特表 2023-537215 無細胞核酸についてのヌクレアーゼに関連する末端シグネチャ分析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-31

(54)【発明の名称】無細胞核酸についてのヌクレアーゼに関連する末端シグネチャ分析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6883 20180101AFI20230824BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230824BHJP

   C12Q 1/44 20060101ALI20230824BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20230824BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6883 Z

C12N15/09 Z

C12Q1/44

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023501816

(86)(22)【出願日】2021-07-13

(85)【翻訳文提出日】2023-01-31

(86)【国際出願番号】 CN2021105939

(87)【国際公開番号】W WO2022012504

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】63/051,268

(32)【優先日】2020-07-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＳＷＩＦＴ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】512037244

【氏名又は名称】ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン

(71)【出願人】

【識別番号】522380594

【氏名又は名称】グレイル，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ロー ユク－ミン デニス

(72)【発明者】

【氏名】チウ ロッサ ワイ クン

(72)【発明者】

【氏名】チャン クワン チョー

(72)【発明者】

【氏名】チアン ペイヨン

(72)【発明者】

【氏名】チャン ウィン イェン

(72)【発明者】

【氏名】ラム ワイ ケイ

(72)【発明者】

【氏名】ハン ダイアナ シアオ チョン

(72)【発明者】

【氏名】ポン ウェンレイ

(72)【発明者】

【氏名】ティン チェン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ34

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS28

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

無細胞ＤＮＡ末端シグネチャ／モチーフ及びＤＮＡ鎖間のオーバーハングのサイズに影響を与える組織におけるヌクレアーゼ発現を使用して、様々な実施形態が実施される。実施形態は、正常細胞と比較して異常細胞において異なって調節されるヌクレアーゼを同定することができる。実施形態は、ヌクレアーゼが、（ｉ）特定の配列末端シグネチャ、又は（ｉｉ）第１の鎖と第２の鎖との間に指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することができる。パラメータは、特定の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含むＤＮＡ分子の量及び／又は指定された長さのオーバーハングに正確に相関する測定された特性に基づいて、生物学的試料について決定することができる。このパラメータを使用して、組織タイプの特徴、臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度、又は生物学的試料中の組織タイプの異常レベルを決定することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の生物学的試料中の異常レベルを分類する方法であって、
第１のヌクレアーゼが、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、前記１つ以上の組織タイプの異常細胞において異なって調節されることを同定することと、
前記第１のヌクレアーゼが、他の配列末端シグネチャと比較して、第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
配列リードを取得するために、前記生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記配列リードが、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む、分析することと、
前記配列リードの第１のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第１のセットの各配列リードが、前記第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの第１の量を決定することと、
前記配列リードの前記第１の量を使用して第１のパラメータを決定することと、
前記第１のパラメータを使用して、前記生物学的試料中の前記１つ以上の組織タイプの前記異常レベルの分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記異常レベルの前記分類の前記決定が、前記第１のパラメータと参照値との間の比較に基づく、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第２のヌクレアーゼが、前記１つ以上の組織タイプの前記正常組織と比較して、前記１つ以上の組織タイプの前記異常細胞において異なって調節されることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記他の配列末端シグネチャと比較して、第２の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記配列リードの第２のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第２のセットの各配列リードが、前記第２の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第２のセットの第２の量を決定することと、
前記配列リードの前記第２の量を使用して第２のパラメータを決定することであって、前記生物学的試料中の前記１つ以上の組織タイプにおける前記異常レベルの前記分類が、更に前記第２のパラメータを使用して決定される、決定することと、を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上の組織タイプの前記正常組織と比較して、前記異常細胞において、前記第１のヌクレアーゼがアップレギュレートされ、前記第２のヌクレアーゼがダウンレギュレートされる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

第２のヌクレアーゼが、前記１つ以上の組織タイプの前記正常組織と比較して、前記１つ以上の組織タイプの前記異常細胞において異なって調節されることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記他の配列末端シグネチャと比較して、前記第２の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記配列リードの第２のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第２のセットの各配列リードが、前記第２の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第２のセットの第２の量を決定することであって、前記第２の量が、前記第１のパラメータを決定するために使用される、決定することと、を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

前記１つ以上の組織タイプの前記正常組織と比較して、前記異常細胞において、前記第１のヌクレアーゼがアップレギュレートされ、前記第２のヌクレアーゼがダウンレギュレートされる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記１つ以上の組織タイプが、胎児組織を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記対象が、妊婦であり、前記１つ以上の組織タイプが、母体血漿中に検出される胎盤組織を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記異常が、子癇前症、早産、胎児染色体異数性、又は胎児遺伝性障害を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

別の対象の生物学的試料を分析することであって、前記別の対象が、前記対象とは異なる生物である、分析することと、
前記別の対象の前記生物学的試料に基づいて、前記第１のヌクレアーゼが、前記第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記異常が、病理である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記病理が、がんであり、前記がんが、肝細胞がん、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、若しくは頭頸部扁平上皮がん、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記分類が、前記病理の複数のステージのうちの１つである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記病理が、自己免疫障害である、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記自己免疫障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

対象の生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度を推定する方法であって、
第１のヌクレアーゼが、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、標的組織タイプにおいて異なって調節されていることを同定することであって、前記臨床的に関連するＤＮＡ分子が、前記標的組織タイプに由来する、同定することと、
前記第１のヌクレアーゼが、他の配列末端シグネチャと比較して、第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
配列リードを取得するために、前記生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記生物学的試料が、前記複数の組織タイプ由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含み、前記配列リードが、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む、分析することと、
前記配列リードの第１のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第１のセットの各配列リードが、前記第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの第１の量を決定することと、
前記配列リードの前記第１の量を使用して第１のパラメータを決定することと、
前記第１のパラメータと、前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度が既知である１つ以上の較正試料から決定される１つ以上の較正値と、を使用して、前記生物学的試料中の前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の前記画分濃度を推定することと、を含む、方法。

【請求項17】

前記臨床的に関連するＤＮＡ分子が、胎児ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、又は移植された臓器のＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

標的組織タイプの特徴を決定する方法であって、
第１のヌクレアーゼが、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、前記標的組織タイプにおいて異なって調節されることを同定することと、
前記第１のヌクレアーゼが、他の配列末端シグネチャと比較して、第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
配列リードを取得するために、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記生物学的試料が、前記複数の組織タイプ由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含み、前記配列リードが、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む、分析することと、
前記配列リードの第１のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第１のセットの各配列リードが、前記第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの第１の量を決定することと、
前記配列リードの前記第１の量についての第１のパラメータを決定することと、
前記第１のパラメータと、前記特徴についての値が既知である１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値と、を使用して、前記標的組織タイプの前記特徴についての第１の値を推定することと、を含む、方法。

【請求項19】

第２のヌクレアーゼが、前記標的組織タイプで異なって調節されていることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記他の配列末端シグネチャと比較して、第２の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記配列リードの第２のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第２のセットの各配列リードが、前記第２の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第２のセットの第２の量を決定することと、
前記第２の量を使用して第２のパラメータを決定することであって、前記画分濃度又は前記標的組織タイプの前記特徴についての前記第１の値が、前記第２のパラメータを使用することによって推定される、決定することと、を更に含む、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記複数の組織タイプの正常組織と比較して、前記標的組織タイプにおいて、前記第１のヌクレアーゼがアップレギュレートされ、前記第２のヌクレアーゼがダウンレギュレートされる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記画分濃度又は前記標的組織タイプの特徴についての前記第１の値が、前記第２のパラメータを別の参照値と比較することによって推定される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

第２のヌクレアーゼが、前記複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、前記標的組織タイプにおいて異なって調節されることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記他の配列末端シグネチャと比較して、前記第２の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記配列リードの第２のセットを同定することであって、前記配列リードの前記第２のセットの各配列リードが、前記第２の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第２のセットの第２の量を決定することであって、前記第２の量が、前記第１のパラメータを決定するために使用される、決定することと、を更に含む、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項23】

少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、前記標的組織タイプにおいて、前記第１のヌクレアーゼがアップレギュレートされ、前記第２のヌクレアーゼがダウンレギュレートされる、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

別の対象の生物学的試料を分析することであって、前記別の対象が、前記対象とは異なる生物である、分析することと、
前記別の対象の前記生物学的試料に基づいて、前記第１のヌクレアーゼが、前記第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、を更に含む、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項25】

前記標的組織タイプが、肝臓又は造血細胞である、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項26】

前記標的組織タイプが、胎児組織である、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項27】

前記標的組織タイプが、がんを有する臓器である、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項28】

前記対象が、妊婦であり、前記標的組織タイプが、胎盤組織である、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項29】

前記標的組織タイプが、胎盤組織であり、前記胎盤組織の特徴が、妊娠中の対象の妊娠期間を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のパラメータ及び前記１つ以上の較正値を使用することが、前記第１のパラメータを前記１つ以上の較正値と比較することを含む、請求項１６又は１８に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のパラメータを前記１つ以上の較正値と比較することが、前記第１のパラメータを前記１つ以上の較正値を含む較正曲線と比較することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記第１のパラメータを前記較正曲線と比較することが、前記第１のパラメータを、前記較正曲線を表す較正関数に入力することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記第１のヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、アポトーシス増強ヌクレアーゼ（ＡＥＮ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）、デオキシリボヌクレアーゼ２（ＤＮＡＳＥ２）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、アプリン／アピリミジン末端デオキシリボヌクレアーゼ１（ＡＰＥＸ１）、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様１（ＤＮＡＳＥ１Ｌ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様２（ＤＮＡＳＥ１Ｌ２）、又はエキソ／エンドヌクレアーゼＧ（ＥＸＯＧ）を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のヌクレアーゼが、前記ＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＣＣＣＡ又はＣＧＴＡを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

第１のヌクレアーゼが、前記ＤＦＦＢであり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＡＡＡＡ又はＡＡＡＴを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記第１のヌクレアーゼが、前記ＤＮＡＳＥ１であり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＴＡＡＴを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記第２のヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、アポトーシス増強ヌクレアーゼ（ＡＥＮ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）、デオキシリボヌクレアーゼ２（ＤＮＡＳＥ２）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、アプリン／アピリミジン末端デオキシリボヌクレアーゼ１（ＡＰＥＸ１）、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様１（ＤＮＡＳＥ１Ｌ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様２（ＤＮＡＳＥ１Ｌ２）、又はエキソ／エンドヌクレアーゼＧ（ＥＸＯＧ）を含む、請求項３、４、５、６、１９、２０、２１、２２、又は２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、前記配列リードを取得するために、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の配列決定を行うことを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記第１のパラメータが、前記第１の量と前記配列リードの別の量との間の比である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

対象から取得した生物学的試料を分析する方法であって、
第１のヌクレアーゼが、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、前記１つ以上の組織タイプの異常細胞において異なって調節されることを同定することと、
前記第１のヌクレアーゼが、２つの対応するＤＮＡ鎖間に第１の指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記対象の前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに相関する前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の特性を測定することを含む、分析することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、不揃い指数値を決定することと、
前記不揃い指数値及び前記第１の指定された長さのオーバーハングに対応する参照値を使用して、前記生物学的試料中の前記１つ以上の組織タイプにおける異常レベルの分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項41】

第２のヌクレアーゼが、前記１つ以上の組織タイプの前記正常組織と比較して、前記１つ以上の組織タイプの前記異常細胞において異なって調節されることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記第１の鎖と前記第２の鎖との間に第２の指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することであって、前記異常レベルの前記分類が、更に前記第２の指定された長さのオーバーハングに対応する別の参照値を使用して決定される、決定することと、を更に含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記異常が、病理である、請求項４０又は４１に記載の方法。

【請求項43】

前記病理が、がんであり、前記がんが、肝細胞がん、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、頭頸部扁平上皮がん、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

対象から取得した生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分を決定する方法であって、
第１のヌクレアーゼが、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、標的組織タイプにおいて異なって調節されていることを同定することであって、前記臨床的に関連するＤＮＡ分子が、前記標的組織タイプに由来する、同定することと、
前記第１のヌクレアーゼが、２つの対応するＤＮＡ鎖間に第１の指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、
前記対象の前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記生物学的試料が、前記複数の組織タイプ由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含み、前記無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さと相関する前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の特性を測定することを含む、分析することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、不揃い指数値を決定することと、
前記不揃い指数値及び前記第１の指定された長さのオーバーハングに対応する参照値を使用して、前記生物学的試料中の前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の前記画分を決定することと、を含む、方法。

【請求項45】

前記参照値が、前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度が既知である１つ以上の較正試料から決定される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

第２のヌクレアーゼが、前記少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、前記標的組織タイプにおいて異なって調節されることを同定することと、
前記第２のヌクレアーゼが、前記第１の鎖と前記第２の鎖との間に第２の指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することであって、前記生物学的試料中の前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の前記画分が、前記不揃い指数値を前記第２の指定された長さのオーバーハングに対応する別の参照値と比較することに更に基づく、決定することと、を更に含む、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

前記臨床的に関連するＤＮＡ分子が、胎児ＤＮＡを含む、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

別の対象の生物学的試料を分析することであって、前記別の対象が、前記対象とは異なる生物である、分析することと、
前記別の対象の前記生物学的試料に基づいて、前記第１のヌクレアーゼが、前記第１の鎖と前記第２の鎖との間に前記第１の指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを決定することと、を更に含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、指定された範囲内のサイズを有する、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記指定された範囲が、１３０～１６０ｂｐである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が、第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子であり、
前記指定された範囲が、第１の指定された範囲であり、
前記方法が、
第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの各核酸分子の鎖の特性を測定することであって、前記第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子が、第２の指定された範囲のサイズを有する、測定することを更に含み、
前記不揃い指数値を決定することが、前記第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性と、前記第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性と、を使用して、比を計算することを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

機械学習モデルを使用して、前記不揃い指数値及び前記参照値を使用して、前記生物学的試料中の前記臨床的に関連するＤＮＡ分子の前記画分を決定することを行う、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記機械学習モデルが、線形回帰、ロジスティック回帰、深層再帰型ニューラルネットワーク、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、ｋ平均クラスタリング、ノイズを伴うアプリケーションの密度に基づく空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、又はサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記特性が、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々の前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態であり、前記不揃い指数値が、前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における前記複数の無細胞ＤＮＡ分子にわたるメチル化レベルを含む、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記第１のヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、アポトーシス増強ヌクレアーゼ（ＡＥＮ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）、デオキシリボヌクレアーゼ２（ＤＮＡＳＥ２）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、アプリン／アピリミジン末端デオキシリボヌクレアーゼ１（ＡＰＥＸ１）、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様１（ＤＮＡＳＥ１Ｌ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様２（ＤＮＡＳＥ１Ｌ２）、又はエキソ／エンドヌクレアーゼＧ（ＥＸＯＧ）を含む、請求項４０～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記第２のヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、アポトーシス増強ヌクレアーゼ（ＡＥＮ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）、デオキシリボヌクレアーゼ２（ＤＮＡＳＥ２）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、アプリン／アピリミジン末端デオキシリボヌクレアーゼ１（ＡＰＥＸ１）、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様１（ＤＮＡＳＥ１Ｌ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様２（ＤＮＡＳＥ１Ｌ２）、又はエキソ／エンドヌクレアーゼＧ（ＥＸＯＧ）を含む、請求項４１又は４６に記載の方法。

【請求項57】

前記不揃い指数値及び前記参照値を使用することが、前記不揃い指数値を前記参照値と比較することを含む、請求項４０～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値を、１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正データ点を含む較正曲線と比較することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記不揃い指数値を前記較正曲線と比較することが、前記不揃い指数値を、前記較正曲線を表す較正関数に入力することを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

対象から取得した生物学的試料を分析する方法であって、前記方法が、
前記生物学的試料を取得することであって、前記生物学的試料が、無細胞ＤＮＡ分子を含み、前記無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出している、取得することと、
前記第１の鎖と前記第２の鎖との間に指定された長さのオーバーハングを有する無細胞ＤＮＡ分子について前記生物学的試料を濃縮することと、
配列リードを取得するために、前記生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記配列リードが、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む、分析することと、
前記配列リードの第１のセットを同定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの第１のサブセットを同定することであって、前記第１のサブセットの各配列リードが、第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む、同定することと、
前記配列リードの前記第１のサブセットの第１の量を決定することと、
前記配列リードの前記第１の量を使用して第１のパラメータを決定することと、
前記第１のパラメータを使用して前記生物学的試料の特徴を決定することと、を含む、方法。

【請求項61】

前記生物学的試料の前記特徴が、前記生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記生物学的試料の前記特徴が、前記生物学的試料における異常レベルである、請求項６０に記載の方法。

【請求項63】

前記第１の配列末端シグネチャが、ヌクレアーゼの切断優先度に対応し、前記ヌクレアーゼが、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較してある組織タイプにおいて異なって調節され、前記生物学的試料の前記特徴を決定することが、前記組織タイプの特徴を決定することを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項64】

前記組織タイプが、肝臓又は造血細胞である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記組織タイプが、腫瘍である、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記組織タイプが、がんを有する臓器である、請求項６３に記載の方法。

【請求項67】

前記対象が、妊婦であり、前記組織タイプが、胎盤組織である、請求項６３に記載の方法。

【請求項68】

前記胎盤組織の特徴が、妊娠中の対象の妊娠期間を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記生物学的試料の前記特徴が、臓器のサイズ又は栄養状態である、請求項６０に記載の方法。

【請求項70】

前記第１の配列末端シグネチャが、ヌクレアーゼの切断優先度に対応する、請求項６０～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記生物学的試料の前記特徴を決定することが、前記第１のパラメータを参照値と比較することを更に含む、請求項６０～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記ヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、アポトーシス増強ヌクレアーゼ（ＡＥＮ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）、デオキシリボヌクレアーゼ２（ＤＮＡＳＥ２）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、アプリン／アピリミジン末端デオキシリボヌクレアーゼ１（ＡＰＥＸ１）、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様１（ＤＮＡＳＥ１Ｌ１）、デオキシリボヌクレアーゼ１様２（ＤＮＡＳＥ１Ｌ２）、又はエキソ／エンドヌクレアーゼＧ（ＥＸＯＧ）を含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記ヌクレアーゼが、前記ＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＣＣＣＡ又はＣＧＴＡを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ヌクレアーゼが、前記ＤＦＦＢであり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＡＡＡＡ又はＡＡＡＴを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項７２に記載の方法。

【請求項75】

前記ヌクレアーゼが、前記ＤＮＡＳＥ１であり、
前記第１の配列末端シグネチャが、ＴＡＡＴを含むヌクレオチド末端配列に対応する、請求項７２に記載の方法。

【請求項76】

前記配列リードの前記第１のセットを同定することが、前記配列リードの第１のセットを取得するために前記無細胞ＤＮＡ分子を配列決定することを含む、請求項６０～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記第１のパラメータが、前記第１の量及び配列リードの別の量を使用して決定される、請求項６０～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記生物学的試料を濃縮することが、ハイブリダイゼーションに基づく標的化捕捉、ライゲーションに基づく増幅、又はライゲーションに基づく捕捉を使用することを含む、請求項６０～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

生物学的試料が得られる対象における病理のレベルを決定するために前記生物学的試料を分析する方法であって、
配列リードを取得するために、前記生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記配列リードが、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子、前記対象及びウイルス由来の前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む、分析することと、
参照ゲノムにアラインする前記配列リードの第１のセットを決定することであって、前記参照ゲノムが、前記ウイルスに対応する、決定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ以上の末端配列の各々についての配列モチーフを決定することと、
前記配列リードの前記第１のセットの前記１つ以上の末端配列に対応する１つ以上の配列モチーフのセットの相対頻度を決定することであって、配列モチーフの相対頻度が、前記配列モチーフに対応する末端配列を有する前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の割合を含む、決定することと、
前記１つ以上の配列モチーフのセットの前記相対頻度の集計値を決定することと、
前記集計値を使用して、前記対象の病理レベルの分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項80】

前記病理が、がんである、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記がんが、肝細胞がん、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、頭頸部扁平上皮がん、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記分類が、がんの複数のステージを含むがんの複数のレベルから決定される、請求項７９に記載の方法。

【請求項83】

前記病理が、自己免疫障害である、請求項７９に記載の方法。

【請求項84】

前記自己免疫障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記病理のレベルが、前記病理に関連する臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度に対応する、請求項７９に記載の方法。

【請求項86】

前記１つ以上の配列モチーフのセットの配列モチーフが、単一ヌクレオチド、２ヌクレオチド配列、３ヌクレオチド配列、４ヌクレオチド配列、５ヌクレオチド配列、６ヌクレオチド配列、又は７ヌクレオチド配列に対応する、請求項７９～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記集約値が、（ｉ）エントロピー値、（ｉｉ）相対頻度の合計、及び（ｉｉｉ）前記１つ以上の配列モチーフのセットについてのカウントのベクトルに対応する多次元データ点からなる群から選択される値である、請求項７９～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記病理レベルの前記分類を決定することが、前記集計値を参照値と比較することを含む、請求項７９～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

対象から取得した生物学的試料を分析する方法であって、前記方法が、
前記対象及びウイルス由来の無細胞ＤＮＡ分子を含む前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖及び第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
参照ゲノムにアラインする前記生物学的試料の無細胞ＤＮＡ分子の第１のセットを同定することであって、前記参照ゲノムが、前記ウイルスに対応する、同定することと、
無細胞ＤＮＡ分子の前記第１のセットの各々について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに比例する前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の特性を測定することと、を含む、分析することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、不揃い指数値を決定することと、
前記不揃い指数値及び参照値を使用することによって前記対象の病態のレベルを決定することと、を含む、方法。

【請求項90】

前記対象の前記病態のレベルを決定することが、前記不揃い指数値を前記参照値と比較することを更に含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値を、１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正データ点を含む較正曲線と比較することを含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記不揃い指数値を前記較正曲線と比較することが、前記不揃い指数値を、前記較正曲線を表す較正関数に入力することを含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記病態が、疾患又は障害を含む、請求項８９～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記病態が、がん又は自己免疫疾患である、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記第１の鎖が、５’末端を含む、請求項８９～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

核酸分子のサイズを測定することを更に含み、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が、指定された範囲内のサイズを有する、請求項８９～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記指定された範囲が、１４０～１６０ｂｐである、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が、第１の複数の核酸分子であり、
前記指定された範囲が、第１の指定された範囲であり、
前記方法が、
第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の鎖の特性を測定することであって、前記第２の複数の核酸分子が、第２の指定された範囲を有するサイズを有する、測定することを更に含み、
前記不揃い指数値を決定することが、前記第１の複数の核酸分子の前記測定された特性と、前記第２の複数の核酸分子の前記測定された特性と、を使用して、比を計算することを含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項99】

前記特性が、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々の前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分における１つ以上の部位におけるメチル化状態であり、前記不揃い指数値が、前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における前記複数の無細胞ＤＮＡ分子にわたるメチル化レベルを含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項100】

より高いメチル化レベルが、前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖のより長い長さと相関している、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

リードを生成するために、核酸分子を分析することと、
前記リードを参照ゲノムにアラインメントすることと、を更に含み、
ここで、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が、転写開始部位に対してある特定の距離範囲内のリードを有する、請求項８９に記載の方法。

【請求項102】

前記測定された特性が、長さである、請求項８９に記載の方法。

【請求項103】

前記参照値が、前記病態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項８９に記載の方法。

【請求項104】

前記参照値が、前記病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項８９に記載の方法。

【請求項105】

機械学習モデルが、前記不揃い指数値及び前記参照値を使用して、前記対象の前記病態の前記レベルの決定を行うために使用される、請求項８９に記載の方法。

【請求項106】

前記ウイルスが、発がん性ウイルスである、請求項７９又は８９に記載の方法。

【請求項107】

無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法であって、
前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに相関する前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖の特性を測定することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、不揃い指数値を決定することと、を含む、分析することと、
前記不揃い指数値及び参照値を使用して、前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項108】

前記生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされる、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの前記分類を決定することが、前記不揃い指数値を前記参照値と比較することを更に含む、請求項１０７又は１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値と異なるかどうかを決定することを含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値よりも小さいかどうかを決定することを含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項112】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値よりも大きいかどうかを決定することを含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項113】

前記参照値が、前記遺伝性障害を有さない１つ以上の参照試料から決定される、請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記参照値が、前記遺伝性障害を有する１つ以上の参照試料から決定される、請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法であって、
前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記対象の第１の生物学的試料中の第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに相関する前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖の特性を測定することであって、前記第１の生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さにわたってインキュベートされる、測定することと、
前記対象の第２の生物学的試料中の第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに相関する前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖の特性を測定することであって、前記第２の生物学的試料が、前記抗凝固剤で処理され、前記第１の時間の長さよりも長い第２の時間の長さにわたってインキュベートされる、測定することと、を含む、分析することと、
前記第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、第１の不揃い指数値を決定することと、
前記第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、第２の不揃い指数値を決定することと、
前記第１の不揃い指数値及び前記第２の不揃い指数値を使用して、前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項116】

前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの前記分類を決定することが、前記第１の不揃い指数値と前記第２の不揃い指数値とを比較することを更に含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記第１の不揃い指数値を前記第２の不揃い指数値と比較することが、前記第１の不揃い指数値が少なくとも閾値量だけ前記第２の不揃い指数値と異なるかどうかを決定することを含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記分類が、前記第１の不揃い指数値が前記第２の不揃い指数値の閾値内にある場合、前記遺伝性障害が存在するというものである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項119】

前記分類が、前記第２の不揃い指数値が少なくとも閾値だけ前記第１の不揃い指数値よりも小さい場合、前記遺伝性障害が存在するというものである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項120】

前記第１の時間の長さが、ゼロである、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記抗凝固剤が、ヘパリンである、請求項１１５～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記抗凝固剤が、ＥＤＴＡである、請求項１１５～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記遺伝子が、ＤＮＡＳＥ１である、請求項１０７～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記遺伝子が、ＤＦＦＢである、請求項１０７～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記遺伝子が、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３である、請求項１０７～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記ヌクレアーゼが、細胞内ＤＮＡを切断する、請求項１０７～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記遺伝性障害が、前記遺伝子の欠失を含む、請求項１０７～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記遺伝性障害の前記分類に基づいて前記対象を治療することを更に含む、請求項１０７～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用してヌクレアーゼの活性を監視するための方法であって、
前記生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々が、第１の鎖と第２の鎖とで部分的又は完全な二本鎖を形成し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖が、前記第２の鎖に突出し、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、
前記第２の鎖に突出した前記第１の鎖の長さに相関する前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖の特性を測定することを含む、分析することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記測定された特性を使用して、不揃い指数値を決定することであって、前記不揃い指数値が、鎖が前記複数の無細胞ＤＮＡ分子において別の鎖に突出していることの集合的な尺度を提供する、決定することと、
前記不揃い指数値及び参照値を使用して、前記ヌクレアーゼの活性の第１の分類を決定することと、を含む、方法。

【請求項130】

前記第１の分類が、数値による分類値であり、前記方法が、
前記数値による分類値をカットオフと比較して、前記ヌクレアーゼに関連する遺伝子が前記対象において遺伝性障害を示すかどうかの第２の分類を決定することを更に含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされる、請求項１２９又は１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記参照値が、前記ヌクレアーゼの前記活性の特定の分類を有する較正試料から決定される、請求項１２９～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記特定の分類が、正常、増加、又は減少である、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記ヌクレアーゼの前記活性の前記第１の分類を決定することが、前記不揃い指数値を前記参照値と比較することを含む、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値と異なるかどうかを決定することを含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値よりも小さいかどうかを決定することを含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項137】

前記不揃い指数値を前記参照値と比較することが、前記不揃い指数値が、少なくとも閾値量だけ前記参照値よりも大きいかどうかを決定することを含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項138】

前記ヌクレアーゼが、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、又はＤＮＡＳＥ１である、請求項１２９～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記生物学的試料を取得する前に、前記対象が、前記ヌクレアーゼによる治療を提供されている、請求項１２９～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記不揃い指数値と前記参照値との比較に基づいて、前記ヌクレアーゼによる前記治療の有効性の第２の分類を決定すること、を更に含む、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記参照値が、前記ヌクレアーゼの前記活性について既知の又は測定された分類を有する１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項１２９～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記１つ以上の参照試料についての前記ヌクレアーゼの前記活性を測定することと、
前記１つ以上の参照試料における前記不揃い指数値を測定することと、を更に含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記１つ以上の参照試料が、複数の参照試料であり、前記方法が、
前記複数の参照試料について前記測定された活性及び測定された不揃い指数値に対応する較正データ点を近似する較正関数を決定することを更に含む、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである、請求項１２９～１４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項145】

前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項１２９～１４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

コンピュータ製品であって、複数の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含み、実行されると、コンピュータシステムを制御して、請求項１～１４５のいずれか一項に記載の方法を実施する、コンピュータ製品。

【請求項147】

システムであって、
請求項１４６に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサと、を備える、システム。

【請求項148】

請求項１～１４５のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を備える、システム。

【請求項149】

請求項１～１４５のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された１つ以上のプロセッサを備える、システム。

【請求項150】

請求項１～１４５のいずれか一項に記載の方法のステップをそれぞれ実施するモジュールを備える、システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月１３日に出願された「Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅｎｄ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｏｒ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」という名称の米国仮特許出願第６３／０５１，２６８号に対する優先権を主張し、その内容はあらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、妊娠及びがんなどの多くの生理学的及び病理学的状態の診断及び予後予測に適用され得る豊富な情報源である（Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７７，５１３－５２２、Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，２０４５８－２０４６３、Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５０，４８５－４８７）。循環ｃｆＤＮＡは現在、非侵襲的バイオマーカーとして一般的に使用されており、短い断片の形態で循環することが知られているが、ｃｆＤＮＡの断片化及び分子プロファイルを支配する生理学的要因は、依然として理解しにくいままである。

【0003】

近年の研究は、ｃｆＤＮＡの断片化が、ヌクレオソームの位置決定に関連する非ランダムプロセスであることを示唆している（Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８，２９、Ｉｖａｎｏｖ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６，Ｓ１、Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，６１ｒａ９１－６１ｒａ９１、Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｅｌｌ １６４，５７－６８、Ｓｕｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，４１８－４２７））。以前に、我々は、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）が血漿中のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルに寄与することを実証している（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）。上記にもかかわらず、ヌクレアーゼ発現レベルを分析するための多くの技法は、ＲＮＡ配列決定又は他の種類のＲＮＡ分析（例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を使用する。しかしながら、ＲＮＡはＤＮＡよりも不安定であり、かつ、安定性が低いことが既知であるため、これらのＲＮＡに基づく技法は効率及び精度が低いという問題があり得る。他の技法には、臨床評価のために侵襲的技法（侵襲的生検又は羊水検査又は絨毛生検など）の使用を必要とし得る、組織特異的ヌクレアーゼの測定が含まれる。

【0004】

したがって、ヌクレアーゼ発現レベル又は他の関連する値、例えば、対象における異常に関連する値を非侵襲的に決定することができる、より堅牢で、効率的で、再現性があり、効果的な技法に対する必要性がある。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、無細胞ＤＮＡ末端シグネチャ／モチーフに影響を与える、組織でのヌクレアーゼ発現を使用するための技法を記載する。例として、特定のヌクレアーゼに対応する末端シグネチャは、ＤＮＡ末端配列（例えば、配列末端シグネチャ）又はＤＮＡ鎖間の指定された長さのオーバーハング（例えば、不揃いな末端指数として測定され得る不揃いな末端シグネチャ）の形態であり得る。いくつかの態様では、組織ヌクレアーゼ発現レベルと無細胞ＤＮＡ末端シグネチャとの間の関係を使用して、異常組織と正常組織とを区別し、組織タイプ（例えば、造血組織対非造血組織、胎児対母体）を区別し、臨床的に関連するＤＮＡ又は標的組織タイプの特徴を決定することができる。

【0006】

別の態様では、生物学的試料は、指定された長さの不揃いな末端を有する無細胞ＤＮＡ分子について濃縮され得る。濃縮された無細胞ＤＮＡ分子からの配列リードを分析して、特定のヌクレアーゼ発現に関連するＤＮＡ末端シグネチャに対応する配列リードのサブセットを同定することができる。配列リードのサブセットを使用して、生物学的試料の特徴（例えば、造血、非造血、腫瘍、非腫瘍、母体、胎児など）を特定するためのパラメータを決定することができる。

【0007】

更に別の態様では、本開示は、ウイルスの無細胞ＤＮＡ末端シグネチャを分析するための技法を記載する。一例では、配列モチーフのセットの相対頻度は、無細胞ウイルスＤＮＡから得られた配列リードのセットから同定することができ、決定された相対頻度を使用して、対象における病理（例えば、上咽頭がん）を決定することができる。一実施形態において、病理は、ウイルス感染（例えば、エプスタイン・バール・ウイルス及び上咽頭がん、リンパ腫若しくは胃がん、若しくはヒトパピローマウイルス及び子宮頸がん、又はＢ型肝炎ウイルス及び肝細胞がん）に関連し得る。別の例では、無細胞ウイルスＤＮＡの測定された特性に基づいて決定された不揃い指数値を使用して、対象の病態を決定することもすることができる。

【0008】

本開示のこれら及び他の実施形態を、以下で詳細に説明する。例えば、他の実施形態は、本明細書に記載の方法と関連付けられたシステム、デバイス、及びコンピュータ可読媒体を対象とする。

【0009】

図面及び特許請求の範囲を含む明細書の残りの部分を参照することにより、本開示の他の特徴及び利点が理解されるであろう。本開示の更なる特徴及び利点、並びに本開示の様々な実施形態の構造及び操作は、添付の図面に関して以下に詳細に記載される。図面において、同様の参照番号は、同一の又は機能的に類似する要素を示し得る。

【0010】

特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、申請及び必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】いくつかの実施形態による、末端モチーフの例を示す。

【図2】いくつかの実施形態による、無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハングの程度を示す一例を示す。

【図3】いくつかの実施形態による、ヌクレアーゼ切断末端シグネチャの例を示す。

【図4】いくつかの実施形態による、異なる組織にわたる異なるヌクレアーゼに対応する発現プロファイルの例を示す。

【図5】いくつかの実施形態による、ヌクレアーゼＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３について示された切断優先度を有するｃｆＤＮＡの生成及び消化のモデルを示す。

【図6】いくつかの実施形態による、組織の生理学的状態又は病理学的状態を決定するための特定の末端シグネチャを有する無細胞ＤＮＡ分子の例示的な分布を示す。

【図7A】いくつかの実施形態による、異なる組織群にわたるモチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を示す箱ひげ図を示す。

【図7B】いくつかの実施形態による、異なる組織群にわたるモチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を示す箱ひげ図を示す。

【図8】いくつかの実施形態による、末端シグネチャを検出するために異なるパラメータを評価するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。

【図9】いくつかの実施形態による、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ、ＤＦＦＢ切断シグネチャ、及びＤＮＡＳＥ１切断シグネチャの三次元散布図を示す。

【図10】いくつかの実施形態による、ロジスティック回帰を使用してＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ、ＤＦＦＢ切断シグネチャ、及びＤＮＡＳＥ１切断シグネチャを決定する性能レベルを示すＲＯＣ曲線を示す。

【図11】いくつかの実施形態による、２つの血漿末端モチーフの比（ＡＣＧＡ／ＣＣＣＧ）を示す箱ひげ図を示す。

【図12】いくつかの実施形態による、野生型マウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスとの間の２つの血漿末端モチーフの比（ＡＣＧＡ／ＣＣＣＧ）を示す箱ひげ図を示す。

【図13】いくつかの実施形態による、野生型マウス（ＤＦＦＢ^＋／＋）とＤＦＦＢ欠失マウス（ＤＦＦＢ^－／－）との間のＡＡＡＴ末端モチーフを有する血漿ＤＮＡ断片のパーセンテージを示す。

【図14】いくつかの実施形態による、肝細胞がん（ＨＣＣ）を有するヒト対象と肝細胞がん（ＨＣＣ）を有さないヒト対象との間のＡＡＡＴ末端モチーフを有する血漿ＤＮＡ断片のパーセンテージを示す。

【図15A】図１５Ａは、いくつかの実施形態による、ヒト健常対照対象（ＣＴＲ）、慢性Ｂ型肝炎感染（ＨＢＶ）を有する患者、及びＨＣＣを有する患者にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比値の箱ひげ図を示す。

【図15B】図１５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比（密な破線）、末端モチーフＣＣＣＡ（ＣＣＣＡ、緩い破線）を有する断片のパーセンテージ、及びモチーフ多様性スコア（ＭＤＳ、実線）を使用した、ＨＣＣを有する患者とＨＣＣを有しない患者との間のＲＯＣ曲線を示す。

【図16】対照対象（例えば、子癇前症を有さない妊婦）及び子癇前症を有する妊娠中の対象にわたるＤＮＡＳＥ１／ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ比の箱ひげ図を示す。

【図17】いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて生物学的試料中の異常レベルを分類するフローチャートである。

【図18A】いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とを区別する例を示す。

【図18B】いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とを区別する例を示す。

【図19】いくつかの実施形態による、胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子とを区別するための２つの血漿末端モチーフの比（ＣＧＡＡ／ＡＡＡＡ）の箱ひげ図を示す。

【図20】いくつかの実施形態による、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とを区別する際のＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比についてのＲＯＣ曲線を示す。

【図21】いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて生物試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度を推定する方法を示すフローチャートである。

【図22A】いくつかの実施形態による、ヒト胎盤組織（Ａ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）及びマウス胎盤組織（Ｂ、Ｄｎａｓｅ１ｌ３）の異なる妊娠期間にわたるデオキシリボヌクレアーゼ１様３発現レベルの箱ひげ図を示す。

【図22B】いくつかの実施形態による、ヒト胎盤組織（Ａ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）及びマウス胎盤組織（Ｂ、Ｄｎａｓｅ１ｌ３）の異なる妊娠期間にわたるデオキシリボヌクレアーゼ１様３発現レベルの箱ひげ図を示す。

【図23】いくつかの実施形態による、異なる妊娠期間にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比の箱ひげ図を示す。

【図24A】いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子とを区別する例を示す。

【図24B】いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子とを区別する例を示す。

【図25】いくつかの実施形態による、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子とを区別する際のＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比についてのＲＯＣ曲線を示す。

【図26】いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて標的組織タイプの特徴を決定する方法を示すフローチャートである。

【図27】野生型マウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスとの間の血漿ＤＮＡの不揃いを示すグラフのセットを示す。

【図28】Ｄｎａｓｅ１^－／－マウスとＷＴマウスの血漿ＤＮＡとの間の血漿ＤＮＡ（ＪＩ－Ｍ）の不揃いを同定する箱ひげ図を示す。

【図29】ＷＴマウスとＤＦＦＢ^－／－マウスとの間の血漿ＤＮＡの不揃いを同定するグラフのセットを示す。

【図30A】いくつかの実施形態による、胎児特異的ＤＮＡ分子と共有ＤＮＡ分子との間の不揃い指数値の比較を示す。

【図30B】いくつかの実施形態による、胎児特異的ＤＮＡ分子と共有ＤＮＡ分子との間の不揃い指数値の比較を示す。

【図31A】図３１Ａは、いくつかの実施形態による、胎盤組織及び白血球におけるＤＮＡＳＥ１の遺伝子発現を示す。

【図31B】図３１Ｂは、いくつかの実施形態による、サイズ選択なしでの胎児特異的断片と共有断片との間の非メチル化不揃い指数（ＪＩ－Ｕ）値の箱ひげ図を示す。

【図31C】図３１Ｃは、いくつかの実施形態による、１３０ｂｐ～１６０ｂｐのサイズ範囲内の胎児特異的断片と共有断片との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示す。

【図32】ＨＣＣを有する患者における変異対立遺伝子（腫瘍性ＤＮＡ）及び野生型対立遺伝子（主に非腫瘍性ＤＮＡ）を有する血漿ＤＮＡ分子間のＪＩ－Ｍ値の累積差を同定するグラフを示す。

【図33】いくつかの実施形態による、不揃い指数値に基づいて臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分を決定する方法を示すフローチャートである。

【図34】いくつかの実施形態による、野生型、ＤＮＡＳＥ１^－／－、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－を含む異なる遺伝子型にわたるマウスにおける血漿ＤＮＡの不揃い指数値の箱ひげ図を示す。

【図35A】図３５Ａは、いくつかの実施形態による、正常肝組織及び肝臓がん組織におけるＤＮＡＳＥ１遺伝子発現の箱ひげ図を示し、図３５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有さない患者とＨＣＣを有する患者との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示し、図３５Ｃは、いくつかの実施形態による、サイズ選択がある及びサイズ選択のない断片によって推定されるＪＩ－Ｕ値間の性能を比較するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図35B】図３５Ａは、いくつかの実施形態による、正常肝組織及び肝臓がん組織におけるＤＮＡＳＥ１遺伝子発現の箱ひげ図を示し、図３５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有さない患者とＨＣＣを有する患者との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示し、図３５Ｃは、いくつかの実施形態による、サイズ選択がある及びサイズ選択のない断片によって推定されるＪＩ－Ｕ値間の性能を比較するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図35C】図３５Ａは、いくつかの実施形態による、正常肝組織及び肝臓がん組織におけるＤＮＡＳＥ１遺伝子発現の箱ひげ図を示し、図３５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有さない患者とＨＣＣを有する患者との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示し、図３５Ｃは、いくつかの実施形態による、サイズ選択がある及びサイズ選択のない断片によって推定されるＪＩ－Ｕ値間の性能を比較するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図36】いくつかの実施形態による、不揃い指数値に基づいて組織の異常レベルを分類する方法を示すフローチャートである。

【図37】ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連するバリアントの異なる遺伝子型を有するヒト対象のＤＮＡ分子における不揃いな末端の分布を同定するグラフを示す。

【図38】対照群とＳＬＥを有する患者との間の末梢血単核細胞におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の遺伝子発現レベルを同定する箱ひげ図を示す。

【図39】対照試料並びに非活動性ＳＬＥ及び活動性ＳＬＥを有する試料の血漿ＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ）の不揃いを同定するグラフのセットを示す。

【図40】対照対象とＳＬＥ対象とを区別するための不揃い指数値及びサイズ比方法の性能を同定する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。

【図41】野生型マウスからの０時間のヘパリンインキュベーションと６時間のヘパリンインキュベーションとの間の異なる断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ値を同定するグラフを示す。

【図42】ＤＮＡＳＥ１^－／－マウスについて０時間のインキュベーションとヘパリンとともに６時間のインキュベーションとの間の異なる断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ値を特定するグラフを示す。

【図43】本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法を例示するフローチャートを示す。

【図44】本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法を例示するフローチャートを示す。

【図45】ＥｘｏＴで処理した又はＥｘｏＴで処理していないアニールされたｄｓＤＮＡの不揃いを同定するプロトコルを示す。

【図46】本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための方法を例示するフローチャートである。

【図47A】いくつかの実施形態による、ＧＣ％と不揃いな末端の長さとの間の関係を示すグラフの例を示す。

【図47B】いくつかの実施形態による、ＧＣ％と不揃いな末端の長さとの間の関係を示すグラフの例を示す。

【図48】いくつかの実施形態による、ＣＣＧＴ末端モチーフを有する断片のパーセンテージの箱ひげ図を示す。

【図49】いくつかの実施形態による、不揃いな末端指数（ＪＩ－Ｕ）、末端モチーフ（ＣＣＧＴ）、及び末端モチーフと不揃いな末端分析との組み合わせを使用して、母体ＤＮＡ断片と胎児ＤＮＡ断片とを区別するための分類力分析を示す。

【図50】いくつかの実施形態による、妊婦の血漿ＤＮＡ試料における予測された胎児ＤＮＡ画分と実際の胎児ＤＮＡ画分との間の散布図を示す。

【図51】いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有する患者における予測された腫瘍ＤＮＡ画分と実際の腫瘍ＤＮＡ画分との間の散布図である。

【図52】いくつかの実施形態による、不揃いな末端を有する無細胞ＤＮＡ分子に由来する末端シグネチャに基づいて生物学的試料の特徴を決定する方法を示すフローチャートである。

【図53】いくつかの実施形態による、特定の数の目的の不揃いな末端を濃縮するための不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的捕捉を使用する方法の例を示す。

【図54】いくつかの実施形態による、特定の数の目的の不揃いな末端を濃縮するための不揃いな末端特異的アダプターライゲーションに基づくアンプリコン配列決定を使用する方法の例を示す。

【図55】いくつかの実施形態による、特定の数の目的の不揃いな末端を決定するためのドロップレットＰＣＲを使用する方法の例を示す。

【図56】いくつかの実施形態による、非腫瘍性上咽頭上皮組織とＮＰＣ組織との間のＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現レベルの箱ひげ図を示す。

【図57A】図５７Ａは、いくつかの実施形態による、上咽頭がんの様々なステージを有する異なる対象にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフＣＣＣＡの箱ひげ図を示し、図５７Ｂは、いくつかの実施形態による、ＮＰＣを有するＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とＮＰＣを有さないＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とを区別する際の末端モチーフＣＣＣＡの性能レベルを示すＲＯＣ曲線を示す。

【図57B】図５７Ａは、いくつかの実施形態による、上咽頭がんの様々なステージを有する異なる対象にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフＣＣＣＡの箱ひげ図を示し、図５７Ｂは、いくつかの実施形態による、ＮＰＣを有するＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とＮＰＣを有さないＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とを区別する際の末端モチーフＣＣＣＡの性能レベルを示すＲＯＣ曲線を示す。

【図58】いくつかの実施形態による、様々なステージの上咽頭がんを有する異なる対象にわたるモチーフ多様性スコアの箱ひげ図を示す。

【図59】いくつかの実施形態による、ＭＤＳとサイズ分析との組み合わせの性能レベルを評価するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図60】いくつかの実施形態による、上咽頭がん（ＮＰＣ）を有する患者及び一過的又は持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有するがＮＰＣを有さない患者にわたる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ断片から推定される２５６の末端モチーフのヒートマップを示す。

【図61】いくつかの実施形態による、陽性ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象において優先的に存在した血漿ＥＢＶ ＤＮＡの末端モチーフを同定するヒートマップを示す。

【図62】いくつかの実施形態による、生物学的試料が得られる対象における病理のレベルを決定するために、無細胞ウイルスＤＮＡ分子を含む生物学的試料を分析する方法を示すフローチャートである。

【図63A】いくつかの実施形態による、異なる対象にわたる非メチル化シグナルから推定される不揃い指数値の箱ひげ図を示す。

【図63B】いくつかの実施形態による、異なる対象にわたる非メチル化シグナルから推定される不揃い指数値の箱ひげ図を示す。

【図64】いくつかの実施形態による、ＮＰＣ組織と非腫瘍性上咽頭上皮組織との間のＤＮＡＳＥ１発現レベルの箱ひげ図を示す。

【図65】いくつかの実施形態による、生物学的試料中の無細胞ウイルスＤＮＡ分子の不揃いな末端を分析する方法を示すフローチャートである。

【図66】本発明の実施形態による、測定システムを示す。

【図67】本発明の実施形態による、測定システムを実行する例示的なサブシステムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

用語
「組織」は、機能単位としてともにグループ化する細胞のグループに対応する。２つ以上のタイプの細胞が、単一の組織内に見出され得る。種々のタイプの組織は、種々のタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、又は血球細胞）からなり得るが、種々の生物（母体対胎児）由来の組織又は健常細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応し得る。異なる個体由来の同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを決定することができる。

【0013】

「生物学的試料」は、対象（例えば、妊婦、がんを有する人、又はがんを有する疑いがある人などのヒト（又は他の動物）、臓器移植レシピエント、又は臓器が関与する疾患プロセス（例えば、心筋梗塞における心臓、脳卒中における脳、若しくは貧血における造血系）を有する疑いがある対象）から採取され、目的の１つ以上の核酸分子を含有する任意の試料を指す。生物学的試料は、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、膣液、睾丸瘤（例えば、精巣）由来の液体、膣洗浄液、胸膜液、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳房）由来の吸引液、眼内液（例えば、房水）であり得る。便試料も使用され得る。様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡのために濃縮された生物学的試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して取得された血漿試料）におけるＤＮＡの大部分は、無細胞であり得、例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、又は９９％超は、無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、例えば、３，０００ｇ×１０分で流体部分を取得することと、残留細胞を除去するために３０，０００ｇで更に１０分間再遠心分離することと、を含み得る。生物学的試料の分析の一環として、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い無細胞ＤＮＡ分子が分析され得る。

【0014】

「臨床的に関連するＤＮＡ」は、例えば、そのようなＤＮＡの画分濃度を決定するため、又は試料（例えば、血漿）の表現型を分類するために、測定されるべき特定の組織供給源のＤＮＡを指し得る。臨床的に関連するＤＮＡの例は、母体血漿における胎児ＤＮＡ、又は患者の血漿における腫瘍ＤＮＡ、又は無細胞ＤＮＡを含む他の試料である。別の例は、移植患者の血漿、血清又は尿における移植片関連ＤＮＡの量の測定を含む。更なる例は、対象の血漿における造血性及び非造血性ＤＮＡの画分濃度、又は試料における肝臓ＤＮＡ断片（若しくは他の組織）の画分濃度、又は脳脊髄液における脳ＤＮＡ断片の画分濃度の測定を含む。

【0015】

「配列リード」は、核酸分子の任意の部分又は全部から配列決定されるヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定された短鎖ヌクレオチド（例えば、約２０～１５０ヌクレオチド）、核酸断片の片端若しくは両端の短鎖ヌクレオチド、又は生物学的試料中に存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。配列リードは、例えば、配列決定技術を使用した、又はプローブを使用した種々の方法で、例えば、ハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブで、又は単一プライマー若しくは等温増幅を使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）若しくは線形増幅などの増幅技術で、取得することができる。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い配列リードが分析され得る。

【0016】

「切断部位」は、核酸、例えば、ＤＮＡがヌクレアーゼによって切断され、それによって核酸、例えば、ＤＮＡ、断片を生じる位置を指し得る。

【0017】

配列リードは、断片の末端に関連する「末端配列」を含み得る。末端配列は、断片の最も外側のＮ塩基、例えば断片の末端の２～３０塩基に対応し得る。配列リードが断片全体に対応する場合、配列リードは２つの末端配列を含み得る。対形成末端配列決定が断片の末端に対応する２つの配列リードを提供する場合、各配列リードは１つの末端配列を含み得る。

【0018】

「配列末端シグネチャ」の「配列モチーフ」は、核酸断片（例えば、無細胞ＤＮＡ断片）における塩基の短い反復パターンを指し得る。配列モチーフは、断片の末端に生じ得、したがって、末端配列の一部であるか、又はそれを含み得る。「末端モチーフ」は、潜在的には特定の組織タイプについて、核酸、例えばＤＮＡ断片の末端において優先的に生じる末端配列についての配列モチーフを指し得る。末端モチーフはまた、断片の末端の直前又は直後に生じ得、それにより、依然として末端配列に対応する。

【0019】

「不揃いな末端」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡ）の粘着末端、核酸のオーバーハング、又は二本鎖核酸が他の核酸鎖とハイブリダイズしていない核酸鎖を含む場合を指し得る。「不揃い指数値」は、不揃いな末端の程度の尺度である。不揃い指数値は、二本鎖核酸において第２の鎖に突出した１つの鎖の平均長に比例し得る。複数の核酸分子の不揃い指数値は、核酸分子間の平滑末端の考慮を含み得る。

【0020】

いくつかの場合では、不揃い指数値は、複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出している集合的な尺度を提供し得る。不揃いの集合的な尺度は、複数の無細胞ＤＮＡ分子におけるオーバーハングの推定される長さ、例えば、無細胞ＤＮＡ分子の各々の個々の尺度の平均値、中央値、又は他の集合的な測定値に基づいて決定することができる。いくつかの場合では、不揃いの集合的な尺度は、特定の断片サイズ範囲（例えば、１３０～１６０ｂｐｓ、２００～３００ｂｐｓ）について決定される。いくつかの場合では、不揃いの集合的な尺度は、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に近接するメチル化シグナルの変化に基づいて決定することができる。

【0021】

ＤＮＡ鎖間の「オーバーハングの長さ」という用語は、参照試料（例えば、正常細胞）と異なって調節されるヌクレアーゼ試料（例えば、腫瘍細胞）との間の血漿ＤＮＡ全体又は特定の断片サイズ範囲内の血漿ＤＮＡの不揃い（例えば、不揃い指数値）を比較することによって推定され得る値を指し得る。いくつかの場合では、オーバーハングの長さは、生物学的試料の特徴を決定するために選択された特定のＤＮＡ断片サイズ範囲（例えば、１３０～１６０ｂｐ、２００～３００ｂｐ）に基づいて異なる。

【0022】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ鎖におけるオーバーハングの長さは、二本鎖ＤＮＡ間のオーバーハングの長さを特徴付ける分類値である。例えば、「長い」オーバーハングは、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔのサイズ、及び１００ｎｔより大きいサイズを有するＤＮＡ鎖のオーバーハングを含み得る。「短い」オーバーハングは、０ｎｔ、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔのサイズを有するＤＮＡ鎖のオーバーハングを含み得る。更に又はあるいは、ＤＮＡ鎖中のオーバーハングの指定された長さは、特定の閾値を超えるオーバーハングのサイズを有する分子のパーセンテージに基づいて推定することができる。例えば、血漿ＤＮＡにおける「長い」オーバーハングの存在は、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、又はそれらの組み合わせよりも大きい分子のパーセンテージとして表すことができる。

【0023】

「末端シグネチャ」は、配列モチーフ、不揃いな末端、又はその両方を指し得る。

【0024】

「対立遺伝子」という用語は、同じ物理的ゲノム遺伝子座にある代替核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指し、異なる表現型の特徴をもたらす場合ともたらさない場合がある。各染色体のコピーが２つある任意の特定の二倍体生物（男性の対象の性染色体を除く）では、各遺伝子の遺伝子型は、ホモ接合体においては同じであり、ヘテロ接合体においては異なる、その遺伝子座に存在する対立遺伝子の対を含む。生物の集団又は種は、典型的には、様々な個体の各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。集団内に２つ以上の対立遺伝子が見られるゲノム遺伝子座は、多型部位と呼ばれる。遺伝子座での対立遺伝子多様性は、存在する対立遺伝子の数（すなわち、多型の程度）、又は集団内のヘテロ接合体の割合（すなわち、ヘテロ接合性率）として測定可能である。本明細書で使用される「多型」という用語は、その頻度に関係なく、ヒトゲノムにおける任意の個体間の多様性を指す。そのような多様性の例は、一塩基多型、単純なタンデムリピート多型、挿入－欠失多型、変異（疾患を引き起こし得る）、及びコピー数の多様性を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ハプロタイプ」という用語は、同じ染色体又は染色体領域上で一緒に伝達される複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、わずか１対の遺伝子座、又は染色体領域、又は染色体全体又は染色体腕を指し得る。

【0025】

「画分胎児ＤＮＡ濃度」という用語は、「胎児ＤＮＡの割合」及び「胎児ＤＮＡ画分」という用語と互換的に使用され、胎児に由来する生物学的試料（例えば、母体の血漿又は血清試料）に存在する胎児ＤＮＡ分子の割合を指す（Ｌｏ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；６２：７６８－７７５、Ｌｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００８；５４：１６６４－１６７２）。

【0026】

「相対頻度」は、割合（例えば、パーセンテージ、画分、又は濃度）を指し得る。特に、特定の末端モチーフ（例えば、ＣＣＧＡ）の相対頻度は、例えば、ＣＣＧＡの末端配列を有することによって、末端モチーフＣＣＧＡに関連する無細胞ＤＮＡ断片の割合を提供し得る。

【0027】

「集計値」は、集合的な特性、すなわち、末端モチーフのセットの相対頻度などの１より大きい数又は測定値を有するデータセットの特性を記述する値又はパラメータを指し得る。例には、平均、中央値、相対頻度の合計、相対頻度間の変動（例えば、エントロピー、標準偏差（ＳＤ）、変動係数（ＣＶ）、四分位範囲（ＩＱＲ）若しくは異なる相対頻度間の特定のパーセンタイルカットオフ（例えば９５又は９９パーセンタイル））、又はクラスタリングで実装され得る相対頻度の参照パターンからの差（例えば、距離）を含む。

【0028】

「較正試料」は、臨床的に関連する核酸の画分濃度（例えば、組織特異的ＤＮＡ画分）が、既知であるか、又は例えば、ドナーのゲノムには存在するがレシピエントのゲノムには存在しない対立遺伝子を移植臓器のマーカーとして使用し得る移植などにおいて組織に特異的な対立遺伝子を使用して較正方法を介して決定される、生物学的試料に対応し得る。別の例として、較正試料は、末端モチーフを決定し得る試料に対応し得る。較正試料は、両方の目的に使用され得る。

【0029】

「較正データ点」は、「較正値」、及び標的組織タイプの測定値若しくは既知の特徴値、又は臨床的に関連する核酸（例えば、特定の組織タイプのＤＮＡ）の画分濃度を含む。較正値は、試料の核酸分子から測定された様々なタイプのデータ、例えば、末端モチーフの量又は不揃い指数値から決定され得る。較正値は、所望の特性、例えば、標的組織タイプの特徴値又は臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度に相関するパラメータに対応する。例えば、較正値は、所望の特性が既知である較正試料について決定された末端シグネチャの相対頻度（例えば、集計値）から決定され得る。較正データ点は、様々な方法で、例えば、離散点として、又は較正関数（検量線又は較正面とも呼ばれる）として定義され得る。較正関数は、較正データ点の追加の数学的変換から導出され得る。

【0030】

「分離値」は、２つの値を包含する差又は比、例えば、２つの画分寄与又は２つのメチル化レベルに相当する。分離値は、単純な差又は比であり得る。例として、ｘ／ｙの直接比は、ｘ／（ｘ＋ｙ）と同様に分離値である。分離値は、他の因子、例えば、乗法的因子を含み得る。他の例として、値の関数の差又は比、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差又は比が使用され得る。分離値には、差及び比を含み得る。

【0031】

「分離値」及び「集計値」（例えば、相対頻度）は、異なる分類（状態）間で変化する試料の測定値を提供するパラメータ（メトリックとも呼ばれる）の２つの例であり、したがって様々な分類を決定するために使用され得る。集計値は、例えば、クラスタリングで行われるように、試料の相対頻度のセットと相対頻度の参照セット間で差が取られる場合の分離値であり得る。

【0032】

本明細書で使用される「分類」という用語は、試料の特定の特性と関係した任意の数又は他の特徴を指す。例えば、「＋」という記号（又は「陽性」という語）は、試料が欠失又は増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。分類は、二者択一（例えば、陽性若しくは陰性）であり得、又はより多くのレベルの分類（例えば、１～１０若しくは０～１のスケール）を有し得る。更なる例として、分類のレベルは、例えば、試料又は標的組織タイプの画分濃度又は特徴の値に対応することができる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「パラメータ」という用語は、定量的データセットを特徴付ける数値、及び／又は定量的データセット間の数的関連性を意味する。例えば、第１の核酸配列の第１の量と第２の核酸配列の第２の量との比（又は比の関数）は、パラメータである。

【0034】

「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用されるのを上回る又は下回る値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。カットオフ又は閾値は、「参照値」であり得るか、又は特定の分類を表すか、若しくは２つ以上の分類間を区別する参照値から導出され得る。そのような参照値は、当業者によって理解されるように、様々な方法で決定され得る。例えば、異なる既知の分類を有する対象の２つの異なるコホートについてメトリック（パラメータ）を決定することができ、参照値を１つの分類（例えば、平均）の代表として、又はメトリックの２つのクラスター間の値（例えば、所望の感度及び特異度を得るために選択される）として選択し得る。別の例として、参照値は、試料の統計シミュレーションに基づいて決定され得る。カットオフ、閾値、参照などの特定の値は、所望の精度（例えば、感度及び特異度）に基づいて決定され得る。パラメータをカットオフ値、閾値、参照値、又は較正値と比較して、分類を決定することができる。このような値を決定するためのプロセスは、例えば、１つ以上のパラメータのセットのトレーニングベクターを受ける機械学習モデルのトレーニングの一部として行うことができる。そして、パラメータとそのような値のいずれかとの比較は、パラメータを、別の対象、例えば、病態、異常、若しくは病理を有する対象若しくは有さない対象、又は既知のパラメータ値（例えば、較正値）を有する対象から決定されたパラメータ値を使用してトレーニングされた機械学習モデルに入力することによって達成することができる。

【0035】

「がんのレベル」という用語は、がんが存在するかどうか（すなわち、存在又は不存在）、がんのステージ、腫瘍のサイズ、転移があるかどうか、体の総腫瘍負荷、治療に対するがんの応答、及び／又はがんの重症度の他の尺度（例えば、がんの再発）を指し得る。がんのレベルは、数字、又は、記号、アルファベット文字、及び色などの他のしるしであり得る。レベルは、ゼロであり得る。がんのレベルは、前悪性病態又は前がん性病態（状態）も含み得る。がんのレベルは、様々な方法で使用され得る。例えば、スクリーニングは、がんを有することを今まで知らなかった人物においてがんが存在するかどうかをチェックし得る。評価は、がんと診断されている人物を調べて、がんの進行を経時的に監視し、療法の有効性を研究し、又は予後を決定し得る。一実施形態において、予後は、患者ががんで死亡する可能性、又は特定の持続時間又は特定の時間の後、がんが進行する可能性、又はがんが転移する可能性若しくは程度として表すことができる。検出は、がんの示唆的特徴（例えば、症状又は他の陽性試験）を有する人ががんを有するかどうかを「スクリーニングすること」を意味し得、又はそれを確認することを意味し得る。

【0036】

「異常レベル」は、生物に関連する異常の量、程度、又は重症度を指し得、このレベルはがんについて上記で記載したとおりであり得る。異常の例は、生物に関連する病理である。異常の別の例は、移植された臓器の拒絶反応である。異常の他の例には、自己免疫発作（例えば、腎臓を損傷するループス腎炎又は多発性硬化症）、炎症性疾患（例えば、肝炎）、線維化プロセス（例えば、肝硬変）、脂肪浸潤（例えば、脂肪肝疾患）、変性プロセス（例えば、アルツハイマー病）、及び虚血性組織損傷（例えば、心筋梗塞又は脳卒中）を含み得る。対象の健常な状態は、正常分類とみなし得る。

【0037】

「妊娠期間」という用語は、女性の最終月経（ＬＭＰ）の開始からかかった妊娠の期間の尺度、又は可能であればより正確な方法で推定される妊娠の対応する期間を指し得る。このような方法には、受精（体外受精で可能である）からの既知の期間に１４日間追加すること、又は産科的超音波検査によることが含まれる。

【0038】

ＤＮＡ分子を説明する際の「損傷」という用語は、ＤＮＡニック、二本鎖ＤＮＡに存在する一本鎖、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング、酸化グアニンによる酸化的ＤＮＡ修飾、脱塩基部位、チミジン二量体、酸化ピリミジン、ブロックされた３’末端、又は不揃いな末端を指し得る。

【0039】

「部位」（「ゲノム部位」とも呼ばれる）は、単一の塩基位置、又は相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位、又は相関する塩基位置のより大きい群であり得る、単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、遺伝子座をその文脈における部位と等価にするであろうただ１つの部位を含み得る。

【0040】

各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）についての「メチル化指数」又は「メチル化状態」は、部位におけるメチル化を、その部位を覆うリードの総数にわたって示す、核酸断片（例えば、配列リード又はプローブから決定されるＤＮＡ断片）の比を指し得る。「リード」は、核酸断片から得られる情報（例えば、部位におけるメチル化状態）に対応することができる。リードは、特定のメチル化状態の核酸断片と優先的にハイブリダイズする試薬（例えば、プライマー又はプローブ）を使用して取得することができる。典型的には、このような試薬は、核酸分子のメチル化状態、例えば、重亜硫酸塩変換、若しくはメチル化感受性制限酵素、若しくはメチル化結合タンパク質、若しくは抗メチルシトシン抗体、又はメチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンを認識する一分子配列決定技法に応じて、核酸分子を異なって修飾するか又は異なって認識するプロセスによる処理後に適用される。

【0041】

領域の「メチル化密度」は、この領域における部位をカバーするリードの総数で割った、メチル化を示す領域内の部位でのリード数を指し得る。この部位は、具体的な特徴を有し得、例えば、ＣｐＧ部位であり得る。したがって、領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、この領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内又はそれより大きい領域のＣｐＧ部位）をカバーするリードの総数で割ったＣｐＧメチル化を示すリード数を指し得る。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域へマッピングされた配列リードによってカバーされた全てのＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位のバイサルファイト処理後に変換されていないシトシン（メチル化されたシトシンに対応する）の総数から決定され得る。この分析はまた、例えば、５００ｂｐ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又は１Ｍｂなどの他のビンサイズに対して実施され得る。領域は、全ゲノム、又は染色体、又は染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合、その領域のメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの割合」は、領域において分析されたシトシン残基の総数、すなわちＣｐＧの文脈外のシトシンを含む、に対する、メチル化されていることが示されている（例えば、バイサルファイト変換後に変換されていない）シトシン部位「Ｃ」の数を指し得る。メチル化指数、メチル化密度、及びメチル化シトシンの比は、「メチル化レベル」の例である。重亜硫酸塩変換の他に、当業者に既知の他のプロセスを使用して、メチル化状態に感度の高い酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に感度の高いプラットフォームを使用する単一分子配列決定（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１３；１１０：１８９１０－１８９１５）及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子リアルタイム分析（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０；７：４６１－４６５）によるもの）を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ分子のメチル化状態を調べることができる。

【0042】

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは値の測定又は決定方法、すなわち測定システムの制限について部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例により、１以内又は１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、「約」又は「およそ」という用語は、値の１桁以内、５倍以内、いくつかの形態では２倍以内を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内の「約」という用語を想定すべきである。「約」という用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有し得る。「約」という用語は、±１０％を指し得る。「約」という用語は、±５％を指し得る。

【0043】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段に示さない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在する値も、下限の１０分の１まで具体的に開示されていると理解される。提供される範囲の端点が範囲に含まれることも理解される。記載された範囲における任意の記載された値又は介在する値と、その記載された範囲における任意の他の記載された値又は介在する値との間の各より小さい範囲が、本開示の実施形態内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、範囲に独立して含まれるか除外されてもよく、どちらか一方、両方の限度がより小さい範囲に含まれるか、又はどちらも含まれない各範囲も、記載された範囲における任意の具体的に除外された限度を条件として、本開示内に包含される。記載された範囲が一方又は両方の限度を含む場合、それらの含まれた限度のいずれか又は両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。

【0044】

標準的な略語、例えば、ｂｐ：塩基対、ｋｂ：キロベース、ｐｉ：ピコリットル、ｓ又はｓｅｃ：秒、ｍｉｎ：分、ｈ又はｈｒ：時間、ａａ：アミノ酸、ｎｔ：ヌクレオチドなどが使用され得る。

【0045】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術の分野における当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本開示の実施形態の実施又は試験には、本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料が使用され得るが、いくつかの潜在的かつ例示的な方法及び材料が、ここで説明され得る。

【0046】

本開示は、無細胞試料（例えば、血漿又は血清）における無細胞ＤＮＡ末端シグネチャに影響を与える特定の組織又はＤＮＡタイプにおけるヌクレアーゼ発現を使用して、無細胞試料の非侵襲的測定を介して特定の組織又はＤＮＡのタイプの特性を決定することができる技法を記載する。ヌクレアーゼが正常細胞と比較して標的組織タイプの異常細胞において異なって調節される例では、試料中の無細胞ＤＮＡ分子における末端シグネチャの測定を使用して、試料／対象中の異常レベル、例えば、異常細胞の存在を決定することができる。例えば、デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）の発現は、健常な対象における肝臓組織と比較して、肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞において相対的にダウンレギュレートされている。

【0047】

異なって調節されるヌクレアーゼを評価して、このヌクレアーゼが、特定の末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断することを同定することができる。様々な実施形態において、特定のヌクレアーゼに対応する末端シグネチャは、少なくとも２つの異なる形態：（ｉ）配列末端モチーフ及び（ｉｉ）ＤＮＡ鎖間の指定された長さのオーバーハング（例えば、不揃いな末端シグネチャ）で同定することができる。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現の末端シグネチャは、ＣＣＣＡ末端モチーフ配列であり得る。別の例として、特定のヌクレアーゼは、そのような無細胞試料における典型的な（通常の）オーバーハングよりも大きなオーバーハング（又は小さなオーバーハング）を好み得る。

【0048】

無細胞ＤＮＡ分子の末端シグネチャを使用して、無細胞ＤＮＡ分子を含む生物学的試料から得られた配列リードに基づいて、様々なタイプのパラメータを決定することができる。例えば、パラメータは、２つの末端モチーフ間の量の比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＴ）であり得る。別の例では、パラメータは、ＤＮＡ分子における不揃いな末端の程度の尺度を同定する不揃い指数値であり得る。これらのパラメータに基づいて、組織ヌクレアーゼ発現レベルと無細胞ＤＮＡ末端シグネチャとの間の関係を使用して、異常な組織と正常な組織とを区別し、組織タイプ（造血組織対非造血組織、胎児対母体など）を区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度又は標的組織タイプの特徴を決定することができる。

【0049】

いくつかの場合では、生物学的試料は、指定された長さの不揃いな末端を有する無細胞ＤＮＡ分子について濃縮することができる。第１の鎖と第２の鎖の間に指定された長さのオーバーハングを有する無細胞ＤＮＡ分子を濃縮するために、不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的化捕捉、不揃いな末端特異的アダプターライゲーションに基づくアンプリコン配列決定、及びデジタルＰＣＲ（例えば、ドロップレットデジタルＰＣＲ）を含む、異なる手法を使用することができる。濃縮された無細胞ＤＮＡ分子からの配列リードを分析して、特定のヌクレアーゼに関連する配列末端シグネチャに対応する配列リードのサブセットを同定することができる。

【0050】

不揃いの濃縮の有無にかかわらず、配列リードのサブセットには、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現に関連する末端シグネチャであるＣＣＣＡ末端モチーフ配列が含まれ得る。配列リードのサブセットを使用して、パラメータ（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＴ間の比）を決定し、生物学的試料の特徴を同定することができる。例えば、決定された特徴は、例えば、ヌクレアーゼが胎児組織と母体組織との間で異なって調節される場合、特定の妊娠期間又は範囲（例えば、８週、９～１２週）を含み得る。別の例では、決定された特徴は、別の組織タイプ（例えば、造血細胞）と比較して異なって調節される特定の組織タイプ（例えば、肝細胞）に対応する臓器のサイズ又は栄養状態であり得る。

【0051】

本開示はまた、ウイルスの無細胞ＤＮＡ末端シグネチャを分析するための技法を記載する。参照ウイルスゲノムにアラインする配列リードのセットが決定される。配列リードのセットの各々について、配列末端モチーフが決定される。配列リードのセットに対応する配列末端モチーフに基づいて、配列モチーフのセットの相対頻度を同定することができ、その集計値（例えば、モチーフ多様性スコア）を決定することができる。集計値を使用して、対象の病理（例えば、上咽頭がんなどのがん）を決定することができる。一実施形態において、病理は、ウイルス感染（例えば、エプスタイン・バール・ウイルス及び上咽頭がん、リンパ腫若しくは胃がん、若しくはヒトパピローマウイルス及び子宮頸がん、又はＢ型肝炎ウイルス及び肝細胞がん）に関連し得る。

【0052】

いくつかの場合では、無細胞ウイルスＤＮＡの測定された特性に基づいて決定された不揃い指数値を使用して、対象の病態を決定することもできる。参照ウイルスゲノムにアラインする配列リードのセットを決定することができる。配列リードのセットの各々について、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性。測定された特性に基づいて、不揃い指数値を決定することができる。不揃い指数値を参照値と比較して、対象の病態（例えば、ＨＣＣ、結腸直腸がん、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、咽頭がんなど）を決定することができる。

【0053】

本明細書に記載される特定の技法は、異常組織と正常組織との区別、組織タイプの区別（例えば、造血組織対非造血組織、胎児対母体）、及び無細胞ＤＮＡ末端シグネチャ／モチーフに影響を与える組織におけるヌクレアーゼ発現を利用することによる臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度の決定を改善する。更に、無細胞ＤＮＡ末端シグネチャに基づく技法は、ヌクレアーゼ発現レベルのみを分析する技法よりも有利である。例えば、ヌクレアーゼ発現レベルの遺伝子分析は、ＲＮＡ配列決定又は他のタイプのＲＮＡ分析（例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を含み得る。ＲＮＡは、加水分解を受けやすいため、ＤＮＡよりも不安定であり、かつ、安定性が低いことが既知である。したがって、試料の収集、調製、及び分析のプロトコルは、ＲＮＡよりもＤＮＡ分析に対してより堅牢で、効率的で、再現性があり、かつ、効果的であり得る。更に、短いリード配列決定を使用して循環ＲＮＡを分析する場合、循環ＲＮＡはより広い分子の長さを有するため、断片のカウントを発現レベルに変換するための追加のメトリックが必要になる。１つの分子が２つ以上の断片を生成し得るが、１回だけ発現したものとしてカウントする必要がある。上記を考慮して、ヌクレアーゼ発現レベルに由来する無細胞ＤＮＡ末端シグネチャは、対象の異なるタイプの臨床評価のためのより正確な及び／又は実用的な指標となり得る。

【0054】

更に、局所的に作用する組織特異的ヌクレアーゼは簡単に測定することができない。これらのヌクレアーゼは、臨床評価のために侵襲的技法（例えば、侵襲的生検又は羊水検査又は絨毛採取など）の使用を必要とし得る組織分析によって測定する必要があり得る。一方、ヌクレアーゼの発現レベルは、血漿中を循環する対応する末端シグネチャを有する無細胞ＤＮＡ分子に反映され得る。このようなシグネチャは、組織細胞のヌクレアーゼ分析と比較して非常に侵襲性の低い技法である血漿ＤＮＡの分析を通じて取ることができる。

【0055】

本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然それ自体変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図したものではないことも理解されたい。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされてきたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に明記されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれ近くである。

【0056】

Ｉ．無細胞ＤＮＡ末端モチーフ
末端モチーフは、無細胞ＤＮＡ断片の末端配列、例えば、断片のいずれかの末端でのＫ塩基の配列に関する。末端配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７などの様々な数の塩基を有するｋ ｍｅｒであり得る。末端モチーフ（又は「配列モチーフ」）は、参照ゲノムの特定の位置とは対照的に、配列自体に関する。したがって、同じ末端モチーフは、参照ゲノム全体の多数の位置に生じ得る。末端モチーフは、例えば、開始位置の直前又は終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。

【0057】

図１は、本開示の実施形態による末端モチーフの例を示す。図１は、分析する４ｍｅｒ末端モチーフを定義する２つの方法を示す。技術１４０において、４ｍｅｒ末端モチーフは、血漿ＤＮＡ分子の各末端の最初の４ｂｐ配列から直接構築される。例えば、配列決定された断片の最初の４ヌクレオチド又は最後の４ヌクレオチドが使用され得る。技術１６０において、４ｍｅｒ末端モチーフは、断片の配列決定された末端からの２ｍｅｒ配列及びその断片の末端に隣接するゲノム領域からの他の２ｍｅｒ配列を利用することによって共同で構築される。他の実施形態において、他のタイプのモチーフ、例えば、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ末端モチーフが使用され得る。

【0058】

図１に示すとおり、無細胞ＤＮＡ断片１１０は、例えば、遠心分離などによる血液試料の精製プロセスを使用して取得される。血漿ＤＮＡ断片に加えて、例えば、血清、尿、唾液、及び本明細書で言及されるその他由来の他のタイプの無細胞ＤＮＡ分子が使用され得る。一実施形態において、ＤＮＡ断片は、平滑末端化され得る。

【0059】

ブロック１２０で、ＤＮＡ断片は、対形成末端配列決定に供される。いくつかの実施形態において、対形成末端配列決定は、ＤＮＡ断片の２つの末端から２つの配列リード、例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基を生成し得る。これらの２つの配列リードは、ＤＮＡ断片（分子）の一対のリードを形成し得、各配列リードは、ＤＮＡ断片のそれぞれの末端の末端配列を含む。他の実施形態において、ＤＮＡ断片全体が配列決定され得、それにより、ＤＮＡ断片の両端の末端配列を含む単一の配列リードを提供する。

【0060】

ブロック１３０で、配列リードは、参照ゲノムにアラインメントされ得る。このアラインメントは、配列モチーフを定義するための異なる方法を説明するためのものであり、いくつかの実施形態において使用されない場合がある。アラインメント手順は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｂｏｗｔｉｅ、ＢＷＡ、ＢＦＡＳＴ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＳＡＨＡ２、ＮｏｖｏＡｌｉｇｎ、及びＳＯＡＰなどの様々なソフトウェアパッケージを使用して実施され得る。

【0061】

技術１４０は、ゲノム１４５へのアラインメントを有する、配列決定された断片１４１の配列リードを示す。５’末端を開始とみなして、第１の末端モチーフ１４２（ＣＣＣＡ）は、配列決定された断片１４１の開始にある。第２の末端モチーフ１４４（ＴＣＧＡ）は、配列決定された断片１４１の尾部にある。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片（例えば、血漿ＤＮＡ）の末端優位性を分析する場合、この配列リードは５’末端のＣ末端カウントに寄与する。そのような末端モチーフは、一実施形態において、酵素がＣＣＣＡを認識し、次に最初のＣの直前に切断を行うときに生じ得る。その場合、ＣＣＣＡは優先的に血漿ＤＮＡ断片の末端にある。ＴＣＧＡについては、酵素がそれを認識し、Ａの後に切断を行い得る。

【0062】

技術１６０は、ゲノム１６５へのアラインメントを有する、配列決定された断片１６１の配列リードを示す。５’末端を開始とみなして、第１の末端モチーフ１６２（ＣＧＣＣ）は、配列決定された断片１６１の開始の直前に生じる第１の部分（ＣＧ）、及び配列決定された断片１６１の開始の末端配列の一部である第２の部分（ＣＣ）を有する。第２の末端モチーフ１６４（ＣＣＧＡ）は、配列決定された断片１６１の尾部の直後に生じる第１の部分（ＧＡ）、及び配列決定された断片１６１の尾部の末端配列の一部である第２の部分（ＣＣ）を有する。そのような末端モチーフは、一実施形態において、酵素がＣＧＣＣを認識し、次いで、Ｇ及びＣの直前を切断するときに生じ得る。その場合、ＣＣは、その直前にＣＧが生じている血漿ＤＮＡ断片の末端に優先的に存在し、それによってＣＧＣＣの末端モチーフを提供するであろう。第２の末端モチーフ１６４（ＣＣＧＡ）については、酵素はＣとＧとの間を切断し得る。その場合、ＣＣは優先的に血漿ＤＮＡ断片の末端に存在するであろう。技術１６０について、隣接するゲノム領域及び配列決定された血漿ＤＮＡ断片からの塩基の数を変えられ得、必ずしも固定比率に制限されるとは限らず、例えば、２：２の代わりに、比は、２：３、３：２、４：４、２：４などであり得る。

【0063】

無細胞ＤＮＡ末端のシグネチャに含まれるヌクレオチドの数が多いほど、モチーフの特異性が高くなり、これは、ゲノムにおいて正確な構成で順序付けられた６塩基を有する確率が、ゲノムにおいて正確な構成で順序付けられた２塩基を有する確率よりも低いためである。したがって、末端モチーフの長さの選択は、使用目的の用途に必要な感度及び／又は特異度によって支配され得る。

【0064】

末端配列は、配列リードを参照ゲノムにアラインメントするために使用されるため、末端配列、又は直前／直後から決定された任意の配列モチーフは、依然として末端配列から決定される。したがって、技術１６０は、他の塩基への末端配列の関連を作成し、参照は、その関連を作成するためのメカニズムとして使用される。技術１４０と１６０間の差異は、特定のＤＮＡ断片がどの２つの末端モチーフに割り当てられるかであり、これは、相対頻度についての特定の値に影響を与える。しかし、製造において使用されるものとして一貫した技術がトレーニングデータに使用される限り、全体的な結果（例えば、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度、病理のレベルの分類など）は、ＤＮＡ断片が末端モチーフにどのように割り当てられるかによって影響を受ない。

【0065】

特定の末端モチーフに対応する末端配列を有するＤＮＡ断片のカウントされた数は、相対頻度を決定するためにカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。以下でより詳細に説明するように、無細胞ＤＮＡ断片についての末端モチーフの相対頻度は分析され得る。末端モチーフの相対頻度における差は、種々のタイプの組織及び種々の表現型、例えば種々のレベルの病理について検出されている。この差は、特定の末端モチーフを有するＤＮＡ断片の量又は末端モチーフのセット（例えば、使用される長さに対応するｋ ｍｅｒの全ての可能な組み合わせ）にわたる全体的なパターン、例えば、分散（エントロピーなど、モチーフ多様性スコアとも呼ばれる）によって定量化され得る。

【0066】

ＩＩ．無細胞ＤＮＡにおける不揃いな末端
無細胞ＤＮＡ末端は、末端の様式に応じて２つの形態に分類されるであろう。無細胞ＤＮＡの１つの形態は、平滑末端を有して血液循環に存在し、他の形態は、粘着末端を保有するであろう。粘着末端は、他の鎖にハイブリダイズしていない少なくとも１つの最も外側のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡの末端である。粘着末端は、オーバーハング又は不揃いな末端とも称する。任意の特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、不揃いな末端は、無細胞ＤＮＡがどのように切断、破壊、又は分解されて断片になるかに関連し得ると考えられている。例えば、ＤＮＡは段階的に断片化する場合があり、不揃いな末端のサイズは、断片化の段階を反映することができる。不揃いな末端の数及び／又は不揃いな末端のオーバーハングのサイズを使用して、無細胞ＤＮＡを有する生物学的試料を分析し、試料及び／又は試料が得られた個体に関する情報を提供し得る。

【0067】

図２は、無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハングの程度（すなわち、オーバーハング指数）をどのように推定できるかを示す一例を例示している。ダイアグラム２１０、２２０、２３０は、無細胞ＤＮＡ分子の例を示し、塗りつぶされたロリポップはメチル化ＣｐＧ部位を表し、塗りつぶされていないロリポップは非メチル化ＣｐＧ部位を表す。ダイアグラム２２０及び２３０では、破線は、塗りつぶされていないロリポップを含む、新しく塗りつぶされたヌクレオチドを表す。ダイアグラム２３０では、左から右を指す赤い矢印は、配列決定結果の第１のリード（リード１）を表し、右から左を指すシアン色の矢印は、第２のリード（リード２）を表す。更に、グラフ２４０は、５’から３’までのリード１及びリード２におけるメチル化レベルを示す。式２５０は、無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハング指数を決定する式を示し、式中、Ｒ１が、リード１のメチル化レベルを表し、Ｒ２が、リード２のメチル化レベルを表す。

【0068】

以下のプロセスは、不揃い指数値を使用して生物学的試料を分析する例を示す。生物学的試料は、個体から得ることができる。生物学的試料は、無細胞である複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖に突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。第１の末端は、３’末端又は５’末端であり得る。血漿ＤＮＡ分子における不揃いな末端の分析は、２０１９年７月２３日に出願された米国特許出願公開第２０２０／００５６２４５／Ａ１号（その全体の内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている様々なアプローチを使用して行うことができる。

【0069】

プロセスは、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性を測定することを含み得る。特性は、複数の核酸のうちの各核酸について測定され得る。特性は、本明細書に記載の任意の技法によって測定することができる。

【0070】

特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分における１つ以上の部位でのメチル化状態であり得る。不揃いな末端値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含み得る。

【0071】

いくつかの実施形態において、プロセスは、核酸分子のサイズを測定することを含む。複数の核酸分子は、指定された範囲内のサイズを有し得る。指定された範囲は、１４０～１６０ｂｐ、生物学的試料に存在するサイズの全範囲よりも小さい任意の範囲、又は本明細書に記載の任意の範囲であり得る。サイズ範囲は、より短い鎖又はより長い鎖のサイズに基づき得る。サイズ範囲は、末端修復後の分子の最も外側のヌクレオチドに基づいてもよい。５’末端が突出している場合、５’から３’までのポリメラーゼを介した伸長が起こり、サイズはより長い鎖になり得るであろう。３’から５’までの合成機能を持つＤＮＡポリメラーゼなしで、３’末端が突出している場合、３’末端の突出した一本鎖がトリミングされ、サイズがより短い鎖になり得る。

【0072】

実施形態において、プロセスは、核酸分子を分析してリードを生成することを含み得る。リードは参照ゲノムにアラインメントされ得る。複数の核酸分子は、転写開始部位に対してある特定の距離範囲内で読み取られ得る。

【0073】

プロセスは、複数の核酸分子の測定された特性を使用して不揃い指数値を決定することを含み得る。

【0074】

第１の複数の核酸分子が指定されたサイズ範囲にある場合、方法は、第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の特性を測定することを含み得る。第２の複数の核酸分子は、第２の指定されたサイズ範囲を有するサイズを有し得る。不揃い指数値を決定することは、第１の複数の核酸分子の測定された特性と、第２の複数の核酸分子の測定された特性とを使用して、比を計算することを含み得る。不揃い指数値には、本明細書に記載の不揃いな末端比又はオーバーハング指数比が含まれ得る。

【0075】

プロセスは、不揃い指数値を参照値と比較し得る。参照値又は比較は、トレーニングデータセットを用いた機械学習を使用して決定され得る。比較は、生物学的試料又は個体に関する異なる情報を決定するために使用し得る。

【0076】

プロセスは、比較に基づいて個人の病態のレベルを決定することを含み得る。病態には、疾患、障害、又は妊娠を挙げることができる。病態は、がん、自己免疫疾患、妊娠関連病態、又は本明細書に記載の任意の病態であり得る。例として、がんには、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、又は咽頭がんが含まれ得る。自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を挙げることができる。以下の様々なデータは、病態のレベルを決定するための例を提供する。

【0077】

いくつかの場合では、参照値は、病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。別の例として、参照値は、病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。参照試料から複数の参照値を決定でき、異なる参照値は、病態の異なるレベルを識別する可能性がある。

【0078】

このプロセスは、比較に基づいて生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定することを含み得る。臨床的に関連するＤＮＡとしては、胎児ＤＮＡ、腫瘍由来ＤＮＡ、又は移植ＤＮＡを挙げることができる。参照値は、臨床的に関連するＤＮＡの既知の画分を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して得ることができる。臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定するための方法は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性を測定する前に、複数の核酸分子を、プロトコルによって処理することを含み得る。１つ以上の参照対象からの核酸分子は、測定された特性を有する複数の核酸分子と同じプロトコルによって処理され得る。

【0079】

較正データ点には、測定された不揃い指数値及び臨床的に関連するＤＮＡの測定された／既知の画分が含まれる。別の技法を介して（例えば、組織特異的対立遺伝子を使用して）画分が測定される任意の試料についての測定された不揃い指数値は、参照値に対応することができる。別の例として、検量線（関数）を較正データポイントに適合させることができ、参照値は検量線上のポイントに対応させることができる。したがって、新しい試料の測定された不揃い指数値を較正関数に入力することができ、これにより、臨床的に関連するＤＮＡの画分を出力することができる。

【0080】

ＩＩＩ．ヌクレアーゼの異なる調節
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、がん及び出生前検査のための強力な非侵襲的バイオマーカーであり、血漿（及び他の無細胞試料）中を短い断片として循環する。ｃｆＤＮＡ断片化の生物学を解明するために、これらのヌクレアーゼの各々を欠損したマウスを用いて、ＤＮＡＳＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、及びＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）の役割を調べた。各タイプのヌクレアーゼ欠損マウスにおけるｃｆＤＮＡ断片の末端を野生型マウスのものとともに分析することによって、各ヌクレアーゼが、ｃｆＤＮＡ断片化の段階的なプロセスを明らかにする特定の切断優先度を有することを示した。ＤＮＡの断片化は、まず、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、及び他のヌクレアーゼを用いて細胞内で始まることを示す。次いで、ｃｆＤＮＡ断片化は、循環ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＮＡＳＥ１を用いて細胞外で継続する。ヌクレオソーム構造を破壊するためにヘパリンを使用することで、１０ｂｐの周期性が無傷のヌクレオソーム構造内のＤＮＡの切断に由来したことも示した。要するに、この作業により、ｃｆＤＮＡ断片化のモデルが確立される。

【0081】

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子は、非ランダムで断片化される。ｃｆＤＮＡ断片化パターンがヌクレオソーム構造に関連していることが報告された（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８；１１５：Ｅ５１０６；Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６４：５７－６８）。ｃｆＤＮＡ分子の非ランダム性はまた、特徴的なサイズプロファイルに反映され、約１６６ｂｐにおいてモーダル頻度を示し、より小さな分子は１０ｂｐの周期性を示す一連のピークを形成した（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；２：６１ｒａ９１）。最近、ゲノム位置のサブセットが、血漿ＤＮＡ分子の生成中に優先的に切断されることが見出された（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１６；１１３：Ｅ８１５９－Ｅ８１６８；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８；１１５：Ｅ１０９２５－Ｅ１０９３３）。例えば、肝臓組織に由来する血漿ＤＮＡ断片末端について、多くのゲノム部位が濃縮されるであろう（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８；１１５：Ｅ１０９２５－Ｅ１０９３３）。当時のこれらのデータにより、血漿ＤＮＡ又は無細胞ＤＮＡが特定のゲノム位置、すなわち、ゲノムの特定のゲノム配位において優先的に断片化し得ることが示唆された。遺伝子ノックアウトを有するマウスモデルを使用して、ヌクレアーゼが血漿ＤＮＡの断片化に寄与することを示した。我々は更に、異なるヌクレアーゼが、特徴的な末端モチーフ又はシグネチャを有する血漿ＤＮＡ又は無細胞ＤＮＡ分子と関連していることを示した（Ｓｅｒｐａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１９；１１６：６４１－６４９；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０６：２０２－１４）。言い換えれば、特定のゲノム位置における断片化以外に、これらの観察により、ＤＮＡの配列コンテクストが、特定のヌクレアーゼによるプロセシングの好ましい基質であるかどうかに影響を与え得ることが示唆される。ここでは、様々なヌクレアーゼに関連する無細胞ＤＮＡ末端モチーフをバイオマーカーとして利用するためのアプローチを開発する。ヌクレアーゼ酵素活性は異なる組織にわたって変動し、がん、妊娠、及び臓器移植などの異なる病態生理学的状態によって変化することを示す。特定の疾患状態において異常であるであろう関連するヌクレアーゼに関連する血漿ＤＮＡ断片化シグネチャの選択的分析は、そのような疾患の検出及び監視に使用することができる。

【0082】

関連するヌクレアーゼは、異なる組織にわたる異なる病態生理学的条件に従って発現の変化（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）を有するものとして定義することができる。ヌクレアーゼの異なる調節は、２０１９年１２月１８日に出願された米国出願第６２／９４９，８６７号、及び２０２０年１月８日に出願された米国出願第６２／９５８，６５１号に記載されるアプローチを使用して測定され、その内容全体はあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。これらの組織がＤＮＡを循環に放出された場合、関連するヌクレアーゼの発現レベルの変化の結果として、特定の末端シグネチャを有する血漿ＤＮＡ分子の相対的存在量が変化する。一実施形態において、そのような末端シグネチャの形式は、末端モチーフ及び不揃いな末端を含むことができるが、これらに限定されない。血漿ＤＮＡ分子における末端モチーフは、２０１９年１２月１９日に出願された米国特許出願公開第２０２０／０１９９６５６Ａ１号に記載されるアプローチを使用して測定され、その内容全体はあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。血漿ＤＮＡ分子の不揃いな末端は、２０１９年７月２３日に出願された米国特許出願公開第２０２０／００５６２４５／Ａ１号に記載されるアプローチを使用して測定され、その内容全体はあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0083】

いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼの異なる調節と標的組織タイプの病態（例えば、がん）との間の関係は、ヌクレアーゼと特定の末端サインとの関連についての知識が与えられた場合に、標的組織の病態を有する対象由来の試料中の特定の末端シグネチャを有する無細胞ＤＮＡ分子の量に基づいて予測することができる。例えば、病態を有する対象からの試料について、高量／低量の特定の末端シグネチャは、ヌクレアーゼの異なる調節が標的組織タイプの病態を有する対象において生じていることを示し得る。

【0084】

他の実施形態において、ヌクレアーゼに関連する末端シグネチャは、特定の末端シグネチャを有する無細胞ＤＮＡ分子の量に基づいて予測することができる。例えば、異なって調節されるヌクレアーゼを有する組織から得られた配列リードを使用して、それぞれの末端シグネチャに対応する末端配列を有する配列リードの１つ以上のセットを同定することができる。別の例として、ヌクレアーゼが異なって調節される標的組織の病態を有することが既知である対象の無細胞試料中の高量／低量の特定の末端シグネチャ。

【0085】

Ａ．異常細胞と正常細胞との間のヌクレアーゼの異なる調節
様々な組織タイプ（例えば、肝臓）にわたって、特定のヌクレアーゼは、正常細胞と比較して異常細胞において異なって調節され得る。これは、そのようなヌクレアーゼの発現の増加又は減少をもたらす異常細胞の遺伝子変異に起因し得る。例えば、ＨＣＣ細胞におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現は、正常細胞におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現と比較してダウンレギュレートされる可能性が高い。異常細胞と正常細胞との間のヌクレアーゼ発現におけるこれらの差異を使用して、対象の生物学的試料がその対応するヌクレアーゼ発現に基づいて異常細胞を含むかどうかを予測することができる。

【0086】

図３は、いくつかの実施形態による、ヌクレアーゼ切断末端シグネチャの例を示す。血漿ＤＮＡ断片化プロセスは、マウスモデルにおけるヌクレアーゼ切断に関連することが見出された（Ｓｅｒｐａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１９；１１６：６４１－６４９；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０６：２０２－１４）。１つ以上のヌクレアーゼの遺伝子発現が、がんなどの特定の病態生理学的状態で変化するであろうと仮定する（図３）。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３デオキシリボヌクレアーゼ１様３（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）の発現は相対的にダウンレギュレートされ、ＤＦＦＢＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）、及びＤＮＡＳＥ１デオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮＡＳＥ１）の発現は、健常な対象の肝臓組織と比較して、ＨＣＣ組織において相対的にアップレギュレートされる。したがって、肝臓組織で機能するヌクレアーゼ又は血液循環に入るヌクレアーゼの相対的な活性は異常であり、これにより、血漿ＤＮＡのヌクレアーゼ切断末端シグネチャの存在量が変化する。

【0087】

一実施形態において、局所臓器／組織で機能するヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ断片化での効果は、局所効果（例えば、異なる調節を引き起こす細胞の異常による）として定義されるが、ヌクレアーゼ循環によって引き起こされるＤＮＡ断片化での効果は、全身効果として定義される。ヌクレアーゼ切断末端シグネチャと称するヌクレアーゼ関連切断シグネチャを具体的に分析するために、シグナル対ノイズ比を改善し、したがって、疾患（例えば、がん）を有する患者と有しない患者とを区別する際の性能が向上する。一実施形態において、図３に示すように、一方がアップレギュレートされたヌクレアーゼ（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）に対応し、他方がダウンレギュレートされた核（ＤＦＦＢ）に対応する血漿ＤＮＡプール中の２つのヌクレアーゼ切断シグネチャの比（すなわち、ヌクレアーゼ切断シグネチャ比）を使用することができる。一実施形態において、相対／絶対偏差、相対／絶対パーセンテージ増加、相対／絶対パーセンテージ低下、複数の比又は偏差の線形／非線形の組み合わせなどを含むがこれらに限定されない、他の統計的及び／又は数学的計算を使用して、１つ以上のヌクレアーゼ切断シグネチャを利用することができる。別の実施形態において、ヌクレアーゼには、ＴＲＥＸ１（スリープライム修復エキソヌクレアーゼ１（Ｔｈｒｅｅ Ｐｒｉｍｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ １））、ＡＥＮ（アポトーシス増強ヌクレアーゼ）、ＥＸＯ１（エキソヌクレアーゼ１）、ＤＮＡＳＥ２（デオキシリボヌクレアーゼ２）、ＥＮＤＯＧ（エンドヌクレアーゼＧ）、ＡＰＥＸ１（アプリン／アピリミジンエンドデオキシリボヌクレアーゼ１）、ＦＥＮ１（フラップ（Ｆｌａｐ）構造特異的エンドヌクレアーゼ１）、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１（デオキシリボヌクレアーゼ１様１）、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２（デオキシリボヌクレアーゼ１様２）、及びＥＸＯＧ（エキソ／エンドヌクレアーゼＧ））が含まれるが、これらに限定されない。

【0088】

説明のために、例としてがんを有する又はがんを有さない肝臓のシナリオを用いる。正常な肝臓では、ＤＮＡＳＥ１及びＤＦＦＢよりもＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現が高い。これらのヌクレアーゼは肝臓内で機能し、ＤＮＡ断片化を促進する（ヌクレアーゼの局所効果と称する）。一方、そのようなヌクレアーゼは循環中に受動的又は能動的に放出され、血液循環中のＤＮＡ断片化における役割を有する（ヌクレアーゼの全身効果と称する）。その結果、正常な肝臓を有する対象由来の血漿試料は、ＤＦＦＢ及びＤＮＡＳＥ１に関連するものよりもＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端シグネチャを有するより多くの血漿ＤＮＡ分子を示す。しかしながら、特定の臨床シナリオ、例えばＨＣＣを有する肝臓において、ＨＣＣに罹患した肝臓での異なるヌクレアーゼの発現レベルは異常であるであろう。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３遺伝子発現のダウンレギュレーション並びにＤＮＡＳＥ１及びＤＦＦＢ遺伝子発現のアップレギュレーションは、ＨＣＣを有する肝臓で生じる。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端シグネチャは、がんを有さない患者と比較して、がん患者において相対的に減少し、ＤＮＡＳＥ１関連及びＤＦＦＢ関連の末端シグネチャは、がんを有さない患者と比較して、がんを有する患者において相対的に増加するであろう。これらのヌクレアーゼに関連する末端シグネチャの相乗的プロファイリングのためのアプローチは本開示で実施され、がんなどの疾患を有する患者と有さない患者とを区別するための血漿ＤＮＡ断片シグナルを改善する。一実施形態において、ＤＮＡ切断における局所及び全身効果を有する臓器には、結腸、小腸、胃、腎臓、膀胱、膵臓、脳、肺、唾液腺、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、胸腺、リンパ節、単球、筋肉、心臓、胎盤、卵巣、乳房、及び精巣が含まれるが、これらに限定されない。

【0089】

説明のために、対形成末端配列決定（７５ｂｐ×２（すなわち、対形成末端配列決定）、イルミナ）を行った。健常な対照（ｎ＝３８）、慢性Ｂ型肝炎を有する患者（ｎ＝１７）、ＨＣＣを有する患者（ｎ＝３４）由来の血漿ＤＮＡをそれぞれ配列決定し、対形成末端配列リードの中央値は３，８００万（範囲：１，８００万～６，５００万）であった。結腸直腸がん、肺がん、上咽頭がん、及び頭頸部扁平上皮がんを有する各患者群由来の１０の血漿ＤＮＡ試料の配列決定も行い、対形成末端配列リードの中央値は４，２００万（範囲：１，９００万～６，５００万）であった。

【0090】

一方、野生型マウス（ｎ＝９）、ＤＮＡＳＥ１遺伝子欠失マウス（ｎ＝３）、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３遺伝子欠失マウス（ｎ＝１３）、及びＤＦＦＢ遺伝子欠失マウス（ｎ＝５）由来の血漿ＤＮＡをそれぞれ配列決定した。リード数の中央値は３，５００万（範囲：１，６００万～７，８００万）であった。

【0091】

Ｂ．異なる組織タイプについてのヌクレアーゼの異なる調節
正常細胞から異常細胞を区別することに加えて、ヌクレアーゼ発現を使用して組織タイプを区別することができる。第１の組織タイプから検出されたヌクレアーゼ発現は、第２の組織タイプのヌクレアーゼ発現とは異なり得る。例えば、肝細胞において検出されるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現量は、食道細胞において検出されるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現量よりも相対的に多い。更に、ヌクレアーゼ発現の違いはまた、異なる組織タイプにわたる異常細胞において見出され得る。例えば、異常な肝細胞（例えば、ＨＣＣ）で検出されるＤＦＦＢ発現量は、異常な膀胱細胞（例えば、膀胱尿路上皮がん）で検出されるＤＦＦＢ発現量よりも相対的に少ない。異なる組織タイプ間のヌクレアーゼ発現のこれらの違いを使用して、異常細胞が由来する組織タイプを予測することができる。

【0092】

図４は、いくつかの実施形態による、異なる組織にわたる異なるヌクレアーゼに対応する発現プロファイルの例を示す。例えば、第１の棒プロット４０５は、異なる組織にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現プロファイルを示し、第２の棒プロット４１０は、異なる組織にわたるＤＦＦＢの発現プロファイルを示し、第３の棒プロット４１５は、異なる組織にわたるＤＮＡＳＥ１の発現プロファイルを示す。棒グラフ４０５、４１０、及び４１５の各々において、以下の頭字語は以下を指す：（１）ＢＬＣＡ－膀胱尿路上皮がん、（２）ＢＲＣＡ－浸潤性乳がん、（３）ＥＳＣＡ－食道がん、（４）ＨＮＳＣ－頭頸部扁平上皮がん、（５）ＫＩＰＡＮ－腎色素嫌性型、腎明細胞がん、及び腎乳頭細胞がんを含む、腎汎がん、（６）ＫＩＲＣ－腎明細胞がん、（７）ＬＩＨＣ－ＨＣＣとも称する肝細胞がん、（８）ＬＵＡＤ－肺腺がん、（９）ＬＵＳＣ－肺扁平上皮がん、（１０）ＳＴＡＤ－胃腺がん、（１１）ＳＴＥＳ－胃及び食道がん、（１２）ＴＨＣＡ－甲状腺がん、及び（１３）ＵＣＥＣ－子宮体子宮内膜がん。

【0093】

更に、ＲＰＫＭは、ＲＮＡ配列決定の結果から推定される正規化された遺伝子発現単位である。すなわち、配列決定された１００万のリード当たりのキロベース当たりのリード数である（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８：５１１－５）。図４に示されるように、異なるヌクレアーゼは、異なる組織にわたって異なる発現レベルを有する。例えば、第２棒グラフ４１０におけるＤＦＦＢ発現は、ＨＣＣとＵＣＥＣとの間の差異を示す。

【0094】

更に、異なるヌクレアーゼは、異常組織と正常組織との間で異なる発現レベルを有する。例えば、第１棒グラフ４０５におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現は、隣接する非腫瘍組織（６８．１８ＲＰＫＭ）と比較して、ＨＣＣ／ＬＩＨＣ腫瘍組織（２．８５ＲＰＫＭ）においてダウンレギュレーションを示した（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。一方、ＤＦＦＢ及びＤＮＡＳＥ１の発現は、隣接する非腫瘍組織（０．６６及び０．２３ＲＰＫＭ）と比較して、ＨＣＣ／ＬＩＨＣ腫瘍組織（１．１７及び０．５３ＲＰＫＭ）においてアップレギュレーションを示した（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。

【0095】

Ｃ．無細胞ＤＮＡ末端モチーフに対するヌクレアーゼの異なる調節の影響
末端モチーフは、無細胞ＤＮＡ断片の末端にある多数のヌクレオチド、及び／又は断片末端に近いが末端にはない１つ若しくはいくつかのヌクレオチドによって定義され得る。一実施形態において、断片末端は５’末端を指す。別の実施形態において、断片末端は３’末端を指す。更に他の実施形態において、５’末端及び３’末端の両方が使用される。分析に使用される断片末端におけるヌクレオチド（ｎｔ）の数は、例えば、１ヌクレオチド（ｎｔ）、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、及び１０ｎｔ以上であるが、これらに限定されない。一実施形態において、ヌクレアーゼに関連する末端モチーフは、ヌクレアーゼによって優先的に切断される部位に対応する。別の実施形態において、ヌクレアーゼに関連する末端モチーフは、１つ以上のヌクレアーゼによって優先的に切断される末端モチーフに対応する。別の実施形態において、ヌクレアーゼに関連する末端モチーフは、疾患（例えば、がん）若しくは臨床シナリオ（例えば、移植後）、又は特定の生理学的状態（例えば、妊娠）において過剰に示されるか又は過少に示される末端モチーフによって定義されるであろう。更に別の実施形態において、ヌクレアーゼに関連する末端モチーフは、ヌクレアーゼノックアウトマウス又は他の遺伝子改変動物において過剰に示されるか又は過少に示される末端モチーフによって定義され得る。

【0096】

図５は、本開示の実施形態による、ヌクレアーゼＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３について示される切断優先度を有するｃｆＤＮＡ生成及び消化のモデルを示す。ＤＦＦＢは、Ａ末端が濃縮された新しいｃｆＤＮＡを生成する。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、典型的な末端プロファイル（「プロファイル」とも称する）に見られる主にＣ末端が濃縮されたｃｆＤＮＡを生成する。ＤＮＡＳＥ１は、ヘパリン及び内因性プロテアーゼの助けを得て、ｃｆＤＮＡをＴ末端断片へと更に消化することができる。

【0097】

図５は、細胞内に示されるＤＦＦＢ（緑色のはさみ）及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３（青色のはさみ）を有するアポトーシス細胞を示す。説明文は、異なる塩基についての３つのヌクレアーゼを切断する選択順序を示す。ＤＦＦＢは、細胞内でのみ作用していることが示される。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、血漿中でも作用していることが示される。ヘパリンを有するＤＮＡＳＥ１（赤色のはさみ）は、血漿中で作用していることが示される。末端塩基での得られた断片が、対応するヌクレアーゼについて異なる色で示される。ＤＮＡ分子は、細胞内で切断された後により短くなり、次いで、血漿中で切断された後に更により短くなる。

【0098】

異なるマウスモデルにおけるｃｆＤＮＡ断片末端に関する本研究から、ｃｆＤＮＡを生成した断片化プロセスの概要を示すモデルの全貌を明らかにすることができる。ＥＤＴＡ中で全血をインキュベートした後に自発的に作られた新たに放出されたｃｆＤＮＡの我々の分析において、新鮮でより長いｃｆＤＮＡが、Ａ末端断片が濃縮されていることを実証した。特に、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、及びＡ＜＞Ｃ断片は、約２００ｂｐ及び４００ｂｐで強いヌクレオソーム周期性を実証する。この同じ実験モデルがＤＦＦＢ欠損マウスの全血に適用されると、長いＡ末端断片の濃縮は見られない。したがって、ＤＦＦＢがこれらのＡ末端断片の生成に関与している可能性が高いと結論付けることができる。

【0099】

この仮説は、アポトーシス中のＤＮＡ断片化において主要な役割を果たすＤＦＦＢ酵素について発表された文献によって実証されている（Ｅｌｍｏｒｅ，Ｓ．（２００７），Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５，４９５－５１６；Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０）。酵素の特徴付け研究により、ＤＦＦＢが、Ａ及びＧヌクレオチド（プリン）を好んで、開いたヌクレオソーム間ＤＮＡ領域に平滑二本鎖切断をもたらすことが示されている（Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０；Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４，１０７８－１０８７；Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５，８２２６－８２３２））。ヌクレオソーム間リンカー領域のみにおける平滑二本鎖切断のこの生物学は、例えば、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、及びＡ＜＞Ｃ断片におけるヌクレオソームパターン形成を説明している。

【0100】

本研究では、インキュベーション前に取得された血漿中の典型的なｃｆＤＮＡが、全ての断片サイズにわたって主にＣで終わることも実証しており、このＣ末端の過剰表現は、ゲノム全体にわたって複数の異なる領域で一致している。ｃｆＤＮＡの典型的なプロファイルは、新鮮なｃｆＤＮＡとは非常に異なるため、１）１つ以上の追加のヌクレアーゼがこのプロファイルを作ること、２）このヌクレアーゼ又はこれらのヌクレアーゼが典型的なｃｆＤＮＡの切断プロセスで優位に立つこと、及び３）このプロセスが新鮮なＡ末端断片の生成後に主に生じることを推測することができる。

【0101】

このＣ末端優位性は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損マウスにおいて失われるため、このＣ末端断片の過剰発現に関与する１つのヌクレアーゼは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３であると考えられる。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の特定のヌクレオチド切断選択を調査する既存の酵素研究はないが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、タンパク質分解の助けなしにほとんど検出できないレベルまで高効率でクロマチンを切断することが知られている（Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３）、Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｅｌｌ １６６，８８－１０１）。全ての断片サイズ間でＣ末端断片がかなり均一に存在することは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３が全てのＤＮＡ、更にはヌクレオソーム内ＤＮＡを効率的に切断することができることを示唆する。

【0102】

ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、興味深い特性を有し、これは、小胞体で発現して、主要な血清ヌクレアーゼのうちの１つとして細胞外に分泌され、またアポトーシスが誘導された後、その小胞体を標的とするモチーフが切断されると核に移行する（Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８）、Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４））。アポトーシス細胞内エンドヌクレアーゼとしてのその役割において、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、ＤＮＡ断片化においてＤＦＦＢと協働することが示唆されている（Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８）、Ｋｏｙａｍａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２１，１１５０－１１６３））。新鮮なｃｆＤＮＡの断片末端プロファイルをＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損マウスのものと比較すると、Ａ末端断片、特にＡ＜＞Ｃフラグメントにおいて周期性の顕著な減衰がある。この減衰は、ＷＴ対ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損マウスにおいてアポトーシスから新たに断片化されたＤＮＡの生成中のＤＮＡＳＥ１Ｌ３の共存する細胞内活性によるものである。

【0103】

血漿ヌクレアーゼとして、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、アポトーシス後に食作用を免れた循環中のＤＮＡを消化するのに役立つ。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、細胞内断片化が生じた後、断片化されたｃｆＤＮＡに対して効果を発揮する可能性が高い。理論的な２ステッププロセスにおいて、第２のステップを阻害することは、第１のステップの通常は一時的な結果が明らかにするはずである。したがって、本質的に、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損マウスの血漿は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３作用のこの第２のステップを阻害し、第１のステップのｃｆＤＮＡプロファイルであるアポトーシスからの細胞内ＤＮＡ断片化を明らかにする。これはまさに我々が発見したものであり、新しく生成されたｃｆＤＮＡに見出されるものと非常に類似したｃｆＤＮＡ断片プロファイルを有する。したがって、血漿内でのＤＮＡＳＥ１Ｌ３消化は、典型的な恒常性ｃｆＤＮＡをもたらす後続のステップになり得る。

【0104】

ＤＮＡＳＥ１欠損マウスからのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルが、ＷＴマウスのものと実質的に異なるようでなかったことを以前に発見したが、ＤＮＡＳＥ１は、「裸の」ＤＮＡの切断を好むことが既知であり、インビボでタンパク質分解の助けを得てクロマチンを切断することだけできる（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１８），Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６４，４０６－４０８；Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３））。ヘパリンを使用してインビボプロテアーゼの機能に取って代わり、ＤＮＡＳＥ１活性を強化することで、ＤＮＡＳＥ１がＴ末端断片へとＤＮＡを切断することを好むことを実証している。ヘパリンインキュベーションによるＴ末端断片の増加は、主に下位ヌクレオソームサイズ（５０～１５０ｂｐ）であり、ＤＮＡＳＥ１が短い１５０ｂｐ未満の断片の生成において役割を果たすことを示唆している。ＤＮＡＳＥ１が裸のＤＮＡをＴ末端断片に切断することを好むことが知られているため、典型的なｃｆＤＮＡプロファイルから、５０～１５０ｂｐ及び２５０～３００ｂｐの範囲のＴ末端断片ピークが、ほとんど裸であり得ると推測することができる。これらのサイズがサブヌクレオソーム断片又はリンカー断片に対応することは可能であり得るが、この仮説を更に調べるために、より研究を行う必要がある。

【0105】

ヘパリンインキュベーション及び末端分析の使用はまた、１０ｂｐの周期性の起源への独特の洞察を提供している。全ての断片タイプが１０ｂｐの周期性を実証するために、短い断片における１０ｂｐの周期性に完全に関与する特定のヌクレアーゼはないことを示す。代わりに、全ての断片タイプについて、ヘパリンが使用されると１０ｂｐの周期性が破壊される。ＤＮＡＳＥ１活性を増強することに加えて、ヘパリンは、ヌクレオソーム構造を破壊する（Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．（１９９２），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ２８８（Ｐｔ３），９５３－９５８）。多くの人が、１０ｂｐの周期性が無傷のヌクレオソーム構造内のＤＮＡの切断に由来すると仮定しているが、本研究が裏付けとなる証拠を提供し、破壊されたヌクレオソームの存在下では１０ｂｐの周期性が生じないことを示すと考えている。

【0106】

近年、Ｗａｔａｎａｂｅらは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＦＦＢ欠損マウスにおけるアセトアミノフェンの過剰投与及び抗Ｆａｓ抗体治療により、インビボ肝細胞壊死及びアポトーシスを誘導した（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１６，７９０－７９５）。Ｗａｔａｎａｂｅらは、ｃｆＤＮＡがＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＦＦＢによって生成されることを示したと主張しているが、彼らのデータは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３及びＤＦＦＢダブルノックアウトマウスにおける肝細胞損傷後に血清ｃｆＤＮＡが増加しているようではないことを示すだけである。その場合でさえ、彼らの方法からの肝細胞損傷の程度は、野生型でも大きく変動し、彼らのアポトーシス抗Ｆａｓ抗体実験におけるｃｆＤＮＡ量との相関は驚くほど低い。ノックアウトマウスにおいて誘導されるアポトーシスの程度に不確実性を与えるこれらの不一致に加えて、彼らは、本研究で提供された断片末端に関する詳細をなにも有していない。

【0107】

本研究において、典型的なｃｆＤＮＡ断片が、２つの主要なステップ：１）ＤＦＦＢ、細胞内ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、及び他のアポトーシスヌクレアーゼによる細胞内ＤＮＡ断片化、並びに２）血清ＤＮＡＳＥ１Ｌ３による細胞外ＤＮＡ断片化で作ら得ることを実証している。次いで、おそらくインビボタンパク質分解により、ＤＮＡＳＥ１は、ｃｆＤＮＡを短いＴ末端断片へと更に分解することができる。この最初のモデルは、ｃｆＤＮＡ生成に関与する多くの主要なヌクレアーゼを含んでいたと考えられるが、モデルは、将来更に改良され得る。例えば、他の潜在的なアポトーシスヌクレアーゼには、エンドヌクレアーゼＧ、ＡＩＦ、トポイソメラーゼＩＩ、及びシクロフィリンが含まれ、おそらく更に発見されるであろう（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（２０１８），Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６，４８９－５１７、Ｓａｍｅｊｉｍａ，Ｋ．ａｎｄ Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，６７７－６８８、Ｙａｎｇ，Ｗ．（２０１１），Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４４，１－９３）。ダブルノックアウトモデルを用いたこれらのヌクレアーゼの更なる研究は、このモデルを更に改良し、Ｇ末端選択を有するヌクレアーゼを明らかにし得る。本質的に、本研究において、異なるヌクレアーゼの作用をｃｆＤＮＡ断片末端プロファイルに明確に関連付けて、基礎生物学及びｃｆＤＮＡ断片の生物学を明らかにしている。

【0108】

ヌクレアーゼ生物学とｃｆＤＮＡ生理学との間のこの関連性が確立されたことで、ｃｆＤＮＡの分野に多くの重要かつ実用的な影響がある。第一に、病理学的結果を伴うヌクレアーゼ生物学の異常は、異常なｃｆＤＮＡプロファイルに反映され得る（Ａｌ－Ｍａｙｏｕｆ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４３，１１８６－１１８８；Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ａｌｃａｚａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８，１２０２－１２０６；Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６５，２１８３－２１８９））。第二に、血漿末端モチーフ分析は、ｃｆＤＮＡ生物学を調査するための強力なアプローチであり、診断用途があり得る。そして最後に、抗凝固剤のタイプ及び血液分離の時間遅延などの分析前の変数は、エピジェネティック情報及び遺伝情報についてｃｆＤＮＡをマイニングするときに覚えておくべき重要な交絡因子である。

【0109】

Ｄ．無細胞ＤＮＡにおける不揃いな末端に対するヌクレアーゼの異なる調節の効果
不揃いな末端を有する無細胞ＤＮＡ分子について、末端モチーフは、二本鎖ＤＮＡ分子に結合した一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチによって定義することができる。そのような一本鎖ＤＮＡ分子の長さは、例えば、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、及び１０ｎｔ以上であり得るが、これらに限定されない。一実施形態において、ヌクレアーゼ関連不揃いな末端は、ヌクレアーゼ認識部位に対応する。別の実施形態において、ヌクレアーゼ関連不揃いな末端は、１つ以上のヌクレアーゼによって優先的に生成される不揃いな末端に対応する。別の実施形態において、ヌクレアーゼ関連不揃いな末端は、疾患において過剰に示されるか又は過少に示される不揃いな末端によって定義されるであろう。

【0110】

更に別の実施形態において、ヌクレアーゼ関連不揃いな末端は、ヌクレアーゼノックアウトマウス又は他の遺伝子改変動物において過剰に示されるか又は過少に示される不揃いな末端によって定義され得る。不揃いな末端の量は、ＤＮＡ末端修復ステップ中のメチル化又は非メチル化シトシンの充填に基づくアプローチ（例えば、米国特許出願公開第２０２０／００５６２４５号に記載）又はオリゴヌクレオチドプローブに基づくハイブリダイゼーションに基づくアプローチ（Ｈａｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０２０；４８：ｅ４７）を含むがこれらに限定されない、多くの技法で測定することができる。無細胞ＤＮＡ分子に存在する不揃いな末端の量は、不揃い指数値と称する。ＤＮＡ末端修復ステップ中のメチル化シトシンの充填によって推定される不揃い指数値［すなわち、対形成末端配列決定反応のリード２のＣＨ部位（Ｈ：Ａ、Ｃ、Ｔ）でのメチル化シグナルのパーセンテージ］は、ＪＩ－Ｍ（すなわち、不揃い指数値－メチル化）と称する。ＤＮＡ末端修復ステップ中の非メチル化シトシンの充填によって推定される不揃い指数値（すなわち、リード２のＣＧ部位での非メチル化シグナルの減少したパーセンテージ）は、ＪＩ－Ｕ（すなわち、不揃い指数値－非メチル化）と称する。

【0111】

ＩＶ．ヌクレアーゼの異なる調節に基づく末端シグネチャ分析
ヌクレアーゼ発現は正常細胞から異常細胞を同定するために使用することができるが、ヌクレアーゼ発現レベルの分析には侵襲的な手順が必要になり得る。更に、ＲＮＡ配列決定などの技法は、精度が低くなり得る。上記を考慮すると、疾患診断の目的のためにヌクレアーゼ発現を安全かつ正確に検出することは困難である。これらの欠陥を克服するために、本開示の実施形態は、特定のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１）が特定の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へとＤＮＡを優先的に切断することを決定し、配列末端シグネチャを含む配列リードの量を決定し、その量を使用して、生物学的試料に対応する組織の異常レベルの分類を予測する。

【0112】

Ａ．対象における異常細胞の検出
一実施形態において、ヌクレアーゼ切断シグネチャ（例えば、特定のヌクレアーゼの優先的切断）は、がんを有する対象と有さない対象との間の血漿ＤＮＡ末端モチーフ（例えば、血漿ＤＮＡの末端の４ｎｔ配列）を分析することによって同定することができる。一実施形態において、モチーフは、１つ以上のヌクレアーゼの遺伝子発現パターン及び１つ以上のヌクレアーゼの好ましい切断配列に基づいて選択することができる。一例では、様々なヌクレアーゼ欠失マウスモデルで明らかにされているように（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０６：２０２－１４）、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３酵素は、ＤＮＡ分子を切断する場合に５’Ｃ末端断片を優先的に作成することが既知であり、ＤＦＦＢ酵素は、ＤＮＡ分子を切断する場合に５’Ａ末端断片を優先的に作成することが既知であり、ＤＮＡＳＥ１酵素は、ＤＮＡ分子を切断する場合に５’Ｔ末端断片を優先的に作成することが既知である。一実施形態において、Ｃが末端である末端モチーフは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャとして定義され、Ａが末端である末端モチーフは、ＤＦＦＢ切断シグネチャとして定義され、Ｔが末端である末端モチーフはＤＮＡＳＥ１切断シグネチャとして定義され得る。

【0113】

したがって、アップレギュレートされたヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）に関連する末端モチーフの存在量によって正規化された、ダウンレギュレートされたヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）に関連する末端モチーフの存在量、又はその逆は、関連する組織の生理学的又は病理学的病態を反映すると仮定した。一実施形態において、相対偏差／絶対偏差、相対パーセンテージ増加／絶対パーセンテージ増加、相対パーセンテージ減少／絶対パーセンテージ減少、複数の比又は偏差の線形結合／非線形結合などを含むがこれらに限定されない、１つ以上のヌクレアーゼ切断シグネチャを利用するための他の統計的及び／又は数学的計算を使用することができる。

【0114】

図６は、いくつかの実施形態による、組織の生理学的状態又は病理学的状態を決定するための特定の末端シグネチャを有する無細胞ＤＮＡ分子の例示的な分布を示す。この目的のために、健常者と比較してＨＣＣ患者において頻度が減少した５’Ｃ末端（ヌクレアーゼＤＮＡＳＥ１Ｌ３で優先される）を有する末端モチーフと、健常な対象と比較してＨＣＣ対象において頻度が増加した５’Ａ末端を有する末端モチーフ（ヌクレアーゼＤＦＦＢで優先される）又はＴ末端を有する末端モチーフ（ヌクレアーゼＤＮＡＳＥ１で優先される）と、に注目した。図６において、３つのアスタリスク＊＊＊は、０．００１未満であるｐ値を表し、２つのアスタリスク＊＊は、０．０１未満であるｐ値を表す。灰色の破線は、１／２５６の頻度を示す。一実施形態において、非ＨＣＣ対象と比較して、ＣＣＣＡ末端モチーフはＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャとして定義することができ、ＡＡＡＡ末端モチーフはＤＦＦＢ切断シグネチャとして定義することができ、ＴＴＴＴはＤＮＡＳＥ１切断シグネチャとして定義することができる（図．６）。一実施形態において、ＤＮＡ断片の他の位置において３’Ａ末端、Ｃ末端、Ｔ末端、若しくはＧ末端、又は塩基組成を有する末端モチーフに着目する。例えば、結合親和性の高いヌクレアーゼ認識部位が切断部位よりも保存的である場合、結合部位で発生するモチーフに着目した末端シグネチャシグナルはより特異的であるであろう。

【0115】

いくつかの実施形態において、血漿ＤＮＡ末端モチーフプロファイルは、疾患を有する患者及び疾患を有さない患者から収集された生物学的試料に基づいて決定される。特に、生物学的試料は、そのような疾患に罹患した臓器のヌクレアーゼ発現プロファイルを評価するために分析される。更に又はあるいは、特定の疾患を有する又は有さない特定の組織に由来する細胞株は、細胞アポトーシスの誘導の際のヌクレアーゼ発現レベル及びＤＮＡ末端モチーフを（例えば、薬理学的薬剤、抗体、放射線などの使用によって）評価するために分析することができる。いくつかの場合では、細胞株又は動物対象における遺伝子発現、例えば、特定のヌクレアーゼの発現を弱めるためにｓｉＲＮＡを改変し、得られた血漿ＤＮＡを分析することによって、血漿ＤＮＡ末端モチーフプロファイルを決定することができる。

【0116】

図７Ａ及び７Ｂは、いくつかの実施形態による、異なる組織群にわたるモチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を示す箱ひげ図を示す。一実施形態において、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比と称する、ＤＦＦＢ切断シグネチャに対するＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャの比を、診断、例えば、がん検出のための１つのメトリックとして使用した。更に、図７Ａ及び７Ｂの各々は、以下の対象カテゴリー：（ｉ）「対照」－健康な対照対象、（ｉｉ）「ＨＢＶ」－Ｂ型肝炎ウイルスによる慢性感染、及び（ｉｉｉ）「ＨＣＣ」－肝細胞がんを有する対象についての結果を示す。

【0117】

一実施形態において、対照対象での５パーセンタイルの比を閾値として使用した場合、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用することによって、ＨＣＣを有する患者のうちの８．８％のみが正常対象として誤分類される。一方、モチーフ多様性スコア（ＭＤＳ）を使用することよって、ＨＣＣを有する患者のうちの２９．４％が正常な対象として誤分類される。モチーフの多様性スコアは以下のように定義された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０；１０：６６４－６７３）：

【0118】

【数1】

【0119】

式中、Ｐｉは、特定のモチーフの頻度である。ＭＤＳ値が高いほど、多様性が高い（すなわち、ランダム性の度合いが高い）ことを示す。理論的なスケールの範囲は０～１である。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比により、対象をがん、例えば、ＨＣＣを有するものとして分類する精度が増す。

【0120】

図８は、いくつかの実施形態による、末端シグネチャの検出のための異なるパラメータを評価するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。これらの結果により、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用した性能が、最近報告されたＭＤＳメトリックを使用した性能よりも優れているであろうことが示唆された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０；１０：６６４－６７３）。このような結論は、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析によって更に裏付けられ（図８）、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比に基づく分析の曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ：０．９６）は、ＭＤＳ分析（ＡＵＣ：０．８６；Ｐ値＜０．０１、ブートストラップ検定）及びＣＣＣＡ％分析（ＡＵＣ：０．９１；Ｐ値＝０．０５、ブートストラップ検定）より大きかった。これらの結果により、目的の組織／臓器における異常なヌクレアーゼと関連付けられるモチーフの選択が、がんを有する患者とがんを有さない患者とを区別する際の識別力を改善し、患者の臨床状態がより良好に同定されることが示唆された。

【0121】

図９は、いくつかの実施形態による、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ、ＤＦＦＢ切断シグネチャ、及びＤＮＡＳＥ１切断シグネチャの三次元散布図を示す。ｘ軸はＤＦＦＢ切断シグネチャ（ＡＡＡＡ）を示し、ｙ軸はＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ（ＣＣＣＡ）を示すし、ｚ軸はＤＮＡＳＥ１切断シグネチャ（ＴＴＴＴ）を示す。更に、ドット９０２（例えば、「ＨＣＣ」）は、ＨＣＣを有する対象の末端切断シグネチャを表し、ドット９０４（例えば、「ＨＢＶ」）は、慢性ＨＢＶ感染を有する対象の末端切断シグネチャを表し、ドット９０６（例えば、「対照」）」）は、健常な対象の末端切断シグネチャを表す。影付き領域９０８は、がんを有する対象とがんを有さない対象とを区別するために使用された分類超平面を示す。

【0122】

図９に示すように、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１ヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない、３つ以上のヌクレアーゼ切断シグネチャを使用して評価を行った。図９に示されるように、ＨＣＣ対象は、健常な対照及び慢性ＨＢＶ感染を有する患者を含む非ＨＣＣ対象から逸脱した。３次元プロットにおいて分類超平面（－８．６＊ｘ＋２．６＊ｙ－３．２＊ｚ＋４．８＝０）を設定したときに、ＨＣＣを有する対象とＨＢＶを有する対象又は健常な対象とを識別するために９１．１％の感度及び９６．４％の特異性を達成することができた。一実施形態において、血漿ＤＮＡにおけるヌクレアーゼ切断シグネチャの使用は、化学療法、放射線療法、免疫療法、及び標的療法を含む療法中の患者の反応を監視するための予後マーカーとして役立つ。

【0123】

図１０は、いくつかの実施形態による、ロジスティック回帰を使用してＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ、ＤＦＦＢ切断シグネチャ、及びＤＮＡＳＥ１切断シグネチャを決定する性能レベルを示すＲＯＣグラフを示す。一実施形態において、多くのヌクレアーゼ切断シグネチャを選択的に利用するために、例えば、ロジスティック回帰、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木、単純ベイズ分類、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、特異値分解（ＳＶＤ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）、人工ニューラルネットワーク、及び分類子のセットを構成し、次いでそれらの予測の加重投票を行うことによって新たなデータ点を分類するアンサンブル方法を含むがこれらに限定されない、異なる統計的アプローチを使用することができる。図１０に示されるように、３つのヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１）の３つの切断末端シグネチャを利用することによってロジスティック回帰分析及びＳＶＭモデルを使用することにより、ＨＣＣを有する対象をそれぞれ０．９４及び０．９３のＡＵＣを有する非ＨＣＣ対象と区別することができた。０．８５の回帰スコアを使用して、９４％の感度及び９３％の特異性が達成された。

【0124】

図１１は、いくつかの実施形態による、２つの血漿末端モチーフの比（ＡＣＧＡ／ＣＣＣＧ）を示す箱ひげ図を示す。一実施形態において、血漿ＤＮＡ末端シグネチャの全ての組み合わせを列挙して、臓器移植、妊娠、がん、免疫関連疾患、及び他の疾患を含む、ヌクレアーゼ活性の異常なプロファイルに関連する疾患を有する患者と疾患を有さない患者とを区別するための最適な組み合わせを決定することにより、ヌクレアーゼ切断シグネチャを定義することができた。一例として、任意の２つの末端モチーフ間の頻度比に関する全ての組み合わせを列挙することができる。２５６のモチーフがあり、３２，６４０の組み合わせが得られる。任意の２つの末端モチーフ間の３２，６４０の頻度比の中で、ＣＣＣＧ末端モチーフに対するＡＣＧＡ末端モチーフの頻度比は、ＨＣＣ患者において増加し（図１１）、ＨＣＣを有する患者（ｎ＝３４）とＨＣＣを有さない患者（ｎ＝５５）を区別する際に最も識別力が高く、ＡＵＣは０．９９であった。

【0125】

一方、結腸直腸がん、肺がん、上咽頭がん、及び頭頸部扁平上皮がんを含む他のがん患者を検出するために、ＴＣＡＡ末端モチーフに対するＡＧＴＡ末端モチーフの頻度比が最も識別力が高く、ＡＵＣは０．９８であった。一実施形態において、ＴＣＡＡ末端モチーフに対するＡＧＴＡ末端モチーフの頻度比は、結腸直腸がんを有する患者と結腸直腸がんを有さない患者とを区別するときに、０．９９の最高のＡＵＣを示した。ＧＡＧＡ末端モチーフに対するＣＡＴＣ末端モチーフの頻度比は、肺がんを有する患者と肺がんを有さない患者とを区別するときに、最高のＡＵＣ１を示した。ＧＡＡＣ末端モチーフに対するＣＡＣＴ末端モチーフの頻度比は、頭頸部扁平上皮がんを有する患者と頭頸部扁平上皮がんを有さない患者とを区別するときに、最高のＡＵＣ１を示した。

【0126】

１．野生型マウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスと間の末端シグネチャ比分析
図１２は、いくつかの実施形態による、野生型マウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスとの間の２つの血漿末端モチーフの比（ＡＣＧＡ／ＣＣＣＧ）を示す箱ひげ図を示す。一実施形態において、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１などであるがこれらに限定されない１つ以上のヌクレアーゼ遺伝子を欠失しているマウスと欠失していないマウスとの間の４ｎｔ末端モチーフを分析することによって、ヌクレアーゼ切断シグネチャを定義又は確認することができた。例えば、ＣＣＣＧ末端モチーフに対するＡＣＧＡ末端モチーフの比の増加は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスでも確認された（図１２）。これらの結果により、ＨＣＣを有する患者におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３のダウンレギュレーションによって潜在的に引き起こされた特定の末端モチーフ比の変化が、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスで直交的に反映され得ることが示唆された。一実施形態において、末端モチーフ比の変化パターンのそのような直交的な確認によって、ヒトの臨床評価のための有益な末端モチーフ比を決定することが可能になる。

【0127】

図１３は、いくつかの実施形態による、野生型マウス（ＤＦＦＢ^＋／＋）とＤＦＦＢ欠失マウス（ＤＦＦＢ^－／－）との間のＡＡＡＴ末端モチーフを有する血漿ＤＮＡ断片のパーセンテージを示す。一実施形態において、図１３に示すように、ＤＦＦＢ（ＤＦＦＢ^－／－）が欠失したマウスの血漿ＤＮＡにおけるＡＡＡＴ末端モチーフを有する分子の頻度（中央値：０．７０％；範囲：０．６６～０．７４％）は、野生型マウス（ＤＦＦＢ^＋／＋）よりも低くなる（中央値：０．６６％；範囲：０．６４～０．７％）ことが見出された。

【0128】

２．ヒト対象の正常細胞と異常細胞との間の末端シグネチャ比分析
図１４は、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有するヒト対象とＨＣＣを有さないヒト対象との間のＡＡＡＴ末端モチーフを有する血漿ＤＮＡ断片のパーセンテージを示す。そのようなＡＡＡＴ末端モチーフは、ＨＣＣを有さない対象と比較して、ＨＣＣを有するヒト患者において上昇することが見出された（図１４）。ＨＣＣ組織におけるＤＦＦＢ発現の相対的上昇を考慮すると（図４Ｂ）、一実施形態において、末端モチーフＡＡＡＴは、ＤＦＦＢ切断シグネチャとみなすことができる。

【0129】

いくつかの実施形態において、特定の末端モチーフ（例えば、ＡＡＡＴ）は、特定の末端モチーフの量の増加又は減少が、対応するヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）の量の増加又は減少にそれぞれ実質的に対応するという決定に基づいて、複数の既知の末端モチーフから選択される。更に又はあるいは、異なる統計的アプローチを使用して、対応するヌクレアーゼの切断シグネチャを表す可能性が高い末端モチーフを選択的に同定することができる。異なる統計的アプローチには、ロジスティック回帰、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木、単純ベイズ分類、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、特異値分解（ＳＶＤ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）、人工ニューラルネットワーク、分類子のセットを構成し、次いでそれらの予測の加重投票を行うことによって新たなデータ点を分類するアンサンブル方法が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0130】

図１５Ａは、いくつかの実施形態による、ヒト健常対照対象（ＣＴＲ）、慢性Ｂ型肝炎感染（ＨＢＶ）を有する対象、及びＨＣＣを有する対象（ＨＣＣ）にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比の値の箱ひげ図を示し、図１５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比（密な破線）、末端モチーフＣＣＣＡを有する断片のパーセンテージ（ＣＣＣＡ、緩い破線）、及びモチーフ多様性スコア（ＭＤＳ、実線）を使用した、ＨＣＣを有する患者とＨＣＣを有さない患者との間のＲＯＣ曲線を示す。いくつかの場合では、血漿ＤＮＡにおける末端モチーフＣＣＣＡと末端モチーフＡＡＡＴとの比をＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比として定義することができる。

【0131】

図１５Ａは、健常な対照及びＢ型肝炎ウイルス保有者と比較して、ＨＣＣを有する患者の血漿に存在するＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比がより低かったことを示している。図１５Ｂは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比メトリック（曲線下面積（ＡＵＣ）：０．９６）が、ＣＣＣＡ末端モチーフ（ＡＵＣ：０．９１）及びＭＤＳ（ＡＵＣ：０．８６）よりも優れていたことを示す。これらの結果により、ＨＣＣ、他のがん、更には他の疾患を有する患者と有さない患者をより効果的に区別するための新しい方法を考案するために、ヌクレアーゼによって優先的に切断される末端モチーフ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３によって優先的に切断されるＣＣＣＡモチーフ）と、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）が遺伝子型が改変されたマウスにおいて変更された末端モチーフと、に関する情報を使用することができることが示唆された。他の実施形態は、ＴＲＥＸ１、ＡＥＮ、ＥＸＯ１、ＤＮＡＳＥ２、ＤＮＡＳＥ１、ＥＮＤＯＧ、ＡＰＥＸ１、ＦＥＮ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、及びＥＸＯＧを含むがこれらに限定されない他のヌクレアーゼに適用することができる。

【0132】

３．子癇前症を有する又は子癇前症を有さない妊娠中の対象間の末端シグネチャ比分析
特定のヌクレアーゼは、子癇前症を有さない対象と比較して、子癇前症を有する対象において異なって調節され得ることが示されている。例えば、以前に公開された研究（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１１；９：１０７；Ｇｏｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１７；２１７：２００．ｅ１－２００．ｅ１７）ではマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイリングデータセットを分析することによって、子癇前症を有する妊娠中の対象では、正常血圧を有する対照妊婦と比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルが６％ダウンレギュレートされることが見出された。対照的に、ＤＮＡＳＥ１発現レベルは、非感染の早産と比較して、子癇前症を有する妊娠中の対象において５．７％アップレギュレートされることが見出された。したがって、特定のヌクレアーゼの１つ以上の末端切断シグネチャを使用して、妊娠中の対象が子癇前症を有するかどうかを予測するパラメータを決定することができる。

【0133】

ＤＮＡＳＥ１切断末端シグネチャ（例えば、チミンヌクレオチドで終結する断片）とＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断末端シグネチャ（例えば、シトシンヌクレオチドで終結する断片）との間の比は、子癇前症を有する妊婦と子癇前症を有さない妊婦とを区別するために使用することができる。

【0134】

図１６は、対照対象（例えば、子癇前症を有さない妊娠中の対象）及び子癇前症を有する妊娠中の対象にわたるＤＮＡＳＥ１／ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ比値の箱ひげ図を示す。図１６において、ＤＮＡＳＥ１切断末端シグネチャは配列ＴＡＡＴに対応し、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断末端シグネチャはＣＧＴＡに対応する。次世代配列決定法（短いリード対形成末端配列決定（ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、イルミナ）を使用して、子癇前症を有する妊娠中の対象（ｎ＝４）及び子癇前症を有さない妊娠中の対象（ｎ＝１０）について配列決定し、マッピングされたリードの中央値は４，２００万であった（範囲：２，１００万～５，０００万）。

【0135】

図１６に示される例を続けると、子癇前症を有する妊婦のＣＧＴＡ末端モチーフ頻度に対するＴＡＡＴの比の中央値（中央値：７．３９；範囲：６．２７～７．８４）は、対照対象の比の中央値（中央値：５．２１；範囲４．９０～６．１１））よりも高い（Ｐ値＝０．００１；マン・ホイットニーのＵ検定）。したがって、ＤＮＡＳＥ１／ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ比の値は、子癇前症を有する妊婦と子癇前症を有さない妊婦とを区別するのに有利であり得る。

【0136】

４．組織タイプにおける異常レベルを決定する方法
図１７は、いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて生物学的試料における異常レベルを分類するための方法を示すフローチャートである。いくつかの場合では、生物学的試料は無細胞ＤＮＡ分子を含む。異常は、がん（例えば、肝細胞がん、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、頭頸部扁平上皮がんなど）、及び自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス）を含む病理であり得る。いくつかの場合では、生物学的試料における異常は、子癇前症、早産、胎児染色体異数性、又は胎児遺伝性障害を含む、胎盤組織（例えば、母体血漿中に検出される胎盤組織）の異常である。

【0137】

ステップ１７０２において、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、１つ以上の組織タイプの異常細胞において異なって調節される第１のヌクレアーゼが同定される。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現は、健常な対象の肝臓組織と比較して、ＨＣＣ細胞において相対的にダウンレギュレートされている。いくつかの場合では、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、１つ以上の組織タイプの異常組織細胞において異なって調節される第２のヌクレアーゼも同定される。例えば、ＤＦＦＢ及びＤＮＡＳＥ１の発現は、健常な対象の肝臓組織と比較して、ＨＣＣ細胞で相対的にアップレギュレートされている。

【0138】

ステップ１７０４において、第１のヌクレアーゼは、他の配列末端シグネチャと比較して第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断するように決定される。例えば、ヌクレアーゼで切断されたシグネチャは、がんを有する対象と有さない対象との間の血漿末端モチーフ（例えば、血漿ＤＮＡの末端における４－ｎｔ配列）を分析することによって同定することができる。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、別の生物（例えば、マウス）の生物学的試料を分析することによって決定される。

【0139】

ステップ１７０６において、配列リードを取るために、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ断片が分析される。いくつかの実施形態において、対形成末端配列決定を使用して、ＤＮＡ断片の２つの末端から２つの配列リード、例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基を得る。本明細書に記載されるように、配列リードは、例えば、配列決定技法を使用して（例えば、合成による配列決定アプローチ（例えば、イルミナ）、又は単一分子配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイムシステム、又はナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して）、又は例えばハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブにおいてプローブを使用して、様々な方法において得てもよい。いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一のプライマーを使用する線形増幅若しくは等温増幅などの増幅技法によって先行され得る。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い配列リードが分析され得る。例として、分析は、本明細書に記載されるように、プローブに基づく又は配列に基づく技法を使用することができる。

【0140】

ステップ１７０８において、配列リードの第１のセットが同定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの各配列リードは、第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットは、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む。第１の配列末端シグネチャを有する末端配列は、例えば、開始位置の直前又は終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。

【0141】

ステップ１７１０において、配列リードの第１のセットの第１の量が決定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの第１の量がカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。

【0142】

ステップ１７１２において、配列リードの第１の量及び潜在的には別の量を使用することによって、第１のパラメータが決定される。いくつかの例では、そのような量の両方は、別個のパラメータであり得る。他の量は、例えば、配列リード及び／又は分析されたＤＮＡ分子の総数に対応する、様々な形態を取ることができる。別の例として、他の量は、各々が１つ以上の他の配列末端シグネチャ（末端モチーフ）に対応する末端配列を含む配列リードの第２のセットの量に対応し得る。したがって、第１のパラメータは、それぞれの末端モチーフを有する配列リードの２つのセット間の量の比であり得る。そのような例では、他の量は、試料サイズ又は分析されたＤＮＡ分子の数に関係なく、一貫した測定値を提供するために第１の量を正規化することができる。そのような正規化によって、第１の量と他の量との間の相対量（例えば、量の比又は量の関数の比）を提供する正規化されたパラメータを得ることができる。

【0143】

いくつかの場合では、第１のパラメータ（例えば、ＤＮＡＳ１Ｌ３／ＤＦＦＢ）は、第１のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳ１Ｌ３）の末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と、第２のヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）の末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量とを使用することによって生成され、第２のヌクレアーゼは、１つ以上の組織タイプのうちの正常な組織と比較して、１つ以上の組織タイプのうちの異常な組織細胞において異なって調節される。したがって、様々な例において、第１のパラメータには、モチーフ多様性スコア、末端モチーフの相対頻度、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比が含まれ得る。

【0144】

末端モチーフの相対頻度の差は、異なる組織タイプ及び異なる表現型、例えば異なる病理レベルのために検出され得る。この差は、特定の末端モチーフを有するＤＮＡ断片の量又は末端モチーフのセット（例えば、使用される長さに対応するｋ ｍｅｒの全ての可能な組み合わせ）にわたる全体的なパターン、例えば、分散（エントロピーなど、モチーフ多様性スコアとも呼ばれる）によって定量化され得る。

【0145】

いくつかの場合では、対応するヌクレアーゼの発現レベルを表す各パラメータを正規化するために、同じ量の配列リードが使用される。更に又はあるいは、異なる量の配列リードを使用して、対応するヌクレアーゼの各パラメータを正規化することができる。

【0146】

ステップ１７１４において、生物学的試料中の１つ以上の組織タイプにおける異常レベルの分類が決定され、異常レベルの分類の決定は、第１のパラメータと参照値との比較に基づく。例えば、ＣＣＣＧ末端モチーフに対するＡＣＧＡの比に対応する値の増加は、肝細胞がん（ＨＣＣ）の分類を示す。いくつかの実施形態において、異常レベルの分類には、病理（例えば、ＨＣＣ）の複数のステージのうちの１つが含まれる。

【0147】

したがって、いくつかの実施形態において、それぞれのヌクレアーゼに基づいて生成されたパラメータを使用して、異常レベルを分類することができる。これらのそれぞれのパラメータを組み合わせて、例えば、比として、それぞれのパラメータのそれぞれの関数の比として、及び機械学習モデルなどのより複雑な関数への２つの入力として、新しい組み合わせパラメータを形成することができる。パラメータの組み合わせの例には、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１／ＤＦＦＢ、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３：ＤＮＡＳＥ１：ＤＦＦＢの他の比が含まれる。更に、３つ以上のヌクレアーゼのパラメータを使用することができ、例えば、３つ以上のヌクレアーゼの相対パラメータを使用することができる。

【0148】

いくつかの実施形態において、異常レベルの分類は、パラメータのセットの分析に基づいて決定することができ、各パラメータは、別の量と組み合わせて（例えば正規化のため）、各々が特定の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの量に対応する。例えば、パラメータには、それぞれの末端シグネチャを有する配列リードの２つのセット間の頻度比の特定の組み合わせが含まれ得る。例えば、パラメータのセットの第１のパラメータは、各々が第１のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と配列リードの別の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＴ）に対応し得、パラメータのセットの第２のパラメータは、各々が第２のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量と配列リードの第３の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＡＣＧＡ／ＣＣＣＧ）に対応し得る。いくつかの場合では、配列リードの第３の量は、第１のパラメータを決定するために使用される配列リードの他の量である。

【0149】

ステップ１７１２及び１７１４を実施するためのいくつかの例では、（例えば、本明細書で説明するように）第１の量及び第２の量を機械学習モデルに入力することができる。機械学習モデルは、パラメータを内部的に（例えば、中間値として）生成し、２つの量に基づいて出力分類を提供することができる。トレーニングセットは、１つ以上の既知の異常レベルを有する試料から開発することができる。機械学習モデルのトレーニングにより、参照値、及び第１のパラメータがどのように決定されるかの構築を提供することができる。

【0150】

Ｂ．臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度
ＭＤＳ値は母体ＤＮＡ分子よりも胎児ＤＮＡ分子で低いため、末端モチーフのプロファイルは胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間で異なることが報告された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０；１０：６６４－６７３）。妊婦におけるヌクレアーゼ切断シグネチャ分析が、胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子とを区別するためのシグナルを改善するかどうかを検査するために、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＣＣＡ末端モチーフの頻度比（すなわち、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比）を計算した。

【0151】

１．末端シグネチャ比分析を使用した母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡと間の区別
図１８Ａ及び１８Ｂは、いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とを区別する例を示す。図１８Ａ及び１８Ｂに示されるように、胎児特異的配列は、一般に、母体特異的配列のものよりも低いモチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比に対応する。しかしながら、母親特異的配列と胎児特異的配列との間の測定値の相対的な違いは、モチーフの多様性スコアと比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比の方が大きくなる。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比は、母体特異的配列と胎児特異的配列とを区別する際により大きな識別力を示し得る。

【0152】

図１９は、いくつかの実施形態による、胎児ＤＮＡ分子と母体のＤＮＡ分子とを区別するための２つの血漿末端モチーフ（ＣＧＡＡ／ＡＡＡＡ）の比の箱ひげ図を示す。一実施形態において、並び替え分析を使用して、母体バックグラウンドＤＮＡ分子から胎児ＤＮＡ分子を区別する際に最も識別力を示す切断シグネチャの組み合わせを決定することにより、ヌクレアーゼ切断シグネチャを定義することができる。一例として、任意の２つの末端モチーフ間の頻度比の全ての組み合わせを列挙することができる。２５６のモチーフがあり、３２，６４０になる。任意の２つの末端モチーフ間の３２，６４０の頻度比の中で、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＧＡＡ末端モチーフの頻度比は胎児ＤＮＡ分子で減少し、胎児ＤＮＡ分子と母体のＤＮＡ分子との間でＡＵＣ１を示した（図２３）。これらの結果により、２つの特定の末端モチーフ（例えば、末端モチーフ比）の選択的分析によって、血漿ＤＮＡ分子由来の組織を決定する際の識別力が改善されることが示唆された。

【0153】

図２０は、いくつかの実施形態による、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とを区別する際のＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比についてのＲＯＣ曲線を示す。ＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及び切断シグネチャ比に対応する値をリードのセットによって決定した。最初に、妊婦の各血漿試料の母体断片及び胎児断片をＳＮＰ部位に基づいて同定した。母体がホモ接合体（ＡＡ）であり、かつ、胎児がヘテロ接合体（ＡＢ）であるＳＮＰにより、胎児特異的ＤＮＡ分子を同定することが可能となる。母体がヘテロ接合体（ＡＢ）であり、かつ、胎児がホモ接合体（ＡＡ）であるＳＮＰにより、母体特異的ＤＮＡ分子（すなわち、母体ＤＮＡ）を同定することが可能となる。

【0154】

各血漿ＤＮＡ試料について、２つの切断比の値が得られた：一方は母体ＤＮＡ（Ｘ）であり、他方は胎児ＤＮＡ（Ｙ）である。例えば、３０人の妊娠中の対象を分析した場合、３０のＸ値及び３０のＹ値が存在するであろう。胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡが異なる切断優先度を有する場合、Ｘ及びＹは異なるはずである。Ｘ値とＹ値との間のＲＯＣを使用して、どの特徴（例えば、ＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断比）が母体ＤＮＡ分子及び胎児ＤＮＡ分子のセット間の最大の差をもたらすかを説明することを目指した。ＲＯＣにおけるより高いＡＵＣは、対応する特徴が、血漿ＤＮＡプールにおける母体／胎児ＤＮＡの寄与又は母体／胎児ＤＮＡに関連する切断変化を反映するためにより強力であろうことを示した。したがって、図２０のＲＯＣ曲線は、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとを区別することができ、それによって本明細書に記載の方法において胎児画分濃度の提供を可能とする際のＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及び末端切断シグネチャ比の特徴の重要性を示すために使用される。

【0155】

胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間のモチーフ多様性スコア値に基づく０．９２のＡＵＣ（図１８Ａ及び図２０）と比較して、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＣＣＡ末端モチーフの頻度比（すなわち、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比）は、より高いＡＵＣ（０．９４）に上昇する（図１８Ｂ及び図２０）。ＣＣＣＡ％（すなわち、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断シグネチャ）の尺度は、最小の識別力を与えた（ＡＵＣ：０．７１）。したがって、ＭＤＳ及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比は、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子との区別が可能であることについて優れた精度を提供することができる。

【0156】

２．組織の分化
ＭＤＳ値は、造血由来のＤＮＡ分子のものよりも肝臓由来のＤＮＡ分子で低かったために、肝臓由来のＤＮＡ分子と主に造血由来のＤＮＡ分子との間では末端モチーフのプロファイルが異なることも報告されている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２０；１０：６６４－６７３）。肝移植患者におけるヌクレアーゼ切断シグネチャ分析が、肝臓由来のＤＮＡ分子を主に造血由来のＤＮＡ分子と区別するためのシグナルを改善するかどうかを検査するために、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＣＣＡ末端モチーフの頻度比も計算した。

【0157】

図２１Ａ及び２１Ｂは、いくつかの実施形態による、モチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を使用して、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子とを区別する例を示す。図２４Ａ及び２４Ｂに示されるように、肝臓由来の配列（例えば、ドナー特異的配列）は、一般に、造血由来の配列（例えば、共有配列）のものよりも低いモチーフ多様性スコア及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比に対応する。しかしながら、２つの配列間の測定値の相対的な違いは、モチーフ多様性スコアと比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比の方が大きい。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比は、母体特異的配列と胎児特異的配列とを区別する際により大きな識別力を示し得る。

【0158】

図２２は、いくつかの実施形態による、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子とを区別する際のＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比についてのＲＯＣ曲線を示す。ここでは、肝移植患者の血漿ＤＮＡ試料を使用した。最初に、肝移植患者の各試料血漿について、ドナー及びレシピエントの対象が異なる遺伝子型（例えば、ドナーの遺伝子型ＡＡ及びレシピエントの遺伝子型ＡＢ、又はドナーＡＢ及びレシピエントＡＡ）を有するＳＮＰに基づき、肝臓由来のＤＮＡ分子及び造血由来のＤＮＡ分子を同定した。

【0159】

図２０で使用した技法と同様に、ＲＯＣ曲線を使用して、どの特徴（例えば、ＭＤＳ、ＣＣＣＡ％、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断比）が肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子（すなわち、レシピエント特異的ＤＮＡ）との間の最大の差をもたらすかを示した。ＲＯＣにおけるより高いＡＵＣは、対応する特徴が、血漿ＤＮＡプールにおける肝臓由来ＤＮＡの寄与又は肝臓由来のＤＮＡに関連する切断変化を反映するためにより強力であろうことを示した。

【0160】

肝臓由来のＤＮＡ分子と造血ＤＮＡ分子との間のＭＤＳ分析についての０．７６のＡＵＣ（図２４Ａ及び図２５）と比較して、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＣＣＡ末端モチーフの頻度比は、より高いＡＵＣ（０．８８）に上昇した（図２４Ｂ及び図２５）。ＣＣＣＡ％は最小の識別力（ＡＵＣ：０．７２）を与えた。したがって、ＭＤＳ及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比は、肝臓由来のＤＮＡ分子と造血由来のＤＮＡ分子との区別が可能であることについて良好な精度を提供することができる。

【0161】

一実施形態において、ヌクレアーゼ切断シグネチャは、並び替え分析を使用して、主に造血由来のＤＮＡ分子から肝臓由来のＤＮＡ分子を区別する際に最も識別力を示す切断シグネチャの組み合わせを決定することによって定義される。一例として、任意の２つの末端モチーフ間の頻度比の全ての組み合わせを列挙することができる。２５６のモチーフがあり、合計３２，６４０の組み合わせが得られる。任意の２つの末端モチーフ間の３２，６４０の頻度比の中で、ＧＧＡＧ末端モチーフに対するＣＴＧＡ末端モチーフの頻度比はＡＵＣ１を与えた。これらの結果により、２つの特定のモチーフの選択的分析は、血漿ＤＮＡ分子由来の組織を区別する際の識別力を改善することが示唆された。

【0162】

３．臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定するための方法
図２３は、いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度を推定するための方法２３００を示すフローチャートである。生物学的試料は、複数の組織タイプ由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含む。いくつかの実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡには、胎児ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、又は移植臓器のＤＮＡが含まれる。標的組織タイプには、肝臓組織、造血細胞、胎児組織、がんを有する臓器、及び胎盤組織が含まれ得る。方法２３００における同様のステップは、図１７の方法１７００と同様の方法で行うことができる。更に、同様のステップを伴う他の方法は、同様の方法で行うことができる。したがって、各方法について追加の説明を繰り返さない場合がある。

【0163】

ステップ２３０２において、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、標的組織タイプにおいて異なって調節される第１のヌクレアーゼが同定される。いくつかの実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡ分子は、標的組織タイプに由来する。いくつかの場合では、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、１つ以上の組織タイプの標的組織タイプにおいて異なって調節される第２のヌクレアーゼも同定される。ステップ２３０２は、図１７のステップ１７０２と同様の方法で実施され得る。

【0164】

ステップ２３０４において、第１のヌクレアーゼは、他の配列末端シグネチャと比較して第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断するように決定される。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、別の生物（例えば、マウス）の生物学的試料を分析することによって決定される。

【0165】

ステップ２３０６において、配列リードを取得するために、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ断片が分析される。いくつかの実施形態において、配列リードは、複数の無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、対形成末端配列決定を使用して配列リードを取得し、その２つの配列リードは、ＤＮＡ断片の２つの末端から得られる（例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基）。本明細書に記載されるように、配列リードは、例えば、配列決定技法を使用して（例えば、合成による配列決定アプローチ（例えば、イルミナ）、又は単一分子配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイムシステム、又はナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して）、又は例えばハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブにおいてプローブを使用して、様々な方法において得てもよい。いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一のプライマーを使用する線形増幅若しくは等温増幅などの増幅技法によって先行され得る。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い配列リードが分析され得る。

【0166】

ステップ２３０８において、配列リードの第１のセットが同定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの各配列リードは、第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットは、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む。第１の配列末端シグネチャを有する末端配列は、例えば、開始位置の直前又は終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。

【0167】

ステップ２３１０において、配列リードの第１のセットの第１の量が決定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの第１の量がカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。

【0168】

ステップ２３１２において、第１のパラメータは、配列リードの第１の量及び潜在的には別の量を使用して決定される。いくつかの例では、そのような量の両方は、別個のパラメータであり得る。本明細書に記載されるように、他の量は、例えば、分析される配列リード及び／又はＤＮＡ分子の総数に対応する、様々な形態をとることができる。別の例として、他の量は、各々が１つ以上の他の配列末端シグネチャ（末端モチーフ）に対応する末端配列を含む配列リードの第２のセットの量に対応し得る。いくつかの実施形態において、第１のパラメータは、それぞれの末端モチーフを有する配列リードの２つのセット間の量の比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＡ）である。いくつかの場合では、第１のパラメータ（例えば、ＤＮＡＳ１Ｌ３／ＤＦＦＢ）は、第１のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）に対応する末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と、第２のヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）の末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量と、を使用することによって生成され、第２のヌクレアーゼは、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、１つ以上の組織タイプの異常な組織細胞において異なって調節される。いくつかの場合では、第１のパラメータは、モチーフ多様性スコア、末端モチーフの相対頻度、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を示す。

【0169】

末端モチーフの相対頻度の差は、異なる組織タイプ及び異なる表現型、例えば異なる病理レベルのために検出され得る。この差は、特定の末端モチーフを有するＤＮＡ断片の量又は末端モチーフのセット（例えば、使用される長さに対応するｋ ｍｅｒの全ての可能な組み合わせ）にわたる全体的なパターン、例えば、分散（エントロピーなど、モチーフ多様性スコアとも呼ばれる）によって定量化され得る。

【0170】

いくつかの場合では、対応するヌクレアーゼの発現レベルを表す各パラメータを正規化するために、同じ量の配列リードが使用される。更に又はあるいは、異なる量の配列リードを使用して、対応するヌクレアーゼの各パラメータを正規化することができる。

【0171】

ステップ２３１４において、生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度が推定される。それぞれのヌクレアーゼに基づいて生成されたパラメータを使用して、配列末端シグネチャに基づいて臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度を決定することができる。これらのそれぞれのパラメータを組み合わせて、例えば、比、それぞれのパラメータのそれぞれの関数の比として、及び機械学習モデルなどのより複雑な関数への２つの入力として、新しい組み合わせパラメータを形成することができる。パラメータの組み合わせの例には、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１／ＤＦＦＢ、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３：ＤＮＡＳＥ１：ＤＦＦＢの他の比が含まれる。更に、３つ以上のヌクレアーゼのパラメータを使用することができ、例えば、３つ以上のヌクレアーゼの相対パラメータを使用することができる。

【0172】

いくつかの実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度は、パラメータのセットを分析することに基づいて推定され、各パラメータは、配列リードの別の量（例えば、正規化のため）と組み合わせて、各々が特定の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの量に対応する。例えば、パラメータには、それぞれの末端シグネチャを有する配列リードの２つのセット間の頻度比の特定の組み合わせが含まれ得る。例えば、パラメータのセットの第１のパラメータは、各々が第１のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と配列リードの別の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＣＧＴＡ／ＧＧＡＧ）に対応し得、パラメータのセットの第２のパラメータは、各々が第２のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量と配列リードの第３の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＡ）に対応し得る。いくつかの場合では、配列リードの第３の量は、第１のパラメータを決定するために使用される配列リードの別の量である。

【0173】

いくつかの実施形態において、画分濃度は、第１のパラメータを、臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分濃度が既知である１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値と比較することによって推定される。例えば、比較は、第１のパラメータ（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＡ末端モチーフ比）が、臨床的に関連するＤＮＡ分子の特定の画分濃度を表す較正値よりも高いか低いかであり得る。比較は、較正曲線（較正データ点で構成される）と比較することを伴うことができ、したがって、比較により、第１のパラメータの第１の値を有する曲線上の点を同定することができる。次に、同定された点に対応する画分濃度を使用して、第１パラメータの画分濃度を推定することができる。例えば、第１のパラメータは、画分濃度の出力を得るための較正関数（例えば、線形又は非線形適合）への入力として提供され得る。同じ技法を使用して、標的組織タイプの特徴値を決定することができる。

【0174】

比較は、複数の較正値に対してであり得る。比較は、試料中の臨床関連ＤＮＡの画分濃度の変化に対する第１のパラメータの変化を提供する較正データに適合する較正関数に第１のパラメータを入力することによって行うことができる。別の例として、１つ以上の較正値は、１つ以上の較正試料における他のパラメータに対応することができる。多次元較正曲線を使用することができる。例えば、第１のパラメータ及び第２のパラメータを、画分濃度が既知であり、かつ、第１及び第２のパラメータが測定されている較正試料からの較正データ点の関数適合（例えば、較正表面）から同定される多次元較正関数に入力することができる。

【0175】

様々な実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を測定することは、組織特異的対立遺伝子又はエピジェネティックマーカーを使用して、又は、例えば、米国特許公開第２０１３／０２３７４３１号に記載されているようなＤＮＡ断片のサイズを使用して、実施され得、それは参照によって全体が組み込まれる。組織特異的なエピジェネティックマーカーは、試料における組織特異的なＤＮＡメチル化パターンを示すＤＮＡ配列を含み得る。

【0176】

様々な実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡは、胎児ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、移植された臓器由来のＤＮＡ、及び特定の組織タイプ（例えば、特定の臓器由来）からなる群から選択され得る。臨床的に関連するＤＮＡは、特定の組織タイプのものであり得、例えば、特定の組織タイプは、肝臓又は造血性である。対象が妊婦である場合、臨床的に関連するＤＮＡは、胎児ＤＮＡに対応する胎盤組織であり得る。別の例として、臨床的に関連するＤＮＡは、がんを有する臓器に由来する腫瘍ＤＮＡであり得る。

【0177】

概して、１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値は、画分濃度が測定されている生物学的（試験）試料に使用されるのと同様のアッセイを使用して生成されることが好ましい。例えば、配列決定ライブラリは同じ方法で生成され得る。処理技術の２つの例は、ＧｅｎｅＲｅａｄ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｓｈｏｐ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｇｅｎｅｒｅａｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｋｉｔ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びＳＰＲＩ（固相可逆固定化、ＡＭＰｕｒｅビーズ、ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎ．ｈｋ／ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ｄｅｐｒ／ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｄｅｐｒ／ｃｌｅａｎｕｐ－ａｎｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ｐｃｒ）である。ＧｅｎｅＲｅａｄは、主に腫瘍断片である短いＤＮＡを除去し得、それは、野生型及び変異体断片と同様に胎児及び移植の場合の末端モチーフの相対頻度に影響を与え得る。

【0178】

Ｃ．標的組織の特徴
様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡ末端シグネチャを使用して、標的組織の特徴を決定する。例えば、決定された特徴は、例えば、ヌクレアーゼが胎児組織と母体組織との間で異なって調節される場合、特定の妊娠期間又は範囲（例えば、８週、９～１２週）を含み得る。別の例では、決定された特徴は、妊娠中の対応する対象の代謝変化によって影響を受け得る特定の組織タイプに対応する臓器のサイズ又は栄養状態であり得る。妊娠期間が異なると、胎盤だけでなく、母体側及び胎児側の両方の多くの臓器の代謝が変化するであろう。

【0179】

１．妊娠期間の決定
ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルは、妊娠初期（例えば、第１期）の妊娠対象におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルと比較して、妊娠後期（例えば、第３期）の妊娠対象においてアップレギュレートされ得る。したがって、特定のヌクレアーゼを表す１つ以上の末端切断シグネチャを使用して、妊娠対象の妊娠期間を予測するパラメータを決定することができる。

【0180】

図２４Ａ及び２４Ｂは、いくつかの実施形態による、ヒト胎盤組織（Ａ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）及びマウス胎盤組織（Ｂ、Ｄｎａｓｅ１ｌ３）の異なる妊娠期間にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルの箱ひげ図を示す。ヌクレアーゼ活性は、妊娠などの異なる病態生理学的ステージによって変わる。例えば、正期産で出産した合併症のない妊娠について募集された２１人の女性及び妊娠９～１２週で外科的中絶を受けた１６人の健常な女性を含む、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ２８５５１）からの１つのマイクロアレイに基づくデータセットを分析した。図２２Ａに示されるように、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルは、第１期（発現レベルの中央値：１０．３；範囲：７．７～１２．４）と比較して、第３期（発現レベルの中央値：１２．４；範囲：１０．９～１４．４）でヒト胎盤において有意に増加することが見出された（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。一方、１０日目、１５日目、及び１９日目の各妊娠期間の５匹のマウスを含む、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ４１４３８）からの別のマイクロアレイに基づくデータセットも分析した。その結果、マウスのオーソロガス遺伝子ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、妊娠初期の１０日目（発現レベルの中央値：８．８；範囲：８．５～９．９）と比較して、妊娠後期の１５日目及び１９日目（発現レベルの中央値：１０．１、範囲：７．８～１０．４）において有意に増加した（Ｐ値＝０．０２、マン・ホイットニーのＵ検定）（図２２Ｂ）。

【0181】

図２５は、いくつかの実施形態による、異なる妊娠期間にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比の箱ひげ図を示す。図２２に示されるように、ＡＡＡＡ末端モチーフに対するＣＣＣＡ末端モチーフのヌクレアーゼ切断シグネチャ比は、妊娠期間が進むにつれて増加した。これらの結果により、２つのモチーフ間のヌクレアーゼ切断シグネチャ比は妊娠期間を評価するためのバイオマーカーとして役立ち得ることが示唆される。したがって、これらのデータは、例えばがんを含む病態生理学的変化を経時的に反映するために、ヌクレアーゼ切断シグネチャ比を使用することの実現可能性を裏付けている。この発見に基づいて、ヌクレアーゼ切断シグネチャ比が、がん又は他の疾患を有する患者の治療的介入に対する反応を経時的に監視又は予測するために使用されるであろうことを企図することができる。

【0182】

２．標的組織の特徴値を決定する方法
図２６は、いくつかの実施形態による、配列末端シグネチャに基づいて標的組織タイプの特徴を決定する方法を示すフローチャートである。標的組織タイプの特徴は、複数の組織タイプからの無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含む生物学的試料を分析することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、標的組織タイプの特徴は、胎盤組織における妊娠期間、又は子癇前症、早産、胎児染色体異数性、及び／若しくは胎児遺伝性障害を含む胎盤組織に関連する病態を示す。標的組織タイプの特徴はまた、肝臓由来のＤＮＡ分子と主に造血由来のＤＮＡ分子とを区別するなど、組織タイプを区別するために使用され得る。

【0183】

ステップ２６０２において、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、標的組織タイプにおいて異なって調節される第１のヌクレアーゼが同定される。いくつかの実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡ分子は、標的組織タイプに由来する。いくつかの場合では、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、１つ以上の組織タイプの標的組織タイプにおいて異なって調節される第２のヌクレアーゼも同定される。

【0184】

ステップ２６０４において、第１のヌクレアーゼは、他の配列末端シグネチャと比較して第１の配列末端シグネチャを有するＤＮＡ分子へと、ＤＮＡを優先的に切断するように決定される。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、別の生物（例えば、マウス）の生物学的試料を分析することによって決定される。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、並び替え分析を使用して、組織ＤＮＡ分子（例えば、肝臓由来のＤＮＡ分子と主にＤＮＡ分子と）を区別する際に最も識別力を示す末端シグネチャの組み合わせを決定することによって決定される。

【0185】

ステップ２６０６において、配列リードを取得するために、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ断片が分析される。いくつかの実施形態において、配列リードは、複数の無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、対形成末端配列決定を使用して配列リードを取得し、その２つの配列リードは、ＤＮＡ断片の２つの末端から得られる（例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基）。本明細書に記載されるように、配列リードは、例えば、配列決定技法を使用して（例えば、合成による配列決定アプローチ（例えば、イルミナ）、又は単一分子配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイムシステム、又はナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して）、又は例えばハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブにおいてプローブを使用して、様々な方法において得てもよい。いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一のプライマーを使用する線形増幅若しくは等温増幅などの増幅技法によって先行され得る。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い配列リードが分析され得る。

【0186】

ステップ２６０８において、配列リードの第１のセットが同定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの各配列リードは、第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットは、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む。第１の配列末端シグネチャを有する末端配列は、例えば、開始位置の直前又は終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。

【0187】

ステップ２６１０において、配列リードの第１のセットの第１の量が決定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの第１の量がカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。

【0188】

ステップ２６１２において、第１のパラメータは、配列リードの第１の量及び潜在的には別の量を使用して決定される。いくつかの例では、そのような量の両方は、別個のパラメータであり得る。他の量は、例えば、配列リード及び／又は分析されたＤＮＡ分子の総数に対応する、様々な形態を取ることができる。別の例として、他の量は、各々が１つ以上の他の配列末端シグネチャ（末端モチーフ）に対応する末端配列を含む配列リードの第２のセットの量に対応し得る。第１のパラメータは、それぞれの末端モチーフを有する配列リードの２つのセット間の量の比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＡ）であり得る。

【0189】

いくつかの場合では、第１のパラメータ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ）は、第１のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）の末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と、第２のヌクレアーゼ（例えば、ＤＦＦＢ）の末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量とを使用することによって生成され、第２のヌクレアーゼは、１つ以上の組織タイプのうちの正常な組織と比較して、１つ以上の組織タイプのうちの異常な組織細胞において異なって調節される。いくつかの場合では、第１のパラメータは、モチーフ多様性スコア、末端モチーフの相対頻度、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ切断シグネチャ比を示す。

【0190】

末端モチーフの相対頻度の差は、異なる組織タイプ及び異なる表現型、例えば異なる病理レベルのために検出され得る。この差は、特定の末端モチーフを有するＤＮＡ断片の量又は末端モチーフのセット（例えば、使用される長さに対応するｋ ｍｅｒの全ての可能な組み合わせ）にわたる全体的なパターン、例えば、分散（エントロピーなど、モチーフ多様性スコアとも呼ばれる）によって定量化され得る。

【0191】

いくつかの場合では、対応するヌクレアーゼの発現レベルを表す各パラメータを正規化するために、同じ量の配列リードが使用される。更に又はあるいは、異なる量の配列リードを使用して、対応するヌクレアーゼの各パラメータを正規化することができる。

【0192】

ステップ２６１４において、第１のパラメータを、特徴についての値が既知である１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値と比較することによって、標的組織タイプの特徴についての第１の値が推定される。ステップ２６１４は、図２３のステップ２３１４と同様の方法で実施され得る。

【0193】

したがって、それぞれのヌクレアーゼに基づいて生成されたパラメータを使用して、標的組織タイプの特徴を決定することができる。これらのそれぞれのパラメータを組み合わせて、例えば、比、それぞれのパラメータのそれぞれの関数の比として、及び機械学習モデルなどのより複雑な関数への２つの入力として、新しい組み合わせパラメータを形成することができる。パラメータの組み合わせの例には、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３／ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１／ＤＦＦＢ、又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３：ＤＮＡＳＥ１：ＤＦＦＢの他の比が含まれる。更に、３つ以上のヌクレアーゼのパラメータを使用することができ、例えば、３つ以上のヌクレアーゼの相対パラメータを使用することができる。

【0194】

いくつかの実施形態において、標的組織タイプの特徴についての第１の値は、パラメータのセットの分析に基づいて推定され、各パラメータは、別の量と組み合わせて（例えば正規化のため）、各々が特定の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの量に対応する。例えば、パラメータには、それぞれの末端シグネチャを有する配列リードの２つのセット間の頻度比の特定の組み合わせが含まれ得る。例えば、パラメータのセットの第１のパラメータは、各々が第１のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第１の量と配列リードの別の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＣＧＴＡ／ＧＧＡＧ）に対応し得、パラメータのセットの第２のパラメータは、各々が第２のヌクレアーゼの末端シグネチャに対応する末端配列を含む配列リードの第２の量と配列リードの第３の量との間の末端シグネチャの比（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＡ）に対応し得る。いくつかの場合では、配列リードの第３の量は、第１のパラメータを決定するために使用される配列リードの別の量である。

【0195】

決定された特徴は、例えば、ヌクレアーゼが胎児組織と母体組織との間で異なって調節される場合、妊娠期間又は範囲（例えば、８週、又は９～１２週）を含み得る。別の例では、決定された特徴は、他の組織タイプ（例えば、造血細胞）と比較して特定の組織タイプ（例えば、肝細胞）であり得る。標的組織タイプの特徴はまた、標的組織タイプの特定の病態（例えば、ＨＣＣ、子癇前症、早産）を示し得る。別の例では、決定された特徴は、特定の組織タイプ（例えば、肝細胞）に対応する臓器のサイズ又は栄養状態であり得る。

【0196】

比較は、複数の較正値に対してであり得る。比較は、試料中の特徴の変化に対する第１のパラメータの変化を提供する較正データに適合する較正関数に第１のパラメータを入力することによって行うことができる。別の例として、１つ以上の較正値は、１つ以上の較正試料における他のパラメータに対応することができる。

【0197】

一般に、１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値は、生物学的（検査）試料に使用されるのと同様のアッセイを使用して生成されることが好ましい。例えば、配列決定ライブラリは同じ方法で生成され得る。処理技術の２つの例は、ＧｅｎｅＲｅａｄ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｓｈｏｐ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｇｅｎｅｒｅａｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｋｉｔ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びＳＰＲＩ（固相可逆固定化、ＡＭＰｕｒｅビーズ、ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎ．ｈｋ／ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ｄｅｐｒ／ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｄｅｐｒ／ｃｌｅａｎｕｐ－ａｎｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ｐｃｒ）である。ＧｅｎｅＲｅａｄは、主に腫瘍断片である短いＤＮＡを除去し得、それは、野生型及び変異体断片と同様に胎児及び移植の場合の末端モチーフの相対頻度に影響を与え得る。

【0198】

Ｖ．ヌクレアーゼの異なる調節に基づく不揃いな末端分析
本明細書に記載されるように、ＤＮＡ末端修復ステップにおいて非メチル化シトシン又はメチル化シトシンを利用することにより、血漿ＤＮＡが不揃いな末端と称する一本鎖末端を有するかどうかを決定することができる。ＤＮＡ末端修復は、一本鎖ＤＮＡにおいて充填されて、二本鎖ＤＮＡを形成する。非比メチル化シトシンの充填を伴うＤＮＡ末端修復に基づく方法では、不揃いの程度は、リード２におけるメチル化レベルの低下によって推定することができる。非メチル化シトシンの充填によって推測されるこのような不揃いの程度をＪＩ－Ｕと称した。一方、メチル化シトシンの充填を伴う末端修復に基づく方法では、不揃いの程度は、リード２におけるメチル化レベルの増加によって推定することができる。メチル化シトシンの充填によって推測されるこのような不揃いの程度をＪＩ－Ｍと称した。

【0199】

いくつかの実施形態において、異常組織を正常組織から区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、組織タイプを区別するなどのために不揃い指数値と比較するように、異なる参照値を決定することができる。例えば、参照値は、ヌクレアーゼが無細胞試料の不揃いの典型的なレベル／正常レベルと比較して不揃いを増加／減少させるかどうかと組み合わせて、ヌクレアーゼがアップレギュレートされているか又はダウンレギュレートされているかに基づいて変化することができる。

【0200】

他の実施形態において、異なるヌクレアーゼに対応する発現レベルを表すために、複数の不揃い指数値を生成することができる。例えば、第１のヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ間に第１の長さのオーバーハングをもたらす末端シグネチャと関連付けることができる。第２のヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ間に第２の長さのオーバーハングをもたらす異なる末端シグネチャと関連付けることができる。

【0201】

参照値は、典型的な値／正常値と比較した第１の長さ及び第２の長さに基づいて変動し得、ヌクレアーゼがアップレギュレートされているか又はダウンレギュレートされているかに基づいて変動する。例えば、２つのヌクレアーゼが両方ともアップレギュレート／ダウンレギュレートされており、どちらも通常より短い／長い長さをもたらす場合、通常からのより大きな偏差が予想されるであろう。あるいは、ヌクレアーゼが不揃い指数値について異なる方向に作用する場合、より小さな偏差が予想され得る。複数の不揃い指数値は、正常組織から異常組織を区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、組織タイプを区別するなどのために、それぞれの参照値と比較することができる。例えば、異常組織と正常組織とを区別するために超平面を決定することができるように、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１）の複数の不揃い指数値を三次元散布図にプロットする。

【0202】

Ａ．様々なヌクレアーゼ及び断片サイズにわたる無細胞ＤＮＡの不揃い
野生型マウスと比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスでは、１３０～１６０ｂｐのサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の不揃いが増加したが（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２０；３０：１１４４－１１５３）、いくつかのヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３）の不揃いな末端分析では、他の断片サイズを考慮することができる。説明のために、無細胞ＤＮＡの不揃いは、５０～６００ｂｐの広い範囲のサイズで評価される。無細胞ＤＮＡの不揃いは、超並列重亜硫酸塩配列決定に基づいて、リード１と比較したリード２のＣｐＧ部位におけるメチル化レベルの低下によって定義された。無細胞ＤＮＡの不揃いの定量化の原理は、本明細書、及び２０２０年１２月８日に出願された米国出願第６３／１２２，６６９号及び２０２１年５月２６日に出願された米国出願第６３／１９３，５０８号に記載されている。その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0203】

１．ＤＮＡＳＥ１Ｌ３
図２７は、野生型マウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失をしたマウスとの間の血漿ＤＮＡの不揃いを示すグラフ２７００のセットを示す。図２７において、グラフ２７０２は、野生型マウス及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスの様々な断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ値を示す。箱ひげ図２７０４は、野生型マウス及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウスの２００～６００ｂｐ範囲内の血漿ＤＮＡのＪＩ－Ｍ値を示す。本実施例では、メチル化シトシンを使用して、野生型（ｎ＝１２）及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－マウス（ｎ＝５）の５０～６００ｂｐのより広い範囲のサイズにおいて不揃い指数値を測定した。マッピングされた対形成末端リードの中央値は１億１，５００万（範囲：５，１００万～２億１，６００万）であった。グラフ２７０２に示されるように、１３０～１６０ｂｐのサイズを有する血漿ＤＮＡ分子での不揃いが、野生型マウスよりも、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失を有するマウスの血漿においてより高いことに加えて、血漿ＤＮＡの不揃いは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失しているマウスの２００ｂｐより大きい分子ではより低いことが示された。

【0204】

グラフ２７０２に示されるように、野生型マウスと比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３が欠失したマウスでは、断片サイズにわたって二相性の不揃い分布が観察された。ほぼ１つのヌクレオソームのサイズである１７０ｂｐよりも短いサイズの短い断片では、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－マウスにおいて不揃いの増加を見ることができる。対照的に、箱ひげ図２７０４は、２００ｂｐより長い断片では、２４．９５％の中央値の減少がＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－マウスにおいて観察することができることを示す。

【0205】

いくつかの場合では、２００ｂｐより大きい血漿ＤＮＡ分子の不揃いの使用によって、１３０～１６０ｂｐの範囲の血漿ＤＮＡ分子に基づく結果と比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失しているマウスとＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失していないマウスとの間の差が大きくなる（箱ひげ図２７０４）。これらの結果は、比較的長い血漿ＤＮＡの不揃いの使用によってＤＮＡヌクレアーゼ活性が反映されることを示している。いくつかの実施形態において、血漿ＤＮＡの不揃いは、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２６０ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐなどより大きいが、これらに限定されないサイズを有するＤＮＡ分子に基づいて決定される。

【0206】

２．ＤＮＡＳＥ１
不揃いの増加は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－マウスモデルにおける短い断片（例えば、＜１７０ｂｐ）に存在し、他の原因となる酵素に起因し得る。例えば、血漿ＤＮＡ不揃いな末端に対するＤＮＡＳＥ１の影響を試験した。

【0207】

図２８は、Ｄｎａｓｅ１^－／－マウスとＷＴマウスとの間の血漿ＤＮＡの不揃い（ＪＩ－Ｍ）を同定する箱ひげ図を示す。図２８では、７匹のＤＮＡＳＥ１^－／－マウス及び１２匹のＷＴマウスのセットを使用して、不揃いの差異を調べた。この例では、１７０ｂｐｓ未満のサイズを有するＤＮＡ断片について、不揃い指数値を測定した。ＤＮＡＳＥ１^－／－マウスＤＮＡ分子に存在する不揃いの平均（ＪＩ－Ｍ平均値：２０．１９；範囲：１８．４９～２２．７０）は、ＷＴマウスの分子由来の分子のもの（ＪＩ－Ｍ平均値：２２．１２；範囲：２０．０１～２５．１４；Ｐ値＝０．０１７、マン・ホイットニーのＵ検定）よりも有意に低かった。この結果は、ＤＮＡＳＥ１が不揃いな末端を無細胞ＤＮＡ分子に導入することができる要因のうちの１つであろうことを示している。

【0208】

３．ＤＦＦＢ
不揃いの末端の生成に関連する酵素を更に調べるために、６匹のＤｆｆｂ^－／－マウス及び６匹のＷＴマウスを使用した。図２９は、ＷＴマウスとＤＦＦＢ^－／－マウスとの間の血漿ＤＮＡの不揃いを同定するグラフのセットを示す。図２９では、箱ひげ図２９０２は、ＷＴマウスとＤＦＦＢ^－／－マウスとの間のＪＩ－Ｍ値の差を示す。ＤＦＦＢのノックアウト（ＪＩ－Ｍ中央値：４３．９６；範囲：４２．５３～４５．２８）によって、ＷＴマウス（ＪＩ－Ｍ中央値：４１．６４；範囲：３９．６３～４２．８６；Ｐ値＝０．００９、マン・ホイットニーのＵ検定）と比較して、２００ｂｐ超の断片サイズでＪＩ－Ｍが５．５７％増加した。更に、グラフ２９０４は、ＷＴマウスとＤＦＦＢ^－／－マウスとの間の異なる断片サイズにわたる血漿ＤＮＡのＪＩ－Ｍ値を示す。グラフ２９０４に示されるように、ＪＩ－Ｍ値の増加は、異なる断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ分布においても見ることができる。この結果は、ＤＦＦＢがＤＮＡ断片化プロセス中に非常に短い不揃いな末端又は平滑末端の生成を促進し得ることを予備的に明らかにすることができる。

【0209】

これらの結果は、様々なサイズにわたる血漿ＤＮＡの不揃いな末端を使用することによって、様々なＤＮＡヌクレアーゼ活性の情報を得ることができることを示している。ＤＮＡヌクレアーゼ活性の異常に関連する疾患は、本開示に存在する実施形態による血漿ＤＮＡの不揃いな末端の分析を通じて検出されるであろう。

【0210】

Ｂ．臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度
いくつかの実施形態において、二本鎖ＤＮＡ間の指定された長さのオーバーハングは、特定のヌクレアーゼの末端切断シグネチャと関連付けることができる。

【0211】

特定の対象の生物学的試料では、この特性（例えば、指定された長さのオーバーハング）を有するＤＮＡ分子の量を同定するパラメータを生成することができ、パラメータを使用して、対象の臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定することができる。例えば、不揃い指数値などのパラメータは、特定の量の胎児特異的ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、又は移植ＤＮＡを含む生物学的試料を示すことができる。例えば、不揃い指数値が別の試料の別の不揃い指数値と比較して高いという決定は、胎児特異的ＤＮＡ又は腫瘍ＤＮＡの異なる画分濃度を示す。

【0212】

１．胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡについての不揃い
図３０Ａ及び３０Ｂは、いくつかの実施形態による、胎児特異的ＤＮＡ分子と共有ＤＮＡ分子との間の不揃い指数値の比較を示す。胎児特異的データ３００２に示されるように、異なるサイズの血漿ＤＮＡ断片にわたって胎児遺伝子型と母体遺伝子型との間で共有される対立遺伝子（主に母体由来）を有する、共有データ３００４によって表される共有ＤＮＡ断片と比較して、より高いＪＩ－Ｍ値が、胎児特異的ＤＮＡ分子に存在する（図３０Ａ）。図３０Ｂは、異なるサイズの血漿ＤＮＡ断片に関連する、胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間の短い分子から長い分子までの異なるサイズにわたるＪＩ－Ｍの差（すなわち、ΔＪ）のプロットを示す。正のＪＩ－Ｍは、胎児特異的対立遺伝子を有する分子がより高いＪＩ－Ｍを有することを意味する。１３０ｂｐ～１６０ｂｐのサイズ範囲内での正の徐々に上昇するΔＪ値は、このサイズ範囲にわたって胎児特異的ＤＮＡに存在し、１６０ｂｐで範囲の最大値を達成した（図３０Ｂ）。

【0213】

図３１Ａは、いくつかの実施形態による、胎盤組織及び白血球におけるＤＮＡＳＥ１の遺伝子発現を示し、図３１Ｂは、いくつかの実施形態による、サイズ選択なしでの胎児特異的断片と共有断片との間の非メチル化の不揃い指数（ＪＩ－Ｕ）値の箱ひげ図を示し、図３１Ｃは、いくつかの実施形態による、胎児特異的断片と１３０～１６０ｂｐのサイズ範囲内の共有断片との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示す。ＤＮＡＳＥ１の発現レベルは、白血球のＤＮＡＳＥ１発現レベルと比較して、胎盤組織において２．５倍高いことが見出された。したがって、ＤＮＡＳＥ１は、胎児ＤＮＡ分子の不揃いの増強に寄与した１つの酵素であり得る（図３１Ａ）。以前に公開されたデータセット（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１７；６３：６０６－６０８）を使用したＪＩ－Ｕ測定に基づいて、３０人の妊娠中の対象も分析した。サイズ選択なしの共有ＤＮＡ断片のＪＩ－Ｕ値（図３１Ｂ）（平均：１６．１；範囲：１４．３～１８．２）と比較して、１３０～１６０ｂｐの胎児ＤＮＡ分子において、より高いＪＩ－Ｕ値が観察された（平均：２０．４；範囲：１５．９～２６．２）（図３１Ｃ）（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。胎児断片と共有断片との間のＪＩ－Ｕの絶対差の中央値（４．５）は、１３０～１６０ｂｐのサイズ範囲において、サイズ選択のない全ての断片のもの（１．７）よりも非常に高かった（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。

【0214】

これらの結果により、不揃いが、胎盤組織におけるＤＮＡＳＥ１活性を反映することに有益であり、したがって、血漿ＤＮＡ分子由来の組織の情報を得るための新しいアプローチを提供するであろうことが示唆される。例えば、妊婦の血漿ＤＮＡの不揃いが高いほど、胎盤組織に由来するＤＮＡ分子が多くなるであろう。サイズ選択により、胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子とを区別する際のシグナル対雑音比が高くなる。

【0215】

２．腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡとの間の不揃い
図３２は、ＨＣＣを有する対象における変異対立遺伝子（腫瘍ＤＮＡ）及び野生型対立遺伝子（主に非腫瘍ＤＮＡ）を有する血漿ＤＮＡ分子間のＪＩ－Ｍ値の累積差を同定するグラフ３２００を示す。図３２に示されるように、変異対立遺伝子を有する血漿ＤＮＡは腫瘍由来のものであったが、野生型対立遺伝子を有する血漿ＤＮＡは主に非腫瘍性であった。３１，２３４の腫瘍由来のＤＮＡ分子及び野生型対立遺伝子を有する２０９，０２７のＤＮＡ分子があった。腫瘍由来ＤＮＡの不揃いは、野生型を有する配列よりも高いことが観察され、腫瘍由来ＤＮＡ分子と野生型分子との間のＪＩ－Ｍの累積差は、ＤＮＡ断片のサイズが大きくなるにつれて増加した。この不揃いの差異を使用して、胎児ＤＮＡについてと同様の方法で腫瘍ＤＮＡの画分濃度を決定することができる。

【0216】

３．臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定する方法
図３３は、いくつかの実施形態による、不揃い指数値に基づいて臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分を決定する方法を示すフローチャートである。生物学的試料は、複数の組織タイプ由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含み得、無細胞ＤＮＡ分子の各々は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖と部分的又は完全な二本鎖を形成する。いくつかの場合では、無細胞ＤＮＡ分子の少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖由来の相補部分を有さず、第２の鎖にハイブリダイズせず、第１の鎖の第１の末端にある。

【0217】

ステップ３３０２において、第１のヌクレアーゼは、複数の組織タイプのうちの少なくとも１つの他の組織タイプと比較して、標的組織タイプにおいて異なって調節されることが同定される。臨床的に関連するＤＮＡ分子は、標的組織タイプに由来し得る。例えば、ＤＮＡＳＥ１発現は、白血球のＤＮＡＳＥ１発現レベルと比較して、胎盤組織において相対的にアップレギュレートされる（図３１Ａ）。別の例では、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現は、健常な対象における肝臓組織と比較して、ＨＣＣ細胞では相対的にダウンレギュレートされている。ステップ３３０２は、図１７のステップ１７０２と同様の方法で実施され得る。

【0218】

いくつかの実施形態において、異なるヌクレアーゼに対応する発現レベルを表すために、複数の不揃い指数値が生成される。複数の不揃い指数値は、正常組織から異常組織を区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、組織タイプを区別するなどのために比較することができる。例えば、臨床的に関連するＤＮＡ分子を決定するための超平面を決定するために、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１）の複数の不揃い指数値を三次元散布図にプロットすることができる。

【0219】

ステップ３３０４において、第１のヌクレアーゼは、ＤＮＡを、第１の鎖と第２の鎖との間に指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子に優先的に切断するように決定される。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、別の生物（例えば、マウス）の生物学的試料を分析することによって決定される。

【0220】

ステップ３３０６において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さと相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が測定される。例えば、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、より高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さに相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。いくつかの場合では、特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態である。他の場合では、特性は、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の長さである。

【0221】

いくつかの実施形態において、（特性が測定される）複数の無細胞ＤＮＡ分子は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有するように構成される。１００～１３０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐ、１２０～１５０ｂｐ、１４０～１７０ｂｐ、１５０～１８０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐ、１７０～２００ｂｐ、１８０～２１０ｂｐ、１９０～２２０ｂｐが含まれるがこれらに限定されない他のサイズ範囲、及び他のサイズ範囲又は異なるサイズ範囲の複数の組み合わせが、他の実施形態で使用されるであろう。

【0222】

いくつかの実施形態において、異なるサイズ範囲及び異なるゲノム位置にわたる不揃いな末端を機械学習アルゴリズムのトレーニングデータとして使用して、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、異常細胞などを正常組織から区別することができる。機械学習アルゴリズムには、線形回帰、ロジスティック回帰、深層再帰型ニューラルネットワーク、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、ｋ平均クラスタリング、ノイズを伴うアプリケーションの密度に基づく空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0223】

ステップ３３０８において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して、不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの場合では、不揃い指数値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを同定する。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する（図３１Ｃ）。

【0224】

第１の複数の核酸分子が指定されたサイズ範囲にある場合、方法は、第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の特性を測定することを含み得る。第２の複数の核酸分子は、第２の指定されたサイズ範囲を有するサイズを有し得る。不揃いな末端値を決定することは、第１の複数の核酸分子の測定された特性と、第２の複数の核酸分子の測定された特性とを使用して、比を計算することを含み得る。不揃い指数値は、本明細書に記載の不揃いな末端比又はオーバーハング指数比を含み得る。

【0225】

ステップ３３１０において、不揃い指数値が参照値と比較される。参照値は、第１の鎖と第２の鎖の間の指定された長さのオーバーハングに基づいて決定することができる。いくつかの場合では、参照値又は比較は、トレーニングデータセットを使用した機械学習を使用して決定される。比較は、生物学的試料又は個体に関する異なる情報を決定するために使用し得る。

【0226】

ステップ３３１２において、生物試料中の臨床的に関連するＤＮＡ分子の画分が、比較に基づいて決定される。いくつかの場合では、参照値は、病態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。別の例として、参照値は、病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。参照試料から複数の参照値を決定でき、異なる参照値は、病態の異なるレベルを識別する可能性がある。

【0227】

様々な実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を測定することは、組織特異的対立遺伝子又はエピジェネティックマーカーを使用して、又は、例えば、米国特許公開第２０１３／０２３７４３１号に記載されているようなＤＮＡ断片のサイズを使用して、実施され得、それは参照によって全体が組み込まれる。組織特異的なエピジェネティックマーカーは、試料における組織特異的なＤＮＡメチル化パターンを示すＤＮＡ配列を含み得る。

【0228】

様々な実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡは、胎児ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、移植された臓器由来のＤＮＡ、及び特定の組織タイプ（例えば、特定の臓器由来）からなる群から選択され得る。臨床的に関連するＤＮＡは、特定の組織タイプのものであり得、例えば、特定の組織タイプは、肝臓又は造血性である。対象が妊婦である場合、臨床的に関連するＤＮＡは、胎児ＤＮＡに対応する胎盤組織であり得る。別の例として、臨床的に関連するＤＮＡは、がんを有する臓器に由来する腫瘍ＤＮＡであり得る。

【0229】

概して、１つ以上の較正試料から決定された１つ以上の較正値は、画分濃度が測定されている生物学的（試験）試料に使用されるのと同様のアッセイを使用して生成されることが好ましい。例えば、配列決定ライブラリは同じ方法で生成され得る。処理技術の２つの例は、ＧｅｎｅＲｅａｄ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｓｈｏｐ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｇｅｎｅｒｅａｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｋｉｔ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びＳＰＲＩ（固相可逆固定化、ＡＭＰｕｒｅビーズ、ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎ．ｈｋ／ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ｄｅｐｒ／ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｄｅｐｒ／ｃｌｅａｎｕｐ－ａｎｄ－ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ｐｃｒ）である。ＧｅｎｅＲｅａｄは、主に腫瘍断片である短いＤＮＡを除去し得、それは、野生型及び変異体断片と同様に胎児及び移植の場合の末端モチーフの相対頻度に影響を与え得る。

【0230】

参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値又は較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。参照値を決定するための較正データ点は、測定された不揃い指数値及び臨床的に関連するＤＮＡの測定された／既知の画分を含むことができる。画分が別の技法（例えば、組織特異的対立遺伝子を使用）を介して測定される、任意の試料についての測定された不揃いな末端値は、参照値に対応させることができる。別の例として、検量線（関数）を較正データポイントに適合させることができ、参照値は検量線上のポイントに対応させることができる。したがって、新しい試料の測定された不揃いな末端値を較正関数に入力することができ、これにより、臨床的に関連するＤＮＡの画分を出力することができる。

【0231】

Ｃ．生物学的混合物を用いた異常細胞の検出
二本鎖ＤＮＡ間の指定された長さのオーバーハングはまた、特定のヌクレアーゼの末端切断シグネチャと関連付けることができる。特定の対象の生物学的試料について、この特性を有するＤＮＡ分子の量を同定するパラメータ（例えば、指定された長さのオーバーハング）を使用して、異常細胞と正常細胞とを区別することができる。例えば、不揃い指数値などのパラメータは、不揃い指数値が正常細胞を表す別の不揃い指数値と比較して高いという決定に応答して、ＨＣＣ細胞を含む生物学的試料を予測することができる。このような区別を使用して、対象の病理レベルを予測することができる。

【0232】

１．異常細胞由来のＤＮＡ対正常細胞由来のＤＮＡの不揃い
図３４は、いくつかの実施形態による、野生型、ＤＮＡＳＥ１^－／－、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－を含む異なる遺伝子型にわたるマウスにおける血漿ＤＮＡの不揃い指数値の箱ひげ図を示す。図３４を参照して、ｙ軸は、メチル化シトシン（ＪＩ－Ｍ）の充填に基づく不揃い指数値を示す。ＷＴ：野生型；ＤＮＡＳＥ１^－／－：ＤＮＡＳＥ１欠失マウス。ＤＮＡＳＥ１^－／－：ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠失マウス。ヌクレアーゼと血漿ＤＮＡ断片化パターンの間の関連付けを明らかにするアプローチを更に検証するために、１億１，５００万（範囲：３，１００万～２億２，３００万）のマッピングされた対形成末端リードの中央値を使用して、１２匹の野生型マウス、ＤＮＡＳＥ１を欠失した（ＤＮＡＳＥ１^－／－）７匹のマウス、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失した（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－）５匹のマウスの配列を決定した。１３０～１６０ｂｐの血漿ＤＮＡ断片を分析した。図３４に示すように、野生型マウスと比較して、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３を欠失させたマウス（ＤＮＡＳＥ１Ｌ３^－／－）では不揃い（ＪＩ－Ｍ）の増加が観察されたのに対し、ＤＮＡＳＥ１を欠失させた（ＤＮＡＳＥ１^－／－）マウスでは減少傾向が見られた（図３４）（Ｐ値：０．０１；クラスカル・ウォリス検定）。これらの結果は、血漿ＤＮＡの不揃いを使用してヌクレアーゼの活性を監視することができる可能性を示唆している。一方、これらの結果によって、ＤＮＡＳＥ１が血漿ＤＮＡにおける長い不揃いな末端の生成に寄与するが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は比較的短い不揃いな末端又は平滑末端を有する血漿ＤＮＡ分子の生成に役割を果たすことも示唆される。

【0233】

図３５Ａは、いくつかの実施形態による、正常肝臓組織及び肝臓がん組織におけるＤＮＡＳＥ１遺伝子発現の箱ひげ図を示し、図３５Ｂは、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有する患者とＨＣＣを有さない患者との間のＪＩ－Ｕ値の箱ひげ図を示し、図３５Ｃは、いくつかの実施形態による、サイズ選択あり及びサイズ選択なしの断片によって推定されるＪＩ－Ｕ間の性能を比較するためのＲＯＣ曲線を示す。マウスモデルで示された結果に基づいて、ＨＣＣ腫瘍においてＤＮＡＳＥ１発現がアップレギュレートされたが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がダウンレギュレートされたため、ＨＣＣを有する患者における血漿ＤＮＡについての不揃いの異常は増強されるであろう（図３５Ａ）。１３０～１６０ｂｐの範囲内の断片から推定される非常に高いＪＩ－Ｕ値が、ＨＣＣを有さない患者（平均：１３．９；範囲：１２．２～１５．６）と比較して、ＨＣＣを有する患者（平均：１５．３；範囲：１３．２～１７．３）で観察された（図３５Ｂ）（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。ＨＣＣを有する患者と有さない患者との間の１３０～１６０ｂｐの断片を使用したＪＩ－ＵのＡＵＣは０．８７であり、これはサイズ選択のないアプローチ（ＡＵＣ：０．５４）よりも優れていた（図３５Ｃ）。これらの結果は、一実施形態において、１３０～１６０ｂｐの断片についてのＪＩ－Ｕが、がん検出の臨床的可能性を有することを示唆している。１００～１３０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐ、１２０～１５０ｂｐ、１４０～１７０ｂｐ、１５０～１８０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐ、１７０～２００ｂｐ、１８０～２１０ｂｐ、１９０～２２０ｂｐが含まれるがこれらに限定されない他のサイズ範囲、及び他のサイズ範囲又は異なるサイズ範囲の複数の組み合わせが、他の実施形態で使用されるであろう。いくつかの実施形態において、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、及び／又は頭頸部扁平上皮がんを含む組織異常を検出するために、異なる組織タイプにわたる不揃い指数値が生成される。

【0234】

一実施形態において、異なるサイズ範囲及び異なるゲノム位置にわたる不揃いな末端を利用することにより、がんなどの患者を区別するための分類子をトレーニングするために、線形回帰、ロジスティック回帰、深層再帰型ニューラルネットワーク、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、ｋ平均クラスタリング、ノイズを伴うアプリケーションの密度に基づく空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を含むがこれらに限定されない、機械学習アルゴリズムが適用されるであろう。

【0235】

２．組織タイプの異常を決定する方法
図３６は、いくつかの実施形態による、不揃い指数値に基づいて組織の異常レベルを分類する方法を示すフローチャートである。生物学的試料は、複数の無細胞ＤＮＡ分子を含み、複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖と部分的又は完全な二本鎖を形成する。いくつかの場合では、複数の無細胞ＤＮＡ分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖由来の相補部分を有さず、第２の鎖にハイブリダイズせず、第１の鎖の第１の末端にある。異常は、がん（例えば、肝細胞がん、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、及び／又は頭頸部扁平上皮がん）、及び自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス）を含む病理であり得る。いくつかの場合では、生物学的試料における異常は、子癇前症、早産、胎児染色体異数性、又は胎児遺伝性障害を含む、胎盤組織（例えば、母体血漿中に検出される胎盤組織）の異常である。

【0236】

ステップ３６０２において、第１のヌクレアーゼは、１つ以上の組織タイプの正常組織と比較して、１つ以上の組織タイプの異常細胞において異なって調節されることが同定される。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３（デオキシリボヌクレアーゼ１様３）の発現は、健常な対象における肝臓組織と比較して、ＨＣＣ細胞において相対的にダウンレギュレートされる。別の例では、ＤＦＦＢ（ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ）及びＤＮＡＳＥ１（デオキシリボヌクレアーゼ１）の発現は、健常な対象における肝臓組織と比較して、ＨＣＣ細胞において相対的にアップレギュレートされる。ステップ３６０２は、図１７のステップ１７０２と同様の方法で実施され得る。

【0237】

ステップ３６０４において、第１のヌクレアーゼは、ＤＮＡを、第１の鎖と第２の鎖との間に指定された長さのオーバーハングを有するＤＮＡ分子に優先的に切断するように決定される。いくつかの場合では、第１のヌクレアーゼの切断優先度は、別の生物（例えば、マウス）の生物学的試料を分析することによって決定される。

【0238】

いくつかの実施形態において、異なるヌクレアーゼに対応する発現レベルを表すために、複数の不揃い指数値が生成される。複数の不揃い指数値は、正常組織から異常組織を区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、組織タイプを区別するなどのために比較することができる。例えば、異常組織と正常組織とを区別するために超平面を決定することができるように、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、及びＤＮＡＳＥ１）の複数の不揃い指数値を三次元散布図にプロットする。

【0239】

ステップ３６０６において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が測定される。例えば、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、より高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さに相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。ステップ３６０６は、図３３のステップ３３０６と同様の方法で実施され得る。

【0240】

ステップ３６０８において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して、不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの実施形態において、不揃いな末端値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含み得る。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する（図３５Ｃ）。ステップ３６０８は、図３３のステップ３３０８と同様の方法で実施され得る。

【0241】

ステップ３６１０において、生物学的試料中の１つ以上の組織タイプにおける異常レベルの分類が、不揃い指数値と参照値との比較に基づいて決定される。参照値は、第１の鎖と第２の鎖の間の指定された長さのオーバーハングに基づいて決定することができる。いくつかの実施形態において、異常レベルの分類は、病理（例えば、ＨＣＣ）の複数のステージのうちの１つを含む。例えば、ＤＮＡＳＥ１発現がＨＣＣ腫瘍においてアップレギュレートされたが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３はダウンレギュレートされたため、ＨＣＣ患者における血漿ＤＮＡの不揃いの異常が増強されるであろう。いくつかの実施形態において、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、上咽頭がん、及び／又は頭頸部扁平上皮がんを含む組織異常を検出するために、異なる組織タイプにわたる不揃い指数値が生成される。いくつかの場合では、機械学習アルゴリズムを適用して、正常組織から異常細胞を区別するための分類子をトレーニングする。

【0242】

Ｄ．遺伝性障害を決定するための不揃い分析
自己免疫疾患は、体の免疫システムが自己寛容を失い、体の細胞及び組織自体を誤って攻撃するときに発生する。自己免疫疾患は、疾患の異種群であり、８０種類以上の自己免疫疾患が同定されている（Ｈａｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２；１１（１０）：７５４－６５；Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌｉｓｔ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｒｄａ．ｏｒｇ／ｄｉｓｅａｓｅｌｉｓｔ／）。最も一般的な自己免疫疾患には、関節リウマチ、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、及び自己免疫性甲状腺炎が含まれる（Ｈａｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２；１１（１０）：７５４－６５）。

【0243】

自己免疫疾患は、ほぼ任意の臓器系に影響を与え得る。１型糖尿病及び多発性硬化症などのこれらの疾患のいくつかは特定の臓器を攻撃する（Ｂｉａｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８６；３９：５８４－６０２）一方で、例えばＳＬＥなどの他の疾患は複数の臓器を攻撃する（Ｆａｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１９；９６：１－１３）。全ての自己免疫疾患の全体的な累積有病率は５％であるが（Ｈａｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２；１１（１０）：７５４－６５）、近年、有病率が増加する傾向がある（Ｄｉｎｓｅ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２０２０；７２（６）：１０２６－１０３５）。ほとんどの自己免疫疾患は慢性であり、適切な治療で制御することができる。しかしながら、時間の経過とともに個人間及び個人内で不確かな変化する症状により、診断及び疾患の監視が困難になる場合が多い。

【0244】

ｃｆＤＮＡ分子は非ランダムに断片化され、アポトーシス及びネクローシスなどの細胞死を介して体内の様々な組織から放出される（Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５；８：２９；Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１６；３５：３４７－３７６）。血漿核酸の分析は、妊娠、がん、及び同種移植拒絶反応を含むがこれらに限定されない様々な疾患のための非侵襲的予後及び診断ツールとして開発されてきた（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．ＢＭＪ．２０１１；３４２： ｃ７４０１；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７；３７７：５１３－５２２；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８；３５９：９２６－９３０；Ｇｉｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１５；１５：２５４１－２５５１）。血漿ＤＮＡのゲノム及びエピジェネティックなシグネチャについての高解像度分析は、ＳＬＥ患者の疾患活動性を反映することが示されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４；１１１：Ｅ５３０２－１１）。

【0245】

ＤＮＡの分解は、体が健常に機能するための重要なプロセスである（Ｋｅｙｅｌ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１７；４２９（１）：１－１１）。血漿ＤＮＡのクリアランス障害は、自己免疫の発症を引き起こし得る（Ｄｕｖｖｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：５０２）。例えばＤＮａｓｅファミリーなどのヌクレアーゼは、ＤＮＡの断片化において極めて重要な役割を果たす。異なるヌクレアーゼは、異なる組織において異なる発現をする（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）。それらは、血漿ＤＮＡの断片化を調節する役割を果たす（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０６：２０２－２１４）。多くの研究が、様々な自己免疫疾患の病因におけるヌクレアーゼの関与を実証している（Ｍａｌｉｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓ．２０１１；２０１１：９４５８６１；Ｚｙｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；２０１０；５（８）：ｅ１２０９６；Ｇａｔｓｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１７ Ｍａｒ；５０（２）：１２５－１３２）。最近のいくつかの研究では、マウスモデルにおいて、ＤＮＡヌクレアーゼとＤＮＡ末端モチーフなどの血漿ＤＮＡ末端モダリティとの関係（Ｓｅｒｐａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１９；１１６：６４１－６４９；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０６：２０２－１４）及び不揃いな末端（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２０；３０：１１４４－１１５３）が示されている。このような末端モダリティをＤＮＡ断片化に関連する新しいタイプのバイオマーカーとして開発することができた。例えば、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損症を有するヒト患者は、血漿ＤＮＡの断片サイズ及び末端モチーフに異常を示した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１０７：８８２－８９４）。

【0246】

多くの免疫学的検査が開発され、診療所で日常的に使用されている。例えば、患者の血液試料は、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗可溶性核抗原抗体（ＥＮＡ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）について検査することができる。しかしながら、特に、ほとんどの自己免疫疾患は本来的に慢性であり、かつ、不明確な症状を示すという事実があり、自己免疫疾患の不均一性並びに早期発見及び治療の重要性のために、自己免疫疾患の診断及び監視について感度の高い方法が必要である。

【0247】

本開示のいくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡの末端モダリティに関連する様々なパラメータが、自己免疫疾患を検出及び監視するために使用される。末端モダリティには、末端モチーフ及び不揃いな末端が含まれ得、パラメータには、多くのリード（末端モチーフ）及び不揃い指数値（不揃いな末端）が含まれ得る。そのような末端モダリティは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、ＴＲＥＸ１、ＡＥＮ、ＥＸＯ１、ＤＮＡＳＥ２、ＥＮＤＯＧ、ＡＰＥＸ１、ＦＥＮ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、及びＥＸＯＧを含むがこれらに限定されないＤＮＡヌクレアーゼ活性に関連し得る。例えば、血漿ＤＮＡ不揃いな末端の提示に関連するパラメータを使用して、健常な対照、非活動性ＳＬＥ、及び活動性ＳＬＥを区別することができる。

【0248】

１．ＤＮＡＳＥ１Ｌ３疾患に関連するバリアントにおける無細胞ＤＮＡの不揃い
ＤＮＡＳＥ１Ｌ３疾患に関連するバリアントにわたる無細胞ＤＮＡの不揃いの違いを同定するために、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３疾患に関連するバリアントを有する５人の対象の各々について、血漿ＤＮＡの不揃いを測定した。図３７は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連するバリアントの異なる遺伝子型を有するヒト対象におけるＤＮＡ分子の不揃いな末端の分布を同定するグラフを示す。線３７０２は、ヘテロ接合性ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連するバリアントである「Ｈ１」を表す（すなわち、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３遺伝子の１つのコピーがまだ機能している）。線３７０４～３７１０は、ホモ接合性ＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントを有する（すなわち、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３遺伝子の両方のコピーが、機能的なＤＮＡＳＥ１Ｌ３酵素を生成することができない）対象である、各々「Ｈ２」、「Ｈ４」、「Ｖ１１」、及び「Ｖ１２」をそれぞれ表す。Ｈ２及びＨ４対象は、ホモ接合フレームシフトｃ．２９０＿２９１ｄｅｌＣＡ（ｐ．Ｔｈｒ９７Ｉｌｅｆｓ＊２）変異を有していた。

【0249】

短い血漿ＤＮＡ断片（例えば、＜１５０ｂｐ）のＪＩ－Ｕとは対照的に、長い血漿ＤＮＡ断片（例えば、＞２００ｂｐ）のＪＩ－Ｕは、ヘテロ接合型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３バリアントを有する対象（ＪＩ－Ｕ中央値：３８．００）と比較して、ホモ接合型ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連するバリアントを有する対象において低かった（ＪＩ－Ｕ中央値：２２．０１）。

【0250】

これらの結果により、血漿ＤＮＡの不揃いがヌクレアーゼ欠損症を有する患者の検出のために使用することができることが示唆される。長い血漿ＤＮＡの不揃いは、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を反映するためのより感度の高いアプローチを提供する。一実施形態において、血漿ＤＮＡの不揃いは、ＤＮＡヌクレアーゼ関連疾患の治療の関連における治療的介入を監視するために使用されるであろう。

【0251】

２．ＳＬＥを有する患者における無細胞ＤＮＡの不揃い
図３８は、対照対象とＳＬＥを有する患者との間の末梢血単核細胞におけるＤＮＡＳＥ１Ｌ３の遺伝子発現レベルを同定する箱ひげ図を示す。図３８に示されるように、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルの有意な減少が、発表されたデータ（Ｒｉｎｃｈａｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０２０ Ｄｅｃ；１０（８）：ｅ２４４）（図３）からＳＬＥ患者において観察されたが、これはＤＮＡＳＥ１Ｌ３部分欠損症とみなされ得る。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の異なる発現レベルに照らして、１４人の健常な対照の試料、１４人の非活動性ＳＬＥ患者、及び２０人の活動性ＳＬＥ患者を含む、以前に公開された重亜硫酸塩配列データに基づき（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４；１１１：Ｅ５３０２－１１）、血漿ＤＮＡの不揃いを分析した。

【0252】

図３９は、対照サンプル並びに非活動性ＳＬＥ及び活動性ＳＬＥを有するサンプルの血漿ＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ）の不揃いを同定するグラフ３９００のセットを示す。図３９では、グラフ３９０２は、対照対象３９０４、不活動性ＳＬＥを有する対象３９０６、及び活動性ＳＬＥを有する対象３９０８における様々なＤＮＡ断片サイズにわたる不揃い指数（ＪＩ－Ｕ）値を示す。グラフ３９０２は、活動性ＳＬＥ患者のＪＩ－Ｕが、それらの対照対象（中央値ＪＩ－Ｕ値：５２．３１）と比較して、約２３０ｂｐのサイズを有する分子（ＪＩ－Ｕ中央値：３９．１６）の最低の不揃いレベルを示したことを示す。非活動性ＳＬＥ患者の血漿ＤＮＡ不揃い（ＪＩ－Ｕ中央値：４８．２１）は、対照対象及び活動性ＳＬＥを有する患者の中間であることが示された。

【0253】

箱ひげ図３９１０は、対照対象、非活動性ＳＬＥ対象、及び活動性ＳＬＥ対象の２００ｂｐ～３００ｂｐ範囲内の血漿ＤＮＡの不揃い指数値を示す。箱ひげ図３９１０では、２００ｂｐ～３００ｂｐのサイズ範囲を有する選択された断片の不揃いにより、３つの群、すなわち、対照対象、非活動性ＳＬＥ対象、及び活動性ＳＬＥ対象を区別することが可能となった。活動性ＳＬＥ患者における不揃いの中央値２５．９１％の減少（ＪＩ－Ｕ値の中央値：３６．２１；範囲：３０．３４～３８．４７）が、対照対象（ＪＩ－Ｕ中央値：４５．５９；範囲：４１．４６～４９．０９）と比較して観察され（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）、不揃いの中央値８．６８％の減少が非活動性ＳＬＥの患者において観察された（ＪＩ－Ｕ値の中央値：４１．９５；範囲：３７．１４～５０．５１）（Ｐ値＝０．０００７９）、マン・ホイットニーのＵ検定）。

【0254】

比較として、箱ひげ図３９１２は、対照対象、非活動性ＳＬＥ対象、及び活動性ＳＬＥ対象における短い血漿ＤＮＡ（１１５ｂｐより短い）の割合を示す。箱ひげ図３９１２に示されるように、短い血漿ＤＮＡ（すなわち、＜１１５ｂｐ）の割合に関するメトリック（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４；１１１：Ｅ５３０２－１１）は、２つの群、すなわち、活動性ＳＬＥ対象に対する対照対象及び非活動性ＳＬＥ対象しか区別できなかった。非活動性ＳＬＥ群と対照群との間で有意な増加は観察されなかったが、これは、不揃い指数値が、正常な対象とＳＬＥの対象とを区別するためのより効果的な手法であり得ることを示す。

【0255】

図４０は、対照対象とＳＬＥ対象とを区別するための不揃い指数値及びサイズ比方法の性能を同定する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線４０００を示す。ＲＯＣ曲線４００２は、対照対象と不活動ＳＬＥ対象とを区別するための不揃い指数値及びサイズ比方法の性能を示す。血漿ＤＮＡサイズ比（ＡＵＣ：０．７；ライン４００６）を使用する技法と比較して、不揃い指数値は、非活動性 ＳＬＥ 患者と健常な対象（ライン４００４）を区別する際にＡＵＣ０．８６での改善された性能を示した。図４０はまた、不活動性ＳＬＥ対象と活動ＳＬＥ対象とを区別するための不揃い指数値及びサイズ比方法の性能を同定するＲＯＣ曲線４００８を示す。ここで、不揃いは、サイズ比法に基づく結果（ＡＵＣ：０．９５；ライン４０１０）と比較して、活動性ＳＬＥ患者と非活動性ＳＬＥ患者とを区別する際にＡＵＣ０．９８（ライン４００８）での改善された性能を示した。したがって、２００～３００ｂｐのサイズ範囲において決定された不揃い指数値は、ＳＬＥを検出するためのバイオマーカーとして使用することができる。更に、参照試料を異なるヌクレアーゼノックアウトを有する試料又は変異ヌクレアーゼ遺伝子を有することが既知である試料と比較することにより、不揃いな末端分析のための最適なサイズ範囲を決定することができる。

【0256】

３．抗凝固剤とともにインキュベートした試料の不揃いな末端分析
ヘパリンは、ＤＮＡＳＥ１活性を増強し、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３活性を阻害することが既知である。ＤＮＡＳＥ１^－／－マウスモデルの使用とは別に、不揃いな末端生成プロセスにおけるＤＮＡＳＥ１の役割を更に調べるために、インビトロヘパリンインキュベーション法を使用した。

【0257】

図４１は、野生型マウスからの０時間のヘパリンインキュベーションから６時間のヘパリンインキュベーションにおける異なる断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ値を特定するグラフ４１００を示す。グラフ４１００に示されるように、ＷＴマウスにおけるＤＮＡＳＥ１の存在（ＪＩ－Ｍ：３４．０１）は、６時間のヘパリンインキュベーション後に不揃いが６２．５７％増加する（ＪＩ－Ｍ：４６．７２）。したがって、異なるヘパリンインキュベーション時間によるＷＴマウスＤＮＡ分子の全体的なＪＩ－Ｍ分布は、６時間のヘパリンインキュベーション血漿からのＤＮＡ分子がより高い不揃いを有することを示す。

【0258】

図４２は、ＤＮＡＳＥ１^－／－マウスについてヘパリンとともに行う０時間のインキュベーションから６時間のインキュベーションにおける異なる断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ値を同定するグラフ４２００を示す。グラフ４２００は、ＤＮＡＳＥ１がノックアウトされたときに、６時間のヘパリンインキュベーションにおける不揃いの増加が消失することを示す。ＤＮＡＳＥ１^－／－ｃｆＤＮＡ分子の断片サイズにわたるＪＩ－Ｍ分布は、０時間～６時間のインキュベーションにおいて全体的に同様の傾向を示す。６時間のヘパリンインキュベーション後の野生型マウスにおける不揃いの有意な増加と比較して、ＤＮＡＳＥ１^－／－マウスのサイズにわたる不揃いの全体的な傾向はほぼ重複することが見出された。

【0259】

これらのデータは、ＤＮＡＳＥ１の活性のヘパリンに基づく増強により、特に短い血漿ＤＮＡ断片において不揃いが増加したことを示唆し、これは、ＤＮＡＳＥ１が短い血漿ＤＮＡ断片に関する不揃いな末端生成の原因であり得ることを意味する。

【0260】

４．遺伝性障害を決定するための方法
様々な技法を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝性障害を検出することができる。遺伝性障害は、特定の遺伝子に対応するヌクレアーゼの変異（例えば、欠失）に関連し得る。そのような変異により、ヌクレアーゼは存在しないか、又は不規則に機能する可能性がある。したがって、影響を受けたヌクレアーゼの発現レベルの変化の程度を決定することができる。いくつかの場合では、生物学的試料中の複数の核酸分子に対応する不揃い指数値を決定して、ヌクレアーゼ発現レベルの変化を同定することができる。これらの不揃い指数値は、遺伝性障害を決定するために対象について決定された不揃い指数値と比較することができる参照値として使用することができる。そのような方法の例が以下のフローチャートに示される。１つのフローチャートについて説明される技術は、他のフローチャートにも適用可能であり、簡潔にするために繰り返されない。

【0261】

ａ）インキュベーションを使用した遺伝性障害の経時的な検出
試料の異なるインキュベーション量は、遺伝性障害が存在するかどうかに応じて、異なる不揃い指数値をもたらし得る（例えば、図４０及び４１）。特定の不揃い指数値は、特定のヌクレアーゼが発現され、かつ、適切に機能しているかどうかに依存し得るため、そのような挙動の正常からの変化は、遺伝性障害が存在することを示し得る。

【0262】

図４３は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法４３００を例示するフローチャートを示す。本明細書の方法４３００及び他の方法は、コンピュータシステムによって制御されることを含めて、コンピュータシステムを用いて全体的又は部分的に実施され得る。例として、遺伝子は、ヌクレアーゼをコードすること、その転写のためのエピジェネティックマーカーを有すること、そのＲＮＡ転写物が存在すること、可変的にスプライシングされたＲＮＡを有すること、又はそのＲＮＡが可変的に翻訳されることによって、ヌクレアーゼに関連付けられ得る。遺伝性障害は、特定の組織（例えば、腫瘍組織）にのみ存在する可能性がある。したがって、遺伝性障害の検出は、がんのレベルを決定するために使用され得る。

【0263】

ブロック４３１０で、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さと相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が、第１の生物学的試料の第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について測定される。第１の生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さにわたってインキュベートされ得る。インキュベーションは、特定の温度以上、例えば、摂氏５度、１０度、１５度、２０度、２５度、又は３０度を超えることができる。より低温での保管は、インキュベーション時間の一部としてカウントされない場合がある。第１の時間の長さは、ゼロであり得る。他の実装例において、第１の生物学的試料は、抗凝固剤で処理されることなく、第１の時間の長さにわたってインキュベートされる。例として、抗凝固剤は、ＥＤＴＡ又はヘパリンであり得る。ＥＤＴＡは、血漿ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３）を阻害して、分析用にｃｆＤＮＡを保存するのに役立ち得る。

【0264】

いくつかの場合では、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、より高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さに相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。いくつかの場合では、特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態である。他の場合では、特性は、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の長さである。

【0265】

いくつかの実施形態において、（特性が測定される）複数の無細胞ＤＮＡ分子は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有するように構成される。１００～１３０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐ、１２０～１５０ｂｐ、１４０～１７０ｂｐ、１５０～１８０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐ、１７０～２００ｂｐ、１８０～２１０ｂｐ、１９０～２２０ｂｐが含まれるがこれらに限定されない他のサイズ範囲、及び他のサイズ範囲又は異なるサイズ範囲の複数の組み合わせが、他の実施形態で使用されるであろう。

【0266】

いくつかの実施形態において、異なるサイズ範囲及び異なるゲノム位置にわたる不揃いな末端を機械学習アルゴリズムのトレーニングデータとして使用して、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、異常細胞などを正常組織から区別することができる。機械学習アルゴリズムには、線形回帰、ロジスティック回帰、深層再帰型ニューラルネットワーク、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、ｋ平均クラスタリング、ノイズを伴うアプリケーションの密度に基づく空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0267】

ブロック４３２０で、第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して、第１の不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、第１の不揃い指数値は、第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの場合では、第１の不揃い指数値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを同定する。いくつかの実施形態において、第１の不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する。

【0268】

ブロック４３３０で、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さと相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が、第２の生物学的試料の第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について測定される。第２の生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さよりも長い第２の時間の長さにわたってインキュベートされ得る。他の実装例において、第２の生物学的試料は、抗凝固剤によって処理されることなくインキュベートされ得る。時間の長さは、温度係数を含むことができ、例えば、より高い温度は、時間の長さを取得するために時間単位を乗算した重み付け係数として機能し得る。このように、より大きい／同じ量の細胞死が、より高い温度でのインキュベーションにより、試料／より短い時間で生じ得る。ステップ４３３０は、ステップ４３１０と同様の様式で実施され得る。

【0269】

ブロック４３４０で、第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して、第２の不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、第２の不揃い指数値は、第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの場合では、第２の不揃い指数値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを同定する。いくつかの実施形態において、第２の不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する第２の複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する。ステップ４３４０は、ステップ４３２０と同様の様式で実施され得る。

【0270】

ブロック４３５０で、第１の不揃い指数値を第２の不揃い指数値と比較して、遺伝子が対象における遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定する。いくつかの実装例において、第１の不揃い指数値を第２の不揃い指数値と比較することは、第１の不揃い指数値が第２の不揃い指数値と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定することを含み、統計的に有意な差又は他の分離値がある場合、不揃い指数値が他よりも大きいことを含み得る。したがって、分類は、第１の不揃い指数値が第２の不揃い指数値の閾値内にある場合、遺伝性障害が存在するというものであり得る。

【0271】

いくつかの場合では、遺伝性障害には、関節リウマチ、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺炎、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。分類は、例えば、ヌクレアーゼのコード遺伝子が両方の染色体において、一方の染色体においてのみ欠損しているか、特定の組織においてのみ欠損しているか、又は変異が発現を低減するが、ヌクレアーゼの存在を排除しないかからの、障害のレベル又は重症度であり得る。ヌクレアーゼの発現のそのような部分的低減は、変異（例えば、欠失）が特定の組織においてのみ存在する場合、又は変異が支持領域内、例えば、ヌクレアーゼの発現レベルに影響を及ぼすｍｉＲＮＡなどの非コード領域内に存在する場合に生じ得る。参照レベルと比較した差の異なる量の結果としての、遺伝性障害の異なるレベル又は重症度。複数の参照レベルを使用して、差の分類を決定することができる。

【0272】

いくつかの例では、第１の不揃い指数値が不揃い指数値量の閾値内にある場合、分類は、遺伝性障害が存在するというものであり得る。いくつかの実施形態において、比較は、第１の不揃い指数値と第２の不揃い指数値との間の分離値を決定することを含むことができる。分離値を参照値（例えば、カットオフ）と比較して、分類を決定することができる。参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値又は較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。第１の不揃い指数値及び第２の不揃い指数値は、参照値／較正値と比較することができるパラメータ値の例である。このような技法は、本明細書の全ての方法に使用され得る。

【0273】

１つ以上の較正値は、１つ以上の参照値であり得るか、又は参照値を決定するために使用され得る。参照値は、分類についての特定の数値に対応することができる。例えば、較正データ点（較正値、及びヌクレアーゼ活性又は有効性のレベルなどの測定された特性）を、補間又は回帰を介して分析して、較正関数（例えば、線形関数）を決定することができる。次いで、較正関数の点を使用して、測定された量又は他のパラメータ（例えば、２つの量間、若しくは測定された量と参照値との間の分離値）の入力に基づいて、入力としての数値分類を決定することができる。そのような技術は、本明細書に記載の方法のいずれにも適用され得る。

【0274】

試験されている遺伝性障害のタイプは、ｃｆＤＮＡの挙動が異なるため、障害が存在するかどうかを決定するために使用される基準のタイプを提供することができる。

【0275】

一例として、遺伝性障害には、遺伝子の欠失が含まれ得る。例として、遺伝子は、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、又はＤＮＡＳＥ１であり得る。ヌクレアーゼは、細胞内ＤＮＡを切断するもの、例えば、ＤＦＦＢ又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得る。ヌクレアーゼは、細胞外ＤＮＡを切断するもの、例えば、ＤＮＡＳＥ１又はＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得る。

【0276】

ｂ）参照値を使用した遺伝性障害の検出
上記のように、異なるインキュベーションを伴う試料間の不揃いの差又は他の分離値（例えば、小さいか大きいか）を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子の遺伝性障害を分類することができる。あるいは、核酸分子の測定された特性から決定された不揃い指数値が、参照値と比較され得る。そのような参照値は、健常な対象において測定された不揃い指数値に対応し得る。

【0277】

図４４は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法４３００を例示するフローチャートを示す。方法４３００に使用されるのと同様の技術が、方法４４００で使用され得る。例として、遺伝子は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、又はＤＮＡＳＥ１である。いくつかの場合では、遺伝性障害には、関節リウマチ、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺炎、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0278】

ブロック４４１０で、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さと相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が、生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について測定される。いくつかの場合では、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、より高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さに相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。いくつかの場合では、特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態である。他の場合では、特性は、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の長さである。図４３のブロック４３１０に使用されるのと同様の技法が、ブロック４４１０で使用され得る。

【0279】

いくつかの場合では、生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、指定された時間にわたってインキュベートされ得る。インキュベーションは、特定の温度以上、例えば、摂氏５度、１０度、１５度、２０度、２５度、又は３０度を超えることができる。より低温での保管は、インキュベーション時間の一部としてカウントされない場合がある。第１の時間の長さは、ゼロであり得る。他の実装例において、生物学的試料は、抗凝固剤で処理することなく、指定された時間にわたってインキュベートされる。例として、抗凝固剤は、ＥＤＴＡ又はヘパリンであり得る。ＥＤＴＡは、血漿ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３）を阻害して、分析用にｃｆＤＮＡを保存するのに役立ち得る。

【0280】

ブロック４４２０で、複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの場合では、不揃い指数値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを同定する。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する。例えば、生物試料中のＳＬＥを検出するための不揃い指数値は、２００～３００ｂｐｓ以内のサイズを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応し得る。図４３のブロック４３２０に使用されるのと同様の技法が、ブロック４４２０で使用され得る。

【0281】

ブロック４４３０で、不揃い指数値を参照値と比較して、遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定する。様々な実施形態において、第１の量を第２の量と比較することは、（１）不揃い指数値が参照値よりも少なくとも閾値量だけ異なるか、又は差が閾値量未満であるかを決定すること、（２）不揃い指数値が参照値よりも少なくとも閾値量だけ少ないかどうかを決定すること、又は（３）不揃い指数値が参照値よりも少なくとも閾値量だけ大きいかどうかを決定することを含み得る。不揃い指数値は、パラメータ値の一例であり、参照値は、較正値であるか、又は較正試料の較正値から決定され得る。いくつかの場合では、分類は、遺伝子が対象において症候性障害又は無症候性障害（例えば、活動性ＳＬＥ）を示すかどうかを更に同定する。

【0282】

参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値又は較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。例えば、ヌクレアーゼ活性は、連続変数であり得、量と参照値との比較は、例えば、本明細書に記載されるように、量を較正関数に入力することによって決定され得る。既知の分類に関して、参照値は、遺伝性障害を有さない１つ以上の参照試料から決定することができる。更に又はあるいは、参照値は、遺伝性障害を有する１つ以上の参照試料から決定される。ブロック４３５０に使用されるのと同様の技術が、ブロック４４３０で使用され得る。

【0283】

Ｅ．ヌクレアーゼ活性を監視するための不揃いな末端分析
ヌクレアーゼ、例えば、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、及びＤＮＡＳＥ１Ｌ３の活性を監視するために、無細胞ＤＮＡの不揃いを決定することができる。そのような活性は、内部ヌクレアーゼから（すなわち、身体の自然なプロセスとして）、及び／又はヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡＳＥ１を添加した結果からのものであり得る。そのような監視を使用して、治療の有効性について遺伝性障害の変化を決定することができる。例えば、ＤＮＡＳＥ１を使用して対象を治療することができる。処理の効果は、Ｔ末端断片のパーセンテージ又はサイズを分析することによって測定され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡＳＥ１（例えば、外因的に添加された）を使用して、ＳＬＥなどの自己免疫状態を治療することができる。活性の決定に応じて、ヌクレアーゼの治療の投与量が変更され得る。いくつかの場合では、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＴ）の活性が監視される。

【0284】

異常なヌクレアーゼ活性（例えば、正常／健康な値に対応する参照値よりも上又は下）の決定は、単独で、又は他の要因と組み合わせて、病理のレベルを示すことができる。病理は、がんであり得る。

【0285】

１．ヌクレアーゼの切断特性を決定する際の不揃い
マウスモデルでの研究とは別に、不揃いはまた、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９などの市販の酵素の切断特性を明らかにするために使用することができる。例えば、エキソヌクレアーゼＴ（ＥｘｏＴ）は、平滑末端を生成するために一般的に使用される酵素である。既知の不揃いな末端を有するＤＮＡ分子（例えば、合成オリゴヌクレオチド）に基づいて、ＥｘｏＴ処理した又はＥｘｏＴ処理しない不揃いな末端の検出を研究した。

【0286】

図４５は、ＥｘｏＴで処理した又はＥｘｏＴで処理していないアニールされたｄｓＤＮＡの不揃いを同定するプロトコル４５００を示す。プロトコル４５０２は、ＥｘｏＴを使用してライブラリを調製するプロセスを示し、これは、不揃いな末端部位の上流にあるいくつかの余分な部位が、アニールされたオリゴ対照のｍＣとともに取り込まれるであろうことを示す。大文字による文字は、二本鎖領域を表す。小文字による文字は、一本鎖の不揃いな末端を表す。プロトコル４５０２に示すように、不揃いな末端部位の１ｂｐ上流の６８．８％はメチル化シトシンの取り込みを示し、不揃いな末端部位の２ｂｐ上流の１５．０４％はメチル化シトシンの取り込みを示し、不揃いな末端部位の３ｂｐ上流の２．７１％は、メチル化シトシンの取り込みを示した。

【0287】

プロトコル４５０４は、ＥｘｏＴなしで調製されたライブラリを調製するためのプロセスを示し、アニールされたオリゴ対照における不揃いな末端部位の上流にそのように余分なｍＣを取り込みことはない。プロトコル４５０２とは対照的に、不揃いな末端の近くにおけるメチル化シトシンの余分な取り込みは、ＥｘｏＴ処理なしの試料では観察できなかった。箱ひげ図４５０６は、２つの異なるライブラリ調製プロセスを使用した８つの対の試料における不揃いな末端の平均長さを示す。ＥｘｏＴなしで調製されたＤＮＡライブラリ（中央値ＪＩ－Ｍ値：１３．７４；範囲１１．８４～１５．２７）と比較して、ヒト試料において、１５．１６％の不揃いの増加中央値が見出された（中央値ＪＩ－Ｍ値１５．８２；範囲１３．４０～１９．２１）（図１０Ｃ）。これらの結果により、ＥｘｏＴが二本鎖領域においても３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有することが示唆される。

【0288】

２．ヌクレアーゼ活性を監視するための方法
図４６は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための方法４６００を例示するフローチャートである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＤＮＡＳＥ１、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＥＮＤＯＧ、ＡＰＥＸ１、ＦＥＮ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ２、又はＤＮＡＳＥ２などのエンドヌクレアーゼである。更に又はあるいは、ヌクレアーゼは、ＥｘｏＴ、ＥＸＯＧ、ＴＲＥＸ１、又はＥＸＯ１などのエキソヌクレアーゼである。方法４６００の態様は、本明細書に記載の他の方法と同様の方法で実施され得る。

【0289】

ブロック４６１０で、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さと相関する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が、生物学的試料の複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子について測定される。いくつかの場合では、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、より高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さに相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。いくつかの場合では、特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態である。他の場合では、特性は、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の長さである。図４３のブロック４３１０に使用されるのと同様の技法が、ブロック４６１０で使用され得る。

【0290】

ブロック４６２０で、複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの場合では、不揃い指数値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを同定する。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する第１の複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する。図４３のブロック４３０に使用されるのと同様の技法が、ブロック４６２０で使用され得る。

【0291】

ブロック４６３０で、不揃い指数値を参照値と比較して、ヌクレアーゼの活性の分類を決定する。いくつかの実施形態において、活性が参照値を下回る場合、対象は、障害を有すると分類され得る。そのような場合、対象は、例えば本明細書に記載されるように治療され得る。分類は、数分類値であり得、これをカットオフと比較して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの第２の分類を決定することができる。

【0292】

参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値又は較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。例えば、ヌクレアーゼ活性は、連続変数であり得、量と参照値との比較は、例えば、本明細書に記載されるように、量を較正関数に入力することによって決定され得る。

【0293】

いくつかの場合では、参照値は、ヌクレアーゼの活性について既知又は測定された分類を有する１つ以上の参照試料を使用して決定される。１つ以上の参照試料についてのヌクレアーゼの活性は、本明細書に記載されるように、例えば、ｃｆＤＮＡ量の蛍光測定又は分光光度測定で測定され得、これは、それ自体で、又はヌクレアーゼ含有試料の添加の前、後、及び／又はそれとリアルタイムで行われ得る。別の例は、放射状酵素拡散法を使用することである。較正値は、１つ以上の参照試料で測定することができ、それにより、参照／較正試料についての２つの測定値を含む較正データ点を提供する。１つ以上の参照試料は、複数の参照試料であり得る。複数の参照試料の測定された活性及び測定された量に対応する較正データ点を、例えば、補間又は回帰によって近似する較正関数が決定され得る。

【0294】

ＶＩ．不揃いな末端と末端シグネチャとの組み合わせ分析
末端シグネチャ及び不揃いな末端の両方を一緒に使用して、ヌクレアーゼの発現レベルを表すことができる。例えば、図４７Ａ及び４７Ｂは、いくつかの実施形態による、ＧＣ％と不揃いな末端の長さとの間の関係を示すグラフの例を示す。短い不揃いな末端（例えば、３、４、及び５ｎｔ）を有する一本鎖ＤＮＡは、長い不揃いな末端を有するもの（例えば、＞１２ｎｔ；平均ＧＣ％：４５％）よりも高いＧＣ％（平均：５１％）を含んでいた（図４７Ａ）。しかしながら、そのようなパターンは、ヒト参照ゲノムからインシリコでランダムに生成された結果には存在しなかった（図４７Ｂ）。これらの結果により、異なる不揃いな末端の長さにわたって塩基組成が均一ではないことが示唆された。実施形態は、配列モチーフと不揃い指数との間のこの相乗効果を使用することができる。一実施形態において、モチーフ多様性スコアが、不揃いな末端の長さ６の分子について最大のＡＵＣ値（ＡＵＣ：０．８４）を与えることを見出し、これは、不揃いな末端の長さによる選択なしの分子を使用したもの（ＡＵＣ：０．７７）よりも高かった。したがって、これらの結果は、特定の不揃いな末端の長さ又は所望の範囲を有する分子を選択的に分析することにより、区別力を改善することができることを示唆している。

【0295】

図４８は、いくつかの実施形態による、ＣＣＧＴ末端モチーフを有する断片のパーセンテージの箱ひげ図を示す。末端モチーフＣＣＧＴの存在量は、母体ＤＮＡ分子（中央値：０．１１；範囲：０．０７８～０．１５）よりも胎児ＤＮＡ分子（中央値：０．０７９；範囲：０．０６７～０．０９）において高かった（Ｐ値＜０．０００１）（図３４）。

【0296】

Ａ．臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度
末端シグネチャと不揃いな末端との組み合わせ分析を使用して、組織タイプの特徴を決定することができ、この特徴は、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度に対応する。図４９は、いくつかの実施形態による、不揃いな末端指数（ＪＩ－Ｕ）、末端モチーフ（ＣＣＧＴ）、並びに末端モチーフと不揃いな末端との組み合わせ分析を使用して、母体及び胎児のＤＮＡ断片を区別するための分類力分析を示す。一例として、上記の組み合わせ分析を次のように実行した：
（１）ＨＣＣを有する患者及びＨＣＣを有さない患者を含むデータセットを、特定のカットオフと比較した末端モチーフＣＣＧＴの存在量に基づいて２つのクラス（すなわち、陽性症例及び陰性症例）に分類した。
（２）次いで、上記のステップで決定された陽性ケースを、特定のカットオフと比較した不揃いな末端指数に基づいて２つのクラス（すなわち、陽性症例及び陰性症例）に更に分類した。
（３）２項分類の２つのステップにおいて持続的に陽性と分類された症例を陽性とみなした。２項分類の上記のプロセスで使用されるカットオフは様々であり得、多くの得られる分類モデルを形成する。これらの分類モデルの中から、末端モチーフ及び不揃いな末端を組み合わせた分析を使用して、最適なモデルを決定することができる。一実施形態において、この組み合わせ分析は、２つ以上の末端モチーフ、並びに断片サイズ、断片サイズ画分化（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｉｚｅ－ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）不揃いな末端、好ましい末端、及び血漿ＤＮＡ分子のヌクレオソームフットプリントなどであるがこれらに限定されない他の断片化特徴を含むように拡張されるであろう。更に他の実施形態において、これらのメトリックうちの１つ以上を、血漿ＤＮＡの他の非断片化（ｎｏｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔｏｍｉｃ）特徴、例えばメチル化状態と組み合わせることができる。

【0297】

図４９に示すように、末端モチーフと不揃いな末端との組み合わせた分析は、個々の分析のＡＵＣ値（不揃いな末端＝０．９６ＡＵＣ；末端モチーフ＝０．９６ＡＵＣ）と比較して、より高いＡＵＣ（０．９８）を示した。したがって、組み合わせ分析を使用して、異常組織を正常組織から区別し、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定し、組織タイプを区別するなどの精度を向上させることができる。

【0298】

図５０は、いくつかの実施形態による、妊婦の血漿ＤＮＡ試料中の予測される胎児ＤＮＡ画分と実際の胎児ＤＮＡ画分との間の散布図を示す。実際の胎児ＤＮＡ画分をＳＮＰアプローチ（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；２：６１ｒａ９１）によって推定した。図５０を参照して、末端モチーフ及び不揃いな末端を使用する回帰分析を使用して、妊婦の血漿ＤＮＡ中の胎児ＤＮＡ画分を予測し得る。説明のために、１つの試料を試験試料とみなし、残りの試料を使用して、数学的モデル（例えば、多重線形回帰モデル）をトレーニングし、全ての試料が試験されるまでこのプロセスを繰り返す、一つ抜き分析を使用し得る。一例として、従属変数としての胎児ＤＮＡ画分に関して多重線形回帰モデルを適合させるために、独立変数としての末端モチーフＣＣＧＴ及び不揃いな末端指数メトリックを使用した。トレーニングプロセスにおいて、実際の胎児ＤＮＡ画分は、一実施形態において、ＳＮＰアプローチによって（例えば、Ｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；２：６１ｒａ９１に従って）決定され得る。一実施形態において、予測される胎児ＤＮＡ画分は、実際の胎児ＤＮＡ画分と相関していた（ｒ＝０．７４及びＰ値＜０．０００１）（図５０）。胎児ＤＮＡ画分を推定するためのこのような結合末端モチーフと不揃いな末端との組み合わせ分析は、単一の測定基準ＣＣＧＴ末端モチーフ（ｒ＝０．７２）又は不揃いな末端指数（０．３）を使用したモデルよりも優れていた。

【0299】

末端シグネチャと不揃いな末端との組み合わせ分析はまた、生物学的試料中の組織タイプの特徴を決定するために使用することができ、この特徴は、異常細胞（例えば、腫瘍ＤＮＡ）の画分に対応する。

【0300】

図５１は、いくつかの実施形態による、ＨＣＣを有する患者における予測される腫瘍ＤＮＡ画分と実際の腫瘍ＤＮＡ画分との間の散布図である。実際の腫瘍ＤＮＡ画分は、コピー数異常によって決定された（Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８：１３２４）。別の実施形態において、ＨＣＣを有する患者では、末端モチーフＡＣＧＡの存在及び不揃いな末端指数（ＪＩ－Ｕ）を使用して、腫瘍ＤＮＡ画分に関して多重線形回帰を適合させた。トレーニングプロセスにおいて、実際の腫瘍ＤＮＡ画分をコピー数異常によって決定した（Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８：１３２４）。図５０に示すように、一つ抜き分析に基づいて、予測される腫瘍ＤＮＡ画分と実際の腫瘍ＤＮＡ画分との間の相関係数は０．８３であった（Ｐ値＜０．０００１）。この結果は、末端モチーフ及び不揃いな末端の組み合わせ分析により、ＨＣＣを有する患者の腫瘍ＤＮＡ画分を推定することが可能であることを示唆している。

【0301】

いくつかの場合では、末端モチーフと不揃いな末端とを選択的に組み合わせるために、例えば、ロジスティック回帰、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木、ＣＡＲＴアルゴリズム（分類木及び回帰木）、単純ベイズ分類、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、特異値分解（ＳＶＤ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）、人工ニューラルネットワーク、分類子のセットを構成し、次いでそれらの予測の加重投票を行うことによって新たなデータ点を分類するアンサンブル方法を含むがこれらに限定されない、異なる統計的アプローチが使用される。

【0302】

Ｂ．組み合わせ分析を用いた標的組織の特徴値を決定するための方法
図５２は、いくつかの実施形態による、不揃いな末端を有する無細胞ＤＮＡ分子に由来する末端シグネチャに基づいて生物学的試料の特徴を決定する方法を示すフローチャートである。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、無細胞ＤＮＡ分子を含み、無細胞ＤＮＡ分子の各々は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖と部分的又は完全な二本鎖を形成する。いくつかの場合では、無細胞ＤＮＡ分子の少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖由来の相補部分を有さず、第２の鎖にハイブリダイズせず、第１の鎖の第１の末端にある。いくつかの実施形態において、標的組織タイプの特徴は、胎盤組織における妊娠期間、又は子癇前症、早産、胎児染色体異数性、代謝障害、及び／若しくは胎児遺伝性障害を含む、胎盤組織に関連する病態を示す。標的組織タイプの特徴はまた、肝臓由来のＤＮＡ分子と主に造血由来のＤＮＡ分子とを区別するなど、組織タイプを区別するために使用され得る。

【0303】

ステップ５２０２において、生物学的試料は、第１の鎖と第２の鎖との間に指定された長さのオーバーハングを有する無細胞ＤＮＡ分子について濃縮される。第１の鎖と第２の鎖の間に指定された長さのオーバーハングを有する無細胞ＤＮＡ分子を濃縮するために、異なる手法を使用し得、これには、不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的化捕捉、不揃いな末端特異的アダプターライゲーションに基づくアンプリコン配列決定、及びデジタルＰＣＲ（例えば、ドロップレットデジタルＰＣＲ）が含まれる。

【0304】

ステップ５２０４において、配列リードを取得するために、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ断片が分析される。いくつかの実施形態において、配列リードは、複数の無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する末端配列を含む。本明細書に記載されるように、配列リードは、例えば、配列決定技法を使用して（例えば、合成による配列決定アプローチ（例えば、イルミナ）、又は単一分子配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイムシステム、又はナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して）、又は例えばハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブにおいてプローブを使用して、様々な方法において得てもよい。いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一のプライマーを使用する線形増幅若しくは等温増幅などの増幅技法によって先行され得る。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い配列リードが分析され得る。

【0305】

ステップ５２０６において、濃縮から得られた配列リードの第１のセットが同定される。いくつかの実施形態において、対形成末端配列決定を使用して配列リードを取得し、その２つの配列リードは、ＤＮＡ断片の２つの末端から得られる（例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基）。

【0306】

ステップ５２０８において、配列リードの第１のセットの第１のサブセットが同定される。いくつかの実施形態において、第１のサブセットの各配列リードは、第１の配列末端シグネチャに対応する末端配列を含む。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットは、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む。第１の配列末端シグネチャを有する末端配列は、例えば、開始位置の直前又は末端位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。ステップ５２０８は、図２６のステップ２６０８と同様の方法で実施され得る。

【0307】

ステップ５２１０において、配列リードの第１のサブセットの第１の量が決定される。いくつかの実施形態において、配列リードの第１のセットの第１の量がカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。ステップ５２１０は、図２６のステップ２６１０と同様の方法で実施され得る。

【0308】

ステップ５２１２において、配列リードの第１の量及び潜在的には別の量を使用して、第１のパラメータが決定される。いくつかの例では、そのような量の両方は、別個のパラメータであり得る。他の量は、例えば、配列リード及び／又は分析されたＤＮＡ分子の総数に対応する、様々な形態を取ることができる。別の例として、他の量は、１つ以上の他の配列末端シグネチャ（末端モチーフ）の量に対応することができる。第１のパラメータは、２つの血漿末端モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ／ＡＡＡＴ）間の量の比であり得る。ステップ５２１２は、図２６のステップ２６１２と同様の方法で実施され得る。

【0309】

ステップ５２１４において、第１のパラメータと参照値との比較に基づいて生物学的試料の特性が決定される。例えば、決定された特徴は、例えばヌクレアーゼが胎児組織と母体組織との間で異なって調節される場合、妊娠期間又は範囲（例えば、８週、９～１２週）を含み得る。別の例では、決定された特徴は、他の組織タイプ（例えば、造血細胞）に対する特定の組織タイプ（例えば、肝細胞）であり得る。標的組織タイプの特徴はまた、標的組織タイプの特定の病態（例えば、ＨＣＣ、子癇前症、早産）を示し得る。別の例では、決定された特徴は、特定の組織タイプ（例えば、肝細胞）に対応する臓器のサイズ又は栄養状態であり得る。更に別の例では、決定された特徴は、生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分を含むことができる。いくつかの実施形態において、臨床的に関連するＤＮＡには、胎児ＤＮＡ、腫瘍由来ＤＮＡ、又は移植ＤＮＡが含まれる。ステップ５２１４は、図２６のステップ２６１２と同様の方法で実施され得る。

【0310】

ＶＩＩ．ＤＮＡ分子中の不揃いな末端を検出するための技法の例
様々な実施形態で実施することができる、ＤＮＡ分子中の不揃いな末端を検出するための様々な技法の例を以下に記載する。

【0311】

Ａ．不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく不揃いな末端の濃縮
別の実施形態において、最大の識別力を示した特定の不揃いな末端を有する分子を物理的に濃縮する。このような物理的濃縮には、不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的化捕捉、不揃いな末端特異的ライゲーションに基づくＰＣＲ増幅、及び不揃いな末端特異的ライゲーションに基づく捕捉が含まれ得るが、これらに限定されない。別の実施形態において、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲとも称する）及びドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、不揃いな末端を検出及び定量化するために使用されるであろう。

【0312】

図５３は、いくつかの実施形態による、特定数の目的の不揃いな末端を濃縮するために、不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的捕捉を使用する方法の例を示す。物理的濃縮分析の一実施形態において、目的の不揃いな末端を濃縮するために、不揃いな末端特異的ハイブリダイゼーションに基づく標的化捕捉を使用することができる。目的の不揃いな末端に特異的にハイブリダイズすることができるビオチン化ＲＮＡプローブを設計した（ステップ１及び２に示されている）。ビオチン化プローブとハイブリダイズする目的の不揃いな末端は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズによってプルダウンすることができる（ステップ３に示されている）。ＲＮＡプローブは、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼによって分解されるであろう（ステップ４に示されている）。目的の不揃いな末端は、プルダウン（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ）材料中で濃縮され、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びメチル化Ｃ（５ｍＣ）によるＤＮＡ末端修復に供されるであろう（ステップ５に示されている）。したがって、目的の不揃いな末端を有する分子に結合した一本鎖は、５ｍＣが充填され、重亜硫酸塩配列のための平滑分子になるであろう。目的の不揃いな末端に関する情報は、限定されないが、２０１９年７月２３日に出願された米国特許出願公開第２０２０／００５６２４５Ａ１号に記載されているアプローチに従って重亜硫酸塩配列決定の結果から決定でき、その内容は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、１つ以上の異なる不揃いな末端を一緒に分析し、例えば、実際の適用のために、異なる不揃いな末端のリード値間の比又は偏差を分析した。

【0313】

Ｂ．不揃いな末端特異的アダプターライゲーションに基づく不揃いな末端の濃縮
図５４は、いくつかの実施形態による、特定の数の目的の不揃いな末端を濃縮するための不揃いな末端特異的アダプターライゲーションに基づくアンプリコン配列決定を使用する方法の例を示す。物理的濃縮分析の一実施形態において、分子の目的の不揃いな末端は、アダプター（すなわち、不揃いな末端特異的アダプター（ステップ１及び２に示される）と特異的にライゲートされるであろう。同じ分子のもう一方の端は、ＤＮＡ末端修復後に平滑化され、ユニバーサルアダプター（すなわち、共通アダプター）とライゲートすることができる（ステップ３に示されている）。共通アダプター及び不揃いな末端特異的アダプターの両方でライゲーションされた分子を、例えばイルミナＰ５配列を含む共通プライマー及びイルミナＰ７配列を含む不揃いな末端特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅に供した（ステップ４及び５に示されている）。増幅産物は、目的の不揃いな末端を決定するために使用することができる。一実施形態において、ＤＮＡ分子の両末端を特定のアダプターとライゲートすることができ、したがって、分子の２つの末端に存在する目的の不揃いな末端を検出することが可能になる。一実施形態において、１つ以上の異なる不揃いな末端を一緒に分析し、例えば、実際の適用のために、異なる不揃いな末端のリード値間の比又は偏差を分析した。

【0314】

Ｃ．目的の不揃いな末端の検出
図５５は、いくつかの実施形態による、ドロップレットＰＣＲを使用して特定の数の目的の不揃いな末端を決定する方法の例を示す。物理的濃縮分析の一実施形態において、分子についての目的の不揃いな末端は、アダプター（すなわち、不揃いな末端特異的アダプターと特異的にライゲートされるであろう（ステップ１及び２に示される）。同じ分子のもう一方の末端は、ＤＮＡ末端修復後に平滑になり、これはユニバーサルアダプター（共通アダプター）とライゲートすることができる（ステップ３に示されている）。共通アダプター及び不揃いな末端特異的アダプターの両方でライゲートされた分子を、ドロップレットデジタルＰＣＲ分析（ｄｄＰＣＲ）に供した（ステップ４に示されている）。一実施形態において、このようなｄｄＰＣＲ分析は、共通アダプターを標的とするフォワードプライマー、クエンチャ及び蛍光レポーターを有するプローブ、並びに不揃いな末端特異的アダプターを標的とするリバースプライマーを利用する。したがって、目的の不揃いな末端を含むドロップレットは、正のリード値になる。一実施形態において、１つ以上の異なる不揃いな末端が一緒に分析され、例えば、実際の適用のために、異なる不揃いな末端のリード値間の比又は偏差が分析された。

【0315】

異なる一実施形態において、５ｍＣ（又は他の確認可能な修飾塩基）を有するＤＮＡ末端修復及び特定のアダプターライゲーションを、目的の不揃いな末端を検出するためのいくつかの適用において組み合わせることができる。

【0316】

ＶＩＩＩ．ウイルスＤＮＡ末端モチーフ分析
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）は、上咽頭がん（ＮＰＣ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ－Ｔ細胞）リンパ腫、及び移植後リンパ増殖性疾患を含む、多くの悪性腫瘍に関連する発がん性ウイルスである。ＥＢＶはまた、伝染性単核症と称する非悪性疾患を引き起こす。患者の血漿ＤＮＡプールにおけるＥＢＶ ＤＮＡの存在は、予測及び再発の監視のためのバイオマーカーとみなされ（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：５４５２－５４５５）、これは大規模な前向き研究で更に確認された（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７：５１３－５２２）。血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの断片サイズは、ＥＢＶ ＤＮＡ陽性の患者がＮＰＣを有するか否かを決定するために使用されるであろう（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８；１１５：Ｅ５１１５－Ｅ５１２４）。

【0317】

図５６は、いくつかの実施形態による、非腫瘍性上咽頭上皮組織とＮＰＣ組織との間のＤＮＡＳＥ１Ｌ３の発現レベルの箱ひげ図を示す。本開示では、公表されているマイクロアレイデータセット（Ｓｅｎｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６）に従って、ＮＰＣ組織と非腫瘍性上咽頭上皮組織との間のＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルを分析した。非腫瘍性上咽頭上皮組織（ｎ＝１０）と比較して、ＮＰＣ組織（ｎ＝３１）ではＤＮＡＳＥ１Ｌ３発現レベルが有意に減少する（例えば、ダウンレギュレートする）ことが見出された（Ｐ値＝０．０００３、マン・ホイットニーのＵ検定）（図５６）。

【0318】

Ａ．ヌクレアーゼの異なる調節に基づくウイルスＤＮＡの末端シグネチャ分析
図５７Ａは、いくつかの実施形態による、様々なステージの上咽頭がんを有する異なる対象にわたるＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフＣＣＣＡの箱ひげ図を示し、図５７Ｂは、いくつかの実施形態による、ＮＰＣを有するＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とＮＰＣを有さないＥＢＶ ＤＮＡ陽性対象とを区別する際の末端モチーフＣＣＣＡの性能レベルを示すＲＯＣ曲線を示す。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）を使用して、ＥＢＶ ＤＮＡ陽性患者のがん病態を分類した。説明のために、以前に発表された研究（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８；１１５：Ｅ５１１５－Ｅ５１２４）において、少なくとも１０００個のＥＢＶ ＤＮＡ断片を有する対象由来の血漿ＥＢＶ ＤＮＡの末端シグネチャを分析した。図５７Ａに示されるように、ＮＰＣを有さない患者（平均ＣＣＣＡ％：２．０１；範囲：１．１９～２．４３）と比較して、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを有する患者を含むＮＰＣ群（平均ＣＣＣＡ％：１．６８；範囲：１．２５～１．９８）（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）において、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフＣＣＣＡのパーセンテージが有意に減少した（例えば、ダウンレギュレートした）。ＡＵＣは０．８５であった（図５７Ｂ）。これらの結果は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３に関連する末端モチーフがＮＰＣを有する患者を検出するためのバイオマーカーとしても使用することができることを示唆している。

【0319】

一実施形態において、ＮＰＣを有するＥＢＶ ＤＮＡ陽性患者とＮＰＣを有さないＥＢＶ ＤＮＡ陽性患者とを区別する際に最も識別力を示す切断シグネチャの組み合わせを決定するための並べ替え分析を使用することによって、ヌクレアーゼ切断シグネチャを定義することができる。一例として、任意の２つの末端モチーフ間の頻度比の全ての組み合わせを列挙することができる。２５６のモチーフがあり、３２、６４０が得られる。任意の２つの末端モチーフ間の３２，６４０の頻度比の中で、ＴＧＧＴに対するＣＣＣＧの末端モチーフの頻度比は０．８７のＡＵＣを示し、これはＣＣＣＡ％のみに基づくＡＵＣよりも大きかった。

【0320】

図５８は、いくつかの実施形態による、様々なステージの上咽頭がんを有する異なる対象にわたるモチーフ多様性スコアの箱ひげ図を示す。一実施形態において、ヌクレアーゼ異常は、末端モチーフのゆがみをもたらす。したがって、モチーフの多様性はそれに応じて変更されるであろう。モチーフ多様性スコアは、ＮＰＣを有さない患者（平均：０．９３３；範囲：０．９２１～０．９４９）と比較して、ＮＰＣを有する患者（平均：０．９５０；範囲：０．９３７～０．９６６）において異常に高かった（図５８）（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。

【0321】

図５９は、いくつかの実施形態による、ＭＤＳ及びサイズの組み合わせ分析の性能レベルを評価するためのＲＯＣ曲線を示す。図５９において、ＭＤＳ＿のみのライン５９０２は、ＭＤＳを使用した分析についてのＲＯＣ曲線を表し、Ｓｉｚｅ＿のみのライン５９０４は、サイズ比を使用した分析についてのＲＯＣ曲線を表し、ＭＤＳ＋サイズのライン５９０６は、ＭＤＳ及びサイズを組み合わせた分析についてのＲＯＣ曲線を表す。一実施形態において、がん検出の性能を向上させるために、ＭＤＳシグナル及びサイズシグナルを組み合わせる。図５９は、ＭＤＳと及びサイズの組み合わせ分析（ＡＵＣ：０．９９）が、ＭＤＳ（ＡＵＣ：０．９７）又はサイズ（ＡＵＣ：０．９７）のみを考慮する分析よりも優れていることを示す。

【0322】

図６０は、いくつかの実施形態による、ＮＰＣを有する患者（色６０１０）及び一過的（色６０３０）又は持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有するがＮＰＣを有さない患者（色６０２０）にわたる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ断片から推定される２５６個の末端モチーフのヒートマップを示す。図６０に示されるように、２５６個の末端モチーフのパターンを利用することによって、ＮＰＣを有する患者及び有さない患者を２つの別個の群にクラスター化することができ、このことは、一実施形態において、がん検出を行うために２つ以上の末端モチーフを使用することができることを示唆している。別の実施形態において、多くの末端モチーフを選択的に利用するために、例えば、ロジスティック回帰、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木、単純ベイズ分類、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、特異値分解（ＳＶＤ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）、人工ニューラルネットワーク、分類子のセットを構成し、次いでそれらの予測の加重投票を行うことによって新たなデータ点を分類するアンサンブル方法を含むがこれらに限定されない、異なる統計的アプローチが使用され得る。

【0323】

図６１は、いくつかの実施形態による、陽性ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象において優先的に存在した血漿ＥＢＶ ＤＮＡの末端モチーフを同定するヒートマップを示す。一実施形態において、疾患優先末端モチーフ（ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｅｎｄ ｍｏｔｉｆ）と称する、特定の疾患において優先的に存在する一連の末端モチーフを決定することができる。例えば、図６１に示されるように、ＴＣＣＣ、ＴＣＣＴ、ＴＣＴＴを含むがこれらに限定されない陽性ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象において優先的に存在する血漿ＥＢＶ ＤＮＡ６１０２の末端モチーフを同定することができた。ＧＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＴＴＡを含むがこれらに限定されないＮＰＣ６１０４を有する対象において優先的に存在する血漿ＥＢＶ ＤＮＡの末端モチーフを同定することができた。ＡＴＣＴ、ＡＴＣＡ、ＡＴＣＣを含むがこれらに限定されないリンパ腫６１０６を有する患者において優先的に存在する血漿ＥＢＶ ＤＮＡの末端モチーフを同定することができた。

【0324】

Ｂ．ウイルスＤＮＡの末端シグネチャ分析を使用して病理レベルを決定する方法
図６２は、いくつかの実施形態による、無細胞ウイルスＤＮＡ分子を含む生物学的試を分析して、生物学的試料が得られる対象における病理レベルを決定する方法を示すフローチャートである。生物学的試料は、対象由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子及びウイルス（例えば、ＥＢＶ）を含む。異常は、がん（例えば、ＮＰＣ、ＨＣＣ、肺がん、乳がん、胃がん、多形膠芽腫、膵臓がん、結腸直腸がん、及び／又は頭頸部扁平上皮がん）、及び自己免疫障害（例、全身性エリテマトーデス）を含む病理であり得る。いくつかの場合では、生物学的試料における異常は、子癇前症、早産、胎児染色体異数性、又は胎児遺伝性障害を含む、胎盤組織（例えば、母体血漿中に検出される胎盤組織）の異常である。

【0325】

ステップ６２０２において、生物学的試料由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子が分析されて、配列リードが得られる。いくつかの実施形態において、配列リードは、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に対応する末端配列を含む。配列リードは、複数の無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する末端配列を含み得る。例として、配列リードは、配列決定又はプローブに基づく技術を使用して取得され得、これらのいずれかは、例えば、増幅又は捕捉プローブを介した濃縮を含み得る。

【0326】

配列決定は、様々な方法で、例えば、超並列配列決定又は次世代配列決定法を使用して、単一分子配列決定を使用して、及び／又は二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡ配列決定ライブラリ調製プロトコルを使用して、実施され得る。当業者は、使用され得る様々な配列決定技術を理解するであろう。配列決定の一部として、配列リードの一部が細胞核酸に対応し得ることが可能である。

【0327】

配列決定は、例えば本明細書に記載されるような標的化配列決定であり得る。例えば、生物学的試料は、特定の領域由来のＤＮＡ断片について濃縮され得る。濃縮は、例えば参照ゲノムによって定義されるように、ゲノムの一部又は全体に結合する捕捉プローブを使用することを含み得る。

【0328】

統計的に有意な数の無細胞ＤＮＡ分子は、画分濃度の正確な決定を提供するために分析され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析される。他の実施形態において、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い無細胞ＤＮＡ分子が分析され得る。

【0329】

ステップ６２０４において、参照ゲノムにアラインする配列リードの第１のセットが決定される。いくつかの実施形態において、参照ゲノムは、ウイルスに対応する。

【0330】

ステップ６２０６において、配列リードの第１セットの各々について、配列モチーフが、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ以上の末端配列の各々について決定される。配列モチーフは、Ｎ塩基位置（例えば、１、２、３、４、５、６など）を含み得る。例として、配列モチーフは、例えば、図１に記載されているように、ＤＮＡ断片の末端に対応する末端での配列リードを分析すること、信号を特定のモチーフと相関させること（例えば、プローブが使用される場合）、及び／又は配列リードを参照ゲノムにアラインメントすることによって決定され得る。

【0331】

例えば、配列決定デバイスによる配列決定後、配列リードは、例えば、有線又は無線通信又は取り外し可能な記憶デバイスを介して配列決定を実施する配列決定デバイスに通信可能に結合され得るコンピュータシステムによって受信され得る。いくつかの実装において、核酸断片の両端を含む１つ以上の配列リードが受信され得る。ＤＮＡ分子の位置は、ＤＮＡ分子の１つ以上の配列リードをヒトゲノムのそれぞれの部分、例えば、特定の領域にマッピングする（アラインメントする）ことによって決定され得る。他の実施形態において、特定のプローブ（例えば、ＰＣＲ又は他の増幅後）は、特定の蛍光色などを介して位置又は特定の末端モチーフを示し得る。同定は、無細胞ＤＮＡ分子が配列モチーフのセットの１つに対応することであり得る。

【0332】

ステップ６２０８において、配列リードの第１のセットの１つ以上の末端配列に対応する１つ以上の配列モチーフのセットの相対頻度が決定される。いくつかの実施形態において、配列モチーフの相対頻度は、配列モチーフに対応する末端配列を有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の割合を提供する。１つ以上の配列モチーフのセットは、１つ以上の参照試料の参照セットを使用して同定され得る。臨床的に関連するＤＮＡの末端モチーフ及び他のＤＮＡ（例えば、健康なＤＮＡ、母体ＤＮＡ、又は移植された臓器をどのように受け取ったかという対象のＤＮＡ）間の差が同定され得るように、遺伝子型の差が決定され得るが、参照試料については臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を知る必要はない。特定の末端モチーフは、差に基づいて選択され得る（例えば、絶対又はパーセンテージの差が最も大きい末端モチーフを選択する）。相対頻度の例は、本開示全体を通して説明されている。

【0333】

いくつかの実装において、配列モチーフはＮ塩基位置を含み、１つ以上の配列モチーフのセットは、Ｎ塩基の全ての組み合わせを含む。一例では、Ｎは、２又は３以上の整数であり得る。１つ以上の配列モチーフのセットは、１つ以上の較正試料又は画分濃度の較正に使用されない他の参照試料で生じる最も頻度の高いものから上位Ｍ（例えば、１０）個の配列モチーフであり得る。

【0334】

ステップ６２１０において、１つ以上の配列モチーフのセットの相対頻度の集計値が決定される。例示的な集計値は、例えば、エントロピー値（モチーフ多様性スコア）、相対頻度の合計、及びモチーフのセットについてカウントのベクトル（例えば、ベクトルは可能な４ｍｅｒの２４５モチーフについての２５６カウント、又は可能な３ｍｅｒの６４モチーフの６４カウント）に対応する多次元データ点を含む、開示全体を通して説明される。１つ以上の配列モチーフのセットが複数の配列モチーフを含む場合、集計値は、セットの相対頻度の合計を含み得る。

【0335】

一例として、１つ以上の配列モチーフのセットが複数の配列モチーフを含む場合、集計値は、セットの相対頻度の合計を含み得る。別の例として、集計値は、相対頻度の分散に対応し得る。例えば、集計値は、エントロピー項を含み得る。エントロピー項は、項の合計を含み得、各項は、相対頻度に相対頻度の対数を掛けたものを含み得る。別の例として、集計値は、機械学習モデル、例えばクラスタリングモデルの最終出力又は中間出力を含み得る。

【0336】

ステップ６２１２において、集計値と参照値との比較に基づいて、対象の病理レベルの分類が決定される。いくつかの実施形態において、異常レベルの分類には、病理（例えば、ＮＰＣ）の複数のステージのうちの１つが含まれる。

【0337】

ＩＸ．ウイルスＤＮＡの不揃いな末端分析
いくつかの実施形態において、二本鎖ＤＮＡ間の指定された長さのオーバーハングは、特定のウイルス関連疾患（例えば、ＥＢＶによって引き起こされる上咽頭がん）を有する対象の末端切断シグネチャと関連付けることができる。生物学的試料について、この特性を有するＤＮＡ分子の量を同定するパラメータ（例えば、指定された長さのオーバーハング）を生成することができ、そのパラメータを使用して、対象のウイルスに関連状する病態（例えば、ＮＰＣ）を予測することができる。

【0338】

Ａ．ヌクレアーゼの異なる調節に基づくウイルスＤＮＡの不揃いな末端分析
図６３Ａ及び６３Ｂは、いくつかの実施形態による、異なる対象にわたる非メチル化シグナルから推定される不揃い指数値の箱ひげ図を示す。我々はまた、本開示において血漿ＥＢＶ ＤＮＡの不揃いな末端の臨床的有用性を調べた。図６３Ａに示されるように、配列決定された総血漿ＥＢＶ ＤＮＡ断片を使用して、血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの不揃いな末端の量は、がんを有する患者とがんを有さない患者との間で異なることが示された。がん患者にはＮＰＣ及びリンパ腫が含まれ、がんを有さない患者は、一過的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する対象、及び持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する対象、並びに伝染性単核症有する対象から構成された。がん患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、一過的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡ及び持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象よりも１２．５％低かった（Ｐ値＝０．０００６、マン・ホイットニーのＵ検定）。がん患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、伝染性単核症を有する患者よりも９．３％低かった（Ｐ値＝０．０６、マン・ホイットニーのＵ検定）。しかしながら、がん患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、リンパ腫患者と同等であり、１．３％の差しかなかった（Ｐ値＝１、マン・ホイットニーのＵ検定）。これらの結果は、ウイルスＤＮＡの不揃いな末端が、ウイルス駆動性がんを有する患者とこれを有さない患者とを区別するための潜在的なバイオマーカーになるであろうことを示唆している。

【0339】

別の実施形態において、図６３Ｂに示されるように、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、がんを有するＥＢＶ ＤＮＡ陽性患者とがんを有さないＥＢＶ ＤＮＡ陽性患者とを区別するためのシグナル対雑音比を高めるために、１３０～１６０ｂｐのサイズの断片から推定することができる。がん患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、一過的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡ及び持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象よりも２９．６％低かった（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。がん患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、伝染性単核症を有する患者よりも１７．８％低かった（Ｐ値＝０．０１、マン・ホイットニーのＵ検定）。したがって、１３０～１６０ｂｐのサイズ範囲間のものから推定される不揃いを使用して、一過的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡ及び持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有するＮＰＣ対象と非ＮＰＣ対象との間の分離の増加が観察され、サイズ選択がシグナル対ノイズ比を増加させることが示唆された。しかしながら、がんを有する患者における血漿ＤＮＡ ＥＢＶ ＤＮＡの不揃い指数値は、リンパ腫患者と同等であり、３．３％の差しかなかった（Ｐ値＝０．５６、マン・ホイットニーのＵ検定）。別の実施形態において、他のサイズ範囲、例えば、これらに限定されないが、５０～８０ｂｐ、６０～９０ｂｐ、７０～１００ｂｐ、８０～１１０ｂｐ、９０～１２０ｂｐ、１００～１３０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐ、１２０～１５０ｂｐ、１４０～１７０ｂｐ、１５０～１８０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐ、１７０～２００ｂｐ、１８０～２１０ｂｐ、１９０～２２０ｂｐ、２００～２３０ｂｐ、２１０～２４０ｂｐ、２２０～２５０ｂｐ、２３０～２６０ｂｐ、２３０～２７０ｂｐ、２５０～２８０ｂｐ、又は異なるサイズ範囲のいくつかの組み合わせを使用することができる。

【0340】

図６４は、いくつかの実施形態による、ＮＰＣ組織と非腫瘍性上咽頭上皮組織との間のＤＮＡＳＥ１発現レベルの箱ひげ図を示す。図６３に戻って参照し、ＮＰＣを有する患者で観察された血漿ＥＢＶ ＤＮＡの不揃いの減少は、ＨＣＣを有する患者の血漿ＤＮＡの不揃いの増加とは対照的であった。あり得る理由の１つは、ＤＮＡＳＥ１発現レベルがＮＰＣ組織と非腫瘍性上咽頭上皮組織との間で有意な変化を示さなかったためであり得（Ｐ値＝０．７７、マン・ホイットニーのＵ検定）（図６４）、このことは、ＤＮＡＳＥ１発現レベルが、近傍の非腫瘍性肝臓組織と比較して、ＨＣＣ組織において有意にアップレギュレートされた事実と対照的である。

【0341】

Ｂ．ウイルスＤＮＡの不揃いな末端の分析を使用して病態のレベルを決定する方法
図６５は、いくつかの実施形態による、生物学的試料中の無細胞ウイルスＤＮＡ分子の不揃いな末端を分析する方法を示すフローチャートである。いくつかの場合では、生物学的試料は、対象由来の複数の無細胞ＤＮＡ分子及びウイルス（例えば、発がん性ウイルス）を含み、複数の無細胞ＤＮＡ分子の各々は、第１の部分及び第２の鎖を有する第１の鎖と部分的又は完全な二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖由来の相補部分を有さず、第２の鎖にハイブリダイズせず、第１の鎖の第１の末端にある。いくつかの場合では、第１は５’末端である。

【0342】

ステップ６５０２において、参照ゲノムにアラインする無細胞ＤＮＡ分子の第１のセットが同定され、参照ゲノムはウイルスに対応する。リードは参照ゲノムにアラインメントされ得る。複数の核酸分子は、転写開始部位に対してある特定の距離範囲内で読み取られ得る。

【0343】

ステップ６５０４において、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性が、無細胞ＤＮＡ分子の第１のセットの各々について測定される。例えば、測定された特性には、第１の鎖のより高いメチル化レベルが含まれ、このより高いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。別の例では、測定された特性には、第１の鎖のメチル化レベルの低下が含まれ、より低いメチル化レベルは、第２の鎖に突出した第１の鎖のより長い長さと相関する。いくつかの場合では、特性は、複数の核酸分子の各々の第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化状態である。他の場合では、特性は、第２の鎖に突出した第１の鎖の長さに比例する第１の鎖及び／又は第２の鎖の長さである。

【0344】

ステップ６５０６において、複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性を使用して、不揃い指数値が決定される。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、複数の無細胞ＤＮＡ分子において鎖が別の鎖に突出した集合的な尺度を提供する。いくつかの実施形態において、不揃いな末端値は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含み得る。いくつかの実施形態において、不揃い指数値は、指定された範囲内のサイズ、例えば１３０～１６０ｂｐｓを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の測定された特性に対応する（図４９Ｂ参照）。

【0345】

第１の複数の核酸分子が指定されたサイズ範囲にある場合、方法は、第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の特性を測定することを含み得る。第２の複数の核酸分子は、第２の指定されたサイズ範囲を有するサイズを有し得る。不揃い指数値を決定することは、第１の複数の核酸分子の測定された特性と、第２の複数の核酸分子の測定された特性とを使用して、比を計算することを含み得る。不揃い指数値は、本明細書に記載の不揃いな末端比又はオーバーハング指数比を含み得る。

【0346】

ステップ６５０８おいて、不揃い指数値が参照値と比較される。参照値又は比較は、トレーニングデータセットを用いた機械学習を使用して決定され得る。比較は、生物学的試料又は個体に関する異なる情報を決定するために使用し得る。

【0347】

ステップ６５１０において、対象の病態のレベルが、比較に基づいて決定され得る。病態には、疾患、障害、又は妊娠を挙げることができる。病態は、がん、自己免疫疾患、妊娠関連病態、又は本明細書に記載の任意の病態であり得る。例として、がんには、がんには、上咽頭がん（ＮＰＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、又は咽頭がんが含まれ得る。自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を挙げることができる。以下の様々なデータは、病態のレベルを決定するための例を提供する。

【0348】

いくつかの場合では、参照値は、病態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。別の例として、参照値は、病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。参照試料から複数の参照値を決定でき、異なる参照値は、病態の異なるレベルを識別する可能性がある。

【0349】

このプロセスは、比較に基づいて生物学的試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定することを含み得る。臨床的に関連するＤＮＡとしては、胎児ＤＮＡ、腫瘍由来ＤＮＡ、又は移植ＤＮＡを挙げることができる。参照値は、臨床的に関連するＤＮＡの既知の画分を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して得ることができる。臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定するための方法は、第１の鎖及び／又は第２の鎖の特性を測定する前に、複数の核酸分子を、プロトコルによって処理することを含み得る。１つ以上の参照対象からの核酸分子は、測定された特性を有する複数の核酸分子と同じプロトコルによって処理され得る。

【0350】

較正データ点には、測定された不揃い指数値、及び臨床的に関連するＤＮＡの測定された／既知の画分が含まれる。別の技法（例えば、組織特異的対立遺伝子を使用）を介して画分が測定される、任意の試料についての測定された不揃い指数値は、参照値に対応することができる。別の例として、検量線（関数）を較正データポイントに適合させることができ、参照値は検量線上のポイントに対応させることができる。したがって、新しい試料の測定された不揃いな末端値を較正関数に入力することができ、これにより、臨床的に関連するＤＮＡの画分を出力することができる。

【0351】

Ｘ．治療
実施形態は、対象の分類を決定した後、患者における病理を治療することを更に含み得る。治療は、病理の決定されたレベル、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度、又は起源の組織に従って提供され得る。例えば、同定された変異は、特定の薬物又は化学療法を用いて標的化され得る。起源の組織を使用して、手術又は任意の他の形態の治療を誘導することができる。そして、病理のレベルを使用して、任意のタイプの治療についてどれほど積極的にするかを決定することができ、これはまた、病理のレベルに基づいても決定され得る。病理（例えば、がん）は、化学療法、薬物、食事療法、療法、及び／又は手術によって治療され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値（例えば、量又はサイズ）が参照値を超えるほど、治療は、より積極的になり得る。

【0352】

治療には、切除が含まれ得る。膀胱がんの場合、治療には、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）が含まれ得る。この手順は、診断、病期分類、及び治療に使用される。ＴＵＲＢＴ中、外科医は、膀胱鏡を尿道から膀胱に挿入する。次いで、小型ワイヤーループ、レーザー、又は高エネルギー電気を備えたツールを使用して、腫瘍が切除される。非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）の患者の場合、がんの治療又は除去のためにＴＵＲＢＴが使用され得る。別の治療には、根治的膀胱切除術及びリンパ節郭清が含まれ得る。根治的膀胱切除術は、膀胱全体、並びに場合によっては周囲の組織及び臓器の除去である。治療には、尿路変向術も含まれ得る。尿路変向術とは、治療の一部として膀胱が除去されたときに、医師が尿を体外に排出するための新しい経路を作る場合である。

【0353】

治療には、化学療法が含まれ得、これは、通常がん細胞の成長及び分裂を防ぐことによって、がん細胞を破壊するための薬物の使用である。薬物には、例えば、膀胱内化学療法のためのマイトマイシン－Ｃ（ジェネリック医薬品として入手可能）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、及びチオテパ（Ｔｅｐａｄｉｎａ）が含まれ得るが、これらに限定されない。全身化学療法には、例えば、シスプラチンゲムシタビン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、ドキソルビシン、及びシスプラチンが含まれ得るが、これらに限定されない。

【0354】

いくつかの実施形態において、治療には、免疫療法が含まれ得る。免疫療法には、ＰＤ－１と呼ばれるタンパク質をブロックする免疫チェックポイント阻害剤が含まれ得る。阻害剤には、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、及びペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0355】

治療の実施形態はまた、標的療法を含み得る。標的療法は、がんの成長及び生存に寄与するがんの特定の遺伝子及び／又はタンパク質を標的とする治療である。例えば、エルダフィチニブは、がん細胞の成長又は拡散を続けているＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ２遺伝子変異を伴う局所進行性又は転移性尿路上皮がんを有する人々を治療するために承認された、経口投与される薬物である。

【0356】

一部の治療法には、放射線療法が含まれ得る。放射線療法は、がん細胞を破壊するために高エネルギーＸ線又は他の粒子を使用することである。各個々の治療に加えて、本明細書に記載のこれらの治療の組み合わせが使用され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値が閾値を超え、閾値自体が参照値を超える場合、治療の組み合わせが使用され得る。参考文献における治療に関する情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0357】

ＸＩ．例示的なシステム
図６６は、本発明の実施形態による、測定システム６６００を例示する。示されたシステムは、試料ホルダ６６１０内の無細胞ＤＮＡ分子などの試料６６０５を含み、試料６６０５はアッセイ６６０８と接触して物理的特性６６１５の信号を提供し得る。試料ホルダの例は、アッセイのプローブ及び／又はプライマー、あるいはドロップレットが（アッセイを含むドロップレットとともに）移動するチューブを含む、フローセルであり得る。試料からの物理的特性６６１５（例えば、蛍光強度、電圧、又は電流）は、検出器６６２０によって検出される。検出器６６２０は、データ信号を構成するデータ点を取得するために、間隔をおいて（例えば、周期的な間隔）測定し得る。一実施形態において、アナログ－デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。試料ホルダ６６１０及び検出器６６２０は、アッセイデバイス、例えば、本明細書に記載される実施形態に従って配列決定を実施する配列決定装置を形成し得る。データ信号６６２５は、検出器６６２０から論理システム６６３０へ送信される。データ信号６６２５は、ローカルメモリ６６３５、外部メモリ６６４０、又は記憶デバイス６６４５に保存され得る。

【0358】

論理システム６６３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどであり得るか、又はそれらを含み得る。それはまた、ディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイなど）、及びユーザ入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含み得るか、又はそれらに連結され得る。論理システム６６３０及び他の構成要素は、スタンドアローン若しくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であり得るか、又は検出器６６２０及び／又は試料ホルダ６６１０を含むデバイス（例えば、配列決定デバイス）に直接取り付けられ得るか、又は組み込まれ得る。論理システム６６３０はまた、プロセッサ６６５０において実行するソフトウェアを含み得る。論理システム６６３０は、本明細書に説明される方法のいずれかを実施するようにシステム６６００を制御するための命令を保存するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム６６３０は、配列決定又は他の物理的操作が実施されるように、試料ホルダ６６１０を含むシステムにコマンドを提供し得る。そのような物理的操作は、特定の順序で、例えば、試薬が特定の順序で追加及び除去されるように、実施され得る。そのような物理的操作は、試料を取得してアッセイを実施するために使用され得るように、例えば、ロボットアームを含む、ロボットシステムによって実施され得る。

【0359】

本明細書で言及されるコンピュータシステムのうちのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用し得る。コンピュータシステム１０においてこのようなサブシステムの例を図６７に示す。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部構成要素を備える、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、並びに他の携帯装置を含み得る。

【0360】

図６７に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス７９、ディスプレイアダプター８２に接続されたモニタ７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）、及びその他などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野において既知である任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７又は外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ－Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナへ、コンピュータシステム１０を接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央プロセッサ７３が、各サブシステムと通信し、システムメモリ７２又は記憶デバイス７９（例えば、ハードドライブ又は光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、及びサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２及び／又は記憶デバイス７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、及び加速度計、並びにこれらに類するものなどのデータ収集デバイス８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力されてもよく、ユーザに対して出力されてもよい。

【0361】

コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、内部インターフェースによって、又は１つの構成要素から別の構成要素に接続され得る、若しくは取り外され得る記憶デバイスを介して、ともに接続された、複数の同じ構成要素又はサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワーク上で通信し得る。そのような例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバとみなすことができ、各々が、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、又は構成要素を含むことができる。

【0362】

実施形態の態様は、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路若しくはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、及び／又はモジュール様式又は一体的な様式で一般的にプログラム可能なプロセッサを備えたメモリに保存されたコンピュータソフトウェアを使用して、制御ロジックの形態で実装され得、したがって、プロセッサは、ハードウェア回路を構成するソフトウェア命令を保存するメモリ、及び構成命令又はＡＳＩＣを備えたＦＰＧＡを含み得る。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、又は単一の回路基板若しくはネットワーク化された上の複数の処理ユニット、並びに専用のハードウェアを含み得る。本開示及び本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェア、並びにハードウェア及びソフトウェアの組み合わせを使用して、本開示の実施形態を実装するための他の手段及び／又は方法を認識及び理解するであろう。

【0363】

本出願で説明されるソフトウェアコンポーネント又は関数のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、又は、例えば、従来の技術若しくは物体指向の技術を使用するＰｅｒｌ若しくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理デバイスによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、記憶及び／又は伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令又はコマンドとして記憶され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リード専用メモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブ若しくはフロッピーディスクなど）、又は光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）など）、又はブルーレイディスク及びフラッシュメモリなどを含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのようなデバイスの任意の組み合わせであり得る。更に、操作の順番は並べ替え得る。プロセスは、その操作が完了すると終了し得るが、図に含まれていない追加のステップを有し得る。プロセスは、メソッド、関数、プロシージャ、サブルーチン、サブプログラムなどに対応する場合がある。プロセスが関数に対応する場合、その終了は、呼び出し関数又はメイン関数への関数の戻りに対応する場合がある。

【0364】

そのようなプログラムはまた、コード化され、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、及び／又は無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して伝送され得る。したがって、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化されてもよく、又は（例えば、インターネットダウンロードを介して）他のデバイスとは別個に提供され得る。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、若しくはコンピュータシステム全体）上若しくはその内部に存在し得、システム又はネットワーク内の異なるコンピュータ製品上若しくはその内部に存在し得る。コンピュータシステムは、モニタ、プリンタ、又は本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザに提供するための他の好適なディスプレイを含み得る。

【0365】

本明細書記載の方法のうちのいずれも、ステップを実施するように構成することができる１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて全体的又は部分的に実施され得る。プロセッサで実施される任意の操作（例えば、位置合わせ、決定、比較、コンピューティング、計算）は、リアルタイムで実施され得る。「リアルタイム」という用語は、特定の時間制限内に完了するコンピューティング操作又はプロセスを指し得る。時間制限は、１分、１時間、１日、又は７日であり得る。したがって、実施形態は、本明細書に説明される方法のうちのいずれかのステップを実施するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なるコンポーネントがそれぞれのステップ又はそれぞれのステップの群を実施する。番号付けされた工程として提示されるが、本明細書の方法の工程は、同時に若しくは異なる時間に、又は異なる順序で実施され得る。更に、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と併用され得る。また、あるステップの全て又は部分は、任意選択的であり得る。更に、本方法のうちのいずれかの任意のステップは、これらのステップを実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、又は他の手段で実行することができる。

【0366】

特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、任意の好適な様態で組み合わせることができる。しかしながら、本開示の他の実施形態は、各個々の態様、又はこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態を対象とし得る。

【0367】

本開示の例示的実施形態の上の説明は、例示及び説明の目的で提示されている。網羅的であること、又は本開示を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正及び変更が、先の教示に鑑みて可能である。

【0368】

「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」の記述は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「又は」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除く、又は」ではなく「を含む、又は」を意味することが意図される。「第１」の構成要素への言及は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。更に、「第１」又は「第２」の構成要素への言及は、明示的に述べられていない限り、言及される構成要素を特定の場所に限定するものではない。「～に基づいて」という用語は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。

【0369】

特許請求の範囲は、任意選択的であり得るいかなる要素も除外するように起草され得る。したがって、この記述は、請求項要素の列挙に関連する「単独で」、「のみ」などの排他的な用語の使用、又は「否定的な」限定の使用についての先行詞として機能することを意図している。

【0370】

本明細書において言及される全ての特許、特許出願、刊行物、及び明細書は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められていない。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先するものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47A】

【図47B】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57A】

【図57B】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63A】

【図63B】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【国際調査報告】