知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ユニヴァーシティ オブ ワシントン センター フォー コマーシャライゼーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-25
(54)【発明の名称】トランスフェリン受容体結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20230818BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230818BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230818BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230818BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230818BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230818BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230818BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230818BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230818BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230818BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230818BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20230818BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230818BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230818BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20230818BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230818BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230818BHJP
A61K 39/44 20060101ALI20230818BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20230818BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20230818BHJP
A61K 38/40 20060101ALN20230818BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61P31/14
A61P35/00
A61K45/00
A61K38/16
A61K47/62
A61K47/65
A61K48/00
A61K47/42
A61K47/46
A61K38/02
A61K39/395 M
A61K39/395 A
A61K39/44
C12N1/15 ZNA
C07K14/79
A61K38/40
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023505951
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(85)【翻訳文提出日】2023-03-23
(86)【国際出願番号】 US2021043469
(87)【国際公開番号】W WO2022026555
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】63/058,908
(32)【優先日】2020-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514104933
【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】サートエ，ダニー
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，ローレン
(72)【発明者】
【氏名】スチュアート，ランス，ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ベイカー，デイビッド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA94
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE57
4C076EE59
4C076EE59M
4C076EE59Q
4C076FF31
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA02
4C084BA03
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA41
4C084BA42
4C084BA44
4C084CA53
4C084DC50
4C084NA03
4C084NA12
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB331
4C085AA13
4C085AA14
4C085BA01
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045BA19
4H045BA20
4H045BA21
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、一般式Ｈ１－Ｈ２－Ｅ１－Ｈ３－Ｅ２－Ｅ３－Ｈ４；およびドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカーのトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを提供し、ここでＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４は、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式Ｈ１－Ｈ２－Ｅ１－Ｈ３－Ｅ２－Ｅ３－Ｈ４；および
１つまたは複数のドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカー
を含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドであって、ここで
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４が、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３が、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含み；
ここで前記ポリペプチドが、前記トランスフェリン受容体に結合する
トランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項2】
Ｈ１が１５から２０アミノ酸長である、請求項１のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項3】
Ｈ１が、配列番号１～８および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ１が、配列番号１～８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項4】
Ｈ２における残基の少なくとも４０％、５０％、または６０％が疎水性である、請求項１～３のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項5】
Ｈ２が１１～１３アミノ酸長である、請求項１～４のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項6】
Ｈ２が、配列番号９～１８および８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｈ２が、配列番号９～１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項7】
太字のＨ２残基が、参照アミノ酸配列に対して保存される、請求項６に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項8】
Ｈ３が１３～１４アミノ酸長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項9】
Ｈ３が、配列番号１９～２７および８８～９２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ３が、配列番号１９～２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項10】
Ｈ４が１４～１５アミノ酸長である、請求項１～９のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項11】
Ｈ４が、配列番号２８～３９および９３～９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ４が、配列番号２８～３９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項12】
太字の残基が、参照ポリペプチドに対して保存される、請求項１１に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項13】
表１の列（ａ）～（ｔ）から選択される単列からのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインの前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項14】
表１の列（ａ）～（ｎ）から選択される単列からのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインの前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項15】
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３のそれぞれにおける前記アミノ酸の少なくとも３個、４個、または５個すべてが疎水性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項16】
Ｅ１が、配列番号６３の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項17】
Ｅ１が、配列番号４０～４５からなる群より選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項18】
Ｅ２が、配列番号６４の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項19】
Ｅ２が、配列番号４６～５３および９８からなる群より選択される前記アミノ酸配列を含むか、Ｅ２が、配列番号４６～５３からなる群より選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項20】
Ｅ３が、配列番号６５の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項21】
Ｅ３が、配列番号５４～６２からなる群より選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項22】
前記Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインが、表２の列（ａ）～（ｏ）から選択される単列からのＥ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインの前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記参照ドメインに対するアミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である；または前記Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインが、表２の列（ａ）～（ｎ）から選択される単列からのＥ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインの前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記参照ドメインに対するアミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項１～２１のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項23】
１つまたは複数の隣接ドメイン間のアミノ酸リンカーを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項24】
前記アミノ酸リンカーが、独立して２～４アミノ酸長である、請求項２３に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項25】
配列番号６６～８５からなる群より選択される、または配列番号６６～７９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項26】
１つまたは複数の追加の機能的ドメインを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項27】
前記１つまたは複数の追加の機能的ドメインが、システイン残基へのリンカーを介して前記ポリペプチドに共有結合している、請求項２６に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項28】
前記１つまたは複数の追加の機能的ドメインが、前記ポリペプチドの前記Ｎおよび／またはＣ末端に存在する、請求項２６に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項29】
前記１つまたは複数の機能的ドメインが、検出ドメイン、安定化ドメイン、治療剤部分、診断部分および薬物送達ビヒクルを含む可能性があるがこれらに限定されない、請求項２６～２８のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項30】
前記１つまたは複数の機能的ドメインが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、ヒドロキシエチルでんぷん（ＨＥＳ）、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／もしくはＳｅｒで構成される立体配座的に無秩序なポリペプチド配列（「ＰＡＳ化」）、ならびに／またはアミノ酸ＬｙｓおよびＡｌａで構成され、Ｇｌｕを含むか含まないムチン拡散性ポリペプチドを含むがこれらに限定されない安定化ドメインを含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項31】
前記１つまたは複数の機能的ドメインが、配列番号９９～１０４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むヘリックスリピートタンパク質を含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項32】
配列番号１０５～１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項33】
少なくとも３μｍ、１μｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ、または５０ｎｍの結合親和性で前記トランスフェリン受容体に結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のトランスフェリン受容体結合ポリペプチド。
【請求項34】
請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項35】
プロモータと動作可能に結合した請求項３４に記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。
【請求項36】
請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３４に記載の核酸および／または請求項３５に記載の（エピソームまたは染色体統合）発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項37】
請求項１～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、または組換え宿主細胞、および医薬適合性のある担体を含む、医薬組成物。
【請求項38】
本明細書に開示されているものを含むがこれらに限定されない任意の適切な目的のために、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物を使用するための方法、またはその用途。
【請求項39】
前記目的が、アレナウイルス感染症を処置または限定すること；腫瘍を処置するための治療剤の送達；および前記治療剤の血清半減期を延長するための生物製剤（タンパク質、核酸、および抗体治療剤が含まれるがこれらに限定されない）などの治療剤との融合を含むがこれらに限定されない、請求項３８に記載の方法または用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年７月３０日付けで出願された米国仮特許出願第６３／０５８，９０８号の利益を請求する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年７月３０日付けで出願された米国仮特許出願第６３／０５８，９０８号の利益を請求する。
【0002】
連邦資金調達ステートメント
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ５０ ＡＧ００５１３６およびＲ０１ ＡＧ０６３８４５の下で、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有している。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ５０ ＡＧ００５１３６およびＲ０１ ＡＧ０６３８４５の下で、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有している。
【0003】
配列表ステートメント
配列表のコンピュータ可読形式は、電子提出により本出願と共に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名が「２０－９７７５－ＷＯ－ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」で、サイズが５５ｋｂである、２０２１年７月１９日に作成されたファイルに含まれている。
配列表のコンピュータ可読形式は、電子提出により本出願と共に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名が「２０－９７７５－ＷＯ－ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」で、サイズが５５ｋｂである、２０２１年７月１９日に作成されたファイルに含まれている。
【背景技術】
【0004】
ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）は、体内の鉄の主要な担体であるトランスフェリンを、受容体媒介トランスサイトーシスを介し、血液脳関門（ＢＢＢ）を超えて輸送する。このプロセスは、治療ペイロードを脳実質に送達するために活用される可能性があり、そうでなければＢＢＢにより遮断される。したがって、ｈＴｆＲは、ＢＢＢ横断ビヒクルの開発にとって魅力的な標的候補である。
【発明の概要】
【0005】
一態様において、本開示は、一般式Ｈ１－Ｈ２－Ｅ１－Ｈ３－Ｅ２－Ｅ３－Ｈ４；
および
ドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカー
を含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを提供し、ここで
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４は、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含み；
ここでポリペプチドは、トランスフェリン受容体に結合する。
および
ドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカー
を含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを提供し、ここで
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４は、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含み；
ここでポリペプチドは、トランスフェリン受容体に結合する。
【0006】
一実施形態において、Ｈ１は、配列番号１～８および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ１は、配列番号１～８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｈ２は、配列番号９～１８および８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｈ２は、配列番号９～１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｈ３は、配列番号１９～２７および８８～９２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ３は、配列番号１９～２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｈ４は、配列番号２８～３９および９３～９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、Ｈ４は、配列番号２８～３９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0007】
一実施形態において、ポリペプチドは、表１の列（ａ）～（ｔ）から選択される単列からのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｅ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、Ｅ１は、配列番号４０～４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｅ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、Ｅ２は、配列番号４６～５３および９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、Ｅ２は、配列番号４６～５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｅ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、Ｅ３は、配列番号５４～６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインは、表２の列（ａ）～（ｏ）から選択される単列からのＥ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、参照ドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【0008】
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６６～８５からなる群より選択される、または配列番号６６～７９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。
【0009】
本開示はまた、本開示のポリペプチドをコードする組換え核酸；プロモータと動作可能に結合した本開示の組換え核酸を含む発現ベクター；本開示のポリペプチド、核酸、および／または発現ベクターを含む宿主細胞；本開示のいずれかのポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、もしくは組換え宿主細胞、および医薬適合性のある担体を含む医薬組成物；ならびにアレナウイルス感染症を処置または限定すること；腫瘍を処置するための治療剤の送達；および治療剤の血清半減期を延長するための生物製剤（タンパク質、核酸、および抗体治療剤が含まれるがこれらに限定されない）などの治療剤との融合を含むがこれらに限定されない任意の適切な目的のための、本開示のポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物の使用のための方法、または用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】コンピュータによるデザインパイプライン。短いベータシートモチーフは、標的エッジストランドに対して整列される。アラインメントの後、ドッキングしたストランドは最小化され、スキャフォールドライブラリ内のタンパク質に存在するエッジストランドにマッチングさせる。得られるエッジ対エッジドックの界面は、続いてデザインされる。
【図2】ヒトトランスフェリン受容体は、ドッキングに適したエッジストランドを含む。Ａ）トランスフェリン受容体エクトドメインは、トランスフェリン結合部位（楕円の箱）から離れている露出したエッジストランド（箱）を含む。Ｂ）完全長デノボフェレドキシン様タンパク質のドッキングは、界面にボイド領域を残す（左）。Ｃ末端ストランドを除去すると、界面パッキング相互作用の可能性を改善する。
【図3】ヒトトランスフェリン受容体結合タンパク質のデザイン。Ａ）第１世代ＴｆＲバインダ（ＴｆＲエクトドメイン、バインダ）のモデル。Ｂ）第２世代ＴｆＲバインダ（ＴｆＲエクトドメイン、バインダ）のモデル。Ｃ）２ＤＳ２５（灰色、陰性対照：黒色）は、フローサイトメトリにおいてｈＴｆＲ外部ドメインに結合する。１００，０００個の細胞が測定された。Ｄ）２ＤＳ２５の円二色性化学変性実験。Ｅ）単一濃度バイオレイヤー干渉法アッセイ（灰色：２ＤＳ２５、黒色：２ＤＳ２５＿ＫＯ（Ｗ８１Ａ／Ｑ８５Ａ）。
【図4】ｈＴｆＲバインダの開発。Ａ）結合（球体としてのＣ－アルファ原子）を改善する２ＤＳ２５上の位置。Ｂ）２ＤＳ２５および最適化変異体のバイオレイヤー干渉法平衡結合曲線。Ｃ）平衡結合曲線２ＤＳ２５および新規デザイン３ＤＳ２、３ＤＳ１０および３ＤＳ１８。
【図5】Ａ）第２世代ｈＴｆＲバインダのデザイン。塩基フェレドキシンスキャフォールドは、界面の埋没表面積を大きくするためにヘリクスｈ１およびｈ２を構築することにより伸長された。Ｂ）第１世代および第２世代ｈＴｆＲバインダのコンピュータによるメトリックスのヒストグラム。
【図6】２ＤＳ２５の特徴づけ。Ａ）ｈＴｆＲ（灰色）に結合した２ＤＳ２５のデザインされたモデル（黄色）。Ｂ）フローサイトメトリヒストグラム（ＰＥシグナル）。２ＤＳ２５は、多重特異性試薬（ＰＳＲ）またはベータシート含有タンパク質ＩＬ１７およびＣＴＬＡ４に結合せず、２ＤＳ２５が特異的であることを示唆する。Ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００での２ＤＳ２５の溶出プロファイルは、ＧＬを増加させる。Ｄ）ＣＤ温度溶融物の全波長スキャン（左）および２２０ｎｍでの吸光度（右）。Ｅ）２ＤＳ２５グアニジン－ＨＣｌ溶融物のＣＤスペクトル。
【図7】２ＤＳ２５変異体バイオレイヤー干渉法。１：１結合モデルにフィッティングさせたバイオレイヤー干渉法実験におけるｈＴｆＲに結合する２ＤＳ２５変異体の生のキネティックトレース。
【図8】バイオレイヤー干渉法は、第３世代デザインをトレースする。Ａ）ｈＴｆＲに結合する７個の新規デザインの単一濃度結合トレース。Ｂ）１：１結合モデルにフィッティングさせたデザイン２ＤＳ２５、３ＤＳ２、３ＤＳ１０および３ＤＳ１８の生のキネティックトレース。
【発明を実施するための形態】
【0011】
引用されたすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。本出願内では、別段の記載がない限り、利用される技術は、いくらかの周知の参考文献、例えば：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌにより編集，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ならびにｔｈｅ Ａｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のいずれかに見出すことができる。
【0012】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に他のものを規定しない限り、複数の指示対象を含む。
【0013】
本明細書で使用されるように、アミノ酸残基は、以下のように略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【0014】
本明細書に開示されているポリペプチドのすべての実施形態において、任意のＮ末端メチオニン残基は任意選択である（すなわち、Ｎ末端メチオニン残基が存在してもよく、存在しなくてもよく、別のポリペプチドと比較してアミノ酸配列同一性の割合を決定する場合、含まれていてもよく、排除されていてもよい）。
【0015】
本開示の任意の態様のすべての実施形態は、文脈上明確に他のものを規定しない限り、組み合わせて使用することができる。
【0016】
文脈上明確に他のものを必要としない限り、明細書および特許請求の範囲全体を通じて、用語「含む」、「含んでいる」などは、排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味で解釈されるべきである；すなわち、「含むがこれらに限定されない」という意味である。さらに、用語「本明細書において」、「上記」、および「下記」ならびに同様の重要な用語は、本出願において使用される場合、全体として本出願を指すが、本出願の任意の特定の部分を指すものではない。
【0017】
第１の態様において、本開示は、一般式Ｈ１－Ｈ２－Ｅ１－Ｈ３－Ｅ２－Ｅ３－Ｈ４；
および
ドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカー
を含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを提供し、ここで
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４は、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含み；
ここでポリペプチドは、トランスフェリン受容体に結合する。
および
ドメイン間の任意選択のアミノ酸リンカー
を含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを提供し、ここで
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４は、それぞれ独立して、１１～２０アミノ酸長のアルファヘリックスドメインを含み；
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、それぞれ独立して、５アミノ酸長のベータシートを含み；
ここでポリペプチドは、トランスフェリン受容体に結合する。
【0018】
本開示のポリペプチドは、以下の実施例において考察されるように、新世界のアレナウイルスの細胞への侵入のための部位としても機能するＴｆＲ頂端ドメインに結合する。マチュポウイルス、フニンウイルス、ガナリトウイルスおよびサビアウイルスなどのこれらの多くのウイルスは、致死率の高い出血熱を引き起こす。したがって、本開示のポリペプチドは、例えば、ウイルスの細胞への侵入を遮断するために、使用される可能性がある。さらに、ＴｆＲは、多くの腫瘍で過剰発現し、したがって、本開示のポリペプチドは、ＴｆＲを発現する腫瘍に治療剤を標的化するために使用される可能性がある。同様に、ＴｆＲが体全体に発現されるので、本開示のポリペプチドは、一般的な送達プラットフォームとして活用される可能性がある。またさらに、ＴｆＲは、血清Ｔｆを細胞に送達するためのその自然の機能の一部として、細胞表面とエンドサイトーシス小胞との間を連続的に循環する。したがって、本開示のポリペプチドへの生物製剤の融合は、生物製剤のインビボ寿命を延長するために使用することができる。
【0019】
トランスフェリン受容体に結合するポリペプチドは、以下の実施例において詳述するように、Ｏｃｔｅｔ機器を使用するバイオレイヤー干渉法により決定される。本明細書における任意の実施形態と組み合わせることができる種々の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも３μｍ、１μｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ、または５０ｎｍの結合親和性でトランスフェリン受容体に結合する。
【0020】
種々のヘリックスドメイン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４）は、１１～２０アミノ酸長であり、ドメインがアルファヘリックスである限り、任意のアミノ酸組成であり得る。種々の実施形態において、ヘリックスドメインは、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１１～１９、１１～１８、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～２９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、または１３～１４アミノ酸長であり得る。
【0021】
一実施形態において、Ｈ１アルファヘリックスドメインは、１５～２０アミノ酸長である。別の実施形態において、Ｈ１は、配列番号１～８および８６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｈ１は、配列番号１～８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0022】
【化1】
【0023】
以下の実施例に記載されるように、本発明者らは、本開示のポリペプチドの広範な突然変異解析および機能解析を実行し、トランスフェリン受容体に結合する場合に界面に関与する残基およびそうでない残基を同定し、したがって、トランスフェリン受容体結合活性を保持している間、ポリペプチドがどのように修飾され得るかについての詳細な教示を提供する。
【0024】
別の実施形態において、アルファヘリックスドメインＨ２における残基の少なくとも４０％、５０％、または６０％は疎水性である。さらなる実施形態において、Ｈ２は、１１～１３アミノ酸長である。種々の実施形態において、Ｈ２は、配列番号９～１８および８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｈ２は、配列番号９～１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0025】
【化2】
【0026】
別の実施形態において、太字体のＨ２残基は、参照のアミノ酸配列に対して（すなわち、配列番号９～１８および８７に対して）保存される。これらの残基は、トランスフェリン受容体結合に関与することが示されている。
【0027】
一実施形態において、Ｈ３アルファヘリックスドメインは、１３～１４アミノ酸長である。別の実施形態において、Ｈ３は、配列番号１９～２７および８８～９２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｈ３は、配列番号１９～２７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0028】
【化3】
【0029】
一実施形態において、アルファヘリックスドメインＨ４は、１４～１５アミノ酸長である。別の実施形態において、Ｈ４は、配列番号２８～３９および９３～９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｈ４は、配列番号２８～３９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0030】
【化4】
【0031】
一実施形態において、Ｈ４ドメインにおける太字の残基は、参照ポリペプチドに対して保存される。これらの残基は、トランスフェリン受容体結合に関与することが示されている。
【0032】
別の実施形態において、本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、表１の列（ａ）～（ｔ）から選択される単列からのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインを含む。別の実施形態において、本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、表１の列（ａ）～（ｎ）から選択される単列からのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４ドメインを含む。列（ａ）～（ｇ）および（ｏ）～（ｔ）は、実施例においてより詳細に説明されるように「２Ｄデザインに基づいている（特定のポリペプチドおよびドメインの命名規則、すなわち「２ＤＳ２５」などを参照されたい）が、列（ｈ）～（ｎ）は、「３Ｄデザイン」（すなわち、３ＤＳ２、３ＤＳ４など）に基づいている。
【0033】
【表1】
【0034】
本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、独立して、５アミノ酸長のベータシートを含む、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインを含む。一実施形態において、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインのそれぞれのアミノ酸の少なくとも３個、４個、または５個すべては、疎水性である。
【0035】
別の実施形態において、Ｅ１ドメインは、アミノ酸配列（Ａ／Ｖ／Ｉ）Ｖ（Ｖ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ／Ｆ）Ｖ（配列番号６３）を含み、括弧内の残基は、所与の位置での代替残基である。さらなる実施形態において、Ｅ１ドメインは、配列番号４０～４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0036】
【化5】
【0037】
さらなる実施形態において、Ｅ２ドメインは、アミノ酸配列（Ｄ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｌ／Ｒ／Ｉ／Ｈ）（Ｖ／Ｉ）（Ｉ／Ｙ／Ｖ／Ｆ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｖ）（配列番号６４）を含む。またさらなる実施形態において、Ｅ２は、配列番号４６～５３および９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、Ｅ２は、配列番号４６～５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0038】
【化6】
【0039】
一実施形態において、Ｅ３ドメインは、アミノ酸配列（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｆ）Ｖ（Ｖ／Ｆ／Ｉ）（Ｉ／Ｖ／Ｒ／Ｆ／）（Ｋ／Ｈ／Ｖ／Ｙ／Ｆ／Ｒ）（配列番号６５）を含む。他の実施形態において、Ｅ３は、配列番号５４～６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0040】
【化7】
【0041】
さらなる実施形態において、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、表２の列（ａ）～（ｏ）から選択される単列からのＥ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインを含み、ここで、参照ドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。別の実施形態において、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、表２の列（ａ）～（ｎ）から選択される単列からのＥ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３ドメインを含み、ここで、参照ドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。列（ａ）～（ｇ）および（ｏ）は、実施例においてより詳細に説明されるように「２Ｄデザインに基づいているが、列（ｈ）～（ｎ）は、「３Ｄデザイン」に基づいている。
【0042】
【表2】
【0043】
本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、１つまたは複数の隣接ドメイン間にアミノ酸リンカーを含む可能性がある。そのようなアミノ酸リンカーが存在する場合、それらは、２つの隣接ドメイン間のみ（例えば、Ｈ１とＨ２ドメインとの間のアミノ酸リンカーがあり、他のドメイン間にはリンカーが存在しない）、複数の隣接ドメイン間、またはすべての隣接ドメイン間に存在する可能性がある。アミノ酸リンカーは、任意の適切な長さおよびアミノ酸組成のものであり得る。一実施形態において、アミノ酸リンカーは、存在する場合、独立して２～４アミノ酸長である。
【0044】
他の実施形態において、トランスフェリン受容体結合ペプチドは、配列番号６６～８５からなる群より選択される、または配列番号６６～７９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0045】
【化8】
【0046】
一実施形態において、参照ポリペプチドに対するアミノ酸置換は、界面内またはその付近にはない表面残基にある。表３は、界面内またはその付近にはない表面残基である残基位置を列記する。当業者により理解されるように、これらの残基は、本開示のポリペプチドおよびトランスフェリン受容体の結合界面で、またはその付近に存在せず（実施例において詳述されるように）、したがって、トランスフェリン受容体結合活性に影響を及ぼすことなく、より容易に突然変異が起きやすい。
【0047】
【表3】
【0048】
本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、追加の残基を含む可能性がある。いくらかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端で追加の残基を含む可能性がある。任意の追加の残基は、意図される目的に適切であると考えられる通りに追加される可能性がある。種々の非限定の実施形態において、ポリペプチドは、機能的ドメインをさらに含む可能性がある。ポリペプチドが、検出ドメイン、安定化ドメイン、治療剤部分、診断部分および薬物送達ビヒクルを含むがこれらに限定されない、任意の追加の機能的ドメインを含む可能性がある。機能的ドメインは、ポリペプチドとの翻訳融合として追加される可能性があるか、ポリペプチドに化学的に結合される可能性がある。システイン残基への共有結合を含むがこれらに限定されない任意の適切な化学結合を使用することができる。例えば結合界面またはその付近には存在しないポリペプチド内の任意の表面アミノ酸残基（表３を参照されたい）は、システインに突然変異する可能性がある。一実施形態において、１つまたは複数の追加の機能的ドメインは、翻訳融合としてポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端に存在する。一実施形態において、１つまたは複数の機能的ドメインは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、ヒドロキシエチルでんぷん（ＨＥＳ）、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／もしくはＳｅｒで構成される立体配座的に無秩序なポリペプチド配列（「ＰＡＳ化」）、ならびに／またはアミノ酸ＬｙｓおよびＡｌａで構成され、Ｇｌｕを含むか含まないムチン拡散性ポリペプチドを含むがこれらに限定されない安定化ドメインを含む。
【0049】
別の実施形態において、機能的ドメインは、ヘリックスリピートタンパク質を含む可能性がある。この実施形態は、血液中により長い滞留時間を有するポリペプチドをもたらす。非限定の実施形態において、ヘリックスリピートタンパク質は、配列番号９９～１０４からなる群より選択されるアミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0050】
【化9】
【0051】
代表的な実施形態において、本実施形態のポリペプチドは、配列番号１０５～１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0052】
【化10】
【0053】
いくらかの実施形態において、所与のアミノ酸は、同様の物理化学的特徴を有する残基により置き換える、例えば、１つの脂肪族残基を別のもの（例えば互いのためにＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）に置換するか、１つの極性残基を別のもの（例えばＬｙｓとＡｒｇとの間；ＧｌｎとＡｓｐとの間；またはＧｌｎとＡｓｎとの間）に置換することができる。他のそのような保存的置換、例えば同様の疎水性特徴を有する全領域の置換が既知である。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性にしたがってグループ化することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）において）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。代わりに、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに分割することができる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。特定の保存的置換には、例えば；ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｎからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ;ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕが含まれる。
【0054】
これらの実施形態のすべてにおいて、パーセント同一性の要件は、ポリペプチドに組み込まれる可能性のある追加の機能的ドメインを含まない。
【0055】
別の実施形態において、本開示のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、少なくとも３μｍ、１μｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ、または５０ｎｍの結合親和性でトランスフェリン受容体に結合する可能性がある。
【0056】
別の態様において、本開示は、一般的にコードされ得る、任意の実施形態のポリペプチドまたは本明細書に開示されている実施形態の組み合わせをコードする組換え核酸を提供する。核酸配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ形状での一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または化学的または生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基をそれぞれ含む可能性があるＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む可能性がある。そのような核酸配列には、ポリＡ配列、修飾コザック配列、ならびにエピトープタグ、移行シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および原形質膜局在シグナルをコードする配列が含まれるがこれらに限定されないコードされたポリペプチドの発現および／または精製を促進するのに有用な追加の配列を含む可能性がある。本明細書の教示に基づいて、核酸配列が本開示のポリペプチドをコードすることは、当業者に明らかであろう。
【0057】
別の態様において、本開示は、プロモータと動作可能に結合した本開示の組換え核酸を含む発現ベクターを提供する。「発現ベクター」には、核酸コード領域または遺伝子を、遺伝子産物の発現に影響を及ぼすことができる任意の制御配列に動作可能に結合するベクターが含まれる。本開示の核酸配列に動作可能に結合した「制御配列」は、核酸分子の発現に影響を及ぼすことができる核酸配列である。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、核酸配列と連続している必要はない。したがって、例えば介在する未翻訳であるが転写済みの配列は、プロモータ配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモータ配列は、依然としてコード配列に「動作可能に結合している」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびリボソーム結合部位が含まれるがこれらに限定されない。そのような発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベースの発現ベクターを含むがこれらに限定されない任意のタイプのものであり得る。哺乳動物系における本開示の核酸配列の発現を駆動するために使用される制御配列は、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦが含まれるがこれらに限定されない多種多様のプロモータのいずれかにより駆動される）または誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答が含まれるがこれらに限定されない多数の誘導性プロモータにより駆動される）であり得る。発現ベクターは、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡへの統合により、宿主組織内で複製可能でなければならない。種々の実施形態において、発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベースのベクター、または任意の他の適切な発現ベクターを含む可能性がある。
【0058】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されている任意の実施形態のポリペプチド、核酸、および／または（エピソームまたは染色体統合）発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであり得る。
【0059】
別の態様において、本開示は、任意の実施形態または実施形態の組み合わせのいずれかのポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、または組換え宿主細胞、ならびに医薬適合性のある担体を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、例えば本明細書に記載の本開示の方法において使用することができる。医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）張度調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）防腐剤および／または（ｇ）緩衝液をさらに含む可能性がある。
【0060】
いくらかの実施形態において、医薬組成物における緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬組成物はまた、凍結乾燥保護剤、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含む可能性がある。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、フェニル水銀硝酸塩、チメロサール、安息香酸、およびそれらの種々の混合物を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、グリシンなどの増量剤を含む。さらに他の実施形態において、医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート、またはそれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、張度調整剤、例えば製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物を含む可能性がある。代表的な調度調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が含まれる。他の実施形態において、医薬組成物は、安定剤、例えば目的のタンパク質と組み合わせる場合、目的のタンパク質の凍結乾燥または液体の形態での化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子をさらに含む。代表的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が含まれる。
【0061】
本明細書における任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチド、核酸、発現ベクター、または細胞は、医薬組成物中の唯一の活性薬剤である可能性があるか、組成物は、意図された用途に適した１つまたは複数の他の活性薬剤をさらに含む可能性がある。
【0062】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示されているものを含むがこれらに限定されない任意の適切な目的のために、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、および／または医薬組成物の使用のための方法、または用途を提供する。
【0063】
種々の実施形態において、目的には、アレナウイルス感染症を処置または限定すること；腫瘍を処置するための治療剤の送達；および治療剤の血清半減期を延長するための生物製剤（タンパク質、核酸、および抗体治療剤が含まれるがこれらに限定されない）などの治療剤との融合を含むがこれらに限定されない。
【0064】
ＴｆＲ頂端ドメイン（以下の実施例において考察されるように、本開示のポリペプチドが結合する）はまた、新世界のアレナウイルスの細胞への侵入のための部位としても機能する（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７，４３８－４４４（２０１０）；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１８８４（２０１８））。マチュポウイルス、フニンウイルス、ガナリトウイルスおよびサビアウイルスなどのこれらの多くのウイルスは、致死率の高い出血熱を引き起こす。したがって、本開示のポリペプチドは、頭頂ドメインに結合する抗体がウイルス侵入を遮断することができるのと同じ方法でウイルスの侵入を遮断する可能性がある。
【0065】
ＴｆＲは、多くの腫瘍で過剰発現され（Ｄａｎｉｅｌｓ－Ｗｅｌｌｓ，Ｔ．Ｒ．およびＰｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ８，９９１－９９４（２０１６））、開示されているポリペプチドを標的分子として使用する標的治療の可能性を高める。同様に、ＴｆＲが全身に発現するので、開示されているポリペプチドは、一般的な送達プラットフォームとして利用される可能性がある。
【0066】
最後にＴｆＲ結合タンパク質は、血清中の生物製剤の寿命を延長するためのリサイクル因子として有用であると示唆されている。Ｆｃ受容体と同様に、ＴｆＲは、血清Ｔｆを細胞に送達するその天然の機能の一部として、細胞表面とエンドサイトーシス小胞との間を連続的に循環する。生物製剤のＴｆへの融合は、それらの血清寿命を延長している。生物製剤の、開示されているポリペプチドへの融合は、同様に生物製剤の寿命の延長に至る可能性がある。
【0067】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であることや、開示されている正確な形式に本開示を限定することを意図していない。本開示の特定の実施形態およびその実施例は、例証目的のために本明細書に記載されているが、当業者に理解されるように、本開示の範囲内で種々の等価な修正が可能である。
【0068】
実施例
極性タンパク質－タンパク質相互作用のデノボデザインは、極性基から水を除去する熱力学的コストのために困難である。ここで、我々は、ベータシートの端で露出した極性主鎖基を、幾何学的に一致したベータストランドで補完し、ベータシート伸長部を形成するタンパク質をデザインするための一般的なアプローチを説明する。我々は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って、相互作用するタンパク質を輸送し、脳への薬物送達のための新規の道を開く、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）上に露出したベータシートに結合する小さなタンパク質のコンピュータデザインに我々のプロトコルを適用した。我々がデザインしたＢＢＢシャトルタンパク質は、ナノモル濃度の親和性でｈＴｆＲを結合し、超安定性であり、ヒトＢＢＢのインビトロ微小流体ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ＣｈｉｐモデルでＢＢＢを通過する。
極性タンパク質－タンパク質相互作用のデノボデザインは、極性基から水を除去する熱力学的コストのために困難である。ここで、我々は、ベータシートの端で露出した極性主鎖基を、幾何学的に一致したベータストランドで補完し、ベータシート伸長部を形成するタンパク質をデザインするための一般的なアプローチを説明する。我々は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って、相互作用するタンパク質を輸送し、脳への薬物送達のための新規の道を開く、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）上に露出したベータシートに結合する小さなタンパク質のコンピュータデザインに我々のプロトコルを適用した。我々がデザインしたＢＢＢシャトルタンパク質は、ナノモル濃度の親和性でｈＴｆＲを結合し、超安定性であり、ヒトＢＢＢのインビトロ微小流体ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ＣｈｉｐモデルでＢＢＢを通過する。
【0069】
ほとんどのタンパク質－タンパク質界面が、主に側鎖－側鎖相互作用で構成されているが、主鎖の水素結合も役割を果たすことができる。我々は、目的の標的タンパク質中で露出したベータストランドと対になるように幾何学的に釣り合いが取れたベータシートを用いる結合タンパク質をデザインするためのコンピュータデザインアプローチを開発した。我々はまず、短い二本鎖ベータシートまたはベータヘアピンを標的タンパク質のエッジストランドに整列させ、次いで、主鎖座標の勾配ベースの最小化を使用して、標的との界面全体での水素結合相互作用を最適化する（図１ａ）。これらの最適化されたベータストランドは、その後、幾何学的に一致するベータシートを有するデノボデザインされた小さいタンパク質スキャフォールドに移植され、ドッキングしたタンパク質－タンパク質複合体を生じる。水素結合の形状および界面全体の埋没表面積に基づいてドックをフィルタリングした後、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）フレキシブル主鎖組み合わせ配列最適化を使用して、側鎖－側鎖相互作用エネルギーおよびデザインされたスキャフォールドの安定性を最大化する。
【0070】
ヒトトランスフェリン受容体結合タンパクのデザイン
我々は、自分たちのプロトコルを使用して、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）結合タンパク質をデザインしようとした。ｈＴｆＲは、受容体媒介トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過してトランスフェリン（体内での鉄の主な担体）を輸送し、このプロセスは、他の方法ではＢＢＢにより遮断される、治療ペイロードを脳実質に送達するために活用されている。例えば、トランスフェリンまたは抗ＴｆＲ抗体などの大きい複雑な分子に結合した抗体およびナノ粒子は、ｈＴｆＲ依存的にＢＢＢを通過して脳実質に入ることが示されている。したがって、ｈＴｆＲは、ＢＢＢ横断ビヒクルの開発にとって魅力的な標的候補である。
我々は、自分たちのプロトコルを使用して、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）結合タンパク質をデザインしようとした。ｈＴｆＲは、受容体媒介トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過してトランスフェリン（体内での鉄の主な担体）を輸送し、このプロセスは、他の方法ではＢＢＢにより遮断される、治療ペイロードを脳実質に送達するために活用されている。例えば、トランスフェリンまたは抗ＴｆＲ抗体などの大きい複雑な分子に結合した抗体およびナノ粒子は、ｈＴｆＲ依存的にＢＢＢを通過して脳実質に入ることが示されている。したがって、ｈＴｆＲは、ＢＢＢ横断ビヒクルの開発にとって魅力的な標的候補である。
【0071】
我々は、トランスフェリンとの競合を回避するためにトランスフェリン結合部位の外側のｈＴｆＲへのバインダをデザインすることを目的とした。ＴｆＲの頭頂ドメインは、ベータシート伸長部に適した露出したエッジストランドを含み８、我々は、自分たちのプロトコルをこの領域に適用した（図２ａ）。ストランドマッチングステップにおいて、我々は、デノボデザインされたフェレドキシンスキャフォールドのＣ末端トランケートバージョンが、かなりの表面積を埋め、界面全体で優れたベータシート水素結合相互作用を作ることができることを見出した（図２ｂ）。ドッキングしたスキャフォールドの配列は、高親和性相互作用のために最適化され、６４９の選択されたデザインのライブラリがオリゴアレイに対して順序付けされ、酵母表面ディスプレイを使用して結合について試験した。しかし、インシリコでの折り畳み傾向が高く、界面形状の相補性が高いにもかかわらず、これらのデザインはいずれもｈＴｆＲに結合しなかった（図３ａおよび図５ｂ）。
【0072】
我々は、これらの第１ラウンドのデザインの欠点が、１４４A２から１３９５A２の範囲であるが、平均がわずかに８４２A２である低界面埋没表面積であったと仮説を立てた。この仮説を試験するため、我々はＲｏｓｅｔｔａＲｅｍｏｄｅｌ（商標）を使用して、標的との第２の界面を形成するためにＮ末端で新規ポリバリンヘリックスを追加することにより開始スキャフォールドを伸長した。何千もの新規主鎖を生成し、そのうちのいくらかにおいて、二次界面ヘリックスが別の強化ヘリックスで安定化された（図５ａ）。主鎖を生成し、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）組み合わせデザイン算出を使用して配列を最適化した後、最も低いエネルギースキャフォールドをｈＴｆＲに再ドッキングし、界面の残基を、固い結合のために再度最適化した（図３ｂ）。これらの第２ラウンドのデザインは、良好な形状の相補性を維持しながら、標的とのより大きい埋没表面積を有していた（図５ｂ）。
【0073】
５０のデザインをコードする合成遺伝子を取得し、酵母表面ディスプレイを使用して、ｈＴｆＲ結合を試験した。５０のうち、１つ（２ＤＳ２５と指定）は、蛍光標識ｈＴｆＲを明らかに結合した（図３ｃ）。デザインモデルにおいて、中央のベータシート伸長部のいずれかの側部上の２つのヘリックスは、界面全体でＴｆＲと接触する（図６ａ）。２ＤＳ２５がタンパク質ＣＴＬＡ４およびＩＬ１７を含むエッジストランドにも、非特異的抗体の同定用に予め開発された多重特異性試薬にも結合しなかったので、結合は特異的であった（図６ｂ）。
【0074】
次に、我々は、固定化金属親和性クロマトグラフィを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から２ＤＳ２５を発現および精製した。タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィから、モノマーに相当する溶出体積で単分散性ピークとして溶出された（図６ｃ）。円二色性分光法は、２ＤＳ２５が高度に安定していることを示した：溶融温度は、９５度より高く、５０％変性に必要なグアニジン－ＨＣｌ濃度は、５．７Ｍであった（図３ｄおよび図６ｄ～図６ｅ）。精製２ＤＳ２５は、バイオレイヤー干渉法実験においてｈＴｆＲエクトドメインを結合した（図３ｅ）。デザインされた結合部位の重要な残基の突然変異が、結合を無効にし、複合体形成がデザインされた界面を介していることを示唆した（図３ｅ）。
【0075】
折り畳みおよび結合の配列決定を調べるため、そして２ＤＳ２５－ｈＴｆＲ複合体の構造の決定を促進するため、我々は、２ＤＳ２５上の各位置が、１つずつ他の２０のアミノ酸すべてで置換された部位飽和突然変異ライブラリ（ＳＳＭ）を作成し、ＦＡＣＳを使用してｈＴｆＲ結合についてスクリーニングした。ディープシーケンシングは、２ＤＳ２５のデザインされたコア残基が保存されていることを明らかにし、２ＤＳ２５がデザインされたように折り畳まれることを示唆した。重要な界面残基も保存されていたが、親和性を高める置換は、界面の周囲で同定された。これらの豊富な置換の組み合わせにより、より親和性の高い変異体が得られた（方法を参照されたい）。
【0076】
結合親和性は、ｈＴｆＲを標的とする化合物のトランスサイトーシス有効性を決定する重要な因子である。我々は、ＳＳＭデータを活用して、異なるＫＤを有する様々なデザインを作成し、ＢＢＢ横断について試験した。結合を改善した突然変異体の大部分は、ｈＴｆＲと２ＤＳ２５との間の界面にマッピングされ、パッキング界面および静電接触を最適化する可能性がある（図４ａ）。結合を改善した２つの突然変異（Ａ４４ＧおよびＩ６６Ｌ）は、界面の遠位で２ＤＳ２５のコア内に発生した；これらは、界面を安定化する微細な立体配座変化を生じる可能性がある。５つの変異体のバイオレイヤー干渉法は、２０ｎＭから４００ｎＭのＫＤの範囲を明らかにした（図４ｂおよび図７）。
【0077】
上記結果および構造解析に基づいて、我々は、別のラウンドのデザインを実行した。我々は、４８のデザインを選択し、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた。順序付けされた４８のデザインのうち２４は、ＳＥＣ後に可溶性であり、７つのデザインは、バイオレイヤー干渉法において結合シグナルを示し（図８ａ）、以前のデザインラウンドと比較して、成功率において７倍より大きい改善となった。我々は、さらなる生物物理学的特徴づけのために３つのデザインを進め、４００～７００ｎＭの範囲の親和性で結合したことを認めた（図４ｃおよび図８ｂ）。
【0078】
考察
タンパク質標的上の露出したベータストランドおよび隣接領域に結合する小さいタンパク質をコンピュータでデザインするための我々の方法は、タンパク質阻害剤デザインのための可能性を大幅に拡張する。タンパク質が固定された標的タンパク質に高い特異性および親和性で結合するためにデノボデザインされる「片面」界面デザインは、デザインされたタンパク質上の適切な形状の疎水性クラスターにより補完することができる表面疎水性パッチを有する標的に今まで大きく限定されていた。我々の方法は、現在、エッジベータストランドを囲む遥かに極性が高く凹みが少ない領域を利用可能にし、したがって、標的とすることができる目的のタンパク質の数を増加させる。結合する標的の領域を選択できるという点で、抗体および他の選択方法に対するコンピュータによるデザインの利点は、ｈＴｆＲの場合明らかである；我々は、競合を回避するためにトランスフェリン結合部位から遥かに離れた部位を選択した。
タンパク質標的上の露出したベータストランドおよび隣接領域に結合する小さいタンパク質をコンピュータでデザインするための我々の方法は、タンパク質阻害剤デザインのための可能性を大幅に拡張する。タンパク質が固定された標的タンパク質に高い特異性および親和性で結合するためにデノボデザインされる「片面」界面デザインは、デザインされたタンパク質上の適切な形状の疎水性クラスターにより補完することができる表面疎水性パッチを有する標的に今まで大きく限定されていた。我々の方法は、現在、エッジベータストランドを囲む遥かに極性が高く凹みが少ない領域を利用可能にし、したがって、標的とすることができる目的のタンパク質の数を増加させる。結合する標的の領域を選択できるという点で、抗体および他の選択方法に対するコンピュータによるデザインの利点は、ｈＴｆＲの場合明らかである；我々は、競合を回避するためにトランスフェリン結合部位から遥かに離れた部位を選択した。
【0079】
我々の小さい安定したデザインのｈＴｆＲバインダ、およびＢＢＢで他の標的に対する同様のデザインは、治療剤および他の分子カーゴを脳に輸送する、刺激的な新規可能性を提供する。小さいサイズ（１０ｋＤａ）は、抗体および同種であるリガンドトランスフェリン（７６ｋＤａである）と比較して受容体媒介トランスサイトーシスを介した脳への改善されたアクセスを提供する。高い安定性およびモジュール性、そしてしたがって遺伝子融合および化学的結合に対する堅牢性を考慮すると、我々のデザインは、治療カーゴに融合／結合するために、より大きくより複雑な分子よりも明確な利点を有している。
【0080】
材料および方法
タンパク質デザイン
標的エッジストランドの同定
ＨＥＴＡＴＭレコードを削除した後、座標制約を使用してトランスフェリン受容体標的タンパク質（ｐｄｂ ３ｋａｓ）をＲｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数に緩和させた。分子グラフィックスビューアで検査することにより、全標的タンパク質エッジストランドを視覚的に、またはベータ構造にあった残基に存在する全主鎖のＨ原子およびＯ原子の原子溶媒アクセス可能表面積（ａＳＡＳＡ）を算出することによりプログラム的に同定した。少なくとも３残基長で平均ａＳＡＳＡ値が２を超えるストランドは、溶媒に露出しているとみなされ、したがって、エッジストランドがストランドドッキングに適していると見なされた。
タンパク質デザイン
標的エッジストランドの同定
ＨＥＴＡＴＭレコードを削除した後、座標制約を使用してトランスフェリン受容体標的タンパク質（ｐｄｂ ３ｋａｓ）をＲｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数に緩和させた。分子グラフィックスビューアで検査することにより、全標的タンパク質エッジストランドを視覚的に、またはベータ構造にあった残基に存在する全主鎖のＨ原子およびＯ原子の原子溶媒アクセス可能表面積（ａＳＡＳＡ）を算出することによりプログラム的に同定した。少なくとも３残基長で平均ａＳＡＳＡ値が２を超えるストランドは、溶媒に露出しているとみなされ、したがって、エッジストランドがストランドドッキングに適していると見なされた。
【0081】
エッジストランドに幾何学的にマッチングするベータモチーフ
コンピュータにより生成されたベータヘアピンモチーフのＣアルファ原子、およびＰＤＢに由来する短い平行および逆平行の二本鎖ベータシートを標的エッジストランド上に整列させた。モチーフの整列させたセグメントを次に削除した。ドッキングしたストランドを、その後、さらに削減するか、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかで伸長させ、異なる長さを有する一連のストランドを生成した。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ＦａｓｔＲｅｌａｘ（商標）を使用する標的の存在下での勾配－降下ベースの最小化を使用して、これらのドックを緩和させ、標的エッジストランドとの主鎖の水素結合相互作用を最適化した。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）（ｈｂｏｎｄ＿ｌｒ＿ｂｂ）における主鎖の水素結合スコアタームのための指定された閾値（典型的に－４）を満たさないドックは、廃棄された。
コンピュータにより生成されたベータヘアピンモチーフのＣアルファ原子、およびＰＤＢに由来する短い平行および逆平行の二本鎖ベータシートを標的エッジストランド上に整列させた。モチーフの整列させたセグメントを次に削除した。ドッキングしたストランドを、その後、さらに削減するか、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかで伸長させ、異なる長さを有する一連のストランドを生成した。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ＦａｓｔＲｅｌａｘ（商標）を使用する標的の存在下での勾配－降下ベースの最小化を使用して、これらのドックを緩和させ、標的エッジストランドとの主鎖の水素結合相互作用を最適化した。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）（ｈｂｏｎｄ＿ｌｒ＿ｂｂ）における主鎖の水素結合スコアタームのための指定された閾値（典型的に－４）を満たさないドックは、廃棄された。
【0082】
ドッキングされ最小化されたストランドのスキャフォールドへのマッチング
Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）でＭｏｔｉｆＧｒａｆｔＭｏｖｅｒ（商標）を使用して、ストランドを、我々のスキャフォールドライブラリに幾何学的にマッチングさせた。マッチングに続いて、ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ（商標）を使用して、得られるタンパク質－タンパク質複合体を界面で再パックし、続いてデカルトおよびキネマティック（ＦａｓｔＲｅｌａｘ）最小化を行って、ドッキングされたストランドおよびスキャフォールドの接合部で潜在的に破壊された結合を規則化した。ヘテロ二量体について、少なくとも１１００A２の界面を埋めたドックのみが下流のデザインラウンドのために選択された。
Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）でＭｏｔｉｆＧｒａｆｔＭｏｖｅｒ（商標）を使用して、ストランドを、我々のスキャフォールドライブラリに幾何学的にマッチングさせた。マッチングに続いて、ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ（商標）を使用して、得られるタンパク質－タンパク質複合体を界面で再パックし、続いてデカルトおよびキネマティック（ＦａｓｔＲｅｌａｘ）最小化を行って、ドッキングされたストランドおよびスキャフォールドの接合部で潜在的に破壊された結合を規則化した。ヘテロ二量体について、少なくとも１１００A２の界面を埋めたドックのみが下流のデザインラウンドのために選択された。
【0083】
界面デザインおよびフィルタリング
側鎖－側鎖相互作用エネルギーおよびデザインされたスキャフォールドの安定性を最大化するために、スコア関数「ｒｅｆ２０１５」または「ベータ＿ｎｏｖ１６」または「ベータ＿ｇｅｎｐｏｔ」を用いるＲｏｓｅｔｔａ（商標）組み合わせ配列最適化を使用して、複合体の界面側鎖をデザインした。配列最適化の間、デザインされたスキャフォールドの主鎖は、可能な側鎖のより細かいサンプリングを可能にするように動かすことを可能にした。さらに、デザインプロトコル中に剛体最小化を可能にした。ヘテロ二量体に存在する明白な水素結合ネットワークのアミノ酸同一性は、配列最適化中、それらの元の原子配置に固定および束縛され、最終的な最小化ステップの間にのみ移動を可能にした。
側鎖－側鎖相互作用エネルギーおよびデザインされたスキャフォールドの安定性を最大化するために、スコア関数「ｒｅｆ２０１５」または「ベータ＿ｎｏｖ１６」または「ベータ＿ｇｅｎｐｏｔ」を用いるＲｏｓｅｔｔａ（商標）組み合わせ配列最適化を使用して、複合体の界面側鎖をデザインした。配列最適化の間、デザインされたスキャフォールドの主鎖は、可能な側鎖のより細かいサンプリングを可能にするように動かすことを可能にした。さらに、デザインプロトコル中に剛体最小化を可能にした。ヘテロ二量体に存在する明白な水素結合ネットワークのアミノ酸同一性は、配列最適化中、それらの元の原子配置に固定および束縛され、最終的な最小化ステップの間にのみ移動を可能にした。
【0084】
一般に、埋没表面積あたりの界面エネルギー（＜＝－２５Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー単位（ＲＥＵ））、界面形状の相補性（＞＝０．６）、界面埋没表面積（＞＝１２００A２）、残留エネルギーあたりの平均（＜＝－２ＲＥＵ）および界面にある原子に埋没して満たされていない極性の数（＜＝３）の点で最良のデザインが、合成遺伝子として順序付けするためのデザインを選択する前に視覚的に検査された。追加のフィルタリングステップとしてのｈＴｆＲバインダについて、複数の独立したＲｏｓｅｔｔａ（商標）折り畳みシミュレーションを実行して、我々のデザインした配列がオフターゲット最小値なしで、最も低いエネルギー構造に折り畳まれるかどうかを評価した。
【0085】
主鎖生成およびスキャフォールドデザイン
第１のｈＴｆＲバインダの基礎として機能するデノボデザインされたフェレドキシン様スキャフォールドは、ブループリントベースの主鎖生成を使用して変更および伸長された。主鎖生成は、二次構造要素を接続するために理想化された標準ループのみを含むように偏っていた。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）組み合わせ配列最適化を使用して、新規主鎖の配列をデザインした。Ｒｏｓｅｔｔａ折り畳みシミュレーションにおいてデザインされた構造に折り畳まれた低エネルギーデザインを選択し、ｈＴｆＲバインダのためのスキャフォールドとして使用した。
第１のｈＴｆＲバインダの基礎として機能するデノボデザインされたフェレドキシン様スキャフォールドは、ブループリントベースの主鎖生成を使用して変更および伸長された。主鎖生成は、二次構造要素を接続するために理想化された標準ループのみを含むように偏っていた。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）組み合わせ配列最適化を使用して、新規主鎖の配列をデザインした。Ｒｏｓｅｔｔａ折り畳みシミュレーションにおいてデザインされた構造に折り畳まれた低エネルギーデザインを選択し、ｈＴｆＲバインダのためのスキャフォールドとして使用した。
【0086】
タンパク質精製および発現
デザインされたタンパク質をコードする合成遺伝子およびそれらの変異体をＩＤＴ ＤＮＡテクノロジーズまたはジェンスクリプトから購入した。配列は、Ｎ末端ヒスチジンタグとそれに続くＴＥＶ開裂部位を含んでいた。全遺伝子は、５０×５０５２、２０ｍＭ ＭｓＳＯ４および微量金属ミクスが添加されたＴＢＩＩ培地（Ｍｐｂｉｏ）中、自己誘導により発現された。発現は、３７度で一晩または３７度で６～８時間の初期増殖後に１８～２５度で一晩の抗生物質選択下で可能であった。
デザインされたタンパク質をコードする合成遺伝子およびそれらの変異体をＩＤＴ ＤＮＡテクノロジーズまたはジェンスクリプトから購入した。配列は、Ｎ末端ヒスチジンタグとそれに続くＴＥＶ開裂部位を含んでいた。全遺伝子は、５０×５０５２、２０ｍＭ ＭｓＳＯ４および微量金属ミクスが添加されたＴＢＩＩ培地（Ｍｐｂｉｏ）中、自己誘導により発現された。発現は、３７度で一晩または３７度で６～８時間の初期増殖後に１８～２５度で一晩の抗生物質選択下で可能であった。
【0087】
次に、細胞を遠心分離により回収し、プロテアーゼ阻害剤（サーモサイエンティフィック）およびウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ（シグマ－アルドリッチ）を含む溶解緩衝液（１００ｍＭトリスｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０）中での細胞の再懸濁後の超音波処理により溶解した。続いて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィによりタンパク質を精製した。清澄化した溶解物を２～４ｍｌのニッケルＮＴＡビーズ（キアゲン）に適用し、２０分間バッチでインキュベートしてから、ビーズを１０～２０カラム体積の溶解緩衝液で洗浄した。デザインを溶出緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ８．０）中で溶出させ、その後、透析緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に対して一晩透析する間、にヒスチジンタグＴＥＶプロテアーゼを使用してヒスチジンタグを開裂した。ＴＥＶ開裂試料のために翌日第２のＩＭＡＣ精製を実行して未開裂タンパク質およびＴＥＶプロテアーゼを捕捉した。最後に、ＳＥＣ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）のいずれかでのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用してデザインを仕上げた。ピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳにより検証し、１～１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、４度で貯蔵するか、－８０での貯蔵のために液体窒素中で急速冷凍した。
【0088】
ヒトトランスフェリン受容体１エクトドメイン（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６－１）を、ダイダロス発現システムを使用して、融合タンパク質（ＩｇＫ－ｓＦＬＡＧ－Ｈｉｓ－Ｓｃｎ－ＴＥＶ－ＴｆＲ１－ｈｉｓ－Ａｖｉｎ）として発現した２０。Ｎ末端発現タグをＴＥＶで開裂した後、タンパク質をＳＥＣによりさらに精製した。インビトロビオチン化キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用して、ピーク画分をビオチン化した。ＳＥＣ緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬによりビオチン化ＴｆＲをさらに精製した。ピーク画分を約１．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、急速冷凍し、－８０度で貯蔵した。
【0089】
円二色性
光路長１ｍｍのキュベット中、０．３２ｍｇ／ｍｌ（化学的溶融物）または０．４ｍｇ／ｍｌ（温度溶融物）のタンパク質濃度で、ＣＤスペクトルをＪ－１５００機器（Ｊａｓｃｏ、イーストン、ＭＤ）で記録した。温度溶融物について、データを２５℃から９５℃の間で２度ごとに２２０ｎｍで記録し、ＤＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中、波長スキャン（１９０～２６０ｎｍ）を１０℃ごとに記録した。グアニジン－ＨＣｌ緩衝液の存在下、２５℃で、化学変性波長スキャンを１９０～２６０ｎｍの間で記録した。化学変性溶融物を、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して以下のモデル２１にフィッティングし、ｍ値、ΔＯ、ＳN、ＳDおよび変性値の中点（ＣＭ）を取得する間、データを２２０ｎｍで記録した。
光路長１ｍｍのキュベット中、０．３２ｍｇ／ｍｌ（化学的溶融物）または０．４ｍｇ／ｍｌ（温度溶融物）のタンパク質濃度で、ＣＤスペクトルをＪ－１５００機器（Ｊａｓｃｏ、イーストン、ＭＤ）で記録した。温度溶融物について、データを２５℃から９５℃の間で２度ごとに２２０ｎｍで記録し、ＤＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中、波長スキャン（１９０～２６０ｎｍ）を１０℃ごとに記録した。グアニジン－ＨＣｌ緩衝液の存在下、２５℃で、化学変性波長スキャンを１９０～２６０ｎｍの間で記録した。化学変性溶融物を、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して以下のモデル２１にフィッティングし、ｍ値、ΔＯ、ＳN、ＳDおよび変性値の中点（ＣＭ）を取得する間、データを２２０ｎｍで記録した。
【0090】
【数1】
【0091】
【数2】
【0092】
ここで、Ｓは観察されたシグナル、ＳＮは折り畳まれたベースラインのシグナル、およびＳＤは変性されたベースラインのシグナルである。ＣＭは以下により得られた。
【0093】
【数3】
【0094】
ライブラリ生成
第１世代ｈＴｆＲバインダについての遺伝子ライブラリを、遺伝子の増幅を可能にする隣接アダプタ配列と一緒にアジレント・テクノロジーからオーダーした。Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ（商標）レディミクス（カパ・バイオシステムズ）を使用するｑＰＣＲを実行して、形質転換効率を低下させる過剰増幅を防止するためにライブラリを増幅させた。増幅およびＤＮＡゲル電気泳動の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を使用してＤＮＡを精製し、第２のｑＰＣＲ増幅ラウンドに供し、ｐＥＴＣＯＮ（商標）アダプタをＤＮＡ両端に追加し、酵母表面ディスプレイベクターｐＥＴＣＯＮ（商標）へのクローニングを促進した。この遺伝子プールをゲル抽出により再度精製した。
第１世代ｈＴｆＲバインダについての遺伝子ライブラリを、遺伝子の増幅を可能にする隣接アダプタ配列と一緒にアジレント・テクノロジーからオーダーした。Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ（商標）レディミクス（カパ・バイオシステムズ）を使用するｑＰＣＲを実行して、形質転換効率を低下させる過剰増幅を防止するためにライブラリを増幅させた。増幅およびＤＮＡゲル電気泳動の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を使用してＤＮＡを精製し、第２のｑＰＣＲ増幅ラウンドに供し、ｐＥＴＣＯＮ（商標）アダプタをＤＮＡ両端に追加し、酵母表面ディスプレイベクターｐＥＴＣＯＮ（商標）へのクローニングを促進した。この遺伝子プールをゲル抽出により再度精製した。
【0095】
２ＤＳ２５部位飽和突然変異誘発ライブラリは、２ＤＳ２５遺伝子の各コドンでオーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成された。無作為化プライマをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＤＮＡゲル電気泳動による所望の挿入サイズの検証後、２回目のＰＣＲを実行してｐＥＴＣＯＮ（商標）アダプタをＤＮＡ両端に追加し、クローニングを促進した。両方のライブラリについて、上述したように２２、線形ライブラリＤＮＡを線形化（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）ｐＥＴＣＯＮ（商標）酵母表面ディスプレイベクターと一緒に用いて、ＥＢＹ１００エレクトロコンピテント酵母細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。
【0096】
酵母表面ディスプレイおよびディープシーケンシング
Ｍｙｃタグ付きデザインをＡｇａ２ｐ融合タンパク質として酵母表面に表示させた。ライブラリの多様性は、すべての場合において１０６未満であった。酵母細胞を、Ｃ－ｔｒｐ－ｕｒａ＋２％グルコース培地中、１６～２４時間、３０℃で増殖させてから、細胞をＳＧＣＡＡ培地に３０℃で１６～２４時間移すことにより発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳＦ（１％ウシ血清アルブミンが添加されたＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、細胞をビオチン化標的と０．５～２時間、室温でインキュベートしてから、ＰＢＳＦで２回洗浄した。次に、これらの細胞を、ストレプトアビジン－フィコエリスリンおよび抗Ｍｙｃ抗体をコンジュゲートしたＦＩＴＣ（ＩＣＬ Ｌａｂ）で２０分間標識してから、再度洗浄した。結合シグナルについての初期スクリーニングのため、ビオチン化標的をストレプトアビジン－フィコエリスリン（インビトロジェン）と１０分間プレインキュベートしてから、複合体を細胞に添加して強烈な結合条件を使用することにより弱いバインダの同定を可能にした。ＦＩＴＣおよびフィコエリスリン（ＰＥ）シグナルを使用して、ソニーＳＨ８００セルソーターまたはＡｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料をソートまたは測定した。ソートされた細胞を回収し、Ｃ－ｔｒｐ－ｕｒａ＋２％グルコース培地中、２４～４８時間増殖させてから、後での分析のために－８０℃で凍結した。ＳＳＭライブラリは、１００ｎＭ、２０ｎＭおよび７ｎＭのｈＴｆＲに対して選択されたが、組み合わせライブラリは、２５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５０ｎＭおよび０．１２５ｎＭのｈＴｆＲに対して選択された。
Ｍｙｃタグ付きデザインをＡｇａ２ｐ融合タンパク質として酵母表面に表示させた。ライブラリの多様性は、すべての場合において１０６未満であった。酵母細胞を、Ｃ－ｔｒｐ－ｕｒａ＋２％グルコース培地中、１６～２４時間、３０℃で増殖させてから、細胞をＳＧＣＡＡ培地に３０℃で１６～２４時間移すことにより発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳＦ（１％ウシ血清アルブミンが添加されたＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、細胞をビオチン化標的と０．５～２時間、室温でインキュベートしてから、ＰＢＳＦで２回洗浄した。次に、これらの細胞を、ストレプトアビジン－フィコエリスリンおよび抗Ｍｙｃ抗体をコンジュゲートしたＦＩＴＣ（ＩＣＬ Ｌａｂ）で２０分間標識してから、再度洗浄した。結合シグナルについての初期スクリーニングのため、ビオチン化標的をストレプトアビジン－フィコエリスリン（インビトロジェン）と１０分間プレインキュベートしてから、複合体を細胞に添加して強烈な結合条件を使用することにより弱いバインダの同定を可能にした。ＦＩＴＣおよびフィコエリスリン（ＰＥ）シグナルを使用して、ソニーＳＨ８００セルソーターまたはＡｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料をソートまたは測定した。ソートされた細胞を回収し、Ｃ－ｔｒｐ－ｕｒａ＋２％グルコース培地中、２４～４８時間増殖させてから、後での分析のために－８０℃で凍結した。ＳＳＭライブラリは、１００ｎＭ、２０ｎＭおよび７ｎＭのｈＴｆＲに対して選択されたが、組み合わせライブラリは、２５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５０ｎＭおよび０．１２５ｎＭのｈＴｆＲに対して選択された。
【0097】
ディープシーケンシングのためのＤＮＡ調製を以前説明２３されたように実行した。６００サイクル試薬キット（イルミナ）を用いるＭｉＳｅｑ（商標）シーケンサーを使用して、ＤＮＡをシーケンシングした。ＰＥＡＲ（商標）ソフトウエア２４を用いてリードをアラインメントした。Ｅｎｒｉｃｈ（商標）ソフトウエア２５に基づくカスタムスクリプトを使用して、配列を最後に分析した。
【0098】
組み合わせ変異体生成
部位飽和突然変異誘発ライブラリのディープシーケンシング分析の後、我々は、個々の突然変異体が結合を改善する１３の位置を同定した。結合親和性をさらに最適化するために、２つのアプローチに従った。最初に、選択された突然変異体のサブセットを手動で組み合わせ、結合アッセイにおける試験のために合成遺伝子として順序付けした。このアプローチにより２ＤＳ２５．３が生じた。
部位飽和突然変異誘発ライブラリのディープシーケンシング分析の後、我々は、個々の突然変異体が結合を改善する１３の位置を同定した。結合親和性をさらに最適化するために、２つのアプローチに従った。最初に、選択された突然変異体のサブセットを手動で組み合わせ、結合アッセイにおける試験のために合成遺伝子として順序付けした。このアプローチにより２ＤＳ２５．３が生じた。
【0099】
第２のアプローチにおいて、我々は、組み合わせライブラリを生成した。我々は、１３の指定位置について縮退コドンを含む２つの重複しているＵｌｔｒａｍｅｒ（商標）オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を順序付けした。Ｕｌｔｒａｍｅｒ（商標）フラグメントを集め、ＰＣＲ増幅してから上記のようにエレクトロポレーションを行った。サンガーシーケンシングにより酵母表面ディスプレイにおいて最良のバインダを選択した後、デザインは、合成遺伝子として順序付けされ、バイオレイヤー干渉法結合アッセイにおける試験のために精製した。
【0100】
驚いたことに、酵母表面上の高親和性変異体は、バイオレイヤー干渉法アッセイで中程度の親和性でのみ結合した。これらの変異体においてオフレートが低下しても、この低下は、一般に、オンレートの代償的な低下を伴っていた。オンレートが速くオフレートが遅い高親和性変異体を作成するため、我々は、ＳＳＭ、２ＤＳ２５．３および２ＤＳ２５．５を生じる組み合わせライブラリ突然変異体の位置を手動で組み合わせた。
【0101】
バイオレイヤー干渉法
ストレプトアビジンコートバイオセンサを使用して、結合アッセイをＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（商標）ＢＬＩシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、メンローパーク、ＣＡ）で実行した。バイオセンサを、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ）が添加されたＯｃｔｅｔ（商標）緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で少なくとも１０分間平衡化した。各実験について、ビオチン化ｈＴｆＲエクトドメインは、バイオセンサを１０～５０ｎＭのｈＴｆＲを含む溶液に２００～５００秒間浸漬することにより、バイオセンサ上に固定化された。続いて、新しいｏｃｔｅｔ緩衝液に浸漬し、緩衝液中で２００秒間ベースラインを確立した。１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で回転しながら、２５℃で滴定を実行した。バイオセンサ上のＴｆＲへのデザインの会合は、９００秒間、ｏｃｔｅｔ緩衝液で希釈された、デザインされたタンパク質を含む溶液にバイオセンサを浸漬することにより可能になった。平衡に到達した後、解離反応速度を９００～１５００秒間モニターするためにバイオセンサを新しい緩衝液溶液に浸漬した。単一濃度アッセイにおいて、Ｏｃｔｅｔ緩衝液で希釈した１μＭのデザインを使用した。平衡結合滴定のため、キネティックデータを回収し、１：１結合モデルを使用して処理し、メーカーのデータ分析ソフトウエア９．１を使用して平衡結合応答Ｒｅｑを取得した。再現性を確実にするために、異なるｈＴｆＲ固定化密度下で、異なるタンパク質調製物を用いる複数の結合実験。代表的な結合曲線は、本文に提示されている。各デザインについて、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて７つのＲｅｑ値を飽和結合曲線にフィッティングし、Ｂｍａｘおよび平衡解離定数ＫＤを取得した。
ストレプトアビジンコートバイオセンサを使用して、結合アッセイをＯｃｔｅｔＲＥＤ９６（商標）ＢＬＩシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、メンローパーク、ＣＡ）で実行した。バイオセンサを、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ）が添加されたＯｃｔｅｔ（商標）緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で少なくとも１０分間平衡化した。各実験について、ビオチン化ｈＴｆＲエクトドメインは、バイオセンサを１０～５０ｎＭのｈＴｆＲを含む溶液に２００～５００秒間浸漬することにより、バイオセンサ上に固定化された。続いて、新しいｏｃｔｅｔ緩衝液に浸漬し、緩衝液中で２００秒間ベースラインを確立した。１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で回転しながら、２５℃で滴定を実行した。バイオセンサ上のＴｆＲへのデザインの会合は、９００秒間、ｏｃｔｅｔ緩衝液で希釈された、デザインされたタンパク質を含む溶液にバイオセンサを浸漬することにより可能になった。平衡に到達した後、解離反応速度を９００～１５００秒間モニターするためにバイオセンサを新しい緩衝液溶液に浸漬した。単一濃度アッセイにおいて、Ｏｃｔｅｔ緩衝液で希釈した１μＭのデザインを使用した。平衡結合滴定のため、キネティックデータを回収し、１：１結合モデルを使用して処理し、メーカーのデータ分析ソフトウエア９．１を使用して平衡結合応答Ｒｅｑを取得した。再現性を確実にするために、異なるｈＴｆＲ固定化密度下で、異なるタンパク質調製物を用いる複数の結合実験。代表的な結合曲線は、本文に提示されている。各デザインについて、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて７つのＲｅｑ値を飽和結合曲線にフィッティングし、Ｂｍａｘおよび平衡解離定数ＫＤを取得した。
【0102】
【数4】
【0103】
参考文献
【表4】
【0104】
試験されたトランスフェリン受容体結合タンパク質の詳細
２ＤＳ２５タイプ（上述した配列）
２ＤＳ２５変異体は、２ＤＳ２５に基づく単一点突然変異体である。点突然変異体は、ＴｆＲ結合を改善する。すべての２ＤＳ２５タイプデザインは、同じトポロジー、長さおよび構造を有している。位置は同等である、すなわち２ＤＳ２５の２７位は、デカルト空間で２ＤＳ２５．６と同じ位置であるが、その位置でのアミノ酸同一性は、変異体間で異なる可能性がある。
２ＤＳ２５タイプ（上述した配列）
２ＤＳ２５変異体は、２ＤＳ２５に基づく単一点突然変異体である。点突然変異体は、ＴｆＲ結合を改善する。すべての２ＤＳ２５タイプデザインは、同じトポロジー、長さおよび構造を有している。位置は同等である、すなわち２ＤＳ２５の２７位は、デカルト空間で２ＤＳ２５．６と同じ位置であるが、その位置でのアミノ酸同一性は、変異体間で異なる可能性がある。
【0105】
第３世代３ＤＳタイプのバインダ（上述した配列）
これらのデザインは、２ＤＳ２５タイプデザインに基づいており、したがって、２ＤＳ２５タイプデザインと同じ二次構造組織および結合モードを有している。ＴｆＲに直接接触する要素および残基は、Ｈ２、Ｅ１およびＨ４にある。
これらのデザインは、２ＤＳ２５タイプデザインに基づいており、したがって、２ＤＳ２５タイプデザインと同じ二次構造組織および結合モードを有している。ＴｆＲに直接接触する要素および残基は、Ｈ２、Ｅ１およびＨ４にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】