達（例えば、鼻腔内、口腔鼻送達など）に適した吸入薬物送達システムを指す。
【0173】
対象に投与される用量及び頻度（単回又は複数回）は、例えば、対象が別の病気にかかっているかどうか、その投与経路；レシピエントの体格（ｓｉｚｅ）、年齢、性別、健康状態、体重、体格指数、及び食事；処置中の疾患の症状の性質及び程度、同時処置の種類、処置中の疾患による合併症、又はその他の健康関連の問題などの、様々な要因によって変更する場合がある。他の治療レジメン又は薬剤を、その実施形態を含む本明細書に記載される方法及び組成物と併せて使用することができる。確立された投薬量（例えば、頻度及び期間）の調整及び操作は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0174】
複数の実施形態では、本明細書（その実施形態を含む）で提供される組成物は、約２ｕｇ～約５０ｕｇの核酸（例えば、肺ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ）が対象に送達される用量（又は量）で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約８ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１２ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１４ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１６ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１８ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２０ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２２ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２４ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２６ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２８ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約３０ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約３２ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。実施形態において、組成物は、約３４ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約３６ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約３８ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４０ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４２ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４４ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４６ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約４８ｕｇ～約５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。
【0175】
複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約３８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約３６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約３４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約３２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約３０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約２８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約２６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約２４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約２２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約１８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約１６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約１４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約１２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約１０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ～約４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２ｕｇ、４ｕｇ、６ｕｇ、８ｕｇ、１０ｕｇ、１２ｕｇ、１４ｕｇ、１６ｕｇ、１８ｕｇ、２０ｕｇ、２２ｕｇ、２４ｕｇ、２６ｕｇ、２８ｕｇ、３０ｕｇ、３２ｕｇ、３４ｕｇ、３６ｕｇ、３８ｕｇ、４０ｕｇ、４２ｕｇ、４４ｕｇ、４６ｕｇ、４８ｕｇ、又は５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、３０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、３２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、３４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、３６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、３８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、４８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、５０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。
【0176】
複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１２ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１４ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１６ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１８ｕｇ～約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。
【0177】
複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約１８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約１６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約１４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ～約１２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇ、１２ｕｇ、１４ｕｇ、１６ｕｇ、１８ｕｇ、又は２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１２ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１４ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１６ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約１８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、１８ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、約２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。複数の実施形態では、組成物は、２０ｕｇの核酸が対象に送達される用量で投与される。
【0178】
ナノ粒子組成物
ある態様では、それに結合している複数の核酸及びそれに結合している複数のタンパク質を含むナノ粒子が提供され、複数の核酸の各々が、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、前記複数のタンパク質の各々が、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質である。複数の実施形態では、ナノ粒子は生体適合性である。複数の実施形態では、ナノ粒子はコアを含み、前記コアは金を含む。複数の実施形態では、ナノ粒子のコアは金－酸化鉄コアである。
ある態様では、それに結合している複数の核酸及びそれに結合している複数のタンパク質を含むナノ粒子が提供され、複数の核酸の各々が、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、前記複数のタンパク質の各々が、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質である。複数の実施形態では、ナノ粒子は生体適合性である。複数の実施形態では、ナノ粒子はコアを含み、前記コアは金を含む。複数の実施形態では、ナノ粒子のコアは金－酸化鉄コアである。
【0179】
複数の実施形態では、ナノ粒子はコア及び外層を含み、前記外層はキトサン－シクロデキストリンポリマーを含む。複数の実施形態では、複数の核酸及び複数のタンパク質は、ナノ粒子の外層に結合している。複数の実施形態では、１つ以上の核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡ配列を含む。複数の実施形態では、ＲＮＡ配列はｍＲＮＡ配列である。複数の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質は、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質からなる群から選択される。
【0180】
ある態様では、本明細書（その実施形態を含む）で提供されるナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤と、を含むワクチン製剤が提供される。複数の実施形態では、ワクチン製剤は、ワクチン賦形剤をさらに含む。複数の実施形態では、ワクチン賦形剤は、安定剤、アジュバント又は保存剤である。複数の実施形態では、ワクチン製剤は、複数のナノ粒子を含む。
【0181】
ある態様では、ＣＯＶＩＤ－１９を予防又は処置する方法が、それを必要とする対象において提供され、本方法は、有効量の、本明細書（その実施形態を含む）で提供されるワクチン、又は本明細書（その実施形態を含む）で提供されるナノ粒子を含む組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む。複数の実施形態では、組成物は鼻腔内経路を介して投与される。複数の実施形態では、組成物は、口腔鼻経路を介して投与される。
【0182】
複数の実施形態では、組成物は気道に投与される。複数の実施形態では、組成物は、気道に投与される（リンパ組織のワルダイエル輪への曝露が含まれる）。複数の実施形態では、組成物は肺に投与される。複数の実施形態では、組成物は気道（リンパ組織のワルダイエル輪への曝露を含む）及び肺に投与される。
【0183】
複数の実施形態では、組成物は複数のナノ粒子を含む。
【0184】
ある態様では、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防又は処置する方法が提供され、本方法は、有効量の、本明細書（その実施形態を含む）に提供されるワクチン、又は本明細書（その実施形態を含む）で提供されるナノ粒子を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。複数の実施形態では、送達は、鼻腔内送達又は口腔鼻送達によるものであり得る。複数の実施形態では、１回の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンにおいて複数のｍＲＮＡの気道標的化が実施される。複数の実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン開発のためのナノバイオテクノロジーとセラノスティック戦略を組み合わせたものが、本明細書で提供される。複数の実施形態では、ＩＮ又は口鼻経路を介して気道に直接送達されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＲＮＡワクチンが、本明細書に提供される。複数の実施形態では、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面抗原（例えば、Ｓ、Ｎ、Ｍ及びＥタンパク質）又はその断片及び複数の表面抗原（例えば、Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質）又はその断片をコードするｍＲＮＡの強力な発現によって産生されるＲＮＡ多価ワクチンが、本明細書で提供される。複数の実施形態では、「ウイルス」抗原の合成ｍＲＮＡ配列、並びに複数のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質を送達するために、ＩＮ又は口腔鼻投与及びその後のＡＣＥ２受容体を発現する呼吸気道の円柱状繊毛細胞（及びそれらの前駆細胞）の標的化のために特別に調整された複数の構成要素を有する操作された多機能ＮＰが本明細書に提供される。複数の実施形態では、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用して哺乳動物肺細胞におけるトランスフェクション後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の発現、細胞表面提示、及び抗体認識を測定することによる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の取り込み及び機能的効果のインビトロでの評価が、本明細書に提供される。複数の実施形態では、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを、マウスモデルにおけるそれらのインビボ免疫応答を評価するためにＩＮ又は口腔鼻経路を介して使用する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の４つ全ての表面抗原、並びにＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質を組み込むｍＲＮＡ多価ワクチンのマウスにおける評価が、本明細書に提供される。
【0185】
実施形態
Ｐ実施形態１：それに結合している複数の核酸及びそれに結合している複数のタンパク質を含むナノ粒子であって、複数の核酸の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、前記複数のタンパク質の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質であるナノ粒子。
Ｐ実施形態１：それに結合している複数の核酸及びそれに結合している複数のタンパク質を含むナノ粒子であって、複数の核酸の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、前記複数のタンパク質の各々は異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質であるナノ粒子。
【0186】
Ｐ実施形態２：ナノ粒子がコアを含み、前記コアが金を含む、Ｐ実施形態１のナノ粒子。
【0187】
Ｐ実施形態３：ナノ粒子のコアが金－酸化鉄コアである、Ｐ実施形態２のナノ粒子。
【0188】
Ｐ実施形態４：前記ナノ粒子がコア及び外層を含み、前記外層がキトサン－シクロデキストリンポリマーを含む、Ｐ実施形態１のナノ粒子。
【0189】
Ｐ実施形態５：前記複数の核酸及び前記複数のタンパク質が前記外層に結合している、Ｐ実施形態４のナノ粒子。
【0190】
Ｐ実施形態６：１つ以上の核酸が前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡ配列を含む、Ｐ実施形態５のナノ粒子。
【0191】
Ｐ実施形態７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質がＳタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質及びＥタンパク質からなる群から選択される、Ｐ実施形態５のナノ粒子。
【0192】
Ｐ実施形態８：Ｐ実施形態１～７の１つのナノ粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン製剤。
【0193】
Ｐ実施形態９：ワクチン賦形剤をさらに含むＰ実施形態８のワクチン製剤。
Ｐ実施形態１０：ワクチン賦形剤が安定剤、アジュバント又は保存剤である、Ｐ実施形態９のワクチン製剤。
Ｐ実施形態１０：ワクチン賦形剤が安定剤、アジュバント又は保存剤である、Ｐ実施形態９のワクチン製剤。
【0194】
Ｐ実施形態１１：それを必要とする対象でＣＯＶＩＤ－１９を予防又は処置する方法であって、前記対象にＰ実施形態８～１０の１つのワクチン又はＰ実施形態１～７の１つのナノ粒子の有効量を含む組成物を投与することを含む方法。
【0195】
Ｐ実施形態１２：組成物が鼻腔内経路を通して投与される、Ｐ実施形態１１の方法。
【0196】
Ｐ実施形態１３：組成物が口腔鼻経路を通して投与される、Ｐ実施形態１１の方法。
【0197】
Ｐ実施形態１４：組成物が肺に投与される、Ｐ実施形態１１の方法。
【0198】
Ｐ実施形態１５：それを必要とする対象でＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルス感染症を予防又は処置する方法であって、それを必要とする対象にＰ実施形態８～１０の１つのワクチン又はＰ実施形態１～７の１つのナノ粒子の有効量を含む組成物を投与することを含む方法。
【0199】
実施形態
実施形態１：（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は前記肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸を含む複合体であって、前記肺ウイルスタンパク質又は核酸は前記ナノ粒子に結合している複合体。
実施形態１：（ａ）金のコアを含むナノ粒子；及び（ｂ）肺ウイルスタンパク質若しくはその断片、又は前記肺ウイルスタンパク質若しくはその断片をコードする核酸を含む複合体であって、前記肺ウイルスタンパク質又は核酸は前記ナノ粒子に結合している複合体。
【0200】
実施形態２：複数の肺ウイルスタンパク質又はその断片を含む、実施形態１の複合体。
【0201】
実施形態３：前記複数の肺ウイルスタンパク質が異なる肺ウイルスタンパク質を含む、実施形態２の複合体。
【0202】
実施形態４：前記肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする複数の核酸を含む、実施形態１の複合体。
【0203】
実施形態５：前記複数の核酸が異なる肺ウイルスタンパク質又はその断片をコードする、実施形態４の複合体。
【0204】
実施形態６：前記肺ウイルスがヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、ＳＡＲＳと関連したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）又はヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）である、実施形態１～５のいずれか１つの複合体。
【0205】
実施形態７：前記肺ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、実施形態６の複合体。
【0206】
実施形態８：前記肺ウイルスタンパク質又はその断片がＳタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質又はＥタンパク質である、実施形態７の複合体。
【0207】
実施形態９：前記金のコアが金－酸化鉄コアである、実施形態１～８のいずれか１つの複合体。
【0208】
実施形態１０：前記ナノ粒子が外層を含む、実施形態１～９のいずれか１つの複合体。
【0209】
実施形態１１：前記外層が前記金のコアに共有結合している、実施形態１０の複合体。
【0210】
実施形態１２：前記外層が前記金のコアに非共有結合している、実施形態１０の複合体。
【0211】
実施形態１３：前記外層がポリマーを含む、実施形態１０～１２のいずれか１つの複合体。
【0212】
実施形態１４：前記外層がカチオン性多糖を含む、実施形態１０～１３のいずれか１つの複合体。
【0213】
実施形態１５：前記カチオン性多糖がキトサンを含む、実施形態１４の複合体。
【0214】
実施形態１６：前記カチオン性多糖がキトサン－シクロデキストリンを含む、実施形態１４の複合体。
【0215】
実施形態１７：前記肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子に共有結合している、実施形態１～１６のいずれか１つの複合体。
【0216】
実施形態１８：前記肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子の前記外層に共有結合している、実施形態１７の複合体。
【0217】
実施形態１９：前記肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子に非共有結合している、実施形態１～１６のいずれか１つの複合体。
【0218】
実施形態２０：前記肺ウイルスタンパク質又は核酸が前記ナノ粒子の前記外層に非共有結合している、実施形態１９の複合体。
【0219】
実施形態２１：前記核酸がデオキシリボ核酸である、実施形態１～２０のいずれか１つの複合体。
【0220】
実施形態２２：前記核酸がリボ核酸である、実施形態１～２０のいずれか１つの複合体。
【0221】
実施形態２３：直径が約２０ｎｍ～約８０ｎｍである、実施形態１～２２のいずれか１つの複合体。
【0222】
実施形態２４：直径が約４０ｎｍである、実施形態１～２３のいずれか１つの複合体。
実 施形態２５：実施形態１～２４のいずれか１つの複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物。
実 施形態２５：実施形態１～２４のいずれか１つの複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物。
【0223】
実施形態２６：安定剤、アジュバント及び保存剤の１つ以上をさらに含む、実施形態２５のワクチン組成物。
【0224】
実施形態２７：経鼻投与のために製剤化される、実施形態２５又は２６のワクチン組成物。
【0225】
実施形態２８：肺ウイルス性疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、実施形態１～２４のいずれか１つの複合体の治療的又は予防的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法。
【0226】
実施形態２９：複合体が鼻腔内経路によって投与される、実施形態２８の方法。
【0227】
実施形態３０：複合体が口腔鼻経路によって投与される、実施形態２８の方法。
【0228】
実施形態３１：複合体が肺に投与される、実施形態２８の方法。
【0229】
実施形態３２：肺ウイルス性疾患の処置又は予防を必要とする対象で肺ウイルス疾患を処置又は予防する方法であって、実施形態２５～２７のいずれか１つのワクチン組成物の治療的又は予防的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法。
【0230】
実施形態３３：組成物が鼻腔内経路を通して投与される、実施形態３２の方法。
【0231】
実施形態３４：組成物が口腔鼻経路を通して投与される、実施形態３２の方法。
【0232】
実施形態３５：組成物が肺に投与される、実施形態３２の方法。
【0233】
実施形態３６：肺ウイルス疾患に感受性である対象を免疫化する方法であって、前記肺ウイルスタンパク質又はその断片に結合する抗体が生成されるような条件下で実施形態１～２４のいずれか１つの複合体を前記対象に投与することを含む方法。
【0234】
実施形態３７：前記抗体がＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体である、実施形態３６の方法。
【実施例】
【0235】
［実施例１］ 例示的実験への導入
核酸ワクチンは、ウイルス自体ではなく、遺伝物質の作製のみがそれらの生成に必要なので、安全であり、開発が容易である。抗ＣＯＶＩＤ－１９核酸ワクチンは、ヒト細胞への、個々のタンパク質又はタンパク質断片をコードする特定の部分のウイルスＲＮＡの送達を引き起こし、これが、その後、送達されたＲＮＡに対するウイルスタンパク質のコピーを生成する。ｍＲＮＡワクチンは、抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞応答を誘導することができる１７～１８。２０２０年４月３０日までに、少なくとも２０チームが、免疫応答を促すためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡ又はＲＮＡの使用を研究していた。伝統的なワクチン及びＤＮＡワクチンと対比させた場合、ＲＮＡワクチンには、以下のようないくつかの重要な利点がある。（１）ＲＮＡワクチンは、病原体粒子無しで作製され、それ故、それらは非感染性であり、さらに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖は、いったんタンパク質が作製されれば、迅速に分解される。（２）転写され、さらにタンパク質に翻訳されるために核に達するのに細胞及び核膜穿孔に依存するｐＤＮＡとは異なり、ＲＮＡ鎖の場合、翻訳されるためには、サイトゾルへのアクセスを得るだけで十分である。（３）ＤＮＡ発現カセットは、ゲノム組込み、挿入突然変異誘発、長期発現、及び抗ＤＮＡ抗体の誘導の理論上のリスクを保持する。（４）初期の臨床試験結果のいくつかは、ＲＮＡワクチンが、信頼できる免疫応答を生み出すことができ、無視できる副作用はあるが、健常個体によって十分に耐用されることを示している。（５）ＲＮＡワクチンは、より迅速に生成することができ、より容易に標準化され、これにより、新興感染爆発に対する応答性が改善される。
核酸ワクチンは、ウイルス自体ではなく、遺伝物質の作製のみがそれらの生成に必要なので、安全であり、開発が容易である。抗ＣＯＶＩＤ－１９核酸ワクチンは、ヒト細胞への、個々のタンパク質又はタンパク質断片をコードする特定の部分のウイルスＲＮＡの送達を引き起こし、これが、その後、送達されたＲＮＡに対するウイルスタンパク質のコピーを生成する。ｍＲＮＡワクチンは、抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞応答を誘導することができる１７～１８。２０２０年４月３０日までに、少なくとも２０チームが、免疫応答を促すためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡ又はＲＮＡの使用を研究していた。伝統的なワクチン及びＤＮＡワクチンと対比させた場合、ＲＮＡワクチンには、以下のようないくつかの重要な利点がある。（１）ＲＮＡワクチンは、病原体粒子無しで作製され、それ故、それらは非感染性であり、さらに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖は、いったんタンパク質が作製されれば、迅速に分解される。（２）転写され、さらにタンパク質に翻訳されるために核に達するのに細胞及び核膜穿孔に依存するｐＤＮＡとは異なり、ＲＮＡ鎖の場合、翻訳されるためには、サイトゾルへのアクセスを得るだけで十分である。（３）ＤＮＡ発現カセットは、ゲノム組込み、挿入突然変異誘発、長期発現、及び抗ＤＮＡ抗体の誘導の理論上のリスクを保持する。（４）初期の臨床試験結果のいくつかは、ＲＮＡワクチンが、信頼できる免疫応答を生み出すことができ、無視できる副作用はあるが、健常個体によって十分に耐用されることを示している。（５）ＲＮＡワクチンは、より迅速に生成することができ、より容易に標準化され、これにより、新興感染爆発に対する応答性が改善される。
【0236】
とりわけ、ほとんどの核酸ワクチンがＳタンパク質のみをコードする。代わりに、本明細書では、とりわけ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２種以上の表面抗原（例えば、Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質）をコードするｍＲＮＡをロバストに発現するための多価（多抗原）ワクチンストラテジーを提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他のコロナウイルスとの有意な相同性を有しはするが、いくつかの抗原における実質的なバリエーションも有する。これらのバリエーションは、感染の様式、疾患の病原性、伝播、及び重症度における相違にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に明確に反映されている。したがって、エピトープワクチンを設計するための可能性のあるウイルスタンパク質の予測ベースのアプローチは、それらの成功率が低いため、有望ではない可能性がある。２種以上の表面抗原を発現する多価ｍＲＮＡワクチンは、より良好な成功を提供する。
【0237】
本明細書では、とりわけ、感染個体の治療となりうるワクチン（例えば、ＡＣＥ２受容体を遮断することによってさらなる感染を防止しながら、免疫抗体を誘導することによって）及び／又は未感染個体の予防を提供する。ｍＲＮＡ配列の操作は、これまでになく合成ｍＲＮＡの翻訳可能性を向上させており、様々な塩基修飾及び送達方法の使用を介して、ｍＲＮＡのインビボ半減期を調節することができる。したがって、担体媒体中又は表面にｍＲＮＡを配合することによって、効率的なインビボ送達が実現し、それにより、宿主細胞細胞質中への迅速な取り込み及び発現が可能となる。諸態様において、ＣＯＶＩＤ－１９に対する多価ｍＲＮＡワクチンストラテジーのための新規ナノ担体と鼻腔内（ＩＮ）送達を臨床セッティングで併用する。
【0238】
本明細書では、とりわけ、ＲＮＡワクチンをＩＮ経路で送達して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原を発現するための効率的なナノ担体を提供する。ＩＮ送達のための効率的な送達システムの使用は、従来のアジュバントの追加無しに、強力な免疫応答を生み出すのに必要な用量を劇的に減少させることができる。したがって、独立した転写産物としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質若しくはその断片のうちの２つ以上をコードする合成ｍＲＮＡ又はＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質若しくはその断片のうちの２つ以上を保持するナノ製剤が本明細書に記載される。生体適合性ナノ粒子（ＮＰ）上にｍＲＮＡ及びタンパク質をローディングすること、並びに臨床的に実用的な送達方法をこれと併用することによって、ＣＯＶＩＤ－１９に対する免疫処置のための多価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの良好な発現のための、容易であり、安全であり、最小限に侵襲的、かつ組織特異的な方法が提供される。
【0239】
本発明者らは、脳腫瘍であるグリア芽腫（ＧＢＭ）に対する、分子標的化セラノスティックナノ製剤を以前に開発した。このナノ製剤には、ＩＮ送達を介して治療用マイクロＲＮＡをマウスＧＢＭに送達するのに使用される５０ｎｍ多官能性金－酸化鉄ＮＰ（ｐｏｌｙＧＩＯＮと呼ばれる）が含まれる２１。シクロデキシトリン－キトサン（ＣＤ－ＣＳ）ハイブリッドポリマーで官能基化されたＰｏｌｙＧＩＯＮの表面は、静電的相互作用による、負荷電のＲＮＡの表面ローディングのための効率的なプラットホームを提供する２１。また、治療剤として価値があるためには、ｐｏｌｙＧＩＯＮの標的化送達及びそれらの輸送の可視化は、少なくとも前臨床研究では必須であり得る。したがって、本発明者らは、ＧＢＭ細胞を標的とするＴ７ペプチドでコーティングされ、結合型ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーで官能基化され、ＧＢＭに対する有効なセラノスティックシステムとして治療用ｍｉＲＮＡでプレロードされたＧＩＯＮコア殻（ＣＴ及びＭＲイメージングを可能にする）のＩＮ送達を開発し、実験的に検証した２１。本発明者らは、同所性移植されたＧＢＭを有するマウスにおけるＩＮ送達後に、このナノ製剤を前臨床的に評価し、ＧＢＭ増殖の顕著な抑制及び動物生存率の同時改良を見出した２１。さらに、ｐｏｌｙＧＩＯＮの存在は、頭蓋内腫瘍へのＩＮ送達及び輸送の同時マルチモダリティイメージングを可能にした２１。
【0240】
本発明者らは、本発明者らのマウス研究において、ＩＮ投与されたｐｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰの輸送が、処置時点のマウスの呼吸数によって決定されることを見出した。本発明者らが、深い麻酔下にあるマウスにｐｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰを投与したとき、送達されたＮＰの大部分は鼻粘膜に固着し、経時的に脳内の病的領域に輸送された。対照的に、本発明者らが、覚醒したマウスでＮＰを投与したとき、本発明者らは、主要な量のＮＰが鼻腔を超えて気道に移動し、その後、遠位の肺に定着したことを見出した。この観察を利用して、本発明者らのｐｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ製剤を使用した、各抗原に特異的なウイルスＲＮＡの非侵襲的な呼吸粘膜標的化送達は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患のための正確な主要初期標的器管である気道及び肺を直接的に標的にして、肺の免疫応答を活性化する新しい抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２多価ワクチンを提供する。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質を発現する組換えアデノウイルスベースのワクチンを使用する類似のアプローチが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＮ投与したときに有意な免疫応答を誘導することが見出されている２１。本発明者らは、金のＮＰが無毒であることを以前に実証した２２～２４。諸態様において、ｐｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳナノ製剤に由来する酸化鉄成分を除去することができる。
【0241】
ＩＮ及び呼吸気道経路（例えば、鼻噴霧／点滴、経口鼻ネブライザー又はインヘラーによるもの）の利点には、循環血の回避、軽減された全身性副作用及び肝／腎クリアランスが含まれ、これにより、気道及び肺常在性メモリーＴ細胞応答並びに実際的な反復的又は慢性的ワクチン投与の可能性が生じる。また、コンプライアンスが高く、作用開始が早い鼻噴霧又は吸入剤としての、個体への非侵襲的、無痛及び好都合な投与は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに新規な特徴をもたらす。
【0242】
［実施例２］ ｍＲＮＡをロードしたナノ粒子のＩＮ送達の結果
ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰは、治療薬をＩＮ送達するための生体適合性の無毒なプラットホームとして働く。
ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰは、治療薬をＩＮ送達するための生体適合性の無毒なプラットホームとして働く。
【0243】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするｍＲＮＡをワクチンとしてマウスの肺に送達して、呼吸粘膜及び肺免疫応答を誘導する実行可能性を、ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡをレポーターとして使用して試験した。ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ送達は、肺における、送達されるＲＮＡの送達、安定性、及び発現をモニタリングするのを、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用することによって容易にする。本発明者らは、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳにおけるＦＬｕｃ－ｍＲＮＡのローディング効率を、Ｎ／Ｐ比（図２Ｃ）及び細胞（ＨＥＫ２９３細胞及びＡ５４９細胞）におけるトランスフェクション効率を光学ＢＬＩを使用して測定することによって試験した。本発明者らの結果は、ルシフェラーゼの強い、ｍＲＮＡ用量依存的な発現を両細胞型で示した。本発明者らは、プルシアンブルー染色を使用することによって、細胞内ＰｏｌｙＧＩＯＮの存在を確認した（図２Ｆ）。
【0244】
ＦＬｕｃ－ｍＲＮＡ発現のＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ ＮＰ媒介ＩＮ送達及び肺常在性ＧＩＯＮの、ＢＬＩを使用したモニタリング
マウスへのＩＮ送達について、ＰｏｌｙＧＩＯＮ ＣＤ－ＣＳ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ複合体を調査した。５μｌのＮＰ複合体を各鼻孔内に４回投与した（１用量あたり合計２０μｌ：２μｇのｍＲＮＡ等価物）。覚醒マウスでＮＰ複合体を送達した。ＢＬＩは、送達後の２４時間の時点で取得し、投薬は毎日続けた。６日後に、マウスをインビボ及び屠殺後のエクスビボでＢＬＩイメージングした。マウスは、最初の用量の後に気管で強いＢＬＩシグナルを示し、４８時間後に肺で強いシグナルを示した。肺におけるシグナルは、５用量後に顕著に強かった（図３）。屠殺前ＢＬＩは、肺における局在シグナルを示した（図４Ｂ）。エクスビボ分析（肺、脾臓、肝臓、気管、及び腎臓）は、肺と気管気管支の接合部で強いＢＬＩシグナルを示した。脾臓を含めて、他の器官にはシグナルが無かった。（図４Ｃ）。
マウスへのＩＮ送達について、ＰｏｌｙＧＩＯＮ ＣＤ－ＣＳ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ複合体を調査した。５μｌのＮＰ複合体を各鼻孔内に４回投与した（１用量あたり合計２０μｌ：２μｇのｍＲＮＡ等価物）。覚醒マウスでＮＰ複合体を送達した。ＢＬＩは、送達後の２４時間の時点で取得し、投薬は毎日続けた。６日後に、マウスをインビボ及び屠殺後のエクスビボでＢＬＩイメージングした。マウスは、最初の用量の後に気管で強いＢＬＩシグナルを示し、４８時間後に肺で強いシグナルを示した。肺におけるシグナルは、５用量後に顕著に強かった（図３）。屠殺前ＢＬＩは、肺における局在シグナルを示した（図４Ｂ）。エクスビボ分析（肺、脾臓、肝臓、気管、及び腎臓）は、肺と気管気管支の接合部で強いＢＬＩシグナルを示した。脾臓を含めて、他の器官にはシグナルが無かった。（図４Ｃ）。
【0245】
［実施例３］ 研究設計及び方法
ＩＮ適合性ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用した、哺乳動物肺細胞でのトランスフェクション後におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡの発現を評価することによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡの最適比率、細胞表面提示、及び抗体認識の特定
宿主組織内のどこでも、ｍＲＮＡでウイルス抗原を発現することによって、抗体応答をウイルスタンパク質に送達し、感染に対して患者を保護することができる。しかし、肺の免疫応答も、気道に感染する病原体に対して重要であり、特に迅速な回復を可能にするため、又は疾患の発症を防止するために重要である。呼吸粘膜免疫応答も、ウイルスに対する持続的な中和免疫をもたらす肺常在性メモリーＢ細胞及びＴ細胞を保持し得る２５。中和抗体を産生しながら、宿主液性及び細胞性免疫応答を誘導するのに有効である可能性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のエピトープを本発明者らが同定するのに役立つ臨床免疫学データが無かったので、本発明者らは、抗ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを迅速に開発する戦術として、抗体応答を誘導する抗原としてウイルスの全表面タンパク質を送達した。理論に拘泥するものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の少なくとも２種の抗原（Ｓ、Ｎ、Ｅ、及びＭタンパク質）の発現は、メモリーＢ細胞及びＴ細胞応答を含めた多価免疫応答を生成し得る。これは、抗原が呼吸粘膜及び肺で発現されるなら、より有効でありうる。
ＩＮ適合性ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用した、哺乳動物肺細胞でのトランスフェクション後におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡの発現を評価することによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡの最適比率、細胞表面提示、及び抗体認識の特定
宿主組織内のどこでも、ｍＲＮＡでウイルス抗原を発現することによって、抗体応答をウイルスタンパク質に送達し、感染に対して患者を保護することができる。しかし、肺の免疫応答も、気道に感染する病原体に対して重要であり、特に迅速な回復を可能にするため、又は疾患の発症を防止するために重要である。呼吸粘膜免疫応答も、ウイルスに対する持続的な中和免疫をもたらす肺常在性メモリーＢ細胞及びＴ細胞を保持し得る２５。中和抗体を産生しながら、宿主液性及び細胞性免疫応答を誘導するのに有効である可能性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のエピトープを本発明者らが同定するのに役立つ臨床免疫学データが無かったので、本発明者らは、抗ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを迅速に開発する戦術として、抗体応答を誘導する抗原としてウイルスの全表面タンパク質を送達した。理論に拘泥するものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の少なくとも２種の抗原（Ｓ、Ｎ、Ｅ、及びＭタンパク質）の発現は、メモリーＢ細胞及びＴ細胞応答を含めた多価免疫応答を生成し得る。これは、抗原が呼吸粘膜及び肺で発現されるなら、より有効でありうる。
【0246】
この目標の達成に向けた第一歩として、本発明者らは、抗原のｍＲＮＡ媒介発現をそれらのロバストネス、タンパク質安定性、及び全ての抗原について同等に近いレベルを実現するのに必要な様々なｍＲＮＡの比率について、それらをインビボ研究に拡張する前に、細胞培養研究で評価する。ヒトＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）に由来するＣ末端シグナルペプチドを有するｍＲＮＡの使用によって、トランスフェクトされた細胞の表面で抗原提示し、それにより、より効果的に免疫応答をインビボで誘導することが可能となる２６～２７。これは、それより細胞内に残留する可能性が高く、それゆえ免疫細胞認識の有効性が低いただの抗原と比較して、それらを後でヒトに適用するのを容易にする可能性がある。
【0247】
ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用したトランスフェクション後の肺細胞において、Ｃ末端ＰＤＧＦＲシグナルペプチドをコードする配列でタグ付けしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をインビトロで使用した、細胞におけるｍＲＮＡの安定性、抗原発現、及び表面提示の評価
臨床適用において本発明者らはヒトＰＤＧＦＲのＣ末端ペプチド配列を使用して、細胞表面に抗原を提示するので、標的細胞に対する抗原表面提示の影響を評価することが重要である。ここで、本発明者らは、肺細胞のインビトロトランスフェクションによって、抗原の発現、安定性、及び表面提示を最適化する。本発明者らは、トランスフェクション効率及びＢＬＩを使用することによる正規化を評価するために、同時トランスフェクション実験用のホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）レポーターｍＲＮＡも使用する。
臨床適用において本発明者らはヒトＰＤＧＦＲのＣ末端ペプチド配列を使用して、細胞表面に抗原を提示するので、標的細胞に対する抗原表面提示の影響を評価することが重要である。ここで、本発明者らは、肺細胞のインビトロトランスフェクションによって、抗原の発現、安定性、及び表面提示を最適化する。本発明者らは、トランスフェクション効率及びＢＬＩを使用することによる正規化を評価するために、同時トランスフェクション実験用のホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）レポーターｍＲＮＡも使用する。
【0248】
実験方法
本発明者らは、ｍＲＮＡ転写物を設計する抗原として、完全長スパイクタンパク質（１２７３ａａ）、核タンパク質（４７９ａａ）、エンベロープタンパク質（７５ａａ）、及び膜タンパク質（２２２ａａ）を使用する。本発明者らは、４種の抗原全てのコード配列として、ヒトＰＤＧＦＲ受容体由来のＣ末端シグナルペプチドを有するハイブリッドｍＲＮＡをインビトロ転写によって生成する。本発明者らは、Ａ５４９肺がん細胞を使用してインビトロ発現を評価する。１２ウェル培養プレート内で各抗原について０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡを使用して、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用して独立してトランスフェクトされた細胞を、細胞表面上のウイルス抗原提示について、免疫染色及び４種の抗原全ての完全長タンパク質に対して産生させたマウスモノクローナル抗体を使用して分析する。本発明者らは、ウエスタンブロットを使用して、細胞溶解物も分析する。さらに、本発明者らは、ＦＬｕｃレポーター遺伝子に対して合成した１００ｎｇのｍＲＮＡを同時トランスフェクション実験で使用して、トランスフェクション効率をＢＬＩによって評価する。細胞は、トランスフェクション後の３回の継代について長期的にモニターして、発現の長さについて検査する。これは、宿主免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現するためにトランスフェクションが反復される後続のインビボ実験のための情報を提供する。
本発明者らは、ｍＲＮＡ転写物を設計する抗原として、完全長スパイクタンパク質（１２７３ａａ）、核タンパク質（４７９ａａ）、エンベロープタンパク質（７５ａａ）、及び膜タンパク質（２２２ａａ）を使用する。本発明者らは、４種の抗原全てのコード配列として、ヒトＰＤＧＦＲ受容体由来のＣ末端シグナルペプチドを有するハイブリッドｍＲＮＡをインビトロ転写によって生成する。本発明者らは、Ａ５４９肺がん細胞を使用してインビトロ発現を評価する。１２ウェル培養プレート内で各抗原について０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡを使用して、ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用して独立してトランスフェクトされた細胞を、細胞表面上のウイルス抗原提示について、免疫染色及び４種の抗原全ての完全長タンパク質に対して産生させたマウスモノクローナル抗体を使用して分析する。本発明者らは、ウエスタンブロットを使用して、細胞溶解物も分析する。さらに、本発明者らは、ＦＬｕｃレポーター遺伝子に対して合成した１００ｎｇのｍＲＮＡを同時トランスフェクション実験で使用して、トランスフェクション効率をＢＬＩによって評価する。細胞は、トランスフェクション後の３回の継代について長期的にモニターして、発現の長さについて検査する。これは、宿主免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現するためにトランスフェクションが反復される後続のインビボ実験のための情報を提供する。
【0249】
この新しいｍＲＮＡワクチンによって発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がそれぞれの抗体に結合する際の機能的な効率のＥＬＩＳＡアッセイを使用した評価
細胞表面提示並びにタンパク質発現の安定性及び量を評価するのと共に、本発明者らは、４種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原全てについて、これらの特性の程度を評価する。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、これらの特性について抗原を特徴付ける。
細胞表面提示並びにタンパク質発現の安定性及び量を評価するのと共に、本発明者らは、４種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原全てについて、これらの特性の程度を評価する。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、これらの特性について抗原を特徴付ける。
【0250】
実験方法
本発明者らは、Ａ５４９肺がん細胞内におけるｍＲＮＡの抗原発現及び表面提示の評価に用いられるものと類似したトランスフェクションプロトコールを使用する。本発明者らは、トランスフェクション４８時間後に単離された細胞溶解物を総タンパク質濃度について定量化し、等量の全細胞溶解物をＥＬＩＳＡアッセイに使用する。本発明者らは、１０μｇ／ｍｌ抗体濃度を使用して、抗体を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝溶液中に希釈することにより、３７℃で４～６時間インキュベートすることによってＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートをコーティングする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有する細胞溶解物を捕獲する前に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉブロッキングバッファーを使用して、プレートを１時間ブロッキングする。本発明者らは、第２の検出用抗体として、Ｃ末端タグに対して産生させた抗ＰＤＧＦＲ抗体を、ＨＲＰ付きのサンドイッチ二次抗体として使用する。本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイ用の標準プロトコールに従う。
本発明者らは、Ａ５４９肺がん細胞内におけるｍＲＮＡの抗原発現及び表面提示の評価に用いられるものと類似したトランスフェクションプロトコールを使用する。本発明者らは、トランスフェクション４８時間後に単離された細胞溶解物を総タンパク質濃度について定量化し、等量の全細胞溶解物をＥＬＩＳＡアッセイに使用する。本発明者らは、１０μｇ／ｍｌ抗体濃度を使用して、抗体を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝溶液中に希釈することにより、３７℃で４～６時間インキュベートすることによってＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートをコーティングする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含有する細胞溶解物を捕獲する前に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉブロッキングバッファーを使用して、プレートを１時間ブロッキングする。本発明者らは、第２の検出用抗体として、Ｃ末端タグに対して産生させた抗ＰＤＧＦＲ抗体を、ＨＲＰ付きのサンドイッチ二次抗体として使用する。本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイ用の標準プロトコールに従う。
【0251】
考察
肺細胞でｍＲＮＡワクチンを使用してトランスフェクトした４種の抗原を免疫組織化学及びウエスタンブロット分析で評価する。本発明者らは、ウイルス抗原それぞれとのＣ末端融合としてヒトＰＤＧＦＲ膜貫通シグナルペプチドを使用するので、これらの抗原がトランスフェクトされた細胞の膜上に提示されることが予測される。単一トランスフェクション後の細胞の連続評価は、細胞発現の寿命を検証することが予測される。さらに、トランスフェクションのためのＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳの使用は、ＩＮ送達されたｍＲＮＡワクチンによる免疫処置の評価にそれをインビボ適用することにおける信頼性を提供する。ＢＬＩに基づくＦＬｕｃ ｍＲＮＡの同時トランスフェクションの使用は、トランスフェクション効率に関する追加の定量的情報を提供することが予測される。これらの実験を完遂することによって、本発明者らは、本明細書で提案しているインビボ研究用の様々な表面抗原の同等に近いレベルの発現を実現するのに必要である、４種のｍＲＮＡそれぞれの至適濃度を特定する。
肺細胞でｍＲＮＡワクチンを使用してトランスフェクトした４種の抗原を免疫組織化学及びウエスタンブロット分析で評価する。本発明者らは、ウイルス抗原それぞれとのＣ末端融合としてヒトＰＤＧＦＲ膜貫通シグナルペプチドを使用するので、これらの抗原がトランスフェクトされた細胞の膜上に提示されることが予測される。単一トランスフェクション後の細胞の連続評価は、細胞発現の寿命を検証することが予測される。さらに、トランスフェクションのためのＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳの使用は、ＩＮ送達されたｍＲＮＡワクチンによる免疫処置の評価にそれをインビボ適用することにおける信頼性を提供する。ＢＬＩに基づくＦＬｕｃ ｍＲＮＡの同時トランスフェクションの使用は、トランスフェクション効率に関する追加の定量的情報を提供することが予測される。これらの実験を完遂することによって、本発明者らは、本明細書で提案しているインビボ研究用の様々な表面抗原の同等に近いレベルの発現を実現するのに必要である、４種のｍＲＮＡそれぞれの至適濃度を特定する。
【0252】
［実施例４］ ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面抗原（Ｓ、Ｎ、Ｅ、及びＭ）のｍＲＮＡワクチンのＩＮ送達及びＢＡＬＢ／ｃ免疫適格マウスにおけるインビボ免疫応答の評価
ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーでコーティングされたＰｏｌｙＧＩＯＮは、核酸の効果的なローディングを示した。本発明者らは、このストラテジーがマウスモデルでＧＢＭに治療用ｍｉＲＮＡを効果的にＩＮ送達することを以前に示した２１。送達時に動物の呼吸数を調節することによって、ＩＮ経路を介した治療用核酸の送達を制御することができる。正常に（麻酔無しで）呼吸する動物に送達されるＮＰは、ＮＰの主要な部分が気管に入り、肺に達する結果となる。ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳは、トランスフェクト細胞に向かう強い性向を有するので、コーティングされたｍＲＮＡは、肺細胞に入ると予測され得る。肺細胞上にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を提示する際に、免疫細胞の動員が起こり、肺免疫応答の活性化並びに自然免疫及び細胞性免疫の産生をもたらし得る。また、長期記憶細胞は、ウイルスに対する防御免疫を維持し得る。
ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーでコーティングされたＰｏｌｙＧＩＯＮは、核酸の効果的なローディングを示した。本発明者らは、このストラテジーがマウスモデルでＧＢＭに治療用ｍｉＲＮＡを効果的にＩＮ送達することを以前に示した２１。送達時に動物の呼吸数を調節することによって、ＩＮ経路を介した治療用核酸の送達を制御することができる。正常に（麻酔無しで）呼吸する動物に送達されるＮＰは、ＮＰの主要な部分が気管に入り、肺に達する結果となる。ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳは、トランスフェクト細胞に向かう強い性向を有するので、コーティングされたｍＲＮＡは、肺細胞に入ると予測され得る。肺細胞上にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を提示する際に、免疫細胞の動員が起こり、肺免疫応答の活性化並びに自然免疫及び細胞性免疫の産生をもたらし得る。また、長期記憶細胞は、ウイルスに対する防御免疫を維持し得る。
【0253】
本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ親系統及びヒトＡＣＥ２受容体を発現するように操作されたトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の４種の表面抗原全てのＩＮ送達されたｍＲＮＡワクチンに対する免疫処置を評価する。この受容体が、感染中の細胞へのウイルス進入、疾患の発症及び進行にとって重要なためである。
【0254】
ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡワクチンのＩＮ送達及び免疫適格ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボの免疫応答の評価
インビボのＩＮ送達には、本発明者らは、同等に近いレベルの発現に特定されている４種のｍＲＮＡ全ての至適濃度を使用する。本発明者らは、麻酔無しの活発なマウスにＰｏｌｙＧＩＯＮ ＣＤ－ＣＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡを送達する。本発明者らは、ＩＮ適用を容易にするために角度７０°の仰臥位にマウスを保持することによって、各鼻孔内で５μｌのＮＰ－ｍＲＮＡ複合体を適用する。本発明者らは、各適用時に容積２０μｌのＮＰ－ｍＲＮＡ複合体を投与する。各２０μｌの複合体は、５００ｎｇの各ｍＲＮＡ＋５８．９μｇのＣＤ－ＣＳ及び２．０×１０９のＧＩＯＮ ＮＰを含有するＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳを含有する。本発明者らは、インビボトランスフェクションの効率及びトランスフェクションの位置を評価するため、ＢＬＩを容易にするために５００ｎｇのＦＬｕｃ－ｍＲＮＡも補足する。ＰｏｌｙＧＩＯＮの分布を追跡するために、本発明者らは、全身マイクロＣＴ及びＭＲイメージングを実施する。本発明者らは、脳へのＮＰのいかなる可能な輸送も検出する。本発明者らは、意図されているｍＲＮＡ送達を観察するために、肺に注目するためである。
インビボのＩＮ送達には、本発明者らは、同等に近いレベルの発現に特定されている４種のｍＲＮＡ全ての至適濃度を使用する。本発明者らは、麻酔無しの活発なマウスにＰｏｌｙＧＩＯＮ ＣＤ－ＣＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡを送達する。本発明者らは、ＩＮ適用を容易にするために角度７０°の仰臥位にマウスを保持することによって、各鼻孔内で５μｌのＮＰ－ｍＲＮＡ複合体を適用する。本発明者らは、各適用時に容積２０μｌのＮＰ－ｍＲＮＡ複合体を投与する。各２０μｌの複合体は、５００ｎｇの各ｍＲＮＡ＋５８．９μｇのＣＤ－ＣＳ及び２．０×１０９のＧＩＯＮ ＮＰを含有するＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳを含有する。本発明者らは、インビボトランスフェクションの効率及びトランスフェクションの位置を評価するため、ＢＬＩを容易にするために５００ｎｇのＦＬｕｃ－ｍＲＮＡも補足する。ＰｏｌｙＧＩＯＮの分布を追跡するために、本発明者らは、全身マイクロＣＴ及びＭＲイメージングを実施する。本発明者らは、脳へのＮＰのいかなる可能な輸送も検出する。本発明者らは、意図されているｍＲＮＡ送達を観察するために、肺に注目するためである。
【0255】
送達の初期のイメージング評価を完遂した後に、本発明者らは、以下の３つのマウス群で免疫応答を研究する。Ｇ１：いかなる処置も無いコントロール、Ｇ２：ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－スクランブルＲＮＡ、及びＧ３：ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｍＲＮＡ。本発明者らは、免疫評価用の血液試料を採集する前に、４つのＩＮ用量（予備結果に基づくもの）で動物を毎日処置する。本発明者らは、顎下血液採取法を使用して、毎週２００μｌの血液を収集する。本発明者らは、血液から血清を分離し、免疫処置に使用されるウイルス抗原のそれぞれに対する抗体価決定のためのＥＬＩＳＡアッセイを使用する。本発明者らは、本明細書に上述したのと同じプロトコールに従う。本発明者らは、本発明者らの初期の結果に基づいて必要とされる追加のブースター用量も送達する。ｓｃＲＮＡコーティングされたＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳで送達された動物及び処置されなかった動物がコントロールとして働く。ひとたび本発明者らが、４種の抗原全てに対する最も高い血液レベルの抗体価に達したならば（１カ月間隔で最大３回のブースター用量）、本発明者らはブースター用量を停止し、隔週のアセスメントによってマウスにおける抗体価を次の６カ月間モニターする。本発明者らは、別の群の動物を有し、それにより、本発明者らは、活性なＴ細胞型及びＢ細胞型の変化を理解するために、最終ブースターを送達した１週間後に、免疫細胞サブタイプを試験する。本発明者らは、６カ月後にマウスで類似の評価を実施する。これは、本発明者らが動物における抗体レベル及び免疫細胞分布の両方を長期の免疫防御効果について評価することを可能にする。本発明者らは、任意の抗原及びＮＰ送達関連の病理学的影響について評価するために、様々な組織（腎臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、及び脳）のエクスビボ組織検査も実施する。
【0256】
ＰｏｌｙＧＩＯＮ－ＣＤ－ＣＳハイブリッドポリマーＮＰを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｍＲＮＡワクチンのＩＮ送達並びにヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるそれらのインビボ免疫応答及び病原性の評価
【0257】
実験方法
本発明者らは、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するＢＡＬＢ／ｃトランスジェニックマウスを使用すると同時に、ｍＲＮＡワクチンのＩＮ送達のために記載したものと同じストラテジーに従う。本発明者らは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た雄性及び雌性ホモ接合型ＴｇＢＡＬＢ／ｃ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎマウスを、ホモ接合型子マウスを得るために繁殖させる。発現される抗原、特にスパイクタンパク質抗原は、ＡＣＥ２受容体へのそれらの強い結合親和性のため、これらの動物で示差的応答を示すことができるので、本発明者らは、任意の病理学的な影響について慎重に動物をモニターし、マウスの健康状態に基づいて必要とされる治療スケジュールを調整する。
本発明者らは、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するＢＡＬＢ／ｃトランスジェニックマウスを使用すると同時に、ｍＲＮＡワクチンのＩＮ送達のために記載したものと同じストラテジーに従う。本発明者らは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た雄性及び雌性ホモ接合型ＴｇＢＡＬＢ／ｃ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎマウスを、ホモ接合型子マウスを得るために繁殖させる。発現される抗原、特にスパイクタンパク質抗原は、ＡＣＥ２受容体へのそれらの強い結合親和性のため、これらの動物で示差的応答を示すことができるので、本発明者らは、任意の病理学的な影響について慎重に動物をモニターし、マウスの健康状態に基づいて必要とされる治療スケジュールを調整する。
【0258】
考察
ＢＡＬＢ／ｃの血清及びｍＲＮＡワクチンを受けるＢＡＬＢ／ｃ－ｈＡＣＥ２トランスジェニック動物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の評価は、類似の効果を示すことが予測されるが、本発明者らは、類似の状態にあるＢＡＬＢ／ｃ動物と比較して、ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＡＣＥ２における低い生存率を伴う重度の病理学的な影響を観察すると予期する。本発明者らは、親ＢＡＬＢ／ｃ株と比較して、トランスジェニック動物におけるはるかに高いＢ細胞及びＴ細胞応答と共に、持続的な循環抗体を予測する。
ＢＡＬＢ／ｃの血清及びｍＲＮＡワクチンを受けるＢＡＬＢ／ｃ－ｈＡＣＥ２トランスジェニック動物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の評価は、類似の効果を示すことが予測されるが、本発明者らは、類似の状態にあるＢＡＬＢ／ｃ動物と比較して、ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＡＣＥ２における低い生存率を伴う重度の病理学的な影響を観察すると予期する。本発明者らは、親ＢＡＬＢ／ｃ株と比較して、トランスジェニック動物におけるはるかに高いＢ細胞及びＴ細胞応答と共に、持続的な循環抗体を予測する。
【0259】
［実施例５］ 呼吸粘膜免疫処置のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチンの金－Ｎａｎｏｓｔａｒ－キトサン媒介送達
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＣ２）によって引き起こされている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＳＣ２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するアデノウイルス、及び不活化ウイルスを使用するものを含めた、様々な抗ＳＣ２ワクチンが、ヒト適用のために承認されている。これらの筋肉内投与されるワクチンで得られる免疫の保護期間は、現在のところ不明である。殺滅中和抗体を介して持続的な免疫を開始することができる代替の自己投与可能なワクチンは、新興突然変異体ＳＣ２バリアントと戦う際に大いに有利となり得る。これは、ワクチン接種された個体が、ＣＯＶＩＤ－１９の受動的キャリアとして作用する可能性も低減し得る。ここで、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ免疫適格マウスモデルにおける、新規な鼻腔内（ＩＮ）送達される、ＳＣ２のＳタンパク質をコードするＤＮＡワクチンの可能性を調査する。修飾金－キトサンナノ担体上で輸送されるこのＳＣ２－スパイクＤＮＡワクチンのＩＮ送達に対する免疫応答は、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ）における強くて一貫したサージ及び様々なＳＣ２バリアント（武漢、南アフリカ、及びＤ６１４Ｇ）のＳタンパク質を発現する偽ウイルスの有効な中和を示す。免疫表現型検査及び組織学的分析は、完全なＳＣ２特異的細胞性及び体液性免疫応答について流入領域リンパ節及び脾臓をプライミングする常在樹状細胞及び肺胞マクロファージによるＳＣ２Ｓ抗原の認識に関与する経時的イベントを明らかにする。肺粘膜及び組織常在性メモリーＴ細胞における達成可能な高レベルの抗ＳＣ２ ＩｇＡは、ＳＣ２及びそのバリアントを進入部位で効率的に阻害することができ、持続的な免疫も提供する。
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックは、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＣ２）によって引き起こされている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＳＣ２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するアデノウイルス、及び不活化ウイルスを使用するものを含めた、様々な抗ＳＣ２ワクチンが、ヒト適用のために承認されている。これらの筋肉内投与されるワクチンで得られる免疫の保護期間は、現在のところ不明である。殺滅中和抗体を介して持続的な免疫を開始することができる代替の自己投与可能なワクチンは、新興突然変異体ＳＣ２バリアントと戦う際に大いに有利となり得る。これは、ワクチン接種された個体が、ＣＯＶＩＤ－１９の受動的キャリアとして作用する可能性も低減し得る。ここで、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ免疫適格マウスモデルにおける、新規な鼻腔内（ＩＮ）送達される、ＳＣ２のＳタンパク質をコードするＤＮＡワクチンの可能性を調査する。修飾金－キトサンナノ担体上で輸送されるこのＳＣ２－スパイクＤＮＡワクチンのＩＮ送達に対する免疫応答は、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ）における強くて一貫したサージ及び様々なＳＣ２バリアント（武漢、南アフリカ、及びＤ６１４Ｇ）のＳタンパク質を発現する偽ウイルスの有効な中和を示す。免疫表現型検査及び組織学的分析は、完全なＳＣ２特異的細胞性及び体液性免疫応答について流入領域リンパ節及び脾臓をプライミングする常在樹状細胞及び肺胞マクロファージによるＳＣ２Ｓ抗原の認識に関与する経時的イベントを明らかにする。肺粘膜及び組織常在性メモリーＴ細胞における達成可能な高レベルの抗ＳＣ２ ＩｇＡは、ＳＣ２及びそのバリアントを進入部位で効率的に阻害することができ、持続的な免疫も提供する。
【0260】
序論
２０１９新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）パンデミックは、世界中で何十億人もの人々を罹患させている。原因となっている病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＳＣ２）は、ベータコロナウイルス科に属する１。コロナウイルスは、ヒト及び哺乳動物に感染するプラス鎖一本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。このウイルスはアグレッシブであり、制御不能に蔓延するので、迅速で高優先度のアプローチが、ワクチン開発中に採用され、緊急使用許可下に承認されている２。ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、不活化ウイルス、ＳＣ２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するアデノウイルス、及びペプチドワクチン品種を含めて、現在ＳＣ２ワクチン開発に考慮されているいくつかのストラテジーがある３。ＭｏｄｅｒｎａによるｍＲＮＡ－１２７３又はＰｆｉｚｅｒによるｍＲＮＡ－ＢＮＴ１６２ｂ２など、ほとんどのワクチンは、現在、初回抗原としてＳＣ２のＳタンパク質を標的としている４。不活化ウイルスワクチン（Ｃｏｖａｘｉｎ）及びＳＣ２のＳタンパク質を発現するアデノウイルスワクチン（Ｃｏｖｉｓｈｉｅｌｄ及びＳｐｕｔｎｉｋ）もヒトで投与される。
２０１９新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）パンデミックは、世界中で何十億人もの人々を罹患させている。原因となっている病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＳＣ２）は、ベータコロナウイルス科に属する１。コロナウイルスは、ヒト及び哺乳動物に感染するプラス鎖一本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。このウイルスはアグレッシブであり、制御不能に蔓延するので、迅速で高優先度のアプローチが、ワクチン開発中に採用され、緊急使用許可下に承認されている２。ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、不活化ウイルス、ＳＣ２スパイク（Ｓ）タンパク質を発現するアデノウイルス、及びペプチドワクチン品種を含めて、現在ＳＣ２ワクチン開発に考慮されているいくつかのストラテジーがある３。ＭｏｄｅｒｎａによるｍＲＮＡ－１２７３又はＰｆｉｚｅｒによるｍＲＮＡ－ＢＮＴ１６２ｂ２など、ほとんどのワクチンは、現在、初回抗原としてＳＣ２のＳタンパク質を標的としている４。不活化ウイルスワクチン（Ｃｏｖａｘｉｎ）及びＳＣ２のＳタンパク質を発現するアデノウイルスワクチン（Ｃｏｖｉｓｈｉｅｌｄ及びＳｐｕｔｎｉｋ）もヒトで投与される。
【0261】
ｍＲＮＡワクチンは、ウイルスタンパク質をコードする合成のインビトロ転写ＲＮＡ配列から開発されるが、ワクチン間のバリエーションは、これらの合成ｍＲＮＡの安定性及びそれらのナノ製剤媒体のものに基づいている５。筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種は、感染及び病態から肺を保護する全身の液性及び細胞性免疫応答を誘導するが、それは殺滅免疫を付与しない。また、貧弱な血管分布に伴う皮下脂肪層中へのワクチンの不注意な注射は、抗原の可動化及びプロセシングの遅延をもたらし、ワクチン失敗を引き起こす可能性がある。したがって、ＩＭワクチン接種後に適切な持続的能動免疫が生じるか否かは、まだ不明である６、７。最適なワクチン療法は、持続的な免疫をもたらす殺滅ワクチンを目指す。抗原をコードするＤＮＡ及びｍＲＮＡコンストラクト両方の利点は、それらを生成するのが、不活化ウイルスを開発すること又は組換えタンパク質を作製することより単純かつ迅速であり、生ウイルス／病原体を用いて実施するリスクが回避できることである８。
【0262】
呼吸器感染症では、ＩＭ注射とは対照的に、液性免疫応答と自然免疫応答の両方を実現し、同時に気道及び肺の殺滅免疫も生成するワクチンの鼻腔内送達（ＩＮ）が好まれる。しかし、ＩＮ送達は、ローディングされた核酸ワクチンを鼻腔を抜けて肺内まで輸送することができるナノ担体を必要とする。効率的なナノ粒子（ＮＰ）送達システムも、有効なＤＮＡ／ＲＮＡワクチン免疫応答を開始する鍵である。いかなる理想的な送達システムも、高ローディング量、安定性、及び生体適合性の組合せを示す必要がある。その点では、リポソームとは別に、キトサンなどのカチオン性多糖及び天然バイオポリマーが、ワクチン送達システムにおけるアジュバントとして使用されている９。キトサンは、ワクチン送達のために上皮細胞の粘膜表面及びそれらの細胞間タイトジャンクションを貫通することができる非毒性、生体付着性、生物分解性、生体適合性のポリマーである１０、１１。キトサンは、核酸の有効なローディング及び細胞膜の反対側への送達、並びに肺内への有効なトランスフェクションを提供するが、鼻腔を抜けて肺内までの可動化を提供するには、生体適合性固体ナノ担体の表面にコーティングすることが必要となる。ここで、本発明者らは、ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡベクター＋ホタルルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするｍＲＮＡをＩＮ送達するための金－Ｎａｎｏｓｔａｒ－キトサン（ＡｕＮＳ－キトサン）ナノ製剤を開発及び評価する。
【0263】
最近の研究は、粘膜免疫の非存在下において、鼻腔がＳＣ２のリザーバとなり、患者を再感染又は他者への疾患伝播の危険にさらす可能性があることを示している１３。ＩＮワクチン接種は、感染とこのリザーバからの伝搬の両方を遮断するのに決定的に重要である鼻腔内の局所的粘膜免疫を開始することができる中和ＩｇＧ、粘膜ＩｇＡ、及びＴ細胞を介した広範な免疫応答を刺激するのに役立つことができるので、この欠点を克服することができる。肺は、他の粘膜部位と多くの特徴を共有するが、その繊細な組織形態学的完全性の保存には、外部からの侵襲に直面した際の炎症促進性応答と抗炎症性応答の間の良好な相互作用が必要である。時機を得て、適切に位置し、厳密に調節されたＴ細胞及びＢ細胞応答は、感染から保護するのに必須であるが、調節不良の炎症は、組織損傷及び疾患発症に寄与する１４。ＩＮ送達には、注射の回避、並びにヒト使用による耐用性及びコンプライアンスが高い可能性が高いことを含めた他の多くの利点がある。さらに、ＩＮ経路を介した気道免疫処置は、多数の抗原提示細胞の確立を含めた免疫応答を誘導するために、大きな表面積を標的とすることができる。ＩＮワクチン接種は、上下気道の粘膜表面及び粘膜下表面で、これらの病原体の入口で高レベルに維持される保護的な液性及び細胞性病原体特異的免疫応答を誘導する。
【0264】
上気道及び気管支樹の肺胞マクロファージ（ＡＭ）、樹状細胞（ＤＣ）、上皮Ｍ細胞、上皮内リンパ球、並びにリンパ節及びリンパ組織全てが、ワクチンに対する強い免疫応答を媒介するのを補助する１６。肺全体の組織常在白血球及び循環白血球の遊走がＩＮワクチン接種における決定的な役割を果たす。この動的相互作用を追跡するために、本発明者らは、Ｃｃｒ２ＲＦＰＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ二重レポーターを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲ）及びＢＡＬＢ／ｃマウスでこのワクチン接種アプローチを評価する。ＣＸ３ＣＲ１＋受容体は、主としてＣＤ８＋、ＣＤ４＋、及びγδＴリンパ球、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＤＣ、及び単球／マクロファージなどの白血球で発現される。一方、操作されたＣＣＲ２－ＲＦＰは、常在性の単球及びＡＭの追跡を可能にする１７。
【0265】
ＮＰ表面／内に配合された抗原は、適切な免疫細胞による取り込みのために、気道及び肺の呼吸粘膜に達することができる１８。弱毒化生ウイルスワクチンのＩＮ投与における懸念が増大している状況において、ＮＰベースの担体は、より安全な粘膜の免疫を引き起こす有望な代替手段である。したがって、本発明者らは、上下気道粘膜に送達されるＳＣ２ワクチンをＩＮ送達する、ＡｕＮＳ－キトサンの能力をマウスで調査する。金ＮＰは、最近、ワクチン接種用の抗原担体及び免疫細胞活性化剤として使用されている１９。これらのＮＰは、無毒であり、様々な適用に使用されている２０。ＩＮ投与用に製剤化された金ＮＰは、リンパ節に拡散して、ロバストな抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答の引き金となることが示されている２１。これを念頭におき、本発明者らは、マウスにおけるＩＮ送達の担体としてＡｕＮＳ－キトサンを使用して、ＤＮＡ（ＳＣ２のＳタンパク質を発現するもの）のワクチン媒介抗体産生を試験する。加えて、本発明者らは、呼吸気道を標的とするため、並びに本発明者らのストラテジーをＳＣ２ｍＲＮＡワクチンの送達に将来適応するための概念実証及びモデルプラットホームとして、ルシフェラーゼレポーターをコードするｍＲＮＡを保持するＡｕＮＳ－キトサンのＩＮ送達の実行可能性を試験する。このアプローチを最終的に臨床に橋渡しすれば、現在のｍＲＮＡワクチンのシームレスな拡張となるはずである。
【0266】
病原体粒子の使用を回避することで、現在のｍＲＮＡワクチンは、明確な利点を得ている。それらが本来的に非感染性となっているためである。いったんタンパク質が作製されれば、ｍＲＮＡ鎖は迅速に分解される。転写され、さらにタンパク質に翻訳されるために核に達するのに細胞及び核膜穿孔に依存するｐＤＮＡとは異なり、ｍＲＮＡ鎖の場合、翻訳されるのに、サイトゾルへのアクセスを得るだけで十分である。初期の臨床試験結果のいくつかは、ＲＮＡワクチンが、信頼できる免疫応答を生み出すことができ、副作用は無視できる程度で、健常個体によって十分に耐用されることを示している。一方、ＤＮＡはｍＲＮＡより安定した分子であり、ＤＮＡの使用は、世界的な配給に適した、より長い有効期間を有するロバストなワクチンをもたらすことができる。しかし、ＤＮＡ発現カセットは、ゲノム組込み、挿入突然変異誘発、長期発現、及び抗ＤＮＡ抗体の誘導の理論上のリスクを保持する。これらの２種の核酸ワクチンの多くのメリットとデメリットを考慮し、本発明者らは、ここで、本発明者らのＡｕＮＳ－キトサン送達媒体を使用してＩＮ投与される抗ＳＣ２ＤＮＡワクチンをまず開発し、前臨床的に評価する。概念的には、本発明者らは、このＤＮＡワクチンを使用して、最初に安定性及び良好な器官特異的発現を検証する（同時送達されるルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのインビボイメージングを使用して）ことによって、本発明者らのＩＮ送達プラットホームについて原理証明を確立すること、及び結果として生じるロバストなワクチン媒介免疫作用の存在をマウスで確立することを目指す。本発明者らは、ＩＮ投与される類似の抗ＳＣ２ｍＲＮＡワクチンを作製し、評価するためにこの同じストラテジーを拡張し、臨床移行の前に、これら２種のナノ技術の比較研究を行う。しかし、提案されているワクチンの両方に適用可能な決定的に重要な前提条件は、本発明者らのＡｕＮＳ－キトサンＮＰを使用して、十分なＳＣ２核酸を細胞膜の反対側に移すことができるかどうかである。通常、エレクトロポレーションは、細胞膜及び核膜の反対側へのＤＮＡ取り込みを必要とするので、本発明者らは、抗ＳＣ２ＤＮＡワクチンの初期試験は、エレクトロポレーションを置き換えるこのＮＰ媒体の能力を確立するのに有用であり得ると推論した。また、ＡｕＮＳ－キトサンのみで、後続のＳタンパク質発現に十分なＤＮＡをサイトゾル、次いで核にロバストに送達することができるならば、それは、Ｓタンパク質の翻訳のためにサイトゾルにアクセスを得ることのみを必要とする、ｍＲＮＡのみを使用する将来の類似ストラテジーが成功する確率が高いことを示唆し得る。
【0267】
Ｓタンパク質が、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体との相互作用と、それに続くエンドサイトーシスとを介してウイルス伝達を媒介することが十分に確立されている。したがって、Ｓタンパク質ベースのワクチンは、ウイルス結合、及びＡＣＥ２受容体を発現する呼吸気道の円柱繊毛細胞（及びそれらの前駆細胞）との融合を遮断するか、又はウイルス感染を中和する抗体を誘導し得る２２。また、ＳＣ２の全ての構造タンパク質と比較して、Ｓタンパク質は、ウイルス感染に対する細胞性免疫及び液性免疫の両方を誘導する主な免疫原性タンパク質であるようである。
【0268】
注射されるタンパク質抗原の短い半減期と比較して、ＤＮＡワクチンは、はるかに長い期間にわたって抗原の組織特異的発現を提供し、それによって、より良好に免疫システムをプライミングことができる２３。したがって、本発明者らは、ＳＣ２ ＤＮＡワクチンをＩＮ送達して、全身性免疫（中和ＩｇＧ）及び鼻腔及び気道における局所免疫（粘膜ＩｇＡ及びＴ細胞）を含めた広範な免疫応答を刺激するＡｕＮＳ－キトサンを設計した。本発明者らは、このＩＮワクチン接種ストラテジーが、ＳＣ２偽ウイルス及びそのバリアントを効率的に中和し、それによって持続的な免疫を提供する抗ＳＣ２ ＩｇＡ及び組織常在性メモリー（ＴＲＭ）Ｔ細胞の顕著なレベルを肺粘膜で実現することを見出す。
【0269】
結果及び考察
金ｎａｎｏｓｔａｒ合成、生理化学的特性、安定性、キトサンコーティング、及び様々なモル比におけるＤＮＡローディング効率のインビトロ特徴分析。
金ｎａｎｏｓｔａｒ合成、生理化学的特性、安定性、キトサンコーティング、及び様々なモル比におけるＤＮＡローディング効率のインビトロ特徴分析。
【0270】
本発明者らは、その全体が全ての目的について参照により本明細書に組み込まれている、本発明者らが以前に概説した修飾手順を使用して、ＡｕＮＳ－キトサンを調製する２０。本発明者らは、ペイロードを組み込むのに十分な表面積を提供する金ナノオクトポッドを生成するための反応条件を最適化した。調製されたままのＡｕＮＳの表面を、それらの生体適合性、コロイド安定性を改善するため、及びアニオン性核酸をローディングするのに十分な表面電位を実現するためにカチオン性バイオポリマーキトサンを使用して修飾した。修飾ＡｕＮＳ上のキトサンの均一な単層が高分解能透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）で明らかであり、これは、ＮＰ表面電位測定の明らかな変化とも相関した。ＴＥＭは、ＮＰのサイズ分布が狭く、ＮＰコアの平均のサイズが２０ｎｍであり、突出スパイクが約２０～３０ｎｍであることを明らかにした（図９Ａ～９Ｃ）。初期状態のＡｕＮＳは、－５．６ｍＶ（±２．８９ｍＶ）の表面電位を有し、カチオン性キトサンポリマーによるキャッピングで、それが＋３５．８ｍＶ（±３．５９ｍＶ）のカチオン性表面電位に変わった。本発明者らは、ゲル遅延度アッセイを使用して、ＡｕＮＳ－キトサンに対するｐＤＮＡ（ＳＣ２Ｓタンパク質のコード配列）のローディング効率を推定した。本発明者らは、漸増量のＡｕＮＳ－キトサンとＳＣ２プラスミド（２μｇ）を複合体にし、その結果得られたポリプレックスは、封入されたｐＤＮＡの一貫した増大を示した。２．５μｌポリプレックス量のＡｕＮＳ－キトサンは、ＮＰ内に２μｇのｐＤＮＡ－ＳＣ２プラスミドを封入し、その結果、ｐＤＮＡは、ゲル遅延度アッセイにおいて、電気泳働中、ウェル内に完全に保持された（図９Ｄ）。本発明者らは、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び表面ゼータ電位測定を使用して、ポリプレックスを流体力学的サイズについて評価した。それは、ゲル電気泳動による発見とも一致した。ポリプレックス内でＡｕＮＳ－キトサンと共にあるＳＣ２プラスミドの量を増やすと、静電的相互作用によってＮＰの表面に捕捉されるｐＤＮＡが増加し、その結果、１μｇのＳＣ２プラスミドと１μｌのＮＰのポリプレックス比で、ゼータ電位は、＋２．１２（±３．４ｍＶ）というほぼ中性の正味の表面電位まで低下した。これは、ＡｕＮＳ－キトサンの最大ローディング効率を示している。同様に、１μｇ超のｐＤＮＡを有するポリプレックス比では、表面ゼータ電位がさらに負の表面電位まで低下した。これは、ＮＰの表面に緩く結合しているｐＤＮＡが過剰であることを示しており、そのことは、ゲル遅延度アッセイでも明確に明らかだった。ポリプレックスの各比率は様々な表面電位を示したが、ｐＤＮＡがローディングされたＡｕＮＳ－キトサンのサイズは、常に３５～４８ｎｍの範囲内にあった（図９Ｅ～９Ｆ）。プラスミド送達のための最適なポリプレックス比を決定するために、本発明者らは、ＡｕＮＳ－キトサンにｐｃＤＮＡ－ＦＬｕｃ－ｅＧＦＰプラスミドをローディングし、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用して、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞におけるトランスフェクション効率についてそれを評価した。ゲル遅延度アッセイ及びゼータ電位測定と一致して、本発明者らは、１μｇのプラスミド及び１μｌのＡｕＮＳの組合せで最大のトランスフェクション効率を観察した。ｐｃＤＮＡ－ＳＣ２プラスミド（ＤＮＡワクチン）を使用してＳタンパク質発現を評価するために、本発明者らは、最適な比率のＡｕＮＳを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＳＣ２プラスミドの様々なバリアント（Ｗｕｈａｎ、ＳＡ、及びＤ６１４Ｇ）でトランスフェクトし、抗ウサギＳＣ２スパイク抗体を使用して、Ｓタンパク質の発現について細胞溶解物をプロービングした。本発明者らは、後続のドットブロット及びＥＬＩＳＡイムノアッセイにおけるＣｏＶ－２及びＣｏＶ－１タンパク質の関与を検証にするために、ＣｏＶ－２及びＣｏＶ－１タンパク質も、抗ＳＣ２抗体を使用してアッセイした（図９Ｈ）。全体的に、提案のＤＮＡワクチン製剤は、ＡｕＮＳ、キトサンポリマー、及びプラスミドＤＮＡという３種の成分を含んでいた。
【0271】
ＳＣ２ＤＮＡワクチンをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンの鼻腔内投与はトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳ抗原特異的な免疫応答を顕現させる。
【0272】
本明細書には、ＩＮ ｍＲＮＡワクチンの土台として、ＩＮ ＤＮＡワクチンプラットホームの開発及び原理証明が記載されている。リポソームＳＴＩＮＧアゴニストをアジュバントとして共に用いるＳＣ２ Ｓタンパク質のサブユニットワクチンは、マウスモデルでのＩＮ送達において強い粘膜免疫を誘導できることが示されている１３。しかし、サブユニットワクチンは、現在、世界中に蔓延している広範囲のバリアントに対する防御をカバーするのに十分な中和抗体を誘発しない可能性がある。したがって、本発明者らは、ＳＣ２ Ｓタンパク質に対する本発明者らのＩＮ－ＤＮＡワクチンを評価した。このストラテジーは、全てのウイルスタンパク質の様々なバリアント全てから保護することができる免疫を誘発するための、様々なＳＣ２構造タンパク質（Ｓ、Ｎ、Ｅ、及びＭ）をコードするｍＲＮＡワクチンに拡張することができる。本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲトランスジェニックマウスを使用して、ＩＮ送達されたワクチンの広範な免疫処置能力を検証し、一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲトランスジェニックマウスは、操作された蛍光タンパク質を使用して、より特異的に、Ｔ細胞活性化及び輸送の評価を可能にする。ＳＣ２ ＤＮＡワクチンのＩＮ送達の効率を評価するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウス（各Ｎ＝１０）のＩＮ送達を介して、ＡｕＮＳ－キトサンにロードされたＳタンパク質を発現するｐＤＮＡを送達した。図１０Ａ～１０Ｂに示す間隔で１０μｇのＤＮＡをマウスに投与した。
【0273】
Ｓタンパク質ベースのドットブロットアッセイを使用して決定された、ＳＣ２ワクチン接種したマウスからの血清の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＣ２のＳタンパク質との反応性
ワクチン接種の際にマウスで生成された抗ＳＣ２特異的免疫グロブリンの確立した証拠を基に、本発明者らは、２００３年のＳＡＲＳアウトブレークに由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＳＣ１）のＳ１サブユニットとの血清交差反応性をさらに調査した２６。本発明者らは、対照及びＳＣ２でワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの両方から様々な時点で収集された血清を、ＳＣ１及びＳＣ２からの精製Ｓタンパク質に対する抗Ｓタンパク質抗体について、化学発光ドットブロットアッセイを使用して試験した。本発明者らは、送達されたＤＮＡワクチンに対する抗体がワクチン接種後に２週間という早さで産生されたことを明らかに観察した。（図１０Ｃ）。ＳＣ１のＳタンパク質はＳＣ２のものと有意な相同性を示しはするが、ＳＣ２ワクチンを使用して誘導されたマウスの血清は、ＳＣ１ Ｓタンパク質に対する、ＳＣ２と比較して低い感受性を示した。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの両方から、全ての時点で収集された血清の評価は、ＳＣ２タンパク質検出の感受性が、ＳＣ１と比較して、はるかに高く、また、両方のマウスモデルで一貫していたことを示している（図１０Ｃ）。ＳＣ１検出シグナルは、有意な交差反応性を示すＳＣ２のものより４０～６０％近く有効性が低かった。これは、ここに概説したワクチン接種アプローチが、サルベコウイルス亜属の関連ウイルスに対する防御を潜在的に、ＳＣ２と比較して同様の効率で提供することができるという以前の発見と一致している２７。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスは、研究した全ての時点で、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較してわずかに高い力価の抗体を有した。これは、それらの遺伝的背景及び免疫背景のバリエーションに関連している可能性がある。全体的に、血清検出レベルの傾向は、ＥＬＩＳＡアッセイで観察されたのと同じパターンに従い、最高血清レベルの抗ＳＣ２ Ｓタンパク質抗体がＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスでそれぞれ処置４週目及び５週目にピークを有した。これは、ＤＮＡワクチン接種で誘発されるＢ細胞媒介の液性免疫応答に関する証拠を提供した（図１０Ｄ）。この傾向は両方のマウスモデルで一貫していたが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲの血清中ピーク抗体レベルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスより約２５％高かった。血清抗体レベル及びそれらがピーク値に達するまでの時間の観察された相違が、これら２株の近交系マウス株の免疫学的相違によるものであった可能性がある２８、２９。しかし、液性免疫応答におけるワクチン接種の有効性及びパターンは、両方のモデルで顕著であった。
ワクチン接種の際にマウスで生成された抗ＳＣ２特異的免疫グロブリンの確立した証拠を基に、本発明者らは、２００３年のＳＡＲＳアウトブレークに由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＳＣ１）のＳ１サブユニットとの血清交差反応性をさらに調査した２６。本発明者らは、対照及びＳＣ２でワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの両方から様々な時点で収集された血清を、ＳＣ１及びＳＣ２からの精製Ｓタンパク質に対する抗Ｓタンパク質抗体について、化学発光ドットブロットアッセイを使用して試験した。本発明者らは、送達されたＤＮＡワクチンに対する抗体がワクチン接種後に２週間という早さで産生されたことを明らかに観察した。（図１０Ｃ）。ＳＣ１のＳタンパク質はＳＣ２のものと有意な相同性を示しはするが、ＳＣ２ワクチンを使用して誘導されたマウスの血清は、ＳＣ１ Ｓタンパク質に対する、ＳＣ２と比較して低い感受性を示した。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの両方から、全ての時点で収集された血清の評価は、ＳＣ２タンパク質検出の感受性が、ＳＣ１と比較して、はるかに高く、また、両方のマウスモデルで一貫していたことを示している（図１０Ｃ）。ＳＣ１検出シグナルは、有意な交差反応性を示すＳＣ２のものより４０～６０％近く有効性が低かった。これは、ここに概説したワクチン接種アプローチが、サルベコウイルス亜属の関連ウイルスに対する防御を潜在的に、ＳＣ２と比較して同様の効率で提供することができるという以前の発見と一致している２７。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスは、研究した全ての時点で、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較してわずかに高い力価の抗体を有した。これは、それらの遺伝的背景及び免疫背景のバリエーションに関連している可能性がある。全体的に、血清検出レベルの傾向は、ＥＬＩＳＡアッセイで観察されたのと同じパターンに従い、最高血清レベルの抗ＳＣ２ Ｓタンパク質抗体がＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスでそれぞれ処置４週目及び５週目にピークを有した。これは、ＤＮＡワクチン接種で誘発されるＢ細胞媒介の液性免疫応答に関する証拠を提供した（図１０Ｄ）。この傾向は両方のマウスモデルで一貫していたが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲの血清中ピーク抗体レベルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスより約２５％高かった。血清抗体レベル及びそれらがピーク値に達するまでの時間の観察された相違が、これら２株の近交系マウス株の免疫学的相違によるものであった可能性がある２８、２９。しかし、液性免疫応答におけるワクチン接種の有効性及びパターンは、両方のモデルで顕著であった。
【0274】
鼻腔内ワクチン接種は、ＳＣ２の突然変異バリアントにするクロスバリアント液性免疫応答をブーストする。
【0275】
ＳＣ２感染症の世界的なサージの下、突然変異を起こすウイルス感受性も蔓延及び時間と共に増大し、その結果、新しい突然変異バリアントの出現をもたらす３０。先行の感染又はワクチン接種によって誘発された中和抗体に対する耐性のため、新興ＳＣ２バリアントの懸念が高まっている。新興Ｓタンパク質バリアントに見出される突然変異は、モノクローナル抗体、回復期血漿、及びワクチン接種された個体からの血清による中和に対する感受性を低減する３１。そのような懸念増大の結果として、本発明者らは、ＩＮ ＳＣ２（Ｗｕｈａｎ）ワクチン接種されたマウス血清がＳＣ２の他の新興バリアントとの交差反応性を示すことができるかどうかさらに評価した。本発明者らは、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ Ｓタンパク質及びＳＣ２－Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ（ＳＡ）突然変異体Ｓタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の全細胞可溶化物を用いた免疫ブロットアッセイを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスから収集された血清を、ＳＣ２－ＳＡ－突然変異体に対するクロスバリアント中和抗体についてプロービングした。本発明者らは、収集された血清によって、ＳＣ２－ＷｕｈａｎとＳＣ２－ＳＡ突然変異体Ｓタンパク質の両方が全ての時点で等しく検出されたことを見出した（図１１Ａ～１１Ｂ）。これらの発見は、両方のマウスモデルで一貫していた。これは、それらがＳＣ２の新しい株に対する本発明者らのワクチン接種アプローチの有効性を強く示している。一方、これらの結果は、本発明者らの提案したストラテジーを使用する場合、クロスバリアント中和抗体を誘発するための、未感染対象と先行感染済みの対象の両方における将来のワクチン接種の重要性及び必要性を指摘している３２。本発明者らは、様々なアッセイを使用することによって、ＳＣ２ Ｓ抗原特異的な免疫応答の血清レベルの傾向を検証した。また、このワクチン接種アプローチの一貫性を確証するために、本発明者らは、各群につき５頭のＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスのバッチを有する２つの独立研究から得られた中和抗体の血清レベルを比較した（図１１Ｃ）。免疫処置の４週間後に収集された血清の比較イムノブロット分析を、精製されたＳＣ２タンパク質及びＳＣ１タンパク質に対して評価した。結果は、両バッチにおける中和抗体について類似の血清レベルを示した。これは、このＩＮ免疫処置アプローチの再現性を支持している。
【0276】
ＤＮＡワクチン媒介免疫と実感染媒介免疫の間の比較を行うために、本発明者らは、ＩＮ経路を介して送達されたＳＣ２偽ウイルスに対する、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックマウスの免疫応答をそれぞれの対照株（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＡＣＥ２）と共に調査した。本発明者らは、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ及びＳＣ２－ＳＡ突然変異体に対応する偽ウイルスの２種の異なったバリアントを野生型及びＡＣＥ２操作されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで試験した。偽ウイルス感染の５日後にマウスから収集した血清の評価は、野生型及びＡＣＥ２トランスジェニックマウスの両方で、有意（ｐ＜０．０１）なレベルの抗ＳＣ２抗体を示した（図１１Ｄ）。比較として、結果は、ＡｕＮＳ－キトサンＮＰにローディングされた本発明者らのＳＣ２ ＤＮＡワクチンのＩＮ投与によって生じた液性免疫応答の程度が、研究の類似の時点（３用量のＳＣ２ ＤＮＡワクチン又はＳＣ２－Ｗｕｈａｎ及びＳＣ２－ＳＡ偽ウイルスの処置の５日後）に偽ウイルスで媒介された伝達によって実現されたものより約３０％近く高かったことを示す。
【0277】
ＡｕＮＳ－キトサンＮＰを使用した、ＳＣ２ Ｓタンパク質を発現するＤＮＡワクチンの鼻腔内送達は液性肺免疫の効果的な活性化を示した。
【0278】
細胞内へのＳＣ２の進入は、ウイルスの受容体として標的細胞表面に作用するＡＣＥ２と、ウイルスＳ糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の相互作用によって開始される３３。Ｓタンパク質ベースのＥＬＩＳＡを使用して、ＳＣ２ Ｓ抗原に対して生成された抗体をスクリーニングすることができる。ＩＮ経路を介して粘膜免疫は、呼吸器病原の初期進入部位又はその近傍で保護を与える分泌ＩｇＡ抗体を含めた、局所免疫応答を誘発することができる３４。ＳＣ２ Ｓ ＤＮＡワクチンをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンの免疫原性及び保護効率を評価するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲという２株の異なるマウス株を使用した。
【0279】
本発明者らは、最適化された比率でＡｕＮＳ－キトサン上にカプセル化した後に、１０μｇのＳＣ２－ＤＮＡワクチンをＩＮ投与した。マウスに最初の週に３用量のＤＮＡワクチンを投与し、その後、連続３週間、１用量を投与した。本発明者らは、図１０Ａの概略図に示す通り、第１の用量の後に８週間血液収集を続けた。本発明者らは、様々な時点の血清中のＳタンパク質抗体応答を分析して、ワクチン接種されたマウスにおけるＳＣ２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ力価を、対照マウスと比較して決定した。ＥＬＩＳＡ結果に示されているように、ＡｕＮＳ－キトサン－ＳＣ２－スパイクのＩＮ免疫処置は、血清中で高レベルのＳタンパク質特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ抗体を誘導したが、対照ＤＮＡをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンはしなかった（図１１Ａ～１１Ｇ）。本発明者らは、ワクチンで誘導された血清中ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを順次に最大８週間、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの両方で、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。Ｓ抗原特異的なＩｇＧレベルは、第１の週（３用量の後）と同じくらい早く、両方のマウス株で指数関数的に上昇し、ワクチン接種のさらなる用量に関わらず、８週間、ピークレベルに維持した（図１１Ｅ）。動物は、いかなるさらなる用量もなしに１４週間維持した。１４週間目に、本発明者らは、血液試料を収集し、追加ブースター用量を投与した。１４週目にブースター用量を投与すると、ＩｇＧレベルがさらに上昇し、１５週目に最大値に達し、その後、数週間にわたって高い値を維持した（図１１Ｅ）。同様に、ＡｕＮＳ－キトサン－ＳＣ２－スパイクＤＮＡワクチン接種は、類似の誘導動態及びピークレベルまでの時間で、Ｓ抗原特異的ＩｇＡも誘発した（図１１Ｆ）。このワクチン接種は、２～８週間にわたる持続的な血清中ピークプラトーも示した。これは、特に、その短い半減期及びセロコンバージョンパターンのため、ＩＭワクチン接種後には通常は観察されない。
【0280】
処置の過程で生成される一貫して高ＩｇＡレベルのこの明確なパターンは、特に、粘膜表面におけるＩｇＡの空間分布及びこの研究で使用されるＩＮ投与経路のために、決定的に重要な利点とみなすことができる。インフルエンザに対するＩｇＧ及びＳＣ２に対するＩｇＧと比較した場合に、ＩｇＡが優れた抗ウイルス特性を有することを複数の研究が見出している。Ｓｔｅｒｌｉｎらは、最近、ＩｇＡがＳＣ２に対する早期の中和応答で支配的であることを示唆し、彼らは、血清ＩｇＡが、ウイルス中和に、血清ＩｇＧより７倍強力であると推論した３５。これらの利点は、本発明者らの研究で採用されたワクチン投与ストラテジーにより効果的に利用し得る。ＩｇＡを介した粘膜免疫増強についての本発明者らの発見は、ウイルスが２型肺胞細胞表面のＡＣＥ２タンパク質にドッキングすることによって呼吸上皮細胞を攻撃する３６、３７ということを考慮すると、ＳＣ２感染を防止する上での重要な利点を与え得る。
【0281】
一方、既存の証拠は、血清と、唾液ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体レベルの間には良好な相関関係を示しているが、血清と唾液ＩｇＡ抗体の間の相関関係ははるかに弱い。唾液ＩｇＭ及びＩｇＧは、主に循環に由来するが、唾液ＩｇＡは、ほとんど、唾液腺で局所的に生成される３８ので、これは予想外のことではない。したがって、ワクチン接種されたマウスの気管支肺胞洗浄液及び唾液中のＳ抗原特異的ＩｇＡのレベルは、血清から決定される値よりはるかに高いということを自信をもって推論することができる。早期の抗体応答としてＳＣ２特異的ＩｇＭ及びＩｇＡが生成され、その後、ＳＣ２特異的なＩｇＧ抗体が生成された３５。ＩｇＧレベルがＳＣ２に対する防御抗体として生涯続くと想定される。しかし、セロコンバージョンの開始は、ＩｇＧ及びＩｇＭの同時セロコンバージョン、すなわちＩｇＧより早いＩｇＭセロコンバージョン及びＩｇＧより遅いＩｇＭセロコンバージョンを含めた免疫グロブリンのそれぞれのレベルも決定する３９。ＩｇＧ及びＩｇＡは、それらのレベルを１４週目まで維持し、単一のブースター用量でさらに高く上昇した（図１１Ｅ～１１Ｇ）。１４週目のブースター用量の後のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭレベルの急速なサージは、急速なリコール応答を誘発することができる持続性のメモリーＢ細胞及びＴ細胞の明らかな証拠にもなっている。液性免疫応答は、典型的には、一次ＩｇＭ抗体応答と、その後のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥで構成され、免疫メモリーに関連する二次抗体応答とを特徴とする。ここで、本発明者らは、血液プール中のＳＣ２特異的中和抗体の形態のＳＣ２に対する液性応答を観察した。全体的に、本発明者らの発見は、ＡｕＮＳ－キトサン－ＳＣ２－スパイクＤＮＡワクチンが免疫適格マウスにおけるＳ抗原特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ応答を効果的に誘導し、それらの血清中持続性が著しい相違していることを実証する。
【0282】
ＡｕＮＳ－キトサンを使用した、ＳＣ２が中和抗体による肺免疫の効率的な活性化を示した場合のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンの鼻腔内送達
送達されたＤＮＡワクチンによる抗体誘導の良好な評価の後に、本発明者らは、中和アッセイ（ＢＥＩ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ）のための偽ウイルスとして、ＳＣ２のＳタンパク質を提示し、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）－ＺｓＧｒｅｅｎがレポーター遺伝子を発現しているレンチ偽ウイルスを使用して、抗体の中和効果を試験した。本発明者らは、最初にスパイク－レンチ偽ウイルスの特異性を、ヒトＡＣＥ２受容体を発現する細胞へのそれらの感染力について試験した。本発明者らは、同じ力価のウイルスを対照細胞及びＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２）細胞に感染させ、伝達７２時間後にＢＬＩを使用して感染力を評価した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞内への偽ウイルスの選択的な伝達を観察し、それらを、様々な条件にある中和抗体の存在下で、ＳＣ２の感染力を模倣するのに適したモデルとして確立した（図１３Ａ）。偽ウイルスをその選択性について確認した後、本発明者らは、ウイルスを、ＤＮＡワクチン送達後の様々な時点に収集したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲ）由来の血清と共に使用して、中和抗体効果を評価した。本発明者らは、商業的供給源から得た検証済み中和抗体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体、キメラＭａｂ［ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ］）を陽性対照として使用し、一方、対照ＤＮＡで処置したマウスから収集された血清を陰性対照として使用した。様々な希釈率の血清／Ａｂを偽ウイルス（５×１０６個のウイルス粒子）と共に５０μＬの無血清培地中で１時間インキュベートし、５０μＬの２×培地と混合することによって細胞（９６ウェルプレート中で０．５×１０４細胞／ウェル）に添加した。細胞をさらに６０時間インキュベートし、１００μｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン（Ｄ－Ｌｕｃ）を添加した後に、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステムを使用して、ＢＬＩに使用した。Ｗｕｈａｎ株のＡｕＮＳ－キトサン－ＳＣ２－スパイクタンパク質で免疫処置されたマウス由来の抗体は、同じ株のＳタンパク質をコードするルシフェラーゼ発現ＳＣ２偽ウイルスを中和し、これは、ＦＬｕｃシグナルの減衰に反映された。ＺｓＧｒｅｅｎベースのＦＡＣＳ分析を使用して、抗体価の時間依存的な変動も測定したところ、この変動は、ＢＬＩで観察された傾向と良好に相関した（図１３Ｂ～１３Ｄ）。３週目にワクチン接種されたマウスから収集された血清の存在下にあるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞における偽ウイルスで伝達されたＺｓＧｒｅｅｎ発現のヒストグラムが、低い方の端に向かって完全に移動し、偽ウイルス伝達を受けなかった対照細胞のものとオーバーラップした。本発明者らの発見は、ワクチン接種されたマウスで生成した高力価の抗ＳＣ２ Ｓ抗原特異的中和抗体の存在を示した。これは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞におけるＳＣ２偽ウイルスの感染を完全に防止し得る。
送達されたＤＮＡワクチンによる抗体誘導の良好な評価の後に、本発明者らは、中和アッセイ（ＢＥＩ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ）のための偽ウイルスとして、ＳＣ２のＳタンパク質を提示し、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）－ＺｓＧｒｅｅｎがレポーター遺伝子を発現しているレンチ偽ウイルスを使用して、抗体の中和効果を試験した。本発明者らは、最初にスパイク－レンチ偽ウイルスの特異性を、ヒトＡＣＥ２受容体を発現する細胞へのそれらの感染力について試験した。本発明者らは、同じ力価のウイルスを対照細胞及びＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２）細胞に感染させ、伝達７２時間後にＢＬＩを使用して感染力を評価した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞内への偽ウイルスの選択的な伝達を観察し、それらを、様々な条件にある中和抗体の存在下で、ＳＣ２の感染力を模倣するのに適したモデルとして確立した（図１３Ａ）。偽ウイルスをその選択性について確認した後、本発明者らは、ウイルスを、ＤＮＡワクチン送達後の様々な時点に収集したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲ）由来の血清と共に使用して、中和抗体効果を評価した。本発明者らは、商業的供給源から得た検証済み中和抗体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体、キメラＭａｂ［ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ］）を陽性対照として使用し、一方、対照ＤＮＡで処置したマウスから収集された血清を陰性対照として使用した。様々な希釈率の血清／Ａｂを偽ウイルス（５×１０６個のウイルス粒子）と共に５０μＬの無血清培地中で１時間インキュベートし、５０μＬの２×培地と混合することによって細胞（９６ウェルプレート中で０．５×１０４細胞／ウェル）に添加した。細胞をさらに６０時間インキュベートし、１００μｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン（Ｄ－Ｌｕｃ）を添加した後に、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステムを使用して、ＢＬＩに使用した。Ｗｕｈａｎ株のＡｕＮＳ－キトサン－ＳＣ２－スパイクタンパク質で免疫処置されたマウス由来の抗体は、同じ株のＳタンパク質をコードするルシフェラーゼ発現ＳＣ２偽ウイルスを中和し、これは、ＦＬｕｃシグナルの減衰に反映された。ＺｓＧｒｅｅｎベースのＦＡＣＳ分析を使用して、抗体価の時間依存的な変動も測定したところ、この変動は、ＢＬＩで観察された傾向と良好に相関した（図１３Ｂ～１３Ｄ）。３週目にワクチン接種されたマウスから収集された血清の存在下にあるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞における偽ウイルスで伝達されたＺｓＧｒｅｅｎ発現のヒストグラムが、低い方の端に向かって完全に移動し、偽ウイルス伝達を受けなかった対照細胞のものとオーバーラップした。本発明者らの発見は、ワクチン接種されたマウスで生成した高力価の抗ＳＣ２ Ｓ抗原特異的中和抗体の存在を示した。これは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞におけるＳＣ２偽ウイルスの感染を完全に防止し得る。
【0283】
ＡｕＮＳ－キトサンを使用した、ＳＣ２のＳタンパク質を発現するＤＮＡワクチンの鼻腔内送達は、ＳＣ２の様々なバリアントに対して有効な中和抗体の効率的産生を誘導した。
【0284】
ＳＣ２の新興突然変異バリアントに対してワクチン接種されたマウスで生成された中和抗体の有効性を調査するために、本発明者らは、Ｗｕｈａｎ株のＳタンパク質、Ｄ６１４Ｇ突然変異体、及び南アフリカバリアント（ＳＣ２－ＳＡ突然変異体）４０を有するＳＣ２偽ウイルスに対してワクチン接種されたマウスの血清の感染力阻害を評価した。本発明者らは、ＤＮＡワクチンで処置されたマウスから収集された血清による、用量依存性の中和効果を観察し、感染力の相対阻害として結果を表した（図１３Ｅ～１３Ｇ）。対照ＤＮＡで処置したマウスから収集された血清の存在下で偽ウイルスで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞は、１００％の感染力を有し、対照として働いた。対照ＤＮＡで処置されたマウス血清におけるＳＣ２ Ｓ抗原特異的抗体の非存在下で、偽ウイルス感染力のレベルは、血清の非存在下で偽ウイルスを使用して形質導入された細胞のものと類似していた。本発明者らは、ブースター用量投与の後に達成した抗ＳＣ２抗体のピーク力価を有する、ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清を、中和アッセイを評価するために使用した。この血清は、研究の１８週目に収集した血清に対応した。本発明者らは、様々な希釈率の血清を使用して、血清中の抗体価と、偽ウイルスの感染力の相関関係を研究し、商業的抗ＳＣ２抗体のものと比較した。本発明者らは、用量依存性（血清希釈率）の感染力減衰を観察し、１：５０の血清希釈では、本発明者らは、感染力のほぼ完全な阻害を見出した。これは、濃度４μｇ／ｍｌの商業的抗体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体、キメラＭＡｂ）で達成されるものとほとんど同様であった。これらの傾向は、高い方の血清希釈率での阻害についてわずかな相違があった、ＳＣ２ Ｓタンパク質の様々なバリアント（すなわち、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ、ＳＣ２－ＳＡ突然変異体、及びＳＣ２－Ｄ６１４Ｇ突然変異体）について操作された３株の偽ウイルス全てで一貫していた。１：５０の血清希釈率では、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ偽ウイルス及びＳＣ２ Ｄ６１４Ｇ突然変異バリアントの両方の感染力がそれぞれ３８％±２２％及び３８％±５％に減衰し、一方、ＳＣ２－ＳＡ突然変異バリアントについては、感染力が若干６７％±７％まで低下した。高い方の血清希釈率におけるこれらの多様性にもかかわらず、本発明者らがアッセイに１：１０の血清希釈率を使用したときには、３つのバリアント全ての感染力が完全に阻害された。これは、新興突然変異体バリアントに対するこのＤＮＡワクチン接種アプローチの有効性を示している（図１３Ｅ～１３Ｇ）。
【0285】
ＡｕＮＳ－キトサンを使用したＳＣ２ Ｓタンパク質を発現するＤＮＡワクチンの鼻腔内送達は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスの細胞性免疫を効果的に誘導した。
【0286】
細胞性免疫応答は、ウイルス感染と戦う上で重要な役割を果たしている４１。それは、それが感染制御をもたらすという点で抗体（液性）応答と基本的に異なるＴ細胞応答を含む。細胞性免疫は、抗原送達に応答して、成熟Ｔ細胞、マクロファージ、ＤＣ、ＮＫ細胞、及び放出されたサイトカインによって主として駆動される４２。ＩＮ ＤＮＡワクチン接種後の細胞性免疫の役割を推論するために、本発明者らは、対照ＤＮＡ及びＳＣ２のＳタンパク質をコードするＤＮＡを使用して、ＡｕＮＳ－キトサンＮＰを使用した送達を受けたマウスの肺、脾臓、胸腺、及びリンパ節から収集された白血球の免疫表現型検査を実施した。肺免疫システムに防御を与える主要免疫細胞サブセットには、ＡＭ、ＤＣ、Ｔヘルパー（ＴＨ）リンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ又はＴＣ）、メモリーリンパ球、ＮＫ細胞、及びＢ細胞が含まれる４３、４４。本発明者らは、４つの全ての試料源で９０％超の純度を有するＣＤ４５＋陽性集団を単離するのに成功した（図１６Ｂ～１６Ｅ）。
【0287】
肺及び脾臓におけるＳＣ２スパイクＤＮＡワクチン媒介の抗原プロセシング及び免疫細胞活性化
肺免疫の重要な細胞性媒介因子は、食細胞（ＡＭ、好中球、好酸球）及びＮＫ細胞から構成される４５。それらは、ＳＣ２スパイク抗原発現細胞を認識し、中和する能力を有する。循環ナイーブＴリンパ球が細胞性免疫の主要応答者であるが、それらは、血流を離れ、末梢組織内に移動する能力が限定的である。したがって、肺におけるＳＣ２の適応免疫の誘導に先立つ重要な要件は、流入領域リンパ節のＴ細胞への初期曝露部位からの抗原輸送である４６。輸入リンパ管を介したそのような抗原輸送は、肺胞ＤＣの専門機能である４７。本発明者らは、ＳＣ２スパイクでワクチン接種されたマウスの肺の本発明者らの免疫組織化学分析における、これらの初期相互作用イベントを観察した。
肺免疫の重要な細胞性媒介因子は、食細胞（ＡＭ、好中球、好酸球）及びＮＫ細胞から構成される４５。それらは、ＳＣ２スパイク抗原発現細胞を認識し、中和する能力を有する。循環ナイーブＴリンパ球が細胞性免疫の主要応答者であるが、それらは、血流を離れ、末梢組織内に移動する能力が限定的である。したがって、肺におけるＳＣ２の適応免疫の誘導に先立つ重要な要件は、流入領域リンパ節のＴ細胞への初期曝露部位からの抗原輸送である４６。輸入リンパ管を介したそのような抗原輸送は、肺胞ＤＣの専門機能である４７。本発明者らは、ＳＣ２スパイクでワクチン接種されたマウスの肺の本発明者らの免疫組織化学分析における、これらの初期相互作用イベントを観察した。
【0288】
免疫細胞及びＳタンパク質の検出のために染色された肺組織は、気管支及び肺胞を裏打ちする内皮細胞内のトランスフェクトされたＳタンパク質の発現を示し、それらは、ＤＣによって選択的に認識される。これらのスパイクＤＮＡ ＮＰの一部も、上皮ジャンクションを通したそれらの伸展から、他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、ＤＣによって直接的に捕捉され、内在化される４８。これらのＳ抗原によってプライミングされたＤＣは、抗原をプロセシングし、リンパ節に流入して（図１８）、細胞性免疫応答の他のコンポーネントをプライミングして、肺にホーミングする。ＤＣは、近位気道におけるその高密度の存在及びそれら固有の高い食作用能力により、内皮細胞によって発現されたＳ抗原を捕捉するための完全なポジションを占めている。それらの戦略的分布、並びに抗原を捕捉及びプロセシングし、リンパ節でそれらをＴ細胞に提示するそれらの能力の全てが、ＤＣを、肺及び他の粘膜表面における主要なＡＰＣにしている４９。
【0289】
例えば、肺におけるスパイク発現及び免疫提示の分析は、気道上皮に存在する免疫監視ＤＣとＳＰＫ抗原を発現する細胞の相互作用が、ＮＫ細胞に対するプロフェッショナル抗原提示細胞としてのそれらの役割を果たし、Ｔ細胞応答を刺激することを示している（データは示されていない）。貪食肺胞マクロファージは抗原提示でもＤＣを補完するが、それらには共刺激分子が無いので、それは比較的に低いレベルのものである。
【0290】
Ｓ処置されたマウスの肺における本発明者らのリンパ球ＦＡＣＳ分析結果は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの増加（７．５％）を明らかにした。これには、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサージ（５．５％）も伴っていた。これは、リンパ節から肺内へのＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞）の到着を説明する（図１６Ｃ）。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、ウイルス排除を促進し、Ｔヘルパータイプ２（Ｔｈ２）応答をＳ抗原に方向づける、ＣＤ８＋Ｔ細胞への交差抗原提示のための肺内主要ＤＣサブセットを表す５０。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、主としてＡＰＣに位置するＭＨＣ－ＩＩに提示される抗原に応答する。
【0291】
Ｓ抗原への真実味のある曝露は、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞増殖及びエフェクター細胞、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７、又はＴｒｅｇ表現型への分化を誘導することができ、一部は、抗原再曝露の際に迅速に再活性化する記憶細胞にさらに分化する５１。したがって、本発明者らは、エフェクター機能及び記憶機能についてだけでなく、脾臓及びリンパ節の胚中心におけるヘルパーＴ細胞としてのそれらの役割についても、Ｓワクチン接種されたマウスの肺でＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を評価した５２。本発明者らは、Ｓ処置したマウスにおけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のレベルがわずかに４．２％増加することを認めた。これは、常在エフェクター記憶細胞として肺胞に残っている生存Ｔ細胞の存在を真実味をもって説明する。ひとたび活性化されれば、ヘルパーＴ細胞は、リンパ節（Ｂ細胞域）でＢ細胞を活性化し、それらを体循環を介して肺に向け直す５３。この経路と一致して、ＳＰＫ処置されたマウスは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団における６．１％の増加を表した（図１６Ｂ～１６Ｅ）。これらの肺常在性Ｂ細胞が適応免疫の主要コンポーネントを表し、ＳＣ２ワクチンに対する抗原特異的な免疫グロブリンを説明するので、肺におけるＢ細胞の増加が全身性ＳＣ２特異的ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＧ免疫グロブリン応答の生成と相関することを確信をもって推論することができる（図１１Ｅ～１１Ｇ）。
【0292】
ＤＣ及びＴ細胞に加えて、常在性ＡＭが、肺胞内腔中の細胞の＞９０％を構成し、肺胞壁中のＤＣと間接的に接触しており、これがＤＣによるＳ抗原提示の応答をうながす５４。本発明者らは、Ｓワクチン接種されたマウスの肺におけるＣＤ１１ｂ＋マクロファージレベルの顕著な増加（１０．３％）も観察した。これは、細胞性免疫応答を用意するそれらの役割を示している。内皮細胞と近接して存在するこれらの常在性ＡＭとして、それらは、肺胞内腔に樹状シュノーケルを伸長する従来のＤＣとも接触する。
【0293】
例えば、未処置マウス、ｐｃＤＮＡ処置マウス、及びＳＰＫ ＤＮＡワクチンでトランスフェクトされたマウスの肺における単球、ＮＫ細胞、及びＤＣの分布の分析は、肺胞及び気管支におけるＤＣの存在の増加を示している（データは示されていない）。これは、ＳＰＫ抗原の認識及びプロセシングにおける、組織常在性肺胞ＤＣの役割を補完する循環ＤＣの到着を示す。単球及び肺胞マクロファージは、肺胞に動員され、Ｓタンパク質を発現する気管支上皮と密接に接して、肺への追加の白血球サブセットの動員を媒介する他のクラスの常在性肺貪食細胞である。さらに、ＳＰＫワクチンのＩＮ投与の際の、肺におけるＤＣ及びＴ細胞応答におけるＮＫ細胞の役割の評価は、ＳＰＫワクチン接種された肺における抹梢の未熟な局所的ＤＣの増加及びそれらの成熟並びに流入領域リンパ節への移動がリンパ節からのＴ細胞応答（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）を駆動することを示している（データは示されていない）。このエフェクターＴ応答の結果として、肺でＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が増加する。一方、自然免疫システムにおける古典的エフェクター細胞すなわちＮＫ細胞の増加は、Ｔ細胞媒介のＳＰＫ免疫原性を補完し、ＤＣ機能を調節して、Ｔ細胞応答に影響を与えることによって、炎症及び組織損傷を緩和する際の防護的役割も果たす。
【0294】
循環から、ＤＣは、白色髄と赤色髄（ＲＰ）の境界にある辺縁帯（ＭＺ）洞で脾臓に入り、応答を開始することができる。本発明者らは、Ｓワクチン接種されたマウスの脾臓組織診断で、辺縁帯からＧＣ内へのＤＣ移動のそのようなイベントを観察した。これは、ｐＤＮＡ処置されたマウスの脾臓と明らかな対比を示した。白色髄（ＷＰ）におけるＤＣの存在の増加は、同時膵臓腎臓（ＳＰＫ）抗原に対する脾臓からの適応免疫応答を誘発する５５。したがって、ＩＮ免疫処置は、ＷＰのＴ細胞域内への集団ＤＣ移動を誘導する。（図１６Ｂ～１６Ｅ）。
【0295】
例えば、脾臓内免疫細胞の特性分析（データは示されていない）は、ＤＣサブセットの差示的な脾臓内移動が適応免疫を調整することを示している。脾臓は、機能及び構造によって赤色髄（ＲＰ）と白色髄（ＷＰ）とに分けられ、これらの２つの領域の間に辺縁帯（ＭＺ）がある。スパイクワクチン接種された肺から到着するｃＤＣは、Ｔ細胞及びＢ細胞応答を調節する脾臓内の免疫細胞の動的アーキテクチャを調節する。Ｓ抗原に対する自然免疫応答による活性化の際に、ｃＤＣは脾臓の「辺縁組織」（ＭＺ及びＲＰ）から脾臓（ＷＰ）の「リンパ節」、すなわち脾臓Ｔ細胞域に移動する。辺縁帯から胚中心へのＤＣ移動は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答のいずれかの選択的誘導をもたらす。
【0296】
同様に、ＳＣ２スパイクＤＮＡワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞のＦＡＣＳ分析も、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の７．４％増加を示した。これは、Ｂ細胞集団の６．３１％増加を伴った。これらの結果は、辺縁帯からＧＣへのｃＤＣ（循環ＤＣ）移動の組織学的証拠と良く相関している（図１６Ｂ）。
【0297】
ワクチン接種されたマウスの脾臓内のＤＣ及びＢリンパ球の同時サージは、ＤＣが、ナイーブＢリンパ球へのＳＣ２抗原の輸送及び移動に関与し、この養子抗原移動の際に、Ｂ細胞がＳＣ２特異的な抗体応答を誘発することを示唆した（図１１Ｅ～１１Ｇ）５６、５７。一方、ＳＣ２は、ｃＤＣとＢリンパ球の相互作用を活性化し、後続のＴ細胞依存応答のプライミングも行い、この推論と一致して、ワクチン接種されたマウスは、ＣＤ４－ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞の約７．９％の増加を表した（図１６Ｂ）。
【0298】
ＤＣなどのプロフェッショナルＡＰＣと並んで、他のＡＰＣ（マクロファージ）も、胚中心Ｂ細胞応答のプロモーターとして積極的に関与している５８。脾臓マクロファージは、白色髄、赤色髄、及び辺縁帯に分けられ、それらのそれぞれが免疫応答で明確な役割を果たしている。ＳＣ２の到着は、辺縁帯及び白色髄の戦略的位置でマクロファージを活性化した。これは、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方と相互作用するためにそれらを近接して配置して、ＳＣ２免疫応答に参加する（データは示されていない）。重要なことに、辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞は、骨髄細胞、樹状細胞、及び間質細胞と共に、辺縁帯の主要構成要素である。これらのＭＺ Ｂ細胞は、Ｓ抗原に対するＩｇＭ抗体の主な産生細胞である。ＭＺ Ｂ細胞の濃縮及び可動化は、脾臓免疫応答の特徴を示す。
【0299】
同様に、本発明者らは、ＳＣ２ワクチン接種されたマウスの脾臓の白色髄及び辺縁帯におけるマクロファージ及び単球の有病率の増加を観察した。これは、ＳＣ２ワクチン接種されたＢＡＬＢｃマウスの脾臓における、Ｂ細胞の６．３％増加を伴う１０．３％のＣＤ１１ｂ＋マクロファージの同時サージと良好に相関した（図１６Ｂ）。
【0300】
最後に、本発明者らは、ＤＮＡワクチンの反復投与で処置されたマウスの肺及び対照における任意の毒性効果の存在について評価した（Ｎ＝３）。ＡｕＮＳ－キトサンを使用して送達されたｐＤＮＡ又はｐＤＮＡ－ＳＣ２スパイクで処置したマウスから収集された肺組織及び脾臓組織の組織学的切片のヘマトキシリン－エオジン染色をこれらの毒物学的な観察のために完成させた（データは示されていない）。本発明者らは、Ｓ ＤＮＡワクチンによってワクチン接種されたマウスの肺では、いかなる有意の組織損傷もないことを観察した。
【0301】
リンパ節におけるＳＣ２スパイクＤＮＡのワクチンで媒介された抗原プロセシング並びにＢ細胞及びＴ細胞活性化。
【0302】
リンパ節は、適応免疫を組織化するＴ細胞、Ｂ細胞、及びＡＰＣを収容する、免疫応答の決定的に重要な指令センターである５９。単球及びＤＣなどのＡＰＣは、ＡｕＮＳ－キトサンを使用したＤＮＡワクチンのＩＮ送達の際に、肺で発現されるＳ抗原を内在化し、ワクチンをリンパ節に物理的に運ぶことができる。この役割に加えて、リンパ節常在性ＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするための交差提示など、一部の組織常在性ＤＣには無い重要な機能を有する６０。肺におけるＤＣとＳタンパク質発現細胞の相互作用（データは示されていない）から明らかなように、これらのＤＣは、Ｓ抗原を捕捉し、それを短いペプチド断片にタンパク質分解し、これらのペプチドをクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子にローディングし、その後、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の表面に物理的に提示することが予測され得る６１。同時に、ＳＣ２スパイク抗原に遭遇したＡＰＣは、ナイーブヘルパーＴ細胞を活性化するために最も近いリンパ節に移動することが予測され得る。ひとたび活性化されれば、ヘルパーＴ細胞は、ＤＣ及びマクロファージによって提示された同じＳ抗原に遭遇したＢ細胞を活性化する６２。典型的なマクロファージとは異なり、被膜下洞マクロファージは、抗原をＢ細胞にリレーし、サイトカインシグナル伝達カスケードを生成して、ＤＣ、好中球、ＮＫ細胞の流入を引き起こすか、いくつかの状態では、Ｔ細胞に抗原を提示することによって、標的特異的免疫応答を様々なリンパ媒介病原体に方向づけ、ＳＣ２ワクチン接種したマウスは、そのような被膜下洞マクロファージ及びＤＣの存在を示した（データは示されていない）６３。Ｂ細胞の活性化は、Ｓ抗原がＢ細胞受容体に結合することによって誘発されることが多く、これは、リンパ節内のＡＰＣの細胞膜上に捕捉されたＳ抗原のＢ細胞認識を介して起こる可能性がある６４。本発明者らがＳ特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ）の一貫した用量依存性サージをワクチン接種されたマウスで見ることができたので、これらのマウスにおけるＢ細胞が、送達されたＳ ＤＮＡワクチンで活性化され、抗原特異応答を組織化したことは確かである。この概念に鑑みて、本発明者らは、特にＢ細胞の成熟及び活性化におけるそれらの決定的な役割のため、このＢ細胞応答を開始する際のリンパ節の役割をさらに調査した。組織学染色の本発明者らの結果は、流入領域リンパ節が、スパイク抗原特異的な免疫応答を生成するために、スパイクで活性されたｃＤＣ、ＮＫ細胞、及びマクロファージを、Ｂ細胞成熟中心、すなわち胚中心（ＧＣ）から集めることを示している（データは示されていない）。ワクチン接種されたマウスのリンパ節は、広範なＢ細胞増殖を伴う多巣性胚中心を有する反応性リンパ節の特徴を表す。ＧＣ内の指状嵌入濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）の存在も、ＧＣ内のＳ特異的Ｂ細胞分類を確認し、ワクチン接種されたマウスにおける免疫グロブリンレベル（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ）の急速なサージを説明する。濾胞間腔内への辺縁帯を通り抜けるＢ細胞移動のイベントは、形質芽細胞と呼ばれる短命な抗体産生細胞を表す。濾胞間域は、適切なＴ細胞応答及びＢ細胞成熟をプライミングする。
【0303】
リンパ節内のそのような特徴的なＳ特異的免疫応答をＳＣ２ＤＮＡワクチンが誘発できるかどうか調査するために、本発明者らは、対照であるｐＤＮＡ処置されたマウスと共に、ＳＣ２ ＤＮＡワクチンを使用して処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから節を採取し（各状態につきＮ＝３動物）、免疫細胞集団の分布を特定するために、ＦＡＣＳを使用して分析した。節は、プロフェッショナルＡＰＣ、特にＤＣによって提示されるＳ抗原で細胞傷害性Ｔ細胞が訓練される場所でもある６５。本発明者らのＦＡＣＳ分析結果は、ｐＤＮＡワクチン接種されたマウスのものと比較して、Ｓワクチン接種されたマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のこの調節を示した（図１６Ｂ～１６Ｅ）。ワクチン接種されたマウスの肺の組織検査は、Ｓ抗原の良好な送達及び発現を示し、ＤＣとこれらのＳ発現細胞の相互作用も捕捉した（データは示されていない）。
【0304】
肺におけるこれらの移動性ＤＣは、抗原をリンパ節常在性ＤＣに移すことができる６６。これらのＳ抗原認識イベントは、自然免疫システムパターン認識受容体又はサイトカイン及びＳ抗原媒介免疫に応答してリンパ節で誘導されるケモカインを活性化するように免疫応答を抗原に向ける。リンパ節内のＢ細胞及びＴ細胞両方のＦＡＣＳ分析は、処置されたマウスにおけるそれらのＳ抗原特異的増強（すなわち、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の１８．６％増加及びＣＤ４＋Ｔ細胞の６．３％増加）を明らかにした。他の前臨床モデルにおける免疫処置研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を起こすのに大量の抗原が必要であり６６、一方、本発明者らのアプローチにおいて、ＤＣによる効率的な抗原プロセシングと及び交差提示がＩＮ経路で実現し、これが、リンパ節からのＴ細胞免疫応答におけるサージももたらしたことを示唆している。より高いレベルの利用可能な抗原及び濾胞ヘルパーＴ細胞のより大きな産生がリンパ節ＧＣ応答を支配することができる。
【0305】
ＳＣ２－スパイクを使用してワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲマウスのリンパ節の組織検査は、抗原活性化の特徴を示した。Ｔ細胞及びＢ細胞は、Ｔ細胞が主として節の深い方にある傍皮質にあり、Ｂ細胞が濾胞にあるという特定の位置に区画化されていた（データは示されていない）。リンパ又はリンパ移動性ＡＰＣによって節に運ばれるＳ抗原は、流入領域リンパ節の被膜下洞に到着する。Ｓ抗原に結合することによる初期シグナル伝達を受けたＢ細胞は、濾胞（ＧＣ）の専門化した小領域に入る。Ｂ細胞のそのような動的な可動化は、対照マウスと比較した場合、ワクチン接種されたマウスで明白であった（データは示されていない）６７。ＧＣは、Ｔ細胞依存性抗体応答中に二次リンパ組織のＢ細胞濾胞で発生する６８。最初にＧＣになるＢ細胞は、濾胞の外、すなわち指状突起細胞及びヘルパーＴ細胞を伴うＴ細胞リッチ域で活性化されなければならない６９。明調部内の濾胞ＤＣ（ＦＤＣ）は、Ｆｃ及び補体受容体を介してＳ抗原を捕捉し、保持し、それらを長期間にわたって局所のＢ細胞に提示できることが予測されている７０、７１。ＧＣ内で、Ｂ細胞は、プロセシングされ、クラスＩＩ ＭＨＣ分子上に提示されている抗原をＦＤＣから取得することができる。活性化Ｂ細胞は、ＧＣを出て、形質芽細胞と呼ばれる短命な抗体産生細胞になることができる。組織学的染色（データは示されていない）から示された結果は、ＳＣ２ ＤＮＡワクチンに応答した抗体産生形質芽細胞の移動に関する証拠として、ＧＣから明調部内へのＢ細胞の移動を示している。リンパ節に直接的に蓄積される抗原の量は、免疫処置されたリンパ節で発生する濾胞ヘルパーＴ細胞及びＧＣ Ｂ細胞の数と相関する７２。したがって、濾胞ＤＣへのＳ抗原送達の効率も、免疫処置に対する応答に影響を与えることになる。ＦＤＣは、いかなる二次リンパ器官の濾胞内に、Ｂ細胞と共に位置する７３。ＦＤＣは、適応免疫応答中における、高親和性形質細胞、すなわちメモリーＢリンパ球の産生及び選択に関する非常に重要な機能を有する７４。ＦＤＣの１つの主要な特性は、抗原を捕捉し、免疫複合体として刺激の強い方式でそれを増殖中のＢ細胞に提示するそれらの能力である。リンパ節内には、ＦＤＣを含む間質細胞のネットワークがある。ＦＤＣは、最初、「抗原保持細網細胞」として同定された７５。続いて、ＦＤＣは、長期間にわたって抗原を保持するそれらの固有の能力により認識された。ＦＤＣのこの特性は、ＧＣ形成及び長期の免疫記憶が含まれるいくつかの免疫機能に決定的に重要である７６。本発明者らのリンパ節組織検査は、Ｂ細胞濾胞（ＢＣＦ）内のそのようなＦＤＣの存在を示しており、Ｔ細胞依存性抗体応答の結果として、Ｂ細胞濾胞でＧＣが発生する。活性化されたＴ細胞及びＡＰＣは、鼻腔リンパの経路に沿って流出し、最終的に頸部リンパ節に接近する７７。したがって、本発明者らは、Ｂ細胞がＧＣの中心にきて、ＤＣがこれらのＧＣ内のＢ細胞の近傍に存在するような、頸部リンパ節の完全なリモデリングを観察した（データは示されていない）。全体的に、本発明者らの結果は、ＡｕＮＳ－キトサンを使用したＤＮＡワクチンの送達により発現されたＳ抗原がリンパ節内の効果的な細胞性免疫を示すことを確認する。
【0306】
ＩＦＮγが病原体を認識し、除去する上で決定的に重要な役割を有するという事実を考慮して、それは、ワクチン応答の予後マーカーとして特定されている。Ｉ型ＩＦＮは、Ｓタンパク質発現から、ＤＣ活性化、Ｔ細胞分化まで及ぶＳＣ２ワクチン接種に至る免疫応答のほとんどあらゆるステップに影響を与えることができる多面的な抗ウイルス性サイトカインである。驚くようなことではないが、Ｉ型ＩＦＮは、ＳＣ２ワクチンに対するＴ細胞及びＢ細胞応答の中心的な媒介因子であることが見出されている。本発明者らは、リンパ節内及び血液中のＴ細胞によるＩＮＦγ発現増加にも気付いた（図１７Ａ～１７Ｅ）７８。ＩＦＮγは、自然免疫システム及び適応免疫システム両方のシグネチャーサイトカインであり、ＩＦＮγを発現する脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、ｐＤＮＡ対照ベクターで処置されたマウスではなく、ＳＣ２ワクチン接種されたマウスでのみ明白であった。
【0307】
ＡｕＮＳ－キトサンはＩＮ送達の際にマウスの肺で、生物発光イメージングを使用して測定されたＦＬｕｃ ｍＲＮＡのロバストな送達を示した。
【0308】
ＤＮＡワクチンのＩＮ送達が有意な発現を実現し、肺免疫応答を誘導するのに成功したので、本発明者らは、細胞内でＡｕＮＳ－キトサンを使用して、ＢＬＩを使用してマウスでＩＮ送達した際に、送達されたｍＲＮＡの安定性及び発現をさらに評価した。本発明者らは、この原理証明研究のコンポーネントのため、ＦＬｕｃレポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡを使用した。様々なｍＲＮＡ濃度（５０、１００、及び２００ｎｇ）でトランスフェクトされた最適Ｎ／Ｐ比の複合体を使用したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞及びＡ５４９細胞のインビトロ結果は、両細胞型における用量依存的なルシフェラーゼ発現を示した（図１４Ａ～１４Ｂ）。本発明者らは、マウスのＩＮ送達のために最適なＡｕＮＳ－キトサン－ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ複合体を、各鼻孔に５μｌのＮＰ複合体を４回（各用量あたり合計２０μｌ、２μｇのｍＲＮＡ等価物）使用した。本発明者らは、処置及び対照のためにそれぞれ３頭のマウスを使用した。本発明者らは、ＡｕＮＳ－キトサン－ｍＲＮＡを送達し、送達後２４時間毎にＢＬＩを取得し、３日間毎日投与を続けた。最終用量の３日後に、マウスを、インビボ生物発光シグナルのために画像化し、その後、組織内のエクスビボ体内分布のために屠殺した。マウスは、肺における強いＢＬＩシグナルを明らかにした（図１４Ｃ）。エクスビボ分析（肺、脾臓、肝臓、気管、及び腎臓）は、肺と気管気管支の接合部で強いＢＬＩシグナルを示した。脾臓を含めた他の器官にはシグナルが無かった（図１４Ｄ）。これらの発見は、合成ｍＲＮＡのインビトロ及びインビボの送達についてのＡｕＮＳ－キトサンの効率を明らかに支持し、インビボ適用についてのｍＲＮＡの安定性及び機能的効率も支持した。
【0309】
結論
本発明者らは、抗原としてそのＳタンパク質をコードするＤＮＡを使用した新規なＳＣ２ワクチンのＩＮ送達の潜在的利点を評価した。ＡｕＮＳ－キトサンＮＰを使用したＤＮＡワクチンの送達は、マウスの呼吸粘膜及び肺におけるこの抗原の良好な発現をもたらし、これが肺への抗原提示ＤＣの動員及び液性抗体応答の強化をもたらす。抗体応答は、３用量のＤＮＡワクチンのＩＮ送達後、１週間という早さで発達する。抗体レベルは、２つの異なるマウスモデル（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲ）で実証されたように、有意な衰弱なしに数週間一貫して上昇した。抗体応答は、高レベルのＩｇＧ及びＩｇＡをもたらし、ＳＣ２の様々なスパイクバリアント（Ｗｕｈａｎ、Ｄ６１４Ｇ、及びＳＡ突然変異体）を発現する偽ウイルスに対する強い中和効果を示す。免疫染色ベースのＦＡＣＳ及び共焦点顕微鏡法を使用した、細胞性免疫応答についての追加の評価は、肺及びリンパ節におけるＴ細胞及びＢ細胞応答の有効な活性化を示し、これは、感染症に対して通常観察される免疫応答に類似したものである。本発明者らの発見は、ＤＮＡ及び合成ｍＲＮＡを送達するための効率的なインビトロ及びインビボナノ製剤としてＡｕＮＳ－キトサンを使用することの長所及び将来のｍＲＮＡワクチン開発及び適用のための機能的インビボトランスフェクションのために核酸を安定化することにおけるその役割にも光をあてる。この原理証明研究は、強い粘膜免疫応答をもたらし、ＳＣ２の様々な抗原（Ｎ、Ｅ、Ｍ、及びＳタンパク質）をコードするｍＲＮＡワクチンを使用するためのロードマップを提供するこのＩＮ ＳＣ２ＤＮＡワクチンの能力に光をあてる。これは、世界中に分布し、連続的に進化している多数のＳＣ２バリアントと戦うための持続性の広範囲抗体応答をもたらす可能性がある。
本発明者らは、抗原としてそのＳタンパク質をコードするＤＮＡを使用した新規なＳＣ２ワクチンのＩＮ送達の潜在的利点を評価した。ＡｕＮＳ－キトサンＮＰを使用したＤＮＡワクチンの送達は、マウスの呼吸粘膜及び肺におけるこの抗原の良好な発現をもたらし、これが肺への抗原提示ＤＣの動員及び液性抗体応答の強化をもたらす。抗体応答は、３用量のＤＮＡワクチンのＩＮ送達後、１週間という早さで発達する。抗体レベルは、２つの異なるマウスモデル（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＲ）で実証されたように、有意な衰弱なしに数週間一貫して上昇した。抗体応答は、高レベルのＩｇＧ及びＩｇＡをもたらし、ＳＣ２の様々なスパイクバリアント（Ｗｕｈａｎ、Ｄ６１４Ｇ、及びＳＡ突然変異体）を発現する偽ウイルスに対する強い中和効果を示す。免疫染色ベースのＦＡＣＳ及び共焦点顕微鏡法を使用した、細胞性免疫応答についての追加の評価は、肺及びリンパ節におけるＴ細胞及びＢ細胞応答の有効な活性化を示し、これは、感染症に対して通常観察される免疫応答に類似したものである。本発明者らの発見は、ＤＮＡ及び合成ｍＲＮＡを送達するための効率的なインビトロ及びインビボナノ製剤としてＡｕＮＳ－キトサンを使用することの長所及び将来のｍＲＮＡワクチン開発及び適用のための機能的インビボトランスフェクションのために核酸を安定化することにおけるその役割にも光をあてる。この原理証明研究は、強い粘膜免疫応答をもたらし、ＳＣ２の様々な抗原（Ｎ、Ｅ、Ｍ、及びＳタンパク質）をコードするｍＲＮＡワクチンを使用するためのロードマップを提供するこのＩＮ ＳＣ２ＤＮＡワクチンの能力に光をあてる。これは、世界中に分布し、連続的に進化している多数のＳＣ２バリアントと戦うための持続性の広範囲抗体応答をもたらす可能性がある。
【0310】
材料及び方法
材料
本発明者らは、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、四塩化金酸、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アスコルビン酸（ＡＡ）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、塩化金（ＩＩＩ）三水和物（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ）、Ｌ（＋）アスコルビン酸（ＡＡ）、クエン酸三ナトリウム二水和物、１Ｎ塩酸溶液（ＨＣｌ）、キトサン、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）から利用可能な最も高い純度で購入した。本発明者らは、全ての調製に再蒸留水を使用した。炭素コーティングされた銅のＴＥＭ格子は、ＶＷＲ（米国ペンシルベニア州Ｒａｄｎｏｒ）から得た。本発明者らは、金ＮＰの合成に使用するガラス器具を王水中で３０分間前処理し、その後、３回の超音波処理（３分）の下、再蒸留水で洗浄及び浄化した。
材料
本発明者らは、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、四塩化金酸、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アスコルビン酸（ＡＡ）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、塩化金（ＩＩＩ）三水和物（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ）、Ｌ（＋）アスコルビン酸（ＡＡ）、クエン酸三ナトリウム二水和物、１Ｎ塩酸溶液（ＨＣｌ）、キトサン、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）から利用可能な最も高い純度で購入した。本発明者らは、全ての調製に再蒸留水を使用した。炭素コーティングされた銅のＴＥＭ格子は、ＶＷＲ（米国ペンシルベニア州Ｒａｄｎｏｒ）から得た。本発明者らは、金ＮＰの合成に使用するガラス器具を王水中で３０分間前処理し、その後、３回の超音波処理（３分）の下、再蒸留水で洗浄及び浄化した。
【0311】
方法
ＡｕＮＳの合成
本発明者らは、以前に報告されている金Ｎａｎｏｓｔａｒｓ合成手順の修飾されたシード支援成長２０を使用して、金Ｎａｎｏｓｔａｒオクタポッドを合成した。簡潔には、０．１５Ｍ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中、ＮａＢＨ４によってＡｕＣｌ４から金ナノシードを生成し、結果のコロイド金をＮａｎｏｓｔａｒ成長のシードとして使用した。水中に０．１Ｍ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び２５０μｌの０．００４Ｍ ＡｇＮＯ３を含有する５ｍＬの水溶液に５μｌのシード金ＮＰを添加した。その後、得られた混合物に約５ｍＬのＨＡｕＣｌ４（０．００１Ｍ）を補足し、７０℃で３０分間、撹拌した。全成分の均質溶解を完了した後に、本発明者らは、溶液温度を３７℃に低下し、４００μｌの０．０７８８Ｍアスコルビン酸水溶液を添加した。本発明者らは、水溶液を３０分間、撹拌し、０．６ｍＬの０．００１Ｍ ＮａＢＨ４溶液の予め氷冷した溶液をさらに滴加した。混合物を１０００ｒｐｍで絶え間無く撹拌し、均質な懸濁液を得た。この懸濁液は、その後非常に濃い緑色に変化し、この時点で、温度を約４℃まで低下させることによって反応を停止させた。結果の金Ｎａｎｏｓｔａｒｓを１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって分離した。これを、蒸留水で３回洗浄し、その後、さらなるインビトロ研究及びインビボ研究に使用する。
ＡｕＮＳの合成
本発明者らは、以前に報告されている金Ｎａｎｏｓｔａｒｓ合成手順の修飾されたシード支援成長２０を使用して、金Ｎａｎｏｓｔａｒオクタポッドを合成した。簡潔には、０．１５Ｍ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中、ＮａＢＨ４によってＡｕＣｌ４から金ナノシードを生成し、結果のコロイド金をＮａｎｏｓｔａｒ成長のシードとして使用した。水中に０．１Ｍ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び２５０μｌの０．００４Ｍ ＡｇＮＯ３を含有する５ｍＬの水溶液に５μｌのシード金ＮＰを添加した。その後、得られた混合物に約５ｍＬのＨＡｕＣｌ４（０．００１Ｍ）を補足し、７０℃で３０分間、撹拌した。全成分の均質溶解を完了した後に、本発明者らは、溶液温度を３７℃に低下し、４００μｌの０．０７８８Ｍアスコルビン酸水溶液を添加した。本発明者らは、水溶液を３０分間、撹拌し、０．６ｍＬの０．００１Ｍ ＮａＢＨ４溶液の予め氷冷した溶液をさらに滴加した。混合物を１０００ｒｐｍで絶え間無く撹拌し、均質な懸濁液を得た。この懸濁液は、その後非常に濃い緑色に変化し、この時点で、温度を約４℃まで低下させることによって反応を停止させた。結果の金Ｎａｎｏｓｔａｒｓを１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって分離した。これを、蒸留水で３回洗浄し、その後、さらなるインビトロ研究及びインビボ研究に使用する。
【0312】
ＳＣ２プラスミド又はｐｃＤＮＡローディングしたＡｕＮＳの製剤化。
【0313】
ＬＶ１－マイクロフルイディクスシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、米国マサチューセッツ州Ｗｅｓｔｗｏｏｄ）を３０，０００ｐｓｉで使用して、０．２％酢酸で溶解されたキトサンをマイクロ流動化した。本発明者らは、濃度０．５ｍｇ／ｍＬのキトサンの懸濁液を出口で抜き出し、ＡｕＮＳをコーティングするためにこれを使用した。本発明者らは、その後、可溶化したキトサンを４００μｌ（ストック－５ｍｇ／ｍＬ）のＡｕＮＳと共に２００ｒｐｍの回転インキュベーター内で、３０℃で終夜インキュベートした。共インキュベーションの前に、調製されたままのＡｕＮａｎｏｓｔａｒｓを短いプローブ超音波処理、すなわち、５秒の「Ｏｎ」振幅４０％で無菌再蒸留水中に分散させて、ＮＰの５ｍｇ／ｍＬ均一懸濁液を形成させた。終夜インキュベーションの後に、本発明者らは、反応混合物に１３，０００ｒｐｍで３０分間の遠心処理を施し、結果のペレットを、６００μｌという規定容量の無菌再蒸留水中に合わせてプールした。本発明者らは、ＤＥＰＣ水中に２００ｎｇ／μｌに希釈したストックＳＣ２プラスミド（２μｇ）を使用し、キトサンでキャッピングした漸増量のＡｕＮＳと複合体形成させ、その後、３７℃で１５分間インキュベートした。複合体を０．７のアガロースゲル上にローディングし、４０Ｖで４５分間の電気泳動を行った。泳動の後に、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋ゲルドキュメンテーションシステム（Ｂｉｏ Ｒａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）でゲルを画像化して、ＤＮＡ封入の程度をさらに定量化し、分析した。最適化したＳＣ２プラスミド又はｐｃＤＮＡローディングしたＡｕＮＳ－キトサンを後続のインビトロ及びインビボ研究に適合させた。プラスミドＤＮＡローディングした複合体を研究の各時点に２０μｌ用量で投与した。
【0314】
ナノ粒子特性分析
本発明者らは、合成手順中のＡｕＮＳ表面修飾の各ステップを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｚシステムにおける動的光散乱法（ＤＬＳ）を２５℃、９０°の散乱角で使用して、平均流体力学直径及びゼータ電位について特徴分析した。本発明者らは、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似法を使用して、ＡｕＮＳベースのＮＰのζ電位（表面電荷）を決定した。本発明者らは、試料をＰＢＳ中に調製し、脱イオン水で希釈して、粒子の表面電荷を正確に測定することができる低イオン強度条件下で測定が行われることを確実にした。本発明者らは、ＳＣ２プラスミドをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンの粒径及び形態を、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＦＥＩ－Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｆ２０ Ｘ－ＴＷＩＮ）を使用して特徴分析した。ＯＲＩＵＳ ＣＣＤカメラを使用し、デジタル顕微造影を介して画像を取得し、エネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＥＤＳ）をＦＥＩ－ＴＩＡインタフェースを介して記録した。試料調製には、ＳＣ２プラスミドをローディングした１０μｌのＡｕＮＳ－キトサンを純炭素支持フィルム付きのグロー放電銅グリッド上にドロップキャストし、１０～１５分間インキュベートし、その後、超純水で洗浄した。
本発明者らは、合成手順中のＡｕＮＳ表面修飾の各ステップを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｚシステムにおける動的光散乱法（ＤＬＳ）を２５℃、９０°の散乱角で使用して、平均流体力学直径及びゼータ電位について特徴分析した。本発明者らは、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似法を使用して、ＡｕＮＳベースのＮＰのζ電位（表面電荷）を決定した。本発明者らは、試料をＰＢＳ中に調製し、脱イオン水で希釈して、粒子の表面電荷を正確に測定することができる低イオン強度条件下で測定が行われることを確実にした。本発明者らは、ＳＣ２プラスミドをローディングしたＡｕＮＳ－キトサンの粒径及び形態を、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＦＥＩ－Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｆ２０ Ｘ－ＴＷＩＮ）を使用して特徴分析した。ＯＲＩＵＳ ＣＣＤカメラを使用し、デジタル顕微造影を介して画像を取得し、エネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＥＤＳ）をＦＥＩ－ＴＩＡインタフェースを介して記録した。試料調製には、ＳＣ２プラスミドをローディングした１０μｌのＡｕＮＳ－キトサンを純炭素支持フィルム付きのグロー放電銅グリッド上にドロップキャストし、１０～１５分間インキュベートし、その後、超純水で洗浄した。
【0315】
細胞におけるＡｕＮＳ－キトサン媒介ＤＮＡトランスフェクションのインビトロ評価
本発明者らは、ＡｕＮＳ－キトサによる細胞取り込み及びＦＬｕｃプラスミド送達を、ＢＬＩを定量的に使用して推定した。ＡｕＮＳ－キトサン上にローディングしたＦＬｕｃ ＥＧＦＰ（１μｇ）プラスミドでＡ５４９細胞を処置した。４８時間に、本発明者らは、処置された細胞を、Ｄ－Ｌｕｃ（１５０μｇ／ｍｌ）基質の存在下でＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ－ＩＩＩインビボイメージングシステムを使用して、生物発光シグナルについて画像化した。明らかな相関関係を得るために、全ての処置条件について、生物発光シグナルを定量化した。
本発明者らは、ＡｕＮＳ－キトサによる細胞取り込み及びＦＬｕｃプラスミド送達を、ＢＬＩを定量的に使用して推定した。ＡｕＮＳ－キトサン上にローディングしたＦＬｕｃ ＥＧＦＰ（１μｇ）プラスミドでＡ５４９細胞を処置した。４８時間に、本発明者らは、処置された細胞を、Ｄ－Ｌｕｃ（１５０μｇ／ｍｌ）基質の存在下でＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ－ＩＩＩインビボイメージングシステムを使用して、生物発光シグナルについて画像化した。明らかな相関関係を得るために、全ての処置条件について、生物発光シグナルを定量化した。
【0316】
マウス株及び免疫処置
本発明者らは、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）から購入し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｃｒ２ＲＦＰ×３ｃｒ１ＧＦＰ二重レポーターを保持するマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。マウスは、特定病原体除去条件下で飼育した。本発明者らは、スタンフォード大学の実験動物飼育に関する管理検討会（ＡＰＬＡＣ）の指導の下に全ての動物実験を行った。本発明者らは、１０μｇのＳＣ２ ＤＮＡ又はｐｃＤＮＡワクチン溶液でマウスをＩＮで免疫処置した。本発明者らは、２～３分以内の動物回復を可能にするイソフルランガス麻酔を使用して軽鎮静下にあるマウスでＮＰ製剤のＩＮ送達を行った。本発明者らは、各マウスを誘導チャンバーに入れ、酸素流量計を０．８～１．５Ｌ／分に調整した。ひとたび定常的な呼吸数が確立されたならば、本発明者らは、２０μｌのナノ製剤を５μＬ／液滴として１５～２０分間にわたってＩＮ投与した。各液滴を投与した後、本発明者らは、３～４分間停止して、動物が液滴を吸入し、定常的な速度で呼吸するのを確実にした。封鎖又は刺激の徴候があるかどうか、鼻孔を密接に観察した。総量を投与した後に、各動物をそのケージに移す前に、麻酔から回復させた。
本発明者らは、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）から購入し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｃｒ２ＲＦＰ×３ｃｒ１ＧＦＰ二重レポーターを保持するマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メイン州Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。マウスは、特定病原体除去条件下で飼育した。本発明者らは、スタンフォード大学の実験動物飼育に関する管理検討会（ＡＰＬＡＣ）の指導の下に全ての動物実験を行った。本発明者らは、１０μｇのＳＣ２ ＤＮＡ又はｐｃＤＮＡワクチン溶液でマウスをＩＮで免疫処置した。本発明者らは、２～３分以内の動物回復を可能にするイソフルランガス麻酔を使用して軽鎮静下にあるマウスでＮＰ製剤のＩＮ送達を行った。本発明者らは、各マウスを誘導チャンバーに入れ、酸素流量計を０．８～１．５Ｌ／分に調整した。ひとたび定常的な呼吸数が確立されたならば、本発明者らは、２０μｌのナノ製剤を５μＬ／液滴として１５～２０分間にわたってＩＮ投与した。各液滴を投与した後、本発明者らは、３～４分間停止して、動物が液滴を吸入し、定常的な速度で呼吸するのを確実にした。封鎖又は刺激の徴候があるかどうか、鼻孔を密接に観察した。総量を投与した後に、各動物をそのケージに移す前に、麻酔から回復させた。
【0317】
疑似化レンチウイルスを用いた血清中和アッセイ
抗体によるウイルス中和は、多くのウイルス疾患に重要な予後予測因子である。血清又は血漿中の中和抗体の力価を簡単かつ迅速に測定するために、本発明者らは、偽ウイルス粒子を開発した。一般に使用されているＶＳＶ－Ｇの代わりのエンベロープ糖タンパク質として、ＳＣ２スパイク（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃ＱＨＤ４３４１６．１、Ｄ６１４Ｇ突然変異を有する）を使用して、ＳＣ２スパイクＤ６１４Ｇ疑似化レンチウイルスを生成した。これらの偽ウイルス粒子は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＦＬｕｃ遺伝子を含有しており、したがって、スパイク媒介性細胞進入をＦＬｕｃイメージングを介して好都合に決定することができる。ＳＣ２スパイクＤ６１４Ｇ疑似化レンチウイルスを使用して、ＳＣ２に対する中和抗体の活性をバイオセイフティーレベル２施設で測定することができる。Ｂ．１．３５１と呼ばれるバリアントは、南アフリカ共和国で２０２０年の秋に最初に同定された。５０１Ｙ．Ｖ２としても知られているこの南アフリカバリアントは、多くの突然変異を有し、これが、より高い伝播性及び感染力をもたらしている可能性がある。スパイク（Ｂ．１．３５１バリアント）（ＳＣ２）疑似化レンチウイルスは、一般に使用されているＶＳＶ－Ｇの代わりのエンベロープ糖タンパク質として、ＳＣ２ Ｂ．１．３５１バリアントスパイク（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃ＱＨＤ４３４１６．１、Ｂ．１．３５１突然変異を有する）を使用して生成した。
抗体によるウイルス中和は、多くのウイルス疾患に重要な予後予測因子である。血清又は血漿中の中和抗体の力価を簡単かつ迅速に測定するために、本発明者らは、偽ウイルス粒子を開発した。一般に使用されているＶＳＶ－Ｇの代わりのエンベロープ糖タンパク質として、ＳＣ２スパイク（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃ＱＨＤ４３４１６．１、Ｄ６１４Ｇ突然変異を有する）を使用して、ＳＣ２スパイクＤ６１４Ｇ疑似化レンチウイルスを生成した。これらの偽ウイルス粒子は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＦＬｕｃ遺伝子を含有しており、したがって、スパイク媒介性細胞進入をＦＬｕｃイメージングを介して好都合に決定することができる。ＳＣ２スパイクＤ６１４Ｇ疑似化レンチウイルスを使用して、ＳＣ２に対する中和抗体の活性をバイオセイフティーレベル２施設で測定することができる。Ｂ．１．３５１と呼ばれるバリアントは、南アフリカ共和国で２０２０年の秋に最初に同定された。５０１Ｙ．Ｖ２としても知られているこの南アフリカバリアントは、多くの突然変異を有し、これが、より高い伝播性及び感染力をもたらしている可能性がある。スパイク（Ｂ．１．３５１バリアント）（ＳＣ２）疑似化レンチウイルスは、一般に使用されているＶＳＶ－Ｇの代わりのエンベロープ糖タンパク質として、ＳＣ２ Ｂ．１．３５１バリアントスパイク（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃ＱＨＤ４３４１６．１、Ｂ．１．３５１突然変異を有する）を使用して生成した。
【0318】
本発明者らは、感染の前の日に、９６ウェルプレート内に１ウェルあたり５×１０４細胞でＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を播種した。本発明者らは、感染の前の日に、９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）内にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を播種した。疑似化ＭＬＶウイルスを培養前細胞に添加した。本発明者らは、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２日間培養した。各ウェル内の全ての細胞をＤ－Ｌｕｃ基質の存在下でルシフェラーゼ発現レベルについてアッセイした。偽ウイルスのＡＣＥ２受容体特異的トランスフェクションを検証した後に、本発明者らは、動物血清の存在下で感染力を評価した。本発明者らは、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭを希釈剤として使用して、５０μｌ容積の血清を順次希釈し、５０μｌの疑似化ウイルスと共に３７℃で１時間プレインキュベートした。これらの感染のために、血清の非存在下でウイルスストックを希釈して使用した。その後、血清／偽ウイルス粒子混合物で細胞を感染させた。感染の４８時間後に、Ｄ－Ｌｕｃ基質を使用してルシフェラーゼを測定した。本発明者らは、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）を使用して中和力価をプロットした。
【0319】
末梢血中のＳＰＫ特異的ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ抗体の測定
本発明者らは、第１の免疫処置の２日前、第１及び第２の免疫処置の１２日後、及び最後の免疫処置の１５日後に、５群全ての各マウスの尾部から採血して、液性免疫応答を評価した。血液を遠心分離し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ検出用に血清を単離した。簡潔には、本発明者らは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５０μｌの５μｇ／ｍｌＳＰＫペプチドで、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を４℃で終夜コーティングした。プレートは、１００μｌの１％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液で、室温で２時間ブロッキングした。本発明者らは、個々のマウスの血清を１：１６００又は１：４００に希釈し、ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでそれを３回洗浄した後に、本発明者らは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国Ｏｘｆｏｒｄ）に結合させた二次抗体ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（１：２０００）でプレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、本発明者らは、２００μｌの基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）／Ｈ２Ｏ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を添加し、室温で３０分間、暗条件下にインキュベートし、５０μｌのＨ２ＳＯ４ ２Ｎを添加することによって反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ分光光度計を使用して、ＯＤ４５０ｎｍでプレートを読み取り、抗体価を平均吸収度±標準偏差（ＳＤ）で表した。
本発明者らは、第１の免疫処置の２日前、第１及び第２の免疫処置の１２日後、及び最後の免疫処置の１５日後に、５群全ての各マウスの尾部から採血して、液性免疫応答を評価した。血液を遠心分離し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ検出用に血清を単離した。簡潔には、本発明者らは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５０μｌの５μｇ／ｍｌＳＰＫペプチドで、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を４℃で終夜コーティングした。プレートは、１００μｌの１％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液で、室温で２時間ブロッキングした。本発明者らは、個々のマウスの血清を１：１６００又は１：４００に希釈し、ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでそれを３回洗浄した後に、本発明者らは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国Ｏｘｆｏｒｄ）に結合させた二次抗体ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（１：２０００）でプレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、本発明者らは、２００μｌの基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）／Ｈ２Ｏ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を添加し、室温で３０分間、暗条件下にインキュベートし、５０μｌのＨ２ＳＯ４ ２Ｎを添加することによって反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ分光光度計を使用して、ＯＤ４５０ｎｍでプレートを読み取り、抗体価を平均吸収度±標準偏差（ＳＤ）で表した。
【0320】
イムノブロット分析
トランスフェクトされた細胞におけるＳＰＫタンパク質の発現を決定し、精製されたＳＰＫタンパク質に関してＳＣ２の突然変異バリアントに対するＳＣ２抗体の特異性をスクリーニングするために、本発明者らは、抗ＳＣ２ ＳＰＫ抗体を使用してイムノブロット分析を行った。本発明者らは、１０ｃｍウェルプレート内に５００，０００個のＨＥＫ２９３細胞を播種し、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１０μｇのｐＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ、ＳＣ２－ＳＡ突然変異体、及びＳＣ２－Ｄ６１４Ｇ突然変異体）でトランスフェクトし、処置の４８時間後に、本発明者らは、さらに抗ＳＰＫ抗体を使用したイムノブロット分析のために、細胞を採取し、プロセシングした。簡潔には、本発明者らは、５００μｌの溶解バッファー中に細胞を溶解させ、１００μｇの総タンパク質をβ－メルカプトエタノール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び１０μｌのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ（４×）ローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱し、４～１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にローディングし、８０Ｖで２時間泳動させた。その後、ゲルから得られる分離タンパク質を孔径０．２μｍのニトロセルロースメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、米国ニューハンプシャー州Ｋｅｅｎｅ）にエレクトロブロッティングした。０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．６）を含有するトリス緩衝食塩水中の５％無脂ドライミルクで膜を３０分間ブロッティングし、抗ウサギＳＰＫモノクローナル抗体と共にロッキングプラットホーム上４℃で終夜インキュベートした。その翌日、本発明者らは、ＰＢＳＴを使用して一次抗体を洗い流し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：１００００希釈、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ペンシルベニア州Ｇｉｌｂｅｒｓｖｉｌｌｅ）を添加し、室温２時間これをロッキング下においた。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でブロットを現像し、画像化し、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩインビボイメージングシステムで定量化した。
トランスフェクトされた細胞におけるＳＰＫタンパク質の発現を決定し、精製されたＳＰＫタンパク質に関してＳＣ２の突然変異バリアントに対するＳＣ２抗体の特異性をスクリーニングするために、本発明者らは、抗ＳＣ２ ＳＰＫ抗体を使用してイムノブロット分析を行った。本発明者らは、１０ｃｍウェルプレート内に５００，０００個のＨＥＫ２９３細胞を播種し、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１０μｇのｐＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ、ＳＣ２－Ｗｕｈａｎ、ＳＣ２－ＳＡ突然変異体、及びＳＣ２－Ｄ６１４Ｇ突然変異体）でトランスフェクトし、処置の４８時間後に、本発明者らは、さらに抗ＳＰＫ抗体を使用したイムノブロット分析のために、細胞を採取し、プロセシングした。簡潔には、本発明者らは、５００μｌの溶解バッファー中に細胞を溶解させ、１００μｇの総タンパク質をβ－メルカプトエタノール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び１０μｌのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ（４×）ローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱し、４～１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にローディングし、８０Ｖで２時間泳動させた。その後、ゲルから得られる分離タンパク質を孔径０．２μｍのニトロセルロースメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、米国ニューハンプシャー州Ｋｅｅｎｅ）にエレクトロブロッティングした。０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．６）を含有するトリス緩衝食塩水中の５％無脂ドライミルクで膜を３０分間ブロッティングし、抗ウサギＳＰＫモノクローナル抗体と共にロッキングプラットホーム上４℃で終夜インキュベートした。その翌日、本発明者らは、ＰＢＳＴを使用して一次抗体を洗い流し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：１００００希釈、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ペンシルベニア州Ｇｉｌｂｅｒｓｖｉｌｌｅ）を添加し、室温２時間これをロッキング下においた。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でブロットを現像し、画像化し、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩインビボイメージングシステムで定量化した。
【0321】
肺、脾臓、及びリンパ節の組織検査
本発明者らは、組織検査用の器官を採取するために、深麻酔下の動物の心臓潅流を行った。簡潔には、本発明者らは、麻酔下に、横隔膜の下で各マウスを解剖し、胸郭を切って、心臓を露出させた。本発明者らは、左心室切開を行い、大動脈に針を挿入し、固定し、その後、右心房を切って、流した。３０ｍＬのＰＢＳを使用して各動物に４～５分間又は肝臓から血液が無くなるまで経心的に灌流した。次に、組織形態を保全し、標的分子の免疫原性を保持するために、本発明者らは、３０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドで動物を４分間灌流した。アルデヒド固定の後、本発明者らは、組織（脾臓、リンパ節、及び肺）を採取し、終夜平衡のために３０％ショ糖のＰＢＳ溶液に移し、その後ＯＣＴ包埋用にプロセシングした。クリオスタットを使用して、ＯＣＴブロックを厚さ５μｍの組織切片にし、ゼラチンでコーティングされた組織学的スライドに融解マウントした。本発明者らは、その後、３７℃で３０分間スライドを乾燥させ、洗浄バッファー中で１０分間再水和させた。１％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液を使用して、組織を室温で３０分間ブロッキングし、その後、抗原特異的抗マウス蛍光色素タグ付き抗体（ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ－７００、ＣＤ１９ Ａｌｅｘａ－７００）と共にインキュベートし、２～８℃で終夜インキュベートした。インキュベーション時間の後に、本発明者らは、抗体を洗浄バッファー中で１５分間３回洗浄した。本発明者らは、その後、３００μＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２希釈溶液中でスライドをインキュベートし、室温で５分間インキュベートした。スライドは、最後にＰＢＳで１回リンスし、抗フェード封入剤を用いてマウントし、それぞれのフィルターの下でＬｅｉｃａ ＤＭｉ８共焦点顕微鏡を使用して可視化した。
本発明者らは、組織検査用の器官を採取するために、深麻酔下の動物の心臓潅流を行った。簡潔には、本発明者らは、麻酔下に、横隔膜の下で各マウスを解剖し、胸郭を切って、心臓を露出させた。本発明者らは、左心室切開を行い、大動脈に針を挿入し、固定し、その後、右心房を切って、流した。３０ｍＬのＰＢＳを使用して各動物に４～５分間又は肝臓から血液が無くなるまで経心的に灌流した。次に、組織形態を保全し、標的分子の免疫原性を保持するために、本発明者らは、３０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドで動物を４分間灌流した。アルデヒド固定の後、本発明者らは、組織（脾臓、リンパ節、及び肺）を採取し、終夜平衡のために３０％ショ糖のＰＢＳ溶液に移し、その後ＯＣＴ包埋用にプロセシングした。クリオスタットを使用して、ＯＣＴブロックを厚さ５μｍの組織切片にし、ゼラチンでコーティングされた組織学的スライドに融解マウントした。本発明者らは、その後、３７℃で３０分間スライドを乾燥させ、洗浄バッファー中で１０分間再水和させた。１％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液を使用して、組織を室温で３０分間ブロッキングし、その後、抗原特異的抗マウス蛍光色素タグ付き抗体（ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ－７００、ＣＤ１９ Ａｌｅｘａ－７００）と共にインキュベートし、２～８℃で終夜インキュベートした。インキュベーション時間の後に、本発明者らは、抗体を洗浄バッファー中で１５分間３回洗浄した。本発明者らは、その後、３００μＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２希釈溶液中でスライドをインキュベートし、室温で５分間インキュベートした。スライドは、最後にＰＢＳで１回リンスし、抗フェード封入剤を用いてマウントし、それぞれのフィルターの下でＬｅｉｃａ ＤＭｉ８共焦点顕微鏡を使用して可視化した。
【0322】
フローサイトメトリー免疫表現型検査：本発明者らは、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、及び血液試料についてフローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーベースの免疫細胞分析を行った。簡潔には、本発明者らは、機械的な解離を使用して、組織から単一細胞懸濁液を調製し、ＡＣＫ溶解バッファーを使用して、赤血球を除去した。最後の洗浄の後に、本発明者らは、７０μｍの細胞濾過器を通して細胞を濾過し、０．１％トリパンブルーを使用して生存率を検査した。蛍光色素で標識した細胞表面マーカー特異的抗マウス抗体、すなわち、ＣＤ４５－Ｐａｃ－Ｂｌｕｅ、ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８ＰＥ－ＣＹ７／ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ－７００、ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ ＰａｃＢｌｕｅ／ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４５／ＣＤ１１ｃ ＰａｃＢｌｕｅ／ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４５／ＣＤ８６ Ｐａｃ Ｂｌｕｅ／ＰＥ、ＣＤ１９ Ａｌｅｘａ－７００、ＣＤ２２ Ａｌｅｘａ－７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で１００万個の細胞を標識化した。ゲーティング及び補償のために、アイソタイプ抗体を含めた。抗体の添加の後、本発明者らは、細胞を暗条件に３０分間保持した。本発明者らは、ＰＢＳを使用して細胞を洗浄し、新しいＰＢＳに懸濁し、その後、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメータを使用して、２０，０００イベントを分析した。
【0323】
統計的分析：本発明者らは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（バージョン８．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して、全てのグラフをプロットし、統計的分析を行った。本発明者らは、独立した実験の３～５頭のマウスからデータをプールし、図のレジェンドに示した平均±標準偏差（ＳＤ）又は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として結果を提示し、分析に第１（２５パーセンタイル）と第３（７５パーセンタイル）の間の四分位範囲を採用した。本発明者らは、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して、グループ化されたデータを比較し、グループ化されたデータの多重比較を計算した。ＥＬＩＳＡと中和力価の間の相関分析のために、Ｐｒｉｓｍ ９．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して有意性（ｐ）を計算した。
【0324】
ｐ値が０．０５未満であった場合に、差が有意であるとした。ｐ値は、対応する図のレジェンドに示されていない場合、有意水準を示す（＊は０．０１＜ｐ＜０．０５を示し、＊＊は０．００１＜ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は０．０００１＜ｐ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す）。
【0325】
表
【0326】
【表1】
【0327】
【表2】
【0328】
実施例１～４の参考文献
【0329】
【表3】
【0330】
実施例５の参考文献
【0331】
【表4】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【国際調査報告】