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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-30
(54)【発明の名称】プロバイオティクス体系及びその応用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/744 20150101AFI20230823BHJP
A61K 35/745 20150101ALI20230823BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20230823BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20230823BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/10 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20230823BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230823BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 15/02 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230823BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20230823BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230823BHJP
A61K 9/68 20060101ALI20230823BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230823BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230823BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230823BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20230823BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230823BHJP
【ＦＩ】
A61K35/744
A61K35/745
A61K35/747
A61K35/741
A61P35/00
A61P1/10
A61P1/12
A61P1/14
A61P9/12
A61P31/00
A61P15/02
A61P1/16
A61P29/00
A61P1/00
A61P17/00
A61P37/08
A61P1/02
A61P25/00
A61P1/04
A61K9/68
A61K9/08
A61K9/12
A61K9/72
A61K47/04
C12N1/20 E
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023508486
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(85)【翻訳文提出日】2023-02-06
(86)【国際出願番号】 CN2020135847
(87)【国際公開番号】W WO2022104959
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】202011294674.9
(32)【優先日】2020-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003823
【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】董 磊
(72)【発明者】
【氏名】韓 ▲チョン▼薇
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA21X
4B065AA30X
4B065BC41
4B065BD50
4B065CA44
4C076AA12
4C076AA24
4C076AA69
4C076AA93
4C076BB01
4C076BB11
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4C076FF31
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4C087BC55
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4C087ZA01
4C087ZA42
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4C087ZA72
4C087ZA73
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZB11
4C087ZB13
4C087ZB26
4C087ZB32
(57)【要約】
外来プロバイオティクスを宿主内に安定な微小環境を形成することができ、経口投与のような簡単な方法で投与することができ、腸管微生物群の組成を変える効果を発揮し、最終的に悪性腫瘍治療の過程で積極的な役割を果たすことができる体系を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロバイオティクスと無機材料からなることを特徴とするプロバイオティクス体系。
【請求項2】
前記プロバイオティクスは、生育過程で酸性環境を生む可能なプロバイオティクスであることを特徴とする請求項１に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項3】
前記プロバイオティクスが乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）であることを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項4】
前記プロバイオティクスは、ラクトバチルス、ビフィズス菌、酪酸紡錘菌および大便連鎖球菌から選ばれる一種または数種類であることを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項5】
前記無機材料が陽イオン交換能と高い表面積を有する材料であることを特徴とする請求項１に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項6】
前記無機材料が酸性環境において、表面にプラス電荷を持つ材料であることを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項7】
前記無機材料が人工的に製造された、酸性環境において表面にプラス電荷を持つ材料であることを特徴とする請求項６に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項8】
前記無機材料が、細孔構造を有する陽イオン交換樹脂、蛍石、ジオクタヘドラルスメクタイト（Ｄｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ Ｓｍｅｃｔｉｔｅｓ）亜族、トリオクタヘドラルスメクタイト（Ｔｒｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ Ｓｍｅｃｔｉｔｅｓ）亜族、珪藻土、カオリン、アタパルジャイト、イライト、緑泥石、セピオライト、ゼオライトおよびタルクのうちの少なくとも1種であることを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項9】
前記無機材料は、中性またはアルカリ性環境において表面にプラス電荷を持たない材料であることを特徴とする請求項６に記載のプロバイオティクス体系。
【請求項10】
前記プロバイオティクス体系は、プロバイオティクス培養液と鉱物材料懸濁液とを混合した後、培養を継続して得た混合体系であることを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載のプロバイオティクス体系。
【請求項11】
前記プロバイオティクス体系の形態は、抽出可能な固体形態、咀嚼可能な固体形態、注射可能な注射液、経口投与可能な経口液、吸入可能なガス状のいずれかであることを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載のプロバイオティクス体系。
【請求項12】
請求項1～9のいずれかに記載のプロバイオティクス体系の疾患治療への応用。
【請求項13】
請求項１～９のいずれかに記載のプロバイオティクス体系の悪性腫瘍治療への応用。
【請求項14】
前記悪性腫瘍は、悪性黒色腫、乳癌、直腸癌、肉腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、甲状腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、皮膚癌、食道癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、または口腔癌であることを特徴とする請求項１３に記載の応用。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか１項に記載のプロバイオティクス体系は、悪性腫瘍の成長を抑製する薬物の製造への応用。
【請求項16】
前記悪性腫瘍は、悪性黒色腫、乳癌、直腸癌、肉腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、甲状腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、皮膚癌、食道癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、または口腔癌であることを特徴とする請求項１５に記載の応用。
【請求項17】
請求項１～９のいずれか１項に記載のプロバイオティクス体系の悪性腫瘍治療過程における化学療法及び免疫治療との併用への応用。
【請求項18】
前記悪性腫瘍は、悪性黒色腫、乳癌、直腸癌、肉腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、甲状腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、皮膚癌、食道癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、または口腔癌であることを特徴とする請求項１７に記載の応用。
【請求項19】
請求項１～９のいずれかに記載のプロバイオティクス体系は、下痢、便秘、消化不良、高血圧、ラクターゼ欠損症、乳糖不耐症、膣感染症、肝硬変、腹腔炎症、腸内毒素血症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、腸易動症候群、歯周炎、精神疾患、潰瘍性大腸炎、多嚢胞性卵巣症候群のいずれかの疾患の治療過程への応用。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか１項に記載のプロバイオティクス体系を含む、悪性腫瘍を治療するための治療薬。
【請求項21】
さらに、悪性腫瘍を治療するための化学療法薬および／または免疫療法薬をさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載の治療薬。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はプロバイオティクス、特に医療目的に使用できるプロバイオティクス体系、特に悪性腫瘍治療に使用できるプロバイオティクス体系に関する。
【背景技術】
【0002】
プロバイオティクスは人体内に定着することにより、宿主のある部位の菌群の組成を変化させる、宿主にとって有益な活性微生物である。主に乳酸菌、ビフィズス菌、放線菌、酵母菌などがある。これらは宿主粘膜と系統免疫機能を調節することにより、あるいは腸内細菌叢のバランスを調節することにより、栄養吸収を促進して腸管の健康を保つ作用がある。プロバイオティクスは通常、生体の免疫力を高め、腸内細菌叢の構造バランスを維持し、生体の抗酸化レベルを高め、腸管炎症を抑制し、腸管粘膜関門を保護するなど、多くの利点を備えていると考えられている。
【0003】
いくつかの報告によると、腸管プロバイオティクスも腫瘍の成長を抑制する作用があり、悪性腫瘍の治療に顕著な効果がある。例えば、２０１８年のＧｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎらの研究によると、プロバイオティクスの抗腫瘍効果は免疫活性化に関係している。腫瘍患者の腸内細菌叢は健常者と異なり、健常者ではビフィズス菌が優位細菌叢であるが、一部の癌患者ではビフィズス菌が顕著に減少している。
【0004】
ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）はグラム陽性、棒状、端部が分岐状を呈することがある嫌気性プロバイオティクスであり、ヒトや動物の消化管、膣、口腔内に広く存在する。ビフィズス菌は人体の免疫細胞と相互作用し、先天性および適応性免疫に関連する特定のシグナル経路を調節し、Ｔｈ１型免疫反応を促進することができる。ビフィズス菌は腫瘍微小環境における樹状突起細胞を増強する機能、ＣＤ８＋Ｔ細胞を募集する機能を有する。一方、悪性腫瘍患者は様々な治療を受けるため、これらの治療手段は微生物群の組成にも大きな影響を及ぼす。そのため、悪性腫瘍患者の腸内細菌叢の構造の再構築、最適化を助けることは積極的な意義がある。
【0005】
しかし、腸内微生物群を再構築し、プロバイオティクスが人体内で積極的な効果を発揮するためには、腸内微生物群の組成を変える必要がある。現在報告されている腸管微生物群の組成を変える方法は主に糞便微生物移植（ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）とプロバイオティクスの服用である。糞便微生物の移植はコストが高く、操作が複雑で、また大きな病原体感染リスクがあるため、好ましい治療案ではない。同時に、現在の様々な実践と試みから、プロバイオティクスを直接経口投与する効果はごくわずかであり、プロバイオティクスを服用することは腸内微生物群の組成を一時的に変化させるだけであり、この時間はこれらのプロバイオティクスが効果を発揮できないほど短いことが示されている。この現象の原因は、外来細菌は宿主腸管での生息能力が低く、安定した凝集と自己保護体系を形成できないため、胃腸環境に直接除去されやすいからである。
【0006】
したがって、本発明は、プロバイオティクスを安定的に増殖させる能力を有する一方で、外来プロバイオティクスの宿主内での安定した微小環境形成を助けることができ、経口投与のような簡単な方法で投与することができ、腸管微生物群の組成を変える効果を発揮し、最終的に悪性腫瘍治療の過程で積極的な役割を果たすことができる体系を発明することを望んでいる
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
背景技術で述べた問題を解決するために、本発明者らは無機材料体系を利用して外因性プロバイオティクスのために生体内に長期安定菌叢を形成する体系の構想を創造的に提案し、一連の研究を通じてこの体系を形成し、最適化した。この体系は大きな医学応用潜在力と価値を持っている
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、プロバイオティクスと無機材料を含む医学的意義のあるプロバイオティクス体系を開示した。その中で、プロバイオティクスは単一菌種でも混合菌種でもよい；無機材料は天然鉱物材料であっても、加工された天然材料であっても、人工的に製造された材料であってもよい。
【0009】
好ましくは、プロバイオティクス体系を構成するプロバイオティクスとは、生育過程で酸性環境を生むプロバイオティクスであり、ここでいう酸性環境を生むプロバイオティクスとは、プロバイオティクスが新陳代謝過程でコロニーの周囲に酸性環境を形成することを意味する。
【0010】
より好ましくは、プロバイオティクス体系を構成するプロバイオティクスは乳酸菌である。
【0011】
最も好ましくは、プロバイオティクス体系を構成するプロバイオティクスはラクトバチルス、ビフィズス菌、酪酸紡錘菌または大便連鎖球菌のうちの１種または２種以上である。
【0012】
プロバイオティクス体系を構成する無機材料は、陽イオン交換能と高い表面積を有する材料であることが好ましい。これらの材料は、微細孔構造を有する陽イオン交換樹脂、蛍石、ジオクタヘドラルスメクタイト亜族のいずれかから選ぶことができ、例えば、バイデライト（Ｂｅｉｄｅｌｌｉｔｅ）、モンモリロナイト（Ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、ノントロナイト（Ｎｏｎｔｒｏｎｉｔｅ）、トリオクタヘドラルスメクタイト（Ｔｒｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ Ｓｍｅｃｔｉｔｅｓ）亜族のいずれか、例えば、サポナイト（Ｓａｐｏｎｉｔｅ）、ソーコナイト（Ｓａｕｃｏｎｉｔｅ）、ヘクトライト（Ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、ステベンサイト（Ｓｔｅｖｅｎｓｉｔｅ）、珪藻土、カオリン、アタパルジャイト、イライト、緑泥石、セピオライト、ゼオライト、タルクである。
【0013】
より好ましくは、プロバイオティクス体系を構成する無機材料は、酸性環境において表面がプラス電荷を持つ材料である。
【0014】
最も好ましくは、プロバイオティクス体系を構成する無機材料は、中性またはアルカリ性環境において表面にプラス電荷を持たず、酸性環境においては表面にプラス電荷を持つ材料である。人工材料はメソポーラスシリカでよく、孔径は２－５０ｎｍである；または、ＺＩＦ－６７、ＵｉＯ－６６（Ｚｒ）、ＭＯＦ－７４－Ｍｇ、Ｃｏ－ＭＯＦ－７４、ＭＩＬ－５３（Ｆｅ）、ＭＩＬ－１０１、ＭＯＦ－７４－Ｎｉ、Ｃｕ－ＢＴＣ、ＭＯＦ－７４－Ｆｅ、ＺＩＦ－８（Ｂａｓｏｌｉｔｅ Ｚ１２００）、ＲＭＯＦ－１、ＭＩＬ－１００（Ｃｒ）、ＭＯＦ－５、Ｃｅ－ＢＴＣ、ＭｇＤＯＢＤＣ、ＭＩＬ－５３（Ａｌ）のいずれかから選択される金属有機骨格化合物である。
【0015】
いくつかの実施例では、プロバイオティクス体系を構成する無機材料として、スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）族に由来する天然または一定の人工処理を施した鉱物材料が選択されている。より具体的には、モンモリロナイト（ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）亜族に由来する、天然または一定の人工処理を施した鉱物材料を選んだ。
【0016】
他のいくつかの実施例では、プロバイオティクス体系を構成する無機材料は、さらに、珪藻土、カオリン、またはアタパルジャイトのいずれかを選択した。
【0017】
他のいくつかの実施例では、プロバイオティクス体系を構成する無機材料は、さらに、人工的に製造された、酸性環境において、表面にプラス電荷を持つ材料を選択した。
【0018】
プロバイオティクスと無機材料が安定して使用可能な体系を形成するために、本発明者らはプロバイオティクス培養液と無機材料懸濁液とを混合した後、一定時間培養を続け、その後安定して使用可能な混合体系を得た。
【0019】
安定して使用可能なプロバイオティクス無機材料体系を形成するために、以下の手順で製造することができる。
【0020】
Ｓ１：プロバイオティクスの活性化及び培養増幅：２５－４０℃、０－２００ｒｐｍ条件下で１０ｍｉｎ－４ｈ嫌気培養する。
Ｓ２：無機材料の活性化：無機材料をアイソトニック緩衝液中で１０ｍｉｎ－１ｈ攪拌する；
Ｓ３：プロバイオティクスの無機材料表面への吸着とプロバイオティクス生物被膜の形成と安定化：無機材料とプロバイオティクスを１０：１－１：１０の割合で混合し、２５－４０℃、０－２００ｒｐｍの条件下で４ｈ－４８ｈ嫌気培養する；
Ｓ４：完成品を分離精製した後、凍結乾燥し、４℃の環境下で保存する。
Ｓ２：無機材料の活性化：無機材料をアイソトニック緩衝液中で１０ｍｉｎ－１ｈ攪拌する；
Ｓ３：プロバイオティクスの無機材料表面への吸着とプロバイオティクス生物被膜の形成と安定化：無機材料とプロバイオティクスを１０：１－１：１０の割合で混合し、２５－４０℃、０－２００ｒｐｍの条件下で４ｈ－４８ｈ嫌気培養する；
Ｓ４：完成品を分離精製した後、凍結乾燥し、４℃の環境下で保存する。
【0021】
後の投与の便宜のため、投与方式に多くの選択肢を提供するが、本発明に記載されたプロバイオティクス体系の形態は、抽出可能な固体形態、咀嚼可能な固体形態、注射可能な注射液、経口経口投与可能な経口液、吸入可能なガス状のいずれかである。上記のような形態を得るには、上記の方法で形成された安定なプロバイオティクス体系を公知の通常の加工プロセスで加工すればよい。
【0022】
本発明が開示した方法で得られたプロバイオティクス体系は、宿主に安定かつ迅速かつ長期的に定着させ、宿主内で腸内微生物組成を再構築、最適化することが実験的に証明されており、当然のことながら、宿主内で腸内微生物組成を再構築、最適化してこれらの疾患を治療または緩和することができれば、本発明のプロバイオティクス体系は必然的にこれらの疾患の治療に利用できると予想される。これらの疾患には、少なくとも下痢、便秘、消化不良、高血圧、ラクターゼ欠損症、乳糖不耐症、膣感染症、肝硬変、腹腔炎症、腸内毒素血症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、腸易動症候群、歯周炎、精神疾患、潰瘍性大腸炎、多嚢胞性卵巣症候群が含まれる。
【0023】
また、一連の実験により、本発明に係るプロバイオティクス体系は悪性腫瘍に対して広範な治療効果及び腫瘍成長抑制効果を有することが証明された。これらの悪性腫瘍には、少なくとも悪性黒色腫、乳癌、直腸癌、肉腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌が含まれる。
【0024】
本発明に係るプロバイオティクス体系は、薬物として各種悪性腫瘍を治療する際に使用することもできるし、現在の既存の治療系の補助的な役割を果たすこともできる。一方、本発明に係るプロバイオティクス体系は、化学療法や免疫療法の過程で患者の腸内微生物群落の回復、再構築を助ける健康食品として使用することができる。一方、化学療法や免疫療法の補助治療薬としても使用できる。本発明に記載のプロバイオティクス体系は、現在知られている化学療法および免疫療法の効果を顕著に高めることができることが実験的に証明されている。
【0025】
本発明は、生体内のプロバイオティクスを体外で無機材料系と結合させ、混合培養することにより、宿主腸管での外来細菌の生息能力が低く、胃腸環境から直接除去されやすい「細菌－無機材料－生体被膜」のような複合微小球を形成することができる。この微小球は宿主の腸内表面によく吸着し、プロバイオティクスの増殖に安全で信頼できる環境を提供し、宿主自身の消化系に一掃されることはない。したがって、ヒトの腸内プロバイオティクスを再構築または最適化することが一定の治療効果を有する疾患であれば、本発明に記載の技術は一定の効果を奏することが予想される。
【0026】
このようなデザイン構想を創造的に提唱するだけでなく、本発明者らは多くの研究を行い、プロバイオティクスと無機材料系が安定に結合し、最終的に「細菌－無機材料－生体被膜」複合微小球を形成できるメカニズムを発見し、プロバイオティクスに安定した成長環境を提供するのに適した無機材料の特徴をまとめた。このような無機材料は陽イオン交換能力を持ち、かつ高い表面積を持つべきであり、さらに重要なことは、この材料自身がプラス電荷を持つべきであり、より好ましい選択は中性またはアルカリ性環境下でプラス電荷を持たず、酸性環境下でプラス電荷を持つことである。
【0027】
また、最も好ましい無機材料によって、特定のプロバイオティクスの成長と増殖を選択的に促進することができることも本発明者らは発見した。例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）とビフィズス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は選択的に促進されるプロバイオティクスである。
【0028】
ラクトバチルスとビフィズス菌はグラム陽性菌であり、その細胞壁中のタイコ酸はＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）で識別できる。これらの腸管に形成されたラクトバチルスとビフィズス菌はＴＬＲ２を介して樹状細胞と相互作用し、樹状細胞を活性化し、それらを腫瘍に進入させる。同時に、活性化された樹状細胞は重要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、Ｔ細胞をイニシエーションする過程で中心的な役割を果たしている。本発明者らの更なる研究より、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の数は血液と腫瘍の両方で増加していることが表明されている。また、プロバイオティクス体系を投与すると、抗がん免疫反応を促進するいくつかのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２）の発現が増加した。したがって、本発明の最も好ましい無機材料とその特有の特性は、腫瘍治療過程におけるプロバイオティクス体系の作用を最大化し、かつ特定のプロバイオティクスを選択的に刺激するため、他の望ましくない菌類の出現を低く維持することができ、安全性を確保していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下の実施例と併せると、本発明をよりよく理解することができる。
【0031】
プロバイオティクス＋無機材料系の効果実験の準備：
（１）微生物の培養と準備。
効果的な比較を行うために、ビフィズス菌（Ａ）、ラクトバチルス菌（Ｂ）、大腸菌（陰性対照）（Ｃ）を選択する。これら３種類の微生物はすべて中国の一般微生物菌種保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）に由来し、下記の表に示すように嫌気的培養を行い、その後の実験で使用する。
（１）微生物の培養と準備。
効果的な比較を行うために、ビフィズス菌（Ａ）、ラクトバチルス菌（Ｂ）、大腸菌（陰性対照）（Ｃ）を選択する。これら３種類の微生物はすべて中国の一般微生物菌種保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）に由来し、下記の表に示すように嫌気的培養を行い、その後の実験で使用する。
【0032】
【表1】
【0033】
（２）無機材料の準備。
いくつかの無機材料の準備。効果的な対比を行うために、スメクタイト（１）、珪藻土（２）、カオリン（３）、アタパルジャイト（４）、メソポーラスシリカ（５）、金属骨格シリカＭＯＦ－５（６）、スメクタイトと珪藻土の混合物（７）、スメクタイトとアタパルジャイトの混合物（８）、スメクタイトと金属骨格の混合物（９）を含む無機材料を用意して実験を行い、これらの材料の準備プロセスはそれぞれ次のとおりである。
いくつかの無機材料の準備。効果的な対比を行うために、スメクタイト（１）、珪藻土（２）、カオリン（３）、アタパルジャイト（４）、メソポーラスシリカ（５）、金属骨格シリカＭＯＦ－５（６）、スメクタイトと珪藻土の混合物（７）、スメクタイトとアタパルジャイトの混合物（８）、スメクタイトと金属骨格の混合物（９）を含む無機材料を用意して実験を行い、これらの材料の準備プロセスはそれぞれ次のとおりである。
【0034】
無菌処理した無機材料粒子とリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を混合し、攪拌混合し、所望の鉱物材料懸濁液を得た。無機材料の無菌処理は紫外照射法を採用した。
【0035】
このうち、スメクタイト（１）は先発薬業から購入し、珪藻土（２）、カオリン（３）、アタパルジャイト（４）はアリババ、メソポーラスシリカ（５）、金属骨格シリカＭＯＦ－５（６）は米国シグマ社から購入した。
【0036】
無機材料の粒子の大きさは３００－６００メッシュで、約２０～５０ミクロンで、各材料系の濃度と割合は下表の通りである。
【0037】
【表2】
【0038】
（３）微生物と無機材料の混合体系の準備
微生物は、（１）微生物の準備中の方法で一定時間培養した後、無機材料懸濁液を一定の割合で培養液に加え、３７℃で一定時間混合培養すればよい。具体的な割合および混合培養時間を下表に示す。
微生物は、（１）微生物の準備中の方法で一定時間培養した後、無機材料懸濁液を一定の割合で培養液に加え、３７℃で一定時間混合培養すればよい。具体的な割合および混合培養時間を下表に示す。
【0039】
【表3】
【0040】
（４）完成品を分離して精製する
遠心分離方式で微生物と無機材料の結合体と液体を分離し、遠心条件は１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎとした。ステップ（２）で使用したアイソトニック緩衝液で遠心分離して得られた沈殿物を洗い流し、精製した微生物と無機材料の結合体を得た。
微生物と無機材料の結合体を緩衝液に再懸濁し、０．０１ｇ／ｍｌ濃度の懸濁液を得た。
遠心分離方式で微生物と無機材料の結合体と液体を分離し、遠心条件は１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎとした。ステップ（２）で使用したアイソトニック緩衝液で遠心分離して得られた沈殿物を洗い流し、精製した微生物と無機材料の結合体を得た。
微生物と無機材料の結合体を緩衝液に再懸濁し、０．０１ｇ／ｍｌ濃度の懸濁液を得た。
【0041】
図１および図２は、ビフィズス菌スメクタイトの表面に生物被膜が形成された電子顕微鏡写真とラクトバチルス属スメクタイトの表面に生物被膜が形成された電子顕微鏡写真である。以上のようにして予想された微生物と無機材料の結合体が得られたことを説明した。
【0042】
（５）マウス実験
本発明の効果を検証するために、複数の病態モデルマウスを用意し、実験の対象は、純ＰＢＳ、純微生物培養液ビフィズス菌（下記表中、Ａで示す）、ラクトバチルス菌（下記表中、Ｂで示す）、大腸菌（下記表中、Ｃで示す）、純無機材料懸濁液：スメクタイト（下記表中、１で示す）、珪藻土（下記表中、２で示す）、カオリン（下記表中、３で示す）、アタパルジャイト（下記表中、４で示す）、人工的に製造された細孔及び金属骨格シリカＭＯＦ－５（下記表中、５、６で示す）、スメクタイト＋珪藻土（下記表中、７で示す）、スメクタイト＋アタパルジャイト（下記表中、８で示す）、スメクタイト＋金属骨格シリカ混合物（下記表中、９で示す）、微生物培養液と無機材料懸濁液を混合した直後の混合液は下記表中、ＦＡ＋（１）――（９）、ＦＢ＋（１）――（９）、ＦＣ＋（１）――（９）で示し、微生物培養液と無機材料懸濁液を混合培養した後に得られた混合液ＳＡ＋（１）――（９）、ＳＢ＋（１）――（９）、ＳＣ＋（１）――（９）である。
本発明の効果を検証するために、複数の病態モデルマウスを用意し、実験の対象は、純ＰＢＳ、純微生物培養液ビフィズス菌（下記表中、Ａで示す）、ラクトバチルス菌（下記表中、Ｂで示す）、大腸菌（下記表中、Ｃで示す）、純無機材料懸濁液：スメクタイト（下記表中、１で示す）、珪藻土（下記表中、２で示す）、カオリン（下記表中、３で示す）、アタパルジャイト（下記表中、４で示す）、人工的に製造された細孔及び金属骨格シリカＭＯＦ－５（下記表中、５、６で示す）、スメクタイト＋珪藻土（下記表中、７で示す）、スメクタイト＋アタパルジャイト（下記表中、８で示す）、スメクタイト＋金属骨格シリカ混合物（下記表中、９で示す）、微生物培養液と無機材料懸濁液を混合した直後の混合液は下記表中、ＦＡ＋（１）――（９）、ＦＢ＋（１）――（９）、ＦＣ＋（１）――（９）で示し、微生物培養液と無機材料懸濁液を混合培養した後に得られた混合液ＳＡ＋（１）――（９）、ＳＢ＋（１）――（９）、ＳＣ＋（１）――（９）である。
【0043】
また、プロバイオティクス混合体系の作用は生体消化器系を介して作用するため、細胞実験による効果検証は不可能であり、生体実験を採用する必要がある。そこで本発明はよく見られるマウス実験を用いて効果を検証した。具体的には、腫瘍抑制率＝（対照群腫瘍の腫瘍重量－治療群腫瘍の腫瘍重量）÷対照群腫瘍の腫瘍重量×１００％を、対照群と治療群との間の腫瘍重量の変化を用いて評価する。個別のケースでは、治療群のテストの対象は無効であり、負の腫瘍抑制率が現れることがある。データ処理を容易にするため、負の値が現れる場合および腫瘍抑制率が３％未満場合、統一的に０で表すことを約束した。これらの場合は、この治療群のテストの対象は効果がないことを示す。
【0044】
また、被験体ごとに１０回の繰り返しを設け、（即ち、各体系ごとに１０匹のマウスを用いる）、腫瘍重量の平均値を計算の基礎とした。
【0045】
また、各対象と現行の一般的な化学療法薬及び免疫治療製剤との併用効果を検証するため、発明チームはＳＡ＋（１）――（9）、ＳＢ＋（１）――（9）、ＳＣ＋（１）――（9）とアジスロマイシン（ＡＤＭ）との併用、及びＳＡ＋（１）――（9）、ＳＢ＋（１）――（9）、ＳＣ＋（１）――（9）とPD1との併用である２組の実験を設置した。その中で、アジスロマイシンの使用条件は以下の通りである。１８－２０ｇのマウス、腹腔内にアジスロマイシンを注射し、投与量は３ｍｇ／ｋｇであり、腫瘍移植後４日目から２日ごとに一回注射する。
【0046】
ＰＤ１の使用条件は、マウス１８－２０ｇ、ＰＤ１抗体を尾静脈で注射し、投与量は１０ｍｇ／ｋｇ、腫瘍移植後４日目から２日ごとに一回注射する。
【0047】
実施例１：メラノーママウスの実験
Ｂ１６－Ｆ１０細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
Ｂ１６－Ｆ１０細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0048】
上記の実験の対象を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから２０日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0049】
【表4】
【0050】
実施例２：乳癌マウスの実験
４Ｔ１細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＢＡＬＢ／ｃマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
４Ｔ１細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＢＡＬＢ／ｃマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0051】
上記の実験の対象を胃内投与によりＢＡＬＢ／ｃマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、４Ｔ１腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから２５日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0052】
【表5】
【0053】
実施例３：結腸癌マウスの実験
ＭＣ３８細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
ＭＣ３８細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0054】
上記の実験の対象を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、ＭＣ３８腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから２５日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0055】
【表6】
【0056】
実施例４：骨肉腫マウスの実験
Ｓ１８０細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
Ｓ１８０細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0057】
上記の実験の対象を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、Ｓ１８０腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから３０日後、最終的に２４時間投与した後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0058】
【表7】
【0059】
実施例５：肝臓癌マウスの実験
ｈｅｐｓ細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
ｈｅｐｓ細胞は中国科学院上海生科学院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0060】
上記の実験の対象を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、ｈｅｐｓ腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから２５日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0061】
【表8】
【0062】
実施例６：肺癌マウスの実験
ＬＬＣ細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
ＬＬＣ細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0063】
上記の実験の対象を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、ＬＬＣ腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから２５日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0064】
【表9】
【0065】
実施例７：子宮頸癌マウスの実験
Ｈｅｌａ細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＢＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
Ｈｅｌａ細胞は中国科学院上海生科院細胞資源センターに由来する；体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＢＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0066】
上記の実験の対象を胃内投与によりＢＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０１ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、２日に１回、合計２週間胃内投与した。十五日目に、Ｈｅｌａ腫瘍細胞は赤血球計数板を通じて生きている細胞を計数し、その後、細胞を５×１０６／ｍｌに調整し、マウスの右前肢脇部皮下（０．１ｍｌ／マウス）に接種し、腫瘍モデルを作成した。腫瘍を移植してから３０日後、最終投与から２４時間後、頸椎を外して致死させ、腫瘍を剥離して重量を量り、腫瘍重量の変化から鉱物材料及びプロバイオティクス鉱物材料複合製剤の腫瘍抑制率を計算し、腫瘍の治療効果を評価した。結果は次の表のとおりである。
【0067】
【表10】
【0068】
実施例８：下痢マウスの実験
体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0069】
マウスは空腹時4時間後、12時間ごとに0.5ml（センナ葉浸出液）を投与し、4日間連続投与し、明らかな下痢症状が観察された後、投与を中止した。調制した実験の対象である経口投与液を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０５ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、１日２回、合計２日間胃内投与した。３日後に治療効果を集計し、最終日にマウスが下痢をしなくなったら治癒とみなす。
【0070】
【表11】
【0071】
実施例９：潰瘍性大腸炎マウスモデル
体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
体重１８－２０グラムのＳＰＦ級のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは揚州大学動物実験センターで購入した。
【0072】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは３％ ＤＳＳ水溶液を７日間飲んだ後、明らかな体重減少、下痢、血便の症状が観察された。調制した実験の対象である経口投与液を胃内投与によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内に注入し、マウス１匹あたり０．０５ｇの鉱物材料の量で投与量を計算し、１日１回、合計７日間胃内投与した。７日後に治療効果を集計し、最終日にマウスが下痢や血便を出さなくなり、体重が回復すれば治癒とみなす。
【0073】
【表12】
【0074】
実施例１０：微生物が異なる条件で処理した後、スメクタイト表面に被膜を形成する実験
【0075】
スメクタイトを３－トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸（ＴＥＳＳＡ）で修飾するには、スメクタイトを１ｇ採取し、ｄｄ Ｈ２Ｏ１００ｍＬに分散し、３０分間温和に振盪した後、ＴＥＳＳＡを１ｍＬ加える。混合液を還流装置に入れて６０℃で２４時間加熱攪拌する。その後、エタノールとｄｄ Ｈ２Ｏで生成物を洗浄し、ＴＥＳＳＡ－ＭＭＴを得た。ＴＥＳＳＡ、化学式：Ｃ１３Ｈ２４Ｏ６Ｓｉ、Ｍａｃｋｌｉｎから購入、試薬番号：Ｔ８４９３５８－５ｇ。
スメクタイトを３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で修飾する手順は、スメクタイトを１ｇ採取し、ｄｄ Ｈ２Ｏ１００ｍＬに分散し、３０分間温和に振盪した後、ＡＰＴＥＳを１．６ｍＬ加える。混合液を還流装置に入れて６０℃で２４時間加熱攪拌する。その後、エタノールとｄｄ Ｈ２Ｏで生成物を洗浄し、ＡＰＴＥＳ－ＭＭＴを得た。ＡＰＴＥＳ、化学式：Ｈ２ｎＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、３Ａｃｈｅｍから購入、試薬番号：Ａ１１３８４。
このようにして、未処理のスメクタイト表面は酸性環境においてプラス電荷を持ち、ＡＰＴＥＳ処理したスメクタイト表面は常にプラス電荷を持ち、ＴＥＳＳＡ処理したスメクタイト表面は常にプラス電荷を持たない３種類のスメクタイトが得られた。
スメクタイトを３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で修飾する手順は、スメクタイトを１ｇ採取し、ｄｄ Ｈ２Ｏ１００ｍＬに分散し、３０分間温和に振盪した後、ＡＰＴＥＳを１．６ｍＬ加える。混合液を還流装置に入れて６０℃で２４時間加熱攪拌する。その後、エタノールとｄｄ Ｈ２Ｏで生成物を洗浄し、ＡＰＴＥＳ－ＭＭＴを得た。ＡＰＴＥＳ、化学式：Ｈ２ｎＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、３Ａｃｈｅｍから購入、試薬番号：Ａ１１３８４。
このようにして、未処理のスメクタイト表面は酸性環境においてプラス電荷を持ち、ＡＰＴＥＳ処理したスメクタイト表面は常にプラス電荷を持ち、ＴＥＳＳＡ処理したスメクタイト表面は常にプラス電荷を持たない３種類のスメクタイトが得られた。
【0076】
培地のｐＨを７付近に調整し、未処理のスメクタイトとともに好酸性ラクトバチルスを培養したところ、好酸性ラクトバチルスはスメクタイト粒子に生物被膜を形成することができなかった。大腸菌とバチルス・ズブチリスの培地のｐＨを５．５未満にすると、大腸菌とバチルス・ズブチリスは未処理のスメクタイト粒子に生物被膜を形成することができる。
【0077】
ＴＥＳＳＡ処理されたスメクタイトは、ｐＨ５．５でマイナス電荷を保つことができ、好酸性ラクトバチルスをＴＥＳＳＡ－ＭＭＴと一緒に培養した場合、好酸性ラクトバチルスは粒子表面に生物被膜を形成しなかった。
【0078】
ＡＰＴＥＳ処理されたスメクタイトの表面は常にプラス電荷を帯びており、好酸性ラクトバチルス、大腸菌、バチルス・ズブチリスなどはいずれもＡＰＴＥＳ－ＭＭＴ表面に生物被膜を形成することができる。図３は、大腸菌がＡＰＴＥＳ処理後のスメクタイト表面に生物被膜を形成した電子顕微鏡写真であるが、大腸菌、バチルス・ズブチリスは無修飾のスメクタイト表面に生物被膜を形成することはできない。
【0079】
以上の実験結果から、粒子表面の正電性は生物被膜形成過程において重要な役割を持っていることが分かった。スメクタイトが酸産生微生物を選択的に支持してその表面に生物被膜を形成する潜在的なメカニズムは、特定の酸産生微生物が産生する酸性環境によって、それに応じて表面プラス電荷に変化するためかもしれない。
【0080】
以上、本発明の概念、原理、思想について、実施例および実施例を含む具体的な実施形態を参照して詳細に説明した。当業者には、本発明の実施形態は上記のようないくつかの形態だけではなく、本出願書類を読んだ後、上述の実施形態におけるステップ、方法、装置、部品に可能な限りの改良、置換、および同等の形態を行うことができ、これらの改良、置換、および同等の形態は本発明の範囲内に含まれると考えられることが理解されるであろう。本発明の保護範囲は特許請求の範囲のみに準ずる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】