(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-28
(54)【発明の名称】ＦＬＴ３リガンド融合タンパク質及び使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230821BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230821BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230821BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230821BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230821BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230821BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230821BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230821BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230821BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230821BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230821BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230821BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230821BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230821BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230821BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/47
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 A
C07K16/18
A61K39/395 N
A61K45/00
A61K39/395 T
A61K39/39
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023507882
(86)(22)【出願日】2021-08-05
(85)【翻訳文提出日】2023-04-04
(86)【国際出願番号】 US2021044586
(87)【国際公開番号】W WO2022031876
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】63/062,713
(32)【優先日】2020-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リウ， イーチン
(72)【発明者】
【氏名】ムシオン， クリスティーン カリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ベインブリッジ， トラヴィス ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】ホッセイニ， イーラジ
(72)【発明者】
【氏名】ラザー， グレゴリー アラン
(72)【発明者】
【氏名】コーエン， シヴァン
(72)【発明者】
【氏名】ケンバル， クリストファー チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】シャルトナー， ジル エム．
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C085AA14
4C085AA38
4C085BB31
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、エフェクターレス免疫グロブリンＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質のＦｌｔ３リガンドへの融合物、及びそれらを使用する方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エフェクターレスＦｃタンパク質を含むＦｃ融合タンパク質であって、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）タンパク質とエフェクターレスＦｃタンパク質とを含み、エフェクターレスＦｃタンパク質が残基配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり、配列番号１３の残基１３～１７がアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号１３の残基７６がグリシンである、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項2】
Ｆｌｔ３Ｌタンパク質が、ＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号４８）、ＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号４９）、ＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５０）、ＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５１）、ＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５２）又はＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含まない、請求項１に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項3】
Ｆｌｔ３Ｌが、配列番号２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項１又は２に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項4】
Ｆｌｔ３Ｌが、配列番号２２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項5】
Ｆｌｔ３Ｌが、配列番号２１のアミノ酸２７～１６７、２７～１６８、２７～１６９、２７～１７０、２７～１７１、２７～１７２、２７～１７３、２７～１７４、２７～１７５、２７～１７６、２７～１７７、２７～１７８、２７～１７９、２７～１８０、２７～１８１、２７～１８２、２７～１８３、２７～１８４、又は２７～１８５を含むタンパク質と少なくとも約９０％同一であるタンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項6】
エフェクターレスＦｃタンパク質のＮ末端が、ペプチド結合を介してＦｌｔ３Ｌタンパク質のＣ末端に連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項7】
融合タンパク質が、配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１３と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項8】
配列番号１２を含む野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＦｃエフェクター機能と比較して減弱されたＦｃエフェクター機能を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項9】
ＦｃエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が、インビトロアッセイにおいて、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１２）に融合した野生型Ｆｌｔ３Ｌを含むＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質によるインビトロアッセイにおける活性レベルの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以下の活性レベルで活性化する、請求項１～８のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項11】
Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端にシグナル配列をさらにコードする、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項12】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする、単離された核酸であって、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号４５を含む、単離された核酸。
【請求項13】
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項14】
請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｆｃ融合タンパク質を産生する方法。
【請求項15】
宿主細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
宿主細胞が大腸菌である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～８のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。
【請求項19】
第２の治療剤をさらに含む、請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項20】
第２の治療剤が、アジュバント、樹状成熟因子及び／又はチェックポイント阻害剤である、請求項１８又は１９に記載の医薬製剤。
【請求項21】
対象における樹状細胞（ＤＣ）の数を増殖させるための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法。
【請求項22】
約０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの用量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質又は請求項１８～２０のいずれか一項に記載の医薬製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを治療するための方法。
【請求項24】
約０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの用量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
第２の治療剤を対象に投与することをさらに含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
第２の治療剤が、アジュバント、樹状成熟因子及び／又はチェックポイント阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
ＤＣ成熟因子を投与することを含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ＤＣ成熟因子が、ポリＩＣ、ポリＩＣＬＣ、ＤＣ４０、放射線療法及び化学療法から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
チェックポイント阻害剤が、ＦｃエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
免疫チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ ９３６５５９、アテゾリズマブ、及びアベルマブからなる群から選択される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項32】
がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
対象が、チェックポイント阻害剤で以前に治療された、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
対象が、チェックポイント阻害剤の治療に応答しなかった、及び／又は、チェックポイント免疫療法の最後の用量を受けた後３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１年、１．５年若しくは２年よりも長い間、チェックポイント阻害剤の治療に応答しなかった、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
対象におけるがんが、免疫砂漠腫瘍を含むと特徴付けられている、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
残基配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む、エフェクターレスＦｃタンパク質であって、配列番号１３の残基１３～１７がアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含むか、又は配列番号１３の残基７６がグリシンである、エフェクターレスＦｃタンパク質。
【請求項37】
配列番号１３の残基１３～１７がアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号１３の残基７６がグリシンである、請求項３６に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質。
【請求項38】
配列番号１３と同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６又は３７に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質。
【請求項39】
配列番号２、４、５、６、１３又は１５と同一のアミノ酸配列を含む、エフェクターレスＦｃタンパク質。
【請求項40】
Ｆｃタンパク質が、配列番号１２を含む野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して減弱されている、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質。
【請求項41】
請求項１～９のいずれか一項に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質を含む、抗体。
【請求項42】
重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項43】
モノクローナル抗体である、請求項４１又は４２に記載の抗体。
【請求項44】
ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項４１又は４２に記載の抗体。
【請求項45】
二重特異性又は多重特異性抗体である、請求項４１又は４２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６２，７１３号の優先権及び利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６２，７１３号の優先権及び利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、２０２１年７月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、Ｐ３６２９８－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１２８，４１３バイトである。
本出願は、２０２１年７月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、Ｐ３６２９８－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１２８，４１３バイトである。
【0003】
発明の分野
本発明は、Ｆｌｔ３リガンド融合タンパク質及びその使用方法に関する。
本発明は、Ｆｌｔ３リガンド融合タンパク質及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
多数の研究が、がんの進行における免疫系成分の差次的存在の重要性を裏付けている（Ｊｏｃｈｅｍｓ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｍ，Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２３６（５）：５６７－５７９（２０１１））。臨床データは、高密度の腫瘍浸潤リンパ球が臨床転帰の改善に関連することを示唆している（Ｍｌｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．；３０：５－１２，（２０１１））。腫瘍免疫浸潤物には、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、肥満細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナイーブ及びメモリーリンパ球、Ｂ細胞及びエフェクターＴ細胞（Ｔリンパ球）が含まれ、これらは主に、腫瘍細胞によって発現される抗原の認識及びその後のＴ細胞による腫瘍細胞の破壊を担う。
多数の研究が、がんの進行における免疫系成分の差次的存在の重要性を裏付けている（Ｊｏｃｈｅｍｓ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｍ，Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２３６（５）：５６７－５７９（２０１１））。臨床データは、高密度の腫瘍浸潤リンパ球が臨床転帰の改善に関連することを示唆している（Ｍｌｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．；３０：５－１２，（２０１１））。腫瘍免疫浸潤物には、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、肥満細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナイーブ及びメモリーリンパ球、Ｂ細胞及びエフェクターＴ細胞（Ｔリンパ球）が含まれ、これらは主に、腫瘍細胞によって発現される抗原の認識及びその後のＴ細胞による腫瘍細胞の破壊を担う。
【0005】
がん細胞による抗原の提示及び腫瘍細胞に対して潜在的に反応し得る免疫細胞の存在にもかかわらず、多くの場合、免疫系は活性化されないか、又は肯定的に抑制される。腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を回避するためのいくつかの免疫調節機構を発達させる。全体的な結果は、損なわれたＴ細胞応答及びアポトーシスの誘導又はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍免疫能の低下である。抗原提示機能及び樹状細胞（ＤＣ）の阻害は、抗腫瘍免疫の回避にさらに寄与する（Ｇｅｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５（６），１８５３－１８６３（２００４）。
【0006】
さらに、腫瘍微小環境の局所免疫抑制性は、標的抗原を発現しないがん細胞亜集団の回避をもたらし得る。したがって、免疫系の抗腫瘍活性の保存及び／又は回復を促進するであろうアプローチを見出すことは、かなりの治療上の利益になるであろう。
【0007】
免疫チェックポイントは、抗腫瘍免疫の腫瘍媒介性下方制御に関与している。Ｔ細胞機能不全は、ＣＤ２８ファミリー受容体のメンバーである阻害性受容体、ＣＴＬＡ－４及びプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）の誘導された発現と同時に起こることが実証されている。それにもかかわらず、近年の広範な研究にもかかわらず、臨床現場における免疫療法の成功は限られている。規制当局によって承認されている治療剤はほとんどなく、その中でも大多数の患者が恩恵を受けていない。近年、免疫チェックポイントは抗腫瘍免疫のダウンレギュレーションに関与しており、治療標的として使用されている。これらの所見は、がんに対する免疫系を利用するための新規な治療アプローチの開発の必要性を強調している。
【0008】
骨髄細胞の増殖を刺激するＩ型膜貫通タンパク質であるヒトＦｌｔ３Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）を１９９４年にクローニングした（Ｌｙｍａｎら、１９９４）。可溶性ｈＦｌｔ３Ｌの使用は、骨髄移植の準備における幹細胞動員、樹状細胞の増殖などのがん免疫療法、並びにワクチンアジュバントを含む様々な前臨床及び臨床状況において検討されている。しかし、Ｆｌｔ３Ｌを利用した医薬組成物は、臨床において第２相を超えたものがない。
【0009】
１つの課題は、Ｆｌｔ３Ｌリガンドへの曝露を最適化し、有害な副作用又は潜在的な好ましくない免疫学的効果を最小限に抑えながら最適な投薬レジメンを同定することである。曝露の調節は、例えば、投与レジメンを変化させ、投与量を変化させ、又は治療分子の薬物動態特性及び／又は薬力学特性を変更することによって行うことができる。がん患者の免疫療法を増強するのに利益のある有益なＰＫ／ＰＤ特性を有するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が本明細書で提供される。
【発明の概要】
【0010】
概要
本発明は、エフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質（エフェクターレス免疫グロブリンＦｃタンパク質に融合された活性Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）を含むＦｌｔ３リガンド融合タンパク質を含む）及びその使用方法を提供する。エフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、及びＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の使用のための方法は、がんの治療、特にチェックポイント免疫療法を受けている患者におけるがんの治療を含む。本発明はさらに、エフェクターレスＩｇＧ Ｆｃタンパク質を提供する。
本発明は、エフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質（エフェクターレス免疫グロブリンＦｃタンパク質に融合された活性Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）を含むＦｌｔ３リガンド融合タンパク質を含む）及びその使用方法を提供する。エフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、及びＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の使用のための方法は、がんの治療、特にチェックポイント免疫療法を受けている患者におけるがんの治療を含む。本発明はさらに、エフェクターレスＩｇＧ Ｆｃタンパク質を提供する。
【0011】
一態様では、残基配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７がアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含むか、又は配列番号１３の残基７６がグリシンである、エフェクターレスＦｃタンパク質が提供される。他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号１３の残基７６はグリシンである。さらに他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と同一のアミノ酸配列を含む。明確性のために、いくつかの実施形態では、配列番号１３の残基１３～１７がＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含む場合、本明細書ではこれをＰＶＡ＃バリアントを包含すると呼んでもよく、配列番号１３の残基７６がグリシンである場合、本明細書ではこれをＮ２９７Ｇ突然変異と呼んでもよく、２９７は抗体のＥＵナンバリングを指す。
【0012】
いくつかの実施形態では、エフェクターレスＦｃタンパク質は、配列番号２、４、５、６、１３又は１５のタンパク質配列を含む。
【0013】
さらに他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質は、配列番号１２を含む野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して減弱されている。
【0014】
いくつかの態様では、残基配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７がアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含むか、又は配列番号１３の残基７６がグリシンである、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体が提供される。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗体はＦｌｔ３Ｌ受容体に結合する。
【0016】
いくつかの実施形態では、抗体はチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、及び／又はＣＴＬＡ－４である。いくつかの実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。
【0017】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質及び第２のタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、エフェクターレスＦｃタンパク質及び第２のタンパク質は、互いに共有結合している。他の実施形態では、エフェクターレスＦｃタンパク質と第２のタンパク質とは、ジスルフィド結合によって連結されている。
【0018】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質をコードする、単離された核酸、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又は本明細書及び上記に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、配列番号２、４、５、６、１３又は１５のタンパク質配列をコードする。他の実施形態では、単離された核酸は、エフェクターレスＦｃタンパク質のＮ末端にシグナル配列をさらにコードする。好ましい例では、単離された核酸は、配列番号１３のタンパク質配列をコードする。
【0019】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質をコードする核酸、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又は本明細書及び上記に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を含む、宿主細胞が提供される。
【0020】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質をコードする核酸、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を含む宿主細胞を培養して各タンパク質を産生することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を宿主細胞から回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞である。他の実施形態では、真核細胞はＣＨＯ細胞である。
【0021】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質をコードする核酸、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を含む、宿主細胞が提供される。
【0022】
いくつかの態様では、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質をコードする核酸、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を含む宿主細胞を培養して、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を産生することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本開示のエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体、及び／又はエフェクターレスＦｃタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を宿主細胞から回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞である。他の実施形態では、真核細胞はＣＨＯ細胞である。
【0023】
一態様では、エフェクターレスＦｃタンパク質（配列番号１３又はそのバリアント）及び第２のタンパク質を含む、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む融合タンパク質であって、第２のタンパク質が標的タンパク質に対するリガンドである融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、リガンドは、リガンドが標的タンパク質に結合すると、標的タンパク質を調節する。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質はＦｌｔ３Ｌである。他の実施形態では、標的タンパク質はＦｌｔ３Ｌ受容体である。好ましい実施形態では、第２のタンパク質は、エフェクターレスＦｃタンパク質のＮ末端である。
【0024】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＦｃタンパク質を含み、配列番号１３の残基１３～１７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、又は配列番号１３の残基７６はグリシンである。他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号１３の残基７６はグリシンである。さらに他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と同一のアミノ酸配列を含む。明確性のために、いくつかの実施形態では、配列番号１３の残基１３～１７がＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含む場合、本明細書ではこれをＰＶＡ＃バリアントを包含すると呼んでもよく、配列番号１３の残基７６がグリシンである場合、本明細書ではこれをＮ２９７Ｇ突然変異と呼んでもよく、２９７は抗体のＥＵナンバリングを指す。
【0025】
一態様では、融合タンパク質は、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）及びエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２を含む野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して減弱されたエフェクター機能を有する。
【0026】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１の残基２７～１６７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、１、２又は３個のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎタンパク質に結合するＦｌｔ３Ｌの領域には存在しない。他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌタンパク質は、配列番号２２の配列を含む。
【0027】
Ｆｌｔ３Ｌ～Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１のアミノ酸２７～１６７、２７～１６８、２７～１６９、２７～１７０、２７～１７１、２７～１７２、２７～１７３、２７～１７４、２７～１７５、２７～１７６、２７～１７７、２７～１７８、２７～１７９、２７～１８０、２７～１８１、２７～１８２、２７～１８３、２７～１８４、又は２７～１８５を含むタンパク質を含む。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の好ましい実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１のアミノ酸２７～１６７又は配列番号２１のアミノ酸２７～１６８からなるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｌｔ３Ｌは、配列番号２１の１６８～２３５、１６９～２３５、１７０～２３５、１７１～２３５、１７２～２３５、１７３～２３５を含まない。さらに他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｌｔ３Ｌは、アミノ酸配列ＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号４８）、ＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号４９）、ＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５０）、ＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５１）、ＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５２）又はＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰＰ（配列番号５３）を含まない。
【0028】
Ｆｌｔ３Ｌ～Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１のアミノ酸２７～１６７、２７～１６８、２７～１６９、２７～１７０、２７～１７１、２７～１７２、２７～１７３、２７～１７４、２７～１７５、２７～１７６、２７～１７７、２７～１７８、２７～１７９、２７～１８０、２７～１８１、２７～１８２、２７～１８３、２７～１８４、又は２７～１８５を含むタンパク質と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるタンパク質を含む。
【0029】
Ｆｌｔ３Ｌ～Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、配列番号２１のアミノ酸２４～１６７、２５～１６７、２６～１６７、２４～１６８、２５～１６８、２６～１６８、２４～１６９、２５～１６９、又は２６～１６９を含むタンパク質と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるタンパク質を含む。
【0030】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含むか、又は配列番号１３の残基７６はグリシンである。他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１３の残基１３～１７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号１３の残基７６はグリシンである。さらに他の実施形態では、エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１３と同一のアミノ酸配列を含む。明確性のために、いくつかの実施形態では、配列番号１３の残基１３～１７がＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含む場合、本明細書ではこれをＰＶＡ＃バリアントを包含すると呼んでもよく、配列番号１３の残基７６がグリシンである場合、本明細書ではこれをＮ２９７Ｇ突然変異と呼んでもよく、２９７は抗体のＥＵナンバリングを指す。
【0031】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２６の残基１５４～１５８はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号２６の残基２１７はグリシンである。
【0033】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２５の残基１５５～１５９はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号２５の残基２１８はグリシンである。
【0034】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３２の残基１５３～１５７はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号３２の残基２１６はグリシンである。
【0035】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３３の残基１５２～１５６はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号３３の残基２１５はグリシンである。
【0036】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３４の残基１５１～１５４はアミノ酸配列ＰＶＡＧＰ（配列番号２０）を含み、かつ配列番号３４の残基２１４はグリシンである。
【0037】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２７～配列番号３１及び配列番号３５～配列番号４４からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロアッセイにおいて、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１２）に融合した野生型Ｆｌｔ３Ｌを含むＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質によるインビトロアッセイにおける活性レベルの約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％未満の活性レベルで活性化する。他の実施形態では、ＡＤＣＰインビトロアッセイは、エフェクター細胞としての初代マクロファージ及び標的細胞としてのＦｌｔ３Ｌ受容体を発現する細胞株の使用を含む。さらに他の実施形態では、初代マクロファージは、健康なヒトドナー由来の単球由来マクロファージである。さらに他の実施形態では、標的細胞はヒト急性リンパ芽球性白血病細胞、任意に、ＳＥＭ細胞株細胞である。いくつかの実施形態では、活性は、パーセント食作用（％ＡＤＣＰ）として測定され、食作用は、標的細胞からの視覚的マーカーの取り込みを測定することによって決定される。
【0039】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、融合タンパク質が投与された対象におけるＤＣ増殖を活性化する。他の実施形態では、ＤＣ増殖は、対象の全血中で測定される。さらに他の実施形態では、ＤＣ増殖は、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、ＤＣ増殖は、異種タンパク質に融合していないＦｌｔ３Ｌタンパク質の投与から生じるＤＣ増殖の少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍又は１０，０００倍である。他の実施形態では、異種タンパク質は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃタンパク質である。さらに他の実施形態では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃタンパク質は、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌタンパク質は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質又はヒト血清アルブミンタンパク質に融合されない。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類、ウサギ、カニクイザル又はヒトである。他の実施形態では、げっ歯類はマウス又はラットである。
【0040】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４を有するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の熱安定性と比較して、増加した熱安定性を有する。他の実施形態では、熱安定性は、示差走査蛍光測定法を使用して測定される。さらに他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４を有するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＴｍよりも少なくとも１．５℃、２℃、３℃、４℃又は５℃高い融解温度（Ｔｍ）を有する。
【0041】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｌｔ３Ｌドメインに単一のアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、置換はインビボ免疫原性を低下させるが、機能活性を１０％、２０％又は３０％を超えて低下させない。他の実施形態では、機能活性アッセイは、動物における樹状細胞の増殖である。
【0042】
いくつかの態様では、本明細書及び上記に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする、単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４のタンパク質配列をコードする。他の実施形態では、単離された核酸は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端にあるシグナル配列をさらにコードする。好ましい例では、単離された核酸は、配列番号４５のタンパク質配列をコードする。
【0043】
いくつかの態様では、本明細書及び上記に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞が提供される。
【0044】
いくつかの態様では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が産生されるように、エフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞からＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞である。他の実施形態では、真核細胞はＣＨＯ細胞である。
【0045】
いくつかの態様では、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤が提供される。
【0046】
幾つかの実施形態では、医薬製剤は、追加の治療剤をさらに含む。さらに他の実施形態では、追加の医薬品は、アジュバント、樹状細胞成熟因子、及び／又はチェックポイント阻害剤である。
【0047】
いくつかの態様では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を投与された対象における樹状細胞（ＤＣ）の数を増殖させるための方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＤＣはｃＤＣ１及び／又はｃＤＣ２細胞である。他の実施形態では、本方法は、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、本方法は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象にＦｌｔ３Ｌ融合タンパク質を約１日１回、週に１回、週に２回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、又は隔月に１回投与することを含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、本方法は、静脈内投与、非経口投与、筋肉内注射、又は皮下注射によってＦｌｔ３Ｌ融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【0051】
いくつかの態様では、がんを治療するための方法であって、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、治療有効量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を投与することと、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することとを含む。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の効果を抑制又は阻害する。さらに他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ９３６５５９、アテゾリズマブ、又はアベルマブである。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。
【0052】
いくつかの実施形態では、本方法は、樹状細胞（ＤＣ）成熟因子を投与することをさらに含む。他の実施形態では、ＤＣ成熟因子は、ポリＩＣ、ポリＩＣＬＣ、ＤＣ４０アゴニスト、放射線療法及び化学療法から選択される。他の実施形態では、ＤＣ成熟因子は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に個体に投与される。特定の実施形態では、ＤＣ成熟因子は放射線療法である。いくつかの実施形態では、本方法は、対象がＤＣ成熟因子を受けた後にＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、対象がＤＣ成熟因子を受ける前にＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、対象がＤＣ成熟因子を受け取るのとほぼ同時にＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0054】
いくつかの実施形態では、対象は、チェックポイント阻害剤で以前に治療された。他の実施形態では、対象は、少なくとも又は約３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１年、１．５年、又は２年間にわたって投与されたチェックポイント阻害剤の治療に応答しなかった。
【0055】
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも又は約３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１年、１．５年、又は２年の期間にわたって投与された放射線療法で治療された。
【0056】
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも又は約３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１年、１．５年、又は２年の期間にわたって投与された化学療法で治療された。
【0057】
いくつかの実施形態では、対象におけるがんは、免疫砂漠腫瘍を含むと特徴付けられている。他の実施形態では、がんは、応答性炎症腫瘍（「ホット腫瘍」）と比較して炎症が低減した腫瘍（「コールド腫瘍」）を含むものとして特徴付けられている。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】図１は、野生型又はバリアントＦｃドメインを有する抗Ｈｅｒ２抗体による異なるレベルのＡＤＣＰ活性を示す。初代Ｍ１マクロファージをＳｋＢｒ３標的細胞とインキュベートした。ｘ軸は抗体濃度を示し、ｙ軸はパーセント食作用を示す。
【図2A-E】図２Ａ～図２Ｅは、野生型又はバリアントＦｃドメインを有する抗Ｈｅｒ２抗体を初代Ｍ１マクロファージ及びＳｋＢｒ３標的細胞とインキュベートした場合のマクロファージによるサイトカイン放出を示す。ｘ軸は抗体濃度を示し、ｙ軸はｐｇ／ｍｌサイトカインを示す。図２Ａ：Ｇ－ＣＳＦ；図２Ｂ：ＧＭ－ＣＳＦ；図２Ｃ：ＩＬ－１０；図２Ｄ：ＩＬ－１ｒａ；図２Ｅ：ＩＬ－６。
【図2F-J】図２Ｆ～図２Ｊは、野生型又はバリアントＦｃドメインを有する抗Ｈｅｒ２抗体を初代Ｍ１マクロファージ及びＳｋＢｒ３標的細胞とインキュベートした場合のマクロファージによるサイトカイン放出を示す。ｘ軸は抗体濃度を示し、ｙ軸はｐｇ／ｍｌサイトカインを示す。図２Ｆ：ＩＬ－８；図２Ｇ：ＭＩＰ－１α；図２Ｈ：ＭＩＰ－１β；図２Ｉ：ＲＡＮＴＥＳ；図２Ｊ：ＴＮＦα。
【図3A-C】図３Ａ～図３Ｃは、凝集及びジスルフィド結合特性に関するＦｌｔ３Ｌ－ＦｃＮＧ２ＬＨ融合タンパク質の異なる特徴を示す。ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞で発現されたタンパク質のｈＦＬＴ３Ｌ．Ｓ１６３．ｎｏ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃凝集及び二量体形成の分析をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示す（図３Ａ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図３Ｂ：２９３細胞及び（図３Ｃ：ＨＥＫ２９７細胞）。図３Ｂ～３Ｃに関して、ｘ軸は時間であり、ｙ軸はｍＡＵである。
【図3D-F】図３Ｄ～図３Ｆは、凝集及びジスルフィド結合特性に関するＦｌｔ３Ｌ－ＦｃＮＧ２ＬＨ融合タンパク質の異なる特徴を示す。ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞で発現されたタンパク質のｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．５ａａ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃凝集及び二量体形成の分析をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示す（図３Ｄ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図３Ｅ：２９３細胞及び（図３Ｆ：ＨＥＫ２９７細胞）。図３Ｅ～３Ｆに関して、ｘ軸は時間であり、ｙ軸はｍＡＵである。
【図4】図４Ａ～図４Ｂは、Ｆｌｔ３ＬがインビトロでＯＣＩ－ＡＭＬ５細胞の増殖を誘導することを示す。図４Ａは、ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨ及びｇＣＤＸ－３０１の用量応答曲線を示す。示されるデータは、３連の値の平均±ＳＤである。データを、最大（１００％）応答としての１０ｕｇ／ｍＬのｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨに対して正規化した。図４Ｂは、ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨ及びｇＣＤＸ－３０１のＥＣ５０効力を示す。結果は、平均±ＳＥＭを示す線を用いて５回の独立した実験から示される。
【図6】図６Ａ～図６Ｂは、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を投与した動物における単球（図６Ａ）及びＤＣ（図６Ｂ）の用量依存的な細胞増殖を示す。抗ｇＤは、陰性対照ヒト化ＩｇＧ抗体である。
【発明を実施するための形態】
【0059】
発明の実施形態の詳細な説明
Ｉ． 定義
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明及び例示的な実施形態が以下に記載される。
Ｉ． 定義
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明及び例示的な実施形態が以下に記載される。
【0060】
「Ｆｌｔ３Ｌ」とも呼ばれる「Ｆｌｔ３リガンド」という用語は、タンパク質がＦｌｔ３受容体（Ｆｌｔ３Ｒ）を標的化する際の診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＦｌｔ３受容体に結合することができるタンパク質を指す。一実施形態では、無関係の非Ｆｌｔ３Ｒタンパク質へのＦｌｔ３リガンドの結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合に、Ｆｌｔ３Ｌへのタンパク質の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｒに結合するタンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、異なる種由来のＦｌｔ３Ｒ間で保存されているＦｌｔ３Ｒに結合する。
【0061】
本明細書で使用される「Ｆｌｔ３Ｌ」という用語は、切断された可溶性Ｆｌｔ３Ｌ（例えば、配列番号２１のおよそ残基２７～１８５）を指すが、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然Ｆｌｔ３Ｌも指すことができる。この用語は、「完全長」の処理されていないＦｌｔ３Ｌ、並びに例えば、細胞内での処理（例えば、シグナルペプチド（リーダー配列）の除去又はＴＭドメインからの切断）から生じる任意の形態のＦｌｔ３Ｌを包含し得る。この用語は、Ｆｌｔ３Ｌの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。内因性シグナル配列を有する例示的なヒトＦｌｔ３Ｌのアミノ酸配列は、配列番号２１に示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション記録Ｐ４９７７１にも提供されるが、他の実施形態では、外因性リーダー配列を含まない成熟Ｆｌｔ３Ｌタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１の残基２７～１６７として提供される。少数の配列バリエーション、特にＦｌｔ３Ｌの機能及び／又は活性（例えば、Ｆｌｔ３受容体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４１１０）への結合）に影響しないＦｌｔ３Ｌの保存的アミノ酸置換もまた、本発明によって意図される。
【0062】
本明細書で使用される「Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質」又は「ＦｃエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、Ｆｌｔ３ＬポリペプチドがバリアントＩｇＧ Ｆｃ領域に直接又は間接的に連結されている融合タンパク質を指し、バリアントＦｃ領域は、その対応する野生型Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が減弱している。「エフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質」という用語の任意の使用について、「エフェクターレス」という用語は融合タンパク質のＦｃ部分に適用されることに留意されたい。特定の好ましい実施形態において、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に連結されたヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質又はポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。しかしながら、本発明のＦｌｔ３Ｌ又はエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号２６）の機能及び／又は活性に有意に影響しないＦｌｔ３Ｌ又はＦｃの挿入、欠失、置換、特に保存的アミノ酸置換などの小さな配列変異も本発明によって企図されることが理解される。本発明のエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｌｔ３受容体タンパク質（Ｆｌｔ３）に結合することができ、これはＦｌｔ３受容体下流シグナル伝達をもたらし得る。本明細書で使用される場合、ＣＤＸ－３０１は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＦｌｔ３Ｌを指す。
【0063】
「抗体」という用語は、ここでは最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた（これらに限定されない）、様々な抗体構造を包含する。
【0064】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0066】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域、単離されたＦｃ領域、又は別のタンパク質に融合されたＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、Ｆｃ領域は由来する抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、以下：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。特定の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を、又は検出可能なエフェクター機能を示さない。特定の他の実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２を有する野生型Ｆｃタンパク質に融合された本発明のＦｌｔ３Ｌタンパク質を含む融合タンパク質と比較して、実質的に低下したエフェクター機能、例えば約５０％、６０％、７０％ ８０％、又は９０％低下したエフェクター機能を示す。
【0067】
本明細書で使用される「樹状細胞増殖」、「樹状細胞の増殖」又は「樹状細胞の数の増加」は、インビトロアッセイでの、又はインビボ実験で測定される樹状細胞の数の増加を指す。
【0068】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な薬用量及び所要期間で有効な量を指す。
【0069】
用語「Ｆｃ領域」とは、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【0070】
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
【0071】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。本明細書では、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が、含まれる。
【0072】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体又は対象はヒトである。
【0073】
「単離された」タンパク質又はポリペプチドは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体精製の評価のための方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0074】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0075】
「Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃをコード融合タンパク質する単離された核酸」は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を指し、それには単一のベクター又は別個のベクターにおけるかかる核酸分子（複数可）が含まれ、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【0076】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
【0077】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００ × 分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性に等しくないことが理解されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されているように得られる。
１００ × 分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性に等しくないことが理解されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されているように得られる。
【0078】
「医薬製剤」という用語は、調製物中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を全く含有しない調製物を指す。
【0079】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0080】
本明細書で使用される場合、「治療」（及びその文法的な変形語、例えば、「治療する」又は「治療すること」）は、治療される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0081】
用語「治療的有効量」は、（ｉ）特定の疾患、症状又は障害を治療又は予防する、（ｉｉ）特定の疾患、症状又は障害の１つ又は複数の症候を減弱、改善又は排除する、あるいは（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、症状又は障害の１つ又は複数の症候の発症を予防又は遅延する、本発明のタンパク質の量を意味する。がんの場合、本明細書に記載の治療有効量の治療剤又は薬剤の組み合わせは、がん細胞の数を低減し、腫瘍サイズを低減し、末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍成長をある程度阻害し、及び／又はがんに関連する症候のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。本明細書に記載の治療有効量の治療剤又は薬剤の組み合わせは、既存のがん細胞の成長を予防し、及び／又はそれらを死滅させることができる程度まで、細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。がん療法に関しては、有効性は、例えば、疾患の進行に対する時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ＴＴＰ）の評価及び／又は応答速度（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ：ＲＲ）の判定によって測定され得る。
【0082】
本明細書で使用される「がん」及び「がん性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的症状を指すか、又は説明する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。腫瘍には、固形腫瘍及び液状腫瘍が含まれる。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん（例えば、上皮性扁平上皮細胞がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌腫を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管がんを含む）、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、悪性脳腫瘍、黒色腫、子宮内膜又は子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、頭頸部がん、並びに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。
【0083】
本明細書で使用される「コールド腫瘍」又は「免疫砂漠」という用語は、低免疫原性であるか、又は腫瘍特異的免疫の不十分な誘発及び免疫原性細胞傷害に対する耐性を特徴とするがん性腫瘍を指す。
【0084】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【0085】
ＩＩ． 組成物及び方法
Ａ． エフェクターレスＦｃタンパク質
一態様では、本発明は、驚くべきことにエフェクター活性が低下した新規なエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質を提供する。本明細書で設計及び記載されるＦｃタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、本明細書では「ＦｃＮＧ２ＬＨ」又は「Ｆｃ ＮＧ ＰＶＡ＃」とも呼ばれる。本明細書に示されるように、ＦｃＮＧ２ＬＨ Ｆｃタンパク質は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するタンパク質と比較してＡＤＣＰ活性が有意に低下し（例えば、少なくとも実施例１及び１０を参照）、マクロファージによるサイトカイン放出の活性化が低下し（例えば、実施例１を参照）、ＡＤＣＣ活性が低下している。また、注目すべきは、Ｎ２９７Ｇ突然変異のみを含有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインの熱安定性と比較した、ＦｃＮＧ２ＬＨタンパク質の熱安定性の驚くべき増加である。
Ａ． エフェクターレスＦｃタンパク質
一態様では、本発明は、驚くべきことにエフェクター活性が低下した新規なエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質を提供する。本明細書で設計及び記載されるＦｃタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、本明細書では「ＦｃＮＧ２ＬＨ」又は「Ｆｃ ＮＧ ＰＶＡ＃」とも呼ばれる。本明細書に示されるように、ＦｃＮＧ２ＬＨ Ｆｃタンパク質は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するタンパク質と比較してＡＤＣＰ活性が有意に低下し（例えば、少なくとも実施例１及び１０を参照）、マクロファージによるサイトカイン放出の活性化が低下し（例えば、実施例１を参照）、ＡＤＣＣ活性が低下している。また、注目すべきは、Ｎ２９７Ｇ突然変異のみを含有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインの熱安定性と比較した、ＦｃＮＧ２ＬＨタンパク質の熱安定性の驚くべき増加である。
【0086】
エフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃドメインタンパク質の設計は、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質におけるその使用に加えて、多くの治療分子に関連して有用性を有する。例えば、分子の２つ以上を一緒に架橋することによって分子（例えば、細胞表面受容体）に結合して活性化するように設計された抗体、チェックポイント阻害剤を標的とする抗体、結合してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を誘導する少なくとも１つのアームを有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体。当業者は、融合タンパク質の生成のための本明細書に記載のエフェクターレスＦｃタンパク質の使用であって、エフェクターレスＦｃタンパク質が、第２のタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に、それぞれエフェクターレスＦｃタンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端に、（例えば、アミノ酸結合を介して）連結されている使用を理解するであろう。第２のタンパク質は、所望の治療機能を有するものであることが好ましい。エフェクターレスＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ受容体の結合によって引き起こされる好中球増加症などの有害反応を防止することができる。治療用タンパク質の分野では、Ｆｃエフェクター機能の制御を改良する方法を継続的に開発する必要がある。
【0087】
一態様では、本発明は、重鎖定常ドメインが配列番号２のＦｃＮＧ２ＬＨタンパク質を含む、抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリン及び抗体を含む。当業者は、ＮＧ２ＬＨ突然変異の存在及び結果として生じるエフェクター機能の欠如又は減少に適応し、それらから利益を得ることができる様々な抗原特異的抗体のフォーマットを容易に想像することができる。例えば、本開示のヒトＩｇＧ１ ＦｃＮＧ２ＬＨは、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体の一部であり得る。換言すれば、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むか又は含み得る任意の免疫グロブリン構造である。
【0088】
Ｂ． 例示的なＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質
一態様では、本発明は、Ｆｌｔ３受容体（Ｆｌｔ３Ｒ）に結合するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質であって、Ｆｃタンパク質が野生型Ｆｃタンパク質と比較して、エフェクター機能をほぼ有さないか、又はエフェクター機能が大幅に低下している、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、特に患者がチェックポイント阻害剤免疫療法に応答しないか、又はチェックポイント阻害剤免疫療法に対する応答が限られている場合に、様々ながん免疫療法治療プロトコルによるがんの治療に有用である。「コールド腫瘍」又は「免疫砂漠」における抗腫瘍免疫応答の欠如は、少なくとも部分的には、抗腫瘍Ｔ細胞応答の不十分又は欠如に起因すると考えられる。効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答には、樹状細胞（ＤＣ）による腫瘍抗原の交差提示が必要である。
一態様では、本発明は、Ｆｌｔ３受容体（Ｆｌｔ３Ｒ）に結合するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質であって、Ｆｃタンパク質が野生型Ｆｃタンパク質と比較して、エフェクター機能をほぼ有さないか、又はエフェクター機能が大幅に低下している、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、特に患者がチェックポイント阻害剤免疫療法に応答しないか、又はチェックポイント阻害剤免疫療法に対する応答が限られている場合に、様々ながん免疫療法治療プロトコルによるがんの治療に有用である。「コールド腫瘍」又は「免疫砂漠」における抗腫瘍免疫応答の欠如は、少なくとも部分的には、抗腫瘍Ｔ細胞応答の不十分又は欠如に起因すると考えられる。効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答には、樹状細胞（ＤＣ）による腫瘍抗原の交差提示が必要である。
【0089】
したがって、がん免疫療法の有効性を高める１つの手段は、腫瘍内の抗原提示ＤＣの数を増加させることである。Ｆｌｔ３Ｌは、前駆細胞の増殖、分化、発達及び動員を通じて、対象においてＤＣを増加させるように部分的に機能することが周知である。健康な対象に投与されたＦｌｔ３Ｌタンパク質が実際にＤＣ及び造血幹細胞を増殖させることができるという証拠があるが（例えば、Ａｎａｎｄａｓａｂａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，５０：９２４－９３０）、１つの懸念は、血液中の組換えＦｌｔ３Ｌの半減期が比較的短いことであり、治療効果が低下する可能性があり、及び／又は投与頻度が高すぎる必要性がある。
【0090】
治療用タンパク質の血清半減期を延長するための十分に確立された戦略は、それを免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ペプチド結合を介して、好ましくはＦｃタンパク質のＮ末端に）に連結又は融合することである（例えば、Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＥＭＢＯ，４：１０１５－１０２８；Ｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：３９４）。しかし、例えばがん免疫療法に使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の場合、多くの予測不可能な免疫学的又は炎症性プロセスをインサイチュで活性化し得る機能的Ｆｃドメインを有することは不利であり得る。実際、サイトカインストーム又はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらす投与のリスクを最小限に抑えることが重要である。さらに、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質ドメインの野生型Ｆｃと免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体との間の相互作用は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質によって結合されたＤＣの食作用性破壊をもたらし得る。Ｆｃ領域によって与えられる利点を維持しながら、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ領域の効果を最小化し、それによって制御することが重要であり得る。本明細書に記載されているのは、本明細書で「Ｆｃ－ＮＧ２ＬＨ」又は「Ｆｃ－ＰＶＡ＃ Ｎ２９７Ｇ」と呼ばれる新しいエフェクターレスＩｇＧ Ｆｃ領域であり、これは特に、例えば野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｎ２９７Ｇ及びＩｇＧ４ Ｆｃ領域と比較した場合、驚くほど低いエフェクター機能（例えば、実施例７を参照）を有することが示された。さらに、実施例８に示すように、ＮＧ２ＬＨバリアントの導入は、Ｆｃドメインの熱安定性の予想外の増加並びに動物の血清中半減期への影響をもたらした。
【0091】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質バリアントのさらなる特徴付けは、Ｆｌｔ３Ｌ Ｗ１４４を置換することがインビトロＴ細胞増殖アッセイで決定されるように免疫原性を有意に増加させることを示し、Ｆｌｔ３Ｌ（配列番号２１）の位置１４９における潜在的な酸化傾向を除去することが治療的エフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質産物に有害であり得ることを示唆している。しかしながら、対照的に、実施例９は、１４９及び１５１の位置での潜在的なグリコシル化部位の置換がインビトロＴ細胞増殖アッセイによって決定されるように免疫原性を増加させなかったことを示しており、これらの位置及び他の位置での突然変異がＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の製造に適している可能性があることを示唆している。
【0092】
重要なことに、本明細書に開示されるエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の様々な用量のインビボ投与は、樹状細胞の大きな増殖をもたらした（例えば、実施例５を参照）。さらに、ＤＣ増殖のレベルは、同等の用量のＣＤＸ－３０１で観察されたものよりもはるかに大きいことは間違いない。
【0093】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に連結されたＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）タンパク質を含み、ＩｇＧ１ Ｆｃは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ Ｆｃに融合された同じＦｌｔ３Ｌと比較してエフェクター機能が低下しているか、又はエフェクター機能を有しない。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｌｔ３Ｌ部分は、細胞表面Ｆｌｔ３受容体（Ｆｌｔ３Ｒ）に結合することができる。Ｆｌｔ３Ｌタンパク質の配列は、およそ残基１～２６に伸長するシグナルペプチド及びおよそ残基１８５～２０５に伸長する膜貫通ドメインを有する、２３５アミノ酸長のタンパク質としてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４９７７１（本明細書において配列番号２１として提供される）に記載されている。残基２９～１５９は、Ｆｌｔ３リガンドとしてＧｅｎＢａｎｋ記録に記載されているが、Ｓａｖｖｉｄｅｓら（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏ，７：４８６－４９１）は、残基２７～１６０が単独で生物活性に十分であることが示されていると述べている。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ末端が配列番号２１の２４～３０の任意のアミノ酸残基であり、Ｃ末端が配列番号２１の１６７～１９０位の任意のアミノ酸残基である、配列番号２１の残基を含むＦｌｔ３リガンドドメインを想定する。Ｓａｖｖｉｄｅｓら（同上）は、残基２７～１６０のみを含む（及び二量体として構成された）ポリペプチドがリガンドの機能活性に十分であることを示したが、以下の実施例２に記載される研究は、配列番号２１の残基１６７のＮ末端を終結させ、例えば、（配列番号１３の）Ｆｃ Ｎ末端残基に共有結合的に連結されるＦｌｔ３Ｌタンパク質を使用することを示す。配列番号２１残基２７～１６７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するタンパク質配列を含む成熟Ｆｌｔ３Ｌタンパク質などのＦｌｔ３Ｌのバリアントも本開示に想定されることが理解される。ここでは（例えば、以下の実施例３）、Ｆｃタンパク質に融合されたＦｌｔ３の断片サイズが、融合タンパク質の凝集に有意な影響を及ぼし得ることが示された。
【0094】
一態様では、本発明は、配列番号２１の残基２７～１６７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＦｌｔ３Ｌタンパク質と、配列番号１３と少なくとも９５％同一であるＩｇＧ Ｆｃ分子とを含むＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。ＩｇＧ Ｆｃ分子は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド（配列番号１２）と比較してＦｃエフェクター機能が減弱しており、Ｆｃエフェクター機能はＣＤＣ、ＡＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰから選択される。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ分子は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドと比較してＡＤＣＰ活性が減弱している。理論に拘束されるものではないが、Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質のエフェクター機能が低い～無いことは、Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質の下側ヒンジにＮ２９７Ｇ突然変異（配列番号１３の位置７６において）とアミノ酸ＰＶＡＧＰ（配列番号１３の残基１３～１７）の両方の固有の組み合わせが存在することに起因すると考えられる。
【0095】
ａ） 置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有するタンパク質バリアントが提供される。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化を表１に「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下に更に記載する。目的の融合タンパク質中にアミノ酸置換を導入し、その産物を、所望の活性、例えば、減少した免疫原性、又は減少したＡＤＣＰについてスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有するタンパク質バリアントが提供される。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化を表１に「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下に更に記載する。目的の融合タンパク質中にアミノ酸置換を導入し、その産物を、所望の活性、例えば、減少した免疫原性、又は減少したＡＤＣＰについてスクリーニングすることができる。
【表1】
【0096】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0097】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【0098】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個以上のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質分子の他の挿入バリアントには、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又はＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が含まれる。
【0099】
ｂ） グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分がグリコシル化されている程度を増加又は減少させるように変化する。Ｆｃドメインへのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分がグリコシル化されている程度を増加又は減少させるように変化する。Ｆｃドメインへのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成することができる。
【0100】
Ｆｃ領域に関して、それに結合している炭水化物は変化し得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有するエフェクターレスＦｃバリアントを作成するために行われてもよい。
【0101】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有するＦｃ融合バリアントが提供される。例えば、フコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定されたように、Ａｓｎ２９７（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造、及び高マンノース構造）に付着した全ての糖鎖構造の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体内のわずかな配列変異のため、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち、２９４位と３００位との間に位置し得る。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠乏」抗体バリアントに関する刊行物の例としては：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）。
【0102】
例えば、融合タンパク質のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有するＦｃバリアントが更に提供される。そのようなＦｃバリアントは、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を持つＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質バリアントも提供される。そのようなＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質（したがって、Ｆｃ）バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【0103】
ｃ） タンパク質誘導体
特定の実施形態では、本明細書中に提供されるエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体又は融合タンパク質、又はＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、当該分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の誘導体化に適した部位には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例：グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる（但しこれらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。Ｆｃ融合タンパク質に結合したポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが結合している場合には、同じ分子であっても異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定するものではないが、改良されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の特定の特性又は機能、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
特定の実施形態では、本明細書中に提供されるエフェクターレスＦｃタンパク質、エフェクターレスＦｃタンパク質を含む抗体又は融合タンパク質、又はＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、当該分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の誘導体化に適した部位には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例：グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる（但しこれらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。Ｆｃ融合タンパク質に結合したポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが結合している場合には、同じ分子であっても異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定するものではないが、改良されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の特定の特性又は機能、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【0104】
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得るＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非保護性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は任意の波長であってよく、通常の細胞に害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を、融合タンパク質－非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
【0105】
Ｃ． 組換え方法及び組成物
Ｆｌｔ３Ｌ融合タンパク質は、当業者に容易に知られている組換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｌｔ３Ｌ部分及びＦｃ部分を含むアミノ酸配列をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下を用いて形質転換されている）：（１）本発明のＦｌｔ３Ｌポリペプチド及びＦｃポリペプチドをコードする核酸を含むベクター。好ましい実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌポリペプチドをコードする核酸は、Ｆｃポリペプチドをコードする核酸の上流にある。さらに、２つの核酸は単一のオペロンにある。一実施形態では、宿主細胞は、真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の作製方法が提供され、方法は、上記で提供するような、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、任意に、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を回収することを含む。
Ｆｌｔ３Ｌ融合タンパク質は、当業者に容易に知られている組換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｌｔ３Ｌ部分及びＦｃ部分を含むアミノ酸配列をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下を用いて形質転換されている）：（１）本発明のＦｌｔ３Ｌポリペプチド及びＦｃポリペプチドをコードする核酸を含むベクター。好ましい実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌポリペプチドをコードする核酸は、Ｆｃポリペプチドをコードする核酸の上流にある。さらに、２つの核酸は単一のオペロンにある。一実施形態では、宿主細胞は、真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の作製方法が提供され、方法は、上記で提供するような、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、任意に、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を回収することを含む。
【0106】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の組換え産生のために、例えば、上記に記載されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸が単離され、１つ以上のベクター内に挿入されて、宿主細胞内で更にクローニング及び／又は発現される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
【0107】
エフェクターレスＦｃタンパク質、Ｆｃタンパク質を含有する抗体若しくは融合タンパク質、又は例えばＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能を必要としない場合には、細菌中で産生され得る。細菌でのポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号明細書、同第５，７８９，１９９号明細書、及び同第５，８４０，５２３号明細書を参照されたい（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）発現後、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離し、さらに精製することができる。
【0108】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターのクローニング又は発現宿主として適しており、その中には、グリコシル化経路が「ヒト化」された菌株及び酵母株が含まれ、その結果、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質が産生される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
【0109】
グリコシル化Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【0110】
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。
【0111】
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載の２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）、
【0112】
Ｄ． アッセイ
本明細書で提供されるＤＣの増殖を促進することができるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けすることができる。
本明細書で提供されるＤＣの増殖を促進することができるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けすることができる。
【0113】
Ｅ． イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、若しくはそれらの断片）、又は放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた本明細書におけるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、若しくはそれらの断片）、又は放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた本明細書におけるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【0114】
一実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のイムノコンジュゲートは、抗体が、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第第５，４１６，０６４号及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部位ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）等のオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）；及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシン又はドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない１種又は複数の薬剤にコンジュゲートされた抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の生成と同様の様式で生成される。
【0115】
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を含む。
【0116】
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。検出のために用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、あるいは核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（ここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄等）を含みうる。
【0117】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【0118】
本明細書における免疫コンジュゲートは、限定されないが、市販（例：米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から）されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
【0119】
Ｆ． 医薬製剤
本明細書に記載されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬製剤は、所望の程度の純度を有するかかるタンパク質と、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））とを混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
本明細書に記載されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬製剤は、所望の程度の純度を有するかかるタンパク質と、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））とを混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
【0120】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な１つを超える、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、樹状細胞成熟因子及び／又はアジュバントをさらに提供することが望ましい場合がある。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【0121】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0122】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、Ｆｃ融合タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
【0123】
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。
【0124】
Ｇ． 治療方法及び組成物
本明細書で提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のいずれも、治療方法に使用することができる。
本明細書で提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のいずれも、治療方法に使用することができる。
【0125】
一態様では、医薬として使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質が提供される。さらなる態様では、がんに使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、治療方法において使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、有効量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法に使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を提供する。このような一実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、樹状細胞の増殖に使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明は、樹状細胞を増殖させるために有効なＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を個体に投与することを含む、個体において樹状細胞を増殖させる方法に使用するためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を提供する。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【0126】
さらなる一態様では、本発明は、医薬品の製造又は調製におけるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、がんの治療のためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む方法における使用のためのものである。このような一実施形態では、本方法は、例えば以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、医薬は、樹状細胞を増殖させるためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、個体において樹状細胞を増殖させる方法に使用するためのものであり、樹状細胞を増殖させるのに有効な量の医薬を個体に投与することを含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
【0127】
さらなる態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、かかるがんを有する個体に有効量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を投与することを含む。そのような一実施形態では、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体へ投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
【0128】
さらなる態様では、本発明は、個体において樹状細胞を増殖させるための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、樹状細胞を増殖させるために有効量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質を個体に投与することを含む。一実施形態では、「個体」は、ヒトである。
【0129】
さらなる一態様では、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書に提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のいずれかを含む、医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供されるＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質のうちのいずれかと、例えば、以下に記載される少なくとも１つの追加の治療剤と、を含む。
【0130】
本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。
【0131】
上述のかかる併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質の投与は、追加の治療剤（複数可）の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行われ得る。一実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約１か月以内、又は約１、２、３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に発生する。本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【0132】
本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、所望な場合、局所治療では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
【0133】
本発明の使用のためのＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、良好な医療行為と一致する方法で調合され、投薬され（ｄｏｓｅｄ）、そして投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）であろう。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、当該疾患を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の試薬と一緒に製剤化されている必要はないが任意に製剤化される。そのような他の試薬の有効量は、製剤中に存在するＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の量、障害又は治療のタイプ、及び上記の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【0134】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の適切な投与量（単独で又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の種類、疾患の重症度と経過、融合タンパク質が予防目的又は治療目的のどちらで投与されるか、以前の治療、患者の病歴とＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質への反応、及び主治医の裁量に依存することになる。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、１回以上の個別投与によるか、持続注入による患者への投与のための最初の候補投与量であり得る。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、症状に応じ、治療は通常、疾患症候の所望の抑制が生じるまで続けられる。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。このような用量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。
【0135】
上の製剤又は治療方法のうちのいずれも、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して行われ得ることが理解される。
【0136】
Ｈ． 製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＦｃ融合タンパク質である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明のＦｃ融合タンパク質を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、更なる細胞毒性剤又はその他の治療剤を含む、第２の容器とを備えていてもよい。本発明のこの実施形態における製造物品は、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示すパッケージ添付文書を更に含んでいてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器等、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＦｃ融合タンパク質である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明のＦｃ融合タンパク質を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、更なる細胞毒性剤又はその他の治療剤を含む、第２の容器とを備えていてもよい。本発明のこの実施形態における製造物品は、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示すパッケージ添付文書を更に含んでいてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器等、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【0137】
上記の製品はいずれも、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解されよう。
【実施例】
【0138】
ＩＩＩ． 実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
【0139】
実施例１．エフェクターレスＦｃタンパク質の設計
「ＮＧ２ＬＨ」という用語は、ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ置換を含み、ＩｇＧ１の下側ヒンジ残基２３３～２３６（ＥＬＬＧ、配列番号１９）をヒトＩｇＧ２の残基２３３～２３６（ＰＶＡ；位置２３６のアミノ酸なし、本明細書では「ＰＶＡ＃」とも呼ばれる）と「スワップ」するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを指し、位置はＫａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従って番号付けされている。ＮＧ２ＬＨ Ｆｃバリアントタンパク質（本明細書では「ＰＶＡ＃ ＮＧ」とも呼ばれる）のエフェクターレス性は、完全長抗体に関連して、野生型、Ｎ２９７Ｇ及び他のＦｃバリアントＩｇＧ１、並びにＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体と比較して、以下の表２で定義されるように最初に示された。
「ＮＧ２ＬＨ」という用語は、ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ置換を含み、ＩｇＧ１の下側ヒンジ残基２３３～２３６（ＥＬＬＧ、配列番号１９）をヒトＩｇＧ２の残基２３３～２３６（ＰＶＡ；位置２３６のアミノ酸なし、本明細書では「ＰＶＡ＃」とも呼ばれる）と「スワップ」するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを指し、位置はＫａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従って番号付けされている。ＮＧ２ＬＨ Ｆｃバリアントタンパク質（本明細書では「ＰＶＡ＃ ＮＧ」とも呼ばれる）のエフェクターレス性は、完全長抗体に関連して、野生型、Ｎ２９７Ｇ及び他のＦｃバリアントＩｇＧ１、並びにＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体と比較して、以下の表２で定義されるように最初に示された。
【表2】
【0140】
抗Ｈｅｒ２抗体（トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）（米国特許第６，４０７，２１３号及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３－９３でも言及されており；本明細書では配列番号４７として言及される）の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをコードする、表２に列挙される重鎖定常領域（ＣＨ１－ＣＨ３）を含む完全長抗体を構築した。これらの抗Ｈｅｒ２抗体の軽鎖は、天然のヒトＣカッパ定常領域を含んでいた。完全長軽鎖及び様々な完全長重鎖をコードする核酸をｐＲＫ哺乳動物発現ベクター（Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３－４７）にクローニングした。軽鎖及び重鎖核酸ベクターをＣＨＯ細胞で共発現させ、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【0141】
次いで、抗体を、Ｈｅｒ２を過剰発現する初代マクロファージ及びＳＫ－ＢＲ－３ヒト乳がん細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３０）を使用して、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び抗体依存性サイトカイン放出（ＡＤＣＲ）に対するそれらの効果について試験した。陰性対照抗体として抗ｇＤ抗体を用いた。単球をドナーＰＢＭＣから単離し、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＭＣＳＦ－１で刺激し、Ｔ－１７５組織培養フラスコ中で５～７日間マクロファージに分化させた。ＡＤＣＰ及びサイトカイン放出実験の前日に、全てのマクロファージを５０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２８５－ＩＦ－１００／ＣＦ）で刺激して、Ｍ１マクロファージに分化させた。マクロファージ及びＳＫ－ＢＲ－３ ＧＦＰ細胞をアキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＣＲ００５）処理によって回収した。除去したマクロファージ及びＳＫ－ＢＲ－３細胞を、それぞれ２ｘ１０６及び０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ １０；Ｌｏｎｚａ ０４－７４３Ｑ，１０％ ＨＩ ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ １０４３８－０２６）に再懸濁した。試験条件（抗体バリアント及び治療濃度）を決定するために、９６ウェルプレートマップを設計した。各抗体バリアントの２倍段階希釈物を培地中で調製した（６点１０倍希釈系列：２０００、２００、２０、２、０．２、０．０２ｎｇ／ｍｌ）。プレートマップに従って、５０ｕｌのマクロファージ及び５０ｕｌのＳＫ－ＢＲ－３を各ウェルに添加し、各ウェルに１００ｋのマクロファージ及び２５ｋのＳＫ－ＢＲ－３細胞を得た。プレートマップに従って、１００ｕＬの２倍抗体連続希釈溶液を９６ウェルプレートのウェルと合わせた。最終抗体処理濃度は１０００、１００、１０、１、０．１、０．０１ｎｇ／ｍｌであった。１００ｕＬの培地を、マクロファージ及びＳＫ－ＢＲ－３細胞を含む３つのウェルに「培地のみ」対照処理として加えた。９６ウェルプレートを２０×ｇで２分間遠心分離し、次いで、３７℃で約２４時間インキュベートした。細胞を４００×ｇで４分間遠心分離し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘによって分析されるＡＤＣＲのために上清を回収した。細胞をアキュターゼ処理によってウェルから除去した。各ウェル中の細胞を２００ｕｌのＦＡＣＳバッファー（ＢＤ、５５４６５７）で一回洗浄した。Ａｌｅｘａ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ａ２０１８６）とコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ、５５５３８５）及び抗ＣＤ１４（ＢＤ，５５５３９６）を用いて染色溶液を調製した（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１００抗体コンジュゲート）。５０ｕＬの染色溶液を全てのウェルに添加し、４℃で３０～６０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２００ｕｌ／ウェル）で２回洗浄した。各ウェル中の細胞を５０ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞の１つのプレートをＡＤＣＰ効率についてＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳデータをソフトウェアＦｌｏｗＪｏで分析した。細胞をＦｏｒｗａｒｄ ａｎｄ Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒプロットでゲートし、次いで、Ｙ軸上にＧＦＰ発現及びＸ軸上にＡｌｅｘａ６４７をプロットした。各象限における細胞パーセンテージを計算した。ＳＫ－ＢＲ－３細胞は主に象限１（Ｑ１、ＧＦＰ陽性）にあり、マクロファージは主に象限３（Ｑ３、Ａｌｅｘａ６４７陽性）にあった。各ウェルの食作用％を計算した：
食作用％＝１００％－（各ウェルのＱ１）／（培地のみの対照ウェル３つの平均Ｑ１）
食作用％＝１００％－（各ウェルのＱ１）／（培地のみの対照ウェル３つの平均Ｑ１）
【0142】
グラフ上にプロットされた抗体処理濃度に対する抗体バリアントの食作用％。
【0143】
２つのプレートをＬｕｍｉｎｅｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ）によって分析した。図１に示すように、漸増濃度のＬＡＬＡＰＧ又はＮＧＬＨ２ Ｆｃ抗Ｈｅｒ２抗体の存在下では、食作用はほぼ観察されなかった。ＩｇＧ１野生型及びＩｇＧ４抗体バリアントでは、最高レベルのＡＤＣＰが観察された。ＩｇＧ２野生型Ｆｃ及びＩｇＧ１ ＰＶＡ＃Ｆｃについて中間レベルの食作用が観察された。したがって、図１は、ＩｇＧ１ ＮＧ２ＬＨ及びＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ ＦｃドメインがインビトロアッセイにおいてＡＤＣＰ活性を欠くことを示す。実験は、ＩｇＧ１ ＮＧ ＰＶＡＧ及びＩｇＧ１ ＮＧ ＰＶＡ＃ ＧＳＳの存在下でのＡＤＣＰ活性の同様の欠如を示す（データは示さず）。
【0144】
ＡＤＣＰアッセイからのサイトカイン放出プロファイルの結果を図２Ａ～図２Ｊに提供する。食作用データと一致して、これらの結果は、天然のＩｇＧ１、ＩｇＧ４と対照的に、及びより少ない程度にＮ２９７Ｇと対照的に、ＮＧ２ＬＨバリアントが標的細胞の存在下でマクロファージによるＡＤＣＲを媒介しないことを実証している。
【0145】
これらのデータは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃと比較してバリアントのＡＤＣＣレポーターアッセイからのデータとは対照的である。オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）又はトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）由来の可変ドメインを上記の野生型及びバリアントのドメインに融合し、ＡＤＣＣアッセイで試験した。このアッセイでは、ＮＫ細胞をＮＦＡＴ－ＲＥ－ルシフェラーゼレポーター細胞として操作し、ＲｃγＲＩＩＩａ結合を読み取り、次いで、ＷＩＬ２Ｓ ＣＤ２０＋細胞又はＳｋＢｒ３ Ｈｅｒ２＋細胞の存在下でアッセイした。野生型又はバリアントのドメインを有する抗ＣＤ２０及び抗Ｈｅｒ２構築物の両方について、全ての非野生型Ｆｃ分子は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃと比較して最小の活性を有していた（図２Ｋ及び図２Ｌを参照）。
【0146】
実施例２．Ｆｌｔ３Ｌ Ｆｃ融合タンパク質の設計
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、日常的な核酸クローニング、タンパク質発現及びタンパク質精製技術を使用して生成された。
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質は、日常的な核酸クローニング、タンパク質発現及びタンパク質精製技術を使用して生成された。
【0147】
ＰＣＲを使用して、所望のキメラＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質（表３、配列番号１０～３１を参照）のＦｌｔ３Ｌ及びＦｃ部分をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡを増幅した。表３に記載のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃタンパク質（配列は表１０に提供）の発現及び産生のために、ヒトＦｌｔ３Ｌの天然シグナル配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４９７７１；配列番号２１の残基１～２７）を含むようにｃＤＮＡを生成した。一例として、ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．５ａａ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃タンパク質の発現のために生成されたｃＤＮＡは、配列番号４５として表１０に提供されるＦｌｔ３Ｌシグナル配列との融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含んでいた。
【表3】
【0148】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合物をコードするｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５（Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２：１（１９９０）；米国特許第６，２３２，１１７号）にサブクローニングし、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。
【0149】
ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞のいずれかを所望の発現構築物で一過性にトランスフェクトし、適切な培養培地中でそれぞれ１０又は６日間増殖させ、精製のために回収した。
【0150】
Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合構築物の精製は、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーキャプチャークロマトグラフィー（ＧＥ）、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＳＥＣ、最後に透析による濃縮及び緩衝液交換を用いて達成した。
【0151】
実施例３．Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の特徴付け
実施例２に記載されるように生成された融合タンパク質を、溶液中での凝集に対する感受性並びにジスルフィド結合の減少及び喪失に関して特徴付け、そのそれぞれをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（３～５ｕｇ／ウェル）及びＨＰＬＣ ＳＥＣ（ＳｕｐｅｒＤｅｘ ２００；平衡化緩衝液：２００ｍＭアルギニン、１３７ｍＭコハク酸、ｐＨ５．０）によって分析した。ＣＨＯ細胞培養物から精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して行われた実験からのデータを以下の表４に要約し、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞において発現されて精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合構築物ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｓ１６３．ｎｏ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃（配列番号４１）からの例示的なデータを図３Ａ～図３Ｃに示し、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞において発現されて精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合構築物ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．５ａａ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃（配列番号２６）からのデータを図３Ｄ～図３Ｆに示す。
実施例２に記載されるように生成された融合タンパク質を、溶液中での凝集に対する感受性並びにジスルフィド結合の減少及び喪失に関して特徴付け、そのそれぞれをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（３～５ｕｇ／ウェル）及びＨＰＬＣ ＳＥＣ（ＳｕｐｅｒＤｅｘ ２００；平衡化緩衝液：２００ｍＭアルギニン、１３７ｍＭコハク酸、ｐＨ５．０）によって分析した。ＣＨＯ細胞培養物から精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して行われた実験からのデータを以下の表４に要約し、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞において発現されて精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合構築物ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｓ１６３．ｎｏ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃（配列番号４１）からの例示的なデータを図３Ａ～図３Ｃに示し、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞において発現されて精製されたＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合構築物ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．５ａａ．ｈｉｎｇｅ．ｈＩｇＧ１．ＮＧ．ＰＶＡ＃（配列番号２６）からのデータを図３Ｄ～図３Ｆに示す。
【表4】
【0152】
上記の表４に要約されたバリアントのデータ分析は、Ｆｌｔ３Ｌ分子の最後のシステインとＦｃ（ＮＧ２ＬＨ）分子の最初のシステインとの間に存在するアミノ酸残基の数（結合長）が凝集及び／又はジスルフィド結合形成のレベルに影響を及ぼし得ることを示した。結合長が１４残基未満である場合、各構築物の最大３０％が分子間ヒンジジスルフィドを欠くようである。５アミノ酸残基以下の結合長は非常に高い凝集をもたらした。配列番号２４、２６、３２、３３及び３４の融合タンパク質について、最も低いレベルの凝集が観察された。配列番号２５、２６及び３２の融合タンパク質について、最低レベルの不完全なヒンジジスルフィド結合が観察され、配列番号３３及び３９も比較的低レベルの不完全なヒンジジスルフィドを有する。Ｆｌｔ３Ｌ及びＦｃタンパク質の両方の構造が十分に特徴付けられ、独立したドメインとしてフォールディングすることができることが示されていることを考慮すると、ここで観察されたデータは幾分予想外であった。しかしながら、各タンパク質ドメインは、ジスルフィド結合及び構造的完全性に重要なシステイン残基を含むことに留意されたい。したがって、データは、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）融合分子の設計が、十分な共有結合Ｆｃ二量体化及び凝集の最小化又は欠如を確実にするためにタンパク質産物の慎重な評価を必要とすることを示す。
【0153】
実施例４．Ｆｌｔ３Ｌ活性についてのインビトロ機能アッセイ
Ｆｌｔ３Ｌタンパク質（Ｆｃ融合なし；配列番号２３）の機能と比較してＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の機能的特性を評価するためにインビトロアッセイを行った。本明細書に記載のように実施されるインビトロアッセイを使用して、Ｆｌｔ３受容体を発現するヒト細胞株の増殖を誘導するＦｌｔ３Ｌタンパク質の効力を測定することができる。
Ｆｌｔ３Ｌタンパク質（Ｆｃ融合なし；配列番号２３）の機能と比較してＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の機能的特性を評価するためにインビトロアッセイを行った。本明細書に記載のように実施されるインビトロアッセイを使用して、Ｆｌｔ３受容体を発現するヒト細胞株の増殖を誘導するＦｌｔ３Ｌタンパク質の効力を測定することができる。
【0154】
Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル平底プレート（カタログ番号３６１０ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を室温で一晩、１００ｕＬのポリ－Ｌ－オルニチン（カタログ番号Ａ－００４－Ｃ ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。ヒトＯＣＩ－ＡＭＬ５細胞（Ｎｏ．ＡＣＣ ２４７、ＤＳＭＺ）を、１００ｕＬのアッセイ培地（５％熱不活性化ＦＢＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ１６４０）中に３０００細胞／ウェルで播種した。Ｆｌｔ３Ｌ試験品をアッセイ培地で２０ｕｇ／ｍＬに希釈し、１：１０に連続希釈した。１００ｕＬの希釈した試験品を各ウェルに（三連で）添加して、１０ｕｇ／ｍＬの最終出発濃度を達成した。最大対照ウェル及び最小対照ウェルには、１０ｕｇ／ｍＬのｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨ（配列番号２６）又はアッセイ培地のみを含めた。アッセイプレートを３７℃、５％ ＣＯ２で７日間インキュベートした。１００ｕＬの上清を各ウェルから取り出し、次いで、１００ｕＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（カタログ番号ＰＲ－Ｇ７５７２ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を各ウェルに加え、プレートを暗所で８～１０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて発光を測定した。生の値を最大対照ウェル及び最小対照ウェルに対して正規化した。各試験品の用量応答をＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）でプロットし、ＥＣ５０値を４パラメータロジスティック曲線を用いて決定した。図４Ａ～図４Ｂに示すグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を用いて生成された。
【0155】
これらのデータは、ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨ及びｇＣＤＸ－３０１の両方がインビトロでＯＣＩ－ＡＭＬ５細胞の用量依存的増殖を誘導したことを示す。平均ＥＣ５０効力の値は同等であった：ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨについて２．５±０．５ｐＭ；ｇＣＤＸ－３０１について２．３±０．５ｐＭ。さらに、ｈＦＬＴ３Ｌ．Ｐ１６７．ｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨ及びｇＣＤＸ－３０１は、インビトロでＯＣＩ－ＡＭＬ５細胞の増殖を少なくとも同等の効力で誘導することができる。
【0156】
実施例５．マウスにおけるＰＫＰＤ研究
免疫系の複雑さを考えると、このヒトＦｃ分子についての情報を提供し得る哺乳動物対象において薬力学を示すことが重要であり得る。ＰＫ／ＰＤ研究を、本明細書中に記載されるようにマウスを用いて行った。
免疫系の複雑さを考えると、このヒトＦｃ分子についての情報を提供し得る哺乳動物対象において薬力学を示すことが重要であり得る。ＰＫ／ＰＤ研究を、本明細書中に記載されるようにマウスを用いて行った。
【0157】
この試験は、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、ＳＣＩＤマウスを使用して実施された。動物を３つの群に分けた。群１、群２及び群３の動物には、それぞれ０．１、１．０及び１０ｍｇ／ｋｇのＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ（配列番号３７－－Ｆｌｔ３Ｌ．Ｑ１５９．Ｆｃ．ＮＧ）を与えた。全血を、ＦＡＣＳによる細胞集団計数のために選択された時点で収集した。血漿を収集し、ｈｕＦｌｔ３Ｌ ＥＬＩＳＡを使用してアッセイして、各試料中の試験物の量を決定した。
【0158】
群平均ＰＫパラメータを以下の表５に要約する。
【表5】
【0159】
表５に報告されたＮＣＡパラメータには、Ｃｍａｘ（初回投与後に観察された最大血清濃度）；Ｃｍａｘ／用量（用量正規化Ｃｍａｘ）；ＡＵＣｉｎｆ（０日目から無限大までの血清中濃度－時間曲線下面積）；ＡＵＣｉｎｆ／用量（用量正規化ＡＵＣ）；ＣＬ（血清中濃度－時間曲線を用いて算出したクリアランス）が含まれる。
【0160】
結果を図５にグラフで示す。
【0161】
群１～３において、Ｃｍａｘは、ほぼ用量比例的に増加した。ＡＵＣの用量比例を超える増加が観察され、標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）が全ての用量群でＰＫプロファイルに影響を及ぼしたことが示唆された。さらに、総クリアランス（ＣＬ）は用量依存的であることが観察され、標的媒介性ＣＬを示唆した。
【0162】
末梢血試料からの平均単球及びＤＣ数を図６Ａ（単球）及び図６Ｂ（ＤＣ）に示す。３つ全ての群において、末梢血において０．１～１０ｍｇ／ｋｇで強い用量依存的な細胞増殖が認められた。ＤＣ増殖の初期動態は用量間で同様であったが、増殖の持続時間は用量／曝露に依存していた。
【0163】
実施例６．カニクイザルにおけるＰＫＰＤ研究
カニクイザルに投与した様々な用量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質（配列番号２６）を使用して、さらなるＰＫＰＤ研究を行った。この試験は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）でナイーブ・カニクイザルを使用して行った。動物を４つの群（雄２匹及び雌１匹／群）に分けた。群１の動物には、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ（Ｎ２９７Ｇ突然変異を有する抗糖タンパク質ＤヒトＩｇＧ１抗体）を与え、一方、群２、３及び４の動物には、それぞれ０．１、１．０及び１０ｍｇ／ｋｇのＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃを与えた。群２の動物には単回用量を投与し、他の群の動物には２回用量を投与した（試験１日目及び２２日目）。全血を、ＦＡＣＳによる細胞集団計数のために選択された時点で収集した。血清を収集し、抗ｈｕＦｌｔ３Ｌ－ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡを使用してアッセイして、各血清試料中の試験物の量を決定した。
カニクイザルに投与した様々な用量のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質（配列番号２６）を使用して、さらなるＰＫＰＤ研究を行った。この試験は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）でナイーブ・カニクイザルを使用して行った。動物を４つの群（雄２匹及び雌１匹／群）に分けた。群１の動物には、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｇＤ（Ｎ２９７Ｇ突然変異を有する抗糖タンパク質ＤヒトＩｇＧ１抗体）を与え、一方、群２、３及び４の動物には、それぞれ０．１、１．０及び１０ｍｇ／ｋｇのＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃを与えた。群２の動物には単回用量を投与し、他の群の動物には２回用量を投与した（試験１日目及び２２日目）。全血を、ＦＡＣＳによる細胞集団計数のために選択された時点で収集した。血清を収集し、抗ｈｕＦｌｔ３Ｌ－ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡを使用してアッセイして、各血清試料中の試験物の量を決定した。
【0164】
以下の表６Ａは、各動物群の投薬を詳述している。群平均ＰＫパラメータを表６Ｂに要約する。
【表6A】
【表6B】
【0165】
結果を図７にグラフで示す。
【0166】
２～３群において、Ｃｍａｘの増加はほぼ用量に比例していた。抗薬物抗体（ＡＤＡ）が１４日目以降に全ての用量の動物で検出され、曝露は高いＡＤＡ力価で動物に影響を与えた。初回投与後にＡＵＣ０－２１の用量比例を超える増加が観察され、特に≦１ｍｇ／ｋｇで、標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）がＰＫプロファイルに影響を及ぼすことが示唆された。さらに、総クリアランス（ＣＬ）は用量依存的であることが観察され、標的媒介性ＣＬを示唆した。１０ｍｇ／ｋｇでは、抗ＧＤ群及びＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ群は類似のＰＫプロファイルを有し、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃの総ＣＬは４．９２ｍＬ／日／ｋｇであった。
【0167】
４つ全ての群の平均単球、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２数を図８Ａ～図８Ｃに示す。ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ治療動物については、０．１～１ｍｇ／ｋｇで、１回目の投与後の末梢血において、強い用量依存的な細胞増殖（単球、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２）が認められた。１０ｍｇ／ｋｇでは、より少ない増殖が観察された。理論に束縛されるものではないが、可能な説明は、高濃度のＦｌｔ３リガンドが増殖及び分化に必要な受容体二量体化を妨げることであり得る。１～１０ｍｇ／ｋｇでは、２回目の投与後に、より低いが持続的な細胞増殖が観察される（おそらくＡＤＡの影響による）。
【0168】
実施例７．Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）のＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合
Ｆｃドメインのエフェクター機能は、ドメイン内の特定のアミノ酸変化によって影響され得る。したがって、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ受容体へのＦｃ（ＮＧ２ＬＨ）の結合をＢｉａｃｏｒｅによって測定した。これらのアッセイのために、ＦｃγＲを抗Ｈｉｓ抗体によってＢｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉するか、又はＦｃＲｎをチップ上に直接固定した。注入終了時（会合期）にデータを収集し、試料の値を標準の値で除算して正規化することによって相対結合活性（％）を計算した。
Ｆｃドメインのエフェクター機能は、ドメイン内の特定のアミノ酸変化によって影響され得る。したがって、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ受容体へのＦｃ（ＮＧ２ＬＨ）の結合をＢｉａｃｏｒｅによって測定した。これらのアッセイのために、ＦｃγＲを抗Ｈｉｓ抗体によってＢｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉するか、又はＦｃＲｎをチップ上に直接固定した。注入終了時（会合期）にデータを収集し、試料の値を標準の値で除算して正規化することによって相対結合活性（％）を計算した。
【0169】
ＰＴＤ Ｂｉｏｃｏｒｅデータの概要を以下の表７に示す。値は、１０ｕｇ／ｍｌでの相対結合レベル（％）を示す。
【表7】
【0170】
実施例８．Ｆｃ（ＮＧ２ＬＨ）の熱安定性
ＦＬＴ３Ｌリガンド融合タンパク質の熱安定性は、治療用生物製剤を開発する１つの重要な態様である。エフェクターレスＦｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質の設計後、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を行って、Ｆｃタンパク質の熱安定性に対するアミノ酸変化の影響を理解した。ＤＳＦは、蛍光色素の存在下でタンパク質の熱アンフォールディングを監視し、典型的にはリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ）を使用して行われる。ＳＹＰＲＯオレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ６６５０）をＰＢＳで１：２０に希釈する。ウェル内の２４ｕｌのＦａｂタンパク質（約１００ｕｇ／ｍｌ）に１ｕｌの希釈色素を添加する。リアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ）において、２０℃から１００℃まで温度が上昇するに従って、蛍光強度をプロットし、例えばボルツマンの式を用いて、遷移曲線の変曲点（Ｔｍ）を算出する。Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００７，２：２２１２－２２２１を参照のこと。
ＦＬＴ３Ｌリガンド融合タンパク質の熱安定性は、治療用生物製剤を開発する１つの重要な態様である。エフェクターレスＦｃ（ＮＧ２ＬＨ）タンパク質の設計後、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を行って、Ｆｃタンパク質の熱安定性に対するアミノ酸変化の影響を理解した。ＤＳＦは、蛍光色素の存在下でタンパク質の熱アンフォールディングを監視し、典型的にはリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ）を使用して行われる。ＳＹＰＲＯオレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ６６５０）をＰＢＳで１：２０に希釈する。ウェル内の２４ｕｌのＦａｂタンパク質（約１００ｕｇ／ｍｌ）に１ｕｌの希釈色素を添加する。リアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ）において、２０℃から１００℃まで温度が上昇するに従って、蛍光強度をプロットし、例えばボルツマンの式を用いて、遷移曲線の変曲点（Ｔｍ）を算出する。Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００７，２：２２１２－２２２１を参照のこと。
【0171】
バリアントＦｃタンパク質を、完全長抗体に関連して、具体的には、オクレリズマブに由来する抗ＣＤ２０抗体として、及びトラスツズマブに由来する抗Ｈｅｒ抗体として分析した。これらのバリアント抗体の安定性データを以下の表８に提供する。さらに、バリアントＦｃタンパク質も、表２に記載の配列を含むがＣＨ１ドメインを含まず、したがってヒンジ配列ＤＫＴＨＴでＮ末端が開始する単離されたＦｃ領域の関連で試験した。これらのバリアントＦｃタンパク質の安定性データを以下の表９に提供する。
【表8】
【表9】
【0172】
データは、完全長ＩｇＧ及び単離されたＦｃタンパク質の両方について、ＰＶＡ＃バリアントをＮ２９７Ｇ置換と組み合わせると、Ｎ２９７Ｇ突然変異のみを有するＦｃ構築物の熱安定性と比較して約２℃の熱安定性の増加をもたらすことを示しており、これは予想外であった。
【0173】
実施例９．エフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のバリアント
様々なＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を評価するために実験を行った。具体的には、特定のタンパク質の免疫原性をＴ細胞増殖アッセイで試験した。図９Ａに示すように、Ｆｌｔ３Ｌ．Ｐ１６７．Ｆｃ．ＮＧ２ＬＨ（配列番号２６）もＦｌｔ３Ｌ．Ｌ１６５．Ｆｃ．ＮＧ２ＬＨ（配列番号３３）も、検出可能な免疫原性を有していた。予想外にも、Ｆｌｔ３Ｌ Ｗ１４４Ｄ突然変異の導入により有意な免疫原性が検出された（配列番号４２）。
様々なＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を評価するために実験を行った。具体的には、特定のタンパク質の免疫原性をＴ細胞増殖アッセイで試験した。図９Ａに示すように、Ｆｌｔ３Ｌ．Ｐ１６７．Ｆｃ．ＮＧ２ＬＨ（配列番号２６）もＦｌｔ３Ｌ．Ｌ１６５．Ｆｃ．ＮＧ２ＬＨ（配列番号３３）も、検出可能な免疫原性を有していた。予想外にも、Ｆｌｔ３Ｌ Ｗ１４４Ｄ突然変異の導入により有意な免疫原性が検出された（配列番号４２）。
【0174】
別の実験では、Ｆｌｔ３Ｌタンパク質のグリコシル化バリアントの免疫原性を評価した。図９Ａに示すように、Ｎ１４９Ｅ、Ｓ１５１Ｄ又はＳ１５１Ｅ突然変異の導入は、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の検出可能な増加を引き起こさなかった。Ｎ１４９Ｅ、Ｓ１５１Ｄ及びＳ１５１Ｅは、配列番号２１に対するアミノ酸の変化及び位置を示す。
【0175】
実施例１０．ＡＤＣＰアッセイにおけるエフェクターレスＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質
ヒト組換えタンパク質Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ構築物の３つのバリアントの抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を比較する実験を行った：１）Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ野生型ＩｇＧ１（配列番号２７）Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨのＦｃ（配列番号２６）及び３）Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ（配列番号２８）。抗Ｆｌｔ３モノクローナル抗体であるＥＢ１０．ｈＩｇＧ１（Ｐｉｌｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：４８４３－４８５１）を陽性対照として使用した。健康なヒトドナー由来の初代単球由来マクロファージをエフェクター細胞及びＳＥＭとして使用し、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞を標的細胞として使用して、ＡＤＣＰアッセイを実施した。簡単に記載すると、初代ヒトマクロファージを、陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって健康なヒトＰＢＭＣからＣＤ１４陽性細胞を単離することによって生成し、５％ ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいて３７℃でマクロファージ分化培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））中で培養した。３日目に、細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦで刺激し、さらに４日間培養した。７日目に、マクロファージを１０μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、ＡＤＣＰアッセイ培地（ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、５０ｕＬ／ウェルで９６ウェル低接着性Ｕ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に添加した。標的ＳＥＭ細胞をＡＤＣＰアッセイ培地で２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、ｐＨｒｏｄｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で事前標識し、マクロファージを含むアッセイプレートに添加した（５０ｕＬ／ウェル）。次いで、試験抗体の１００ｕＬの連続希釈物（表１）を、マクロファージ及びＳＥＭ細胞を含む各ウェルに添加し、続いて３７℃で５％二酸化炭素と共に４．５時間インキュベートした。抗体の最終濃度は、試験抗体あたり合計１１試料について、３倍連続希釈後に０．４５７～３０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、４℃で固定した。細胞をフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＶＤ １０）で分析した。食作用をＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．；Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）によって分析した。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光を使用して、試料集団中のマクロファージをゲーティングした。食作用を、ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ陽性マクロファージのパーセンテージを測定することによって決定した。食作用の程度を、対照条件（抗体が存在しない）からｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ陽性マクロファージのパーセントを差し引くことによって正規化した。全てのデータ点を二連で収集した。食作用パーセント（％ＡＤＣＰ）を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて４パラメータモデルに当てはめた。この手順を、３人のドナーを用いた独立した実験で行った。
ヒト組換えタンパク質Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ構築物の３つのバリアントの抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を比較する実験を行った：１）Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ野生型ＩｇＧ１（配列番号２７）Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨのＦｃ（配列番号２６）及び３）Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ（配列番号２８）。抗Ｆｌｔ３モノクローナル抗体であるＥＢ１０．ｈＩｇＧ１（Ｐｉｌｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：４８４３－４８５１）を陽性対照として使用した。健康なヒトドナー由来の初代単球由来マクロファージをエフェクター細胞及びＳＥＭとして使用し、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞を標的細胞として使用して、ＡＤＣＰアッセイを実施した。簡単に記載すると、初代ヒトマクロファージを、陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって健康なヒトＰＢＭＣからＣＤ１４陽性細胞を単離することによって生成し、５％ ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいて３７℃でマクロファージ分化培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））中で培養した。３日目に、細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦで刺激し、さらに４日間培養した。７日目に、マクロファージを１０μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、ＡＤＣＰアッセイ培地（ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、５０ｕＬ／ウェルで９６ウェル低接着性Ｕ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に添加した。標的ＳＥＭ細胞をＡＤＣＰアッセイ培地で２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、ｐＨｒｏｄｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で事前標識し、マクロファージを含むアッセイプレートに添加した（５０ｕＬ／ウェル）。次いで、試験抗体の１００ｕＬの連続希釈物（表１）を、マクロファージ及びＳＥＭ細胞を含む各ウェルに添加し、続いて３７℃で５％二酸化炭素と共に４．５時間インキュベートした。抗体の最終濃度は、試験抗体あたり合計１１試料について、３倍連続希釈後に０．４５７～３０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、４℃で固定した。細胞をフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＶＤ １０）で分析した。食作用をＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．；Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）によって分析した。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光を使用して、試料集団中のマクロファージをゲーティングした。食作用を、ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ陽性マクロファージのパーセンテージを測定することによって決定した。食作用の程度を、対照条件（抗体が存在しない）からｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ陽性マクロファージのパーセントを差し引くことによって正規化した。全てのデータ点を二連で収集した。食作用パーセント（％ＡＤＣＰ）を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて４パラメータモデルに当てはめた。この手順を、３人のドナーを用いた独立した実験で行った。
【0176】
この研究では、Ｆｌｔ３発現ＳＥＭ細胞を標的細胞として使用した。ＳＥＭ標的細胞を、酸性ｐＨで明るく蛍光するｐＨｒｏｄｏ ＡＭで事前標識した。標的細胞を含有するファゴソームが次第に酸性になるにつれて、ｐＨｒｏｄｏ緑色蛍光シグナルが増加し、これはフローサイトメーターで検出することができる。Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．ＮＧ２ＬＨのＦｃ（配列番号２６、５．１ｍｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３ＬとｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ（配列番号２８、１．９２ｍｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３ＬとＷＴ ＩｇＧ１（配列番号２７、２．５ｍｇ／ｍＬ）及びＥＢ１０．ｈＩｇＧ１（３．１７ｍｇ／ｍＬ）によって誘導されるＡＤＣＰ活性を調べ、３人の異なるドナー由来の単球由来マクロファージを用いた３つの独立した実験で比較した。
【0177】
全てのデータ点を二連で収集し、％食作用（％ＡＤＣＰ）の平均を試験した分子の濃度に対してプロットした（薬物濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）：３ｕｇ／ｍＬ～０．４５７ｎｇ／ｍＬ）。データを４－パラメータモデルでフィッティングした。代表的な用量反応ＡＤＣＰ曲線を図１０に示す。ＡＤＣＰアッセイの固有の制限を受けて、３つ全ての実験において、Ｆｌｔ３ＬとＷＴ ＩｇＧ１及びＥＢ１０．ｈＩｇＧ１によって誘導されたＡＤＣＰ活性が、Ｆｌｔ３発現細胞において観察された。さらに、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＩｇＧ－Ｎ２９７Ｇは比較的低いＡＤＣＰを誘導したが、ＦＬＴ ３Ｌ－Ｆｃ－ＩｇＧ ＮＧ２ＬＨではＡＤＣＰ活性がほとんど又は全く検出されなかった。
【0178】
Ｆｌｔ３Ｌ部分に１、２、又は３個のアミノ酸置換を含むＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質などの、Ｆｃ ＮＧ２ＬＨ（配列番号１３）を含む、追加のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質のＡＤＣＰ活性を測定するために、追加の研究を行うことができる。そのような研究は、ＡＤＣＰ活性をほとんど又は全く有さないがインビボでＤＣの増殖を活性化することができる追加のＦｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質を示すことができる。
【表10】
【0179】
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【図1】
【図2A-E】
【図2F-J】
【図2K】
【図2L】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】