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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-31
(54)【発明の名称】能動補償を用いる電気穿孔
(51)【国際特許分類】
C12M 1/42 20060101AFI20230824BHJP
G01N 27/04 20060101ALI20230824BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230824BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20230824BHJP
【ＦＩ】
C12M1/42
G01N27/04 Z
C12M1/00 A
C12N15/87 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023504334
(86)(22)【出願日】2021-07-15
(85)【翻訳文提出日】2023-01-20
(86)【国際出願番号】 US2021041832
(87)【国際公開番号】W WO2022020175
(87)【国際公開日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】16/935,987
(32)【優先日】2020-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518419057
【氏名又は名称】ナントセル，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン，チー－ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン リュー，ジョン トーマス
(72)【発明者】
【氏名】メーラビ，アーティン
【テーマコード（参考）】
2G060
4B029
【Ｆターム（参考）】
2G060AA15
2G060AD06
2G060AF07
2G060AG03
2G060KA09
4B029AA24
4B029BB11
4B029GB07
(57)【要約】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置は、細胞及びカーゴを含む流体が流れるための経路を画定する電極と、電極にわたって結合される電源と、制御回路とを含む。幾つかの例において、制御回路は、電極間の抵抗の増大に起因した誘導電流の低下を検出し、電源を制御して誘導電流を増大させ、電極間の電場を維持するように構成される。抵抗の前の値に基づいて、電極間の抵抗の将来の値を予測し得る。他の例において、制御回路は、電極間を流れる流体のパラメータを検出し、パラメータの検出に応答して、電気パルスを生成するか、又は電気パルスの生成を停止するように電源を制御するように構成される。カーゴを用いて細胞を電気穿孔する他の装置例及び方法例も開示される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極であって、前記電極は、流体が前記経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する、２つの電極と、
前記電極にわたって結合されるＤＣ電源と、
前記ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導し、前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出し、ある時間期間にわたる前記電極間の前記抵抗の複数の値を特定し、前記抵抗の前記特定された複数の値に基づいて前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測し、前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を増大させて、前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御するように構成された制御回路と、
を備える、装置。
【請求項2】
前記抵抗の前記特定される複数の値は、第１の値及び第２の値を含み、前記制御回路は、少なくとも前記抵抗の前記第１の値と前記抵抗の前記第２の値との間で直線投影を適用し、前記直線投影に基づいて前記電極間の前記抵抗の前記将来の値を予測するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
前記制御回路は、定義された数の電気パルスのデータ長に基づいて前記直線投影を適用するように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項4】
前記制御回路は、前記誘導電流が定義された値であるとき、前記抵抗の前記第１の値を特定するように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項5】
前記誘導電流の前記定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項４に記載の装置。
【請求項6】
前記制御回路は、定義された値まで前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項7】
前記誘導電流の前記定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項６に記載の装置。
【請求項8】
前記制御回路は、前記複数の電気パルスの前記電圧を増大させて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項9】
前記制御回路は、比例積分偏差コントローラ、比例積分コントローラ、比例偏差コントローラ、及び比例コントローラの少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項10】
前記比例積分偏差コントローラ、前記比例積分コントローラ、前記比例偏差コントローラ、及び／又は前記比例コントローラの前記少なくとも１つの利得係数は、一定又は可変である、請求項９に記載の装置。
【請求項11】
前記制御回路は、前記流体と関連するパラメータを検出し、前記流体と関連するパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項12】
前記流体と関連する前記パラメータは第１のパラメータであり、前記制御回路は、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１１に記載の装置。
【請求項13】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極と、
前記電極にわたって結合され、複数の電気パルスを提供して、前記電極間に電場を生成するための前記電極を通る電流を誘導するＤＣ電源と、
前記流体と関連する第１のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第１のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御し、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される制御回路と、
を備える、装置。
【請求項14】
前記流体と関連する前記第１のパラメータは、流体の存在を含み、且つ／又は前記流体と関連する前記第２のパラメータは流体の不在を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項15】
前記制御回路に結合された第１のセンサ及び第２のセンサを更に備え、前記第１のセンサは前記経路と流通して、流体の前記存在を検出し、前記第２のセンサは前記経路と流通して、流体の前記不在を検出する、請求項１４に記載の装置。
【請求項16】
前記第１のセンサ及び／又は前記第２のセンサは、前記流体と関連する電気パラメータを検知するように構成された光センサ又はセンサを含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項17】
前記流体と関連する前記第２のパラメータは、流体の存在を含み、前記装置は、前記経路と流通する弁と、前記経路と流通し、前記弁の外側に位置決めされて、流体の前記存在を検出するセンサとを更に備え、前記制御回路は、前記弁が流体の前記存在を検出したことに応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１３に記載の装置。
【請求項18】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極であって、前記電極は、流体が前記経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する、２つの電極と、
前記電極にわたって結合されるＤＣ電源と、
前記ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成するための電流を前記電極を通して誘導し、前記電極間の前記抵抗の増大に起因した前記誘導電流の低下を検出し、前記誘導電流を増大させて前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御するように構成された制御回路と、
を備える、装置。
【請求項19】
前記制御回路は、定義された値まで前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１８に記載の装置。
【請求項20】
前記誘導電流の前記定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項１９に記載の装置。
【請求項21】
前記制御回路は、前記複数の電気パルスの前記電圧を増大させて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項22】
前記制御回路は、前記電極間の前記抵抗の前記増大を特定し、前記電極間の前記抵抗の前記特定された増大に基づいて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項23】
前記制御回路は、前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測し、前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項24】
前記制御回路は、ある時間期間にわたり前記抵抗の少なくとも２つの値間に直線投影を適用し、前記直線投影に基づいて前記電極間の前記抵抗の前記将来の値を予測するように構成される、請求項２３に記載の装置。
【請求項25】
前記制御回路は、定義された数の電気パルスのデータ長に基づいて前記直線投影を適用するように構成される、請求項２４に記載の装置。
【請求項26】
前記制御回路は、比例積分偏差コントローラ、比例積分コントローラ、比例偏差コントローラ、及び比例コントローラの少なくとも１つを含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項27】
前記比例積分偏差コントローラ、前記比例積分コントローラ、前記比例偏差コントローラ、及び／又は前記比例コントローラの前記少なくとも１つの利得係数は、一定又は可変である、請求項２６に記載の装置。
【請求項28】
前記制御回路は、前記流体と関連するパラメータを検出し、前記流体と関連するパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項29】
前記流体と関連する前記パラメータは第１のパラメータであり、前記制御回路は、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項２８に記載の装置。
【請求項30】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことであって、前記電極は、流体が前記経路を流れるとき、間に抵抗を有する、流すことと、
ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導する、制御することと、
前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出することと、
ある時間期間にわたる前記電極間の前記抵抗の複数の値を特定することと、
前記抵抗の前記特定された複数の値に基づいて前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測することと、
前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を増大させて、前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【請求項31】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことと、
前記流体と関連する第１のパラメータを検出することと、
前記流体と関連する前記第１のパラメータの検出に応答して、前記電極間に電場を生成するために、複数の電気パルスを生成して前記電極を通る電流を誘導するようにＤＣ電源を制御することと、
前記流体と関連する第２のパラメータを検出することと、
前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【請求項32】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことであって、前記電極は、流体が前記経路を流れるとき、間に抵抗を有する、流すことと、
ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導する、制御することと、
前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出することと、
前記誘導電流を増大させて前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年７月２２日付けで出願された米国特許出願第１６／９３５，９８７号明細書からの米国特許法第１２０条下での優先権を主張するものであり、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
本願は、２０２０年７月２２日付けで出願された米国特許出願第１６／９３５，９８７号明細書からの米国特許法第１２０条下での優先権を主張するものであり、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【0002】
本開示は、能動補償を用いる電気穿孔に関する。
【背景技術】
【0003】
このセクションは、必ずしも先行技術ではない、本開示に関する背景情報を提供する。
【0004】
形質移入は、核酸を細胞に導入して、遺伝子組み換え細胞を生成するのに一般に使用される。光穿孔、リン酸カルシウムを利用したポリマーに基づく方法、微量注入法、電気穿孔法、ウイルス形質導入、及び脂質仲介法（例えばリポソーム－ＤＮＡ複合体を使用する）を含め、細胞の形質移入するために種々の物理的、化学的、及びウイルス的方法が存在している。電気穿孔が細胞の形質移入に使用される場合、被制御直流（ＤＣ）電気パルスが細胞に印加されて、膜電位差を誘導する。この膜電位差は、細胞膜の規則構造の可逆的破壊を生じさせ、膜に孔を形成させる。次いで対象分子が孔を通して細胞に入ることができる。孔形成は、電気穿孔プロセスで使用される平行電極間の距離、電気パルスの特性、電極にわたる電場強度等を含め、種々のパラメータを調整することによって制御することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
このセクションは、本開示の概要を提供し、本開示の全範囲又はその特徴の全ての包括的開示ではない。
【0006】
本開示の一態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置が提示される。本装置は、互いから離間され、細胞及びカーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極と、電極にわたって結合されるＤＣ電源と、制御回路とを含む。流体が経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する電極。制御回路は、ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを電極に提供し、定義された値において電極間に電場を生成する、電極を通る電流を誘導し、電極間の抵抗の増大に起因して誘導電流の低下を検出し、誘導電流を増大させて電極間の電場を定義された値に維持するようにＤＣ電源を制御するよう構成される。
【0007】
本開示の別の態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置が提示される。本装置は、互いから離間され、細胞及びカーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極と、電極にわたって結合され、複数の電気パルスを提供して、電極間に電場を生成するための電極を通る電流を誘導するＤＣ電源と、流体と関連する第１のパラメータを検出し、流体と関連する第１のパラメータの検出に応答して、複数の電気パルスを生成するようにＤＣ電源を制御し、流体と関連する第２のパラメータを検出し、流体と関連する第２のパラメータの検出に応答して、複数の電気パルスの生成を停止するようにＤＣ電源を制御するよう構成される制御回路とを含む。
【0008】
本開示の別の態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置が提示される。本装置は、互いから離間され、細胞及びカーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極と、電極にわたって結合されるＤＣ電源と、制御回路とを含む。流体が経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する電極。制御回路は、ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを電極に提供し、定義された値において電極間に電場を生成するための電流を電極を通して誘導し、電極間の抵抗の増大に起因した誘導電流の低下を検出し、ある時間期間にわたる電極間の抵抗の複数の値を特定し、抵抗の特定された複数の値に基づいて電極間の抵抗の将来の値を予測し、抵抗の将来の値に基づいて誘導電流を増大させて、電極間の電場を定義された値に維持するようにＤＣ電源を制御するように構成される。
【0009】
本開示の別の態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法が提示される。本方法は、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に細胞及びカーゴを含む流体を流すことを含む。流体が経路を流れるとき、間に抵抗を有する電極。本方法は、ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを電極に提供し、定義された値において電極間に電場を生成する、電極を通る電流を誘導する、制御することと、電極間の抵抗の増大に起因して誘導電流の低下を検出することと、誘導電流を増大させて、電極間の電場を定義された値に維持するようにＤＣ電源を制御することとを更に含む。
【0010】
本開示の別の態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法が提示される。本方法は、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に細胞及びカーゴを含む流体を流すことと、流体と関連する第１のパラメータを検出することと、流体と関連する第１のパラメータの検出に応答して、電極間に電場を生成するために、複数の電気パルスを生成して電極を通る電流を誘導するようにＤＣ電源を制御することと、流体と関連する第２のパラメータを検出することと、流体と関連する第２のパラメータの検出に応答して、複数の電気パルスの生成を停止するようにＤＣ電源を制御することとを含む。
【0011】
本開示の別の態様によれば、カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法が提示される。本方法は、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に細胞及びカーゴを含む流体を流すことを含む。流体が経路を流れるとき、間に抵抗を有する電極。本方法は、ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを電極に提供し、定義された値において電極間に電場を生成する、電極を通る電流を誘導する、制御することと、電極間の抵抗の増大に起因して誘導電流の低下を検出することと、ある時間期間にわたる電極間の抵抗の複数の値を特定することと、抵抗の特定された複数の値に基づいて電極間の抵抗の将来の値を予測することと、抵抗の将来の値に基づいて誘導電流を増大させて、電極間の電場を定義された値に維持するようにＤＣ電源を制御することとを更に含む。
【0012】
更なる態様及び適用可能な分野は、本明細書に提供される説明から明らかになろう。本開示の種々の態様は個々に又は１つ若しくは複数の他の態様と組み合わせて実施し得ることを理解されたい。本明細書における説明及び具体例が例示目的のみを意図し、本開示の範囲を限定する意図がないことも理解されたい。
【0013】
本明細書に記載される図面は、可能全ての実施態様ではなく、選択された実施形態の例示のみを目的とし、本開示の範囲の限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本開示の一実施形態例による、能動補償を採用して電場強度を維持する電気穿孔装置のブロック図である。
【図2】別の実施形態例による、能動補償が適用されない場合の電気穿孔装置の電極に提供される電圧、電極を通して誘導される電流、電場強度を低下させる電極間の抵抗の増大を示すグラフである。
【図3】別の実施形態例による、能動補償が適用されない場合の電気穿孔装置の電極に提供される電圧、電極を通して誘導される電流、電場強度を低下させる電極間の抵抗の増大を示すグラフである。
【図4】別の実施形態例による、能動補償がない場合の異なる電気穿孔プロセスでの電場強度の低下を示すグラフである。
【図5】別の実施形態例による能動補償を採用した電気穿孔装置の電極を通る誘導電流を示すグラフである。
【図6】別の実施形態例による「全データ」直線投影を採用した予測補償技法を示すグラフである。
【図7】別の実施形態例による「全データ」直線投影を採用した予測補償技法を示すグラフである。
【図8】別の実施形態例による「移動窓」直線投影を採用した予測補償技法を示すグラフである。
【図9】別の実施形態例による「移動窓」直線投影を採用した予測補償技法を示すグラフである。
【図10】別の実施形態例による、異なる予測補償技法が採用された場合の電場強度を示すグラフである。
【図11】別の実施形態例による、異なる予測補償技法が適用された場合の生物学的性能結果を示すグラフである。
【図12】別の実施形態例による、電極と、流体が電極間に存在するときを検出するセンサとを含む電気穿孔装置のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
対応する参照番号は、図面の幾つかの図を通して対応する（しかし必ずしも同一であるわけではない）部分及び／又は特徴を示す。
【0016】
この開示が完全であり、当業者に範囲を十分に伝えるように、実施形態例が提供される。本開示の実施形態の完全理解を提供するために、特定の構成要素、デバイス、及び方法の例等の多くの具体的な詳細が記載される。具体的な詳細が採用される必要はなく、実施形態例は多くの異なる形態で実施することが可能であり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが当業者には明らかになろう。幾つかの実施形態例において、周知のプロセス、周知のデバイス構造、及び周知の技術については詳述していない。
【0017】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態例の説明を目的としており、限定を意図していない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを示す場合を除き、複数形も同様に包含することが意図され得る。「備える」、「備えている」、「含む」、及び「有する」という用語は包括的であり、したがって、述べられた特徴、整数、ステップ、動作、要素、及び／又は構成要素の存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、構成要素、及び／又はそのグループの存在又は追加を除外しない。本明細書に記載される方法のステップ、プロセス、及び動作は、実行順として特に識別される場合を除き、論考又は図示される特定の順序での実行を必ず必要とするものとして解釈されるべきではない。追加又は代替のステップを採用し得ることも理解されたい。
【0018】
第１、第２、第３等の用語は、本明細書において、種々の要素、構成要素、領域、層、及び／又はセクションを記載するために本明細書で使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、層、及び／又はセクションはこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある要素、構成要素、領域、層、又はセクションを別の領域、層、又はセクションから区別するために使用されているだけであり得る。「第１」、「第２」、及び他の数値用語等の用語は、本明細書で使用される場合、文脈によって明確に示される場合を除き、シーケンス又は順序を黙示しない。したがって、後述する第１の要素、構成要素、領域、層、又はセクションは、実施形態例の教示から逸脱せずに、第２の要素、構成要素、領域、層、又はセクションと呼ぶことができる。
【0019】
「内」、「外」、「下方」、「下」、「下の方」、「上」、「上方」等の空間の相対的用語は、本明細書では、図に示されているある要素又は特徴の別の要素又は特徴への関係を説明するために説明を容易にするために使用し得る。空間の相対的用語は、図に示される向きに加えて、使用中又は動作中のデバイスの異なる向きも包含することを意図し得る。例えば、図中のデバイスが上下逆になった場合、他の要素又は特徴の「下方」又は「下」にあると説明された要素は、その他の要素又は特徴の「上」に向けられる。したがって、「下」という用語例は、上及び下の向きの両方を包含することができる。デバイスは別様に向けられてもよく（９０度回転又は他の向き）、本明細書で使用される空間の相対的用語はそれに従って解釈される。
【0020】
実施形態例について添付図面を参照してより十分にこれより説明する。
【0021】
本開示の一実施形態例によるカーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置が図１に示され、全体的に参照番号１００によって示されている。図１に示されるように、装置１００は２つの電極１０２、１０４、電極にわたって結合されたＤＣ電源１０６、及び制御回路１０８を含む。電極１０２、１０４は互いから離間され、間を流れる細胞１１２及びカーゴ１１０を含む流体の経路（概して矢印Ｆで示されている）を画定する。電極は間に抵抗Ｒｃｈｉｐを有する。制御回路１０８はＤＣ電源１０６を制御して、電圧Ｖｐｓにおいて直流（ＤＣ）電気パルスを電極１０２、１０４に提供して、電極１０２、１０４を通る電流Ｉｃｈｉｐを誘導し、電極１０２と１０４との間に電場Ｅを生成し、電極間の抵抗Ｒｃｈｉｐの増大に起因した誘導電流Ｉｃｈｉｐの低下を検出し、ＤＣ電源１０６を制御して誘導電流Ｉｃｈｉｐを上げ、電極１０２と１０４との間の電場Ｅを定義された値に維持する。
【0022】
例えば、電極１０２、１０４及び関連する構成要素はチップを形成し得る。電極１０２、１０４及び電極１０２と１０４との間を流れる流体は、抵抗Ｒｃｈｉｐ（例えば流体が存在する場合のチップの抵抗）を有し得る。そのような例において、抵抗Ｒｃｈｉｐは少なくとも流体の抵抗Ｒｂ及び流体と電極１０２、１０４の表面との間の界面抵抗Ｒｉに等しい。図１に示されるように、電場Ｅは、ＤＣ電源１０６が電圧Ｖｐｓ（例えば調整電圧）において電気パルスを提供する場合、流体にわたって（例えば電極１０２と１０４との間に）生成される有効電場を表す。図１の特定の例において、電場Ｅは、電極１０２、１０４にわたる電圧Ｖｃｈｉｐ（例えば電圧Ｖｐｓから任意の電圧降下を差し引いたもの）を電極１０２と１０４との間の距離で除したものに等しい。
【0023】
電極１０２、１０４を通る誘導電流Ｉｃｈｉｐを上げることにより、電気穿孔中の形質移入効率を維持し得、幾つかの例では改善し得る。例えば、電気穿孔中、抵抗Ｒｃｈｉｐは、ＤＣ電源１０６によって提供される電気パルス数の関すとして経時増大し得る。幾つかの例において、抵抗Ｒｃｈｉｐの増大は、界面抵抗Ｒｉの増大によって生じ得る。そのような例において、抵抗の増大は、例えば、電極パッシベーション、電極劣化等を生じさせる電極１０２、１０４の表面に付着した荷電分子、ＤＮＡ、タンパク質等に起因し得る。抵抗Ｒｃｈｉｐが増大した結果として、誘導電流Ｉｃｈｉｐは下がり得、電極１０２と１０４との間を流れる流体にわたる有効電場Ｅは下がり得る。その結果、形質移入効率は、以下更に説明するように経時低下し得る。しかしながら、チップを通って流れる誘導電流Ｉｃｈｉｐが増大し、幾つかの例では、能動補償を通して定義された値に維持され得る場合（例えば更に以下説明するように）、電気穿孔中、流体にわたる有効電場及び形質移入効率は維持され得、幾つかの例では改善し得る。
【0024】
図２及び図３は、能動補償が採用されない場合の電気穿孔中の図１の電極１０２、１０４と関連する電気特性を示すグラフ２００、３００を示す。図２及び図３の特定の例では、本明細書において実施例１に記載されるようなα－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（例えばカーゴ）をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドのＣＨＯ－Ｓ細胞への形質移入に関連する電気特性。
【0025】
特に、図２は、チップと関連する抵抗Ｒｃｈｉｐ（線２０２）及び図１の流体にわたる電場Ｅ（線２０４）を示す。図３は、チップを通って流れる誘導電流Ｉｃｈｉｐ（線３０２）及び電極１０２、１０４にわたる電圧Ｖｃｈｉｐ（線３０４）を示す。テストにより、ＤＣ電源１０６によって提供される電気パルスの数が上がるにつれて抵抗Ｒｃｈｉｐ（線２０２）が上がることが示された。この抵抗の増大は、流体が電極１０２と１０４との間の経路（例えばチャンバ）に入るとき、開始される。図２の特定の例において、抵抗Ｒｃｈｉｐは、線２０６によって示されるように、７番目のパルスの前後（例えば低下が始まるとき）で増大し始める。抵抗が経時増大するにつれて、図２及び図３に示されるように、チップを通って流れる誘導電流Ｉｃｈｉｐ（線３０２）は低下し、電圧Ｖｃｈｉｐ（線３０４）は増大する。この時間中、電場Ｅ（線２０４）は線２０６において低下し始め、電気穿孔プロセスが線２０８において終わるまで低下し続ける。
【0026】
図４は、本明細書において実施例２に記載されるように、異なる量のパルスにわたる、α－ＣＴＬＡ４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（例えばカーゴ）をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞に形質移入するための４つの実験電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４の電場を表す線４０２、４０４、４０６、４０８を含むグラフ４００を示す。特に、線４０２（実線構成を有する）は電気穿孔プロセスＰ１中の電場を表し、線４０４（破線構成を有する）は電気穿孔プロセスＰ２中の電場を表し、線４０６（一点鎖線構成を有する）は電気穿孔プロセスＰ３中の電場を表し、線４０８（二点鎖線構成を有する）は電気穿孔プロセスＰ４中の電場を表す。本明細書における実施例２を参照のこと。
【0027】
図４及び以下の表１に示されるように、有効電場は、電極１０２と１０４との間を通る流体量が増大するにつれてより大きな低下を経験する。流体量は、各電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４中に受け取られた電気パルス数に関連する。例えば、電気穿孔プロセスＰ１は、プロセスＰ１が線４１０で終わるとき、１２０マイクロリットル（μＬ）の流体を処理し（例えば約６０パルスの持続時間）、電気穿孔プロセスＰ２は、プロセスＰ２が線４１２で終わるとき、２４０μＬの流体を処理し（例えば約８３パルスの持続時間）、電気穿孔プロセスＰ３は、プロセスＰ３が線４１４で終わるとき、４００μＬの流体を処理し（例えば約１２５パルスの持続時間）、電気穿孔プロセスＰ４は、プロセスＰ４が線４１６で終わるとき、６００μＬの流体を処理する（例えば約１５５パルスの持続時間）。
【0028】
【表1】
【0029】
図４に示されるように、電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と関連する有効電場（線４０２、４０４、４０６、４０８）は、約２０～２５のパルスで低下し始める。この時間における各有効電場の値は、上の表１に示されるように約１．３１ｋＶ／ｃｍである。図４及び上の表１に示されるように、電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４が終わるとき、プロセスＰ１と関連する電場（即ち線４０２）は０．９ｋＶ／ｃｍであり、プロセスＰ２と関連する電場（即ち線４０４）は０．７１ｋＶ／ｃｍであり、プロセスＰ３と関連する電場（即ち線４０６）は０．５４ｋＶ／ｃｍであり、プロセスＰ４と関連する電場（即ち線４０８）は０．４６ｋＶ／ｃｍである。したがって、上の表１に示されるように、電気穿孔プロセスＰ１中に受ける電場は３１％のパーセント変化を有し、電気穿孔プロセスＰ２中に受ける電場は４６％のパーセント変化を有し、電気穿孔プロセスＰ３中に受ける電場は５８％のパーセント変化を有し、電気穿孔プロセスＰ４中に受ける電場は６５％のパーセント変化を有する。したがって、電極１０２と１０４との間を通る流体が多くなるほど、有効電場は大きな低下を経験する。
【0030】
さらに、電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と関連する歩留まりは、電極１０２と１０４との間を通る流体量が増える（例えば電気パルス数が増大する）につれて低下し得る。例えば、上の表１に示されるように、電気穿孔プロセスＰ１の力価は４日目で３４．５μｇ／ｍＬであり、電気穿孔プロセスＰ２の力価は４日目で２４．７μｇ／ｍＬであり、電気穿孔プロセスＰ３の力価は４日目で２７．２μｇ／ｍＬであり、電気穿孔プロセスＰ４の力価は４日目で２２μｇ／ｍＬである。したがって、図４に示されるように、α－ＣＴＬＡ４／ＴｘＭ－Ｂタンパク質が形質移入されるＣＨＯ－Ｓ細胞の濃度は、電気穿孔プロセスＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と関連する電場が低下するとき、低下する。したがって、形質移入効率は、電場Ｅが低下するにつれて低下し得る。
【0031】
しかしながら、形質移入効率は、流体にわたる有効電場が十分であることを保証することにより、電気穿孔プロセス全体を通して所望のレベルに維持し得る。例えば、図１を参照すると、制御回路１０８は、電流センサ１１４を用いて電極１０２、１０４を通る誘導電流Ｉｃｈｉｐをモニタし得る。そのような例において、制御回路１０８は電流Ｉｃｈｉｐをモニタしてピーク電流値を検出し得る。有効電場Ｅの低下を示す電流Ｉｃｈｉｐの低下が検出される場合（例えば電流Ｉｃｈｉｐがピーク電流値に達し、それから低下する場合）、制御回路１０８はＤＣ電源１０６を制御して、電流Ｉｃｈｉｐを上げ、ピーク電流値、ピーク電流値未満の所望の値等の定義された値に維持する。したがって、この特定の例において、制御回路１０８は、ＤＣ電源１０６によって提供される電流の低下の検出に応答してＤＣ電源１０６を制御し、電流Ｉｃｈｉｐを定義された値に維持する（例えば補償プロセスを開始する）。
【0032】
他の例において、制御回路１０８は、電圧センサ１１６を用いて電極１０２、１０４にわたる電圧Ｖｃｈｉｐをモニタし、電圧Ｖｃｈｉｐが定義された電圧閾値以上であることに応答して、ＤＣ電源１０６を制御し、電流Ｉｃｈｉｐを定義された値に維持し得る。例えば、先に説明したように、電圧Ｖｃｈｉｐは、有効電場Ｅの低下が生じると増大し始め得る。そのような例において、制御回路１０８は、電圧を定義された電圧閾値と比較することにより、電圧Ｖｃｈｉｐが増大し始めるときを検出し得る。電圧Ｖｃｈｉｐが定義された電圧閾値に達するか、又は超えたことに応答して、本明細書において説明したように、制御回路１０８はＤＣ電源１０６を制御して、電流Ｉｃｈｉｐを定義された値に維持し得る。
【0033】
誘導電流Ｉｃｈｉｐは、電流の損失を能動的に補償することによって維持し得る。例えば、電流Ｉｃｈｉｐは、ＤＣ電源１０６によって提供される電圧Ｖｐｓ及び／又は誘導電流Ｉｃｈｉｐを調整することによって維持し得る。電圧Ｖｐｓ及び／又は電流Ｉｃｈｉｐは、電気穿孔プロセス中、１回又は複数回調整し得る（例えばランダムに又は検知されたパラメータに基づいて周期的に等）。幾つかの例において、電圧Ｖｐｓ及び／又は電流Ｉｃｈｉｐは固定された定値に調整し得る。他の例において、電圧Ｖｐｓ及び／又は電流Ｉｃｈｉｐは、所望の正／負の傾き、数式（例えば多項式関数）等に従って調整し得る。例えば、ＤＣ電源１０６は、異なる（例えばより高い）電流を提供して電流低下を補償するように制御し得る。他の例において、ＤＣ電源１０６は、電流低下を補償するように異なる電圧を提供するよう制御し得る。そのような例において、ＤＣ電源１０６によって提供される電圧は変更し得る。例えば、制御回路１０８は、電圧をピーク電圧値まで増大させるため、電圧を異なる設定値に調整するため等でＤＣ電源１０６を制御し得る。
【0034】
例えば、チップに供給されるチップ電圧Ｖｃｈｉｐを所与として、図１のチップを通って流れる誘導電流Ｉｃｈｉｐは、総チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの関数である。そのような例において、以下の式（１）はこの関係を表す。先に説明したように、抵抗Ｒｃｈｉｐは、以下の式（２）に示されるように、ＤＣ電源１０６によって提供される電気パルス数の関数として増大し得る。抵抗Ｒｃｈｉｐが増大した結果として、電流Ｉｃｈｉｐは経時低下する。
式（１） Ｖｃｈｉｐ＝Ｉｃｈｉｐ・Ｒｃｈｉｐ
式（２） Ｒｃｈｉｐ＝Ｒ（パルス数）
式（１） Ｖｃｈｉｐ＝Ｉｃｈｉｐ・Ｒｃｈｉｐ
式（２） Ｒｃｈｉｐ＝Ｒ（パルス数）
【0035】
ＤＣ電源１０６は、低下している電流Ｉｃｈｉｐを補償するように、定義されたパラメータに基づいて制御し得る。例えば、制御回路１０８が電流Ｉｃｈｉｐの低下を検出する場合、制御回路１０８はＤＣ電源１０６を制御して、以下の式（３）に示されるように、ピーク電流Ｉｐｅａｋ等の定義された値に電流Ｉｃｈｉｐを維持し得る。そのような例において、ＤＣ電源１０６がピーク値の電流Ｉｃｈｉｐを提供することが望ましい場合、式（３）は以下の式（４）に変更することができる。電流Ｉｃｈｉｐがピーク値（例えば定数）に維持される場合、電圧は、抵抗が増大するにつれて増大する必要がある。幾つかの例において、制御回路１０８は、電気パルスの電圧をピーク電圧値Ｖｐｅａｋ又は別の適した値に増大させるようにＤＣ電源１０６を制御し得る。
式（３） Ｖｐｅａｋ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ０
式（４） Ｖｐｅａｋ／Ｒ０＝Ｉｐｅａｋ＝Ｖ（パルス数）／Ｒ（パルス数）
式（３） Ｖｐｅａｋ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ０
式（４） Ｖｐｅａｋ／Ｒ０＝Ｉｐｅａｋ＝Ｖ（パルス数）／Ｒ（パルス数）
【0036】
したがって、電流Ｉｃｈｉｐをピーク定数値に維持するために、ＤＣ電源１０６によって提供される調整電圧Ｖｐｓは、以下の式（５）に示されるように、電気パルス数及び定義された電流レベル（例えばピーク電流値）の関数として変化する抵抗に基づいて設定値Ｖｓｅｔに増大させ得る。
式（５） Ｖｓｅｔ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ（パルス数）
式（５） Ｖｓｅｔ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ（パルス数）
【0037】
図５は、経時変化する図１の誘導電流Ｉｃｈｉｐを示すグラフ５００を示す。例えば、グラフ５００は５つの段階に分けられる：（１）電気穿孔プロセスの開始、（２）流体が電極１０２と１０４との間を流れる、（３）低下、（４）電流補償、及び（５）電気穿孔プロセスの完了。図５に示されるように、電流Ｉｃｈｉｐは、流体が電極１０２と１０４との間を流れるとき、ピーク値に増大する。制御回路１０８が電流Ｉｃｈｉｐの低下を検出した場合（低下段階の開始時に）、ＤＣ電源１０６によって提供される電圧Ｖｐｓは設定値Ｖｓｅｔに増大する。その結果として、図５に示されるように、電流Ｉｃｈｉｐは、補償段階中、電気穿孔プロセスが終わるまで、ピーク値（又は別の適した定義された値）まで増大して維持される。先に説明したように、電圧Ｖｐｓが増大しない場合、電流Ｉｃｈｉｐは低下する。
【0038】
補償を開始するには、誘導電流Ｉｃｈｉｐが閾値を超える必要があり得る。例えば、図５に示されるように、制御回路１０８がＤＣ電源１０６を制御して電流チップを増大させるには、誘導電流Ｉｃｈｉｐが補償閾値を超える必要があり得る。これは、流体がチャンバに入る際のノイズに起因して、制御回路１０８が、誘導電流Ｉｃｈｉｐがピークに達したときに補償段階を時期尚早に開始しないようにし得る。
【0039】
幾つかの例において、電流Ｉｃｈｉｐは、応答的補償技法に基づいて定義された値（例えばピーク電流値）まで増大且つ／又は維持し得る。そのような例において、図１の制御回路１０８は、抵抗Ｒｃｈｉｐの増大を特定し、次いで電極１０２と１０４との間の抵抗の特定された増大に基づいて誘導電流Ｉｃｈｉｐを増大且つ／又は維持するようにＤＣ電源１０６を制御し得る。抵抗変化を特定し、抵抗変化に基づいてＤＣ電源１０６を制御するこのプロセスは、所望のように繰り返し得る。例えば、電流Ｉｃｈｉｐをピーク電流値に維持することが望ましい場合、ピーク電流値は、以下の式（６）に示されるように、システム電圧Ｖｓｙｓ及びシステム抵抗Ｒｓｙｓ（例えば抵抗Ｒｃｈｉｐ及び任意の寄生抵抗）に基づいて決定し得る。そのような例において、抵抗Ｒｓｙｓが低下に起因して増大する場合（先に説明したように）、電圧Ｖｓｙｓは増大し、電流Ｉｃｈｉｐはピーク電流値のままである。抵抗Ｒｓｙｓは、以下の式（７）に示されるように、電圧及び電流の測定値に基づいて特定し得る。
式（６） Ｖｓｙｓ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒｓｙｓ
式（７） Ｒｓｙｓ＝Ｖｍｅａｓ／Ｉｍｅａｓ
式（６） Ｖｓｙｓ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒｓｙｓ
式（７） Ｒｓｙｓ＝Ｖｍｅａｓ／Ｉｍｅａｓ
【0040】
先に説明したように、ＤＣ電源１０６は、電流Ｉｃｈｉｐをピーク電流値に維持するように制御される。例えば、電圧Ｖｓｙｓは、電流Ｉｃｈｉｐを維持するように変更し得る。そのような例において、新しいシステム電圧Ｖｓｙｓ，ｎｅｗは、先の式（６）及び（７）を使用する場合、以下の式（８）に示されるように変化する抵抗に基づいて決定し得る。電圧Ｖｓｙｓは、抵抗Ｒｓｙｓが経時変化し続けるにつれて、複数回変化し得る（例えばＶｓｙｓ，ｎｅｗ１、Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ２等）。
式（８） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・（Ｖｍｅａｓ／Ｉｍｅａｓ）
式（８） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・（Ｖｍｅａｓ／Ｉｍｅａｓ）
【0041】
幾つかの例において、制御回路１０８が電流補償段階を開始する前、図５に示されるように、電流Ｉｃｈｉｐは減少傾向を有し得る。そのような例において、以下の式（９）に示されるように、予測された電圧及び電流を第１の補償値に使用し得る（電圧及び電流の測定値の代わりに）。
式（９） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・（Ｖｐｒｏｊｅｃｔｅｄ／Ｉｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）
式（９） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・（Ｖｐｒｏｊｅｃｔｅｄ／Ｉｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）
【0042】
さらに、システムの運動学を考慮に入れるために、フィードバック利得係数を導入し得る。例えば、新しい電圧の値Ｖｓｙｓ，ｎｅｗと電圧の前の値Ｖｓｙｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓとの間の電圧差ΔＶは、以下の式（１０）を用いて特定し得る。そのような例において、ＤＣ電源１０６は、以下の式（１１）に示されるように、電圧差ΔＶ及びフィードバック利得係数Ｇに基づいて設定電圧Ｖｓｙｓ，ｓｅｔを提供するように制御し得る。フィードバック利得係数Ｇは、固定値であってもよく、又は前の補償結果から機械学習された（オンライン計算、オフラインデータベース等に基づいて）値等の変数値であってもよい。
式（１０） ΔＶ＝Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ－Ｖｓｙｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓ
式（１１） Ｖｓｙｓ，ｓｅｔ＝Ｇ・ΔＶ
式（１０） ΔＶ＝Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ－Ｖｓｙｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓ
式（１１） Ｖｓｙｓ，ｓｅｔ＝Ｇ・ΔＶ
【0043】
他の例において、誘導電流Ｉｃｈｉｐは、予測補償技法に基づいて定義された値（例えばピーク電流値）まで増大且つ／又はそこに維持し得る。そのような例において、図１の制御回路１０８は、電極１０２と１０４との間の抵抗の将来の値Ｒｃｈｉｐを予測し、次いで抵抗の予測値に基づいて定義された値（例えばピーク電流値）に増大且つ／又はそこに維持するようにＤＣ電源１０６を制御し得る。例えば、制御回路１０８は、電極１０２と１０４との間の抵抗Ｒｃｈｉｐ（例えば変化する抵抗の値）を複数回特定し、特定された抵抗間の直線投影を適用して、抵抗の将来の値を予測し得る。更に以下説明するように、直線投影は、例えば、「全データ」直線統計又は「移動窓」直線投影に基づいて適用し得る。
【0044】
例えば、図６は、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの測定値（線６０２）及び「全データ」直線投影に基づいて適用される直線投影（線６０４）を含むグラフ６００を示す。この例において、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐは、全低下期間を通してＤＣ電源１０６によって提供された電気パルス数の関数として線形増大すると仮定される。この特定の例において、制御回路１０８は、２つの連続パルスで電流低下を検出した後、ピーク電流値を決定する。ピーク電流において、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値が特定される（線６０２の点６０６において）。例えば、ピーク電流におけるチップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値は、先に説明したように、電流及び電圧の測定値に基づいて決定し得る。このピーク電流値は、低下中に増大し始める前のチップ抵抗Ｒｃｈｉｐの最小値に対応する。ピーク電流（及び最小抵抗）において、パルス点値Ｐは０に等しく設定される。電流低下の２つの連続パルス後、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値が再び特定される（線６０２の点６０８における）。この電流において、パルス点値Ｐはｎに等しく設定される。
【0045】
次に、直線投影（破線６０４）が、点６０６におけるパルス点値Ｐ＝０（ピーク電流）から点６０８におけるパルス点値Ｐ＝ｎ（最新パルス点）に適用し得る（例えば線形適合）。この直線投影を使用して、電極劣化に起因した次のパルス（例えばパルス点値Ｐ＝ｎ＋１）における抵抗の将来値（Ｒ＿ｎ＋１）を予測し得る。これは、直線投影線６０４上の点６１０として示されている。抵抗（Ｒ＿ｎ＋１）が予測された後、電源１０６は、以下の式（１２）に示されるように、予測抵抗値及び電流Ｉｃｈｉｐの定義された値（例えばピーク電流値）に基づいて新しい電圧Ｖｓｙｓ，ｎｅｗを提供するように制御し得る。
式（１２） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ＿ｎ＋１
式（１２） Ｖｓｙｓ，ｎｅｗ＝Ｉｐｅａｋ・Ｒ＿ｎ＋１
【0046】
「全データ」直線投影プロセスは、所望のように繰り返されて（例えば電気穿孔プロセスの終わりまで）、次のパルスにおける抵抗（Ｒ＿ｎ＋２、Ｒ＿ｎ＋３）を予測し、電流Ｉｃｈｉｐを定義された値に維持するために必要な電圧を決定し得る。例えば、図７は、将来のパルスにおける抵抗値を予測するために適用される複数の直線投影（例えば破線７０２ａ～ｎ）を示すグラフ７００を示す。図６及び図７に示される「全データ」直線投影を使用することにより、適用される直線投影、ひいては抵抗の予測値は、抵抗値を特定する際に受けるノイズに起因した電圧変化の不規則性を受けにくいことができる。しかしながら、「全データ」直線投影法の使用は、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐが非線形的に変化する（例えば非線形低下）場合、正確な予測を提供しないことがある。
【0047】
図８は、チップ抵抗の測定値Ｒｃｈｉｐ（線８０２）及び「移動窓」直線投影に基づいて適用される直線投影（線８０４）を含むグラフ８００を示す。この例において、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐは局所間隔で線形増大（例えば区分的線形増大）すると仮定される。「移動窓投影法において、図１の制御回路１０８は、２つの連続パルスで電流低下を検出した後、ピーク電流値を決定する。ピーク電流において、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値が特定される（例えば測定等される）。線８０２上のこの抵抗値は点８０６として識別される。ピーク電流において、パルス点値Ｐは０に等しく設定される。チップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値は、初期抵抗値後（例えばＰ＝０の後）、１回又は複数回特定される。図８の特定の例において、制御回路１０８は、線８０２の点８０８（パルス点値Ｐ＝ｎ－１に対応する）におけるチップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値及び線８０２の点８１０（パルス点値Ｐ＝ｎに対応する）におけるチップ抵抗Ｒｃｈｉｐの値を特定する。他の例において、制御回路１０８はチップ抵抗のより多数又は少数の値を特定し得る。
【0048】
次に、直線投影（線８０４）が、パルス点値Ｐ＝ｎ－ｍからパルス点値Ｐ＝ｎ（最新パルス点）に適用し得（例えば線形適合）、ｍは区分のデータ長（例えば局所間隔にわたる定義された電気パルス数）である。図８の例において、ｍは３に等しく（例えば点８０６、８０８、８１０）、点８１０は最新パルス点である。したがって、この特定の例において、直線投影は、図８に示されるように、点８０６（例えばＰ＝ｎ－ｍ）と点８１０（例えばＰ＝ｎ）との間で線形適合される。次いでこの直線投影を使用して、次のパルス（例えばパルス点値Ｐ＝ｎ＋１）における抵抗の将来値（Ｒ＿ｎ＋１）を予測し得る。これは、直線投影線８０４上の点８１２として示される。抵抗（Ｒ＿ｎ＋１）が予測された後、電源１０６は、予測抵抗値及び電流Ｉｃｈｉｐの定義された値（例えばピーク電流値）に基づいて新しい電圧Ｖｓｙｓ，ｎｅｗを提供するように制御し得る。
【0049】
「移動窓」直線投影プロセスは、所望のように繰り返されて（例えば電気穿孔プロセスの終わりまで）、次のパルスにおける抵抗を予測し、電流Ｉｃｈｉｐを定義された値に維持するために必要な電圧を決定し得る。例えば、図９は、将来のパルスにおける抵抗値を予測するために適用される複数の直線投影（例えば破線９０２ａ～ｎ）を示すグラフ９００を示す。各直線投影の区分のデータ長（ｍ）は同じであってもよく、又は異なってもよい。図８及び図９に示される「移動窓」直線投影を使用することにより、制御回路１０８は、チップ抵抗Ｒｃｈｉｐが非線形的に変化する（例えば非線形低下）場合、積極的補償手法で応答し得る。しかしながら、「移動窓」直線投影法の使用は、予測プロセス中、望ましくないノイズを導入し得る。
【0050】
図１の制御回路１０８は、先に説明した予測補償技法を採用する場合、種々の構成要素及び／又は方法を採用し得る。例えば、「全データ」及び「移動窓」直線投影技法は、フィードバック制御のために線形回帰に基づく。そのような例において、単純な利得係数Ｇをフィードバック制御と共に採用し得る。
【0051】
他の例において、制御回路１０８はフィードバック制御に特定のコントローラを含み得る。例えば、制御回路１０８は、比例積分偏差（ＰＩＤ）コントローラ、比例積分（ＰＩ）コントローラ、比例偏差（ＰＤ）コントローラ、及び／又は比例（Ｐ）コントローラを含み得を含み得る。さらに、システムの運動学を考慮に入れるために、ＰＩＤコントローラ、ＰＩコントローラ、ＰＤコントローラ、及び／又はＰコントローラの利得係数を導入し得る。フィードバック利得係数は固定値であってもよく、又は変数値であってもよい。
【0052】
幾つかの例において、フィードバック利得係数は、前の補償結果（オンライン計算、オフラインデータベース等に基づく）等から機械学習し得る。例えば、予測補償技法は、形質移入されている同じ細胞株又は同じ用途（例えばタンパク質産生）に、実験で得られた既知のデータ点、過去のデータベース等に基づいて機械学習法を使用し得る。
【0053】
テストにより、「移動窓」直線投影の使用が、低下期間中、他の補償技法よりも良好な補償結果を生成し得ることが示された。例えば、図１０は、位置合わせされた時間期間にわたる正規化された電場値を表す線１００２、１００４、１００６、１００８を含むグラフ１０００を示す。特に、線１００２（点線構成を有する）は「移動窓」直線投影が適用される場合の電場を表し、線１００４（二点鎖線構成を有する）は「全データ」直線投影が適用される場合の電場を表し、線１００６（破線構成を有する）は応答補償技法が適用される場合の電場を表し、線１００８（実線構成を有する）は補償技法が適用されない場合の電場を表す。１０秒の印の後（例えば正規化電場値がピークに達すると）、低下が始まり、低下が検出された後、「移動窓」直線投影、「全データ」直線投影、及び応答技法の補償が始まる。図１０に示されるように、「移動窓」直線投影技法に対応する電場（線１００２）は、低下期間中、約１の正規化値に維持され、「全データ」直線投影技法に対応する電場（線１００４）は、低下期間中、約０．９５の正規化値に維持され、応答補償技法に対応する電場（線１００６）は、低下期間中、約０．８５の正規化値に維持される。したがって、図１０の例において、「移動窓」直線投影技法は、「全データ」直線投影及び応答補償技法よりも良好な形質移入効率を提供する。
【0054】
さらに、「移動窓」直線投影技法を使用した電気穿孔プロセスは、従来の電気穿孔プロセスよりも大きな歩留まりを受け得る。本明細書における実施例３を参照のこと。例えば、図１１は、異なる電気穿孔プロセスを使用してＣＨＯ－Ｓ細胞にα－ＣＴＬＡ４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質を形質移入する場合の生物学的性能結果を表す線１１０２、１１０４、１１０６、１１０８、１１１０を含むグラフ１１００を示す。図１１の例において、本明細書に開示されるような「移動窓」直線投影技法が適用される電気穿孔プロセス又は補償のない従来の電気穿孔プロセスを使用して、α－ＣＴＬＡ４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞に形質移入した。特に、線１１０２、１１０４、１１０６は、補償中、「移動窓」直線投影技法を採用する電気穿孔プロセスと関連し、線１１０８は補償のないＭａｘｃｙｔｅ（登録商標）電気穿孔プロセスと関連し、線１１００は補償のない従来の電気穿孔プロセスである。
【0055】
示されるように、力価線１１０２（点線構成を有する）は、１．４５ｋＶ／ｃｍの電場が１０ｍＬの二相性試料に適用された場合、３３５．３μｇ／ｍＬに達し、力価線１１０４（破線構成を有する）は、１．４５ｋＶ／ｃｍの電場が１０ｍＬの試料に適用された場合、３０６μｇ／ｍＬに達し、力価線１１０６（一点鎖線構成を有する）は、１．３ｋＶ／ｃｍの電場が１０ｍＬの試料に適用された場合、２７６．９μｇ／ｍＬに達する。さらに、力価線１１０８（二点鎖線構成を有する）は、１００ｍＬ試料で２１４．２μｇ／ｍＬに達し、力価線１１１０（実線構成を有する）は、１０ｍＬ試料で１６０．９μｇ／ｍＬに達する。したがって、形質移入効率は、補償が適用されない場合（例えば線１１０８、１１１０）と比較して、「移動窓」直線投影技法に基づく補償が適用される場合（例えば線１１０２、１１０４，１１０６）、はるかに高くなり得る。
【0056】
幾つかの例において、制御回路（例えば図１の制御回路１０８）は、電極間を流れる流体をモニタし、流体と関連する１つ又は複数のパラメータの検出に応答して、関連するＤＣ電源を制御して、電気パルスを生成且つ／又は電気パルスの生成を停止させ得る。例えば、図１２は、カーゴを用いて細胞に形質移入する装置１２００を示し、電極１２０２、１２０４、１２１０、１２１２と、電極１２１０、１２１２に結合されたセンサ１２０６とを含む。電極１２０２、１２０４は図１の電極１０２、１０４と略同様である。したがって、電極１２０２、１２０４は互いから離間され得、間を流れる細胞及びカーゴを含む流体の経路１２０８を画定し得る。経路１２０８は蛇行構成又は任意の他の適した構成を有し得る。
【0057】
図１２に示されるように、電極１２１０、１２１２は電極１２０２、１２０４の逆側の経路１２０８（例えば流体チャネル）の流入口及び流出口に位置決めされる。例えば、図１２に示されるように、電極１２１０（破線で示される）は、電極１２０２、１２０４の下側の流入口及び流出口に位置決めされ、電極１２１２（実線で示される）は電極１２０２、１２０４の上側の流入口及び流出口に位置決めされる。電極１２１０、１２１２は、電極１２０２と１２０４との間の流体経路１２０８への流体の流入及び流出を検出するために採用し得る。
【0058】
図１２の例において、センサ１２０６は、本明細書で説明されるように、ＤＣ電源（図示せず）を制御して、電場低下の補償する制御回路（図示せず）又はその一部と通信し得る。センサ１２０６は電流センサ又はインピーダンスセンサであり得る。
【0059】
図１２の特定の例において、経路１２０８を通る流体は、電圧が電極１２１０、１２１２に印加されるとき、電極１２１０、１２１２を取って流れる電流及び／又は電極１２１０、１２１２にわたる抵抗を検知することによって検出される。例えば、電極１２０２と１２０４との間の経路１２０８を通って流れる流体は、電極１２１０、１２１２を通る電流を変化させ得、且つ／又は電極１２１０、１２１２にわたる抵抗を変化させ得る。そのような例において、センサ１２０６はこの電流及び／又は抵抗の変化を検出し、電気穿孔プロセスが開始された（例えば流体が電極１２１０と１２１２との間を流れている）、終了しつつある等を示す信号を制御回路に送信し得る。
【0060】
例えば、図１３は、５つの段階での流体フローと、５つの段階にわたる電極１２１０、１２１２と関連する検知パラメータ（例えば電流又は抵抗）のグラフとを示す。第１の段階において、流体は電極１２１０、１２１２に達しておらず、検知パラメータは初期状態（例えば流体のない定常状態値）のままである。第２の段階において、流体は経路１２０８の流入口において電極１２１０、１２１２を通り、検知パラメータを増大させる。第３の段階において、流体は経路１２０８の流入口及び流出口において電極１２１０、１２１２を通り、検知パラメータを再び増大させる。第４の段階において、流体は、経路１２０８の流出口において電極１２１０、１２１２を通り、検知パラメータを低下させる。第５の段階において、流体は電極１２１０、１２１２を通過してしまっており、検知パラメータを再び低下させる（例えば定常状態値に戻る）。したがって、制御回路は、パラメータの増大（例えば流体が段階２～４に存在する場合）に基づいて電気パルスを生成し、定常状態パラメータ（例えば段階５において）に基づいて電気パルスの生成を停止するようにＤＣ電源を制御し得る。さらに、流体が存在するときに関連して電場が低下し始めるときが既知である場合、制御回路は、チャンバに流体が充填されたとき（例えば段階３）、電場低下を補償するようにＤＣ電源を制御し始め得る。これにより、制御回路は、例えばＤＣ電源によって提供される電流の低下検出に基づく他の技法と比較して、早期の時点で補償プロセスを開始することができる。
【0061】
図１４は、電極間を流れる流体をモニタし、流体と関連する１つ又は複数のパラメータの検出に応答して、電気パルスを生成且つ／又は電気パルスの生成を停止するように関連するＤＣ電源を制御し得る別の装置１４００を示す。例えば、図１４に示されるように、装置１４００は、流体経路１４２０、１４２２、１４２４、流体経路１４２２における逆止め弁１４２６、経路１４２０、１４２２、１４２４と流通するセンサ１４０６ａ～ｄ、及び経路１２０８を画定する図１２の電極１２０２、１２０４を含む。示されるように、流体経路１２０８（電極１２０２と１２０４との間）は、流体経路１４２０と１４２４との間に結合され、流体経路１４２２（例えば側方経路）は流体経路１４２０から延びる。図１３の例において、センサ１４０６ａ～ｄは、本明細書で説明されたように、電場低下を補償するようにＤＣ電源（図示せず）を制御する制御回路又はその一部と通信し得る。
【0062】
電気穿孔プロセスが開始されると、流体は、破線矢印で示されるように、経路１２０８、１４２０、１４２２、１４２４を通って流れ始める。特に、流体は経路１４２０（例えば流入経路）を通って流れ、経路１２０８に入り、経路１４２４（例えば流出経路）から出る。そのような例において、一方又は両方のセンサ１４０６ａ～ｂは、経路１２０８（例えばチップ）に流入する流体を検知し、信号を制御回路に送信し得る。これにより、制御回路は、電気穿孔プロセスが開始されたことを示す流体の存在を検出することができる。したがって、制御回路は、流体の存在に基づいて、ＤＣ電源を制御して電気パルスを生成し得る。制御回路は次いで、センサ１４０６ａ～ｃのいずれか１つが流体の存在を検出したことに応答して、電場の低下を補償するようなＤＣ電源の制御を開始し得る。これは、例えばＤＣ電源によって提供される電流の低下検出に基づく他の技法と比較して、早期の時点で補償プロセスを開始し得る。
【0063】
さらに、制御回路は、流体と関連するパラメータに基づいて電気穿孔プロセスを停止し得る。例えば、センサ１４０６ｃは、流体が経路１２０８（例えばチップ）を通過し終えており、電気穿孔プロセスが終了したことを示す流体の低下及び／又は流体の不在を検知し得る。そのような例において、センサ１４０６ｃは信号を制御回路に送信し得、制御回路は、電気パルスの生成を停止（例えば電気穿孔プロセスを停止）するようにＤＣ電源を制御し得、且つ／又はオフにするように流体ポンプを制御し得る。
【0064】
幾つかの例において、逆止め弁１４２６は、経路１２０８、１４２０、１４２４の１つでの流体の詰まりを検知する閉塞検出器として機能し得る。例えば、流体の詰まりが存在する場合、圧力が逆止め弁１４２６の内側に蓄積し得る。圧力が逆止め弁１４２６の定義された作動閾値（例えば２０～４０ｐｓｉ）を超える場合、逆止め弁１４２６は開かれて、流体が経路１４２２を通り、弁１４２６の外側に位置決めされたセンサ１４０６ｄを超えて流れさせ得る。そのような例において、センサ１４０６ｄは流体を検出し（経路１２０８、１４２０、１４２４の１つにおける詰まりを示す）、信号を制御回路に送信して、電気パルスの生成及び／又は流体ポンプを停止させる。他の例において、逆止め弁１４２６は、弁１４２６の状態（例えば開又は閉）に基づいて制御回路に信号を送信して、詰まりが存在するか否かを示し得る。そのような例において、センサ１４０６ｄは採用されなくてよい。
【0065】
センサ１４０６ａ～ｄは任意の適したセンサであり得る。例えば、センサ１４０６ａ～ｄのいずれか１つは、超音波センサ、光センサ（例えば赤外線センサ）等であり得る。そのような例において、流体は、流体、流体を通る移動を反映した波及び／又は光によって検出し得る。光センサは、可視光又は非可視光を提供且つ／又は検出し得る。幾つかの例において、ＬＥＤ、レーザ、赤外線光等の１つ又は複数の光源は、センサ１４０６ａ～ｄと併せて採用されてもよく、且つ／又はセンサ１４０６ａ～ｄの一部であってもよい。さらに、図１３の特定の例において、４つのセンサ１４０６ａ～ｄは電極１２０２、１２０４の外部に位置決めされる。他の例において、所望であれば、センサ１４０６ａ～ｄのいずれか１つは経路１２０８に沿って（例えば電極１２０２と１２０４との間）位置決めし得る。さらに、幾つかの例において、１つのみのセンサ（例えばセンサ１４０６ａ、センサ１４０６ｂ等）を利用してもよく、４つよりも多くのセンサを利用してもよい等である。
【0066】
本明細書に開示される電極は、任意の適したタイプの導電性電極であり得る。例えば、電極１０２、１０４、１２０２、１２０４、１２１０、１２１２のいずれか１つは、細胞及びカーゴを含む流体を通過させる多孔性を有するメッシュ板、固体板等を含み得る。
【0067】
さらに、本明細書に開示される電源及び制御回路は種々の適した構成要素を含み得る。例えば、図１５は、ＤＣ電源１０６と、図１の制御回路１０８とを含む装置１５００を示す。図１５の例において、ＤＣ電源１０６は電力変換器１５０２及びパルス回路１５０４を含む。電力変換器１５０２は、任意の適した変換器トポロジを有するＤＣ－ＤＣ電力変換回路及び／又はＡＣ－ＤＣ電力変換回路を含み得る。例えば、電力変換器１５０２はＤＣ又はＡＣ電力を受け取り、調整ＤＣ電圧をパルス回路１５０４に出力し得る。幾つかの例において、電源１０６はＡＣ－ＤＣ整流器と、ＡＣ－ＤＣ整流器に結合されたＤＣ－ＤＣバック、ブースト等の変換回路とを含み得る。
【0068】
図１５のパルス回路１５０４は調整ＤＣ電圧を電力変換器１５０２から受け取り、ＤＣ電圧をＤＣ電気パルスに変換する。本明細書に説明したように、電気パルスは次いで電極（例えば図１の電極１０２、１０４、図１２の電極１２０２、１２０４等）に提供される。例えば、パルス回路１５０４は、電力変換器１５０２からのＤＣ電圧を解釈して電気パルスを作成する１つ又は複数のスイッチングデバイスを含み得る。
【0069】
図１５の例において、制御回路１０８はコントローラ１５０６と、コントローラ１５０６に結合されたパルス生成器１５０８とを含む。示されるように、コントローラ１５０６は、電力変換器１５０２の出力パラメータ（例えば出力電圧）を表すフィードバック信号を受信し、フィードバック信号に基づいて電力変換器１５０２内の１つ又は複数のスイッチングデバイスを制御するための１つ又は複数の制御信号を電力変換器１５０２に提供する。幾つかの例において、コントローラ１５０６は、図１の電圧センサ１１６によって検知された電圧Ｖｃｈｉｐ及び／又は図１の電流センサ１１４によって検知された誘導電流Ｉｃｈｉｐに基づいて電力変換器のスイッチングデバイスを制御して、異なる設定値における電力変換器の出力電圧を調整する。したがって、コントローラ１５０６は電気パルスの振幅を制御し得る。そのような例において、コントローラ１５０６は、本明細書に説明したように、電場低下を補償するように電力変換器１５０２の出力を制御し得る。
【0070】
コントローラ１５０６は、信号をパルス生成器１５０８に提供し、パルス生成器１５０８は、コントローラ１５０６から受信した信号に基づいて電気パルスを生成するようにスイッチデバイスを制御するための１つ又は複数の制御信号をパルス回路１５０４に提供する。幾つかの例において、パルス生成器１５０８は、コントローラ１５０６から受信した信号に基づいて電気パルスの周波数、パルス幅、デューティサイクル等を調整し得る。
【実施例】
【0071】
実施例１（図２及び図３）
細胞調製：実験前、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ａ１１５５７－０１）をＣＤ－ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．１０７４３０２９）＋８ｍＭのＬ－グルタミンで増殖させた。ＣＨＯ－Ｓ細胞を培養し、２ｅ６細胞／ｍＬ未満の濃度で採取した。実験の０日目、３７℃で５％の自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーが存在し、実験の１日目、１ｍＭの酪酸ナトリウムが添加され、５％の自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーを３２℃にした。実験の４日目及び８日目に自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーを供給した。電気穿孔プロセス中、生存力及びＶＣＤ（生細胞密度）は同様の傾向線を辿る。
細胞調製：実験前、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ａ１１５５７－０１）をＣＤ－ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．１０７４３０２９）＋８ｍＭのＬ－グルタミンで増殖させた。ＣＨＯ－Ｓ細胞を培養し、２ｅ６細胞／ｍＬ未満の濃度で採取した。実験の０日目、３７℃で５％の自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーが存在し、実験の１日目、１ｍＭの酪酸ナトリウムが添加され、５％の自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーを３２℃にした。実験の４日目及び８日目に自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーを供給した。電気穿孔プロセス中、生存力及びＶＣＤ（生細胞密度）は同様の傾向線を辿る。
【0072】
細胞を採取し、自家製ナトリウム系電気穿孔バッファー（ナトリウム濃度８ｍＭ／Ｌ、導電率＝１０～１４ｍＳ／ｃｍ、モル浸透圧濃度＝２６５～３００ｍＯＳＭ／Ｌ、ｐＨ７．２～７．４）で洗浄し、細胞密度１００ｅ６細胞／ｍＬで自家製ナトリウム系バッファーに再懸濁させた。自家製ナトリウム系電気穿孔バッファーの以下の表２に示す。
【0073】
【表2】
【0074】
α－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（Ｎ－８４４－２）ＤＮＡ調製：Ｎ－８４４－２は、抗ＣＴＬＡ－４ｓｃＦｖがＩＬ－１５ＲαＳｕ部分に付着した抗ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ分子である。抗ＣＴＬＡ－４ｓｃＦｖ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ分子の調製及び開示は、国際公開第２０１８／０７５９８９号パンフレットに開示されており、これは全体的に、参照により本明細書に援用される。Ｎ－８４４－２のＤＮＡ配列を哺乳類発現プラスミドに移植した。次いで、Ｅｎｄｏ Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｇｉｇａキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２３９１）を使用して、Ｎ－８４４－２配列を含むＤＮＡプラスミドをミリグラム量で調製した。α－ＣＴＬＡ４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを水中に希釈し、電気穿孔プロセスの直前、細胞懸濁液と混合した。
【0075】
電気穿孔：細胞及びＤＮＡ混合懸濁液を５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブに入れ、蠕動ポンプ及び管類を用いて電気穿孔チップに圧送した。パルス波形は４０Ｖであり、パルス幅は４５０μｓであり、パルス間隔は２．７秒であり、流量は２ｍＬ／分であった。各パルス（ｐ）の関数として実験全体にわたって電圧Ｖ（ｐ）及び電流Ｉ（ｐ）を記録し、抵抗Ｒ（ｐ）をＲ（ｐ）＝Ｖ（ｐ）／Ｉ（ｏｐ）として計算した。Ｒ０＝ｍｉｎ（Ｒ（ｐ））は、流体が完全に電気穿孔チャンバを充填したときであり、これが図１における初期電極－流体界面抵抗Ｒｉとして設定される。有効電場をＥ＝Ｖ（ｐ）＊Ｒ０／（Ｒ（ｐ）＊ｄ）として計算し、ｄは電極対間の距離であった。図２及び図３：Ｖ、Ｉ、Ｒ、Ｅを次いでパルスｐの関数数としてプロットした。
【0076】
実施例２（図４）
細胞調製及びα－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（Ｎ－８４４－２）ＤＮＡ調製は実施例１と同じであった。
細胞調製及びα－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（Ｎ－８４４－２）ＤＮＡ調製は実施例１と同じであった。
【0077】
電気穿孔：細胞及びＤＮＡ混合懸濁液を１．５ｍＬ管に入れ、蠕動ポンプ及び管類を用いて電気穿孔チップに圧送した。４つの異なる総量の細胞及びＤＮＡ混合液をこの実験でテストした：１２０μＬ、２４０μＬ、４００μＬ、及び６００μＬ。パルス波形は３８Ｖであり、パルス幅は４５０μｓであり、パルス間隔は０．２７秒であり、流量は１ｍＬ／分であった。各パルス（ｐ）の関数として実験全体にわたって電圧Ｖ（ｐ）及び電流Ｉ（ｐ）を記録し、抵抗Ｒ（ｐ）をＲ（ｐ）＝Ｖ（ｐ）／Ｉ（ｏｐ）として計算した。Ｒ０＝ｍｉｎ（Ｒ（ｐ））は、流体が完全に電気穿孔チャンバを充填したときであり、これが図１における初期電極－流体界面抵抗Ｒｉとして設定された。有効電場をＥ＝Ｖ（ｐ）＊Ｒ０／（Ｒ（ｐ）＊ｄ）として計算し、ｄは電極対間の距離であった。図４：次いでパルスｐの関数数として有効電場Ｅをプロットした。
【0078】
実施例３（図１１）
細胞調製及びα－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（Ｎ－８４４－２）ＤＮＡ調製は実施例１と同じであった。
細胞調製及びα－ＣＴＬＡ－４／ＴｘＭ－Ｂ融合タンパク質（Ｎ－８４４－２）ＤＮＡ調製は実施例１と同じであった。
【0079】
電気穿孔：細胞及びＤＮＡ混合懸濁液を５０ｍＬ管に入れ、蠕動ポンプ及び管類を用いて電気穿孔チップに圧送した。上述したように同じ細胞調製を用いた５つの異なる電気穿孔条件を比較した。５つの異なる条件を以下の表３に示す。
【0080】
【表3】
【0081】
図１１は、補償法を用いて、タンパク質産生力価結果が改善することを示す。力価は、 Ｎ－６０１（モノクローナルＩｇＧ１抗体）を使用して準備した標準曲線と共にＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅでのタンパク質Ａバイオセンサを使用して測定した。
【0082】
実施形態の上記説明は、例示及び説明を目的として提供されている。網羅的である、即ち本開示の限定は意図していない。特定の実施形態の個々の要素又は特徴は一般に、その特定の実施形態に限定されず、適用可能な場合には相互交換可能であり、特に図示又は説明されていない場合であっても、選択された実施形態において使用することができる。特定の実施形態の個々の要素又は特徴は多くの方法で変更することもできる。そのような変更は本開示からの逸脱として見なされるべきではなく、そのような全ての変更は本開示の範囲内に包含されると意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極であって、前記電極は、流体が前記経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する、２つの電極と、
前記電極にわたって結合されるＤＣ電源と、
前記ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、第一の定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導し、前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出し、ある時間期間にわたる前記電極間の前記抵抗の複数の値を特定し、前記抵抗の前記特定された複数の値に基づいて前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測し、前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を第二の定義された値へ増大させて、前記電極間の前記電場を前記第一の定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御するように構成された制御回路と、
を備える、装置。
【請求項2】
前記抵抗の前記特定される複数の値は、第１の値及び第２の値を含み、前記制御回路は、少なくとも前記抵抗の前記第１の値と前記抵抗の前記第２の値との間で直線投影を適用し、前記直線投影に基づいて前記電極間の前記抵抗の前記将来の値を予測するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
前記制御回路は、定義された数の電気パルスのデータ長に基づいて前記直線投影を適用するように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項4】
前記制御回路は、前記誘導電流が第二の定義された値であるとき、前記抵抗の前記第１の値を特定するように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項5】
前記誘導電流の前記第二の定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項４に記載の装置。
【請求項6】
前記誘導電流の前記第２の定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項１に記載の装置。
【請求項7】
前記制御回路は、前記複数の電気パルスの前記電圧を増大させて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項8】
前記制御回路は、比例積分偏差コントローラ、比例積分コントローラ、比例偏差コントローラ、及び比例コントローラの少なくとも１つを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項9】
前記比例積分偏差コントローラ、前記比例積分コントローラ、前記比例偏差コントローラ、及び／又は前記比例コントローラの前記少なくとも１つの利得係数は、一定又は可変である、請求項８に記載の装置。
【請求項10】
前記制御回路は、前記流体と関連するパラメータを検出し、前記流体と関連するパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項11】
前記流体と関連する前記パラメータは第１のパラメータであり、前記制御回路は、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１０に記載の装置。
【請求項12】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極と、
前記電極にわたって結合され、複数の電気パルスを提供して、前記電極間に電場を生成するための前記電極を通る電流を誘導するＤＣ電源と、
流体の存在を含む、前記流体と関連する第１のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第１のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御し、流体の存在又は不在のいずれかを含む、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される制御回路と、
を含む、装置。
【請求項13】
前記制御回路に結合された第１のセンサ及び第２のセンサを更に備え、前記第１のセンサは前記経路と流通して、流体の前記存在を検出し、前記第２のセンサは前記経路と流通して、流体の前記不在を検出する、請求項１２に記載の装置。
【請求項14】
前記第１のセンサ及び／又は前記第２のセンサは、前記流体と関連する電気パラメータを検知するように構成された光センサ又はセンサを含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項15】
前記流体と関連する前記第２のパラメータは、流体の存在を含み、前記装置は、前記経路と流通する弁と、前記経路と流通し、前記弁の外側に位置決めされて、流体の前記存在を検出するセンサとを更に備え、前記制御回路は、前記弁が流体の前記存在を検出したことに応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１２に記載の装置。
【請求項16】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する装置であって、互いから離間され、前記細胞及び前記カーゴを含む流体が間を流れるための経路を画定する２つの電極であって、前記電極は、流体が前記経路を通って流れるとき、間に抵抗を有する、２つの電極と、
前記電極にわたって結合されるＤＣ電源と、
前記ＤＣ電源を制御して、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成するための電流を前記電極を通して誘導し、前記電極間の前記抵抗の増大に起因した前記誘導電流の低下を検出し、前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測し、前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を増大させて前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成された制御回路と、
を備える、装置。
【請求項17】
前記制御回路は、定義された値まで前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１６に記載の装置。
【請求項18】
前記誘導電流の前記定義された値は、前記誘導電流のピーク値である、請求項１７に記載の装置。
【請求項19】
前記制御回路は、前記複数の電気パルスの前記電圧を増大させて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するように構成される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項20】
前記制御回路は、前記電極間の前記抵抗の前記増大を特定し、前記電極間の前記抵抗の前記特定された増大に基づいて前記誘導電流を増大させるように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項21】
前記制御回路は、ある時間期間にわたり前記抵抗の少なくとも２つの値間に直線投影を適用し、前記直線投影に基づいて前記電極間の前記抵抗の前記将来の値を予測するように構成される、請求項１９に記載の装置。
【請求項22】
前記制御回路は、定義された数の電気パルスのデータ長に基づいて前記直線投影を適用するように構成される、請求項２１に記載の装置。
【請求項23】
前記制御回路は、比例積分偏差コントローラ、比例積分コントローラ、比例偏差コントローラ、及び比例コントローラの少なくとも１つを含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項24】
前記比例積分偏差コントローラ、前記比例積分コントローラ、前記比例偏差コントローラ、及び／又は前記比例コントローラの前記少なくとも１つの利得係数は、一定又は可変である、請求項２３に記載の装置。
【請求項25】
前記制御回路は、前記流体と関連するパラメータを検出し、前記流体と関連するパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスを生成するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項26】
前記流体と関連する前記パラメータは第１のパラメータであり、前記制御回路は、前記流体と関連する第２のパラメータを検出し、前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御するよう構成される、請求項２５に記載の装置。
【請求項27】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことであって、前記電極は、流体が前記経路を流れるとき、間に抵抗を有する、流すことと、
ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導する、制御することと、
前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出することと、
ある時間期間にわたる前記電極間の前記抵抗の複数の値を特定することと、
前記抵抗の前記特定された複数の値に基づいて前記電極間の前記抵抗の将来の値を予測することと、
前記抵抗の前記将来の値に基づいて前記誘導電流を増大させて、前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【請求項28】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことと、
前記流体と関連する第１のパラメータを検出することと、
前記流体と関連する前記第１のパラメータの検出に応答して、前記電極間に電場を生成するために、複数の電気パルスを生成して前記電極を通る電流を誘導するようにＤＣ電源を制御することと、
前記流体と関連する第２のパラメータを検出することと、
前記流体と関連する前記第２のパラメータの検出に応答して、前記複数の電気パルスの生成を停止するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【請求項29】
カーゴを用いて細胞を電気穿孔する方法であって、互いから離間された２つの電極によって画定される経路に前記細胞及び前記カーゴを含む流体を流すことであって、前記電極は、流体が前記経路を流れるとき、間に抵抗を有する、流すことと、
ＤＣ電源を制御することであって、それにより、ある電圧で複数の電気パルスを前記電極に提供し、定義された値において前記電極間に電場を生成する、前記電極を通る電流を誘導する、制御することと、
前記電極間の前記抵抗の増大に起因して前記誘導電流の低下を検出することと、
前記誘導電流を増大させて前記電極間の前記電場を前記定義された値に維持するように前記ＤＣ電源を制御することと、
を含む、方法。
【国際調査報告】