特表2023-536962重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－２）、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-30
(54)【発明の名称】重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－２）、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20230823BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20230823BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20230823BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230823BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230823BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230823BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6888 Z ZNA
C12Q1/70
C12M1/00 A
C12M1/34 B
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023507728
(86)(22)【出願日】2021-08-04
(85)【翻訳文提出日】2023-02-03
(86)【国際出願番号】 EP2021071733
(87)【国際公開番号】W WO2022029157
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】63/062,105
(32)【優先日】2020-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】レンチエン ホアン
(72)【発明者】
【氏名】チンタオ スン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB13
4B029FA01
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS32
4B063QX02
(57)【要約】
生物学的試料又は非生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在の迅速検出のための方法が記載されている。これらの方法は、ポイントオブケア設定で迅速に実施されるように適合されている。本方法は、増幅する工程、ハイブリダイズする工程、及び検出する工程を実施することを含み得る。具体的には、この標的の検出用に設計された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするプライマー及びプローブが提供される。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするプライマー及びプローブを含むキット及び反応容器が提供される。さらに、生物学的試料又は非生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの存在又は非存在の同時の迅速検出のための方法、キット及び反応容器が記載されている。
【選択図】図４Ａ
【選択図】図４Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）核酸を検出する方法であって、前記方法が、ａ）標的核酸が前記試料中に存在する場合、１つ以上の増幅産物を生成するのに適した条件下で、前記試料を少なくとも第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットと接触させることと、
ｂ）１つ以上の増幅産物が存在する場合、第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブの少なくとも一方からシグナルを生成するのに適した条件下で、前記試料を少なくとも前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブと接触させることと、
ｃ）工程ｂ）で生成された前記シグナルを検出することであって、前記１つ以上の増幅産物の存在が前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在を示し、前記１つ以上の増幅産物の非存在が前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の非存在を示す、工程ｂ）で生成された前記シグナルを検出することと
を含み、
前記第１のプライマーセットが、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、
前記第２のプライマーセットが、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、
前記第１の検出可能なプローブが、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第２の検出可能なプローブが、配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を検出する方法。
【請求項2】
前記第１のプライマーが、配列番号１～３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
少なくとも前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブの各々が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されており、工程ｃ）が、少なくとも前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブの前記ドナー蛍光部分と前記対応するアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在が前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在又は非存在を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブの各々の前記ドナー蛍光部分及び前記対応するアクセプター部分が８～２０ヌクレオチド離れている、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブの各々が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素からなる群から選択される異なるドナー蛍光部分で標識される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の検出可能なプローブ及び前記第２の検出可能なプローブの前記ドナー蛍光部分が同じであり、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項7】
前記プライマー及び／又は検出可能なプローブの少なくとも１つが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記修飾ヌクレオチドが、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、及びＮ６－メチル－ｄＡからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
１つ以上の他のウイルスから核酸を検出することを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記１つ以上の他のウイルスが、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、インフルエンザＤ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コウモリコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第１のプライマーが配列番号３のオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号４のオリゴヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第３のプライマーが配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第４のプライマーが配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の検出可能なプローブが配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第２の検出可能なプローブが配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
第３のプライマーセット、第４のプライマーセット、第３の検出可能なプローブ、及び第４の検出可能なプローブを更に含み、前記第３のプライマーセットが、配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含み、
前記第４のプライマーセットが、配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含み、
前記第３の検出可能なプローブが、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第４の検出可能なプローブが配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含み、
前記第３の検出可能なプローブ及び前記第４の検出可能なプローブの各々が、異なるドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されており、
工程ｃ）が、前記第３の検出可能なプローブ及び前記第４の検出可能なプローブの前記ドナー蛍光部分と前記対応するアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを更に含み、前記第３の検出可能なプローブからの蛍光の存在又は非存在が、前記試料中のインフルエンザＡ核酸の存在又は非存在を示し、前記第４の検出可能なプローブからの蛍光の存在又は非存在が、前記試料中のインフルエンザＢ核酸の存在又は非存在を示す、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第３の検出可能なプローブ及び前記第４の検出可能なプローブの各々が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素からなる群から選択される異なるドナー蛍光部分で標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ドナー蛍光部分が、前記第１の検出可能なプローブ、前記第２の検出可能なプローブ、前記第３の検出可能なプローブ及び前記第４の検出可能なプローブの少なくとも１つの末端ヌクレオチド上に位置し、前記対応するアクセプター部分が、前記第１の検出可能なプローブ、前記第２の検出可能なプローブ、前記第３の検出可能なプローブ及び前記第４の検出可能なプローブの少なくとも１つの他方の末端ヌクレオチド上に位置する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、前記キットが、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットと、
第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブと
を備え、
前記第１のプライマーセットが、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、
前記第２のプライマーセットが、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、
前記第１の検出可能なプローブが、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第２の検出可能なプローブが、配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキット。
【請求項17】
第３のプライマーセット、第４のプライマーセット、第３の検出可能なプローブ、及び第４の検出可能なプローブを更に備え、前記第３のプライマーセットが、配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含み、
前記第４のプライマーセットが、配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含み、
前記第３の検出可能なプローブが、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第４の検出可能なプローブが配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
細管形態の反応容器であって、（ａ）試料を導入可能な開口部を有する近位端と、
（ｂ）遠位端と、
（ｃ）少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を収容する第１のセグメント、前記第１のセグメントの遠位にあり、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び前記第２のセグメントの遠位にあり、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントであって、前記セグメントの各々が、
（ｉ）前記細管によって画定されており、
（ｉｉ）前記細管の対向する壁部分を互いに結合することによって形成された流体密封シールによって少なくとも部分的に流体的に隔離され、その結果、
（Ａ）前記流体密封シールが、前記流体密封シールによって部分的に流体的に隔離されたセグメントに流体圧力を加えることによって破壊され、
（Ｂ）前記流体密封シールが、前記流体密封シールによって部分的に流体的に隔離されたセグメントに流体圧力を加えることによって前記流体密封シールが破壊されるのを防止するために、前記流体密封シールを破壊することなく、前記細管の対向する前記壁部分が結合される場所でクランプされることが可能であり、
（ｉｉｉ）別のセグメントから排出された流体の体積を受け取るくらいに拡張可能であり、圧縮された場合に実質的に流体を含まないくらいに圧縮可能である、少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を収容する第１のセグメント、前記第１のセグメントの遠位にあり、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び前記第２のセグメントの遠位にあり、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントと、
（ｄ）前記開口部を閉じるためのキャップであって、前記キャップが前記細管と流体連通するチャンバを含み、気体の自由な流出を可能にするが、チューブ内のすべての液体体積及び感染病原体を保持する、前記開口部を閉じるためのキャップと、
（ｅ）前記細管の近位端及び遠位端が保持される剛性フレームと、
（ｆ）一体型細管張力付与機構、又は前記細管の圧縮及び平坦化を容易にするように十分にピンと張った前記細管を引っ張る前記剛性フレームへの前記細管のアタッチメントと
を備える反応容器であって、
（ｇ）前記反応容器が、
第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットと、
第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブを収容し、
前記第１のプライマーセットが、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、
前記第２のプライマーセットが、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、
前記第１の検出可能なプローブが、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
前記第２の検出可能なプローブが、配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、細管形態の反応容器。
【請求項19】
第３のプライマーセット、第４のプライマーセット、第３の検出可能なプローブ、及び第４の検出可能なプローブを更に含み、前記第３のプライマーセットが、配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含み、
前記第４のプライマーセットが、配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含み、
前記第３の検出可能なプローブが、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第４の検出可能なプローブが配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本開示はウイルス診断の分野に関し、より詳細には、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」）の存在又は非存在の検出に関する。本開示はまた、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢの存在又は非存在の同時検出に関する。
本開示はウイルス診断の分野に関し、より詳細には、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」）の存在又は非存在の検出に関する。本開示はまた、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢの存在又は非存在の同時検出に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、並びにラクダ、コウモリ、ハクビシン、マウス、イヌ及びネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物コロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のＨＫＵ２関連コロナウイルスは、２０１８年に豚の致命的な急性下痢症候群の原因であった。
Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、並びにラクダ、コウモリ、ハクビシン、マウス、イヌ及びネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物コロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のＨＫＵ２関連コロナウイルスは、２０１８年に豚の致命的な急性下痢症候群の原因であった。
【0003】
ヒトに対して病原性であるいくつかのコロナウイルスの中で、ほとんどは、いくつかの顕著な例外を除いて、軽度の臨床症状に関連しており、すなわち、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、（２００２年１１月に中国南部の広東省で出現し、２００２年～０３年の間に３７か国で８０００件を超えるヒト感染症及び７７４件の死亡例をもたらした新規なベータコロナウイルス）、並びに中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）（２０１２年にアラビアで初めて検出され、検査室で確認された２４９４件の感染症及び２０１２年９月以降の死者８５８人の原因であり、そのうち３８人が韓国への導入後に死亡した）がその例として挙げられる。
【0004】
２０１９年後半に、中国湖北省武漢で、ウイルス性肺炎を有するいくつかの患者が発見された。２０１９新規コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）と最初に命名された新規ヒト感染性コロナウイルスを、次世代シーケンシングにより同定した。この新規コロナウイルスは、コロナウイルス科、ベータコロナウイルス属及びサルベコウイルス亜属に分類され、Ｌｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０２０，Ｖｏｌ．３９５，ｐ．５６５－５７４による’’Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ’’に記載されている。２０２０年２月１１日に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、このウイルスの正式名を重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）として発表した。２０２１年４月２９日現在、１億８０００万人を超える症例が確認され、３９０万人を超える死者が国際的に報告されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は世界中のほぼ全ての国で検出され、米国で最も多い数であった（ｗｗｗ．ｗｏｒｌｄｉｎｆｏｍｅｔｅｒｓ．ｃｏｍ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）。
【0005】
インフルエンザ、すなわち流感は、オルトミクソウイルス科のウイルスに関連する非常に伝染性のウイルス性呼吸器疾患である。流感の感染症はいつでも起こり得るが、通常、各半球における冬の数ヶ月間の季節的大流行によって特徴付けられる。症状は、患者ごとに重症度が大きく異なるが、典型的には、咳、発熱、鼻水又は鼻詰まり、喉の痛み、身体の痛み、及び疲労のうちの１つ以上を含む。流感は誰にでも感染し得るが、高齢者及び幼児、並びに免疫能力の低下及び特定の既存の症状を有する者にとって特に危険である。
【0006】
インフルエンザＡ～Ｄと示される４つの既知のタイプのインフルエンザウイルスが存在する。ヒトはインフルエンザＡ、Ｂ及びＣに感染し得るが、ヒトのインフルエンザＤ感染の症例は報告されていない。ヒトに感染する最も一般的なタイプはインフルエンザＡであり、次いでインフルエンザＢである。インフルエンザＡは、ウイルス粒子の外表面に見られる２つのタンパク質、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）のバリエーションに基づいて血清型に更に分けられる。ヘマグルチニン変異体Ｈ１～Ｈ３及びノイラミニダーゼ変異体Ｎ１及びＮ２は、季節的大流行の間に生じる最も一般的な血清型を形成する。数年の間に、インフルエンザＡの大流行は、世界中で壊滅的な影響を及ぼし、流感パンデミックをもたらした。例えば、１９１８年のスペイン流感のパンデミックでは、１７００万人～５０００万人が死亡したと推定されている。１９５７年のアジア流感のパンデミック及び１９６８年の香港流感のパンデミックによって、それぞれ１００万人以上の人々が死亡した。インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１血清型は、１９１８年のスペイン流感の原因であり、一方で、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２血清型は、それぞれアジア流感及び香港流感のパンデミックの原因因子であった。
【0007】
インフルエンザＢ及びインフルエンザＣは、ヒトに感染することができるが、はるかに危険ではない。インフルエンザＢは単一の血清型を有するので、このウイルスに対する集団免疫を確立し維持することがより容易である。インフルエンザＢは、ヒトにおいてインフルエンザＡよりも流行性が低いが、小児及び青年に不釣り合いに影響を及ぼし、局所的な流行につながる可能性がある。インフルエンザＣは、ヒトに感染することができるが、インフルエンザＢよりも危険性は更に低く、患者は軽度の症状しか示さない。
【0008】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、２９，９０３塩基長のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子であり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７に示される）、以下のような遺伝子の順序（５’から３’）を有する：レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ（ウイルス複製及びウイルス構築に必須の１６個の予測非構造タンパク質を有する２１，２９１塩基）、スパイク（Ｓ遺伝子、細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする３，８２２塩基）、ＯＲＦ３ａｂ（８２８塩基長）、エンベロープ（Ｅ遺伝子、エンベロープタンパク質をコードする２２８塩基）、膜（Ｍ遺伝子、膜タンパク質をコードする６６９塩基）、ヌクレオカプシド（Ｎ遺伝子、ゲノムＲＮＡと複合体を形成するヌクレオカプシドタンパク質をコードする１２６０塩基）。さらに、５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在する。
【0009】
インフルエンザＡゲノムは、１３，５８８塩基長のセグメント化されたネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ参照されたい）。ゲノムは、株に応じて、１０～１４個の遺伝子をコードする８つのセグメントで構成される。最長から最短まで、セグメント及びそれにコードされる遺伝子は以下の通りである：セグメント１（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２）；セグメント２（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ１及びＰＢ１－Ｆ２タンパク質）；セグメント３（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ及びＰＡ－Ｘタンパク質）；セグメント４（赤血球凝集素）；セグメント５（核タンパク質）；セグメント６（ノイラミニダーゼ）；セグメント７（マトリックスタンパク質Ｍ１及びマトリックスタンパク質Ｍ２）；セグメント８（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＥＰ）。赤血球凝集素及びノイラミニダーゼは、インフルエンザビリオンの外側に見られる大きなタンパク質である。赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス粒子の標的細胞への結合及びウイルスゲノムの細胞への侵入を担う。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、感染細胞からのビリオンの放出を触媒する。ＨＡには１６種類、ＮＡには９種類のサブタイプが存在するが、通常ヒトに見られるのはＨ１、Ｈ２、Ｈ３とＮ１、Ｎ２だけである。
【0010】
インフルエンザＢゲノムは、インフルエンザＡゲノムと同様に、１４，５４８塩基長の８セグメントのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子である。インフルエンザＢのゲノムは、いくつかの例外を除いて、インフルエンザＡのゲノムと非常に類似している。最長から最短まで、セグメント及びそれにコードされる遺伝子は以下の通りである：セグメント１（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２）；セグメント２（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ１タンパク質）；セグメント３（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ）；セグメント４（赤血球凝集素）；セグメント５（核タンパク質）；セグメント６（ノイラミニダーゼ及びマトリックスタンパク質ＮＢ）；セグメント７（マトリックスタンパク質Ｍ１及び膜タンパク質ＢＭ２）；セグメント８（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＥＰ）。
【0011】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症及びインフルエンザ感染症の迅速かつ正確な診断及び鑑別は、呼吸器感染症が疑われる個体において重要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインフルエンザの季節性範囲は重複しており、２つの疾患の臨床症状は類似している可能性があり、大多数の個体における無症候性又は軽度の「インフルエンザ様」の病気（発熱、咳、息切れ、又は筋痛等）からより重症で生命を脅かす疾患まで及ぶ。しかしながら、２つのウイルスタイプは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者が前駆症状性である間に感染を拡散し得る一方で、インフルエンザ患者は症状をより迅速に発症し、前駆症状性である間にウイルスを排出しないという点で異なる。結果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインフルエンザの両方の迅速かつ正確な検出及び鑑別は、タイムクリティカルな医学的意思決定を知らせ、感染制御努力を促し、効率的な資源供給を促進し、標的療法及び抗菌剤の使用を最適化し、付随的な試験又は手順を減らすのに役立ち得る。したがって、当該技術分野では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための迅速で、信頼性があり、特異的で、高感度の方法、ならびにインフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出及び鑑別する方法に対する継続的な必要性がある。
【発明の概要】
【0012】
発明の概要
本開示は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）装置を使用して、単一の反応容器内で定性的又は定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって、生物学的又は非生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を迅速に検出する方法を提供する。本明細書では、逆転写工程と、増幅工程及びハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程とを実施することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法が開示される。単一の反応容器内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するように設計されたプライマー、プローブ及びキットを更に提供する。本方法を実行するためのプライマー、プローブ、及び他の試薬を含み、本方法を実行することができる更なる消耗品が開示される。検出方法は、各標的ゲノムの様々な領域を標的とするように設計され得る。例えば、本方法は、核タンパク質（Ｎ）領域、非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）領域、Ｓ遺伝子（細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする）、ＯＲＦ３ａｂ、Ｅ遺伝子（エンベロープタンパク質をコードする）、及びＭ遺伝子（膜タンパク質をコードする）をコードする１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの領域を標的とするように設計され得る。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在し、これらも標的となり得る。
本開示は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）装置を使用して、単一の反応容器内で定性的又は定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって、生物学的又は非生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を迅速に検出する方法を提供する。本明細書では、逆転写工程と、増幅工程及びハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程とを実施することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法が開示される。単一の反応容器内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するように設計されたプライマー、プローブ及びキットを更に提供する。本方法を実行するためのプライマー、プローブ、及び他の試薬を含み、本方法を実行することができる更なる消耗品が開示される。検出方法は、各標的ゲノムの様々な領域を標的とするように設計され得る。例えば、本方法は、核タンパク質（Ｎ）領域、非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）領域、Ｓ遺伝子（細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする）、ＯＲＦ３ａｂ、Ｅ遺伝子（エンベロープタンパク質をコードする）、及びＭ遺伝子（膜タンパク質をコードする）をコードする１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの領域を標的とするように設計され得る。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在し、これらも標的となり得る。
【0013】
本開示はまた、ポイントオブケア（ＰＯＣ）装置を使用して単一のチューブで定性的又は定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって、生物学的又は非生物学的試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を迅速かつ同時検出するための方法、例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を多重検出するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ｆｌｕ Ａ」若しくは「ｆｌｕＡ」という用語又はその変形は、インフルエンザＡを指し、「ｆｌｕ Ｂ」若しくは「ｆｌｕＢ」という用語又はその変形は、インフルエンザＢを指す。インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法であって、逆転写工程と、増幅工程及びハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程とを行うことを含む方法が提供される。単一の反応容器内でインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために設計されたプライマー、プローブ、及びキットが更に開示される。さらに、本方法を実行するためのプライマー、プローブ、及び他の試薬を含み、本方法を実行することができる消耗品が提供される。検出方法は、各標的ゲノムの様々な領域を標的とするように設計され得る。例えば、本方法は、上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの領域を標的とするように設計され得る。含まれる内部対照の標的領域を増幅するために、内部対照プライマー及びプローブセットも含まれ得る。そのような内部対照は、アッセイプロセスの全ての工程を通して標的ウイルスのプロセシングを監視するのを助け、ＲＴ－ＰＣＲ反応における可能性のある阻害剤の存在を検出するのを助けることができる。
【0014】
インフルエンザＡ及びＢに関して、本方法は、それらのゲノムを構成する８つのセグメント内の任意の遺伝子又は非コード領域を標的とするように設計され得る。例えば、本方法は、インフルエンザＡマトリックス遺伝子の十分に保存された領域、及び／又はインフルエンザＢの非構造タンパク質遺伝子を標的とし得る。
【0015】
核酸標的の増幅及び検出は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって達成され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに関する知識が不足していることを考慮すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの保存領域及びＲＴ－ＰＣＲに最適な領域内の選択配列を検出するためのマルチターゲットアッセイが有利であると考えられ得る。特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はインフルエンザウイルス変異体の検出に関連する領域等の他の領域もまた、望ましい結果を達成するために標的化され得る。
【0016】
本明細書に記載のアッセイは、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、（カリフォルニア州プレザントン）で行うことができ、これは、試料の調製及び精製、核酸増幅、ならびに生物学的試料中の標的配列の検出を自動化及び統合する。これは、２０分以内に様々な標的の検査結果を提供することができるポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスであり、したがって、患者の感染の迅速かつ正確な同定が必要な状況で有利である。アッセイチューブに試料を添加すること以外に、試薬の調製又は追加の工程は必要とされない。ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置は、試験を実行し、結果を見るための機器及びプリロードされたソフトウェアからなる。このシステムは、核酸精製及びＲＴ－ＰＣＲ試薬を保持し、試料調製及びＲＴ－ＰＣＲプロセスを収容する使い捨ての単回使用アッセイチューブの使用を必要とする。検出モジュールは、リアルタイムで反応を監視し、オンボードコンピュータは、収集されたデータを分析し、解釈された結果を表示する。後者は、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置の一体型ＬＣＤタッチスクリーン上のアッセイレポート及び電子ファイルに示されている。レポートは、ＵＳＢ又はネットワーク接続プリンタを介して直接印刷することができる。結果を、外部サーバ、ミドルウェア若しくはデータ管理システム、又は検査情報システム（ＬＩＳ）にエクスポートすることもできる。米国特許第６，７８０，６１７号を参照されたい。
【0017】
アッセイを行うために、ユーザは、例えば、ユーザ施設の標準的な手順に従って唾液、鼻咽頭、又は鼻スワブ試料を収集する。ウイルス輸送培地又は生理食塩水に懸濁した試料の場合、ユーザは、転送ピペットを使用してアッセイチューブに試料を転送する。次いで、操作者は、アッセイチューブをｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置に挿入する前に、アッセイチューブバーコードをスキャンする。アッセイチューブは、脆弱で破裂可能なシールによって画定されたセグメントに分離されたプラスチックチューブ又は細管であり、剛性フレーム上にピンと張った状態で保持される。
【0018】
試料調製方法は、カオトロピック剤に基づく溶解及び磁性ガラス粒子に基づく（「ＭＧＰ」）核酸精製に基づく。まず、試料を液体輸送媒体で希釈し、内部対照と混合する。次いで、カオトロピック及びタンパク質分解試薬は、試料中の高分子（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質）及び核酸（例えば、ウイルスゲノム）の三次元構造を破壊し、それらを変性させる。第２に、溶液中の水和分子から水を除去するカオトロピック塩の存在下でＭＧＰの表面に結合することによって、核酸が溶解物から単離される。第３に、磁場を用いてＭＧＰを溶解物から分離し、溶解物を除去する。第４に、捕捉された核酸を有するビーズを洗浄して、試料中の可能性のある阻害剤を除去する。最後に、捕捉された核酸を低塩条件下で少量の溶出緩衝液に溶出する。
【0019】
標的核酸がＲＮＡを含む場合、溶出されたウイルスＲＮＡは、まず逆転写酵素活性を用いて相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に逆転写される。標的核酸がＤＮＡを含む場合、逆転写酵素工程は不要である。次いで、ＤＮＡ又はｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を受け、そこで反応混合物を繰り返し加熱して核酸を変性させ、冷却してプライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を可能にして、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの１つ以上の特異的領域を指数関数的に増幅する。二重標識蛍光発生加水分解プローブは、フォワードプライマーとリバースプライマーの結合領域の間に位置する特異的標的配列にアニールする。ＰＣＲサイクルの伸長段階の間、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性はプローブを分解し、レポーター色素（例えば、６－ヘキサクロロカルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ））をクエンチャー（例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ））から分離させ、したがって蛍光シグナルを生成する。蛍光強度を各ＰＣＲサイクルでモニターする。蛍光強度が所定の閾値を超えると、蛍光チャネルに対応する特定の分析物、この場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびに任意にインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ、加えて内部対照（ＩＣ）について、サイクル閾値（Ｃｔ）値が返される。測定された相対最大蛍光シグナル（Ａｍｐ）の値も計算することができる。
【0020】
試験プロセス中、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置の複数の試料処理アクチュエータは、アッセイチューブを圧縮してシールを選択的に開き、アッセイチューブセグメントから試薬を放出し、あるセグメントから別のセグメントに試料を移動させ、反応体積、温度、圧力、サイクル数、及びインキュベーション時間等の反応条件を制御する。「アクチュエータ」及び「圧縮部材」という用語は、ここでは互換的に使用される。アクチュエータは、クランプとして作用して、セグメント間の接合部に圧力を加え、選択されたセグメントを閉じたままにすることができる。これらの全てのパラメータの正確な制御は、アッセイ反応のための最適条件を提供する。組み込みマイクロプロセッサは、試料調製、核酸抽出、標的濃度濃縮、阻害剤除去、核酸溶出、及びリアルタイムＰＣＲを含む全ての所望のアッセイプロセスを実行するようにこれらの動作を制御及び調整する。
【0021】
全てのアッセイ工程は、閉じた自己完結型アッセイチューブ内で行われ、試料間の交差汚染の可能性を最小限に抑える。分析装置は全ての試験工程を実行し、解釈された結果を約２０分で表示する。解釈された結果のレポートは、結果を見るウィンドウで見ることができ、ＵＳＢ接続プリンタを介して直接印刷することができる。
【0022】
一態様では、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法が提供され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が試料中に存在する場合に１つ以上の増幅産物を生成するために、試料を少なくとも１組のプライマーと接触させることを含む増幅工程であって、プライマーのセットが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が試料中に存在する場合に増幅産物を生成する、工程を行うことと；増幅産物（複数可）を１つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程であって、１つ以上の検出可能なプローブは、少なくとも１組のプライマーの増幅産物に特異的な少なくとも１つのプローブを含む工程を行うことと；増幅産物の存在又は非存在を検出する工程であって、増幅産物の存在が、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、増幅産物の不在が、試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在しないことを示す工程、を含む。
【0023】
ここでは、本方法（複数可）で使用される少なくとも１組のプライマーは、配列番号１～３又は７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６又は１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、１つ以上の検出可能なプローブは、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0024】
別の実施形態では、本方法（複数可）で使用される少なくとも１組のプライマーは、配列番号１～３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、検出可能なプローブは、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0025】
別の実施形態では、本方法（複数可）で使用される少なくとも１組のプライマーは、配列番号３のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、検出可能なプローブは、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0026】
別の実施形態では、本方法（複数可）で使用される少なくとも１組のプライマーは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、検出可能なプローブは、配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0027】
別の実施形態では、本方法（複数可）で使用される少なくとも１組のプライマーは、配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、検出可能なプローブは、配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0028】
別の実施形態において、本方法（複数可）で使用されるプライマーの少なくとも１つのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含む第１のプライマーのセット；配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含む第２のプライマーのセット；配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１の検出可能なプローブ；並びに配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２の検出可能なプローブを含む。
【0029】
別の実施形態では、本方法（複数可）で使用される少なくとも１セットのプライマーは、配列番号３のオリゴヌクレオチド配列と、配列番号４のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含む第１のプライマーセット、及び配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含む第２のプライマーセット、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含む第１の検出可能なプローブ及び配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を含む第２の検出可能なプローブを含む。
【0030】
別の態様では、試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を同時に検出するための方法であって、試料中にインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に、試料を第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、及び第３のプライマーセットと接触させて１つ以上の増幅産物を産生することを含む、増幅工程を実施する工程であって、第１のプライマーセットが試料中にインフルエンザＡが存在する場合に増幅産物を産生し、第２のプライマーセットが試料中にインフルエンザＢが存在する場合に増幅産物を産生し、第３のプライマーセットが試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に増幅産物を産生する、増幅工程を実施する工程と、増幅産物（複数可）を３つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施する工程であって、３つ以上の検出可能なプローブが、第１のプライマーセット、第２のプライマーセット及び第３のプライマーセットの各々の増幅産物に特異的な少なくとも１つのプローブを含む、ハイブリダイズ工程を実施する工程と、増幅産物の存在又は非存在を検出する工程であって、増幅産物の存在が、試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、増幅産物の非存在が、試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す、増幅産物の存在又は非存在を検出する工程と、を含む、方法が提供される。
【0031】
ここでは、本方法（複数可）で使用される第１のセットのプライマーは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含む第１のプライマーのセット；配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含む第２のプライマーのセット；配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含む第３のプライマーのセットを含み、第１の検出可能なプローブは、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第３の検出可能なプローブは配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本方法は、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含む第４のプライマーセット、及び配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４の検出可能なプローブを更に含む。
【0032】
別の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットが提供され、該キットは、プライマーの第１セット及び第２セットのプライマーと；第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブとを含み、第１のプライマーのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、第２のプライマーのセットは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、第１の検出可能なプローブは配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0033】
別の態様では、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうち１つ以上を検出するためのキットが提供され、該キットは、少なくとも第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、及び第３のプライマーセットと、少なくとも第１の検出可能なプローブ、第２の検出可能なプローブ、及び第３の検出可能なプローブとを含む。ここでは、キットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含む第１のプライマーのセット；配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含む第２のプライマーのセット；配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含む第３のプライマーのセット；並びに配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１の検出可能なプローブ；配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２の検出可能なプローブ；及び配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む第３の検出可能なプローブを含み得る。別の実施形態では、本キットは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含む第４のプライマーセット、及び配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４の検出可能なプローブを更に含む。
【0034】
他の実施形態では、キットは、上記のプライマー及びプローブに加えて、核酸ポリメラーゼの活性を可能にする核酸ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び緩衝液のうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであり、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。特定の実施形態では、核酸ポリメラーゼは、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の細菌に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。キットはまた、キット構成要素を使用するために、コンピュータ可読装置に印刷又は格納された容器及び／又は説明書を含むことができる。
【0035】
別の態様では、細管の形態の反応容器が提供され、試料が導入可能な開口部を有する近位端；遠位端；少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を収容する含む第１のセグメント、第１のセグメントの遠位に位置し、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び第２のセグメントの遠位に位置し、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントであって、当該セグメントの各々は、細管によって画定され、少なくとも部分的に、細管の対向する壁部分の互いに結合することによって形成される流体密封シールによって、他のセグメントから流体的に分離されており、その結果、流体密封シールによって部分的に流体的に分離されているセグメントに流体圧力を加えることによって流体密封シールが破壊され、流体密封シールは、流体密封シールを破断することなく細管の対向する壁部分が結合されている場所でクランプされることが可能であり、流体密封シールによって部分的に流体的に隔離されているセグメントに流体圧力を加えることによって流体密封シールが破断するのを防ぎ、別のセグメントから排出された大量の流体を受け取るくらいに拡張可能であって、圧縮された際に実質的に流体を含まないくらいに圧縮可能である、少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を収容する第１のセグメント、前記第１のセグメントの遠位にあり、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び前記第２のセグメントの遠位にあり、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントと、開口部を閉じるためのキャップ、細管と流体連通しているチャンバを含むキャップ、及び気体の自由な流出を可能にするが、チューブ内の全ての液体量及び感染病原体を保持するキャップと；細管の近位端及び遠位端が保持される剛性フレームと；細管の圧縮及び平坦化を容易にするために細管を十分にピンと張って引っ張る、一体型細管張力機構又は細管の剛性フレームへのアタッチメントと、第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、及び第３のプライマーセットを含む第３のセグメント内の反応容器と、少なくとも第１の検出可能なプローブ、第２の検出可能なプローブ、及び第３の検出可能なプローブを含み、第１のプライマーのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、第２のプライマーのセットは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、第１の検出可能なプローブは配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0036】
別の態様では、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの１つ以上を検出するための反応容器が提供される。ここでは、第３のセグメント中の反応容器は、少なくとも第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、及び第３のプライマーセットと、少なくとも第１の検出可能なプローブ、第２の検出可能なプローブ、及び第３の検出可能なプローブとを含む。ここでは、反応容器は、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含む第１のプライマーのセット；配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含む第２のプライマーのセット；配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含む第３のプライマーのセット；並びに配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１の検出可能なプローブ；配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２の検出可能なプローブ；及び配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む第３の検出可能なプローブを含み得る。別の実施形態では、第３のセグメント中の反応容器は、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含む第４のプライマーセット、及び配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４の検出可能なプローブを更に含む。
【0037】
他の実施形態では、本明細書に開示される方法、キット及び反応容器は、配列番号３の第１のプライマーと配列番号４の第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーと、配列番号１２の第３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第３のプライマーと、配列番号１７の第４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第４のプライマーと、配列番号２３の第５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第５のプライマーと、配列番号２５の第６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第６のプライマーと、配列番号２８の第７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第７のプライマーと、配列番号２９の第８のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第８のプライマーとを含む又はそれからなる、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的を同時に増幅するためのプライマーのセットを利用し得る。
【0038】
他の実施形態において、本明細書に開示される方法、キット及び反応容器は、配列番号３の第１のプライマーと、配列番号４の第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーと、配列番号１２の第３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第３のプライマーと、配列番号１７の第４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第４のプライマーと、配列番号２３の第５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第５のプライマーと、配列番号２４の第６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第６のプライマーと、配列番号２５の第７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第７のプライマーと、配列番号２８の第８のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第８のプライマーと配列番号２９の第９のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第９のプライマーと、を含む又はそれからなる、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的を同時に増幅するためのプライマーのセットを利用し得る。
【0039】
別の態様では、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）核酸を検出する方法であって、標的核酸が試料中に存在する場合に１つ以上の増幅産物を産生するのに適した条件下で、試料を少なくとも第１のプライマーのセット及び第２のプライマーのセットと接触させることと、１つ以上の増幅産物が存在する場合、第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブのうちの少なくとも１つからシグナルを生成するのに適した条件下で、試料を少なくとも第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブと接触させることと、工程ｂ）で生成されたシグナルを検出することと、を含み、１つ以上の増幅産物の存在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在を示し、１つ以上の増幅産物の不在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の不在を示し、第１のプライマーのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、第２のプライマーのセットは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、第１の検出可能なプローブは配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を検出する方法が提供される。第１のプライマーは、配列番号１～３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むことができ、第２のプライマーは、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。別の実施形態では、方法は、第３のプライマーのセット、第４のプライマーのセット、第３の検出可能プローブ、及び第４の検出可能プローブを更に含んでもよく、第３のプライマーのセットは、配列番号２３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含み、第４のプライマーのセットは、配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含み、第３の検出可能なプローブは、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第４の検出可能なプローブは配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含み、当該第３の検出可能なプローブ及び当該第４の検出可能なプローブのそれぞれは、異なるドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されており、工程ｃ）は、第３の検出可能なプローブ及び第４の検出可能なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを更に含み、第３の検出可能なプローブからの蛍光の存在又は非存在が、試料中のインフルエンザＡ核酸の存在又は非存在を示すものであり、第４の検出可能なプローブからの蛍光の存在又は非存在が、試料中のインフルエンザＢ核酸の存在又は非存在を示す。
【0040】
別の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットが提供され、プライマーの第１セット及び第２セットのプライマーと；第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブとを含み、第１のプライマーのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、第２のプライマーのセットは、配列番号１０～１２のオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマーとを含み、第１の検出可能なプローブは配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、キットは、第３のプライマーのセット、第４のプライマーのセット、第３の検出可能プローブ、及び第４の検出可能プローブを更に含んでもよく、第３のプライマーのセットは、配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含み、第４のプライマーのセットは、配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第７のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含み、第３の検出可能なプローブは、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第４の検出可能なプローブは配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0041】
別の実施形態では、細管の形態の反応容器が提供され、試料が導入可能な開口部を有する近位端；遠位端；少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を含む第１のセグメント、第１のセグメントの遠位に位置し、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び第２のセグメントの遠位に位置し、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントであって、当該セグメントの各々は、細管によって画定され、細管の対向する壁部分の互いの結合によって形成される流体密封シールにより、少なくとも部分的に流体的に隔離され、その結果、流体密封シールによって部分的に流体的に分離されているセグメントに流体圧力を加えることによって流体密封シールが破壊され、流体密封シールは、流体密封シールを破断することなく細管の対向する壁部分が結合されている場所でクランプされることが可能であり、流体密封シールによって部分的に流体的に隔離されているセグメントに流体圧力を加えることによって流体密封シールが破断するのを防ぎ、別のセグメントから排出された大量の流体を受け取るくらいに拡張可能であって、圧縮された際に実質的に流体を含まないくらいに圧縮可能である、少なくとも、少なくとも１つの核酸抽出試薬を収容する第１のセグメント、前記第１のセグメントの遠位にあり、洗浄試薬を収容する第２のセグメント、及び前記第２のセグメントの遠位にあり、１つ以上の増幅試薬を収容する第３のセグメントと、開口部を閉じるためのキャップ、細管と流体連通するチャンバとを含むキャップ、ガスの自由な脱出を可能にするが、チューブ内の全ての液体量と感染病原体を保持するキャップ、細管の近位端及び遠位端が保持される剛性フレーム、細管の圧縮及び平坦化を容易にするために細管を十分にぴんと張って引っ張る、一体型細管張力機構又は細管の剛性フレームへのアタッチメントを備える反応容器であって、当該反応容器が、第１のプライマーセット及び第２のプライマーのセットと、第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブとを収容し、第１のプライマーのセットは、配列番号１～３及び配列番号７～９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４～６及び配列番号１３～１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを含み、第２のプライマーのセットは、配列番号１０～１２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第３のプライマーと、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第４のプライマー、第１の検出可能なプローブは、配列番号１８～２０のオリゴヌクレオチド配列を含み、第２の検出可能なプローブは配列番号２１～２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、反応容器は、配列番号２３のオリゴヌクレオチド配列を含む第５のプライマーと、配列番号２４～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーとを含む第３のプライマーのセット；配列番号２８のオリゴヌクレオチド配列を含む第６のプライマーと、配列番号２９のオリゴヌクレオチド配列を含む第８のプライマーとを含む第４のプライマーのセットを更に収容してもよく、第３の検出可能なプローブは、配列番号２６～２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、第４の検出可能なプローブは配列番号３０のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、方法、キット又は反応容器は、少なくとも第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブの各々がドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されるものであり得る。ここでは、工程ｃ）における方法は、少なくとも第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在が試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在又は非存在を示す。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、当該第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブの各々のドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分が、両端を含めて８～２０ヌクレオチド離れているものであってもよい。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、当該第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブの各々が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素及びクマリン色素からなる群から選択される異なるドナー蛍光部分で標識されるものであってもよい。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、当該第１の検出可能なプローブ及び第２の検出可能なプローブ上の当該ドナー蛍光部分が同じであり、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７からなる群から選択されるものであってもよい。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、プライマー及び検出可能なプローブの少なくとも１つが修飾ヌクレオチドを含むものであり得る。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、当該修飾ヌクレオチドが、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、及びＮ６－メチル－ｄＡからなる群から選択されるものであってもよい。別の実施形態において、方法、キット又は反応容器は更に、１つ以上の他のウイルスからの核酸を検出するために好適であり得、該１つ以上の他のウイルスは、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、インフルエンザＤ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コウモリコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）からなる群から選択される。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、第１のプライマーが配列番号３のオリゴヌクレオチド配列を含み、第２のプライマーが配列番号４のオリゴヌクレオチド配列を含むものであり得る。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、第３のプライマーが配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含み、第４のプライマーが配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列を含むものであり得る。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、第２の検出可能なプローブが配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を含むものであり得る。方法、キット又は反応容器の別の実施形態では、当該第３の検出可能なプローブ及び第４の検出可能なプローブの各々は、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素からなる群から選択される異なるドナー蛍光部分で標識されてもよい。別の実施形態では、方法、キット又は反応容器は、ドナー蛍光部分が、当該第１の検出可能なプローブ、第２の検出可能なプローブ、第３の検出可能なプローブ及び第４の検出可能なプローブの少なくとも１つの末端ヌクレオチド上に位置し、対応するアクセプター部分が、当該第１の検出可能なプローブ、第２の検出可能なプローブ、第３の検出可能なプローブ及び第４の検出可能なプローブの少なくとも１つの他方の末端ヌクレオチド上に位置するものであり得る。
【0043】
一般に、オリゴヌクレオチドは、プライマー核酸、プローブ核酸等であり得る。オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３０のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％等）を有する１つ以上の核酸を含み得る。オリゴヌクレオチドは、１００個以下のヌクレオチドを有し得る。これらの実施形態の一定のものでは、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチド等）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、未修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性及び／又は特異性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【0044】
特定の実施形態では、増幅は、５’～３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ酵素を使用して達成することができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して達成され得る。いくつかの態様では、標的がＤＮＡテンプレートではなくＲＮＡテンプレートを含む場合、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して増幅を達成することができる。いくつかの態様では、試料中の標的の量の定量が望ましい場合、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用することができる。
【0045】
ある特定の実施形態において、プローブとして作用するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー蛍光部分及び少なくとも１つのアクセプター部分を含む。アクセプター部分は、それ自体が蛍光性であってもよく、あるいは、ダーククエンチャーであってもよい。ドナー蛍光部分及びアクセプター部分は、プローブの長さに沿って互いに８～２０ヌクレオチド以内であり得る。他の態様において、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。レポーター色素又はアクセプター色素からの蛍光は、規定された波長で測定され、したがって、増幅された標的の検出及び識別を可能にする。最初に、完全なプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制される。ＰＣＲ増幅工程の間、プローブの特異的な一本鎖ＤＮＡテンプレートへのハイブリダイゼーションにより、核酸ポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素及びクエンチャー色素が分離し、蛍光シグナルが産生される。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断プローブ量が増加し、レポーター色素の累積シグナルが同時に増加する。任意に、１つ以上の更なるプローブ（例えば、内部基準制御装置等）もまた、標的プローブに関連する蛍光色素標識とは独特かつ異なるレポーター蛍光色素で標識され得る。そのような場合、特定のレポーター色素が規定された波長で測定されるので、増幅された標的及び１つ以上の更なるプローブの同時検出及び識別が可能である。
【0046】
本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸、又はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在又は非存在を検出する方法は、ヒト個体からの生物学的試料に適用され得る。そのような生物学的試料は、当業者に公知のサンプリング方法、例えば、鼻スワブ試料、喉スワブ試料、中鼻甲介スワブ試料、鼻咽頭洗浄／吸引試料、鼻洗浄／吸引試料、鼻咽頭スワブ試料、又は中咽頭スワブ試料を使用して患者から得ることができる。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために、又はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、若しくはインフルエンザＡとインフルエンザＢとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を同時に検出するために、他の試料タイプ（例えば、痰、唾液、血液、尿、糞便、口腔液、下気道吸引物、気管支肺胞洗浄液、胸水、肺生検、又はそれらの誘導体等）を評価するために当業者によって同じ検査が使用され得る。本明細書中に開示される方法はまた、非生物学的試料（例えば、水試料、空気試料、食品試料、農業試料、環境試料、土壌試料、液体試験試料、表面試験試料等）に、又は非ヒト供給源、例えば、家畜、野生動物、飼育動物等から得られる生物学的試料に適用され得る。
【0047】
一態様において、キットは、ドナー及び対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分又はダーククエンチャーで標識されるプローブを含むことができ、又はオリゴヌクレオチドを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を更に含むことができる。キットはまた、添付文書及びプライマー、プローブ及びフルオロフォア部分を使用して試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在若しくは非存在を検出するための説明書を含み得る。
【0048】
本明細書に記載の反応容器及びキットは、消耗品（試料容器としても知られる）を受け入れるための開口部と、開口部に沿って配置された少なくとも１つの処理ステーションとを有する処理ユニット、例えば分析装置を含む試料を処理するための装置と共に使用するのに適している。米国特許第７，７１８，４２１号、同第６，７８０，６１７号、及び同第６，７４８，６１７号を参照されたい。「を測定すること」及び「を決定すること」という用語は、本明細書では互換的に使用される。処理ユニットは、開口部内で試料容器を圧縮し、それによって試料容器内の試料容器の内容物を変位させるように適合された少なくとも１つの圧縮部材（又はアクチュエータ）を含む。他の圧縮部材は、所定の位置に一定量の試料容器内容物を保持するためのクランプとして作用することができる。処理ユニットは、試料容器内の内容物との間で熱エネルギーを伝達することができる少なくとも１つのエネルギー伝達要素を更に含む。
【0049】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ここではＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１と表示する）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのゲノム構成並びに本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブの標的領域の位置を示す。Ｅ：エンベロープタンパク質遺伝子；Ｍ：膜タンパク質遺伝子；Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子；ＯＲＦ１ａ／ｂ：非構造遺伝子のＯＲＦ；Ｓ：スパイクタンパク質遺伝子。アンプリコンの下の数字は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７によるゲノム位置である。
【図2】図２は、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢウイルスのゲノム構成、ならびに本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドセットの位置の部分図である。図２Ａ：インフルエンザＡのゲノム構成の部分図。参照：ＫＣ７８１４５０インフルエンザＡウイルス（Ａ／ミシガン／０１／２０１０（Ｈ１Ｎ１））セグメント７マトリックスタンパク質２（Ｍ２）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子。図２Ｂ：インフルエンザＢのゲノム構成の部分図。参照：ＫＭ６５４６０８インフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ／Ｆｌｕ１０３／２０１３）セグメント８核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）及び非構造タンパク質１（ＮＳ１）遺伝子。
【図3A】図３は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｏｒｆ１ａｂ標的）を同時に検出するアッセイに使用するための、本明細書に開示される様々なオリゴヌクレオチドセット（表２～４）の性能を示す。Ｃｔ（又はサイクル閾値）は、蛍光シグナルが所定のシグナル閾値を超えるのに必要なＰＣＲサイクルの数である。Ａｍｐは、ＰＣＲ増殖曲線の最終振幅の計算平均である。図３Ａ：様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｏｒｆ１ａｂオリゴヌクレオチドセットの存在下でのインフルエンザＡ ＲＮＡ標的の検出－Ｃｔ測定。
【図3F】図３Ｆ：様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｏｒｆ１ａｂオリゴヌクレオチドセットの存在下でのｎＣｏＶ１転写物の検出－Ａｍｐ測定。菱形は、Ｃｔ及びＡｍｐ値の分布を示す。中央の横線は平均値を示し、上の線は上７５％を示し、下の線は下２５％を示す。
【図4A】図４は、合成試料中の標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネルメンバー１、米国マサチューセッツ州ミルフォードのＳｅｒａＣａｒｅ）（「ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１」）の検出における選択されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｏｒｆ１ａｂオリゴヌクレオチドセットの性能を示す。合成試料は、模擬ユニバーサル輸送媒体（「ｓＵＴＭ」）中にインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、インフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び４００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１を含んでいた。濃度は供給業者によって決定された。ｓＵＴＭは、ユニバーサル輸送培地（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マリエータ）をヒト上皮細胞及びブタムチンと混合することによって作製した。図４Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｏｒｆ１ａｂオリゴヌクレオチドセットの存在下でのインフルエンザＡ ＲＮＡ標的の検出－Ｃｔ測定。
【図4F】図４Ｆ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｏｒｆ１ａｂオリゴヌクレオチドセットの存在下でのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１の検出－Ａｍｐ測定。菱形は、Ｃｔ及びＡｍｐの分布を示す。中央の横線は平均値を示し、上の線は上７５％を示し、下の線は下２５％を示す。
【図5A】図５は、合成試料中の標準的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１）の検出における様々な候補ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子オリゴヌクレオチドセットの性能を示す。合成試料は、模擬ユニバーサル輸送媒体中にインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、インフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び４００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１を含んでいた。図５Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子オリゴヌクレオチドセットの存在下でのインフルエンザＡ ＲＮＡ標的の検出－Ｃｔ測定。
【図5F】図５Ｆ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子オリゴヌクレオチドセットの存在下でのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１の検出－Ａｍｐ測定。菱形は、Ｃｔ及びＡｍｐの分布を示す。中央の横線は平均値を示し、上の線は上７５％を示し、下の線は下２５％を示す。
【図6A】図６は、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢ標的の検出における、ＵＴＭにおけるＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一標的及び二重標的アッセイの性能を示す。ＳＴＡ＝単一標的アッセイ；ＤＴＡ＝二重標的アッセイ。図６Ａ：インフルエンザＡ ＲＮＡ標的の検出－Ｃｔ測定。
【図7A】図７は、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢ標的の検出における、ＵＴＭ（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マリエータ）におけるＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一標的及び二重標的アッセイの性能を示す。ＳＴＡ＝単一標的アッセイ；ＤＴＡ＝二重標的アッセイ。図７Ａ：インフルエンザＡ ＲＮＡ標的の検出－Ｃｔ測定。
【図8A】図８は、ｓＵＴＭにおけるＡｃｃｕｐｌｅｘ（商標）パネルメンバー１の検出におけるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２単一標的アッセイ及び二重標的アッセイの性能を示す。図８Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＴＡ及びＤＴＡアッセイにおけるＡｃｃｕｐｌｅｘ（商標）パネルメンバー１（５０コピー／ｍｌ及び１００コピー／ｍｌ）の検出－Ｃｔ測定。
【図8B】図８Ｂ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＴＡ及びＤＴＡアッセイにおけるＡｃｃｕｐｌｅｘ（商標）パネルメンバー１（５０コピー／ｍｌ及び１００コピー／ｍｌ）の検出－Ａｍｐ測定。菱形は、Ｃｔ及びＡｍｐの分布を示す。中央の横線は平均値を示す。
【図9A】図９は、Ａｃｃｕｐｌｅｘ（ＳｅｒａＣａｒｅ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）参照物質の検出におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単一標的アッセイ及び二重標的アッセイの性能を示す。図９Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＴＡ及びＤＴＡアッセイにおけるＵＴＭ（２５コピー／ｍｌ及び５０コピー／ｍｌ）でのＡｃｃｕｐｌｅｘ（商標）参照材料の検出－Ｃｔ測定。
【発明を実施するための形態】
【0051】
発明の詳細な説明
核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、及び感度よく検出するための方法を提供する。ポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスを使用して単一チューブ内の非生物学的又は生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲアッセイを本明細書に記載する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを収容する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度の上昇、並びに試料の封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、ＰＯＣ設定におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のための他のアッセイと並行して多重化され得る。
核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、及び感度よく検出するための方法を提供する。ポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスを使用して単一チューブ内の非生物学的又は生物学的試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲアッセイを本明細書に記載する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを収容する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度の上昇、並びに試料の封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、ＰＯＣ設定におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のための他のアッセイと並行して多重化され得る。
【0052】
さらに、核酸増幅によるインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の同時診断は、これらの呼吸器ウイルス感染症を迅速に、正確に、確実に、特異的に、及び感度よく検出及び鑑別するための方法を提供する。非生物学的又は生物学的試料中のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出し、鑑別するためのポイントオブケア（ＰＯＣ）装置を使用する単一チューブにおけるリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲアッセイを本明細書中に記載する。インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを収容する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度の上昇、並びに試料の封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、ＰＯＣ設定におけるインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、この技術は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断及び予後診断に使用することができる。このアッセイは、症候性個体及び無症候性個体の両方の感染の検出に有用である。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出マルチプレックスアッセイはまた、他のウイルス標的（インフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、ＳＡＲＳ－１、ＭＥＲＳ、又は他のコロナウイルスが含まれるが、これらに限定されない）の検出のための他のアッセイと並行して更に多重化され得る。同様に、アッセイは、１つ又はいっくつかの標的に対するオリゴヌクレオチドのみを用いて実施され得る。そのような場合、他の標的（複数可）のためのプライマー及び／又はプローブを除去することができる。そのため、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアッセイは、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢのプライマー及び／又はプローブ（複数可）を除去又は中和した後に行うことができる；又は、インフルエンザＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのアッセイを、インフルエンザＢについてのプライマー及び／又はプローブ（複数可）を除去又は中和した後で行うことができる；又はインフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２を検出するためのアッセイを、インフルエンザＡについてのプライマー及び／又はプローブ（複数可）を除去又は中和した後に行うことができる。
【0053】
本開示は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ又はｑＲＴ－ＰＣＲ増幅及び検出技術を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に同定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（例えば、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子及び／又はＮ遺伝子）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー及び蛍光標識加水分解プローブを含む。オリゴヌクレオチドは、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子及び／又はＮ遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ゲノム内の複数の位置にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを有することは、単一コピー遺伝子座を標的化することと比較して、感度を改善するのに有利である。
【0054】
標的ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、開示される方法はまた、１つ以上のプライマー対を使用して試料からの核酸分子遺伝子標的の１つ以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程に加えて、逆転写工程を実施することを含む。
【0055】
本明細書で使用される用語「試料」は、核酸を含む任意の検体又は培養物（例えば微生物培養物）を含む。「試料」という用語はまた、生物学的試料及び非生物学的試料の両方を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、一般に、ウイルス生物を含む生物に由来する試料を指す。生物学的試料の例としては、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞上皮、胃、腹膜、管、耳、関節鏡視下の）、生検試料、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、母体液（ｂｒｅａｓｔ ｆｌｕｉｄ）、胚細胞、及び胎児細胞が挙げられる。本開示の文脈において、生物学的試料は、特に、鼻腔スワブ試料、咽頭スワブ試料、中鼻甲介スワブ試料、鼻咽頭洗浄／吸引試料、鼻洗浄／吸引試料、鼻咽頭スワブ試料、中咽頭スワブ試料、喀痰、血液、尿、糞便、口腔液、下気道吸引液、気管支肺胞洗浄液、胸水、肺生検、又はそれらの誘導体等を指す場合がある。非生物学的試料としては、表面物質、土壌、水、工業用試料等の環境材料、ならびに食品及び乳製品加工機器、装置、器具、家庭用品、使い捨て及び非使い捨てアイテム、液体試験試料、表面試験試料等から得られた試料が挙げられる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「チューブ」という用語は、開放端及び閉鎖端を有する可撓性プラスチックから作製された円筒状容器を指す。開口端は、キャップによって閉じられて保持されてもよく、チューブは、剛性フレームによって所定の向きに保持される。「チューブ」という用語は、本明細書における「反応容器」又は同様の用語と互換的に使用され得る。可撓性プラスチックチューブは、シールによって分離されたセグメントに分割されてもよい。シールは破裂可能であり、すなわち、所定の圧力が加えられるとシールが開き、１つ以上の隣接するセグメントの液体内容物が混合することを可能にするように構成される。本明細書で使用される場合、「セグメント」及び「区画」という用語は、互換的に使用される。また、本明細書で使用される場合、「破裂可能」、「脆弱」、及び「破断可能」という用語は、シールの特徴に関して使用される場合に互換的である。
【0057】
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、テンプレート核酸分子（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムからの核酸分子）の一方若しくは両方の鎖のコピー又はそれに相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーをテンプレート核酸にアニーリングすること、及び増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）並びにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ２及び／又はＫＣｌ）の存在が必要である。本明細書で使用される場合、「増幅産物」は、増幅手順によって産生される核酸産物を指す。
【0058】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、１つ以上のプライマー及び／又はプローブの核酸テンプレート又は増幅産物へのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、プライマー及び／又はプローブの融解温度より低いが、非特異的、例えば配列非依存的なハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
【0059】
本明細書で使用される場合、「検出する」という用語は、存在、非存在、レベル又は量、ならびに核酸配列の存在又は非存在の確率又は可能性の発見又は決定を意味する。「検出可能な部分」、「レポーター」、「フルオロフォア」又は「標識」は、検出可能なシグナルを与え、レポーターとして作用する、すなわち特定のオリゴヌクレオチド標的分子の存在、非存在、レベル又は量をシグナル伝達する分子である。検出可能なシグナルは、例えば比色、蛍光又は発光であり得る。オリゴヌクレオチド検出のための特に有用な標識は、蛍光色素、例えば、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、クマリン色素、又はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリー色素の色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）である。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、５，６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、及び６－カルボキシ－４’、５’－ジクロロ－２’、７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）が挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、例えば、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）、カルボキシ－ローダミン（ＲＯＸ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）、ローダミン６Ｇ、カルボキシテトラメチル－ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ならびにローダミン誘導体ＪＡ２７０（Ｊｏｓｅｌ ｅｔ ａｌ．に対して２００１年２月６日付けで発光された、米国特許第６，１８４，３７９号を参照されたい）が挙げられる。シアニンファミリーの色素としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、ならびにそれらの変異体が挙げられる。上に列挙したフルオレセイン色素、ローダミン色素、及びシアニン色素は、一般に、様々な供給源、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム）から市販されている。他の有用な蛍光色素は、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（商標）、Ｑｕａｓａｒ（商標）５７０、Ｑｕａｓａｒ（商標）６７０、Ｑｕａｓａｒ（商標）７０５、Ｐｕｌｓａｒ（商標）６５０、ＬＣ－Ｒｅｄ６４０、ＬＣ－Ｒｅｄ７０５、及び他の色素である。他の有用な蛍光色素としては、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ（登録商標）６１０、及びＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ６３５を含むＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ファミリーの色素が挙げられる。Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（商標）、Ｑｕａｓａｒ（商標）、Ｐｕｌｓａｒ（商標）、及びＣＡＬ Ｆｌｕｏｒファミリーの色素は、カリフォルニア州ノバトのＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。
【0060】
「鑑別する」という用語は、複数の特定の標的のうちのどれが試料中に存在するかを評価する能力を指す。
【0061】
「クエンチャー部分」又は「クエンチャー分子」は、検出可能な部分からの検出可能なシグナルをクエンチすることができる分子である。蛍光検出可能部分と共に使用されるクエンチャー部分の例としては、例えば、いわゆるダーククエンチャー、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標）－１又はＢＨＱ（登録商標）－２）（ＬＧＣ ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ノバト）又はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル）；及び蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）を使用する蛍光部分、例えば上記のシアニン色素等が挙げられる。「ダーククエンチャー」は、蛍光励起が可能な分子であるが、励起に応答して光を放出する代わりに、それらは励起エネルギーを熱に変換する。
【0062】
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照されたい）は、ドナー検出可能部分及び対応するアクセプター検出可能部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、又は他の方法で検出及び／又は定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。アクセプターは、典型的には、伝達されたエネルギーを熱（ダーククエンチャー）又は異なる波長の光放射のいずれかの形態で再放出する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照されたい）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
【0063】
一例において、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分（例えば、ＨＥＸ染料）及び対応するダーククエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ））を含むことができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ＰＣＲの伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、例えばＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断され、その結果、ドナー蛍光部分の蛍光発光はもはやクエンチされず、検出可能な標識に特徴的な波長で光が放射される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。
【0064】
蛍光検出は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタにかけた他の高強度光源を用いて行うことができる。
【0065】
ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。一般に、リンカーアームは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までの距離として測定される場合、約１０Å～約２５Åの長さである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法を開示している。ドナー又はアクセプター蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧ等の、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ、例えばＤＮＡ核酸ポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができるオリゴマー核酸化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、修飾オリゴヌクレオチドも指す。オリゴヌクレオチドの３’末端は、更なるヌクレオチドがテンプレート依存性核酸ポリメラーゼによって結合され得る遊離３’－ＯＨ基を提供する。プライマーは、一本鎖ＤＮＡ標的の特定の配列にハイブリダイズし、標的ＤＮＡ分子に相補的なヌクレオチドの付加を介して核酸ポリメラーゼによって伸長される。プライマーはまた、逆転写工程、例えば標的ＲＮＡ分子からのテンプレート依存性伸長をプライミングしてｃＤＮＡ分子を生成するのに役立つ可能性がある。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、少なくとも１つの検出可能な部分を含み、標的核酸検出を行うために５’－ヌクレアーゼ反応で使用されるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、例えば、プローブは、単一の検出可能な部分（例えば、蛍光色素等）のみを含む。特定の実施形態では、プローブは、プローブが選択された条件下でヘアピン構造を形成することができるような自己相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも２つの検出可能部分を含み、２つの標識のうちの１つがオリゴヌクレオチドから切断又は別様に分離された後に、増大した強度の放射線を放つ。特定の実施形態では、プローブは、２つの異なる蛍光色素、例えば、５’末端レポーター色素及び３’末端色素で標識される。他の実施形態において、プローブは、蛍光色素及びクエンチャーで、例えば、５’末端レポーター色素及び３’末端クエンチャーで標識される。いくつかの実施形態では、プローブは、末端位置以外の位置、又は末端位置に加えて、クエンチャー部分で標識されてもよく、例えば、クエンチャーは内部位置に位置してもよい。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的に低減又はクエンチされるように、蛍光共鳴エネルギー移動を介して２つのフルオロフォアの間で起こる。ＰＣＲの伸長工程中、例えばテンプレート核酸にハイブリダイズした５’－ヌクレアーゼプローブは、例えばＤＮＡポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断され、その結果、レポーター色素の蛍光発光はもはや消光されず、その特徴的な波長でレポーター色素から光が放射される。例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；米国特許第５，９９４，０５６号；及び米国特許第６，１７１，７８５号に記載される。
【0068】
実施形態に応じて、使用されるプローブ（複数可）は、任意に、少なくとも１つの標識及び少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。いくつかの実施形態では、プローブは、２種以上の異なるレポーター染料及びクエンチャー染料又は部分で標識されてよい。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。
【0069】
本明細書で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー（複数可）」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列を特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列の例としては、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子、Ｓ遺伝子、ＯＲＦ３ａｂ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、及び他の予測されるＯＲＦ領域、ならびに非コード領域内の核酸が挙げられる。検討されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、標的領域にアニーリングする。対応する標的配列を含む１つ以上の核酸が試料中に存在する場合、１つ以上の増幅産物が産生され、言い換えれば、１つ御以上の増幅産物の存在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す。増幅産物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についての１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブ（複数可）」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸と特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、及び検出工程を含み、試料は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を検出するために１つ以上の検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブと接触する。
【0070】
同様に、本明細書で使用される「インフルエンザＡプライマー（複数可）」及び「インフルエンザＢプライマー（複数可）」という用語は、それぞれインフルエンザＡゲノム及びインフルエンザＢゲノムに見られる核酸配列を特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。本明細書で使用される場合、「インフルエンザＡプローブ（複数可）」及び「インフルエンザＢプローブ（複数可）」という用語は、それぞれインフルエンザＡゲノム及びインフルエンザＢゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングし、それぞれの標的増幅産物の検出を可能にするオリゴヌクレオチドプローブを指す。
【0071】
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連する核酸ポリメラーゼの活性を指し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去され、３’末端に向かって移動する。
【0072】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖テンプレート核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
【0073】
本明細書で使用される場合、「伸長」又は「延長」という用語は、ヌクレオチド（又は他の類似の分子）が成長中の核酸増幅産物に組み込まれるプロセスを指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒によって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加する核酸ポリメラーゼによって伸長され得る。
【0074】
「Ｃｔ」（又はサイクル閾値）という用語は、蛍光シグナルが所定の蛍光シグナル閾値（すなわち、シグナルがバックグラウンドレベルを超える場合）を超えるのに必要なＰＣＲサイクルの数を指す。「Ａｍｐ」（又は増幅シグナル）という用語は、ＰＣＲ増殖曲線の最終振幅の計算された平均を指す。これは、終点蛍光を正規化されたベースライン蛍光で割ることによって計算され、したがって単位なしの量である。
【0075】
２以上の核酸配列の文脈における「同一」又は「同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定して最大の一致に関して比較及びアラインメントした場合に、同一又は特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）’’Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ’’Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）’’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ’’Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）’’Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ’’Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）’’Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ’’Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）’’ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ’’Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されている。
【0076】
「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する天然に存在しないヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド（又は「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然のヌクレオチドとは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ等が挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。他の実施形態では、特定の修飾ヌクレオチド置換は、非特異的核酸増幅（例えば、プライマー－ダイマー形成等を最小限に抑える）を減少させ、及び／又は意図する標的アンプリコンの収量を増加させることができる。他の修飾ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、又は他の望ましい特徴を提供し得る。これらの種類の核酸修飾の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。「修飾ヌクレオシド」は、「修飾ヌクレオチド」について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
【0077】
標的核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、様々なコンピュータプログラム、例えばＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．、コロラド州カスケード）等のコンピュータプログラムを使用して設計することができる。増幅プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０ヌクレオチド長、又はその間の任意の整数）である。
【0078】
本明細書に例示される核酸以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸も、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために使用し得る。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を使用して当業者によって特異性及び／又は感度について評価され得る。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸における１つ以上の欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～３０から選択される配列を有する核酸、又は配列番号１～３０の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体を含む。
【0079】
特定の実施形態は、米国特許出願公開第２０１００００５６３８３号の図１に示すように、細胞溶解ゾーン、核酸調製ゾーン、第１段階増幅ゾーン、第２段階増幅ゾーンを含む自己含有核酸分析チューブを含む。装置は、様々なサイズの様々なチャネル及びセグメントを形成するために破断可能なシールによって区画（又はセグメント）にセグメント化された可撓性装置であってもよい。個々の区画は、試料を処理するための様々な試薬及び緩衝液を含み得る。チューブ内の液体は、圧力、例えば空気圧によってブリスター間を移動する。特に、クランプ及びアクチュエータは、流体の移動を指示し、破断可能なシールを破裂させるために、様々な組み合わせで、様々なタイミングで装置に適用することができる。破断可能なシールのこの破裂は、セグメント間の流体の流れを可能にする装置内面を残すことができる。一実施形態では、生物学的試料の流れは、処理が進行するにつれて装置の遠位端に向けられてもよく、廃棄物の流れは、試料が最初に入力された装置の開口部に向かって反対方向に移動するように強制されてもよい。この試料入口は、場合によっては恒久的に、ロック機構を備えたキャップによって密封することができ、廃棄物チャンバは、貯蔵のために廃棄物を受け入れるためにキャップ内に配置することができる。この手法の大きな利点は、処理された試料が、処理されていない試料が触れた表面と接触しないことである。その結果、装置の壁を被覆する可能性がある未処理の試料中に存在する微量の反応阻害剤は、処理された試料を汚染する可能性が低い。
【0080】
例示的な実施形態では、１つ以上の試薬は、乾燥物質として及び／又は液体溶液として装置セグメントに保存することができる。試薬が乾燥フォーマットで保存され得る実施形態では、試薬溶液の再構成を容易にするために、液体溶液を隣接するセグメントに保存することができる。代表的な試薬としては、溶解試薬、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、ＤＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテイナーゼ阻害剤、キレート剤、中和試薬、カオトロピック塩溶液、洗剤、界面活性剤、抗凝固剤、発芽液（ｇｅｒｍｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、イソプロパノール、エタノール溶液、抗体、核酸プローブ、ペプチド核酸プローブ、及びホスホロチオエート核酸プローブ等が挙げられる。試薬の１つがカオトロピック塩溶液である実施形態では、好ましい成分は、グアニジニウムイソシアネート若しくはグアニジニウム塩酸塩、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、試料が投入される開口部に対して試薬が装置内に貯蔵され得る順序は、チューブを利用する方法において試薬が使用され得る順序を反映する。いくつかの実施形態では、試薬は、試料の予め選択された成分に特異的に結合することができる物質を含む。例えば、物質は核酸に特異的に結合し得るか、又は核酸プローブは特定の塩基配列を有する核酸に特異的に結合し得る。他の実施形態では、１つ以上のデバイスセグメントは、反応混合物中の核酸又は他の成分に特異的に結合する分子又は物質を内面に担持して、核酸又は他の成分の単離又は除去を容易にし得る。米国特許第１０，７７４，３９３号を参照されたい。
【0081】
デバイスセグメントからのシグナルのリアルタイム検出は、ブロックに接続された光度計、分光計、蛍光計、又はＣＣＤ等のセンサを使用することによって達成することができる。シグナルのフォーマットは、蛍光、スペクトル、及び／又は画像（細胞の画像又は量子ドット等の人工要素等）等の特定の波長における光の強度とすることができる。蛍光検出のため、光学系からの光の励起を使用して反応を照らすことができ、発光を蛍光計、光度計、分光計、又はＣＣＤによって検出することができる。特定の波長を有する複数のシグナルを検出するために、分光計の専用の検出チャネルによって異なる波長シグナルを直列又は並列に検出することができる。
【0082】
本開示の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための、又はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を同時に検出するためのキットを更に提供する。キットは、適切な包装材料と共に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子標的（複数可）を検出するため、又はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子標的を検出するために使用されるプライマー及びプローブを含むことができる。インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための代表的なプライマー及びプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子を増幅してハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例を本明細書で提供する。
【0083】
キットはまた、プローブを標識するための１つ以上の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、標的プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。キットはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブを使用して試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための説明書を有する添付文書又は包装ラベルを含むことができる。キットは、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。キットはまた、様々な成分、例えばプライマー及び／又はプローブ、添付文書、及び／又は試薬を保持するための１つ以上の容器の形態で提供され得る。
【実施例】
【0084】
以下の実施例、表、及び図は、主題の理解を助けるために提供される。本発明の趣旨（複数可）から逸脱することなく、本明細書に記載の開示に修正を加えることができることを理解されたい。
【0085】
実施例１：候補プライマー及びプローブオリゴヌクレオチドセットの選択
ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）インフルエンザＡ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州プレザントン）（「Ａ／Ｂ－ＲＳＶアッセイ」又は「Ａ／Ｂ ＲＳＶ試験」）から始めて、ＲＳＶ特異的オリゴヌクレオチドをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的オリゴヌクレオチドで置き換えることにより、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置上で同時に検出するアッセイを開発した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための本明細書に記載の方法及びアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの２つの異なる遺伝子（ｏｒｆ１ａｂ及びＮ遺伝子）を標的化して、単一のゲノム領域のみを標的化した場合に見逃され得る株の増加による偽陰性結果の可能性を最小限に抑えることを含む。同様に、同じＡ／Ｂ－ＲＳＶアッセイから始めて、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出するために使用されるオリゴヌクレオチドを削除し、またＲＳＶ検出をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出に置き換えることによって、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のみを検出するアッセイを開発した。このバージョンでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのオリゴヌクレオチドのみが存在する。
ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）インフルエンザＡ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州プレザントン）（「Ａ／Ｂ－ＲＳＶアッセイ」又は「Ａ／Ｂ ＲＳＶ試験」）から始めて、ＲＳＶ特異的オリゴヌクレオチドをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的オリゴヌクレオチドで置き換えることにより、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置上で同時に検出するアッセイを開発した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための本明細書に記載の方法及びアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの２つの異なる遺伝子（ｏｒｆ１ａｂ及びＮ遺伝子）を標的化して、単一のゲノム領域のみを標的化した場合に見逃され得る株の増加による偽陰性結果の可能性を最小限に抑えることを含む。同様に、同じＡ／Ｂ－ＲＳＶアッセイから始めて、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出するために使用されるオリゴヌクレオチドを削除し、またＲＳＶ検出をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出に置き換えることによって、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のみを検出するアッセイを開発した。このバージョンでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのオリゴヌクレオチドのみが存在する。
【0086】
Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイからインフルエンザＡ及びインフルエンザＢのオリゴヌクレオチドと多重化することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリゴヌクレオチドを同定するために、バイオインフォマティクス分析を行った。Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイのインフルエンザＡプライマー及びインフルエンザＢプライマーならびにプローブの配列を表１に示す。インフルエンザＡプローブをＦＡＭ及びＢＨＱ－１で標識し、インフルエンザＢプローブをＣａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ノバト）及びＢＨＱ－２で標識する。表２は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのｏｒｆ１ａｂ領域を標的とするプライマー及びプローブを示す。表３は、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＮ遺伝子を標的とするプライマー及びプローブを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ及びＮ遺伝子プローブをＣＹ５．５及びＢＨＱ－２で標識する。図１は、表２及び表３に列挙した様々なオリゴヌクレオチドが標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム中の位置を示し、図２は、表１に列挙されるインフルエンザＡプライマー及びインフルエンザＢプライマー及びプローブによって標的化される位置を示す。
【0087】
【表1】
【0088】
【表2】
【0089】
【表3】
【0090】
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリゴヌクレオチドセットの選択－ｏｒｆ１ ａｂ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ遺伝子領域に対する様々な候補オリゴヌクレオチドセット（表２及び表４）を、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出のためのＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験からのオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した場合の性能について評価した。オリゴヌクレオチドセット及びそれらの成分を表４に示す。例えば、オリゴヌクレオチドセットＦ３－セット１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ遺伝子内の領域を標的とし、配列番号１（フォワードプライマー）、配列番号１８（プローブ）及び配列番号４（リバースプライマー）のオリゴヌクレオチドを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ遺伝子領域に対する様々な候補オリゴヌクレオチドセット（表２及び表４）を、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出のためのＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験からのオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した場合の性能について評価した。オリゴヌクレオチドセット及びそれらの成分を表４に示す。例えば、オリゴヌクレオチドセットＦ３－セット１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ遺伝子内の領域を標的とし、配列番号１（フォワードプライマー）、配列番号１８（プローブ）及び配列番号４（リバースプライマー）のオリゴヌクレオチドを含む。
【0091】
【表4】
【0092】
Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイで使用されるＲＳＶオリゴヌクレオチドを、同じ濃度の様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ候補オリゴヌクレオチドセットで置き換え、Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイチューブパッキング構成、スクリプト、及びデータ分析用のコールツールを使用して、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）システムで分析を行った。精製インフルエンザＡ（Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７）及びインフルエンザＢ（Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４）ＲＮＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎＣｏＶ１転写物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１由来のｎｔ１４８８０－１５０２０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７０））をＭｕｌｔｉＰｒｅｐ検体希釈液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ニュージャージー州ブランチバーグ）（バルク汎用検体希釈液としても知られている）で希釈し、アッセイ性能試験で使用した。７つのＦ３オリゴヌクレオチドセットのそれぞれを用いた３回の陰性実行では偽陽性は観察されなかった（Ｆ３セットはｏｒｆ１ａｂに対するものであった）。ｎＣｏＶ１ ＲＮＡ転写物が１００コピー／試験である場合、オリゴヌクレオチドセットＦ３－セット３、Ｆ３－セット４、Ｆ３－セット５及びＦ３－セット６は、他の３つのオリゴヌクレオチドセットよりも良好な性能を示した（図３Ｅ及び図３Ｆ）。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢについて、Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイを使用した結果と比較した場合、Ｃｔは、これらのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリゴヌクレオチドセットとの多重化によって影響を受けなかったが、オリゴヌクレオチドセットＦ３－セット３、Ｆ３－セット４及びＦ３－セット５のみが、Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイと比較的同等の性能を示した（図３Ａ～３Ｄ）。したがって、更なる性能試験のためにＦ３－セット３、Ｆ３－セット４、及びＦ３－セット５を選択した。
【0093】
選択したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｆ３オリゴヌクレオチドセットの更なる性能評価を、模擬ユニバーサル輸送媒体（「ｓＵＴＭ」）中で３×ＬｏＤインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、３×ＬｏＤインフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び４００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネルメンバー１（Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。Ｆ３－セット３及びＦ３－セット４と比較して、Ｆ３－セット５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出について同等のＣｔ及びより高いＡｍｐを示し（図４Ｅ～Ｆ）、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢについてより良好な性能（図４Ａ～Ｄ）を示した。ＦｌｕＡ／Ｂ－ＲＳＶと比較して、Ｆ３－セット５は、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対してわずかに減少したＡｍｐしか示さなかったことに留意されたい。したがって、更なる研究のために、Ｆ３－セット５を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｒｆ１ａｂ遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドセットとして選択した。
【0094】
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリゴヌクレオチドセットの選択－Ｎ遺伝子
二重標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験を構築するために、バイオインフォマティクスアプローチを使用して、Ｎ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドの７セットを調製した（表３及び表４）。Ｎ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドを用いた初期オリゴヌクレオチドスクリーニングを、ｓＵＴＭを含有するｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）フルチューブ内で直接行った。各Ｆ４オリゴヌクレオチドセットを用いた４回の純粋な陰性実行（試料マトリックスを添加しない）では偽陽性は観察されなかった。１０００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１の場合、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７は、他のＦ４オリゴヌクレオチドセットよりも有意に良好な性能を示した（図５Ｅ～Ｆ）。さらに、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７は、１０×インフルエンザＡ（１．６４×１０－２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）（図５Ａ～Ｂ）及び１０×インフルエンザＢ（５．５８×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）（図５Ｃ～Ｄ）の存在下で許容可能な性能を示した。したがって、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７を更なる性能試験のために選択した。
二重標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験を構築するために、バイオインフォマティクスアプローチを使用して、Ｎ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドの７セットを調製した（表３及び表４）。Ｎ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドを用いた初期オリゴヌクレオチドスクリーニングを、ｓＵＴＭを含有するｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）フルチューブ内で直接行った。各Ｆ４オリゴヌクレオチドセットを用いた４回の純粋な陰性実行（試料マトリックスを添加しない）では偽陽性は観察されなかった。１０００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１の場合、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７は、他のＦ４オリゴヌクレオチドセットよりも有意に良好な性能を示した（図５Ｅ～Ｆ）。さらに、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７は、１０×インフルエンザＡ（１．６４×１０－２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）（図５Ａ～Ｂ）及び１０×インフルエンザＢ（５．５８×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）（図５Ｃ～Ｄ）の存在下で許容可能な性能を示した。したがって、オリゴヌクレオチドセットＦ４－セット７を更なる性能試験のために選択した。
【0095】
実施例４：インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出における、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）インフルエンザＡ／Ｂ及びＲＳＶアッセイに対する単一標的及び二重標的アッセイ
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出において、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイの性能を、インフルエンザＡ／Ｂ＆ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２単一標的試験（「ＳＴＡ」）（ｏｒｆ１ａｂ標的のみ）及び二重標的試験（「ＤＴＡ」）（ｏｒｆ１ａｂ及びＮ遺伝子標的）の性能と比較するために試験を行った。単一及び二重標的試験の両方について、１０回の純粋な陰性実行（試料マトリックスを添加しない）及び１０回の陰性実行（ｓＵＴＭを添加）は、偽陽性シグナルを明らかにしなかった。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出する際のＦ３－セット５オリゴセットを有するＳＴＡならびにＦ３－セット５及びＦ４－セット７オリゴセットを有するＤＴＡの性能を、ｓＵＴＭ及びＵＴＭにおいて評価した。ｓＵＴＭでは、標的インプットは、３×ＬｏＤインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、３×ＬｏＤインフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び４００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１であった。ＵＴＭでは、標的インプットは、３×ＬｏＤインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、３×ＬｏＤインフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び５０コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）参照材料であった。
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出において、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイの性能を、インフルエンザＡ／Ｂ＆ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２単一標的試験（「ＳＴＡ」）（ｏｒｆ１ａｂ標的のみ）及び二重標的試験（「ＤＴＡ」）（ｏｒｆ１ａｂ及びＮ遺伝子標的）の性能と比較するために試験を行った。単一及び二重標的試験の両方について、１０回の純粋な陰性実行（試料マトリックスを添加しない）及び１０回の陰性実行（ｓＵＴＭを添加）は、偽陽性シグナルを明らかにしなかった。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出する際のＦ３－セット５オリゴセットを有するＳＴＡならびにＦ３－セット５及びＦ４－セット７オリゴセットを有するＤＴＡの性能を、ｓＵＴＭ及びＵＴＭにおいて評価した。ｓＵＴＭでは、標的インプットは、３×ＬｏＤインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、３×ＬｏＤインフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び４００コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１であった。ＵＴＭでは、標的インプットは、３×ＬｏＤインフルエンザＡ（４．９２×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、３×ＬｏＤインフルエンザＢ（１．６７×１０－３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）及び５０コピー／ｍＬのＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）参照材料であった。
【0096】
図６に示されるように、ＳＴＡ及びＤＴＡの性能は、Ｃｔ値（図６Ａ及び６Ｃ）で測定した場合、ｓＵＴＭにおけるインフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出において、Ａ／Ｂ＆ＲＳＶアッセイの性能に匹敵した。ＳＴＡは、ｓＵＴＭにおいてインフルエンザＡ及びインフルエンザＢについてより高いＡｍｐ値を示し、ＤＴＡは、ｓＵＴＭにおいてインフルエンザＡ及びインフルエンザＢについて同等のＡｍｐ値を示した（図６Ｂ及び６Ｄ）。図７に見られるように、標的をＵＴＭで評価した場合、同様の結果が得られた。ＳＴＡ及びＤＴＡは、Ｃｔ値で測定した場合、ＵＴＭでのインフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出においてＡ／Ｂ－ＲＳＶアッセイと同等であった（図７Ａ及び７Ｃ）。ＳＴＡは、ＵＴＭにおいてインフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対してより高いＡｍｐを示し、ＤＴＡは、ＵＴＭにおいてインフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対して同等のＡｍｐを示した（図７Ｂ及び７Ｄ）。
【0097】
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出における単一標的アッセイ及び二重標的アッセイ対Ａ／Ｂ－ＲＳＶアッセイ
ＳＴＡ及びＤＴＡは、ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１について、ｓＵＴＭ中１００コピー／ｍＬ（ヒット率９５％以上）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出感度を示した（表５）。両方の試験は、１００コピー／ｍｌ及び５０コピー／ｍｌの両方で良好に機能したが、ＤＴＡは、ＳＴＡよりも５０コピー／ｍｌでわずかに高いＣｔ値を有した（図８Ａ）。１００コピー／ｍＬ及び５０コピー／ｍＬの両方について、ＳＴＡは、ＤＴＡよりも高いＡｍｐを示した（図８Ｂ）。
ＳＴＡ及びＤＴＡは、ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）パネルメンバー１について、ｓＵＴＭ中１００コピー／ｍＬ（ヒット率９５％以上）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出感度を示した（表５）。両方の試験は、１００コピー／ｍｌ及び５０コピー／ｍｌの両方で良好に機能したが、ＤＴＡは、ＳＴＡよりも５０コピー／ｍｌでわずかに高いＣｔ値を有した（図８Ａ）。１００コピー／ｍＬ及び５０コピー／ｍＬの両方について、ＳＴＡは、ＤＴＡよりも高いＡｍｐを示した（図８Ｂ）。
【0098】
ＵＴＭでは、ＳＴＡとＤＴＡの両方が、ＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）参照材料のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出感度を、それぞれ５０コピー／ｍＬ及び２５コピー／ｍＬで示した（ヒット率９５％）（表５）。両方の試験は、５０コピー／ｍｌよりも２５コピー／ｍｌでわずかに高いＣｔ値を有した（図９Ａ）。ＳＴＡ及びＤＴＡの両方について、予想通り、２５コピー／ｍＬよりも５０コピー／ｍＬでより高いＡｍｐ値が測定され、両方の試験で同様の値が得られた（図９Ｂ）。
【0099】
【表5】
【0100】
実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬｏＤ研究
ＬｏＤ（検出限界）研究は、全ての（真陽性）複製物の９５％以上が試験で陽性となる最低検出可能濃度の標的配列を決定する。本明細書に記載の方法を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬｏＤを決定するために、米国患者（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０、カタログ番号０８１０５８７ＣＦＨＩ－０．５ｍＬ、ロット番号３２４０４７、３．１６×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、米国ニューヨーク州バッファロー）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株の熱不活性化培養試料をプールされた陰性臨床鼻咽頭スワブマトリックス（ＮＮＰＳ）に段階希釈した。レベル間に２倍の連続希釈を有する５つの濃度レベルを、１０個の複製物のみを試験した最高濃度レベルを除いて、濃度ごとに２０個の複製物で試験した。さらに、３つの複製物のブランク試料（すなわち、プールされたＮＮＰＳ）を試験して、マトリックスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であることを確認した。ＬｏＤ試験のため、ＤＴＡアッセイチューブの３つのパイロットロットが、ロットあたりの複製数がほぼ等しく、２０個のｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置（分析装置あたり４～５回の実行）及び２つの独立した希釈系列ＬｏＤごとに同数の複製物も組換え希釈系列を使用して決定した）を研究に使用した。
ＬｏＤ（検出限界）研究は、全ての（真陽性）複製物の９５％以上が試験で陽性となる最低検出可能濃度の標的配列を決定する。本明細書に記載の方法を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＬｏＤを決定するために、米国患者（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０、カタログ番号０８１０５８７ＣＦＨＩ－０．５ｍＬ、ロット番号３２４０４７、３．１６×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、米国ニューヨーク州バッファロー）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株の熱不活性化培養試料をプールされた陰性臨床鼻咽頭スワブマトリックス（ＮＮＰＳ）に段階希釈した。レベル間に２倍の連続希釈を有する５つの濃度レベルを、１０個の複製物のみを試験した最高濃度レベルを除いて、濃度ごとに２０個の複製物で試験した。さらに、３つの複製物のブランク試料（すなわち、プールされたＮＮＰＳ）を試験して、マトリックスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であることを確認した。ＬｏＤ試験のため、ＤＴＡアッセイチューブの３つのパイロットロットが、ロットあたりの複製数がほぼ等しく、２０個のｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置（分析装置あたり４～５回の実行）及び２つの独立した希釈系列ＬｏＤごとに同数の複製物も組換え希釈系列を使用して決定した）を研究に使用した。
【0101】
表６に示すように、観察されたヒット率が９５％以上の濃度レベルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について０．０１２ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。表７に示されるように、プロビットは、９５％のヒット率がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について０．０１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであると予測した。
【0102】
１×１０４コピー／ｍＬでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＡｃｃｕＰｌｅｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検証パネル、メンバー２。プロビット予測によって得られたＬｏＤは５８コピー／ｍＬであり、９５％ＣＩは４１～１２４であった（データは示さず）。
【0103】
【表6】
【0104】
【表7】
【0105】
実施例７：Ｆｌｕ Ａ／Ｆｌｕ Ｂ ＬｏＤ分析
この試験は、本明細書に記載の二重標的アッセイのインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ分析感度がＡ／Ｂ－ＲＳＶアッセイのものと同等であることを示した。
この試験は、本明細書に記載の二重標的アッセイのインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ分析感度がＡ／Ｂ－ＲＳＶアッセイのものと同等であることを示した。
【0106】
培養インフルエンザＡウイルス株Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（カタログ番号０８１０２４４ＣＦ、ロット番号３１２２９６、１．４１×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、米国ニューヨーク州）及びインフルエンザＢウイルス株Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６（カタログ番号０８１０２５５ＣＦ、ロット番号３１２４７９、１．４１×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、米国ニューヨーク州）を、プールされた陰性臨床鼻咽頭スワブマトリックス（ＮＮＰＳ）にスパイクし、次いで、連続希釈し、ＤＴＡ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験の両方を使用して試験した。
【0107】
レベル間に２倍の連続希釈を有する５つの濃度レベルを、１０個の複製物のみを試験した最高濃度レベルを除いて、濃度ごとに合計２０個の複製物で試験した。さらに、３つの複製物のブランク試料（すなわち、プールされたＮＮＰＳ）を試験して、マトリックスがインフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対して陰性であることを確認した。３つのパイロットロットのＤＴＡチューブ、２０個のｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析装置（分析装置あたり４～５回の実行）及び２つの独立した希釈系列（希釈系列あたりの複製物の数に等しい）を試験に使用した。１ロットのＡ／Ｂ－ＲＳＶ試薬を研究に使用した。
【0108】
観察されたヒット率が９５％以上の濃度レベルは、二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験の両方について、インフルエンザＡについて０．００１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（表８）及びインフルエンザＢについて０．００４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（表９）であった。インフルエンザＢ複製物の１つは、Ａ／Ｂ－ＲＳＶ試験によって有効な「不確定」結果を生成し、この複製物は有効な複製物であるため、ヒット率計算のための全複製に含まれていた。
【0109】
表１０に示されるように、プロビットは、インフルエンザＡの９５％ヒット率を、二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験についてそれぞれ０．０００７及び０．０００９ＴＣＩＤ５０／ｍＬと予測した。プロビットは、インフルエンザＢの９５％ヒット率を、二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験についてそれぞれ０．００１８及び０．００２６ＴＣＩＤ５０／ｍＬと予測した。重複信頼区間は、ＤＴＡ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験の分析感度がインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ検出について同等であることを実証した。
【0110】
【表8】
【0111】
【表9】
【0112】
【表10】
【0113】
ＬｏＤの更なる分析を、（プロビット分析がインフルエンザＡについての信頼区間を有していなかったため）より厳しい信頼区間について最尤法（ＭＬＥ）を使用して行った。８３％ＣＩは、インフルエンザＡ（ＤＴＡについては０．０００７～０．００１２及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験については０．００１０～０．００１７）及びインフルエンザＢ（ＤＴＡについては０．００１４～０．００２２及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験については０．００１８～０．００２９）について重複していることが示され、二重標的アッセイとＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験との間に統計学的有意差がないことが実証された。
【0114】
実施例８：臨床試料におけるインフルエンザＡ／Ｂの検出
保管されたインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ陽性臨床試料を、二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験を用いて試験した。臨床試料は、ＵＴＭの鼻咽頭スワブ検体であり、様々な外部供給業者から入手した。さらに、ＣＤＣ２０１９ヒトインフルエンザウイルスパネル（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０２／２０１８株、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９株を含む）；インフルエンザＢ Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７及びインフルエンザＢ Ｙａｍａｇａｔａ系統Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３をＮＮＰＳに希釈し、Ａ／Ｂ－ＲＳＶ試験及び二重標的試験の両方を用いて試験した。
保管されたインフルエンザＡ及びインフルエンザＢ陽性臨床試料を、二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験を用いて試験した。臨床試料は、ＵＴＭの鼻咽頭スワブ検体であり、様々な外部供給業者から入手した。さらに、ＣＤＣ２０１９ヒトインフルエンザウイルスパネル（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０２／２０１８株、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９株を含む）；インフルエンザＢ Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７及びインフルエンザＢ Ｙａｍａｇａｔａ系統Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３をＮＮＰＳに希釈し、Ａ／Ｂ－ＲＳＶ試験及び二重標的試験の両方を用いて試験した。
【0115】
表１１～１３に示すように、全ての陽性臨床試料が両試験で陽性と試験された。表１１を参照すると、両方の試験は、インフルエンザＡ試料の１００％を検出し、偽陽性インフルエンザＢ結果を報告しなかった。同様に、表１２に示すように、両方の試験は、インフルエンザＢ試料の１００％を検出し、偽陽性インフルエンザＡ結果を報告しなかった。最後に、表１３は、ＣＤＣ２０１９ヒトインフルエンザウイルスパネルの２つのインフルエンザＡ及び２つのインフルエンザＢ株／系統が二重標的アッセイ及びＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験の両方によって適切に検出されたことを示す。
【0116】
【表11】
【0117】
【表12】
【0118】
【表13】
【0119】
実施例９：ＤＴＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との交差反応性
不活化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１全ウイルスを試験することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との二重標的アッセイの交差反応性を評価した。ガンマ線照射された培養ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｕｒｂａｎｉ株（カタログ番号ＮＲ－９５４７、ロット番号５８５４２０３６、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、米国バージニア州）を、ＵＴＭのプールされた陰性鼻咽頭スワブ試料に、１．０×１０５～１．０×１０１ｐｆｕ／ｍＬの最終濃度に連続希釈した。結果を表１４に示す。試験した濃度のいずれも、偽陽性結果を生成することによって二重標的アッセイ性能を妨げなかった。
不活化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１全ウイルスを試験することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との二重標的アッセイの交差反応性を評価した。ガンマ線照射された培養ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｕｒｂａｎｉ株（カタログ番号ＮＲ－９５４７、ロット番号５８５４２０３６、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、米国バージニア州）を、ＵＴＭのプールされた陰性鼻咽頭スワブ試料に、１．０×１０５～１．０×１０１ｐｆｕ／ｍＬの最終濃度に連続希釈した。結果を表１４に示す。試験した濃度のいずれも、偽陽性結果を生成することによって二重標的アッセイ性能を妨げなかった。
【0120】
【表14】
【0121】
実施例１０：ＤＴＡの臨床性能
二重標的試験の臨床性能を、呼吸器感染症が疑われる患者からＵＴＭで収集した５６個の既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭臨床試料及び２３１個の陰性臨床試料（鼻咽頭及び鼻スワブ試料の混合物）を使用して評価した。二重標的試験を用いて臨床試料の試験を行い、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州プレザントン）で使用するための市販のｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験の性能と比較した。
二重標的試験の臨床性能を、呼吸器感染症が疑われる患者からＵＴＭで収集した５６個の既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭臨床試料及び２３１個の陰性臨床試料（鼻咽頭及び鼻スワブ試料の混合物）を使用して評価した。二重標的試験を用いて臨床試料の試験を行い、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州プレザントン）で使用するための市販のｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験の性能と比較した。
【0122】
既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性検体を、ＢｉｏＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州オークランド）及びＵＣ Ｄａｖｉｓ（カリフォルニア州デイビス）から入手した。全ての陽性試料は、ＵＴＭで採取した鼻咽頭スワブであった。研究で使用された陰性臨床検体は、上気道感染症が疑われる個体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックの前に米国で収集された。これらの陰性検体には、ミニチップフロックスワブ及び通常のフロックスワブを使用してＵＴＭで収集された鼻及び鼻咽頭スワブ検体の両方が含まれる。採取装置の添付文書に従って、有資格者が臨床検体を採取した。回収装置の添付文書に記載されているように試料を取り扱い、使用するまで凍結保存した。
【0123】
合計５６個の既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭スワブ検体及び２３１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性検体（鼻咽頭スワブ検体と鼻スワブ検体との混合物）を試験した。表１５に示すように、５６個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料全てが、ＤＴＡ及びｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験の両方で陽性と試験された。試験した２３１の陰性検体のうち、５つが無効な結果を生成し、再試験時に、２つが二重標的試験で無効のままであった。二重標的試験に対する本試験の初期及び再試験後の無効率は、それぞれ１．７％（５／２８７）及び０．７％（２／２８７）であった。無効のままであった陰性試料は除外したため、２２９／２３１の陰性試料を含めた。１つの陰性試料はインフルエンザＡに対して陽性と試験され、この結果はＡ／Ｂ－ＲＳＶ試験で確認された（データは示さず）。ＤＴＡ及びｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検定の両方を使用して、２２９検体全てをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性と試験され、相関分析に使用した（表１６）。結果は、２つの試験間で１００％の陽性一致率（ＰＰＡ）及び１００％の陰性一致率（ＮＰＡ）を示した。
【0124】
【表15】
【0125】
【表16】
【0126】
実施例１１：Ｆｌｕ Ａ／Ｆｌｕ Ｂ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２競合阻害（同時感染）：
インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間の競合的阻害を、高濃度の１つのパネル標的及び低濃度の１つ以上の更なるパネル標的を含む共感染試料を使用して一連の希釈実験を行うことによって評価した。これらの実験の目的は、高濃度標的（複数可）の存在が競合による低濃度標的の検出を阻害する濃度を同定することであった。低濃度を約３×ＬｏＤと定義した。高濃度標的は、高力価（Ｃｔ２０～２４）又は非常に高力価（Ｃｔ１２～１６）のいずれかと定義した。低濃度標的が１００％のヒット率で検出されるまで、試料を一連の希釈で試験した。
インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間の競合的阻害を、高濃度の１つのパネル標的及び低濃度の１つ以上の更なるパネル標的を含む共感染試料を使用して一連の希釈実験を行うことによって評価した。これらの実験の目的は、高濃度標的（複数可）の存在が競合による低濃度標的の検出を阻害する濃度を同定することであった。低濃度を約３×ＬｏＤと定義した。高濃度標的は、高力価（Ｃｔ２０～２４）又は非常に高力価（Ｃｔ１２～１６）のいずれかと定義した。低濃度標的が１００％のヒット率で検出されるまで、試料を一連の希釈で試験した。
【0127】
不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）ウイルス、培養インフルエンザＡ（Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７）ウイルス、及び培養インフルエンザＢ（Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／０６及びＣｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７）ウイルスを、ＵＴＭ試料マトリックスに溶出したプール陰性鼻咽頭スワブで調製した。条件ごとに３つの複製物を試験した。希釈実験で試験した濃度をＩＤ ５０／ｍＬ及びコピー／ｍＬの両方で示す。
【0128】
Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｄｄＰＣＲ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０２１）を使用して、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を独立して増幅するように設計された標的特異的ＰＣＲプライマー及びプローブセットを用いた単一標的シングルプレックスアッセイで、ＲＴ－ｄｄＰＣＲ（逆転写酵素ドロップレットデジタルＰＣＲ）アッセイを使用して、コピー／ｍＬの各ウイルスストックの濃度を定量した。
【0129】
試験結果の概要を図１０に示す。インフルエンザＡの高標的試料は１２の平均Ｃｔを示したが、インフルエンザＢ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的試料は２０～２４の平均Ｃｔをもたらした。低標的濃度（標的２及び３）は約３×ＬｏＤであった。
【0130】
研究の結果は、インフルエンザＢが低濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の阻害を引き起こすために８．１０×１０５コピー／ｍＬを超える濃度を必要とすることを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、低濃度でインフルエンザＡ及びインフルエンザＢの両方の検出を阻害するために、３．６０×１０４コピー／ｍＬを超える濃度を必要とした。
【0131】
実施例１２：干渉微生物
干渉微生物研究は、鼻咽頭スワブ試料中に存在し得る非インフルエンザ微生物がインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの検出に干渉し得るかどうかを評価する。交差反応性試験で試験したヒトゲノムＤＮＡ及び３５個の微生物を含むパネルを、潜在的な干渉について試験した。細菌及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を≧１０６ＣＦＵ／ｍＬで試験し、ウイルスを≧１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ又は利用可能な最高濃度で、ＵＴＭマトリックス中の陰性ＮＰＳにおいて約３×ＬｏＤ濃度の１つのインフルエンザＡ株及び１つのインフルエンザＢ株の存在下で試験した。結果は、試験した濃度のヒトゲノムＤＮＡ又は微生物の存在がインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの検出を妨げなかったことを示す（表１７）。
干渉微生物研究は、鼻咽頭スワブ試料中に存在し得る非インフルエンザ微生物がインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの検出に干渉し得るかどうかを評価する。交差反応性試験で試験したヒトゲノムＤＮＡ及び３５個の微生物を含むパネルを、潜在的な干渉について試験した。細菌及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を≧１０６ＣＦＵ／ｍＬで試験し、ウイルスを≧１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ又は利用可能な最高濃度で、ＵＴＭマトリックス中の陰性ＮＰＳにおいて約３×ＬｏＤ濃度の１つのインフルエンザＡ株及び１つのインフルエンザＢ株の存在下で試験した。結果は、試験した濃度のヒトゲノムＤＮＡ又は微生物の存在がインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの検出を妨げなかったことを示す（表１７）。
【0132】
【表17-1】
【表17-2】
【0133】
実施例１３－臨床試験－インフルエンザＡ／Ｂ
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出におけるＤＴＡの臨床性能を、ＣＬＩＡを除外した１２の医療施設で評価した。２０１３年～２０１４年及び２０１４年～２０１５年のインフルエンザシーズン中に、米国において呼吸器感染症の徴候及び症状を有する患者から前向き鼻咽頭スワブ（ＮＰＳ）検体を収集し、研究施設で前向きに試験した。さらに、後向きＮＰＳ検体を、２つの参照実験室から得て、１２の施設のうちの３つに分配して試験した。後向き検体を、試験のためにそれらの部位の毎日のワークロードに組み込んだ。
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出におけるＤＴＡの臨床性能を、ＣＬＩＡを除外した１２の医療施設で評価した。２０１３年～２０１４年及び２０１４年～２０１５年のインフルエンザシーズン中に、米国において呼吸器感染症の徴候及び症状を有する患者から前向き鼻咽頭スワブ（ＮＰＳ）検体を収集し、研究施設で前向きに試験した。さらに、後向きＮＰＳ検体を、２つの参照実験室から得て、１２の施設のうちの３つに分配して試験した。後向き検体を、試験のためにそれらの部位の毎日のワークロードに組み込んだ。
【0134】
ＤＴＡ及びＦＤＡ認可検査室ベースの多重リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）試験（コンパレータ試験）を使用して、各患者の検体をインフルエンザＡ及びインフルエンザＢについて試験した。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出におけるＤＴＡの結果を、コンパレータ試験の結果と比較した。合計１，３５０の前向きＮＰＳ検体及び２９２の後向きＮＰＳ検体を性能分析に含めた。
【0135】
合計１，３５０の鼻咽頭スワブ（ＮＰＳ）検体を性能分析に含めた（表１８及び表１９）。コンパレータ試験と比較して、このアッセイは、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢについてそれぞれ９８．３％及び９５．２％の陽性一致を示し、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢについてそれぞれ９６．０％及び９９．４％の陰性一致を示した。
【0136】
【表18】
【0137】
【表19】
【0138】
後向き検体分析のために、合計２９２個の後向き鼻咽頭スワブ（ＮＰＳ）検体を性能分析に含めた（表２０及び表２１）。コンパレータ試験と比較して、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢは、それぞれ９８．７％及び９９．０％の陽性一致を示し、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢについてそれぞれ９９．１％及び９９．５％の陰性一致を示した。
【0139】
【表20】
【0140】
【表21】
【0141】
実施例１４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬｏＤ研究
二重標的アッセイを、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出するために使用されるプライマー及びプローブを除去することによって更に修飾し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に適したプライマー及びプローブのみを有するアッセイ（本明細書では「ＤＴ（－）アッセイ」と表記する）を作製した。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス（ＵＳＡＷＡ １／２０２０、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、カタログ番号０８１０５８７ ＣＦＨＩ－０．５ｍＬ）を使用して、ＤＴ（－）アッセイの予備的ＬｏＤを決定した。示された濃度を達成するために、プールされたＮＮＰＳ臨床バックグラウンドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２培養物を添加することによって４レベルパネルを調製した。同じパネルをコンパレータ試験としてＤＴＡに対しても試験した（表２２）。両方の試験を使用して、各レベルの２０個の複製物を試験した。９５％のヒット率によるＬｏＤ及び９５％の信頼限界を含むプロビット推定値の結果を両方の試験について要約する。
二重標的アッセイを、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出するために使用されるプライマー及びプローブを除去することによって更に修飾し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に適したプライマー及びプローブのみを有するアッセイ（本明細書では「ＤＴ（－）アッセイ」と表記する）を作製した。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス（ＵＳＡＷＡ １／２０２０、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、カタログ番号０８１０５８７ ＣＦＨＩ－０．５ｍＬ）を使用して、ＤＴ（－）アッセイの予備的ＬｏＤを決定した。示された濃度を達成するために、プールされたＮＮＰＳ臨床バックグラウンドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２培養物を添加することによって４レベルパネルを調製した。同じパネルをコンパレータ試験としてＤＴＡに対しても試験した（表２２）。両方の試験を使用して、各レベルの２０個の複製物を試験した。９５％のヒット率によるＬｏＤ及び９５％の信頼限界を含むプロビット推定値の結果を両方の試験について要約する。
【0142】
ＤＴＡ（－）アッセイＬｏＤは、９５％ヒット率及びプロビット推定値の両方によって決定されるように、０．０１２ ＴＣＩＤ５０／ｍＬである（表２２）。ＤＴＡとの比較も表２２に示す。ＤＴ（－）アッセイは、ＤＴＡよりもこの研究においてわずかに良好な分析感度を示したが、プロビットＬｏＤの重複信頼区間は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２検出のためのＤＴ（－）アッセイとＤＴＡアッセイとの間の同等の分析感度を示す。
【0143】
【表22】
【0144】
ＤＴ（－）アッセイとＤＴＡ試験との間のＣｔ及びＡＭＰ性能についてもデータセットを分析した。平均Ｃｔ及び平均ＡＭＰの要約を表２３に示す。ＤＴ（－）アッセイとＤＴＡ試験との間で平均Ｃｔに有意差はなかったが、ＤＴ（－）アッセイでは平均ＡＭＰの顕著な増加があった（表２３）。ＡＭＰの増加は、ＤＴＡよりもＤＴ（－）アッセイのロバスト性の増加を示唆している。
【0145】
【表23】
【0146】
実施例１５：ＤＴ（－）アッセイの包括性試験
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を実施して、ＤＴ（－）アッセイ（分類ＩＤ２６９７０４９）のためのオリゴヌクレオチドセットの予測される能力を決定し、ＮＣＢＩ（＞８６Ｋ）及びＧＩＳＡＩＤ（＞６５７Ｋ）データベース（２０２１年３月１５日現在）において全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を検出した。オリゴヌクレオチドセットによって検出される２つのデータベース中の各配列の予測される影響を、内部配列比較ソフトウェアを使用して評価し、Ｃｔ又はプローブ融解温度（Ｔｍ）の予測される増加として定量した。予測されたＣｔが５サイクルを超えて増加するか、又はプローブＴｍが６５℃未満である場合、配列はプライマー／プローブ試験セットによって検出されない可能性があると予測される。ＤＴ（－）アッセイオリゴヌクレオチドセット（ＤＴＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的オリゴヌクレオチドセットと同一である）についてのミスマッチ分析及び予測されるアッセイの影響を表２４に要約する。ＮＣＢＩ及びＧＩＳＡＩＤデータベースの全ての配列は、ＤＴ（－）アッセイのオリゴヌクレオチドセットの少なくとも１つによって検出されると予測される。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を実施して、ＤＴ（－）アッセイ（分類ＩＤ２６９７０４９）のためのオリゴヌクレオチドセットの予測される能力を決定し、ＮＣＢＩ（＞８６Ｋ）及びＧＩＳＡＩＤ（＞６５７Ｋ）データベース（２０２１年３月１５日現在）において全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を検出した。オリゴヌクレオチドセットによって検出される２つのデータベース中の各配列の予測される影響を、内部配列比較ソフトウェアを使用して評価し、Ｃｔ又はプローブ融解温度（Ｔｍ）の予測される増加として定量した。予測されたＣｔが５サイクルを超えて増加するか、又はプローブＴｍが６５℃未満である場合、配列はプライマー／プローブ試験セットによって検出されない可能性があると予測される。ＤＴ（－）アッセイオリゴヌクレオチドセット（ＤＴＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的オリゴヌクレオチドセットと同一である）についてのミスマッチ分析及び予測されるアッセイの影響を表２４に要約する。ＮＣＢＩ及びＧＩＳＡＩＤデータベースの全ての配列は、ＤＴ（－）アッセイのオリゴヌクレオチドセットの少なくとも１つによって検出されると予測される。
【0147】
【表24】
【0148】
実施例１６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床研究－無症候性試料
ＤＴ（－）アッセイの臨床性能を、ＣＯＶＩＤ－１９スクリーニングのために単一の検査施設に提出された無症候性個体から生理食塩水で収集された合計２０７個の鼻咽頭臨床試料を使用して評価した。臨床試料の試験は、ＤＴ（－）及びＣＯＶＩＤ－１９スクリーニングに承認されている高感度ＦＤＡクリアＥＵＡ分子アッセイを用いて行った。表２５に示すように、結果は、コンパレータ方法に対して、両側９５％信頼区間の下限８４．５％と１００％の陽性一致；９６．２％の両側９５％信頼区間の下限と９８．９％の陰性一致を示した。
ＤＴ（－）アッセイの臨床性能を、ＣＯＶＩＤ－１９スクリーニングのために単一の検査施設に提出された無症候性個体から生理食塩水で収集された合計２０７個の鼻咽頭臨床試料を使用して評価した。臨床試料の試験は、ＤＴ（－）及びＣＯＶＩＤ－１９スクリーニングに承認されている高感度ＦＤＡクリアＥＵＡ分子アッセイを用いて行った。表２５に示すように、結果は、コンパレータ方法に対して、両側９５％信頼区間の下限８４．５％と１００％の陽性一致；９６．２％の両側９５％信頼区間の下限と９８．９％の陰性一致を示した。
【0149】
【表25】
【0150】
実施例１７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床試験－陽性の疑いのある試料
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査の臨床性能を、呼吸器感染症の徴候及び症状を有するものを含む、ＣＯＶＩＤ－１９感染症を有すると疑われる個体からＵＴＭで収集された合計２３０個の鼻咽頭臨床試料を使用して評価した。臨床試料の試験は、ｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験及びＣＯＶＩＤ－１９の診断試験のために承認されている高感度ＦＤＡ認可ＥＵＡ分子アッセイを用いて行った。表２６に示すように、結果は、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍに対するｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験とコンパレータ法との間の９６．１％の陽性一致率（ＰＰＡ）及び９６．８％の陰性一致率（ＮＰＡ）を示した。８つの不一致検体（ｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験による５つの陽性及びコンパレータ法による３つの陽性）は全て、それぞれのアッセイについて検出限界以下の非常に低い陽性検体であり、陽性結果をもたらした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査の臨床性能を、呼吸器感染症の徴候及び症状を有するものを含む、ＣＯＶＩＤ－１９感染症を有すると疑われる個体からＵＴＭで収集された合計２３０個の鼻咽頭臨床試料を使用して評価した。臨床試料の試験は、ｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験及びＣＯＶＩＤ－１９の診断試験のために承認されている高感度ＦＤＡ認可ＥＵＡ分子アッセイを用いて行った。表２６に示すように、結果は、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍに対するｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験とコンパレータ法との間の９６．１％の陽性一致率（ＰＰＡ）及び９６．８％の陰性一致率（ＮＰＡ）を示した。８つの不一致検体（ｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験による５つの陽性及びコンパレータ法による３つの陽性）は全て、それぞれのアッセイについて検出限界以下の非常に低い陽性検体であり、陽性結果をもたらした。
【0151】
【表26】
【0152】
前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】