特表 2023-536844 ワクチン接種を改善するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-30

(54)【発明の名称】ワクチン接種を改善するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230823BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/20 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/25 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/27 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/28 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/21 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/22 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/23 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/49 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230823BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230823BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20230823BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230823BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230823BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230823BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/33

C12N15/31

C12N15/12

C12N15/20

C12N15/24

C12N15/25

C12N15/26

C12N15/27

C12N15/28

C12N15/21

C12N15/22

C12N15/23

C12N15/50

C12N15/44

C12N15/49

C12N15/48

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

A61K31/7105

A61K48/00

A61P31/12

A61P31/14

A61P37/04

A61K39/02

A61K39/12

A61K39/00 K

A61P31/10

A61P31/04

A61K35/76

A61K39/145

A61K39/215

A61P31/16

A61P31/18

A61K39/21

A61P31/06

A61K9/127

A61K35/761

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023505988

(86)(22)【出願日】2021-07-30

(85)【翻訳文提出日】2023-03-24

(86)【国際出願番号】 US2021043975

(87)【国際公開番号】W WO2022035621

(87)【国際公開日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】63/059,458

(32)【優先日】2020-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】PCT/US2021/019028

(32)【優先日】2021-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520079913

【氏名又は名称】コンバインド セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】２５１ Ｌｉｔｔｌｅ Ｆａｌｌｓ Ｄｒｉｖｅ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄｅｌａｗａｒｅ １９８０８， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ミコル，ロメイン

(72)【発明者】

【氏名】デュバル，ヴァレリー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA93

4C076BB11

4C076BB22

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC31

4C076CC32

4C076CC35

4C084AA13

4C084MA24

4C084MA57

4C084MA59

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB022

4C084ZB051

4C084ZB052

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB311

4C084ZB312

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC751

4C084ZC752

4C085AA03

4C085BA07

4C085BA49

4C085BA51

4C085BA55

4C085BA69

4C085BA71

4C085BB01

4C085CC07

4C085CC08

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA24

4C086MA57

4C086MA59

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB02

4C086ZB05

4C086ZB09

4C086ZB31

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087MA24

4C087MA57

4C087MA59

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB05

4C087ZB09

4C087ZB31

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC75

(57)【要約】

第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物が提供され、第１のＯＲＦは抗原をコードし、第１のＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、第１のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている。ＯＲＦおよびＯＰＳを含むｍＲＮＡコンストラクトを含むさらなる組成物であって、ＯＲＦが炎症性サイトカインをコードする、さらなる組成物、ならびにたとえば病原性疾患などの疾患の処置および予防のためのこれらの組成物の一方または両方を含む方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第１のｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、前記第１のＯＲＦが抗原をコードし、
前記第１のＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、前記第１のＯＰＳが少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、組成物。

【請求項2】

前記第１のｍＲＮＡコンストラクトが、インビボ送達組成物内に含まれるか、または前記インビボ送達組成物に吸着される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記抗原が、病原性微生物タンパク質および腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記病原性微生物タンパク質が、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、寄生体タンパク質、およびプリオンからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第２のｍＲＮＡコンストラクトをさらに含み、前記第２のＯＲＦが炎症性サイトカインをコードする、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。

【請求項6】

前記炎症性サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、およびＧＭ－ＣＳＦからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記第２のｍＲＮＡコンストラクトが、送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、請求項５または請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記第２のＯＲＦが、ＩＬ－１２タンパク質、またはそのサブユニット、誘導体、フラグメント、アゴニスト、もしくはホモログをコードする、請求項５～７のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

前記第２のＯＲＦが、配列番号５９と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記第２のＯＲＦが第２の非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが第２の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、前記第２のＯＰＳが少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む、請求項５～９のいずれかに記載の組成物。

【請求項11】

前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記第１のＯＰＳが、前記第２のＯＰＳに対して少なくとも１つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記第１のＯＰＳおよび前記第２のＯＰＳが、同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物が、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含む送達組成物を含む、請求項１～１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項15】

前記第１のＯＰＳが、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。

【請求項16】

前記第１のＯＰＳが、すべてが互いに異なる少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。

【請求項17】

前記第１のＯＰＳが、筋肉、肝臓、脳、乳房、内皮、膵臓、結腸、腎臓、肺、脾臓、および皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群より選択される１つ以上の器官または組織を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。

【請求項18】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－９８、Ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１４１、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－１４８ａ／ｂ、ｍｉＲＮＡ－１４３、ｍｉＲＮＡ－１４５、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０５、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー、ｍｉＲＮＡ－８７７、ｍｉＲＮＡ－４３００、ｍｉＲＮＡ－４７２０、および／またはｍｉＲＮＡ－６７６１に結合する１つ以上の配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１７のいずれかに記載の組成物。

【請求項19】

前記第１のＯＰＳが、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１～１８のいずれかに記載の組成物。

【請求項20】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。

【請求項21】

前記第１のＯＰＳが、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含む、請求項１～２０のいずれかに記載の組成物。

【請求項22】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２１のいずれかに記載の組成物。

【請求項23】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２２のいずれかに記載の組成物。

【請求項24】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２４のいずれかに記載の組成物。

【請求項26】

前記第１のＯＰＳが、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２５のいずれかに記載の組成物。

【請求項27】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２６のいずれかに記載の組成物。

【請求項28】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～２７のいずれかに記載の組成物。

【請求項29】

前記抗原が、ウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項１～２８のいずれかに記載の組成物。

【請求項30】

前記抗原がコロナウイルススパイクタンパク質を含む、請求項２９に記載の組成物。

【請求項31】

前記抗原が変異体コロナウイルススパイクタンパク質を含む、請求項２９に記載の組成物。

【請求項32】

前記コロナウイルススパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項３０または３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記抗原が、インフルエンザタンパク質もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項２９に記載の組成物。

【請求項34】

前記インフルエンザタンパク質がヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス－２、および／または核タンパク質からなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記インフルエンザタンパク質が、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＡ型インフルエンザのサブタイプのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６から選択される、請求項３３に記載の組成物。

【請求項36】

前記抗原が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質、もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項２９に記載の組成物。

【請求項37】

前記呼吸器合胞体ウイルスの前記タンパク質がＦ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項２９に記載の組成物。

【請求項39】

前記ＨＩＶタンパク質が、糖タンパク質１２０中和エピトープまたは糖タンパク質１４５である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記抗原が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項１～２８のいずれかに記載の組成物。

【請求項41】

結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の前記タンパク質が、ＥＳＡＴ－６、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４、Ｒｖ２６２６、および／またはＲｐｆＤ－Ｂから選択される、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記抗原が、結腸直腸腫瘍抗原を含む腫瘍関連抗原である、請求項１～２８のいずれかに記載の組成物。

【請求項43】

前記抗原が、ＭＵＣ１である腫瘍関連抗原である、請求項１～２８のいずれかに記載の組成物。

【請求項44】

前記抗原が、ネオ抗原である腫瘍関連抗原である、請求項１～２８のいずれかに記載の組成物。

【請求項45】

前記第１のｍＲＮＡコンストラクトが第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含み、前記第２のＯＲＦがＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードする、請求項１～４または１４～４４のいずれかに記載の組成物。

【請求項46】

前記第１のｍＲＮＡコンストラクトが、さらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含み、前記さらなるＯＲＦが、前記第１のＯＲＦによってコードされる前記抗原とは異なる抗原をコードする、請求項１～４４のいずれかに記載の組成物。

【請求項47】

前記さらなるＯＲＦによってコードされる前記抗原が、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、もしくは腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択される、請求項４６に記載の組成物。

【請求項48】

前記第２のＯＰＳが、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項49】

前記第２のＯＰＳが、すべてが互いに異なる少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８のいずれかに記載の組成物。

【請求項50】

前記第２のＯＰＳが、筋肉、肝臓、脳、乳房、内皮、膵臓、結腸、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群より選択される１つ以上の器官または組織を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１０～１３または４８～４９のいずれかに記載の組成物。

【請求項51】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－９８、Ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１４１、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－１４８ａ／ｂ、ｍｉＲＮＡ－１４３、ｍｉＲＮＡ－１４５、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０５、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー、ｍｉＲＮＡ－８７７、ｍｉＲＮＡ－４３００、ｍｉＲＮＡ－４７２０、およびｍｉＲＮＡ－６７６１と結合できる１つ以上の配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５０のいずれかに記載の組成物。

【請求項52】

前記第２のＯＰＳが、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１０～１３または４８～５１のいずれかに記載の組成物。

【請求項53】

前記第２のＯＰＳが、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含む、請求項１０～１３または４８～５２のいずれかに記載の組成物。

【請求項54】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５３のいずれかに記載の組成物。

【請求項55】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５４のいずれかに記載の組成物。

【請求項56】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５５のいずれかに記載の組成物。

【請求項57】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５６のいずれかに記載の組成物。

【請求項58】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５７のいずれかに記載の組成物。

【請求項59】

前記第２のＯＰＳが、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５８のいずれかに記載の組成物。

【請求項60】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～５９のいずれかに記載の組成物。

【請求項61】

前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ－１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～６０のいずれかに記載の組成物。

【請求項62】

前記第１のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含み、
前記第２のＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－１９２、および／またはｍｉＲＮＡ３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０～１３または４８～６１のいずれかに記載の組成物。

【請求項63】

少なくとも第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第３のｍＲＮＡコンストラクトをさらに含み、前記第３のＯＲＦが、前記第１のＯＲＦによってコードされる前記抗原とは異なる抗原をコードし、前記抗原が細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、もしくは腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択される、請求項１～６２のいずれかに記載の組成物。

【請求項64】

前記第３のＯＲＦが少なくとも第３の非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが少なくとも第３の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、前記第３のＯＰＳが複数の器官を保護し、前記第３のＯＰＳが少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

前記第１のＯＲＦが、コロナウイルススパイクタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントをコードし、前記第３のＯＲＦが、インフルエンザタンパク質またはその変異体の全部または一部を含むウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントをコードする、請求項６３または６４に記載の組成物。

【請求項66】

前記組成物が、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、動脈内、および／または吸入による投与に好適である、請求項１～６５のいずれかに記載の組成物。

【請求項67】

病原性疾患の予防または処置の方法における使用のための、請求項１～６６のいずれかに記載の組成物。

【請求項68】

前記方法が、前記組成物を必要とする対象に投与することを含む、請求項６７に記載の使用のための組成物。

【請求項69】

前記病原性疾患がコロナウイルスによって引き起こされる、請求項６７または６８に記載の使用のための組成物。

【請求項70】

前記病原性疾患が前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる、請求項６９に記載の使用のための組成物。

【請求項71】

請求項８または９のいずれかに記載の組成物を必要とする対象に投与することを含む、Ｔｈ１免疫応答を増加させる方法。

【請求項72】

少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトであって、前記第１のＯＲＦが、細菌タンパク質および／またはウイルスタンパク質から選択される抗原をコードする、少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトと、
少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第２のｍＲＮＡコンストラクトを含む第２のコンストラクトであって、前記ＯＲＦがＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードし、前記第２のＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、前記ＯＰＳが少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、第２のコンストラクト
と、
インビボ送達組成物とを含む組成物であって、
前記第１および第２のコンストラクトが、前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、組成物。

【請求項73】

前記ＯＲＦが、ＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログをコードする、請求項７２に記載の組成物。

【請求項74】

前記送達組成物が、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含む、請求項７２または７３に記載の組成物。

【請求項75】

前記ＯＰＳが、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項７２～７４のいずれかに記載の組成物。

【請求項76】

前記ＯＰＳが、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含む、請求項７２～７５のいずれかに記載の組成物。

【請求項77】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～７６のいずれかに記載の組成物。

【請求項78】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～７７のいずれかに記載の組成物。

【請求項79】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～７８のいずれかに記載の組成物。

【請求項80】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～７９のいずれかに記載の組成物。

【請求項81】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～８０のいずれかに記載の組成物。

【請求項82】

前記ＯＰＳが、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～８１のいずれかに記載の組成物。

【請求項83】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～８２のいずれかに記載の組成物。

【請求項84】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ－１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項７２～８３のいずれかに記載の組成物。

【請求項85】

前記抗原が、ウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項７２～８４のいずれかに記載の組成物。

【請求項86】

前記抗原がコロナウイルススパイクタンパク質を含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項87】

前記抗原が変異体コロナウイルススパイクタンパク質を含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項88】

前記コロナウイルススパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項８６または８７に記載の組成物。

【請求項89】

前記抗原が、インフルエンザタンパク質もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項90】

前記インフルエンザタンパク質がヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス－２、および／または核タンパク質からなる群より選択される、請求項８９に記載の組成物。

【請求項91】

前記インフルエンザタンパク質が、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＡ型インフルエンザのサブタイプのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６から選択される、請求項８９に記載の組成物。

【請求項92】

前記抗原が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質、もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項93】

前記呼吸器合胞体ウイルスの前記タンパク質がＦ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質である、請求項９２に記載の組成物。

【請求項94】

前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項95】

前記ＨＩＶタンパク質が、糖タンパク質１２０中和エピトープまたは糖タンパク質１４５である、請求項９４に記載の組成物。

【請求項96】

前記抗原が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項７２～８４のいずれかに記載の組成物。

【請求項97】

結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の前記タンパク質が、ＥＳＡＴ－６、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４、Ｒｖ２６２６、および／またはＲｐｆＤ－Ｂから選択される、請求項９６に記載の組成物。

【請求項98】

病原性疾患の予防方法における使用のための、請求項７２～９６のいずれかに記載の組成物。

【請求項99】

請求項７３に記載の組成物を必要とする対象に投与することを含む、Ｔｈ１免疫応答を増加させる方法。

【請求項100】

少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトであって、
前記少なくとも１つのＯＲＦがＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードし、前記ＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、前記ＯＰＳが少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトと、インビボ送達組成物と、を含む組成物であって、
前記ｍＲＮＡコンストラクトが前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、組成物。

【請求項101】

前記ＯＲＦが、ＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログをコードする、請求項１００に記載の組成物。

【請求項102】

前記送達組成物が、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含む、請求項１００または１０１に記載の組成物。

【請求項103】

前記ＯＰＳが、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１００～１０２のいずれかに記載の組成物。

【請求項104】

前記ＯＰＳが、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含む、請求項１００～１０４のいずれかに記載の組成物。

【請求項105】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１０４のいずれかに記載の組成物。

【請求項106】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１０５のいずれかに記載の組成物。

【請求項107】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１０６のいずれかに記載の組成物。

【請求項108】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１０７に記載の組成物。

【請求項109】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１０８のいずれかに記載の組成物。

【請求項110】

前記ＯＰＳが、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１０９のいずれかに記載の組成物。

【請求項111】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１１０のいずれかに記載の組成物。

【請求項112】

前記ＯＰＳが、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ－１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１００～１１１のいずれかに記載の組成物。

【請求項113】

病原性疾患の予防方法における使用のための、請求項１００～１１２のいずれかに記載の組成物であって、前記方法が、
前記組成物を必要とする対象に投与することと、
前記対象にワクチン組成物を同時投与することと、を含む、請求項１００～１１２のいずれかに記載の組成物。

【請求項114】

請求項１０１に記載の組成物を必要とする対象に投与することを含む、Ｔｈ１免疫応答を増加させる方法。

【請求項115】

請求項１００～１１２のいずれかに記載の組成物と、
トキソイドワクチン、組み換えワクチン、コンジュゲートワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ＤＮＡベースのワクチン、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組み換えベクターベースのワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるワクチンと、を含む、組成物。

【請求項116】

１つ以上の病原性疾患を処置もしくは予防するか、または免疫応答を改善する方法であって、前記方法が、
少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトであって、前記第１のＯＲＦが、細菌タンパク質、もしくはウイルスタンパク質、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択される抗原をコードし、前記第１のＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、前記ＯＰＳが複数の器官を保護し、前記第１のＯＰＳが少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトと、インビボ送達組成物と、を含む組成物を、必要とする対象に投与することを含み、
前記ｍＲＮＡコンストラクトが前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、方法。

【請求項117】

少なくとも第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物を前記対象に同時投与することをさらに含み、前記第２のＯＲＦが、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードする、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記第２のＯＲＦが、ＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログをコードする、請求項１１６または請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記第２のＯＲＦが、配列番号５９と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１１６～１１８のいずれかに記載の方法。

【請求項120】

前記第２のＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが複数の器官を保護する少なくとも第２のＯＰＳを含み、前記第２のＯＰＳが少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、請求項１１６～１１９のいずれかに記載の方法。

【請求項121】

前記第１のＯＰＳが、前記第２のＯＰＳに対してｍｉＲＮＡ標的配列の異なるセットを含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記第１のＯＰＳおよび前記第２のＯＰＳが同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項123】

前記送達組成物が、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含む、請求項１１６～１２２のいずれかに記載の方法。

【請求項124】

前記病原性疾患がコロナウイルスによって引き起こされる、請求項１１６～１２３のいずれかに記載の方法。

【請求項125】

前記病原性疾患がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記抗原が、コロナウイルススパイクタンパク質の全部または一部を含むウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項１２４または１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記抗原が、変異体コロナウイルススパイクタンパク質の全部または一部を含むウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、請求項１２４または１２５に記載の方法。

【請求項128】

前記コロナウイルススパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項１２６または１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記第１のｍＲＮＡコンストラクトが、さらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含み、前記さらなるＯＲＦが、前記第１のＯＲＦによってコードされる前記抗原とは異なる抗原をコードする、請求項１１６～１２８のいずれかに記載の方法。

【請求項130】

少なくとも第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第３のｍＲＮＡコンストラクトを前記対象に同時投与することをさらに含み、前記第３のＯＲＦが、前記第１のＯＲＦによってコードされる前記抗原とは異なる抗原をコードする、請求項１１６～１２８のいずれかに記載の方法。

【請求項131】

１つ以上の病原性疾患を予防するか、または免疫応答を改善する方法であって、前記方法が、
ワクチン組成物を必要とする対象に投与することと、
少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトであって、前記少なくとも１つのＯＲＦがＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードし、前記ＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、前記ＯＰＳが少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトと；インビボ送達組成物であって、前記ｍＲＮＡコンストラクトが前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、インビボ送達組成物とを含むアジュバント組成物を、前記対象に同時投与することとを含む、方法。

【請求項132】

前記ワクチン組成物が、トキソイドワクチン、組み換えワクチン、コンジュゲートワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ＤＮＡベースのワクチン、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組み換えベクターベースのワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記ワクチン組成物が、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトであって、前記第１のＯＲＦが、細菌タンパク質またはその一部、ウイルスタンパク質またはその一部、およびネオ抗原またはその一部から選択される抗原をコードする、第１のｍＲＮＡコンストラクトと、インビボ送達組成物とを含み、前記ｍＲＮＡコンストラクトが、前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、請求項１３１または１３２に記載の方法。

【請求項134】

同時投与することが、前記ワクチン組成物および前記アジュバント組成物を同時に、またはいずれかの順序で連続して投与することを含む、請求項１１７～１３３のいずれかに記載の方法。

【請求項135】

前記ワクチン組成物および／または前記アジュバント組成物が、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、動脈内、および／または吸入によって投与される、請求項１１６～１３４のいずれかに記載の方法。

【請求項136】

前記病原性疾患が細胞内病原体によって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項137】

前記病原性疾患が潜伏性感染症である、請求項１１６～１３６のいずれかに記載の方法。

【請求項138】

前記病原性疾患が活動性感染症である、請求項１１６～１３６のいずれかに記載の方法。

【請求項139】

前記病原性疾患がインフルエンザウイルスによって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項140】

前記病原性疾患がコロナウイルスによって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項141】

前記病原性疾患がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記病原性疾患が呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）によって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項143】

前記病原性疾患がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項144】

前記病原性疾患が水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項145】

前記病原性疾患が結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる、請求項１１６～１３５のいずれかに記載の方法。

【請求項146】

癌を処置または予防する方法であって、前記方法が、
少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトであって、前記第１のＯＲＦが、腫瘍関連抗原またはそのエピトープ含有フラグメントをコードし、前記第１のＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、前記ＯＰＳが複数の器官を保護し、前記第１のＯＰＳが少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトと、インビボ送達組成物と、を含む第１の組成物を、必要とする対象に投与することを含み、
前記ｍＲＮＡコンストラクトが前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、方法。

【請求項147】

前記腫瘍関連抗原が結腸直腸腫瘍抗原を含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記腫瘍関連抗原がＭＵＣ１である、請求項１４６に記載の方法。

【請求項149】

前記腫瘍関連抗原がネオ抗原である、請求項１４６に記載の方法。

【請求項150】

前記ネオ抗原が前記対象に対して個別化されている、請求項１４９に記載の方法。

【請求項151】

少なくとも第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む第２の組成物を前記対象に同時投与することをさらに含み、前記第２のＯＲＦが、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードする、請求項１４６～１５０のいずれかに記載の方法。

【請求項152】

同時投与することが、前記第１の組成物および前記第２の組成物を同時に、またはいずれかの順序で連続して投与することを含む、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

癌を処置または予防する方法であって、前記方法が、
癌治療用ワクチン組成物を必要とする対象に投与することと、
少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトであって、前記少なくとも１つのＯＲＦがＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードし、前記ＯＲＦが少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、前記ＵＴＲが複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、前記ＯＰＳが少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々が対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている、少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトと；インビボ送達組成物であって、前記ｍＲＮＡコンストラクトが前記送達組成物内に含まれるか、または前記送達組成物に吸着される、インビボ送達組成物とを含む組成物を、前記対象に同時投与することとを含む、方法。

【請求項154】

前記癌治療用ワクチン組成物が、前記対象に腫瘍関連抗原を送達する、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

前記腫瘍関連抗原が、ウイルスベクターを使用して前記対象に送達される、請求項１５４に記載の方法。

【請求項156】

前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１５５に記載の方法。

【請求項157】

前記アデノウイルスベクターがＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２である、請求項１５６に記載の方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２０年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／０５９，４５８号と、２０２１年２月２２日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２１／１９０２８号に対する優先権の利益を主張する。その各々の内容は、その全体が引用により援用される。

【0002】

本発明は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）送達技術、ならびにこれらのｍＲＮＡ送達技術をさまざまな治療、診断、および予防の適応症において使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

特定の標的組織または器官において、たとえばポリペプチドなどの特定の遺伝子産物の発現を誘導する能力がしばしば所望される。多くの状況において、標的組織または器官は２つ以上の細胞型を含み、こうした場合には、異なる細胞型において異なる程度で遺伝子産物を発現すること、すなわち標的組織における異なる細胞型の間で遺伝子産物の示差的発現を提供することもしばしば所望される。たとえば遺伝子療法において、変異した遺伝子および／または機能しない遺伝子を標的細胞においてインタクトコピーで置換し得るが、近隣の細胞、組織、および器官におけるオフターゲットのタンパク質産生を最小化することも有用である。同様に、たとえばＣＯＶＩＤ－１９に対するスパイクタンパク質などのワクチン抗原に対する遺伝子産物は、最大の応答を確実にするために、好ましくは免疫系の樹状細胞の中または周囲で発現される。

【0004】

遺伝子療法は、コードポリヌクレオチドを標的細胞に導入するためにウイルスベクターに頼ることが多いが、ウイルスを使用せずにポリヌクレオチドを細胞に送達する他の技術も存在する。ウイルスの利点としては、トランスフェクション率が比較的高くなり得ること、およびウイルスが標的細胞に入るときの結合タンパク質の制御によってウイルスに特定の細胞型を標的とさせ得ることが挙げられる。対照的に、コードポリヌクレオチドを細胞に導入する非ウイルスの方法は、低いトランスフェクション率と、特定の器官および細胞型に対する標的化発現のための選択肢が限定されることとによる問題を有し得る。しかし、ウイルス介入の性質は毒性および炎症のリスクを有するが、導入された因子の発現の持続時間および程度に対する制御も限定される。

【0005】

生物学的アプローチに基づく腫瘍治療は、たとえば特に直接的な細胞溶解、細胞傷害性免疫エフェクター機構、および血管虚脱を介するものなど、多数の多様な機構を使用して、より正確に癌を標的にして破壊するため、従来の化学療法に対する利点を有する。結果として、こうしたアプローチの可能性に対する臨床研究の数が有意に増加している。しかし、治療活性の範囲が多様であるため、前臨床研究および臨床研究は複雑である。なぜなら、それらの治療可能性に複数のパラメータが影響し得るため、処置失敗の原因または治療活性を増強し得る方法の特定が困難であり得るからである。オンターゲット活性、腫瘍特異性を維持し、かつ副作用を低減することも、こうした実験的かつ有力な療法の主要な課題である。

【0006】

ウイルスに基づく療法は、疾患処置の多くの態様に対処するための有望なアプローチとして出現してきた。不活化または弱毒化ウイルスに基づく癌ワクチンは、難治性の癌に対するかなりの可能性を提供する。しかし、治療用ウイルスの有効性は、しばしば身体自体の免疫応答によって妨害されるため、全身投与を回避するために適用が限定される。よって、現在利用可能な治療用ウイルスのアプローチの範囲を改善および増強することができる新規の組成物および方法を提供することは有利であろう。

【0007】

ワクチンは、感染性疾患に対する非常に有効な予防的介入であることが多い。しかし、いくつかの適用およびいくつかの状況では、ワクチンの効力が最適でなくなり得る。たとえば、送達された抗原に対する有効な応答の発生は、対象の免疫系の能力に依存する。すべての対象において、免疫は経時的に失われる可能性があり、かつ／または特定の抗原に対する免疫応答は不十分であり得る。

【0008】

同様に、特定のタイプまたはクラスの病原体は、抗免疫適応、迅速な変異、または自然経過に起因して、ワクチン接種が困難であり得る。たとえばウイルス、細胞内細菌、または単細胞真核生物（たとえばマラリア寄生虫など）などの細胞内寄生体はしばしば、それに対するワクチンを提供することが困難であり得る。

【0009】

しばしば、生弱毒化ワクチンは改善された応答を提供し得るが、付随するリスクを有し、それは主に弱毒化病原体の再活性化のリスクである。既存のワクチン技術の他の欠点としては、ワクチンによって誘発される免疫応答による効果の低い病原体変異体が出現する（たとえば、標的抗原をコードする遺伝子に変異が生じたときなど）「ワクチンエスケープ」の可能性、経時的な免疫の喪失、および不完全な耐性が挙げられる。

【0010】

したがって、これらすべての理由から、ワクチンは、免疫応答を増加させるためのアジュバントと共に提供されることが多いが、これらのアジュバント自体が、たとえば症状の誘導および自己免疫攻撃のリスクなどのリスクを有する。したがって、特にワクチン接種することがより困難な病原体に関して、より有効かつ安全なワクチンおよび／またはアジュバントを提供する必要がある。

【0011】

特許文献１には、マイクロＲＮＡ結合部位を含む操作されたゲノムを有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスが記載されている。

【0012】

特許文献２は、哺乳動物細胞または組織において目的のポリペプチドを発現させるための方法に関し、この方法は、前記哺乳動物細胞または組織を、目的のポリペプチドをコードする改変ｍＲＮＡを含む製剤と接触させることを含む。特許文献３には、マイクロＲＮＡ結合部位を含み得る少なくとも１つの末端修飾を含む核酸の設計、調製、製造、および／または製剤化が記載されている。前述の先行技術は、同時投与される治療剤または因子で処置される対象の体内の単一または複数の器官タイプの有効な保護を確実にするという問題に取り組んでいない。

【0013】

特許文献４および特許文献５は、単数または複数の標的器官内の少なくとも第１および第２の細胞型におけるコード配列の示差的発現を可能にするｍｉＲＮＡ結合部位配列を含む、１つ以上の標的器官内での１つ以上のポリペプチドの発現のためのｍＲＮＡ配列の送達のための組成物および方法を記載する。

【0014】

特定の器官および／または組織におけるたとえばｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド配列の発現を調節するための、さらに改善され最適化された方法および組成物をさらに開発する必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】国際公開第２０１７／１３２５５２（Ａ１）号公報

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１３／１５６８４９（Ａ１）号公報

【特許文献3】国際公開第２０１６／０１１３０６（Ａ２）号公報

【特許文献4】国際公開第２０１９／０５１１００（Ａ１）号公報

【特許文献5】国際公開第２０１９／１５８９５５（Ａ１）号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

さまざまな実施形態において、本発明は、たとえばワクチンおよび／またはアジュバント組成物などとして使用するための、たとえばｍＲＮＡコンストラクトなどのヌクレオチドコード産物を送達するために好適な組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、送達される組成物の１つ以上は、特に器官保護配列の提供によって、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を含むことによって、制御された発現に適合される。本明細書に記載されるすべての態様において、「ｍＲＮＡコンストラクト」は、翻訳されてタンパク質産物を産生できる環状または環状化ＲＮＡコンストラクトを含むことが予期される。

【課題を解決するための手段】

【0017】

第１の態様では、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を含む第１のｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物が提供され、ここで第１のＯＲＦは抗原をコードする。第１のＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ：ｏｒｇａｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、第１のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ）標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている。

【0018】

第１のｍＲＮＡコンストラクトは、インビボ送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着されてもよい。抗原は、病原性微生物タンパク質および腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントからなる群より選択されてもよい。病原性微生物タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、寄生体タンパク質、およびプリオンからなる群より選択されてもよい。

【0019】

抗原は、ウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよい。抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質、変異体コロナウイルススパイクタンパク質、適切にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含んでもよい。抗原は、インフルエンザタンパク質もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切にはインフルエンザタンパク質は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス－２、および／または核タンパク質からなる群より選択される。インフルエンザタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＡ型インフルエンザのサブタイプのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６から選択されてもよい。抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ：ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）タンパク質、もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質はＦ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質である。抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）タンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、ＨＩＶタンパク質は糖タンパク質１２０中和エピトープまたは糖タンパク質１４５である。

【0020】

抗原は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質は、ＥＳＡＴ－６、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４、Ｒｖ２６２６、および／またはＲｐｆＤ－Ｂから選択される。

【0021】

抗原は、腫瘍関連抗原であってもよい。腫瘍関連抗原は、結腸直腸腫瘍抗原、ＭＵＣ１、および／またはネオ抗原を含んでもよい。

【0022】

第１のｍＲＮＡコンストラクトは、さらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含んでもよく、さらなるＯＲＦは、第１のＯＲＦによってコードされる抗原とは異なる抗原をコードする。さらなるＯＲＦは、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、もしくは腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択されてもよい。さらなる抗原は、第１のＯＲＦによってコードされる抗原の同一性とは独立に、第１のＯＲＦによってコードされる抗原と任意の可能性で類似していてもよい。

【0023】

いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡコンストラクトは、さらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含んでもよく、さらなるＯＲＦは炎症性サイトカインをコードする。炎症性サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択されてもよい。

【0024】

第１のＯＰＳは、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第１のＯＰＳは、すべてが互いに異なる少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第１のＯＰＳのｍｉＲＮＡ配列のいずれかが反復されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のＯＰＳは、筋肉、肝臓、脳、乳房、内皮、膵臓、結腸、腎臓、肺、脾臓、および皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群、より具体的には筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群より選択される１つ以上の器官または組織を保護するように選択されるｍｉＲＮＡ配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－９８、Ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１４１、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－１４８ａ／ｂ、ｍｉＲＮＡ－１４３、ｍｉＲＮＡ－１４５、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０５、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー（たとえばｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｂ、またはｃ）、ｍｉＲＮＡ－８７７、ｍｉＲＮＡ－４３００、ｍｉＲＮＡ－４７２０、および／またはｍｉＲＮＡ－６７６１に結合する１つ以上の配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。第１のＯＰＳは、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含んでもよい。第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／またはｍｉＲ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合ができる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、組成物は第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第２のｍＲＮＡコンストラクトをさらに含み、第２のＯＲＦは炎症性サイトカインをコードする。炎症性サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、およびＧＭ－ＣＳＦからなる群より選択されてもよい。第２のｍＲＮＡコンストラクトは、送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着されてもよく、この送達組成物は第１のｍＲＮＡコンストラクトに関連するものと同じであっても異なっていてもよい。送達組成物は、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含んでもよい。

【0027】

第２のＯＲＦは、ＩＬ－１２タンパク質、またはそのサブユニット、誘導体、フラグメント、アゴニスト、もしくはホモログをコードしてもよい。特に、第２のＯＲＦは配列番号５９と少なくとも９０％同一である配列を含んでもよい。

【0028】

いくつかの実施形態では、第２のＯＲＦは第２の非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは第２の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、第２のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む。少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されてもよい。第２のＯＰＳは、上記で考察された第１のＯＰＳの任意の変形と同様に定義されてもよく、第１のＯＰＳの同一性とは独立して変動し得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、第２のＯＰＳは、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。第２のＯＰＳは、すべてが互いに異なる少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第２のＯＰＳは、筋肉、肝臓、脳、乳房、内皮、膵臓、結腸、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群；より具体的には筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、皮膚、心臓、胃腸器官、生殖器、および食道からなる群より選択される１つ以上の器官または組織を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－９８、Ｌｅｔ７ ｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１４１、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－１４８ａ／ｂ、ｍｉＲＮＡ－１４３、ｍｉＲＮＡ－１４５、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０５、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー（たとえばｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｂ、またはｃ）ファミリー（たとえばｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｂ、またはｃ）、ｍｉＲＮＡ－８７７、ｍｉＲＮＡ－４３００、ｍｉＲＮＡ－４７２０、および／またはｍｉＲＮＡ－６７６１に結合する１つ以上の配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／またはｍｉＲＮＡ－１９２と結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。第２のＯＰＳは、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含んでもよい。第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／またはｌｅｔ７ａ／ｂと結合できる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／もしくはｍｉＲ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ならびに／またはｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合ができる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0031】

第１のＯＰＳは、第２のＯＰＳに対して少なくとも１つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第１のＯＰＳおよび第２のＯＰＳは、同じｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。一実施形態では、第１のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、およびｍｉＲ－２０３ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含み、第２のＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、および／またはｍｉＲＮＡ３０ａと結合できるｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0032】

組成物は、少なくとも第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第３のｍＲＮＡコンストラクトを（第２のｍＲＮＡコンストラクトに加えて、またはその代わりに）さらに含んでもよく、第３のＯＲＦは、第１のＯＲＦによってコードされる抗原とは異なる抗原をコードし、その抗原は細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、もしくは腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択される。第３のＯＲＦは少なくとも第３の非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されてもよく、ＵＴＲは少なくとも第３の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、第３のＯＰＳは複数の器官を保護し、第３のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている。第３のＯＰＳは、上記で考察された第１または第２のＯＰＳの任意の変形と同様に定義されてもよく、第１または第２のＯＰＳの同一性とは独立して変動し得る。

【0033】

一実施形態において、第１のＯＲＦは、コロナウイルススパイクタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントをコードし、第３のＯＲＦは、インフルエンザタンパク質またはその変異体の全部または一部を含むウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントをコードする。

【0034】

組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、動脈内、および／または吸入による投与に好適であってもよい。

【0035】

第２の態様では、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトと、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第２のｍＲＮＡコンストラクトを含む第２のコンストラクトとを含む組成物が提供され、ここでＯＲＦは炎症性サイトカインをコードし、第２のＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、ＯＰＳは少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている。

【0036】

この第２の態様の組成物の構成要素は、上記で定義された第１の態様の対応する因子の任意の変形と同様に定義されてもよく、上述のとおり、たとえばさらなるＯＲＦおよびさらなるｍＲＮＡコンストラクトなどのさらなる構成要素も含まれてもよい。たとえば、第１のｍＲＮＡコンストラクトのＯＲＦは、細菌タンパク質および／もしくはウイルスタンパク質から選択される抗原をコードしてもよく、かつ／または第１の態様について上述したとおりに定義されてもよい。組成物はインビボ送達組成物を含んでもよく、第１および／または第２のコンストラクトは、送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着されてもよい。送達組成物は、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含んでもよい。

【0037】

第２のｍＲＮＡコンストラクトのＯＲＦは、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される炎症性サイトカインをコードしてもよく、かつＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログをコードしてもよい。

【0038】

第２のコンストラクトのＯＰＳは、上記の第１の態様について記載されたＯＰＳのいずれかとして定義されてもよい。いくつかの実施形態において、ＯＰＳは、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む。ＯＰＳは、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含んでもよい。ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／もしくはｍｉＲＮＡ－１９２との結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／もしくはｌｅｔ７ａ／ｂとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／もしくはｍｉＲ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ならびに／またはｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合ができる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。一実施形態において、ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できるｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0039】

第１のｍＲＮＡコンストラクトによってコードされる抗原は、病原性微生物タンパク質および腫瘍関連抗原、またはそのエピトープ含有フラグメントからなる群より選択されてもよい。病原性微生物タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、寄生体タンパク質、およびプリオンからなる群より選択されてもよい。

【0040】

抗原は、ウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよい。抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質、変異体コロナウイルススパイクタンパク質、適切にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含んでもよい。抗原は、インフルエンザタンパク質もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切にはインフルエンザタンパク質は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス－２、および／または核タンパク質からなる群より選択される。インフルエンザタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＡ型インフルエンザのサブタイプのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６から選択されてもよい。抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質、もしくはその変異体、またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質はＦ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質である。抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、ＨＩＶタンパク質は糖タンパク質１２０中和エピトープまたは糖タンパク質１４５である。

【0041】

抗原は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよく、適切には、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質は、ＥＳＡＴ－６、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４、Ｒｖ２６２６、および／またはＲｐｆＤ－Ｂから選択される。

【0042】

さらなる実施形態では、上記の任意の態様または変形において記載される組成物は、病原性疾患の予防または処置の方法における使用のためのものであり、この方法は、組成物を必要とする対象に投与すること；および／または記載されるさまざまなコンストラクトを必要とする対象に同時投与することを含んでもよい。病原性疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであり得るコロナウイルスによって引き起こされてもよい。

【0043】

さらなる実施形態では、Ｔｈ１免疫応答を増加させる方法が提供され、この方法は上記で定義された組成物を投与することを含み、この組成物には特にＩＬ－１２タンパク質、またはそのサブユニット、誘導体、フラグメント、アゴニスト、もしくはホモログをコードするＯＲＦが含まれる。

【0044】

第３の態様では、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物が提供され、ここで少なくとも１つのＯＲＦは炎症性サイトカインをコードし、ＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、ＯＰＳは少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化されている。

【0045】

再び、この第３の態様の組成物の構成要素は、上記で定義された第１または第２の態様の対応する因子の任意の変形と同様に定義されてもよく、特に第２のｍＲＮＡコンストラクトと同様に定義される。組成物はインビボ送達組成物をさらに含んでもよく、ｍＲＮＡコンストラクトは送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される。送達組成物は、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含んでもよい。炎症性サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択されてもよく、ＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログであってもよい。

【0046】

ＯＰＳは、上記の態様について説明されたＯＰＳのいずれかとして定義されてもよい。いくつかの実施形態において、ＯＰＳは、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚からなる群より選択される１つ以上の器官を保護するように選択されたｍｉＲＮＡ配列を含む。ＯＰＳは、配列番号４４～５７の１つ以上から選択される配列を含んでもよい。

【0047】

ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、および／もしくはｍｉＲＮＡ－１９２との結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ１３３ａ、ｍｉＲＮＡ２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、ｍｉＲＮＡ２０５、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、ｍｉＲＮＡ３０ａ、および／もしくはｌｅｔ７ａ／ｂとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－３０ａ、および／もしくはｍｉＲ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａとの結合；ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４との結合ができる配列から選択される少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列、ならびにｍｉＲＮＡ－１２２と結合できる２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

【0048】

一実施形態では、記載される組成物は、病原性疾患の予防方法における使用のためのものであり、この方法は、組成物を必要とする対象に投与することと、その対象にワクチン組成物を同時投与することとを含む。

【0049】

別の実施形態では、組成物は、トキソイドワクチン、組み換えワクチン、コンジュゲートワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ＤＮＡベースのワクチン、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組み換えベクターベースのワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるワクチンをさらに含む。

【0050】

第４の態様では、１つ以上の病原性疾患を処置もしくは予防するか、または免疫応答を改善する方法が提供され、この方法は、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物を必要とする対象に投与することを含み、ここで第１のＯＲＦは、細菌タンパク質、もしくはウイルスタンパク質、またはそのエピトープ含有フラグメントから選択される抗原をコードする。第１のＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、ＯＰＳは複数の器官を保護し、第１のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化され、およびインビボ送達組成物を含み、ｍＲＮＡコンストラクトは送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される。送達組成物は、たとえばポリマー粒子などの粒子、リポソーム、リピドイド粒子、およびウイルスベクターからなる群より選択される送達ベクターを含んでもよい。

【0051】

この第４の態様において使用される組成物の構成要素は、上記で定義された態様の対応する因子の任意の変形と同様に定義されてもよく、上記の態様、特に第１の態様に記載されたさらなる構成要素を含んでもよい。

【0052】

いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物を対象に同時投与することをさらに含み、第２のＯＲＦは、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択され得る炎症性サイトカインをコードする。第２のＯＲＦは、ＩＬ－１２タンパク質、またはその誘導体、アゴニスト、もしくはホモログをコードしてもよい。第２のＯＲＦは、配列番号５９と少なくとも９０％同一である配列を含んでもよい。

【0053】

第１のＯＰＳは、第２のＯＰＳに対してｍｉＲＮＡ標的配列の異なるセットを含んでもよい。第１のＯＰＳおよび第２のＯＰＳは、同じｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。第１および／または第２のＯＰＳは、上述の態様におけるものと同様に独立して定義されてもよい。

【0054】

いくつかの実施形態において、病原性疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであり得るコロナウイルスによって引き起こされる。抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質または変異体コロナウイルススパイクタンパク質の全部または一部を含む、ウイルスタンパク質またはそのエピトープ含有フラグメントを含んでもよい。コロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であってもよい。

【0055】

いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡコンストラクトは、さらなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含み、さらなるＯＲＦは、第１のＯＲＦによってコードされる抗原とは異なる抗原をコードする。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む第３のｍＲＮＡコンストラクトを対象に同時投与することをさらに含み、第３のＯＲＦは、第１のＯＲＦによってコードされる抗原とは異なる抗原をコードする。

【0056】

第５の態様では、１つ以上の病原性疾患を予防するか、または免疫応答を改善する方法が提供され、この方法は、ワクチン組成物を必要とする対象に投与することと、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含むアジュバント組成物を対象に同時投与することとを含み、ここで少なくとも１つのＯＲＦは炎症性サイトカインをコードし、ＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、ＯＰＳは少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化され、アジュバント組成物はさらにインビボ送達組成物を含み、ｍＲＮＡコンストラクトは送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される。

【0057】

再び、この第４の態様において使用される組成物の構成要素は、上記で定義された態様の対応する因子の任意の変形と同様に定義されてもよく、上記の態様に記載されたさらなる構成要素を含んでもよい。

【0058】

炎症性サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択されてもよい。

【0059】

いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、トキソイドワクチン、組み換えワクチン、コンジュゲートワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ＤＮＡベースのワクチン、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組み換えベクターベースのワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトであって、第１のＯＲＦが抗原をコードする、第１のｍＲＮＡコンストラクトと、インビボ送達組成物であって、ｍＲＮＡコンストラクトが送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される、インビボ送達組成物とを含む。抗原は、任意の先行する態様と同様に定義されてもよい。

【0060】

同時投与することは、ワクチン組成物およびアジュバント組成物を同時に、またはいずれかの順序で連続して投与することを含んでもよい。ワクチン組成物および／またはアジュバント組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、動脈内、および／または吸入によって投与されてもよい。

【0061】

第４または第５の態様のいくつかの実施形態では、病原性疾患は細胞内病原体によって引き起こされる。病原性疾患は、潜伏性感染症または活動性感染症であってもよい。病原性疾患は、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ：Ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）、または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされてもよい。

【0062】

第６の態様では、癌を処置または予防する方法が提供され、この方法は、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも第１のｍＲＮＡコンストラクトを含む第１の組成物を必要とする対象に投与することを含み、第１のＯＲＦは腫瘍関連抗原またはそのエピトープ含有フラグメントをコードする。第１のＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは少なくとも第１の器官保護配列（ＯＰＳ）を含み、ＯＰＳは複数の器官を保護し、第１のＯＰＳは少なくとも２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化され、およびインビボ送達組成物を含み、ｍＲＮＡコンストラクトは送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される。

【0063】

いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む第２の組成物を対象に同時投与することをさらに含み、第２のＯＲＦは、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択され得る炎症性サイトカインをコードする。第２のｍＲＮＡコンストラクトは、任意の前述の態様で定義されるＯＰＳを含んでもよい。同時投与することは、第１の組成物および第２の組成物を同時に、またはいずれかの順序で連続して投与することを含んでもよい。

【0064】

第７の態様では、癌を処置または予防する方法が提供され、この方法は、癌治療用ワクチン組成物を必要とする対象に投与することと、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも１つのｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物を対象に同時投与することとを含み、少なくとも１つのＯＲＦは、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦから選択され得る炎症性サイトカインをコードする。ＯＲＦは少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）に機能的に連結されており、ＵＴＲは複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳを含み、ＯＰＳは少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、対応するｍｉＲＮＡ配列とハイブリダイズするために最適化され、およびインビボ送達組成物を含み、ｍＲＮＡコンストラクトは送達組成物内に含まれるか、またはそれに吸着される。

【0065】

いくつかの実施形態において、癌治療用ワクチン組成物は、腫瘍関連抗原を対象に送達する。ウイルスベクターを用いて腫瘍関連抗原が対象に送達され、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであってもよく、いくつかの実施形態ではＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２である。

【0066】

第６または第７の態様のいくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、結腸直腸腫瘍抗原および／またはＭＵＣ１を含む。腫瘍関連抗原はネオ抗原であってもよく、これは対象に対して個別化されてもよい。

【0067】

本明細書に記載されるさまざまな実施形態および実施例において本発明をさらに例示しており、当業者によって理解されるであろうとおり、その特徴はさらに組み合わされて付加的な実施形態を形成してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】本発明の実施形態による器官保護配列（ＯＰＳ）を組み込んだｍＲＮＡコンストラクトの概略図（すなわち、縮尺どおりではない）を示す図である。

【図2】本明細書に記載される組成物をさまざまな細胞型に投与した後のレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現を決定するために行われたプロトコルを示す概略図であり、蛍光顕微鏡（テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）およびＤＡＰＩフィルター）によって、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された細胞核によってｍＣｈｅｒｒｙシグナル分析が行われる。

【図3】上記プロトコル後の３つの肝細胞型におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す図であり、複数の器官保護配列（ＭＯＰ）を含有するｍＲＮＡであるｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ－５ＭＯＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたときの正常マウスおよびヒト肝細胞の両方における細胞シグナルが、対照ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをトランスフェクトした後のヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）または正常マウス肝細胞（ＡＭＬ１２）細胞において見出されるシグナルと比較して有意に低減することを実証するものである。画像は、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターによって取得された画像を重ね合わせたものであり、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルおよび細胞核染色を示す。

【図4】Ｃｙｔａｔｉｏｎ機器（バイオテック（Ｂｉｏｔｅｋ））を用いたトランスフェクト細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の定量化を示す図である。

【図5】図５Ａ～５Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰ処理細胞におけるシグナルの低減を示す図である。図５Ａは、本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた正常ヒト腎細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示し、ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰ処理細胞におけるシグナルの低減を示し、ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳の低減を示す。画像は、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルおよび細胞核染色を示す。図５Ｂは、Ｃｙｔａｔｉｏｎ機器（バイオテック）を使用した、トランスフェクトされた正常ヒト腎細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の定量化を示す。

【図6】図６Ａ～６Ｆは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列がＡＭＬ１２マウス肝細胞における発現を抑制するが、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）では抑制しないことを実証するものである。写真の各セットについて、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図６Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照Ｈｅｐ３Ｂ細胞（肝臓癌）を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図６Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図６Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図６Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ＡＭＬ１２細胞（正常肝臓）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図６Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図６Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル。

【図7】図７Ａ～７Ｆは、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列がＡＭＬ１２マウス肝細胞における発現を抑制するが、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）では抑制しないことを実証するものである。写真の各セットについて、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図７Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照Ｈｅｐ３Ｂ細胞（肝臓癌）を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図７Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図７Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図７Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ＡＭＬ１２細胞（正常肝臓）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図７Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図７Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル。

【図8】図８Ａ～８Ｂは、１回（１＊）、２回（２＊）、または４回（４＊）複製されたｍｉＲＮＡ－１２２に結合する完全一致多重ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＡＭＬ１２正常肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現の抑制にいくらかの用量依存性があるが（図８Ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ癌細胞では用量依存性がはるかに低いことを示す（図８Ｂ）。（図８Ａ）および（図８Ｂ）の各々について、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。ｍＲＮＡを注入していない対照、およびｍＣｈｅｒｒｙに対するｍＲＮＡであるがＭＯＰ配列を有さないものも含まれる。

【図9】図９Ａ～９Ｄは、ｍｉＲＮＡ１２２に結合する不完全一致二重鎖（２＊）ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされたＡＭＬ１２マウス肝臓肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図である。（図９Ａ）、（図９Ｂ）、（図９Ｃ）、および（図９Ｄ）の各々について、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図９Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ＡＭＬ１２細胞（正常肝臓）における細胞核染色を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図９Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図９Ｃ）２＊不完全一致ｍｉＲＮＡ－１２２ ＭＯＰ配列（非最適化）を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、下のパネルはＡＭＬ１２細胞においてｍＣｈｅｒｒｙの検出可能な発現が存在することを示す、（図９Ｄ）２＊完全一致ｍｉＲＮＡ－１２２ ＭＯＰ結合配列（最適化）を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＡＭＬ１２細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、下のパネルはＡＭＬ１２細胞においてｍＣｈｅｒｒｙの検出可能な発現がほぼないことを示す。

【図10】図１０Ａ～１０Ｆは、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた腎細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列がヒト腎細胞（ｈＲＥＣ）におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を抑制するが、癌細胞（７８６－０）では抑制しないことを実証するものである。（図１０Ａ）、（図１０Ｂ）、（図１０Ｃ）、（図１０Ｄ）、（図１０Ｅ）、および（図１０Ｆ）の各々について、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図１０Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照７８６－０ヒト腎細胞腺癌細胞における細胞核染色を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１０Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされた７８６－０細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１０Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされた７８６－０細胞における細胞核およびｍＣｈｅｒｒｙシグナルであり、これは発現の証拠を示す、（図１０Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ｈＲＥＣ細胞（正常混合腎上皮細胞）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１０Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたｈＲＥＣ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１０Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたｈＲＥＣ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルのみでは実質的に発現を示さない。

【図11】図１１Ａ～１１Ｆは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた腎細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列がヒト腎細胞（ｈＲＥＣ）におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を抑制するが、癌細胞（７８６－０）では抑制しないことを実証するものである。（図１１Ａ）、（図１１Ｂ）、（図１１Ｃ）、（図１１Ｄ）、（図１１Ｅ）、および（図１１Ｆ）の各々について、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図１１Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照７８６－０ヒト腎細胞腺癌細胞における細胞核染色を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１１Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされた７８６－０細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１１Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされた７８６－０細胞における細胞核およびｍＣｈｅｒｒｙシグナルであり、これは発現の証拠を示す、（図１１Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ｈＲＥＣ細胞（正常混合腎上皮細胞）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１１Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたｈＲＥＣ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１１Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたｈＲＥＣ細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルのみでは実質的に発現を示さない。

【図12】図１２Ａ～１２Ｂは、一実施形態による実験の結果を示す図であり、ここではヒトＰＢＭＣ細胞が本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされており、その組成物は（図１２Ａ）ヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡを３つのレベルの投与量で含み、以下のｍＲＮＡによるトランスフェクションの６時間後にＩＬ－１２の発現が記録される：ＮＣ（単鎖由来の非コードヒト組み換えＩＬ－１２ － ＡＴＧコドンなし）、ｈｄｃＩＬ－１２（別個のＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ ｍＲＮＡの１：１混合物からのヒト組み換えＩＬ－１２）、ｈｓｃＩＬ－１２（単鎖由来のヒト組み換えＩＬ－１２）、およびｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰ（単鎖由来のヒト組み換えＩＬ－１２）、これはｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む単鎖組み換えＩＬ－１２発現ｍＲＮＡである；（図１２Ｂ）ヒトＧＭ－ＣＳＦを発現するｍＲＮＡを３つのレベルの投与量で含み、以下のｍＲＮＡによるトランスフェクションの６時間後にＧＭ－ＣＳＦの発現が記録される：ＮＣ（非コードＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ － ＡＴＧコドンなし）、ｈＧＭ－ＣＳＦ、およびｈＧＭ－ＣＳＦ－ＭＯＰ、これはｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含むｈＧＭ－ＣＳＦ発現ｍＲＮＡである。

【図13】図１３Ａ～１３Ｆは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた結腸上皮細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列が結腸上皮細胞における発現を抑制するが、結腸癌細胞（ＨＣＴ－１１６）では抑制しないことを実証するものである。写真の各セットについて、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図１３Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照結腸上皮細胞を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１３Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされた結腸細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１３Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされた結腸細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１３Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ＨＣＴ－１１６細胞（結腸癌）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１３Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＣＴ－１１６細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１３Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＣＴ－１１６細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル。

【図14】図１４Ａ～１４Ｆは、ｍｉＲＮＡ－Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた結腸上皮細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比較を示す図であり、ＭＯＰ配列が、ｍｉＲＮＡ－Ｌｅｔ７ｂ結合部位の存在に起因する、正常結腸細胞および結腸癌細胞の両方における発現を抑制することによる器官保護を提供することを実証するものである。写真の各セットについて、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図１４Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照結腸上皮細胞を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１４Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされた結腸細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１４Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされた結腸細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１４Ｄ）ｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照ＨＣＴ－１１６細胞（結腸癌）における細胞核染色、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１４Ｅ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＣＴ－１１６細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１４Ｆ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＣＴ－１１６細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル。

【図15】図１５Ａ～１５Ｃは、ｍｉＲＮＡ－Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む本明細書に記載される組成物でトランスフェクトされた正常健常肺細胞（ＢＥＡＳ－２Ｂ）におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す図であり、ＭＯＰ配列が、ｍｉＲＮＡ－Ｌｅｔ７ｂ結合部位の存在に起因する、健常肺細胞における発現を抑制することによる肺に対する器官保護を提供することを実証するものである。写真の各セットについて、上のパネルは、テキサスレッドおよびＤＡＰＩフィルターキューブによって取得された画像を重ね合わせたものであり、細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。下のパネルは、テキサスレッドフィルターキューブによって取得された画像を表し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のみを示す。（図１５Ａ）上のパネルはｍＲＮＡでトランスフェクトされていない対照細胞を示し、下のパネルはｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示さない、（図１５Ｂ）ＭＯＰ配列を有さないｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル、（図１５Ｃ）ＭＯＰ配列を有するｍＲＮＡでトランスフェクトされた肺細胞における細胞核染色およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル。

【図16】図１６Ａ～１６Ｂは、マウスにおけるインビボ体内分布実験の結果を示す図であり、（図１６Ａ）本発明の組成物を投与してから３．５時間後（Ｔ３．５ｈ）に、ＭＯＰ含有コンストラクト（グループ２および３）およびＭＯＰコンストラクトなしの対照群（グループ１）を含むすべてのグループにおいて、全身イメージングを通して高レベルのルシフェラーゼ発現を見ることができるが、２４時間後（Ｔ２４ｈ）にはＭＯＰ含有組成物においてルシフェラーゼ発現の有意なダウンレギュレーションが見られることを実証するものである。（図１６Ｂ）において、２４時間後の器官のエクスビボイメージングは、グループ１（ＭＯＰなし対照）と比較して、グループ２および３（ＭＯＰ含有コンストラクト）のマウスの肝臓、肺、脾臓、および腎臓におけるルシフェラーゼ発現の減少を示す。

【図17】図１７Ａ～１７Ｂは、皮下Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍（ヒト肝臓癌）を有するマウスにおける体内分布研究のさらなる結果を示す図である。各マウスに、本発明の特定の実施形態による組成物を腫瘍内注射によって投与した。２４時間後のエクスビボイメージングによってすべてのグループの腫瘍組織においてルシフェラーゼ発現を見ることができ、一方でグループ２および３についてはＭＯＰ配列によって肝臓の保護が提供される。溶媒群にはリン酸緩衝食塩水を投与した。グループ１にはルシフェラーゼを投与した（ＭＯＰなし対照）。

【図18】マウスＩＬ－１２アジュバントの存在下または非存在下でのオボアルブミンに対する抗原特異的免疫応答の動物試験の結果を示す図である。ｍＲＮＡの投与量をグラフの下の表に示す。応答は、免疫化の１４日後に血清中で検出された抗オボアルブミンマウスＩｇＧの量によって示される。

【図19】筋肉内投与後のマウスにおけるインビボ体内分布実験の結果を示す図である。エクスビボイメージングの結果は、本発明の特定の実施形態の組成物を投与してから４時間後に、ＭＯＰ含有コンストラクト（Ｌｕｃ－ＭＯＰ１、Ｌｕｃ－ＭＯＰ２、Ｌｕｃ－ＭＯＰ３）を有したグループのマウスの複数の器官において、ＭＯＰなし対照（Ｌｕｃ）と比較してルシフェラーゼ発現が減少することを実証する。注射部位での発現は、Ｌｕｃ－ＭＯＰ１を除くすべてのグループにおいて高いままであった。溶媒群にはリン酸緩衝食塩水を投与した。この結果は、筋肉内投与経路を介して本発明の組成物を使用して、有効な器官保護が達成され得ることを示す。

【図20】静脈内投与後のマウスにおけるインビボ体内分布実験の結果を示す図である。エクスビボイメージングの結果は、本発明の特定の実施形態の組成物を投与してから６時間後に、ＭＯＰ含有コンストラクト（Ｌｕｃ－ＭＯＰ１、Ｌｕｃ－ＭＯＰ２、Ｌｕｃ－ＭＯＰ３）を有したグループのマウスの複数の器官において、ＭＯＰなし対照（Ｌｕｃ）と比較してルシフェラーゼ発現が減少することを実証する。溶媒群にはリン酸緩衝食塩水を投与した。この結果は、静脈内投与経路を介して本発明の組成物を使用して、有効な器官保護が達成され得ることを示す。

【図21】マウスＩＬ－１２ ｍＲＮＡアジュバントからの免疫刺激の存在下または不在下でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質特異的免疫応答の動物試験の結果を示す図である。図２１は、免疫化の４２日後に生成された血清ＩｇＧに関するＢａｌｂ／ｃマウスの応答を示す。

【図22A】図２２Ａ～２２Ｂは、一実施形態による実験の結果を示す図であり、ここでは３つのレベルの投与量でヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡを含む本明細書に記載される組成物でヒトＰＢＭＣ細胞がトランスフェクトされている。図２２ａは、以下のｍＲＮＡによるトランスフェクションの２４時間後に定量化されたＩＬ－１２の発現を示す：ＮＣ（単鎖由来の非コードヒト組み換えＩＬ－１２ － ＡＴＧコドンを欠く）、ｈｓｃＩＬ－１２（単鎖由来のヒト組み換えＩＬ－１２）、およびｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰＶ（ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む単鎖組み換えＩＬ－１２発現ｍＲＮＡ）、ｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰＣ（ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－１９２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａに結合する完全一致ＭＯＰ配列を含む単鎖組み換えＩＬ－１２発現ｍＲＮＡ）。データは、ヒトＩＬ－１２の用量依存的発現を示す。

【図22B】図２２Ａ～２２Ｂは、一実施形態による実験の結果を示す図であり、ここでは３つのレベルの投与量でヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡを含む本明細書に記載される組成物でヒトＰＢＭＣ細胞がトランスフェクトされている。図２２ｂは、ヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡによってトランスフェクトされたＰＢＭＣにおけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ）のＩＬ－１２介在性誘導を示す。ｍＲＮＡによるトランスフェクションの７２時間後に、ヒトインターフェロンガンマを測定する。データは、自然免疫および適応免疫の両方に重要な免疫刺激性サイトカインであるインターフェロンガンマのＩＬ－１２介在性誘導を示す。

【図23】一実施形態による実験の結果を示す図であり、ここではＭＯＰを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｍＲＮＡを発現するｍＲＮＡと、ＭＯＰを有する（ｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰＶ）および有さない（ｈｓｃＩＬ－１２）ヒト単鎖組み換えＩＬ－１２発現ｍＲＮＡとの組み合わせを含む本明細書に記載される組成物でヒトＰＢＭＣ細胞がトランスフェクトされている。ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ）に対する完全一致結合配列を含む。この結果は、トランスフェクションの１２０時間後、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）発現が、ＭＯＰを有するおよび有さないヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡの存在下で増加することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0069】

別様に示されない限り、本発明の実施は、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術、および化学的方法の従来の技術を使用する。こうした技術は、たとえばＭ．Ｒ．グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、２０１２、「モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第４版、１－３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ；オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら（「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、オンラインＩＳＳＮ：１９３４－３６４７）；Ｂ．ロー（Ｒｏｅ）、Ｊ．クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）、およびＡ．カーン（Ｋａｈｎ）、１９９６、「ＤＮＡの単離および配列決定：必須技術（ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ；Ｊ．Ｍ．ポラック（Ｐｏｌａｋ）およびジェームス（Ｊａｍｅｓ）Ｏ’Ｄ．マギー（ＭｃＧｅｅ）、１９９０、「インサイツハイブリダイゼーション：原理および実施（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｍ．Ｊ．ガイト（Ｇａｉｔ）（編集者）、１９８４、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．ライリー（Ｌｉｌｌｅｙ）およびＪ．Ｅ．ダルバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、１９９２、「酵素学の方法：ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成および物理的分析（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ）」メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；「合成生物学、パートＡ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ Ａ）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、クリス・フォークト（Ｃｈｒｉｓ Ｖｏｉｇｔ）編、４９７巻、２－６６２頁（２０１１）；「合成生物学、パートＢ、コンピュータ支援の設計およびＤＮＡアセンブリ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ Ｂ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、クリストファー・フォークト（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｖｏｉｇｔ）編、４９８巻、２－５００頁（２０１１）；「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、デビッド（Ｄａｖｉｄ）Ｒ．エンゲルケ（Ｅｎｇｅｌｋｅ）およびジョン（Ｊｏｈｎ）Ｊ．ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）、３９２巻、１－４５４頁（２００５）などの文献においても説明されている。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書において引用により援用される。

【0070】

本発明を示す前に、本発明の理解を助けるであろういくつかの定義を提供する。本明細書において引用されるすべての参考文献は、その全体が引用により援用される。別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0071】

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、列挙された要素のいずれかが必然的に含まれ、他の要素も任意選択で含まれてもよいことを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、任意の列挙された要素が必然的に含まれ、列挙された要素の基本的特徴および新規の特徴に実質的に影響し得る要素が除外され、その他の要素は任意選択で含まれてもよいことを意味する。「からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、列挙されたもの以外のすべての要素が除外されることを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0072】

ポリヌクレオチド配列に適用されるときの「単離された」という用語は、その配列がその起源である天然の生物から取り出されており、よって外来のまたは望ましくないコード配列または調節配列を含まないことを示す。単離された配列は、組み換えＤＮＡプロセスおよび遺伝子操作されたタンパク質合成系における使用に適している。こうした単離された配列は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびゲノムクローンを含む。単離された配列は、タンパク質コード配列のみに限定されてもよいし、たとえばプロモーターおよび転写ターミネーターなどの５’および３’調節配列、または非翻訳配列（ＵＴＲ）も含み得る。本発明をさらに示す前に、本発明の理解を助けるであろういくつかの定義を提供する。

【0073】

「ポリヌクレオチド」は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって連結されている、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基から構成されてもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡを含み、インビトロで合成的に製造されるか、または天然の供給源から単離されてもよい。ポリヌクレオチドのサイズは典型的に、二本鎖ポリヌクレオチドについては塩基対（ｂｐ：ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ）の数として表されるか、一本鎖ポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチド（ｎｔ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の数として表される。１０００ｂｐまたはｎｔはキロベース（ｋｂ：ｋｉｌｏｂａｓｅ）に等しい。約４０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、各ヌクレオチドの３’末端および５’末端がホスホジエステル結合によって連結されている、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基から構成されてもよい。核酸配列はＤＮＡおよびＲＮＡを含んでもよく、インビトロで合成的に製造されるか、または天然の供給源から単離されてもよい。本発明の特定の実施形態では、核酸配列はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）を含む。

【0074】

核酸は、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ、たとえばメチル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはたとえば７－メチルグアノシンによる５’－キャッピング、たとえば切断およびポリアデニル化などの３’－プロセシング、ならびにスプライシングなどの翻訳後修飾を受けたＲＮＡなどをさらに含んでもよい。加えて核酸は、たとえばヘキシトール核酸（ＨＮＡ：ｈｅｘｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などの合成核酸（ＸＮＡ）を含んでもよい。

【0075】

本発明によると、本明細書に記載される核酸配列に対する相同性は、単なる１００％の配列同一性に限定されない。これに関して、２つの配列に関する「実質的に類似する」という用語は、それらの配列が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の類似性を有することを意味する。同様に、２つの配列に関する「実質的に相補的」という用語は、それらの配列が完全に相補的であること、または塩基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が相補的であることを意味する。すなわち、ハイブリダイズすることが意図される配列の塩基間でミスマッチ（不一致）が発生する可能性があり、ミスマッチは塩基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、または最大３０％の間で生じ得る。しかし場合によっては、互いにハイブリダイズできるが、いくつかのミスマッチを含有する２つの配列、すなわち「不正確な一致」、「不完全一致」、または「不正確な相補性」と、ミスマッチなしで互いにハイブリダイズできる２つの配列、すなわち「正確な一致」、「完全一致」、または「正確な相補性」とを区別することが望ましいことがある。さらに、ミスマッチの程度の可能性が考慮される。

【0076】

本明細書で使用される「器官保護配列」（「ＯＰＳ」）という用語は、天然または合成起源の複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）標的配列と、任意選択の１つ以上の補助配列とを含む配列を示す。ＯＰＳが複数の器官に保護を与えるとき、それは複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）または「マルチ（ｍｕｌｔｉ－）」器官保護（ＭＯＰ）配列と呼ばれることがある。「標的配列」という用語は、特定のｍｉＲＮＡによる結合の標的とされる、ｍＲＮＡ配列内のたとえば非翻訳領域（ＵＴＲ）内などに含まれる配列を示す。結合は、ｍｉＲＮＡ内に含まれる相補的塩基対と対応する標的配列との間の核酸ハイブリダイゼーションによって起こる。結合相互作用は、特定のｍｉＲＮＡと標的配列との間にミスマッチが生じないように、またはミスマッチが標的配列の長さにわたって１塩基対以下のミスマッチに限定されるように最適化されてもよい。本発明の実施形態では、単一塩基ミスマッチは、標的配列の５’または３’末端に限定される。最適化された配列は、細胞中に存在する標的ｍｉＲＮＡと完全一致させたものとも説明でき、野生型結合配列と２つ以上の塩基対が異なっていてもよい。３つ以上の天然に存在するミスマッチを含む野生型配列は、対応する相補的ｍｉＲＮＡ配列に対して完全一致でない、または不完全一致とみなされる。

【0077】

たとえば発現コンストラクトなどの核酸配列に適用されるときの「機能的に連結された」という用語は、配列が意図される目的を達成するためにそれらの配列が協働的に機能するように配置されることを示す。例として、ＤＮＡベクターにおけるプロモーター配列は転写の開始を可能にし、その転写は連結されたコード配列を通じて終結配列まで進行する。ＲＮＡ配列の場合は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と呼ばれる連結されたポリペプチドコード配列に関連して１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）が配置されてもよい。本明細書に開示される所与のｍＲＮＡは、２つ以上のＯＲＦ、いわゆるポリシストロニックＲＮＡを含んでもよい。当分野で公知であるとおり、ｍＲＮＡは２つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、結果として、複数の機能的産物の産生をもたらすために必要な切断部位または他の配列を含むことがある。ＵＴＲは、機能的に連結されたコード配列ＯＲＦに対して５’または３’に位置してもよい。ＵＴＲは、天然に見出されるｍＲＮＡ配列に典型的に見出される配列、たとえばコザックコンセンサス配列、開始コドン、シス作用性翻訳調節エレメント、キャップ非依存性翻訳開始配列、ポリＡテール、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ）、ｍＲＮＡの安定性および／または寿命を調節する構造、ならびにｍＲＮＡの局在化を指示する配列などのうちの１つ以上を含んでもよい。ｍＲＮＡは、同じまたは異なる複数のＵＴＲを含んでもよい。１つ以上のＵＴＲは、ＯＰＳを含んでもよいし、ＯＰＳに近接または隣接して位置してもよい。ＵＴＲは、たとえばコザック配列などのｍＲＮＡに対する翻訳または安定性制御を提供する直鎖状配列を含んでもよいし、加えてそれらは、特に５’ＵＴＲ内の局在化二次構造の形成を促進する１つ以上の配列を含んでもよい。本発明の一実施形態では、平均未満のＧＣ含量を有する５’ＵＴＲを使用して、ｍＲＮＡの効率的な翻訳を促進してもよい。

【0078】

本発明の文脈における「ポリペプチドを発現する」という用語は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの産生を示す。これは典型的に、配列が送達される細胞のリボソーム機構による、供給されたｍＲＮＡ配列すなわちＯＲＦの翻訳を含む。

【0079】

たとえば「疾患細胞」および／または「疾患組織」などにおける、本明細書で使用される「疾患」という用語は、異常な、健常でない、または疾患の病理を示す組織および器官（またはその一部）および細胞を示す。たとえば、疾患細胞はウイルス、細菌、プリオン、真菌、もしくは真核生物寄生体に感染していてもよく；有害な変異を含んでもよく；かつ／または癌性、前癌性、腫瘍性、もしくは新生物性であってもよい。感染は、細胞に内在化されて自身の生活環のかなりの部分にわたって細胞内に存在する病原体を含んでもよい。疾患細胞は、他の点では正常な細胞またはいわゆる健常細胞と比較したときに、変化した細胞内ｍｉＲＮＡ環境を含んでもよい。特定の場合において、疾患細胞は、病理学的には正常であるが、疾患に対する前駆状態を表す変化した細胞内ｍｉＲＮＡ環境を含んでいてもよい。疾患組織は、別の器官または器官系からの疾患細胞によって浸潤された健常組織を含んでもよい。例として、多くの炎症性疾患は、他の点では健常な器官がたとえばＴ細胞および好中球などの免疫細胞の浸潤を受ける病理を含む。さらなる例として、狭窄または硬変病変を有する器官および組織は、健常細胞および疾患細胞の両方を近接して含んでもよい。

【0080】

本明細書で使用される「癌」という用語は、悪性腫瘍を含む組織中の新生物を示し、これは特定の組織において始まった原発癌であっても、他の場所からの転移によって広がった二次癌であってもよい。癌、新生物、および悪性腫瘍という用語は、本明細書において互換的に使用される。癌は、新生物内に位置するか、または新生物に関連する特性を有する組織または細胞を示してもよい。新生物は典型的に、正常組織および正常細胞と自身とを区別する特徴を有する。こうした特徴には、退形成の程度、形態の変化、形状の不規則性、細胞接着性の低下、転移する能力、および細胞増殖の増加が含まれるが、これらに限定されない。「癌」に関連し、しばしばそれと同義である用語は、肉腫、細胞腫、悪性腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、形質転換、および新生物などを含む。本明細書で使用される「癌」という用語は、前悪性および／または前癌性腫瘍、ならびに悪性癌を含む。

【0081】

たとえば「健常な細胞」および／または「健常な組織」などにおける、本明細書で使用される「健常な」という用語は、それ自体は疾患ではなく、かつ／または典型的に正常に機能する表現型に近い組織および器官（またはその一部）および細胞を示す。本発明の文脈において、「健常な」という用語は相対的なものであり、たとえば、腫瘍に冒された組織中の非新生物細胞は、絶対的な意味で完全に健常ではないであろうことが認識され得る。したがって「非健常細胞」は、それ自体は新生物性でも癌性でも前癌性でもないが、たとえば硬変性、炎症性、もしくは感染性、または別様の疾患であり得る細胞を意味する。同様に、「健常または非健常組織」とは、全体的な健常性にかかわらず、腫瘍、新生物、癌性、もしくは前癌性の細胞か、または上述の他の疾患を有さない組織またはその一部を意味する。たとえば、癌性組織および線維性組織を含む器官の文脈において、線維性組織内に含まれる細胞は、癌性組織と比較して相対的に「健常」であると考えられてもよい。「健常な」細胞についての正常に機能する表現型の近似のために使用されるモデルは、細胞機能および遺伝子発現のその他の点では本来の細胞に近い不死化細胞株を含んでもよい。

【0082】

代替的な実施形態では、細胞、細胞型、組織、および／または器官の健常状態は、ｍｉＲＮＡ発現の定量化によって決定される。たとえば癌などの特定の疾患タイプでは、特定のｍｉＲＮＡ種の発現が影響を受けて、影響を受けない細胞と比較してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。ｍｉＲＮＡトランスクリプトームにおけるこの差異を使用して、相対的な健常状態を識別すること、あるいは／または健常な細胞、細胞型、組織、および／もしくは器官の疾患状態への進行を追跡することができる。疾患状態には、新生物細胞への形質転換のさまざまな段階が含まれてもよい。本発明の実施形態では、異なる細胞型におけるタンパク質発現を制御するために、所与の器官または器官系内に含まれる細胞型のｍｉＲＮＡトランスクリプトームの示差的変動が利用される。

【0083】

本明細書で使用される「器官」という用語は、「器官系」と同義であり、たとえば生理学的機能、解剖学的機能、恒常性機能、または内分泌機能などの生物学的機能を提供するために対象の体内で区画化され得る組織および／または細胞型の組み合わせを示す。適切には、器官または器官系は、たとえば肝臓または膵臓などの血管付きの内部器官を意味してもよい。典型的には、器官は、その器官に特徴的な表現型を示す少なくとも２つの組織タイプおよび／または複数の細胞型を含む。組織または組織系は協働することがあるが、公式に器官とはみなされない。たとえば、血液は一般に組織または液体組織ともみなされるが、使用される定義に応じて、厳密な意味で器官とはみなされないことがある。それにもかかわらず、特定の実施形態における本発明の組成物および方法は、血液、造血組織、およびリンパ組織を含む器官、組織、および組織系に関する保護効果を示す働きをしてもよい。

【0084】

本明細書で使用される「治療用ウイルス」という用語は、癌細胞に感染して死滅させることができるウイルスを示し、この死滅は宿主抗腫瘍応答の刺激による間接的な死滅を含む。治療用ウイルスは、ワクチン製剤において有用である弱毒化ウイルスまたは改変ウイルスも含んでもよい。

【0085】

【表1】

【0086】

本発明の実施形態では、ウイルスは、ウイルスのボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）分類の第Ｉ～ＶＩＩ群（ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）Ｄ（１９７１）。「動物ウイルスゲノムの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）。」バクテリオロジカル・レビューズ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｖ．）３５（３）：２３５－４１）のうちのいずれか１つから選択されてもよい。本発明の特定の実施形態において、適切なウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスゲノムを有することを特徴とするボルチモアの第Ｉ群、正の一本鎖ＤＮＡゲノムを有することを特徴とする第ＩＩ群、二本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを有することを特徴とする第ＩＩＩ群、一本鎖の正のＲＮＡゲノムを有する第ＩＶ群、および一本鎖の負のＲＮＡゲノムを有する第Ｖ群から選択されてもよい。

【0087】

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、天然で産生されるか、または合成手段によってインビトロで産生された、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約１２アミノ酸残基長未満のポリペプチドは典型的に「ペプチド」と呼ばれ、約１２～約３０アミノ酸残基長のものは「オリゴペプチド」と呼ばれてもよい。本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するポリペプチド、前駆体形態、またはプロタンパク質の産物を示す。加えてポリペプチドは、グリコシル化、タンパク質切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、およびリン酸化などを含んでもよいがこれらに限定されない、成熟または翻訳後修飾プロセスを受け得る。本明細書において「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子を示すために使用される。

【0088】

本明細書で使用される「遺伝子産物」という用語は、本明細書に記載される本発明のｍＲＮＡコンストラクト内に含まれる少なくとも１つのコード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるペプチドまたはポリペプチドを示す。ポリシストロニックｍＲＮＡコンストラクトが使用されてもよく、これは同じポリ核酸鎖上に位置する複数のＯＲＦによってコードされる複数の遺伝子産物の産生をもたらす。複数のＯＲＦが、機能的に協働し得るか、または多様な生物学的な治療的であり得る効果を有する複合体および／もしくは多量体タンパク質を形成し得る、たとえばタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドなどのさまざまな産物のインサイツでの産生をもたらしてもよいことが認識されるだろう。

【0089】

ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、典型的にはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。特定のタンパク質が２つ以上のサブユニットからなるとき、ｍＲＮＡは、１つ以上のＯＲＦ内に１つ以上のサブユニットをコードしてもよい。代替的な実施形態において、第１のｍＲＮＡは第１のサブユニットをコードしてもよく、一方で第２の同時投与されたｍＲＮＡは、インサイツで翻訳されたときに、マルチサブユニットタンパク質遺伝子産物のアセンブリをもたらす第２のサブユニットをコードしてもよい。標的細胞内での遺伝子産物の翻訳は、適用される細胞型に対する適切な局在化された翻訳後修飾を可能にする。こうした修飾は、遺伝子産物のフォールディング、局在化、相互作用、分解、および活性を調節してもよい。典型的な翻訳後修飾には、切断、リフォールディング、および／またはたとえばメチル化、アセチル化、もしくはグリコシル化などの化学修飾が含まれてもよい。

【0090】

（本明細書の他の箇所に記載されるとおり）別々のｍＲＮＡコンストラクト上に存在し、送達粒子と会合するように製剤化されるとき、これらは、異なるｍＲＮＡコンストラクトが同じ個々の送達粒子と会合され得るように共製剤化されてもよいし、異なるｍＲＮＡコンストラクトが異なる送達粒子と会合され得るように別々に製剤化されてもよい。

【0091】

ｍＲＮＡを細胞に直接送達することによって、細胞におけるたとえばポリペプチドおよび／またはタンパク質などの所望の遺伝子産物の直接的かつ制御可能な翻訳が可能になる。ｍＲＮＡの提供は、たとえばｍｉＲＮＡ介在性制御（以下の特定の実施形態において詳述される）などの細胞発現調節機構の使用を特定的に可能にするだけでなく、エピソームまたはゲノムに挿入されたＤＮＡベクターが提供するであろう標的細胞のトランスクリプトームに対する永続的となり得る変化ではなく、産物の有限かつ枯渇性の供給も行う。

【0092】

本発明の実施形態において、核酸配列全体に組織特異性および安定性を付与し得る１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）と機能的に組み合わされた少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡ配列が提供される。「組織特異性」とは、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質産物の翻訳が、ＵＴＲの存在によって調節されることを意味する。調節は、ｍＲＮＡからタンパク質への検出可能な翻訳を可能にすること、低減させること、または遮断することをも含んでもよい。ＵＴＲはシスで、すなわち、同じポリヌクレオチド鎖上でｍＲＮＡに直接連結されてもよい。代替的な実施形態では、遺伝子産物をコードする第１の配列が提供され、核酸配列全体に組織特異性を付与する１つ以上のＵＴＲを含む、第１の配列の一部にハイブリダイズするさらなる第２の配列が提供される。この後者の実施形態において、ＵＴＲは、遺伝子産物をコードする配列にトランスで機能的に連結している。

【0093】

本発明の特定の実施形態によると、たとえば健常な肝細胞、ＣＮＳ、筋肉、皮膚などの非疾患組織における遺伝子産物の発現を防止または低減させるために必要であるとおりにｍＲＮＡに機能的に連結された、こうした関連核酸配列を含むｍＲＮＡが提供される。以後、このｍＲＮＡを「コードｍＲＮＡ」と呼ぶ。したがって、５’キャップと、リボソーム動員ならびに組織および／または器官特異的発現に必要なＵＴＲ（排他的ではないが典型的にはＯＲＦの３’側に位置する）と、１つ以上のＯＲＦをそれぞれ規定する開始コドンおよび終止コドンとを含む、このコードｍＲＮＡコンストラクトまたは転写物が提供される。コンストラクトが全身的に導入されるか、または非疾患肝臓、肺、膵臓、乳房、脳／ＣＮＳ、腎臓、脾臓、筋肉、皮膚、および／もしくは結腸消化管への局所的投与を介して導入されるとき、遺伝子産物の発現は防止または低減される。対照的に、前述の器官内に含まれる新生物細胞またはその他の疾患細胞は、典型的に、正常な非疾患細胞の発現パターンに従わず、まったく異なるｍｉＲＮＡトランスクリプトームを有する。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、これらの異常細胞において特異的に翻訳されるが、隣接する健常細胞または非疾患細胞においては翻訳されないか、またはより低い程度に翻訳される。上述の器官へのｍＲＮＡコンストラクトの送達は、本明細書に記載される微粒子送達プラットフォームを介するか、または当技術分野で公知の任意の適切なやり方で達成されてもよい。細胞型特異的発現は、以下により詳細に記載されるものなどのマイクロＲＮＡ調節機構によって介在され得る。

【0094】

本発明のさらなる実施形態によると、たとえば肝細胞、ＣＮＳ、筋肉、皮膚、腎臓など、抗原に対する免疫応答を生じさせるのに必要とされない組織または器官における遺伝子産物の発現を防止または低減させるために必要であるとおりにｍＲＮＡに機能的に連結された、こうした関連核酸配列を含むｍＲＮＡが提供される。５’キャップと、リボソーム動員ならびに組織および／または器官特異的発現に必要な１つ以上のＵＴＲ（排他的ではないが典型的にはＯＲＦの３’側に位置する）と、１つ以上のＯＲＦをそれぞれ規定する開始コドンおよび終止コドンとを含んでも含まなくてもよいコードｍＲＮＡコンストラクトまたは転写物が提供される。コンストラクトが対象に全身的にまたは局所投与を介して導入されるとき、遺伝子産物の発現は、典型的に免疫応答に必要とされない細胞および組織において防止または低減される。対照的に、体内または上記器官に含まれる免疫細胞、たとえばＴ細胞、Ｂ細胞、または異なるタイプの樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）などは、異なるｍｉＲＮＡトランスクリプトームを有する。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、これらの免疫細胞において特異的に翻訳されるが、隣接する健常な細胞および組織においては翻訳されないか、またはより低い程度に翻訳される。上述の細胞および組織へのｍＲＮＡコンストラクトの送達は、本明細書に記載される微粒子送達プラットフォームを介するか、または当技術分野で公知の任意の適切なやり方で達成されてもよい。

【0095】

本明細書で定義される「治療成分」または「治療剤」は、治療介入の一部として個々のヒトまたは他の動物に投与されたときに、その個々のヒトまたは他の動物に対する治療効果に寄与する分子、物質、細胞、または生物を示す。治療効果は、治療成分自体によって引き起こされても、治療介入の別の成分によって引き起こされてもよい。治療成分は、コード核酸成分、特にｍＲＮＡであってもよい。コード核酸成分は、以下に定義されるとおりの治療増強因子をコードしてもよい。治療成分は薬物も含んでもよく、任意選択でたとえば小分子またはモノクローナル抗体（またはそのフラグメント）などの化学療法薬を含んでもよい。本発明の他の実施形態では、治療剤は、たとえばウイルスベクターなどの治療用ウイルスを含む。

【0096】

「治療効果」という用語は、対象に投与された物質、分子、組成物、細胞、または生物を含む薬理学的または治療的に活性な薬剤によって引き起こされる、動物の対象、典型的にはヒトにおける局所的または全身的な効果を示し、「治療介入」という用語は、こうした物質、分子、組成物、細胞、または生物の投与を示す。よってこの用語は、動物またはヒト対象における疾患の診断、治癒、緩和、処置、もしくは予防、または望ましい身体的もしくは精神的な発達および状態の増強における使用が意図される任意の薬剤を意味する。「治療有効量」という語句は、任意の処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で所望の局所的または全身的効果を生じるこうした薬剤の量を意味する。特定の実施形態では、薬剤の治療有効量は、その治療指数および溶解性などに依存する。たとえば、本発明の特定の治療剤は、こうした処置に適用可能な妥当な利益／リスク比を生じるために十分な量で投与されてもよい。感染性疾患または癌を含む疾患の処置の特定の状況において、「治療効果」は、感染性病原生物力価の減少、有益な細胞バイオマーカーの増加（例、白血球数の増加）、固体腫瘍体積の低減、癌細胞数の減少、観察される転移数の減少、平均余命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、腫瘍細胞マーカーの発現の減少、および／または状態に関連するさまざまな生理的症状の寛解を含むがこれらに限定されないさまざまな手段によって明らかにされ得る。たとえばワクチン接種による予防などによるウイルス、細菌、または寄生虫感染の処置の特定の状況において、「治療効果」は、病原体チャレンジに対する完全もしくは部分的な耐性、ヒトもしくは動物対象における病原体に対する循環抗体の存在、またはワクチン効力のその他の公知の尺度によって示されてもよい。

【0097】

一実施形態では、治療が投与される対象は、哺乳動物（例、げっ歯類、霊長類、非ヒト哺乳動物、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）または家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、たとえばイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびヤギなど）であり、適切にはヒトである。さらなる実施形態では、対象は、たとえば癌などの疾患の動物モデルである。たとえば、動物モデルは、ヒト由来の癌、適切には肝臓、肺、膵臓、乳房、脳、腎臓、筋肉、皮膚、および／または結腸消化管の癌の同所性異種移植動物モデルであり得る。さらなる実施形態では、対象は感染性疾患の動物モデルである。たとえば、動物モデルは１つ以上のウイルス、細菌、真菌、プリオン、または真核生物寄生体に感染していてもよく、またはこうした病原体に感染することとなる。

【0098】

本発明の方法の特定の実施形態において、対象はたとえば治療用ウイルス療法、化学療法、放射線療法、標的療法、ワクチン接種、および／または抗免疫チェックポイント療法などの治療的処置をまだ受けていない。さらに別の実施形態において、対象はたとえば上記の治療などの治療的処置を受けたことがある。なおさらなる実施形態において、対象はたとえば上記の治療などの治療的処置を受けている。

【0099】

さらなる実施形態では、対象は、癌性または前癌性組織を除去するための手術を受けたことがある。他の実施形態では、癌性組織は除去されておらず、たとえば癌性組織は、外科的介入を受けたときに対象の生命を危険にさらすおそれがある組織もしくは器官、または外科的手技が永続的な害もしくは致死性の相当なリスクをもたらし得る領域など、身体の手術不可能な領域に位置することがある。

【0100】

いくつかの実施形態において、提供されるコードｍＲＮＡコンストラクトは「治療増強因子」をコードしてもよい。本発明によると、治療増強因子は、所与の細胞、適切には標的細胞に対して治療効果を発揮するために別の同時投与された治療剤の能力を増強または促進し得る遺伝子産物またはポリペプチドである。標的細胞内またはその近傍に導入されるとき、治療増強因子の発現は、同時投与された治療剤と協働することによって、薬剤の治療活性を可能にするかまたは増強してもよい。他の実施形態において、治療増強因子は、同時投与または連続的に投与されるワクチンのアジュバントとして作用してもよい。アジュバントは、対象の自然免疫系を活性化するために使用され得る薬理学的または免疫学的物質である。アジュバントはこのやり方で、対象の自然免疫系が病原体からの感染に対してより迅速に応答することを可能にする。加えてアジュバントは、たとえばウイルス感染または細菌感染などの特定の感染病原体に特異的な適応免疫応答を刺激するように働いてもよい。加えていくつかのアジュバントは、有効な抗原提示を指示すること、ならびにＴヘルパー１型（Ｔｈ１：Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ－１）免疫応答を刺激および増強することに効果的であってもよい。代替的に、治療増強因子は、同時投与または連続的に投与される弱毒化または改変ウイルス、たとえばワクチン製剤において使用される改変アデノウイルスなどに対するアジュバントとして作用してもよい。不活化ウイルスまたは生弱毒化ウイルスワクチンは典型的に、免疫応答を促進するためにアジュバントを必要とする。加えて、組み換えタンパク質ベースのサブユニットワクチンの固有の免疫原性も比較的低く、アジュバントが同時投与されることが望ましい。よって本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物の役割は、提示された抗原に応答して免疫細胞によって産生される中和抗体のレベルを増加させることである。

【0101】

本発明の特定の実施形態による組成物において、複数の治療増強因子が組み合わされてもよい。こうした実施形態では、各治療増強因子のコード配列は、別々のｍＲＮＡ分子中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、２つ以上の治療増強因子に対する配列が同じｍＲＮＡ分子上に存在してもよい。こうした場合、ポリシストロニックｍＲＮＡ分子は、たとえば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などのすべてのコード配列の発現に必要な配列をさらに含む。

【0102】

複数の異なるｍＲＮＡ分子が１つ以上の送達系に含まれる実施形態では、たとえば粒子、リポソーム、ウイルスベクター系などの各送達系は、「ペイロード」として１つ以上のタイプのｍＲＮＡ分子を含み得ることが予期される。すなわち、特定の実施形態におけるすべての送達ペイロードが、前記実施形態において提供されるｍＲＮＡ分子のすべてを必ずしも含むわけではない。このようにして、本明細書に記載の標的化剤によって、異なる送達系およびそれらの関連配列を異なる標的細胞に向けることも可能であると考えられる。

【0103】

同様に、（本明細書の他の箇所に記載されるとおり）別々のｍＲＮＡコンストラクトが提供され、それらが送達粒子と会合するように製剤化される任意の実施形態において、これらは、異なるｍＲＮＡコンストラクトが同じ送達粒子と会合され得るように共製剤化されてもよい（すなわち、異なるｍＲＮＡが同じプロセスで一緒に送達粒子とパッケージングされてもよい）し、異なるｍＲＮＡコンストラクトが異なる送達粒子と会合され得るように別々に製剤化されてもよい。

【0104】

本発明の特定の実施形態のｍＲＮＡコンストラクトは、ポリヌクレオチド発現コンストラクトから合成されてもよく、これはたとえばＤＮＡプラスミドなどであってもよい。この発現コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトの転写が起こり得るように、転写の開始に必要な任意のプロモーター配列および対応する終結配列を含んでもよい。こうしたポリヌクレオチド発現コンストラクトは、それ自体で本発明の実施形態を含むことが予期される。

【0105】

サイトカイン
本発明の実施形態において、ｍＲＮＡコンストラクトは、たとえばアジュバントとして作用するサイトカインなどのサイトカインに対する遺伝子産物をコードしてもよい。

【0106】

サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要な小タンパク質の広範なカテゴリーである。サイトカインは、免疫調節剤として、自己分泌、パラ分泌、および内分泌シグナル伝達に関与することが示されている。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が挙げられる。サイトカインは、たとえばマクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および肥満細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、およびさまざまな間質細胞を含む広範囲の細胞によって産生され、所与のサイトカインが２つ以上の細胞型によって産生されてもよい。サイトカインは細胞表面受容体を通じて作用し、免疫系において特に重要である。サイトカインは、液性免疫応答と細胞ベースの免疫応答とのバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、増殖、および応答性を調節する。サイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびケモカインとして分類されている。

【0107】

インターロイキン（ＩＬ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ）は、最初に白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））による発現が見られたサイトカイン（分泌タンパク質およびシグナル分子）のグループである。免疫系の機能は大部分がインターロイキンに依存しており、いくつかのインターロイキンのまれな欠損が記述されており、そのすべてが自己免疫疾患または免疫不全を特徴とする。インターロイキンの大部分は、ヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球によって合成され、加えて単球、マクロファージ、および内皮細胞を通じて合成される。インターロイキンは、ＴおよびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。インターロイキンとしては、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン９（ＩＬ－９）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１６（ＩＬ－１６）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン１９（ＩＬ－１９）、インターロイキン２０（ＩＬ－２０）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）、インターロイキン２４（ＩＬ－２４）、インターロイキン２５（ＩＬ－２５）、インターロイキン２６（ＩＬ－２６）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン２８（ＩＬ－２８）、インターロイキン２９（ＩＬ－２９）、インターロイキン３０（ＩＬ－３０）、インターロイキン３１（ＩＬ－３１）、インターロイキン３２（ＩＬ－３２）、インターロイキン３３（ＩＬ－３３）、インターロイキン３５（ＩＬ－３５）、およびインターロイキン３６（ＩＬ－３６）が挙げられる。

【0108】

ＩＬ－１アルファおよびＩＬ－１ベータは、免疫応答、炎症反応、および造血の調節に関与するサイトカインである。ＩＬ－２は、応答性Ｔ細胞の増殖を誘導するリンホカインである。加えてＩＬ－２は、いくつかのＢ細胞に対して、受容体特異的結合を介して、成長因子および抗体産生刺激因子として作用する。ＩＬ－３は、顆粒球およびマクロファージの産生、分化、および機能を制御することによって造血を調節するサイトカインである。ＩＬ－４は、Ｂ細胞の増殖および分化ならびにＴ細胞増殖を誘導する。ＩＬ－５は好酸球の増殖および活性化を調節する。ＩＬ－６は、Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌細胞への最終分化、ならびに骨髄腫／形質細胞腫の増殖、神経細胞分化、および肝細胞における急性期反応物質の誘導において必須の役割を果たす。ＩＬ－７は、Ｂ細胞およびＴ細胞系統の両方の初期リンパ系細胞の成長因子として働くサイトカインである。ＩＬ－８は好中球走化性を誘導する。ＩＬ－９は、ヘルパーＴ細胞のＩＬ－２非依存性およびＩＬ－４非依存性増殖を支援するサイトカインである。ＩＬ－１０は、活性化マクロファージおよびヘルパーＴ細胞によって産生されるＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＴＮＦ、およびＧＭ－ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの合成を阻害するタンパク質である。ＩＬ－１１は巨核球形成を刺激し、血小板の産生増加をもたらし、加えて破骨細胞を活性化し、上皮細胞増殖およびアポトーシスを阻害し、マクロファージメディエーター産生を阻害する。ＩＬ－１２は、さまざまな細胞内病原体に対する正常な宿主防御を含むＴｈ１細胞性免疫応答の刺激および維持に関与する。ＩＬ－１３は、炎症および免疫応答の調節において重要であり得る多面的なサイトカインである。ＩＬ－１４は、Ｂ細胞の生育および増殖を制御し、Ｉｇ分泌を阻害する。ＩＬ－１５はナチュラルキラー細胞の産生を誘導する。ＩＬ－１６はＣＤ４＋化学誘引物質である。ＩＬ－１７は、活性化メモリーＴ細胞によって産生される強力な炎症性サイトカインである。ＩＬ－１８は、ＩＦＮｇの産生およびナチュラルキラー細胞活性の増加を誘導する。ＩＬ－２０は、ケラチノサイトの増殖および分化を調節する。ＩＬ－２１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を共刺激し、ＮＫ細胞傷害性を増大させ、ＣＤ４０がもたらすＢ細胞の増殖、分化、およびアイソタイプスイッチを増大させ、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する。ＩＬ－２２は、上皮細胞からのデフェンシンの産生を刺激し、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を活性化する。ＩＬ－２３は、ＩＬ－１７産生細胞の維持に関与し、血管新生を増加させるが、ＣＤ８ Ｔ細胞浸潤を低減させる。ＩＬ－２４は、細胞生存、炎症性サイトカイン発現に影響を及ぼすことによって、腫瘍抑制、創傷治癒、および乾癬において重要な役割を果たす。ＩＬ－２５は、好酸球増殖を刺激するＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３の産生を誘導する。ＩＬ－２６は、ＩＬ－１０およびＩＬ－８の分泌、ならびに上皮細胞上のＣＤ５４の細胞表面発現を増強する。ＩＬ－２７は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の活性を調節する。ＩＬ－２８は、ウイルスに対する免疫防御において役割を果たす。ＩＬ－２９は、微生物に対する宿主防御において役割を果たす。ＩＬ－３０はＩＬ－２７の１本の鎖を形成する。ＩＬ－３１は、皮膚の炎症において役割を果たす可能性がある。ＩＬ－３２は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８、およびＣＸＣＬ２を分泌するように単球およびマクロファージを誘導する。ＩＬ－３３は、２型サイトカインを産生するようにヘルパーＴ細胞を誘導する。ＩＬ－３５は、Ｔヘルパー細胞活性化の抑制を誘導する。ＩＬ－３６はＤＣおよびＴ細胞応答を調節する。

【0109】

リンホカインは、リンパ球として知られるタイプの免疫細胞によって産生されるサイトカインのサブセットである。リンホカインは、典型的にはＴ細胞によって産生されるタンパク質メディエーターであり、その細胞間のシグナル伝達によって免疫系応答を指示する。リンホカインは、マクロファージおよびその他のリンパ球を含む他の免疫細胞の感染部位への誘引、ならびにその後それらの免疫細胞が免疫応答を開始できるようにそれらを活性化することを含む、多くの役割を有する。リンホカインは、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助ける。Ｔヘルパー細胞によって分泌される重要なリンホカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）が挙げられる。

【0110】

ＧＭ－ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生するように幹細胞を刺激する。単球は循環から出て組織内に移動し、そこで成熟してマクロファージおよび樹状細胞になる。よってこれは免疫／炎症カスケードの一部であり、このために少数のマクロファージの活性化によって、感染と戦うために重要なプロセスであるマクロファージ数の増加を迅速にもたらすことができる。ＧＭ－ＣＳＦは好中球遊走も増強し、細胞表面上に発現される受容体の変化を引き起こす。ＩＦＮγは、感染に対する自然免疫および適応免疫に重要なサイトカインである。ＩＦＮγはマクロファージの活性化因子であり、主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子発現の誘導因子である。免疫系におけるＩＦＮγの重要性は、それがウイルス複製を直接阻害できることに部分的に由来し、最も重要なことは、それが免疫刺激効果および免疫調節効果を有することである。

【0111】

モノカインは、主に単球およびマクロファージによって産生されるタイプのサイトカインである。いくつかのモノカインとしては、ＩＬ－１、腫瘍壊死因子アルファ、アルファインターフェロンおよびベータインターフェロン、ならびにコロニー刺激因子が挙げられる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）は、細胞シグナル伝達のために免疫系によって使用される小タンパク質のサイトカインである。ＴＮＦは、感染に対する炎症応答の一部として他の免疫系細胞を動員するために放出される。インターフェロン（ＩＦＮ）は、いくつかのウイルスの存在に応答して宿主細胞によって作製および放出されるシグナル伝達タンパク質のグループである。ＩＦＮ－αタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ：ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）によって産生され、主にウイルス感染に対する自然免疫に関与する。ＩＦＮ－βタンパク質は、線維芽細胞によって大量に産生され、主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、造血幹細胞の表面の受容体タンパク質に結合することによって細胞内シグナル伝達経路を活性化することで、細胞を増殖させて血液細胞に分化させることができる分泌糖タンパク質である。

【0112】

ケモカインは、近傍の応答性細胞における指向性走化性を誘導する能力を有する小サイトカインのファミリーである。ケモカインは、機能的に恒常性であるものと炎症性であるものとに分けられる。恒常性ケモカインは、特定の組織において構成的に産生され、基底白血球遊走を担い、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、およびＣＸＣＬ１３を含む。炎症性ケモカインは、病理学的条件下で形成され、免疫細胞を炎症部位に誘引する炎症応答に能動的に関与し、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０を含む。

【0113】

インターフェロン（ＩＦＮ）は、いくつかのウイルスの存在に応答して宿主細胞によって作製および放出されるシグナル伝達タンパク質のグループである。ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、およびＩＦＮ－ωは、ＩＦＮ－α／β受容体複合体に結合し、かつ標的細胞上の特異的受容体に結合して、ウイルスが自身のＲＮＡおよびＤＮＡを産生および複製するのを妨げるタンパク質の発現をもたらす。ＩＦＮ－γは、細胞傷害性Ｔ細胞および１型Ｔヘルパー細胞によって放出されるが、ＩＦＮ－γは、２型Ｔヘルパー細胞の増殖を妨げる。

【0114】

成長因子は、細胞増殖、創傷治癒、および時には細胞分化を刺激できる、天然に存在する物質である。成長因子としては、アドレノメデュリン（ＡＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１２、ＢＭＰ１２、ＢＭＰ１４、およびＢＭＰ１５）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ：Ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ：Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子３（ＦＧＦ３）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ５）、線維芽細胞成長因子６（ＦＧＦ６）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、線維芽細胞成長因子１１（ＦＧＦ１１）、線維芽細胞成長因子１２（ＦＧＦ１２）、線維芽細胞成長因子１３（ＦＧＦ１３）、線維芽細胞成長因子１４（ＦＧＦ１４）、線維芽細胞成長因子１５（ＦＧＦ１５）、線維芽細胞成長因子１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞成長因子１７（ＦＧＦ１７）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、線維芽細胞成長因子２２（ＦＧＦ２２）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ニュールツリン、ペルセフィン、アルテミン、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９：Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、肝臓癌由来成長因子（ＨＤＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、インスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１：Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ：Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１：Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ １）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ：Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３：Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、胎盤成長因子（ＰＧＦ：Ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ：Ｒｅｎａｌａｓｅ） － 抗アポトーシス生存因子、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ：Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α：：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、およびＷｎｔシグナル伝達経路タンパク質が挙げられる。

【0115】

上述したとおり、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む免疫細胞に対する免疫刺激性サイトカインである。ＩＬ－１２は、食細胞および抗原提示細胞によって特異的に産生され、抗腫瘍免疫応答を増強するヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ－１２の強力な免疫刺激特性の結果として、全身投与すると重篤な副作用がもたらされ得るため、患者におけるその臨床適用が制限される。操作されたＮＫ９２による腫瘍部位でのＩＬ－１２の発現は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）改変Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増加させることが示されている（ルオ（Ｌｕｏ）ら、フロンティアズ・イン・オンコロジー（Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．）（２０１９）１２月１９日；９：１４４８）。腫瘍におけるＩＬ－１２誘導性ＩＦＮγ蓄積は、Ｔリンパ球またはその他の宿主免疫細胞（例、ＮＫ細胞）の腫瘍への浸透も促進し、それによって治療効果が増強されると考えられている（チナサミー（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ）Ｄ．ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）２０１２：１８／フミェレフスキ（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ）Ｍ．ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）２０１１；７１／ケルカー（Ｋｅｒｋａｒ）ＳＰ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）２０１１；１２１／ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ＨＪ．ら、ネイチャー・レビューズ・クリニカル・オンコロジー（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ）２０１６；１３）。

【0116】

本発明の実施形態において、本発明の組成物は、機能的ＩＬ－１２またはその類似体もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む。野生型ＩＬ－１２は、３５ｋＤａのＩＬ－１２Ａサブユニットおよび４０ｋＤａのＩＬ－１２Ｂサブユニットのヘテロ二量体を含むため、ＯＲＦはこれらのサブユニットの一方を含んでもよく、かつ他方のサブユニットをコードする別のｍＲＮＡと組み合わせて投与されることによって、細胞における機能的ＩＬ－１２のアセンブリを可能にしてもよい。代替的に、機能的ＩＬ－１２は、単一のＯＲＦ内に両方のサブユニットを含むＩＬ－１２の改変された単鎖バージョンの形態であってもよい（たとえば、配列番号５９を参照）。

【0117】

本発明のいくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、腫瘍微小環境において一過性に発現される。他の実施形態において、コードｍＲＮＡは、たとえば活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのＡＰＣまたは免疫細胞の生存、増殖、および／または分化の調節に関与するサイトカインまたはその他の遺伝子産物をコードする。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、本明細書に開示される任意のサイトカイン、より具体的には、たとえばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＴＧＦベータ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、およびそれらの任意の組み合わせなどのサイトカインをコードし得る。

【0118】

マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、各々が約２０～２５ヌクレオチドを含有する非コードＲＮＡのクラスであり、そのいくつかは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中の相補的標的配列に結合することによって遺伝子発現の転写後調節に関与し、そのサイレンシングをもたらすと考えられている。これらのｍｉＲＮＡ相補的標的配列は、本明細書においてｍｉＲＮＡ結合部位またはｍｉＲＮＡ結合部位配列とも呼ばれる。特定のｍｉＲＮＡは、発現が高度に組織特異的であり、たとえばｍｉＲＮＡ－１２２およびその変異体は、肝臓に豊富に存在し、他の組織ではまれにしか発現されない（ラゴス－キンタナ（Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ）ら、カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００２；１２：７３５－７３９）。

【0119】

したがってｍｉＲＮＡ系は、細胞に導入された核酸が標的組織中の選択された細胞型においてサイレンシングされ、他の細胞型において発現され得る強固なプラットフォームを提供する。特定の所与のｍｉＲＮＡに対する標的配列を、標的細胞に導入するｍＲＮＡコンストラクトの特にＵＴＲ内に含めることによって、特定の導入遺伝子の発現をいくつかの細胞型では低減または実質的に排除する一方で、他の細胞型では残存させることができる（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）およびナルジニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．）２００９；１０（８）：５７８－５８５）。

【0120】

本発明の特定の実施形態に従って、複数のこうしたｍｉＲＮＡ標的配列を器官保護配列内に含ませ、次いでそれをｍＲＮＡコンストラクトに含ませ得ることが予期される。複数のｍｉＲＮＡ標的配列が存在するとき、この複数とはたとえば３つ以上、４つ以上、典型的には５つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍＲＮＡコンストラクト内の特定のＵＴＲ内で連続的に、タンデムに、または予め定められた位置に配置されてもよい。複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、器官保護配列全体の機能を支援または促進するように働く補助配列によって分離されてもよい。例として、適切な補助配列は、リンカーまたはスペーサー配列からなっていてもよく、この配列はランダム化されていてもよいし、たとえば「ｕｕｕａａａ」などの特定の配列を含んでもよいが、他のスペーサー配列も使用され得る。スペーサー長は変化でき、かつスペーサー配列の反復を含むことができ、たとえばスペーサー「ｕｕｕａａａ」は、連結されるべき任意の標的配列の各々の間に１回（すなわち、「ｕｕｕａａａ」）、２回（すなわち、「ｕｕｕａａａｕｕｕａａａ」 － 配列番号１）、３回、４回、５回、または６回含まれ得る。いくつかの実施形態では、結合部位配列間にスペーサー配列が存在しなくてもよい。

【0121】

ｍｉＲＮＡ－１２２は、健常な非疾患肝臓組織には豊富に存在するが、大部分の肝臓癌および疾患細胞において低減する（ブラコーニ（Ｂｒａｃｏｎｉ）ら、セミナーズ・イン・オンコロジー（Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．）２０１１；３８（６）：７５２－７６３、ブラウンおよびナルジニ、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．）２００９；１０（８）：５７８－５８５）。上記の方法により、標的組織が肝臓であるとき、ｍｉＲＮＡ－１２２標的配列（たとえば、配列番号１）をｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲに含めることによって、導入されたｍＲＮＡ配列の翻訳を癌性肝細胞において促進でき、かつトランスフェクトされた健常細胞において低減または実質的に排除できることが見出された。

【0122】

同様にして、他のｍｉＲＮＡ標的配列を使用することによって、他の器官における癌細胞と健常細胞との間でもこうしたｍＲＮＡの示差的翻訳が可能である。適切な候補としては、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２５、ｍｉＲＮＡ－１９９、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－Ｌｅｔ７、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１４１、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－１４３、ｍｉＲＮＡ－１４５、ｍｉＲＮＡ－１４８、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、およびｍｉＲＮＡ－３０ファミリー（たとえば、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｂ、またはｃ）に対する標的部位が挙げられる（が、これらに限定されない）。

【0123】

表２は、ｍｉＲＮＡ配列のさらなる（非限定的な）例を示し、これは特定の器官および／または組織における発現が実証されており、かついくつかの場合には健常細胞と疾患細胞との間の示差的発現が実証されているものである。

【0124】

ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０６は、筋肉および／または心筋特異的ｍｉＲＮＡの例として記載されている（センペーレ（Ｓｅｍｐｅｒｅ）ら、ゲノム・バイオロジー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００４；５：Ｒ１３；ルドウィグ（Ｌｕｄｗｉｇ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１６；４４（８）：３８６５－３８７７）。ｍｉＲＮＡ－１は疾患において調節不全であることも実証されており、たとえば梗塞心臓組織においてｍｉＲＮＡ－１のダウンレギュレーションが検出されており（ボスチャンシック（Ｂｏｓｔｊａｎｃｉｃ）Ｅ、ら、カルディオロジー（Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）、２０１０；１１５（３）：１６３－１６９）、一方では横紋筋肉腫細胞株においてもｍｉＲＮＡ－１の劇的な低減が検出されている（ラオ（Ｒａｏ）、プラカシュ（Ｐｒａｋａｓｈ）Ｋら、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ．）２０１０；２４（９）：３４２７－３４３７）。ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０６の使用は、特に本発明による組成物が筋肉内投与されるときに、所望であれば局所的な正常筋細胞における発現を低減させるように考慮されてもよい。

【0125】

ｍｉＲＮＡ－１２５は、表２に示されるとおりいくつかの組織において発現され、たとえば肝細胞癌（コッポラ（Ｃｏｐｐｏｌａ）ら、オンコターゲット（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ）２０１７；８）；乳癌（マティー（Ｍａｔｔｉｅ）ら、モレキュラー・キャンサー（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ）２００６；５）、肺癌（ワン（Ｗａｎｇ）ら、ＦＥＢＳジャーナル（ＦＥＢＳ Ｊ）２００９）、卵巣癌（リー（Ｌｅｅ）ら、オンコターゲット（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ）２０１６；７）、胃癌（シュー（Ｘｕ）ら、モレキュラー・メディシン・レポーツ（Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ）２０１４；１０）、結腸癌（トング（Ｔｏｎｇ）ら、バイオメディシン・アンド・ファーマコセラピー（Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ）２０１５；７５）、および子宮頸癌（ファン（Ｆａｎ）ら、オンコターゲット（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ）２０１５；６）；神経芽細胞腫、髄芽細胞腫（フェレッティ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（ｌｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ）２００９；１２４）、神経膠芽細胞腫（コルテス（Ｃｏｒｔｅｚ）ら、ジーンズ・クロモソームス・アンド・キャンサー（Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ）２０１０；４９）、および網膜芽腫（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、セル・シグナル（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ）２０１６；２８）などのいくつかの固形腫瘍においてダウンレギュレートされる。

【0126】

いくつかのｍｉＲＮＡ種は、多形神経膠芽腫細胞（チャン（Ｚｈａｎｇｈ）ら、Ｊ Ｍｉｏｌ Ｍｅｄ ２００９；８７／シャイ（Ｓｈｉ）ら、ブレーン・リサーチ（7Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ）２００８；１２３６）においても非疾患脳細胞（例、ニューロン）と比較して示差的に発現され、ｍｉＲＮＡ－１２４ａは最も調節不全のものの１つである（カルシ（Ｋａｒｓｙ）ら、ジーン・キャンサー（Ｇｅｎｅ Ｃａｎｃｅｒ）２０１２；３；リディック（Ｒｉｄｄｉｃｋ）ら、ネイチャー・レビューズ・ニューロロジー（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ）２０１１；７；ガウアー（Ｇａｕｒ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）２００７；６７／シルバー（Ｓｉｌｂｅｒ）ら、ＢＭＣメディシン（ＢＭＣ Ｍｅｄ）２００８；６）。

【0127】

肺癌において、近年のメタ分析により、非小細胞肺癌におけるＬｅｔ－７（ならびにｍｉＲＮＡ－１４８ａおよびｍｉＲＮＡ－１４８ｂ）のダウンレギュレーションが確認された（ラミチャネ（Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ）ら、ディジーズ・マーカーズ（Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ）２０１８）。

【0128】

同様に、ｍｉＲＮＡ－３７５発現は、健常な膵臓細胞と比較して、膵臓癌細胞においてダウンレギュレートされることが見出されている（シヅオ（Ｓｈｉｄｕｏ）ら、バイオメディカル・レポーツ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）２０１３；１）。膵臓において、ｍｉＲＮＡ－３７５発現は正常な膵臓細胞において高いが、疾患組織および／または癌性組織において有意に低いことが示されている（ソン（Ｓｏｎｇ）、ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、２０１３）。この発現は癌のステージに関連することが示されており、より進行した癌では発現がさらに低下する。ｍｉＲＮＡ－３７５は、３－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（ＰＤＫ１：３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－１）ｍＲＮＡを標的とし、したがってＰＩ３－キナーゼ／ＰＫＢカスケードに影響を及ぼすことによって、膵臓β細胞におけるグルコース誘導性の生物学的応答の調節に関与すると考えられている（エル・オウアマリ（Ｅｌ Ｏｕａａｍａｒｉ）ら、ダイアベティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）５７：２７０８－２７１７、２００８）。ｍｉＲＮＡ－３７５の抗増殖効果は、この推測される作用様式に関係しており、これは癌細胞におけるそのダウンレギュレーションを説明してもよい。

【0129】

表２は、本発明の実施形態において使用され得る、特定の器官および／または組織に関連するｍｉＲＮＡの非限定的な例を考察するものである。本発明は、所与のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのクラスが所与の器官または器官系内の第２の細胞型に対して第１の細胞型においてダウンレギュレートされる場合のみに限定されないことが認識されるだろう。反対に、たとえば器官もしくは器官系内に含まれるものなどの細胞型の間か、または異なる器官もしくは器官系の間に調節ｍｉＲＮＡの示差的発現パターンが存在することのみが必要とされる。細胞間のタンパク質産物の対応する示差的翻訳を可能にすることによって望ましくないオフターゲット副作用を低減するために、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ｍｉＲＮＡ系の示差的発現を活用できる。これは、細胞型または組織間でのｍＲＮＡの示差的発現が所望される実施形態において、特に有用である。たとえば、アジュバントとして使用される場合に、炎症性サイトカインをコードするｍＲＮＡを、炎症の増加が所望されないたとえば皮膚、肝臓、腎臓、または結腸などの１つ以上の健常な組織では発現させずに、主に免疫細胞において発現させることが有利であってもよい。

【0130】

癌と隣接する健常組織との間のｍｉＲＮＡの示差的発現によって、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡサイレンシングの使用を識別および特徴付けできるモデル系が表される。健常細胞と癌細胞との間の同様の示差的ｍｉＲＮＡ発現について証拠が見出されている癌の例としては、乳癌（ニガード（Ｎｙｇａａｒｄ）ら、ＢＭＣメディカル・ゲノミクス（ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、２００９年６月９日；２：３５）、卵巣癌（ワイマン（Ｗｙｍａｎ）ら、プロス・ワン（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ）、２００９；４（４）：ｅ５３１１）、前立腺癌（ワタヒキ（Ｗａｔａｈｉｋｉ）ら、プロス・ワン（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ）、２０１１；６（９）：ｅ２４９５０）、および子宮頸癌（ルイ（Ｌｕｉ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００７年７月１日；６７（１３）：６０３１－４３）が挙げられる。特許文献１には、さまざまな癌細胞における発現レベルが異なる広範囲のｍｉＲＮＡが記載されている。皮膚では、健常組織と隣接する黒色腫細胞との間の示差的発現ｍｉＲＮＡ発現も観察される。

【0131】

【表2】

【0132】

免疫療法で患者を処置することは、オフターゲット効果の可能性に起因する安全性の問題を有することがある。コードｍＲＮＡ配列の提供による特定のポリペプチドの発現であっても、特定の器官に対する負の影響を有し得る。したがって、たとえば肝臓、脳、乳房、肺、膵臓、結腸／胃腸管、皮膚、筋肉、および腎臓などの健常な組織を保護することは、臨床応用の成功のために最重要である。上記のものなどのｍｉＲＮＡを使用して、特定の細胞、組織、および／または器官のタイプにおいて投与されたｍＲＮＡの発現を低下させて、それらの細胞、組織、および／または器官を任意のオフターゲット効果から保護できる。たとえば、特定の組織において高度に発現される特異的ｍｉＲＮＡに対する標的配列を用いて健常細胞を保護することができ、たとえばｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、および／またはｍｉＲＮＡ－２０６を用いて、健常な筋肉および／または心筋組織を保護できる。結果として、疾患細胞および健常細胞における示差的発現と必ずしも関連しないｍｉＲＮＡ標的配列を使用することが所望されてもよい。たとえば、ｍｉＲＮＡ－１４２およびｍｉＲＮＡ１４５は膵臓組織において発現し、一方でｍｉＲＮＡ－９は脳および肺において高発現するため、これらの組織の保護に使用できる。

【0133】

２つ以上の組織を保護するときは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列の組み合わせが使用される。たとえば、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－１、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列は、肝臓、皮膚、筋肉、および腎臓組織の細胞を保護するために一緒に使用される。

【0134】

よって本発明の組成物は、これまでの「実験的な」細胞療法またはウイルス療法の採用の成功を増強および促進するための実現可能な技術プラットフォームを表してもよい。

【0135】

本開示から明らかであるとおり、本発明は、治療、送達プラットフォーム（たとえば異なるナノ粒子組成物など）、治療剤（たとえば薬物、ワクチン、および／またはウイルスなど）、コードされたポリペプチドおよび標的細胞、組織、または器官のいくつかの可能な組み合わせに関係することが想定される。これらの可能性の各々およびすべては、ｍＲＮＡ配列によって供給されるコードポリペプチドの最適な発現に対する関係を有する。

【0136】

ｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上の特徴の最適化は、示差的発現を促進することによって健常な器官の保護を行うことに特定の効力をもたらし得ることが見出されている。同様に、特定の状況に従って、特定の器官、組織、または細胞型において得られる示差的発現を増加または減少させるように、こうした特徴を制御できる。さまざまな異なる細胞型においてさまざまな発現レベルが所望される状況が存在することがあり、本明細書に記載される１つ以上の特徴を変化させることによって、こうした結果を可能にするように標的配列が改変され得ることが意図される。加えて、ｍｉＲＮＡ標的部位配列は、同じ組織内または異なる組織内で２つ以上のｍｉＲＮＡによる調節を受けるように改変され得る。

【0137】

配列一致：標的配列が相補的ｍｉＲＮＡ配列と正確に一致する程度（すなわち、ｍｉＲＮＡ配列と結合部位配列との間のミスマッチの数）は、結果として生じる発現サイレンシングの効力に影響を与えることが示されている。たとえば、正確な一致または完全一致は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を有する配列のより迅速な分解をもたらすことが示されている（ブラウンおよびナルジニ、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．）２００９；１０（８）：５７８－５８５。したがって、特定の細胞型において特定のポリペプチド産物の完全または完全に近いサイレンシングが必要とされるとき、その細胞型に関連するｍｉＲＮＡ配列と正確に一致するか、または最大で１塩基対ミスマッチ以下を有するｍｉＲＮＡ標的配列を選択することが所望されてもよい。同様に、特定の細胞型において発現の欠如ではないが低減が所望されるときは、ミスマッチの数が増加したｍｉＲＮＡ結合部位配列を選択して、これを可能にできる。最終的にプロセシングされた成熟５Ｐまたは３Ｐ ｍｉＲＮＡを有するステムループｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの配列、および下線を引いたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ中の成熟ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する配列、ならびに成熟ｍｉＲＮＡ配列および二重鎖形成配列自体を含む、本明細書で言及されるいくつかのｍｉＲＮＡ配列の例を以下の表３に示す。細胞において有意なレベルで発現された成熟ｍｉＲＮＡ（５Ｐ鎖および３Ｐ鎖のいずれかまたは両方であり得る）をマークしている（＊）。表４は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにおいて二重鎖を形成する元の不完全一致の標的配列、続いて成熟ｍｉＲＮＡ配列、および過剰発現された成熟ｍｉＲＮＡ配列と完全一致するように設計された改変相補的標的配列の開発を示す。従来の５’から３’方向の改変標的配列を太字で示す。

【0138】

【表3】

【0139】

【表4】

【0140】

ｍｉＲＮＡ配列の変異体および多型が見出され得ること、ならびに類似の特性を有するｍｉＲＮＡファミリーが存在することが公知である。本発明では、特定のｍｉＲＮＡ配列および関連する結合部位のすべての適切な変異体およびファミリーメンバーが適切なときに使用され得ることが想定される。他方で、明らかに密接に関連するｍｉＲＮＡ配列が、異なる発現プロファイルを有し得る（サン（Ｓｕｎ）ら、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ）。２０１７年１１月２８日）ため、場合によっては文献を参照することによって、特定の置換が適切かどうかを決定することが必要となろう。たとえばＬｅｔ－７は、いくつかの関連する変異体を有するより広いファミリーの一部であり、それらの変異体はＬｅｔ－７ａからＬｅｔ－７ｋなどと示され得る。上記で考察したとおり、こうした変異体および多型は、ｍｉＲＮＡ介在性サイレンシングを可能にする自身の効力が異なることがあり、したがって特定の細胞型における所望のレベルのサイレンシングを可能にするために特定の選択を行い得ることが意図される。

【0141】

ｍＲＮＡコンストラクト中の複数のｍｉＲＮＡ標的配列の存在は、供給される単数または複数のポリペプチドの示差的発現の効力の改善を可能にする。理論に結び付けられるものではないが、標的部位の数が増加すると、ｍｉＲＮＡによる翻訳阻害の可能性が増加すると考えられる。複数のｍｉＲＮＡ標的部位は、実質的に同じ標的配列の複数のコピーを含むことができ、それによって冗長性が導入される。代替的または付加的に、複数の標的配列は、実質的に異なる配列を含むことができ、それによってｍＲＮＡコンストラクトが２種以上のｍｉＲＮＡに標的にされることを可能にする。上記の器官およびそれらの関連する特異的ｍｉＲＮＡ発現の考察から明らかであるとおり、このようにして、２つ以上の細胞型について、および／または２つ以上の器官において、供給されたｍＲＮＡコンストラクトの示差的発現が達成され得る。両方のアプローチが、同じ配列または複数の配列内で可能であると考えられる。同じｍｉＲＮＡ配列に対する標的であることが意図されるが、たとえばＬｅｔ７などの同じファミリーの異なるｍｉＲＮＡ変異体に結合するために差異を有する標的部位が含まれる、中間のアプローチも想定される。

【0142】

複数の標的部位の使用に関連するいくつかの利点には、単一の器官内で本発明のｍＲＮＡ配列によって供給されるポリペプチドの示差的発現の効率の増加が含まれる。異なる結合部位配列、または２つ以上の組織もしくは器官のタイプに適用可能な配列を使用することによって、２つ以上の器官または組織における異なる細胞型において示差的発現を達成することを可能にできる。これは、本発明による組成物の全身投与が使用され、２つ以上の器官におけるオフターゲット効果を回避する必要があるときに望ましいことがある。

【0143】

局所化または標的化した投与であっても、供給されたｍＲＮＡコンストラクトは、それらが意図されていない器官、組織、および／または細胞に遭遇または蓄積する可能性がある。特に、肝臓および脾臓組織は、これらの器官の生理学的機能のために、投与された組成物を蓄積することがある。これらの場合、オフターゲット効果を回避するために、供給されるコンストラクトが、これらの組織における発現の低減を可能にするｍｉＲＮＡ標的配列を含むことが有利であってもよい。逆に、いくつかの器官、組織、および／または細胞型においては発現が促進されるが、他のものでは促進されないことが望ましいことがあり、これはそれに応じたｍｉＲＮＡ標的配列の選択によって達成できる。

【0144】

ｍｉＲＮＡ標的部位の特定の組み合わせは、標的器官の特定の組み合わせに関連でき、これは異なる状況において特に有効であってもよい。たとえば、投与された組成物は肝臓および脾臓に蓄積する可能性があるため、それらの器官に関連するｍｉＲＮＡ標的配列を使用することによって、組成物と接触し得る健常細胞に指向された保護を与えることができる。たとえば、結合部位配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２およびｍｉＲＮＡ－１４２の各々、または肝臓および脾臓関連ｍｉＲＮＡ配列の任意のその他の組み合わせ、たとえば表２においてこれらの器官について列挙されるものの任意の組み合わせなどに対する１つ以上の標的を提供し得る。こうした組み合わせは、たとえばｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５、およびｍｉＲＮＡ－１９９（肝臓）から選択される少なくとも１つの標的部位の少なくとも１つのコピー；ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１９４、ｍｉＲＮＡ－２０４、ｍｉＲＮＡ－２１５、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｂ、ｃ（腎臓）から選択される少なくとも１つの結合部位配列の少なくとも１つのコピー；ならびにｍｉＲＮＡ－１４２（脾臓）に対する結合部位の少なくとも１つのコピーなどを含み得る。

【0145】

こうしたアプローチは、特定の種類の送達ナノ粒子に特に有利であってもよい。たとえば、リポソームベースのナノ粒子は、肝臓、腎臓、および脾臓に蓄積する傾向があるかもしれない。他のナノ粒子タイプまたは代替的な投与アプローチは、異なる器官または組織に蓄積することがあり、あるいは組成物の標的化によって特定の器官または組織の発現調節が特に必要となることがある。たとえば、筋肉内投与は筋肉組織における蓄積をもたらすことがあり、皮下投与は皮膚組織における蓄積をもたらすことがあり、その影響に対する保護からそれらの細胞型は利益を受けるだろう。したがって、複数の器官における望ましくない発現からの広範な保護を与えるｍｉＲＮＡ結合部位配列を含む、一般的な、おそらくはより長い配列を選択するか、またはより短い配列および／もしくは反復結合部位配列の包含を可能にし得る、特定の状況において必要とされる１つ以上の器官における特異的保護を可能にする特定のｍｉＲＮＡ結合部位配列を選択することが可能である（下記参照）。このようにして、送達されるｍＲＮＡ配列を送達様式に関して最適化できる（またはその逆も同様である）。

【0146】

いくつかの場合には、器官保護配列において使用されるｍｉＲＮＡ標的配列は、処置される組織または器官と関連していなくてもよく、前記組織および器官内の健常細胞と疾患細胞との間の示差的発現をもたらすように設計されていなくてもよい。むしろｍｉＲＮＡ結合配列は、処置することが意図されない器官におけるオフターゲット効果を防止するように選択されてもよい。たとえば、本発明による組成物および方法は、たとえば黒色腫の処置などの皮膚の処置のために設計され得る。皮膚への組成物の適用は、たとえば腫瘍への直接注射または腫瘍に直接つながる血液供給への注射などによって、局所的または腫瘍内（ＩＴ：ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ）に行われ得る。しかしこうした場合、組成物は、血流、リンパ系によって取り込まれる可能性があり、またはこれらの手段もしくはその他の手段によって、たとえば肝臓、腎臓、および／もしくは脾臓などの皮膚以外の器官に接触および／もしくは蓄積し得る。こうした場合、ｍｉＲＮＡ標的配列は、望ましくない体内分布に適応し、こうしたオフターゲット器官内でのコードｍＲＮＡの発現を防止するように選択されてもよい。たとえば、肝臓、腎臓、および脾臓に関連するｍｉＲＮＡ標的配列の使用が選択されてもよく、それによってこれらの器官内に含まれる健常細胞内での発現が防止されてもよい。これを可能にし得るｍｉＲＮＡ標的配列の可能な組み合わせの例が上記に示される。

【0147】

結合部位配列とｍｉＲＮＡ配列との間の完全一致は、ｍｉＲＮＡ介在サイレンシングを起こすために必要とされず、かついくつかのｍｉＲＮＡ配列（特に類似の細胞型内に存在する配列）はかなりの類似性を有するので、２つ以上のｍｉＲＮＡ配列に対する標的を提供し得る配列を考案できる可能性があることも想定される。たとえば、ｍｉＲＮＡ－１２２およびｍｉＲＮＡ－１９９は類似の結合部位配列を有し、たとえばｍｉＲＮＡ－１２２結合部位配列をわずかに改変することなどによって、両方のｍｉＲＮＡに実質的に相補的である配列を設計してｍｉＲＮＡ標的配列として含ませることができる。このようにして、ｍｉＲＮＡ－１２２およびｍｉＲＮＡ－１９９の両方がこうした配列に結合し、ｍＲＮＡの分解を増加させ得る。同様に、Ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡに対する標的配列は、Ｌｅｔ－７ファミリーの他のメンバーに対する標的配列として働き得る。異なるｍｉＲＮＡの結合部位配列を、任意の適切なアラインメント技術によってアラインメントして、共有ヌクレオチドについて比較することができ、それによってそれらの共有ヌクレオチドを含む結合部位配列を設計できる。

【0148】

本発明の特定の実施形態において、特定の標的部位配列がｍＲＮＡ内で反復される回数は、結合部位配列が介在するサイレンシングの効力に影響することがある。たとえば、１つのｍｉＲＮＡ標的部位の反復数を増加させることによって、関連ｍｉＲＮＡがそれに結合する可能性を増加させることができ、よって翻訳が起こる前の翻訳阻害または分解の可能性を増加させることができる。結果として、特定の細胞型においてより完全なｍｉＲＮＡ介在性サイレンシングが必要とされるとき、それらの細胞において発現されるｍｉＲＮＡに適した標的配列のより多くの反復が使用され得る。同様に、本明細書において考察される他のアプローチのいずれかを伴うか、または伴わずに、より少ない結合部位配列を含ませることによって、低減するが欠如しない発現が達成され得る。したがって、ｍＲＮＡ中に同じ結合部位配列を１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上提供することができ、かつそれを単独で提供するか、または他のｍｉＲＮＡの標的部位配列と組み合わせて提供できる。

【0149】

特定の実施形態によると、ｍＲＮＡ配列内に含まれるｍｉＲＮＡ標的部位の順序は、得られる器官保護効力に影響することがある。たとえば、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－３７５、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－１４２（肝臓、肺、乳房、膵臓、腎臓、および脾臓細胞に存在する）に対する標的配列は、この順序で提供することもできるし、たとえば以下などのいくつかの他の順列で提供することもできる。
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３７５ － Ｌｅｔ７ － ｍｉＲＮＡ－１９２ － ｍｉＲＮＡ－１４２；
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３７５ － Ｌｅｔ７ － ｍｉＲＮＡ－１４２ － ｍｉＲＮＡ－１９２；または
ｍｉＲＮＡ－１２２ － Ｌｅｔ７ － ｍｉＲＮＡ－３７５ － ｍｉＲＮＡ－１４２ － ｍｉＲＮＡ－１９２。

【0150】

別の例として、ｍｉＲＮＡ－１２２、Ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲＮＡ－１４２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、ｍｉＲＮＡ－１４３（肝臓、肺／結腸、脾臓／造血細胞、腎臓、および結腸細胞に存在する）に対する標的配列は、この順序で提供することもできるし、たとえば以下などのいくつかの他の順列で提供することもできる。
ｍｉＲＮＡ－１２２ － Ｌｅｔ７ａ － ｍｉＲＮＡ－１４２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ － ｍｉＲＮＡ－１４３；
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－１４２ － Ｌｅｔ７ａ － ｍｉＲＮＡ－１４３ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ；または
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ － Ｌｅｔ７ａ － ｍｉＲＮＡ－１４３ － ｍｉＲＮＡ－１４２

【0151】

以下により詳細に記載される本発明の特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ（肝臓、結腸、および腎臓に存在する）に対する標的配列は、たとえば以下などのさまざまな組み合わせで提供することができる。
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－１９２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ；
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ － ｍｉＲＮＡ－１９２；または
ｍｉＲＮＡ－１９２ － ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ

【0152】

以下により詳細に記載される本発明のさらなる実施形態において、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ（肝臓、結腸、脾臓、肺、および腎臓に存在する）に対する標的配列は、たとえば以下などのさまざまな組み合わせで提供することができる。
Ｌｅｔ７ｂ － ｍｉＲＮＡ－１２６ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ；
Ｌｅｔ７ｂ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ － ｍｉＲＮＡ－１２６；または
ｍｉＲＮＡ－１２６ － Ｌｅｔ７ｂ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ

【0153】

本明細書において考察されるとおり、こうした組み合わせは、特定の癌の処置、またはワクチンもしくはアジュバント発現系における使用のために設計された組成物の投与によって影響を受けやすい組織を保護するのに有用であり得る。

【0154】

さらなる例として、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－３０ａ（肝臓、皮膚、筋肉／心筋、および腎臓に存在する）に対する標的配列は、この順序で提供することもできるし、たとえば以下などのいくつかの他の順列で提供することもできる。
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ；
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ；または
ｍｉＲＮＡ－１２２ － ｍｉＲＮＡ－３０ａ － ｍｉＲＮＡ－１ － ｍｉＲＮＡ－２０３ａ

【0155】

ワクチン、アジュバント、および類似のアプローチに関連して以下に考察されるとおり、こうした組み合わせは、免疫応答を誘導するように設計された組成物の投与によって影響を受けやすい組織を保護するのに有用であり得る。

【0156】

したがって本発明は、ｍＲＮＡによって送達されるコード配列、およびどの細胞型に送達するかによって調整可能な異なるアプローチを選択することを可能にする。言い換えると、本発明によって可能になる示差的発現は、必要とされるいかなる発現レベルまたは発現低下も可能にするために「構成可能」である。

【0157】

別の実施形態において、送達されたｍＲＮＡは、免疫刺激タンパク質または抗免疫抑制タンパク質をコードしてもよいし、別のやり方で免疫応答を誘導するように作用してもよい。こうした場合、標的疾患細胞におけるコード産物の最大限の発現が所望されてもよいが、標的器官の周囲の健常組織における発現を低減させるがなおも存在させることも所望されてもよい。他方で、オフターゲット免疫応答および起こり得る全身反応を防止するために、特定の組織（たとえば脳または他の神経組織など）におけるこうした免疫刺激産物の発現を完全に回避すること、および／または組成物が蓄積しやすい細胞、組織、および器官における発現を低減させることが望ましいことがある。したがって一例では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、標的疾患細胞における完全な発現を可能にし、標的器官における健常細胞での発現を部分的に低下させ、一方で神経組織および蓄積部位における発現をより完全に低下させるように、上記で考察したアプローチの１つ以上によって決定され得る。

【0158】

いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるｍＲＮＡ配列を単一の組成物中に提供してもよい。これらの異なる配列は、異なるポリペプチドおよび／または異なるｍｉＲＮＡ標的部位をコードし得る。このようにして、単一の組成物が複数の異なるポリペプチドの発現を可能にし得る。別々のｍＲＮＡ配列においてｍｉＲＮＡ標的配列の異なる組み合わせを使用することによって、所望の目的に従って、異なる細胞型または標的器官が特定のポリペプチドを発現するか、または特定のポリペプチドの発現から保護されることが可能となる。たとえば、肝臓および脳の健常細胞をポリペプチド「Ａ」の発現から保護する必要があるが、健常な脳においてポリペプチド「Ｂ」を発現し、肝臓では発現しないことが所望されるとき、第１のｍＲＮＡ配列は、「Ａ」の配列と共にｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４ａに対する標的部位を含んでもよく、一方で第２のｍＲＮＡ配列は、「Ｂ」の配列と共にｍｉＲＮＡ－１２２およびｍｉＲＮＡ－１２５ａに対する結合部位を含み得る。

【0159】

当業者は、器官および細胞型の所与のセットにおける発現の任意の組み合わせを達成するために、ｍｉＲＮＡ標的部位、ポリペプチド配列、および複数のｍＲＮＡ配列の組み合わせを考案できることが認識され得る。これらの配列に関係する関連器官および組織のタイプは、上記および表２で考察されている。図１は、本発明のいくつかの実施形態によるｍＲＮＡコンストラクトの概略図を示す。ＯＲＦは開始コドンに先行され、終止コドンで終結し、その後の３’ＵＴＲに一連の最大５つ以上の結合部位配列が存在する。図１に示すとおり、ＯＰＳを規定するｍｉＲＮＡ標的部位（ＢＳ１～ＢＳ５）は、スペーサーによって分離されていてもよいし、好ましいときはスペーサーがまったくなくてもよい。ＯＲＦは、たとえば本明細書に記載のポリペプチドなどをコードし得る。任意の実施形態において終止コドンの可変性が想定され、すべての実施形態において、ＯＲＦと結合部位配列との間に終止コドンが存在しないことがある。

【0160】

本発明によって供給されるｍＲＮＡ配列のＵＴＲは、標的器官内の細胞型の１つにおいて発現されるＵＴＲ配列の一部または全部に対する類似性、たとえば９０％を超える類似性などを有するように選択され得る。特定の細胞型は、発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子を有することがあり、ＵＴＲ配列は、たとえば関連するｍＲＮＡ配列の安定性または分解を促進することなどによって、この制御に介在できる。

【0161】

一例として、癌細胞においてアップレギュレートされることが公知である遺伝子に関連するＵＴＲは、これらの癌細胞における自身の安定性および翻訳を促進するたとえばｍｉＲＮＡ結合部位配列などの１つ以上の特徴を有してもよい。供給されるｍＲＮＡ配列に類似の配列を組み込むことによって、安定性および翻訳が癌性細胞において改善されるが、非癌性細胞または健常細胞においては改善されないようにできる。

【0162】

特定の状況において、標的組織における異なる細胞型において示差的発現を示すｍｉＲＮＡ配列に対する２つ以上の候補が存在し得る可能性がある。こうした場合には、ｍＲＮＡコンストラクトに複数のｍｉＲＮＡ標的配列が含まれること、およびこれらの配列が実質的に異なる配列であり得ることが有利であってもよい。しかし、複数のｍｉＲＮＡ標的配列の各々が実質的に同じ配列であり得ることも想定される。

【0163】

サイトカインとの組み合わせ
本明細書に記載される組成物および方法は、病原生物からの疾患または感染に対する免疫応答を誘導するように作用し得ることが予期される。特に、癌細胞に対して免疫応答が誘導されてもよい。発癌のプロセスはしばしば、癌細胞が免疫系を逃れようとするやり方を含み、それはこれらの細胞によって産生および提示される抗原に対する変化を伴う。

【0164】

いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるｍＲＮＡは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）、抗免疫抑制タンパク質、または免疫原性剤であるタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「抗免疫抑制タンパク質」という用語は、免疫抑制経路を阻害するタンパク質である。

【0165】

本明細書で使用される「免疫原性剤」という用語は、炎症性または免疫原性免疫応答を増加させるタンパク質を示す。特定の実施形態では、抗免疫抑制および免疫原性剤は、抗腫瘍免疫応答を誘導する。こうした薬剤の例としては、免疫チェックポイント受容体（例、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＰＤ１、およびＰＤＬ１など）に結合してそれを阻害する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、炎症性サイトカイン（例、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦなど）、または活性化受容体（例、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、および同時刺激受容体など）に結合してそれを活性化するタンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、タンパク質はＥｐＣＡＭ、ＩＦＮβ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、Ａ２Ａ、抗ＦＧＦ２、抗ＦＧＦＲ／ＦＧＦＲ２ｂ、抗ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＣＬ５、ＣＤ１３７、ＣＤ２００、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＳＦ－１Ｒ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、エンドセリンＢ受容体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－３５、ＩＳＲＥ７、ＬＦＡ－１、ＮＧ２（ＳＰＥＧ４としても公知である）、ＳＭＡＤ、ＳＴＩＮＧ、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、およびＶＣＡＭ１から選択される。

【0166】

本発明は、細胞ベースの治療において使用される標的細胞集団に、機能的巨大分子をコードするｍＲＮＡを供給する組成物を包含する。いくつかの実施形態では、標的細胞集団は、遺伝子操作されたＴ細胞集団である。

【0167】

コードｍＲＮＡを使用して、免疫細胞の集団または免疫細胞集団の組み合わせを対象の特定の部位に誘引してもよい。いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、免疫細胞を腫瘍微小環境に誘引するために使用される。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、腫瘍微小環境への免疫細胞の不十分な遊走を克服するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｂ細胞、たとえばマクロファージもしくは樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に誘引するために使用される。

【0168】

コードｍＲＮＡは、腫瘍微小環境へのＴ細胞の不十分な遊走を克服するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、送達粒子は、腫瘍微小環境を特異的に標的とし、コードｍＲＮＡは、腫瘍微小環境にＴ細胞を誘引するか、または別様に動員する遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡはケモカインを発現する。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、Ｔ細胞を誘引するケモカイン、たとえばＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＸＣＬ１、およびこれらの任意の組み合わせなどをコードし得る。たとえば自己免疫疾患など、逆の効果が所望される状況において、コードｍＲＮＡは、上記因子のブロッカー、アンタゴニスト、および／または阻害剤を発現し得る。

【0169】

コードｍＲＮＡは、腫瘍微小環境に送達され、その中で一過性に発現されてもよい。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、たとえば活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの、腫瘍応答における免疫細胞の生存、増殖、および／または分化の調節に関与するサイトカインまたはその他の遺伝子産物をコードする。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、たとえばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＴＧＦベータ、およびそれらの任意の組み合わせなどのサイトカインをコードし得る。再び、たとえば自己免疫疾患など、逆の効果が所望される状況において、コードｍＲＮＡは、上記因子のブロッカー、アンタゴニスト、および／または阻害剤、たとえばＴＧＦベータの阻害剤などを発現し得る。

【0170】

ｍＲＮＡを供給する組成物は、特定の細胞サブタイプを標的とし、それらに結合すると、受容体介在性エンドサイトーシスを刺激することによって自身が運搬する合成ｍＲＮＡを細胞に導入することで、その細胞が合成ｍＲＮＡを発現し得るようにするように設計されてもよい。導入遺伝子の核輸送および転写は必要とされないので、このプロセスは迅速かつ効率的である。

【0171】

いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡは、免疫細胞（たとえば共刺激物質など）もしくは免疫経路に関連する受容体もしくはその他の細胞表面タンパク質、またはこうした受容体を標的とする分子をコードしてもよい。たとえば、コードｍＲＮＡは、次のうちの１つ以上から選択される以下の細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子をコードしてもよい。ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ－３、ＧＰ－２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４。同様に、コードｍＲＮＡは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化因子をコードしてもよい。一実施形態では、コードｍＲＮＡは、１つ以上のＴ細胞膜タンパク質３阻害剤をコードする。一実施形態では、コードｍＲＮＡは、ＮＦ－κＢの１つ以上の阻害剤をコードする。

【0172】

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーは、病原体認識および自然免疫の活性化に関与する。特にＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡを認識でき、したがって転写因子ＮＦ－κＢの活性化および抗ウイルス応答によるｓｓＲＮＡウイルスの認識において役割を果たす。したがって、コードｍＲＮＡがたとえばＴＬＲ８などのＴＬＲファミリーのメンバーをコードする実施形態は、抗ウイルス応答が所望されるときに考慮される。

【0173】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ送達系を使用して、Ｔ細胞を所望の表現型に向けてプログラムする１つ以上の薬剤をコードするｍＲＮＡを送達してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡナノ粒子送達組成物を使用して、所望のＴ細胞表現型の特徴であるマーカーおよび転写パターンを誘導してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡナノ粒子送達組成物を使用して、ＣＤ２６Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ：ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ）の発生を促進してもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、標的細胞集団における細胞分化を制御するために、１つ以上の転写因子をコードするｍＲＮＡを供給する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＣＤ８ Ｔ細胞における発生のエフェクターからメモリーへの移行を制御するＦｏｘｏ１である。

【0174】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ送達組成物は、たとえばＴ細胞上に見出される表面抗原などのＴ細胞マーカーに特異的な表面アンカー標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、表面アンカー標的化ドメインは、ナノ粒子をＴ細胞に選択的に結合し、受容体誘導性エンドサイトーシスを開始してｍＲＮＡナノ粒子送達組成物を内部移行させる抗原に対して特異的である。いくつかの実施形態において、表面アンカー標的化ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、またはそれらの組み合わせに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、表面アンカー標的化ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、またはそれらの組み合わせに選択的に結合する抗体であるか、またはそれに由来する。

【0175】

送達プラットフォーム
標的細胞へのコードヌクレオチド配列の導入は、細胞外空間から細胞内環境へ所望の物質を移動させるために、送達剤または「インビボ送達組成物」の使用を必要とすることが多い。こうした送達剤／組成物は、しばしば送達粒子を含んでもよい。送達粒子は、食作用を受け、かつ／または標的細胞と融合することがある。送達粒子は、封入によって、またはマトリックスもしくは構造内に物質を含むことによって、所望の物質を含有してもよい。

【0176】

本明細書で使用される「送達粒子」という用語は、封入、マトリックス内での保持、複合体の形成、表面吸着、またはその他の手段によって治療成分を含み得る粒子を含む薬物または生物学的分子送達系を示す。これらの系は、たとえばコード核酸配列などの治療成分を標的細胞に送達できる。分子または物質の直接投与と比較して、送達粒子の使用は、作用部位に送達される物質の量、時間、および／または放出動態を制御することによって、送達の効力だけでなく安全性も改善してもよい。送達粒子系は、物質または薬物が所望の治療標的位置に到達することを可能にするために生物学的膜を横断することにも熟達している。送達粒子はマイクロスケールであってもよいが、特定の実施形態では、典型的にはナノスケール、すなわちナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、典型的には直径が少なくとも５０ｎｍ（ナノメートル）、適切には少なくとも約１００ｎｍ、典型的には最大で１５０ｎｍ、２００ｎｍのサイズであるが、任意選択的には最大で３００ｎｍである。本発明の一実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも約６０ｎｍの平均直径を有する。これらのサイズの利点は、これが、粒子が細網内皮系（単核食細胞系）クリアランスの閾値未満であること、すなわち粒子が身体の防御機構の一部として食細胞によって破壊されないほど十分に小さいことを意味することである。これは、本発明の組成物のために静脈内送達経路を使用することを容易にする。送達粒子内に含まれる活性物質をそれらの標的組織に投与および送達するために使用される経路は、疾患、特に感染性疾患を処置するときに非常に重要な因子である。これらの経路は、それらがどのように適用されるかに依存して、異なるレベルの効力を有することがある。本発明の特定の実施形態では、送達粒子の投与は通常、たとえば皮下、静脈内、または動脈内投与などによる全身的なものである。時折、疾患のタイプまたは重篤度によって、送達粒子は、罹患した器官または組織に、たとえば腫瘍内投与などによって直接適用されてもよい。

【0177】

ナノ粒子の組成物の代替的な可能性としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ：ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））、ポリカプロラクトン、脂質またはリン脂質ベースの粒子、たとえばリポソームまたはエキソソームなど；タンパク質および／または糖タンパク質に基づく粒子、たとえばコラーゲン、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、ケラチン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質、およびたとえばカゼインなどの乳タンパク質など（ロチャロエンカル（Ｌｏｈｃｈａｒｏｅｎｋａｌ）ら、バイオメッド・リサーチ・インターナショナル（ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；２０１４巻（２０１４））；コロイド状ナノ粒子；ならびにたとえば金、銀、アルミニウム、銅酸化物、金属有機サイクルおよびケージ（ＭＯＣ：ｍｅｔａｌ－ｏｒｇａｎｉｃ ｃｙｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｇｅｓ）などの金属または金属化合物に基づく粒子などが挙げられる。特定の実施形態において、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）は、高い生体適合性および生分解性を有するため、本発明の送達粒子において使用されてもよい。ＰＬＧＡは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって１９８９年に臨床使用が承認された。それ以来、広範囲の薬物および生体分子の持続放出製剤に対してＰＬＧＡが好まれてきた。ＰＬＧＡは、同様にミセルベースのナノ粒子を作製するために、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）と共製剤化されてもよい。加えて、ＰＬＧＡおよびＰＥＧのジブロックコポリマー、またはＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧトリブロックコポリマーを使用してミセルが調製されてもよい。

【0178】

特に、核酸の送達のためにポリエチレンイミン（ＰＥＩ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を含むポリマーが研究されている。ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ：ｐｏｌｙ（β－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒｓ））から構成されるナノ粒子ベクターも、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）との共製剤化において、核酸送達に適していることが示されている（カチュマレク（Ｋａｃｚｍａｒｅｋ）ＪＣら、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション・イングリッシュ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．）２０１６；５５（４４）１３８０８－１３８１２）。デンドリマーも使用が予期される。こうした共製剤の粒子は、ｍＲＮＡを肺に送達するために使用されてきた。

【0179】

たとえばセルロース、キチン、シクロデキストリン、およびキトサンなどの多糖類およびそれらの誘導体に基づく粒子も考慮される。キトサンは、キチンを部分的に脱アセチル化して得られるカチオン性の直鎖状多糖であり、この物質を含むナノ粒子は、たとえば生体適合性、低毒性、および小サイズなどの薬物送達のために有望な特性を有する（フェルト（Ｆｅｌｔ）ら、ドラッグ・ディベロプメント・アンド・インダストリアル・ファーマシー（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、２４巻、１９９８－１１号）。上記の構成要素の組み合わせが使用されてもよいことが想定される。本発明の特定の実施形態において、ナノ粒子は、粘膜における持続放出生体分子送達のために理想的となる優れた粘膜接着および浸透特性を示すキトサンを含む。

【0180】

送達粒子は、たとえばニオソームまたはリポソームなどの脂質ベースのナノ粒子送達系を含んでもよい。脂質ナノ粒子は、典型的にはリン脂質、イオン化可能な脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を含有する多成分脂質系である。粒子表面上のＰＥＧ化脂質は、インビボで粒子凝集を低減し、循環時間を延長させるのに役立ち得る。適切なリポソーム製剤は、Ｌ－α－ホスファチジルコリンおよびＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｒａｃ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））を含んでもよい。核酸の送達に特に適したイオン化可能な脂質を含む代替的なリポソーム製剤は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ））およびＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコント－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエートを含んでもよい。脂質ベースのナノ粒子の効力の別の決定因子は、脂質ｐＫａである。ｍＲＮＡカーゴの送達のために最適な脂質ｐＫａは、６．６～６．８の範囲である。

【0181】

送達粒子は、アミノアルコールリピドイドを含んでもよい。これらの化合物は、核酸の送達に特に適したナノ粒子、リポソーム、およびミセルを含む粒子の形成に使用されてもよい。本発明のいくつかの実施形態によるアミノアルコールリピドイド粒子を含むナノ製剤の製造の例示的な例が実施例に見出されてもよい。本発明の実施形態では、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール、およびジオレオイルグリセロホスフェート－ジエチレンジアミンコンジュゲート（ＤＯＰ－ＤＥＤＡ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ｐＨ６．０で正に帯電し、ｐＨ７．４で中性であり、ｐＨ８．０で負に帯電する。血漿タンパク質による分解を最小化し、封入されたｍＲＮＡカーゴを保護するために、この送達系は血流中で中性である。インビボで送達されるとき、これらのＬＮＰビヒクルは、自身の疎水性脂質領域でアポリポタンパク質（例、ａｐｏＥ３）に結合し、これによって特に腫瘍細胞による細胞取り込みを促進できる。

【0182】

送達粒子は、標的組織の細胞に対して標的化されてもよい。この標的化は、送達粒子の表面上の標的化剤によって介在されてもよく、標的化剤はタンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、小分子、核酸などであってもよい。標的化剤は、特定の細胞または組織を標的とするために使用されてもよいし、粒子のエンドサイトーシスまたは食作用を促進するために使用されてもよい。標的化剤の例としては、抗体、抗体のフラグメント、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、トランスフェリン、アシアリコタンパク質（ａｓｉａｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）のｇｐ１２０エンベロープタンパク質、炭水化物、受容体リガンド、シアル酸、アプタマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、活性標的化リガンドによって改変された標的化リポソームは、たとえばｍＲＮＡなどのカーゴを他の部位に放出することなく、標的組織／器官／細胞における蓄積を増加させることによって、リポソームの能力を有意に改善できる。

【0183】

脂質ベースのナノ粒子は、それ自体がアジュバントとしても有利に作用してもよい。広範囲の脂質が、強力な固有のアジュバント活性を有することが報告されている。たとえばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）などのカチオン性脂質は、注射部位での抗原の沈着および細胞の抗原内在化の増強を示す。ＤＤＡによって構造化された固体脂質ナノ粒子は、高い抗原吸着効率、インビトロ抗原輸送、インビボ分布、および高い抗体応答を示す（アンダールッジ（Ａｎｄｅｒｌｕｚｚｉ）ら、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）２０２０、３３０、９３３－９４４）。結果として、送達系としてＬＮＰを使用するｍＲＮＡ送達ワクチンにおけるアジュバント活性を改善する努力は、ナノ粒子に使用される脂質を操作することに集中する傾向がある。しかし上述したとおり、脂質特性と、カーゴとしてのｍＲＮＡの封入に対する適合性との間、ならびに体内分布、放出動態、および細胞取り込みに関して、トレードオフが存在する。

【0184】

対象に投与されるとき、治療成分は、インビボ送達組成物の一部として適切に投与され、かつ医薬組成物を作製するために薬学的に受容可能な溶媒をさらに含んでもよい。受容可能な薬学的溶媒は、たとえば水および油などの液体であってもよく、それは石油、動物、植物、または合成に由来するもの、たとえばピーナッツ油、大豆油、鉱油、およびゴマ油などであり得る。薬学的溶媒は、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、および尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用してもよい。対象に投与されるとき、薬学的に受容可能な溶媒は、好ましくは滅菌される。本発明の化合物が静脈内投与されるとき、水は適切な溶媒である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体溶媒として、特に注射可能な溶液に対して使用され得る。適切な薬学的溶媒は、たとえばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどの賦形剤も含む。医薬組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または緩衝剤も含有できる。

【0185】

本発明の薬物および医薬組成物は、液体、溶液、懸濁物、ゲル、放出調節製剤（たとえば徐放または持続放出など）、エマルジョン、カプセル（たとえば、液体またはゲルを含有するカプセルなど）、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、または当技術分野で公知の任意のその他の適切な製剤の形態を取り得る。適切な薬学的溶媒の他の例は、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、アルフォンソ（Ａｌｆｏｎｓｏ）Ｒ．ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、Ｐａ．、第１９版、１９９５に記載されており、たとえば１４４７～１６７６頁などを参照されたい。

【0186】

本明細書に記載される任意の化合物または組成物について、インビトロ細胞培養アッセイによって治療有効量を最初に決定できる。標的濃度は、本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の方法を用いて測定される、本明細書に記載される方法を達成できる活性成分の濃度となる。

【0187】

当技術分野において周知であるとおり、ヒト対象に使用するための治療有効量を動物モデルから決定することもできる。たとえば、ヒトに対する用量は、動物において有効であることが見出されている濃度を達成するように製剤化され得る。上記のとおり、ヒトにおける投与量は、化合物の有効性をモニターし、投与量を上方または下方に調整することによって調整できる。上記の方法およびその他の方法に基づいてヒトにおける最大効力を達成するように用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0188】

本発明の実施形態は、医薬における使用のために製剤化された組成物を含んでもよいことが予期される。したがって、組織内または患者もしくは動物の体内の細胞上の位置に標的化され得る組成物を形成するために、本発明の組成物は生体適合性溶液中に懸濁されてもよい（すなわち、組成物はインビトロ、エクスビボ、またはインビボで使用され得る）。適切には、生体適合性溶液は、リン酸緩衝食塩水または任意の他の薬学的に受容可能な担体溶液であってもよい。１つ以上の追加の薬学的に受容可能な担体（たとえば希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒など）を、医薬組成物中で本発明の組成物と組み合わせてもよい。適切な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）によって「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。本発明の医薬製剤および組成物は、規制基準に適合するように製剤化され、経口、静脈内、局所、腫瘍内、もしくは皮下で、またはその他の標準的な経路を介して投与され得る。投与は、全身または局所または鼻腔内または髄腔内であり得る。特に、本発明による組成物は、静脈内、病巣内、腫瘍内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、動脈内で、および／または吸入によって投与され得る。

【0189】

さらに意図されるのは、本発明のいくつかの実施形態の組成物が、代替的な抗腫瘍成分またはその他の抗癌治療成分と別々に、または組み合わせて投与される実施形態である。これらの成分としては、腫瘍溶解性ウイルス、小分子薬物、化学療法剤、放射線治療剤、治療用ワクチン、または生物学的薬剤が挙げられ得る。これらの成分は、本発明の組成物と同時に投与されてもよく、かつ送達粒子内に含まれてもよいし、任意の適切な手段によって、本発明の組成物の投与の前または後に別々に投与されてもよい。

【0190】

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、たとえば実験室設定などのインビトロおよび／またはエクスビボ方法において使用されてもよいことも予期される。インビトロ方法の例においては、本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む送達系を含む組成物が標的インビトロ細胞に投与され、ｍＲＮＡ配列に含まれるｍｉＲＮＡ結合部位配列が、標的インビトロ細胞内の異なる細胞型におけるｍＲＮＡのコード配列の示差的発現を可能にする。同様に、本明細書に記載される送達系およびｍＲＮＡ配列を含む組成物が、動物から採取された標的エクスビボ試料に投与され、ｍＲＮＡ配列に含まれるｍｉＲＮＡ結合部位配列が、標的試料内の異なる細胞型におけるｍＲＮＡのコード配列の示差的発現を可能にする方法が予期される。

【0191】

ワクチン
本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物は、ワクチン療法において、従来のワクチンの効力の増強のために、ならびに／あるいはたとえばウイルス、細菌、真菌、原虫、プリオン、および蠕虫（寄生虫）などの感染性病原体に対する使用のため、またはたとえば癌などの疾患の処置における使用のための新規ワクチン形態として使用され得る。記載されるｍＲＮＡコンストラクトは、５’および３’末端の（直接的または間接的）連結によって環状化され得ることが予期され、こうした環状または環状化ＲＮＡコンストラクトは、本明細書で使用される「ｍＲＮＡコンストラクト」という用語に含まれると考えられる。こうしたコンストラクトは、たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などに対するＲＮＡベースのワクチンとして有効であり得ることが示されている（クー（Ｑｕ）Ｌ．ら、バイオアーカイブ（ｂｉｏＲｘｉｖ）２０２１．０３．１６．４３５５９４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．１６．４３５５９４）。結果として、本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトは、細胞内で翻訳され得る環状または環状化ＲＮＡコンストラクトを含む。

【0192】

よって、本発明の組成物は、ワクチン製剤中に含ませるか、またはワクチンと組み合わせて投与される（例、適切なサイトカインを有する）アジュバントの形態にすることによって、感染性病原性疾患の予防または処置に使用されてもよい。

【0193】

感染性細菌病原体の例としては、アセトバクター・オウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アグロバクテリア・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリイノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ビネランディイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、ビリダンス・ストレプトコッカス（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・フスフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノジェニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、プレボテラ・メラニノジェニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・キンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・セパシアン（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａｎ）、カリマトバクテリウム・グラヌロマティス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｅｌｃｈｉｉ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ）、エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エールリヒア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラタス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フソバクテリウム・ネクロフォーラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ペルツッシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・ノグチ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、メタノバクテリウム・エクストロケンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、ミクロバクテリウム・マルチフォルメ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプレムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・メキシカン（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｅｘｉｃａｎ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノジェニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、バクテロイデス・メラニノジェニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・シッタシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッチア・キンタナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッチア・トラコーマ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロチャリマエア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロチャリマエア・キンタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロチア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ジセンテリア（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、スピリルム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチ







オル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられる。

【0194】

ウイルス感染病原体の例としては、アデノ随伴ウイルス；アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス；ＢＫポリオーマウイルス；バンナウイルス；バーマフォレストウイルス；ブニヤムウェラウイルス；ブニヤウイルスラクロス；ブニヤウイルスカンジキウサギ；オナガザルヘルペスウイルス；チャンディプラウイルス；チクングニアウイルス；コサウイルスＡ；牛痘ウイルス；コクサッキーウイルス；クリミア・コンゴ出血熱ウイルス；デングウイルス；ドーリウイルス；ダグベウイルス；ドゥベンヘイジウイルス；東部ウマ脳炎ウイルス；エボラウイルス；エコーウイルス；脳心筋炎ウイルス；エプスタイン－バーウイルス；ヨーロッパコウモリリッサウイルス；ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス；ハンタンウイルス；ヘンドラウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；デルタ肝炎ウイルス；馬痘ウイルス；ヒトアデノウイルス；ヒトアストロウイルス；ヒトコロナウイルス；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトエンテロウイルス６８、７０；ヒトヘルペスウイルス１；ヒトヘルペスウイルス２；ヒトヘルペスウイルス６；ヒトヘルペスウイルス７；ヒトヘルペスウイルス８；ヒト免疫不全ウイルス；ヒトパピローマウイルス１；ヒトパピローマウイルス２；ヒトパピローマウイルス１６、１８；ヒトパラインフルエンザ；ヒトパルボウイルスＢ１９；ヒト呼吸器合胞体ウイルス；ヒトライノウイルス；ヒトＳＡＲＳコロナウイルス；ヒトスプマレトロウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス；ヒトトロウイルス；インフルエンザＡウイルス；インフルエンザＢウイルス；インフルエンザＣウイルス；イスファハンウイルス；ＪＣポリオーマウイルス；日本脳炎ウイルス；ジュニンアレナウイルス；ＫＩポリオーマウイルス；クンジンウイルス；ラゴスコウモリウイルス；ビクトリア湖マールブルグウイルス；ランガトウイルス；ラッサウイルス；ローズデールウイルス；跳躍病ウイルス；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス；マチュポウイルス；マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス；麻疹ウイルス；メンゴ脳心筋炎ウイルス；メルケル細胞ポリオーマウイルス；モコラウイルス；伝染性軟属腫ウイルス；サル痘ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；マレーバレー脳炎ウイルス；ニューヨークウイルス；ニパウイルス；ノーウォークウイルス；オニョンニョンウイルス；Ｏｒｆウイルス；オロポーシェウイルス；ピチンデウイルス；ポリオウイルス；プンタトロフレボウイルス；プーマラウイルス；狂犬病ウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；リフトバレー熱ウイルス；ロサウイルスＡ；ロスリバーウイルス；ロタウイルスＡ；ロタウイルスＢ；ロタウイルスＣ；風疹ウイルス；サギヤマウイルス；サリウイルスＡ；シチリア型サシチョウバエ熱ウイルス；サッポロウイルス；ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ）；セムリキフォレストウイルス；ソウルウイルス；サル泡沫状ウイルス；シミアンウイルス５；シンドビスウイルス；サザンプトンウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；ダニ媒介ポワッサンウイルス；トルクテノウイルス；トスカーナウイルス；ウークニエミウイルス；ワクシニアウイルス；水痘帯状疱疹ウイルス；痘瘡ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウイルス；水疱性口内炎ウイルス；西部ウマ脳炎ウイルス；ＷＵポリオーマウイルス；ウエストナイルウイルス；ヤバサル腫瘍ウイルス；ヤバ様疾患ウイルス；黄熱病ウイルス；およびジカウイルスが挙げられる。

【0195】

真菌感染病原体の例としては、以下が挙げられる。ギムノプス（Ｇｙｍｎｏｐｕｓ）種、ロドコリビア・ブチラセア（Ｒｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ ｂｕｔｙｒａｃｅａ）、ニガクリタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、塊茎種、ボチア・カスタネラ（Ｂｏｔｈｉａ ｃａｓｔａｎｅｌｌａ）、リゾスフィア（Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）種、ヘルポトリキエラセアエ（Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ）種、アナイボゴケ（Ｖｅｒｒｕｃａｒｉａｃｅａｅ）種、マーチャンジオミセス（Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ）種、ミニメデューサ（Ｍｉｎｉｍｅｄｕｓａ）種、マーチャンジオバシジウム・オーランチアクム（Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｂａｓｉｄｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、マーチャンジオミセス・コラリヌス（Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、マーチャンジオミセス・リグニコラ（Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ ｌｉｇｎｉｃｏｌａ）、ブルゴア（Ｂｕｒｇｏａ）種、アテリア・アラクノイデア（Ａｔｈｅｌｉａ ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ）、アルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、ヤマドリタケ（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）、アカエノキンチャヤマイグチ（Ｌｅｃｃｉｎｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）種、シンポディオマイコプシス（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）種、コガネエイランタイ属ニバリス（Ｆｌａｖｏｃｅｔｒａｒｉａ ｎｉｖａｌｉｓ）、アンペロミセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）種、ギムノプス・ビフォルミス（Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ）、ギムノプス（Ｇｙｍｎｏｐｕｓ）種、ギムノプス・コンフルエンス（Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｃｏｎｆｌｕｅｎｓ）、ギムノプス・スポンギオサス（Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｓ）、コリビア・レアディ（Ｃｏｌｌｙｂｉａ ｒｅａｄｉｉ）、マラスミエルス・ステノフィラス（Ｍａｒａｓｍｉｅｌｌｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌｕｓ）、マラスミエルス・ラメアリス（Ｍａｒａｓｍｉｅｌｌｕｓ ｒａｍｅａｌｉｓ）、マラスミエルス・スコロドニウス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｓｃｏｒｏｄｏｎｉｕｓ）、カレバタケ（Ｃｏｌｌｙｂｉａ ｍａｒａｓｍｉｏｉｄｅｓ）、ミクロンフェール・ブラシコレンズ（Ｍｉｃｒｏｍｐｈａｌｅ ｂｒａｓｓｉｃｏｌｅｎｓ）、カリピア・モンタグネイ（Ｃａｒｉｐｉａ ｍｏｎｔａｇｎｅｉ）、ロドコリビア（Ｒｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ）種、アンスラコフィルム・ラテリチウム（Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、アンスラコフィルム・アルチェリ（Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ａｒｃｈｅｒｉ）、アンスラコフィルム（Ａｎｔｈｒａｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種、ファネロケテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）種、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、アカゲシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｉｍｂｒｉｃａｔｕｍ）、キシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ）、トメンテラ・サブリラシナ（Ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ ｓｕｂｌｉｌａｃｉｎａ）、リゾポゴン（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ）種、ラカリア（Ｌａｃｃａｒｉａ）種、アセタケ属（ｌｎｏｃｙｂｅ）種、ワカフサタケ属（Ｈｅｂｅｌｏｍａ）種、フウセンタケ属（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ）種、クラブリナ（Ｃｌａｖｕｌｉｎａ）種、アワタケ属（Ｘｅｒｏｃｏｍｕｓ）種、テングタケ属（Ａｍａｎｉｔａ）種、ユーロティウム・ハーバリオルム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｉｏｒｕｍ）、エデュイリア・アテシア（Ｅｄｙｕｉｌｌｉａ ａｔｈｅｃｉａ）、ワルクピエラ・スピヌロサ（Ｗａｒｃｕｐｉｅｌｌａ ｓｐｉｎｕｌｏｓａ）、ヘミカーペンテレス・パラドクサス（Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ヘミカーペンテレス・アカンソスポラス（Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ ａｃａｎｔｈｏｓｐｏｒｕｓ）、ヘミカーペンテレス（Ｈｅｍｉｃａｒｐｅｎｔｅｌｅｓ）種、シェトサートリア・クレメア（Ｃｈａｅｔｏｓａｒｔｏｒｙａ ｃｒｅｍｅａ）、ペトロミセス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ）種、グラフィウム・テクトネ（Ｇｒａｐｈｉｕｍ ｔｅｃｔｏｎａｅ）、ジプロライメロイデス（Ｄｉ ｐｌｏｌａｉｍｅｌｌｏｉｄｅｓ）種、ラブドライムス（Ｒｈａｂｄｏｌａｉｍｕｓ）種、ツチヒラタケ（Ｈｏｈｅｎｂｕｅｈｅｌｉａ ｐｅｔａｌｏｄｅｓ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、クリプトコッカス・アルボリフォルミス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｒｂｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ガムシレラ・パルビコリス（Ｇａｍｓｙｌｅｌｌａ ｐａｒｖｉｃｏｌｌｉｓ）、モナクロスポリウム・ハプトチルム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈａｐｔｏｔｙｌｕｍ）、モナクロスポリウム・シチュアネンス（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｃｈｕａｎｅｎｓｅ）、モナクロスポリウム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、モナクロスポリウム・ゲフィロパガム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ）、モナクロスポリウム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ドレチスレレラ・コエロブロチャ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ ｃｏｅｌｏｂｒｏｃｈａ）、ドレチスレレラ・ダクチロイデス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、ドレチスレレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｅｌｌａ）種、アルツロボトリス・ムシフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｍｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、アルツロボトリス・フラグランス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｆｌａｇｒａｎｓ）、アルツロボトリス・ヘルツィアナ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｈｅｒｔｚｉａｎａ）、アルツロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）、アルツロボトリス・ベルミコラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｖｅｒｍｉｃｏｌａ）、アルツロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）種、モナクロスポリウム・ドレクスレリ（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、ベルミスポラ（Ｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）種、シュードアレシェリア・ボイジイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）（スケドスポリウム・アピオスペルムム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ））、スケドスポリウム・インフラツム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ）、ジオスミシア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、イチゴ炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、ロフォデルミウム・ピセアエ（Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｉｕｍ ｐｉｃｅａｅ）、フザリウム・アシアチカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、シントラクチア・ソルギ－ブルガリス（Ｃｉｎｔｒａｃｔｉａ ｓｏｒｇｈｉ－ｖｕｌｇａｒｉｓ）、カンタロサイブ・グルベリ（Ｃａｎｔｈａｒｏｃｙｂｅ ｇｒｕｂｅｒｉ）、ブールドチア（Ｂｏｕｒｄｏｔｉａ）種、キクラゲ属（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）種、プッチニア・バーソロマエイ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅｉ）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、ジアポルテ・ファセオロルム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ）、メランコニス・スチルボストーマ（Ｍｅｌａｎｃｏｎｉｓ ｓｔｉｌｂｏｓｔｏｍａ）、キシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）種、トリコフィトン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・インタージギタレ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｕｍ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉｉ）トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、クロロフィルム・アガリコイデス（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｕｍ ａｇａｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ケノコッカム・ゲオフィルム（Ｃｅｎｏｃｏｃｃｕｍ ｇｅｏｐｈｉｌｕｍ）、ビョウタケ目（Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ）種、リゾシファス・エリカエ（Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ ｅｒｉｃａｅ）、シロカラハツタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、チチタケ属（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ）種、ピロダーマ・ファラックス（Ｐｉｌｏｄｅｒｍａ ｆａｌｌａｘ）、ヌメリイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ）、キシメジ属（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）種、オオキツネタケ（Ｌａｃｃａｒｉａ ｃｆ ｂｉｃｏｌｏｕｒ）、カワムラフウセンタケ（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、セイリジウム（Ｓｅｉｒｉｄｉｕｍ）種、アピオスポラ・モンタグネイ（Ａｐｉｏｓｐｏｒａ ｍｏｎｔａｇｎｅｉ）、ムラサキウロコタケ（Ｃｈｏｎｄｒｏｓｔｅｒｅｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、ボトリオバシジウム・サブコロナタム（Ｂｏｔｒｙｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｕｂｃｏｒｏｎａｔｕｍ）、トゲミノヒメイグチ（Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ ｓｈｉｃｈｉａｎｕｓ）、キクバナイグチ属（Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ）種、ヒポクレア・ファリノス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｆａｒｉｎｏｓｅ）、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）種、サルコストロマ・レスチオニス（Ｓａｒｃｏｓｔｒｏｍａ ｒｅｓｔｉｏｎｉｓ）、サルコストロマ（Ｓａｒｃｏｓｔｒｏｍａ）種、トランカテラ・ベツラエ（Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ ｂｅｔｕｌａｅ）、トランカテラ（Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ）種、ペスタロチオプシス・マチルダエ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｍａｔｉｌｄａｅ）、パラコニオチリウム（Ｐａｒａｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ）種、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）種、カニングハメラ・バイニエリ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｂａｉｎｉｅｒｉ）、カニングハメラ・ベルトレチアエ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅ）、アンズタケ（Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ ｃｉｂａｒｉｕｓ）、アピオスポラ・バンブサエ（Ａｐｉｏｓｐｏｒａ ｂａｍｂｕｓａｅ）、アピオスポラ（Ａｐｉｏｓｐｏｒａ）種、ジスコストロマ・ボタン（Ｄｉｓｃｏｓｔｒｏｍａ ｂｏｔａｎ）、セルコフォラ・カウダーテ（Ｃｅｒｃｏｐｈｏｒａ ｃａｕｄａｔｅ）、グノモニア・リビコラ（Ｇｎｏｍｏｎｉａ ｒｉｂｉｃｏｌａ）、フォーレリナ・エロンゲート（Ｆａｕｒｅｌｉｎａ ｅｌｏｎｇａｔｅ）、ミコリザ・フンギ（Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｆｕｎｇｉ）、ゲオミセス・パノラム（Ｇｅｏｍｙｃｅｓ ｐａｎｎｏｒｕｍ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）種、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）種、クロノスタチス（Ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓ）種、フォマ・ユーピレナ（Ｐｈｏｍａ ｅｕｐｙｒｅｎａ）、テトラクラディウム（Ｔｅｔｒａｃｌａｄｉｕｍ）種、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種、ツラスネラ・カロスポラ（Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ ｃａｌｏｓｐｏｒａ）、エプロリザ（Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａ）種、ツラスネラ・カロスポラ（Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ ｃａｌｏｓｐｏｒａ）、アンタークトミセス・シクロトロフィクス（Ａｎｔａｒｃｔｏｍｙｃｅｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｉｃ







ｕｓ）、アンフィスフェリアセアエ（Ａｍｐｈｉｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）種、ホモプシス属（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、ペスタロチオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）種、ペスタロチオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）種、マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）種、コニオケータ目（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）種、シロキクラゲ目（Ｔｒｅｍｅｌｌａｌｅｓ）種、ドチデアレス（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ）種、フィラコラセアエ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ）種、サッカロミケス目（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）種、ヘルポトリキエラセアエ（Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ）種、ユリ綱（Ｌｉｌｉｏｐｓｉｄａ）種、トリコスポロナレス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｌｅｓ）種、トリコスポロン・ミコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）種、ドチオラセアエ（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ）種、ボタンタケ目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）種、ミコスファエレラセアエ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）種、スポリディオボラレス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌａｌｅｓ）種、バッカクキン科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）種、プレオスポラ目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ）種、ウスチラガナ科（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｃｅａｅ）種、フィラコラセアエ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ）種、ケカビ科（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ）種、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）種、フィロバシディウム目（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｌｅｓ）種、カロスフェリアセアエ（Ｃａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）種、バッカクキン科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）種、ムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）種、ヘルポトリキエラセアエ（Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅ）種、ミクロドキウム（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ） 種、フィラコラセアエ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ）種、ゾプフィアセアエ（Ｚｏｐｆｉａｃｅａｅ）種、
ボトリオスフェリアセアエ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）種、ビョウタケ科（Ｈｅｌｏｔｉａｃｅａｅ）種、ビオネクトリア科（Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）種、ラクノクラディウム科（Ｌａｃｈｎｏｃｌａｄｉａｃｅａｅ）種、ディポダスカセアエ（Ｄｉ ｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ）種、カウレルパセアエ（Ｃａｕｌｅｒｐａｃｅａｅ）種、ミクロストロマタレス（Ｍｉｃｒｏｓｔｒｏｍａｔａｌｅｓ）種、アフィロフォラレス（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）種、モンタグヌラセアエ（Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ）種、ジムノアスカセエ（Ｇｙｍｎｏａｓｃａｃｅａｅ）種、クリフォネクトリアセアエ（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）種、マメザヤタケ目（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）種、モンタグヌラセアエ（Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ）種、カエトミアセアエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）種、オオロウソクゴケモドキ（Ｘａｎｔｈｏｒｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、サンゴエイランタイ（Ｃｅｔｒａｒｉａ ａｃｕｌｅａｔｅ）、ネフロモプシス・ラウレリ（Ｎｅｐｈｒｏｍｏｐｓｉｓ ｌａｕｒｅｒｉ）、タッカーマンノプシス・クロロフィラ（Ｔｕｃｋｅｒｍａｎｎｏｐｓｉｓ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａ）、セトラリア・エリセトルム（Ｃｅｔｒａｒｉａ ｅｒｉｃｅｔｏｒｕｍ）、エイランタイ属（Ｃｅｔｒａｒｉａ）種、ウスキエイランタイ（Ｆｌａｖｏｃｅｔｒａｒｉａ ｃｕｃｕｌｌａｔａ）、カエルネフェルティア・メリリイ（Ｋａｅｒｎｅｆｅｌｔｉａ ｍｅｒｒｉｌｌｉｉ）、アモロシア・リトラリス（Ａｍｏｒｏｓｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、クアンバラリア・シアネセンス（Ｑｕａｍｂａｌａｒｉａ ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ）、ベニイロクチキムシタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｒｏｓｅｏｓｔｒｏｍａｔａ）、ノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）種、ベニタケ属（Ｒｕｓｓｕｌａ）種、クラブリナ（Ｃｌａｖｕｌｉｎａ）種、ツバー・クエルシコラ（Ｔｕｂｅｒ ｑｕｅｒｃｉｃｏｌａ）、ジムノミセス（Ｇｙｍｎｏｍｙｃｅｓ）種、テトラカエツム・エレガンス（Ｔｅｔｒａｃｈａｅｔｕｍ ｅｌｅｇａｎｓ）、アングイロスポラ・ロンギシマ（Ａｎｇｕｉｌｌｏｓｐｏｒａ ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）種、シロコッカス・コニゲヌス（Ｓｉｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｉｇｅｎｕｓ）、ショウロ（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ ｒｏｓｅｏｌｕｓ）、リゾポゴン・オリバセオチンクタス（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ ｏｌｉｖａｃｅｏｔｉｎｃｔｕｓ）、ショウロ属（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ）種、ピソリサス・ミクロカルプス（Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐｕｓ）、リゾシファス・エリカエ（Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ ｅｒｉｃａｅ）、アオアシフウセンタケ（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ ｇｌａｕｃｏｐｕｓ）、ヒダハタケ属（Ｐａｘｉｌｌｕｓ）種、スイルス・バリエゲーテス（Ｓｕｉｌｌｕｓ ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ）、ピロバクルム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ツラスネラ（Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ）種、ヒメムキタケ属（Ｈｏｈｅｎｂｕｅｈｅｌｉａ）種、コクリオボルス・ルナタス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｌｕｎａｔｕｓ）、チヂレタケ（Ｐｌｉｃａｔｕｒｏｐｓｉｓ ｃｒｉｓｐａ）、ボンダルセボミセス・タクシ（Ｂｏｎｄａｒｃｅｖｏｍｙｃｅｓ ｔａｘｉ）、イチョウタケ（Ｔａｐｉｎｅｌｌａ ｐａｎｕｏｉｄｅｓ）、タピネラ（Ｔａｐｉｎｅｌｌａ）種、オーストロパキシルス（Ａｕｓｔｒｏｐａｘｉｌｌｕｓ）種、オウギタケ（Ｇｏｍｐｈｉｄｉｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ハンノキイグチ（Ｇｙｒｏｄｏｎ ｌｉｖｉｄｕｓ）、フィロポルス・ペレティエリ（Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｕｓ ｐｅｌｌｅｔｉｅｒｉ）、シャモニキシア・カエスピトース（Ｃｈａｍｏｎｉｘｉａ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｅ）、ポルフィレルス・ポルフィロスポラス（Ｐｏｒｐｈｙｒｅｌｌｕｓ ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｐｏｒｕｓ）、トランココルメラ・シトリナ（Ｔｒｕｎｃｏｃｏｌｕｍｅｌｌａ ｃｉｔｒｉｎａ）、ニワタケ（Ｔａｐｉｎｅｌｌａ ａｔｒｏｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、スクレロダーマ・リーブ（Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ ｌｅａｖｅ）、スイルス・バリエゲーテス（Ｓｕｉｌｌｕｓ ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ）、ヌメリイグチ属（Ｓｕｉｌｌｕｓ）種、ポルフィレルス・ポルフィロスポラス（Ｐｏｒｐｈｙｒｅｌｌｕｓ ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ピソリウス・アルヒツス（Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、フェオジロポルス・ポルテントサス（Ｐｈａｅｏｇｙｒｏｐｏｒｕｓ ｐｏｒｔｅｎｔｏｓｕｓ）、メラノガスター・バリエゲーテス（Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｖａｒｉｅｇａｔｅｓ）、ヒメシワタケ（Ｌｅｕｃｏｇｙｒｏｐｈａｎａ ｍｏｌｌｕｓｃａ）、ヒドノメルリウス・ピナストリ（Ｈｙｄｎｏｍｅｒｕｌｉｕｓ ｐｉｎａｓｔｒｉ）、オウギタケ（Ｇｏｍｐｈｉｄｉｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ハンノキイグチ（Ｇｙｒｏｄｏｎ ｌｉｖｉｄｕｓ）、アイゾメイグチ（Ｇｙｒｏｐｏｒｕｓ ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ）、コショウイグチ（Ｃｈａｌｃｉｐｏｒｕｓ ｐｉｐｅｒａｔｕｓ）、シャモニキシア・カエスピトース（Ｃｈａｍｏｎｉｘｉａ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｅ）、ボンダルセボミセス・タクシ（Ｂｏｎｄａｒｃｅｖｏｍｙｃｅｓ ｔａｘｉ）、デンドリフィエラ・トリチシコラ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ ｔｒｉｔｉｃｉｃｏｌａ）、グイグナルディア（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ）種、シライア（Ｓｈｉｒａｉａ）種、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ホモプシス属（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ）種、ジアポルサレス（Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ）種、ペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）種、ロフィオストーマ（Ｌｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）種、ベルチシリウム・クラミドスポリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペシロマイセス・リラシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ペシロマイセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）種、セラトリザ・オリザエ－サチバエ（Ｃｅｒａｔｏｒｈｉｚａ ｏｒｙｚａｅ－ｓａｔｉｖａｅ）、ジオスミシア・パリダ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ ｐａｌｌｉｄａ）、ジオスミシア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ゲオシフォン・ピリフォルミス（Ｇｅｏｓｉｐｈｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、ツブゴケ属（Ａｇｏｎｉｍｉａ）種、エントツゴケ（Ｐｙｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、エクソフィアラ・デルマチチジス（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、エクソフィアラ・ピシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）、エクソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）種、ラミクロリジウム・アンセプス（Ｒａｍｉｃｈｌｏｒｉｄｉｕｍ ａｎｃｅｐｓ）、ラミクロリジウム（Ｒａｍｉｃｈｌｏｒｉｄｉｕｍ）種、カプロニア・ピロセラ（Ｃａｐｒｏｎｉａ ｐｉｌｏｓｅｌｌａ）、コナサナギタケ（Ｉｓａｒｉａ ｆａｒｉｎｏｓｅ）、ポチョニア・スクラスポリア（Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｓｕｃｈｌａｓｐｏｒｉａ）、レカニシリウム・プサリオタエ（Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）、クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅ）種、レオチオマイセート（Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅ）種、ウスチラギノイデア・ビクセンス（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｘｅｎｓ）、ハイホザイマ・リグニコラ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ ｌｉｇｎｉｃｏｌａ）、コニオカエタ・マラコトリチャ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ ｍａｌａｃｏｔｒｉｃｈａ）、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）種、トルビエラ・コンフラゴサ（Ｔｏｒｒｕｂｉｅｌｌａ ｃｏｎｆｒａｇｏｓａ）、イサリア・テヌイペス（Ｉｓａｒｉａ ｔｅｎｕｉｐｅｓ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・アウドウイニイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉｉ）、ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）種、エピコッカム・フロコスム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、ギガスポーラ・ロゼア（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ）、ギガスポーラ（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ）種、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）種、シュードペロノスポラ・クベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、ヒアロペロノスポラ・パラシチカ（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、プレクトフォメラ（Ｐｌｅｃｔｏｐｈｏｍｅｌｌａ）種、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）、キカイガラタケ属（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）種、ドンキオポリア・エクスパンサ（Ｄｏｎｋｉｏｐｏｒｉａ ｅｘｐａｎｓａ）、アントロジア・シヌオサ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｓｉｎｕｏｓａ）、フェオアクレモニウム・ルブリゲルム（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｒｕｂｒｉｇｅｎｕｍ）、フェオアクレモニウム（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）種、アルベルチニエラ・ポリポリコラ（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉｅｌｌａ ｐｏｌｙｐｏｒｉｃｏｌａ）、セファロセカ・スルフレア（Ｃｅｐｈａｌｏｔｈｅｃａ ｓｕｌｆｕｒｅａ）、フラゴスフェリア・レニフブルミス（Ｆｒａｇｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｅｎｉｆｂｒｍｉｓ）、フラゴスフェリア（Ｆｒａｇｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、フィアレモニウム・ジモルホスポルム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ）、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）種、ピキア・ノルベゲンシス（Ｐｉｃｈｉａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ゴンダワナミセス（Ｇｏｎｄａｗａｎａｍｙｃｅｓ）種、グラフィウム（Ｇｒａｐｈｉｕｍ）種、アンブロシエラ（Ａｍｂｒｏｓｉｅｌｌａ）種、ミクログロッサム（Ｍｉｃｒｏｇｌｏｓｓｕｍ）種、ニカワチャワンタケ（Ｎｅｏｂｕｌｇａｒｉａ ｐｕｒａ）、ホルワヤ・ムシダ（Ｈｏｌｗａｙａ ｍｕｃｉｄａ）、クロロビブリッセア（Ｃｈｌｏｒｏｖｉｂｒｉｓｓｅａ）種、クロロシボリア（Ｃｈｌｏｒｏｃｉｂｏｒｉａ）種、タクステロガスター（Ｔｈａｘｔｅｒｏｇａｓｔｅｒ）種、フウセンタケ属（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ）種、セチェリオガスター（Ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｏｇａｓｔｅｒ）種、チムグロベア（Ｔｉｍｇｒｏｖｅａ）種、デスコミセス（Ｄｅｓｃｏｍｙｃｅｓ）種、マメツブタケ（Ｈｙｍｅｎｏｇａｓｔｅｒ ａｒｅｎａｒｉｕｓ）、クアドリスポラ・ツベルクラリス（Ｑｕａｄｒｉｓｐｏｒａ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉｓ）、クアドリスポラ（Ｑｕａｄｒｉｓｐｏｒａ）種、プロトグロッスム・ビオラセウム（Ｐｒｏｔｏｇｌｏｓｓｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、セラトストメラ・ピレナイカ（Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍｅｌｌａ ｐｙｒｅｎａｉｃａ）、セラトスフェリア・ランパドフォラ（Ｃｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｌａｍｐａｄｏｐｈｏｒａ）、フォンセセア・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、チャシワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ ａｃｅｒｉｎａ）、シワウロコタケ属（Ｐｈｌｅｂｉａ）種、ペスタロチオプシス・ジセミナタ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ラコスペルミセス・コアエ（Ｒａｃｏｓｐｅｒｍｙｃｅｓ ｋｏａｅ）、エンドラエシウム・アカシアエ（Ｅｎｄｏｒａｅｃｉｕｍ ａｃａｃｉａｅ）、ウロミクラジウム・テッペリアヌム（Ｕｒｏｍｙｃｌａｄｉｕｍ ｔｅｐｐｅｒｉａｎｕｍ）、ウロミクラジウム（







Ｕｒｏｍｙｃｌａｄｉｕｍ）種、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）種、サイロシベ・クエベセンシス（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｑｕｅｂｅｃｅｎｓｉｓ）、カワリコシワツバタケ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｍｅｒｄａｒｉａ）、シビレタケ属（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ）種、ジムノピルス・ルテオフォリウス（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ ｌｕｔｅｏｆｏｌｉｕｓ）、チャツムタケ（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ ｌｉｑｕｉｒｉｔｉａｅ）、チャツムタケ属（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ）種、ハイフォロマ・ツベロスム（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、メラノタス・ハルティイ（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｈａｒｔｉｉ）、パナエオルス・ウリギノサス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｓ）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ）、アカヒダササタケ（Ｄｅｒｍｏｃｙｂｅ ｓｅｍｉｓａｎｇｕｉｎｅａ）、デルモシベ（Ｄｅｒｍｏｃｙｂｅ）種、ヘリコマ・マンス＊パス（Ｈｅｌｉｃｏｍａ ｍｏｎｔｈ＊ ｐｅｓ）、ヘリコマ（Ｈｅｌｉｃｏｍａ）種、ツベウフィア・ヘリコミセス（Ｔｕｂｅｕｆｉａ ｈｅｌｉｃｏｍｙｃｅｓ）、ツベウフィア（Ｔｕｂｅｕｆｉａ）種、レオフミコラ・ベルコサ（Ｌｅｏｈｕｍｉｃｏｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、レプトスファエルリナ・チャルタルム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、マクロフォマ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍａ）種、マルソニナ・ロサエ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ ｒｏｓａｅ）、ボトリオチニア・フケリアナ（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、ペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）種、クリソスポリウム・カルミチャエリイ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｍｉｃｈａｅｌｉｉ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ダクチレラ・オキシスポラ（Ｄａｃｔｙｌｅｌｌａ ｏｘｙｓｐｏｒａ）、ダクチレリナ・ロバタム（Ｄａｃｔｙｌｅｌｌｉｎａ ｌｏｂａｔｕｍ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）種、クリソフィルム・スパルシフロルム（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐａｒｓｉｆｌｏｒｕｍ）、オーガストノキ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌｕｍ）種、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サワダエア・ポリフィダ（Ｓａｗａｄａｅａ ｐｏｌｙｆｉｄａ）、サワダエア（Ｓａｗａｄａｅａ）種、パラウンチヌラ・セプタタ（Ｐａｒａｕｎｃｉｎｕｌａ ｓｅｐｔａｔａ）、エリシフェ・モリ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｍｏｒｉ）、エリシフェ属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）種、チフロチャエタ・ジャポニカ（Ｔｙｐｈｕｌｏｃｈａｅｔａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ウドンコ病菌（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｒｏｎｔｉｉ）、ゴロビノミセス（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、ポドスファエラ・キサンチイ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）種、アースロクラジエラ・モウゲオティイ（Ａｒｔｈｒｏｃｌａｄｉｅｌｌａ ｍｏｕｇｅｏｔｉｉ）、ネオエリシフェ・ガレオプシジス（Ｎｅｏｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇａｌｅｏｐｓｉｄｉｓ）、カキウドンコ病菌（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ ｋａｋｉｃｏｌａ）、フィラクチニア（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ）種、シフェロフォラ・ラシニアタ（Ｃｙｐｈｅｌｌｏｐｈｏｒａ ｌａｃｉｎｉａｔａ）、スフェログラフィウム・テヌイロストルム（Ｓｐｈａｅｒｏｇｒａｐｈｉｕｍ ｔｅｎｕｉｒｏｓｔｒｕｍ）、ミクロスファエラ・トリフォリイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、スファエロテカ・スピラエラエ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｓｐｉｒａｅａｅ）、スファエロテカ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）種、ウンシヌリエラ・オーストラリアナ（Ｕｎｃｉｎｕｌｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉａｎａ）、アブシジア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ユミケカビ（Ａｂｓｉｄｉａ）種、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）種、ネクトリア・クルタ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｃｕｒｔａ）、アカヒダヒメムサシタケ（Ａｎａｍｉｋａ ｌａｃｔａｒｉｏｌｅｎｓ）、ヘベロマ・ベルチペス（Ｈｅｂｅｌｏｍａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、ストロファリア・アンビグア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ａｍｂｉｇｕａ）、フミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｐｒａｅｃｏｘ）、イタチハリタケ（Ｈｙｄｎｕｍ ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）、カノシタ属（Ｈｙｄｎｕｍ）種、メリニオミセス・バリアビリス（Ｍｅｌｉｎｉｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、リゾシファス・エリカエ（Ｒｈｉｚｏｓｃｙｐｈｕｓ ｅｒｉｃａｅ）、クリプトスポリオプシス・エリカエ（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｅｒｉｃａｅ）、ヒアロデンドロン（Ｈｙａｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）種、レプトグラフィウム・ルンドベルギイ（Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ ｌｕｎｄｂｅｒｇｉｉ）、レプトグラフィウム（Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ）種、テルミトミセス（Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ）種、コクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ホモプシス属（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ）種、メタリジウム菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、ノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）種、チレチオプシス・ワシントネンシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）、ミダレアミタケ（Ｃｅｒｒｅｎａ ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、スタキボトリス・カルタルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、フェオコッコミセス・ニグリカンス（Ｐｈａｅｏｃｏｃｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、ガノダーマ・フィリピイ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｐｈｉｌｉｐｐｉｉ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）種、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）、シストセカ・ラネストリス（Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ ｌａｎｅｓｔｒｉｓ）、レベイルラ・タウリカ（Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ ｔａｕｒｉｃａ）、フィラクチニア・フラキシニ（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ ｆｒａｘｉｎｉ）、バリコスポリウム・エロデアエ（Ｖａｒｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ ｅｌｏｄｅａｅ）、リノクラジエラ・バシトヌム（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ ｂａｓｉｔｏｎｕｍ）、メランクレヌス・オリゴスペルムス（Ｍｅｌａｎｃｈｌｅｎｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｕｓ）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、フィゾムコール（Ｐｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、コニディオボラス・コロナツス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｃｏｒｏｎａｔｕｓ）、コニドボラス（Ｃｏｎｉｄｏｂｏｌｕｓ）種、バシディオボルス・ラナルム（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｒａｎａｒｕｍ）、バシディオボルス（ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）種、オクロニス（Ｏｃｈｒｏｎｉｓ）種、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ヒストプラズマ属（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種、ウィルコクシナ・ミコラエ（Ｗｉｌｃｏｘｉｎａ ｍｉｋｏｌａｅ）、ラシオジプロディア（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ）種、フィシア・カエシア（Ｐｈｙｓｃｉａ ｃａｅｓｉａ）、ムカデゴケ属（Ｐｈｙｓｃｉａ）種、ブラキコニジエロプシス（Ｂｒａｃｈｙｃｏｎｉｄｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）種、キコガサダケ（Ｃｏｎｏｃｙｂｅ ｌａｃｔｅａｌ）、ガストロサイブ・ラテリチア（Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ ｌａｔｅｒｉｔｉａ）、ガストロサイブ（Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ）種、アグロサイブ・セミオルビクラリス（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｓｅｍｉｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）、タフリナ・プルニ（Ｔａｐｈｒｉｎａ ｐｒｕｎｉ）、タフリナ（Ｔａｐｈｒｉｎａ）種、ナガエノヤグラタケ（Ａｓｔｅｒｏｐｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、アステロフォラ（Ａｓｔｅｒｏｐｈｏｒａ）種、エレモセシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉ）、トリクラジウム・スプレンデンス（Ｔｒｉｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）、ラマリア・フラバ（Ｒａｍａｒｉａ ｆｌａｖａ）、ホウキタケ属（Ｒａｍａｒｉａ）種、ラカリア・フラターナル（Ｌａｃｃａｒｉａ ｆｒａｔｅｒｎａｌ）、スクテロスポラ（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｓｐｏｒａ）種、イロスポリウム・カルネウム（Ｉｌｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｎｅｕｍ）、ホブソニア・クリスチアンセニイ（Ｈｏｂｓｏｎｉａ ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎｉｉ）、マーチャンジオミセス・コラリヌス（Ｍａｒｃｈａｎｄｉｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、フシコックム・ルテウム（Ｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ ｌｕｔｅｕｍ）、ボトリオスフェリア・リビス（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｉｂｉｓ）、シュードザイマ・アフィジス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）種、ペソツム・エルベセンス（Ｐｅｓｏｔｕｍ ｅｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、バタレア・ステベニイ（Ｂａｔｔａｒｒｅａ ｓｔｅｖｅｎｉｉ）、バタレア（Ｂａｔｔａｒｒｅａ）種、ハーポスポリウム・ヤヌス（Ｈａｒｐｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｊａｎｕｓ）、ハーポスポリウム（Ｈａｒｐｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ヒルステラ・ロシリエンシス（ＨｉｒｓｕｔｅＩｌａ ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アルスロデルマ・シフェリイ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）、アルスロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）種、プチニアストルム・ゴエッペルチアヌム（Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｕｍ ｇｏｅｐｐｅｒｔｉａｎｕｍ）、クロナルチウム・オシデンタレ（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、クロナルチウム・アリゾニクム（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ａｒｉｚｏｎｉｃｕｍ）、クロナルチウム（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ）種、ペリデルミウム・ハルクネシイ（Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ ｈａｒｋｎｅｓｓｉｉ）、ペリデルミウム（Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ）種、クリソミクサ・アルクトスタフィリ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａ ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｉ）、ホレヤ・シネカウダ（Ｈｏｌｌｅｙａ ｓｉｎｅｃａｕｄａ）、ホレヤ（Ｈｏｌｌｅｙａ）種、ズーフソラ・ラジカンス（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｄｉｃａｎｓ）、スミチウム・クリセタエ（Ｓｍｉｔｔｉｕｍ ｃｕｌｉｓｅｔａｅ）、アウクサルスロン・ズフィアヌム（Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ ｚｕｆｆｉａｎｕｍ）、レニスポラ・フラビシマ（Ｒｅｎｉｓｐｏｒａ ｆｌａｖｉｓｓｉｍａ）、クテノミセス・セラタス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｒａｔｕｓ）、およびスポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）。

【0196】

感染病原体としての寄生生物種の例は、蠕虫（ｈｅｌｍｉｔｈｓ）（寄生虫（ｗｏｒｍｓ））を含んでもよく、それは以下から選択されてもよい。条虫（ｃｅｓｔｏｄｅｓ）：例、アナプロセファラ（Ａｎａｐｌｏｃｅｐｈａｌａ）種；ジピリジウム（Ｄｉｐｙｌｉｄｉｕｍ）種；裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）種；エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種；モニエジア（Ｍｏｎｉｅｚｉａ）種；タエニア（Ｔａｅｎｉａ）種；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）、例、ジクロコエリウム（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ）種；カンテツ属（Ｆａｓｃｉｏｌａ）種；パラムフィストマム（Ｐａｒａｍｐｈｉｓｔｏｍｕｍ）種；住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種；または線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）；例、鉤虫属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）種；アネカトル（Ａｎｅｃａｔｏｒ）種；アスカリディア（Ａｓｃａｒｉｄｉａ）種；回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）種；ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）種；ブノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）種；カピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）種；チャベルチア（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）種；クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）種；シアトストムム（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ）種；シリコシクルス（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ）種；シリコドントホルス（Ｃｙｌｉｃｏｄｏｎｔｏｐｈｏｒｕｓ）種；シリコステファヌス（Ｃｙｌｉｃｏｓｔｅｐｈａｎｕｓ）種；クラテロストムム（Ｃｒａｔｅｒｏｓｔｏｍｕｍ）種；ディクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）種；ジペタロネマ（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）種；ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）種；ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）種；エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）種；フィラロイデス（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）種；ハブロネマ（Ｈａｂｒｏｎｅｍａ）種；ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）種；ヘテラキス（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ）種；ヒオストロンギルス（Ｈｙｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種；メタストロンギルス（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種；メウレリウス（Ｍｅｕｌｌｅｒｉｕｓ）種、ネカトール（Ｎｅｃａｔｏｒ）種；ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）種；ニッポストロンギルス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種；オエソファゴストムム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）種；オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）種；オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）種；オキシウリス（Ｏｘｙｕｒｉｓ）種；パラスカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）種；ステファヌルス（Ｓｔｅｐｈａｎｕｒｕｓ）種；ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種；シンガムス（Ｓｙｎｇａｍｕｓ）種；トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）種；ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）種；テラドルサギア（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ）種；トキサスカリス（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）種；トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）種；鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）種；トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種；トリオドントフォロウス（Ｔｒｉｏｄｏｎｔｏｐｈｏｒｏｕｓ）種；ウンシナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）種、および／またはウシェレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）種。

【0197】

感染病原体としての寄生生物種の例は、以下から選択される原虫を含んでもよい。トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｄｏｎｏｖａｎ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）を含むリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含むがそれに限定されないマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種；ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉ）、クリプトスポリジウム・パルム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｕｍ）、ランブル・フラゲラテ（Ｒｕｍｂｌｅ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）、シゲラ・アメーバ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｍｏｅｂａ）、およびシクロスポランガ・カネテネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａｎｇａ ｃａｎｅｔｅｎｅｎｓｉｓ）。

【0198】

本明細書において考察されるワクチン組成物および方法は、特に有効な免疫原性タンパク質が公知であるときの、ワクチン接種に感受性であることがすでに公知であり得る疾患、処置および予防に対して非排他的に予期される。

【0199】

表５（以下）は、本発明の組成物および方法において使用するために選択される、それに対する免疫応答が所望される抗原の例示的な例を提供する。当業者は、公開データベースおよび刊行物から類似の抗原／標的を容易に入手し、本発明の組成物を生成できる。たとえば感染前の予防および活動性感染症などの疾患の状態に依存して、２つ以上の抗原が対象に送達されてもよいことが理解されるべきである。例として、活動性結核疾患を有する対象については、活動期（例、ＥＳＡＴ６ Ａｇ８５Ｂ）、潜伏期（Ｒｖ２６２６）、および／または蘇生期（ＲｐｆＢ－Ｄ）由来のＴＢタンパク質をコードするＴＢ抗原を送達してもよい。このようにして、特にＴｈ１応答を誘発するアジュバントを投与することが所望されるときに、活動性の結核が処置され得る。

【0200】

本発明の一態様において、本明細書に記載される組成物は、標準的な治療と組み合わせて投与され、たとえば、活動性の細菌感染またはウイルス感染に対しては、こうした疾患を処置するための当分野で公知の抗菌剤または抗ウイルス剤が投与され得る。こうした薬剤は、本発明の組成物による処置の前か、それと同時（単独で、または固定用量の組み合わせとして）か、またはその後に投与され得る。

【0201】

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、免疫応答が望まれる抗原をコードし得る。こうした抗原の送達は、上記で考察された局所的免疫応答を誘導するために使用されるか、または抗原自体に対する適応免疫応答を誘発するため、すなわちワクチンと同様に、その抗原に対する免疫を誘導するために使用され得る。こうした場合、本発明による組成物をアジュバントと組み合わせて、免疫応答の発生を促進させてもよい。適切には、１つ以上の炎症性サイトカインをアジュバントとして使用してもよく、それはたとえばＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦ、またはそれらのアゴニストおよびホモログなどから選択される。任意選択で、１つ以上の炎症性サイトカインは、特にＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される。特定の実施形態では、１つ以上の炎症性サイトカインはＩＬ－１２、ＩＦＮγ、およびＧＭ－ＣＳＦから選択される。特定の実施形態において、炎症性サイトカインは、同時投与または連続投与されるワクチン組成物のアジュバントとして作用する。

【0202】

感染性疾患の予防または病原体感染症の予防のための予防ワクチン
たとえば、コードｍＲＮＡは、それに対する全体的または部分的な免疫反応が所望される細菌、ウイルス、またはその他の微生物のタンパク質をコードし得る。こうしたコードされた産物は、この考察において「抗原産物」または「抗原」と呼ばれる。いくつかの場合に、細菌、ウイルス、またはその他の微生物のタンパク質の一部（「エピトープ」または「抗原決定基」）のみに対して免疫を生成でき、よってそれらの部分のみをコードすることも想定される。特に、外部に提示される微生物タンパク質の部分は、免疫認識のための有望な標的として選択され得る。結果として、コードされる抗原は、細菌、ウイルス、またはその他の微生物のタンパク質であり得るが、その部分配列、一部、またはフラグメントであってもよく、特にその「エピトープ含有フラグメント」であり得る。同じまたは異なるｍＲＮＡコンストラクトにおいて、特定の微生物または病原体に対する２つ以上の抗原が提供され得ることが想定される。

【0203】

本明細書において考察されるワクチン組成物および方法は、表５に記載されるものなどの、特に有効な免疫原性タンパク質が公知であるときの、ワクチン接種に感受性であることがすでに公知である疾患、処置および予防に対して非排他的に予期される。結果として、本明細書中の組成物および方法は、以下に記載される免疫原性タンパク質またはその変異体のうちの１つ以上をコードするｍＲＮＡコンストラクトを使用し得る。

【0204】

【表5】

【0205】

本明細書において考察されるワクチンは、適切には（排他的ではないが）、細胞質または小胞のいずれかの細胞内病原体に向けた方向性が想定される。これに関する細胞内細胞質病原体の例は、ウイルス、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、およびたとえばマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種などの原虫寄生体である。小胞細胞内病原体の例としては、マイコバクテリア、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。

【0206】

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、たとえば重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２ ｖｉｒｕｓ）、すなわちＣｏｖｉｄ－１９パンデミックの原因ウイルスなどの、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの１つ以上のウイルスタンパク質をコードし得る。このウイルスは、Ｓ（スパイク（ｓｐｉｋｅ））、Ｅ（エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ））、Ｍ（膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ））、およびＮ（ヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ））タンパク質という４つの構造タンパク質を有する。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の全部または一部をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｓタンパク質外部ドメインの融合前形態（残基９８６および９８７にプロリン置換を有するアミノ酸１～１２０８；ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７）をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）すなわちＲＢＤ（残基３１９～５９１；ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７）をコードする。これはこのタンパク質の外側部分であり、免疫系によって認識され得るエピトープと考えられる位置である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体のスパイクタンパク質、たとえばアルファ、ベータ、ガンマ、イプシロン、デルタ、カッパ、またはイータ変異体などのスパイクタンパク質の全部または一部をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、以下の表６Ａに列挙される配列（配列番号６２～６７）、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の類似性を有する配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、スパイクタンパク質またはその一部をコードするｍＲＮＡは、ヒトまたは他の哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにおいて使用されるヌクレオシドのうちの１つ以上は、その異性体によって置換されている。例として、ｍＲＮＡコンストラクト中のウリジンヌクレオシドの１つ、複数、またはすべてが、プソイドウリジンヌクレオシドによって置換される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異体のスパイクタンパク質をコードし、ｍＲＮＡの器官保護ＭＯＰ配列はｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１９２、およびｍｉＲＮＡ３０ａの各々に対する標的部位を含み、別の実施形態ではｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ｂに対する標的部位をさらに含む。以下により詳細に記載される本発明の他の実施形態において、ｍＲＮＡは、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さない、非コドン最適化またはヒトコドン最適化ウーハン（Ｗｕｈａｎ）株、ベータ変異体、またはアルファ変異体から選択される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前スパイクタンパク質をコードする。ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ結合配列の以下の組み合わせを含むものから選択されてもよい。ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１９２、およびｍｉＲＮＡ３０ａ；ならびにｌｅｔ７、ｍｉＲＮＡ１２６、およびｍｉＲＮＡ３０ａ；ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１、ｍｉＲＮＡ２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ３０ａ。器官保護が必要とされる特定の状況に依存して、他のＭＯＰ配列が選択されてもよいことが認識されるだろう。本明細書に記載されるとおり、選択されるＭＯＰ配列は、体内のそれぞれの標的ｍｉＲＮＡ配列との完全一致ハイブリダイゼーションを確実にするためにさらに最適化されたｍｉＲＮＡ結合配列を含んでもよい。

【0207】

【表6A】

【0208】

いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）としても知られるヒトアルファ－ヘルペスウイルス３（ＨＨＶ－３：Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ３）の１つ以上のウイルスタンパク質をコードし得る。特定の実施形態において、コードｍＲＮＡは、ＶＺＶの１つ以上の糖タンパク質、たとえば糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）などをコードし得る。

【0209】

いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡは、インフルエンザウイルス（流行性季節性インフルエンザを引き起こすＡ型およびＢ型）の１つ以上の免疫原性ウイルスタンパク質、たとえばヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックス－２、および／または核タンパク質などをコードし得る。ヘマグルチニンは、インフルエンザのグループ、型、さらにはサブタイプの間でも高度に可変性であり、これは汎用インフルエンザワクチンを開発することが困難である一要因である。ヘマグルチニンの頭部ドメインは高度に可変性であるが、ヘマグルチニンの膜近位ストークドメインはグループ内で比較的よく保存されているが、免疫サブドミナントである。したがって、いくつかのワクチン戦略は、頭部ドメインを有さない低減されたＨＡを使用し、したがって本発明の実施形態においてこうした低減されたＨＡが提供され得ることが予期される。

【0210】

インフルエンザの任意のグループ、型、またはサブタイプ由来の１つ以上の免疫原性ウイルスタンパク質を提供することが考えられ、それはたとえば、インフルエンザＡグループ１：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８サブタイプおよびＮ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ８サブタイプ；インフルエンザＡグループ２：Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、Ｈ１５サブタイプ＋Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ９サブタイプ；またはインフルエンザＢ由来のものなどである。インフルエンザＢウイルスはサブタイプに分けられないが、代わりにＢ／ヤマガタおよびＢ／ビクトリアの２つの系列にさらに分類される。

【0211】

ノイラミニダーゼはヘマグルチニンよりもゆっくりとドリフトし、ノイラミニダーゼに対する抗体はサブタイプ内で交差防御的であることが示されている。ノイラミニダーゼは、ヘマグルチニンと比較すると免疫サブドミナントである。マトリックス－２および／または核タンパク質は、ヘマグルチニンよりも保存されているが、免疫サブドミナントである。

【0212】

毎年、ＷＨＯは予測に基づいて四価または三価インフルエンザワクチンを推奨している。結果として、広範な防御を提供するために、２つ以上のインフルエンザ抗原をコードする組成物およびコンストラクトを提供することが特に想定される。

【0213】

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、たとえばＦ糖タンパク質および／またはＧ糖タンパク質などの呼吸器合胞体ウイルスの１つ以上の免疫原性ウイルスタンパク質をコードし得る。Ａ２株由来のＦ糖タンパク質は、ＲＳＶ Ａ（ロング）株およびＲＳＶ Ｂ（１８５３７）株に対する交差防御を誘導する、マクレラン（ＭｃＬｅｌｌａｎ）ら、２０１３に記載される改変を使用した融合前コンフォメーションで安定化され得る。

【0214】

いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡは、たとえば糖タンパク質１２０中和エピトープ（ＣＤ４ＢＳ ４２１－４３３エピトープなど）または糖タンパク質１４５の全長または一部などの、ヒト免疫不全ウイルスの１つ以上の免疫原性ウイルスタンパク質をコードし得る。たとえばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｎｅｆなどのＨＩＶ由来の抗原は、ワクチン候補の可能性のあるものとしてさまざまなベクターにおいて発現されている（ＩＰナシメントおよびＬＣＣレイテ、ブラジリアン・ジャーナル・オブ・メディカル・アンド・バイオロジカル・リサーチ（Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．）２０１２ ｄｏｉ：１０．１５９０／Ｓ０１００－８７９Ｘ２０１２００７５００１４２）。

【0215】

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、マイコバクテリウム属由来の細菌の１つ以上の免疫原性細菌タンパク質またはその一部をコードし得る。特に、コードｍＲＮＡは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および／またはらい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）細菌由来の１つ以上の細菌タンパク質をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、コードｍＲＮＡは、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の活動期および／または潜伏期および／または蘇生期由来の１つ以上のタンパク質をコードしてもよい。たとえば、ｍＲＮＡは、ＥＳＡＴ－６、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４、Ｒｖ２６２６、および／もしくはＲｐｆＤ－Ｂ、またはその一部から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質の１つ以上をコードしてもよい。

【0216】

以下の表６Ｂは、本発明において使用され得るいくつかの異なる可能な病原体に対する抗原をコードするＯＲＦの例を示す。本明細書中に記載されるとおり、これらのＯＲＦは、さらなるＲＮＡ配列、最も具体的にはＯＰＳと共に存在でき、かつ／またはさらなるｍＲＮＡコンストラクトと組み合わせて使用され得る。上記の考察と同様に、いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、以下の表６に列挙される配列（配列番号６９～８４）、またはそのエピトープ含有フラグメント、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の類似性を有する配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、抗原またはその一部をコードするｍＲＮＡは、ヒトまたは他の哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡにおいて使用されるヌクレオシドのうちの１つ以上は、その異性体によって置換されている。例として、ｍＲＮＡコンストラクト中のウリジンヌクレオシドの１つ、複数、またはすべてが、プソイドウリジンヌクレオシドによって置換される。

【0217】

【表6B】

【0218】

たとえば２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来のスパイクタンパク質をコードするなど、２つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡを含む、医薬組成物を含む組成物を提供することが特に想定される。本明細書中の他の箇所に記載されるとおり、同じまたは異なるｍＲＮＡコンストラクトによって複数の抗原が提供されてもよい。１つの態様において、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ベータ（南アフリカ）変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、およびデルタ変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の少なくとも２つ、適切には３つすべてに由来するスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡコンストラクトを含む組成物が提供される。これらは、同じまたは異なるｍＲＮＡコンストラクト上に存在してもよい。本明細書中の他の箇所に記載されるとおり、これらの抗原をコードするｍＲＮＡコンストラクトは、ＯＰＳを欠いていてもよいし、それらの１つ以上、適切にはすべてがＯＰＳを有してもよい。いくつかの実施形態において、ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；またはｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列を含み得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、以下でさらに考察されるとおり、組成物は免疫調節剤をコードするｍＲＮＡも含み得る。特に、本明細書中の他の箇所で考察されるとおり、組成物はＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡも含んでもよい。本明細書中の他の箇所に記載されるとおり、免疫調節剤ｍＲＮＡはＯＰＳを欠いていてもよいし、ＯＰＳを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；またはｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列を含み得る。特定の実施形態において、記載されるとおり、抗原（たとえば、２つ以上の変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）をコードするｍＲＮＡコンストラクトはＯＰＳを欠いていてもよいが、免疫調節剤（たとえばＩＬ－１２）をコードするｍＲＮＡコンストラクトはＯＰＳを含んでもよい。

【0219】

いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（またはその変異体）およびインフルエンザの各々に由来するウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物を提供して、たとえば、これらのウイルスの一方または両方の季節性変異体、新規変異体、または新興変異体に対する多価ワクチン接種または共同ワクチン接種を提供し得ることが想定される。他の箇所に記載されるとおり、同じまたは異なるｍＲＮＡコンストラクト上に異なる抗原が提供されてもよく、他の箇所に記載されるとおり、これらのｍＲＮＡコンストラクトはＯＰＳを欠いていてもよいし、ＯＰＳ／ＭＯＰを含んでもよい。以下でさらに考察されるとおり、組成物は、たとえばＩＬ－１２などの免疫調節剤をコードするｍＲＮＡをさらに含んでもよい。記載されるとおり、このｍＲＮＡはＯＰＳも含んでもよい。

【0220】

さまざまな実施形態では、抗原産物をコードするｍＲＮＡは、複数の器官を保護する少なくとも１つのＯＰＳ（すなわち、多器官保護配列または「ＭＯＰ」）を付加的に含み、ＯＰＳ配列は、少なくとも３つ（たとえば、少なくとも第１、第２、および第３）のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む。標的配列の１つは、ｍｉＲＮＡ－１と結合できる配列であり得る。標的配列は、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－２０５、ｍｉＲＮＡ－２００ｃ、ｍｉＲＮＡ－３０ａ／ｂ／ｃ、および／またはＬｅｔ７ａ／ｂのうちの１つ以上、適切にはこれらのすべてと結合できる配列を含むことができる。

【0221】

任意の抗原をコードするｍＲＮＡのさまざまな実施形態において、ＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；またはｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できる配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つの配列を含むことができる。本明細書に記載されるものなどの任意のＯＰＳは、脳組織の保護のためにｍｉＲＮＡ－１２４と結合できる配列、および／またはＬｅｔ７ｂと結合できる配列をさらに含んでもよい。ＯＰＳ内の標的配列の順序（すなわち、それらの５’から３’への配置）は重要であるとは考えられず、任意の順列が考慮されてもよい。

【0222】

上記のアプローチは、細菌または他の生物によって産生された不活性化毒素に対する免疫応答が誘導される典型的な「トキソイド」ワクチンか、または標的微生物のフラグメントに対して免疫応答が誘導される「サブユニット」ワクチンと同様のワクチン治療組成物を調製するために特に適していることが認識され得る。

【0223】

本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、提案される標的組織として、血液またはその細区分（たとえば、造血細胞およびリンパ系細胞など）を有してもよいが、血液およびその細区分は、免疫応答を誘導することを目的とする実施形態、コードｍＲＮＡによってコードされる産物に対して免疫応答を誘導させる実施形態、および／または任意選択でワクチン療法を提供することを目的とする実施形態において、特に適切であり得ることが特に考えられる。こうしたアプローチに対する標的として特に予期されるのは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）、および適切には抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）である。

【0224】

従来のワクチンは、病原体特異的抗原（外因性抗原）を免疫系に提示することによって、それに対する免疫反応が誘導され得るようにして、この外因性抗原に次に遭遇したときにそれを認識して迅速に対抗できるようにすることによって、少なくとも部分的に機能する。いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）がこのプロセスの鍵である。すべての有核細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）に内因性抗原を提示することができるが、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む特定の細胞は「プロフェッショナル」ＡＰＣであり、外因性抗原を検出および提示する能力を有する。これらの細胞は、外因性抗原を内在化してプロセシングし、主要組織適合性複合体ＩＩ型（ＭＨＣ－ＩＩ：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）およびしばしば共刺激分子と会合して、それらの外因性抗原またはそれらのフラグメント（免疫優性エピトープ）を表面上に提示して、Ｂ細胞による抗体産生（適応免疫）を開始する際に中心的役割を果たすたとえばＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞などの増強されたＴ細胞応答を形成する。

【0225】

過去の努力により、インフルエンザタンパク質をコードするｍＲＮＡを脂質ナノ粒子で投与して、免疫細胞の動員ならびに単球および樹状細胞によるｍＲＮＡの翻訳をもたらすことができることが実証されている（リャン（Ｌｉａｎｇ）ら「アカゲザルにおける改変ｍＲＮＡワクチン投与後のインビボでの抗原提示細胞の効率的な標的化および活性化（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ａｆｔｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ）。モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）２０１７）。したがって、外因性抗原またはそのエピトープをコードする本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物によるプロフェッショナルＡＰＣ（たとえば単球および樹状細胞など）のトランスフェクションは、抗原提示と、その抗原に対する長期にわたる適応免疫の誘導とを可能にすることが予期される。しかし、プロフェッショナルＡＰＣ内での抗原の発現は必要ではなく、他の組織による抗原の発現が、所望の免疫応答を誘導するのに有効となり得る。これは、産生された抗原が産生後に通常の方法でプロフェッショナルＡＰＣによって取り込まれてプロセシングされ得るからである。

【0226】

これに加えて、またはその代わりに、本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を使用して、たとえばサイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、または主要組織適合性複合体などのワクチン誘導免疫のプロセスに関連する産物を送達および発現させることができる。こうしたコードされた産物は、この考察のために「免疫刺激物質」、「免疫調節産物」、もしくは「免疫調節剤」と呼ばれるか、または同時投与されたワクチン組成物に対する応答を刺激するために使用されるときは「アジュバント」と呼ばれる。抗原およびさらなる（免疫調節）成分の両方をコードするｍＲＮＡが投与されるとき、上記のとおり、これらは別々のｍＲＮＡコンストラクトとして製剤化されるか、または同じポリシストロニックｍＲＮＡ上に一緒に製剤化され得る。別々のｍＲＮＡコンストラクトがこれらの産物に使用されるとき、以下でさらに考察されるとおり、別々のコンストラクトの各々は、ｍｉＲＮＡ結合性部位配列の同じセットを含むことができ（すなわち、それらの各々が同じＯＰＳを含んでもよい）、またはｍｉＲＮＡ結合部位配列の異なるセット（異なるＯＰＳ）を含んでもよい。場合によっては、ｍＲＮＡコンストラクトのうちのいずれかが、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を完全に欠いていてもよい。ワクチン誘導免疫のプロセスに関連する産物をコードするｍＲＮＡは、当業者に公知の任意のタイプのワクチンと組み合わせて、すなわち、タンパク質ベース（トキソイド、組み換え、コンジュゲートワクチン）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＤＮＡベースのワクチン（上記のとおりの環状または環状化ＲＮＡコンストラクトを含む）、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、または組み換えベクターベースのワクチン（例、ＭＶＡまたはアデノウイルスプラットフォーム）と組み合わせて使用できることが認識され得る。

【0227】

このようにして、同時投与されたｍＲＮＡコード抗原または他のタイプのワクチンに対する免疫応答を、制御可能な多用途のやり方で増強できる。このアプローチの別の利点は、免疫応答を増強するための免疫調節剤の投与によって、単一の組成物で複数のポリペプチドを提供できることが期待されることである。

【0228】

たとえば、マクロファージはＭＨＣ－ＩＩを発現するために、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）のＴ細胞分泌による活性化を必要とする。したがって、記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物でのトランスフェクションによるＩＦＮ－γ発現の誘導は、従来のワクチンアプローチか、または本明細書中に記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物を使用するアプローチによって抗原発現を誘導したときのいずれでも、ワクチン誘導免疫応答の誘導を増強し得る。同様に、たとえばＴＬＲ、適切には上記で考察したＴＬＲ８などの免疫原性プロセスに関与する細胞受容体の誘導も、本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物を用いて実施できる。

【0229】

Ｔｈ１およびＴｈ２免疫応答の主な相違点は、Ｔｈ１免疫応答が、細胞内寄生体を殺し、かつ自己免疫応答を永続させる炎症誘発性応答であるのに対して、Ｔｈ２免疫応答は、アトピーにおけるＩｇＥおよび好酸球性応答を促進し、抗炎症性応答を生じることによって、蠕虫などの大きな細胞外寄生体を殺すことである。さらに、重要なＴｈ１サイトカインはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）であるのに対し、Ｔｈ２サイトカインはインターロイキン４、５、６、１０、および１３を含む。Ｔｈ１免疫応答は、細菌およびウイルスなどの細胞内寄生体に対してＴｈ１細胞によって生じる免疫応答である。一般的に、サイトカインＩＬ－１２は、Ｔｈ１細胞を活性化することによってＴｈ１免疫応答を引き起こすことを担う。さらに、活性化されたＴｈ１細胞は、たとえばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）およびインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインを分泌する。Ｔｈ１免疫応答は、細胞性免疫をもたらす炎症誘発性応答である。したがって、Ｔｈ１免疫応答はマクロファージならびにＣＤ８ Ｔ細胞、ＩｇＧ Ｂ細胞、およびＩＦＮ－γＣＤ４ Ｔ細胞を活性化する。インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ－β）を含む、Ｔｈ１細胞によって産生されるサイトカインはＴｈ１免疫応答に介在し、一方、たとえばインターロイキン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３）などのＴｈ２細胞によって産生されるサイトカインはＴｈ２免疫応答に介在する。

【0230】

ＩＬ－１２は、抗原刺激に応答して樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトＢリンパ芽球細胞によって産生され、Ｔ細胞の刺激および増殖に関与する。ＩＬ－１２は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１サブセットの発生において重要な役割を有する、刺激性および炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ－１２は元々、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生、細胞増殖、ならびにナチュラルキラー細胞およびＴ細胞によって介在される細胞傷害性を誘導する能力を有することによって発見された。現在では、上記のとおり、ＩＬ－１２がＴｈ１応答の発生においても重要な役割を果たし、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２産生をもたらすことが立証されている。これらのサイトカインは、次いで細胞傷害性Ｔ細胞応答およびマクロファージ活性化を促進し得る。

【0231】

別の実施形態では、外因性抗原発現を誘導するために従来のワクチンアプローチまたは本明細書中に記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物を使用するアプローチのいずれを用いたときにも、ワクチン効力を増強するかまたはワクチン誘導性免疫応答を増強するために、ＩＬ－１２発現をもたらすｍＲＮＡコンストラクトおよび／または組成物を投与することが所望されてもよい。このようにして、ＩＬ－１２は、同時またはほぼ同時に送達される抗原を特定的に標的とするレシピエントにおける免疫刺激応答を提供するためのアジュバントとして存在する。前述のとおり、Ｔｈ１応答を誘導するＩＬ－１２の有利な生物学的活性は、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２産生を促進する。これらのサイトカインは共に、投与された抗原に応答して細胞傷害性Ｔ細胞免疫を促進できる。このタイプのワクチン療法のレシピエントにおける免疫原性応答は、たとえば数例を挙げるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ、ＨＩＶ、およびＲＳＶを含むウイルスなどの細胞内病原体；またはさらにはたとえば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの細胞内細菌病原体によってもたらされる感染性疾患の処置もしくは予防に特に適している。

【0232】

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦまたはＣＳＦ２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５２５７８）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含むさまざまな細胞型によって産生される免疫調節剤である。加えてＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示細胞の機能を調節し、かつ樹状細胞活性化の増強および単核食細胞成熟の増強に関与する。ＧＭ－ＣＳＦは、過去にワクチンにおいて応答を刺激するために使用されている（ユー（Ｙｕ）ら「新規のＧＭ－ＣＳＦベースのワクチン：ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子最適化における１つの小さなステップ、ヒトワクチンにとっての１つの大きな飛躍（Ｎｏｖｅｌ ＧＭ－ＣＳＦ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｏｎｅ ｓｍａｌｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ＧＭ－ＣＳＦ ｇｅｎｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ、ｏｎｅ ｇｉａｎｔ ｌｅａｐ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ）。」ヒューマン・ワクチンズ・アンド・イムノセラピューティックス（Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）２０１６）。特にＧＭ－ＣＳＦは、ジフテリア予防（グラッセ（Ｇｒａｓｓｅ）Ｍら「ＧＭ－ＣＳＦは多価ワクチン中のジフテリア成分に対する免疫応答を改善する（ＧＭ－ＣＳＦ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）。」ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）。２０１８）、および結核予防（ワン（Ｗａｎｇ）ら「ウイルスベースのＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子アジュバント製剤の使用によるＢＣＧワクチンの免疫原性の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＢＣＧ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｖｉｒａｌ－ｂａｓｅｄ ＧＭ－ＣＳＦ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）。」ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）。２００２）を含むがこれらに限定されない細菌疾患または感染に対するワクチン応答を改善することが示されている。コロナウイルス、インフルエンザウイルス（リウ（Ｌｉｕ）ら「保存されたインフルエンザタンパク質およびＧＰＩアンカーＣＣＬ２８／ＧＭ－ＣＳＦ融合タンパク質から構成されるインフルエンザウイルス様粒子は、同種および異種ウイルスに対する防御免疫を増強する（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＧＰｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ＣＣＬ２８／ＧＭ－ＣＳＦ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｖｉｒｕｓｅｓ）。」インターナショナル・イムノファーマコロジー（Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．）２０１８）、およびブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）（ユー（Ｙｕ）ら「ＧＭ－ＣＳＦを発現する組み換え生弱毒化ＰＲＲＳＶの構築およびインビトロ評価（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＰＲＲＳＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧＭ－ＣＳＦ）。」バイロロジー・ジャーナル（Ｖｉｒｏｌ Ｊ．）２０１４）を含むがこれらに限定されないウイルス性疾患またはウイルス感染症に対するワクチンアプローチにおけるＧＭ－ＣＳＦの使用によって、同様の改善が発見または理論化されている。

【0233】

したがって、本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を用いたＧＭ－ＣＳＦのコードｍＲＮＡの導入は、抗体および細胞性免疫応答の両方を通じてワクチン免疫原性を増強するために使用され得る。したがってこうしたアプローチは、ヒトおよびその他のレシピエントにおけるワクチンアジュバント、エンハンサー、または免疫学的ブースターとして、予防および治療用ワクチン型の両方において使用され得る。同様の効果は、たとえばマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦまたはＣＳＦ１；ＧｅｎＢａｎｋ ＢＣ０２１１１７）および顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（Ｇ－ＣＳＦまたはＣＳＦ３；ＧｅｎＢａｎｋ ＢＣ０３３２４５）などの他のＣＳＦ型タンパク質についても見られ得る。

【0234】

上記で考察したとおり、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βは、主にウイルス感染に対する自然免疫に関与し、記載されるとおり、本明細書中に記載されるｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を使用したこれらの薬剤の一方または両方の導入は、免疫原性を増加させるために使用され得る。

【0235】

ＩＦＮ－γ合成は、適応免疫応答の強さおよび質に影響を及ぼすことが公知である。適応免疫応答の出現前に発生する、免疫化後のＩＦＮ－γの早期合成は、ワクチンに対する高品質免疫応答の徴候である。自然免疫細胞によるＩＦＮ－γのこの早期放出は、樹状細胞の成熟に影響を及ぼし、結果的にＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１系列への極性化に影響を及ぼす。

【0236】

考察されたとおり、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２は活性化ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞にも産生され、これらの薬剤の一方または両方の導入によって、関連する応答を増加し得ることが予期される。同様に、本明細書の他の箇所で考察されるＴＮＦαは、感染に対する炎症応答の一部として他の免疫系細胞を動員するために放出され、したがって本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を用いたＴＮＦαの提供は、抗ウイルス免疫原性を増強するために使用され得る。

【0237】

ＩＬ－６は、Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌細胞への最終分化に関与し、本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を用いたその導入は、免疫原性を改善することが想定される。

【0238】

本明細書中に記載されるとおりに投与されるときのＩＬ－８の導入は、好中球走化性を改善し、よって免疫原性を改善することが予期される。

【0239】

本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトまたは組成物を使用して誘導することができるワクチン誘導免疫のプロセスに関連する産物の他の例としては、核因子ＮＦ－κＢ経路のモジュレーターが挙げられ、これは結核菌（ＢＣＧ）ワクチンに対するワクチン応答の発生に関与している（シェイ（Ｓｈｅｙ）ら「生後９ヵ月間にわたるマイコバクテリアに対する自然応答の成熟（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｎｉｎｅ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ｌｉｆｅ）。」ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ．）２０１４）。

【0240】

上記のものなどの同時投与のための特定の免疫調節剤を選択できることは、特定のタイプの免疫応答の促進を可能にし、これは特定の病原体に対する有効な免疫を誘導するために有益であり得る。例として、考察されるＩＬ－１２は、Ｔｈ１応答の発生において重要な役割を果たし、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２産生をもたらすので、こうした細胞内病原体に対するワクチン接種をするときに、このサイトカインを同時投与することが有益であり得る。たとえばＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－β、ＩＬ－２、およびＩＬ－１０など、その他のＴｈ１関連サイトカインも、こうした反応を促進するために付加的または代替的に有用であってもよい。

【0241】

上記の考察によるｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物は、抗原をコードするか免疫調節剤をコードするかにかかわらず、本明細書に記載の任意の器官保護配列を含み得る。しかし、特定の実施形態では、器官保護配列は、筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚のうちの１つ以上を保護するように選択される（たとえば、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、および／またはｍｉＲＮＡ－２０３ａに対する標的配列を使用する）。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－２０３ａの４つすべてに対する標的配列が器官保護配列に含まれる。こうした組み合わせは、筋肉組織（組成物は筋肉内投与され得るため）、ならびに肝臓および腎臓組織を保護するのに有効であると考えられる。筋肉組織の保護が所望される任意の実施形態においては、表２に従って、ｍｉＲＮＡ１の代わりまたはそれに加えて、ｍｉＲＮＡ１３３ａおよび／またはｍｉＲＮＡ２０６に対する標的配列が含まれ得ることが特に考慮される。たとえば、こうしたＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１３３ａ、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ；またはｍｉＲＮＡ－２０６、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含み得る。皮下または皮内投与も一般的であり、皮膚の細胞を保護するために、皮膚に関連する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列（表２参照）も使用されてもよい。

【0242】

特定のワクチンは、内皮組織との相互作用に関連する副作用を有し得ると考えられている。ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）Ｍ、ハーマンス（Ｈｅｒｍａｎｓ）Ｃ（２０２１）ＰＬｏＳメディシン（ＰＬｏＳ Ｍｅｄ）１８（５）：ｅ１００３６４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｍｅｄ．１００３６４８では、以下の機構が示唆された。筋肉内注射後、ワクチンアデノウイルスは内皮細胞に感染し、自身のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の産生を誘導する。ヘパラン硫酸ＰＧは、内皮細胞の管腔側でスパイクタンパク質に結合するか、または損傷細胞によって放出され得る。スパイクタンパク質は、ＡＣＥ２依存性機構およびＡＣＥ２非依存性機構を介して血小板を活性化するだろう。活性化血小板によって放出されたＰＦ４は、内皮細胞から脱落したヘパラン硫酸ＰＧに結合した後に免疫原性になるだろう。

【0243】

したがっていくつかの実施形態では、内皮組織を保護するためにｍｉＲＮＡ標的配列を含ませることを所望されることがある。したがって、表２において考察されたとおり、ｍｉＲＮＡ－９８および／またはｍｉＲＮＡ－１２６標的配列がＯＰＳに含まれてもよい。このタイプの保護は、任意の投与様式に有用であると考えられ、特に血管内への投与（静脈内、動脈内など）または筋肉内投与が使用されるときに有用であると考えられる。

【0244】

他の実施形態では、標的配列は、上記の表３または４からの１つ以上の配列の任意の適切な組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態では、免疫調節剤をコードするｍＲＮＡコンストラクト内に含まれるＯＰＳは、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ；Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａ；ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、およびｍｉＲＮＡ－３０ａと結合できる配列；またはｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、およびｍｉＲＮＡ－１２４と結合できる配列、ならびにｍｉＲＮＡ１２２と結合できる２つの配列を含み得る。

【0245】

こうしたコンストラクトおよび組成物におけるｍｉＲＮＡ－１４２標的配列の使用を回避することも有利であると考えられる。なぜなら、このｍｉＲＮＡは造血起源の細胞および免疫細胞において豊富であり、したがってワクチン介在性応答に介在すると予想される細胞における発現の低下をもたらし得るからである。

【0246】

抗原および免疫調節成分の両方をコードするｍＲＮＡが投与される実施形態において、これらを別々のｍＲＮＡコンストラクトとして提供することができ、それらのｍＲＮＡコンストラクトは共製剤化されても、別々に製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡコンストラクトのいずれかが、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を完全に欠いていてもよい。他の場合には、本明細書に記載されるとおり、各ｍＲＮＡコンストラクトは１つ以上の器官保護配列を含んでもよい。これらの器官保護配列は、各ｍＲＮＡコンストラクトについて同じであってもよいし、異なっていてもよい。抗原および免疫調節産物の異なる目的およびオフターゲット効果の可能性を考慮すると、これらの産物の示差的発現の異なるパターンを支援すること、および／または各産物に対する異なる組織または細胞型に対する保護を拡大することのために、これらの産物の各々に対する異なる器官保護配列を使用することが有益であり得ると考えられる。

【0247】

たとえば、抗原成分を主に筋細胞およびＡＰＣに発現させることが有利であってもよく、したがって、これらの産物をコードするｍＲＮＡに含まれる器官保護配列は、他の健常な組織を保護しながらこれらの細胞型における発現を可能にするように選択されてもよい。場合によっては、抗原成分が、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、および／もしくはｍｉＲＮＡ３０ａ、またはこれらの３つすべてに対する標的配列を含む器官保護配列を有することが好ましいことがある。

【0248】

上記で考察したとおり、たとえばＩＬ－１２などの免疫調節剤は、オフターゲット効果を生じる可能性があるため、これらの因子をコードするｍＲＮＡは、（たとえばｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、および／もしくはｍｉＲＮＡ－２０３ａ、またはこれらの４つすべてに対する標的配列によって）筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および／または皮膚に最大限の保護を提供するように選択されてもよく、一方で抗原成分をコードするｍＲＮＡは、発現の幅を増加させるために、より少ないｍｉＲＮＡ結合性部位配列を含んでもよい。

【0249】

一実施形態では、本発明の実施形態に従って投与される免疫調節剤は、タンパク質ベースのワクチン免疫原性を改善する。

【0250】

一実施形態では、本発明の実施形態に従って投与される免疫調節剤は、ウイルスベースのワクチン免疫原性を改善する。

【0251】

治療用ワクチン（または能動免疫療法）
従来の予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）なワクチン接種に加え、より新しい分野は、たとえば持続性感染または癌などの、体内にすでに存在する標的に対する免疫応答を誘発することを目的とした治療用ワクチンの分野である。こうした場合、免疫応答はしばしばダウンレギュレートされているか、そうでなければ正常な免疫応答から疾患を保護するように作用する耐性機構によって抑制されるため、治療用ワクチンははるかに困難であることが証明されている（メリーフ（Ｍｅｌｉｅｆ）ら「治療用癌ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（ＪＣＩ）２０１５）。

【0252】

したがって一実施形態では、腫瘍細胞における翻訳のために、腫瘍抗原をコードする本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトが提供される。先に考察したとおり、これは癌細胞に対する免疫応答を誘導することを目的とする。これまでで明らかなとおり、本発明による器官保護配列の選択的使用によって、標的腫瘍組織以外の細胞型、組織、および／または器官における発現を低減させることができ、それは腫瘍を取り囲む同じまたは異なる組織タイプの組織中の健常細胞であるか、あるいは投与の使用または全身分散によって影響を受け得る他の器官であってもよい。

【0253】

こうした投与は、生じる免疫応答を改善するために治療用ワクチンと組み合わせて行うことができ、または腫瘍に対する応答を開始するために、導入されたエンハンサーに免疫系が反応するので、こうした投与自体が治療用ワクチンであってもよい。

【0254】

癌を処置するためのワクチンとしての治療用ウイルスとの組み合わせ（ウイルスベースの免疫療法としての治療用癌ワクチン）
治療用ワクチンとも呼ばれる癌処置用ワクチンは、免疫系をブーストして、健常細胞上には見出されない癌特異的抗原（腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原）を保有する細胞を認識および破壊する免疫治療の一種である。たとえば、結腸直腸ネオ抗原はＭＵＣ１を含み、これは結腸直腸腫瘍細胞に一般的に見出される。他のネオ抗原は、患者の腫瘍に特異的であってもよい。この後者の場合、癌処置用ワクチンは、個別化されたネオ抗原ワクチンとなる。癌処置用ワクチンは、すでに癌と診断された患者に使用される。この療法は、癌細胞を破壊すること、腫瘍の成長および広がりを停止させること、または他の処置が終了した後に癌が再発するのを防止することができる。癌ワクチンは、それに対する免疫応答が所望される抗原と、免疫応答を強化するアジュバントとを含んでもよい。

【0255】

典型的な癌ワクチン接種戦略は、長期にわたる抗腫瘍免疫応答を生成できる、たとえば樹状細胞などの免疫系の主要な抗原提示細胞に腫瘍関連抗原を送達するための適切なベクターを選択することを含んでもよい。特定の実施形態では、アデノウイルス（Ａｄ：ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターは、高い効率を有し、かつ挿入変異誘発に対するリスクが低いことから、ネオ抗原遺伝子の送達のためのビヒクルとして使用されてもよい。たとえばＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２ベクターなどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子産物およびＡｄカプシドタンパク質に対する強力な液性免疫応答および細胞免疫応答を迅速に誘発するので、有望な遺伝子ワクチンプラットフォームである。このことは、腫瘍ネオ抗原をコードするＡｄベクターに感染した樹状細胞を通じたインビトロおよびインビボの両方での抗腫瘍Ｔ細胞応答の生成によって実証されている。したがって一実施形態では、１つ以上の免疫調節剤をコードする本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトを使用して、治療用癌ワクチンによって生成される細胞応答を誘引および活性化できる。本明細書に記載される適切な免疫調節剤は、ＩＬ－１２ならびにその誘導体（例、単鎖形態）およびホモログを含んでもよい。こうしたｍＲＮＡコンストラクトは、たとえば筋肉、肝臓、腎臓、肺、脾臓、および皮膚のうちの１つ以上の保護などのために選択され得る、１つ以上の器官保護配列を含んでもよい（たとえば、ｍｉＲＮＡＮＡ－１、ｍｉＲＮＡＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ、および／もしくはｍｉＲＮＡ－２０３ａ；ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡＮＡ－１２６、および／もしくはｍｉＲＮＡ－３０ａ；またはｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、および／もしくはｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を使用する）。

【0256】

ＧＭ－ＣＳＦは、以前に考察された予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ／ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンにおける役割の可能性と同様に、治療用ワクチンに対するアジュバントの可能性もあるものとして同定されている（ヤン（Ｙａｎら「ＧＭ－ＣＳＦベースの癌免疫療法における最近の進展（Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ＧＭ－ＣＳＦ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）。」イムノセラピー（ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）。２０１７；チャオ（Ｚｈａｏ）ら「治療用ワクチンのアジュバントとしてのＧＭ－ＣＳＦの再調査（Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ＧＭ－ＣＳＦ ａｓ ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ）。」セルラー・アンド・モレキュラー・イムノロジー（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ ｌｍｍｕｎｏｌ．）２０１８）。同様に、癌に対する抗原特異的免疫を増強するためにウイルスベースのワクチンの一部として送達されるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ：ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ）は、免疫応答と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および増殖の誘導とを改善することが示されている（メディナ－エシェベルツ（Ｍｅｄｉｎａ－Ｅｃｈｅｖｅｒｚ）ら「相乗的な癌免疫療法は、ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌが誘導する自然免疫および適応免疫と、腫瘍標的化抗体とを組み合わせる（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ＭＶＡ－ＣＤ４０Ｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。」ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．）２０１９）。したがって、本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトおよび組成物を使用して、癌処置用ワクチンの前、間、または後にＧＭ－ＣＳＦまたはＣＤ４０Ｌの発現を誘導して、抗腫瘍免疫応答を増強できる。

【0257】

突然変異の結果として癌細胞によって産生される新規抗原である「ネオ抗原」を含む、患者特異的抗原に対する免疫応答を誘導することも所望され得る（リヒティ（Ｌｉｃｈｔｙ）ら「癌免疫療法による拡散（Ｇｏｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）。」ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ）。２０１４）。したがって別の実施形態では、腫瘍関連抗原および／または患者のネオ抗原をコードするｍＲＮＡを含む、本明細書に記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび／または組成物を設計できる。いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡコンストラクトは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ：ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ：Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２：ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ｒａｓの異常産物、またはｐ５３のうちの１つ以上から選択される腫瘍関連抗原をコードしてもよい。

【0258】

これらは、同じまたは異なるｍＲＮＡコンストラクトのいずれかにおいて、上記で考察されたとおりに免疫調節剤、免疫エンハンサー、およびその他のエフェクター化合物をコードする任意の他のｍＲＮＡと共に存在し得る。こうしたアプローチは、効果が増強された抗原性タンパク質を産生するように腫瘍細胞を誘導して、免疫系がそれらの腫瘍細胞をよりよく認識できるようにすることを目的とする。腫瘍細胞に対するこの細胞応答は、癌細胞による免疫調節剤の発現をさらに誘導することでも増強され得る。予防ワクチンに対する上記の考察のとおり、別個のｍＲＮＡコンストラクトを使用して腫瘍関連抗原（またはネオ抗原）および免疫調節成分の両方を提供するとき、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコンストラクトのいずれかが、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を完全に欠いていてもよい。他の場合には、本明細書に記載されるとおり、各ｍＲＮＡコンストラクトは１つ以上の器官保護配列を含んでもよい。これらの器官保護配列は、各ｍＲＮＡコンストラクトについて同じであってもよいし、異なっていてもよい。器官保護配列が異なるとき、これらの器官保護配列は、これらの産物の示差的発現の異なるパターンを支援すること、および／または各産物に対する異なる組織または細胞型に対する保護を拡大することのために選択されてもよい。

【0259】

よって、本発明の特定の実施形態によると、たとえば癌ワクチンなどの癌免疫療法薬と組み合わせて使用するための、たとえば免疫刺激または免疫調節タンパク質またはポリペプチドなどの治療増強因子をコードする本明細書に記載されるｍＲＮＡが提供される。癌ワクチンは、たとえば改変されたヒトまたは霊長類アデノウイルスなどの治療用ウイルスを含んでもよく、かつ免疫刺激または免疫調節タンパク質またはポリペプチドは、生物学的に活性なＩＬ－１２および／またはＧＭ－ＣＳＦを含んでもよい。

【0260】

別の実施形態においては、全体を通して考察されるとおり、腫瘍細胞内での発現または腫瘍細胞による発現のために、ＮＦ－κＢ経路のモジュレーターおよび／または阻害剤をコードする本明細書中に記載されるｍＲＮＡコンストラクトおよび／または組成物が提供される。

【0261】

本発明の組成物および方法は、以下の実施例によって例示されるが、これらに限定されるものではない。

【実施例】

【0262】

ｍＲＮＡコンストラクト
すべてのｍＲＮＡコンストラクトは、生成されたＤＮＡ配列からトリリンク・バイオテクノロジーズ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）によって合成される。これらのｍＲＮＡは、完全にプロセシング、キャッピング、およびポリアデニル化されたｍＲＮＡに類似しており、リボソームによる翻訳の準備ができている。

【0263】

製剤
すべてのｍＲＮＡコンストラクトを、イオン化可能な脂質様物質Ｃ１２－２００、リン脂質ＤＯＰＥ、コレステロール、および脂質アンカーポリエチレングリコールＣ１４－ＰＥＧ２０００－ＤＭＰＥ混合物の多成分ナノ粒子に製剤化する。このＣ１２－２００：ｍＲＮＡの特定の組成および特定の重量比（１０：１）、ならびに脂質様物質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧのモル［％］組成は、インビボでの高いトランスフェクション効率のために最適化したものであり（カウフマン（Ｋａｕｆｆｍａｎ）Ｋ．Ｊ．、ナノ・レター（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒ）。２０１５、１５、７３００－７３０６）、ＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡと称される。製剤を作製するために、脂質成分をエタノールに溶解し、Ｔ接合部混合装置を使用して１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３）に希釈したｍＲＮＡと１：３の比で混合した。製剤を２０ｋＤａ膜透析カセット中でリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に対して室温で４時間透析した。必要なときは、次いでアミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）遠心濾過ユニット（１００ｋＤａカットオフ）を用いて製剤を濃縮した。その後、製剤を特徴付けの準備ができた新しいチューブに移した。リボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）ＲＮＡアッセイ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を製造業者のプロトコルに従って使用して、ｍＲＮＡ封入および濃度の効力を測定する。脂質ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ：Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）およびサイズ（Ｚ_ave）を、動的光散乱（ゼータサイザーナノ－ＺＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ）、マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ））を使用して測定する。

【0264】

製剤を使用して、図２に示されるとおりのマルチウェルプレートアッセイにおいて細胞をトランスフェクトする。約１．５ｐｍｏｌ／ウェルのＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡとなるように製剤を適切に希釈する。アッセイの読み出しは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色（ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅｒ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によって細胞核を染色して細胞密度を決定することによって、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を介してｍＲＮＡの発現を検出するためのものである。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、蛍光顕微鏡（バイオテックのＣｙｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓまたはサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ）を使用してトランスフェクションの２４時間後に定量化した。

【0265】

これらの製剤は、インビボ動物研究において細胞をトランスフェクトするためにも使用される。

【0266】

細胞培養およびトランスフェクション
すべての細胞を、５％ＣＯ₂の存在下で３７℃で増殖させた。培養細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、ＡＭＬ１２、７８６－０、ｈＲＥＣ、ＨＣＴ－１１６）のインビトロ単一トランスフェクションを以下のとおりに実施した。トランスフェクションの１日前に、表７に列挙した推奨完全培地および細胞密度で９６ウェル組織培養処理マイクロウェルプレートに細胞を播種した。翌日、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合しながら、ウェル中の培地にｍＲＮＡ－ＤＭＰ^CTxを直接添加することによって、２００ｕＬの血清減少培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地、Ｇｉｂｃｏ）中で１．５ｐｍｏｌのＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を除去し、完全培地で置換した。

【0267】

【表7】

【0268】

ヒト正常肝細胞（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製品参照番号ＭＴＯＸＨ１０００）のトランスフェクションのために、シグマ推奨の解凍、完全補充プレーティングおよび培養培地（参照記号ＭＥＤ－ＨＨＴＭ、ＭＥＤ－ＨＨＰＭ、ＭＥＤ－ＨＨＰＭＳＰ、ＭＥＤ－ＨＨＣＭ、ＭＥＤ－ＨＨＣＭＳＰ）を使用して、２４ウェルコラーゲンコーティングプレートに２５０，０００細胞／ｍＬの細胞密度で細胞をプレーティングした。５％ＦＢＳを含有する培養培地中で、ｍＲＮＡ－ＤＭＰ^CTxのトランスフェクションを行った。４時間のインキュベーション後、ｍＲＮＡ混合物を除去し、完全補充培地をウェルに戻し加えた。

【0269】

正常成体上皮結腸細胞（セルアプリケーションズ社（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．）、参照番号７３２Ｃｎ－０５ａ）のトランスフェクションのために、ＧＩ上皮細胞解凍溶液およびＧＩ上皮細胞規定培養培地（セルアプリケーションズ社、参照番号７１６ＤＣ－５０および７１６Ｔ－２０）を使用して細胞を解凍し、プレーティングし、培養した。９６ウェルマイクロプレートウェルをＧＩ上皮細胞コーティング溶液（セルアプリケーションズ社、参照番号０２５－０５）で前処理し、ウェル当たり６０，０００細胞を播種した。翌日、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合しながら、ウェル中の培地にｍＲＮＡ－ＤＭＰ^CTxを直接添加することによって、２００ｕＬの血清減少培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地、Ｇｉｂｃｏ）中で１．５ｐｍｏｌのＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を除去し、培養培地で置換した。

【0270】

正常ヒト肺／気管支細胞（ＢＡＥＳ－２Ｂ細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９６０９）のトランスフェクションのために、ＢＥＧＭ気管支上皮ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキット（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））によって補充したＢＥＧＭ培地（ロンザ）中で細胞を増殖させた。細胞を、コラーゲンＩコーティングマイクロウェルプレートに、１ｍＬ当たり７５，０００細胞の密度で播種した。翌日、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合しながら、ウェル中の培地にＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡを直接添加することによって、２００ｕＬの血清減少培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地、Ｇｉｂｃｏ）中で１．５ｐｍｏｌのＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を除去し、培養培地で置換した。

【0271】

蛍光顕微鏡法
トランスフェクションの２４時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素（インビトロジェンのＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬）を用いて細胞核を染色した。蛍光顕微鏡（バイオテックのＣｙｔａｔｉｏｎ機器またはサーモフィッシャーサイエンティフィックのＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬイメージングシステム）を使用して、生細胞において核染色およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を検出した。フィルターキューブのテキサスレッドおよびＤＡＰＩならびに２０倍対物レンズを用いて画像を取得した。

【実施例1】

【0272】

非最適化対最適化ｍｉＲＮＡ標的配列（不一致対一致）
本発明がコンストラクトｍＲＮＡで標的細胞を首尾よくトランスフェクトし、続いて非改変ｍｉＲＮＡ標的配列よりも良好なタンパク質示差的発現を駆動する可能性を調査するために、ｍｉＲＮＡ結合部位によって改変されたＤＭＰ^CTxｍＲＮＡプラットフォームを、ヒト癌細胞株および各器官に対する正常初代細胞を用いたインビトロモデルにおいて最初に評価する。培養細胞におけるトランスフェクションおよび翻訳効率を追跡するために、精製ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを使用する。

【0273】

たとえば、ｍｉＲＮＡ－１２２は、豊富に存在する肝臓特異的ｍｉＲＮＡであり、その発現は、ヒト原発性肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）およびたとえばＨｅｐ３ＢなどのＨＣＣ由来細胞株において有意に減少する。この実施例の研究の目的は、最適化されたｍｉＲＮＡ－１２２標的配列（たとえば変異体２）の挿入によるｍＲＮＡ配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変が、試験されたＨＣＣ細胞株ではなく、正常肝細胞において外因性ｍＲＮＡのより高い翻訳抑制をもたらし得ることを実証することである。その目的のために、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡコンストラクトを、３’－ＵＴＲに少なくとも１つの最適化されていないｍｉＲＮＡ－１２２標的配列（変異体１）または少なくとも１つの最適化された完全一致標的配列（変異体２）を含むように改変した。このｍＲＮＡコンストラクトを、高レベルのｍｉＲＮＡ－１２２を発現することが公知であるマウスＡＭＬ１２正常肝細胞にトランスフェクトする。ｍｉＲＮＡ標的配列を有さないｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡコンストラクトを陽性対照として使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、蛍光顕微鏡（サーモフィッシャーサイエンティフィックのＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ）を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡコンストラクトの単一トランスフェクションの２４時間後に検出した。送達されたコンストラクトの発現を確認するために、ウェスタンブロットまたはたとえば質量分析などのプロテオーム解析技術を含む、代替的な定量方法を使用できる。

【0274】

変異体１［配列番号４］：５’－ＡＡＣＧＣＣＡＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＵＡ－３'（不一致ｍｉＲＮＡ－１２２標的配列）
変異体２［配列番号４４］：５’－ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ－３'（完全一致ｍｉＲＮＡ－１２２標的配列）

【0275】

結果
図９Ｂに示されるとおり、ＭＯＰなしのｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの発現は、ＡＭＬ１２細胞において強い。３’ＵＴＲに単一の不完全一致ｍｉＲＮＡ－１２２標的配列（変異体１）が含まれるとき、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は明らかなままである（図９Ｃを参照されたい。図９Ｄ、右側パネルにおいてｍＣｈｅｒｒｙ発現の大幅な低減が明らかなことから、変異体２を使用した完全一致の効果は明らかである。

【実施例2】

【0276】

ｍｉＲＮＡ標的配列の反復数の効果の比較
本発明がｍＲＮＡコンストラクト中の標的配列の数を増加させることによってより良好な示差的発現を駆動する可能性を調査するために、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを、３’－ＵＴＲに１つ、２つ、または４つの最適化されたｍｉＲＮＡ－１２２ ｍｉＲＮＡ標的配列を含むように改変し、ヒトＨｅｐ３Ｂ癌細胞株および対応する正常ＡＭＬ１２初代細胞において、インビトロで翻訳効率を評価して比較した。ｍｉＲＮＡ標的配列を有さないｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡコンストラクトを陽性対照として使用した。図１に示されるとおり、特異的ヌクレオチド（ｕｕｕａａａなど）を使用してｍｉＲＮＡ－１２２標的配列を連結する。ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡコンストラクトの単一トランスフェクションの２４時間後に、蛍光顕微鏡（サーモフィッシャーサイエンティフィックのＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ）によってｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を検出した。送達されたコンストラクトの発現を確認するために、ウェスタンブロットまたはたとえば質量分析などのプロテオーム解析技術を含む、代替的な定量方法も使用できる。

【0277】

結果
結合部位配列を多重化した結果を図８に示す。ＡＭＬ１２正常肝細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現の抑制には、ある程度の用量依存性があり（ａ）、結合部位配列の２回および４回の反復は、高レベルのｍＣｈｅｒｒｙ抑制を示す。しかし、この効果はＨｅｐ３Ｂ癌細胞ではあまり明らかではなく（ｂ）、ｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルは、ｍｉＲＮＡ結合部位の１回または２回の反復についてほぼ一貫したままであり、４倍多重配列に対する発現がわずかに低減するのみである。

【実施例3】

【0278】

インビトロでの多器官保護方法の概念の証明
本発明が複数の異なるレシピエント細胞型における特定のＯＲＦの示差的発現を実証する可能性を調査するために、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを、３’ＵＴＲに３つまたは５つのｍｉＲＮＡ標的配列を含むように改変した。第１のｍＲＮＡ配列において、ｍｉＲＮＡ－１２２、Ｌｅｔ７ｂ、およびｍｉＲＮＡ－１９２に対する標的配列が提供され（ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰ）、第２のｍＲＮＡ配列において、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２４ａ、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－３７５、およびｍｉＲＮＡ－１９２に対する標的配列が提供される（ｍＣｈｅｒｒｙ－５ＭＯＰ）。ｍｉＲＮＡ標的配列を有さない対照ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ配列も使用した。

【0279】

調製されたｍＲＮＡ配列を上記のとおりにナノ製剤化した。調製されたナノ粒子を、ヒト正常肝細胞（シグマ製品参照番号ＭＴＯＸＨ１０００）、マウス正常肝細胞（ＡＴＣＣのＡＭＬ１２）、およびヒト肝臓癌細胞（ＡＴＣＣのＨｅｐ３Ｂ）に対応する細胞株にトランスフェクトした（図２）。加えて、正常ヒト腎細胞（ＡＴＣＣのｈＲＥＣ）に対応する細胞株を、ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰ ｍＲＮＡおよび対照ｍＣｈｅｒｒｙ ＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を２４ウェルプレートに播種した。ウェル当たり０．５ｕｇのｍＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にＣｙｔａｔｉｏｎ ５機器（バイオテック）を用いてイメージングを行った。

【0280】

図３は、３つの肝細胞型におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示しており、ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ－５ＭＯＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたときに、対照ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをトランスフェクトした後のヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）または正常細胞において見出されるシグナルと比較して、正常マウスおよびヒト肝細胞の両方における細胞シグナルが有意に低減することを実証している。これは、ｍｉＲＮＡ標的配列の包含の結果として、正常細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ翻訳が低減したことを示す。図４は、バイオテックのＧｅｎ５イメージングソフトウェアを使用した、トランスフェクト細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の定量化を示す。バックグラウンドシグナルを差し引いている。値は、細胞当たりの蛍光シグナルの平均および標準偏差を表す。評価されたｍＲＮＡを対照と比較したときの統計的有意差は、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．００５として示される。この結果は、３ＭＯＰまたは５ＭＯＰ ｍｉＲＮＡ標的配列を使用したときに正常肝細胞（ヒトおよびマウス）におけるタンパク質発現が約８０％低減するのに対し、腫瘍細胞ではより少ない低減が見られることを実証する。

【0281】

図５Ａは、トランスフェクトされた正常ヒト腎細胞（ｈＲＥＣ ＡＴＣＣ－ＰＣＳ－４００－０１２）におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す。ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰ処理細胞においてシグナルの低減を見ることができ、これはｍＣｈｅｒｒｙ翻訳の低減を示す。図５Ｂにおいて、バイオテックのＧｅｎ５イメージングソフトウェアを使用してこれを定量化しており、これも同様に、ｍＣｈｅｒｒｙ－３ＭＯＰによるトランスフェクション後の正常腎細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルの約６０％の低減を示す。図５Ｂでは、バックグラウンドシグナルが差し引かれており、値は細胞当たりの蛍光シグナルの平均および標準偏差を表す。評価されたｍＲＮＡを対照と比較したときの統計的有意差は、^*Ｐ＜０．０５として示される。

【0282】

図６は、３ＭＯＰ配列の代替的な配置を用いた肝細胞における実験の結果を示す。この場合の３ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１９２、およびｍｉＲＮＡ３０ａに完全一致したｍｉＲＮＡ結合部位を含む。認識可能な発現が見られない図６（ｆ）のマウスＡＭＬ１２肝細胞と比較したとき、図６（ｃ）においてＨｅｐ３Ｂ癌細胞における発現が明らかに見られる。

【0283】

図７は、３ＭＯＰ配列の別の代替的配置の結果を示す。この場合の３ＭＯＰ配列は、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ１２６、およびｍｉＲＮＡ３０ａに完全一致したｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ここでも、認識可能な発現が見られない図７（ｆ）のマウスＡＭＬ１２肝細胞と比較したとき、図７（ｃ）においてＨｅｐ３Ｂ癌細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現が明らかに見られる。

【0284】

図１０は、図７の実験で使用したものと同じ３ＭＯＰ配列（ｍｉＲＮＡｌｅｔ７ｂ－ｍｉＲＮＡ１２６－ｍｉＲＮＡ３０ａ）についての腎臓における組織および器官特異的保護の効果を実証する。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ｈＲＥＣヒト腎細胞においてほぼ完全に抑制される（図１０（ｆ））が、７８６－０腎腺癌細胞では抑制されない（図１０（ｃ））。図１１において、代替的な３ＭＯＰ配列を試験している（ｍｉＲＮＡ１２２－ｍｉＲＮＡ１９２－ｍｉＲＮＡ３０ａ）。図１０および図１１で試験したＭＯＰ配列は両方とも、腎臓を保護するｍｉＲＮＡ３０ａに対する完全一致結合配列を含むが、後者の３ＭＯＰは、腎臓保護の推定二重層を提供する完全一致ｍｉＲＮＡ－１９２結合部位をさらに含む（上記表２を参照されたい）。図１１において、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ｈＲＥＣヒト腎細胞では見えない（図１１（ｆ））が、７８６－０腎腺癌細胞では明らかに明確である（図１１（ｃ））。

【0285】

図１３は、図１１の実験で使用したものと同じ３ＭＯＰ配列（ｍｉＲＮＡ１２２－ｍｉＲＮＡ１９２－ｍｉＲＮＡ３０ａ）についての結腸における組織および器官特異的保護の効果を実証する。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ヒト結腸上皮細胞においてほぼ完全に抑制される（図１３（ｃ））が、ＨＣＴ－１１６細胞においては抑制されない（図１３（ｆ））。図１４において、代替的な３ＭＯＰ配列を試験している（ｍｉＲＮＡｌｅｔ７ｂ－ｍｉＲＮＡ１２６－ｍｉＲＮＡ３０ａ）。図１４で試験したＭＯＰ配列は、結腸組織を広く保護するＬｅｔ７ｂに対する完全一致結合配列を含む。図１４において、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、結腸上皮細胞（図１４（ｃ））およびＨＣＴ－１１６細胞（図１４（ｆ））においても非常に低減している。

【0286】

図１５は、ｍｉＲＮＡｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ１２６、およびｍｉＲＮＡ３０ａに対する結合部位を含むＭＯＰ配列を使用した、肺における組織および器官特異的保護の効果を実証する。上記の他のアッセイと同様に、健常な非癌性ヒト肺組織の最も近い近似を表す気管支上皮細胞株であるＢＥＡＳ－２Ｂ細胞株を選択した。ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞は、複製欠損ＳＶ４０／アデノウイルス１２ハイブリッドによる感染を介して不死化されるが、これは取り扱いおよびクローニングの改善を可能にするためである。これらの細胞は、正常に機能する肺上皮のモデルとしての扁平上皮細胞の分化を研究するためのアッセイにおいて使用される。図１５（ｃ）において、ＭＯＰ配列の存在は、ＭＯＰの不在と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の非常に高レベルの抑制をもたらす。

【0287】

図７（ｆ）、１０（ｆ）、１４（ｃ）、および１５（ｃ）に示される結果は、ｍｉＲＮＡｌｅｔ７ｂ－ｍｉＲＮＡ１２６－ｍｉＲＮＡ３０ａ ＭＯＰ配列の包含が、健常な肝臓、腎臓、結腸、および肺における関連ＯＲＦ発現からの有効な保護を提供することを示す。図６（ｆ）、１１（ｆ）、および１３（ｃ）の結果は、ｍｉＲＮＡ１２２－ｍｉＲＮＡ１９２－ｍｉＲＮＡ３０ａ結合配列を含む代替的なＭＯＰが、健常な肝臓、腎臓、および結腸組織に対して有効な保護を提供することを示す。

【0288】

この実施例は、複数の異なるｍｉＲＮＡ標的配列を含む器官保護配列が、複数の異なる器官に由来する細胞において示差的発現を駆動するように作用することもでき、かつ複数の組織において正常細胞と腫瘍細胞とを区別できることを実証する。

【実施例4】

【0289】

ＩＬ－１２およびＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡによるヒトＰＢＭＣのトランスフェクション
ＩＬ－１２および／またはＧＭ－ＣＳＦは、たとえば治療用ウイルスと組み合わせた使用、またはワクチン組成物と同時投与されるアジュバントとしての使用など、抗腫瘍療法と組み合わせて使用され得る免疫調節サイトカインである。この実験では、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さない、ＤＭＰ^CTxｈＧＭ－ＣＳＦ（ヒトＧＭ－ＣＳＦ）およびｈｄｃＩＬ－１２（二本鎖ヒトＩＬ－１２ ｐ７０）またはｈｓｃＩＬ－１２（単鎖ヒトＩＬ－１２ ｐ７０）を、ヒトＰＢＭＣにある範囲の投与量でインビトロで投与した。ｈｓｃＩＬ－１２ ｐ７０およびｈＧＭＣＳＦに対する非コードｍＲＮＡも陰性対照（ＮＣ：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。細胞内のタンパク質の発現は、投与されたｍＲＮＡの用量に関連することが示された。

【0290】

ＬＮＰ－免疫調節剤ＩＬ－１２およびＧＭ－ＣＳＦのインビトロトランスフェクション効率および毒性
５人の異なるドナー（１８～５５歳）由来のＰＢＭＣ細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓから入手し、ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁して３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で培養した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たり３００，０００のＰＢＭＣ細胞を播種し、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さない、ＩＬ－１２一本鎖もしくは二本鎖変異体またはＧＭ－ＣＳＦのいずれかをコードするＤＭＰ^CTx製剤化ｍＲＮＡでトランスフェクトした（以下の表８を参照）。１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように培地に添加されたＬＰＳ（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、００－４９７６）を伴う３００，０００ＰＢＭＣ細胞を含有するウェルによって、ＰＢＭＣが正常に機能していることを検証するための陽性対照を実施した。ＰＢＭＣ細胞もＬＮＰトランスフェクションも有さないウェル（ＢＧ－Ｃ）、１５０，０００の非トランスフェクトＰＢＭＣ細胞のみを有するウェル（ＬＣ）、および３００，０００の非トランスフェクトＰＢＭＣ細胞を有するウェル（ＨＣ）によって、並行して陰性対照を実施した。

【0291】

トランスフェクションの４時間後、ヒトＡＢ熱不活性化血清（シグマ）を最終濃度１％になるように添加した。トランスフェクションの６時間後、６０μＬの各ウェルの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、細胞を遠心分離によって除去し、上清をＭＳＤアッセイのために－８０℃で凍結した。トランスフェクションの２１時間後、Ｔｗｅｅｎ－２０を最終濃度１．１％になるようにＨＣウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、各ウェルからのすべての上清を遠心分離によって収集した。６０μＬの上清をＭＳＤアッセイのために－８０℃で凍結し、残りの１３０μＬをＬＤＨアッセイのために－８０℃で凍結した。

【0292】

Ｕ－ＰＬＥＸアッセイ（メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ））を使用し、製造業者の指示に従って、ヒトサイトカインＩＬ－１２ｐ７０およびＧＭ－ＣＳＦ分析のためのＭＳＤアッセイを行った。グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータを棒グラフにプロットした。

【0293】

ロシェ（Ｒｏｃｈｅ）の細胞毒性検出キットＰＬＵＳ（ＬＤＨ）（４７４４９２６００１）を使用し、製造業者の指示に従ってＬＤＨアッセイを行った。

【0294】

結果
図１２は、トランスフェクションの６時間後のＭＯＰ含有コンストラクトから検出可能なレベルのヒトＩＬ－１２ ｐ７０およびＧＭ－ＣＳＦの両方を示す。ｍＲＮＡ中のＭＯＰの存在によって、肝臓、皮膚、筋肉、および腎臓組織におけるオフターゲット発現が最小限になる。ＬＤＨアッセイは、ＩＬ－１２一本鎖もしくは二本鎖変異体またはＧＭ－ＣＳＦのいずれかをコードするＤＭＰ^CTxｍＲＮＡが、ＰＢＭＣにおいて陰性対照を上回る有意な細胞傷害性を誘導しなかったことを示した。この結果は、２４時間後に再度チェックしたときも一貫していた（データは示さず）。

【0295】

【表8】

【実施例5】

【0296】

ＭＯＰ配列を有するルシフェラーゼ発現ｍＲＮＡのＤＭＰ^CTxのインビボ体内分布
本発明がインビボでの特定のＯＲＦの示差的発現を実証する可能性を調査するために、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ：ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡコンストラクトの３’ＵＴＲにおける３つのｍｉＲＮＡ標的配列の２つの異なる組み合わせを含むように、実施例３と同様に改変した。第１のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（グループ２）。第２のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（グループ３）。すべてのＭＯＰコンストラクトは、対応するｍｉＲＮＡに対する完全一致標的配列を含有した。コンストラクト中にＭＯＰ配列を有さない対照ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ配列も使用した（グループ１）。溶媒群にはリン酸緩衝食塩水を投与した。

【0297】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0298】

【表9】

【0299】

動物。 すべての実験は、すべての現地の規則および規制に従って、クラウンバイオサイエンス（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ノッティンガム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）ＵＫで実施した。すべてのマウスをチャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から入手した。

【0300】

非腫瘍性体内分布研究。 ７～９週齢の健常な雌ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さないホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードする１ｍｇ／ｋｇの製剤（ＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡ）を、ボーラス尾部静脈注射によって注射した。全身画像を投与前（０時間）、ならびに投与後３．５時間および２４時間に撮影し、リビング・イメージ・ソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）ＬＳ、ＵＳ）を使用してルシフェラーゼシグナルの量を定量化した。イメージングの１５分前に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのｄ－ルシフェリンを（皮下）注射し、次いで１０分後に麻酔し、発光検出のためのイメージングチャンバーに入れた（腹側および背側のビュー）。２４時間の時点で、肝臓、腎臓、脾臓、および肺を取り出し、エクスビボでイメージングした。

【0301】

腫瘍体内分布研究。ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ細胞）（２×１０⁶細胞）を、８～１０週齢のフォックス・チェイス（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ）ＳＣＩＤマウスの左側腹部に皮下移植した。マウスを、腫瘍量のキャリパー測定に基づいて研究グループに分類し、約１００ｍｍ³の腫瘍サイズを選択した。次いで、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さないホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードする製剤（ＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡ）を、１ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍内注射した。全身画像を投与前（０時間）、ならびに投与後３．５時間および２４時間に撮影し、リビング・イメージ・ソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）ＬＳ、ＵＳ）を使用してルシフェラーゼシグナルの量を定量化した。イメージングの１５分前に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのｄ－ルシフェリンを（皮下）注射し、次いで１０分後に麻酔し、発光検出のためのイメージングチャンバーに入れた（腹側および背側のビュー）。２４時間の時点で、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、および肺を取り出し、エクスビボでイメージングした。

【0302】

結果
図１６（ａ）は、静脈内投与による投薬の３．５時間後に、ＭＯＰ含有コンストラクト（グループ２および３）ならびにＭＯＰコンストラクトなしの対照群（グループ１）を含むすべてのグループにおいて、全身イメージングを通して高レベルのルシフェラーゼ発現が見られ得ることを示す。しかし、２つのＭＯＰ含有コンストラクトではタンパク質発現が１～２桁少ない。この傾向は２４時間後も残り、ここではすべてのグループにおいて全体的なタンパク質発現がわずかに少なくなっている。

【0303】

ＭＯＰの存在は、肝臓、肺、脾臓、および腎臓の組織におけるインビボのオフターゲット発現を最小化するのに驚くほど有効である。図１６（ｂ）において、器官のエクスビボイメージングは、グループ１（ＭＯＰなし対照）と比較して、グループ２および３（ＭＯＰ含有コンストラクト）のマウスについて、肝臓（ｍｉＲＮＡ－１２２）、肺（ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲ３０ａ）、脾臓（Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６）、および腎臓（ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ）におけるルシフェラーゼ発現の減少を示し、両方のＭＯＰコンストラクトがＯＲＦの発現からの有益な多器官保護を提供することが確認される。

【0304】

健常な組織におけるオフターゲット効果を最小限にすることが重要であるが、タンパク質発現がたとえば腫瘍などの標的組織において依然として生じることを確実にすることも重要である。表１０は、Ｈｅｐ３Ｂ肝臓腫瘍が存在するときに、タンパク質発現が３つのグループすべてについて同じ桁の大きさで維持されたことを示す。加えて、腫瘍を有さないインビボ研究において見られたとおり、健常な肝臓におけるルシフェラーゼ発現は、いずれかのＭＯＰが存在するときに２～３桁減少する。

【0305】

【表10】

【0306】

図１７は、投与の２４時間後に、ＭＯＰ含有コンストラクト（グループ２および３）およびＭＯＰコンストラクトなしの対照群（グループ１）を含むすべてのグループの腫瘍組織において、エクスビボイメージングを通して高レベルのルシフェラーゼ発現が見られ得ることを示す。図１７（ａ）は、マウスにおける腫瘍体積が各グループにおいて類似していたことを示す。図１７（ｂ）は、投薬の２４時間後に、健常な肝臓組織（正常な肝臓）においてＭＯＰコンストラクトなしの対照群（グループ１）について高いルシフェラーゼ発現が見られ、ＭＯＰ含有コンストラクト（グループ２および３）を使用すると発現が２～３桁低減したことを示す。他の器官ではほとんど発現が見られない（データは示さず）。

【実施例6】

【0307】

筋肉内（ＩＭ：ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）投与後のＭＯＰ配列を有するルシフェラーゼ発現ｍＲＮＡのＤＭＰ^CTxのインビボ体内分布
この実験は、実施例５で取ったアプローチと同様である。しかし、ほとんどのワクチン組成物は筋肉内注射（ＩＭ）を介して投与されるので、ＩＭ投与後にインビボでＦＬｕｃ ＯＲＦの示差的発現をもたらす体内分布を実証することが必要であった。ｍＲＮＡを実施例５と同様に改変したが、今回は、ｍＲＮＡコンストラクトの３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ標的配列の３つの異なる組み合わせを含ませるように改変した。第１のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ１）。第２のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ２）。第３のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ３）。すべてのＭＯＰコンストラクトは、対応する細胞ｍｉＲＮＡに対する完全一致標的配列を含有した。コンストラクト中にＭＯＰ配列を有さない対照ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ配列も使用した（Ｌｕｃ）。ｍＲＮＡカーゴを有さない対照群も含まれ、ここではマウスにリン酸食塩緩衝液（溶媒）を投与した。

【0308】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0309】

【表11】

【0310】

７～９週齢の健常な雌ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さないホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードする１０ｕｇの製剤（ＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡ）をＩＭ注射によって注射した。イメージングの１５分前に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのｄ－ルシフェリンを（皮下）注射し、次いで１０分後に麻酔し、発光検出のためのイメージングチャンバーに入れた（腹側および背側のビュー）。４時間の時点で、肝臓、腎臓、脾臓、ならびに注射部位の筋肉および皮膚を取り出し、エクスビボでイメージングした。

【0311】

結果
図１９において、器官のエクスビボイメージングは、すべてのグループについて肝臓（ｍｉＲＮＡ－１２２）におけるルシフェラーゼ発現の減少を示す。脾臓（Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６）では、Ｌｕｃ－ＭＯＰ１が最も効果を示した。腎臓（ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ）では、すべてのＭＯＰ含有ｍＲＮＡが発現低下の傾向を示した。注射部位では、Ｌｕｃ－ＭＯＰ１はルシフェラーゼの産生を低減させたが、他のＭＯＰは低減させなかった。この結果は、異なるＭＯＰコンストラクトが、必要に応じて変動され得るＯＲＦの発現からの有益な多器官保護を提供することを確認するものである。

【実施例7】

【0312】

静脈内（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）投与後のＭＯＰ配列を有するルシフェラーゼ発現ｍＲＮＡのＤＭＰ^CTxのインビボ体内分布
この実験は、実施例５で取ったアプローチと同様である。多器官保護を評価するために、本発明者らは、ＤＭＰ^CTx製剤を静脈内投与して、器官内の高い送達およびシグナルを確実にした。ｍＲＮＡを実施例６と同様に改変した。第１のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６、およびｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ１）。第２のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ２）。第３のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（Ｌｕｃ－ＭＯＰ３）。すべてのＭＯＰコンストラクトは、対応する細胞ｍｉＲＮＡに対する完全一致標的配列を含有した。コンストラクト中にＭＯＰ配列を有さない対照ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ配列も使用した（Ｌｕｃ）。ｍＲＮＡカーゴを有さない対照群も含まれ、ここではマウスにリン酸緩衝食塩水（溶媒）を投与した。

【0313】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0314】

【表12】

【0315】

７～９週齢の健常な雌ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さないホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードする１ｍｇ／ｋｇの製剤（ＤＭＰ^CTx－ｍＲＮＡ）を、ボーラス尾部静脈注射によって注射した。投与６時間後に全身画像を撮影し、リビング・イメージ・ソフトウェア（キャリパーＬＳ、ＵＳ）を使用してルシフェラーゼシグナルの量を定量化した。イメージングの１５分前に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのｄ－ルシフェリンを（皮下）注射し、次いで１０分後に麻酔し、発光検出のためのイメージングチャンバーに入れた（腹側および背側のビュー）。６時間の時点で、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、膵臓、および肺を取り出し、エクスビボでイメージングした。

【0316】

結果
ＭＯＰの存在は、ここでも肝臓、肺、脾臓、膵臓、心臓、および腎臓の組織におけるインビボのオフターゲット発現を最小化するのに驚くほど有効である。図２０において、器官のエクスビボイメージングは、Ｌｕｃグループ（ＭＯＰなし対照）と比較して、ＭＯＰ含有コンストラクト（Ｌｕｃ－ＭＯＰ１、Ｌｕｃ－ＭＯＰ２、およびＬｕｃ－ＭＯＰ３）を投与されたグループのマウスについて、肝臓（ｍｉＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲ３０ａ）、脾臓（Ｌｅｔ７ｂ、ｍｉＲＮＡ－１２６）、膵臓（ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー、Ｌｅｔ７ファミリー、ｍｉＲＮＡ－１２２）、心臓（ｍｉＲＮＡ－３０ファミリー、ｍｉＲＮＡ－１２６、Ｌｅｔ７ファミリー）、および腎臓（ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａ）におけるルシフェラーゼ発現の減少を示し、すべてのＭＯＰコンストラクトがＯＲＦの発現からの有益な多器官保護を提供することが確認される。

【実施例8】

【0317】

抗原特異的免疫応答のインビボ評価
本発明による組成物がワクチンとして作用する能力を調査し、同時投与されたサイトカインのアジュバント効果を実証するために、特定の外因性抗原、この場合は卵白タンパク質であるオボアルブミン（ＯＶＡ：ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）に対する抗体応答を生じさせる研究をインビボで行った。

【0318】

この実験のために、先に記載したとおりのナノ粒子組成物ＤＭＰ^CTxにｍＲＮＡコンストラクトを封入した。使用した組成物は、オボアルブミンタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－ＯＶＡ）、およびＭＯＰ配列を有するマウス単鎖ＩＬ－１２タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－ｍｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰ）であった。使用されるときのＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する完全一致結合部位を含んだ（配列番号６８を参照）。

【0319】

【表13】

【0320】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0321】

【表14】

【0322】

６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスを、試験－１日目に体重によって各々４つのグループに無作為化した。０日目に、マウスの左大腿部に以下のものを５０μｌ筋肉内注射した。
３μｇのＤＭＰ^CTx－ＯＶＡ（グループ２、ＬＮＰ－ＯＶＡ）；
３μｇのＤＭＰ^CTx－ＯＶＡおよび５μｇのＩＬ－１２コンストラクトの用量のＤＭＰ^CTx－ｍｓｃＩＬ－１２（グループ３；ＬＮＰ－ＯＶＡ＋ＩＬ１２）；
１０μｇのＤＭＰ^CTx－ＯＶＡ（グループ４；ＬＮＰ－ＯＶＡ）（
対照グループ１には、試験０日目にのみ、左大腿に溶媒のリン酸緩衝食塩水５０μｌの筋肉内注射を行った。

【0323】

試験１４日目に、末端心臓穿刺によって血液を採取し、遠心分離（９０秒、ＲＴ、１０．０００×ｇ）によって血清を単離し、アリコートを凍結した。製造業者の指示（コンドレックス（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ））に従って、収集した血清をマウス抗ＯＶＡ ＩｇＧの検出のために処理した。

【0324】

結果
図１８は、実験の結果を示す。低用量の３μｇのｍＲＮＡでは、ＤＭＰ^CTx－ＯＶＡ（オボアルブミン）は、１匹のマウスレスポンダーのみで弱い応答を誘導した。この応答は、ｍＲＮＡの投与量を３倍を超える１０μｇまで増加させることによって実質的に増加する。しかし、アジュバントとしての炎症誘発性サイトカインＩＬ１２と一緒に低用量のオボアルブミンを同時投与した結果、レスポンダーの数が有意に改善した。これは、低用量の抗原応答が、同時投与されたＩＬ－１２の存在によってインビボでブーストされ得ることを示す。

【0325】

これらの結果は、所与の標的に対するＩｇＧ抗体応答が誘導され得ることを実証する。オボアルブミンが病原体特異的抗原でないことを考慮すると、これによって、この結果が介入の結果であり、任意の提供された外因性ポリペプチド抗原に適用可能なはずであることも実証される。ＩＬ－１２のインビボ投与は全身投与ではなく、ＭＯＰ配列によって制御されており、それによって炎症誘発性分子のオフターゲット発現が低減されていたため、この結果はさらに驚くべきものである。

【実施例9】

【0326】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的免疫応答のインビボ評価
本発明による組成物が特定の病原性標的に対するワクチンとして作用する能力、すなわちウイルス抗原に対するインビボ免疫応答を誘発する能力をさらに調査するために、マウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物、および免疫調節サイトカインＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物を注射した（先の実施例８に記載したとおり）。組成物に対するマウスの液性免疫応答を試験した。

【0327】

この実験のために、先に記載したとおりのナノ粒子組成物にｍＲＮＡコンストラクトを封入した。使用した組成物は、抗原としての配列番号６３に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－Ｓｐｉｋｅ ＣｏＶ）、およびアジュバントとしての配列番号６８に示されるマウス単鎖ＩＬ－１２タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－ｍｓｃＩＬ－１２）であった。両方とも、３’ＵＴＲにＭＯＰＶ（ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａ）配列を含む。

【0328】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0329】

【表15】

【0330】

Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを、試験０日目に体重によって各々３つのグループに無作為化した。０日目および１４日目に、マウスの左大腿部に以下のものを５０μｌ筋肉内注射した。ＤＭＰ^CTx－Ｓｐｉｋｅ ＣｏＶ（０日目のＬＮＰ－スパイク用量１μｇおよび１４日目のブースト１０μｇ － いわゆる１／１０投与計画）；
またはＤＭＰ^CTx－Ｓｐｉｋｅ ＣｏＶ（０日目のＬＮＰ－スパイク用量１μｇおよび１４日目のブースト１０μｇ － いわゆる１／１０投与計画）およびＩＬ－１２コンストラクトＤＭＰ^CTx－ｍｓｃＩＬ１２（０日目および１４日目に１ｕｇ）。対照群には、試験０日目および１４日目に、左大腿に溶媒のリン酸緩衝食塩水５０ｕｌの筋肉内注射を行った。

【0331】

試験４２日目（プライム後４２日およびブースト後２８日）に、すべてのグループから末端心臓穿刺によって血液を採取し、遠心分離（９０秒、ＲＴ、１０．０００×ｇ）によって血清を単離し、アリコートを凍結して－８０℃で保存した。採取した血清中の抗スパイク抗体を検出するために、マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡキット（アクロバイオシステムズ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ＃ＲＡＳ－Ｔ０２３）を製造業者の指示に従って使用した。

【0332】

結果
図２１は、ＩＬ１２が添加された際にスパイクタンパク質に応答したＩｇＧ産生の明確な増加があることを示す。

【0333】

これらの結果は、アジュバントとしてのＩＬ－１２免疫調節サイトカインのインビボでの添加が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原に対する免疫応答の発生に有利であることを実証する。この応答は、抗原およびアジュバントの両方が、抗原およびアジュバントの両方の全身性／オフターゲット産生を低減させるＭＯＰ配列の制御下でｍＲＮＡとして投与された場合でさえ、驚くほど良好に維持される。ＩＬ－１２が投与からわずか６時間でヒトＰＢＭＣにおいて産生され得ることを示した、実施例４に示されるインビトロデータ（図１２（ａ）を参照）と組み合わせると、ワクチンおよびアジュバントの投与から比較的短時間で、ＭＯＰ配列を含むワクチンおよびアジュバント組成物から防御免疫応答が生じ得ることが明らかにさらに示される。

【実施例10】

【0334】

ヒトＩＬ－１２によるヒトＰＢＭＣのインビトロトランスフェクション
本発明による組成物がワクチンアジュバントとして作用する能力をさらに調査するために、本発明者らは、ＭＯＰを有する／有さないＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をトランスフェクトし、インターフェロンガンマのＩＬ－１２介在性誘導を測定した。

【0335】

４人の異なるドナー由来のＰＢＭＣ細胞をステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手し、ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁して３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。丸底９６ウェルプレートにおいてウェル当たり３００，０００のＰＢＭＣ細胞を播種し、ＭＯＰ配列を有するかまたは有さないＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２単一でトランスフェクトした。第１のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（ＭＯＰＶ）。第２のｍＲＮＡ ＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１９２、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含有する（ＭＯＰＣ）。すべてのＭＯＰコンストラクトは、対応する細胞ｍｉＲＮＡに対する完全一致標的配列を含有した。３用量の（ＭＯＰを有するかまたは有さない）ＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２を使用した。トランスフェクトされていないＰＢＭＣ、またはヒト単鎖ＩＬ－１２非コードｍＲＮＡ（ｈＩＬ－１２ ＮＣ－ＡＴＧ開始コドンなし）でトランスフェクトされたＰＢＭＣによって、並行して陰性対照を実施した。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートした。

【0336】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0337】

【表16】

【0338】

トランスフェクションの４時間後、ヒトＡＢ熱不活性化血清（バレーバイオメディカル（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））を最終濃度５％になるように添加した。トランスフェクションの２４時間後、１００μＬの各ウェルの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、細胞を遠心分離によって除去し、上清をヒトＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡアッセイ（インビトロジェン、カタログ８８－７１２６）のために－８０℃で凍結した。トランスフェクションの７２時間後、１００μＬの各ウェルの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、細胞を遠心分離によって除去し、上清をインターフェロンガンマＥＬＩＳＡアッセイ（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）カタログ４３０１１６）のために－８０℃で凍結した。ヒトＩＬ－１２ｐ７０およびヒトインターフェロンガンマのＥＬＩＳＡアッセイを、製造業者の指示に従って行った。グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータを棒グラフにプロットした。

【0339】

結果
図２２ａは、ＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２産物でトランスフェクトしたヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ－１２の用量依存的発現を示す。図２２ｂ（各ドナーを別々に示す）は、自然免疫および適応免疫の両方に重要な免疫刺激性サイトカインであるＩＦＮ－γのＩＬ－１２介在性誘導を示す。ＩＬ－１２介在性ＩＦＮ－γ発現の大きさはドナー間で変動するが、ＩＬ－１２の存在とＩＦＮ－γ発現との間には明らかな相関がある。

【実施例11】

【0340】

ヒトＩＬ－１２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクによるヒトＰＢＭＣのインビトロトランスフェクション
本発明による組成物が自然免疫応答および適応免疫応答を活性化する能力、すなわちインターフェロンガンマを誘導する能力をさらに調査するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物、および免疫調節剤ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をトランスフェクトした。

【0341】

この実験のために、上記のとおりのナノ粒子組成物にｍＲＮＡコンストラクトを封入した。使用した組成物は、ＭＯＰ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－ＳＣｏＶ－ＭＯＰＶ）、およびＭＯＰ配列を有するかまたは有さないヒト単鎖ＩＬ－１２タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物（ＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２）（ＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰＶ）であった。使用されるときのＭＯＰ配列は、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１、ｍｉＲＮＡ－２０３ａ、ｍｉＲＮＡ－３０ａに対する標的配列を含んだ（ＭＯＰＶ）。

【0342】

製剤は上記のとおりに作製され、以下の特徴を有した。

【0343】

【表17】

【0344】

５人の健常なドナーのＰＢＭＣを、ＤＭＰ^CTx－ＳＣｏＶ－ＭＯＰで、ＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２およびＤＭＰ^CTx－ｈｓｃＩＬ－１２－ＭＯＰＶを伴うかまたは伴わずにトランスフェクトした。すべてのＰＢＭＣを抗ＣＤ３コーティングプレート上に播種し、可溶性抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で処理して、一般的なＴ細胞活性化を誘導した。トランスフェクションの５日後、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γ定量のために上清を回収した。

【0345】

０日目に、ＰＭＢＣ（３００ ０００細胞）を播種し、ナノ粒子組成物または滅菌ＰＢＳを添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートした。１０μｌのヒトＡＢ血清（ｈＡｂ）を、総容量２００μｌおよび総ｈＡｂ血清濃度５％となるように添加した。

【0346】

５日目に、上清を以下のとおりに回収した。プレートをＲＴで５分間、３００×ｇで遠心沈殿させた。上清をＶ底９６ウェルプレートに移し、ＲＴで５分間、４００×ｇで回転させた。上清を新しいＶ底９６ウェルプレートに移し、－８０℃で保存した。メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（ＭＳＤカタログＫ１５１ＴＴＫ－２）によるＩＦＮガンマ発現の読み出しを、製造業者の指示に従って行った。

【0347】

結果
図２３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）発現が、ＭＯＰを有するおよび有さないヒトＩＬ－１２を発現するｍＲＮＡの存在下で同様に増加することを示す。適応免疫応答の出現前に発生する、免疫化後のＩＦＮ－γの早期合成は、ワクチンに対する高品質免疫応答の徴候である。なぜなら、その早期放出は、樹状細胞の成熟を助け、その結果としてＣＤ４⁺Ｔ細胞のＴ_H１系統への極性化を助けるからである。

【0348】

本明細書において本発明の特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは例として、例示のみを目的として行われたものである。前述の実施形態は、以下に添付される請求項の範囲を限定することを意図するものではない。請求項によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対してさまざまな置換、変更、および修正を行ってもよいことが、本発明者らによって予期される。本発明の実施形態によるコンストラクトおよびベクターに含まれている任意の非ヒト核酸および／またはポリペプチド配列は、英国、米国および欧州連合内の供給源から得られたものである。本発明者の知る限りでは、アクセスおよび利益共有契約の対象となり得る遺伝的資源、または関連する従来の知識は、本発明の創出において使用されていない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A-C】

【図6D-F】

【図7A-C】

【図7D-F】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A-C】

【図10D-F】

【図11A-C】

【図11D-F】

【図12A】

【図12B】

【図13A-C】

【図13D-F】

【図14A-C】

【図14D-F】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【配列表】

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【国際調査報告】