特表 2023-537204 間葉系ストローマ細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）および前記ＥＶを得るための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-31

(54)【発明の名称】間葉系ストローマ細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）および前記ＥＶを得るための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20230824BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 38/40 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 11/16 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230824BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230824BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20230824BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61K38/38

A61K38/40

A61P11/00

A61P29/00

A61P9/12

A61P11/06

A61P37/08

A61P43/00 105

A61P31/04

A61P11/16

A61P31/12

A61P31/16

A61P31/14

A61P1/04

C12N5/077

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023500297

(86)(22)【出願日】2021-07-08

(85)【翻訳文提出日】2023-02-03

(86)【国際出願番号】 EP2021068989

(87)【国際公開番号】W WO2022008652

(87)【国際公開日】2022-01-13

(31)【優先権主張番号】20184893.4

(32)【優先日】2020-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523004073

【氏名又は名称】エクソ バイオロジクス エスアー

【氏名又は名称原語表記】ＥＸＯ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ ＳＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100217135

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 誠

(72)【発明者】

【氏名】マルチン ユルガ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BB19

4B065BB32

4B065BD18

4B065BD39

4B065CA44

4C084AA01

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4C084ZC51

4C087AA01

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4C087NA14

4C087ZA42

4C087ZA59

4C087ZA60

4C087ZA68

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZB21

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC51

(57)【要約】

本発明は、間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）の組成物を製造するプロセスに関するものであり、前記プロセスは、－精製されたヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンを含む無血清ゼノフリー培地でＭＳＣを培養および増殖させることと、－ＥＶを含有する細胞上清を採取することと、前記細胞上清を濾過してＥＶを得ることと、－前記ＥＶを好ましくは限外濾過によって濃縮することと、を含む。第２の態様およびさらなる態様において、前記発明は、ＥＶを含有する組成物およびその臨床的使用を対象とする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）の組成物を製造するプロセスであって、
－精製されたヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンを含む無血清ゼノフリー培地でＭＳＣを培養および増殖させることと、
－ＥＶを含有する細胞上清を採取することと、
－前記細胞上清を濾過してＥＶを得ることと、
－前記ＥＶを濃縮することと、を含む、プロセス。

【請求項2】

前記アルブミンおよびトランスフェリンが、ヒト血漿から精製されたものであるか、または組換えアルブミンおよび組換えトランスフェリンである、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記培地中のアルブミン濃度が１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記培地中のトランスフェリン濃度が５５ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌである、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

前記細胞上清の濾過が、少なくとも２段階の濾過過程である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項6】

２段階の濾過過程における前記濾過が、メッシュサイズが１～５μｍである第１のフィルタを通して行われ、その後、メッシュサイズが１μｍ未満である第２のフィルタを通して行われる、請求項５に記載のプロセス。

【請求項7】

前記濃縮工程が接線流濾過工程であり、これにより前記濾過過程の濾液を濃縮する、請求項５または６に記載のプロセス。

【請求項8】

前記ＭＳＣを培養する１８～２４時間の時間範囲で、細胞培地１ｍＬ当たり少なくとも０．２５×１０^９個の粒子が産生され、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンである前記粒子の少なくとも９０％がＥＶである、請求項７に記載のプロセス。

【請求項9】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）を含有する組成物であって、前記ＥＶのサイズが１μｍ未満であり、前記組成物のヒトアルブミン濃度が１０～３０ｇ／Ｌであり、前記組成物に存在する前記アルブミンの少なくとも９０％が前記ＥＶと会合している、組成物。

【請求項10】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンを好ましくは６０ｍｇ／Ｌ～６００ｍｇ／Ｌの濃度で含有する、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンおよびヒトアルブミンを、アルブミン１ｇにつきトランスフェリン２～６０ｍｇの割合で含む、請求項９または１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＥＶのサイズが５０～３００ｎｍである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物がさらに製剤化および／または処理される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

治療的または予防的な使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

肺疾患の予防または治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記肺疾患が、炎症性肺疾患、肺血管疾患、または急性肺損傷である、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

前記炎症性肺疾患が、肺高血圧症、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギー、肺炎、または特発性肺線維症である、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

前記急性肺損傷が、敗血症と関連するか、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

前記炎症性肺疾患が、ウイルス感染、好ましくはインフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連する、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

ＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用するための、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９誘発肺炎または急性肺炎の治療に使用するための、請求項１３～１９に記載の使用のための組成物。

【請求項21】

クローン病などの炎症性腸疾患の予防または治療に使用するための、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記治療有効量の前記組成物が患者に投与され、前記患者は成人、乳児または新生児であってよい、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項23】

前記組成物が、前記患者または各投与について１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）および前記細胞外小胞を含む組成物、ならびにこれを得るための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥＶは、脂質二重層に囲まれた粒子であり、天然では細胞から放出され、細胞とは異なり複製されることがない。ＥＶの直径は、物理的に可能な最小値に近いサイズの一枚膜リポソーム（約２０～３０ナノメートル）から１０ミクロン以上までさまざまであるが、大半は２００ナノメートル未満である。これらは、親細胞から、タンパク質、核酸、脂質、代謝産物、さらには細胞小器官などの輸送物（cargo）を輸送する。これまでに研究されてきた細胞のほとんどは、細胞壁に囲まれている細菌、真菌、植物細胞の一部も含め、ＥＶを放出すると考えられている。ＥＶの様々なサブタイプが、サイズ、生合成経路、輸送物、元の細胞、および機能に応じて定義され、エクソソーム、マイクロベシクル、エクトソーム等の用語などの異なる名称がこれまでに提案されている。

【0003】

ＥＶは、疾患に冒された組織および細胞に核酸等の輸送物を送達するなど、治療目的で使用することができる。この関心の高まりと並行して、疾病のバイオマーカーまたは治療法としてのＥＶの開発に焦点を当てた企業の設立および資金提供プログラムや国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：ＩＳＥＶ）が設立され、この分野を専門とする科学論文誌Journal of Extracellular Vesiclesが創刊された。

【0004】

ＥＶの治療利用への関心が高まる中、臨床グレードのＥＶのニーズも高まっている。臨床で有益となるには、ＥＶを良好な再現性でかつ制御して生産する必要がある。製造される各バッチの品質が均一であることを保証するために、ＥＶを含有する組成物の製造における製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）が重要である。細胞由来の治療薬を扱うにあたり、ＧＭＰは特に困難である。

【0005】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来のエクソソームの製造プロセスは、例えば、非特許文献１に記載されている。また、非特許文献２には、ＭＳＣ由来のエクソソームについて、皮膚組織の再生可能性という観点から、特定の条件下で生成されたエクソソームが記載されている。ＭＳＣの培養には、各種の培地を用いることができ、そのうちの無血清ゼノフリー培養培地が非特許文献３に開示されている。さらに、特許文献４には、肺疾患の治療におけるＭＳＣセクレトームおよび細胞外小胞（ＥＶ）の使用について記載されている。同文献でヒトでの使用に関して記載されているデータはほとんどが推測に基づくものであり、低再現性および低収率など、当該技術分野におけるいくつかの問題点を浮き彫りにしている。さらに、同文献は、ＥＶを製造するためにＭＳＣの大規模培養にバイオリアクターを使用する際の潜在的な問題について警告している。最後に、引用文献５は、肺疾患の治療におけるアルブミンの使用について言及している。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Reka Agnes Haraszti et al., 2018

【非特許文献2】Diem Huong Huang at al., 2020

【非特許文献3】Lucas G. Chase et al., 2012

【非特許文献4】Antoine Monsel et al., 2016

【非特許文献5】Youngja Park et al., 2011

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、ＥＶの臨床利用が普及するまでには、いくつかの問題を解決する必要がある。臨床グレードのＥＶを、信頼性が高くかつ良好な再現性で定量的に生産、保存し、取り扱うためのプラットフォームを開発することは、依然として課題である。ＭＳＣ由来ＥＶを用いた医薬品およびその後の臨床試験のためには、ＭＳＣ由来ＥＶを用いた治療法を臨床導入する前に、いくつかの科学的、法規的、技術的、および機構的な問題を解決する必要がある。

【0008】

このため、臨床グレードのＭＳＣ由来ＥＶを、ＧＭＰ条件下で、安定的かつ良好な再現性で、費用対効果の高い大規模で生産することが可能なプロトコールが求められている。さらに、安定性が良好で、商業的に有利な保存期間を持つＥＶベースの製品が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）２０２０ＧＭＰ品質ガイドラインに準拠したＧＭＰ条件下で、安定的かつ良好な再現性でＭＳＣからＥＶの生産を可能にする方法を提供する。得られるＥＶ組成物は臨床グレードのｃＧＭＰ製品であり、臨床試験および患者への使用が容易であり、安定性が良好である。

【0010】

この目的のため、本発明は、請求項１に記載の製造プロセス、および請求項９に記載の組成物を提供する。好ましい実施形態は、請求項２～８および請求項１０～１３に記載されている。

【0011】

前記製品は、様々な臨床用途および治療効果が期待できる。前記製品の使用は、請求項１４～２３に記載されている。

【発明の効果】

【0012】

前記組成物の長期安定性により、本製品は様々な臨床用途に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明のＥＶの製造に用いることができるＭＳＣ増殖ユニットおよびＥＶ処理ユニットの一実施形態を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

定義
特段の定義のない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示に用いられるすべての用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般に理解する意味を有する。さらなる指針として、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義を記載する。

【0015】

本明細書において、以下の用語は以下の意味を有する。

【0016】

本明細書で使用する「A」、「an」、および「the」は、文脈上明示的に特段の指示のない限り、単数形および複数形を指すものとする。例えば、「a compartmentコンパートメント」は、１つまたは複数のコンパートメントを指す。

【0017】

本明細書において、パラメータ、量、時間などの測定可能な値に言及して用いられる「約」は、本開示の発明において実施するのに適切な限りにおいて、規定される値の±２０％以下、好ましくは±１０％以下、より好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらに好ましくは±０．１％以下の変動を包含するものとする。ただし、修飾語「約」が指す値自体も具体的に開示されていることを理解されたい。

【0018】

本明細書で使用する「有し」、「備え」、および「含み」、「～から構成され」は、「有する」、「備える」、「含む」または「～から構成される」と同義であり、例えば、その前に挙げた構成要素を特定する包括的またはオープンエンドの用語であって、当業者に公知であるか当該記載に開示されている追加の記載のない構成要素、特徴、要素、メンバー、工程を排除または排除するものではない。

【0019】

終点による数値範囲の記載は、記載された終点だけでなく、その範囲内に含まれるすべての数値および分数を含む。

【0020】

「重量％」、「重量パーセント」、「％ｗｔ」または「ｗｔ％」という表現は、別段の定義のない限り、本明細書全体を通じて、製剤の総重量に基づく各成分の相対重量を意味する。

【0021】

１つ以上または少なくとも１つのメンバー（複数可）のような「１つ以上」または「少なくとも１つ」という用語は、それ自体明確であり、さらなる例示として、この用語は、特に、前記メンバーの任意の１つ、または前記メンバーの任意の２つ以上、例えば、前記メンバーの任意の３以上、４以上、５以上、６以上または７以上などへの言及、および前記メンバーのすべてのメンバーまでへの言及を包含する。

【0022】

特段の定義のない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示に用いられるすべての用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般に理解する意味を有する。さらなる指針として、本発明の教示をよりよく理解するために、本明細書に使用する用語を定義する。本明細書に使用する用語または定義は、本発明の理解を補助するためにのみ提供するものである。

【0023】

本明細書全体において「一実施形態」または「ある実施形態」との言及は、当該実施形態に関連して説明する特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な箇所における「一実施形態において」または「ある実施形態において」という表現は、必ずしもすべてが同一の実施形態を指すとは限らないが、同じでもよい。さらに、１つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者に明らかなように、特定の特徴、構造または特性が任意の適切な方法で組み合わされてもよい。さらに、当業者であれば理解するように、本明細書に記載する一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むものの他の特徴を含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味し、他の特徴は含まないが、異なる実施形態を形成する。例えば、後述の特許請求の範囲において、請求項の実施形態はいずれも任意の組み合わせで用いられてよい。

【0024】

本発明の目的のために、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、前記ＥＶと会合しているタンパク質を含む、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる種類の細胞によって分泌されるマイクロメートルまたはナノメートルサイズの粒子として理解される。ＥＶは、脂質の球体内に封入されたタンパク質、増殖因子、ｍｉＲＮＡなどの分子を含む。ＥＶは、そのサイズおよび細胞内起源によって分類される。エクソソームとは、サイズが通常０．１ミクロン以下のＥＶのサブグループである。エクソソームは、後期エンドソームコンパートメントである多胞体に由来し、多胞体と原形質膜との融合により分泌される。別の種類のＥＶとして、皮質細胞骨格の破壊によって細胞膜から直接放出される、サイズが１ミクロン以内の膜小胞の異種な集団である脱落小胞（マイクロ小胞とも呼ばれる）がある。細胞から分泌されるあらゆる種類の小胞を総称してＥＶと定義する。

【0025】

物質との関連において「ＥＶ（複数可）と会合している」という用語は、前記物質が、ａ）ＥＶの表面層に（共有結合もしくは非共有結合などの任意の種類の結合によって）、好ましくは非共有結合によって付着もしくは結合している；および／またはｂ）前記ＥＶの表面層内に付着もしくは結合している；および／またはｃ）前記ＥＶ内に内在化されている、のいずれかを意味する。

【0026】

ＥＶと会合している前記物質は、どのような種類の物質でもよく、例えば、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸（例えば、ノンコーディングＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、糖類、炭水化物、脂質、ビタミン、増殖因子、血管新生促進分子、心臓保護酵素、抗体、抗炎症分子、抗線維化分子、抗酸化分子、神経新生促進（pro-neurogenic）分子、抗ウイルス分子などの分子；金属イオンまたはカルシウムイオンなどのイオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0027】

「細胞培地」または「細胞培養培地」または「培地」という用語は、細胞の維持または成長に用いることができる、規定された組成の栄養成分および他の成分の水溶液を意味する。

【0028】

「無血清」細胞培養培地という用語は、動物またはヒトの血清、血漿または血液リンパを含まない細胞培養培地を意味する。前記無血清培地は、アルブミン、トランスフェリン、低密度脂質、およびホルモン等などの血液、血清または血漿を加工したか、またはこれらに由来する成分を含んでよい。また、血清、血漿または血液リンパではない、好ましくは公知の完全に再生可能な組成および濃度の他の生物学的成分（例えば、増殖因子、ホルモンおよび担体タンパク質）を含んでもよい。

【0029】

「ゼノフリー」細胞培養培地という用語は、非ヒト動物に直接由来する成分も、非ヒト動物のＤＮＡ配列から製造された組換え成分も含まない細胞培養培地と理解される。

【0030】

本明細書で使用する「薬学的に許容可能な担体」という用語は、対象に著しい刺激を与えず、投与された組成物の生物学的な活性および特性を損なわない担体または希釈剤を意味する。例えば、薬学的に許容可能な担体は、安定剤および／またはアジュバントとして作用してよい。担体の例としては、限定するものではないが、プロピレングリコール、生理食塩水、有機溶媒と水とのエマルジョン、混合物などが挙げられる。

【0031】

「十分な量」という用語は、所望の測定可能な効果をもたらすのに十分な量、例えば、タンパク質発現プロファイルを変化させるのに十分な量を意味する。

【0032】

「治療有効量」という用語は、疾病の症状を改善するのに有効な量をいう。予防は治療とみなすことができるため、治療有効量は「予防有効量」であってもよい。

【0033】

「治療」という用語は、治療的な処置と予防的な処置との両方を意味し、対象となる病理的状態または障害を予防または遅延（軽減）することを目的とする。治療が必要な対象は、すでに障害を有する対象のほか、障害を有しやすい対象、または障害を予防したい対象である。

【0034】

「組成物」という用語は、製造プロセスのあらゆる段階における組成物を指し、薬学的に許容可能な最終産物、およびそのプロセス途中の中間体を含む。

【0035】

「治療」という用語は、疾患、障害もしくは状態の進行、または疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状を逆転、予防、緩和または抑制することを意味する。本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、未治療の対照集団と比較して、または治療前の同じ哺乳動物と比較して、哺乳動物における疾患、障害または状態の発生の確率または件数を減少させることを指してもよい。例えば、本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、疾患、障害または状態を予防することを指してよく、疾患、障害もしくは状態の発症を遅延もしくは予防すること、または疾患、障害もしくは状態の症状を遅延もしくは予防することを含んでよい。本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、疾患、障害もしくは状態の重症度、または疾患、障害もしくは状態に罹患する前のそのような疾患、障害もしくは状態の症状を軽減することを指してもよい。疾患、障害または病態の罹患前のこのような予防または重症度の軽減は、投与時には疾患、障害または病態に罹患していない対象への、本明細書に記載の本技術の組成物の投与と関連する。本明細書で使用する「治療」は、疾患、障害もしくは状態の再発、またはそのような疾患、障害もしくは状態の１つ以上の症状の再発を防止することをさらに指してもよい。本明細書で使用する「治療」、「処置」、および「治療的」という用語は、上で定義したように、治療する行為を指す。

【0036】

本明細書で使用する「線維化」という用語は、器官や組織において、修復または反応の過程における過剰な線維性結合組織の形成を指す。

【0037】

本発明の目的のために、「間葉系ストローマ細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、様々な細胞型に分化することができるストローマ付着細胞として理解されるものとする。ＭＳＣの由来は、骨髄、臍帯細胞、脂肪組織、羊水、乳腺、血液などである。

【0038】

本発明は、ＭＳＣからＥＶを製造するプロセス、前記方法によって得られる組成物、およびその治療的使用に関する。

【0039】

第１の態様において、本発明は、ＭＳＣ由来のＥＶの組成物の製造プロセスに関する。より詳細には、前記プロセスは、
－精製されたヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンを含む無血清ゼノフリー培地でＭＳＣを培養および増殖させる工程と、
－ＥＶを含有する細胞上清を採取する工程と、
－前記細胞上清を濾過してＥＶを得る工程と、
－前記ＥＶを好ましくは限外濾過によって濃縮する工程と、を含む。

【0040】

ＭＳＣは、ＥＶの製造に用いる容器、好ましくはバイオリアクター、より好ましくは撹拌型槽型バイオリアクターで培養および増殖させる。この目的のため、ＭＳＣを、ヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンを補充した無血清ゼノフリーの培養培地で培養および増殖させる。ＭＳＣの培養および増殖に無血清ゼノフリー培地を使用することで、不要な汚染物質のＥＶへの含有を防止することができる。このような汚染物質は、得られたＥＶ製品（EV product）のさらなる臨床使用を妨げる可能性がある。血清および血小板の溶解液は一般にアルブミンを含み、細胞の成長は培地中のアルブミンのレベルに影響されることが多い。しかし、血清および血小板の溶解液中のアルブミンおよび他の成分のレベルは変動する。臨床グレードのＥＶを得るためには、血清および血小板の溶解液の使用は避けるべきである。

【0041】

しかし、アルブミンは、前記ＥＶの安定性および機能性を補助するため、最終産物の重要な成分である。本文脈において、ＥＶなどの製品の「安定性」という用語は、容器または閉鎖系などの特定の環境において、特定の製剤または製品が、物理的、化学的、微生物的、毒性的、および機能的な仕様または特性などのパラメータの値の所定の範囲内に所定の期間とどまる能力を指す。このようなパラメータの例としては、限定するものではないが、粒子数、粒子サイズ、内部成分の漏洩、および活性が挙げられる。

【0042】

ＥＶの安定性を補助するため、前記細胞培地中に外因性アルブミンが存在することが望ましい。したがって、ある実施形態では、前記培地は、例えばヒト血漿から精製されたものなどの、組換えまたは精製アルブミンのいずれかのヒトアルブミンを含む。さらなる実施形態では、前記アルブミンは、前記培地中に１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌの濃度で存在する。後者の濃度は、良好で安定した最終産物を得るうえで特に有用であることが示された。

【0043】

細胞増殖培地は、トランスフェリン、好ましくは、例えば血漿から精製されたものなど、組換えまたは精製トランスフェリンをさらに含む。トランスフェリンは、概算分子量７８～８０ｋＤａの単鎖糖タンパク質のアイソタイプの広範な微小かつ不均質な（micro-heterogeneous）集団を形成している。トランスフェリンは、細胞外への鉄の貯蔵および輸送を促進するため、培養中の細胞に鉄を供給する方法として生理学的に適切である。トランスフェリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＶの細胞への取り込みを補助することが報告されている（例えば、国際公開第２０１３／０８４００１号を参照）。アルブミンに加え、およびアルブミンと同様に、トランスフェリンも最終ＥＶ製品の安定化を補助することができる。ある実施形態では、前記トランスフェリンは、５０ｍｇ／～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌの濃度で成長培地に存在する。後者の濃度は、ＥＶ製品の品質にとって最適であることが判明した。

【0044】

本プロトコールにより、アルブミンとトランスフェリンとの両方を、アルブミンおよびトランスフェリンの大部分を前記ＥＶと会合させた状態で、最終産物に存在させることが可能となる。

【0045】

さらなる実施形態では、前記培地は、無機金属塩、アミノ酸などの栄養素、およびビタミンの基本混合物であり、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ／Ｆ－１２の組成から公知のように、ｐＨがｐＨ７．０～７．４の範囲内にある。また、培地は、グルタミンもしくはグルタミン酸、またはＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンなどのその前駆体、ならびに４５００ｍｇ／Ｌ以下のレベルのグルコースおよび１種以上の脂肪酸を含んでもよい。

【0046】

さらなる実施形態では、前記培地は、限定するものではないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、例えばヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、ヒトＰＤＧＦ－ＡＢおよびＰＤＧＦ－ＡＡ）および／またはヒトＴＧＦ－β１などのヒト増殖因子、好ましくは組換えＰＤＧＦ－ＢＢおよび／またはＴＧＦ－β１などをさらに含む。また、本発明者らは、増殖因子が他の増殖因子と相乗的に作用して、ＭＳＣの成長および増殖を促進することも発見した。ある実施形態では、前記培地は、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ－β１をさらに含む。

【0047】

ＰＤＧＦは、細胞の増殖および分裂の制御因子であり、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に結合する。化学的には、ＰＤＧＦは２本のＡ鎖（－ＡＡ）または２本のＢ鎖（－ＢＢ）、あるいはこれらの組み合わせ（－ＡＢ）から構成される２量体糖タンパク質である。ＰＤＧＦ－ＡＢは、ＰＤＧＦαおよびＰＤＧＦβ受容体サブユニットと結合し、ＰＤＧＦα－β受容体２量体およびＰＤＧＦα－α受容体２量体を形成することがわかっている。本開示の文脈においては、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢおよびＰＤＧＦ－ＡＡを包含する。

【0048】

トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）は、ＭＳＣの増殖を刺激し、さらにＭＳＣの免疫調節特性に影響を与え、そのセクレトームを炎症促進または抗炎症の方向に変化させる多面的なサイトカインである。

【0049】

ある例では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＢＢである。ある例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約１ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約７．５ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、約１５ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬである。

【0050】

別の例では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＡＢである。ある例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは約１ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは約７．５ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＢのレベルは約１５ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約３９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＢＢのレベルは、少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬである。

【0051】

別の例では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＡＡである。ある例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、約１ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、約７．５ｎｇ／ｍＬ～１２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、約１５ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３１ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３２ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３３ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３４ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３５ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３６ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３７ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３８ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約３９ｎｇ／ｍＬである。別の例では、ＰＤＧＦ－ＡＡのレベルは、少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬである。

【0052】

ゼノフリー無血清培養培地は、それぞれの成分を組み合わせて調製してもよいし、本明細書に記載する指針に基づいて市販品から選択し（任意選択で適合させて）よい。例えば、使用できる可能性のある市販のゼノフリー無血清培地を、任意選択で、本明細書に開示する任意の特徴および／または条件（preferences）で適合させた後に、使用することができる。

【0053】

ある実施形態では、前記培地は、緩衝系を含んでよい。ｐＨの調節は最適な培養条件のために重要であり、一般に、天然緩衝系または化学緩衝系の２つの緩衝系のいずれかによって行われる。

【0054】

天然緩衝系では、気体状のＣＯ_２が培地中に含有されるＣＯ_３ ^－－／ＨＣＯ_３ ^－と平衡に達する。天然緩衝系を含む培養培地は、５～１０％のＣＯ_２を含む空気雰囲気で維持する必要があり、通常はＣＯ_２インキュベーターを使用して維持する。天然緩衝系は低コストであり、毒性もない。双性イオンであるＨＥＰＥＳを用いた化学緩衝法は、ｐＨ７．２～７．４の範囲で優れた緩衝能を有し、気体雰囲気の制御を必要としない。ＨＥＰＥＳは比較的高価であり、細胞の種類によっては高濃度で毒性がある。また、ＨＥＰＥＳは、蛍光への曝露によって引き起こされる光毒性作用に対する培地の感度を大きく高めることが示されている。

【0055】

ある実施形態では、前記培地は、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを含んでもよく、これにより、ｐＨの常時モニタリングが可能となる。細胞の増殖中に、細胞から放出される代謝産物によりｐＨが変化し、培地の色が変化する。フェノールレッドにより低ｐＨでは培地が黄色に、高ｐＨでは培地が紫色になる。細胞培養に最適なｐＨ値であるｐＨ７．４では、培地は明るい赤色になる。

【0056】

別の実施形態では、前記培地は、無機塩を含んでもよい。前記無機塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのイオンを供給することで、浸透圧のバランスを保ち、膜電位の調節を補助する。

【0057】

前記培地は、アミノ酸、好ましくは必須アミノ酸を含んでよい。必須アミノ酸であるＬ－グルタミンは特に重要である。Ｌ－グルタミンはＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ、およびヌクレオチドに窒素を供給し、代謝のための二次エネルギー源として機能する。Ｌ－グルタミンは不安定なアミノ酸であり、細胞で利用できない形に経時変化するため、使用直前に培地に添加する必要がある。Ｌ－グルタミンの分解によりアンモニアが蓄積され、アンモニアは一部の細胞株に有害な影響を及ぼすことがあるため、本来の培地の組成よりもＬ－グルタミンを多く添加する場合は注意が必要である。哺乳類細胞用培養培地のＬ－グルタミン濃度は、１９９培地の０．６８ｍＭからダルベッコ変法イーグルス培地の４ｍＭと大きく変動してよい。無脊椎動物の細胞培養培地は、１２．３ｍＭものＬ－グルタミンを含んでよい。ｇｌｕｔａｍａｘなどの添加物はより安定であり、培地の交換または追加を必要とせずに長期培養のため、およびこの期間のグルタミン濃度をより安定させるために、グルタミンの代わりに用いることができる。

【0058】

また、成長中に減少する非必須アミノ酸を培地に添加してもよい。非必須アミノ酸を培地に補充すると、細胞の成長が促進され、生存期間が延びる。

【0059】

糖類の形態の炭水化物は、主要なエネルギー源である。ほとんどの培地はグルコースおよびガラクトースを含むが、一部、マルトースおよびフルクトースを含むものもある。

【0060】

前記培地は、脂肪酸、脂質、ビタミン、微量元素をさらに含んでよい。無血清培地には、血清中に通常含まれる微量元素を補充することが多い。銅、亜鉛、セレンなどの微量元素、およびトリカルボン酸中間体は、細胞が正常に成長するために微量で必要とされる化学元素である。

【0061】

ある実施形態では、細菌および／または真菌の汚染物質の増殖を制御するために抗生物質を使用してもよく、例えば、この例としては、典型的には、ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物、あるいは／または、限定するものではないが、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、レボフロキサシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ペニシリン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクトロマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チロシンおよびゼオシンなどの他の化合物が例示される。

【0062】

ある実施形態では、前記ＭＳＣは、前記バイオリアクター内に入れたマイクロキャリアまたはマイクロビーズ上で成長および増殖してよい。このようなマイクロキャリアまたはビーズは、当該技術分野で公知であり、商業的に入手可能である。ある実施形態では、前記マイクロキャリアまたはビーズは、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、それらの模倣物またはそれらの組み合わせなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされていてよい。好ましい実施形態では、前記マイクロキャリアまたはビーズは負に帯電している。

【0063】

ＭＳＣが所望の濃度および／またはコンフルエンシーに達した後、前記ＥＶを含有する細胞上清を回収し、さらに処理する。本発明において、前記細胞上清は、ＭＳＣを成長および増殖させた細胞培地である。ある実施形態において、前記上清は、前記ＭＳＣが少なくとも４０×１０^６細胞／Ｌの最小濃度に達したときに回収される。細胞の濃度および生存率は、例えば、ブルカーカウンティングチャンバーおよびトリパンブルー染色等の血球計数装置などの細胞計数法により決定することができる。上記の培養条件下で、前記ＭＳＣは、前記ＭＳＣを培養する１８～２４時間の時間範囲で、細胞培地１ｍＬ当たり少なくとも０．２５×１０^９個の粒子／培地を産生する。

【0064】

上記に使用する「粒子」は、好ましくは粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンである粒子であればどのようなものでもよいが、ＥＶが挙げられる。粒子の例としては、タンパク質またはペプチドの凝集体を挙げることができる。前記粒子の起源は、ＭＳＣまたはＭＳＣを培養および増殖させるための細胞培地である。したがって、前記粒子は、前記細胞培地もしくはＭＳＣに通常存在するか、またはその一部である任意の粒子であってよい。

【0065】

好ましくは、本明細書に記載の方法を使用する場合、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンの前記粒子の少なくとも９０％がＥＶである。

【0066】

続く工程では、前記細胞培地中に存在する汚染物質を除去するために、前記細胞上清が濾過される。後者は最終産物の純度および安定性に寄与する。好ましい実施形態では、前記濾過は、少なくとも２段階の濾過を含む。ある実施形態では、前記濾過工程の少なくとも１段階はデッドエンド濾過である。さらなる実施形態では、前記濾過工程の両方が、デッドエンド濾過によって行われる。好ましくは、上で定義したＧＭＰ規格に準拠させるために、濾過工程の少なくとも１段階は、製品の滅菌手段としても使用される。上清から不純物を十分に除去するために、場合によってはデッドエンド濾過を連続して行う必要があることがわかっている。場合によっては、１回の濾過では使用するフィルタが目詰まりを起こし、最終産物の純度が低下し量が減少することが多いこともわかっている。

【0067】

第１の濾過工程では、細胞上清をデッドエンドフィルタで濾過する。さらなる好ましい実施形態では、前記濾過は、前記上清を、メッシュサイズが１～５ミクロン、より好ましくは１～３ミクロンのフィルタにかける手段によって行われる。ある実施形態では、前記第１の濾過工程は、フ
ィルタを通して、一定流量、好ましくは１００ｍＬ／分を供給する蠕動ポンプを備えた閉鎖系におけるデッドエンド濾過によって行われる。

【0068】

ある実施形態では、第１の濾過の濾液は、第２のフィルタ、本工程では、第１の濾過工程で使用するものよりも小孔径のフィルタにかけられる。好ましくは、最終産物を上記のＧＭＰ規格に適合させるために、この第２の濾過工程は滅菌工程である。より好ましい実施形態では、前記フィルタのメッシュサイズは、１ミクロン以下、より好ましくは０．０５～１ミクロン、さらに好ましくは０．１～０．５ミクロン、最も好ましくは０．１～０．２２ミクロンである。ある実施形態では、前記第２の濾過工程は、好ましくは第１の濾過工程と相互接続され、フィルタを通して、一定流量、好ましくは１００ｍＬ／分を供給する蠕動ポンプを備えた閉鎖系におけるデッドエンド濾過によって行われる。

【0069】

前記濾過工程の濾液は、本発明に係るＥＶを含有する。最終工程において、前記ＥＶが洗浄および濃縮される。洗浄および濃縮は、精密濾過または限外濾過のいずれかの膜濾過など、当該技術分野において公知の従来の手段で行われてよい。濃縮とは、溶液から液体を除去し、溶質分子を得る過程である。

【0070】

膜濾過は、ライフサイエンスの研究で広く用いられている分離技術である。膜濾過は、膜の空隙率によって、精密濾過過程と限外濾過過程とに分類される。精密濾過膜は、通常、孔径が０．１μｍ～１０μｍ程度であり、一般に清澄化、殺菌、および細胞採取のための微粒子の除去に使用される。限外濾過膜は、孔径が０．００１～０．１μｍと極めて小さく、溶存分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、およびその他の生体分子）の濃縮および脱塩、緩衝液交換、ならびに総分画などに使用される。限外濾過膜は、一般に孔径ではなく分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により分類される。精密濾過膜および限外濾過膜のいずれかを使用することができる膜濾過の主なモードには、１）「デッドエンド」濾過とも呼ばれるダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）、供給流を膜面に対して垂直に流し、流体の１００％を膜に通過させる方式、２）クロスフロー濾過とも呼ばれるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、供給流を膜面に対して平行に流し、一部を膜（透過液）に透過させ、残り（リテンテート）を供給タンクへ再循環させる方式、の２つの方式がある。

【0071】

場合に応じて、前記洗浄および濃縮は、ＴＦＦによって行われる。ＴＦＦ（クロスフロー濾過）は、膜面に対して平行に供給流を流す過程である。圧力をかけると、流れの一部が膜を通過し（濾液または透過液）、残りの部分（リテンテート）が供給タンクに戻り再循環される。

【0072】

ある実施形態では、１以上のデッドエンド濾過工程の濾液がＴＦＦ濃縮工程で使用される。さらなる好ましい実施形態では、ＴＦＦはカットオフ範囲が１００ｋＤａであり、分子量が１００ｋＤａ未満の粒子および成分を除去し、すべてではないにしてもその大部分をＴＦＦ透過液に移す。その結果、リテンテートに残る前記最終組成物では、分子量１００ｋＤａ未満の遊離の（すなわち、ＥＶと会合していない）構成要素、成分または物質が減少している。前記構成要素、成分または物質は、前記細胞培地に通常存在するか、または培地の一部であるタンパク質またはペプチドなどの任意の粒子であってよい。リテンテートは、必要な濃度に達するまで、ＴＦＦ装置内で再循環される。再循環中に、不要な成分を除去するために、洗浄用媒質または洗浄バッファ、好ましくは生理食塩水洗浄バッファを用いて、リテンテートを洗浄することができる。濃縮されたリテンテートを、その後、限定するものではないが、回収バッグまたはクライオチューブなどの回収容器に回収し、１０℃未満、好ましくは４℃の低温で保持するか、または－２０℃～－１９６℃、好ましくは－４０℃～－１９６℃、さらに好ましくは－８０℃～－１９６℃で凍結することができる。

【0073】

本発明のＥＶは、ＭＳＣ由来である。前記ＭＳＣは、ヒト由来であり、骨髄、臍帯、ホウォートンゼリー、臍帯血、羊膜、骨髄、脂肪組織、歯髄、末梢血、卵管、乳腺、肝臓および肺の組織などに由来するものであってよい。好ましい実施形態では、前記ＭＳＣは、臍帯由来である（ＵＣ－ＭＳＣ）。

【0074】

ある実施形態では、ＭＳＣは、上記のように組織の１つから新鮮に単離され、バイオリアクターでさらに増殖される。別の実施形態では、凍結保存されたＭＳＣが使用される。様々な起源からＭＳＣを得るための方法は、当該技術分野において一般に公知であり、本発明に容易に適用可能である。簡略に記載すると、臍帯などの組織を、例えば、コラゲナーゼおよび／またはトリプシンなどの酵素によって酵素的に消化させ、洗浄し、遠心分離してよい。得られたペレットを、培養フラスコ内で適当な細胞培地にプレートし、適当な条件で培養する。前記培養フラスコが、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、それらの模倣物またはそれらの組み合わせなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされてよい。後者は、接着および細胞の成長を促進することがある。別の実施形態では、前記培養フラスコが、例えばフィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、それらの模倣物またはそれらの組み合わせなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたコーティング済みマイクロキャリアまたはマイクロビーズを含んでよい。細胞が所定の最小限の割合のコンフルエンシー、好ましくは８０％以上のコンフルエンシーに達するまで培地をリフレッシュし、その後、細胞を採取する。

【0075】

継代すると、培養細胞を剥離して、培養基および細胞同士を解離させる。細胞の剥離および解離は、当該技術分野において一般的に公知のように行うことができ、例えば、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、Ｉ型、II型、III型またはIV型などのコラゲナーゼ、ディスパーゼ、プロナーゼ、パパインなどから選択される）による酵素処理、二価イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ）による処理、または機械的処理（例えば、小口径ピペットもしくはピペットチップを用いたピペット処理の繰り返し）、またはこれらの任意の組合せによって行うことができる。

【0076】

細胞の剥離および分散の適切な方法は、培地中の生存細胞の大部分を保存しつつ、細胞を所望の程度剥離および分散させるものでなければならない。好ましくは、培養細胞の剥離および解離により、細胞のかなりの割合（例えば、細胞の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）が単一の生存細胞として得られる。残りの細胞は、それぞれが比較的少数の細胞（例えば、平均で１～１００の細胞）を含む細胞クラスター中に存在してよい。

【0077】

次に、このように剥離および解離させた細胞（通常は等張緩衝液または培地中の細胞懸濁液として）を、細胞が接着できる基材上に再プレーティングし、その後、上記のような培地で培養して、さらに増殖を持続させてよい。その後、これらの細胞を、１０～１０^５細胞／ｃｍ^２の濃度で、約１／１６～１／２、好ましくは約１／８～１／２、より好ましくは約１／４～１／２の分割比で再プレーティングして培養してよい。分割比は、継代した細胞のうち、細胞を得た容器と同じ表面積の空の（通常は新しい）培養容器に播種する割合を示す。培養容器、ならびに培養容器および細胞培養培地に細胞を付着させる表面の種類は、上記のように最初に使用したものと同じでもよいし、異なっていてもよい。

【0078】

好ましい工程では、その後、細胞をより大型のレシピエントに播種し、増殖させる。細胞が望ましい量に達したら、そのままバイオリアクターに入れてさらに増殖させＥＶを採取しても、適量の細胞を凍結保存して後で使用してもよい。前記ＭＳＣの凍結保護は、典型的には、１種または複数種の凍結保護剤の存在下で行われる。このような薬剤は凍結および融解時の細胞損傷を防止するもので、当業者には一般に公知である。凍結保護剤の例としては、例えば細胞培地が挙げられ、ＤＭＳＯをに混ぜて使用する。細胞を、それに適した容器またはクライオバッグで凍結保存してよい。

【0079】

さらなる工程において、前記ＭＳＣ（新鮮単離ＭＳＣまたは凍結保存ＭＳＣのいずれか）が、バイオリアクター、好ましくは閉鎖撹拌式槽型バイオリアクターでさらに増殖されてよい。細胞を、バイオリアクター内で、上記のように適切な増殖条件（無血清ゼノフリー培地）で増殖させる。ある実施形態では、上記のように凍結保存に使用される容器またはクライオバッグは、無菌状態でバイオリアクターに取り付けられるように設計されており、（層）流キャビネットが不要となる。これにより、ＥＶの製造プロセスで（高度な無菌状態の）クリーンルームが必要ではなくなる。

【0080】

上記のような方法は、ＭＳＣ細胞増殖ユニットとＥＶ処理ユニットとを備えるＥＶ用精製システムにおいて実施することができる。２つのユニットとそれぞれのコンパートメントおよび／または部品とは、互いに流体的に接続され、一方のユニットから他方のユニットへ細胞培地および材料が流れるようになっている。流体の接続は、チューブ、パイプ、バルブ、ポンプなど、当該技術分野における従来の手段で実現される。ある実施形態では、前記ＭＳＣ細胞増殖ユニットは、バイオリアクター、好ましくは撹拌式バイオリアクターと、冷却コンパートメントとを備える。前記冷却コンパートメントは、周囲温度および前記冷却コンパートメント内の物体を４度などの１０度未満の温度に冷却する手段によって設けられる。好ましい実施形態では、前記冷却コンパートメントは冷蔵庫である。前記冷却コンパートメントは、バイオリアクターに移す新鮮な細胞培養培地と、前記バイオリアクターから出る細胞上清とをそれぞれ貯蔵するためのタンクまたは容器を備えてよい。この目的のために、細胞培養培地容器またはタンクの出口が、バイオリアクターの入口と流体的に接続される。培地が正常に流れるように、ポンプ、好ましくは蠕動ポンプが設けられる。バイオリアクターの出口は、冷却コンパートメント内の細胞上清容器の入口と流体的に接続される。この場合も、製品が流れるようにするために（蠕動）ポンプが設けられてよい。この構成では、バイオリアクターからの上清が細胞上清回収容器またはタンクに流れ、バイオリアクターに新鮮な培地が供給されてよい。バイオリアクターは、場合に応じて撹拌式バイオリアクターである。好ましくは、前記新鮮な培地は、少なくとも室温であるか、より好ましくはインキュベーターのような当該技術分野において公知の任意の加熱装置によって、好ましくは約３７℃に予熱される。当該技術分野における従来の手段、例えば、マグネチックスターラーまたは前記バイオリアクターに設置されたスターラーによって撹拌が行われてよい。前記バイオリアクターは、ＣＯ_２が供給されてもよいし、ＣＯ_２インキュベーター内に配置されてもよい。後者の実施形態では、バイオリアクターは、気体交換を可能にする手段を備える。細胞増殖ユニットには、様々なプロセスを監視するためのセンサーが設けられてよい。ある実施形態では、前記バイオリアクターおよび／またはＣＯ_２インキュベーター内の温度、湿度およびＣＯ_２レベルを測定するためのセンサーが設けられる。また、冷却コンパートメント内の状態を監視するために、例えば温度を監視するためのセンサーが設けられてよい

【0081】

ＥＶを含有する細胞上清は、ＭＳＣが所望の量に達した時点でバイオリアクターから供給され、１０℃未満、例えば４℃の温度で保存される。適量の細胞上清が得られたら、前記上清がＥＶ処理ユニットへ移される。ある実施形態では、この適量がＥＶ処理ユニットへ一括で移される。処理前に、複数のバッチを再度プールしてから可能である。代替的な実施形態では、この量がＥＶ処理ユニットに連続的に移される。ＥＶ処理ユニットは、好ましくは、１つ以上のフィルタ装置、ＴＦＦ濃縮器などの膜濾過装置、および最終産物の貯蔵コンパートメントを（ここに記載の順で）備える。これらの装置およびコンパートメント同士は流体的に接続され、ある装置から別の装置への流体の輸送ができるようになっており、場合に応じて閉ループ系である。さらに好ましい実施形態では、前記ＥＶ処理ユニットは、フィルタメッシュサイズが１～５ミクロン、より好ましくは１～３ミクロンの第１のフィルタ装置を備える。次に、第１の濾過の濾液が、第１の濾過工程で使用したメッシュサイズよりもメッシュサイズの小さい第２のフィルタ装置に移される。より好ましい実施形態では、前記フィルタ装置のメッシュサイズは、１ミクロン以下、より好ましくは０．０５～１ミクロン、さらに好ましくは０．１～０．５ミクロン、最も好ましくは０．１～０．２２ミクロンである。ある実施形態では、前記フィルタ装置は、好ましくは、第１の濾過工程と相互接続され、フィルタを通して、一定流量、好ましくは１００ｍＬ／分を供給する蠕動ポンプを備えた閉鎖系で行われるデッドエンド濾過を可能にする。

【0082】

濾過ののち、濾液がＴＦＦ装置に移される。この目的のため、最終フィルタ装置が、再び前記ＴＦＦと流体接続される。これらの装置は、通常、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により分類される。分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）または公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）は、膜によって９０％が保持される溶質の最小分子量として定義される。好ましい実施形態では、前記ＴＦＦは、カットオフ範囲が１００ｋＤａである。前記ＴＦＦは、サンプルの洗浄、濃縮、さらに精製に用いられる。ＴＦＦから、濃縮および精製されたサンプルが、充填および最終製造ユニットに移され、最終産物を得る。ある実施形態では、最終産物が、充填装置に接続されたバッグに回収され、充填装置がサンプルを最終レシピエントのために分割（aliquoting）してよい。また、最終レシピエントのための分割を手動で行うことも可能である。

【0083】

ある例では、上記のような製造プロセスを用いる場合、バイオリアクター内の最小濃度が少なくとも４０×１０^６粒子／ＬのＭＳＣの１００倍濃縮上清から、最終産物組成物１ｍＬあたり少なくとも１×１０^１１の粒子を得ることができる。ＭＳＣのコンフルエンシーは最大８０％であった。好ましくは、０．５Ｌのバイオリアクター１台に約８×１０^６個のＭＳＣを植え付け、培養し、完全に増殖させる。その後、前記ＭＳＣが上清にＥＶを放出し始め、上清が２４時間ごとに、例えば培養バッグに回収される。この例では、前記培養バッグの内容物を４回プールし、濾過（本例では、メッシュサイズ０．２２ミクロンを使用）して１００倍濃縮すると、１ｍＬあたり少なくとも１×１０^１１の粒子が得られる。

【0084】

上記の例で使用される「粒子」は、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンであるどのような粒子でもよく、その中でもＥＶが挙げられる。粒子の他の例としては、タンパク質またはペプチドの凝集体を挙げることができる。前記粒子の起源は、ＭＳＣまたはＭＳＣを培養および増殖させるための細胞培地である。したがって、前記粒子は、前記細胞培地もしくはＭＳＣに通常存在するか、またはその一部である任意の粒子であってよい。

【0085】

好ましくは、上記のような方法を用いる場合、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンである前記粒子の少なくとも９０％が、ＥＶである。

【0086】

さらなる態様において、本発明は、ＭＳＣに由来するＥＶを含有する組成物も対象とする好ましい実施形態では、前記ＥＶは、サイズが１μｍ未満であり、前記組成物のヒトアルブミン濃度は、１０～３０ｇ／Ｌである。

【0087】

別の実施形態またはさらなる実施形態では、本発明に係る組成物は、ＭＳＣ由来の１μｍ未満のサイズのＥＶを含有し、トランスフェリンとアルブミンとを含有し、その割合は、アルブミン１ｇあたりトランスフェリン約２～６０ｍｇ、好ましくはアルブミン１ｇあたりトランスフェリン約５～５５ｍｇ、より好ましくはアルブミン１ｇあたりトランスフェリン１０～４５ｍｇ、最も好ましくはアルブミン１ｇあたりトランスフェリン１０～４０ｍｇである。

【0088】

ある実施形態では、組成物のＥＶのサイズは、１μｍ未満である。好ましい実施形態では、組成物のＥＶのサイズは、約７５０ｎｍ未満、好ましくは５００ｎｍ未満、好ましくは４００ｎｍ未満、好ましくは３００ｎｍ未満である。別のまたはさらなる好ましい実施形態では、組成物のＥＶのサイズは、少なくとも５ｎｍ、より好ましくは少なくとも１０ｎｍ、より好ましくは少なくとも２５ｎｍ、より好ましくは少なくとも５０ｎｍである。別のまたはさらなる好ましい実施形態では、組成物のＥＶのサイズは、２５～５００ｎｍ、好ましくは２５～４００ｎｍ、より好ましくは約５０～約３００ｎｍである。

【0089】

ＥＶのサイズ測定およびカウントには、光学的手法が通常用いられる。本発明のある実施形態では、前記ＥＶの粒子サイズが、液体緩衝液中に懸濁させたナノ粒子の定量およびサイズ測定のための好ましい方法であるナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって測定される。別の実施形態またはさらなる実施形態では、ＮＴＡの基準法として用いられる調整可能抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を用いて粒子サイズが測定される。別の実施形態またはさらなる実施形態では、高解像度フローサイトメトリーを用いて粒子サイズが測定される。

【0090】

上述のプロセスによって得ることができる本発明に係る組成物は、ヒトアルブミンを１０～３０ｇ／Ｌの濃度、より好ましくは１０～２０ｇ／Ｌの濃度、より好ましくは１５～２０ｇ／Ｌ、または好ましくは１２～１６ｇ／Ｌの濃度で含有する。前記アルブミン濃度は、比色法または抗アルブミン抗体によるＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ある実施形態では、前記比色測定は、ブロモクレゾールグリーンアッセイである。

【0091】

前記アルブミンの起源は、ＭＳＣの細胞培地である。アルブミンは、ＭＳＣによって産生されないため、理論上は本製造プロセスの汚染物質とみなされるが、実際には、本発明の最終産物、ひいては組成物の安定性および機能性を担保するためにはアルブミンの存在が必要であることが意外にも明らかにされた。アルブミンは、必要な濃度であれば、部分的に薬物の安定剤および活性の増強剤として作用する。アルブミンを強制的に除去すると活性が低下することがわかっている（Hyungtaek Jeon et al, 2020）。

【0092】

好ましくは、前記アルブミンは、動物および／またはヒトへの使用が許容されるために、臨床グレードの製品である。

【0093】

ある実施形態では、前記組成物中に存在する前記アルブミンの少なくとも９０％が、前記組成物中の前記ＥＶと会合している。

【0094】

ヒトアルブミンの分子量は約６６ｋＤａである。したがって、ＥＶと会合していないアルブミンはＴＦＦ処理によって除去され、組成物中に残ったアルブミンはＥＶと会合している。さらなる好ましい実施形態では、前記組成物中のアルブミンの少なくとも９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％がＥＶと会合している。

【0095】

ある実施形態では、前記組成物は、ヒトトランスフェリンも含有する。前記組成物中のトランスフェリンのレベルは、好ましくは２５ｍｇ／Ｌ～９５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～７５ｍｇ／Ｌである。ある実施形態では、前記組成物中のトランスフェリンのレベルは、好ましくは６０～６００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００～５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１５０～４５０ｍｇ／Ｌである。トランスフェリンは、細胞膜を介した粒子の移動に関与することが報告されており、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＶの安定性および細胞への取り込みに関与していると言われている。このため、トランスフェリンの存在は、前記ＥＶ組成物のさらなる使用に好影響を与えることが知られている。

【0096】

ある実施形態では、前記組成物中に存在する前記トランスフェリンの少なくとも９０％が、前記組成物中の前記ＥＶと会合している。

【0097】

ヒトのトランスフェリンの分子量は約８０ｋＤａである。そのため、前記ＥＶと会合していないトランスフェリンは、ＴＦＦ処理によってある程度除去され、組成物中に残存するトランスフェリンはＥＶと会合している。さらなる好ましい実施形態では、前記組成物中のトランスフェリンの少なくとも９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％が前記ＥＶと会合している。

【0098】

アルブミンおよびトランスフェリンの両者、ならびに他のタンパク質の濃度は、当該技術分野におけるＥＬＩＳＡなどの従来の手段によって測定することができる。

【0099】

ある実施形態では、前記組成物は、分子量が１００ｋＤａ未満の遊離成分を５％未満含む。

【0100】

「遊離成分」という用語は、最終産物に含まれる成分や構成要素のうち、ＥＶと会合しておらず、このため最終産物中に遊離した形態で利用できるものを指す。

【0101】

例えば、カットオフ値１００ｋＤａのＴＦＦ濾過によって、ＭＷが１００ｋＤａ未満の遊離成分を５％未満とすることにより、組成物が十分に規定され、ＧＭＰに適合していることが保証される。ＭＳＣの細胞増殖培地中のほとんどの成分の分子量は、１００ｋＤａ未満である。このような低分子量の成分は、最終産物に残っていると汚染物質とみなされるため、最小限に抑えることが望ましい。さらなる好ましい実施形態では、前記組成物は、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の遊離成分を含有する。

【0102】

さらなる実施形態では、前記ＥＶの少なくとも６０％は、アネキシンＶを含有する。

【0103】

アネキシンは、カルシウム依存のリン脂質結合タンパク質であり、ＥＶと会合することでＥＶの抗炎症性を高める。アネキシンＶなど、アネキシンの一部は、炎症促進活性に関与している。しかし、アネキシンＶがＥＶと会合すると、ＥＶの抗炎症活性が高まることがわかっている。アネキシンＶの分子量は約３７ｋＤａである。

【0104】

本発明のある実施形態によれば、ＥＶ会合アルブミンとＥＶ会合アネキシンＶとの比は、１：４．５００～１：３５０．０００である。

【0105】

本発明のある実施形態では、組成物は、１種または複数種の第２の治療剤をさらに含んでよい。本明細書で使用する場合、治療薬は、本明細書に記載するような疾患の予防、治療および／または管理に使用することができる任意の薬剤を意味する。このような薬剤は、小胞内に存在し（例えば、ＥＶの本体内に含まれ）ていてもよいし、ＥＶと会合していてもよい。適切な治療薬は当業者に公知であり、ノンコーディングＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、増殖因子、血管新生促進分子、心臓保護酵素、抗体、抗炎症分子、抗線維化分子、抗酸化分子、神経新生促進分子、抗ウイルス分子などを挙げることができる。一部の実施形態では、単離されたＥＶが、第２の薬剤と併用される。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ステロイド、抗酸化剤、または吸入一酸化窒素である。一部の実施形態では、ステロイドは、コルチコステロイドである。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、メチルプレドニゾロンまたはデキサメタゾンである。一部の実施形態では、抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼである。

【0106】

限定するものではないが肺高血圧症を含む特定の肺疾患の治療または管理に用いられる特定の第２の治療剤としては、酸素、ワルファリン（クマジン）などの抗凝固剤；フロセミド（ラシックス（登録商標））またはスピロナラクトン（アルダクトン（登録商標））などの利尿剤；カルシウムチャネルブロッカー；Ｋ－ｄｕｒ（登録商標）などのカリウム；ジゴキシンなどの強心薬；ニフェジピン（Ｐｒｏｃａｒｄｉａ（登録商標））またはジルチアゼム（カルディゼム（登録商標））などの血管拡張薬；ボセンタン（トラクリア（登録商標））およびアンブリセンタン（レタイリス（登録商標））などのエンドセリン受容体拮抗薬；ポプロステノール（フローラン（登録商標））、トレプロスチニルナトリウム（リモデュリン（登録商標）、Ｔｙｖａｓｏ（登録商標））、およびイロプロスト（ベンタビス（登録商標））などのプロスタサイクリン類似物質；ならびにシルデナフィル（レバチオ（登録商標））およびタダラフィル（アドシルカ（登録商標））などのＰＤＥ－５阻害剤などが挙げられる。

【0107】

前記組成物は、好ましくは、液体として製剤化される。保存は、バイアル、点滴バッグ、アンプル、カートリッジ、液体吸入器、ネブライザーまたは粉末吸入器などの吸入器、およびプレフィルドシリンジなどの手段によって行われてよい。前記液体製剤は、活性主体または医薬品としてのＥＶのほかに、保存後の活性薬物が確実に安定して保たれるようにするための様々な化合物をさらに含有してよい。これらとしては、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、張力調整剤、増量剤、粘度向上剤・低下剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバントなどが挙げられる。

【0108】

別の実施形態では、前記組成物が、凍結乾燥またはフリーズドライされてよい。前記凍結乾燥製剤は、バイアル、カートリッジ、液体吸入器、ネブライザーまたは粉末吸入器などの吸入器、デュアルチャンバーシリンジ、およびプレフィルド混合システムに保管されてよい。投与前に、凍結乾燥組成物が液体として再溶解（reconstituted）される。この場合、凍結乾燥粉末に液体希釈剤を配合し、混合した後、注入してよい。通常、再溶解には、薬剤が正しく混合され投与されるようにするための再溶解および送達システムが必要である。

【0109】

好ましい実施形態では、前記組成物は水性である。本発明の一実施形態では、ＥＶは、薬学的に許容可能な担体をさらに含む組成物として製剤化される。薬学的に許容可能な担体または希釈剤は、本発明のＥＶが存在可能（viable）な状態に保たれ、その特性を保持するように選択される。薬学的に許容可能な担体は、予防的または治療的な活性を有する薬剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルである。各担体は、製剤の他の成分と適合し、対象に害を与えないという意味で「許容可能な」ものでなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能することが可能な材料の例の一部としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；水酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびにその他医薬製剤に用いられる無毒の適合物質が挙げられる。

【0110】

前記組成物の保存は、４℃、より好ましくは、前記組成物を－２０℃～－１９６℃、好ましくは－４０℃～－１９６℃、より好ましくは－８０℃～－１９６℃の温度で凍結する凍結保存によって行われてよい。前記凍結手順は、好ましくは、スナップフリージングまたはガラス化凍結手順であり、凍結過程の間および解凍後に製品が存在可能となる。別の凍結手順としては、製品の安定性を高めるために、速度制御凍結、好ましくは結晶化点での発熱反応の補正も行ってよい。後者の手順では、速度制御フリーザーを使用することができる。

【0111】

ある実施形態では、前記組成物が、注射、静脈内投与、吸入、気管内注入、全身への注入、鼻腔内注入による投与用に適合される。また、前記組成物は、ＥＶを徐放させるために、単独で、またはハイドロゲル、ポリマーもしくはポリマー医療機器と組み合わせて、外用のために処方されてもよい。

【0112】

一部の実施形態では、本組成物が、静脈内投与用に適合される。一部の実施形態では、本組成物が、対象の肺または気管への投与用に適合される。一部の実施形態では、組成物が、吸入による投与のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物が、エアロゾルとして投与するために製剤化される。一部の実施形態では、単離されたＥＶが、ネブライザーを用いて投与される。一部の実施形態では、単離されたＥＶが、気管内チューブを用いて投与される。

【0113】

一部の実施形態では、単離されたＥＶが、界面活性剤、好ましくは肺サーファクタントと共に投与または製剤化される。この界面活性剤は、好ましくは、組成物の安定性に影響を与えないように選択される。一部の実施形態では、肺サーファクタントは、単離された天然由来の界面活性剤である。一部の実施形態では、肺サーファクタントは、ウシ肺またはブタ肺に由来する。一部の実施形態では、肺サーファクタントは、合成界面活性剤である。肺サーファクタントは、（例えば、肺胞壁同士の癒着を防ぐことによって）肺の気道を開いた状態に保つのに有用なリポタンパク質混合物である。肺サーファクタントは、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスホチジルコリン（ＰＣ）、ホスホチジルグリセロール（ＰＧ）などのリン脂質；コレステロール；およびＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ、ＳＰ－Ｄなどのタンパク質から構成されていてもよい。一部の実施形態では、肺サーファクタントは、ウシ肺またはブタ肺の組織などの天然の起源に由来する。例えば、Ａｌｖｅｏｆａｃｔ（商標）（牛肺洗浄液由来）、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（商標）（豚肺ミンチ由来）、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（商標）（子牛肺洗浄液由来）、Ｓｕｒｖａｎｔａ（商標）（牛肺ミンチにＤＰＰＣ、パルミチン酸、トリパルミチンなどの成分を追加したもの）などが挙げられる。また、肺サーファクタントは合成であってもよい。例としては、Ｅｘｏｓｕｒｆ（商標）（ＤＰＰＣにヘキサデカノールおよびチロキサポールを添加したもの）、Ｐｕｍａｃｔａｎｔ（商標）または人工的肺拡張コンパウンド（Artificial Lung Expanding Compound：ＡＬＥＣ）（ＤＰＰＣおよびＰＧを含む）、ＫＬ－４（ＤＰＰＣ、パルミトイル－オレイルホスファチジルグリコール、パルミチン酸、およびＳＰ－Ｂを摸倣する合成ペプチドを含む）、Ｖｅｎｔｉｃｕｔｅ（商標）（ＤＰＰＣ、ＰＧ、パルミチン酸、組換え型ＳＰ－Ｃを含む）等が挙げられる。肺サーファクタントは、市販品の販売業者から入手することができる。

【0114】

また、本発明は、パッケージングされラベル付けされた医薬品を包含する。この製造品またはキットは、ガラスバイアルもしくはプラスチックアンプルなどの容器または密封された他の容器に適切な単位投与形態を含む。単位投与形態は、例えばエアロゾルによる肺への投与用に適合されることが望ましい。好ましくは、製造品またはキットは、医薬品の投与方法を含む使用方法に関する説明書をさらに含む。説明書は、医療提供者、技師または対象に、標的とする疾病または障害を適切に予防または治療する方法について助言を与える情報資料をさらに含んでよい。換言すれば、製造品は、限定するものではないが、実際の投与量、モニタリング手順、および他のモニタリング情報を含む、使用のための投与レジメンを示すまたは示唆する指示を含む。

【0115】

他の医薬品と同様に、包装材および容器は保管および輸送中の製品の安定性を保護するように設計されており、安定性を保証するために乾燥剤を含んでよい。

【0116】

キットは、滅菌水性懸濁液中にＥＶを含んでよく、直接使用されるか、または静脈内注射もしくはネブライザーでの使用のために通常の生理食塩水で希釈されるか、または気管内投与のために界面活性剤で希釈もしくはこれと組み合わせられる。このため、キットは生理食塩水または界面活性剤などの希釈液や薬剤を含んでよい。また、キットは、ネブライザーなどの肺送達デバイス、またはマウスピース、ノーズピース、またはマスクのような使い捨て部品を含んでもよい。

【0117】

最終的な態様において、本発明は、上記のような組成物の使用にも同様に関する。より詳細には、前記組成物は、治療的または予防的な使用のために適合される。本発明は、特定の疾患を予防および治療することを企図する。疾病の予防とは、疾病が顕在化する可能性を低減すること、および／または疾病の発症を遅らせることを意味する。疾病の治療とは、疾病の症状を低減または消失させることを意味する。したがって、本発明は、対象の疾患を治療および／または予防するための方法を提供することも企図する。

【0118】

対象は好ましくはヒト対象であるが、本発明の特定の態様は、ヒト対象、農業用家畜（例えば、牛、豚など）、愛玩動物（例えば、馬）、伴侶動物（例えば、犬、猫など）など、恩恵を得る可能性がある任意の対象に実施することができる。好ましい実施形態では、前記対象は、ヒト、好ましくはヒトの患者であり、前記患者は、成人、乳児、または新生児であってよい。

【0119】

ある実施形態では、上記いずれかの実施形態に係る組成物は、肺疾患の予防または治療に使用される。ある実施形態では、前記肺疾患は、炎症性肺疾患、肺血管疾患、または急性肺損傷であってよい。より好ましくは、前記炎症性肺疾患は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）とも呼ばれる肺高血圧症、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギー、特発性肺線維症または肺炎などである。前記炎症性肺疾患は、ウイルス感染症などの感染症に起因するものであってよい。好ましい実施形態では、前記ウイルス感染症は、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。別の実施形態では、前記急性肺損傷は、敗血症と関連するか、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。

【0120】

また、これらの疾患には、炎症性の要素を有さない肺血管疾患も含まれる。本発明に従って治療されてよいさらに別の肺の状態には、敗血症または換気と関連する可能性のある急性肺障害が含まれる。後者の例としては、急性呼吸促迫症候群がある。

【0121】

肺高血圧症は、肺動脈の血圧が正常値を大きく上回ることを特徴とする肺疾患である。症状としては、息切れ、特に運動時の胸痛、脱力感、疲労感、失神、特に運動時の軽い頭痛、めまい、心音および雑音の異常、頚静脈怒張、腹部、脚および足首の体液貯留、爪床の青色化などが挙げられる。

【0122】

気管支肺異形成症は、酸素吸入を受けているか人工呼吸器を装着している新生児、早産、特に超早産（妊娠３２週より前）で生まれた新生児が罹患する疾患である。新生児慢性肺疾患とも呼ばれる。ＢＰＤの原因としては、例えば人工呼吸などによる機械的損傷、例えば酸素療法などによる酸素毒性、感染症などが挙げられる。この疾患は、時間の経過と共に非炎症性から炎症性へと進行することがある。症状は、皮膚の青色化、慢性の咳、速い呼吸、息切れなどが挙げられる。ＢＰＤの患者は、ＲＳ（respiratory syncytial）ウイルス感染症などの感染症にかかりやすい。ＢＰＤの患者は、肺高血圧症を発症することがある。

【0123】

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）または成人呼吸窮迫症候群とも呼ばれ、肺の損傷または急性疾患の結果として生じる状態である。肺の損傷は、換気、外傷、火傷、および／または誤嚥の結果であることがある。急性疾患は、感染性肺炎または敗血症のことがある。これは、急性肺損傷の重症例とされ、命にかかわることも多い。肺の炎症、ガス交換の障害、炎症性メディエータの放出、低酸素血症、および多臓器不全を特徴とする。また、ＡＲＤＳは、胸部Ｘ線で両側の浸潤をみとめる場合、吸入酸素量（ＦｉＯ_２）に対する動脈血酸素分圧（ＰａＯ_２）が２００ｍｍＨｇを下回る比率としても定義することができる。両側の浸潤を伴いＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比が３００ｍｍＨｇ未満であれば、急性肺障害を示し、ＲＤＳの前兆であることが多い。ＡＲＤＳの症状としては、息切れ、頻呼吸、および酸素レベルの低下による精神錯乱が挙げられる。

【0124】

特発性肺線維症は、原因不明の肺の瘢痕化または肥厚を特徴とする。５０～７０代に多く発症する。症状は、息切れ、規則的な咳（一般的には乾いた咳）、胸痛、および活動レベルの低下などである。

【0125】

予防および／または治療で、場合によっては、ＥＶを単独で、または１種以上の第２の薬剤もしくは有効成分と共に使用されてよい。また、対象に、外部からの酸素投与を伴う、または伴わない換気などの機械的介入を行ってもよい。

【0126】

対象は、本発明のＥＶを用いた治療に適応可能な肺の疾患（または状態）を有する対象であっても、そのような疾患（または状態）を発症するリスクのある対象であってもよい。そのような対象には、新生児、特に低妊娠期に生まれた新生児が含まれる。本明細書において、ヒト新生児とは、出生時から生後約４週間までのヒトを指す。本明細書において、ヒト乳児とは、生後約４週間から約３歳までのヒトを指す。本明細書において、低妊娠期間とは、特定の種の生物の正常な妊娠期間より前に起こる出産（または分娩）を意味する。ヒトの場合、妊娠満期は約４０週であり、３７週から４０週以上までと幅がある。低妊娠期間とは、ヒトにおいては、早産と同様に、妊娠３７週以前の出生として定義される。したがって、本発明は、妊娠３７週以前、さらに短い妊娠期間（例えば、３６週以前、３５週以前、３４週以前、３３週以前、３２週以前、３１週以前、３０週以前、２９週以前、２８週以前、２７週以前、２６週以前、または２５週以前）に生まれた対象の予防および／または治療を企図する。通常、このような未熟児は新生児として治療されるが、本発明では、新生児の段階を超えて、小児期および／または成人期まで治療することを企図する。対象の中には、例えば肺高血圧症などの特定の形態の肺疾患に対する遺伝的素因を有するものもあり、このような対象も本発明に従って治療されてよい。

【0127】

新生児、特に低妊娠期間齢の新生児に関して、本発明は、生後４週間、３週間、２週間、１週間、６日、５日、４日、３日、２日、１日、１２時間、６時間、３時間、または１時間以内にＥＶを投与することを企図する。一部の重要な例では、生後１時間以内にＭＳＣエクソソームが投与される。

【0128】

本開示は、限定するものではないが、ＢＰＤなどの肺疾患を示す症状がない場合であっても、ＥＶを投与することをさらに企図する。

【0129】

ある実施形態では、本発明に係るＥＶを含有する前記組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９、より詳細にはＣＯＶＩＤ－１９誘発肺炎または急性肺炎の治療に使用されてよい。ＣＯＶＩＤ－１９は、ヒトの呼吸器系および肺の上皮組織を攻撃する重症急性呼吸器症候群による新興感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９疾患では、より重篤な症状を発症するリスクの高い患者層が存在することが報告されている。主な合併症は、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多臓器不全、敗血症性ショック、および死亡が挙げられる。

【0130】

ＣＯＶＩＤ－１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とも呼ばれ、これを原因とし、サイトカインストーム、多臓器不全、敗血症性ショックおよび血栓を前駆症状とする急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に進行することがある肺感染症の異なるメカニズムに関連していることが示されている。これに対し、細菌性肺炎は、肺全体または肺の肺胞の一部が炎症を起こし、液体、膿、細胞破片で満たされる一般的な肺感染症で、ほとんどがウイルス、真菌、または細菌によって引き起こされ、多くの場合、抗生物質で治療される。その他の症例では、心血管系合併症が生じ、肝障害の影響による肝酵素の上昇、神経症状が発現する。小児では、感染が進行すると川崎病に似た症状の小児多臓器不全症候群を発症し、死に至ることもある。現在のデータでは、報告される症例に占める子どもの割合は少なく、１０歳未満が約１％、１０～１９歳が約４％である。

【0131】

ＥＶを含有する前記組成物は、炎症過程の抑制を主な作用機序とするマルチターゲット治療効果を提供する。

【0132】

ＥＶは、過度の炎症およびサイトカインストーム、線維化、（機械的）換気による酸化ストレス、ウイルスの活動および炎症反応による上皮細胞のアポトーシスなど、肺損傷の複数のメカニズムを標的とする。

【0133】

別の実施形態では、ＥＶを含有する前記組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９、より詳細にはＣＯＶＩＤ－１９誘発肺炎または急性肺炎の補助治療として用いられる。

【0134】

別の実施形態では、上記のいずれかの実施形態に係る前記組成物は、クローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防または治療に使用される。ＩＢＤは、消化管に炎症を生じる疾病の総称であり、最も一般的なＩＢＤに潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）とがある。ＵＣは、結腸および直腸の最内側の粘膜に長期間にわたる炎症およびただれを引き起こす疾病である。ＣＤは消化管のどこにでも発生し、患部組織の深層部まで浸透することがある。ＣＤの症状として、肛門周囲瘻孔の発生がある。しかし、これらの疾患は、いずれも、腹痛、激しい下痢、倦怠感、および体重減少などを引き起こすという点で類似する。

【0135】

肺疾患に関してＥＶを投与する場合、好ましい投与方法は、気管内注入または吸入である。神経疾患に関しては、好ましくは全身への注入、鼻腔内への注入、または吸入である。クローン病の瘻孔、潰瘍、または軟骨の修復に関しては、局所注射が好ましい。創傷治癒、火傷および／または潰瘍の治療に関しては、ＥＶは、好ましくは、ＥＶの徐放のためのハイドロゲルまたはポリマー医療機器と組み合わせて、身体の外側に投与される。

【0136】

本発明のＥＶは、有効量投与される。有効量とは、単独で所望の結果を促す薬剤の量を意味する。絶対量は、投与のために選択された材料、単回投与か複数回投与か、年齢、身体状態、身体の大きさ、体重、疾患のステージなどの個々の患者のパラメータを含む様々な要因に依存する。これらの要因は、当業者には公知であり、日常的な実験を超えることなく対応することができる。また、投与量は、前記組成物を投与する対象によって異なってよい。

【0137】

本発明のある実施形態では、前記ＥＶは、前記患者の１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの用量で投与されるか、または前記患者の１０^１０ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、投与量は、小児（０ヶ月から１２歳までの年齢）では１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１１ＥＶ／ｋｇの範囲である。１２～１９歳および成人では、前記用量は、１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの範囲であってよい。

【0138】

本発明のある実施形態では、前記ＥＶは、ＣＤの肛門周囲瘻孔の治療のために、患者１人につき約１０^１０～約１０^１２ＥＶの用量で投与される。

【0139】

また、本開示は、２回、３回、４回、５回またはそれ以上の投与を含む、ＥＶの反復投与も企図する。場合によっては、前記ＥＶが、連続的に投与されてよい。反復または連続投与は、治療する状態の重症度に応じて、数時間（例えば、１～２、１～３、１～６、１～１２、１～１８もしくは１～２４時間）、数日（例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６日もしくは１～７日）、または数週間（例えば、１～２週間、１～３週間もしくは１～４週間）の期間行われてよい。投与が繰り返されるが連続的でない場合、投与間隔は、数時間（例えば、４時間、６時間、もしくは１２時間）、数日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、もしくは６日）、または数週間（例えば、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間）であってよい。投与間隔は同じでも、異なっていてもよい。例えば、疾病の症状が悪化しているようであれば、ＥＶをより頻回に投与し、症状が安定または軽減したら、ＥＶの投与頻度を減らしてよい。

【0140】

場合によっては、低用量のＥＶを繰り返し静脈内投与してよい。したがって、本開示は、ＥＶの低用量形態の反復投与、およびＥＶの高用量形態の単回投与を企図する。低用量形態は、限定するものではないが、１キログラムあたりまたは１回の局所注入あたり１０^１０～１０^１１ＥＶの範囲であってよく、高用量形態は、限定するものではないが、１キログラムあたりまたは１回の局所注入あたり１０^１１～１０^１２の範囲であってよい。とりわけ、疾患の重症度、対象の健康状態、および投与経路に応じて、低用量または高用量のＥＶの単回または反復投与が企図されることが理解されるであろう。

【0141】

ＥＶは、肺または消化管への送達を可能にする任意の経路で投与されてよい。全身への投与経路としては、静脈内ボーラス注射または持続的注入が適している。鼻腔内投与、（例えば、挿管による）気管内投与、および（例えば、口または鼻からエアロゾルを介した）吸入などのより直接的な経路も本発明によって企図され、場合によっては、特に迅速な作用が必要な場合は、より適切なことがある。本明細書で使用されるように、エアロゾルとは気体中に微粒子として分散した液体の懸濁液であり、そのような粒子を含む細かい霧または噴霧も含む。本明細書で使用されるように、エアロゾル化とは、液体懸濁液を微粒子または液滴に変化させることによってエアロゾルを生成する過程である。これは、加圧パックまたはネブライザーなどのエアロゾル送達システムを使用して行われてよい。ネブライザーとしては、限定するものではないが、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤の使用による、気流（すなわち空気圧）、超音波、および振動メッシュネブライザーが挙げられる。ネブライザーのほかにも、肺への送達用のデバイスとしては定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。吸入器または送気器に使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、凍結乾燥エクソソームおよび乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤を含んで製剤化されてよい。

【0142】

ＥＶは、全身への送達が望ましい場合、例えばボーラス注入または連続注入を含む注入による非経口投与用に製剤化されてよい。注入用製剤は、保存剤を添加した、または添加しない単位用量形態、例えば、アンプルまたはマルチ用量容器で提供されてよい。

【0143】

組成物は、油性または水性のビヒクル中の水溶性懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルなどが挙げられる。水性注入用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を高める物質を含んでよい。任意選択で、懸濁液が、溶解性を向上させる適切な安定剤または薬剤を含んでよい。あるいは、エクソソームは、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水で再溶解（constitution）するための凍結乾燥された形態または他の粉末もしくは固体の形態であってもよい。

【0144】

本明細書に記載のＥＶおよび組成物は、好ましくは、上記のような方法によって得られる。

【0145】

次に、本発明を、限定するものではない実施例を参照しながらより詳細に説明する。

【実施例】

【0146】

実施例１－ＭＳＣからのＥＶの単離
臍帯組織またはホウォートンゼリーから得た臍帯由来ＭＳＣを、細胞培養培地供給容器（１）と流体接続されている撹拌式バイオリアクター（２）を備える増殖装置で増殖させた。図１を参照すると、参照符号は以下を示す。
１．細胞培養培地容器
２．撹拌式バイオリアクター
３．細胞上清容器
４．冷蔵庫
５ａ，５ｂ，５ｃ．蠕動ポンプ
６．第１のフィルタユニット
７．第２のフィルタユニット
８．ＴＦＦカセット
９．最終産物

【0147】

前記バイオリアクター（２）内に入れた三次元マイクロキャリアの存在下、および精製ヒトアルブミンを３ｇ／Ｌの濃度で含有するゼノフリー無血清培地の存在下で、細胞を増殖させる。この培地は、６０ｍｇ／Ｌの濃度の組換え精製トランスフェリンをさらに含有していた。

【0148】

バイオリアクター（２）内の最小濃度が少なくとも４０×１０^６細胞／Ｌに達し、ＭＳＣのコンフルエントが最大８０％に達するまでＭＳＣを増殖および成長させた。細胞濃度は、マイクロビーズに付着したＭＳＣの細胞計数および蛍光標識によって規定した。この段階で、細胞はＥＶの分泌を開始できるようになっていた。このため、新鮮な無血清ゼノフリー培地を基礎培地（ＤＭＥＭ／グルコース高含有／フェノールレッドなし／ｇｌｕｔａｍａｘ、サーモサイエンティフィック）で１：１０に希釈し、細胞培養に供給した。２４時間後には、ＥＶの採取を開始できるようになった。この目的のために、バイオリアクター（２）内の調整した細胞培養物または細胞上清を、４℃に設定した冷蔵庫（４）に入れた細胞上清容器（３）にポンプで移した。この上清は、ＭＳＣが産生したＥＶを含んでいた。その後、容器（３）に収集した上清を、蠕動ポンプ（５ｃ）により、２ミクロンのフィルタを有する第１のフィルタユニット（６）にポンプで送った。上清を、蠕動ポンプ（５ｃ）を備えた閉鎖系で、フィルタ（６）を通して１００ｍＬ／分で一定流量を供給するデッドエンド濾過により濾過した。その後、第１の濾過工程の透過物を、第１のフィルタユニット（６）と流体接続され、０．２ミクロンのフィルタを有する第２のフィルタユニット（７）で濾過した。フィルタ（７）を通して１００ｍＬ／分で一定流量を供給する蠕動ポンプ（５ｃ）を備えた閉鎖系で、デッドエンド濾過により濾過を行った。ＥＶを含有する透過物を１Ｌのバッグに回収し、その後４℃で保存した。

【0149】

最終工程では、前記透過物を、デッドエンドフィルタユニット（６，７）と流体接続されたカットオフが１００ｋＤａのＴＦＦカセット（８）にかけた。ＴＦＦカセット（８）を通ったＥＶを含有するリテンテートを生理食塩水緩衝液で洗浄し、回転子速度３００ｒｐｍの蠕動ポンプ（５ｃ）を用いてＴＦＦカセット（８）を循環させて最終容量が１０ｍＬとなるまで濃縮した。ＴＦＦ（８）から最終産物（９）を回収し、－８０℃以下で凍結するか、またはクライオチューブ、バッグもしくはその他の適当な容器に入れ４℃で保存した。

【0150】

前記最終産物に対し、生成物の品質を確認するために分析を行った。品質管理として、ＥＶの純度および安定性を保証するための比色分析およびＥＬＩＳＡによる、ＥＶと会合しているアルブミン濃度の測定、ナノ粒子トラッキングアナライザー（ＮＴＡ）、調整抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）、電子顕微鏡ならびに／またはＲＡＭＡＮ顕微鏡などの技術による粒子分析を行った。生成物のサンプルにエンドトキシンおよび／またはマイコプラズマが含まれているかどうかを検査した。その他の品質管理としては、定性クロマトグラフィー、質量分析、ＥＬＩＳＡ、シークエンシング、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの偏光などの活性試験を行った。

【0151】

上記の培養条件において、前記ＭＳＣは、前記ＭＳＣを培養する１８～２４時間の時間範囲で、細胞培地１ｍＬ当たり少なくとも０．２５×１０^９個の粒子を産生する。

【0152】

上記実験は、ＵＣ由来のＭＳＣで実施したが、限定するものではないが、乳腺、骨髄、ホウォートンゼリー、（臍帯）血、末梢血、羊膜、脂肪組織、歯髄、卵管、肝臓および肺の組織など、他の組織または起源に由来するＭＳＣでも繰り返した。

【0153】

実施例２：ＥＶ製品中のアルブミン濃度測定
実施例１に記載の方法で得られたＥＶ製品について、アルブミン濃度を分析した。アルブミン濃度は、以下の２種類の方法で測定した。
－比色測定
－ＥＬＩＳＡ
簡略に記載すると、ブロモクレゾールグリーンを用いて、サンプル中のアルブミン濃度を比色反応により評価した。ＥＬＩＳＡによる濃度測定は、抗ヒトアルブミン抗体で行った。

【0154】

比色反応により測定した最終産物のアルブミン濃度は１６ｇ／Ｌであった。

【0155】

ＥＬＩＳＡで測定した濃度は約１７ｇ／Ｌであった。アルブミンの分子量は約６６ｋＤａであり、ＥＶと会合していないアルブミンはカットオフが１００ｋＤａのＴＦＦにより除去されることが予想される。そのため、残ったアルブミンはＥＶと会合していると考えられる。

【0156】

実施例３：ＥＶ製品中のトランスフェリン濃度測定
実施例１に記載の方法で得られたＥＶ製品のトランスフェリン濃度を分析する。トランスフェリン濃度は、ＥＬＩＳＡ（アブカム）を用いて、製造業者のプロトコールに従って定量化する。

【0157】

最終産物においてＥＬＩＳＡ（アブカム）により測定したトランスフェリン濃度は７０ｍｇ／Ｌであった。

【0158】

実施例４：ＥＶ製造用臨床グレード培養培地の純度
ＥＶ製造に使用する様々な培地における汚染粒子の濃度を評価するための実験を行った。試験対象は以下の培地である。
１．精製ヒトアルブミン０．３ｇ／Ｌと組換え精製トランスフェリン７ｍｇ／Ｌとを含むゼノフリー無血清培地（実施例１で用いた培地に対しＤＭＥＭ培地を用いて約１：１０に希釈したもの）
２．基礎ＤＭＥＭ培地（添加物なし）（サーモサイエンティフィック／ロンザ）
３．未規定製品を添加した培養培地（サーモサイエンティフィック／ロンザ）

【0159】

新鮮な培地のサンプルを、ＮＴＡ、ＴＲＰＳ、およびＦＡＣＳの各装置を使用して分析する。粒子のサイズおよび量を定量化した。コントロールとして精製水を使用した。

【0160】

ＥＶを、実施例１で説明したような方法で、上述した培地のいずれかを用いて製造する。品質管理の結果、異なる培地で生産したＥＶについて、汚染粒子の数が最も少ないのは培地２であるものの、この培地は長期の細胞培養には対応できない。汚染粒子が最も多いのは、培地３である。培地１は、他の培地の中間の数の汚染粒子を含むが、長期的な細胞培養に対応できる。

【0161】

実施例５：ＥＶ製造のための臨床グレードの培地での細胞培養
本実験は、以下における細胞数、細胞増殖曲線、および細胞生存率を示すものである。
１．精製ヒトアルブミン３ｇ／Ｌと組換え精製トランスフェリン６０ｍｇ／Ｌとを含むゼノフリー無血清培地（実施例１で使用したものと同様の培地）。
２．基礎ＤＭＥＭ培地（添加物なし）（サーモサイエンティフィック／ロンザ）
３．未規定製品を添加した培養培地（サーモサイエンティフィック／ロンザ）

【0162】

方法
第１の実験では、ＭＳＣを、培地１、培地２または培地３の存在下で、細胞が７０～８０％のコンフルエンシーに達するまで、第１の実施例で上述したような培養系で増殖させる。

【0163】

その後、第２の実験では、第１の実験で培地１、培地２、および培地３で増殖させた細胞を同じ培地でリフレッシュする。

【0164】

第３の実験では、第１の実験で培地１に増殖させた細胞を、培地２と２：８の割合で混合した培地１でリフレッシュする。同じ実験で、第１の実験で培地３に増殖させた細胞を、培地２と２：８の割合で混合した培地３でリフレッシュする。

【0165】

第４の実験では、第１の実験で培地１、培地２、および培地３に増殖させた細胞を、培地２でリフレッシュする。

【0166】

実験２、実験３、および実験４では、細胞培養を少なくとも５日間続け、２４時間ごとに培地をリフレッシュした。培地のリフレッシュは、古い培地を１００％除去し、同量の新しい培地を加えて行う。

【0167】

結果
第１の実験では、培地１および培地３のＭＳＣがマイクロキャリアに付着することが確認されるが、培地２ではこれがみとめられない。ＭＳＣは、培地１および培地３の両方で成長／増殖することができるが、培地２では生存能力を維持することができない。以降の実験では、培地１および培地３で培養した細胞のみを使用する。

【0168】

実験２では、未希釈の培地１および培地３の細胞培養物が、２４～４８時間以内に急速に過剰増殖し、その後、細胞が死滅する。実験３では、希釈した培地１および培地３を用いた細胞培養物は非常にゆっくりと成長を続け、細胞は少なくとも５日間存在可能である。実験４では、培地１および培地３に代えて培地２を用いた細胞培養物は２日しか生存できず、その後、細胞が死滅する。

【0169】

実施例６：臨床グレードの培養培地におけるＥＶの濃度および効率性
本実験は、以下におけるＥＶの濃度を示すものである。
１．精製ヒトアルブミン０．３ｇ／Ｌと組換え精製トランスフェリン７ｍｇ／Ｌとを含むゼノフリー無血清培地（実施例１で用いた培地に対してＤＭＥＭ培地を用いて約１：１０に希釈したもの）
２．基礎ＤＭＥＭ培地（添加物なし）（サーモサイエンティフィック／ロンザ）
３．未規定製品を添加した培養培地（サーモサイエンティフィック／ロンザ）

【0170】

ＭＳＣを、上述の培地のうちの１つで上述のように増殖させる。培養は少なくとも５日間続け、すべての培地を２４時間ごとにリフレッシュする。

【0171】

実施例１および実施例５のＥＶ製造プロトコールを使用する。培地１は、全粒子から新鮮な培地に存在する粒子を減算して求めた細胞分泌粒子（真性ＥＶ）の濃度が最も高い。特にこの実施例では、粒子の少なくとも９５％、最大９９％が、ＭＳＣ（ＥＶ）によって分泌される。

【0172】

実施例７：３ＤバイオリアクターシステムにおけるＥＶの生産効率
本実験は、以下におけるＥＶ生成の効率性を示すものである。
ｉ）図１に図示し実施例１に記載の３次元培養システム
ii）２次元培養システム

【0173】

ＭＳＣを、３次元培養システム（０．５Ｌおよび１Ｌの撹拌式バイオリアクター）ならびに２次元多層フラスコで、増殖用の培地（ｉ）に続いてＥＶ生成用の希釈培地（ｉ）を使用して製造する。細胞数、培地の量、フットプリント、およびＥＶ収量を算出し、より大容量のバイオリアクターに外挿する。３Ｄバイオリアクター法は、２Ｄ培養システムと比較して、フットプリントが小さく、培地の消費量が少なく、バッチあたりのＥＶ収量が高い。

【0174】

実施例８：ＴＦＦシステムを用いたＥＶの分離効率
本実験は、以下を用いたＥＶの精製効率を示すものである。
ｉ）最終濃縮工程としてカットオフ１００ｋＤａのＴＦＦシステム
ii）サイズ排除クロマトグラフィー
iii）超遠心分離

【0175】

ＴＦＦ濃縮を使用することにより、ＳＥＣと比較して格段に高いＥＶ回収率が得られる。ＴＦＦの収量はＵＣの収量と同等であるが、後者ではＥＶが損傷し、品質が低下する。また、ＵＣはＧＭＰ／大量生産には適さない。

【0176】

実施例９：ＢＰＤ治療への使用を意図したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＥＶの活性
ＥＶを、実施例１に従って製造し、ＢＰＤの以下の主要な症状の治療に使用する。

【0177】

ａ）炎症
ＥＶのインターナリゼーションアッセイ。蛍光標識したＥＶをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養する。標識したＥＶを内包する免疫細胞の集団をフローサイトメトリーにより定量化する。抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ５６、および抗ＣＤ１５の各マーカーを調べる。分析は、０時間、１時間、６時間、１２時間、および時間２４時間後に行い、好中球については６時間後に行う。線維芽細胞が産生するＥＶをネガティブコントロールとして使用する。

【0178】

リンパ球の遊走アッセイ。ＥＶをトランスウェルシステムでＰＢＭＣと共培養する。ケモカインＳＤＦ－１に対する細胞遊走を調べる。細胞の表現型の分析および定量化は、フローサイトメトリーにより行う。

【0179】

Ｂ細胞アッセイ。ＥＶを、ＣｐＧ刺激したヒト末梢血単核細胞と共培養する。細胞の増殖および形質細胞への分化を調べ、フローサイトメトリーで表現型を調べ定量化を行う。サイトカインおよび抗体の定量は、ＥＬＩＳＡで行う。

【0180】

Ｔ細胞アッセイ。ＥＶを、ヒト末梢血単核細胞およびＴ細胞アクティベーターＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共培養する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスを、フローサイトメトリーを用いて定量化する。Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を求める。増殖Ｔｒｅｇはフローサイトメトリーにより定量化する。ＩＬ１０、ＴＧＦ－β、ガレクチン－１、ＨＧＦ、ＰＧＥ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γの各サイトカインの定量は、ＥＬＩＳＡで行う。

【0181】

ＣＤ細胞アッセイ。ＣＤ細胞の活性化を、ＥＶと共培養してフローサイトメトリーにより調べる共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびに成熟マーカーＣＤ８３のアップレギュレーションをフローサイトメトリーにより定量化する。ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦ－βの各サイトカインの定量は、ＥＬＩＳＡで行う。フローサイトメトリーを用いて貪食アッセイを行う（ＦＩＴＣ－デキストランによるインキュベーション）。トランスウェルアッセイおよびフローサイトメトリーにより、マイグレーションアッセイを行う。

【0182】

マクロファージアッセイ。ＥＶを、Ｍ１刺激（ＬＰＳ）およびＭ２刺激（ＩＬ４／ＩＬ１３）を行ったマクロファージと共培養する。Ｍ１／Ｍ２比率をフローサイトメトリーにより算出する。ＩＬ６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ１、ＴＧＦ－β、ＦＧＦの各サイトカインの定量は、ＥＬＩＳＡで行い、ｑＰＣＲ遺伝子の発現解析で確認した。トランスウェルマイグレーションアッセイ（ｆＭＬＰ方向）を行い、フローサイトメトリーにより定量化する。

【0183】

ＮＫ細胞アッセイ。ＥＶを、ＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞と共培養する。ＴＮＦα、ＩＦＮγの各サイトカインの定量は、ＥＬＩＳＡで行う。ＣＤ２７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γの各成熟マーカー、および細胞増殖はフローサイトメトリーにより定量化する。

【0184】

ｂ）線維症
正常なヒト肺線維芽細胞およびヒト上皮細胞を用いて、市販の線維化アッセイを用いて実験を行う。ヒト肺線維芽細胞を、時間を変え、複数用量で濃度を変えて送達したＥＶと共培養する。その後、α－ＳＭＡおよびコラーゲンＩ／フィブロネクチンの解析を行う。

【0185】

別の実験では、ヒト初代気管支上皮細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）に対するＥＶの影響を測定する。ＥＭＴを、市販のアッセイを用い、製造業者のプロトコールに従って調べる。一実験では、健常組織または特発性肺線維症患者由来の実験用初代細胞をＴＧＦ－βで刺激してＥＭＴを誘導し、非刺激細胞をコントロールとして使用する。その後、ヒト上皮細胞を、時間を変え、複数用量で濃度を変えて送達したＥＶと共培養する。ＦＡＣＳならびにＥ－カドヘリンおよびフィブロネクチンの発現を用いてＥＭＴを検出し定量化する。

【0186】

別の実験では、ヒト気管支初代線維芽細胞における線維芽細胞－筋線維芽細胞転換（ＦＭＴ）に対するＥＶの影響を測定する。ＦＭＴを、市販のアッセイを用い、製造業者のプロトコールに従って調べる。ある実験では、健常組織または特発性肺線維症患者由来の実験用初代細胞をＴＧＦ－βで刺激してＦＭＴを誘導し、非刺激細胞をコントロールとして使用する。その後、ヒト線維芽細胞を、時間を変え、複数用量で濃度を変えて送達したＥＶと共培養する。α－平滑筋アクチンマーカーを用いてＦＭＴを検出し定量化する。

【0187】

ｃ）酸化ストレスおよび細胞のアポトーシス
線維症の研究で報告されているアッセイおよび細胞株を使用して、細胞のアポトーシスおよび酸化ストレスを定量化（ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー）する。

【0188】

Ｈ_２Ｏ_２または他の試薬を用いて酸化ストレスを誘発する。細胞を、時間を変え、かつ酸化ストレス誘発物質の量を変えて酸化ストレスに曝露させる。その後、細胞を、時間を変え、複数用量で濃度を変えて送達したＥＶと共培養する。酸化ストレスの直接的な影響を活性酸素の検出および定量化により測定し、間接的な影響を核酸損傷、脂質過酸化、およびタンパク質酸化を測定することにより測定する。酸化ストレスの直接的および間接的なマーカーの検出および定量化は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを用いて行う。

【0189】

酸化ストレスに反応した細胞のアポトーシスを、市販のアッセイを用い、製造業者のプロトコールに従って検出および定量化する。一実験では、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）（サーモフィッシャー）を使用して、ＦＡＣＳによる細胞生存率の検出を行う。

【0190】

別の実験では、アネキシンＶ免疫蛍光染色法により、初期のアポトーシスを検出し、ＦＡＣＳを用いて定量化する。

【0191】

別の実験では、活性化されたカスパーゼ－３およびカスパーゼ－７をＦＡＣＳにより定量化することで、初期のアポトーシスを検出する。

【0192】

実施例１０：クローン病の治療に使用することを目的としたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＥＶの活性
本実験は、クローン病の主要な症状の治療における、実施例１に従って製造したＥＶの活性を示す。実施例９（ａ）～（ｃ）に記載の実験に加えて、ＥＶを用いた血管新生アッセイも実施する。

【0193】

一実験では、マトリゲル上でＨＵＶＥＣ細胞をＥＶと共培養し、チューブ形成を調べる。ヒトＨＵＶＥＣ細胞を用いて市販の血管新生チューブ形成アッセイを使用して実験を行う。血管形成に必要な天然の細胞外マトリックスの特性を模倣するため、ハイドロゲルなどの３次元環境で細胞を培養する。ＥＶを、時間を変え、複数用量で濃度を変えて送達する。ＨＵＶＥＣ細胞の免疫標識および蛍光標識、ならびにＥＶに反応したチューブの長さおよび分岐の測定などを用いて解析を行う。

【0194】

実施例１１：ＢＰＤのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＥＶの生体内分布の研究
本実験は、ＢＰＤのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける、実施例１に従って製造したＥＶの生体内分布を評価する。

【0195】

ＢＰＤのための確立された広く使用されている動物モデル、すなわち高濃度酸素環境に曝露した新生児ラットを用いてｉｎ ｖｉｖｏ非臨床試験を行う（O'Reilly M et al, 2014; Thebaud B, 2018）。新生児ラットは出生時に肺の構造が未熟（後期管状期／早期嚢状期）であり、生後５日目に肺胞期に達するため、このモデルは人工呼吸を行った未熟児の状態を模倣したものであるといえる。ラットは生後３０日目頃に完全な肺胞形成に達するが、生後間もない時期に高濃度酸素環境に曝露すると、肺胞の発達が妨げられ、肺胞マクロファージが増加し、肺血管の形成に悪影響を及ぼすことが知られている。このように、構造的な観点では、新生児期の齧歯類の肺は、２４～２８週の早産児のヒト新生児とほぼ近似している（Porzionato A et al, 2019; Porzionato A et al, 2021）。

【0196】

高濃度酸素環境誘発ＢＰＤの新生児ラットモデルにおいて、気管内（ＩＴ）投与したＥＶ製品の生体内分布の評価を、以下のように行う。

【0197】

生成物のＥＶを親油性蛍光マーカー（ヨウ化ＤｉＲ［ヨウ化１，１－ジオクタデシル－３，３，３－テトラメチルインドトリカルボシアニン］）で染色し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の生成物の生体内分布を評価する。

【0198】

合計４０匹の野生型Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの仔ラットのうち、２０匹を正常濃度酸素環境（ｎｏｒｍｏｘｉａ）に曝露させ、残りの２０匹は上述のように高濃度酸素環境（ｈｙｐｅｒｏｘｉａ）に曝露させる。生後７日目に２０匹の仔ラット（高濃度酸素環境１０匹、正常濃度酸素環境１０匹）に、１×１０^９粒子のＥＶ製品をＩＴ投与し、これは１×１０^１１／ｋｇＢＷに相当する。２０匹の対照仔ラット（高濃度酸素環境１０匹、正常濃度酸素環境１０匹）にＰＢＳ対照を注入する。ＩＴ注入は、肺の損傷部位にＥＶ製品を直接局所投与するために選択され、この方法を臨床に応用することを最終的な目標とする。

【0199】

蛍光分析により全身の分布を評価し、これにより、注入後異なる時点（３時間および２４時間）での１０匹の仔ラットの各群の個々の臓器における色素濃度を評価する。

【0200】

このアッセイの結果、正常濃度酸素環境条件に曝露させた仔ラットでは、注射後３時間で、ＥＶ製品が様々な臓器に均一に分布し、鼠径リンパ節に大きなシグナルがみられることが判明した。正常濃度酸素環境条件では注射後２４時間に、リンパ節（鼠径部および腋窩部）にシグナルをみとめることができる。これらの仔ラットでは、標識されたＥＶ製品が肺から速やかに排出され、全身に分布する。特にリンパ節（鼠径部および腋窩部）にシグナルが集中し、２４時間後はこの位置でしか観察されない。

【0201】

高濃度酸素環境に曝露させた仔ラットでは、注射後３時間で肺のシグナルが完全に消失し、他の臓器のシグナルもほとんど消失した。ほとんどすべてのシグナルが腋窩リンパ節および鼠径リンパ節にみられる。このことは、高濃度酸素環境条件では、投与部位からのＥＶ製品の取り込みが速いことを示していると考えられる。高濃度酸素環境処置を行った仔ラットでは、注射後２４時間で、シグナルのほとんどが腋窩リンパ節にみられる（鼠径リンパ節にはシグナルがみられない）。

【0202】

リンパ節は、これまでＥＶの生体内分布研究において標的組織として評価されたことがないため、これらの結果は新規のものであることを述べておく。これらの結果は、リンパ節がＥＶ製品が主として蓄積する部位であり、ＥＶ製品の投与に対する免疫学的反応を引き起こす基本的なエフェクター部位であることを明確に示している。

【0203】

実施例１２：ＢＰＤのｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いたＥＶの活性
本実験は、ＢＰＤのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、実施例１に従って製造したＥＶの活性を示すものである。Porzionato et al. 2018の記述に従ったモデルを採用する。

【0204】

簡潔に記載すると、倫理委員会の承認を受けて、３０匹の野生型Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを研究に使用する。高濃度酸素環境への曝露の方法は、様々な研究チームによって確立され、複数の文献に発表されている（Grisafi et al., 2012, 2013; Marconi et al., 2014; Porzionato et al., 2012 2018）。チャンバー内で酸素を連続的にモニターしながら飼育した仔ラットに実験を行う。実験動物を６０％の酸素に２週間曝露させ、本発明のＥＶ製品を気管内投与により処置する。対照動物は６０％酸素に２週間曝露させ、生理食塩水（プラセボ）を気管内投与することで処置する。正常濃度酸素環境の対照動物は、２１％の酸素に２週間曝露させ、本発明のＥＶ製品または生理食塩水を気管内投与する。ＥＶを生後３日目、７日目、１０日目に注入する。

【0205】

ＥＶ製品の単回または複数回のＩＴ注入の有効性を試験する。本製品の投与量は、６．４×１０^９粒子／投与であり、３つの異なる時点で３．１９×１０^１１～５．７１×１０^１１粒子／ｋｇ体重の範囲に相当する。

【0206】

その後、Porzionato et al., 2018に記載されたプロトコールに従って動物の肺を固定し、Ｓｃｈｅｒｌｅの方法（Scherle, 1970）に従って肺の体積を測定する。肺のスライスを用いて、組織学的および免疫組織学的解析を行う。組織収縮係数は、Porzionato et al., 2018に記載されたプロトコールに沿って推定する。立体分析は、Porzionato et al., 2018に記載のように行い、以下のいくつかのパラメータを定量化する。ｉ）肺胞空間および肺胞隔膜の体積分率、ii）肺胞空間および肺胞隔膜の総体積、iii）空間の表面積密度、iv）肺胞空間の総表面、ｖ）全肺体積、vi）肺胞数および平均肺胞容積、ならびに他のパラメータ。

【0207】

特に、ＥＶ製品のＩＴ投与の有効性を、形態学的測定、サイトフロリメトリおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価し、治療後の高濃度酸素環境誘発肺障害の回復および炎症反応を確立する。形態学的解析では、肺体積の推定、組織学的評価、免疫組織化学的解析、筋線維芽細胞の免疫蛍光分析、II型肺胞上皮細胞の免疫蛍光分析、免疫蛍光法で染色したサンプルの定量化、アルシアンブルー染色および定量化、タンパク質カルボニル化アッセイ、肺胞形成の立体評価、動脈筋層の形態学的測定、微小血管密度、およびマクロファージ集団の形態学的測定などを行った。

【0208】

すべての病理組織学的および形態学的評価は、実験群に対して盲検的に行う。生後３日目、７日目、１０日の時点で、すべての動物に対し、それぞれ対照（ビヒクルのみ）またはＥＶ製品溶液を３回ＩＴ注入することを含む治療サイクルを完了させる。

【0209】

出生後に高濃度酸素環境に曝露させると、肺胞が破壊され、その結果、列挙したすべての組織形態学的パラメータが悪化する。これらのパラメータのうち、高濃度酸素環境暴露群では肺胞表面の減少が統計的に有意にみとめられた。また、隔壁の厚みも有意に増加しており、これは炎症過程に起因する可能性がある（表１）。

【0210】

【表1】

【0211】

多重比較（ボンフェローニ検定）により、肺胞表面については、高濃度酸素環境暴露群は、正常濃度酸素環境暴露群および高濃度酸素環境暴露＋ＥＶ製品処置群の両方に対し統計的な差があり、ＥＶ製品が治療効果を示すことが示された。隔壁の厚さについては、高濃度酸素環境暴露群と高濃度酸素環境暴露＋ＥＶ製品処置群とに統計的な差はない。

【0212】

II型肺上皮細胞（ＡＴＩＩ）の特異的マーカーである肺サーファクタント関連タンパク質Ｃ（ＳＦＴＰＣ）陽性細胞を免疫蛍光法で定量化したところ、低酸素誘導障害後にＡＴＩＩが著しく減少することが示された。ＥＶ製品を投与すると、肺組織中のＳＦＰＴＣの量が増加する。グリコサミノグリカン生成のマーカーであるアルシアンブルー染色でも同様の結果が得られる。さらに、高濃度酸素環境暴露処置とそれに伴う炎症過程とによって生じる活性酸素種（ＲＯＳ）によって引き起こされるタンパク質の酸化損傷の確立されたマーカーであるタンパク質カルボニル化に対するＥＶ製品の効果を試験する。その結果、高濃度酸素環境条件で増加した損傷がＥＶ製品の投与により回復した。ＥＶ製品処置群では死亡率の増加はみとめられず、気管内投与の安全性が確認された。

【0213】

これらの結果は、確立された新生児ラットモデルにおいて、気管支肺異形成の治療におけるＥＶ製品の使用の有効性を示すものである。予備的データから、ＥＶ製品が肺実質を酸化ストレスから保護し、ＢＰＤの発症に重要な因子であるＡＴ２細胞によるサーファクタントの生成を増加させることが示唆される。

【0214】

実施例１３：クローン病のｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いたＥＶの活性の評価
本実験は、クローン病のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、実施例１に従って製造したＥＶの活性を示すものである。簡潔に記載すると、８週齢の雌Ｂ５７ＢＬ／６Ｊマウスで実験を行う。飲料水に３％のドデシル硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加し、５日間にわたって自由摂取で投与することで大腸炎を誘発させた。これは確立され、広く用いられている動物モデルであり、ＰｕｂＭｅｄで何百回も引用されている（総括論文については、Kawada et al., 2007を参照）。すべての動物を、適切な倫理規範に従って扱う。動物を以下の３つの実験群に分ける。
－第１群（ｎ＝４、正常対照）：ＰＢＳ（ビヒクルのみ）、０．２ｍＬを１～５日目に毎日腹腔内（ｉｐ）投与。
－第２群（ｎ＝５、大腸炎誘発）：飲料水に３％のＤＳＳを添加する以外は第１群と同様に行う。
－第３群（ｎ＝４、大腸炎誘発およびＥＶによる治療）：０．２ｍＬのＰＢＳに懸濁させたＭＳＣ－ＥＶをＩＰ経路で添加する以外は第２群と同様に行う。

【0215】

６日目にＣＯ_２を用いて動物を犠牲にする。大腸を摘出し、組織の一部をホルマリンで固定して組織学的解析を行い、他の部分は直ちに液体窒素で凍結して、－８０℃で保存してＲＮＡの抽出を行う。

【0216】

ＥＶの用量および投与経路
ＥＶを前述の手順で単離し、投与する。
投与経路：ＥＶを０．２ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、０日目から５日目まで毎日腹腔内投与。

【0217】

－腸管損傷の評価
動物の体重
疾患活動性指標（糞便評価；Tanaka F, 2008参照）
－催炎性（Flogosis）の病理組織学的徴候
－大腸組織抽出物中の炎症メディエータ発現の滴定。ＲＴ－ＰＣＲによるＴＮＦａｌｆａ、ＩＬ６、ＩＬ－１β、およびＣｏ×２の解析。

【0218】

結果の統計解析
データは平均値±ＳＤで示す。群間差をｔ検定で解析し、ｐ＜０．０５を有意とする。

【0219】

結果
結論として、ＥＶは実験的大腸炎の炎症反応を低減し、疾患活動性指数を低下させ全身状態を改善させるために適していることが結果より示される。ＥＶは腸管炎症性疾患動物モデルにおいて、臨床像および催炎性（flogistic）反応を改善する。

【0220】

実施例１４：ヒトでのＢＰＤの治療に使用するためのＥＶ製品の投与および安全性および有効性の評価のためのプロトコール
ＢＰＤの治療に使用するための実施例１に記載の方法により得られたＥＶ製品の安全性および有効性を、ヒトの臨床試験で調べる。簡潔に記載すると、妊娠期間２３～２８週、かつ出生体重１５００ｇ以下のＢＰＤリスクの高い早産児であって、気管内挿管され、吸入酸素分率（ＦｉＯ_２）２５％超の人工呼吸器下にある新生児を対象として試験を行う。ＥＶ製品を気管内投与する。気管内チューブによる侵襲的換気下にある早産児のみが試験の参加対象となるため、ＥＶ製品または生理食塩水対照液の気管内（ＩＴ）適用がさらなるリスクを引き起こすことはない。

【0221】

この試験は以下の２相に分けられる。
第Ｉ相ＥＶ製品の安全性および忍容性
第Ｉ相では、１８人の被験者を３人ずつの６つのコホートに分け、各コホートに３とおりの投与量（低用量（ＬＤ）：１×１０^１０ＥＶ／ｋｇ体重（ＢＷ）、中用量（ＭＤ）：３×１０^１０ＥＶ／ｋｇＢＷ、または高用量（ＨＤ）：９×１０^１０ＥＶ／ｋｇＢＷ）のいずれか、および２とおりのレジメン（１回または３回のＩＴ投与、複数回投与の場合は間隔は２４時間）のうちのいずれかでＥＶ製品を投与する。

【0222】

主な目的は、３の異なる投与レベルのＥＶ製品を単回または複数回ＩＴ投与した場合の用量制限毒性（ＤＬＴ）または最大耐容量（ＭＴＤ）を同定することにある。

【0223】

この相では、以下のいくつかの側面を評価する。
－月経後齢３６週（ＰＭＡ）または退院時にＥＶ製品をＩＴ投与（投与量を変えて単回投与または複数回投与）した場合の急性毒性および短期毒性。
－ＥＶ製品投与後６時間および２４時間以内のＤＬＴ。
－ＰＭＡ３６または退院までの異なる時点で報告されたＡＥ（有害事象）およびＳＡＥ（重篤な有害事象）（死亡症例を含む）（関連ありおよび関連なし）。
－退院までの複数の時点における、臨床検査および血液検査（肝および腎機能検査、造血指標、血圧、体温など）、肺の超音波検査、ならびに心エコー検査によるＥＶ製品の中期的毒性の評価。
－生後２８日に酸素吸入および人工呼吸を行った被験者の人数（Jobe AH et al., 2001によるＢＰＤの定義）。
－修正ＮＩＣＨＤ重症度分類（グレードＩ～IIIA）症例定義（Higgins RD et al., 2018に準拠）によるＰＭＡ３６週にＥＶ製品を投与した後のＢＰＤの発生率および重症度。これを過去の同様の症例と比較。
－試験終了時（ＥＯＳ）のＥＶ製品投与後の総合的な健康状態（１歳調整年齢）。
－ＰＭＡ３６週およびＥＯＳ（１歳調整年齢）での死亡率。

【0224】

第IIa相。ＢＰＤ治療におけるＥＶ製品の有効性
第IIa相では、７０人の被験者を３５人ずつの２群に分ける。一方の群には、第Ｉ相の結果に基づいて選択する用量レベルおよびレジメンでＥＶ製品による治療を行い、他の群には生理食塩水を対照溶液として投与する（プラセボ群）。

【0225】

主な目的は、無作為化二重盲検プラセボ対照試験において、ＢＰＤの治療におけるＥＶ製品の有効性を評価することにある。

【0226】

この相では、以下のいくつかの側面を評価する。
－プラセボ群（生理食塩水）と比較した、ＰＭＡ３６週時点におけるＢＰＤの発症件数および重症度に対するＥＶ製品の有効性の結果。ＢＰＤの状態および重症度を、修正ＮＩＣＨＤ重症度分類（グレードＩ～IIIA）の定義に従って評価する。
－両群について、生後２８日後に酸素が必要な被験者および人工呼吸器の補助を受けた被験者の人数。
－ＥＯＳ（１歳調整後）におけるＥＶ製品投与後およびプラセボ群の総合的な健康状態。
－両群について、ＰＭＡ３６週およびＥＯＳ（１年調整後年齢）での死亡率。
－両群について、ＰＭＡ３６週または退院までの異なる時点で報告されたＡＥおよびＳＡＥ（関連ありおよび関連なし）。
－両群について、ＥＯＳまでの受動的サーベイランスで報告されたＳＡＥ（関連ありおよび関連なし）。
－両群について、ＰＭＡ３６週または退院までのＭＶ／呼吸器補助の期間、ＲＯＰ、ＮＥＣ、ＩＶＨ、敗血症の評価。
－被験児を挿管するまでの数回の時点における気管内吸引液中の免疫マーカー（ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦａ、ＴＧＦｂ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ｒａ）の検査。
－両群について、１歳調整年齢またはＥＯＳの乳児の神経発達状態の評価。

【0227】

本発明は、実施例に記載、および／または図に図示した実施形態に限定されない。むしろ、本発明に係る方法は、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの異なる方法で実施することができる。

【符号の説明】

【0228】

１ 細胞培養培地容器
２ 撹拌式バイオリアクター
３ 細胞上清容器
４ 冷蔵庫
５ａ，５ｂ，５ｃ 蠕動ポンプ
６ 第１のフィルタユニット
７ 第２のフィルタユニット
８ ＴＦＦカセット
９ 最終産物

【図1】

【手続補正書】

【提出日】2022-05-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）の組成物を製造するプロセスであって、
－ヒトアルブミンおよびヒトトランスフェリンを含む無血清ゼノフリー培地でＭＳＣを培養および増殖させることと、
－ＥＶを含有する細胞上清を採取することと、
－前記細胞上清を濾過してＥＶを得ることと、
－前記ＥＶを濃縮することと、を含み、前記培地中の前記ヒトアルブミン濃度が１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである、プロセス。

【請求項2】

前記ヒトアルブミンおよびヒトトランスフェリンが、ヒト血漿から精製されたものであるか、または組換えアルブミンおよび組換えトランスフェリンである、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記培地中のヒトトランスフェリン濃度が５５ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌである、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記細胞上清の濾過が、少なくとも２段階の濾過過程である、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

２段階の濾過過程における前記濾過が、メッシュサイズが１～５μｍである第１のフィルタを通して行われ、その後、メッシュサイズが１μｍ未満である第２のフィルタを通して行われる、請求項４に記載のプロセス。

【請求項6】

前記濃縮工程が接線流濾過工程であり、これにより前記濾過過程の濾液を濃縮する、請求項４または５に記載のプロセス。

【請求項7】

前記ＭＳＣを培養する１８～２４時間の時間範囲で、細胞培地１ｍＬ当たり少なくとも０．２５×１０^９個の粒子が産生され、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンである前記粒子の少なくとも９０％がＥＶである、請求項６に記載のプロセス。

【請求項8】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）を含有する組成物であって、前記ＥＶのサイズが１μｍ未満であり、前記組成物のヒトアルブミン濃度が１０～３０ｇ／Ｌであり、前記組成物に存在する前記ヒトアルブミンの少なくとも９０％が前記ＥＶと会合している、組成物。

【請求項9】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンを好ましくは６０ｍｇ／Ｌ～６００ｍｇ／Ｌの濃度で含有する、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンおよびヒトアルブミンを、アルブミン１ｇにつきトランスフェリン２～６０ｍｇの割合で含む、請求項８または９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＥＶのサイズが５０～３００ｎｍである、請求項８～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物がさらに製剤化および／または処理される、請求項８～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

治療的または予防的な使用のための、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

肺疾患の予防または治療に使用するための、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

前記肺疾患が、炎症性肺疾患、肺血管疾患、または急性肺損傷である、請求項１４に記載の使用のための組成物。

【請求項16】

前記炎症性肺疾患が、肺高血圧症、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギー、肺炎、または特発性肺線維症である、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

前記急性肺損傷が、敗血症と関連するか、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

前記炎症性肺疾患が、ウイルス感染、好ましくはインフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連する、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

ＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用するための、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９誘発肺炎または急性肺炎の治療に使用するための、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

クローン病などの炎症性腸疾患の予防または治療に使用するための、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

治療有効量の前記組成物が患者に投与され、前記患者は成人、乳児または新生児であってよい、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項22】

前記組成物が、前記患者または各投与について１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの用量で投与される、請求項２１に記載の使用のための組成物。

【手続補正書】

【提出日】2023-03-07

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）の組成物を製造するプロセスであって、
－精製されたヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンを含む無血清ゼノフリー培地でＭＳＣを培養および増殖させることと、
－ＥＶを含有する細胞上清を採取することと、
－前記細胞上清を濾過してＥＶを得ることと、
－前記ＥＶを濃縮することと、を含む、プロセス。

【請求項2】

前記アルブミンおよびトランスフェリンが、ヒト血漿から精製されたものであるか、または組換えアルブミンおよび組換えトランスフェリンである、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記培地中のアルブミン濃度が１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌである、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記培地中のトランスフェリン濃度が５５ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５５ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌである、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

前記細胞上清の濾過が、少なくとも２段階の濾過過程である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項6】

２段階の濾過過程における前記濾過が、メッシュサイズが１～５μｍである第１のフィルタを通して行われ、その後、メッシュサイズが１μｍ未満である第２のフィルタを通して行われる、請求項５に記載のプロセス。

【請求項7】

前記濃縮工程が接線流濾過工程であり、これにより前記濾過過程の濾液を濃縮する、請求項５または６に記載のプロセス。

【請求項8】

前記ＭＳＣを培養する１８～２４時間の時間範囲で、細胞培地１ｍＬ当たり少なくとも０．２５×１０^９個の粒子が産生され、粒子サイズが０．０５～０．２２ミクロンである前記粒子の少なくとも９０％がＥＶである、請求項７に記載のプロセス。

【請求項9】

間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）を含有する組成物であって、前記ＥＶのサイズが１μｍ未満であり、前記組成物のヒトアルブミン濃度が１０～３０ｇ／Ｌであり、前記組成物に存在する前記アルブミンの少なくとも９０％が前記ＥＶと会合している、組成物。

【請求項10】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンを好ましくは６０ｍｇ／Ｌ～６００ｍｇ／Ｌの濃度で含有する、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記組成物が、ヒトトランスフェリンおよびヒトアルブミンを、アルブミン１ｇにつきトランスフェリン２～６０ｍｇの割合で含む、請求項９または１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＥＶのサイズが５０～３００ｎｍである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物がさらに製剤化および／または処理される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

治療的または予防的な使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

肺疾患の予防または治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記肺疾患が、炎症性肺疾患、肺血管疾患、または急性肺損傷である、請求項１５に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

前記炎症性肺疾患が、肺高血圧症、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギー、肺炎、または特発性肺線維症である、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

前記急性肺損傷が、敗血症と関連するか、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

前記炎症性肺疾患が、ウイルス感染、好ましくはインフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連する、請求項１６に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

ＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用するための、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９誘発肺炎または急性肺炎の治療に使用するための、請求項１３～１９に記載の使用のための組成物。

【請求項21】

クローン病などの炎症性腸疾患の予防または治療に使用するための、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記治療有効量の前記組成物が患者に投与され、前記患者は成人、乳児または新生児であってよい、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項23】

前記組成物が、前記患者または各投与について１０^９ＥＶ／ｋｇ～１０^１２ＥＶ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【国際調査報告】