(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-24
(54)【発明の名称】自己免疫疾患の処置のためのピリジノン化合物
(51)【国際特許分類】
C07D 213/74 20060101AFI20230817BHJP
C07D 498/10 20060101ALI20230817BHJP
C07D 413/14 20060101ALI20230817BHJP
C07D 471/04 20060101ALI20230817BHJP
C07D 487/04 20060101ALI20230817BHJP
C07D 519/00 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/5386 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/553 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20230817BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20230817BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230817BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230817BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230817BHJP
C07D 401/14 20060101ALI20230817BHJP
【ＦＩ】
C07D213/74
C07D498/10
C07D413/14
C07D471/04 112
C07D487/04 147
C07D519/00 301
A61K31/5386
A61K31/506
A61K31/553
A61K31/496
A61K31/497
A61K31/4985
A61P13/12
A61P29/00
A61P37/06
C07D401/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023507596
(86)(22)【出願日】2021-08-02
(85)【翻訳文提出日】2023-03-30
(86)【国際出願番号】 EP2021071550
(87)【国際公開番号】W WO2022029068
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/106791
(32)【優先日】2020-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ドンドン
(72)【発明者】
【氏名】デイ，ファビアン
(72)【発明者】
【氏名】ホン，シン
(72)【発明者】
【氏名】タン，スーフェイ
(72)【発明者】
【氏名】シュ，ジアス
(72)【発明者】
【氏名】ジュ，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ゾウ，ジェ
【テーマコード（参考）】
4C050
4C055
4C063
4C065
4C072
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C050AA01
4C050BB08
4C050CC08
4C050EE03
4C050FF01
4C050GG01
4C050HH04
4C055AA01
4C055AA04
4C055BA02
4C055BA03
4C055BA06
4C055BA13
4C055BA42
4C055BA52
4C055BB10
4C055CA02
4C055CA03
4C055CA06
4C055CA25
4C055CA27
4C055CB10
4C055DA01
4C055EA01
4C063AA03
4C063AA05
4C063BB02
4C063BB09
4C063CC12
4C063CC29
4C063CC34
4C063CC57
4C063DD02
4C063DD10
4C063DD12
4C063DD29
4C063EE01
4C065AA05
4C065BB09
4C065CC01
4C065DD02
4C065EE02
4C065HH01
4C065JJ01
4C065KK01
4C065LL08
4C065PP12
4C065PP15
4C065QQ05
4C072AA04
4C072BB02
4C072CC02
4C072CC11
4C072EE07
4C072FF01
4C072GG01
4C072HH07
4C072HH08
4C072JJ03
4C072MM10
4C072UU01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086BC42
4C086BC50
4C086BC75
4C086CB09
4C086CB22
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA09
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA81
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZC42
(57)【要約】
本発明は、式（Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡは、本明細書に記載されるとおりである）
の化合物及びそれらの薬学的に許容され得る塩、並びに該化合物を含む組成物及び該化合物を使用する方法に関する。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡは、本明細書に記載されるとおりである）
の化合物及びそれらの薬学的に許容され得る塩、並びに該化合物を含む組成物及び該化合物を使用する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
（式中、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１～６アルキル又はハロＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルであり、前記ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルは、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルは、アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）
から選択される置換基で置換されており、
Ａは、ＣＨ又はＮである）
の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩。
【請求項2】
ＡがＣＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｒ４が、【化2】
であり、Ｒ５は、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルは、アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）
から選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｒ４が、【化3】
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（（ピペラジニル）フェニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピラジニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、又は（（ピペラジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、
【化4】
（式中、Ｒ５ｂはピペラジニルである）、又は
【化5】
（式中、Ｒ５ｃは、ピペラジニルピリジニル又は（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）
である、請求項３に記載の化合物。
【請求項5】
Ｒ４が、【化6】
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル、（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジニル）メチル、（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル）メチル、［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３－ピリジニル］メチル、［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－［６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル、（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル、又は（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチルである）、
【化7】
（式中、Ｒ５ｂはピペラジン－１－イルである）、又は
【化8】
（式中、Ｒ５ｃは、６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル又は２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）
である、請求項４に記載の化合物。
【請求項6】
Ｒ３がＣ１～６アルキルである、請求項４又は５に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒ３が、エチル又はイソプロピルである、請求項６に記載の化合物。
【請求項8】
Ｒ４が、【化9】
（式中、Ｒ５ａは、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル又は（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、又は
【化10】
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）である、請求項６に記載の化合物。
【請求項9】
Ｒ４が、【化11】
（式中、Ｒ５ａは、［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチルである）、又は
【化12】
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）である、請求項８に記載の化合物。
【請求項10】
Ｒ１がＣ１～６アルキルであり、Ｒ２がＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３がＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４が、
【化13】
（式中、Ｒ５ａは、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル若しくは（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、又は
【化14】
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）であり、
ＡがＣＨである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩。
【請求項11】
Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がメチルであり、
Ｒ３が、エチル又はイソプロピルであり、
Ｒ４が、
【化15】
（式中、Ｒ５ａは、［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチルである）、又は
【化16】
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）であり、
ＡがＣＨである、請求項１０に記載の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩。
【請求項12】
５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；５－［２－エチル－６－［４－［［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３ ピリジル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－［（６Ｓ）－６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；及び
５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
から選択される化合物、又はその薬学的に許容され得る塩。
【請求項13】
ａ）式（ＩＸ）【化17】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－１）
【化18】
の化合物を得る工程、
ｂ）式（ＸＶ）
【化19】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－２）
【化20】
の化合物を得る工程、
ｃ）式（ＸＶＩＩ）
【化21】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－３）
【化22】
の化合物を得る工程
のいずれかを含み、
式中、ＰＧはＢｏｃであり；Ｌは、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペラジニルピペリジニル、ピペリジニルピペラジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イルであり；Ｇ１は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、フェニル、ピペラジニル、ピラジニル、ピリジニル又はピリミジニルであり；Ｇ２は、ピペラジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル又はアミノ－１，４－オキサゼパン－４－イルであり；Ｇ３は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＡは、請求項１～１１のいずれか一項と同様に定義される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法。
【請求項14】
治療活性物質としての使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、又は薬学的に許容され得る塩。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物と、治療不活性担体とを含む、医薬組成物。
【請求項16】
全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置又は予防のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項17】
全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置又は予防のための医薬の調製のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項18】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８及びＴＬＲ９のアンタゴニストのための医薬の調製のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項19】
全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置又は予防のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又は薬学的に許容され得る塩。
【請求項20】
請求項１３に記載の方法に従って製造された場合の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又は薬学的に許容され得る塩。
【請求項21】
全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置又は予防のための方法であって、治療有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項22】
上述されるとおりである発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物における処置及び／又は予防に有用な有機化合物、特に、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置に有用なＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【0002】
自己免疫性結合組織病（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＴＤ）には、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）、原発性シェーグレン症候群（ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｐＳｊＳ）、混合性結合組織病（ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＭＣＴＤ）、皮膚筋炎／多発性筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ／ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ：ＤＭ／ＰＭ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）、及び全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＳＳｃ）等のプロトタイプの自己免疫症候群が含まれる。ＲＡを除いて、患者が利用可能である実際に効果的で安全な治療法はない。ＳＬＥは、１００，０００人あたり２０～１５０人の有病率を有するプロトタイプのＣＴＤであり、皮膚や関節で一般的に観察される症状から腎不全、肺不全、又は心不全に至るまで、様々な臓器において広範な炎症や組織損傷を引き起こす。従来、ＳＬＥは、非特異的な抗炎症薬又は免疫抑制薬で処置されてきた。しかしながら、免疫抑制薬、例えばコルチコステロイドの長期使用は、部分的にしか効果がなく、望ましくない毒性及び副作用を伴う。ベリムマブは、過去５０年間にＦＤＡが承認した唯一の狼瘡薬であるが、ＳＬＥ患者のごく一部にしか効果がなく、それも控えめで遅れがある（Ｎａｖａｒｒａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ Ｌａｎｃｅｔ ２０１１，３７７，７２１．）。抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、特定のサイトカインに対するｍＡｂ又は可溶性受容体等の他の生物学的製剤は、ほとんどの臨床研究で失敗している。したがって、より多くの患者群で持続的な改善を提供し、多くの自己免疫疾患及び自己炎症疾患で慢性的に使用しても安全性がより高い、新規治療法が必要とされている。
【0003】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、幅広い種類の免疫細胞における広範な免疫応答を開始することができるパターン認識受容体（ＰＲＲ）の重要なファミリーである。自然宿主防御センサとして、エンドソームＴＬＲ７、８、及び９は、ウイルス、細菌に由来する核酸を認識し、具体的には、ＴＬＲ７／８及びＴＬＲ９は、それぞれ一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｓｓＲＮＡ）及び一本鎖ＣｐＧ－ＤＮＡを認識する。しかしながら、ＴＲＬ７、８、９の異常な核酸感知は、幅広い自己免疫疾患及び自己炎症性疾患の重要なノードと見なされている（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００７，２２０，２５１．Ｊｉｍeｎｅｚ－Ｄａｌｍａｒｏｎｉ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ．２０１６，１５，１．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，５０，１．）。抗ＲＮＡ抗体及び抗ＤＮＡ抗体は十分に確立されたＳＬＥの診断マーカーであり、自己ＲＮＡ及び自己ＤＮＡの両方をエンドソームへ送達することができる。自己ＲＮＡ複合体がＴＬＲ７及びＴＬＲ８によって認識され得るのに対し、自己ＤＮＡ複合体はＴＬＲ９の活性化を引き起こし得る。実際、血液及び／又は組織からの自己ＲＮＡ及び自己ＤＮＡのクリアランスの欠陥は、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）患者において明白である。ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ＳＬＥ組織において上方調節され、それぞれループス腎炎の慢性化及び活性と相関していると報告されてきた。ＳＬＥ患者のＢ細胞において、ＴＬＲ７発現は抗ＲＮＰ抗体産生と相関しているのに対し、ＴＬＲ９発現はＩＬ－６レベル及び抗二本鎖ＤＮＡ抗体レベルと相関している。一貫して、ループスマウスモデルでは、ＴＬＲ７は抗ＲＮＡ抗体に必要であり、ＴＬＲ９は、抗ヌクレオソーム抗体に必要である。その一方で、マウスにおけるＴＬＲ７又はヒトＴＬＲ８の過剰発現は、自己免疫及び自己炎症を促進する。その上、ＴＬＲ８の活性化は、ｍＤＣ／マクロファージの炎症性サイトカイン分泌、好中球ネトーシス、Ｔｈ１７細胞の誘導、及びＴｒｅｇ細胞の抑制に特異的に寄与する。Ｂ細胞の自己抗体産生の促進におけるＴＬＲ９の役割について述べたことに加えて、ｐＤＣにおける自己ＤＮＡによるＴＬＲ９の活性化もまた、Ｉ型ＩＦＮ及び他の炎症性サイトカインの誘導をもたらす。ｐＤＣとＢ細胞の両方においてＴＬＲ９が自己免疫疾患の病因にこのような重要な役割を果たしていることと、自己免疫疾患の多くの患者においてＴＬＲ９を容易に活性できる自己ＤＮＡ複合体が広範囲に存在することとを考えると、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の経路の阻害に加えて、自己ＤＮＡを介したＴＬＲ９経路を更に遮断することには特別な利点があり得る。まとめると、ＴＬＲ７、８、９経路は、有効なステロイド非含有及び非細胞毒性の経口薬が存在しない自己免疫疾患及び自己炎症疾患の処置用の新たな治療標的であり、これらの経路全てをまさに上流から阻害することにより、満足な治療効果が得られる可能性がある。したがって、本発明者らは、自己免疫疾患及び自己炎症疾患の処置のために、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９を標的とし、抑制する経口化合物を発明した。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、式（Ｉ）
（式中、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキル又はハロＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルであり、当該ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルは、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）から選択される置換基で置換されており、
Ａは、ＣＨ又はＮである）
の新規化合物、又はその薬学的に許容され得る塩に関する。
【化1】
（式中、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキル又はハロＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルであり、当該ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルは、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）から選択される置換基で置換されており、
Ａは、ＣＨ又はＮである）
の新規化合物、又はその薬学的に許容され得る塩に関する。
【0005】
本発明の他の目的は、式（Ｉ）の新規化合物に関する。その製造、本発明による化合物に基づく医薬及びその製造、並びにＴＬＲ７及びＴＬＲ８及びＴＬＲ９アンタゴニストとしての式（Ｉ）の化合物の使用、並びに全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置又は予防のための使用。式（Ｉ）の化合物は、優れたＴＬＲ７及びＴＬＲ８及びＴＬＲ９の拮抗活性を示す。加えて、式（Ｉ）の化合物は、良好な細胞毒性、光毒性、可溶性、ｈＰＢＭＣ、ヒトミクロソーム安定性、ＡＯ（ヒトサイトゾルアルデヒドオキシダーゼ）、及びＳＤＰＫプロファイル、並びに低いＣＹＰ阻害も示す。
【発明を実施するための形態】
【0006】
定義
「Ｃ１～６アルキル」という用語は、１～６個、特に１～４個の炭素原子を含有する飽和直鎖又は分枝鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等を示す。特定の「Ｃ１～６アルキル」基は、メチル、エチル、及びｎ－プロピルである。
「Ｃ１～６アルキル」という用語は、１～６個、特に１～４個の炭素原子を含有する飽和直鎖又は分枝鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等を示す。特定の「Ｃ１～６アルキル」基は、メチル、エチル、及びｎ－プロピルである。
【0007】
「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを示す。
【0008】
「ハロＣ１～６アルキル」という用語は、Ｃ１～６アルキル基の水素原子の少なくとも１つが、同じ又は異なるハロゲン原子、特に、フルオロ原子で置き換えられているＣ１～６アルキル基を示す。ハロＣ１～６アルキルの例としては、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、若しくはトリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、若しくはトリフルオロエチル、又はモノフルオロプロピル、ジフルオロプロピル、若しくはトリフルオロプロピル、例えば３，３，３－トリフルオロプロピル、２－フルオロエチル、トリフルオロエチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、ジフルオロエチル、又はトリフルオロメチルが挙げられる。
【0009】
「薬学的に許容され得る塩」という用語は、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない塩を意味する。薬学的に許容され得る塩には、酸付加塩及び塩基付加塩の両方が含まれる。
【0010】
「薬学的に許容され得る酸性付加塩」という用語は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等の無機酸と、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸（ｍａｌｏｎｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、及びサリチル酸等の有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環式、カルボン酸、及びスルホン酸類から選択される有機酸とで形成されるような薬学的に許容され得る塩を意味する。
【0011】
「薬学的に許容され得る塩基付加塩」という用語は、有機塩基又は無機塩基で形成される薬学的に許容され得る塩を意味する。許容され得る無機塩基の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、及びアルミニウム塩が挙げられる。薬学的に許容され得る有機非毒性塩基から誘導される塩としては、天然の置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペリジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、及びポリアミン樹脂を含む、第一級、第二級、及び第三級アミン、置換アミンの塩が挙げられる。
【0012】
「薬学的に活性な代謝物」という用語は、特定の化合物又はその塩の体内での代謝を通じて産生される薬理学的に活性な生成物を示す。体内に入った後、ほとんどの薬物は化学反応の基質となり、それらの物理的特性及び生物学的効果を変化させ得る。これらの代謝変換は、通常、本発明の化合物の極性に影響を与え、薬物が体内に分配されて体内から排泄される方法を変える。しかしながら、場合によっては、治療効果のために薬物の代謝が必要になる。
【0013】
「治療有効量」という用語は、対象に投与された場合に、（ｉ）特定の疾患、状態若しくは障害を処置若しくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態若しくは障害の１若しくは複数の症状を軽減、改善若しくは排除する、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態若しくは障害の１若しくは複数の症状の発症を予防若しくは遅延させる、本発明の化合物若しくは分子の量を意味する。治療有効量は、化合物、処置される病状、処置される疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、投与の経路及び形態、主治医又は獣医師の判断、並びにその他の要因に応じて異なる。
【0014】
「医薬組成物」という用語は、それを必要とする哺乳動物（例えばヒト）に投与される、治療有効量の有効活性成分を薬学的に許容され得る添加物とともに含む混合物又は溶液を示す。
【0015】
ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９のアンタゴニスト
本発明は、（ｉ）式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキル又はハロＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルであり、当該ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルは、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）から選択される置換基で置換されており、
Ａは、ＣＨ又はＮである）
の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩に関する。
本発明は、（ｉ）式（Ｉ）：
【化2】
（式中、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキル又はハロＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルであり、当該ピペラジニル、ピペリジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジニルは、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）から選択される置換基で置換されており、
Ａは、ＣＨ又はＮである）
の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩に関する。
【0016】
本発明の更なる実施形態は、（ｉｉ）ＡがＣＨである、（ｉ）による式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
【0017】
本発明の更なる実施形態は、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉ）による式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩であって、
Ｒ４は、
であり、Ｒ５は、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）
から選択される。
Ｒ４は、
【化3】
であり、Ｒ５は、
５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、
フェニルＣ１～６アルキル（フェニルはピペラジニルで置換されている）、
ピペラジニル、
ピラジニルＣ１～６アルキル（ピラジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニル（ピリジニルはピペラジニルで置換されている）、
ピリジニルＣ１～６アルキル（ピリジニルは、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル又はピペラジニルで置換されている）、
ピリミジニル（ピリミジニルは５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イルで置換されている）、及び
ピリミジニルＣ１～６アルキル（ピリミジニルはアミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル又はピペラジニルで置換されている）
から選択される。
【0018】
本発明の更なる実施形態は、（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩であって、
Ｒ４は、
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（（ピペラジニル）フェニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピラジニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、又は（（ピペラジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、
（式中、Ｒ５ｂはピペラジニルである）、又は
（式中、Ｒ５ｃはピペラジニルピリジニル又は（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）
である。
Ｒ４は、
【化4】
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（（ピペラジニル）フェニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピラジニル）Ｃ１～６アルキル、（（ピペラジニル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル、又は（（ピペラジニル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、
【化5】
（式中、Ｒ５ｂはピペラジニルである）、又は
【化6】
（式中、Ｒ５ｃはピペラジニルピリジニル又は（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）
である。
【0019】
本発明の更なる実施形態は、（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物であって、
Ｒ４は、
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル、（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジニル）メチル、（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル）メチル、［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３－ピリジニル］メチル、［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－［６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル、（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル、又は（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチルである）、
（式中、Ｒ５ｂはピペラジン－１－イルである）、又は
（式中、Ｒ５ｃは６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル又は２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）
である。
Ｒ４は、
【化7】
（式中、Ｒ５ａは、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル、（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル、（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジニル）メチル、（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル）メチル、［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３－ピリジニル］メチル、［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、［２－［６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル、（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル、又は（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチルである）、
【化8】
（式中、Ｒ５ｂはピペラジン－１－イルである）、又は
【化9】
（式中、Ｒ５ｃは６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジニル又は２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）
である。
【0020】
本発明の更なる実施形態は、（ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、Ｒ３はＣ１～６アルキルである。
【0021】
本発明の更なる実施形態は、（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、Ｒ３はエチル又はイソプロピルである。
【0022】
本発明の更なる実施形態は、（ｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、Ｒ４は
（式中、Ｒ５ａは（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル又は（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、
又は
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）
である。
【化10】
（式中、Ｒ５ａは（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル又は（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、
又は
【化11】
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）
である。
【0023】
本発明の更なる実施形態は、（ｉｘ）（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、Ｒ４は
（式中、Ｒ５ａは［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、又は
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）
である。
【化12】
（式中、Ｒ５ａは［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル、又は
【化13】
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）
である。
【0024】
本発明の更なる実施形態は、（ｘ）（ｉ）～（ｉｘ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、
（式中、Ｒ５ａは、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル又は（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、又は
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）であり、
ＡはＣＨである
式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
Ｒ１はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ３はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ４は、
【化14】
（式中、Ｒ５ａは、（（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキル又は（（アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル）ピリミジニル）Ｃ１～６アルキルである）、又は
【化15】
（式中、Ｒ５ｃは（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジニルである）であり、
ＡはＣＨである
式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
【0025】
本発明の更なる実施形態は、（ｘｉ）（ｉ）～（ｘ）のいずれか１つに記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩であって、
Ｒ１はメチルであり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３はエチル又はイソプロピルであり、
Ｒ４は
（式中、Ｒ５ａは［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチルである）、又は
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）であり、
ＡはＣＨである
式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
Ｒ１はメチルであり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３はエチル又はイソプロピルであり、
Ｒ４は
【化16】
（式中、Ｒ５ａは［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル若しくは［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチルである）、又は
【化17】
（式中、Ｒ５ｃは２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イルである）であり、
ＡはＣＨである
式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
【0026】
本発明の別の実施形態は、以下：
５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－エチル－６－［４－［［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３ ピリジル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－［（６Ｓ）－６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；及び
５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
から選択される式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－エチル－６－［４－［［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３ ピリジル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－［（６Ｓ）－６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；及び
５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン；
から選択される式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩である。
【0027】
合成
本発明の化合物は、任意の従来の手段によって調製することができる。これらの化合物及びそれらの出発物質を合成するための好適なプロセスは、以下のスキーム及び実施例に提供されている。全ての置換基、特にＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＡは、別段示されない限り、上に記載されるとおりである。さらに、別段の明白な記述がない限り、全ての反応、反応条件、略語及び記号は、有機化学の当業者に周知の意味を有する。
本発明の化合物は、任意の従来の手段によって調製することができる。これらの化合物及びそれらの出発物質を合成するための好適なプロセスは、以下のスキーム及び実施例に提供されている。全ての置換基、特にＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＡは、別段示されない限り、上に記載されるとおりである。さらに、別段の明白な記述がない限り、全ての反応、反応条件、略語及び記号は、有機化学の当業者に周知の意味を有する。
【0028】
式（Ｉ）の化合物を調製するための一般的な合成経路を以下に示す。
【0029】
【化18】
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はハロゲンである；ＡはＣＨ又はＮである；ＰＧはＢｏｃ等の保護基である；Ｌは、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペラジニルピペリジニル、ピペリジニルピペラジニル又は３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イルである；Ｇ１は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル、フェニル、ピペラジニル、ピラジニル、ピリジニル又はピリミジニルである；Ｇ２は、ピペラジニル、５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル、アミノ（Ｃ１～６アルキル）アゼチジニル又はアミノ－１，４－オキサゼパン－４－イルである。
【0030】
式（ＩＶ）の化合物を、適切な塩基、例えばＫＯＡｃ、及び適切なパラジウム触媒、例えばＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物の存在下でビス（ピナコラト）ジボロンで処理して、式（Ｖ）の化合物を得る。ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２ 付加物等の適切な触媒及びＫ２ＣＯ３等の適切な塩基を用いた式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）の化合物との間のＳｕｚｕｋｉ－カップリング反応により、式（ＶＩＩ）の化合物が得られる。式（ＶＩＩ）の化合物を、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２等の触媒、及びＣｓ２ＣＯ３又はｔ－ＢｕＯＮａ等の適切な塩基の存在下で化合物（ＶＩＩＩ）とＢｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇアミノ化して、式（ＩＸ）の化合物を得る。ＴＦＡ等の酸性条件下での式（ＩＸ）の化合物の脱保護により、（Ｉ－１）の化合物が得られる。Ｋ２ＣＯ３等の適切な塩基の存在下での式（Ｉ－１）の化合物と式（Ｘ）の化合物との間の置換反応により、式（ＸＩＩＩ）の化合物が得られる。式（ＸＩＩＩ）の化合物は、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３等の還元剤を用いた式（Ｘ）の化合物と式（ＸＩＩ）の化合物との間の還元的アミノ化によっても得ることができる。ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２等の触媒、及びＣｓ２ＣＯ３又はｔ－ＢｕＯＮａ等の適切な塩基を用いたバックワルド・ハートウィグ（Ｂｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇ）アミノ化条件下での式（ＸＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＶ）の化合物とのカップリングにより、式（ＸＶ）の化合物が得られる。ＴＦＡ等の酸性条件下での式（ＸＶ）の化合物の脱保護により、（Ｉ－２）の化合物を得る。
【0031】
【化19】
式中、Ｇ３は、５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イルである。
【0032】
ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２等の触媒、及びＣｓ２ＣＯ３又はｔ－ＢｕＯＮａ等の適切な塩基を用いたＢｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇアミノ化条件下での式（Ｉ－１）の化合物と式（ＸＶＩ）の化合物とのカップリングにより、式（ＸＶＩＩ）の化合物が得られる。ＴＦＡ等の酸性条件下での式（ＸＶＩＩ）の化合物の脱保護により、式（Ｉ－３）の化合物が得られる。
【0033】
【化20】
【0034】
式（ＶＩＩ）の化合物を、スキーム３を介して得ることもできる。
【0035】
ＫＯＡｃ等の適切な塩基、及びＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物等の適切なパラジウム触媒の存在下で、式（ＶＩ）の化合物をビス（ピナコラト）ジボロンで処理すると、式（ＸＩＸ）の化合物が得られる。ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物等の適切な触媒、及びＫ２ＣＯ３等の適切な塩基を用いるＳｕｚｕｋｉカップリング条件下での式（ＸＩＸ）の化合物と式（ＩＶ）の化合物とのカップリングにより、式（ＶＩＩ）の化合物を得る。
【0036】
本発明の化合物は、ジアステレオマー又はエナンチオマーの混合物として得ることができ、これらは、当該技術分野で周知の方法、例えば、（キラル）ＨＰＬＣ又はＳＦＣによって分離することができる。
【0037】
また、本発明は、以下の工程：
ａ）式（ＩＸ）
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－１）
の化合物を得る工程、
ｂ）式（ＸＶ）
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－２）
の化合物を得る工程、
ｃ）式（ＸＶＩＩ）
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－３）
の化合物を得る工程
（調製方法において、
工程ａ）、ｂ）及びｃ）では、酸は、例えば、ＴＦＡであってもよい）
のいずれかを含む、式（Ｉ）の化合物の調製方法にも関する。
ａ）式（ＩＸ）
【化21】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－１）
【化22】
の化合物を得る工程、
ｂ）式（ＸＶ）
【化23】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－２）
【化24】
の化合物を得る工程、
ｃ）式（ＸＶＩＩ）
【化25】
の化合物を、酸を用いて脱保護して、式（Ｉ－３）
【化26】
の化合物を得る工程
（調製方法において、
工程ａ）、ｂ）及びｃ）では、酸は、例えば、ＴＦＡであってもよい）
のいずれかを含む、式（Ｉ）の化合物の調製方法にも関する。
【0038】
上記の方法によって製造される場合の式（Ｉ）の化合物も、本発明の目的である。
【0039】
適応症及び処置の方法
本発明は、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９のアンタゴニストとして使用することができ、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を介した経路活性化、並びにあらゆる種類のサイトカイン及びあらゆる形態の自己抗体の産生を通じて媒介される自然免疫応答及び適応免疫応答を含むがこれらに限定されない、それぞれの下流の生物学的イベントを阻害する化合物を提供する。したがって、本発明の化合物は、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、好中球、ケラチノサイト、上皮細胞を含むがこれらに限定されない、そのような受容体（複数可）を発現するあらゆる種類の細胞において、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９をブロックするのに有用である。このように、化合物は、全身性エリテマトーデス及びループス腎炎の治療薬又は予防薬として使用することができる。
本発明は、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９のアンタゴニストとして使用することができ、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を介した経路活性化、並びにあらゆる種類のサイトカイン及びあらゆる形態の自己抗体の産生を通じて媒介される自然免疫応答及び適応免疫応答を含むがこれらに限定されない、それぞれの下流の生物学的イベントを阻害する化合物を提供する。したがって、本発明の化合物は、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、好中球、ケラチノサイト、上皮細胞を含むがこれらに限定されない、そのような受容体（複数可）を発現するあらゆる種類の細胞において、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９をブロックするのに有用である。このように、化合物は、全身性エリテマトーデス及びループス腎炎の治療薬又は予防薬として使用することができる。
【0040】
本発明は、処置又は予防を必要とする患者における全身性エリテマトーデス及びループス腎炎の処置又は予防のための方法を提供する。
【0041】
別の実施形態は、処置又は予防を必要とする哺乳動物における全身性エリテマトーデス及びループス腎炎を処置又は予防する方法を含み、該方法は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、立体異性体、互変異性体、プロドラッグ、又はその薬学的に許容され得る塩を該哺乳動物に投与することを含む。
【実施例】
【0042】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより十分に理解される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0043】
略語
本発明は、以下の実施例を参照することによってより十分に理解される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより十分に理解される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0044】
本明細書で使用される略語は、以下のとおりである。
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ｂｏｃ２Ｏ：二炭酸ジ－ｔｅｒｔブチル
ＣｂｚＣｌ：クロロギ酸ベンジル
ＤＡＳＴ：（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド
ＤＥＡ：ジエチルアミン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＥｔＯＡｃ又はＥＡ：酢酸エチル
ＦＡ：ギ酸
ＨＬＭ ヒト肝ミクロソーム
ＩＣ５０：５０％阻害濃度
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析
ＭＳ：質量分析法
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
［Ｐｄ（アリル）Ｃｌ］２：アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体
Ｐｄ［Ｐ（ｏ－ｔｏｌ）３］２：ビス（トリ－ｏ－トリルホスフィン）パラジウム
ＰＥ：石油エーテル
ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ：分取高速液体クロマトグラフィー
ｒｔ：室温
ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２：クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジイソプロポキシ－１，１’－ビフェニル）［２－（２’－アミノ－１，１’－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）第２世代
ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物：［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）
二塩化ジクロロメタン付加物
ＤＡＳＴ：（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド
ＳＦＣ：超臨界流体クロマトグラフィー
ＴＥＡ：トリメチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ｖ／ｖ：体積比
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ｂｏｃ２Ｏ：二炭酸ジ－ｔｅｒｔブチル
ＣｂｚＣｌ：クロロギ酸ベンジル
ＤＡＳＴ：（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド
ＤＥＡ：ジエチルアミン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＥｔＯＡｃ又はＥＡ：酢酸エチル
ＦＡ：ギ酸
ＨＬＭ ヒト肝ミクロソーム
ＩＣ５０：５０％阻害濃度
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析
ＭＳ：質量分析法
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
［Ｐｄ（アリル）Ｃｌ］２：アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体
Ｐｄ［Ｐ（ｏ－ｔｏｌ）３］２：ビス（トリ－ｏ－トリルホスフィン）パラジウム
ＰＥ：石油エーテル
ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ：分取高速液体クロマトグラフィー
ｒｔ：室温
ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２：クロロ（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジイソプロポキシ－１，１’－ビフェニル）［２－（２’－アミノ－１，１’－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）第２世代
ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物：［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）
二塩化ジクロロメタン付加物
ＤＡＳＴ：（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド
ＳＦＣ：超臨界流体クロマトグラフィー
ＴＥＡ：トリメチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ｖ／ｖ：体積比
【0045】
一般的な実験条件
中間体及び最終化合物を、以下の機器のうちの１つを使用して、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した：ｉ）Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１システム及びＱｕａｄ １２／２５カートリッジモジュール；ｉｉ）ＩＳＣＯコンビフラッシュクロマトグラフィー機器。シリカゲルのブランド及び細孔径：ｉ）ＫＰ－ＳＩＬ ６０Å、粒径：４０～６０μｍ；ｉｉ）ＣＡＳ登録番号：シリカゲル：６３２３１－６７－４、粒径：４７～６０ミクロン シリカゲル；ｉｉｉ）Ｑｉｎｇｄａｏ Ｈａｉｙａｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製のＺＣＸ、細孔：２００～３００又は３００～４００。
中間体及び最終化合物を、以下の機器のうちの１つを使用して、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した：ｉ）Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１システム及びＱｕａｄ １２／２５カートリッジモジュール；ｉｉ）ＩＳＣＯコンビフラッシュクロマトグラフィー機器。シリカゲルのブランド及び細孔径：ｉ）ＫＰ－ＳＩＬ ６０Å、粒径：４０～６０μｍ；ｉｉ）ＣＡＳ登録番号：シリカゲル：６３２３１－６７－４、粒径：４７～６０ミクロン シリカゲル；ｉｉｉ）Ｑｉｎｇｄａｏ Ｈａｉｙａｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製のＺＣＸ、細孔：２００～３００又は３００～４００。
【0046】
中間体及び最終化合物を、ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｐｒｅｐ－Ｃ１８（５μｍ、ＯＢＤ（商標）３０×１００ｍｍ）カラム、ＳｕｎＦｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ－Ｃ１８（５μｍ、ＯＢＤ（商標）３０×１００ｍｍ）カラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ－Ｃ１８（１０μｍ、２５×１５０ｍｍ）又はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－Ｃ１８（１０μｍ、２５×１５０ｍｍ）を使用する逆相カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。Ｗａｔｅｒｓ ＡｕｔｏＰ精製システム（サンプルマネージャー２７６７、ポンプ２５２５、検出器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ及びＵＶ ２４８７、溶媒系：アセトニトリル及び水中０．１％水酸化アンモニウム；アセトニトリル及び水中０．１％ＦＡ又はアセトニトリル及び水中０．１％ＴＦＡ）。又はＧｉｌｓｏｎ－２８１精製システム（ポンプ３２２、検出器：ＵＶ １５６、溶媒系：アセトニトリル及び水中０．０５％水酸化アンモニウム；アセトニトリル及び水中０．２２５％ＦＡ；アセトニトリル及び水中０．０５％ＨＣｌ；アセトニトリル及び水中０．０７５％ＴＦＡ；又はアセトニトリル及び水）。
【0047】
ＳＦＣキラル分離について、中間体を、キラルカラム（Ｄａｉｃｅｌ ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ、５μｍ、３０×２５０ｍｍ）、ＡＳ（１０μｍ、３０×２５０ｍｍ）又はＡＤ（１０μｍ、３０×２５０ｍｍ）によって、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｍｕｌｔｉｇｒａｍ ＩＩＩシステムＳＦＣ、Ｗａｔｅｒｓ ８０Ｑ分取ＳＦＣ又はＴｈａｒ８０分取ＳＦＣ、溶媒系：ＣＯ２及びＩＰＡ（ＩＰＡ中の０．５％ＴＥＡ）又はＣＯ２及びＭｅＯＨ（ＭｅＯＨ中の０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ）、背圧１００バール、２５４又は２２０ｎｍの検出紫外線を用いて分離した。
【0048】
化合物のＬＣ／ＭＳスペクトルを、ＬＣ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ（商標）Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５－Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２０２０－Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ、又はＡｇｉｌｅｎｔ Ａｌｌｉａｎｃｅ ６１１０－Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ）を用いて得た。ＬＣ／ＭＳ条件は以下のとおりであった（実行時間３分又は１．５分）：
酸性条件Ｉ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル中０．１％ ＴＦＡ；
酸性条件ＩＩ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０３７５％ＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル中０．０１８７５％ＴＦＡ；
基本条件Ｉ：Ａ：Ｈ２中０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル；
塩基性条件ＩＩ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０２５％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル；
中性条件：Ａ：Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル。
酸性条件Ｉ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル中０．１％ ＴＦＡ；
酸性条件ＩＩ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０３７５％ＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル中０．０１８７５％ＴＦＡ；
基本条件Ｉ：Ａ：Ｈ２中０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル；
塩基性条件ＩＩ：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０２５％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル；
中性条件：Ａ：Ｈ２Ｏ；Ｂ：アセトニトリル。
【0049】
マススペクトル（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ：ＭＳ）：一般的には親核の質量（ｐａｒｅｎｔ ｍａｓｓ）を示すイオンのみが報告され、特に明記しない限り、引用された質量イオン（ｍａｓｓ ｉｏｎ）は正の質量イオン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｉｏｎ）（ＭＨ）＋である。
【0050】
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚを使用して取得した。
【0051】
マイクロ波支援反応は、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｓｉｘｔｙマイクロ波合成装置で行った。空気に敏感な試薬を含む全ての反応を、アルゴン又は窒素雰囲気下で行った。試薬は、特に明記しない限り、市販のものをそのまま使用し、更に精製することなく使用した。
【0052】
調製実施例
以下の実施例は、本発明の意味を説明することを意図しているが、決して本発明の意味の範囲内での限定を表すものではない。
以下の実施例は、本発明の意味を説明することを意図しているが、決して本発明の意味の範囲内での限定を表すものではない。
【0053】
中間体Ａ１
３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン
３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン
【化27】
【0054】
中間体Ａ１
工程１：５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミンの調製
工程１：５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミンの調製
【化28】
【0055】
中間体Ａ１－ａ
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の６－エチルピリジン－２－アミン（５ｇ、４０．９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号２１７１７－２９－３、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ３７７６）、１－ブロモピロリジン－２，５－ジオン（８．０１ｇ、４５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１２８－０８－５、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログＢ８１２５５）の混合物を０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミン（４．１ｇ、収率４９．８％）を橙色固体として得た。ＭＳ：計算値２０２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２０２（Ｍ＋Ｈ＋）．
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の６－エチルピリジン－２－アミン（５ｇ、４０．９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号２１７１７－２９－３、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ３７７６）、１－ブロモピロリジン－２，５－ジオン（８．０１ｇ、４５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１２８－０８－５、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログＢ８１２５５）の混合物を０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミン（４．１ｇ、収率４９．８％）を橙色固体として得た。ＭＳ：計算値２０２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２０２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0056】
工程２：３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジンの調製
【化29】
【0057】
中間体Ａ１
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミン（４．１ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＣｌ２（５．４８ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）、亜硝酸ｔｅｒｔ－ブチル（５．２６ｇ、５１ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号５４０－８０－７、販売業者：ＴＣＩ、カタログＮ０３５７）の混合物を５０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～８０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン（２．８ｇ、収率６２．３％）を黄色液体として得た。ＭＳ：計算値２２０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２２０（Ｍ＋Ｈ＋）．
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の５－ブロモ－６－エチルピリジン－２－アミン（４．１ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＣｌ２（５．４８ｇ、４０．８ｍｍｏｌ）、亜硝酸ｔｅｒｔ－ブチル（５．２６ｇ、５１ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号５４０－８０－７、販売業者：ＴＣＩ、カタログＮ０３５７）の混合物を５０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～８０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン（２．８ｇ、収率６２．３％）を黄色液体として得た。ＭＳ：計算値２２０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２２０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0058】
中間体Ａ２
６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン
６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン
【化30】
【0059】
中間体Ａ２
ジオキサン（２０ｍＬ）中の３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン（２．８ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（３．１２ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（３．５５ｇ、１４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号７３１８３－３４－３、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ．、カタログＳＹ００１３２３）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（９２９ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号９５４６４－０５－４、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ、カタログＳＹ００２６１４）を加え、混合物をＮ２雰囲気下、９０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン（１．９５ｇ、収率５７．４％）を黄色固体として得た。ＭＳ：計算値２６８（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２６８（Ｍ＋Ｈ＋）．
ジオキサン（２０ｍＬ）中の３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジン（２．８ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（３．１２ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（３．５５ｇ、１４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号７３１８３－３４－３、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ．、カタログＳＹ００１３２３）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（９２９ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号９５４６４－０５－４、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ、カタログＳＹ００２６１４）を加え、混合物をＮ２雰囲気下、９０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン（１．９５ｇ、収率５７．４％）を黄色固体として得た。ＭＳ：計算値２６８（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２６８（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0060】
中間体Ａ３
３－ブロモ－６－クロロ－２－イソプロピルピリジン
３－ブロモ－６－クロロ－２－イソプロピルピリジン
【化31】
【0061】
中間体Ａ３
工程１において、６－エチルピリジン－２－アミンの代わりに６－イソプロピルピリジン－２－アミンを使用することによって、中間体Ａ１の調製と同様に、中間体Ａ３を調製した。ＭＳ計算値２３４（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２３４（Ｍ＋Ｈ＋）．
工程１において、６－エチルピリジン－２－アミンの代わりに６－イソプロピルピリジン－２－アミンを使用することによって、中間体Ａ１の調製と同様に、中間体Ａ３を調製した。ＭＳ計算値２３４（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２３４（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0062】
中間体Ａ４
６－クロロ－２－イソプロピル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン
６－クロロ－２－イソプロピル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン
【化32】
【0063】
中間体Ａ４
３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジンの代わりに３－ブロモ－６－クロロ－２－イソプロピル－ピリジンを用いて、中間体Ａ２の調製と同様にして、中間体Ａ４を調製した。ＭＳ計算値２８２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２８２（Ｍ＋Ｈ＋）．
３－ブロモ－６－クロロ－２－エチルピリジンの代わりに３－ブロモ－６－クロロ－２－イソプロピル－ピリジンを用いて、中間体Ａ２の調製と同様にして、中間体Ａ４を調製した。ＭＳ計算値２８２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２８２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0064】
中間体Ａ５
３－ブロモ－６－クロロ－２－（ジフルオロメチル）ピリジン
３－ブロモ－６－クロロ－２－（ジフルオロメチル）ピリジン
【化33】
【0065】
中間体Ａ５
－７８℃に冷却したＤＣＭ（４０ｍＬ）中の３－ブロモ－６－クロロピコリンアルデヒド（１．５ｇ、６．８ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１０６０８１５－６４－６、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ２５９８６９）の溶液に、ＤＡＳＴ（４．３９ｇ、３．６ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号３８０７８－０９－０、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ、カタログＰＢＬＹ８２３１）を添加した。添加後、混合物を－７８℃で更に３０分間撹拌し、次いで、室温に加温し、１０時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、３－ブロモ－６－クロロ－２－（ジフルオロメチル）ピリジン（１．５ｇ、収率９１％）を黄色固体として得た。ＭＳ：計算値２４２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２４２（Ｍ＋Ｈ＋）．
－７８℃に冷却したＤＣＭ（４０ｍＬ）中の３－ブロモ－６－クロロピコリンアルデヒド（１．５ｇ、６．８ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１０６０８１５－６４－６、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ２５９８６９）の溶液に、ＤＡＳＴ（４．３９ｇ、３．６ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号３８０７８－０９－０、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ、カタログＰＢＬＹ８２３１）を添加した。添加後、混合物を－７８℃で更に３０分間撹拌し、次いで、室温に加温し、１０時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＰＥ／ＥＡ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、３－ブロモ－６－クロロ－２－（ジフルオロメチル）ピリジン（１．５ｇ、収率９１％）を黄色固体として得た。ＭＳ：計算値２４２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２４２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0066】
中間体Ｂ１
１，３－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２－オン
１，３－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２－オン
【化34】
【0067】
中間体Ｂ１
ジオキサン（１０ｍＬ）中の５－ブロモ－１，３－ジメチルピリジン－２（１Ｈ）－オン（０．５ｇ、２．４７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号５１４１７－１３－１、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログＪＲＤ０８９０）、ＫＯＡｃ（２９１ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（７５４ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（９０．５ｍｇ、１２４μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、９０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、１，３－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２－オン（６１６ｍｇ、収率１００％）を褐色固体として得た。ＭＳ：計算値２５０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２５０（Ｍ＋Ｈ＋）．
ジオキサン（１０ｍＬ）中の５－ブロモ－１，３－ジメチルピリジン－２（１Ｈ）－オン（０．５ｇ、２．４７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号５１４１７－１３－１、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログＪＲＤ０８９０）、ＫＯＡｃ（２９１ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（７５４ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（９０．５ｍｇ、１２４μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、９０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、１，３－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２－オン（６１６ｍｇ、収率１００％）を褐色固体として得た。ＭＳ：計算値２５０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２５０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0068】
実施例１
５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化35】
【0069】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【0070】
【化36】
【0071】
工程１：５－（６－クロロ－２－エチル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化37】
【0072】
ジオキサン（５ｍＬ）及び水（１ｍＬ）の混合溶媒中の５－ブロモ－１，３－ジメチルピリジン－２（１Ｈ）－オン（２３８ｍｇ、１．１９μｍｏｌ、ＣＡＳ番号５１４１７－１３－１、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログＪＲＤ０８９０）、６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン（中間体Ａ２、３１８ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（２０５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（７２．４ｍｇ、９９μｍｏｌ、ＣＡＳ番号９５４６４－０５－４、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ、カタログＳＹ００２６１４）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下にて８０℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、５－（６－クロロ－２－エチル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（２９７ｍｇ、収率９４．８％）を淡褐色油状物として得た。ＭＳ：計算値２６３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２６３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0073】
工程２：ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化38】
【0074】
ジオキサン（５ｍＬ）中の５－（６－クロロ－２－エチル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（２９７ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレート（２７４ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号７７２７９－２４－４、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢ１３５１７）及びＣｓ２ＣＯ３（５５２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（４３．９ｍｇ、５６．５μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１３７５３２５－６８－０、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ７５３２４６）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（２８７ｍｇ、収率６１．５％）を橙色油状物として得た。ＭＳ：計算値４１３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４１３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0075】
工程３：５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化39】
【0076】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（９０ｍｇ、２１８μｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。残渣を２Ｍ ＫＯＨ溶液（５ｍＬ）で希釈し、得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮すると、５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（６８ｍｇ、収率９９．８％）の粗物質が黄色油状物として得られ、これを更に精製することなく次の工程に直接使用した。ＭＳ：計算値３１３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３１３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0077】
工程４：５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化40】
【0078】
ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中の５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（８０５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）、２－クロロ－５（クロロメチル）－ピリミジン（２．１ｇ、１２．９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１４８４０６－１３－７、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、カタログＰＢＮ２０１２０２０９）及びＫ２ＣＯ３（１．７８ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）の混合物を４０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物をフィルタにかけ、濾液を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（２６０ ｍｇ、収率２３％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値４３９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４３９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0079】
工程５：ｔｅｒｔ－ブチル２－［５－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの調製
【化41】
【0080】
ジオキサン（３ｍＬ）中の５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（６５ｍｇ、１４８μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（６７．６ｍｇ、２９６μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１２５１０１１－０５－８、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、カタログＰＢＮ２０１１１０６３）及びＣｓ２ＣＯ３（９６．５ｍｇ、２９６μｍｏｌ）の混合物に、Ｒｕｐｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（５．７５ｍｇ、７．４μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル２－［５－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（３７ｍｇ、収率３９．６％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値６３１（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値６３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0081】
工程６：５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化42】
【0082】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル２－［５－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（３７ｍｇ、５８．７μｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮し、次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製して、５－［２－エチル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（１７ｍｇ、収率４４．９％）を白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５０（ｓ，２Ｈ），７．５４－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３５－４．２９（ｍ，２Ｈ），４．２８－４．２３（ｍ，２Ｈ），４．１６－４．１１（ｍ，２Ｈ），４．１１－３．７４（ｍ，６Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．５３（ｓ，２Ｈ），３．４１（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．２９－３．２３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値５３１（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0083】
実施例２
５－［２－エチル－６－［４－［［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３ ピリジル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－エチル－６－［４－［［６－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）－３ ピリジル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化43】
【0084】
工程４において、２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリミジン（ＣＡＳ番号１４８４０６－１３－７、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢＮ ２０１２０２０９）の代わりに２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリジン（ＣＡＳ番号７０２５８－１８－３、ベンダー：ＴＣＩ）を使用することにより、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0085】
実施例２（４５ｍｇ、２０．６％）を白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．２０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５０－７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８７－６．８０（ｍ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３６－４．２９（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，２Ｈ），４．０５－３．７５（ｍ，６Ｈ），３．６５－３．６０（ｍ，３Ｈ），３．５９－３．５４（ｍ，２Ｈ），３．４４－３．３４（ｍ，４Ｈ），３．３０－３．２５（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値５３０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５３０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0086】
実施例３
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化44】
【0087】
工程５において、化合物 ｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（ＣＡＳ番号１２５１０１１－０５－８、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢＮ ２０１１１０６３）の代わりにｔｅｒｔ－ブチルＮ－（３－メチルアゼチジン－３－イル）ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＣＡＳ番号１０１８４４３－０１－０、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢ０３０４６）を使用することにより、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0088】
実施例３（１５ｍｇ、４５．８％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５２（ｓ，２Ｈ），７．４８－７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），４．２９－４．１５（ｍ，４Ｈ），４．１５－３．５３（ｍ，７Ｈ），３．４８－３．３３（ｍ，４Ｈ），２．６９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４８９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0089】
実施例４
５－［６－［４－［［２－［（６Ｓ）－６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［６－［４－［［２－［（６Ｓ）－６－アミノ－１，４－オキサゼパン－４－イル］ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化45】
【0090】
工程５において、ｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（ＣＡＳ番号１２５１０１１－０５－８、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢＮ２０１１１０６３）の代わりにｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（６Ｓ）－１，４－オキサゼパン－６－イル］ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＣＡＳ番号２３０６２４７－１１－８、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢ９７９３１）を使用することによって、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0091】
実施例４（７ｍｇ、２９．３％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５１（ｓ，２Ｈ），７．４５－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４－７．３７（ｍ，１Ｈ），６．７９－６．８４（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｄｄ，Ｊ＝１５．０，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），４．１０－４．２１（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｂｒ ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，７Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．４１（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．６９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１９ ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値５１９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５１９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0092】
実施例５
５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化46】
【0093】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化47】
【0094】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化48】
【0095】
ＤＣＭ（１０ｍＬ）のＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３６９ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（６８ｍｇ、２１８μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－ホルミルフェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート（２５３ｍｇ、８７１μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１９７６３８－８３－８、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ、カタログＳＹ０３１４９１）の混合物を、室温で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１９ｍｇ、収率１４．９％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値５８７（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５８７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0096】
工程２：５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化49】
【0097】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレートの溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製し、５－［２－エチル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（１１ｍｇ、収率５５．４％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．４８－７．４２（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８１－６．７６（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），３．７２－３．３２（ｍ，１５Ｈ），３．３０－２．７８（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値４８７（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４８７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0098】
実施例６
５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化50】
【0099】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化51】
【0100】
工程１：５－（６－クロロ－２－イソプロピル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化52】
【0101】
工程１において、６－クロロ－２－エチル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン の代わりに６－クロロ－２－イソプロピル－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン（中間対４）を使用することによって、化合物１ａの調製と同様に化合物６ａを調製した。ＭＳ：計算値２７７（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値２７７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0102】
工程２：５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化53】
【0103】
工程２において、５－（６－クロロ－２－エチル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの代わりに５－（６－クロロ－２－イソプロピル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンを使用することにより、化合物１ｃの調製と同様に化合物６ｂを調製した。ＭＳ：計算値３２７（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３２７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0104】
工程３：５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化54】
【0105】
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中の２－クロロピリミジン－５－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（１８０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号９３３７０２－５５－７、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ．、カタログＰＢ０１５０３）、５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（３００ｍｇ、９１９μｍｏｌ）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）の混合物を、２５℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を次いで、真空で濃縮し、次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（４６０ｍｇ、１１０％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0106】
工程４：５－［２－イソプロピル－６－［４－［［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化55】
【0107】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの代わりに５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンを使用することにより、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0108】
実施例６（３０ｍｇ）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５０（ｓ，２Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３５－４．２１（ｍ，５Ｈ），４．１３（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，２Ｈ），４．０４－３．９３（ｍ，２Ｈ），３．３２（ｂｒ ｓ，１０Ｈ），３．３０－３．０３（ｍ，５Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５４５（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５４５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0109】
実施例７
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化56】
【0110】
工程１：５－［６－［４－［（５－ブロモ－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化57】
【0111】
化合物７ａを、２－クロロピリミジン－５－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅの代わりに５－ブロモピリジン－２－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅを使用することによって、化合物６ｃの調製と同様に調製した。ＭＳ：計算値４９６（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４９６（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0112】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イル－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化58】
【0113】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの代わりに５－［６－［４－［（５－ブロモ－２－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレートを用い、実施例１の調製と同様に、表題化合物を調製した。
【0114】
実施例７（６．０ｍｇ）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．４８（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５５－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４８－７．４４（ｍ，１Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），４．１０－３．７４（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．６０－３．５３（ｍ，４Ｈ），３．４９－３．３９（ｍ，８Ｈ），３．１５－３．０５（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0115】
実施例８
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化59】
【0116】
工程１：５－［６－［４－［（５－クロロピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化60】
【0117】
５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及び２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリミジンの代わりに５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及び２－クロロ－５－（クロロメチル）ピラジン（ＣＡＳ番号１０５９８５－２１－５、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ２２８１２４）を使用することによって、化合物１ｄの調製と同様に化合物８ａを調製した。ＭＳ：計算値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0118】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化61】
【0119】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの代わりに５－［６－［４－［（５－クロロピラジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレートを使用することによって、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0120】
実施例８（２６．０ｍｇ）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５４－８．４０（ｍ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４７－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７４－４．１５（ｍ，４Ｈ），４．０３－３．９３（ｍ，４Ｈ），３．８５－３．３１（ｍ，１２Ｈ），３．２９－３．１６（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｑｄ，Ｊ＝６．７，１３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0121】
実施例９
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（２－ピペラジン－１－イルピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化62】
【0122】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの代わりに５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレートを使用することによって、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0123】
実施例９（２８ｍｇ、５１．６％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５７－８．５２（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７４－４．３８（ｍ，２Ｈ），４．３７－４．２６（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１１（ｍ，４Ｈ），４．１３－３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８５－３．３４（ｍ，８Ｈ），３．２９－２．９７（ｍ，４Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．２２－１．１７（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0124】
実施例１０
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［６－［４－［［２－（３－アミノ－３－メチル－アゼチジン－１－イル）ピリミジン－５－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化63】
【0125】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート代わりに５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルＮ－（３－メチルアゼチジン－３－イル）ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＣＡＳ番号１０１８４４３－０１－０、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ、カタログＰＢ０３０４６）を用いて、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0126】
実施例１０（２８ｍｇ、４２％）を灰白色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．５２（ｓ，２Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４４－４．０１（ｍ，７Ｈ），３．８９－３．３２（ｍ，８Ｈ），３．２９－３．０２（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0127】
実施例１１
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化64】
【0128】
工程１：５－［６－［４－［（６－クロロ－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化65】
【0129】
５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及び２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリミジン．の代わりに５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及び２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリジン（ＣＡＳ番号７０２５８－１８－３、販売業者：ＴＣＩ）を使用することによって、化合物１ｄの調製と同様に化合物１１ａを調製した。ＭＳ：計算値４５２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４５２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0130】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－［４－［（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化66】
【0131】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート代わりに５－［６－［４－［（６－クロロ－３－ピリジル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレートを使用することによって、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0132】
実施例１１（２８ｍｇ、５３．７％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．３０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８３－４．０７（ｍ，４Ｈ），４．０１－３．８０（ｍ，５Ｈ），３．６８－３．３２（ｍ，１０Ｈ），３．２８－２．９２（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0133】
実施例１２
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化67】
【0134】
工程１：５－［６－［４－［（５－クロロピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化68】
【0135】
２－クロロピリミジン－５－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅの代わりに２－クロロピリミジン－５－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（ＣＡＳ番号９３３７０２－５５－７、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ．、カタログＰＢ０１５０３）を使用することによって、化合物６ｃの調製と同様にＣｏｍｐｏｕｎｄ １２ａを調製した。ＭＳ：計算値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４５３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0136】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－［４－［（５－ピペラジン－１－イルピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化69】
【0137】
工程５において、５－［６－［４－［（２－クロロピリミジン－５－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの代わりに５－［６－［４－［（５－クロロピリミジン－２－イル）メチル］ピペラジン－１－イル］－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレートを使用することによって、実施例１の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0138】
実施例１２（３０ｍｇ、４２．５％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．６３（ｓ，２Ｈ），７．４４－７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．３２（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７８－４．０１（ｍ，４Ｈ），３．９１－３．３２（ｍ，１７Ｈ），３．１７－３．０２（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0139】
実施例１３
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化70】
【0140】
工程１において、５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの代わりに５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンを用いることにより、実施例５の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0141】
実施例１３（２８ｍｇ、４３．３％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．４５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４２－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３０（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．７４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７０－４．４１（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．５６－３．４４（ｍ，６Ｈ），３．４１－３．３６（ｍ，４Ｈ），３．２８－２．９８（ｍ，５Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０１（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0142】
実施例１４
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－［（３－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化71】
【0143】
工程１において、５－（２－エチル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル４－（４－ホルミルフェニル）ピペラジン－１－カルボキシレートの代わりに５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン及びｔｅｒｔ－ブチル４－（３－ホルミルフェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート（ＣＡＳ番号１２５７８４９－２５－４、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ１６８７５１）を使用することにより、実施例５の調製と同様に表題化合物を調製した。
【0144】
実施例１４（３９ｍｇ、６６．７％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．６５－７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５８－７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４５－７．３１（ｍ，５Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６０－４．０９（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．５３－３．３２（ｍ，８Ｈ），３．２８－２．９９（ｍ，７Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値５０１（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0145】
実施例１５
５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化72】
【0146】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化73】
【0147】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル２－［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］－７，８－ジヒドロ－５Ｈ－１，６－ナフチリジン－６－カルボキシレートの調製
【化74】
【0148】
ジオキサン（５ｍＬ）中の５－（２－イソプロピル－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（１００ｍｇ、３０６μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル２－クロロ－７，８－ジヒドロ－５Ｈ－１，６－ナフチリジン－６－カルボキシレート（２０６ｍｇ、７６６μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１１５１６６５－１５－４、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ２１６９９０）、Ｃｓ２ＣＯ３（２９９ｍｇ、９１９μｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（４７．６ｍｇ、６１．３μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１３７５３２５－６８－０、販売業者：ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ７５３２４６）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで混合物を真空で濃縮し、次いで残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル２－［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］－７，８－ジヒドロ－５Ｈ－１，６－ナフチリジン－６－カルボキシレート（１００ｍｇ、収率５８．４％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値５５９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５５９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0149】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化75】
【0150】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル２－［４－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］－７，８－ジヒドロ－５Ｈ－１，６－ナフチリジン－６－カルボキシレートの溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製し、５－［２－イソプロピル－６－［４－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（３４ｍｇ）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．６６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４８－７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），３．８９－３．７９（ｍ，８Ｈ），３．６３－３．６１（ｍ，３Ｈ），３．２１－３．１５（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．０７（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，２Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値４５９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４５９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0151】
実施例１６
５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化76】
【0152】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化77】
【0153】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレートの調製
【化78】
【0154】
ジオキサン（３ｍＬ）中の５－（６－クロロ－２－イソプロピル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（１００ｍｇ、３６１μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（８７．２ｍｇ、３６１μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１１５９８２５－３４－９、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ．、カタログＰＢ０７０６３）及びＣｓ２ＣＯ３（２３５ｍｇ、７２３μｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（１４ｍｇ、１８．１μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（１４３ｍｇ、収率８２．２％）が黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値４８２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４８２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0155】
工程２：５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化79】
【0156】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（１４３ｍｇ、２９７μｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。残渣を２Ｍ ＫＯＨ溶液（５ｍＬ）で希釈し、得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮すると、５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（８７ｍｇ、収率７６．８％）の粗物質が淡褐色油状物として得られ、これを更に精製することなく次の工程に直接使用した。ＭＳ：計算値３８２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３８２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0157】
工程３：ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－［２－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化80】
【0158】
ジオキサン（３ｍＬ）中の５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－イソプロピル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（８７ｍｇ、２２８μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル４－（５－ブロモ－２－ピリジル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１５６ｍｇ、４５６μｍｏｌ、ＣＡＳ番号１５３７４７－９７－８、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ、カタログＳＹ１０１５６１）及びＣｓ２ＣＯ３（１４９ｍｇ、４５６μｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（８．８６ｍｇ、１１．４μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－［２－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１６ｍｇ、収率１０．９％）を淡褐色油状物として得た。ＭＳ：計算値６４３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値６４３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0159】
工程４：５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化81】
【0160】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［５－［２－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１６ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮し、次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製して、５－［２－イソプロピル－６－［８－（６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル）－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（９ｍｇ、収率４６．８％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．８９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝９．４，２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３９－７．４６（ｍ，２Ｈ），７．３１－７．３５（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．９１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５８－３．７１（ｍ，６Ｈ），３．１９－３．４６（ｍ，１２Ｈ），２．９９－３．１９（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．１６－１．２３（ｍ，７Ｈ）．ＭＳ：計算値５４３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５４３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0161】
実施例１７
５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化82】
【0162】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化83】
【0163】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－ブロモ－６－（ジフルオロメチル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化84】
【0164】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＣｓ２ＣＯ３（３０２ｍｇ、９２８μｍｏｌ）、３－ブロモ－６－クロロ－２（ジフルオロメチル）ピリジン（１５０ｍｇ、６１９μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルピペラジン－１－カルボキシレート（１７３ｍｇ、９２８μｍｏｌ）の混合物を１２０℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮し、次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［５－ブロモ－６－（ジフルオロメチル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１２３ｍｇ、収率５０．７％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値３９３（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３９３（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0165】
工程２：ｔｅｒｔ－ブチル４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化85】
【0166】
ジオキサン（２ｍＬ）と水（０．５ｍＬ）との混合溶媒中のｔｅｒｔ－ブチル４－（５－ブロモ－６－（ジフルオロメチル）ピリジン－２－イル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１２３ｍｇ、３１４μｍｏｌ）、１，３－ジメチル－５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリジン－２（１Ｈ）－オン（７８．１ｍｇ、３１４μｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（６５ｍｇ、４７０μｍｏｌ）の混合物に、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（１１．５ｍｇ、１５．７μｍｏｌ）を添加し、混合物をジオキサン／Ｈ２Ｏ（５：１、２．５ｍＬ）中、Ｎ２雰囲気下にて８０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１２０ｍｇ、収率８８．２％）を橙色固体として得た。ＭＳ：計算値４３５（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４３５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0167】
工程３：５－［２－（ジフルオロメチル）－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化86】
【0168】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１２０ｍｇ、２７５μｍｏｌ）の溶液に、（１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、次いで混合物を真空で濃縮し、残渣を２Ｍ ＫＯＨ溶液（５ｍＬ）で希釈し、得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮して、５－［２－（ジフルオロメチル）－６－ピペラジン－１－イル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（９２．４ｍｇ、１００％）の粗物質を黄色油状物として得て、これを更に精製することなく次の工程で直接使用した。ＭＳ：計算値３３５（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３３５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0169】
工程４：ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化87】
【0170】
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２’－（ジフルオロメチル）－１，５－ジメチル－６’－（ピペラジン－１－イル）－［３，３’－ビピリジン］－６（１Ｈ）－オン（９２．４ｍｇ、２７５μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－ホルミルフェニル）ピペラジン－１－カルボキシレート（４７２ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）及びＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（５７４ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）の混合物を、２５℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を次いで、真空で濃縮し、次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１２４ｍｇ、収率７５．１％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値６０９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値６０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0171】
工程５：５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化88】
【0172】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［４－［６－（ジフルオロメチル）－５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－２－ピリジル］ピペラジン－１－イル］メチル］フェニル］ピペラジン－１－カルボキシレート（１２５ｍｇ、２０５μｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製し、５－［２－（ジフルオロメチル）－６－［４－［（４－ピペラジン－１－イルフェニル）メチル］ピペラジン－１－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（１５ｍｇ、収率１１．５％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．６２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５０－７．４３（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．１６－７．０７（ｍ，３Ｈ），６．７５－６．４１（ｍ，１Ｈ），４．７７－４．３９（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｓ，２Ｈ），３．６８－３．３３（ｍ，１４Ｈ），３．３１－２．９９（ｍ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ）．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝－１１３．５２（ｄ，Ｊ＝５４．５Ｈｚ，２Ｆ）．ＭＳ：計算値５０９（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0173】
実施例１８
５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化89】
【0174】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化90】
【0175】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル４－［１－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－４－ピペリジル］ピペラジン－１－カルボキシレートの調製
【化91】
【0176】
ジオキサン（５ｍＬ）中の５－（６－クロロ－２－イソプロピル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（８０ｍｇ、２８９μｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－ピペリジル）ピペラジン－１－カルボキシレート（１００ｍｇ、３７１μｍｏｌ、ＣＡＳ番号２０５０５９－２４－１、販売業者：Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ、カタログＢＤ５７１２１）、Ｃｓ２ＣＯ３（１５０ｍｇ、４２５μｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（１５ｍｇ、１９．３μｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル４－［１－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－４－ピペリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（５０ｍｇ、３３．９％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値５１０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５１０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0177】
工程２：５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化92】
【0178】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［１－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－イソプロピル－２－ピリジル］－４－ピペリジル］ピペラジン－１－カルボキシレート（５０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮した。次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製し、５－［２－イソプロピル－６－（４－ピペラジン－１－イル－１－ピペリジル）－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（２４ｍｇ、４６．７％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝７．４４－７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），３．５９－３．５０（ｍ，８Ｈ），３．４９－３．４１（ｍ，１Ｈ），３．１５－３．０６（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，２Ｈ），２．２４－２．１２（ｍ，５Ｈ），１．７６（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．０，１２．２Ｈｚ，２Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．ＭＳ：計算値４１０（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４１０（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0179】
実施例１９
５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン
【化93】
【0180】
表題化合物を、以下のスキームによって調製した。
【化94】
【0181】
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル２－（５－ブロモピリミジン－２－イル）－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの調製
【化95】
【0182】
ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の５－ブロモ－２－クロロ－ピリミジン（３００ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号３２７７９－３６－５、販売業者：Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ、カタログ３２７７９－３６－５）、ｔｅｒｔ－ブチル５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（４２５ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（３２２ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で３時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮し、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル２－（５－ブロモピリミジン－２－イル）－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（５３９ｍｇ、収率９０．２％）を白色固体として得た。ＭＳ：計算値３８５（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３８５（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0183】
工程２：ｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレートの調製
【化96】
【0184】
５－（６－クロロ－２－エチル－３－ピリジル）－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（５５５ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、化合物１ａ）、ｔｅｒｔ－ブチル１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（６０８ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号１１５９８２５－３４－９、販売業者：ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ）、カタログＰＢ０７０６３）及びＣｓ２ＣＯ３（１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の混合物に、ＲｕＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（８１ｍｇ、１１０μｍｏｌ）を添加し、混合物をジオキサン（５ｍＬ）中、Ｎ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を次いで、真空で濃縮し、次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１０％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、ｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（５１７ｍｇ、収率５２．６％）が黄色油状物として得られた。ＭＳ：計算値４６８（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値４６８（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0185】
工程３：５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化97】
【0186】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－カルボキシレート（５１７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、次いで、混合物を真空で濃縮し、次いで、残渣を２Ｍ ＫＯＨ溶液の添加によってｐＨ約１２に調整した。得られた混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮して、５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（３７６ｍｇ、収率９３％）の粗物質を橙色油状物として得た。ＭＳ：計算値３６８（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値３６８（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0187】
工程４：ｔｅｒｔ－ブチル２－［５－［８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレートの調製
【化98】
【0188】
トルエン（５ｍＬ）中の５－［６－（１，３，４，６，７，８，９，９ａ－オクタヒドロピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル）－２－エチル－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オン（２００ｍｇ、０．５４４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル２－（５－ブロモピリミジン－２－イル）－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（２０９．６７ｍｇ、０．５４４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（９９．６７ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号５１３６４－５１－３、販売業者：ＢｅＰｈａｒｍ）、２－（ジ－ｔ－ブチルホスフィノ）ビフェニル（６４．９６ｍｇ、０．２１８ｍｍｏｌ、ＣＡＳ番号２２４３１１－５１－７、販売業者：Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ９１２１２７）の混合物に、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（２０９．２ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下、１１０℃で１６時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を次いで、真空で濃縮し、次いで、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０％～１５％）の勾配で溶出するフラッシュカラムによって精製して、２－［５－［８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（９０ｍｇ、収率２４．６％）を黄色油状物として得た。ＭＳ：計算値６７２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値６７２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0189】
工程５：５－［２－エチル－６－［２－［２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－８－イル］－３－ピリジル］－１，３－ジメチル－ピリジン－２－オンの調製
【化99】
【0190】
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル２－［５－［８－［５－（１，５－ジメチル－６－オキソ－３－ピリジル）－６－エチル－２－ピリジル］－３，４，６，７，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［１，２－ａ］ピラジン－２－イル］ピリミジン－２－イル］－５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－８－カルボキシレート（９０ｍｇ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、次いで、混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を真空で濃縮し、次いで、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製して、６’－（４－（（２－（５－オキサ－２，８－ジアザスピロ［３．５］ノナン－２－イル）ピリミジン－５－イル）メチル）ピペラジン－１－イル）－２’－エチル－１，５－ジメチル－［３，３’－ビピリジン］－６（１Ｈ）－オン２，２，２－トリフルオロアセテート（４２ｍｇ）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２９８ Ｋ）δ（ｐｐｍ）＝８．３２（ｓ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０８（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｄｄ，Ｊ＝４．１，５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８２－３．７４（ｍ，１Ｈ），３．７３－３．６３（ｍ，４Ｈ），３．６３－３．６０（ｍ，３Ｈ），３．５２（ｓ，２Ｈ），３．４７－３．３３（ｍ，３Ｈ），３．３０－３．１７（ｍ，４Ｈ），３．１４－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：計算値５７２（Ｍ＋Ｈ＋）、実測値５７２（Ｍ＋Ｈ＋）．
【0191】
実施例２０
【0192】
以下の試験は、ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－７／８／９細胞アッセイにおいて式（Ｉ）及び式（Ｉａ）の化合物の活性を決定するために行った。
【0193】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－７細胞アッセイ：
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－７細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ７、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞は本来、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ７の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ７リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ７細胞を刺激することによってＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導した。したがって、レポーターの発現は、２０時間のインキュベーションの間、Ｒ８４８（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）等のリガンドの刺激下でＴＬＲ７アンタゴニストによって低下した。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーター活性を、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変色する検出媒体であるＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して波長６４０ｎｍで測定した。
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－７細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ７、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞は本来、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ７の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ７リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ７細胞を刺激することによってＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導した。したがって、レポーターの発現は、２０時間のインキュベーションの間、Ｒ８４８（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）等のリガンドの刺激下でＴＬＲ７アンタゴニストによって低下した。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーター活性を、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変色する検出媒体であるＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して波長６４０ｎｍで測定した。
【0194】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ７細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍＬノルモシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清を含み、１％の最終ＤＭＳＯ及び１０μＬの上記ＤＭＥＭ中の２０μＭ Ｒ８４８の存在下で連続希釈した２０μＬの試験化合物を加えたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）の９６ウェルプレートに、１７０μＬの体積で２５０，０００～４５０，０００細胞／ｍＬの密度にてインキュベートして、ＣＯ２インキュベーター内で３７°Ｃの下で２０時間インキュベーションを行った。その後、各ウェルからの２０μＬの上清を、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ基質溶液で３７℃の下で２時間インキュベートし、分光光度計を使用して、６２０～６５５ｎｍにおける吸光度を読み取った。ＴＬＲ７の活性化が下流のＮＦ－κＢの活性化につながるシグナル伝達経路は広く受け入れられているため、ＴＬＲ７アンタゴニストを評価するために同様のレポーターアッセイを改良した。
【0195】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－８細胞アッセイ：
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－８細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ８、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞はもともと、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ８の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ８リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞を刺激することによりＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導した。したがって、レポーターの発現は、２０時間のインキュベーションのために、Ｒ８４８等のリガンドの刺激下でＴＬＲ８アンタゴニストによって低減された。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーターの活性は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を用いて、波長６４０ｎｍで測定され、検出媒体は、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変化した。
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－８細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ８、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞はもともと、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ８の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ８リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞を刺激することによりＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導した。したがって、レポーターの発現は、２０時間のインキュベーションのために、Ｒ８４８等のリガンドの刺激下でＴＬＲ８アンタゴニストによって低減された。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーターの活性は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を用いて、波長６４０ｎｍで測定され、検出媒体は、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変化した。
【0196】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ８細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍＬノルモシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清を含み、１％の最終ＤＭＳＯ及び１０μＬの上記ＤＭＥＭ中の６０μＭ Ｒ８４８の存在下で連続希釈した２０μＬの試験化合物を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の９６ウェルプレートに、１７０μＬの体積で２５０，０００～４５０，０００細胞／ｍＬの密度にてインキュベートして、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃の下で２０時間インキュベーションを行った。その後、各ウェルからの２０μＬの上清を１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ基質溶液で３７℃の下で２時間インキュベートし、分光光度計を使用して、６２０～６５５ｎｍにおける吸光度を読み取った。ＴＬＲ８の活性化が下流のＮＦ－κＢの活性化につながるシグナル伝達経路は広く受け入れられているため、ＴＬＲ８アンタゴニストを評価するために同様のレポーターアッセイを改良した。
【0197】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－９細胞アッセイ：
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－９細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ９、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞はもともと、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ９の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ９リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞を刺激することによりＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導された。したがって、レポーターの発現は、ＯＤＮ２００６（カタログ番号：ｔｌｒｌ－２００６－１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）等のリガンドの刺激下での２０時間のインキュベーションのために、ＴＬＲ９のアンタゴニストによって低下した。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーターの活性は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、波長６４０ｎｍで測定され、検出培地は、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変化した。
安定したＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－９細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ９、米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。これらの細胞はもともと、ＮＦ－κＢの活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ９の刺激を研究するために設計された。ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を、５つのＮＦ－κＢ及びＡＰ－１結合部位に融合したＩＦＮ－β最小プロモータの制御下に置いた。ＳＥＡＰは、ＴＬＲ９リガンドでＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞を刺激することによりＮＦ－κＢ及びＡＰ－１を活性化することによって誘導された。したがって、レポーターの発現は、ＯＤＮ２００６（カタログ番号：ｔｌｒｌ－２００６－１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）等のリガンドの刺激下での２０時間のインキュベーションのために、ＴＬＲ９のアンタゴニストによって低下した。細胞培養上清のＳＥＡＰレポーターの活性は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）キット（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｂ１、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、波長６４０ｎｍで測定され、検出培地は、アルカリホスファターゼの存在下で紫色又は青色に変化した。
【0198】
ＨＥＫ２９３－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ９細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍＬノルモシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清を含み、１％の最終ＤＭＳＯ及び１０μＬの上記ＤＭＥＭ中の２０μＭ ＯＤＮ２００６の存在下で連続希釈した２０μＬの試験化合物を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の９６ウェルプレートに、１７０μＬの体積で２５０，０００～４５０，０００細胞／ｍＬの密度にてインキュベートして、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃の下で２０時間インキュベーションを行った。その後、各ウェルからの２０μＬの上清を１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ基質溶液で３７℃の下で２時間インキュベートし、分光光度計を使用して、６２０～６５５ｎｍにおける吸光度を読み取った。ＴＬＲ９の活性化が下流のＮＦ－κＢの活性化につながるというシグナル伝達経路は広く受け入れられているため、同様のレポーターアッセイをＴＬＲ９アンタゴニストの評価用に改良した。
【0199】
式（Ｉ）の化合物は、０．１μＭ未満のヒトＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８阻害活性（ＩＣ５０値）、１μＭ未満のＴＬＲ９阻害活性を有する。本発明の化合物の活性データを表１に示した。
【表1】
【0200】
実施例２１
ｈＥＲＧチャネル阻害アッセイ：
ｈＥＲＧチャネル阻害アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏでの心臓毒性に関連するｈＥＲＧ阻害を呈する化合物を同定する非常に高感度な測定である。ｈＥＲＧ Ｋ＋チャネルは、ヒトにおいてクローン化されており、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株において安定して発現した。ＣＨＯｈＥＲＧ細胞をパッチクランプ（電圧クランプ、細胞全体）実験に使用した。細胞を電圧パターンで刺激して、ｈＥＲＧチャネルを活性化し、ＩＫｈＥＲＧ電流（ｈＥＲＧチャネルの急速遅延外向き整流器カリウム電流（ｒａｐｉｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｏｕｔｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ））を伝導した。細胞を数分間安定させた後、ＩＫｈＥＲＧの振幅及び動態を刺激周波数０．１Ｈｚ（６ｂｐｍ）で記録した。その後、試験化合物を、漸増濃度で調製物に添加した。各濃度について、定常状態の効果に到達するための試みを行い、これは、通常３～１０分以内に達成され、その時点で、次に高い濃度が適用された。ＩＫｈＥＲＧの振幅及び動態は、薬剤の各濃度において記録して、これを対照値（１００％とする）と比較した。（参考文献：Ｒｅｄｆｅｒｎ ＷＳ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｌ，Ｄａｖｉｓ ＡＳ，Ｌｙｎｃｈ ＷＧ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｉ，Ｐａｌｅｔｈｏｒｐｅ Ｓ，Ｓｉｅｇｌ ＰＫ，Ｓｔｒａｎｇ Ｉ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＡＴ，Ｗａｌｌｉｓ Ｒ，Ｃａｍｍ ＡＪ，Ｈａｍｍｏｎｄ ＴＧ．２００３；Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ＱＴ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｒｓａｄｅ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ ｆｏｒ ａ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｄｒｕｇｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５８：３２－４５，Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ＭＣ，Ｔｒｉｓｔａｎｉ－Ｆｉｒｏｕｚｉ Ｍ．２００６；ｈＥＲＧ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ ４４０：４６３－４６９，Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｒ，Ｌｅｉｓｈｍａｎ Ｄ，Ｗａｌｋｅｒ Ｄ．２００２；Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｆｏｒ ＱＴ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．５：１１６－２６）。
ｈＥＲＧチャネル阻害アッセイ：
ｈＥＲＧチャネル阻害アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏでの心臓毒性に関連するｈＥＲＧ阻害を呈する化合物を同定する非常に高感度な測定である。ｈＥＲＧ Ｋ＋チャネルは、ヒトにおいてクローン化されており、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株において安定して発現した。ＣＨＯｈＥＲＧ細胞をパッチクランプ（電圧クランプ、細胞全体）実験に使用した。細胞を電圧パターンで刺激して、ｈＥＲＧチャネルを活性化し、ＩＫｈＥＲＧ電流（ｈＥＲＧチャネルの急速遅延外向き整流器カリウム電流（ｒａｐｉｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｏｕｔｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ））を伝導した。細胞を数分間安定させた後、ＩＫｈＥＲＧの振幅及び動態を刺激周波数０．１Ｈｚ（６ｂｐｍ）で記録した。その後、試験化合物を、漸増濃度で調製物に添加した。各濃度について、定常状態の効果に到達するための試みを行い、これは、通常３～１０分以内に達成され、その時点で、次に高い濃度が適用された。ＩＫｈＥＲＧの振幅及び動態は、薬剤の各濃度において記録して、これを対照値（１００％とする）と比較した。（参考文献：Ｒｅｄｆｅｒｎ ＷＳ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｌ，Ｄａｖｉｓ ＡＳ，Ｌｙｎｃｈ ＷＧ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｉ，Ｐａｌｅｔｈｏｒｐｅ Ｓ，Ｓｉｅｇｌ ＰＫ，Ｓｔｒａｎｇ Ｉ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＡＴ，Ｗａｌｌｉｓ Ｒ，Ｃａｍｍ ＡＪ，Ｈａｍｍｏｎｄ ＴＧ．２００３；Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ＱＴ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｒｓａｄｅ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ ｆｏｒ ａ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｄｒｕｇｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５８：３２－４５，Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ＭＣ，Ｔｒｉｓｔａｎｉ－Ｆｉｒｏｕｚｉ Ｍ．２００６；ｈＥＲＧ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ ４４０：４６３－４６９，Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｒ，Ｌｅｉｓｈｍａｎ Ｄ，Ｗａｌｋｅｒ Ｄ．２００２；Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｆｏｒ ＱＴ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．５：１１６－２６）。
【0201】
ｈＥＲＧの結果を表２に示す。３０よりも大きな安全比（ｈＥＲＧ ＩＣ２０／ＥＣ５０）は、潜在的なｈＥＲＧ関連心臓毒性からＴＬＲ７／８／９経路を阻害することによって、薬理学を識別するのに十分なウィンドウを示唆している。ｈＥＲＧ易罹病性を評価するために早期選択性指数として機能する、以下のｈＥＲＧ ＩＣ２０／ＴＬＲ７／８／９ ＩＣ５０の計算によると、明確に参照化合物ＥＲ－８８７２５８、ＥＲ－８８８２８５、ＥＲ－８８８２８６、Ｒ１、及びＲ２は、本発明の化合物と比較して安全性ウィンドウが非常に狭い。
【表2】
【0202】
実施例２２
ヒトＰＢＭＣ細胞ベースのアッセイ
ＨＥＫレポーター細胞株とは異なり、ヒト末梢血単核細胞（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、主にリンパ球、単球、樹状細胞からなる血液中の初代ヒト免疫細胞を表す。これらの細胞は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、又はＴＬＲ９を発現するため、それぞれのリガンド刺激に対する天然のレスポンダである。これらのＴＬＲが活性化すると、ＰＢＭＣはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで同様のサイトカイン及びケモカインを分泌するため、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬＲ７／８／９アンタゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏの効力は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的応答に容易に変換可能である。
ヒトＰＢＭＣ細胞ベースのアッセイ
ＨＥＫレポーター細胞株とは異なり、ヒト末梢血単核細胞（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、主にリンパ球、単球、樹状細胞からなる血液中の初代ヒト免疫細胞を表す。これらの細胞は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、又はＴＬＲ９を発現するため、それぞれのリガンド刺激に対する天然のレスポンダである。これらのＴＬＲが活性化すると、ＰＢＭＣはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで同様のサイトカイン及びケモカインを分泌するため、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬＲ７／８／９アンタゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏの効力は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的応答に容易に変換可能である。
【0203】
新たに採取したリチウムヘパリン化（リチウムヘパリンプラス採血管、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標））健康ドナー全血から、密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が単離された。簡単に説明すると、５０ｍＬの血液を、多孔質バリア付きの５０ｍＬ円すい管（Ｌｅｕｃｏｓｅｐ ｔｕｂｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）において、２５ｍＬ ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋非含有）で希釈し、回転後に１５．５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを水平に寝かせた。ブレーキをオフ位置にした状態で、管を８００×ｇ（１９４６ｒｐｍ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣをバフィーコートから収集した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、赤血球を２ｍＬの懸濁液（Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）によって室温で５～１０分間溶解させた。ＰＢＳでの最終洗浄後、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地において、最終濃度２×１０６細胞／ｍＬでＰＢＭＣを再懸濁させ、組織培養処理した丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）において、１５０μＬ／ウェル（３×１０５細胞／ウェル）でプレーティングした。
【0204】
可溶化され、１００％ＤＭＳＯにおいて連続希釈されたアンタゴニスト化合物（本発明の化合物）を細胞に２回添加して、１％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）の最終濃度を得た。ＰＢＭＣを、アンタゴニスト化合物とともに３７°Ｃ、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、（最終濃度を示す）以下のように、ウェルあたり４８μＬの完全培地に多様なＴＬＲアゴニスト試薬を添加した。ＴＬＲ９の場合、１μＭのＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ＴＬＲ８の場合、１μｇ／ｍＬのＯＲＮ ０６／ＬｙｏＶｅｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の場合、１μｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）。ＰＢＭＣを、５％ＣＯ２で３７°Ｃで一晩インキュベートした。細胞培養上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘＴＭ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は製造元の推奨プロトコル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ったＥＬＩＳＡ手順によって様々なヒトサイトカインのレベルを評価した。細胞の生存率もまたＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって確認された。
【表3】
【0205】
実施例２３
ヒトミクロソーム安定性アッセイ
ヒトミクロソーム安定性アッセイを用いて、ヒト肝ミクロソームにおける試験化合物の代謝安定性の早期評価を行う。
ヒトミクロソーム安定性アッセイ
ヒトミクロソーム安定性アッセイを用いて、ヒト肝ミクロソームにおける試験化合物の代謝安定性の早期評価を行う。
【0206】
ヒト肝ミクロソーム（カタログ番号：４５２１１７、Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＵＳＡ）；カタログ番号：Ｈ２６１０、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ（ＵＳＡ））を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で３７°Ｃにて１０分間、試験化合物とともにプレインキュベートした。ＮＡＤＰＨ再生システムを加えて反応を開始した。最終的なインキュベーション混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に１μＭの試験化合物、０．５ｍｇ／ｍＬの肝臓ミクロソームタンパク質、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＡＤＰ、１ユニット／ｍＬのイソクエン酸脱水素酵素及び６ｍＭイソクエン酸を含有していた。３７℃で、０、３、６、９、１５、及び３０分のインキュベーション時間後に、３００μＬの冷アセトニトリル（内部標準物質を含む）を１００μＬのインキュベーション混合物に加えて、この反応を終止させた。沈殿及び遠心分離の後、試料中に残存している化合物の量を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。また、０分及び３０分でＮＡＤＰＨ再生システムなしの対照も調製し、分析した。本発明の化合物は、上述のアッセイにおいて測定された良好なヒト肝ミクロソーム安定性を示した。結果を以下の表４に示す。
【表4】
【0207】
実施例２４
３Ｔ３ｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性アッセイ
光毒性は、特定の化学物質を皮膚に最初に曝露し、その後に光に曝露した後に誘発される毒性反応、又は化学物質を全身に投与した後に皮膚照射することで同様に誘発される毒性反応として定義されている。本研究で使用したアッセイは、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いた簡便なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを使用して、化学物質の光毒性の可能性を検出するように設計されている。この試験の原理は、非毒性用量のＵＶＡ光に曝露した場合とそうでない場合に試験した、化学物質の細胞毒性を比較することである。細胞毒性は、処置の１日後に生体色素であるニュートラルレッドの取り込みによって決定される、細胞の増殖率の用量依存性の低下として表される。
３Ｔ３ｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性アッセイ
光毒性は、特定の化学物質を皮膚に最初に曝露し、その後に光に曝露した後に誘発される毒性反応、又は化学物質を全身に投与した後に皮膚照射することで同様に誘発される毒性反応として定義されている。本研究で使用したアッセイは、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いた簡便なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを使用して、化学物質の光毒性の可能性を検出するように設計されている。この試験の原理は、非毒性用量のＵＶＡ光に曝露した場合とそうでない場合に試験した、化学物質の細胞毒性を比較することである。細胞毒性は、処置の１日後に生体色素であるニュートラルレッドの取り込みによって決定される、細胞の増殖率の用量依存性の低下として表される。
【0208】
１．方法
試験項目のストック溶液の調製及び投与量
細胞の曝露を開始する直前に、少量の物質を秤量し、ＤＭＳＯに新たに配合した。このストック溶液又はＤＭＳＯによる適切な希釈液を細胞懸濁液に加えて、必要な最終濃度を得た。全ての溶液は、一般的にエッペンドルフキャップ中で調製し、使用後に廃棄した。
試験項目のストック溶液の調製及び投与量
細胞の曝露を開始する直前に、少量の物質を秤量し、ＤＭＳＯに新たに配合した。このストック溶液又はＤＭＳＯによる適切な希釈液を細胞懸濁液に加えて、必要な最終濃度を得た。全ての溶液は、一般的にエッペンドルフキャップ中で調製し、使用後に廃棄した。
【0209】
参照物質
クロルプロマジン（ＨＣＬ）（Ｓｉｇｍａ、バッチ／ロット番号：１２０Ｍ１３２８Ｖ）、試験濃度：３００μｇ／ｍＬ、溶媒：ＰＢＳ／３％ＤＭＳＯ
クロルプロマジン（ＨＣＬ）（Ｓｉｇｍａ、バッチ／ロット番号：１２０Ｍ１３２８Ｖ）、試験濃度：３００μｇ／ｍＬ、溶媒：ＰＢＳ／３％ＤＭＳＯ
【0210】
ＵＶ吸収スペクトルの測定
それ自体での、又はＵＶ－Ａ若しくはＵＶ－Ｂの事前照射による吸収スペクトルを、Ｌａｍｂｄａ－２スペクトル光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて２４０ｎｍ～４００ｎｍの間で記録した。
それ自体での、又はＵＶ－Ａ若しくはＵＶ－Ｂの事前照射による吸収スペクトルを、Ｌａｍｂｄａ－２スペクトル光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて２４０ｎｍ～４００ｎｍの間で記録した。
【表5】
【0211】
光毒性の決定
この試験では、ＩＮＶＩＴＴＯＸプロトコルＮｏ ７８（ＥＲＧＡＴＴ／ＦＲＡＭＥ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．ＩＮＶＩＴＴＯＸ ＰＲＯＴＯＣＯＬ Ｎｏ ７８．３Ｔ３ ＮＲＵ Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ．Ｍａｒｃｈ １９９４）に従って修正したＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｐｕｅｒｎｅｒ（Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ，Ｅ，Ｐｕｅｒｎｅｒ ＪＡ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．１９８５；２４：１１９－１２４．）のニュートラルレッド取り込み（ＮＲＵ）アッセイを、試験項目の可能性のある光毒性の可能性を調べるために適合させた。このアッセイは、培養マウス線維芽細胞のリソソームへのニュートラルレッド色素の能動的取り込みに基づいている。リソソーム膜は多くの光毒性化合物の作用部位であることが知られているため、このアッセイは光毒性損傷の可能性の測定値を提供することができる。
この試験では、ＩＮＶＩＴＴＯＸプロトコルＮｏ ７８（ＥＲＧＡＴＴ／ＦＲＡＭＥ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．ＩＮＶＩＴＴＯＸ ＰＲＯＴＯＣＯＬ Ｎｏ ７８．３Ｔ３ ＮＲＵ Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ．Ｍａｒｃｈ １９９４）に従って修正したＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｐｕｅｒｎｅｒ（Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ，Ｅ，Ｐｕｅｒｎｅｒ ＪＡ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．１９８５；２４：１１９－１２４．）のニュートラルレッド取り込み（ＮＲＵ）アッセイを、試験項目の可能性のある光毒性の可能性を調べるために適合させた。このアッセイは、培養マウス線維芽細胞のリソソームへのニュートラルレッド色素の能動的取り込みに基づいている。リソソーム膜は多くの光毒性化合物の作用部位であることが知られているため、このアッセイは光毒性損傷の可能性の測定値を提供することができる。
【0212】
細胞培養の調製
マウス線維芽細胞クローンＡ３１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１６３－継代番号１０８）を、ｓＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトアビジンを補充した、ダルベッコの最小必須培地）を含む１７５ｃｍ２の組織培養グレードフラスコ中で６％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で培養した。細胞がコンフルエンスに近づく前に、トリプシン処理によってフラスコから取り出した。アッセイで使用する前に、細胞を１００μｌの容量のｓＤＭＥＭ中で１×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、２４時間付着させた。
マウス線維芽細胞クローンＡ３１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１６３－継代番号１０８）を、ｓＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトアビジンを補充した、ダルベッコの最小必須培地）を含む１７５ｃｍ２の組織培養グレードフラスコ中で６％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で培養した。細胞がコンフルエンスに近づく前に、トリプシン処理によってフラスコから取り出した。アッセイで使用する前に、細胞を１００μｌの容量のｓＤＭＥＭ中で１×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、２４時間付着させた。
【0213】
試験項目への曝露
マウス線維芽細胞とのインキュベーションのために、試験項目をＰＢＳ／３％ＤＭＳＯで希釈した（詳細な濃度は結果を参照）。
マウス線維芽細胞とのインキュベーションのために、試験項目をＰＢＳ／３％ＤＭＳＯで希釈した（詳細な濃度は結果を参照）。
【0214】
培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ Ｒｅｆ ２１８８５－０２５）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｒｅｆ １０２７０－１０６）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｒｅｆ １５１４０－１２２））をウェルから除き、マウス線維芽細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、試験項目を含む１００μＬのＰＢＳ／３％ＤＭＳＯを添加し、標的細胞を６％ＣＯ２で３７℃にて１時間インキュベーションした。
【0215】
ＵＶ曝露
各試験項目について、マイクロタイタープレートを表６に従って調製した。「ＵＶＡプレート」は、約５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光に曝露し、「ダークプレート」は暗所に保管し、細胞毒性対照として機能した。塩酸クロルプロマジンを含むプレートは、陽性対照として機能した。ＵＶフラックスを、ＵＶメーター（Ｄｒ．Ｇｒｏｅｂｅｌ ＲＭ２１）で測定した。
各試験項目について、マイクロタイタープレートを表６に従って調製した。「ＵＶＡプレート」は、約５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光に曝露し、「ダークプレート」は暗所に保管し、細胞毒性対照として機能した。塩酸クロルプロマジンを含むプレートは、陽性対照として機能した。ＵＶフラックスを、ＵＶメーター（Ｄｒ．Ｇｒｏｅｂｅｌ ＲＭ２１）で測定した。
【0216】
ＵＶ照射後、試験項目をウェルから除き（ＰＢＳによる１回の洗浄工程）、ｓＤＭＥＭと交換した。次いで、標的細胞を６％ＣＯ２中で３７℃にて一晩インキュベーションした。
【表6】
【0217】
９６ウェルマイクロタイタープレートを以下のように調製した：
各プレートは、標準細胞生存率曲線の算出のため、ニュートラルレッド溶液（０％標準－Ｓ１）でインキュベートされていないか、又はニュートラルレッド（１００％標準－Ｓ２）で染色された細胞と溶媒を含むウェルを含んでいたが、試験項目は含んでいなかった。Ｕ０１～Ｕ０８でラベル付けされたウェルには、異なる試験項目の濃度が含まれていた。
各プレートは、標準細胞生存率曲線の算出のため、ニュートラルレッド溶液（０％標準－Ｓ１）でインキュベートされていないか、又はニュートラルレッド（１００％標準－Ｓ２）で染色された細胞と溶媒を含むウェルを含んでいたが、試験項目は含んでいなかった。Ｕ０１～Ｕ０８でラベル付けされたウェルには、異なる試験項目の濃度が含まれていた。
【0218】
ニュートラルレッドの取り込み
すぐに使用できるニュートラルレッド（ＮＲ）染色溶液を以下のように新たに調製した：
● ０．４％のストック水溶液を遮光し、使用前にフィルタにかけてＮＲ結晶を除去した。
● 次いで、１：４０希釈のストック溶液をｓＤＭＥＭ中で調製し、細胞に添加した。
すぐに使用できるニュートラルレッド（ＮＲ）染色溶液を以下のように新たに調製した：
● ０．４％のストック水溶液を遮光し、使用前にフィルタにかけてＮＲ結晶を除去した。
● 次いで、１：４０希釈のストック溶液をｓＤＭＥＭ中で調製し、細胞に添加した。
【0219】
インキュベーション後、アッセイするウェルにニュートラルレッドを含むｓＤＭＥＭを１００μＬ充填した。標的細胞をＮＲとともに６％ＣＯ２中で３７℃にて３時間インキュベーションした。
【0220】
ニュートラルレッドの取り込みの測定
混入しなかったニュートラルレッドを標的細胞から除去し、少なくとも１００μＬのＰＢＳでウェルを洗浄した。次いで、１５０μＬのニュートラルレッド脱着溶液（１％氷酢酸、ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ中５０％エタノール）を添加し、混入した色素を定量的に抽出した。ニュートラルレッドが細胞から抽出されて均一な溶液を形成するまで、マイクロタイタープレートシェーカー上でプレートを少なくとも１０分間激しく振とうした後、得られる着色溶液の吸光度を、５４０ｎｍでＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。
混入しなかったニュートラルレッドを標的細胞から除去し、少なくとも１００μＬのＰＢＳでウェルを洗浄した。次いで、１５０μＬのニュートラルレッド脱着溶液（１％氷酢酸、ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ中５０％エタノール）を添加し、混入した色素を定量的に抽出した。ニュートラルレッドが細胞から抽出されて均一な溶液を形成するまで、マイクロタイタープレートシェーカー上でプレートを少なくとも１０分間激しく振とうした後、得られる着色溶液の吸光度を、５４０ｎｍでＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。
【0221】
細胞生存率の算出
細胞生存率は、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて算出した。最初に、次の式に基づいて、プログラムの線形曲線フィットオプションを用いて２点標準曲線（０％及び１００％の生存率）を算出した：
Ｙ＝Ａ＋（Ｂ×Ｘ）
（Ａ＝直線のｙ切片；Ｂ＝直線の傾き；
０％の細胞生存率＝溶媒を含むが、試験項目とニュートラルレッドを含まない細胞。
１００％の細胞生存率＝溶媒とニュートラルレッドを含むが、試験項目を含まない細胞）
細胞生存率は、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて算出した。最初に、次の式に基づいて、プログラムの線形曲線フィットオプションを用いて２点標準曲線（０％及び１００％の生存率）を算出した：
Ｙ＝Ａ＋（Ｂ×Ｘ）
（Ａ＝直線のｙ切片；Ｂ＝直線の傾き；
０％の細胞生存率＝溶媒を含むが、試験項目とニュートラルレッドを含まない細胞。
１００％の細胞生存率＝溶媒とニュートラルレッドを含むが、試験項目を含まない細胞）
【0222】
これにより、試験化学物質の濃度を上昇させながらインキュベーションした細胞の生存率を算出した。クロルプロマジン（ＨＣｌ）は、実験の陽性対照として機能した。
【0223】
ＩＣ５０値の算出
全ての計算を、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ分析ソフトウェアパッケージを使用して行った
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｌ．ｅｄｕ／ｊｂｐｃ／ｆｉｌｅｓ／２０１４／０５／ＳｏｆｔＭａｘ＿Ｐｒｏ＿Ｕｓｅｒ＿Ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆを参照）。
全ての計算を、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ分析ソフトウェアパッケージを使用して行った
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｌ．ｅｄｕ／ｊｂｐｃ／ｆｉｌｅｓ／２０１４／０５／ＳｏｆｔＭａｘ＿Ｐｒｏ＿Ｕｓｅｒ＿Ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆを参照）。
【0224】
光毒性の判別係数の算出
光毒性の可能性を評価するために、ＵＶ曝露を行った場合とそうでない場合に決定したＩＣ５０値を比較した。
係数＝ＩＣ５０（－ＵＶ）／ＩＣ５０（＋ＵＶ）
光毒性の可能性を評価するために、ＵＶ曝露を行った場合とそうでない場合に決定したＩＣ５０値を比較した。
係数＝ＩＣ５０（－ＵＶ）／ＩＣ５０（＋ＵＶ）
【0225】
光毒性試験化学物質と非光毒性試験化学物質とを区別するため、＞５のカットオフ係数を適用した（Ｌｉｅｂｓｃｈ Ｍ，Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ，Ｂａｌｌｓ Ｍ，Ｂｒａｎｄ Ｍ，Ｄｏｅｒｉｎｇ Ｂ，Ｄｕｐｕｉｓ Ｊ，Ｈｏｌｚｈｕｅｔｅｒ ＨＧ，Ｋｌｅｃａｋ Ｇ，Ｌ．Ｅｐｌａｔｔｅｎｉｅｒ Ｈ，Ｌｏｖｅｌｌ Ｗ，Ｍａｕｒｅｒ Ｔ，Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｆ，Ｍｏｏｒｅ Ｌ，Ｐａｐｅ Ｗ，Ｐｆａｎｎｅｎｂｅｃｋｅｒ Ｕ，Ｐｏｔｔｈａｓｔ ＪＭ，Ｄｅ Ｓｉｌｖａ Ｏ，Ｓｔｅｉｌｉｎｇ Ｗ，Ｗｉｌｌｓｈａｗ Ａ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＣ／ＣＯＬＩＰＡ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｉｎ：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｋｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ，Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ；Ｖｏｌ．１０．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，－Ｅｄｓ．Ｒｏｕｇｉｅｒ Ａ，Ｍａｉｂａｃｈ ＨＩ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＡＭ；Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ Ｐｕｂｌ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ １９９４，ｐｐ．２４３－２５１）。
【0226】
試験した最高濃度であってもマウス線維芽細胞に対して細胞毒性はないが、ＵＶ曝露後に細胞生存率の用量依存性の強い低下を示す試験項目も光毒性と見なされる（Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ，Ｂａｌｌｓ Ｍ，Ｄｕｐｕｉｓ Ｊ，Ｐａｐｅ ＷＪＷ，Ｐｅｃｈｏｖｉｔｃｈ Ｇ，Ｓｉｌｖａ ＤｅＯ，Ｈｏｌｚｈｕｅｔｔｅｒ，ＨＧ，Ｃｌｏｔｈｉｅｒ Ｒ，Ｄｅｓｏｌｌｅ Ｐ，Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ Ｆ，Ｌｉｅｂｓｃｈ Ｍ，Ｌｏｗｅｌｌ ＷＷ，Ｍａｕｒｅｒ Ｔ，Ｐｆａｎｎｅｎｂｅｃｋｅｒ Ｕ，Ｐｏｔｔｈａｓｔ ＪＭ，Ｃｓａｔｏ Ｍ，Ｓｌａｄｏｗｓｋｉ Ｄ，Ｓｔｅｉｌｉｎｇ Ｗ，Ｂｒａｎｔｏｍ Ｐ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＥＵ／ＣＯＬＩＰＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈａｓｅ ＩＩ（ｂｌｉｎｄ ｔｒｉａｌ）．Ｐａｒｔ １：Ｔｈｅ ３Ｔ３ ＮＲＵ ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １９９８，１２：３０５－３２７）。
【0227】
試験結果を以下に示すが、本発明の化合物は非常に良好な光毒性プロファイルを示した。
【表7】
【0228】
実施例２５
並列人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）
ＰＡＭＰＡ（並行人工膜透過性アッセイ）は、薬物候補の第一選択透過性スクリーニングである。このアッセイは、人工リン脂質膜を使用して経細胞吸収条件を模倣し、化合物ランキング及び最適化、並びに腸吸収を予測するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルの入力パラメータに使用することができる透過性値を生成する。
並列人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）
ＰＡＭＰＡ（並行人工膜透過性アッセイ）は、薬物候補の第一選択透過性スクリーニングである。このアッセイは、人工リン脂質膜を使用して経細胞吸収条件を模倣し、化合物ランキング及び最適化、並びに腸吸収を予測するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルの入力パラメータに使用することができる透過性値を生成する。
【0229】
浸透実験を、疎水性ＰＶＤＦ ９６ウェルマイクロタイターフィルタプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＩＰＮ ４５５０）内で行う。各ウェルをＰＶＤＦ膜でコーティングし、これを１％レシチン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ３５５６－１Ｇ）を含有する５μＬドデカン（Ｓｉｇｍａ、Ｄ２２１１０４）で調製する。
【0230】
典型的なＰＡＭＰＡ実験プロトコルは以下のとおりである：ドナープレートを、１５０μＬの１００ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（２．６ｇのＫＨ２ＰＯ４及び１８．５ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ）を約１０００ｍＬの超純水に溶解し、完全に混合する。５％ＤＭＳＯを含有する１Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ塩酸のいずれかを使用して、ｐＨを７．４０±０．０５に調整する。各アクセプターウェルの底部のフィルタを３００μＬの１００ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（２．６ｇのＫＨ２ＰＯ４及び１８．５ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏを約１０００ｍＬの超純水に溶解し、完全に混合する。１Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ塩酸のいずれかを使用して、ｐＨを７．４０±０．０５に調整した）で満たす。得られたサンドイッチを、一定の振盪（３００ｒｐｍ）下、室温で４時間インキュベートする。次いで、サンドイッチを解体する。インキュベーションの前に、２０μＬの投与溶液をスパイクし、Ｔ０試料として２５０μＬのＰＢＳ及び１３０μＬのクエンチ溶液（アセトニトリル）と混合する。インキュベーション後、アクセプターチャンバーから２７０μＬの溶液を回収し、続いて１３０μＬのアセトニトリルを加える。ドナーチャンバーから溶液２０μＬを回収し、ＰＢＳ ２５０μＬ及びアセトニトリル１３０μＬを加える。全試料中の化合物の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより求め、透過性（Ｐｅ、１０－６ｃｍ／ｓを求める式は以下のとおりである。
【数1】
【0231】
ＶＤはドナーウェルの体積であり、ＶＲはアクセプターウェルの体積であり、面積は膜の活性表面積であり、時間はインキュベーション時間（このアッセイでは１４，４００秒）であり、ＣＲ及びＣＤは、アッセイの完了時のそれぞれアクセプター溶液及びドナー溶液中の化合物の濃度であり、Ｃ０は、インキュベーション前のドナー溶液中の化合物の濃度である。
【0232】
ＰＡＭＰＡアッセイの主な読み出しは、１０－６ｃｍ／ｓで表される透過性値Ｐｅである。決定される二次読み出しは、ドナー及びアクセプター区画中の化合物の量並びに膜内の化合物保持である。透過速度及び膜保持率に応じて、化合物は「低」（Ｐｅ＜０．２及び膜保持率＜２０％）、又は「中及び高」（Ｐｅ≧０．２；又はＰｅ＜０．２及び膜保持率≧２０％）に分類される。各試料を３連で測定し、標準偏差を、透過定数Ｐｅについて求める。アクセプター溶液及びドナー溶液中の試料が平衡に達した場合（速度論的情報なし）、参照が沈殿した場合（濁度測定）、又は分析上の制限がある場合、結果は表示されない。
【表8】
【0233】
実施例２６
雄性Ｗｉｓｔｅｒ－Ｈａｎラットにおける単回用量薬物動態（ＰＫ）研究
選択した化合物の薬物動態特性を、雄性Ｗｉｓｔｅｒ－Ｈａｎラット（販売業者：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）における単回用量ＰＫ試験によって評価した。簡潔には、２群の動物に、単回用量のそれぞれの化合物を２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与（ＩＶ、ボーラス）又は１０ｍｇ／ｋｇで経口投与（ＰＯ、強制投与）した。血液試料（約１５０μＬ）を、投与の５分後（ＩＶの場合のみ）、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、７時間後及び２４時間後に頸静脈を介して収集した。血液試料をＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固剤を含むチューブに入れ、４℃で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離して、試料から血漿を分離した。遠心分離後、得られた血漿をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる生物分析のために清浄なチューブに移した。薬物動態パラメータは、非コンパートメント分析を用いて計算した。分布容積（Ｖｓｓ）、半減期（Ｔ１／２）及びクリアランス（ＣＬ）を、ＩＶ投与後の血漿濃度－時間曲線に基づいて得た。ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、ＰＯ投与後の実験観察から直接記録した。血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ）は、最後の検出可能な濃度まで線形台形則を使用して計算した。バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、ＩＶ及びＰＯ投薬後の用量正規化ＡＵＣ０－ｌａｓｔに基づいて計算した。
雄性Ｗｉｓｔｅｒ－Ｈａｎラットにおける単回用量薬物動態（ＰＫ）研究
選択した化合物の薬物動態特性を、雄性Ｗｉｓｔｅｒ－Ｈａｎラット（販売業者：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）における単回用量ＰＫ試験によって評価した。簡潔には、２群の動物に、単回用量のそれぞれの化合物を２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与（ＩＶ、ボーラス）又は１０ｍｇ／ｋｇで経口投与（ＰＯ、強制投与）した。血液試料（約１５０μＬ）を、投与の５分後（ＩＶの場合のみ）、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、７時間後及び２４時間後に頸静脈を介して収集した。血液試料をＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固剤を含むチューブに入れ、４℃で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離して、試料から血漿を分離した。遠心分離後、得られた血漿をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる生物分析のために清浄なチューブに移した。薬物動態パラメータは、非コンパートメント分析を用いて計算した。分布容積（Ｖｓｓ）、半減期（Ｔ１／２）及びクリアランス（ＣＬ）を、ＩＶ投与後の血漿濃度－時間曲線に基づいて得た。ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、ＰＯ投与後の実験観察から直接記録した。血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－ｌａｓｔ）は、最後の検出可能な濃度まで線形台形則を使用して計算した。バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、ＩＶ及びＰＯ投薬後の用量正規化ＡＵＣ０－ｌａｓｔに基づいて計算した。
【0234】
薬物のＶｓｓは、薬物が血漿ではなく体組織に分布する程度を表す。Ｖｓｓは、組織に分布する薬物の量に正比例する。Ｖｓｓが高いほど、組織分布の量が多いことを示す。
【0235】
ＩＶ及びＰＯ投与後のＰＫパラメータの結果を表９に示す。
【表9】
【0236】
実施例２７
ヒトサイトゾルアルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）基質アッセイ
ヒトサイトゾルＡＯ基質アッセイは、選択したアルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）阻害剤の有無にかかわらず、ヒト肝サイトゾルにおける試験化合物の代謝安定性を評価するためのものである。
ヒトサイトゾルアルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）基質アッセイ
ヒトサイトゾルＡＯ基質アッセイは、選択したアルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）阻害剤の有無にかかわらず、ヒト肝サイトゾルにおける試験化合物の代謝安定性を評価するためのものである。
【0237】
細胞質インキュベーションをディープウェル９６ウェルプレートで行った。試験化合物の変換及び酸化代謝産物の形成を６０分間にわたって監視した。インキュベーションの体積は０．４ｍＬ／ウェルであり、時点は０．５、３．５、６．５、１０、２０、３０、４５及び６０分であった。ヒト肝サイトゾル（１ｍｇタンパク質／ｍＬ、ＢＤ ＵｌｔｒａＰｏｏｌ（商標）ヒトサイトゾル）、及び試験化合物（２連で１μＭ）又は対照化合物（すなわち、既知のＡＯ基質；２連で１μＭ）を水浴中３７℃でインキュベートした。各対応する時点で、１２０μＬのクエンチ溶液（アセトニトリル中のヒドララジン、５０μＭ、総有機濃度は最終インキュベーションで≦１％になる）を加えて反応を停止させ、４０μＬの試料を取り出した。全ての試料プレートをよく混合し、３２２０×ｇで１０～２０分間遠心分離し、上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に適切な水又は緩衝液で希釈した。
【0238】
試験化合物及び対照化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ排出速度を決定するために、以下の式を用いて、分析物／内部標準ピーク面積比を残存率に変換した：
【数2】
【0239】
また、％残存対時間の対数線形プロットから半減期（Ｔ１／２）を計算した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの肝臓固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ）値の推定を、以下のように肝臓サイトゾルインキュベーションにおける基質消失速度から計算した：ＣＬｉｎｔ（サイトゾル）＝０．６９３／半減期／ｍｇサイトゾルタンパク質／ｍＬ。
【表10】
【国際調査報告】