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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-25
(54)【発明の名称】ウイルス感染を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230818BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230818BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20230818BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230818BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230818BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230818BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230818BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230818BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230818BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230818BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20230818BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20230818BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 100Z
C07K14/165 ZNA
C12N9/50
C07K19/00
A61P31/14
A61K9/72
A61K9/12
A61K38/16
A61K31/713
A61K47/64
C12N15/50
C12N15/57
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504816
(86)(22)【出願日】2021-07-23
(85)【翻訳文提出日】2023-03-08
(86)【国際出願番号】 US2021043077
(87)【国際公開番号】W WO2022020782
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】2007849
(32)【優先日】2020-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514289920
【氏名又は名称】アーディジェン， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デサイ， ニール ピー．
(72)【発明者】
【氏名】ディビタ， ジル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA24
4C076AA93
4C076AA95
4C076BB25
4C076BB27
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF34
4C076FF68
4C084AA13
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA41
4C084MA13
4C084MA55
4C084MA59
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA55
4C086MA59
4C086NA14
4C086ZB33
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本出願は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染の治療に有用なペプチド及び核酸を提供する。例示的なペプチドは、キメラペプチドと、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との間の相互作用を遮断するブロッキングペプチドと、を含む。例示的な核酸には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に標的とするｓｉＲＮＡが含まれる。本出願は、ペプチド及び核酸の細胞内送達を促進する第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）をさらに含む複合体及びナノ粒子も提供する。
【選択図】図５Ｃ
【選択図】図５Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
【請求項2】
前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項3】
前記ループ配列が、アミノ酸約２０個以下の長さを有する、請求項２に記載のキメラペプチド。
【請求項4】
前記ループ配列が、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する、請求項３に記載のキメラペプチド。
【請求項5】
前記ブロッキングペプチドが、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項6】
前記ループ配列が、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項7】
前記ループ配列が、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される、請求項６に記載のキメラペプチド。
【請求項8】
前記ブロッキングペプチドが、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項9】
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項10】
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項11】
前記ループ配列が環状である、請求項２～１０に記載のキメラペプチド。
【請求項12】
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項13】
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項14】
前記安定化ペプチドが、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する、請求項１２または請求項１３に記載のキメラペプチド。
【請求項15】
前記ブロッキングペプチド及び前記安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項16】
前記安定化ペプチドが、配列番号４９または５０に示される配列を含む、請求項１５に記載のキメラペプチド。
【請求項17】
前記安定化ペプチドが、両親媒性ヘリックス構造を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項18】
前記安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、請求項１７に記載のキメラペプチド。
【請求項19】
前記安定化ペプチドが、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１８に記載のキメラペプチド。
【請求項20】
前記安定化ペプチドが、配列番号５５または９７に示される配列を含む、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【請求項21】
前記ブロッキングペプチドと前記安定化ペプチドとがリンカーによって連結されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項22】
前記リンカーが、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される、請求項２１に記載のキメラペプチド。
【請求項23】
前記ＰＥＧ部分が、約２～約７個のエチレングリコール単位からなる、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【請求項24】
配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項25】
配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項26】
配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチド。
【請求項27】
前記ペプチドが、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の非天然ペプチド。
【請求項28】
前記ペプチドが、アミノ酸約１００個以下の長さを有する、請求項２６または２７に記載の非天然ペプチド。
【請求項29】
配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
【請求項30】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６３、１７０、１６６、または１６８に示される核酸配列を含む、請求項２９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項31】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、請求項２６もしくは２７に記載のペプチド、または請求項２８もしくは請求項２９に記載のｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡが前記第２のペプチドと複合体を形成している、前記複合体。
【請求項32】
前記第２のペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである、請求項３１に記載の複合体。
【請求項33】
前記第２のペプチドと前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約１：１～約８０：１である、請求項３１または請求項３２に記載の複合体。
【請求項34】
前記第２のペプチドと前記ペプチドとのモル比が、約２：１～約１０：１である、請求項３３に記載の複合体。
【請求項35】
前記第２のペプチドと前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約５：１～約５０：１である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項36】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、もしくは請求項２６～２８のいずれかに記載のペプチド、及び／またはｂ）請求項２９もしくは請求項３０に記載のｓｉＲＮＡを含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項37】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６６に示される核酸配列を含む、請求項３６に記載の複合体。
【請求項38】
配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む、請求項３７に記載の複合体。
【請求項39】
請求項３０～３８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ナノ粒子。
【請求項40】
前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ以下の直径を有する、請求項３９に記載のナノ粒子。
【請求項41】
前記ナノ粒子が、約４０～約６０ｎｍの直径を有する、請求項４０に記載のナノ粒子。
【請求項42】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、請求項２６～２８のいずれかに記載のペプチド、請求項２９または請求項３０に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３１～４１のいずれかに記載の複合体またはナノ粒子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項43】
前記組成物が、２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、前記２つ以上の複合体またはナノ粒子が異なるカーゴを含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
前記カーゴを前記第２のペプチドと組み合わせることを含む、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法。
【請求項45】
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法であって、前記個体に有効量の請求項４２または請求項４３の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項46】
前記医薬組成物が、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記個体が、ヒトである、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２４日に出願されたフランス国特許出願第ＦＲ２００７８４９号に基づく優先権を主張し、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容を援用する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
本出願は、２０２０年７月２４日に出願されたフランス国特許出願第ＦＲ２００７８４９号に基づく優先権を主張し、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容を援用する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの次の提出物の全容を参照によって本明細書に援用する。すなわち、配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７３７２００１３４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年７月２３日、サイズ：５９ＫＢ）。
【0003】
本出願は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染を治療するための阻害ペプチド、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、複合体、ナノ粒子、及び組成物に関する。
【背景技術】
【0004】
中国の武漢での新しいヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現は、呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の世界的な流行を引き起こした。この病気を治療するためのワクチン及び標的治療薬は現在不足している。
【0005】
本明細書で言及されるあらゆる刊行物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示内容は、参照により本明細書にそれらの全容を援用するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本出願は、一態様において、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドを提供し、ブロッキングペプチドは、スパイク糖タンパク質（「ＳＰＩＫＥ」）とアンジオテンシン変換酵素２（「ＡＣＥ２」）との相互作用を特異的に遮断し、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約２０個以下の長さを有する。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する。
【0007】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む。
【0008】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される。
【0009】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。
【0010】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ループ配列は、環状である。
【0011】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている。
【0012】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている。
【0013】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する。
【0014】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ブロッキングペプチド及び安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号４９または５０に示される配列を含む。
【0015】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、両親媒性ヘリックス構造を含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号５５または９７に示される配列を含む。
【0016】
上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。上記に述べたキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２～約７個のエチレングリコール単位で構成される。
【0017】
上記のキメラペプチドのいずれかによるいくつかの実施形態では、キメラペプチドは、配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラペプチドは、配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0018】
本出願は別の態様において、配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【0019】
本出願は別の態様において、配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６または１６８、または１７０に示される核酸配列を含む。
【0020】
本出願は別の態様において、ａ）上記に述べたペプチドまたはｓｉＲＮＡのいずれかを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、ペプチドまたはｓｉＲＮＡが第２のペプチドと複合体を形成している、複合体を提供する。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとペプチドまたはｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとペプチドとのモル比は、約２：１～約１０：１である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約５：１～約５０：１である。いくつかの実施形態では、複合体は、ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、または請求項２６または２７に記載のペプチド、ｂ）請求項２８または請求項２９に記載のｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６６に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む。
【0021】
本出願は別の態様において、上記に述べた複合体のいずれかを含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１００ｎｍ以下の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約４０～約６０ｎｍの直径を有する。
【0022】
本出願は別の態様において、上記に述べたペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、またはナノ粒子のいずれかと、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、２つ以上の複合体またはナノ粒子は異なるカーゴを含む。
【0023】
本出願は別の態様において、カーゴを第２のペプチドと組み合わせることを含む、上記に述べた複合体またはナノ粒子のいずれかを調製する方法を提供する。
【0024】
本出願は別の態様において、有効量の上記に述べた医薬組成物のいずれかの個体に投与することを含む、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】Ａ～Ｄは、ＡＣＥ２に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の全体構造を示している。この構造は、Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ５８１，ｐａｇｅｓ ２１５－２２０（２０２０））により報告されている、細胞受容体ＡＣＥ２に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤの結晶構造に基づいている。Ａ及びＢにおいて、ＡＣＥ２タンパク質のＮ末端ヘリックスと相互作用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭドメインの部分が薄い灰色で示されている。Ｃ及びＤにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤドメインと相互作用するＡＣＥ２ドメインが強調されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのＲＢＭドメインに接触するα１及びα２ヘリックスは薄い灰色である。
【0026】
【図2】Ａ～Ｅは、選択されたペプチド阻害剤の構造編成を示す。Ｐｅｐｌｏｏｋ－Ｚｕｌｔｉｍプログラムを使用して、各ヘリックス状ペプチドの構造の動的および安定性分析を決定した。ＡＤＧＮペプチドは黒色で、阻害ペプチドは薄い灰色で示されている。主な相互作用を形成する残基は棒で示されている。
【0027】
【図3】Ａ及びＢは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤のスクリーニングを示す。異なるペプチドを、遊離ペプチドとして（Ａ）、または５／１のモル比でＡＤＧＮ－１０６と形成されたナノ粒子複合体内（Ｂ）で、一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【0028】
【図4】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤のスクリーニングを示す。異なるペプチドを、遊離ペプチドとして（Ａ）、または５／１のモル比でＡＤＧＮ－１０６と形成されたナノ粒子複合体内（Ｂ）で、一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【0029】
【図5A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度を有するペプチドを、ウイルス感染の直前に単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えるか（Ｃ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３０分間混合してから単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた（Ａ）。ＡＤＧＮ－１０６、ヒドロキシクロロキン、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。異なるペプチドの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いてＶｅｒｏ－６細胞で分析した（Ｂ及びＤ）。
【図5B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度を有するペプチドを、ウイルス感染の直前に単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えるか（Ｃ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３０分間混合してから単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた（Ａ）。ＡＤＧＮ－１０６、ヒドロキシクロロキン、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。異なるペプチドの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いてＶｅｒｏ－６細胞で分析した（Ｂ及びＤ）。
【図5C】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度を有するペプチドを、ウイルス感染の直前に単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えるか（Ｃ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３０分間混合してから単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた（Ａ）。ＡＤＧＮ－１０６、ヒドロキシクロロキン、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。異なるペプチドの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いてＶｅｒｏ－６細胞で分析した（Ｂ及びＤ）。
【図5D】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度を有するペプチドを、ウイルス感染の直前に単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えるか（Ｃ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３０分間混合してから単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた（Ａ）。ＡＤＧＮ－１０６、ヒドロキシクロロキン、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。異なるペプチドの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いてＶｅｒｏ－６細胞で分析した（Ｂ及びＤ）。
【0030】
【図6】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの評価を示す。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ヌクレオカプシドをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＮＰプラスミドをトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ヌクレオカプシド－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後に評価し（Ａ）、ＧｌｏｗＭａｘでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した（Ｂ）。
【0031】
【図7】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３ａ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの評価を示す。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＯＲＦ３ａをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＯＲＦ３ａプラスミドをトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ＯＲＦ３Ａ－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後に評価し（Ａ）、ＧｌｏｗＭａｘでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した（Ｂ）。
【0032】
【図8】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの評価を示す。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＯＲＦ８をコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＯＲＦ８プラスミドをトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ＯＲＦ８－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後に評価し（Ａ）、ＧｌｏｗＭａｘでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した（Ｂ）。
【0033】
【図9】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡの評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ｓｉＲＮＡを、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体を形成させた。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００を、ウイルス感染の直前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた（Ａ）。ＡＤＧＮ－１００、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを使用してＶｅｒｏ－６細胞に対する異なるｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ複合体の細胞毒性を分析した（Ｂ）。
【0034】
【図10】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡ／阻害剤ペプチドの評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ｓｉＲＮＡ溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体及びＬＮＣＯＶ－１５またはＬＮＣＯＶ－１８を、ウイルス感染の前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。ＡＤＧＮ－１００、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。阻害率及び細胞変性効果を７２時間後に測定した。
【0035】
【図11A】ＬＮＣＯＶペプチドと複合体を形成したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡの評価を示す。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ヌクレオカプシドをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＮＰプラスミドをトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００、ＬＮＣＯＶ－１５、及びＬＮＣＯＶ－１８と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ヌクレオカプシド－ｅＧＦＰタンパク質のレベルを、トランスフェクションの４８時間後に評価した。
【0036】
【図11B】示された二次構造を有するＶＥＰＥＰ－９ペプチドを示す。「Ｈ」は「ヘリックス」、「ｔ」はターンを表す。
【0037】
【図12A】ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）及びデルタ（Ｄ）バリアントモル比（図３Ｂ）を含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。Ａ～Ｅは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）、デルタ（Ｄ）、及びイプシロン（Ｅ）バリアントを含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【図12B】ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）及びデルタ（Ｄ）バリアントモル比（図３Ｂ）を含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。Ａ～Ｅは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）、デルタ（Ｄ）、及びイプシロン（Ｅ）バリアントを含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【図12C】ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）及びデルタ（Ｄ）バリアントモル比（図３Ｂ）を含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。Ａ～Ｅは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）、デルタ（Ｄ）、及びイプシロン（Ｅ）バリアントを含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【図12D】ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）及びデルタ（Ｄ）バリアントモル比（図３Ｂ）を含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。Ａ～Ｅは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）、デルタ（Ｄ）、及びイプシロン（Ｅ）バリアントを含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【図12E】ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）及びデルタ（Ｄ）バリアントモル比（図３Ｂ）を含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。Ａ～Ｅは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤アッセイにおけるペプチド阻害剤の影響を示す。異なるペプチドを一定範囲の濃度（０．１ｎＭ～１０μＭ）で評価した。アルファ（Ａ）、ベータ（Ｂ）、ガンマ（Ｃ）、デルタ（Ｄ）、及びイプシロン（Ｅ）バリアントを含む４つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した。結果は、３つの別々の実験の平均に相当する。
【0038】
【図13A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。抗ウイルスアッセイをＶｅｒｏ Ｅ６細胞で行った。細胞を、配列１７、配列２８、または配列３３のペプチド（１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度）または６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）を含む培地、または抗ウイルス分子を含まない培地（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）中で１時間インキュベートすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ（Ａ）またはベータ（Ｂ）またはデルタ（Ｃ）変異株にＭＯＩ０．００１で３重に感染させた。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。上清を感染の２４時間後に回収し、ＶｅｒｏＥ６細胞でＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定し、Ｓｐｅａｒｍａｎ ＆ Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムによって計算した。
【図13B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。抗ウイルスアッセイをＶｅｒｏ Ｅ６細胞で行った。細胞を、配列１７、配列２８、または配列３３のペプチド（１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度）または６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）を含む培地、または抗ウイルス分子を含まない培地（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）中で１時間インキュベートすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ（Ａ）またはベータ（Ｂ）またはデルタ（Ｃ）変異株にＭＯＩ０．００１で３重に感染させた。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。上清を感染の２４時間後に回収し、ＶｅｒｏＥ６細胞でＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定し、Ｓｐｅａｒｍａｎ ＆ Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムによって計算した。
【図13C】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。抗ウイルスアッセイをＶｅｒｏ Ｅ６細胞で行った。細胞を、配列１７、配列２８、または配列３３のペプチド（１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度）または６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）を含む培地、または抗ウイルス分子を含まない培地（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）中で１時間インキュベートすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ（Ａ）またはベータ（Ｂ）またはデルタ（Ｃ）変異株にＭＯＩ０．００１で３重に感染させた。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。上清を感染の２４時間後に回収し、ＶｅｒｏＥ６細胞でＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定し、Ｓｐｅａｒｍａｎ ＆ Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムによって計算した。
【0039】
【図14】Ａ～Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡ／阻害剤ペプチドの評価を示す。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ｓｉＲＮＡ溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体及びＬＮＣＯＶ－１５、ＬＮＣＯＶ－２０またはＬＮＣＯＶ－１８を、ウイルス感染の前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）、または抗ウイルス分子なし（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。上清を感染の２４時間後に回収し、ＶｅｒｏＥ６細胞でＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定し、Ｓｐｅａｒｍａｎ ＆ Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムによって計算した。
【0040】
【図15A】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤のインビボ肺生体内分布を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した（Ａ）。注入から６時間、１２時間、４８時間、及び７２時間後の臓器でエクスビボ蛍光シグナルが観察された。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【図15B】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤のインビボ肺生体内分布を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した（Ａ）。注入から６時間、１２時間、４８時間、及び７２時間後の臓器でエクスビボ蛍光シグナルが観察された。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【図15C】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤のインビボ肺生体内分布を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した（Ａ）。注入から６時間、１２時間、４８時間、及び７２時間後の臓器でエクスビボ蛍光シグナルが観察された。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【図15D】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤のインビボ肺生体内分布を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した（Ａ）。注入から６時間、１２時間、４８時間、及び７２時間後の臓器でエクスビボ蛍光シグナルが観察された。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【図15E】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤のインビボ肺生体内分布を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した（Ａ）。注入から６時間、１２時間、４８時間、及び７２時間後の臓器でエクスビボ蛍光シグナルが観察された。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【0041】
【図16】Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤で処置した肺の共焦点顕微鏡分析を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。投与４時間、２４時間および７２時間後に肺を採取し、５％グルコース中の４％ホルムアルデヒドで固定した。組織をＭｉｔｏ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄで染色し、核はＨｏｅｓｃｈで染色した。
【0042】
【図17】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ阻害剤で処置した肺の定量的共焦点顕微鏡分析を示す。試験は健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。投与４時間、２４時間および７２時間後に肺を採取し、５％グルコース中の４％ホルムアルデヒドで固定した。組織をＭｉｔｏ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄで染色し、核はＨｏｅｓｃｈで染色した。対数変換されたデータに対する複数の比較による一元配置分散分析。＊＊＊Ｐ＝０．０００５、＊＊Ｐ＝０．００１、＊Ｐ＝０．００１１；ＮＳ、有意でない。
【0043】
【図18A】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18B】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18C】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18D】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18E】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18F】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【図18G】インビボでのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２阻害剤の特性評価、体重及び臓器重量分析を示す。気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。
【0044】
【図19A】ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体による処置後の気管支肺胞洗浄分析を示す。注入から２日後にＢＡＬを行った。ＢＡＬ中の細胞の割合、総タンパク質、及びＬＤＨのレベルを分析した。結果を、ネガティブコントロールとして使用した生理食塩水緩衝液と比較した。
【図19B】ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体による処置後の気管支肺胞洗浄分析を示す。注入から２日後にＢＡＬを行った。ＢＡＬ中の細胞の割合、総タンパク質、及びＬＤＨのレベルを分析した。結果を、ネガティブコントロールとして使用した生理食塩水緩衝液と比較した。
【図19C】ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体による処置後の気管支肺胞洗浄分析を示す。注入から２日後にＢＡＬを行った。ＢＡＬ中の細胞の割合、総タンパク質、及びＬＤＨのレベルを分析した。結果を、ネガティブコントロールとして使用した生理食塩水緩衝液と比較した。
【0045】
【図20】Ａ及びＢは、ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体による処置後のＡＳＴ及びＡＬＴ血液分析を示す。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した。生理食塩水をネガティブコントロールとして用いた。血漿中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルを注入の２日後にアッセイした。
【発明を実施するための形態】
【0046】
本出願は、一態様において、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）のスパイク糖タンパク質（ＳＰＩＫＥ）と、個体（人間など）の様々な細胞型（肺細胞など）で発現するＡＣＥ２との相互作用を遮断する新規阻害ペプチド（すなわち、ブロッキングペプチド）を提供する。実施例のセクションに示されるように、例示的な阻害ペプチドは、インビトロ及び感染細胞の両方で、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を効果的に遮断する。
【0047】
いくつかの実施形態では、阻害ペプチドは、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであり、安定化ペプチドはブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する。理論に拘束されるものではないが、両親媒性ヘリックス構造を有するペプチドは、螺旋状のブロッキングペプチドを安定化することが観察されており、これにはヘリックスの同じ側に位置する主に芳香族残基（例えば、トリプトファン残基）及び静電相互作用が関与している。ループ配列を有するブロッキングペプチドの環化がブロッキングペプチドを安定化し、環化したブロッキングペプチドと安定化ペプチドとの融合によってブロッキングペプチドがさらに安定化することも観察されている。実施例で示されるように、例示的なペプチド（配列番号１７、２８、または３３に示される配列を含むペプチドなど）は、強力な抗ウイルス効果及び肺に浸透する能力を示す。
【0048】
本出願は、別の態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする新規核酸（ｓｉＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６または１７０に示される核酸配列を含む。
【0049】
本出願は、別の実施形態において、本明細書に記載の阻害ペプチドまたは核酸のいずれかを含む複合体及びナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、複合体またはナノ粒子は第２のペプチドを含み、第２のペプチドは、阻害ペプチド及び／または核酸（ｓｉＲＮＡなど）のいずれか１つ以上と複合体を形成する。阻害ペプチド及び／またはサイレンシングＲＮＡベースの複合体及びナノ粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入を中和し、サイレンシングＲＮＡの送達によってウイルス産生を防止することが観察されている。要約すると、本明細書に記載の阻害ペプチド、核酸、複合体、ナノ粒子は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患に対する簡単で効率的な治療法を提供するものでる。
【0050】
本出願はまた、本明細書に記載のキメラペプチド、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、及び／またはナノ粒子を投与することによってＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法も提供する。
【0051】
Ｉ．定義
「非天然の」、「合成」、または「操作された」という用語は、互換的に使用され、人の手が関与していることを示す。核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で自然に付随し、自然界で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「非天然の」、「合成」、または「操作された」という用語は、互換的に使用され、人の手が関与していることを示す。核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で自然に付随し、自然界で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【0052】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態の少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、合成、天然、及び非天然であってよく、参照核酸と同様の結合特性を有する、ロック核酸（ＬＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）、及びジップ核酸（ＺＮＡ）を含む、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸が含まれる。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が含まれる。特に示されない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換物）、アレル、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、ならびに明示的に示される配列も暗黙的に含む。詳細には、縮重コドン置換物は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって得ることができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｒｎ．，２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ， ８：９１－９８ （１９９４））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチド同士は、リン酸基を介して結合される。「塩基」には、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体をさらに含むプリン及びピリミジン、ならびにこれらに限定されるものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラーゼ、及びハロゲン化アルキルなどの新しい反応基を配置する修飾を含むがこれらに限定されないプリン及びピリミジンの合成誘導体が含まれる。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一般的に（ただし、必ずしもそうではない）ヌクレオチド約２００個未満の長さである、短鎖の、一般的には合成ポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」とは、互いに相容れないものではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、等しく完全にオリゴヌクレオチドにも適用可能である。
【0053】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指して互換的に使用される。哺乳類としては、マウス、サル、ヒト、家畜、狩猟動物、及び愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。インビトロで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫も包含される。
【0054】
「治療剤」、「治療能力のある薬剤」または「治療薬」という用語は互換的に使用され、対象に投与される際に何らかの有益な効果を与える分子または化合物を指す。有益な効果には、診断判定を可能とすること；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または状態の発症の軽減または予防；及び、疾患、症状、障害または病的状態に広く抗することが含まれる。
【0055】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果は、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：疾患に起因する１つ以上の症状を減少させること（例えば、やはりウイルスに感染した治療していない個人と比較してウイルス量を減少させるかまたはウイルス量の増加を遅くすること）、疾患の程度を軽減すること（例えば、感染の経過を減少させること、例えば、感染の発症を減少させること、個人が集中治療室（ＩＣＵ）または換気装置内にいる日数を減らすことなど）、疾患を安定させること（例えば、疾患の悪化を予防または遅延させること）、疾患の広がりを予防または遅延させること、疾患の再発を予防または遅延させること、疾患の進行を遅延または減速させること、病状を改善すること、疾患の（部分的または全体的）寛解を提供すること、疾患の処置に必要な１つ以上の他の治療剤の投与量を減少させること、疾患の進行を遅延すること、生活の質を高めるまたは向上させること、体重増加を増大させること、及び／または生存期間を延長させること。疾患（例えば、コロナウイルス感染における呼吸器症状など）の病理学的結果の低減も「治療」に包含される。本発明の方法は、これらの治療の態様のうちの任意の１つ以上を企図する。
【0056】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び病状、対象の体重及び年齢、病状の重症度、当業者によって容易に決定できる投与方法などのうちの１つ以上に応じて異なり得る。この用語は、本明細書に記載の画像法のいずれか１つによる検出を行うための画像を与える線量にも適用される。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、画像化しようとする組織、及びそれが運ばれる物理的送達系のうちの１つ以上に応じて異なり得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬学的に適合する」とは、生物学的にまたは他の方法で望ましくない材料を意味し、例えば、材料は、任意の顕著な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の他の成分のうちのいずれかと有害な形で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込まれてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒性試験及び製造試験の必要な基準を満たし、及び／または米国食品医薬品局によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれている。
【0058】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬学的に適合する」とは、生物学的にまたは他の方法で望ましくない材料を意味し、例えば、材料は、任意の顕著な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の他の成分のうちのいずれかと有害な方法で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込まれてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒性試験及び製造試験の必要な基準を満たし、及び／または米国食品医薬品局によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれている。
【0059】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、実施形態「からなる」及び／または「から本質的になる」ことを含むと理解される。
【0060】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途指示されない限り、複数の対象を含む。
【0061】
本明細書で「約」の値またはパラメータを参照することは、その値またはパラメータをそれ自体で対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」と言う場合の記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【0062】
本出願の組成物及び方法は、本明細書に記載された本出願の必須要素及び限定、ならびに本明細書に記載された、またはさもなくば有用な任意の追加的または任意の成分、構成要素、または限定を含むか、それらから構成されるか、またはそれらから本質的に構成されうる。
【0063】
特に断りのない限り、専門用語は従来の用法に従って使用される。
【0064】
キメラペプチド
本出願は、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドを提供し、ここで、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する。
本出願は、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドを提供し、ここで、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する。
【0065】
いくつかの実施形態では、キメラペプチドは、アミノ酸約５～約１００個（アミノ酸約１０～約８０個、アミノ酸約１０～約７０個、アミノ酸約１０～約６０個、アミノ酸約１０～約５０個など）の長さを有する。
【0066】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含み、安定化ペプチドは両親媒性ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約２０個以下（例えばアミノ酸約７～１８個）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、ループ配列は環状である。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0067】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含み、安定化ペプチドは両親媒性ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0068】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、配列番号１、６、８～１１、２３、２４、２６～２８、３１、４２、４５及び４７～５２からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドはＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0069】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、配列番号１、６、及び８～１１からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドは配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは環状である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0070】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１、１５６、及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含み、安定化ペプチドは配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0071】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドが提供され、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドは配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、及び３１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0072】
いくつかの実施形態では、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドが提供される。
【0073】
ブロッキングペプチド
本出願は、ブロッキングペプチド、及び本明細書に記載のブロッキングペプチドと安定化ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
本出願は、ブロッキングペプチド、及び本明細書に記載のブロッキングペプチドと安定化ペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
【0074】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列、またはＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）の細胞外ドメイン内の配列（例えば、ループ配列、αヘリックス、β鎖、またはこれらの組み合わせ）に由来する配列を含む。本明細書に記載のループ配列は、ＳＰＩＫＥまたはＡＣＥタンパク質の構造から選択され、β鎖またはαヘリックスであり得る２個の二次構造モチーフの間に位置する。ループ配列は環化されてもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約５０個以下（例えば、アミノ酸約４０、３５、３０、２５、または２２個以下）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約２０個以下（例えば、アミノ酸約１８、１５、１２、または１０個以下）の長さを有する。
【0076】
いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約５～４０個（例えば、アミノ酸約５～３０個、アミノ酸５～２５個、アミノ酸５～２０個）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する。
【0077】
いくつかの実施形態では、ループ配列は環状である。
【0078】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む。リシンを用いることでリシン側鎖による連結を介してループの環化を促進することができる。
【0079】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ループ配列は、ＳＰＩＫＥの受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）内にある。いくつかの実施形態では、ループ配列は、ループα４－β５、ループβ５－β６、及びループβ６－α５からなる群から選択されるＲＢＭ構造モチーフのいずれかのモチーフ内にある。
【0080】
いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１、６及び８～１１からなる群から選択される配列を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）の細胞外ドメイン内の配列（例えば、ループ配列、またはαヘリックスモチーフ）に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のα１ヘリックス内の配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックス内の配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のβ３とβ４鎖との間のループ配列に由来する配列を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列は、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列と配列のＣ末端の１個、２個または３個のアミノ酸が異なる。
【0083】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列を含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、及び３１からなる群から選択される配列を含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、遮断ペプチドは、配列番号１５１～１６０のいずれか１つから選択される環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１、１５６及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２～２２及び２４～４１のいずれか１つから選択される非天然ペプチドを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）のα１及びα２ヘリックスに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）のα１ヘリックスに由来する第１の配列と、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）のα２ヘリックスに由来する第２の配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１の配列は、配列番号４７または４８に示されるアミノ酸配列を含み、第２の配列は、配列番号４９または５０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の配列は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含み、第２の配列は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の配列は、第１の配列のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第２の配列は、第１の配列のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の配列と第２の配列とは、リンカー（本明細書に記載のリンカーのいずれかなど）によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２７、３８、３９、４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0088】
本明細書に記載のブロッキングペプチドは、ステープルされる。本明細書で使用される「ステープルされた」とは、ペプチド内の２個の残基間の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドはステープルされ、ペプチドの２個のアミノ酸間に化学結合を含む。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲまたはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。いくつかの実施形態では、化学結合は炭化水素結合である。
【0089】
いくつかの実施形態では、配列番号１～５２及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含み、少なくとも１つ以上のアミノ酸がＤ－アミノ酸であるブロッキングペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドのアミノ酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％は、Ｄ－アミノ酸の形態である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｄ－アミノ酸で１００％構成される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部は環状である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部はαヘリックス構造を有する。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１～１６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、配列番号１～２２、４２～４６、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部は環状である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドのアミノ酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％は、Ｄ－アミノ酸の形態である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｄ－アミノ酸で１００％構成される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１、１５６及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、配列番号２３～４１及び４７～５２のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）はαヘリックス構造を有する。いくつかの実施形態では、非ヘリックス構造のアミノ酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または１００％は、Ｄ－アミノ酸の形態である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、または９５％、または１００％は、レトロインベルソペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部（例えば、非ヘリックス構造の一部）はステープルされる。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドはステープルされ、ペプチドの２個のアミノ酸間に化学結合を含む。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲまたはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。いくつかの実施形態では、化学結合は炭化水素結合である。
【0092】
いくつかの実施形態では、配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチド（または非天然ペプチド）が提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチド（または非天然ペプチド）は、アミノ酸約５～約１００個（アミノ酸約１０～約８０個、アミノ酸約１０～約７０個、アミノ酸約１０～約６０個、アミノ酸約１０～約５０個など）の長さを有する。
【0093】
本出願はまた、第２の部分に連結された、本明細書に記載のブロッキングペプチドのいずれかを提供する。第２の部分は、ブロッキングペプチドの構造（二次構造、例えばループまたはヘリックス構造など）を安定化する。いくつかの実施形態では、第２の部分はＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、第２の部分は脂質である。いくつかの実施形態では、第２の部分はナノ粒子である。いくつかの実施形態では、第２の部分は抗体である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドの少なくとも一部は環状である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１～１６０（例えば、配列番号１５１、１５６、及び１５８～１６０）からなる群から選択される環状ペプチドを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、第２の部分はＰＥＧ部分（本明細書に記載のＰＥＧ部分のいずれかなど）である。ペプチドのＰＥＧ化は、αヘリックスの二次構造の促進、薬物送達の促進、結合体のインビボ循環時間など、様々な利点を与える。例えば、Ｈａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４，４０５３－４０６０）、Ｈａｍｌｅｙ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，１５４３－１５５９）、及びＬａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１６ Ｏｃｔｏｂｅｒ；３４：８８－９４）を参照されたい。ＰＥＧ部分をペプチドに連結する方法は、例えば、Ｈａｍｅｄ及びＨａｍｌｅｙに記載の方法など、当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約７、６、５、４、３、または２個以下の単位で構成される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、２個または４個の単位で構成される。
【0095】
いくつかの実施形態では、第２の部分は、ウイルス（例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする、または中和する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はナノボディーである。例示的な抗体は、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ｖｏｌｕｍｅ １１，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２５１（２０２０））、及びＰｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ５８３，ｐａｇｅｓ ２９０－２９５（２０２０））に見ることができる。
【0096】
いくつかの実施形態では、第２の部分はナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は金ナノ粒子（例えば、Ａｕナノ粒子）である。ペプチドをナノ粒子に連結する一般的な原理及び方法は、例えば、Ｂｒａｎｃｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１９，４１：８６－９４）に記載されるように当該技術分野では周知かつ認識されているものである。
【0097】
いくつかの実施形態では、第２の部分は脂質である。ペプチドの脂質化は、ペプチドベースの薬物の薬物動態及び薬力学プロファイルを促進する。例えば、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ２０１７；１０３０：１８５－２２７）及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２（２０１３）４６８－４７９）を参照されたい。脂質をペプチドに連結する方法は、例えば、Ｋｏｗａｌｃｙｚｋ及びＷａｒｄに記載の方法など、当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、脂質はアシル化剤である。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドはアシル化される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドはＣ８またはＣ１６脂肪酸によりアシル化される。いくつかの実施形態では、Ｃ８またはＣ１６脂肪酸は、直鎖炭化水素鎖にある。
【0098】
いくつかの実施形態では、第２の部分はペプチドのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分はペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ペプチド内の１つ以上のアミノ酸に付加される（システイン、セリン、スレオニン、またはリシンに付加された脂質など）。
【0099】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと第２の部分とは、リンカー（本明細書に記載のリンカーのいずれかなど）によって連結される。
【0100】
安定化ペプチド
いくつかの実施形態における安定化ペプチドは、両親媒性αヘリックス（または両親媒性ヘリックス）構造を含む。両親媒性ヘリックスは、極性／非極性界面と接触するとαヘリックス構造に折り畳まれるペプチド配列である。多くのタンパク質に見られる二次構造である両親媒性ヘリックスは、その構造と、ヘリックスの２つの面間での疎水性残基と極性残基との分離によって定義される。この分離のため両親媒性ヘリックス（ＡＨ）は極性－非極性界面に吸着することができる。
いくつかの実施形態における安定化ペプチドは、両親媒性αヘリックス（または両親媒性ヘリックス）構造を含む。両親媒性ヘリックスは、極性／非極性界面と接触するとαヘリックス構造に折り畳まれるペプチド配列である。多くのタンパク質に見られる二次構造である両親媒性ヘリックスは、その構造と、ヘリックスの２つの面間での疎水性残基と極性残基との分離によって定義される。この分離のため両親媒性ヘリックス（ＡＨ）は極性－非極性界面に吸着することができる。
【0101】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはリンカー（本明細書に記載されるリンカーのいずれかなど）によってブロッキングペプチドに連結される。
【0102】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、アミノ酸約８個～アミノ酸約５０個（例えば、アミノ酸約１０個～約４０個、例えば、アミノ酸約１２個～約３０個）の長さを有する。
【0103】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、単一コアのヘリックスモチーフを含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは２個以上のヘリックスモチーフを含む。例示的な安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ（例えば、配列番号１５０）、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドを含む。４つのペプチドはいずれも、膜を模倣した環境内で二次両親媒性ヘリックス構造をとり、一方の側にＴｒｐ基、もう一方の側に荷電残基、さらに別の側に疎水性残基を露出させる。ＣＡＤＹとＶＥＰＥＰ－６は同じ二次構造を有し、ペプチドのコア、Ｃ及びＮ末端にヘリックスモチーフがある（表１）。これに対し、ＡＤＧＮ－１００及びＶＥＰＥＰ－９ペプチドは単一コアのヘリックスモチーフを有し、これはＶＥＰＥＰ－９でより長く、Ｋｏｎａｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１０（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｃｒｏｗｌｅｔ ｅｔ ａｌ ２０１４（ＢＢＡ）と一致している。
【表1】
【0104】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、本明細書に記載の安定化ペプチドのいずれかのレトロインベルソペプチド（例えば、逆配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長されると、その親分子のものと同様であるがアミドペプチド結合が反転した側鎖トポロジーをとるペプチド）である。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の安定化ペプチド（例えば、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）はステープルされる。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはステープルされ、ペプチドの２個のアミノ酸間に化学結合を含む。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲまたはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。いくつかの実施形態では、化学結合は炭化水素結合である。
【0107】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチド及び安定化ペプチドはそれぞれ、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号４９または５０に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはリンカー（本明細書に記載されるリンカーのいずれかなど）によってブロッキングペプチドに連結される。
【0108】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号４９、５０、及び５３～１５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0109】
ＡＤＧＮ－１００ペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＧＮ－１００ペプチドはコアモチーフを含み、コアモチーフはアミノ酸配列ＲＷＲＬＷＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＳＲ（配列番号５３）であり、ただし、Ｘ１はＶまたはＳであり、Ｘ２はＲ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ３はＳまたはＬであり、Ｘ４はＷまたはＹである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、その長さの約５０％を超える範囲（例えば、約５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び９５％のいずれかを超える範囲）にわたってαヘリックス構造の形をとる。例示的なＡＤＧＮ－１００ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＵＳ２０１９０００２４９９Ａ１、ＥＰ３２３７４３６、及びＷＯ２０１６／１０２６８７に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＧＮ－１００ペプチドはコアモチーフを含み、コアモチーフはアミノ酸配列ＲＷＲＬＷＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＳＲ（配列番号５３）であり、ただし、Ｘ１はＶまたはＳであり、Ｘ２はＲ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ３はＳまたはＬであり、Ｘ４はＷまたはＹである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、その長さの約５０％を超える範囲（例えば、約５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び９５％のいずれかを超える範囲）にわたってαヘリックス構造の形をとる。例示的なＡＤＧＮ－１００ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＵＳ２０１９０００２４９９Ａ１、ＥＰ３２３７４３６、及びＷＯ２０１６／１０２６８７に記載されている。
【0110】
いくつかの実施形態では、ヘリックス構造は、Ｓ及びＲ残基の少なくとも２個（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、または８個のいずれか）がヘリックス構造の一方の側にあり、Ｗ残基の少なくとも１個（例えば、少なくとも２、３、４、または５個のいずれか）がヘリックス構造の反対側にあるように構成される。いくつかの実施形態では、Ｓ及びＲ残基の大部分がヘリックス構造の一方の側にあり、Ｗ残基の大部分がヘリックス構造の反対側にある。いくつかの実施形態では、Ｓ及びＲ残基の全部がヘリックス構造の一方の側にあり、Ｗ残基の全部がヘリックス構造の反対側にある。いくつかの実施形態では、ヘリックス構造は、静電接触のパッチがヘリックス構造の一方の側に形成され、疎水性接触のパッチがヘリックス構造の他方の側に形成されるように構成される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、カーゴ分子の存在下で単一のヘリックスの形をとる。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７９のいずれか１つに示される配列を含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＲＷＲＬＷＲＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＳＲ（配列番号５４）（ただし、Ｘ１はＡまたはＶであり、Ｘ２はＧまたはＬであり、Ｘ３はＷまたはＹであり、Ｘ４はＶまたはＳであり、Ｘ５はＲ、ＶまたはＡであり、Ｘ６はＳまたはＬであり、Ｘ７はＷまたはＹである）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５５）、ＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５６）、ＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号５７）、またはＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号５８）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５５）を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドは、Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号５９）（ただし、Ｘ１は任意のアミノ酸またはアミノ酸なしであり、Ｘ２～Ｘ８は任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドは、Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓ、またはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＡまたはＶであり、Ｘ３はＧまたはＬであり、Ｘ４はＷまたはＹであり、Ｘ５はＶまたはＳであり、Ｘ６はＲ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ７はＳまたはＬであり、Ｘ８はＷまたはＹである）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドは、配列番号６１～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＧＮ－１００ペプチドはコアモチーフを含み、コアモチーフはアミノ酸配列ＲＷＲＬＷＲＷＳＲ（配列番号６５）である。
【0115】
いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、レトロインベルソペプチド（例えば、逆配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長されると、その親分子のものと同様であるがアミドペプチド結合が反転した側鎖トポロジーをとるペプチド）である。いくつかの実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号６６または６７の配列を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、炭化水素結合によって連結された３個または６個の残基によって分離された２個の残基を含む。いくつかの実施形態では、この結合はキメラペプチドの安定性を高める。いくつかの実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ （アミノ酸配列６８）、ＲＳＳＡＧＷＲＷＲＳＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（アミノ酸配列６９）、ＲＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＳＷＳＲ（アミノ酸配列７０）、ＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（アミノ酸配列７１）、ＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（アミノ酸配列７２）、ＲＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＳＷＳＲ（アミノ酸配列７３）、ＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＲＳＷＳＲ（アミノ酸配列７４）、ＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＲＳＷＳＳＲ（アミノ酸配列７５）、ＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（アミノ酸配列７６）、ＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（アミノ酸配列７７）、ＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＡＬＹＳＲ（アミノ酸配列７８）、またはＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＡＬＹＳＳＲ（アミノ酸配列７９）（ただし、下付き文字「Ｓ」で示された残基は、炭化水素結合によって連結されている）を含む。
【0117】
ＶＥＰＥＰ－６ペプチド
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（ＡＤＧＮ－１０６ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－１０６ペプチドとも呼ばれる）を含む。本明細書に記載のＶＥＰＥＰ－６ペプチドは二次両親媒性ペプチドである。これらは非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－６は溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、及びカーゴ（ｓｉＲＮＡ／一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドなど）の存在下でαヘリックス構造の形をとる。例示的なＶＥＰＥＰ－６ペプチドについては、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＵＳ２０１４０２２７３４４及びＥＰ２６９４５２９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（ＡＤＧＮ－１０６ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－１０６ペプチドとも呼ばれる）を含む。本明細書に記載のＶＥＰＥＰ－６ペプチドは二次両親媒性ペプチドである。これらは非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－６は溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、及びカーゴ（ｓｉＲＮＡ／一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドなど）の存在下でαヘリックス構造の形をとる。例示的なＶＥＰＥＰ－６ペプチドについては、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＵＳ２０１４０２２７３４４及びＥＰ２６９４５２９を参照されたい。
【0118】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ＬＸ１ＲＡＬＷＸ８ＬＸ２Ｘ８Ｘ３ＬＷＸ８ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８０）、ＬＸ１ＬＡＲＷＸ８ＬＸ２Ｘ８Ｘ３ＬＷＸ８ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８１）、ＬＸ１ＡＲＬＷＸ８ＬＸ２Ｘ８Ｘ３ＬＷＸ８ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８２）、ＬＸ１ＲＡＬＷＲＬＸ２ＲＸ３ＬＷＲＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８３）（ただし、Ｘ１はＦまたはＷであり、Ｘ２はＬ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ３はＳ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ４はＬまたはＷであり、Ｘ５はＷまたはＲであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＡまたはアミノ酸なしであり、Ｘ８はＲまたはＳである）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６は、ＬＸ１ＲＡＬＷＲＬＸ２ＲＸ３ＬＷＲＬＸ４Ｘ５ＫＸ６（配列番号８４）（ただし、Ｘ１はＦまたはＷであり、Ｘ２はＬまたはＷであり、Ｘ３はＳ、ＡまたはＮであり、Ｘ４はＬまたはＷであり、Ｘ５はＷまたはＲであり、Ｘ６はＡまたはアミノ酸なしである）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号８５～９０のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９１～９７のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫ（配列番号９７）を含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドはレトロインベルソペプチドである。いくつかの実施形態では、レトロインベルソペプチドは配列番号９８の配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、炭化水素結合によって連結された３個または６個の残基によって分離された２個の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、７位と１１位の２個の残基の間に炭化水素結合を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、１０位と１４位の２個の残基の間に炭化水素結合を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、４位と１１位の２個の残基の間に炭化水素結合を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９９～１０７のいずれか１つに示される配列を含む。
【0121】
ＶＥＰＥＰ－９ペプチド
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（またはＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドとも呼ばれる）を含む。ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅを除くＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、二次両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。図１１Ｂを参照されたい。ＶＥＰＥＰ－９は溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、ならびにペプチド、ＳＭＨ、及び低分子オリゴヌクレオチドなどのカーゴの存在下でαヘリックス構造の形をとる。これに対して、ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅは、配列中のプロリン残基の存在により、コイル／ターン編成の形をとる。ＶＥＰＥＰ－９ｃのＮ末端ドメインは、脂質または人工細胞膜の存在下、及びカーゴの存在下で、αヘリックス構造の形をとる。ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅも安定化ペプチドとして機能することが予想される。本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２４、ＵＳ２０１６００６０２９６Ａ１、及びＥＰ２９２８９０８に記載される例示的なＶＥＰＥＰ－９ペプチドを参照されたい。
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（またはＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドとも呼ばれる）を含む。ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅを除くＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、二次両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。図１１Ｂを参照されたい。ＶＥＰＥＰ－９は溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、ならびにペプチド、ＳＭＨ、及び低分子オリゴヌクレオチドなどのカーゴの存在下でαヘリックス構造の形をとる。これに対して、ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅは、配列中のプロリン残基の存在により、コイル／ターン編成の形をとる。ＶＥＰＥＰ－９ｃのＮ末端ドメインは、脂質または人工細胞膜の存在下、及びカーゴの存在下で、αヘリックス構造の形をとる。ＶＥＰＥＰ－９ｃ及びＶＥＰＥＰ－９ｅも安定化ペプチドとして機能することが予想される。本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２４、ＵＳ２０１６００６０２９６Ａ１、及びＥＰ２９２８９０８に記載される例示的なＶＥＰＥＰ－９ペプチドを参照されたい。
【0122】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号１０８）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＬまたはアミノ酸なしであり、Ｘ３はＲまたはアミノ酸なしであり、Ｘ４はＬ、ＲまたはＧであり、Ｘ５はＲ、ＷまたはＳであり、Ｘ６はＳ、ＰまたはＴであり、Ｘ７はＷまたはＰであり、Ｘ８はＦ、ＡまたはＲであり、Ｘ９はＳ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０はＲまたはＳであり、Ｘ１１はＷまたはアミノ酸なしであり、Ｘ１２はＡ、Ｒまたはアミノ酸なしであり、Ｘ１３はＷまたはＦであり、Ｘ３がアミノ酸なしである場合、Ｘ２、Ｘ１１及びＸ１２もアミノ酸なしである）を含むＶＥＰＥＰ－９細胞浸透性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＲＷＷＬＲＷＡＸ６ＲＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号１０９）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓ、またはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＬまたはアミノ酸なし、Ｘ６はＳまたはＰであり、Ｘ８はＦまたはＡであり、Ｘ９はＳ、ＬまたはＰであり、Ｘ１０はＲまたはＳであり、Ｘ１２はＡまたはＲであり、Ｘ１３はＷである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号１１０）、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号１１１）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号１１２）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号１１３）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＰＲＷＦＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号１１４）、及びＸ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号１１５）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしである）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ７Ｘ８ＲＸ１０ＷＷＲ（配列番号１１６）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしであり、Ｘ４はＲまたはＧであり、Ｘ５はＷまたはＳであり、Ｘ６はＳ、ＴまたはＰであり、Ｘ７はＷまたはＰであり、Ｘ８はＡまたはＲであり、Ｘ１０はＳまたはＲである）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＲＷＷＡＳＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号１１７）、Ｘ１ＷＷＧＳＷＡＴＰＲＲＲＷＷＲ（配列番号１１８）、及びＸ１ＷＷＲＷＷＡＰＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号１１９）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓ、またはアミノ酸なしである）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号１２０または１２１に示される配列を含む。
【0123】
ＶＥＰＥＰ－３ペプチド
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはＶＥＰＥＰ－３ペプチドを含む。ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、一次両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、ならびにペプチドまたはタンパク質などのカーゴの存在下でＮ末端部分がαヘリックス構造の形をとる。例示的なＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２２、ＵＳ２０１６００８９４４７、及びＥＰ２９５１１９６に記載されている。
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはＶＥＰＥＰ－３ペプチドを含む。ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、一次両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは溶液中で遊離型としてアンフォールドし、脂質または人工細胞膜の存在下、ならびにペプチドまたはタンパク質などのカーゴの存在下でＮ末端部分がαヘリックス構造の形をとる。例示的なＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２２、ＵＳ２０１６００８９４４７、及びＥＰ２９５１１９６に記載されている。
【0124】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２２）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＫ、ＲまたはＬであり（互いに独立して）、Ｘ３はＦまたはＷであり（互いに独立して）、Ｘ４はＦ、ＷまたはＹであり（互いに独立して）、Ｘ５はＥ、ＲまたはＳであり、Ｘ６はＲ、ＴまたはＳであり、Ｘ７はＥ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ８はアミノ酸なし、ＦまたはＷであり、Ｘ９はＰまたはＲであり、Ｘ１０はＲまたはＬであり、Ｘ１１はＫ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２はＲまたはＦであり、Ｘ１３はＲまたはＫである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＷＸ４ＥＸ２ＷＸ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３ＰＲＸ１１ＲＸ１３（配列番号１２３）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＫ、ＲまたはＬであり、Ｘ３はＦまたはＷであり、Ｘ４はＦ、ＷまたはＹであり、Ｘ５はＥ、ＲまたはＳであり、Ｘ６はＲ、ＴまたはＳであり、Ｘ７はＥ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ８はアミノ酸なし、ＦまたはＷであり、Ｘ９はＰまたはＲであり、Ｘ１０はＲまたはＬであり、Ｘ１１はＫ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２はＲまたはＦであり、Ｘ１３はＲまたはＫである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号１２４）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号１２５）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＫ（配列番号１２６）、Ｘ１ＲＷＷＥＫＷＷＴＲＷＰＲＫＲＫ（配列番号１２７）、またはＸ１ＲＷＹＥＫＷＹＴＥＦＰＲＲＲＲ（配列番号１２８）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＸ１４ＷＷＲＥＷＷＲＸ１４ＷＰＲＫＲＫ（配列番号１２９）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓ、またはアミノ酸なしであり、Ｘ１４は非天然アミノであり、２個の非天然アミノ酸間に炭化水素結合がある）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＸ５Ｘ１０Ｘ３ＷＸ６Ｘ７ＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２Ｒ（配列番号１３０）（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしであり、Ｘ２はＫ、ＲまたはＬであり、Ｘ３はＦまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＳであり、Ｘ６はＲまたはＳであり、Ｘ７はＲまたはＳであり、Ｘ８はＦまたはＷであり、Ｘ９はＲまたはＰであり、Ｘ１０はＬまたはＲであり、Ｘ１２はＲまたはＦである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＲＬＷＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１３１）、Ｘ１ＬＷＷＲＲＷＷＳＲＷＷＰＲＷＲＲ（配列番号１３２）、Ｘ１ＬＷＷＳＲＷＷＲＳＷＦＲＬＷＦＲ（配列番号１３３）、またはＸ１ＫＦＷＳＲＦＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１３４））（ただし、Ｘ１はβＡ、Ｓまたはアミノ酸なしである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１２２～１３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、細胞透過性ペプチドは、非天然アミノ酸による５位及び１２位のアミノ酸の置換、及び２個の非天然アミノ酸間の炭化水素結合の付加によって改変されている。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＸ１４ＬＷＷＲＳＷＸ１４ＲＬＷＲＲ（配列番号１３５）（ただし、Ｘ１はベータアラニン、セリン、またはアミノ酸なしであり、Ｘ１４は非天然アミノ酸であり、２個の非天然アミノ酸間に炭化水素結合がある）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１３６または１３７に示される配列を含む。
【0125】
ＶＥＰＥＰ－４ペプチド
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはＶＥＰＥＰ－４ペプチドを含む。ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは溶液中、ならびに脂質または人工細胞膜の存在下、またはペプチドもしくは小分子などのカーゴの存在下で遊離型としてアンフォールドする。例示的なＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＵＳ２０１６０１１５１９９Ａ１、ＷＯ２０１４／０５３６２８、及びＥＰ２９２８９０６に記載されている。
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはＶＥＰＥＰ－４ペプチドを含む。ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、両親媒性ペプチドであり、非常に汎用性が高く、強い構造多型を示す。ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは溶液中、ならびに脂質または人工細胞膜の存在下、またはペプチドもしくは小分子などのカーゴの存在下で遊離型としてアンフォールドする。例示的なＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＵＳ２０１６０１１５１９９Ａ１、ＷＯ２０１４／０５３６２８、及びＥＰ２９２８９０６に記載されている。
【0126】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、アミノ酸配列ＸＷＸＲＬＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１３８）（ただし、１位のＸはβＡ、Ｓ、またはアミノ酸なしであり、３、９及び１０位のＸは互いに独立してＷまたはＦであり、８位のＸがＳである場合、６位のＸはＲであり、８位のＸがＲの場合、６位のＸはＳであり、７位のＸはＬまたはアミノ酸なしであり、１１位のＸはＲまたはアミノ酸なしであり、１１位のＸがアミノ酸なしである場合、７位のＸはＬである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、配列番号１３８～１４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ＶＥＰＥＰ－５ペプチド
ＶＥＰＥＰ－５ペプチド
【0127】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはＶＥＰＥＰ－５ペプチドを含む。ＶＥＰＥＰ－５は短い一次ペプチドであり、場合によっては二次両親媒性ペプチドであり、ペプチド、ペプチド類似体、ＰＮＡ、及び疎水性小分子（ｓｍａｌｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；以下、「ＳＨＭ」として示す）などの分子と安定したナノ粒子を形成する。例示的なＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、例えば、本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところのＵＳ２０１６０１４５２９９Ａ１、ＷＯ２０１４／０５３６２９、及びＥＰ２９２８９０７に記載されている。
【0128】
いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、アミノ酸配列ＲＸＷＸＲＬＷＸＲＬＲ（配列番号１４３）（ただし、２位のＸはＲまたはＳであり、４及び８位のＸは互いに独立してＷまたはＦである）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、配列番号１４４～１４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0129】
リンカー
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、リンカーによりブロッキングペプチドに連結される。
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、リンカーによりブロッキングペプチドに連結される。
【0130】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個、３個、または４個のグリシン、場合により連続したグリシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリンを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１８６）またはＳＧＧＧＧ（配列番号１８７）配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のポリマーはＣＰＰのＮ末端に結合され、第２のポリマーはＣＰＰのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、分枝状ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａ以下である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも約１、２、または３個のエチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０、９、８、または７個のエチレングリコール単位で構成される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１、２、または３個のエチレングリコール単位で構成される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～８個、または約２～約７個のエチレングリコール単位で構成される。
【0132】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド架橋、ポリグリシン（Ｇ２またはＧ４など）、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、及びＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分はＡｖａ（５－アミノペンタン酸）を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ａｈｘ（アミノカプロン酸）を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリンを含む。プロリンは、ブロックドメインと安定化ドメインの間の二次構造にキンクを形成する。
【0134】
いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分（例えば、約２～７個のエチレングリコール単位で構成される）、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。
【0135】
本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、または安定化ペプチドのいずれかをコードする核酸も想到される。
【0136】
ｓｉＲＮＡ
本出願は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを標的とする新規ｓｉＲＮＡを提供する。
本出願は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを標的とする新規ｓｉＲＮＡを提供する。
【0137】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６１～１７０のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号１６６の核酸配列を含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７１～１７５のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７１、１７３、及び１７４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７６～１７９のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７７、１７８、及び１８０からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを修飾することができる（例えば、化学的に修飾する）。修飾の例としては、３’末端デオキシチミン、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ修飾、２’－アミノ修飾、２’－アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホルアミデート修飾、５’－ホスホロチオエート基修飾、５’リン酸または５’リン酸模倣体修飾、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾が挙げられるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオチドは、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、またはヌクレオチドを含む非天然塩基のいずれであってもよい。
【0141】
本明細書ではまた、以下に記載されるような複合体、ナノ粒子、組成物を含むがこれらに限定されない、上記に述べたようなキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡのいずれかを含む複合体、ナノ粒子、組成物も提供される。
【0142】
ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びコンジュゲーションを含む（ただし、これらに限定されない）本出願に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、及び組成物のいずれかを送達するための多くの送達システムを使用して、キメラペプチド（複数可）、ブロッキングペプチド（複数可）及び／またはｓｉＲＮＡを宿主細胞に導入することができる。従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて哺乳類細胞または標的組織に核酸を導入することができる。このような方法を使用して、本発明のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドをコードする核酸を、培養細胞または宿主生物に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のコンストラクトの転写産物）、ネイキッド核酸、及びリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成させた核酸が挙げられる。
【0143】
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エクソソーム、マイクロベシクル、または遺伝子銃、ネイキッドＤＮＡ、及び人工ビリオンが挙げられる。
【0144】
核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、及び／またはウイルスペイロードを細胞核に輸送するうえで高い効率を有する。
【0145】
複合体及びナノ粒子
本出願は、ａ）本明細書に記載されるもののいずれかのようなキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡが第２のペプチドと複合体を形成している、複合体を提供する。本明細書に記載の複合体のいずれかを含むナノ粒子も提供される。いくつかの実施形態では、ａ）本明細書に記載されるもののいずれかのようなキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含むナノ粒子が提供される。
本出願は、ａ）本明細書に記載されるもののいずれかのようなキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡが第２のペプチドと複合体を形成している、複合体を提供する。本明細書に記載の複合体のいずれかを含むナノ粒子も提供される。いくつかの実施形態では、ａ）本明細書に記載されるもののいずれかのようなキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含むナノ粒子が提供される。
【0146】
いくつかの実施形態では、ａ）ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとを含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドがＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的にブロックし、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含み、安定化ペプチドが両親媒性ヘリックスを含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、およびＶＥＰＥＰ－９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、アミノ酸約２０個以下（例えばアミノ酸約７～１８個）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、ループ配列は環状である。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0147】
いくつかの実施形態では、ａ）ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとを含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドがＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的にブロックし、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含み、安定化ペプチドが両親媒性ヘリックスを含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドはブロッキングペプチドのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドと安定化ペプチドとはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0148】
いくつかの実施形態では、ａ）安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドが配列番号１、６、８～１１、２３、２４、２６～２８、３１、４２、４５及び４７～５２からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドが、リンカーによってブロッキングペプチドのＣ末端に連結されたＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0149】
いくつかの実施形態では、ａ）リンカーによって安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチド（例えば、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結される）を含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドが、配列番号１、６、及び８～１１からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドが、配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0150】
いくつかの実施形態では、ａ）リンカーによって安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチド（例えば、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結される）を含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドが、配列番号１５１、１５６、及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含み、安定化ペプチドが、配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0151】
いくつかの実施形態では、ａ）リンカーによって安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチド（例えば、ブロッキングペプチドのＣ末端に連結される）を含むキメラペプチドを含むカーゴであって、ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドが、配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む、カーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0152】
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、安定化ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ－１０６ペプチド、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、及びＶＥＰＥＰ－１０９ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはキメラペプチドと複合体を形成する。
【0153】
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号２７、３８、３９、４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとブロッキングペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはブロッキングペプチドと複合体を形成する。
【0154】
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとブロッキングペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはブロッキングペプチドと複合体を形成する。
【0155】
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとブロッキングペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはブロッキングペプチドと複合体を形成する。
【0156】
いくつかの実施形態では、ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約５：１～約５０：１、約２０：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはブロッキングペプチドと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６１～１７０のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号１６６の核酸配列を含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）からなる群から選択される第２のペプチドとを含み、ｓｉＲＮＡが第２のペプチドと複合体を形成している、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約５：１～約５０：１、約２０：１）である。
【0158】
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ）配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドと、ｉｉ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡと、を含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約５：１～約５０：１、約２０：１）である。いくつかの実施形態において、第２のペプチドとキメラペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。
【0159】
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ）配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドと、ｉｉ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡと、を含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む、複合体またはナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号５３～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号８０～１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１０８～１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約５：１～約５０：１、約２０：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとブロッキングペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。
【0160】
カーゴ分子
いくつかの実施形態では、上記に述べた複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）、ペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）、及びペプチド／核酸複合体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記に述べた複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）、ペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）、及びペプチド／核酸複合体からなる群から選択される。
【0161】
核酸
いくつかの実施形態では、上記に述べた複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のオリゴ及びポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、様々な形態のＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴマー、リボザイム、アプタマー、プラスミドＤＮＡなど、及びそれらの１つ以上の適当な組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡｉを含む。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡ及びＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは疾患または状態を治療するための治療用タンパク質をコードし、ＲＮＡｉはＲＮＡを標的とし、ＲＮＡの発現はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する疾患もしくは状態に関連する。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドと核酸とのモル比は、約１：１～約１００：１である。
いくつかの実施形態では、上記に述べた複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のオリゴ及びポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、様々な形態のＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴマー、リボザイム、アプタマー、プラスミドＤＮＡなど、及びそれらの１つ以上の適当な組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡｉを含む。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡ及びＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは疾患または状態を治療するための治療用タンパク質をコードし、ＲＮＡｉはＲＮＡを標的とし、ＲＮＡの発現はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する疾患もしくは状態に関連する。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドと核酸とのモル比は、約１：１～約１００：１である。
【0162】
いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンタゴマーの場合には必ずしもではないが最大２００ヌクレオチドまで、またはプラスミドＤＮＡの場合には最大１０００キロ塩基までの範囲の長さのいずれであってもよい。
【0163】
いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）またはｓｈＲＮＡのような干渉ＲＮＡである。「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内にある場合に、標的遺伝子または配列の発現を低減または阻害することができる（例えば、干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介するかまたはその翻訳を阻害することにより）一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡ）のことを指し、したがって、干渉ＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２本の相補鎖若しくは単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡのことを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子または配列に対して実質的または完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉ＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子またはその部分配列に対応することができる。干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」が含まれ、例えば、約１５～６０、１５～５０、または５～４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より典型的には約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さの干渉ＲＮＡが含まれる（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５～６０、１５～５０、１５～４０、５～３０、５～２５、または１９～２５塩基対の長さ、好ましくは約８～２２、９～２０、または１９～２１塩基対の長さである）。
【0164】
いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖アンチセンスＲＮＡである。干渉ＲＮＡの適当な長さは、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対、または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一）である。いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、例えば、非天然ヌクレオチドを組み込むことによって改変される。
【0165】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に関連する疾患に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡである。
【0166】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６１～１７０のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号１６６の核酸配列を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７１～１７５のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７１、１７３、及び１７４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７６～１７９のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１７７、１７８、及び１８０からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0169】
いくつかの実施形態において、核酸はｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、真核細胞に見られる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。マイクロＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して非常に少ない数のヌクレオチド（平均２２個）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的のメッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に結合する転写後制御因子であり、通常は翻訳抑制または標的の分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは、１０００種以上のｍｉＲＮＡをコードしていると考えられるが、これは哺乳類遺伝子の約６０％を標的にできると考えられ、多くのヒト細胞型に豊富に存在している。ｍｉＲＮＡの適当な長さは、約５～約２００ヌクレオチド、または０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対、または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一）である。いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、例えば、非天然ヌクレオチドを組み込むことによって改変される。
【0170】
いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメント（例えば、約１０００ｂｐ以下の長さのＤＮＡフラグメント）である。さらに、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、高メチル化または低メチル化されてもよい。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは１つ以上の遺伝子をコードし、前記１つ以上の遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、適当な宿主細胞中でのプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントの維持を可能とする選択マーカーをコードする１つ以上の遺伝子を含んでもよい。
【0171】
ペプチド
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害するブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のブロッキングペプチドのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、本明細書に記載のキメラペプチドのいずれかなどのキメラペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害するブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のブロッキングペプチドのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、本明細書に記載のキメラペプチドのいずれかなどのキメラペプチドを含む。
【0172】
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）を特異的に標的とするブロッキングペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、スパイクタンパク質（例えば、ヒトＡＣＥ２）に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ループ配列は、ＳＰＩＫＥの受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）内にある。いくつかの実施形態では、ループ配列は、ループα４－β５、ループβ５－β６、及びループβ６－α５からなる群から選択されるＲＢＭ構造モチーフのいずれかのモチーフ内にある。
【0173】
いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ループ配列は、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１、６及び８～１１からなる群から選択される配列を含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、スパイクタンパク質を特異的に標的とする阻害ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、阻害ペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）に由来するアミノ酸配列を含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２（例えば、ヒトＡＣＥ２）の細胞外ドメイン内の配列（例えば、ループ配列、またはαヘリックスモチーフ）に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のα１ヘリックス内の配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックス内の配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ヒトＡＣＥ２のβ３とβ４鎖との間のループ配列に由来する配列を含む。
【0176】
いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列は、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列と配列のＣ末端の１個、２個または３個のアミノ酸が異なる。
【0177】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、及び３１からなる群から選択される配列を含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、遮断ペプチドは、配列番号１５１～１６０のいずれか１つから選択される環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１、１５６及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含む。
【0180】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２～２２及び２４～４１のいずれか１つから選択される非天然ペプチドを含む。
【0181】
ペプチド／核酸複合体
いくつかの実施形態では、カーゴは、ａ）核酸（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２またはそれに関連する疾患に関与するタンパク質をコードする、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡ）と、ｂ）ＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害するブロッキングペプチドと、を含む２つ以上のカーゴ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡでる。
いくつかの実施形態では、カーゴは、ａ）核酸（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２またはそれに関連する疾患に関与するタンパク質をコードする、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡ）と、ｂ）ＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害するブロッキングペプチドと、を含む２つ以上のカーゴ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡでる。
【0182】
いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：５～約５０：１（例えば、約１：１～約２０：１、約２：１～約１０：１、約４：１）である。
【0183】
例示的な核酸には、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれも含まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号１６６の核酸配列を含む。
【0184】
例示的なブロッキングペプチドには、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれも含まれる。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、ａ）配列番号１５１、１５６、及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチド、またはｂ）配列番号１、６、８～１１、１２、１７、１９～２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、４５、４７、４８、５０、及び５２からなる群から選択される配列を含むペプチドを含む。
【0185】
第２のペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２のペプチドは、カーゴと複合体を形成した後、ナノ構造（例えば、直径２００ｎｍ以下の）に自己集合することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２のペプチドは、カーゴと複合体を形成した後、ナノ構造（例えば、直径２００ｎｍ以下の）に自己集合することができる。
【0186】
第２のペプチドは、上記に述べた安定化ペプチドのいずれであってもよい。
【0187】
細胞透過性ペプチド
いくつかの実施形態では、第２のペプチドは細胞透過性ペプチドである。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、有望な非ウイルス手法の１つである。ＣＰＰの定義は常に変化してきているが、一般に、タンパク質またはキメラ配列のいずれかに由来するアミノ酸３０個未満の短いペプチドとして説明されている。ＣＰＰは通常、両親媒性であり、正味の正電荷を持っている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６）。ＣＰＰは生体膜を透過し、細胞質中へと細胞膜を通過するへの様々な生体分子の移動を誘発し、それらの細胞内経路を改善することで、標的との相互作用を促進することができる。ＣＰＰは２つの主要なクラスに分類され、１つ目はカーゴとの化学結合を必要とするもので、２つ目は安定した非共有結合複合体の形成を伴うものである。いずれの手法のＣＰＰも、広範な細胞型及びインビボモデルへの様々なカーゴ（プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、ペプチド、リポソーム、ナノ粒子など）の送達を助けることが報告されている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６；Ｍｉｃｋａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，２００－２０９；Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １１，３３９５－３４０８）。
いくつかの実施形態では、第２のペプチドは細胞透過性ペプチドである。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、有望な非ウイルス手法の１つである。ＣＰＰの定義は常に変化してきているが、一般に、タンパク質またはキメラ配列のいずれかに由来するアミノ酸３０個未満の短いペプチドとして説明されている。ＣＰＰは通常、両親媒性であり、正味の正電荷を持っている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６）。ＣＰＰは生体膜を透過し、細胞質中へと細胞膜を通過するへの様々な生体分子の移動を誘発し、それらの細胞内経路を改善することで、標的との相互作用を促進することができる。ＣＰＰは２つの主要なクラスに分類され、１つ目はカーゴとの化学結合を必要とするもので、２つ目は安定した非共有結合複合体の形成を伴うものである。いずれの手法のＣＰＰも、広範な細胞型及びインビボモデルへの様々なカーゴ（プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、ペプチド、リポソーム、ナノ粒子など）の送達を助けることが報告されている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６；Ｍｉｃｋａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，２００－２０９；Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １１，３３９５－３４０８）。
【0188】
タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）の概念は、ある種のタンパク質（主に転写因子）が細胞内及び細胞間を往来できるという観察に基づいて最初に提案された（レビューについては、Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６を参照）。最初の観察は、１９８８年にＦｒａｎｋｅｌとＰａｂｏによって行われた。彼らは、ＨＩＶ－１の転写トランス活性化（Ｔａｔ）タンパク質が細胞内に入り、核内に移行できることを示した。１９９１年、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚのグループは、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメインについて同じ結論に達し、このドメインが神経細胞に内在化されることを実証した。これらの研究は、１９９４年の最初のタンパク質伝達ドメイン（ペネトラチンと名付けられたアンテナペディアのホメオドメインの３番目のヘリックスに由来する１６量体ペプチド）の発見の起源となった。１９９７年、Ｌｅｂｌｅｕのグループは、細胞取り込みに必要なＴａｔの最小配列を特定し、インビボでのＰＴＤの応用の最初の概念実証が、低分子ペプチド及び高分子タンパク質の送達についてＤｏｗｄｙのグループによって報告された（Ｇｕｍｐ ＪＭ， ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ ＳＦ（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３，４４３－４４８．）。歴史的には、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の概念は、１９９８年にＬａｎｇｅｌのグループによって導入され、スズメバチ毒ペプチドであるマストパランに連結された神経ペプチドガラニンのＮ末端フラグメントに由来する最初のキメラペプチドキャリアとしてトランスポータンが設計された。トランスポータンは、培養細胞とインビボの両方でＰＮＡ（ペプチド核酸）の送達を改善することが最初に報告されている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ））。１９９７年に、ＨｅｉｔｚとＤｉｖｉｔａのグループは、ＣＰＰがカーゴとの安定した非共有複合体の形成に関与する新しい手法を提案した（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５，２７３０－２７３６）。この手法は、最初、親水性（極性）ドメインと疎水性（無極性）ドメインの２つのドメインからなる短いペプチドキャリア（ＭＰＧ）に基づいたものであった。ＭＰＧは核酸の送達用に設計されたものである。その後、一次両親媒性ペプチドＰｅｐ－１が、タンパク質及びペプチドの非共有結合的送達について提案された（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９，１１７３－１１７６）。その後、ＷｅｎｄｅｒとＦｕｔａｋｉのグループにより、ポリアルギニン配列（Ａｒｇ８）が低分子及び高分子を細胞内にインビボで誘導するのに十分であることが示された（Ｎａｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０，１０１１－１０２２；Ｒｏｔｈｂａｒｄ ｅｔ ａｌ． （２００４））Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６， ９５０６－９５０７）。それ以来、天然または非天然の配列に由来する多くのＣＰＰが同定され、そのリストは常に増え続けている。単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、カルシトニン、抗菌ペプチドまたは毒素ペプチド、細胞周期の調節に関与するタンパク質、及びポリプロリンリッチペプチドに由来するペプチドが得られている（Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７，１９５－２０６）。最近では、二次両親媒性ＣＰＰに基づいた新しい非共有結合的手法が記載されている。上記に述べたＣＡＤＹ及びＶＥＰＥＰファミリーのようなこれらのペプチドは、分子の異なる側に親水性及び疎水性残基を有するヘリックス形状（すなわち、両親媒性ヘリックス）に自己集合することができる。ＷＯ２０１４／０５３８７９は、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドを開示し、ＷＯ２０１４／０５３８８１は、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドを開示し、ＷＯ２０１４／０５３８８２は、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドを開示し、ＷＯ２０１２／１３７１５０は、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドを開示し、ＷＯ２０１４／０５３８８０は、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドを開示し、ＷＯ２０１６／１０２６８７は、ＡＤＧＮ－１００ペプチドを開示し、ＵＳ２０１０／００９９６２６は、ＣＡＤＹペプチドを開示し、米国特許第７，５１４，５３０号は、ＭＰＧペプチドを開示しており、これらの開示内容の全体を参照により本明細書に援用するものである。
【0189】
いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド（例えば、配列番号１８１）、ＰＥＰ－２ペプチド（例えば、配列番号１８２）、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはＶＥＰＥＰ－９ペプチドを含む。
【0190】
ＬＮＣＯＶペプチド
いくつかの実施形態では、第２のペプチドはＬＮＣＯＶペプチドを含む。実施例１３に示されるように、例示的なＬＮＣＯＶペプチド（ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８）は、細胞内のカーゴ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の送達を促進する。いくつかの実施形態では、ＬＮＣＯＶペプチドは、配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＣＯＶペプチドは、配列番号１７または３３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のペプチドはＬＮＣＯＶペプチドを含む。実施例１３に示されるように、例示的なＬＮＣＯＶペプチド（ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８）は、細胞内のカーゴ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の送達を促進する。いくつかの実施形態では、ＬＮＣＯＶペプチドは、配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＣＯＶペプチドは、配列番号１７または３３のアミノ酸配列を含む。
【0191】
第２のペプチドの修飾
いくつかの実施形態において、第２のペプチド（例えば、本明細書に記載のＣＰＰ、例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、第２のペプチドのＮ末端に連結された（例えば、共有結合により連結された）１つ以上の部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は第２のペプチドのＮ末端に共有結合により連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核搬出シグナル、抗体またはその抗体フラグメント、ペプチド、多糖類、リンカー部分、及び標的化部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は第２のペプチドのＮ末端に共有結合により連結されたアセチル基を含む。
いくつかの実施形態において、第２のペプチド（例えば、本明細書に記載のＣＰＰ、例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、第２のペプチドのＮ末端に連結された（例えば、共有結合により連結された）１つ以上の部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は第２のペプチドのＮ末端に共有結合により連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核搬出シグナル、抗体またはその抗体フラグメント、ペプチド、多糖類、リンカー部分、及び標的化部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は第２のペプチドのＮ末端に共有結合により連結されたアセチル基を含む。
【0192】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２のペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、第２のペプチドのＣ末端に連結された（例えば、共有結合により連結された）１つ以上の部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝状のＣ１～Ｃ６アルキル基、第一級または第二級アミン、配糖体誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核搬出シグナル、抗体またはその抗体フラグメント、ペプチド、多糖類、リンカー部分、及び標的化部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の部分はシステアミド基を含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２のペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）はステープルされる。本明細書で使用される「ステープルされた」とは、ペプチド内の２個の残基間の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはステープルされ、ペプチドの２個のアミノ酸間に化学結合を含む。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離される。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲまたはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＲである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸のそれぞれはＳである。いくつかの実施形態では、化学結合によって連結された２個のアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。いくつかの実施形態では、化学結合は炭化水素結合である。
【0194】
いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、Ｌアミノ酸を含むＬペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、レトロインベルソペプチド（例えば、逆配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長されると、その親分子のものと同様であるがアミドペプチド結合が反転した側鎖トポロジーをとるペプチド）である。いくつかの実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号６６、６７または９８の配列を含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、Ｎ末端から、アセチル基、標的化部分、及び細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結されたリンカー部分を含む。
【0196】
標的化部分
一部の実施形態において、第２のペプチドは、標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、複合体またはナノ粒子の特定の臓器または組織への送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化部分は第２のペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、標的化部分は第２のペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１の標的化部分が第２のペプチドのＮ末端に結合され、第２の標的化部分が第２のペプチドのＣ末端に結合される。
一部の実施形態において、第２のペプチドは、標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、複合体またはナノ粒子の特定の臓器または組織への送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化部分は第２のペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、標的化部分は第２のペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１の標的化部分が第２のペプチドのＮ末端に結合され、第２の標的化部分が第２のペプチドのＣ末端に結合される。
【0197】
いくつかの実施形態では、標的化部分は、１つ以上の臓器を標的とする標的化ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の臓器は、筋肉、心臓、脳、脾臓、リンパ節、肝臓、肺、及び腎臓からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的化ペプチドは肺を標的とする。いくつかの実施形態では、標的化ペプチドは、ＹＩＧＳＲ（配列番号１８５）のアミノ酸配列を含む。
【0198】
いくつかの実施形態では、標的化部分はリンカー（本明細書に記載されるリンカーのいずれかなど）によって第２のペプチドに連結される。
【0199】
ナノ粒子
本出願は一態様において、上記に述べた複合体のいずれか１つ以上を含むコアを含むナノ粒子を提供する。
本出願は一態様において、上記に述べた複合体のいずれか１つ以上を含むコアを含むナノ粒子を提供する。
【0200】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体を含むコアを含むナノ粒子であって、複合体中の第２のペプチド（細胞透過性ペプチドなど）がカーゴと結合している、ナノ粒子が提供される。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合によらない。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合による。
【0201】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、外周細胞透過性ペプチド（すなわち、ＣＰＰ）を含む表面層（例えば、シェル）をさらに含み、コアはシェルによって被覆される。いくつかの実施形態では、外周ＣＰＰは、コア内の第２のペプチドと同じである。いくつかの実施形態では、外周ＣＰＰは、コア内の第２のペプチドと異なる。いくつかの実施形態では、外周ＣＰＰは、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－４、ＶＥＰＥＰ－５、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、及びＰｅｐ－２ペプチドを含む（ただし、これらに限定されない）。いくつかの実施形態では、外周ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。いくつかの実施形態では、外周細胞透過性ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面層中の外周細胞透過性ペプチドの少なくとも一部は、標的化部分に連結される。いくつかの実施形態では、連結は、共有結合による。いくつかの実施形態では、共有結合による連結は、化学結合による。いくつかの実施形態では、共有結合による連結は、遺伝子的手法による。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子のコアと表面層との間に中間層をさらに含む。いくつかの実施形態では、中間層は中間ＣＰＰを含む。いくつかの実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内の第２のペプチドと同じである。いくつかの実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内の第２のペプチドと異なる。いくつかの実施形態では、中間ＣＰＰは、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、及びＰｅｐ－２ペプチドを含む（ただし、これらに限定されない）。いくつかの実施形態では、中間ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。
【0202】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、複数の複合体を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、所定の比率で存在する複数の複合体を含む。いくつかの実施形態において、所定の比率は、下記により詳細に記載される方法のいずれかにおけるナノ粒子の最も効果的な使用を可能にするように選択される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、１つ以上のさらなるｓｉＲＮＡ、１つ以上の本明細書に記載のさらなるキメラまたはブロッキングペプチド、及び／または１つ以上の第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）をさらに含む。
【0203】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ａ）第２のペプチド（例えば、本明細書に記載の第２のペプチドのいずれか）と複合体を形成した第１のキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第１の複合体と、ｂ）第３のペプチド（例えば、「第２のペプチド」セクションに記載のペプチドのいずれか）と複合体を形成した第２のキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第２の複合体と、を含み、第１のキメラまたはブロッキングペプチドはＡＣＥ２を標的とし、第２のキメラまたはブロッキングペプチドはＳＰＩＫＥを標的とする。いくつかの実施形態では、第１のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択されるループ配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。
【0204】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ａ）第２のペプチド（例えば、本明細書に記載の第２のペプチドのいずれか）と複合体を形成したキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第１の複合体と、ｂ）第３のペプチド（例えば、「第２のペプチド」のセクションに記載されるペプチドのいずれか）と複合体を形成したｓｉＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）を含む第２の複合体と、を含み、キメラペプチドまたはブロッキングペプチドはＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害し、ｓｉＲＮＡはＳＰＩＫＥのヌクレオカプシドを標的とする。いくつかの実施形態では、キメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0205】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ａ）第２のペプチド（例えば、本明細書に記載の第２のペプチドのいずれか）と複合体を形成した第１のキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第１の複合体と、ｂ）第３のペプチド（例えば、「第２のペプチド」セクションに記載のペプチドのいずれか）と複合体を形成した第２のキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第２の複合体と、ｃ）第４のペプチド（例えば、「第２のペプチド」のセクションに記載されるペプチドのいずれか）と複合体を形成したｓｉＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）を含む第３の複合体と、を含み、第１のキメラまたはブロッキングペプチドはＡＣＥ２を標的とし、第２のキメラまたはブロッキングペプチドはＳＰＩＫＥを標的とし、ｓｉＲＮＡはＳＰＩＫＥのヌクレオカプシドを標的とする。いくつかの実施形態では、第１のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択されるループ配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0206】
いくつかの実施形態では、上記に述べた第２、第３、及び第４のペプチドのうちの１つ以上は、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、及びＰｅｐ－２ペプチドを含む（ただし、これらに限定されない）細胞透過性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２、第３、及び第４のペプチドのうちの１つ以上の少なくとも一部は、標的化部分に連結される。いくつかの実施形態では、連結は、共有結合による。
【0207】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子のいずれかによれば、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍであり、例えば、約２０ｎｍ～約８００ｎｍ、約２０ｎｍ～約６００ｎｍ、約２０ｎｍ～約６００ｎｍ、及び約２０ｎｍ～約４００ｎｍを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０または６０ｎｍのいずれか以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約１００ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約６０ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約２０ｎｍ～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約２０ｎｍ～約８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約３０ｎｍ～約６０ｎｍである。
【0208】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約１５０ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約１００ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約２０ｎｍ～約４００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約３０ｎｍ～約４００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約４０ｎｍ～約３００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均または中間直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍである。
【0209】
平均粒径を決定する方法は当該技術分野では周知のものであり、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）は、サブマイクロメートルサイズの粒子のサイズを決定するために一般的に使用されてきた。国際規格ＩＳＯ２２４１２ 粒径分析－動的光散乱、国際標準化機構（ＩＳＯ）２００８及び動的光散乱一般的用語の定義（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１１）。いくつかの実施形態では、粒径は、組成物中のナノ粒子の体積重み付け平均粒径（Ｄｖ５０）として測定される。
【0210】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は滅菌濾過可能である。
【0211】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶ～約６０ｍＶ（例えば、約－３０、－２５、－２０、－１５、－１０、－５、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０ｍＶ（これらの値の間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶ～約３０ｍＶであり、例えば、約－２５ｍＶ～約２５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約２０ｍＶ、約－１５ｍＶ～約１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約１０ｍＶ、及び約－５ｍＶ～約１０ｍＶを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、約０．０５～約０．６（例えば、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、及び０．６のいずれか）（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、約０．１～約０．４、または約０．１５～約０．３である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は実質的に無毒性である。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）を使用して測定することができる。
【0212】
組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、またはナノ粒子のいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、またはナノ粒子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体と、を含む医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、またはナノ粒子のいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、またはナノ粒子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体と、を含む医薬組成物である。
【0213】
いくつかの実施形態では、組成物は、異なるカーゴを含む２つ以上のナノ粒子の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、ａ）ＡＣＥ２またはＳＰＩＫＥを特異的に標的とするキメラペプチドまたはブロッキングペプチドを含む上記の第１のナノ粒子と、ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを特異的に標的とするｓｉＲＮＡを含む第２のナノ粒子と、を含む。いくつかの実施形態では、キメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、組成物中の複合体またはナノ粒子の濃度は、約１ｎＭ～約１００ｍＭであり、例えば、約１０ｎＭ～約５０ｍＭ、約２５ｎＭ～約２５ｍＭ、約５０ｎＭ～約１０ｍＭ、約１００ｎＭ～約１ｍＭ、約５００ｎＭ～約７５０μＭ、約７５０ｎＭ～約５００μＭ、約１μＭ～約２５０μＭ、約１０μＭ～約２００μＭ、及び約５０μＭ～約１５０μＭを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥される。
【0215】
本明細書で使用される「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤及び／または担体」という用語には、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合した、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれるものとする。一般的には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体とは、連邦、州政府の規制機関、もしくは他の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくはヒト及び非ヒト哺乳動物を含む動物における使用について他の広く認識される薬局方に記載されている希釈剤、賦形剤、及び／または担体である。希釈剤、賦形剤、及び／または「担体」という用語は、医薬組成物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を指す。かかる医薬希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、滅菌液、例えば、水及び、石油、動物、植物または合成起源のものを含めた油であり得る。水、生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液を液体希釈剤、賦形剤及び／または担体として、特に注射液に使用することできる。好適な医薬希釈剤及び／または賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられ、凍結乾燥補助剤も含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、徐放製剤などの形態をとることができる。適切な医薬希釈剤、賦形剤、及び／または担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方法に適合する必要がある。適切な希釈剤、賦形剤、及び／または担体は当業者には明らかであり、投与経路に大きく依存する。
【0216】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体またはナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、組成物中の複合体またはナノ粒子の凝集レベル、及び／または組成物中の複合体またはナノ粒子によって媒介される細胞内送達の効率に影響を与える。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体によって媒介される凝集及び／または送達効率に対する効果の程度及び／または方向は、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体の相対量に依存する。
【0217】
例えば、いくつかの実施形態では、組成物中の１つ以上の濃度での薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体（塩、糖、化学緩衝剤、緩衝液、細胞培地、または担体タンパク質など）の存在は、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２００％（例えば、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進及び／またはこれに寄与する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２００％（例えば、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、ＮａＣｌ（ただしこれに限定されない）を含む塩である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、スクロース、グルコース、及びマンニトール（ただしこれらに限定されない）を含む糖である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、ＨＥＰＥＳ（ただしこれに限定されない）を含む化学緩衝剤である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、ＰＢＳ（ただしこれに限定されない）を含む緩衝液である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、及び／または担体は、ＤＭＥＭ（ただしこれに限定されない）を含む細胞培地である。粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）など、粒径を測定するための当該技術分野では周知の任意の手段を使用して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、複合体またはナノ粒子のＤＬＳによって測定されるＺ平均よりも１０％大きい、ＤＬＳによって測定されるＺ平均を有する凝集体は、複合体またはナノ粒子よりも１０％大きい。
【0218】
いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物中の塩の濃度は、約１００ｍＭ以下（例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＭ以下（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。
【0219】
いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２５％（例えば、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物中の糖の濃度は、約２０％以下（例えば、約１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％以下（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、糖はスクロースである。いくつかの実施形態では、糖はグルコースである。いくつかの実施形態では、糖はマンニトールである。
【0220】
いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７．５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約３％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を、複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進しない及び／またはこれに寄与しない濃度で含む。いくつかの実施形態では、化学緩衝剤はＨＥＰＥＳである。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、ＨＥＰＥＳを含む緩衝液の形態で組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳを含む溶液のｐＨは、約５～約９（例えば、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、及び９のいずれか（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、組成物は、約７５ｍＭ以下（例えば、約７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０ｍＭ以下（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））の濃度のＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、化学緩衝剤はリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、リン酸塩を含む緩衝液の形態で組成物に添加される。いくつかの実施形態では、組成物はＰＢＳを含まない。
【0221】
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２００％（例えば、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、細胞培地は、ＤＭＥＭである。いくつかの実施形態では、組成物は、約７０％以下（例えば、約６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０％以下（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））の濃度のＤＭＥＭを含む。
【0222】
いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子の凝集を促進しない及び／またはこれに寄与しないか、あるいは複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２００％（例えば、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む））大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２５％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％大きいサイズ以下のサイズを有する複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進する及び／またはこれに寄与する濃度で含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はアルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。
【0223】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼球内、眼内、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内（気管内注入など）、肺、腔内、経鼻または経口投与、または噴霧（ＮＢ）用に製剤化される。
【0224】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、噴霧用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経鼻投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、気管内投与（気管内注入など）用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【0225】
調製方法
本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、及び非天然ペプチドのいずれかのような、本明細書に記載されるペプチドは、当該技術分野では周知の任意の方法によって合成することができる。例えば、ペプチドは、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で（フルオレニルメトキシ）－カルボニル（Ｆｍｏｃ）を含むＡＥＤＩ－ｅｘｐｅｎｓｉｎ樹脂を使用した固相ペプチド合成法によって合成することができる。例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２８、ＵＳ２０１６０１１５１９９Ａ１またはＥＰ２９２８９０６を参照されたい。
本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、及び非天然ペプチドのいずれかのような、本明細書に記載されるペプチドは、当該技術分野では周知の任意の方法によって合成することができる。例えば、ペプチドは、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で（フルオレニルメトキシ）－カルボニル（Ｆｍｏｃ）を含むＡＥＤＩ－ｅｘｐｅｎｓｉｎ樹脂を使用した固相ペプチド合成法によって合成することができる。例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１４／０５３６２８、ＵＳ２０１６０１１５１９９Ａ１またはＥＰ２９２８９０６を参照されたい。
【0226】
本明細書に記載のペプチドを調製する方法については、実施例（例えば、実施例１）も参照されたい。環状ペプチドの調製については、例えば、Ｒａｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１９；２００１：１３３－１４５） 及び Ａｌｓｉｎａ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３５，Ｉｓｓｕｅ ５１，１９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４，Ｐａｇｅｓ ９６３３－９６３６）に記載されている。
【0227】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法が提供される。
【0228】
いくつかの実施形態では、第２のペプチドをカーゴ分子と結合させ、それによって複合体を形成することを含む、第２のペプチドとカーゴ分子とを含む上記に述べた複合体を調製する方法が提供される。
【0229】
いくつかの実施形態では、ペプチドとカーゴ分子とは、それぞれ、約１：１～約１００：１（約１：１～約５０：１、または約５：１～約２０：１）のモル比で組み合わされる。
【0230】
いくつかの実施形態では、方法は、カーゴ分子を含む第１の溶液を第２のペプチドを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成することを含み、第３の溶液は、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整され、第３の溶液は複合体が形成されるようにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、第１の溶液は滅菌水中にカーゴを含み、及び／または第２の溶液は滅菌水中にペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の溶液は、複合体が形成されるようにインキュベートした後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整される。
【0231】
いくつかの実施形態では、方法は、複合体を細孔サイズの膜を通して濾過する濾過プロセスをさらに含む。いくつかの実施形態では、細孔は、少なくとも約０．１μｍ（少なくとも約０．１μｍ、０．１５μｍ、０．２μｍ、０．２５μｍ、０．３μｍ、０．３５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍまたは１．２μｍなど）の直径を有する。いくつかの実施形態では、細孔は、約１．２μｍ、１．０μｍ、０．８μｍ、０．６μｍ、０．５μｍ、０．４５μｍ、０．４μｍ、０．３５μｍ、０．３μｍ、または０．２５μｍ以下の直径を有する。いくつかの実施形態では、最高は、約０．１μｍ～約１．２μｍ（例えば、約０．１～約０．８μｍ、約０．２～約０．５μｍ）の直径を有する。
【0232】
いくつかの実施形態では、本出願のカーゴ分子送達複合体またはナノ粒子を含む安定な組成物では、複合体またはナノ粒子の平均直径は約１０％よりも大きく変化せず、多分散指数は約１０％よりも大きく変化しない。
【0233】
本明細書に記載のペプチドのいずれかを調製する方法も提供される。
【0234】
使用方法
本出願は、一態様において、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療する方法であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、上記に述べたものなどの組成物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を個体に投与することを含む、方法を提供する。本出願はまた、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を予防する方法であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、上記に述べたものなどの組成物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
本出願は、一態様において、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療する方法であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、上記に述べたものなどの組成物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を個体に投与することを含む、方法を提供する。本出願はまた、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を予防する方法であって、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、上記に述べたものなどの組成物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0235】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療する方法であって、個体に、リンカーによって安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドを含む組成物を投与することを含み、ブロッキングペプチドが、配列番号１、６、８～１１、２３、２４、２６～２８、３１、４２、４５及び４７～５２からなる群から選択される配列を含み、安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５５または９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１５１、１５６及び１５８～１６０からなる群から選択される環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２３、２４、２６～２８、及び３１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラペプチドは、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0236】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療する方法であって、個体に、配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれか１つから選択される非天然ペプチドを含むブロッキングペプチドを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、配列番号２７、３８、３９、４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0237】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個体に、配列番号１６１～１７０のいずれか１つの核酸配列を含むｓｉＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号１６６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0238】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個体に、ａ）配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０（例えば、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０）に示されるアミノ酸配列を含む第１のペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む複合体を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドと第１のペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは第１のペプチドと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0239】
いくつかの実施形態では、個体に、ａ）配列番号２７、３８、３９、４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドを含むカーゴと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む複合体を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとブロッキングペプチドとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約２：１～約１０：１、約５：１）である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドはブロッキングペプチドと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0240】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個体に、ａ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）ＡＤＧＮ－１００ペプチド（例えば、配列番号５５）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（例えば、配列番号９７）またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド（例えば、配列番号１２０または１２１）からなる群から選択される第２のペプチドとを含む複合体であって、ｓｉＲＮＡが第２のペプチドと複合体を形成している、複合体を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドとｓｉＲＮＡとのモル比は、約１：１～約８０：１（例えば、約５：１～約５０：１、約２０：１）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0241】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個体に、ｉ）配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドと、ｉｉ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む複合体を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0242】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個人に、ｉ）配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドと、ｉｉ）配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡと、ｂ）ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド（例えば、配列番号１８３）、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第２のペプチドと、を含む複合体を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0243】
いくつかの実施形態では、個体におけるウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）またはウイルス感染に関連する疾患もしくは状態を治療または予防する方法であって、個人に、ａ）第２のペプチド（例えば、本明細書に記載の第２のペプチドのいずれか）と複合体を形成したキメラペプチドまたはブロッキングペプチド（例えば、本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドのいずれか）を含む第１の複合体と、ｂ）第３のペプチド（例えば、「第２のペプチド」のセクションに記載されるペプチドのいずれか）と複合体を形成したｓｉＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのいずれか）を含む第２の複合体と、を含む組成物を投与することを含み、キメラペプチドまたはブロッキングペプチドがＡＣＥ２とＳＰＩＫＥとの相互作用を阻害し、ｓｉＲＮＡがＳＰＩＫＥのヌクレオカプシドを標的とする、方法が提供される。いくつかの実施形態では、キメラペプチドまたはブロッキングペプチドは、配列番号１７、２０、２１、２７、２８、３３、３９、及び４０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１６３、１６６、１６８、及び１７０（例えば、配列番号１６６）からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、経鼻または気管内に、あるいは吸入または噴霧によって投与される。
【0244】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、男性である。いくつかの実施形態では、個体は、女性である。いくつかの実施形態では、個体は、免疫系が損なわれている。
【0245】
いくつかの実施形態では、個体はウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に曝露されている。いくつかの実施形態では、個体は、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）の初期症状（例えば、発熱、例えば、空咳、例えば、息切れ）を示している。いくつかの実施形態では、個体は、胸痛もしくは胸の圧迫感、息切れ、及び／または唇もしくは顔面の蒼白を有する。いくつかの実施形態では、個体は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有する。いくつかの実施形態では、個体は病院に入院している。いくつかの実施形態では、個体は集中治療室（ＩＣＵ）に入れられる。
【0246】
いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）への曝露から約１、３、５、または７日以内に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルスに曝露される前に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルスへの潜在的曝露の約１、２、３、４、５、６、または７日前に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルスへの潜在的曝露の約１、２、または３週間前に投与される。
【0247】
いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）の初期症状（例えば、発熱、例えば、空咳、例えば、息切れ）の出現から約１、３、５、または７以内に投与される。
【0248】
いくつかの実施形態では、組成物は、個体が胸痛もしくは胸の圧迫感、息切れ、及び／または唇もしくは顔面の蒼白を有してから約１、２、３、４、５、６、または７日以内に投与される。
【0249】
いくつかの実施形態では、組成物は、個体が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有してから約３、６、１２、または２４時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、個体が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有してから約１、２、３、４、または５以内に投与される。
【0250】
いくつかの実施形態では、組成物は、１日３回、１日２回、毎日、２、３、４、５、または６日に１回、週１回、隔週１回、または月１回投与される。
【0251】
ウイルス
いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、コロナウイルス科（例えば、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、もしくはガンマコロナウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、フラビウイルス科（例えば、フラビウイルスもしくはヘパシウイルス）、またはカリシウイルス科（例えば、ノロウイルス）のメンバーであるウイルスによって引き起こされる。
いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、コロナウイルス科（例えば、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、もしくはガンマコロナウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、フラビウイルス科（例えば、フラビウイルスもしくはヘパシウイルス）、またはカリシウイルス科（例えば、ノロウイルス）のメンバーであるウイルスによって引き起こされる。
【0252】
いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、コロナウイルス科のメンバーであるウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アルファコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ－２２９ＥまたはＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ベータコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスである。
【0253】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、アルファコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９ＥまたはＨＣｏＶ－ＮＬ６３である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３である。
【0254】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ベータコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＭＥＲＳ－ＣｏＶである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶである。
【0255】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0256】
併用療法
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の第２の薬剤または療法を投与することをさらに含む。本明細書に記載の第２の薬剤または療法は、ウイルス感染を治療するうえで有用な任意の薬剤または療法であってよい。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の第２の薬剤または療法を投与することをさらに含む。本明細書に記載の第２の薬剤または療法は、ウイルス感染を治療するうえで有用な任意の薬剤または療法であってよい。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、方法はまた、治療有効量のさらなる抗ウイルス剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、さらなる抗ウイルス剤は、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ＩＦＮ－α、ロピナビル、リトナビル、ペンシクロビル、ガリデシビル、ジスルフィラム、ダルナビル、コビシスタット、ＡＳＣ０９Ｆ、ジスルフィラム、ナファモスタット、グリフィスシン、アリスポリビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ニタゾキサニド、バロキサビルマルボキシル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、ファビピラビル、ラニナミビル、リバビリン、ウミフェノビル、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、クロロキンである。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、ヒドロキシクロロキンである。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、レムデシビルである。
【0258】
いくつかの実施形態では、組成物と第２の薬剤とは同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与される。いくつかの実施形態では、組成物と第２の薬剤とは同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）投与される。いくつかの実施形態では、組成物と第２の薬剤とは順次投与される。
【0259】
投与量及び投与方法
組成物及び／または第２の薬剤／療法の投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて、治療過程で調節することができる。別々に投与される場合、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、異なる投与頻度または間隔で投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法の徐放製剤を使用することができる。徐放を行うための各種の製剤及び装置が、当該技術分野において周知である。本明細書に記載の投与形態の組み合わせも使用することができる。
組成物及び／または第２の薬剤／療法の投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて、治療過程で調節することができる。別々に投与される場合、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、異なる投与頻度または間隔で投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法の徐放製剤を使用することができる。徐放を行うための各種の製剤及び装置が、当該技術分野において周知である。本明細書に記載の投与形態の組み合わせも使用することができる。
【0260】
いくつかの実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象を治療するための本明細書に記載のキメラペプチド、ブロッキングペプチド、またはｓｉＲＮＡの投与量は、各投与で約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、投与後の感染部位における本明細書に記載のキメラまたはブロッキングペプチドの濃度は、約０．０１μＭ～１０μＭ（例えば、約０．１μＭ～約１μＭ、例えば約０．５μＭ）である。いくつかの実施形態では、投与後の感染部位における本明細書に記載のｓｉＲＮＡの濃度は、約０．１ｎＭ～約１０μＭ（例えば、約１ｎＭ～１μＭ、例えば約１ｎＭ～約２００ｎＭ）である。
【0261】
いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）への曝露から約１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０日以内に投与される。
【0262】
いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）の最初の症状（例えば、発熱、例えば、空咳、例えば、息切れ）の出現から約１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、または２０以内に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、症状（例えば、発熱、例えば、空咳、例えば、息切れ）が少なくとも２、３、４、５、６、または７日間続く場合に投与される。
【0263】
いくつかの実施形態では、組成物は、個体が胸痛もしくは胸の圧迫感、息切れ、及び／または唇もしくは顔面の蒼白を有してから約１、２、３、４、５、６、または７日以内に投与される。
【0264】
いくつかの実施形態では、組成物は、個体が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有してから約３、６、１２、または２４時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、個体が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有してから約１、２、３、４、または５以内に投与される。
【0265】
いくつかの実施形態では、組成物は、１日３回、１日２回、毎日、２、３、４、５、または６日に１回、週１回、隔週１回、または月１回投与される。
【0266】
組成物及び／または第２の薬剤／療法は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与することができる。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、組成物または第２の薬剤／療法は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼球内、眼内、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内、経鼻、または経口投与、または噴霧（ＮＢ）または気管内注入のいずれかによって個体に投与される。
【0267】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び／または第２の薬剤／療法は、全身または局所投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び／または第２の薬剤／療法は、静脈内、局所、眼球内、眼内、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内、または経口投与、または噴霧（ＮＢ）、吸入、または気管内注入用に製剤化される。
【0268】
いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、噴霧用に製剤化されるかまたは噴霧により個体に投与される。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、経鼻投与用に製剤化されるかまたは経鼻投与により個体に投与される。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、気管内投与（例えば、気管内注入）用に製剤化されるかまたは気管内投与により個体に投与される。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、吸入用に製剤化されるかまたは吸入により個体に投与される。いくつかの実施形態では、組成物及び／または第２の薬剤／療法は、静脈内投与用に製剤化されるかまたは静脈内投与により個体に投与される。
【0269】
患者集団
いくつかの実施形態では、個体は、免疫系が損なわれている。
いくつかの実施形態では、個体は、免疫系が損なわれている。
【0270】
いくつかの実施形態では、個体は、男性である。いくつかの実施形態では、個体は、女性である。
【0271】
いくつかの実施形態では、個体は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳の年齢である。いくつかの実施形態では、個体は、少なくとも約１８、１５、１２、１０、８、６、４、２、または１歳以下の年齢である。いくつかの実施形態では、個体は約２０歳～約４０歳の年齢である。
【0272】
いくつかの実施形態では、個体はウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に曝露されている。
【0273】
いくつかの実施形態では、個体は、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）の最初の症状（例えば、発熱、例えば空咳、例えば息切れ）を示している。
【0274】
いくつかの実施形態では、個体は、胸痛もしくは胸の圧迫感、息切れ、及び／または唇もしくは顔面の蒼白を示している。いくつかの実施形態では、個体は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）を有する。いくつかの実施形態では、個体は病院に入院している。いくつかの実施形態では、個体は集中治療室（ＩＣＵ）に入れられる。
【0275】
いくつかの実施形態では、個体は、参照ＡＣＥ２発現よりも高いＡＣＥ２発現（例えば肺細胞上でのＡＣＥ２発現）（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％または２００％高い）を有する。いくつかの実施形態では、参照ＡＣＥ２発現は、個体と同じ性別及び／または民族性を有する個体群の平均ＡＣＥ２発現である。
【0276】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される個体は、自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、個体は、移植片拒絶反応に関連する疾患または状態を有する。
【0277】
いくつかの実施形態では、個体は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）による治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。いくつかの実施形態では、個体は、コルチコステロイドによる治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。いくつかの実施形態では、個体は、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ＩＦＮ－α、ロピナビル、リトナビル、ペンシクロビル、ガリデシビル、ジスルフィラム、ダルナビル、コビシスタット、ＡＳＣ０９Ｆ、ジスルフィラム、ナファモスタット、グリフィスシン、アリスポリビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ニタゾキサニド、バロキサビルマルボキシル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、ファビピラビル、ラニナミビル、リバビリン、ウミフェノビル、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上による治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。いくつかの実施形態では、個体は、クロロキンによる治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。いくつかの実施形態では、個体は、ヒドロキシクロロキンによる治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。いくつかの実施形態では、個体は、レムデシビルによる治療を受けたことがあるかまたは治療に失敗したことがある。
【0278】
キット
本明細書では、本明細書に記載の方法において有用なキット、試薬、及び製品も提供される。いくつかの実施形態では、キットは、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）のいずれかなどの本明細書に記載のペプチド及びｓｉＲＮＡのいずれかを含むバイアルを、場合により他の分子とともに、１つのバイアルに組み合わせて、または異なるバイアルで別々に含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチドのいずれか）は、適切な１つ以上のキメラペプチド／ブロッキングペプチド及び／またはｓｉＲＮＡと組み合わせることで、効果的な治療を行うために患者に投与できる複合体またはナノ粒子を与える。したがって、いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドと、２）第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のｓｉＲＮＡと、２）第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のｓｉＲＮＡと、２）本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドと、場合により３）本明細書に記載の第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本明細書では、本明細書に記載の方法において有用なキット、試薬、及び製品も提供される。いくつかの実施形態では、キットは、キメラペプチド、ブロッキングペプチド、ｓｉＲＮＡ、第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）のいずれかなどの本明細書に記載のペプチド及びｓｉＲＮＡのいずれかを含むバイアルを、場合により他の分子とともに、１つのバイアルに組み合わせて、または異なるバイアルで別々に含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチド（例えば、細胞透過性ペプチドのいずれか）は、適切な１つ以上のキメラペプチド／ブロッキングペプチド及び／またはｓｉＲＮＡと組み合わせることで、効果的な治療を行うために患者に投与できる複合体またはナノ粒子を与える。したがって、いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドと、２）第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のｓｉＲＮＡと、２）第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、１）本明細書に記載のｓｉＲＮＡと、２）本明細書に記載のキメラペプチドまたはブロッキングペプチドと、場合により３）本明細書に記載の第２のペプチドと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0279】
本明細書に記載のキットは、本発明の方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書（例えば、本明細書に記載の医薬組成物を調製するための説明書及び／または医薬組成物を使用するための説明書）をさらに含むことができる。本発明の方法を実施するための説明書は、適当な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷することができる。したがって、説明書は、添付文書としてキット内、キットまたはその構成要素の容器のラベル内（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付属する）などに存在してもよい。いくつかの実施形態では、説明書は、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスクなどの適当なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在してもよい。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットの中には存在せず、例えば、インターネット経由でリモートソースから説明書を得る手段が提供される。この実施例の一例としては、説明書を見ることができる、及び／またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットがある。説明書と同様、説明書を得るためのこうした手段は適当な媒体に記録される。
【0280】
キットの様々な構成要素は別々の容器に入れることができ、これらの容器を単一のハウジング、例えば箱の中に入れることができる。
【0281】
例示的な実施形態
実施形態１．安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
実施形態１．安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
【0282】
実施形態２．前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【0283】
実施形態３．前記ループ配列が、アミノ酸約２０個以下の長さを有する、請求項２に記載のキメラペプチド。
【0284】
実施形態４．前記ループ配列が、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する、請求項３に記載のキメラペプチド。
【0285】
実施形態５．前記ブロッキングペプチドが、Ｃ末端にＫを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0286】
実施形態６．前記ループ配列が、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0287】
実施形態７．前記ループ配列が、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される、請求項６に記載のキメラペプチド。
【0288】
実施形態８．前記ブロッキングペプチドが、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【0289】
実施形態９．前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【0290】
実施形態１０．前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【0291】
実施形態１１．前記ループ配列が、環状である、請求項２～１０に記載のキメラペプチド。
【0292】
実施形態１２．前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0293】
実施形態１３．前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0294】
実施形態１４．前記安定化ペプチドが、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する、請求項１２または請求項１３に記載のキメラペプチド。
【0295】
実施形態１５．前記ブロッキングペプチド及び前記安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0296】
実施形態１６．前記安定化ペプチドが、配列番号４９または５０に示される配列を含む、請求項１５に記載のキメラペプチド。
【0297】
実施形態１７．前記安定化ペプチドが、両親媒性ヘリックス構造を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0298】
実施形態１８．前記安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、請求項１７に記載のキメラペプチド。
【0299】
実施形態１９．前記安定化ペプチドが、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１８に記載のキメラペプチド。
【0300】
実施形態２０．前記安定化ペプチドが、配列番号５５または９７に示される配列を含む、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【0301】
実施形態２１．前記ブロッキングペプチドと前記安定化ペプチドとがリンカーによって連結されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0302】
実施形態２２．前記リンカーが、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される、請求項２１に記載のキメラペプチド。
【0303】
実施形態２３．前記ＰＥＧ部分が、約２～約７個のエチレングリコール単位で構成される、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【0304】
実施形態２４．配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【0305】
実施形態２５．配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラペプチド。
【0306】
実施形態２６．配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチド。
【0307】
実施形態２７．前記ペプチドが、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の非天然ペプチド。
【0308】
実施形態２８．前記ペプチドが、アミノ酸約１００個以下の長さを有する、実施形態２６または２７に記載の非天然ペプチド。
【0309】
実施形態２９．配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
【0310】
実施形態３０．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６３、１７０、１６６、または１６８に示される核酸配列を含む、実施形態２９に記載のｓｉＲＮＡ。
【0311】
実施形態３１．ａ）実施形態１～２５のいずれかのキメラペプチド、実施形態２６もしくは２７のペプチド、または実施形態２８もしくは実施形態２９のｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、前記ペプチドまたはｓｉＲＮＡが前記第２のペプチドと複合体を形成している、前記複合体。
【0312】
実施形態３２．前記第２のペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである、実施形態３１に記載の複合体。
【0313】
実施形態３３．前記第２のペプチドと前記ペプチドまたはｓｉＲＮＡとのモル比が、約１：１～約８０：１である、実施形態３１または実施形態３２に記載の複合体。
【0314】
実施形態３４．前記第２のペプチドと前記ペプチドとのモル比が、約２：１～約１０：１である、実施形態３３に記載の複合体。
【0315】
実施形態３５．前記第２のペプチドと前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約５：１～約５０：１である、実施形態３４に記載の複合体。
【0316】
実施形態３６．ａ）実施形態１～２５のいずれかのキメラペプチド、もしくは実施形態２６～２８のいずれかのペプチド、及び／またはｂ）実施形態２９もしくは実施形態３０のｓｉＲＮＡを含む、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の複合体。
【0317】
実施形態３７．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６６に示される核酸配列を含む、実施形態３６に記載の複合体。
【0318】
実施形態３８．配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む、実施形態３７に記載の複合体。
【0319】
実施形態３９．実施形態３０～３８のいずれか１つの複合体を含む、ナノ粒子。
【0320】
実施形態４０．前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ以下の直径を有する、実施形態３９に記載のナノ粒子。
【0321】
実施形態４１．前記ナノ粒子が、約４０～約６０ｎｍの直径を有する、実施形態４０に記載のナノ粒子。
【0322】
実施形態４２．ａ）実施形態１～２５のいずれかのキメラペプチド、実施形態２６～２８のいずれかのペプチド、実施形態２９または実施形態３０のｓｉＲＮＡ、実施形態３１～４１のいずれかの複合体またはナノ粒子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【0323】
実施形態４３．２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、前記２つ以上の複合体またはナノ粒子が異なるカーゴを含む、実施形態４２に記載の医薬組成物。
【0324】
実施形態４４．前記カーゴを前記第２のペプチドと組み合わせることを含む、実施形態３１～４１のいずれか１つに記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法。
【0325】
実施形態４５．個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法であって、前記個体に有効量の実施形態４２または実施形態４３の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【0326】
実施形態４６．前記医薬組成物が、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される、実施形態４５に記載の方法。
【0327】
実施形態４７．前記個体が、ヒトである、実施形態４５または実施形態４６に記載の方法。
【実施例】
【0328】
以下の実施例は、本出願の純粋な例示であることが意図されており、したがって、あらゆる意味において本出願を限定するものとしてみなされるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、例示の目的で示されるものであって、限定することを目的とするものではない。
【0329】
実施例１．ＡＣＥ２／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤの相互作用を標的とするペプチド及びペプチドベースのナノ粒子の設計
ＡＣＥ２またはＳｐｉｋｅタンパク質結合ドメインのいずれかを標的とするペプチド阻害剤を、ＡＣＥ２：Ｓｐｉｋｅタンパク質複合体の公開された結晶（ＰＤＢコード：６Ｍ１７）構造及び電子顕微鏡（ＰＤＢコード：６ＬＺＧ）構造の両方に基づいて設計した。阻害剤は、環化、ステープル化学、レトロインベルソ、またはＤアミノ酸の使用のいずれかによってさらに安定化できる安定した構造体が得られるように設計した。
ＡＣＥ２またはＳｐｉｋｅタンパク質結合ドメインのいずれかを標的とするペプチド阻害剤を、ＡＣＥ２：Ｓｐｉｋｅタンパク質複合体の公開された結晶（ＰＤＢコード：６Ｍ１７）構造及び電子顕微鏡（ＰＤＢコード：６ＬＺＧ）構造の両方に基づいて設計した。阻害剤は、環化、ステープル化学、レトロインベルソ、またはＤアミノ酸の使用のいずれかによってさらに安定化できる安定した構造体が得られるように設計した。
【0330】
Ａ．スパイクタンパク質由来の阻害剤の選択
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ構造には、５本鎖の逆平行βシート（β１、β２、β３、β４、及びβ７）の短い連結ヘリックスとループを有するコアドメインが含まれていた。ＡＣＥ２受容体に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの接触残基の多くは、コアドメインのβ４鎖とβ７鎖の間に位置している（図１Ａ）。受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ドメインには、短いβ５及びβ６鎖、α４及びα５ヘリックス及びループが含まれる。主な接触には、α４とβ５の間のループ、β６とα５の間のループ、及びβ５とβ６の間のループの一部が関与していた。ＲＢＭドメインの遠位端のループを連結するシステインペアＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８も、界面の安定化に主要な役割を果たしている（図１Ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ構造内のＲＢＭドメインから、以下の配列を有する１１個の阻害配列が得られている。下記表２を参照。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ構造には、５本鎖の逆平行βシート（β１、β２、β３、β４、及びβ７）の短い連結ヘリックスとループを有するコアドメインが含まれていた。ＡＣＥ２受容体に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの接触残基の多くは、コアドメインのβ４鎖とβ７鎖の間に位置している（図１Ａ）。受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ドメインには、短いβ５及びβ６鎖、α４及びα５ヘリックス及びループが含まれる。主な接触には、α４とβ５の間のループ、β６とα５の間のループ、及びβ５とβ６の間のループの一部が関与していた。ＲＢＭドメインの遠位端のループを連結するシステインペアＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８も、界面の安定化に主要な役割を果たしている（図１Ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ構造内のＲＢＭドメインから、以下の配列を有する１１個の阻害配列が得られている。下記表２を参照。
【0331】
【表2】
【0332】
各ペプチド配列を、クリックケミストリーを使用して直鎖状または環状のいずれかとしてＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００ペプチドに連結した（Ｒａｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１９；２００１：１３３－１４５を参照）。場合によっては、ブロッキングペプチドのＣ末端にある１個または２個のアミノ酸をリシンに置き換えることでリシン側鎖による連結を介した環状ペプチドが得られる（Ａｌｓｉｎａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３５，Ｉｓｓｕｅ ５１，１９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４，Ｐａｇｅｓ ９６３３－９６３６を参照）。各配列は、ＡＤＧＮペプチドのＮ末端にアミノ結合により直接連結するか、またはリンカーモチーフを介して連結した。Ａｖａ（４ペンチン酸）、Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、ポリＧまたはＰＥＧ（ＰＥＧ－２）をリンカーとして使用した。表３を参照。
【0333】
【表3】
【0334】
Ｂ．ＡＣＥ２ドメイン由来の阻害剤の選択
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの拡張されたＲＢＭは、ＡＣＥ２の小葉部分の下面と接触し、ＲＢＭの凹状の外面がＡＣＥ２のＮ末端ヘリックスを収容する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤとＡＣＥ２受容体ドメインとの主要な接触には主としてα１ヘリックスが関与し、α２ヘリックス及びβ３鎖とβ４鎖との間のループもある程度関与している（図１Ｃ及び１Ｄ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの拡張されたＲＢＭは、ＡＣＥ２の小葉部分の下面と接触し、ＲＢＭの凹状の外面がＡＣＥ２のＮ末端ヘリックスを収容する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤとＡＣＥ２受容体ドメインとの主要な接触には主としてα１ヘリックスが関与し、α２ヘリックス及びβ３鎖とβ４鎖との間のループもある程度関与している（図１Ｃ及び１Ｄ）。
【0335】
以下の配列を有する、ＡＣＥ２構造に基づいた９個の阻害配列が選択されている。α１ヘリックスに由来するＬＮＣＯＶ－１９／３３／３４、α１ヘリックスとα２ヘリックスの両方に由来するＬＮＣＯＶ２０／２７、ならびにβ３鎖とβ４鎖の一部及びそれに続くαヘリックスを含むβ３鎖とβ４鎖の間のループに由来するＬＮＣＯＶ－３５／３６／３７。表４を参照。
【0336】
【表4】
【0337】
各ペプチド配列を、クリックケミストリーを使用して直鎖状としてＡＤＧＮペプチドに連結した。各配列は、ＡＤＧＮペプチドのＮ末端にアミノ結合で直接連結するか、またはリンカーモチーフを介して連結した。Ａｖａ（４ペンチン酸）、Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、ポリＧまたはＰＥＧ（ＰＥＧ－２）をリンカーとして使用した。表５を参照。
【0338】
【表5】
【0339】
実施例２．選択された阻害配列の構造解析
ＡＤＧＮペプチドに連結された、またはされていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来する阻害配列の二次構造を、分子モデリングｐｅｐｌｏｏｋ－Ｚｕｌｔｉｍ及びＰＥＰＦＯＬＤプログラムを使用して決定した（Ｔｈｏｍａｓ Ａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｅｕｒ Ｒ．，２００６，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ： ｈｏｗ ｆａｒ ａｒｅ ｗｅ？，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．６５，８８９－９７及びＬａｍｉａｂｌｅ Ａ，Ｔｈｅｖｅｎｅｔ Ｐ，Ｒｅｙ Ｊ，Ｖａｖｒｕｓａ Ｍ，Ｄｅｒｒｅｕｍａｕｘ Ｐ，Ｔｕｆｆｅｒｙ Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｌ ８；４４（Ｗ１）：Ｗ４４９－５４）。
ＡＤＧＮペプチドに連結された、またはされていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来する阻害配列の二次構造を、分子モデリングｐｅｐｌｏｏｋ－Ｚｕｌｔｉｍ及びＰＥＰＦＯＬＤプログラムを使用して決定した（Ｔｈｏｍａｓ Ａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｅｕｒ Ｒ．，２００６，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ： ｈｏｗ ｆａｒ ａｒｅ ｗｅ？，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．６５，８８９－９７及びＬａｍｉａｂｌｅ Ａ，Ｔｈｅｖｅｎｅｔ Ｐ，Ｒｅｙ Ｊ，Ｖａｖｒｕｓａ Ｍ，Ｄｅｒｒｅｕｍａｕｘ Ｐ，Ｔｕｆｆｅｒｙ Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｌ ８；４４（Ｗ１）：Ｗ４４９－５４）。
【0340】
以下の表６に示されているように、α１ヘリックス（配列２３～２６）及びα１及びα２ヘリックス（配列２７／２８）に由来するペプチドは、溶液中で二次ヘリックス構造をとる。
【表6】
【0341】
Ｐｅｐｌｏｏｋ－Ｚｕｌｔｉｍプログラムを使用して、各ヘリックス状ペプチドの構造の動的および安定性分析を決定した。各ペプチドのアミノ酸及びペプチド配列全体の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）、及びファンデルワールス力（ｖｄＷ）と静電エネルギーの両方の相互作用エネルギーを計算した。結果は、阻害ドメインのヘリックス構造は、ＡＤＧＮペプチドに連結されると、ＡＤＧＮペプチドの芳香族残基との直接的な相互作用によって、強力に安定化されることを示した。
【0342】
ＡＤＧＮを介した二次構造の安定化は、主に配列３２／３３／３４／３５及び配列４１で観察される。ＡＤＧＮ－１０６残基とＡＤＧＮ－１００残基は、阻害ドメインのヘリックス構造を安定化させた。ＡＤＧＮペプチドのアルギニン残基がペプチドの表面でアクセス可能な状態に保たれていることで、他のＡＤＧＮペプチドとのさらなる相互作用が可能となった。ＲＢＤドメインと接触するペプチドの残基は、ペプチドの表面でアクセス可能な状態に保たれている（図２Ａ～２Ｅ）。
【0343】
実施例３．ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用のペプチド阻害剤のスクリーニング
ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断する様々なペプチドの効力を、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビトロで評価した。スクリーニングは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用の阻害剤をスクリーニング及びプロファイリングするように設計した。評価は９６ウェルフォーマットで行った。ＡＣＥ２タンパク質をニッケル被覆９６ウェルプレートに付着させ、次いでゆっくりと振盪しながらペプチド阻害剤溶液と室温で３０分間、インキュベートした。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－Ｆｃを、ペプチド阻害剤溶液の存在下でプレート上のＡＣＥ２に加え、ゆっくりと振盪しながら室温で１時間、インキュベートした。各プレートを抗Ｆｃ－ＨＲＰで処理した後、ＨＲＰ基質を加えて化学発光を発生させ、化学発光リーダーを使用して分析した。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌにより記載されるＳＢＰ－１ ペプチド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するファースト・イン・クラスのペプチドバインダー、Ｇ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｐｏｍｐｌｕｎ，Ａ．Ｒ．Ｌｏｆｔｉｓ，Ａ．Ｌｏａｓ，Ｂ．Ｌ．Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０３．１９．９９９３１８；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０３．１９．９９９３１８ ２０２０）をポジティブコントロールとして使用した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図３Ａ～３Ｂ及び表７に示す。
ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断する様々なペプチドの効力を、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビトロで評価した。スクリーニングは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用の阻害剤をスクリーニング及びプロファイリングするように設計した。評価は９６ウェルフォーマットで行った。ＡＣＥ２タンパク質をニッケル被覆９６ウェルプレートに付着させ、次いでゆっくりと振盪しながらペプチド阻害剤溶液と室温で３０分間、インキュベートした。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－Ｆｃを、ペプチド阻害剤溶液の存在下でプレート上のＡＣＥ２に加え、ゆっくりと振盪しながら室温で１時間、インキュベートした。各プレートを抗Ｆｃ－ＨＲＰで処理した後、ＨＲＰ基質を加えて化学発光を発生させ、化学発光リーダーを使用して分析した。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌにより記載されるＳＢＰ－１ ペプチド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するファースト・イン・クラスのペプチドバインダー、Ｇ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｐｏｍｐｌｕｎ，Ａ．Ｒ．Ｌｏｆｔｉｓ，Ａ．Ｌｏａｓ，Ｂ．Ｌ．Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０３．１９．９９９３１８；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０３．１９．９９９３１８ ２０２０）をポジティブコントロールとして使用した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図３Ａ～３Ｂ及び表７に示す。
【0344】
ＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するＳＢＰ－１コントロール配列は、ＩＣ５０＝７８５±２５ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げる。ＳＢＰ－１をＡＤＧＮ－１０６（配列３２）と共有結合させた場合、ＩＣ５０＝３２５．２±１７ｎＭであり、効力は２．４倍増加し、ＡＤＧＮ－１０６の存在がＳＢＰ－１ドメインのヘリックス構造を安定化させたことが確認された。ＡＤＧＮ－１００（配列４１）と共有結合させた場合、ＩＣ５０＝４３２．５±２１ｎＭであり、ＳＢＰ－１の効力はやはり１．８倍増加した。
【0345】
Ａ．スパイクタンパク質由来のペプチド：
直鎖状配列（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。
直鎖状配列（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。
【0346】
これに対して、ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させた環状ペプチドに相当する配列１２／１７／１９／２０／２１のペプチドは、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断した。これらの結果は、ペプチド構造を安定化させるための環化の存在が、ＡＣＥ２タンパク質表面との相互作用に必要であることを示唆している。
【0347】
ＡＤＧＮ－１０６（配列１９）と共有結合させた場合、配列８のみがＩＣ５０＝９０．６±８ｎＭでＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を阻害することは、ＡＤＧＮペプチドとの共有結合が阻害ドメインの構造を安定化させることを裏付けるものである。
【0348】
システインペアＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８によって安定化されたループβ５－β６由来の配列１７のペプチドは、ＩＣ５０＝５７．５±１１ｎＭで相互作用を遮断し、これは遊離ＳＢＰ－１またはＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して１５倍及び６倍高い効力である。
【0349】
ＩＣ５０＝１７．２±５ｎＭ及び２２．６±７ｎＭの最も強い阻害がβ６－α５間のループに由来する配列２０及び配列２１のペプチドで得られ、これは遊離ＳＢＰ－１またはＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して４０倍及び１６倍高い効力である。
【0350】
Ｂ．ＡＣＥ２タンパク質由来のペプチド：
ＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチドである配列２３～２６は、ＩＣ５０＝７８５＜ｘ＜２μＭでＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断した。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３２～３５）、効果が３～６倍向上する。ＡＤＧＮ－１０６に連結された配列２４に相当する配列３３は、配列２４で得られたＩＣ５０＝１．３μＭと比較して、ＩＣＣ５０＝１７８±１４ｎＭを示している。これらの結果は、ＡＤＧＮ－１０６の存在が阻害ドメインのヘリックス構造を安定化させたことを裏付けるものである。
ＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチドである配列２３～２６は、ＩＣ５０＝７８５＜ｘ＜２μＭでＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断した。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３２～３５）、効果が３～６倍向上する。ＡＤＧＮ－１０６に連結された配列２４に相当する配列３３は、配列２４で得られたＩＣ５０＝１．３μＭと比較して、ＩＣＣ５０＝１７８±１４ｎＭを示している。これらの結果は、ＡＤＧＮ－１０６の存在が阻害ドメインのヘリックス構造を安定化させたことを裏付けるものである。
【0351】
最も強い阻害がＡＣＥ２のα１ヘリックス及びα２ヘリックスに由来するペプチドで得られた。すなわち、配列２７及び配列２８は、ＩＣ５０＝約５０ｎＭでＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断し、これは遊離ＳＢＰ－１またはＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して１５倍及び６倍高い効力である。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３９及び４０）、効果が１．４倍向上する。
【0352】
ＡＣＥ２タンパク質のβ３及びβ４ループに由来するペプチドである配列２９／３０／３１は、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３６～３８）、効果が１０～１００倍向上する。ＡＤＧＮ－１０６に連結された配列３１に相当する配列３８は、配列３１で得られたＩＣ５０＝２５μＭと比較して、ＩＣ５０＝２１４．２±２１ｎＭを示している。スパイク由来の阻害剤に関して、これらの結果は、ＡＤＧＮペプチドとの共有結合がこれらの阻害ペプチドの構造を安定化させるうえで不可欠であることを示した。
【0353】
結論として、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの相互作用を遮断する最良の候補は以下に相当する。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＳＰＩＫＥのβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＳＰＩＫＥのβ５－β６ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列１７）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列２７、２８、３９、４０）。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＳＰＩＫＥのβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＳＰＩＫＥのβ５－β６ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列１７）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列２７、２８、３９、４０）。
【0354】
実施例４ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用のペプチド阻害剤のスクリーニング
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断する異なるペプチドの効力を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビトロで評価した。スクリーニングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２の阻害剤をスクリーニング及びプロファイリングするように設計した。評価は９６ウェルフォーマットで行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をニッケル被覆９６ウェルプレートに付着させ、次いでゆっくりと振盪しながらペプチド阻害剤溶液と室温で３０分間、インキュベートする。最後に、ＡＣＥ２－Ｆｃを、ペプチド阻害剤溶液の存在下でプレート上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－Ｆｃに加え、ゆっくりと振盪しながら室温で１時間、インキュベートする。各プレートを抗Ｆｃ－ＨＲＰで処理した後、ＨＲＰ基質を加えて化学発光を発生させ、化学発光リーダーを使用して分析した。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．により記載されるＳＢＰ－１ペプチドをポジティブコントロールとして使用した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図４Ａ～４Ｂ及び表７に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断する異なるペプチドの効力を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビトロで評価した。スクリーニングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２の阻害剤をスクリーニング及びプロファイリングするように設計した。評価は９６ウェルフォーマットで行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をニッケル被覆９６ウェルプレートに付着させ、次いでゆっくりと振盪しながらペプチド阻害剤溶液と室温で３０分間、インキュベートする。最後に、ＡＣＥ２－Ｆｃを、ペプチド阻害剤溶液の存在下でプレート上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－Ｆｃに加え、ゆっくりと振盪しながら室温で１時間、インキュベートする。各プレートを抗Ｆｃ－ＨＲＰで処理した後、ＨＲＰ基質を加えて化学発光を発生させ、化学発光リーダーを使用して分析した。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．により記載されるＳＢＰ－１ペプチドをポジティブコントロールとして使用した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図４Ａ～４Ｂ及び表７に示す。
【0355】
ＳＢＰ－１コントロール配列は、ＩＣ５０＝２６７±１２ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げる。ＳＢＰ－１がＡＤＧＮ－１０６（配列３２）またはＡＤＧＮ－１００（配列４１）と共有結合された場合、ＩＣ５０＝１３４．２±１４ｎＭ及び２１９．７±９ｎＭであり、効力は２．０倍及び１．４倍増加する。
【0356】
Ａ．スパイクタンパク質由来のペプチド：
対応する直鎖状配列またはＡＤＧＮ－１０６と連結されない（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。ＡＤＧＮ－１０６と連結されたα４－β５間のループに相当するペプチド（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。
対応する直鎖状配列またはＡＤＧＮ－１０６と連結されない（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。ＡＤＧＮ－１０６と連結されたα４－β５間のループに相当するペプチド（配列１～１１）のいずれも、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。
【0357】
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させた環状ペプチドに相当する配列１７／１９／２０／２１／２２のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断し、このことは環化の存在及びＡＤＧＮペプチドとの共有結合の両方が、ＡＣＥ２タンパク質表面との相互作用の主要な要件として、阻害ドメインの構造を安定化させることを示唆した。
【0358】
ＩＣ５０＝４４．２±７ｎＭ及び３８．５±１１ｎＭの最良の阻害がβ６－α５間のループに由来する配列２０及び配列２１のペプチドで得られ、これは遊離ＳＢＰ－１またはＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して６．６倍及び３．３倍高い効力である。β６－α５間のループとα５ヘリックスに相当する配列２２は、配列２０／配列２１よりも３．６倍効力が低く、β６－α５間のループがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断するのに十分であることを示唆している。
【0359】
ループβ５－β６由来の配列１７のペプチドは、ＩＣ５０＝７８．２±９ｎＭで相互作用を遮断し、これは遊離ＳＢＰ－１またはＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して３．４倍及び１．７倍高い効力である。
【0360】
Ｂ．ＡＣＥ２タンパク質由来のペプチド：
ＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチドである配列２３～２６は、ＩＣ５０＝３００＜ｘ＜１μＭでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断した。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３２～３５）、効果が２～１０倍向上する。
ＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチドである配列２３～２６は、ＩＣ５０＝３００＜ｘ＜１μＭでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断した。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３２～３５）、効果が２～１０倍向上する。
【0361】
最良の阻害が、ＡＤＧＮ－１０６と連結されたＡＣＥ２のα１ヘリックスの一部に相当する配列３３で得られ、配列２４で得られたＩＣ５０＝５７０±３０ｎＭと比較して、ＩＣ５０＝１８．４±３ｎＭでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断した。これらの結果は、ＡＤＧＮ－１０６の存在が阻害ドメインのヘリックス構造を安定化したことを裏付けている。配列３３は、遊離ＳＢＰ－１及びＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して１４倍及び８倍高い効力である。
【0362】
ＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来するペプチドである配列２７及び配列２８は、ＩＣ５０＝３７．４ｎＭ±８ｎｍ及び３８．５ｎＭ±７ｎｍでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断し、これは遊離ＳＢＰ－１及びＡＤＧＮ－１０６と連結されたＳＢＰ－１と比較して７倍及び３．５倍高い効力である。
【0363】
ＡＣＥ２タンパク質のβ３及びβ４ループに由来するペプチドである配列２９／３０／３１は、１０μＭ未満の濃度では阻害を示さなかった。これらのペプチドをＡＤＧＮ－１０６と共有結合させると（配列３６～３８）、効果が１０～１００倍向上する。ＡＤＧＮ－１０６に連結された配列３１に相当する配列３８は、配列３１で得られたＩＣ５０＝２５μＭと比較して、ＩＣ５０＝１０２．８±１７ｎＭを示している。スパイク由来の阻害剤に関して、これらの結果は、ＡＤＧＮペプチドとの共有結合が阻害ペプチドの構造を安定化させるうえで不可欠であることを示した。
【0364】
結論として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２の相互作用を遮断する最良の候補は以下に相当する。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列３３）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１－α２ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列２７、２８、３９、４０）。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（例えば、配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列３３）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１－α２ヘリックスに由来するペプチド（例えば、配列２７、２８、３９、４０）。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【0365】
実施例５．阻害剤ペプチドを用いたＡＤＧＮペプチドベースのナノ粒子の形成
次に、異なるペプチドがＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００ペプチドの存在下でナノ粒子組織を形成する能力を試験した。１μＭ未満のＩＣ５０でＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を阻害するペプチドを、１／５のペプチド／ＡＤＧＮモル比でＡＤＧＮ－１０６ペプチドとの複合体としてさらに評価した。各ペプチドで、５または１０モル過剰のＡＤＧＮ－１０６と複合体を形成させた。ペプチド／ＡＤＧＮ－１０６複合体の平均サイズと多分散性を、測定ごとに２５℃で３分間測定し、ゼータ電位をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）を使用して測定した。３回の別々の実験の平均のデータを表８に示す。
次に、異なるペプチドがＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００ペプチドの存在下でナノ粒子組織を形成する能力を試験した。１μＭ未満のＩＣ５０でＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を阻害するペプチドを、１／５のペプチド／ＡＤＧＮモル比でＡＤＧＮ－１０６ペプチドとの複合体としてさらに評価した。各ペプチドで、５または１０モル過剰のＡＤＧＮ－１０６と複合体を形成させた。ペプチド／ＡＤＧＮ－１０６複合体の平均サイズと多分散性を、測定ごとに２５℃で３分間測定し、ゼータ電位をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）を使用して測定した。３回の別々の実験の平均のデータを表８に示す。
【表8】
【0366】
表８に示されるように、ＡＤＧＮ－１０６は、配列２３／配列３９／配列４０を除いて、約３５～５０ｎｍの平均直径及び０．２～０．２５の多分散指数（ＰＩ）を有する安定した複合体を異なるペプチドと形成する。これに対して、配列１～１１及び配列２４～２６に対応するペプチドでは、ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００の存在下で複合体は検出されず、阻害ペプチドの構造的編成及びサイズが複合体形成に重要であることを示唆した。
【0367】
実施例６．ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用のペプチドベースナノ粒子による阻害
ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断する異なるペプチド阻害剤／ＡＤＧＮ－１０６複合体の効力を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２及びＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＩｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の両方を使用してインビトロで評価した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図３Ｂ、図４Ｂ及び表７に示す。
ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用を遮断する異なるペプチド阻害剤／ＡＤＧＮ－１０６複合体の効力を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２及びＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＩｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の両方を使用してインビトロで評価した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図３Ｂ、図４Ｂ及び表７に示す。
【0368】
【0369】
Ａ．ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク相互作用
ＳＢＰ－１コントロール配列はＡＤＧＮ－１０６とナノ粒子の形で複合体を形成させた場合、ＩＣ５０＝１６３．４±２９ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げ、ＳＢＰ－１はＩＣ５０＝２４．５±２ｎＭでＡＤＧＮ－１０６に共有結合した（配列３２）。
ＳＢＰ－１コントロール配列はＡＤＧＮ－１０６とナノ粒子の形で複合体を形成させた場合、ＩＣ５０＝１６３．４±２９ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げ、ＳＢＰ－１はＩＣ５０＝２４．５±２ｎＭでＡＤＧＮ－１０６に共有結合した（配列３２）。
【0370】
ペプチド配列１７、１９、２０、２１、２７、２８、３９、４０は、ナノ粒子の形でＡＤＧＮ－１０６と複合体を形成させた場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用をＩＣ５０＜１０ｎＭで阻害した。最高の阻害は、ＩＣ５０値が３．４±０．２、３．７±０．５、５．２±０．４、１．８±０．８、及び２．７±０．７ｎＭである配列１７、２０、２７、２８で得られ、ＳＢＰ－１ペプチド／ＡＤＧＮ－１０６複合体及びＳＢＰ－１－ＡＤＧＮ－１０６／ＡＤＧＮ－１０６複合体よりも４０～６倍高い効力である。
【0371】
Ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用
ＳＢＰ－１コントロール配列はＡＤＧＮ－１０６とナノ粒子の形で複合体を形成させた場合、ＩＣ５０＝８７．５±１５ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げ、ＳＢＰ－１はＩＣ５０＝７．２±４ｎＭでＡＤＧＮ－１０６に共有結合した（配列３２）。
ＳＢＰ－１コントロール配列はＡＤＧＮ－１０６とナノ粒子の形で複合体を形成させた場合、ＩＣ５０＝８７．５±１５ｎＭでＡＣＥ２：スパイク阻害を妨げ、ＳＢＰ－１はＩＣ５０＝７．２±４ｎＭでＡＤＧＮ－１０６に共有結合した（配列３２）。
【0372】
ペプチド配列１７／２７／２８／３３／３９／４０は、ナノ粒子の形でＡＤＧＮ－１０６と複合体を形成させた場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用をＩＣ５０＜５ｎＭで阻害した。最高の阻害は、ＩＣ５０値が２．７±０．１、１．１±０．５、２．１±０．４、及び１．２±０．４ｎＭである配列１７／２７／２８／３３で得られ、ＳＢＰ－１ペプチド／ＡＤＧＮ－１０６複合体及びＳＢＰ－１－ＡＤＧＮ－１０６／ＡＤＧＮ－１０６複合体よりも３５～４倍高い効力である。
【表9】
【0373】
驚くべきことに、これらの結果はナノ粒子としての異なるペプチドのＡＤＧＮ－１０６との結合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク：ＡＣＥ２相互作用を遮断するそれらの効力を有意に向上させることを示唆している。表９を参照されたい。ＡＤＧＮ－１０６と異なるペプチドとの安定したナノ粒子の形成により、阻害ドメインの濃度が局所的に増加し、効果が高まるものと考えられる。
【0374】
結論として、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの相互作用を遮断する最良の候補は以下に相当する。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ５－β６ループに相当する環状ペプチド（配列１７）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来するペプチド（配列２７、２８、３９、４０）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチド（配列３３）。
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ６－α５ループに相当する環状ペプチド（配列２０及び配列２１）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたβ５－β６ループに相当する環状ペプチド（配列１７）、
ＡＤＧＮ－１０６と結合された、または結合されていないＡＣＥ２のα１及びα２ヘリックスに由来するペプチド（配列２７、２８、３９、４０）、
ＡＤＧＮ－１０６と共有結合させたＡＣＥ２のα１ヘリックスに由来するペプチド（配列３３）。
【0375】
実施例７．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染のペプチド阻害剤のスクリーニング
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する異なるペプチド（ナノ粒子形態ではない）の影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。０．５μＭの単一濃度のペプチドを使用してスクリーニングを行った。ペプチドをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ０．０１）と３０分間混合した後、単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた。感染から７２時間後、プレートを固定、染色し、分析した。これと並行して、非感染細胞を使用し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、異なるペプチドのみの細胞毒性をモニタリングした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する異なるペプチド（ナノ粒子形態ではない）の影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。０．５μＭの単一濃度のペプチドを使用してスクリーニングを行った。ペプチドをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ０．０１）と３０分間混合した後、単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた。感染から７２時間後、プレートを固定、染色し、分析した。これと並行して、非感染細胞を使用し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、異なるペプチドのみの細胞毒性をモニタリングした。
【0376】
結果を表１０に示す。
【表10】
【0377】
表１０に示されるように、０．５μＭの濃度でペプチド配列１７、２０、２２、２８、及び３３はウイルス感染の阻害を示す。配列１７、２８、及び３３はウイルス感染を８０％以上、配列２２は６０％減少させ、細胞毒性は極めて低い。そこで、感染の阻害に関する完全なＩＣ５０情報を得るためにペプチド配列１７、２２、２８、及び３３を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染力及び複製についてさらに評価した。
【0378】
感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。異なる希釈濃度を有するペプチドを、ウイルス感染の直前に単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えるか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３０分間混合してから単層Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞に加えた。ＡＤＧＮ－１０６、ヒドロキシクロロキン、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＶｅｒｏ－６、Ｈ１２９９及びＨＥＰＧ２細胞に対する異なるペプチドの細胞毒性を分析した。
【0379】
結果を表１１に示す。
【表11】
【0380】
図５Ａ、５Ｃ及び表１１に示されるように、４つのペプチドはいずれも、ナノモル範囲のＩＣ５０でＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染に対して強力な阻害活性を示した。配列１７及び配列２２は、それぞれ２１．５±１２ｎＭ及び１２４．５±１４ｎＭのＩＣ５０を示した。配列２８及び配列３３は、それぞれ３４．５±１１ｎＭ及び２１．７±８ｎＭのＩＣ５０を示した。感染前にＳＡＲＳ ＣｏＶ－２とプレインキュベートすることにより、配列２８及び配列３３の効力が２倍増加したが、このことは、これらのペプチドがスパイクタンパク質と相互作用し、したがってウイルスと直接相互作用するという事実と一致している。これに対して、プレインキュベーションは配列２２の効力には影響せず、配列１７の抗ウイルス活性を２倍減少させた。ＡＤＧＮ－１０６単独では、ＩＣ５０＝５．５～６．８μＭと弱い抗ウイルス活性を示した。
【0381】
すべてのペプチドが、非感染細胞に対して比較的低い細胞毒性を示し、３００～５００μＭの範囲のＴＤ５０値を示した。図５Ｂ及び５Ｄを参照されたい。
【0382】
配列１７／２８／３３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成し、硫酸ヒドロキシクロロキン（ＩＣ５０＝４．４±０．２１５μＭ）よりも２５０倍強い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を示している。
【0383】
実施例８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡの選択
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とする１０種類のｓｉＲＮＡを選択した（表１２）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とする１０種類のｓｉＲＮＡを選択した（表１２）。
【表12】
【0384】
これらのｓｉＲＮＡを、ｅＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを発現するＨ１２９９肺上皮細胞で評価した。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ヌクレオカプシドをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＮＰプラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ参照番号ＭＣ－０１０１１３７）をトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ヌクレオカプシド－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後にＥｌｉｓａ（Ａｂｃａｍ）により評価し、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した。結果を図６Ａ～６Ｂ、及び表１２に示す。
【0385】
図６Ａに示されるように、ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０＝４．５±２ｎＭでｅＧＦＰサイレンシングを誘導した。４つのｓｉＲＮＡ（ＤＩＶＣ－６／ＤＩＶＣ－３／ＤＩＶＣ－８／ＤＩＶＣ－１０）は、低ナノモル濃度でＮＣサイレンシングを誘導した。最良のサイレンシング応答は、ＤＩＶＣ－６及びＤＩＶＣ－３でそれぞれＩＣ５０＝８．７±２ｎＭ及び１１．４±５ｎＭで得られた。ｓｉＲＮＡに関連する顕著な毒性は観察されなかった。図６Ｂを参照されたい。
【0386】
実施例９．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの選択
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を標的とする５種類の異なるｓｉＲＮＡを選択した（表１３）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を標的とする５種類の異なるｓｉＲＮＡを選択した（表１３）。
【表13】
【0387】
これらのｓｉＲＮＡを、ｅＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３Ａ遺伝子を発現するＨ１２９９肺上皮細胞で評価した。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＯＲＦ３ＡをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＯＲＦ３ａプラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ参照番号ＭＣ－０１０１１３７）をトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ＯＲＦ３ａ－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後にＥｌｉｓａ（Ａｂｃａｍ）により評価し、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した。結果を図７Ａ及び７Ｂ、ならびに表１３に示す。
【0388】
図７Ａに示されるように、ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡは、４．５±２ｎＭのＩＣ５０でｅＧＦＰサイレンシングを誘導した。
【0389】
ＤＩＶＣ－３１及びＤＩＶＣ－３４ ｓｉＲＮＡは、それぞれＩＣ５０＝１８．４±２ｎＭ及び１２．３±１ｎＭの低ナノモル濃度でＯＲＦ３ａタンパク質のサイレンシングを誘導した。ｓｉＲＮＡに関連する顕著な毒性は観察されなかった。
【0390】
実施例１０．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの選択
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とする５種類のｓｉＲＮＡを選択した（表１４）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を標的とする５種類のｓｉＲＮＡを選択した（表１４）。
【表14】
【0391】
これらのｓｉＲＮＡを、ｅＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８遺伝子を発現するＨ１２９９肺上皮細胞で評価した。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＯＲＦ８をコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＯＲＦ８プラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ参照番号ＭＣ－０１０１１３７）をトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ及びｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ＯＲＦ８－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後にＥｌｉｓａ（Ａｂｃａｍ）により評価し、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した。結果を図８Ａ～８Ｂ、及び表１４に示す。
【0392】
図８Ａに示されるように、ＤＩＶＣ－８２、ＤＩＶＣ－８３及びＤＩＶＣ－８５ ｓｉＲＮＡは、それぞれＩＣ５０＝２１．７±７ｎＭ、１５．４±３ｎＭ、及び１０．８±２ｎＭでＯＲＦ８ａタンパク質のサイレンシングを誘導した。ｓｉＲＮＡに関連する顕著な毒性は観察されなかった。
【0393】
実施例１１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染のｓｉＲＮＡのスクリーニング
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡの影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ｓｉＲＮＡ（ＤＩＶＣ－３、ＤＩＶＣ－６、ＤＩＶＣ－８、ＤＩＶＣ－３４及び／またはＤＩＶＣ－８５）を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体を形成させた。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体を、ウイルス感染の直前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。ＡＤＧＮ－１００、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＶｅｒｏ－６細胞に対する異なるｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体の細胞毒性を分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡの影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ｓｉＲＮＡ（ＤＩＶＣ－３、ＤＩＶＣ－６、ＤＩＶＣ－８、ＤＩＶＣ－３４及び／またはＤＩＶＣ－８５）を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体を形成させた。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体を、ウイルス感染の直前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。ＡＤＧＮ－１００、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＶｅｒｏ－６細胞に対する異なるｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体の細胞毒性を分析した。
【0394】
結果を図９Ａ～９Ｂ、及び表１５に示す。
【0395】
【表15】
【0396】
図９及び表１５に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ＤＩＶＣ－３、ＤＩＶＣ－６及びＤＩＶＣ－８）は、ナノモル範囲のＩＣ５０でＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染に対して強力な阻害活性を示した。ＤＩＶＣ－３及びＤＩＶＣ－６は、それぞれＩＣ５０＝８４．±１４ｎＭ及び６８±１２ｎＭを示している。これに対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８（ＤＩＶＣ－８５）またはＯＲＦ３Ａ（ＤＩＶＣ－３４）を標的とするｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０＝約１μＭで中程度の抗ウイルス活性を示した。ＡＤＧＮ－１００単独では、ＩＣ５０＝７．５μＭと弱い抗ウイルス活性を示した。これらのデータは、ＯＲＦ３Ａ及びＯＲＦ８タンパク質とは対照的に、ヌクレオカプシドがウイルス産生に不可欠であることを示唆するものである。
【0397】
すべてのｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体が、非感染細胞に対して比較的低い細胞毒性を示し、３００～６００μＭの範囲のＴＤ５０値を示した。
【0398】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成し、硫酸ヒドロキシクロロキン（ＩＣ５０４．４±０．２１５μＭ）よりも６４倍強い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を示している。
【0399】
実施例１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡとペプチド阻害剤の組み合わせの影響
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）及び３３（ＬＮＣＯＶ－１８）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成することを実証した。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２：ＡＣＥ２受容体のペプチド阻害剤を組み合わせることによるウイルス複製への影響を評価した。
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）及び３３（ＬＮＣＯＶ－１８）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成することを実証した。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２：ＡＣＥ２受容体のペプチド阻害剤を組み合わせることによるウイルス複製への影響を評価した。
【0400】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡ／ペプチド阻害剤の組み合わせの影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡを、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００と複合体を形成させた。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００複合体及び配列１７または配列３３を、ウイルス感染の直前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。ＡＤＧＮ－１００、及びバッファーをコントロールとして使用し、すべての処理を３重に行った。
【0401】
結果を図１０及び表１６に示す。
【0402】
【表16】
【0403】
図１０及び表１６に示されるように、ＬＮＣＯＶ－１５またはＬＮＣＯＶ－１８ペプチドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－３ ｓｉＲＮＡと組み合わせることで、遊離ペプチドの効力が２～３倍、ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡペプチドの効力が６倍向上し、ＤＩＶＣ－６／ＬＮＣＯＶ－１５及びＤＩＶＣ－６／ＬＮＣＯＶ－１８の組み合わせで、それぞれＩＣ５０＝８．４±８ｎＭ及び１１．２±４ｎＭであった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡを阻害剤ペプチドと組み合わせることで、細胞への侵入と複製を含むウイルス複製における２つの異なる段階を標的化できることを実証するものである。
【0404】
実施例１３．ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８は、培養細胞におけるｓｉＲＮＡの送達を促進する。
ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８が培養細胞におけるｓｉＲＮＡ送達を促進する効力は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡを使用して評価されている。
ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８が培養細胞におけるｓｉＲＮＡ送達を促進する効力は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドを標的とするｓｉＲＮＡを使用して評価されている。
【0405】
ｓｉＲＮＡ ＤＩＶＣ－６を、ｅＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドを発現するＨ１２９９肺上皮細胞で評価した。Ｈ１２９９肺上皮細胞に、ｅＧＦＰでタグ付けされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ヌクレオカプシドをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｎ－ｅＧＦＰ－ＮＰプラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ参照番号ＭＣ－０１０１１３７）をトランスフェクトした。次いで、細胞を、モル比１／２０でＡＤＧＮ－１００、ＬＮＣＯＶ－１５、及びＬＮＣＯＶ－１８と複合体化したｓｉＲＮＡ（１ｎＭ～２００ｎＭ）で処理した。ｓｃｒ－ｓｉＲＮＡを、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。ヌクレオカプシド－ｅＧＦＰタンパク質のレベルをトランスフェクションから４８時間後にＥｌｉｓａ（Ａｂｃａｍ）により評価し、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して毒性を測定した。結果を表１１Ａに示す。
【0406】
図１１Ａに示されるように、ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８は、培養細胞におけるｓｉＲＮＡ送達を促進し、低ナノモル濃度でＮＣサイレンシングのサイレンシングをもたらしている。ＬＮＣＯＶ－１５及びＬＮＣＯＶ－１８と複合体を形成させた場合、それぞれＩＣ５０＝１１±４ｎＭ及び８．７±２ｎＭで、ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡに関連するサイレンシング応答が得られた。これらの結果はＡＤＧＮ－１００で得られたものと同様であり、ＬＮＣＯＶペプチドが強力なｓｉＲＮＡ送達ベクターであり、ｓｉＲＮＡの送達とウイルスの細胞への侵入の阻止の両方の目的で使用できることを示唆するものである。
【0407】
実施例１４：ペプチド阻害剤を使用したＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアント相互作用の阻害。
ここ数カ月で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのいくつかの新たな変異株が出現した。英国変異株Ｂ．１．１．７、ブラジル変異株Ｐ．１、南アフリカ変異株Ｂ．１．３５１、及び最新のインド変異株Ｂ．１．６１７は、感染率が高いため特に懸念されている。スパイクタンパク質のＲＢＤドメインで特定された変異のサブセットが複数の株で生じており、伝染性、感染力を高め、免疫回避能力を高める可能性があることが報告されている。
ここ数カ月で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのいくつかの新たな変異株が出現した。英国変異株Ｂ．１．１．７、ブラジル変異株Ｐ．１、南アフリカ変異株Ｂ．１．３５１、及び最新のインド変異株Ｂ．１．６１７は、感染率が高いため特に懸念されている。スパイクタンパク質のＲＢＤドメインで特定された変異のサブセットが複数の株で生じており、伝染性、感染力を高め、免疫回避能力を高める可能性があることが報告されている。
【0408】
ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントとの相互作用を遮断するリードペプチド配列１７（ＬＮ－ＣＯＶ－１５）、配列２８（ＬＮ－ＣＯＶ－２０）及び配列３３（ＬＮ－ＣＯＶ－１８）の効力を、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビトロで評価した。アルファ（Ｂ１．１．７／英国）、ベータ（Ｂ１．３５１／南アフリカ）、ガンマ（Ｐ１／ブラジル）、デルタ（Ｂ１６１７２／インド）及びイプシロン（Ｂ１４２９）変異株を含む、主要な変異を有する５つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントでペプチド阻害を評価した（表１７）。ＲＢＤ及びスパイクタンパク質バリアントは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（米国）より入手した。
【0409】
【表17】
【0410】
ペプチドの評価は９６ウェルフォーマットで行った。ＡＣＥ２タンパク質をニッケル被覆９６ウェルプレートに付着させ、次いでゆっくりと振盪しながらペプチド阻害剤溶液と室温で３０分間、インキュベートした。最後に、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－Ｆｃを、ペプチド阻害剤溶液の存在下でプレート上のＡＣＥ２に加え、ゆっくりと振盪しながら室温で１時間、インキュベートした。各プレートを抗Ｆｃ－ＨＲＰで処理した後、ＨＲＰ基質を加えて化学発光を発生させ、化学発光リーダーを使用して分析した。結果は、３回の別々の実験の平均に相当し、図１２Ａ～１２Ｅ及び表１８に示す。
【0411】
【表18】
【0412】
図１２Ａ～１２Ｅに示されるように、各リードペプチドは、ＡＣＥ２と異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントとの相互作用を遮断している。いずれの場合も、ＩＣ５０値は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２の原株で得られたものと同様である。
【0413】
配列２８及び配列３３ペプチドは、使用したスパイクバリアントに関係なくＩＣ５０＝５０ｎＭ未満であり、最も効率的である。配列２８及び配列３３ペプチドはスパイクタンパク質を直接標的とし、ＡＣＥ２との界面について競合した。このＡＣＥ２／スパイク界面には、残基Ｎ５０１、Ｅ４８４、Ｌ４５２、及びＫ４１７が含まれており、ＡＣＥ２に対する親和性が高い異なるバリアントで変異している。
【0414】
変異Ｌ４５２Ｒ（デルタ及びイプシロン変異株）は、免疫回避及び高い伝染性との関連が示されている。この変異は、配列２８及び配列３３の直接の標的となる。
【0415】
Ｅ４８４残基の変異は、ウイルスの感染力を高め、ＡＣＥ２との相互作用を強化することが報告されている。このＥ４８４Ｋ（Ｐガンマ及びベータ変異株）及びＥ４８４Ｑ（デルタ変異株）変異は、同じスパイク／ＡＣＥ２界面について競合する配列１７の直接の標的となる。
【0416】
実施例１５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株ウイルス感染に対するペプチド阻害剤の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株ウイルスの感染力及び複製を遮断するリードペプチド配列１７（ＬＮ－ＣＯＶ－１５）、配列２８（ＬＮ－ＣＯＶ－２０）、及び配列３３（ＬＮ－ＣＯＶ－１８）の効力をさらに評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株ウイルスの感染力及び複製を遮断するリードペプチド配列１７（ＬＮ－ＣＯＶ－１５）、配列２８（ＬＮ－ＣＯＶ－２０）、及び配列３３（ＬＮ－ＣＯＶ－１８）の効力をさらに評価した。
【0417】
抗ウイルスアッセイを、２％ＦＢＳ（Ｅｕｒｏｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｐ０７８１；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｄ６４２９；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中のＶｅｒｏＥ６細胞で行った。配列１７、配列２８、または配列３３のペプチド（１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度）または６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）を含む培地、または抗ウイルス分子を含まない培地（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）中で１時間インキュベートすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株（アルファ／ベータ／デルタ）にＭＯＩ０．００１で３重に感染させた。ペプチド溶液をＤＭＳＯ／水（２％）中で調製し、５ｍＭのストック液から希釈した。感染の１時間後に接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、前に示した濃度の新しい培地を加えた。上清を感染の２４時間後に回収し、ＶｅｒｏＥ６細胞でＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定し、Ｓｐｅａｒｍａｎ ＆ Ｋａｅｒｂｅｒアルゴリズムによって計算した。結果を図１３Ａ～１３Ｃ、及び表１９に示す。
【0418】
【表19】
【0419】
図１３Ａ～１３Ｃ及び表１９に示されるように、３つのペプチドはいずれも、すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異株ウイルスに対して強力な阻害活性を示し、試験した最大濃度（５００ｎＭ）で９９．９９％を上回るウイルス阻害率を実現した。アルファ／ベータ及びデルタ変異株では、配列２８及び配列３３で得られたＩＣ５０値は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２の原株で得られた値と同様である。配列１７は、アルファ及びベータ変異株に対する効果がそれぞれ３～４倍低くなっている。
【0420】
配列２８及び配列３３は、すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株感染の極めて強力な阻害剤を構成し、レムデシビルよりも２００倍強い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を示している。
【0421】
実施例１６．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス変異株の感染に対するｓｉＲＮＡとペプチド阻害剤の組み合わせの影響
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）、配列２８（ＬＮＣＯＶ－２０）及び３３（ＬＮＣＯＶ－１８）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成することを実証した。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２：ＡＣＥ２受容体のペプチド阻害剤を組み合わせることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、及びデルタ変異株の複製への影響を評価した。
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）、配列２８（ＬＮＣＯＶ－２０）及び３３（ＬＮＣＯＶ－１８）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成することを実証した。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２：ＡＣＥ２受容体のペプチド阻害剤を組み合わせることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、及びデルタ変異株の複製への影響を評価した。
【0422】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対するｓｉＲＮＡ／ペプチド阻害剤の組み合わせの影響をＶｅｒｏ Ｅ６細胞で評価した。感染の１日前に細胞を９６ウェルに播種した。ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡを、ＡＤＧＮ－１００、配列１７、配列２８、または配列３３とモル比１／２０で複合体化した。異なる希釈濃度のｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体及び配列１７、配列２８、及び配列３３を、ウイルス感染の直前に単層のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に直接加えた。６μＭのレムデシビル（ポジティブコントロール、ＲＭＤ）、または抗ウイルス分子なし（ネガティブコントロール、「Ｔ－」）をコントロールとして使用し、すべての処置を３重で行った。
【0423】
結果を図１４Ａ～１４Ｃ、及び表１９に示す。
【0424】
【表20】
【0425】
図１４Ａ～１４Ｃに示されるように、ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡは、すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異株ウイルスに対して強力な阻害活性を示した。ＤＩＶＣ－６が標的とする配列は、変異率が低く、試験した異なる変異株では影響を受けていないヌクレオカプシドのＣＴＤドメインのＮ末端部分に位置していることから、このことは驚くには値しない。
【0426】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の原株について報告されているように、配列１７、配列２８、及び配列３３のペプチドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡと組み合わせることで、遊離ペプチドの効力が２～３倍、ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡの効力が６～１０倍向上した。
【0427】
これらの結果は、ｓｉＲＮＡを阻害剤ペプチドと組み合わせることで、細胞への侵入と複製を含むウイルス複製における２つの異なる段階を標的化できることを実証するものである。
【0428】
実施例１７．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体阻害剤の肺投与。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）及び配列３３（ＬＮＣＯＶ－１８）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は呼吸を介して肺組織に感染するため、本発明者らは、同じ経路を用いてペプチド阻害剤とペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を送達することを試みた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子を標的とするＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡである配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）及び配列３３（ＬＮＣＯＶ－１８）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の極めて強力な阻害剤を構成する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は呼吸を介して肺組織に感染するため、本発明者らは、同じ経路を用いてペプチド阻害剤とペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を送達することを試みた。
【0429】
肺の治療では、高い組織浸透性を得ることと、肺の深部に到達させることが重要である点を考慮して、本発明者らは、配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）、配列３３（ＬＮＣＯＶ－１８）、配列１７／ＤＩＶＣ－６及び配列３３／ＤＩＶＣ－６複合体の気管内注入を用いて肺への送達と分布を評価した。配列３３及び配列１７の体内分布をモニターするために、ペプチドのＮ末端をＣｙ５．５色素で標識した。ＤＩＶＣ－６ ｓｉＲＮＡの体内分布をモニターするために、ｓｉＲＮＡをＣｙ－５．５で標識した。
【0430】
インビボでの肺の体内分布試験を、健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した（表２０）。非侵襲的なインビボ全身蛍光画像法により、蛍光を、Ｔ０、注入の１時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した。ＩＶＩＳキネティックシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光画像を取得し（ｅｘ：６４０±１７ｎｍ、ｅｍ：６８０±１０ｎｍ）、Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ ２Ｄ）を使用して蛍光画像から半定量的データを取得した。
【0431】
【表21】
【0432】
図１５Ａ～１５Ｅに示されるように、マウスの気管内注入後、すべての化合物が肺で非常に強いシグナルを示し、投与後７２時間まで高く維持されている。これに対して、遊離Ｃｙ５．５色素では、シグナルは４時間後に検出されなかった。すべての化合物は、注射後２４時間及び４８時間で膀胱及び肝臓から速やかに排出されている。７２時間後、肺のみがインビボで検出可能なシグナルを示している。
【0433】
共焦点顕微鏡により、異なる化合物の肺分布のさらなる分析を行った。投与４時間、２４時間および７２時間後に肺を採取し、５％グルコース中の４％ホルムアルデヒドで固定した。組織をＭｉｔｏ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄで染色し、核はＨｏｅｓｃｈで染色した。共焦点顕微鏡分析を図１６Ａ～１６Ｂに示す。
【0434】
４時間後、ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体のいずれもが主に細胞表面に蓄積した。蛍光シグナルがマクロファージ及び実質でもみられるが、いずれの化合物も核では検出されなかった。
【0435】
２４時間後、ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体は同様の明るいシグナルを発し、マクロファージ及び細胞型１及び２に蓄積がみられた。これに対して、遊離Ｃｙ５．５色素ではシグナルは検出されず、異なる化合物の肺送達の特異性が確認された。
【0436】
７２時間後、ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体はいずれも、主に１／２型上皮細胞及びマクロファージの細胞質に位置している。
【0437】
これらの結果は、配列１７及び配列３３ペプチドが気管内投与された場合、１型及び２型肺上皮細胞を標的として肺組織に顕著に浸透できることを示唆している。図１７に示されるように、すべての化合物が肺で７２時間検出可能であるのに対して、遊離色素は２４時間後にはほとんど検出されない。
【0438】
ペプチド及びペプチド／ｓｉＲＮＡの両方が気管内注入後に細胞表面に蓄積したことは、これらがＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の初期感染を防ぐための優れた候補となることを実証するものである。
【0439】
実施例１８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のペプチド阻害剤及びペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体阻害剤の肺及び肝臓毒性試験
配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）、配列３３（ＬＮＣＯＶ－１８）、配列１７／ＤＩＶＣ－６及び配列３３／ＤＩＶＣ－６複合体の肺及び肝臓毒性試験を、健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した（表２０）。生理食塩水をネガティブコントロールとして用いた。投与１２、２４、４８及び７２時間後に試料を採取した。
配列１７（ＬＮＣＯＶ－１５）、配列３３（ＬＮＣＯＶ－１８）、配列１７／ＤＩＶＣ－６及び配列３３／ＤＩＶＣ－６複合体の肺及び肝臓毒性試験を、健康な４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実施した。各ペプチドまたは各ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の単回用量を気管内注入（２００μｇ）により投与した（表２０）。生理食塩水をネガティブコントロールとして用いた。投与１２、２４、４８及び７２時間後に試料を採取した。
【0440】
気管内注入（０日目）の前、１日目、２日目、及び屠殺前（３日目）にマウスの体重を記録した。肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脳を３日目に採取し、臓器指数を測定した。図１８Ａ～１８Ｇに示されるように、統計的データ分析によって、異なる群間で有意な体重変化及び臓器指数の変化がないことが示された。
【0441】
注入から２日後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬ中の細胞の割合、総タンパク質、及びＬＤＨのレベルを分析した。結果を、ネガティブコントロールとして使用した生理食塩水緩衝液と比較した。図１９Ａに示されるように、候補化合物とネガティブコントロールとの間に明らかな差は認められなかった。配列１７及び配列３３／ＤＩＶＣ６で処置したマウスでは、マクロファージのわずかな増加のみが検出された。統計的データ分析に基づくと、５つの群間でＬＤＨ及び総タンパク質アッセイに有意差は認められない（図１９Ｂ～１９Ｃ）。
【0442】
これらのデータは、ペプチド阻害剤による処置もペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体による処置も肺炎症を誘発せず、どちらの処置も十分に忍容されることを示すものである。
【0443】
血漿中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルを注入の２日後にアッセイした。統計的データ分析に基づくと、５つの群間でＡＬＴまたはＡＳＴアッセイに有意差は認められない（図２０Ａ～２０Ｂ）。これらのデータは、ペプチド阻害剤もペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体も、肺への注入時に肝臓毒性を誘発しなかったことを示すものである。
【0444】
リードＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２阻害剤である配列１７、配列３３、配列１７／ＤＩＶＣ－６、及び配列３３／ＤＩＶＣ６は、気管内投与時に忍容性が高く、処置に伴う肺及び肝臓への毒性はみられなかった。
【表22-1】
【表22-2】
【表22-3】
【表22-4】
【表22-5】
【表22-6】
【表22-7】
【表22-8】
【表22-9】
【表22-10】
【表22-11】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図18G】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
【請求項2】
前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項3】
前記ループ配列が、アミノ酸約２０個以下の長さを有する、請求項２に記載のキメラペプチド。
【請求項4】
前記ループ配列が、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する、請求項３に記載のキメラペプチド。
【請求項5】
前記ブロッキングペプチドが、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項6】
前記ループ配列が、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項7】
前記ループ配列が、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される、請求項６に記載のキメラペプチド。
【請求項8】
前記ブロッキングペプチドが、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項9】
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項10】
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項11】
前記ループ配列が環状である、請求項２～１０に記載のキメラペプチド。
【請求項12】
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項13】
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項14】
前記安定化ペプチドが、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する、請求項１２または請求項１３に記載のキメラペプチド。
【請求項15】
前記ブロッキングペプチド及び前記安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項16】
前記安定化ペプチドが、配列番号４９または５０に示される配列を含む、請求項１５に記載のキメラペプチド。
【請求項17】
前記安定化ペプチドが、両親媒性ヘリックス構造を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項18】
前記安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、請求項１７に記載のキメラペプチド。
【請求項19】
前記安定化ペプチドが、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１８に記載のキメラペプチド。
【請求項20】
前記安定化ペプチドが、配列番号５５または９７に示される配列を含む、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【請求項21】
前記ブロッキングペプチドと前記安定化ペプチドとがリンカーによって連結されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項22】
前記リンカーが、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される、請求項２１に記載のキメラペプチド。
【請求項23】
前記ＰＥＧ部分が、約２～約７個のエチレングリコール単位からなる、請求項１９に記載のキメラペプチド。
【請求項24】
配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
【請求項25】
配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項26】
配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチド。
【請求項27】
前記ペプチドが、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の非天然ペプチド。
【請求項28】
前記ペプチドが、アミノ酸約１００個以下の長さを有する、請求項２６または２７に記載の非天然ペプチド。
【請求項29】
配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
【請求項30】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６３、１７０、１６６、または１６８に示される核酸配列を含む、請求項２９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項31】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、請求項２６もしくは２７に記載のペプチド、または請求項２８もしくは請求項２９に記載のｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡが前記第２のペプチドと複合体を形成している、前記複合体。
【請求項32】
前記第２のペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである、請求項３１に記載の複合体。
【請求項33】
前記第２のペプチドと前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約１：１～約８０：１である、請求項３１または請求項３２に記載の複合体。
【請求項34】
前記第２のペプチドと前記ペプチドとのモル比が、約２：１～約１０：１である、請求項３３に記載の複合体。
【請求項35】
前記第２のペプチドと前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約５：１～約５０：１である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項36】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、もしくは請求項２６～２８のいずれかに記載のペプチド、及び／またはｂ）請求項２９もしくは請求項３０に記載のｓｉＲＮＡを含む、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項37】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６６に示される核酸配列を含む、請求項３６に記載の複合体。
【請求項38】
配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む、請求項３７に記載の複合体。
【請求項39】
請求項３０～３８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ナノ粒子。
【請求項40】
前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ以下の直径を有する、請求項３９に記載のナノ粒子。
【請求項41】
前記ナノ粒子が、約４０～約６０ｎｍの直径を有する、請求項４０に記載のナノ粒子。
【請求項42】
ａ）請求項１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、請求項２６～２８のいずれかに記載のペプチド、請求項２９または請求項３０に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３１～４１のいずれかに記載の複合体またはナノ粒子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項43】
前記組成物が、２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、前記２つ以上の複合体またはナノ粒子が異なるカーゴを含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
前記カーゴを前記第２のペプチドと組み合わせることを含む、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法。
【請求項45】
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するための、請求項４２または請求項４３の医薬組成物。
【請求項46】
前記医薬組成物が、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与されるものである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項47】
前記個体が、ヒトである、請求項４５または請求項４６に記載の医薬組成物。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
本出願は別の態様において、有効量の上記に述べた医薬組成物のいずれかの個体に投与することを含む、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
（項目２）
前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む、項目１に記載のキメラペプチド。
（項目３）
前記ループ配列が、アミノ酸約２０個以下の長さを有する、項目２に記載のキメラペプチド。
（項目４）
前記ループ配列が、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する、項目３に記載のキメラペプチド。
（項目５）
前記ブロッキングペプチドが、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む、項目１～４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目６）
前記ループ配列が、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される、項目１～５のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目７）
前記ループ配列が、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される、項目６に記載のキメラペプチド。
（項目８）
前記ブロッキングペプチドが、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む、項目１に記載のキメラペプチド。
（項目９）
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、項目８に記載のキメラペプチド。
（項目１０）
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、項目９に記載のキメラペプチド。
（項目１１）
前記ループ配列が環状である、項目２～１０に記載のキメラペプチド。
（項目１２）
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている、項目１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１３）
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている、項目１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１４）
前記安定化ペプチドが、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する、項目１２または項目１３に記載のキメラペプチド。
（項目１５）
前記ブロッキングペプチド及び前記安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む、項目８～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１６）
前記安定化ペプチドが、配列番号４９または５０に示される配列を含む、項目１５に記載のキメラペプチド。
（項目１７）
前記安定化ペプチドが、両親媒性ヘリックス構造を含む、項目１～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１８）
前記安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、項目１７に記載のキメラペプチド。
（項目１９）
前記安定化ペプチドが、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む、項目１８に記載のキメラペプチド。
（項目２０）
前記安定化ペプチドが、配列番号５５または９７に示される配列を含む、項目１９に記載のキメラペプチド。
（項目２１）
前記ブロッキングペプチドと前記安定化ペプチドとがリンカーによって連結されている、項目１～２０のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目２２）
前記リンカーが、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される、項目２１に記載のキメラペプチド。
（項目２３）
前記ＰＥＧ部分が、約２～約７個のエチレングリコール単位からなる、項目１９に記載のキメラペプチド。
（項目２４）
配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目２５）
配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載のキメラペプチド。
（項目２６）
配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチド。
（項目２７）
前記ペプチドが、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の非天然ペプチド。
（項目２８）
前記ペプチドが、アミノ酸約１００個以下の長さを有する、項目２６または２７に記載の非天然ペプチド。
（項目２９）
配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
（項目３０）
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６３、１７０、１６６、または１６８に示される核酸配列を含む、項目２９に記載のｓｉＲＮＡ。
（項目３１）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、項目２６もしくは２７に記載のペプチド、または項目２８もしくは項目２９に記載のｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡが前記第２のペプチドと複合体を形成している、前記複合体。
（項目３２）
前記第２のペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである、項目３１に記載の複合体。
（項目３３）
前記第２のペプチドと前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約１：１～約８０：１である、項目３１または項目３２に記載の複合体。
（項目３４）
前記第２のペプチドと前記ペプチドとのモル比が、約２：１～約１０：１である、項目３３に記載の複合体。
（項目３５）
前記第２のペプチドと前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約５：１～約５０：１である、項目３４に記載の複合体。
（項目３６）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、もしくは項目２６～２８のいずれかに記載のペプチド、及び／またはｂ）項目２９もしくは項目３０に記載のｓｉＲＮＡを含む、項目３１～３５のいずれか１項に記載の複合体。
（項目３７）
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６６に示される核酸配列を含む、項目３６に記載の複合体。
（項目３８）
配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む、項目３７に記載の複合体。
（項目３９）
項目３０～３８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ナノ粒子。
（項目４０）
前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ以下の直径を有する、項目３９に記載のナノ粒子。
（項目４１）
前記ナノ粒子が、約４０～約６０ｎｍの直径を有する、項目４０に記載のナノ粒子。
（項目４２）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、項目２６～２８のいずれかに記載のペプチド、項目２９または項目３０に記載のｓｉＲＮＡ、項目３１～４１のいずれかに記載の複合体またはナノ粒子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（項目４３）
前記組成物が、２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、前記２つ以上の複合体またはナノ粒子が異なるカーゴを含む、項目４２に記載の医薬組成物。
（項目４４）
前記カーゴを前記第２のペプチドと組み合わせることを含む、項目３１～４１のいずれか１項に記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法。
（項目４５）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法であって、前記個体に有効量の項目４２または項目４３の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目４６）
前記医薬組成物が、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記個体が、ヒトである、項目４５または項目４６に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
安定化ペプチドに連結されたブロッキングペプチドを含むキメラペプチドであって、前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥとＡＣＥ２との相互作用を特異的に遮断し、前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドの二次構造または三次構造を安定化する、前記キメラペプチド。
（項目２）
前記ブロッキングペプチドが、ＳＰＩＫＥの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のループ配列を含む、項目１に記載のキメラペプチド。
（項目３）
前記ループ配列が、アミノ酸約２０個以下の長さを有する、項目２に記載のキメラペプチド。
（項目４）
前記ループ配列が、アミノ酸約７個～アミノ酸約１８個の長さを有する、項目３に記載のキメラペプチド。
（項目５）
前記ブロッキングペプチドが、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を含む、項目１～４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目６）
前記ループ配列が、配列番号１～１１及び４２～４６からなる群から選択される、項目１～５のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目７）
前記ループ配列が、配列番号１、６、８～１１、４２及び４５からなる群から選択される、項目６に記載のキメラペプチド。
（項目８）
前記ブロッキングペプチドが、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン内の配列に由来する配列を含む、項目１に記載のキメラペプチド。
（項目９）
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３～３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、項目８に記載のキメラペプチド。
（項目１０）
前記ブロッキングペプチドが、配列番号２３、２４、２６～２８、３１及び４７～５２からなる群から選択される配列を含む、項目９に記載のキメラペプチド。
（項目１１）
前記ループ配列が環状である、項目２～１０に記載のキメラペプチド。
（項目１２）
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＣ末端に連結されている、項目１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１３）
前記安定化ペプチドが、前記ブロッキングペプチドのＮ末端に連結されている、項目１～１１のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１４）
前記安定化ペプチドが、アミノ酸約１２個～アミノ酸約３０個の長さを有する、項目１２または項目１３に記載のキメラペプチド。
（項目１５）
前記ブロッキングペプチド及び前記安定化ペプチドがそれぞれ、ＡＣＥ２に由来する配列を含む、項目８～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１６）
前記安定化ペプチドが、配列番号４９または５０に示される配列を含む、項目１５に記載のキメラペプチド。
（項目１７）
前記安定化ペプチドが、両親媒性ヘリックス構造を含む、項目１～１４のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目１８）
前記安定化ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む、項目１７に記載のキメラペプチド。
（項目１９）
前記安定化ペプチドが、配列番号５３～１０７のいずれか１つに示される配列を含む、項目１８に記載のキメラペプチド。
（項目２０）
前記安定化ペプチドが、配列番号５５または９７に示される配列を含む、項目１９に記載のキメラペプチド。
（項目２１）
前記ブロッキングペプチドと前記安定化ペプチドとがリンカーによって連結されている、項目１～２０のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目２２）
前記リンカーが、プロリン、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、及びＡｈｘからなる群から選択される、項目２１に記載のキメラペプチド。
（項目２３）
前記ＰＥＧ部分が、約２～約７個のエチレングリコール単位からなる、項目１９に記載のキメラペプチド。
（項目２４）
配列番号１２～２２、２７、２８、及び３１～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のキメラペプチド。
（項目２５）
配列番号１２、１７、１９～２２、２７、２８、３１～３３、３５、及び３８～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載のキメラペプチド。
（項目２６）
配列番号１２～２２、２４～４１、及び１５１～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む非天然ペプチド。
（項目２７）
前記ペプチドが、配列番号１２、１７、１９～２２、２４、２６～２８、３１～３３、３５、３８～４０、１５１、１５６、及び１５８～１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の非天然ペプチド。
（項目２８）
前記ペプチドが、アミノ酸約１００個以下の長さを有する、項目２６または２７に記載の非天然ペプチド。
（項目２９）
配列番号１６１～１８０からなる群から選択される核酸配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
（項目３０）
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６３、１７０、１６６、または１６８に示される核酸配列を含む、項目２９に記載のｓｉＲＮＡ。
（項目３１）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、項目２６もしくは２７に記載のペプチド、または項目２８もしくは項目２９に記載のｓｉＲＮＡを含むカーゴと、ｂ）第２のペプチドと、を含む複合体であって、前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡが前記第２のペプチドと複合体を形成している、前記複合体。
（項目３２）
前記第２のペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＬＮＣＯＶペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、及びＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである、項目３１に記載の複合体。
（項目３３）
前記第２のペプチドと前記ペプチドまたは前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約１：１～約８０：１である、項目３１または項目３２に記載の複合体。
（項目３４）
前記第２のペプチドと前記ペプチドとのモル比が、約２：１～約１０：１である、項目３３に記載の複合体。
（項目３５）
前記第２のペプチドと前記ｓｉＲＮＡとのモル比が、約５：１～約５０：１である、項目３４に記載の複合体。
（項目３６）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、もしくは項目２６～２８のいずれかに記載のペプチド、及び／またはｂ）項目２９もしくは項目３０に記載のｓｉＲＮＡを含む、項目３１～３５のいずれか１項に記載の複合体。
（項目３７）
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１６６に示される核酸配列を含む、項目３６に記載の複合体。
（項目３８）
配列番号１７または３３に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含む、項目３７に記載の複合体。
（項目３９）
項目３０～３８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ナノ粒子。
（項目４０）
前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ以下の直径を有する、項目３９に記載のナノ粒子。
（項目４１）
前記ナノ粒子が、約４０～約６０ｎｍの直径を有する、項目４０に記載のナノ粒子。
（項目４２）
ａ）項目１～２５のいずれかに記載のキメラペプチド、項目２６～２８のいずれかに記載のペプチド、項目２９または項目３０に記載のｓｉＲＮＡ、項目３１～４１のいずれかに記載の複合体またはナノ粒子と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（項目４３）
前記組成物が、２つ以上の複合体またはナノ粒子を含み、前記２つ以上の複合体またはナノ粒子が異なるカーゴを含む、項目４２に記載の医薬組成物。
（項目４４）
前記カーゴを前記第２のペプチドと組み合わせることを含む、項目３１～４１のいずれか１項に記載の複合体またはナノ粒子を調製する方法。
（項目４５）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療する方法であって、前記個体に有効量の項目４２または項目４３の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目４６）
前記医薬組成物が、噴霧または局所肺または経鼻送達により投与される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記個体が、ヒトである、項目４５または項目４６に記載の方法。
【国際調査報告】