特表 2023-537327 膵内分泌細胞の分化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-31

(54)【発明の名称】膵内分泌細胞の分化

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20230824BHJP

   A61K 35/39 20150101ALI20230824BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/20 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/22 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/395 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/426 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/203 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/4375 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/553 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20230824BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230824BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230824BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

A61K35/39

A61K45/06

A61K31/20

A61K31/22

A61K31/395

A61K38/05

A61K38/18

A61K31/426

A61K31/203

A61K31/496

A61K31/4375

A61K38/22

A61K31/553

A61K31/519

A61K31/437

A61K35/12

A61P3/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023506497

(86)(22)【出願日】2021-07-30

(85)【翻訳文提出日】2023-03-31

(86)【国際出願番号】 US2021044080

(87)【国際公開番号】W WO2022026932

(87)【国際公開日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】63/059,433

(32)【優先日】2020-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】598032106

【氏名又は名称】バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】ハーブ，ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】シエ，チュンフイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC20

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA22

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA14

4C084BA32

4C084BA44

4C084DB30

4C084DB54

4C084DB61

4C084DC32

4C084NA05

4C084ZC35

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC50

4C086BC57

4C086BC82

4C086CB05

4C086CB09

4C086GA07

4C086GA12

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB51

4C087BB63

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA02

4C087NA14

4C087ZC35

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA05

4C206DA11

4C206DB03

4C206DB04

4C206DB56

(57)【要約】

幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化に関連する組成物および方法が本明細書で開示される。一部の態様では、本明細書において提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで膵β細胞、α細胞、δ細胞、およびＥＣ細胞の産生に関する。一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される方法に従って産生された細胞を含む医薬組成物、ならびにそれらを使用する処理の方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップと、
（ｂ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と接触させるステップと、
（ｃ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む第２の組成物と接触させるステップと
を含む方法。

【請求項2】

（ａ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と接触させるステップと、
（ｂ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と接触させるステップと
を含む方法。

【請求項3】

前記第２の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる第３の組成物と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

（ａ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と接触させるステップと、
（ｂ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と接触させるステップと、
（ｃ）前記第２の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、の膵前駆細胞の少なくとも一部をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる第３の組成物と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップと
を含む方法であって、前記ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される、対応する細胞集団と比較して、
（ｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；
（ｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；
（ｉｉｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；または
（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合を含む方法。

【請求項5】

前記第３の組成物が、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記第３の組成物が、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子を含む、請求項３または４に記載の方法。

【請求項7】

前記第３の組成物が、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、前記エピジェネティック修飾化合物、前記ＥＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記γ－セクレターゼ阻害剤、前記プロテインキナーゼ阻害剤、前記ＲＯＣＫ阻害剤、および前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第３の組成物が前記ＰＫＣ活性化剤を含まない、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

第１の組成物が、前記ＲＯＣＫ阻害剤、前記ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、前記ＦＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および前記ＳＨＨ経路阻害剤を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

第２の組成物が、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、前記ＥＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、前記プロテインキナーゼ阻害剤、前記ＲＯＣＫ阻害剤、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および前記エピジェネティック修飾化合物を含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団が、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される対応する細胞集団と比較して、
（ｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；
（ｉｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；
（ｉｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；または
（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合
を含む、請求項３または５から１０に記載の方法。

【請求項12】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団が、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される対応する細胞集団と比較して、
（ｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；
（ｉｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；
（ｉｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；および
（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合
を含む、請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、
ソマトスタチンを発現する少なくとも約４％の細胞、
グルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞、
ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞、または
Ｃ－ペプチドを発現する少なくとも約４０％の細胞
を含む、請求項３から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される対応する細胞集団と比較して、
ソマトスタチンを発現する少なくとも約１００％を超える細胞、
グルカゴンを発現する少なくとも約２００％を超える細胞、
ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約５０％より少ない細胞、または
Ｃ－ペプチドを発現する少なくとも約２０％を超える細胞
を含む、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の期間が１～３日である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の期間が約２日である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の期間が１～３日である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第２の期間が約２日である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＰＫＣ活性化剤がＰＤＢＵを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＰＫＣ活性化剤が、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＰＫＣ活性化剤が、約５００ｎＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記γ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、請求項１、２または６から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記γ－セクレターゼ阻害剤が、０．５μＭ～１０μＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される、請求項１から３または５から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記γ－セクレターゼ阻害剤が、約２μＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される、請求項１から３または５から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む組成物と接触させ、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を得るステップ
をさらに含む、請求項２から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させるステップ
をさらに含む、請求項１または２６に記載の方法。

【請求項28】

胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞を前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性腸管細胞に分化させるステップ
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

（ａ）集団中の多能性幹細胞をＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、
（ｂ）前記胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞をＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞に分化させるステップと、
（ｃ）前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させるステップと、
（ｄ）前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、
（ｅ）１～３日の第１の期間、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と共にインキュベートするステップと、
（ｆ）（ｅ）の後に、１～３日の第２の期間、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記ＰＫＣ活性化剤、前記γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と共にインキュベートするステップと、
（ｇ）（ｆ）の後に、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団に分化させるステップと
を含む方法。

【請求項30】

（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含む；
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む；
（Ｃ）前記γ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む；
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む；
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮもしくはＤＭＨを含む；
（Ｆ）前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む；
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ－１を含む；
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む；
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビビンを含む；または
（Ｊ）前記エピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、もしくはＥＰＺ６４３８を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、
（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤およびγ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、
（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと
を含む方法。

【請求項32】

細胞集団を、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子の一方または両方と接触させるステップを含む方法であって、細胞集団はＰＤＸ１陽性細胞を含む方法。

【請求項33】

細胞集団がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

細胞集団がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

（ａ）１～５日間以下の期間、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、
（ｂ）第１の細胞集団をγセクレターゼ阻害剤と接触させるステップと
を含む方法。

【請求項36】

ステップ（ａ）の接触が、４日間または５日間の期間である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ステップ（ｂ）が、第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、
（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップであって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体であるステップと、
（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと
を含む方法。

【請求項39】

ベンゾラクタム誘導体がＴＰＰＢである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

ステップ（ｂ）が、第１の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

方法が、
（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップ
をさらに含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

ステップ（ｄ）が、第３の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含まない、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ステップ（ｄ）が、第３の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップを含まない、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

ステップ（ｄ）が、第３の細胞集団をＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含まない、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

ステップ（ｄ）が、第３の細胞集団をＥＧＦファミリーからの成長因子と接触させるステップを含まない、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

方法が、
（ｅ）第４の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップ
をさらに含む、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

ステップ（ｅ）が、第４の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、
（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、
（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにγ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと、
（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップと、
（ｅ）第４の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびに血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップと、
を含む方法。

【請求項49】

ステップ（ｅ）が、第４の細胞集団を血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

ステップ（ａ）が、１、２、３、４、５または６日間にわたって行われる、請求項３１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

ステップ（ａ）が、３～５日間（例えば、４日間）にわたって行われる、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

ステップ（ｂ）が、１、２、３または４日間にわたって行われる、請求項３１から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

ステップ（ｂ）が、１～３日間（例えば、２日間）にわたって行われる、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

ステップ（ｃ）が、１、２、３、または４日間にわたって行われる、請求項３１から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

ステップ（ｃ）が、１～３日間（例えば、２日間）にわたって行われる、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

ステップ（ｄ）が、１、２、３、４、５、６、または７日間にわたって行われる、請求項３１から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

ステップ（ｄ）が、４～６日間（例えば、５日間）にわたって行われる、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ステップ（ｅ）が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間にわたって行われる、請求項４６から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

ステップ（ｅ）が、１０～１２日間にわたって行われる、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

第１の細胞集団が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞および／またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項３１から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

第２の細胞集団が、ＰＤＸ１陽性およびＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項３１から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

第３の細胞集団が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陰性細胞および／またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項３１から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

第４の細胞集団が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項４１から６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

第５の細胞集団が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞を含む、請求項４６から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

第４の細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

第４の細胞集団における４０～６０％の細胞が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

第４の細胞集団が、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現しない細胞を含む、請求項４１から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

第４の細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％または３５～４０％の細胞が、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現しない、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

第４の細胞集団における１０～２５％の細胞が、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

第４の細胞集団が、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない細胞を含む、請求項４１から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

第４の細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％または１５～２０％の細胞が、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

ステップ（ａ）が、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む、請求項３１から７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

ステップ（ｂ）が、第１の細胞集団を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む、請求項３１から７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

ステップ（ｃ）が、第２の細胞集団を、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む、請求項３１から７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

ステップ（ｄ）が、第３の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む、請求項４１から７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾバビンまたはＹ－２７６３２である、請求項３１から７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

ステップ（ａ）および／または（ｂ）において使用するためのＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子がアクチビンＡである、請求項３１から７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

ステップ（ａ）および／または（ｂ）において使用するためのＦＧＦファミリーからの成長因子がＫＧＦである、請求項３１から７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸である、請求項３１から７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのＳＨＨ経路阻害剤がＳａｎｔ－１である、請求項３１から７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

ステップ（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）において使用するためのＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される、請求項３１または４１から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

ＰＫＣ活性化剤がＰＤＢＵである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

ステップ（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのγ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩである、請求項３１から８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤がＡＬＫ５ｉである、請求項３１から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

ステップ（ｃ）において使用するためのＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンである、請求項３１から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＴＨシグナル伝達経路活性化剤が、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である、請求項３１から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのプロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンである、請求項３１から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である、請求項３１から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのエピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐである、請求項３１から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項91】

組成物における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の細胞が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である、請求項９０に記載の組成物。

【請求項92】

組成物における９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満の細胞が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である、請求項９０または９１に記載の組成物。

【請求項93】

前記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される、請求項９０から９２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項94】

γ－セクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項９０から９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項95】

γ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩである、請求項９０から９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項96】

組成物がＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項９０から９５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項97】

ＦＧＦファミリーからの成長因子がＫＧＦである、請求項９６に記載の組成物。

【請求項98】

組成物がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子をさらに含む、請求項９０から９７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項99】

ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子がアクチビンＡである、請求項９８に記載の組成物。

【請求項100】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；およびＰＫＣ活性化剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物であって、ＰＫＣ活性化剤がベンゾラクタム誘導体である組成物。

【請求項101】

ＰＫＣ活性化剤がＴＰＰＢである、請求項９０から１００のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項102】

組成物がγ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む、請求項１００または１０１に記載の組成物。

【請求項103】

γ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩである、請求項１０２に記載の組成物。

【請求項104】

γ－セクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１０２に記載の組成物。

【請求項105】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む、請求項９０から１０４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項106】

血清アルブミンタンパク質をさらに含む、請求項９０から１０５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項107】

血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む、請求項９０から１０６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項108】

ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾバビンである、請求項１０５から１０７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項109】

ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸である、請求項１０５から１０８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項110】

ＳＨＨ経路阻害剤がＳａｎｔ－１である、請求項１０５から１０９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項111】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤がＡＬＫ５ｉである、請求項１０５から１１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項112】

ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンである、請求項１０５から１１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項113】

甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤が、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である、請求項１０５から１１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項114】

プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンである、請求項１０５から１１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項115】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である、請求項１０５から１１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項116】

エピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐである、請求項１０５から１１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項117】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団が、
Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞；ならびに
（ｉ）ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞、および／または
（ｉｉ）グルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞
を含む組成物。

【請求項118】

前記細胞集団が、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３０％の細胞、およびグルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を含む、請求項１１７に記載の組成物。

【請求項119】

細胞のパーセンテージがフローサイトメトリーによって測定される、請求項１１７または１１８に記載の組成物。

【請求項120】

前記細胞集団が、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない少なくとも約１５％の細胞を含む、請求項１１７から１１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項121】

前記細胞集団が、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない少なくとも約４％の細胞を含む、請求項１１７から１２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項122】

細胞集団を含む組成物であって、
ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、もしくは８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；
ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに／または
ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物。

【請求項123】

細胞集団を含む組成物であって、
ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；
ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに
ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物。

【請求項124】

細胞集団を含む組成物であって、
ａ）細胞集団における５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～３５％、２５～３０％、もしくは３０～３５％の細胞は、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現せず；
ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；および／または
ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物。

【請求項125】

細胞集団を含む組成物であって、
ａ）細胞集団における５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～３５％、２５～３０％、または３０～３５％の細胞は、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現せず；
ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；および
ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物。

【請求項126】

細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない、請求項１２４または１２５に記載の組成物。

【請求項127】

ａ）細胞集団における４０～６０％の細胞が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１は発現せず；
ｂ）細胞集団における１０～２５％の細胞が、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンは発現せず；ならびに
ｃ）細胞集団における４～１０％の細胞が、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンは発現しない、請求項１２２から１２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項128】

細胞集団における２５％未満、２０％未満、１８％未満、１５％未満、１２％未満、または１０％未満の細胞が、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現しない、請求項１２７に記載の組成物。

【請求項129】

細胞集団が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞から産生される、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項130】

Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグルコース刺激インスリン分泌応答を呈す、請求項１１７から１２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項131】

グルコースチャレンジに応答して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞によるインスリンの分泌が、グルコースチャレンジのグルコース濃度に比例する、請求項１３０に記載の組成物。

【請求項132】

Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞が、１回または複数のグルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌する、請求項１３０または１３１に記載の組成物。

【請求項133】

Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞が、第１のグルコースチャレンジ、第２のグルコースチャレンジ、および第３のグルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌し、第１のグルコースチャレンジ、第２のグルコースチャレンジ、および第３のグルコースチャレンジが連続的に適用される、請求項１３０から１３２に記載の組成物。

【請求項134】

請求項９０から１３３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１から８９のいずれか一項に記載の方法に従って生成された細胞集団、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。

【請求項135】

請求項９０から１３４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１から８９のいずれか一項に記載の方法に従って生成された細胞集団を含むデバイスであって、デバイスは、対象に埋め込まれた場合、インスリンを生成し、放出するように構成されるデバイス。

【請求項136】

対象を処置する方法であって、請求項９０から１３４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１から８９のいずれか一項に記載の方法に従って生成された細胞集団、または請求項１３５に記載のデバイスと共に、対象に投与するステップを含む方法。

【請求項137】

ＰＤＸ１陽性細胞、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子のうちの一方または両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項138】

細胞の組成物がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む、請求項１３７に記載の組成物。

【請求項139】

細胞の組成物がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項１３８に記載の組成物。

【請求項140】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか１つまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項１３７から１３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項141】

ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物。

【請求項142】

γ－セクレターゼ阻害剤がＸＸＩである、請求項１４１に記載の組成物。

【請求項143】

組成物における少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の細胞が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である、請求項１４１または１４２に記載の組成物。

【請求項144】

組成物における９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の細胞が、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である、請求項１４１から１４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項145】

ＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項146】

ＦＧＦファミリーからの成長因子がＫＧＦである、請求項１４５に記載の組成物。

【請求項147】

ソニックヘッジホッグ経路阻害剤をさらに含む、請求項１４１から１４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項148】

ソニックヘッジホッグ経路阻害剤がＳＡＮＴ－１である、請求項１４７に記載の組成物。

【請求項149】

ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項150】

ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビビンである、請求項１４９に記載の組成物。

【請求項151】

ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子をさらに含む、請求項１４１から１５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項152】

ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子がアクチビンＡである、請求項１５１に記載の組成物。

【請求項153】

レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項１４１から１５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項154】

レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸である、請求項１５３に記載の組成物。

【請求項155】

ＰＫＣ活性化剤をさらに含む、請求項１４１から１５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項156】

ＰＫＣ活性化剤がＰＤＢＵである、請求項１５５に記載の組成物。

【請求項157】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか２つをさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項158】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか３つをさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項159】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか４つをさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項160】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか５つをさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項161】

組成物が、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか６つをさらに含む、請求項１４１から１４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項162】

請求項１４１から１６１のいずれか一項に記載の組成物を含むデバイスであって、デバイスは、対象に埋め込まれた場合、インスリンを生成し、放出するように構成されるデバイス。

【請求項163】

請求項１４１から１６１のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップ、または請求項１６２に記載のデバイスを対象に埋め込むステップを含む、対象を処置する方法。

【請求項164】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって、集団は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含み、集団における少なくとも７３％の細胞がＩＳＬ１陽性細胞である集団。

【請求項165】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって、集団における少なくとも４０％の細胞はＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である集団。

【請求項166】

集団における１２％未満の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である、請求項１６４または１６５に記載の集団。

【請求項167】

ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって、集団における１２％未満の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である集団。

【請求項168】

集団における１０％未満、８％未満、６％未満、または４％未満の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である、請求項１６５から１６７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項169】

集団における少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７３％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％の細胞がＩＳＬ１陽性細胞である、請求項１６５から１６８のいずれか一項に記載の集団。

【請求項170】

集団における２～１２％、４～１２％、６～１２％、８～１２％、２～８％、４～８％、３～６％または３～５％の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である、請求項１６５から１６９のいずれか一項に記載の集団。

【請求項171】

集団における５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８５％、６０～８０％、６０～７５％、６０～７０％、６５～９０％、６５～８５％、６５～８０％、６５～７５％、６５～７０％、７０～９０％、７０～８５％、７０～８０％、７０～７５％、７５～９０％、７５～８５％、７５～８０％、８０～９０％、８０～８５％、または８５～９０％の細胞が、ＩＳＬ１陽性細胞である、請求項１６５から１７０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項172】

集団が、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１７１のいずれか一項に記載の集団。

【請求項173】

集団における少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、約４～１１％、または約５～１０％の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である、請求項１６５から１７２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項174】

集団における少なくとも４０％の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である、請求項１６５から１７３のいずれか一項に記載の集団。

【請求項175】

集団における少なくとも４５％、少なくとも５０％、約４０～５０％、約４５～５５％、または約５０～５５％の細胞が、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である、請求項１６５から１７４のいずれか一項に記載の集団。

【請求項176】

集団における少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、約８５～９５％、または約９０～９５％の細胞が、ＩＳＬ１陽性細胞である、請求項１６５から１７５のいずれか一項に記載の集団。

【請求項177】

集団が、幹細胞由来ベータ細胞よりも多くの幹細胞由来アルファ細胞を含む、請求項１６５から１７６のいずれか一項に記載の集団。

【請求項178】

細胞集団がｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞に由来する、請求項１６５から１７７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項179】

培地をさらに含む、請求項１６５から１７８のいずれか一項に記載の集団。

【請求項180】

培地が糖を含む、請求項１７９に記載の集団。

【請求項181】

糖がスクロースまたはグルコースである、請求項１８０に記載の集団。

【請求項182】

培地が、約０．０５％～約１．５％の濃度で糖を含む、請求項１８０または１８１に記載の集団。

【請求項183】

培地がＣＭＲＬ培地であるか、または培地がＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａである、請求項１７９から１８２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項184】

細胞集団が細胞クラスター内にある、請求項１６５から１８３のいずれか一項に記載の集団。

【請求項185】

細胞集団が１つまたは複数の細胞クラスター内にある、請求項１６５から１８３のいずれか一項に記載の集団。

【請求項186】

細胞クラスターが、約１２５～約２２５ミクロンの直径、約１３０～約１６０ミクロンの直径、約１７０～約２２５ミクロンの直径、約１４０～約２００ミクロンの直径、約１４０～約１７０ミクロンの直径、約１６０～約２２０ミクロンの直径、約１７０～約２１５ミクロンの直径、または１７０～約２００ミクロンの直径である、請求項１８５に記載の集団。

【請求項187】

集団が、ベータ－２－ミクログロブリン遺伝子における遺伝的破壊を有する、請求項１６５から１８６のいずれか一項に記載の集団。

【請求項188】

集団が、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも低いレベルのＭＡＦＡを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１８７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項189】

集団が、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高いレベルのＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１８８のいずれか一項に記載の集団。

【請求項190】

集団が、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高いレベルのＳＩＸ２、ＨＯＰＸ、ＩＡＰＰおよび／またはＵＣＮ３を発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１８９のいずれか一項に記載の集団。

【請求項191】

集団が、ＭＡＦＡを発現しないＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１９０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項192】

集団が、ＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む、請求項１６５から１９１のいずれか一項に記載の集団。

【請求項193】

対象への埋め込みのためのデバイスに含有される、請求項１６５から１９２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項194】

請求項１６５から１９２のいずれか一項に記載の集団を含む移植用カプセル化デバイス。

【請求項195】

デバイスが、糖尿病を有する対象に埋め込まれている、請求項１９４に記載の移植用カプセル化デバイス。

【請求項196】

対象がＩ型糖尿病を有する、請求項１９５に記載の移植用カプセル化デバイス。

【請求項197】

請求項１６５から１９２のいずれか一項に記載の集団を含む組成物を対象に投与するステップ、または請求項１９３から１９６のいずれか一項に記載のデバイスを対象に埋め込むステップを含む、対象を処置する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／０５９，４３３号に対する特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

[0002]幹細胞由来β細胞の産生は、膵島および膵臓器官の産生に向けた潜在的に有用なステップを提供することができる。幹細胞から誘導された組織によって治療可能な急速に進行する疾患の１つが糖尿病である。１型糖尿病は膵島におけるβ－細胞の自己免疫的破壊に起因する。２型糖尿病は末梢組織のインスリン抵抗性およびβ－細胞の機能異常に起因する。糖尿病患者、特に１型糖尿病を患っている患者は、新たなβ－細胞の移植によって治癒する可能性がある。死体ヒト膵島の移植を受けた患者は、この戦略によって５年またはそれ以上、インスリン依存性を脱することができるが、ドナー膵島の希少性およびその品質のために、このアプローチには限界がある。幹細胞からヒトβ－細胞の無制限な供給を産生できれば、この療法を数百万人の新たな患者に広げることができ、これは幹細胞の生物学を臨床に変換する重要なテストケースになり得る。

【0003】

参照による組込み
[0003]本明細書に記述する全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれていると具体的にかつ個別に示されていると同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。他に指示がなければ、本明細書に記述する刊行物、特許、および特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0004】

[0004]一部の態様では、（ａ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップと、（ｂ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と接触させるステップと、（ｃ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む第２の組成物と接触させるステップとを含む方法が本明細書で開示される。

【0005】

[0005]一部の態様では、（ａ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と接触させるステップと、（ｂ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と接触させるステップとを含む方法が本明細書で開示される。

【0006】

[0006]一部の例では、本方法は、前記第２の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる第３の組成物と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップをさらに含む。

【0007】

[0007]一部の態様では、（ａ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と接触させるステップと、（ｂ）前記第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と接触させるステップと、（ｃ）前記第２の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる第３の組成物と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップとを含む方法であって、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される、対応する細胞集団と比較して、（ｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；（ｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；（ｉｉｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；または（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合を含む方法が本明細書で開示される。

【0008】

[0008]一部の例では、前記第３の組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモン（ＴＨ）シグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む。一部の例では、前記第３の組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子を含む。一部の例では、前記第３の組成物は、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、前記エピジェネティック修飾化合物、前記ＥＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記γ－セクレターゼ阻害剤、前記プロテインキナーゼ阻害剤、前記ＲＯＣＫ阻害剤、および前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む。一部の例では、前記第３の組成物は、前記ＰＫＣ活性化剤を含まない。一部の例では、第１の組成物は、前記ＲＯＣＫ阻害剤、前記ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、前記ＦＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および前記ＳＨＨ経路阻害剤を含む。一部の例では、第２の組成物は、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、前記ＥＧＦファミリーからの成長因子、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、前記プロテインキナーゼ阻害剤、前記ＲＯＣＫ阻害剤、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および前記エピジェネティック修飾化合物を含む。一部の例では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される対応する細胞集団と比較して、（ｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；（ｉｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；（ｉｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；または（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合を含む。一部の例では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される対応する細胞集団と比較して、（ｉ）ソマトスタチンを発現する細胞の増加した割合；（ｉｉ）グルカゴンを発現する細胞の増加した割合；（ｉｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞の減少した割合；および（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞の増加した割合を含む。一部の例では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現する少なくとも約４％の細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞、またはＣ－ペプチドを発現する少なくとも約４０％の細胞を含む。一部の例では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む前記細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定して、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記第１の組成物中または前記第２の組成物中の前記ＰＫＣ活性化剤と接触させることなく産生される細胞の対応する集団と比較して、ソマトスタチンを発現する少なくとも約１００％を超える細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約２００％を超える細胞、ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約５０％より少ない細胞、またはＣ－ペプチドを発現する少なくとも約２０％を超える細胞を含む。一部の例では、第１の期間は１～３日である。一部の例では、前記第１の期間は約２日である。一部の例では、前記第２の期間は１～３日である。一部の例では、前記第２の期間は約２日である。一部の例では、前記ＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の例では、前記ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵを含む。一部の例では、前記ＰＫＣ活性化剤は、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される。一部の例では、前記ＰＫＣ活性化剤は、約５００ｎＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される。一部の例では、前記γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。一部の例では、前記γ－セクレターゼ阻害剤は、０．５μＭ～１０μＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される。一部の例では、前記γ－セクレターゼ阻害剤は、約２μＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団に接触される。

【0009】

[0009]一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む組成物と接触させ、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞を前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性腸管細胞に分化させるステップをさらに含む。

【0010】

[0010]一部の態様では、（ａ）集団中の多能性幹細胞をＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、（ｂ）前記胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞をＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞に分化させるステップと、（ｃ）前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記ＦＯＸＡ２陽性、ＰＤＸ１陰性の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化させるステップと、（ｄ）前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、（ｅ）１～３日の第１の期間、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と共にインキュベートするステップと、（ｆ）（ｅ）の後に、１～３日の第２の期間、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、前記ＰＫＣ活性化剤、前記γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と共にインキュベートするステップと、（ｇ）（ｆ）の後に、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによって、前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団に分化させるステップとを含む方法が本明細書で開示される。一部の例では、前記ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含み、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含み、前記γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含み、前記ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含み、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮもしくはＤＭＨを含み、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含み、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ－１を含み、前記プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含み、前記ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンを含み、または前記エピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、もしくはＥＰＺ６４３８を含む。

【0011】

[0011]一部の態様では、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤およびγ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む方法が本明細書で開示される。

【0012】

[0012]一部の態様では、細胞集団を、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子の一方または両方と接触させるステップを含む方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。

【0013】

[0013]一部の態様では、（ａ）１～５日間以下の期間、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団をγセクレターゼ阻害剤と接触させるステップとを含む方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の接触は、４日間または５日間の期間である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む。

【0014】

[0014]一部の態様では、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップであって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体であるステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む方法が本明細書で開示される。

【0015】

[0015]一部の例では、ベンゾラクタム誘導体はＴＰＰＢである。一部の例では、ステップ（ｂ）は、第１の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＥＧＦファミリーからの成長因子と接触させるステップを含まない。一部の例では、本方法は、（ｅ）第４の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、ステップ（ｅ）は、第４の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0016】

[0016]一部の態様では、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにγ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと、（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップと、（ｅ）第４の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびに血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップとを含む方法が本明細書で開示される。

【0017】

[0017]一部の例では、ステップ（ｅ）は、第４の細胞集団を血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む。一部の例では、ステップ（ａ）は、１、２、３、４、５または６日間にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ａ）は、３～５日間（例えば、４日間）にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｂ）は、１、２、３、または４日間にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｂ）は、１～３日間（例えば、２日間）にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｃ）は、１、２、３、または４日間にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｃ）は、１～３日間（例えば、２日間）にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｄ）は、１、２、３、４、５、６、または７日間にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｄ）は、４～６日間（例えば、５日間）にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｅ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間にわたって行われる。一部の例では、ステップ（ｅ）は、１０～１２日間にわたって行われる。一部の例では、第１の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞および／またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の例では、第２の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性およびＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の例では、第３の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陰性細胞および／またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の例では、第５の細胞集団は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない。一部の例では、第４の細胞集団における４０～６０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない。一部の例では、第４の細胞集団は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現しない細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現しない。一部の例では、第４の細胞集団における１０～２５％の細胞は、マトスタチンを発現するが、グルカゴンは発現しない。一部の例では、第４の細胞集団は、ソマトスタチンを発現するが。グルカゴンを発現しない細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない。一部の例では、ステップ（ａ）は、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む。一部の例では、ステップ（ｂ）は、第１の細胞集団を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む。一部の例では、ステップ（ｃ）は、第２の細胞集団を、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の例では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾバビン（ｔｈｉａｚｏｖａｖｉｎ）またはＹ－２７６３２である。一部の例では、ステップ（ａ）および／または（ｂ）において使用するためのＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡである。一部の例では、ステップ（ａ）および／または（ｂ）において使用するためのＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。一部の例では、ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸である。一部の例では、ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ－１である。一部の例では、ステップ（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）において使用するためのＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵである。一部の例では、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）において使用するためのγ－セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩである。一部の例では、ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５ｉである。一部の例では、ステップ（ｃ）において使用するためのＥＧＦファミリーからの成長因子は、ベータセルリンである。一部の例では、ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＴＨシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である。一部の例では、ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンである。一部の例では、ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である。一部の例では、ステップ（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）において使用するためのエピジェネティック修飾化合物は、ＤＺＮｅｐである。

【0018】

[0018]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で開示される。

【0019】

[0019]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で開示される。一部の実施形態では、組成物における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である。一部の実施形態では、組成物における９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である。

【0020】

[0020]組成物の一部の実施形態では、前記ＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル）である。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩである。

【0021】

[0021]組成物の一部の実施形態では、組成物は、ＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。一部の実施形態では、組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子はアクチビンＡである。

【0022】

[0022]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；およびＰＫＣ活性化剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物であって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体である組成物が本明細書で開示される。

【0023】

[0023]組成物の一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＰＢである。一部の例では、組成物は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴである。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩである。一部の例では、組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む。一部の例では、組成物は、血清アルブミンタンパク質をさらに含む。一部の例では、組成物は、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾバビンである。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸である。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ－１である。一部の例では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤はＡＬＫ５ｉである。一部の例では、ＥＧＦファミリーの成長因子がベータセルリンである。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である。一部の例では、プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンである。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐである。

【0024】

[0024]一部の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は、（ａ）Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞；および（ｂ）ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞、またはグルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞（例えば、フローサイトメトリーによって測定した場合）を含む組成物が本明細書で開示される。一部の態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞；ならびに（ｉ）ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞、および／または（ｉｉ）グルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって測定される。

【0025】

[0025]一部の例では、前記細胞集団は、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３０％の細胞、およびグルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を含む。一部の例では、前記細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３０％の細胞、およびグルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を含む。一部の例では、前記細胞集団は、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない少なくとも約１５％の細胞を含む。一部の例では、前記細胞集団は、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない少なくとも約４％の細胞を含む。

【0026】

[0026]一部の態様では、細胞集団を含む組成物であって、ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、もしくは８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに／またはｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で開示される。

【0027】

[0027]一部の態様では、複数の細胞を含む組成物であって、ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびにｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で開示される。

【0028】

[0028]一部の態様では、細胞集団を含む組成物であって、ａ）細胞集団における５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～３５％、２５～３０％、もしくは３０～３５％の細胞は、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現せず；ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；および／またはｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で開示される。

【0029】

[0029]一部の態様では、細胞集団を含む組成物であって、ａ）細胞集団における５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～３５％、２５～３０％、または３０～３５％の細胞は、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現せず；ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％、または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；およびｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％、または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で開示される。

【0030】

[0030]組成物の一部の実施形態では、細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない。

【0031】

[0031]組成物の一部の実施形態では、細胞集団における４０～６０％の細胞が、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１は発現せず；細胞集団における１０～２５％の細胞が、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンは発現せず；ならびに細胞集団における４～１０％の細胞が、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンは発現しない。一部の例では、細胞集団における２５％未満、２０％未満、１８％未満、１５％未満、１２％未満、または１０％未満の細胞が、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現しない。一部の例では、細胞集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞から産生される。一部の例では、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグルコース刺激インスリン分泌応答を呈す。一部の例では、グルコースチャレンジに応答して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞によるインスリンの分泌は、グルコースチャレンジのグルコース濃度に比例する。一部の例では、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞は、１回または複数のグルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌する。一部の例では、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない細胞が、第１のグルコースチャレンジ、第２のグルコースチャレンジ、および第３のグルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌し、第１のグルコースチャレンジ、第２のグルコースチャレンジ、および第３のグルコースチャレンジが連続的に適用される。

【0032】

[0032]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性細胞、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子の一方または両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で開示される。一部の実施形態では、細胞の組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。

【0033】

[0033]一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか１つまたはそれらの組合せをさらに含む。

【0034】

[0034]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が本明細書で開示される。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩである。

【0035】

[0035]一部の実施形態では、組成物における少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である。一部の実施形態では、組成物における９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である。

【0036】

[0036]一部の実施形態では、組成物は、ＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態様では、組成物は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤をさらに含む。

【0037】

[0037]一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか２つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか３つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか４つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか５つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか６つをさらに含む。

【0038】

[0038]組成物の一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。一部の実施形態では、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤はＳＡＮＴ－１である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡである。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸である。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵである。

【0039】

[0039]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって；集団は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含み；集団における少なくとも７３％の細胞がＩＳＬ１陽性細胞である集団が本明細書で開示される。一部の実施形態では、集団における１２％未満の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。

【0040】

[0040]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって；集団における少なくとも４０％の細胞はＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である集団が本明細書で開示される。一部の実施形態では、集団における１２％未満の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。

【0041】

[0041]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって、集団における１２％未満の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である集団が本明細書で開示される。

【0042】

[0042]一部の実施形態では、集団における１０％未満、８％未満、６％未満、または４％未満の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７３％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％の細胞はＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における２～１２％、４～１２％、６～１２％、８～１２％、２～８％、４～８％、３～６％または３～５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。一部の実施形態では、集団における５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８５％、６０～８０％、６０～７５％、６０～７０％、６５～９０％、６５～８５％、６５～８０％、６５～７５％、６５～７０％、７０～９０％、７０～８５％、７０～８０％、７０～７５％、７５～９０％、７５～８５％、７５～８０％、８０～９０％、８０～８５％、または８５～９０％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。

【0043】

[0043]一部の実施形態では、集団は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団における少なくとも４０％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも４５％、少なくとも５０％、約４０～５０％、約４５～５５％、または約５０～５５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、約８５～９５％、または約９０～９５％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。

【0044】

[0044]一部の実施形態では、集団は、幹細胞由来ベータ細胞よりも多くの幹細胞由来アルファ細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団はｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞に由来する。

【0045】

[0045]一部の実施形態では、集団は培地をさらに含む。一部の実施形態では、培地は糖を含む。一部の実施形態では、糖はスクロースまたはグルコースである。一部の実施形態では、培地は、約０．０５％～約１．５％の濃度の糖を含む。一部の実施形態では、培地はＣＭＲＬ培地であるか、または培地はＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ保存培地である。

【0046】

[0046]一部の実施形態では、細胞集団は細胞クラスター内にある。一部の実施形態では、細胞集団は１つまたは複数の細胞クラスター内にある。一部の実施形態では、細胞クラスターは、約１２５～約２２５ミクロンの直径、約１３０～約１６０ミクロンの直径、約１７０～約２２５ミクロンの直径、約１４０～約２００ミクロンの直径、約１４０～約１７０ミクロンの直径、約１６０～約２２０ミクロンの直径、約１７０～約２１５ミクロンの直径、または１７０～約２００ミクロンの直径である。

【0047】

[0047]一部の実施形態では、集団は、ベータ－２－ミクログロブリン遺伝子における遺伝的破壊を有する。
[0048]一部の実施形態では、集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも低いレベルのＭＡＦＡを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高いレベルのＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも高いレベルのＳＩＸ２、ＨＯＰＸ、ＩＡＰＰおよび／またはＵＣＮ３を発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。

【0048】

[0049]一部の実施形態では、集団は、ＭＡＦＡを発現しないＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、ＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。

【0049】

[0050]一部の実施形態では、集団は、対象への埋め込みのためのデバイスに含有される。一部の態様では、本開示は、集団を含む移植用カプセル化デバイスを提供する。一部の実施形態では、デバイスは、糖尿病を有する対象に埋め込まれている。一部の実施形態では、対象は、Ｉ型糖尿病を有する。一部の態様では、本開示は、対象を処置する方法であって、本方法は、集団を含む組成物を対象に投与するステップ、またはデバイスを対象に埋め込むステップを含む方法を提供する。

【0050】

[0051]一部の態様では、本明細書で開示される組成物、または本明細書で開示される方法に従って生成された細胞集団、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物が本明細書で開示される。

【0051】

[0052]一部の態様では、本明細書で開示される組成物、または本明細書で開示される方法に従って生成された細胞集団を含むデバイスであって、デバイスは、対象に埋め込まれた場合、インスリンを生成し、放出するように構成されるデバイスが本明細書で開示される。

【0052】

[0053]一部の態様では、本明細書で開示される組成物、または本明細書で開示される方法に従って生成された細胞集団、または本明細書で開示されるデバイスを対象に投与するステップを含む、対象を処置する方法が本明細書で開示される。

【0053】

[0054]本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付図面を参照することによって得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】[0055]図１は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコール（バージョンＡおよびバージョンＢ）に従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団の単一細胞配列決定の結果を示す。

【図2A】[0056]図２Ａ～２Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図２Ｂ）、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団におけるＣ－ペプチド陽性、ＶＭＡＴ１陰性細胞のパーセンテージをまとめる（図２Ａ）。

【図2B】図２Ａ～２Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図２Ｂ）、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団におけるＣ－ペプチド陽性、ＶＭＡＴ１陰性細胞のパーセンテージをまとめる（図２Ａ）。

【図3】[0057]図３は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団におけるグルカゴン陽性、ソマトスタチン陰性細胞（ＧＣＧ＋／ＳＳＴ－）のパーセンテージをまとめる。

【図4】[0058]図４は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団におけるソマトスタチン陽性、グルカゴン陰性細胞（ＳＳＴ＋／ＧＣＧ－）のパーセンテージをまとめる。

【図5】[0059]図５は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団におけるＶＭＡＴ１陽性、Ｃ－ペプチド陰性細胞（ＶＭＡＴ１＋／ｃ－ペプチド－）のパーセンテージをまとめる。

【図6A】[0060]図６Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団における、再凝集前のＳＯＸ９陽性細胞のパーセンテージをまとめる。

【図6B】図６Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団における、再凝集後のＳＯＸ９陽性細胞のパーセンテージをまとめる。

【図7】[0061]図７は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団における再凝集後の回収率をまとめる。

【図8】[0062]図８は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団のグルコース刺激によるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答をまとめる。

【図9】[0063]図９は、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用されたＰＤＢＵの有無にかかわらず、２つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞集団のインスリン含量をまとめる。

【図10A】[0064]図１０Ａ～１０Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１０Ａ）、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２の間に適用されたＰＤＢＵまたはＰＤＢＵおよびＸＸＩの有無にかかわらず、３つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団におけるＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞（図１０Ｂ）のパーセンテージをまとめる。

【図10B】[0064]図１０Ａ～１０Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１０Ａ）、Ｓ４ｄ５からＳ５ｄ２の間に適用されたＰＤＢＵまたはＰＤＢＵおよびＸＸＩの有無にかかわらず、３つの例示的な分化プロトコールに従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団におけるＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞（図１０Ｂ）のパーセンテージをまとめる。

【図11A】[0065]図１１Ａ～１１Ｃは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１１Ａ）、３つの例示的な分化プロトコール：ａ）ＰＤＢＵまたはＴＰＰＢを伴わないバージョンＡ（バージョンＡ）；ｂ）ＰＤＢＵを伴う（ＶＡ／ＰＤＢＵ）；またはｃ）ＴＰＰＢを伴う（ＶＡ／ＴＰＰＢ）、に従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団におけるＮＫＸ６．１陽性／陰性細胞およびＩＳＬ１陽性／陰性細胞（図１１Ｂ）のパーセンテージをまとめる。図１１Ｃは、バージョンＡ、ＶＡ／ＰＤＢＵ、ＶＡ／ＴＰＰＢ、ならびにＶＡ／ＴＰＰＢ＋ＸＸＩの細胞収率を示す。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｃは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１１Ａ）、３つの例示的な分化プロトコール：ａ）ＰＤＢＵまたはＴＰＰＢを伴わないバージョンＡ（バージョンＡ）；ｂ）ＰＤＢＵを伴う（ＶＡ／ＰＤＢＵ）；またはｃ）ＴＰＰＢを伴う（ＶＡ／ＴＰＰＢ）、に従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団におけるＮＫＸ６．１陽性／陰性細胞およびＩＳＬ１陽性／陰性細胞（図１１Ｂ）のパーセンテージをまとめる。図１１Ｃは、バージョンＡ、ＶＡ／ＰＤＢＵ、ＶＡ／ＴＰＰＢ、ならびにＶＡ／ＴＰＰＢ＋ＸＸＩの細胞収率を示す。

【図11C】図１１Ａ～１１Ｃは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１１Ａ）、３つの例示的な分化プロトコール：ａ）ＰＤＢＵまたはＴＰＰＢを伴わないバージョンＡ（バージョンＡ）；ｂ）ＰＤＢＵを伴う（ＶＡ／ＰＤＢＵ）；またはｃ）ＴＰＰＢを伴う（ＶＡ／ＴＰＰＢ）、に従って産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団におけるＮＫＸ６．１陽性／陰性細胞およびＩＳＬ１陽性／陰性細胞（図１１Ｂ）のパーセンテージをまとめる。図１１Ｃは、バージョンＡ、ＶＡ／ＰＤＢＵ、ＶＡ／ＴＰＰＢ、ならびにＶＡ／ＴＰＰＢ＋ＸＸＩの細胞収率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

[0066]以下の記述および実施例によって、本開示の実施形態を詳細に説明する。本開示は本明細書に記載した特定の実施形態に限定されず、したがって変動し得ることを理解されたい。当業者であれば、本開示には多数の変形および改変が存在し、これらは本開示の範囲内に包含されることが認識される。

【0056】

[0067]全ての用語は当業者によって理解されるように理解されることを意図している。他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術における当業者によって共通に理解されると同じ意味を有する。

【0057】

[0068]本明細書で用いる見出しは整理の目的のみのためであって、記載した主題を限定するものと解釈すべきではない。
[0069]本開示の種々の特徴を単一の実施形態に関連して記述することができるが、特徴を個別にまたは任意の適切な組合せで提供することもできる。逆に、明確にするために本開示を個別の実施形態に関連して本明細書に記載することができるが、本開示を単一の実施形態で実行することもできる。

【0058】

[0070]以下の定義は当技術における定義を補うものであって本出願を指向しており、関連するまたは関連しないいかなる例、例えば広く共有されているいかなる特許または特許出願にも帰属されない。本明細書に記載した方法および材料と同様のまたは等価のいかなる方法および材料も本開示を試験するための実施において用いることができるが、本明細書には好ましい材料および方法を記載している。したがって、本明細書で用いる用語は特定の実施形態を記述する目的のためのみであって、限定することを意図していない。

【0059】

[0071]本出願において単数形の使用は、特に他の記述がなければ、複数形を含む。本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって他が明確に記述されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。

【0060】

[0072]本出願において「または」の使用は、他の記述がなければ、「および／または」を意味する。本明細書で用いる用語「および／または」および「それらの任意の組合せ」ならびにそれらの文法的等価物は、相互交換可能に用いられ得る。これらの用語は、任意の組合せが具体的に意図されることを伝達することができる。説明目的のみのために、以下の語句、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」は、「個別にＡ、個別にＢ、個別にＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。用語「または」は、文脈によって特に離接的な使用が意味されない限り、接続的または離接的に用いられ得る。

【0061】

[0073]さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(include、includes)」および「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、限定的でない。
[0074]明細書中における「一部の実施形態」、「一実施形態(an embodiment、one embodiment)」、または「他の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記述された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態には含まれないことを意味する。

【0062】

[0075]本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単語「含む（comprising）」（ならびに「comprise」および「comprises」等のcomprisingの任意の形）、「有する(having)」（ならびに「have」および「has」等のhavingの任意の形）、「含む(including)」（ならびに「includes」および「include」等のincludingの任意の形）、または「含む(containing)」（ならびに「contains」および「contain」等のcontainingの任意の形）は包括的またはオープンエンドであり、言及されていない追加的な要素または方法ステップを排除しない。本明細書で論じる任意の実施形態は本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もそうであることが意図されている。さらに、本開示の組成物は本開示の方法を達成するために用いることができる。

【0063】

[0076]本明細書で用いる参照の数値およびその文法的等価物に関連する用語「約」は、その数値それ自体およびその数値のプラスマイナス１０％の値の範囲を含み得る。
[0077]用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、これは部分的にその値がどのようにして測定されまたは決定されたか、例えば測定システムの限界によることになる。例えば、「約」は当技術における慣例によって標準偏差の１倍以内または１倍を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。別の例では、「約１０」の量は、１０および９から１１までの任意の量を含む。さらに別の例では、参照数値に関連する用語「約」は、その値のプラスマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲をも含み得る。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関しては、用語「約」は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。出願および特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合には、他に記述がなければ、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を前提とすべきである。

【0064】

[0078]本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患を意味し得る。例えば、本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、それだけに限らないが、１型糖尿病、２型糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、外科的糖尿病、妊娠性糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病を含む全てまたは任意の型の糖尿病を意味し得る。一部の例では、糖尿病は遺伝性糖尿病の１形態であり得る。

【0065】

[0079]用語「内分泌細胞」は、特に特定しない限り、「膵島」、「膵島細胞」、「膵島同等物」、「膵島様細胞」、「膵臓島」、およびその文法的等価物等の、生体の膵臓に存在するホルモン生成細胞を意味し得る。一実施形態では、内分泌細胞は膵前駆細胞または前駆体から分化することができる。膵島細胞は、それだけに限らないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、および／または膵ε細胞を含む様々な型の細胞を含み得る。膵島細胞は細胞の群、細胞クラスター、その他をも意味し得る。

【0066】

[0080]用語「前駆細胞」および「前駆体」細胞は本明細書において相互交換可能に用いられ、分化によって生じることができる細胞と比較してより原始的な（例えば発生経路または発達において完全に分化した細胞よりも早いステップにある）細胞表現型を有する細胞を意味する。前駆細胞はまた、顕著なまたは極めて高い増殖可能性を有し得ることが多い。前駆細胞は発生経路および細胞が発生し分化する環境に応じて、多くの異なった分化細胞型または単一の分化細胞型を生じることができる。

【0067】

[0081]インスリン陽性内分泌細胞に関連する用語としての「その前駆体」は、前駆細胞をインスリン陽性内分泌細胞に分化するために適した条件下で培養したときにインスリン陽性内分泌細胞に分化することができる、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌前駆細胞を含む任意の細胞を意味し得る。

【0068】

[0082]用語「幹細胞から誘導されたβ細胞」、「ＳＣ－β細胞」、「機能性β細胞」、「機能性膵β細胞」、「成熟ＳＣ－β細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えばＰＤＸ－１またはＮＫＸ６．１）を呈し、インスリンを分泌し、および内分泌成熟β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する細胞（例えば非天然膵β細胞）を意味し得る。一部の実施形態では、本明細書で用いる用語「ＳＣ－β細胞」および「非天然β細胞」は相互交換可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ－β細胞」は成熟した膵細胞を含む。ＳＣ－β細胞は幹細胞から（例えば直接）誘導される必要はないことを理解されたい。それは、本開示の方法が、出発点として任意の細胞を用いて任意のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体からＳＣ－β細胞を誘導することができるからである（本発明はこの様式に限定することを意図していないので、例えば胚幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的に再プログラミングされた体細胞（例えば人工多能性幹細胞とそれが誘導されたもとの体細胞との間の中間状態に部分的に再プログラミングされた体細胞）、万能性細胞、全能性細胞、上記の任意の細胞の分化転換したバージョン、その他を用いることができる）。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は多重のグルコースチャレンジ（例えば少なくとも１回、少なくとも２回、もしくは少なくとも３回またはそれ以上の一連のグルコースチャレンジ）に対する応答を呈する。一部の実施形態では、応答は多重のグルコースチャレンジに対する内因性膵島（例えばヒト膵島）の応答に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞の形態は内因性β細胞の形態に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｖｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のＧＳＩＳ応答を呈する。ＳＣ－β細胞のＧＳＩＳ応答は、ＳＣ－β細胞を宿主（例えばヒトまたは動物）に移植した後、２週以内に観察することができる。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はインスリンを分泌顆粒に詰め込む。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はカプセル化された結晶インスリン顆粒を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は１．１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は２を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はサイトカインに応答してサイトカイン誘起アポトーシスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞からのインスリンの分泌は公知の抗糖尿病薬（例えば分泌促進物質）に応答して増強される。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はモノホルモナルである。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は他のホルモン、例えばグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを異常に共発現しない。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は低い複製速度を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞はグルコースに応答して細胞内Ｃａ２＋を増加させる。

【0069】

[0083]用語「幹細胞由来α細胞」、「ＳＣ－α細胞」、「機能性α細胞」、「機能性膵α細胞」、「成熟ＳＣ－α細胞」およびそれらの文法的等価物は、膵α細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えば、グルカゴン、ＩＳＬ１を発現するがＮＫＸ６．１を発現しない）を示し、グルカゴンを発現し、機能性グルカゴンを分泌する細胞（例えば、非天然膵α細胞）を指すことができる。一部の実施形態では、「ＳＣ－α細胞」は、ソマトスタチンを発現しない。一部の実施形態では、「ＳＣ－α細胞」は、インスリンを発現しない。一部の実施形態では、本明細書で用いる用語「ＳＣ－α細胞」および「非天然α細胞」は、相互交換可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ－α細胞」は、成熟膵細胞を含む。

【0070】

[0084]用語「幹細胞由来δ細胞」、「ＳＣ－δ細胞」、「機能性δ細胞」、「機能性膵δ細胞」、「成熟ＳＣ－δ細胞」およびそれらの文法的等価物は、膵δ細胞（例えば、ソマトスタチン）を示す少なくとも１つのマーカーを示し、ソマトスタチンを発現および分泌する細胞（例えば、非天然膵δ細胞）を指すことができる。一部の実施形態では、「ＳＣ－δ細胞」は、グルカゴンを発現しない。一部の実施形態では、「ＳＣ－δ細胞」は、インスリンを発現しない。一部の実施形態では、本明細書で用いる用語「ＳＣ－δ細胞」および「非天然δ細胞」は、相互交換可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ－δ細胞」は、成熟膵細胞を含む。

【0071】

[0085]用語「幹細胞由来腸クロム親和性（ＥＣ）細胞」、「ＳＣ－ＥＣ細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵ＥＣ細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えば、ＶＭＡＴ１（小胞性モノアミントランスポーター１）、ＮＫＸ６．１を発現するがＩＳＬ１を発現しない）を示す細胞（例えば、非天然膵ＥＣ細胞）を指すことができる。一部の実施形態では、本明細書で用いる用語「ＳＣ－ＥＣ細胞」および「非天然ＥＣ細胞」は、相互交換可能である。

【0072】

[0086]ＳＣ－β細胞と同様に、ＳＣ－α、ＳＣ－δ細胞、およびＳＣ－ＥＣ細胞は幹細胞から（例えば、直接）誘導される必要はなく、これは、開示の方法が、出発点としてＳＣ－β細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の間に産生された他の前駆細胞からＳＣ－α細胞を誘導することができるためであることが理解されるべきである（例えば、本発明は、このように限定されることを意図しないため、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的に再プログラミングされた体細胞（例えば、人工多能性幹細胞とそれが誘導された体細胞との間の中間状態に部分的に再プログラミングされた体細胞）、万能性細胞、全能性細胞、前述の任意の細胞の分化転換したバージョンなどを使用することができる）。

【0073】

[0087]本明細書で用いる場合、用語「インスリン生成細胞」およびその文法的等価物は、膵前駆細胞またはその前駆体から分化し、インスリンを分泌する細胞を意味する。インスリン生成細胞は、その用語が本明細書に記載されているように、膵β細胞、ならびに構造的または誘導的な様式でインスリンを合成（例えばインスリン遺伝子を転写し、プロインスリンｍＲＮＡを翻訳し、およびプロインスリンｍＲＮＡを修飾してインスリンタンパク質に）し、発現（例えばインスリン遺伝子が運搬する表現型の形質を実現）し、または分泌（インスリンを細胞外スペースに放出）する膵β様細胞（例えばインスリン陽性内分泌細胞）を含み得る。例えばインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体を本開示の方法に従ってＳＣ－β細胞に分化することによって生成されたインスリン生成細胞の集団は、膵β細胞またはβ様細胞（例えば内因性β細胞の少なくとも１つもしくは少なくとも２つの特徴を有し、内因性成熟β細胞に類似したグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する細胞）であってよい。例えば本明細書に開示した方法によって生成されたインスリン生成細胞の集団は成熟した膵β細胞またはＳＣ－β細胞を含んでよく、非インスリン生成細胞（例えばインスリンを生成せずまたは分泌しないこと以外は細胞様表現型を有する細胞）を含んでもよい。

【0074】

[0088]用語「インスリン陽性β様細胞」、「インスリン陽性内分泌細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカーを呈し、インスリンも発現するが、内因性β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を欠く細胞（例えば膵内分泌細胞）を意味し得る。「インスリン陽性の内分泌細胞」の例示的マーカーとしては、それだけに限らないが、ＮＫＸ６．１（ＮＫ６ホメオボックス１）、ＩＳＬ１（Ｉｓｌｅｔ１）、およびインスリンが挙げられる。一部の例では、用語「インスリン陽性の内分泌細胞」および「ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞」は相互交換可能に使用される。

【0075】

[0089]用語「β細胞マーカー」は、限定なく、特異的に膵β細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味する。例示的なβ細胞マーカーには、それだけに限らないが、膵および十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）ポリペプチド、インスリン、ｃ－ペプチド、アミリン、Ｅ－カドヘリン、Ｈｎｆ３β、ＰＣＩ／３、Ｂ２、Ｎｋｘ２．２、ＧＬＵＴ２、ＰＣ２、ＺｎＴ－８、ＩＳＬ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、１ Ｉｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ－６、Ｈｎｆ－３ベータ、およびＭａｆＡ、ならびにZhangら、Diabetes. 50(10):2231-6 (2001)によって記載されたものが含まれる。一部の実施形態では、β細胞マーカーは核β－細胞マーカーである。一部の実施形態では、β細胞マーカーはＰＤＸ１またはＰＨ３である。

【0076】

[0090]用語「膵内分泌マーカー」は、限定なく、特異的に膵内分泌細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味し得る。例示的な膵内分泌細胞マーカーには、それだけに限らないが、Ｎｇｎ－３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＩｓｌｅｔ－１が含まれる。

【0077】

[0091]用語「膵前駆細胞」、「膵内分泌前駆細胞」、「膵前駆体」、「膵内分泌前駆体」、およびそれらの文法的等価物は本明細書で相互交換可能に用いられ、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞、または膵導管細胞を形成することができる膵ホルモン発現細胞になることができる幹細胞を意味し得る。これらの細胞は少なくとも１つの型の膵細胞、例えばインスリンを生成するβ細胞、グルカゴンを生成するα細胞、ソマトスタチンを生成するδ細胞（またはＤ細胞）、および／または膵ポリペプチドを生成するＦ細胞に向けた分化に関与している。そのような細胞は以下のマーカー、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ－１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、またはＡＲＸのうち少なくとも１つを発現することができる。

【0078】

[0092]本明細書で用いる用語「ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞」は、膵β細胞等のＳＣ－β細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を意味し得る。ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はマーカーＰＤＸ１を発現する。その他のマーカーには、それだけに限らないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６もしくはＮＲｘ２．２が含まれる。ＰＤＸ１の発現は、抗ＰＤＸ１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１の発現を欠く。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、それがＮＫＸ６．１の発現を欠くので、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞と称することもできる。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は「膵前腸内胚葉細胞」と名付けることもできる。

【0079】

[0093]用語「ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞」および「ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆体」は、本明細書において相互交換可能に使用され、膵β細胞などのインスリン生成細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指すことができる。ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性の膵前駆細胞はマーカーＰＤＸ１およびＮＫＸ６－１を発現する。その他のマーカーには、それだけに限らないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６もしくはＮＲｘ２．２が含まれる。ＮＫＸ６－１の発現は、抗ＮＫＸ６－１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。本明細書で用いる場合、用語「ＮＫＸ６．１」および「ＮＫＸ６－１」は等価で相互交換可能である。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性の膵前駆細胞は「膵前腸前駆体細胞」と名付けることもできる。

【0080】

[0094]用語「ＮｅｕｒｏＤ」および「ＮｅｕｒｏＤ１」は相互交換可能に用いられ、膵内分泌前駆細胞において発現するタンパク質およびそれをコードする遺伝子を特定する。
[0095]用語「エピジェネティクス」は、ＤＮＡ配列の変化を含まない遺伝子機能の遺伝性の変化を意味する。エピジェネティクスは遺伝子の活性および発現に影響する染色体の変化を意味することが最も多いが、ゲノムの修飾に由来しない任意の遺伝可能な表現型の変化を記述するために用いることもできる。細胞および生理学的な表現型の形質に対するそのような効果は外的または環境的な要因に起因することがあるか、または正常な発生プログラムの一部であることもある。エピジェネティクスはヌクレオチド配列の変化を含まないゲノムの機能的に関連する変化を意味することもある。そのような変化を生成する機構の例としてはＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾があり、そのそれぞれは根底にあるＤＮＡ配列を改変せずに、遺伝子が発現される様式を改変する。遺伝子の発現はＤＮＡのサイレンサー領域に結合している抑制タンパク質の作用によって制御され得る。これらのエピジェネティクスは細胞の寿命の間の細胞分割を通して持続することができ、これらが生命体の根底にあるＤＮＡ配列の変化を含まないとしても、多世代にわたって持続することができる。真核細胞の生物学におけるエピジェネティクスの１つの例として、細胞分化のプロセスがある。形態形成の間に全能性幹細胞が種々の多能性細胞になり、次いでこれが完全に分化した細胞になることができる。

【0081】

[0096]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクスを起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現を変化させる化合物を意味する。エピジェネティクスは、遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある種の細胞、例えばベータ細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制する。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要である。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し、これは分化の間に不活性化される。非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

【0082】

[0097]用語「分化した細胞」またはその文法的等価物は、その天然形においてその用語が本明細書において定義されるように多能性ではない任意の初代細胞を意味する。別の言い方では、用語「分化した細胞」は、細胞分化プロセスにおいて特殊性の低い細胞型（例えば人工多能性幹細胞等の幹細胞）の細胞から誘導された特殊性の高い細胞型の細胞を意味し得る。理論に限定されることは望まないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、最初に膵細胞およびその他の内胚葉細胞型を形成することができる内胚葉細胞に分化することができる。内胚葉細胞のさらなる分化は膵経路に導かれ、細胞の約９８％は外分泌性、導管性、またはマトリックスの細胞になり、約２％が内分泌細胞になる。早期の内分泌細胞は膵島前駆細胞であり、次いでこれがさらに、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを分泌するインスリン生成細胞（例えば機能性内分泌細胞）に分化することができる。内胚葉細胞は内胚葉起源の他の細胞、例えば肺、肝臓、腸、胸腺等に分化することもできる。

【0083】

[0098]本明細書で用いる場合、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは反対に、生命体を形成する任意の細胞を意味し得る。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知である）は、受精の間に融合して接合子と呼ばれる細胞を生成する精子および卵子であり、接合子から哺乳動物の胚の全体が発生する。体細胞がそれから作られる細胞である精子および卵子（生殖母細胞）および未分化幹細胞は別として、哺乳動物の体内の全ての他の細胞型は体細胞である。内部器官、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て体細胞から作られている。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは胚に存在せずまたは胚から得られず、そのような細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に起因しない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは胚または胎児以外の生命体に存在しもしくはこれから得られ、またはそのような細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に起因する細胞を意味する。他に指示しなければ、少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体をインスリン生成性でグルコース応答性の細胞に変換するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で実施することができる（少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体が対象の中に存在する場合にはｉｎ ｖｉｖｏが実施され、単離され培地中に維持された少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏが実施される）。

【0084】

[0099]本明細書で用いる場合、用語「成体細胞」は胚発生の後で体内の至るところに見出される細胞を意味し得る。
[0100]本明細書で用いる場合、用語「内胚葉細胞」は極めて早期の胚の中の３つの一次胚細胞層のうちの１つからのものである細胞を意味し得る（他の２つの胚細胞層は中胚葉および外胚葉である）。内胚葉は３つの層のうち最も内側にある。内胚葉細胞は分化して最初に胚性腸を生じ、次いで呼吸管および消化管（例えば腸）のライニング、肝臓、ならびに膵を生じる。

【0085】

[0101]本明細書で用いる用語「内胚葉起源の細胞」は、内胚葉細胞から発生しまたは分化した任意の細胞を意味し得る。例えば、内胚葉起源の細胞には肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞が含まれる。理論に縛られることは望まないが、肝臓および膵の前駆細胞（膵前駆細胞とも称される）は胚前腸内の内胚葉細胞から発生する。これらが特定されてからすぐに、肝臓および膵の前駆細胞は全く異なった細胞機能および再生能力を急速に獲得する。これらの変化は、脊椎動物の間で高度に保存された誘起シグナルおよび遺伝子制御因子によって引き起こされる。臓器の発生および再生に対する興味は、肝不全およびＩ型糖尿病の治療処置における肝細胞および膵β細胞への強いニーズによって加速されてきた。多様なモデルの生命体およびヒトにおける研究によって、肝細胞および膵細胞の分化を引き起こし、多様な幹細胞および前駆細胞の型からの肝細胞およびβ細胞の分化をどのように促進するかについての指針を提供する進化的に保存された誘起シグナルおよび転写因子のネットワークが明らかになってきた。

【0086】

[0102]本明細書で用いる用語「胚体内胚葉」は、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ－β細胞（例えば膵β細胞）に分化することができる細胞を意味し得る。胚体内胚葉細胞はマーカーＳｏｘ１７を発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なその他のマーカーには、それだけに限らないが、ＭＩＸＬ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３Ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ－Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＣＭＫＯＲ１、およびＣＲＩＰ１が含まれる。特に、本明細書の胚体内胚葉細胞はＳｏｘ１７ならびに一部の実施形態ではＳｏｘ１７およびＨＮＦ３Ｂを発現し、顕著なレベルのＧＡＴＡ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＰＦ、またはＤＡＢは発現しない。胚体内胚葉細胞はマーカーＰＤＸ１については陽性ではない（例えばそれらはＰＤＸ１陰性である）。胚体内胚葉細胞は肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。Ｓｏｘ１７およびその他の胚体内胚葉のマーカーの発現は、例えば抗Ｓｏｘ１７抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。

【0087】

[0103]用語「膵内胚葉」は、膵β細胞を含む多重の膵臓系統に分化することができるが、非膵臓系統に分化する能力をもはや有しない内胚葉起源の細胞を意味し得る。
[0104]本明細書で用いる用語「原腸管細胞」または「腸管細胞」は、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ－β細胞（例えば膵β細胞）に分化することができる細胞を意味し得る。原腸管細胞は以下のマーカー、ＨＮＰ１－β、ＨＮＦ３－β、またはＨＮＦ４－αのうち少なくとも１つを発現する。一部の例では、原腸管細胞は、ＦＯＸＡ２陽性およびＳＯＸ２陽性であり、即ち、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３－βとしても公知である）とＳＯＸ２の両方を発現する。一部の例では、原腸管細胞は、ＦＯＸＡ２陽性およびＰＤＸ１陰性であり、即ち、ＦＯＸＡ２を発現するがＰＤＸ１は発現しない。原腸管細胞は肺、肝臓、膵、胃、および腸の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。ＨＮＦ１－βおよびその他の原腸管のマーカーの発現は、例えば抗ＨＮＦ１－β抗体を用いる免疫化学等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。

【0088】

[0105]本明細書で用いる用語「幹細胞」は、増殖することができ、次に分化したまたは分化可能な娘細胞を生じることができる多数の母細胞を産生する能力を有するより多くの前駆細胞を生じる未分化の細胞を意味し得る。娘細胞それ自体は、増殖し、続いて１つまたは複数の成熟細胞型に分化する子孫を生成するように誘起される一方、親の発生可能性を有する１個または複数の細胞を保持することができる。用語「幹細胞」は、特定の状況下ではより特殊化されまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、特定の状況下では実質的に分化せずに増殖する能力を保持している前駆細胞のサブセットを意味し得る。一実施形態では、幹細胞という用語は一般に、その子孫（descendants、progeny）が、胚の細胞および組織の漸進的多様化で起こるように、分化によって、例えば完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に、特殊化する、天然に存在する母細胞を意味する。細胞の分化は典型的には多くの細胞分割を通して起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は万能性細胞由来であってよく、万能性細胞はそれ自体、万能性細胞由来、等々である。これらの万能性細胞のそれぞれは幹細胞であると考えられるが、それぞれが生じることができる細胞型の範囲はかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞はより大きな発生の可能性を有する細胞を生じる能力をも有する。そのような能力は天然であってもよく、種々の因子を用いる処理によって人工的に誘起してもよい。多くの生物学的な例では、幹細胞は２つ以上の異なった細胞型を有する子孫を生成することができるので「万能性」でもあるが、これは「幹細胞性」であるために必要ではない。「自己更新」は幹細胞の定義の他の古典的な部分であり、これは本書で用いるように重要である。理論的には、自己更新は２つの主な機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対称的に分割され、１つの娘は幹細胞状態を保持し、他の娘はいくつかの異なった他の特定の機能および表現型を発現することができる。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは２つの幹細胞に対称的に分割することができ、それにより集団中のいくつかの幹細胞は全体として維持される一方、集団中の他の細胞は分化した子孫のみを生じる。形式的には、幹細胞として始まった細胞が分化した表現型に向かって進行するが、「逆行」し、幹細胞の表現型を逆発現することも可能である。これは当業者によって「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化」と称されることが多い。本明細書で用いる場合、用語「多能性幹細胞」には、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞等が含まれる。

【0089】

[0106]本明細書で用いる用語「多能性」は、種々の条件下で２種以上の分化した細胞型に分化し、好ましくは３種全ての胚細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を意味し得る。多能性細胞は、一次的には例えばヌードマウスの奇形腫形成アッセイを用いて２種以上の細胞型、好ましくは３種全ての胚葉層に分化する能力によって特徴付けられる。多能性は胚幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性のための好ましい試験は３種の胚葉層のそれぞれの細胞へ分化する能力を実証することである。そのような細胞を単に培養するだけではそれ自体、これらの細胞を多能性にするわけではないことに留意されたい。再プログラミングされた多能性細胞（例えば本明細書でその用語を定義するようにｉＰＳ細胞）は、一般には培養中に限られた回数の分割のみの能力を有する初代親細胞と比較して、成長の可能性を失わずに延長された継代の能力を有することも特徴としている。

【0090】

[0107]本明細書で用いる場合、用語「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」は相互交換可能に用いられ、例えば１つまたは複数の遺伝子の強制的な発現を誘起することによって、非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から人工的に誘導された（例えば誘起された、または完全な逆転による）多能性幹細胞を意味し得る。

【0091】

[0108]用語「表現型」は、実際の遺伝子型に関わらず、環境条件および因子の特定の組のもとに細胞または生命体を定義する１つまたはいくつかの生物的特徴の全てを意味し得る。

【0092】

[0109]用語「対象」、「患者」、または「個体」は本明細書で相互交換可能に用いられ、それから細胞が得られ、および／または本明細書に記載した細胞を用いる予防的処置を含む処置がそれに提供される動物、例えばヒトを意味し得る。ヒト対象等の特定の動物に特有な感染、病態、または疾患状態の処置については、対象という用語はその特定の動物を意味し得る。本明細書で相互交換可能に用いられる「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類等の哺乳動物が含まれる。用語「対象」には、それだけに限らないが哺乳類、爬虫類、両生類、および魚類を含む任意の脊椎動物も包含される。しかし有利には、対象はヒト等の哺乳動物、または例えばイヌ、ネコ、ウマ、その他の家畜、もしくはウシ、ヒツジ、ブタ、その他の生産用哺乳動物等のその他の哺乳動物である。「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では糖尿病に限らず、例えば疾患または障害を有すると診断されたか、その疑いがある患者を意味する。

【0093】

[0110]本明細書で用いる「投与する」は、本明細書に記載した１つまたは複数の組成物を患者または対象に提供することを意味し得る。例として限定せずに、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって実施することができる。１つまたは複数のそのような経路を採用することができる。非経口投与は、例えばボーラス注射または時間をかけた段階的潅流によるものでよい。あるいは、または同時に、投与は経口経路によるものでよい。さらに、投与は細胞のボーラスまたはペレットを手術で堆積してもよく、医用デバイスを位置決めしてもよい。一実施形態では、本開示の組成物は、増殖性障害を治療しまたは予防するために有効な量の本明細書に記載した核酸配列または本明細書に記載した少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを発現する操作された細胞または宿主細胞を含み得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載した細胞集団を含んでよい。そのような組成物は、中性緩衝食塩液、リン酸緩衝食塩液等の緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン、マンニトール等の炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン等のキレート化剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含んでもよい。

【0094】

[0111]全体に開示したいくつかの数値は、例えば「Ｘは少なくともまたは少なくとも約１００、または２００［または任意の数］である」と称される。この数値にはその数それ自体および以下
ｉ）Ｘは少なくとも１００である、
ｉｉ）Ｘは少なくとも２００である、
ｉｉｉ）Ｘは少なくとも約１００である、および
ｉｖ）Ｘは少なくとも約２００である
の全てが含まれる。

【0095】

[0112]全体に開示した数値によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての数値はこのように解釈すべきである。

【0096】

[0113]全体に開示した範囲は、例えば「Ｘは１～２日目もしくは約１～２日目に、または２～３日目もしくは約２～３日目に［または任意の数値範囲に］投与される」と称されることがある。この範囲にはその数それ自体（例えば範囲の終点）および以下
ｉ）Ｘは１日目と２日目の間に投与される、
ｉｉ）Ｘは２日目と３日目の間に投与される、
ｉｉｉ）Ｘは約１日目と２日目の間に投与される、
ｉｖ）Ｘは約２日目と３日目の間に投与される、
ｖ）Ｘは１日目と約２日目の間に投与される、
ｖｉ）Ｘは２日目と約３日目の間に投与される、
ｖｉｉ）Ｘは約１日目と約２日目の間に投与される、および
ｖｉｉｉ）Ｘは約２日目と約３日目の間に投与される
の全てが含まれる。

【0097】

[0114]全体に開示した範囲によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての範囲はこのように解釈すべきである。

【0098】

[0115]態様では、本開示は膵前駆細胞を分化する組成物および方法を提供する。本明細書で提供される組成物および方法は、一部の実施形態では、膵β細胞、細胞集団、または高純度の膵β細胞、高インスリン含量、優れたグルコース依存性インスリン分泌応答、ならびに構造的および機能的に天然膵島に類似し得る膵αおよびδ細胞ならびに腸クロム親和性細胞の適切なパーセンテージを有する細胞クラスターを提供することができる。

【0099】

[0116]一部の態様では、膵臓内分泌細胞を分化する方法が本明細書で提供される。一部の例では、本方法は、増加した膵β細胞、増加した膵α細胞、増加した膵δ細胞、減少した腸クロム親和性細胞（ＥＣ細胞）、またはそれらの任意の組合せの産生をもたらす。一部の例では、本方法は、約３０％～４０％の膵β細胞、３０％～４０％の膵α細胞、３～１０％の膵δ細胞、および／または２０％未満のＥＣ細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞組成物の産生をもたらす。一部の例では、本明細書で開示される方法に従って産生された細胞組成物は、従来の方法に従って産生された細胞組成物と比較して、グルコース刺激ンスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を改善した。一部の例では、本明細書で開示される細胞組成物は、天然膵島に近い動的ＧＳＩＳ応答を有する。

【0100】

[0117]一部の態様では、本明細書で提供される方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞におけるＮＫＸ６．１発現の誘導中または誘導後、例えば、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させる末期段階において、ＰＫＣ活性化を利用する。ある特定の理論に縛られることなく、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞におけるＰＫＣシグナル伝達の活性化は、ある特定の細胞の分化運命に影響し、膵α細胞のパーセンテージの増加およびＥＣ細胞のパーセンテージの減少をもたらすことができる。

【0101】

[0118]一部の態様では、本開示は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤およびγ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む方法を提供する。

【0102】

[0119]一部の態様では、本開示は、細胞集団を、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子の一方または両方と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。

【0103】

[0120]一部の態様では、本開示は、（ａ）１～５日間以下の期間、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団をγセクレターゼ阻害剤と接触させるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の接触は、４日間または５日間の期間である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む。

【0104】

[0121]一部の態様では、本開示は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップであって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体であるステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む方法を提供する。一部の例では、ベンゾラクタム誘導体はＴＰＰＢである。

【0105】

[0122]一部の態様では、本開示は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにγ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと、（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップと、（ｅ）第４の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびに血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップとを含む方法を提供する。

【0106】

[0123]一部の態様では、本明細書で開示される方法は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生することによって、前記ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化するステップを含む。一部の例では、本方法は、第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む第２の組成物と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、第２の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部を、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる第３の組成物と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップを含む。

【0107】

[0124]一部の例では、本明細書では、細胞集団を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物が提供され、細胞集団は、（ａ）Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞；および（ｂ）ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約３５％の細胞、またはグルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞を含む（例えば、フローサイトメトリーによって測定した場合）。一部の態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団を含む組成物を提供し、前記細胞集団は、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％細胞；および（ｉ）ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約３５％細胞、および／または（ｉｉ）グルカゴンを発現する少なくとも約１５％細胞を含む。一部の実施形態では、細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって測定される。一部の例では、前記細胞集団は、ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約３０％の細胞、およびグルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を含む。

【0108】

[0125]一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；およびＰＫＣ活性化剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物であって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体である組成物が本明細書で提供される。

【0109】

[0126]一部の例では、細胞集団を含む組成物であって、（ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、もしくは８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；（ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；（ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で提供される。

【0110】

[0127]一部の例では、細胞集団を含む組成物であって、（ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；（ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに（ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で提供される。

【0111】

[0128]一部の例では、本明細書で提供される方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる場合、ＰＫＣ活性化を含む。例えば、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞への分化を指向する分化因子と接触させる時間の初期段階で、ＰＫＣ活性化剤を導入することができる。一部の例では、本方法は、（ａ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と１～２日間接触させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を得るステップと、ならびに（ｂ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物と１～２日間接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む第２の形質転換細胞集団を得るステップとを含む。

【0112】

内分泌細胞を産生する方法
[0129]態様では、本開示は膵前駆細胞または前駆体から内分泌細胞を産生する組成物および方法に関する。内分泌細胞を産生して少なくとも１個のＳＣ－β細胞を提供するある例示的な詳細なプロトコールは、それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および第２０１５／０２１８５２２号に記載されている。

【0113】

[0130]一部の例では、内分泌細胞の集団を産生する方法は、膵β細胞を産生する場合、膵αおよび／またはδ細胞の増加したパーセンテージ、膵臓ＥＣ細胞の減少したパーセンテージをもたらす。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法を用いて、α細胞の濃縮された集団を得ることができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法を用いて、δ細胞の濃縮された集団を得ることができる。一部の例では、内分泌細胞集団を産生する方法は、（ａ）第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップと、（ｂ）第１の期間後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させ、それにより膵臓内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップとを含む。一部の例では、本明細書で開示される方法に従って産生された細胞集団は、第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＰＫＣ活性化剤と接触させずに産生された対応する細胞集団と比較して、（ｉ）ソマトスタチンを発現する細胞のパーセンテージが増加し；（ｉｉ）グルカゴンを発現する細胞のパーセンテージが増加し；（ｉｉｉ）ＶＭＡＴ１を発現する細胞のパーセンテージが減少し；または（ｉｖ）Ｃ－ペプチドを発現する細胞のパーセンテージが増加している。

【0114】

[0131]一部の例では、本方法は、第１の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤からなる群から選択される因子を含む第１の組成物と接触させるステップと、第１の期間後に、第２の期間、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物からなる群から選択される因子を含む第２の組成物と接触させるステップを含む。一部の例では、第１の組成物は、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む。一部の例では、第２の組成物は、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む。

【0115】

[0132]一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞に分化させる組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、後成的修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子を含む。一部の例では、組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む。

【0116】

[0133]一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ＰＫＣ活性化剤を含む組成物と接触させることをさらに含む。例えば、本方法は、（ａ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と１～２日間接触させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を得るステップと、ならびにｂ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物と１～２日間接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む第２の形質転換細胞集団を得るステップとを含む。一部の例では、本方法は、第２の形質転換細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させ、それにより膵臓内分泌細胞を含む細胞集団を産生することをさらに含む。

【0117】

[0134]一部の例では、本明細書で提供される方法に従って産生された膵臓内分泌細胞を含む細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現する少なくとも約４％の細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約１５％の細胞、ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約３５％の細胞、またはＣ－ペプチドを発現する少なくとも約４０％の細胞を含む。一部の例では、膵臓内分泌細胞を含む細胞集団は、ＰＫＣ活性化剤と接触することなく産生される対応する細胞集団と比較して、ソマトスタチンを発現する少なくとも約５０％を超える細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約５０％を超える細胞、ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約２０％を下回る細胞、またはＣ－ペプチドを発現する少なくとも約１０％を超える細胞を含む。一部の例では、膵臓内分泌細胞を含む細胞集団は、ＰＫＣ活性化剤と接触することなく産生される対応する細胞集団と比較して、ソマトスタチンを発現する少なくとも約１００％を超える細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約２００％を超える細胞、ＶＭＡＴ１を発現する少なくとも約５０％を下回る細胞、またはＣ－ペプチドを発現する少なくとも約２０％を超える細胞を含む。

【0118】

[0135]一部の態様では、本開示は、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップを含む方法を提供する。一部の例では、本方法は、第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤およびγ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤およびγ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む。一部の例では、本方法は、（ｄ）第３の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0119】

[0136]一部の態様では、本開示は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップであって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体であるステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップとを含む方法を提供する。一部の例では、ベンゾラクタム誘導体はＴＰＰＢである。一部の例では、第２の細胞集団を産生するステップ（ｂ）は、第１の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、第４の細胞集団を産生するステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、第４の細胞集団を産生するステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をγ－セクレターゼ阻害剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、第４の細胞集団を産生するステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含まない。一部の例では、第４の細胞集団を産生するステップ（ｄ）は、第３の細胞集団をＥＧＦファミリーからの成長因子と接触させるステップを含まない。

【0120】

[0137]一部の例では、本方法は、（ｅ）第４の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップをさらに含む。一部の例では、ステップ（ｅ）は、第４の細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0121】

[0138]一部の態様では、本開示は、（ａ）複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第１の細胞集団を産生するステップと、（ｂ）第１の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第２の細胞集団を産生するステップと、（ｃ）第２の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびにγ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第３の細胞集団を産生するステップと、（ｄ）第３の細胞集団を、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第４の細胞集団を産生するステップと、（ｅ）第４の細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ならびに血清アルブミンタンパク質、ビタミンＣ、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物のうちの１つまたは複数と接触させ、それにより第５の細胞集団を産生するステップとを含む方法を提供する。一部の例では、本明細書で提供される方法のステップ（ｄ）は、第４の細胞集団を血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む。

【0122】

[0139]一部の例では、本明細書で開示される方法における第１の細胞集団を産生するためのステップ（ａ）は、約１、２、３、４、５または６日間にわたって行われる。一部の例では、第１の細胞集団を産生するためのステップ（ａ）は、３～５日間、例えば、３～４日間、４～５日間、約３日間、約４日間、または約５日間にわたって行われる。一部の例では、第１の細胞集団を産生するためのステップ（ａ）は、４日間にわたって行われる。一部の例では、本明細書で開示される方法における第２の細胞集団を産生するためのステップ（ｂ）は、１、２、３または４日間にわたって行われる。一部の例では、第２の細胞集団を産生するためのステップ（ｂ）は、１～３日間、例えば、１～２日間、２～３日間、約１日間、約２日間、または約３日間にわたって行われる。一部の例では、第２の細胞集団を産生するためのステップ（ｂ）は、２日間にわたって行われる。一部の例では、本明細書で開示される方法における第３の細胞集団を産生するためのステップ（ｃ）は、１、２、３、または４日間に行われる。一部の例では、第３の細胞集団を産生するためのステップ（ｃ）は、１～３日間、例えば、１～２日間、２～３日間、約１日間、約２日間、または約３日間にわたって行われる。一部の例では、第３の細胞集団を産生するためのステップ（ｃ）は、２日間にわたって行われる。一部の例では、本明細書で開示される方法における第４の細胞集団を産生するためのステップ（ｄ）は、１、２、３、４、５、６、または７日間にわたって行われる。一部の例では、第４の細胞集団を産生するためのステップ（ｄ）は、４～６日間、例えば、５～６日間、４～５日間、約４日間、約５日間、または約６日間にわたって行われる。一部の例では、第４の細胞集団を産生するためのステップ（ｄ）は、５日間にわたって行われる。一部の例では、本明細書で開示される方法における第５の細胞集団を産生するためのステップ（ｅ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間にわたって行われる。一部の例では、第４の細胞集団を産生するためのステップ（ｄ）は、１０～１２日間、例えば、１０～１１日間、１１～１２日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間にわたって行われる。

【0123】

[0140]一部の例では、第２の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性およびＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の例では、第５の細胞集団は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現する細胞を含むが、ＶＭＡＴ１を発現しない。一部の例では、第４の細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない。一部の例では、第４の細胞集団における４０～６０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現しない。一部の例では、第４の細胞集団は、グルカゴンを発現するがソマトスタチンを発現しない細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現しない。一部の例では、第４の細胞集団における１０～２５％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない。一部の例では、第４の細胞集団は、ソマトスタチンを発現するがグルカゴンを発現しない細胞を含む。一部の例では、第４の細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない。

【0124】

[0141]一部の例では、本明細書で提供される方法における第１の細胞集団を産生するステップは、複数のＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む。一部の例では、本明細書で提供される方法における第２の細胞集団を産生するステップは、第１の細胞集団を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させるステップを含む。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団を産生するステップは、第２の細胞集団を、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の例では、本明細書で提供される方法における第４の細胞集団を産生するステップは、第３の細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の例では、本明細書で提供される方法において使用するためのＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾバビンである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第１の細胞集団および／または第２の細胞集団を産生するステップに使用するためのＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第１の細胞集団および／または第２の細胞集団を産生するステップに使用するためのＦＧＦファミリーからの成長因子は、ＫＧＦである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第１の細胞集団、第２の細胞集団、および／または第３の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸である。一部の例では、本明細書で提供される方法における第１の細胞集団、第２の細胞集団、および／または第３の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ－１である。一部の例では、本明細書で提供される方法における第２の細胞集団、第３の細胞集団、および／または第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第２の細胞集団、および／または第３の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのγ－セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団、および／または第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５ｉである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＥＧＦファミリーからの成長因子は、ベータセルリンである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団および／または第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＴＨシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である。一部の例では、第３の細胞集団、および／または本明細書で提供される方法における第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンである。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団、および／または第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である。一部の例では、本明細書で提供される方法における第３の細胞集団、および／または第４の細胞集団を産生するステップにおいて使用するためのエピジェネティック修飾化合物は、ＤＺＮｅｐである。

【0125】

[0142]一部の例では、膵前駆細胞がＰＫＣ活性化剤で処理される第１の期間は、少なくとも２日間、３日間、または４日間である。一部の例では、第１の期間は、多くとも４日間、３日間、または２日間である。一部の例では、第１の期間は、２～４日間である。一部の例では、膵前駆細胞がＰＫＣ活性化剤で処理される第２の期間は、少なくとも２日間である。一部の例では、第２の期間は、多くとも４日間である。一部の例では、第２の期間は、２～４日間である。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化とＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞の分化の間の移行の間に本明細書において検討されるＰＫＣ活性化剤の処理は、少なくとも２日間、３日間、または４日間である。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化とＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞の分化の間の移行の間に本明細書において検討されるＰＫＣ活性化剤の処理は、多くとも２日間、３日間、または４日間である。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の分化とＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞の分化の間の移行の間に本明細書において検討されるＰＫＣ活性化剤の処理は、２日間～４日間である。

【0126】

[0143]一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、分化プロセスの間、２つ以上の異なる時点で分化細胞集団に接触される。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、細胞集団に接触され、細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、細胞集団に接触され、細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、細胞集団に接触され、細胞は、インスリン陽性細胞を含む。一部の実施形態では、以下の分化ステージ：細胞がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む場合；細胞がＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む場合；および細胞がインスリン陽性細胞を含む場合の各々でＰＫＣ活性化剤は細胞集団に接触される。一部の実施形態では、同じタイプのＰＫＣ活性化剤（例えば、ホルボールエステルまたはベンゾラクタム誘導体）は、２つ以上の異なる時点で、異なる細胞集団に投与される。例えば、一部の実施形態では、ホルボールエステル（例えば、ＰＤＢＵ）は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞集団に投与され、ホルボールエステル（例えば、ＰＤＢＵ）は、同じ分化プロトコールの間、ＰＤＸ陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞集団に投与される。一部の実施形態では、１種または複数の異なるＰＫＣ活性化剤（例えば、ホルボールエステルおよびベンゾラクタム誘導体）は、２つ以上の異なる時点で、異なる細胞集団に投与される。例えば、一部の実施形態では、ホルボールエステル（例えば、ＰＤＢＵ）は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む細胞集団に投与され、ベンゾラクタム誘導体（例えば、ＴＰＰＢ）は、同じ分化プロトコールの間、ＰＤＸ陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む細胞集団に投与される。

【0127】

[0144]一部の例では、本明細書に記載される方法のＰＫＣ活性化剤の非限定的な例は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢを含む。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵを含む。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＰＢを含む。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団に、５０ｎＭ～２０００ｎＭ、７５ｎＭ～１５００ｎＭ、１００ｎＭ～１０００ｎＭ、２００ｎＭ～７５０ｎＭ、または４００ｎＭ～６００ｎＭの濃度で接触される。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度である。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、少なくとも約１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または１０００ｎＭの濃度である。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、多くとも約１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または１０００ｎＭの濃度である。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、約１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または１０００ｎＭの濃度である。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤は、約５００ｎＭの濃度である。

【0128】

[0145]一部の例では、本明細書に記載される方法において使用されるガンマセクレターゼ阻害剤の非限定的な例には、ＸＸＩおよびＤＡＰＴが含まれる。一部の例では、ガンマセクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。一部の例では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、０．２μＭ～２０μＭ、０．３μＭ～１５μＭ、０．５μＭ～１０μＭ、１μＭ～５μＭ、または１．５μＭ～２．５μＭの濃度で、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団に接触される。一部の例では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．５μＭ、０．７５μＭ、１μＭ、１．２５μＭ、１．５μＭ、１．７５μＭ、２μＭ、２．２５μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、７．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、または２０μＭの濃度である。一部の例では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、少なくとも約０．５μＭ、０．７５μＭ、１μＭ、１．２５μＭ、１．５μＭ、１．７５μＭ、２μＭ、２．２５μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、または５μＭの濃度である。一部の例では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、多くとも約１μＭ、１．２５μＭ、１．５μＭ、１．７５μＭ、２μＭ、２．２５μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、７．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、または２０μＭの濃度である。

【0129】

細胞組成物
[0146]一部の態様では、ＳＣ－β細胞、ＳＣ－α細胞、ＳＣ－δ細胞、およびＳＣ－ＥＣ細胞を含む細胞組成物が本明細書で提供される。一部の例では、本明細書で提供される細胞組成物は、所望の量（例えば、パーセンテージ）のＳＣ－β細胞、ＳＣ－α細胞、およびＳＣ－δ細胞、ならびに限られた量のＳＣ－ＥＣ細胞を有する。一部の例では、細胞組成物の細胞構成は、天然の膵島に類似している。

【0130】

[0147]一部の例では、本開示のＳＣ－β細胞は、正常なβ細胞機能に重要であるβ細胞の多くの特徴的な特徴を共有する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟膵β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、少なくとも１つのグルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、少なくとも２つの連続的グルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、少なくとも３つの連続的グルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、複数のグルコースチャレンジに対する内因性ヒト膵島のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植した直後に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ２４時間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ１週間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ２週間以内に観察される。一部の実施形態では、低いグルコース濃度と比較して、高いグルコース濃度に応答して分泌されるインスリンの比率によって特徴付けられる細胞の刺激指数は、内因性成熟膵β細胞の刺激指数に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、１より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、１より大きいかまたは１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、１．１より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、１．１より大きいかまたは１．１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、２より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、１より大きいかまたは１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ－β細胞は、少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０またはそれより大きい刺激指数を呈する。

【0131】

[0148]一部の実施形態では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴまたはＸＸＩである。

【0132】

[0149]一部の態様では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＰＫＣ活性化剤；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である。一部の実施形態では、組成物における９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＦＲ２３６９２４、プロストラチン、ＳＣ－９、およびＴＰＰＢからなる群から選択される。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴまたはＸＸＩである。一部の実施形態では、組成物は、ＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。一部の実施形態では、組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子はアクチビンＡである。

【0133】

[0150]一部の態様では、本開示は、ＰＤＸ１陽性細胞、γ－セクレターゼ阻害剤、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子およびＦＧＦファミリーからの成長因子のうちの一方または両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、細胞の組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の組成物は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちのいずれか１つまたはそれらの組合せをさらに含む。

【0134】

[0151]一部の態様では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞；ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；およびγ－セクレターゼ阻害剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物を提供する。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩである。一部の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴである。

【0135】

[0152]一部の実施形態では、組成物における少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞である。一部の実施形態では、組成物における９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の細胞は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞である。

【0136】

[0153]一部の実施形態では、組成物は、ＦＧＦファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤をさらに含む。

【0137】

[0154]一部の実施形態では、組成物は、ＰＫＣ活性化剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のうちの２つ以上（例えば、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、またはいずれか６つ）をさらに含む。組成物の一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。一部の実施形態では、ソニックヘッジホッグ経路阻害剤はＳＡＮＴ－１である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡである。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸である。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤はＰＤＢＵである。

【0138】

[0155]一部の態様では、本開示は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団を提供する。一部の実施形態では、集団は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団における少なくとも７３％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも４０％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における１２％未満の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。

【0139】

[0156]一部の態様では、本開示は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞およびＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団であって、集団における１２％未満（例えば、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはそれ以下）の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である集団を提供する。一部の実施形態では、集団における１０％未満、８％未満、６％未満、４％未満、１～１１％、２～１０％、２～１２％、４～１２％、６～１２％、８～１２％、２～８％、４～８％、３～６％または３～５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。一部の実施形態では、集団における２～１２％、４～１２％、６～１２％、８～１２％、２～８％、４～８％、３～６％または３～５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陰性細胞である。

【0140】

[0157]一部の実施形態では、集団における少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、約８５～９５％、または約９０～９５％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８５％、６０～８０％、６０～７５％、６０～７０％、６５～９０％、６５～８５％、６５～８０％、６５～７５％、６５～７０％、７０～９０％、７０～８５％、７０～８０％、７０～７５％、７５～９０％、７５～８５％、７５～８０％、８０～９０％、８０～８５％、または８５～９０％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、約８５～９５％、または約９０～９５％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の細胞は、ＩＳＬ１陽性細胞である。

【0141】

[0158]一部の実施形態では、集団は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞よりも多くのＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、集団における少なくとも４０％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における少なくとも４５％、少なくとも５０％、約４０～５０％、約４５～５５％、または約５０～５５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。一部の実施形態では、集団における約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、または約５５％の細胞は、ＮＫＸ６．１陰性、ＩＳＬ１陽性細胞である。

【0142】

[0159]一部の態様では、本開示は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞；ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞；およびＰＫＣ活性化剤を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物であって、ＰＫＣ活性化剤はベンゾラクタム誘導体である組成物を提供する。一部の例では、ベンゾラクタムはＴＰＰＢである。一部の例では、組成物は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。γセクレターゼ阻害剤はＸＸＩであり得る。

【0143】

[0160]一部の例では、本明細書に提供される組成物は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される分化因子を含む。一部の例では、組成物は血清アルブミンタンパク質も含む。

【0144】

[0161]一部の例では、本明細書に提供される組成物は、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、エピジェネティック修飾化合物、ＳＨＨ経路阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む。

【0145】

[0162]一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾバビンである。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸である。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ－１である。一部の例では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤はＡＬＫ５ｉである。一部の例では、ＥＧＦファミリーの成長因子はベータセルリンである。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３、ＧＣ－１または甲状腺ホルモン誘導体である。一部の例では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンである。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１である。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐである。

【0146】

[0163]一部の例では、本開示の細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物の細胞におけるＣ－ペプチドの発現およびＶＭＡＴ１の非存在は、細胞がＳＣ－β細胞であることを示唆する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３０％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない約３０％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％を有する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない約３０％～約６０％、約３５％～約５５％、約４０％～約５０％の細胞を有する。

【0147】

[0164]一部の例では、本開示の細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３５％の細胞を有する。一部の例では、本開示の細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現し、Ｃ－ペプチドを発現しない多くとも約３５％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物の細胞におけるＶＭＡＴ１の発現およびＣ－ペプチドの非存在は、細胞がＳＣ－ＥＣ細胞であることを示唆する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現し、Ｃ－ペプチドを発現しない、多くとも約３５％、３２％、３１％、３０％、２８％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、または２０％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現し、Ｃ－ペプチドを発現しない約３５％、３２％、３１％、３０％、２８％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、または１５％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現し、Ｃ－ペプチドを発現しない約１５％～約３０％、約１６％～２５％、約１７％～約２２％、約１８％～約２０％の細胞を有する。

【0148】

[0165]一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、グルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない少なくとも約１５％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物の細胞におけるグルカゴンの発現、およびソマトスタチンの非発現は、細胞がＳＣ－α細胞であることを示唆する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、または２２％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない約１０％～約３０％、約１２％～約２５％、約１３％～約２２％、約１５％～約２０％、または約１６％～約１８％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、グルカゴンを発現し、ソマトスタチンを発現しない約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、または２２％の細胞を含む。

【0149】

[0166]一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない少なくとも約４％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物の細胞におけるグルカゴンの発現、おとびソマトスタチンの非発現は、細胞がＳＣ－δ細胞であることを示唆する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない少なくとも約２％、３％、４％、５％、６％、７％、または８％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない約１％～約９％、約２％～約８％、約３％～約７％、または約４％～約６％の細胞を含む。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、ソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない約２％、３％、４％、５％、６％、７％、または８％の細胞を含む。

【0150】

[0167]一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３０％の細胞、およびグルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞を有する。一部の例では、細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約３０％の細胞、グルカゴンを発現する少なくとも約２０％の細胞、およびソマトスタチンを発現し、グルカゴンを発現しない少なくとも４％の細胞を有する。

【0151】

[0168]一部の例では、本明細書で提供される細胞組成物は、フローサイトメトリーによって測定して、（ａ）Ｃ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１を発現しない少なくとも約３５％の細胞；および（ｂ）ソマトスタチンを発現する少なくとも約１０％の細胞を含む。一部の例では、フローサイトメトリーによって測定して、細胞組成物においてソマトスタチンを発現する少なくとも約１５％の細胞が存在する。

【0152】

[0169]一部の例では、細胞集団を含む組成物であって、（ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、もしくは８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；（ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％もしくは３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに／または（ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％もしくは１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で提供される。

【0153】

[0170]一部の例では、細胞集団を含む組成物であって、（ａ）細胞集団における３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、７０～９０％、７０～８０％、または８０～９０％の細胞は、Ｃ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；（ｂ）細胞集団における５～４０％、５～３５％、５～３０％、５～２５％、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～１５％、１５～４０％、１５～３５％、１５～３０％、１５～２５％、１５～２０％、２０～４０％、２０～３５％、２０～３０％、２０～２５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～４０％、３０～３５％または３５～４０％の細胞は、グルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに（ｃ）細胞集団における３～２０％、３～１５％、３～１２％、３～１０％、３～８％、３～５％、４～２０％、４～１５％、４～１２％、４～１０％、４～８％、４～５％、５～２０％、５～１５％、５～１２％、５～１０％、５～８％、７～２０％、７～１５％、７～１２％、７～１０％、９～２０％、９～１５％、９～１２％、８～１０％、８～１２％、８～１５％、８～２０％、１０～２０％、１０～１２％、１０～１５％、１２～２０％、１２～１５％または１５～２０％の細胞は、ソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない組成物が本明細書で提供される。

【0154】

[0171]一部の例では、本明細書で提供される細胞集団において、４０～６０％の細胞はＣ－ペプチドおよびＩＳＬ１を発現するが、ＶＭＡＴ１を発現せず；１０～２５％の細胞はグルカゴンを発現するが、ソマトスタチンを発現せず；ならびに４～１０％の細胞はソマトスタチンを発現するが、グルカゴンを発現しない。一部の例では、本明細書で提供される細胞集団において、２５％未満、２０％未満、１８％未満、１５％未満、１２％未満、または１０％未満の細胞は、ＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現しない。

【0155】

[0172]本開示のさらなる他の実施形態は、ＳＣ－β細胞およびインスリン陽性内分泌細胞またはそれらが分化されるその前駆体の混合物を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。例えば、約９５個毎のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約５個のＳＣ－β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が産生され得る。他の実施形態では、約５個毎のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約９５個のＳＣ－β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が産生され得る。さらに、他の比率のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対するＳＣ－β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が企図される。例えば、約１，０００，０００個毎、または少なくとも１００，０００個、または少なくとも１０，０００個、または少なくとも１０００個もしくは５００個、または少なくとも２５０個または少なくとも１００個または少なくとも１０個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約１個のＳＣ－β細胞を含む組成物を生成することができる。

【0156】

[0173]一部の事例では、本明細書に開示されている細胞集団または細胞クラスター、例えば、細胞選別プロセスを介さずに単離された細胞集団または細胞クラスターは、選別されていない。一部の実施形態では、本明細書に開示されている細胞クラスターは、所与の環境、例えば、３Ｄ懸濁液培養で培養された細胞の自己凝集によって形成された細胞クラスターを指し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されている細胞クラスターは、本明細書に記載されているように、分化プロセスの間に形成された中間体細胞クラスターである。一部の例では、中間体細胞クラスター、例えば、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ３細胞クラスター）、またはＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ４細胞クラスター）は、細胞選別に供されない。一部の例では、細胞選別を通過する細胞集団は、本明細書に開示される中間体細胞クラスターを形成することができない場合がある。例えば、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、細胞選別を経た後に、本明細書に開示される細胞クラスターを形成することができない場合がある。

【0157】

[0174]本明細書に記載されている細胞選別は、細胞のサイズ、形状（形態）、表面タンパク質発現、内因性シグナルタンパク質の発現、またはこれらの任意の組合せにおける差に依拠することによって、複数の細胞から１群の細胞を単離するプロセスを指し得る。一部の事例では、細胞選別は、細胞をフローサイトメトリーに供することを含む。フローサイトメトリーは、レーザーまたはインピーダンスに基づく生物物理学的技術であり得る。フローサイトメトリーの間に、細胞を、流体流に懸濁させ、電子検出装置を通過させることができる。フローサイトメトリーの１種である、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）では、細胞の光学特性（例えば、レーザー励起時の発光波長）のうちの１つまたは複数のパラメーターに基づいて、物理的に分離し、それによって、フローサイトメトリーを使用して目的の細胞を精製することができる。本明細書に記載されているように、選別されていない細胞クラスターは、活性細胞選別プロセス、例えば、フローサイトメトリーに供されていない複数の細胞によって形成された細胞クラスターであり得る。一部の事例では、本明細書で議論されているフローサイトメトリーは、細胞内で発現される１つまたは複数のシグナルペプチドに基づき得る。例えば、細胞クラスターは、シグナルペプチド（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、シグナルペプチドは、細胞内のインスリン発現のインジケーターとして発現される。例えば、細胞クラスターは、インスリンプロモーターの制御下で、ＧＦＰをコードする外因性核酸配列を有する細胞を含むことができる。インスリンプロモーターは、内因性または外因性プロモーターであり得る。一部の事例では、これらの細胞内でのＧＦＰの発現は、細胞内でのインスリン発現を示すことができる。よって、ＧＦＰシグナルは、膵β細胞のマーカーであり得る。一部の事例では、本明細書に記載されている細胞選別は、磁気抗体または他のリガンドを使用して異なる種類の細胞を標識し、磁気特性の差を細胞選別について使用することができる、磁気活性化フローサイトメトリーを含み得る。

【0158】

[0175]本明細書に記載されるＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、ＮＧＮ３、またはＣＨＧＡのような１つまたは複数の特定のマーカーを発現する細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーアッセイのような技法を用いて検出されるパーセンテージ値であり得る。一部の事例では、フローサイトメトリーアッセイの間に、本明細書で議論された細胞集団または細胞クラスターは、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓのような消化酵素中でのインキュベーションによって、単細胞懸濁液中に分散される。分散された細胞は、ＰＢＳのような好適な緩衝液中で洗浄され、遠心分離され、次いで、４％のＰＦＡのような固定緩衝液中に再懸濁され得る。次いで、目的の細胞マーカーに対する一次抗体とのインキュベーションを行うことができ、その後、二次抗体と共にインキュベートすることができる。抗体のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる分離に供することができる。フローサイトメトリー以外の技法を使用して、本明細書に記載の細胞を特徴付ける、例えば、細胞のパーセンテージを決定することもできる。細胞を特徴付ける方法の非限定的な例としては、遺伝子配列決定、顕微鏡技法（蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡）、核型決定、アイソザイム分析、ＤＮＡ特性、およびウイルス感受性が挙げられる。

【0159】

[0176]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、グルコースで誘導した際に分泌されるインスリンの量と比較して、ＫＣｌ（例えば、約２０～約５０ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ）で誘導した際により多量のインスリンを分泌する組成物に関する。一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団は、グルコースで誘導した際に分泌されるインスリンの量と比較して、ＫＣｌで誘導した際に、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍多量のインスリンを分泌する。

【0160】

[0177]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、シグナル伝達因子の非存在下における同等の細胞と比較して、シグナル伝達因子の存在下で、ＫＣｌおよび／またはグルコースで誘導した際により多量のインスリンを分泌する、組成物に関する。一部の実施形態では、細胞は、高グルコースの存在下でより多量のインスリンを分泌するが、低グルコースの存在下では分泌しない。一部の実施形態では、高グルコース濃度は、約１０～２０ｍＭである。一部の実施形態では、低グルコース濃度は、約２～５ｍＭである。

【0161】

[0178]一部の態様では、本開示は、分化した膵前駆細胞の集団を含む組成物であって、集団が、フローサイトメトリーによって決定して、少なくとも６０％の膵β細胞を含む、組成物に関する。一部の実施形態では、集団は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の膵β細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、基本培地の構成成分と接触していない同等の集団と比較して、所定の基本培地の構成成分と接触した際に、より高いパーセンテージの膵β細胞を含む。

【0162】

[0179]本明細書に記載の本開示の方法に従って産生された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟した、ＳＣ－β細胞（例えば、膵β細胞）は、多くの利点を実証し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース刺激インスリン分泌を実施し、遺伝子発現と超微細構造によってヒト膵島β細胞に似ており、マウスへと移植された場合にヒトインスリンを分泌し、高血糖症を改善し、細胞療法に対する新たなプラットフォーム（例えば、追加のおよび／または機能的β細胞を必要とする対象への移植）、薬物スクリーニング（例えば、インスリン産生／分泌、生存、脱分化など）、研究（例えば、正常なβ細胞と糖尿病のβ細胞の間の機能の差を決定すること）、および組織工学（例えば、膵島を再構築する際に第１の細胞型としてＳＣ－β細胞を使用すること）を提供する。
幹細胞および再プログラミング
[0180]ＳＣ－β細胞（例えば成熟膵β細胞またはβ－様細胞）またはその前駆体を生成するための幹細胞の使用が本明細書で提供される。一実施形態では、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および第２０１５／０２１８５２２号に記載されたものと同様のプロトコールを用い、少なくとも１個のＳＣ－β細胞を提供するために、幹細胞の代わりに、またはそれとともに胚細胞を使用してよい。好適な胚細胞は、例えば最後の生理周期の約８～１１週後に採取したヒト胎児材料中に存在する原初胚細胞から調製することができる。説明的な胚細胞の調製法は、例えばShamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。

【0163】

[0181]ＳＣ－β細胞（例えば、膵β細胞）、ならびに膵α細胞、および／または膵δ細胞を産生する組成物および方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本開示は、膵α細胞について濃縮された細胞集団を産生する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、膵δ細胞について濃縮された細胞集団を産生する方法を提供する。

【0164】

[0182]一般には、少なくとも１個のＳＣ－β細胞またはその前駆体、例えば本明細書に開示した方法によって生成した膵前駆細胞は、様々な細胞の混合物または組合せ、例えば原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６－１陽性の膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞）、および／またはその他の多能性細胞もしくは幹細胞等の細胞の混合物を含み得る。

【0165】

[0183]幹細胞または多能性細胞を所望の分化ステージに分化させるために、任意の適切な培養プロトコールに従って、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体が生成され得る。一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、少なくとも１個の多能性細胞を少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体に分化させるために適した時間および条件下で少なくとも１個の多能性細胞を培養することによって生成される。

【0166】

[0184]一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、実質的に純粋な膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団である。一部の実施形態では、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は多能性細胞または分化した細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は胚幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないか、それらを欠いている。

【0167】

[0185]一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は、対象から例えば組織生検、例えば皮膚生検として単離することができ、本明細書に記載した組成物および方法における使用のための少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体を生成するためのさらなる分化のための人工多能性幹細胞に再プログラミングすることができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によって膵α、βおよび／もしくはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0168】

[0186]一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に記載した方法によって膵α、βおよび／もしくはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0169】

[0187]さらに、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体、例えば、膵前駆体は、任意の哺乳動物種からのものであってよく、非限定的な例には、ネズミ科、ウシ科、サル科、ブタ科、ウマ科、ヒツジ科、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ単純にするため、本明細書における方法の説明は哺乳動物の少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体に言及しているが、本明細書に記載した方法の全ては少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の他の細胞型に容易に適用できることを理解されたい。一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体はヒト個体から誘導される。

【0170】

幹細胞
[0188]本開示の実施形態は、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の産生のための幹細胞の使用に関する。本明細書で用いる用語「幹細胞」は、自己更新し、分化した細胞型を産生する能力を有する細胞（例えば植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を意味し得る（Morrisonら、(1997) Cell 88:287-298）。細胞発生学の文脈においては、形容詞「分化した」または「分化している」は相対的な用語である。「分化した細胞」は、それと比較している細胞よりも発生の経路をさらに下流に進行した細胞であり得る。したがって、多能性幹細胞は系統が制限された前駆細胞（例えば中胚葉幹細胞）に分化することができ、これは次にさらに制限された細胞（例えばニューロン前駆細胞）に分化することができ、これは最終段階の細胞（例えば最終分化細胞、例えばニューロン、心筋細胞等）に分化することができる。最終段階の細胞はある種の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持できることも保持できないこともある。幹細胞は特定のマーカー（例えばタンパク質、ＲＮＡ等）の存在および特定のマーカーの非存在によって特徴付けることができる。幹細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方の機能性アッセイ、特に多種の分化した子孫を生じる幹細胞の能力に関連するアッセイによっても同定することができる。一実施形態では、宿主細胞は成体幹細胞、体幹細胞、非胚幹細胞、胚幹細胞、造血幹細胞であり、多能性幹細胞、およびトロホブラスト幹細胞を含む。

【0171】

[0189]目的の幹細胞、例えば本明細書で提供する方法に使用できる幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含み得る。本明細書で用いる用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、生命体の全ての細胞型を生成することができる幹細胞を意味する。したがって、ＰＳＣは生命体の全ての胚葉の細胞（例えば脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）を生じることができる。多能性細胞は奇形腫を形成すること、および生命体の外胚葉、中胚葉、または内胚葉の組織に寄与することができる。植物の多能性幹細胞は植物の全ての細胞型（例えば根、茎、葉、その他の細胞）を生じることができる。

【0172】

[0190]本開示の実施形態は膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の産生のためのＰＳＣの使用に関する。動物のＰＳＣはいくつかの異なった方式で誘導することができる。例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）は胚の内部細胞集塊から誘導することができる（Thomsonら、Science. 1998 Nov. 6; 282(5391):1145-7）。一方、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は体細胞から誘導することができる（Takahashiら、Cell. 2007 Nov. 30; 131(5):861-72；Takahashiら、Nat Protoc. 2007; 2(12):3081-9；Yuら、Science. 2007 Dec. 21; 318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov. 20）。用語ＰＳＣはその起源に関わらず多能性幹細胞を意味することができるので、用語ＰＳＣは用語ＥＳＣおよびｉＰＳＣ、ならびにＰＳＣの別の例である用語、胎児胚幹細胞（ＥＧＳＣ）をも包含することができる。ＰＳＣは確立された細胞株の形態であってよく、これらは初代胚組織から直接得ることができ、または体細胞から誘導することもできる。

【0173】

[0191]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のためのＥＳＣの使用に関する。「胚幹細胞（ＥＳＣ）」は胚から、典型的には胚盤胞の内部細胞集塊から単離されたＰＳＣを意味し得る。ＥＳＣ株、例えばｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）がＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている。目的の幹細胞にはその他の霊長類からの胚幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞も含まれる。幹細胞は任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類等から得ることができる（Thomsonら、(1998) Science 282:1145；Thomsonら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844；Thomsonら、(1996) Biol. Reprod. 55:254；Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）。培養では、ＥＳＣは大きな核－細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長することができる。さらに、ＥＳＣはＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、およびアルカリホスファターゼを発現することができるが、ＳＳＥＡ－１は発現しない。ＥＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，９１３号、同第５，８４３，７８０号、および同第６，２００，８０６号に見出すことができる。未分化の形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、それぞれが全体として本明細書に組み込まれるＷＯ第９９／２０７４１号、ＷＯ第０１／５１６１６号、およびＷＯ第０３／０２０９２０号に記載されている。

【0174】

[0192]「胎児胚幹細胞（ＥＧＳＣ）または胎児胚細胞」または「ＥＧ細胞」は、胚細胞および／または胚細胞前駆細胞、例えば原初胚細胞、例えば精子および卵子になることができる胚細胞から誘導されたＰＳＣを意味し得る。胎児胚細胞（ＥＧ細胞）は上記の胎児幹細胞と同様の特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，１５３，６８４号；Matsui, Y.ら、(1992) Cell 70:841；Shamblott, M.ら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113；Shamblott, M.ら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726；およびKoshimizu, U.ら、(1996) Development, 122:1235に見出すことができる。

【0175】

[0193]本開示の実施形態は膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の産生のためのｉＰＳＣの使用に関する。「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、ＰＳＣでない細胞から（例えばＰＳＣに対して分化した細胞から）誘導されたＰＳＣを意味し得る。ｉＰＳＣは最終的に分化した細胞を含む多種の異なった細胞型から誘導することができる。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様の形態を有し、大きな核－細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長することができる。さらに、ｉＰＳＣは、それだけに限らないがアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含む当業者には公知の１つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現することができる。ｉＰＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００４７２６３号、同第２００９／００６８７４２号、同第２００９／０１９１１５９号、同第２００９／０２２７０３２号、同第２００９／０２４６８７５号、および同第２００９／０３０４６４６に見出すことができる。一般にｉＰＳＣを産生するためには、体細胞を再プログラミングして多能性幹細胞にする当技術で公知の再プログラミング因子（例えばＯｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、その他）を体細胞に提供する。

【0176】

[0194]本開示の実施形態は膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の産生のための体細胞の使用に関する。「体細胞」は実験的操作の非存在下では生命体内の全ての型の細胞を通常には生じない生命体内の任意の細胞を意味し得る。換言すれば、体細胞は十分に分化しており、したがって生体の３つ全ての胚葉の細胞、例えば外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞を天然には産生しない細胞であり得る。例えば、体細胞にはニューロンおよびニューロン前駆細胞が含まれ、ニューロン前駆細胞は中枢神経系の全てのまたはいくつかの細胞型を天然に生じることができるが、中胚葉または内胚葉の系統の細胞を生じることはできない。

【0177】

[0195]ある特定の例では、幹細胞は本明細書で開示した方法による少なくとも１つの分化因子または組成物に曝露される前には未分化（例えば特定の系統に関わっていない細胞）であってよく、一方、他の例では、本明細書に記載した少なくとも１つの分化因子または組成物に曝露する前に幹細胞を１つまたは複数の中間細胞型に分化することが望ましいことがある。例えば、幹細胞は未分化細胞の形態学的、生物学的、または物理的な特徴を呈することがあり、これらの特徴はこれらの細胞を胎児起源または成体起源の分化した細胞と区別するために用いることができる。一部の例では、未分化細胞は高い核／細胞質比および目立った核を有する細胞のコロニーにおいて微視的な二次元で現れ得る。幹細胞はそれ自体（例えば実質的に未分化細胞が何ら存在しない）であってよく、または分化細胞の存在下に使用してもよい。ある特定の例では、幹細胞は成長し、任意選択で分化し得るために、好適な栄養剤および任意選択で他の細胞の存在下で培養することができる。例えば、幹細胞の成長を補助するために、胎児線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が培養中に存在してもよい。線維芽細胞は幹細胞の成長の１つの段階の間に存在してよいが、必ずしも全ての段階に存在する必要はない。例えば、線維芽細胞は最初の培養段階で幹細胞の培養に添加し、１つまたは複数の引き続く培養段階では幹細胞の培養に添加しなくてもよい。

【0178】

[0196]本発明の全ての態様において使用する幹細胞は任意の種類の組織（例えば胎児もしくは前胎児の組織等の胚組織、または成体組織）から誘導される任意の細胞であってよく、これらの幹細胞は適切な条件下で種々の細胞型、例えば３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の全てまたは少なくとも１つの誘導体からなる子孫を生成する能力があるという特徴を有し得る。これらの細胞型は確立された細胞株の形態で提供することができ、または初代胚組織から直接得て、直ちに分化に使用することもできる。ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている細胞、例えばｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＦＩＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が含まれる。一部の実施形態では、成熟したインスリン陽性細胞への化学的に誘起された分化のために使用したヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源には、ヒト胚を破壊するステップは含まれていなかった。一部の実施形態では、成熟したインスリン陽性細胞への化学的に誘起された分化のために使用したヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源には、ヒト胚を破壊するステップは含まれていない。

【0179】

[0197]別の例では、幹細胞は固体組織を含む組織から単離することができる。一部の実施形態では、組織は皮膚、脂肪組織（例えばアジポーズ組織）、筋肉組織、心臓または心臓組織である。他の実施形態では、組織は例えばそれだけに限らないが臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨である。

【0180】

[0198]本明細書で提供する方法において使用され得る幹細胞には、Thomsonら、(1998) Science 282:1145によって記載されたヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞、アカゲザル幹細胞等の他の霊長類からの胚幹細胞（Thomsonら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844）、マーモセット幹細胞（Thomsonら、(1996) Biol. Reprod. 55:254）、およびヒト胎児胚（ｈＥＧ）細胞（Shambloftら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）によって例示される種々の型の胚細胞も含まれ得る。本明細書で提供する方法には、中胚葉幹細胞およびその他の早期心臓発生細胞等の系統に関与する幹細胞も適用可能である（Reyesら、(2001) Blood 98:2615-2625、EisenbergおよびBader、(1996) Circ Res. 78(2):205-16等を参照されたい）。幹細胞は任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類等から得ることができる。一部の実施形態では、ヒト胚は本明細書に開示した方法および組成物に使用する多能性細胞の供給源のために破壊されなかった。一部の実施形態では、ヒト胚は本明細書に開示した方法および組成物に使用する多能性細胞の供給源のために破壊されない。

【0181】

[0199]内皮、筋肉、および／またはニューロンの幹細胞の好適な供給源からの細胞の混合物を、本開示の目的のために哺乳動物のドナーから収穫することができる。好適な供給源は造血微小環境である。例えば、好ましくは固定化された（例えば動員された）循環末梢血を対象から取り出すことができる。一実施形態では、幹細胞は再プログラミングされた幹細胞、例えば体細胞または分化した細胞から誘導された幹細胞であってよい。そのような実施形態では、脱分化された幹細胞は、例えばそれだけに限らないが新生物細胞、腫瘍細胞、およびがん細胞、あるいは人工多能性幹細胞もしくはｉＰＳ細胞等の、誘導され再プログラミングされた細胞であってよい。

【0182】

[0200]一部の実施形態では、本明細書に記載した膵α、βおよび／またはδ細胞は、毛髪細胞、角化細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン形成細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜角化細胞、網膜ムラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア細胞（例えば乏突起樹状細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えばＩ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、ゴブレット細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、ゴブレット細胞、パネス細胞、腸細胞、マイクロフォールド細胞、肝細胞、肝星細胞、（例えば中胚葉からのクッパー細胞）、胆嚢細胞、房心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えばＰＰ細胞）、膵ε細胞、甲状腺（例えば濾胞性細胞）、副甲状腺（例えば副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋サテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハル介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞（stromal cells）、間質細胞（interstitial cells）、テロサイト単純上皮細胞、有足細胞、腎近位細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ペッグ細胞、胚葉細胞、精子、卵子、リンパ球、ミエロイド細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中血管芽細胞、周皮壁細胞、脾細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、ミクロファージ、白血球）、トロホブラスト幹細胞、またはそれらの任意の組合せのうち１つまたは複数から誘導することができる。

【0183】

再プログラミング
[0201]本明細書で用いる用語「再プログラミング」は、体細胞の分化状態を改変または逆行させるプロセスを意味し得る。細胞は再プログラミングの前に部分的にまたは最終的に分化させることができる。再プログラミングは体細胞の分化状態の多能性細胞への完全な逆行を包含し得る。そのような分化の完全な逆行は人工多能性（ｉＰＳ）細胞を生成し得る。本明細書で用いる再プログラミングは、細胞の分化状態の、例えば、多能性でも万能性でもないがそれが生じた元の分化した細胞の１つまたは複数の特定の特徴を失った細胞である万能性状態の細胞または体細胞への部分的な逆行、例えば分化した細胞の様々な体細胞型への直接的再プログラミングをも包含し得る。再プログラミングには、接合子が成体に成長する際の細胞の分化の間に起こる核酸の修飾（例えばメチル化）、クロマチンの縮合、エピジェネティクス、ゲノムの刷り込み等の遺伝可能なパターンの少なくともいくつかの改変、例えば逆行が含まれ得る。

【0184】

[0202]本明細書で用いる場合、用語「再プログラミング因子」は、細胞の「再プログラミング」、即ちそれによって細胞が異なった細胞型または表現型に変換される分化、および／または脱分化、および／または分化転換に関連する分子を意味し得る。再プログラミング因子は一般に、細胞の分化、脱分化、および／または分化転換に関連する遺伝子の発現に影響する。転写因子は再プログラミング因子の例である。

【0185】

[0203]本明細書で用いる用語「分化」およびその文法的等価物は、特殊性の低い細胞（例えばより高い細胞能力を有するより原始的な細胞）が特殊性の高い細胞型（例えばより低い細胞能力を有するより原始的でない細胞）になるプロセスを意味し、用語「脱分化」は、特殊性の高い細胞が特殊性の低い細胞型（例えばより高い細胞能力を有するより原始的な細胞）になるプロセスを意味し、用語「分化転換」は、特定の細胞型の細胞がその「細胞能力」または「原始性」のレベルを顕著に変化させずに別の細胞型に変換されるプロセスを意味し得る。理論に縛られることは望まないが、細胞がその「細胞能力」または「原始性」のレベルを顕著に変化させずに１つの系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型から別の系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型に変換された場合には、細胞は「分化転換」すると考えられる。

【0186】

[0204]本明細書で用いる場合、用語「細胞分化能」は、細胞が異なる系統の細胞に分化する能力を意味すると理解されたい。例えば、多能性細胞（例えば幹細胞）は、３つの胚葉、即ち内胚葉（胃の内部ライニング、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）のいずれの細胞にも分化する可能性を有し、したがって高い細胞分化能を有する。万能性細胞（例えば幹細胞またはある型の誘起された幹細胞）は多いが限られた数の系統（例えば造血幹細胞、心幹細胞、または神経幹細胞等）から細胞を生じる能力を有し、多能性細胞よりは比較的低い細胞分化能を有している。特定の系統に関与し、または最終的に分化した細胞は、さらに低い細胞分化能を有し得る。当技術で公知の分化転換の特定の例には、例えば線維芽ベータ細胞の、または膵外分泌細胞からベータ細胞への変換等が含まれる。

【0187】

[0205]したがって、細胞はより原始的な細胞に分化させることができ（例えば最終的に分化した細胞は万能性または多能性に分化することができ）、または細胞はより原始性の低い細胞に脱分化させることができる（例えば万能性または多能性の細胞は系統に関与する細胞または最終的に分化した細胞に分化することができる）。しかし、一実施形態では、細胞は例えば同様の細胞能力レベルで１つの細胞型（または表現型）から別の細胞型（または表現型）に変換または分化転換させることができる。したがって、本開示の一実施形態では、本開示の誘起するステップは、本開示の細胞を再プログラミングして、分化し、脱分化し、および／または分化転換することができる。本開示の一実施形態では、本開示の誘起するステップは、細胞を再プログラミングして分化転換することができる。

【0188】

[0206]１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド再プログラミング因子を使用し、例えば分化、脱分化、および／または分化転換することによって特定の型の細胞を再プログラミングまたは誘起して別の型の細胞にする方法は、当業者には公知である。そのような方法は、細胞の再プログラミングに関連する１つまたは複数の転写因子またはその他のポリペプチドをコードする遺伝材料の導入に依拠し得る。例えば、ＰＤＸ１、Ｎｇｎ３およびＭａｆＡ、またはそれらの機能的断片は全て、本開示の細胞の細胞分化、脱分化、および／または分化転換を誘起することができるペプチドをコードしていることが知られている公知である。当業者に公知のいくつかの方法では、再プログラミング遺伝子（上記の遺伝子等）によってコードされる外因性ポリペプチド（例えば組換えポリペプチド）が細胞と接触して、例えば本開示の細胞を誘起する。当業者であれば、他の遺伝子も細胞の再プログラミングに関連し、そのような遺伝子をコードする外因性分子（またはその機能性断片）およびコードされたポリペプチドもポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子（例えば、続いて細胞の再プログラミングに関連する別の遺伝子の発現レベルに影響するポリヌクレオチドまたはポリペプチド）であると考えられることが認識される。例えば、ｐ５３の不活性化を低減させる外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのエピジェネティック遺伝子サイレンサーの導入によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘起する効率が上昇することが示されている。したがって、エピジェネティックサイレンサーをコードする外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに細胞の再プログラミングまたは細胞のプログラミング効率の上昇に直接または間接に関与すると思われるその他の遺伝子またはタンパク質は、外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子を構成すると考えられる。当業者であれば、細胞の再プログラミングの阻害に関与する遺伝子の発現をノックダウンすることができるＲＮＡｉ分子（またはＲＮＡｉ分子をコードする遺伝子材料）の導入等の、細胞の再プログラミングに影響する他の方法が存在することが認識される。したがって、細胞の再プログラミングに関連し、または細胞の再プログラミングを促進する任意の外因性のポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子は、本明細書に記載した外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子であると理解されたい。

【0189】

[0207]本開示の一部の実施形態では、本方法には小分子でない再プログラミング因子の使用は含まれない。しかし、本方法では培地、血清、血清代替物、補助剤、抗生剤、その他、例えばＲＰＭＩ、腎上皮基本培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｆ１２、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ．ＴＭ－１（ジペプチド、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミン）、Ｂ２７、ヘパリン、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、セレン、エタノールアミン、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ノルマシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシン等の「日常的」な組織培養成分を利用できることが認識される。これらの典型的な組織培養成分（および組織培養で日常的に使用されるその他の同様の組織培養成分）は、本開示の目的のための小分子の再プログラミング分子ではない。これらの成分は本明細書で定義する小分子でも、本明細書で定義する再プログラミング因子でもない。

【0190】

[0208]したがって、一実施形態では、本開示は、細胞を１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子とともに培養するステップを含まない。したがって、一実施形態では、本開示の方法は、誘起されたα、βおよび／またはδ細胞を産生すること、またはそうでなければ本開示の細胞を誘起して分化させ、脱分化させ、および／または分化転換させることに関与する、例えばトランスポゾン、ウイルストランスジェニックベクター（レトロウイルスベクター等）、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、またはこれらの分子のいずれかの断片を導入することによる、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子の導入を含まない。

【0191】

[0209]即ち、一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子の非存在下で実施される。したがって、一実施形態では、本開示の方法では、ポリペプチド転写因子、分化、脱分化、および／または分化転換の誘起に特異的に関連するその他のポリペプチド因子、ポリペプチド転写因子をコードするポリヌクレオチド配列、分化、脱分化、および／または分化転換の誘起に特異的に関連するその他のポリペプチド因子をコードするポリヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ならびにそれらの断片を添加せずに、小分子（例えばＨＤＡＣ阻害剤）を利用して細胞を再プログラミングすることを理解されたい。
幹細胞から誘導されたβ細胞を産生する方法
[0210]ＳＣ－β細胞（例えば、非天然の膵β細胞）を産生する方法が本明細書で提供される。幹細胞から内分泌細胞を産生して少なくとも１個のＳＣ－β細胞を提供する詳細なプロトコールは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および同第２０１５／０２１８５２２号に記載されている。

【0192】

[0211]内胚葉は消化管および呼吸管、甲状腺、肝臓、ならびに膵を生じることができる。内胚葉系統の代表的な疾患としてはインスリンを生成するβ細胞の破壊に起因する１型糖尿病がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの機能性β細胞の産生は、１型糖尿病の置換細胞療法のための実際的で更新可能な細胞源になり得る。芽球段階の胚の内部細胞集塊から産生される胚幹（ＥＳ）細胞は、損傷された任意の細胞の移植または細胞に基づく療法のための有望な細胞源を表している。これらは培地中に維持され、それ自体で更新され、未分化ＥＳ細胞として無限に増殖することができる。ＥＳ細胞は外胚葉、中胚葉、および内胚葉の系統細胞または組織として、生体の全ての細胞型に分化することができる。ＥＳ細胞の主な利点は培地中での安定な自己更新および分化の可能性である。

【0193】

[0212]胚体内胚葉は胚発生の原腸形成のプロセスによってｉｎ ｖｉｖｏで内部細胞集塊から産生され、このプロセスで胚盤葉上層細胞が３つの胚葉を形成するように指令される。胚体内胚葉は膵β細胞、肝臓の肝細胞、肺の肺胞細胞、甲状腺、胸腺、ならびに栄養管および呼吸管の上皮ライニング等の生命臓器に寄与する多様な細胞および組織を生じることができる。これは、臓側および壁側内胚葉を生じることができる胚体外組織の原始内胚葉とは異なる。ＥＳ細胞から誘導された胚体内胚葉は、理論的には任意の内胚葉誘導体になることができ、ＥＳ細胞を内胚葉系統に導くことは治療用の内胚葉誘導体を産生させるための必須要件である。

【0194】

[0213]胚体内胚葉の前後軸の正確なパターニングによって、最終的には原腸管が形成され得る。胚体内胚葉によって誘導された原腸管は、前後軸に沿って咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、および大腸、ならびに膵、肺、甲状腺、胸腺、副甲状腺、および肝臓等の関連する臓器を誘起する。原腸管の前腸の前部は肺、甲状腺、食道、および胃になる。膵、肝臓、および十二指腸は、前腸の後部から起源する。原腸管の中腸および後腸は小腸および大腸を生じる。前腸の前部は発生マーカー、ＮＫ２ホメオボックス（ＮＫＸ２－１）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－ボックス２（ＳＯＸ２）を発現し、前腸の後部は造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、膵および十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）、ワンカットホメオボックス１（ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＦ６として公知である）、および肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）を発現し、中腸／後腸は尾型ホメオボックス１（ＣＤＸ１）、尾型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、ならびに運動ニューロンおよび膵のホメオボックス１（ＭＮＸ１）（３、１９、２０）を発現する。

【0195】

[0214]膵β細胞の分化の成功には、分化した細胞が生理学的に適切な量のインスリンを合成し分泌することが必要である。ｈＰＳＣ細胞分化を指向する例示的な段階的プロトコールが開発され、正常な膵内分泌発生の主要段階を反復する分化プロセスを伴う（例えば、実施例１のバージョンＡプロトコール）。ｈＰＳＣ細胞のホルモン発現膵内分泌細胞への分化は、ｈＰＳＣ細胞を、胚の発生、中内胚葉および胚体内胚葉への分化、原腸内胚葉の確立、前腸後部のパターニング、ならびに膵内胚葉および内分泌前駆体の特定化および成熟からなる主要な段階に通過させることによって行われる。これらの段階を通じて、ｈＰＳＣ細胞は膵内分泌表現型およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグルコース応答インスリン分泌の能力を得ることができる。

【0196】

[0215]一般に、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体、例えば本明細書に開示した方法によって生成した膵前駆細胞は、様々な細胞の混合物または組合せ、例えばＰＤＸ１陽性膵前駆細胞、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６－１を共発現する膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞）、ならびに／またはその他の多能性細胞もしくは幹細胞を含み得る。

【0197】

[0216]少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階に分化する任意の好適な培養プロトコールに従って生成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、少なくとも１個の多能性細胞を少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体に分化するために適した時間および条件下で少なくとも１個の多能性細胞を培養することによって生成される。

【0198】

[0217]一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は、実質的に純粋な膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団である。一部の実施形態では、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は多能性細胞または分化した細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の集団は実質的に胚幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を含まないか、それらを欠いている。

【0199】

[0218]一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は、対象から例えば組織生検、例えば皮膚生検として単離することができ、本明細書に記載した組成物および方法における使用のための少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体を生成するためのさらなる分化のための人工多能性幹細胞に再プログラミングすることができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によって膵α、βおよび／またはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0200】

[0219]一部の実施形態では、少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によって膵α、βおよび／もしくはδ細胞に変換される前に増加させられる。

【0201】

[0220]さらに、少なくとも１つの膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体、例えば、膵前駆体は、任意の哺乳動物種からのものであってもよく、非限定的な例には、ネズミ科、ウシ科、サル科、ブタ科、ウマ科、ヒツジ科、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ単純にするため、本明細書における方法の説明は哺乳動物の少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体に言及しているが、本明細書に記載した方法の全ては少なくとも１個の膵α、βおよび／もしくはδ細胞またはその前駆体の他の細胞型に容易に適用できることを理解されたい。一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ－β細胞またはその前駆体はヒト個体から誘導される。

【0202】

胚体内胚葉細胞
[0221]本開示の態様には胚体内胚葉細胞が含まれる。本明細書において使用する胚体内胚葉細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは内胚葉細胞に分化される。一部の態様では、内胚葉細胞（ステージ１）は、例えば原腸管細胞（ステージ２）、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞（ステージ３）、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞（ステージ４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（ステージ５）にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞（ステージ６）に誘起されまたは成熟する。

【0203】

[0222]一部の例では、胚体内胚葉細胞は、集団中の少なくともいくつかの多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることによって、例えば多能性細胞の集団をｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子およびｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させて多能性細胞の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。

【0204】

[0223]多能性幹細胞を（例えば単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。多能性幹細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができる任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、本明細書で提供する方法において使用することができる。一部の例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤はＣＨＩＲ９９Ｑ２１を含む。一部の例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤はＷｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。

【0205】

[0224]一部の例では、集団中の少なくともいくつかの多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化するステップは、多能性細胞の集団をｉ）アクチビンＡ、およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と好適な期間、例えば約２日、約３日、約４日、または約５日、接触させて集団中の多能性細胞の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を誘起するプロセスによって達成され、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。

【0206】

[0225]一部の例では、本方法は、多能性細胞の集団を好適な濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させることによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。

【0207】

[0226]一部の例では、本方法は、多能性細胞の集団を好適な濃度、例えば約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、または約２００μＭのＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させることによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。

【0208】

[0227]一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｎｏｄａｌ、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｄｎ５、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、少なくとも１つのマーカーの発現は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して、胚体内胚葉細胞において統計学的に有意な量で上方制御される。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、およびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｚｉｃ１、Ｐａｘ６、Ｆｌｋ１、およびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対してより高いレベルのＳｍａｄ２のホスホリル化を統計的に有意な量で有する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腸管を形成する能力を有する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞に分化することができ、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞はＦｏｘＡ２および／またはＣｌａｕｄｉｎ６を発現する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、内胚葉起源の細胞にさらに分化することができる。

【0209】

[0228]一部の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも、または分化の第１段階の間に、少なくとも１つのβ細胞分化因子の存在下に培養される。任意の多能性幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞もしくはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じた任意の多能性幹細胞もしくはその他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部の例では、本明細書に記載したβ細胞分化因子は多能性幹細胞の集団の培地中に存在してよく、または多能性幹細胞の集団の成長（例えば複製または増加）の間に一度にまたは定期的に添加してよい。ある特定の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。他の例では、多能性幹細胞の集団は、分化の第１段階の間に少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。

【0210】

原腸管細胞
[0229]本開示の態様には原腸管細胞が含まれる。本明細書において使用する原腸管細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、胚体内胚葉細胞は原腸管細胞に分化される。一部の態様では、原腸管細胞は、例えばＰＤＸ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘起されまたは成熟する。

【0211】

[0230]一部の例では、原腸管細胞は、集団中の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させることによって、例えば胚体内胚葉細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させて胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかの原腸管細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、原腸管細胞は原腸管細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。

【0212】

[0231]胚体内胚葉細胞を（例えば単独で、または他の因子と組み合わせて）誘起して原腸管細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ８Ｂを含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ１０を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２１を含む。

【0213】

[0232]一部の例では、原腸管細胞は、集団中の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させることによって、例えば胚体内胚葉細胞をある期間、例えば約１日、約２日、約３日、または約４日、ＫＧＦと接触させて胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかの原腸管細胞への分化を誘起することによって、得ることができる。

【0214】

[0233]一部の例では、本方法は、胚体内胚葉細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの好適な濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させることによって胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。一部の例では、本方法は胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。

【0215】

ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞
[0234]本開示の態様にはＰＤＸ１陽性膵前駆細胞が含まれる。本明細書において使用するＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、原腸管細胞はＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化される。一部の態様では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は、例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘起されまたは成熟する。

【0216】

[0235]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤；ｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるよう誘導することによって得ることができ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0217】

[0236]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0218】

[0237]一部の例では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0219】

[0238]一部の例では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤；およびｉｉｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させることによって得ることができ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0220】

[0239]一部の例では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させ、原腸管細胞の少なくとも一部のＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞へ分化を誘導することによって得ることができ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１を発現する。

【0221】

[0240]原腸管細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、約３．２５μＭ、約３．５μＭ、約３．７５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ－１）と接触させるステップを含む。

【0222】

[0241]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の例では、ＴＧＦ－βファミリーからの成長因子はアクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２７ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約２９ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。

【0223】

[0242]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｍ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップを含む。

【0224】

[0243]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。

【0225】

[0244]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0226】

[0245]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＰＫＣ活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＰｄＢＵを含む。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＰＢを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、約１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約１００μＭ、約１２０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１７５μＭ、約１８０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２４０μＭ、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２８０μＭ、約３００μＭ、約３２０μＭ、約３４０μＭ、約３６０μＭ、約３８０μＭ、約４００μＭ、約４２０μＭ、約４４０μＭ、約４６０μＭ、約４８０μＭ、約５００μＭ、約５２０μＭ、約５４０μＭ、約５６０μＭ、約５８０μＭ、約６００μＭ、約６２０μＭ、約６４０μＭ、約６６０μＭ、約６８０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、原腸管細胞を、例えば、１０ｎＭ～１ｍＭ、１０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～１μＭ、１０～８００ｎＭ、１００～９００ｎＭ、３００～８００ｎＭ、３００～６００ｎＭ、４００～６００ｎＭ、４５０～５５０ｎＭ、または約５００ｎＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄＢＵまたはＴＰＰＢ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、原腸管細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰＤＢＵ）で処理されない。

【0227】

[0246]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＰＤＸ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。

【0228】

[0247]一部の例では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞をレチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと、好適な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、または約４日、接触させることによって、得ることができる。一部の例では、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原腸管細胞をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させることによって、例えば、原腸管細胞をレチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＤＭＨ－１、ＰｄＢＵ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと約２日接触させることによって、得ることができる。

【0229】

ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞
[0248]本開示の態様にはＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞が含まれる。本明細書において使用するＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化される。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、例えばＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ－β細胞に誘起されまたは成熟する。

【0230】

[0249]一部の態様では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞からＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を生成する方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば細胞のクラスター化を促進しおよび／または細胞の生存を促進する条件下で）ａ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択でｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞分化因子と接触させて集団中の少なくとも１個のＰＤＸ１陽性膵前駆細胞のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘起するステップを含み、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１を発現する。

【0231】

[0250]一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させてＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞への分化を誘起するステップによって得られ、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞はＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現する。

【0232】

[0251]一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させてＰＤＸ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかのＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞への分化を誘起することによって得られる。一部の実施形態では、接触の３、４、または５日後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させることによって得られ、次に、細胞は、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｖｉ）ＰＫＣ活性化剤、ならびに任意選択でガンマセクレターゼ阻害剤と接触される。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下でＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させることによって得られる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの成長因子はＫＧＦである。

【0233】

[0252]一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は多能性細胞の集団から生成される。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はｉＰＳ細胞の集団から生成される。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はＥＳＣ細胞の集団から生成される。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は胚体内胚葉細胞の集団から生成される。一部の例では、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は原腸管細胞の集団から生成される。

【0234】

[0253]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子、および少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップを含む。

【0235】

[0254]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。

【0236】

[0255]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0237】

[0256]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、または１４－１１５２を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。

【0238】

[0257]ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの任意の活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの活性化剤はアクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２ｎｇ／ｍＬ、約１．４ｎｇ／ｍＬ、約１．６ｎｇ／ｍＬ、約１．８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２ｎｇ／ｍＬ、約２．４ｎｇ／ｍＬ、約２．６ｎｇ／ｍＬ、約２．８ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．２ｎｇ／ｍＬ、約３．４ｎｇ／ｍＬ、約３．６ｎｇ／ｍＬ、約３．８ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．２ｎｇ／ｍＬ、約４．４ｎｇ／ｍＬ、約４．６ｎｇ／ｍＬ、約４．８ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約５．２ｎｇ／ｍＬ、約５．４ｎｇ／ｍＬ、約５．６ｎｇ／ｍＬ、約５．８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６．２ｎｇ／ｍＬ、約６．４ｎｇ／ｍＬ、約６．６ｎｇ／ｍＬ、約６．８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を例えば約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。

【0239】

[0258]一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡと５日または６日間接触させることによって得られる。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと５日または６日間接触させることによって得られる。一部の例では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦと５日間接触させることによって得られる。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、ａ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞をＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと３、４または５日間接触させ、続いてｂ）ａ）の細胞をＰＤＢＵ、ＸＸＩ、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、チアゾビビン、およびアクチビンＡと１、２または３日間接触させることによって得られる。

【0240】

インスリン陽性の内分泌細胞
[0259]本開示の態様にはインスリン陽性内分泌細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞）。本明細書において使用するインスリン陽性内分泌細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞はインスリン陽性内分泌細胞(例えば、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性細胞、またはβ様細胞)に分化される。一部の態様では、インスリン陽性内分泌細胞は、例えばＳＣ－β細胞への誘起または成熟によってさらに分化される。

【0241】

[0260]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を生成する方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば細胞のクラスター化を促進する条件下で）ａ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、およびｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、集団中の少なくとも１個のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞はＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、および／またはインスリンを発現する。

【0242】

[0261]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えば甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ－βＩ型受容体キナーゼシグナル伝達を含む。一部の例では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。

【0243】

[0262]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えばＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はトリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ－１を含む。

【0244】

[0263]一部の例では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を、少なくとも１つの追加の因子と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、またはｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞集団（例えば、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）を、少なくとも１つの追加の因子と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、またはｖｉｉ）ＰＫＣ活性化剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。

【0245】

[0264]一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。

【0246】

[0265]一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つと接触させるステップを含む。

【0247】

[0266]一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を生成する方法において、分化因子のいくつかは分化のステップの間、最初の１日、２日、３日、４日、または５日間のみ存在する。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、およびＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子などの分化因子のいくつかは、インキュベーションの最初の１、２、または３日後に培地から除去される。

【0248】

[0267]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のγ－セクレターゼ阻害剤を使用することができる。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。一部の例では、γ－セクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約２．９μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．２μＭ、約５．４μＭ、約５．６μＭ、約５．８μＭ、約６μＭ、約６．２μＭ、約６．４μＭ、約６．６μＭ、約６．８μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、または約５０μＭの濃度のγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＸＸＩ）と接触させるステップを含む。

【0249】

[0268]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができるＥＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はベータセルリンを含む。一部の例では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＥＧＦを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦファミリーからの成長因子（例えばベータセルリン）と接触させるステップを含む。

【0250】

[0269]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はＲＡを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。

【0251】

[0270]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例ではＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。

【0252】

[0271]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ－１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１１８９）と接触させるステップを含む。

【0253】

[0272]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ－１１５２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ－２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。

【0254】

[0273]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のエピジェネティック修飾化合物を使用することができる。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばＤＺＮｅｐを含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤、例えばＫＤ５１７０を含む。一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のエピジェネティック修飾化合物（例えばＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）と接触させるステップを含む。

【0255】

[0274]一部の例では、細胞の集団は任意選択でプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。一部の例では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられない。一部の例では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のプロテインキナーゼ阻害剤を使用することができる。一部の例では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む。

【0256】

[0275]一部の例では、本方法は、細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ－１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、およびベータセルリンと７日間接触させて集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の例では、本方法は、細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ－１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、ベータセルリン、およびＬＤＮ１９３１８９と７日間接触させて集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分化因子がステージ５の一部で、例えばステージ５の期間の最初の１日、２日、３日、４日、５日、または６日にのみ、またはステージの期間の最後の１日、２日、３日、４日、５日、または６日に、添加される。１つの例では、細胞はＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の２日、３日、４日または５日にのみ接触させられ、その後、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は培地から除去される。別の例では、細胞はＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の１日、２日、または３日にのみ接触させられ、その後、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は培地から除去される。

【0257】

[0276]一部の例では、本方法は細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＢＥ５培地中で培養して集団中の少なくとも１個のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。

【0258】

[0277]本開示の態様は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤で処理することを伴い、本明細書で開示される方法に従って産生された膵内分泌細胞の細胞集団において、膵α細胞のパーセンテージの増加、膵δ細胞のパーセンテージの増加、膵β細胞のパーセンテージの増加、ＥＣ細胞のパーセンテージの減少、またはそれらの任意の組合せをもたらすことができる。

【0259】

[0278]一部の例では、本方法は、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤を含む第１の組成物と１～２日間接触させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を得るステップと、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、およびエピジェネティック修飾化合物を含む第２の組成物と１～２日間接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む第２の形質転換細胞集団を得るステップを含む。

【0260】

[0279]一部の例では、本方法は、（１）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と約２～６日間接触させ、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化を誘導するステップと、（２）（１）の後に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む集団を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｖ）ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｖｉ）ＰＫＣ活性化剤と１～２日間接触させ、それによりＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を産生するステップとを含む。

【0261】

[0280]一部の例では、本方法は、（３）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む第１の形質転換細胞集団を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｘ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｘｉ）ＰＫＣ活性化剤と１～２日間接触させ、それにより第２の形質転換細胞集団を産生するステップと、（４）第２の形質転換細胞集団を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させ、それによりＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を産生するステップとをさらに含む。

【0262】

膵β細胞
[0281]本開示の態様は膵β細胞（例えば非天然膵β細胞）を産生するステップを含む。非天然膵β細胞は、一部の例では、形態および機能において内因性成熟β細胞と類似しているが、それにも関わらず天然β細胞とは区別される。

【0263】

[0282]一部の例では、本明細書で提供する方法を用いて産生されたインスリン陽性膵内分泌細胞は、単独で、または他の型の細胞、例えばその前駆体、例えば幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞、もしくはＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞とともに、細胞クラスターを形成することができる。

【0264】

[0283]一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞または細胞集団のいずれかは、細胞クラスター内にある。一部の態様では、内因性の膵島の機能および特徴に類似する細胞クラスターが本明細書で提供される。このような細胞クラスターは、代謝、例えば、対象におけるグルコース代謝の調節における内因性の膵島の機能を模倣することができる。したがって、細胞クラスターは、不十分な膵島機能、例えば、糖尿病に起因する疾患を処置するために対象に移植することができる。用語「クラスター」および「凝集体」は、相互交換可能に使用することができ、密接な細胞間接触を有する細胞群を指し、一部の例では、クラスター内の細胞を互いに接着させることができる。細胞クラスターは、複数の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも２５００個、少なくとも３０００個、少なくとも３５００個、少なくとも４０００個、少なくとも４５００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも３０，０００個、または少なくとも５０，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、１０～１０，０００個の細胞、５０～１０，０００個、１００～１０，０００個、１００～１０，０００個、１，０００～１０，０００個、５００～１０，０００個、５００～５，０００個、５００～２，５００個、５００～２，０００個、１，０００～１００，０００個、１，０００～５０，０００個、１，０００～４０，０００個、１，０００～２０，０００個、１，０００～１０，０００個、１，０００～５，０００個、および１，０００～３，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも５００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも１，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも２，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも５，０００個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、１００，０００個以下、９０，０００個以下、８０，０００個以下、７０，０００個以下、６０，０００個以下、５０，０００個以下、４０，０００個以下、３０，０００個以下、２０，０００個以下、１０，０００個以下、７，０００個以下、５，０００個以下、３，０００個以下、２，０００個以下または１，０００個以下の細胞を含む。

【0265】

[0284]細胞クラスターは、内因性の膵島に類似したサイズであり得る。例えば、細胞クラスターは、内因性の膵島に類似した直径を有することができる。細胞クラスターの直径は、細胞クラスターの表面上の２つの点の間の最大直線距離を指すことができる。一部の例では、細胞クラスターの直径は、多くとも３００μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、または４０μｍである。細胞クラスターの直径は、約７５μｍ～約２５０μｍであり得る。細胞クラスターの直径は、多くとも１００μｍであり得る。

【0266】

[0285]一部の実施形態では、細胞クラスターは、約１００～約２５０ミクロンの直径（例えば、約１２５、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２００、約２１０、約２１５、約２２０、または約２２５ミクロンの直径）である。例えば、一部の実施形態では、細胞クラスターは、約１２５～約２２５、約１３０～約１６０、約１７０～約２２５、約１４０～約２００、約１４０～約１７０、約１６０～約２２０、約１７０～約２１５、または約１７０～約２００ミクロンの直径である。

【0267】

[0286]一部の実施形態では、本開示の組成物、細胞または細胞集団は、少なくとも１つの遺伝子配列においてゲノム破壊を有する細胞を含む。一部の実施形態では、ゲノム破壊は、前記遺伝子配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子をコードする。一部の実施形態では、ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列はＣＩＩＴＡをコードする。例えば、一部の実施形態では、組成物または細胞集団は、ベータ－２－ミクログロブリン遺伝子におけるゲノム破壊を有する。遺伝子およびそのゲノム破壊の追加の例は、関連する内容が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０２０／０３３８７９号においてさらに詳細に記載される。一部の実施形態では、ゲノム破壊は、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ）を用いて誘導される。

【0268】

[0287]一部の実施形態では、本開示の組成物または細胞集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞よりも低いレベルのＭＡＦＡを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、組成物または細胞集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞よりも高いレベルのＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、組成物または細胞集団は、健康な対照である成人対象の膵臓由来のＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞よりも高いレベルのＳＩＸ２、ＨＯＰＸ、ＩＡＰＰおよび／またはＵＣＮ３を発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞を含む。

【0269】

[0288]一部の実施形態では、本開示の組成物または細胞集団は、ＭＡＦＡを発現しないＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、組成物または細胞集団は、ＭＡＦＢを発現するＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ陽性細胞を含む。

【0270】

[0289]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団は、いかなる外因性分化因子（例えばＴＧＦ－βシグナル伝達経路の阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－βスーパーファミリー、ＦＧＦファミリー、もしくはＥＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤）の添加もなしに、ＳＣ－β細胞に成熟するように直接誘起することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を、血清アルブミンタンパク質、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および／またはエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団をヒト血清アルブミンタンパク質と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団をＰＫＣ活性化剤と接触させるステップを含む。

【0271】

[0290]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞を分化因子と接触させることによって、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団を誘起してＳＣ－β細胞に成熟させることができる。分化因子は、本明細書に記載したＴＧＦ－βシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤および甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含み得る。一部の例では、ＳＣ－β細胞はインスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団をＡｌｋ５ｉおよびＴ３もしくはＧＣ－１と接触させることによって得ることができる。

【0272】

[0291]一部の例では、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性、ＩＳＬ１陽性の内分泌細胞を含む細胞集団を、（ｉ）ＦＧＦファミリーからの成長因子、（ｉｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、（ｉｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｉｖ）エピジェネティック修飾化合物、（ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、（ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、（ｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、および（ｖｉｉｉ）リパーゼ阻害剤と約１、２、５日間接触させるステップを含む。一部の例では、接触は約３日間である。

【0273】

[0292]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞はＮＳ－ＧＦｓ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞は１０％ＦＢＳを補ったＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞は１％ＨＳＡを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で成熟させることができる。他の例では、ＳＣ－β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団を、２％ＢＳＡを補ってもよいＭＣＤＢ１３１培地中で培養することによって得ることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ－β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、本明細書に記載した小分子の因子を含まなくてよい。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ－β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、血清（例えばＦＢＳ）を含まなくてよい。他の例では、ＳＣ－β細胞は、０．０５％ＨＳＡおよびビタミンＣを補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中でインスリン陽性の内分泌細胞を含有する細胞集団を培養することによって得ることができる。一部の例では、ＳＣ－β細胞は、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣおよびグルタミン（Ｇｌｎ、例えば、４ｍＭ）を補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中でインスリン陽性の内分泌細胞を含有する細胞集団を培養することによって得ることができる。一部の例では、Ｓ６の間に培地の種類を変更することができる。例えば、Ｓ６細胞を、最初の２～４日間、０．０５％ＨＳＡおよびビタミンＣを補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中で培養し、次に、１％ＨＳＡを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養する。一部の例では、追加の因子が培地に導入される。例えば、Ｓ６細胞は、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣ、およびグルタミン（Ｇｌｎ、例えば、４ｍＭ）を補充することができるＭＣＤＢ１３１培地中で、１０～１２日間培養することができ、その間、Ｓ６の第４日からＺｎＳＯ_４が導入される。

【0274】

[0293]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ－セクレターゼ阻害剤、任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、および任意選択でｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補足したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ＳＣ－β細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈す方法を提供する。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。

【0275】

[0294]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖｉｉ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子と２日間接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ－セクレターゼ阻害剤、および任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、および任意選択でｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補足したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ＳＣ－β細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈す方法を提供する。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。

【0276】

[0295]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ－セクレターゼ阻害剤、および任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補足したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ＳＣ－β細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈す方法を提供する。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。

【0277】

[0296]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５または６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と５～７日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補足したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ＳＣ－β細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈す方法を提供する。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。

【0278】

[0297]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間または６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｉｉｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｖ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｖｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と５～７日間接触させ、５～７日間の最初の３日以内に、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、後でＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞から除かれるＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路、およびＥＧＦファミリーマートからの少なくとも１つの成長因子と接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、外因性分化因子を含まない培地（例えば、ＮＳ－ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補足したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７～１４日間培養し、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部の、ＳＣ－β細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含み、ＳＣ－β細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈す方法を提供する。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。

【0279】

[0298]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ－β細胞を産生する方法であって、本方法は、ａ）多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって、集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと、ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップと、ｃ）原腸管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって、原腸管細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｄ）ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と３または４日間接触させ、続いてｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子、およびｖｉ）ＰＫＣ活性化剤、および任意選択でｖｉｉ）ガンマセクレターゼ阻害剤と１～２日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップと、ｅ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｘ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｘｉ）ＰＫＣ活性化剤と１～２日間接触させ、続いてｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ－セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えば、ＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と３～６日間接触させるプロセスによって、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部をＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップと、ｆ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ－β細胞に分化させるステップとを含む方法を提供する。

【0280】

[0299]第１の細胞クラスターから分離された細胞を培養するために使用された培地は、ゼノフリーであり得る。動物を起源とする細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物由来の生成物を有することができない。一部の事例では、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いずれの非ヒト動物由来の生成物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。例えば、培地は、約１％～約２０％、約５％～約１５％、約８％～約１２％、約９～約１１％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、約１０％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、小分子および／またはＦＢＳを含むことができない。例えば、培地は、２％のＢＳＡを補充したＭＣＤＢ１３１基礎培地を含むことができる。一部の事例では、培地は、血清を含まない。一部の例では、培地は、外因性小分子またはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ２１）からの成長因子、ソニックヘッジホッグアンタゴニスト（例えば、Ｓａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、またはこれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、またはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４－１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤（例えば、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２－ミリステート １３－アセテート、ブリオスタチン１、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦβスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２）、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＳＢ－５０５１２４、またはこれらの誘導体）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９またはこれらの誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３、ＧＣ－１またはこれらの誘導体）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の活性化剤（例えば、ＷＮＴ３ａまたはアクチビンＡ） 上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子（例えば、ベータセルリンまたはＥＧＦ）、広範囲のキナーゼ（例えば、スタウロスポリンまたはその誘導体）、非必須アミノ酸、ビタミンまたは酸化防止剤（例えば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、またはこれらの誘導体）、あるいはＮ－アセチルシステイン、硫酸亜鉛、またはヘパリンのような他の添加物を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部の事例では、再凝集培地は、他の細胞外マトリックス分子または材料、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、または、例えば、溶解された細胞膜調製物を含まない。

【0281】

[0300]当業者であれば、培地中に補充される血清アルブミンの濃度が変化し得ることを認識するであろう。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＢＳＡを含むことができる。他の事例では、培地は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＨＳＡを含むことができる。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、伝統的な基礎培地に見られない構成成分、例えば、微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、ならびに高レベルの一部のアミノ酸およびビタミンを含有することができる。これらの添加物によって、非常に低いレベルの血清または規定された構成成分が補充される培地を可能とすることができる。培地は、タンパク質および／または成長因子を含まなくてもよく、かつＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、および／またはグルタミンが補充されてもよい。培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含んでもよい。培地において使用される非限定的な例示的細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、バイグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部の事例では、培地は、ラミニン、例えば、ＬＮ－３３２を含む。一部の事例では、培地は、ヘパリンを含む。

【0282】

[0301]培地は、例えば、培地中の細胞に最適な環境を与えるために、培養中に周期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから分離された細胞を培養する場合、培地は、少なくともまたは約４時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎、３日毎もしくは４日毎に交換することができる。例えば、培地は、約４８時間毎に交換することができる。

【0283】

[0302]一部の事例では、細胞は、動的条件下（例えば、細胞が、懸濁培養下にある間、一定の動きまたは撹拌に供される条件下）で培養することができる。細胞を動的培養するために、細胞は、制御ユニットに接続され、よって、制御された培養系を提供することができる容器（例えば、スピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ～３０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌの；１００ｍｌの；または１２５ｍｌのエルレンマイヤー中の）などの非接着性容器）中で培養することができる。一部の事例では、細胞は、それらの増殖能力を維持しながら、非動的条件（例えば、静的培養）下で培養することができる。細胞を非動的培養するために、細胞は、接着性培養ベッセル中で培養することができる。接着性培養ベッセルは、ベッセル表面の細胞への接着性を改良するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基質のいずれかでコーティングされてもよい。細胞接着のための基質は、（使用される場合）幹細胞またはフィーダー細胞を付着させることを意図する任意の材料であり得る。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解された細胞膜調製物が挙げられる。

【0284】

[0303]動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）中の培地は、撹拌され得る（例えば、スターラーによって）。スピン速度は、再凝集される第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似することができるように制御され得る。一部の事例では、スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが、約７５μｍ～約２５０μｍとなり得るように制御される。動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）のスピン速度は、１分当たり約２０回転（ｒｐｍ）～約１００ｒｐｍ、例えば、約３０ｒｐｍ～約９０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ～約５０ｒｐｍであり得る。一部の事例では、スピン速度は、約５０ｒｐｍであり得る。

【0285】

[0304]本明細書において提供されるステージ６の細胞は、本明細書に記載されているように、分離および再凝集プロセスに供されても供されなくてもよい。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞クラスターは再凝集され得る。細胞クラスターの再凝集により、インスリン陽性内分泌細胞を濃縮することができる。一部の事例では、細胞クラスター中のインスリン陽性内分泌細胞は、膵β細胞へとさらに成熟され得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、天然の膵島に似た、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈し得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈する非天然膵β細胞を含み得る。一部の実施形態では、再凝集プロセスは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４３１７９の開示に従って実施され得る。

【0286】

[0305]本明細書において提供される方法に従って得られるステージ６の細胞は、凍結保存および再凝集手順の後に、高い回収率を有することができる。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、このような処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ－１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ５の後の凍結保存後に、少なくとも約３５％、３７．５％、４０％、４２．５％、４５％、４７．５％、４８％、４９％、または５０％である回収率を有し得る。回収率は、凍結保存前の細胞と比較した、凍結保存、解凍および回収、ならびに再凝集手順後に生存し、再凝集した細胞クラスターを形成する細胞のパーセンテージとして計算することができる。

【0287】

[0306]一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される方法を使用して得られる非天然膵β細胞またはその前駆体の凍結保存に関する。一部の実施形態では、非天然膵β細胞を含む細胞集団は、凍結保存によって保存することができる。例えば、非天然β細胞、例えば、ステージ６の細胞を含む細胞集団は、一部の事例では、細胞懸濁液、例えば、単一細胞の懸濁液中に分離されてもよく、細胞懸濁液は、凍結保存、例えば、凍結保存溶液中で凍結することができる。細胞の分離は、本明細書に与えられる技法のいずれか、例えば、酵素処理によって行うことができる。細胞は、最高－２０℃、最高－３０℃、最高－４０℃、最高－５０℃、最高－６０℃、最高－７０℃、最高－８０℃、最高－９０℃、最高－１００℃、最高－１１０℃、最高－１２０℃、最高－１３０℃、最高－１４０℃、最高－１５０℃、最高－１６０℃、最高－１７０℃、最高－１８０℃、最高－１９０℃、または細胞は最高－２００℃の温度で凍結することができる。一部の事例では、細胞は、約－８０℃の温度で凍結される。一部の事例では、細胞は、約－１９５℃の温度で凍結される。凍結保存に必要とされる低温をもたらすために、以下に限定されないが、電気冷凍庫、固体二酸化炭素、および液体窒素などの任意の冷却方法を使用することができる。一部の事例では、カスタムメイドと市販の溶液の両方を含む、当業者にとって利用可能な任意の凍結保存溶液を、低温での保存用に細胞をインキュベートするために使用することができる。例えば、凍結保護物質を含有する溶液を使用してもよい。凍結保護物質は、細胞を凍結による損傷から保護するために構成される薬剤であり得る。例えば、凍結保護物質は、凍結保存溶液のガラス転移温度を低下させることができる物質であり得る。使用することができる例示的な凍結保護物質として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール）、デキストラン（例えば、デキストラン－４０）、およびトレハロースが挙げられる。他の作用のために、追加の薬剤を凍結保存溶液に添加してもよい。一部の事例では、市販の凍結保存溶液、例えば、ＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（商標）、ｐＺｅｒｖｅ（商標）、Ｐｒｉｍｅ－ＸＶ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標） Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉａ、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標） ＦＲＳ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ、およびＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ（登録商標） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａを本明細書において提供される方法において使用することができる。

【0288】

[0307]分化プロセスの間に、細胞を本明細書で提供される照射処置に供することができる。一部の事例では、ステージ６における細胞集団、例えば、インスリン陽性内分泌細胞から膵β細胞へと分化される細胞を有する細胞集団または細胞クラスターは、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存からの回収後の再凝集後のステージ６の細胞集団は、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存された細胞（例えば、ステージ５の終わりに凍結保存された細胞）は、次の分化プロセスのために、解凍および回収前に、ある特定の期間照射される。

【0289】

[0308]一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陰性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、Ｃ－ペプチド陽性細胞を含む。一部の実施形態では、ステージ６細胞またはステージ６細胞の特徴を有する細胞は、ＮＳ－ＧＦ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中でインキュベートされる。一部の実施形態では、ステージ６細胞またはステージ６細胞の特徴を有する細胞は、ビタミンまたは酸化防止剤（例えば、ビタミンＣ）、アルブミンタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンタンパク質）、ＴＧＦ－β経路阻害剤（例えば、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（例えば、チアゾビビン）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＺＮＥＰ）、およびプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、スタウロスポリン）のうちの１つまたは複数と接触される。一部の実施形態では、ステージ６細胞は、ＰＫＣ活性化剤（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９２１７４８７号を参照されたい）と接触される。

【0290】

分化因子
[0309]本開示の態様は、例えば、インスリン陽性内分泌細胞の成熟または他の前駆細胞のＳＣ－β細胞（例えば、成熟膵β細胞）への分化を誘導するために、前駆細胞（例えば、幹細胞、例えば、ｉＰＳ細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞）をβ細胞分化因子と接触させることに関する。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）の胚体内胚葉細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、原腸管細胞のＰＤＸ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、ＰＤＸ１陽性膵前駆細胞のＮＫＸ６－１陽性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、ＮＫＸ６－１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、インスリン陽性内分泌細胞のＳＣ－β細胞への成熟を誘導することができる。

【0291】

[0310]本明細書に記載の少なくとも１つの分化因子は、単独で、または他の分化作用剤と組み合わせて使用し、本明細書に開示されている方法に従って、ＳＣ－β細胞を産生することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の分化因子は、ＳＣ－β細胞を産生する方法において使用される。

【0292】

形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー
[0311]本開示の態様は、分化因子としての形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーからの成長因子の使用に関する。「ＴＧＦ－βスーパーファミリー」は、公知のＴＧＦβファミリーのメンバーの構造的および機能的特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＴＧＦβファミリーとしては、ＴＧＦβシリーズのタンパク質、インヒビン（インヒビンＡおよびインヒビンＢを含む）、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢを含む）、ＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｄｐｐ（デカペンタプレジック）、Ｖｇ－１、ＭＮＳＦ（モノクローナル非特異的抑制因子）などが挙げられる。このファミリーのタンパク質の活性は、様々な細胞型の特定の受容体への特異的結合に基づき得る。このファミリーのメンバーは、特にＣ末端において、それらの機能に相関する配列同一性の領域を共有することができる。ＴＧＦβファミリーは、１００を超える別々のタンパク質を含むことができ、これらは全て、アミノ酸配列同一性の少なくとも１つの領域を共有する。本明細書に開示されている方法において使用することができるファミリーのメンバーとしては、以下のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されず、以下のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ０７９９５、Ｐ１８３３１、Ｐ０８４７６、Ｑ０４９９８、Ｐ０３９７０、Ｐ４３０３２、Ｐ５５１０２、Ｐ２７０９２、Ｐ４２９１７、Ｐ０９５２９、Ｐ２７０９３、Ｐ０４０８８、Ｑ０４９９９、Ｐ１７４９１、Ｐ５５１０４、Ｑ９ＷＵＫ５、Ｐ５５１０３、Ｏ８８９５９、Ｏ０８７１７、Ｐ５８１６６、Ｏ６１６４３、Ｐ３５６２１、Ｐ０９５３４、Ｐ４８９７０、Ｑ９ＮＲ２３、Ｐ２５７０３、Ｐ３０８８４、Ｐ１２６４３、Ｐ４９００１、Ｐ２１２７４、Ｏ４６５６４、Ｏ１９００６、Ｐ２２００４、Ｐ２０７２２、Ｑ０４９０６、Ｑ０７１０４、Ｐ３０８８６、Ｐ１８０７５、Ｐ２３３５９、Ｐ２２００３、Ｐ３４８２１、Ｐ４９００３、Ｑ９０７５１、Ｐ２１２７５、Ｑ０６８２６、Ｐ３０８８５、Ｐ３４８２０、Ｑ２９６０７、Ｐ１２６４４、Ｑ９０７５２、Ｏ４６５７６、Ｐ２７５３９、Ｐ４８９６９、Ｑ２６９７４、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、Ｐ２７０９１、Ｏ４２２２２、Ｑ２４７３５、Ｐ２０８６３、Ｏ１８８２８、Ｐ５５１０６、Ｑ９ＰＴＱ２、Ｏ１４７９３、Ｏ０８６８９、Ｏ４２２２１、Ｏ１８８３０、Ｏ１８８３１、Ｏ１８８３６、Ｏ３５３１２、Ｏ４２２２０、Ｐ４３０２６、Ｐ４３０２７、Ｐ４３０２９、Ｏ９５３９０、Ｑ９Ｒ２２９、Ｏ９３４４９、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、Ｑ９ＢＤＷ８、Ｐ４３０２８、Ｑ７Ｚ４Ｐ５、Ｐ５０４１４、Ｐ１７２４６、Ｐ５４８３１、Ｐ０４２０２、Ｐ０１１３７、Ｐ０９５３３、Ｐ１８３４１、Ｏ１９０１１、Ｑ９Ｚ１Ｙ６、Ｐ０７２００、Ｑ９Ｚ２１７、Ｏ９５３９３、Ｐ５５１０５、Ｐ３０３７１、Ｑ９ＭＺＥ２、Ｑ０７２５８、Ｑ９６Ｓ４２、Ｐ９７７３７、ＡＡＡ９７４１５．１、ＮＰ－７７６７８８．１、ＮＰ－０５８８２４．１、ＥＡＬ２４００１．１、１ Ｓ４Ｙ、ＮＰ－００１００９８５６．１、ＮＰ－１－０３２４０６．１、ＮＰ－９９９１９３．１、ＸＰ－５１９０６３．１、ＡＡＧ１７２６０．１、ＣＡＡ４０８０６．１、ＮＰ－１－００１００９４５８．１、ＡＡＱ５５８０８．１、ＡＡＫ４０３４１．１、ＡＡＰ３３０１９．１、ＡＡＫ２１２６５．１、ＡＡＣ５９７３８．１、ＣＡＩ４６００３．１、Ｂ４０９０５、ＡＡＱ５５８１１．１、ＡＡＫ４０３４２．１、ＸＰ－５４０３６４．１、Ｐ５５１０２、ＡＡＱ５５８１０．１、ＮＰ－９９０７２７．１、ＣＡＡ５１１６３．１、ＡＡＤ５０４４８．１、ＪＣ４８６２、ＰＮ０５０４、ＢＡＢ１７６００．１、ＡＡＨ５６７４２．１、ＢＡＢ１７５９６．１、ＣＡＧ０６１８３．１、ＣＡＧ０５３３９．１、ＢＡＢ１７６０１．１、ＣＡＢ４３０９１．１、Ａ３６１９２、ＡＡＡ４９１６２．１、ＡＡＴ４２２００．１、ＮＰ－７８９８２２．１、ＡＡＡ５９４５１．１、ＡＡＡ５９１６９．１、ＸＰ－５４１０００．１、ＮＰ－９９０５３７．１、ＮＰ－１－００２１８４．１、ＡＡＣ１４１８７．１、ＡＡＰ８３３１９．１、ＡＡＡ５９１７０．１、ＢＡＢ１６９７３．１、ＡＡＭ６６７６６．１、ＷＦＰＧＢＢ、１２０１２７８Ｃ、ＡＡＨ３００２９．１、ＣＡＡ４９３２６．１、ＸＰ－３４４１３１．１、ＡＡ－１４８８４５．１、ＸＰ－１－１４８９６６．３、１４８２３５、Ｂ４１３９８、ＡＡＨ７７８５７．１、ＡＡＢ２６８６３．１、１７０６３２７Ａ、ＢＡＡ８３８０４．１、ＮＰ－５７１１４３．１、ＣＡＧ００８５８．１、ＢＡＢ１７５９９．１、ＢＡＢ１７６０２．１、ＡＡＢ６１４６８．１、ＰＮ０５０５、ＰＮ０５０６、ＣＡＢ４３０９２．１、ＢＡＢ１７５９８．１、ＢＡＡ２２５７０．１、ＢＡＢ１６９７２．１、ＢＡＣ８１６７２．１、ＢＡＡ１２６９４．１、ＢＡＡ０８４９４．１、Ｂ３６１９２、Ｃ３６１９２、ＢＡＢ１６９７１．１、ＮＰ－０３４６９５．１、ＡＡＡ４９１６０．１、ＣＡＡ６２３４７．１、ＡＡＡ４９１６１．１、ＡＡＤ３０１３２．１、ＣＡＡ５８２９０．１、ＮＰ－００５５２９．１、ＸＰ－５２２４４３．１、ＡＡＭ２７４４８．１、ＸＰ－５３８２４７．１、ＡＡＤ３０１３３． Ｉ、ＡＡＣ３６７４１．１、ＡＡＨ１０４０４．１、ＮＰ－０３２４０８．１、ＡＡＮ０３６８２．１、ＸＰ－５０９１６１．１、ＡＡＣ３２３１１．１、ＮＰ－６５１９４２．２、ＡＡＬ５１００５．１、ＡＡＣ３９０８３．１、ＡＡＨ８５５４７．１、ＮＰ－５７１０２３．１、ＣＡＦ９４１１３．１、ＥＡＬ２９２４７．１、ＡＡＷ３０００７．１、ＡＡＨ９０２３２．１、Ａ２９６１９、ＮＰ－００１００７９０５．１、ＡＡＨ７３５０８．１、ＡＡＤＯ２２０１．１、ＮＰ－９９９７９３．１、ＮＰ－９９０５４２．１、ＡＡＦ１９８４１．１、ＡＡＣ９７４８８．１、ＡＡＣ６００３８．１、ＮＰ ９８９１９７．１、ＮＰ－５７１４３４．１、ＥＡＬ４１２２９．１、ＡＡＴ０７３０２．１、ＣＡＩ１９４７２．１、ＮＰ－０３１５８２．１、ＡＡＡ４０５４８．１、ＸＰ－５３５８８０．１、ＮＰ－１－０３７２３９．１、ＡＡＴ７２００７．１、ＸＰ－４１８９５６．１、ＣＡＡ４１６３４．１、ＢＡＣ３０８６４．１、ＣＡＡ３８８５０．１、ＣＡＢ８１６５７．２、ＣＡＡ４５０１８．１、ＣＡＡ４５０１９．１、ＢＡＣ２８２４７．１、ＮＰ－０３１５８１．１、ＮＰ－９９０４７９．１、ＮＰ－９９９８２０．１、ＡＡＢ２７３３５．１、Ｓ４５３５５、ＣＡＢ８２００７．１、ＸＰ－５３４３５１．１、ＮＰ－０５８８７４．１、ＮＰ－０３１５７９．１、１ＲＥＷ、ＡＡＢ９６７８５．１、ＡＡＢ４６３６７．１、ＣＡＡ０５０３３．１、ＢＡＡ８９０１２．１、ＩＥＳ７、ＡＡＰ２０８７０．１、ＢＡＣ２４０８７．１、ＡＡＧ０９７８４．１、ＢＡＣ０６３５２．１、ＡＡＱ８９２３４．１、ＡＡＭ２７０００．１、ＡＡＨ３０９５９．１、ＣＡＧＯ１４９１．１、ＮＰ－５７１４３５．１、１ＲＥＵ、ＡＡＣ６０２８６．１、ＢＡＡ２４４０６．１、Ａ３６１９３、ＡＡＨ５５９５９．１、ＡＡＨ５４６４７．１、ＡＡＨ９０６８９．１、ＣＡＧ０９４２２．１、ＢＡＤ１６７４３．１、ＮＰ－０３２１３４．１、ＸＰ－５３２１７９．１、ＡＡＢ２４８７６．１、ＡＡＨ５７７０２．１、ＡＡＡ８２６１６．１、ＣＡＡ４０２２２．１、ＣＡＢ９０２７３．２、ＸＰ－３４２５９２．１、ＸＰ－５３４８９６．１、ＸＰ－５３４４６２．１、１ＬＸＩ、ＸＰ－４１７４９６．１、ＡＡＦ３４１７９．１、ＡＡＬ７３１８８．１、ＣＡＦ９６２６６．１、ＡＡＢ３４２２６．１、ＡＡＢ３３８４６．１、ＡＡＴ１２４１５．１、ＡＡ０３３８１９．１、ＡＡＴ７２００８．１、ＡＡＤ３８４０２．１、ＢＡＢ６８３９６．１、ＣＡＡ４５０２１．１、ＡＡＢ２７３３７．１、ＡＡＰ６９９１７．１、ＡＡＴＩ２４１６．１、ＮＰ－５７１３９６．１、ＣＡＡ５３５１３．１、ＡＡ０３３８２０．１、ＡＡＡ４８５６８．１、ＢＡＣ０２６０５．１、ＢＡＣ０２６０４．１、ＢＡＣ０２６０３．１、ＢＡＣ０２６０２．１、ＢＡＣ０２６０１．１、ＢＡＣ０２５９９．１、ＢＡＣ０２５９８．１、ＢＡＣ０２５９７．１、ＢＡＣ０２５９５．１、ＢＡＣ０２５９３．１、ＢＡＣ０２５９２．１、ＢＡＣ０２５９０．１、ＡＡＤ２８０３９．１、ＡＡＰ７４５６０．１、ＡＡＢ９４７８６．１、ＮＰ－００１４８３．２、ＸＰ－５２８１９５．１、ＮＰ－５７１４１７．１、ＮＰ－００１００１５５７． Ｉ、ＡＡＨ４３２２２．１、ＡＡＭ３３１４３．１、ＣＡＧ１０３８１．１、ＢＡＡ３１１３２．１、ＥＡＬ３９６８０．１、ＥＡＡ１２４８２．２、Ｐ３４８２０、ＡＡＰ８８９７２．１、ＡＡＰ７４５５９．１、ＣＡＩ１６４１８．１、ＡＡＤ３０５３８．１、ＸＰ－３４５５０２．１、ＮＰ－１－０３８５５４．１、ＣＡＧ０４０８９．１、ＣＡＤ６０９３６．２、ＮＰ－０３１５８４．１、Ｂ５５４５２、ＡＡＣ６０２８５．１、ＢＡＡ０６４１０．１、ＡＡＨ５２８４６．１、ＮＰ－０３１５８０．１、ＮＰ－１－０３６９５９．１、ＣＡＡ４５８３６．１、ＣＡＡ４５０２０．１、Ｑ２９６０７、ＡＡＢ２７３３６．１、ＸＰ－５４７８１７．１、ＡＡＴ１２４１４．１、ＡＡＭ５４０４９．１、ＡＡＨ７８９０１．１、ＡＡ０２５７４５．１、ＮＰ－５７０９１２．１、ＸＰ－３９２１９４．１、ＡＡＤ２０８２９．１、ＡＡＣ９７１１３．１、ＡＡＣ６１６９４．１、ＡＡＨ６０３４０．１、ＡＡＲ９７９０６．１、ＢＡＡ３２２２７．１、ＢＡＢ６８３９５．１、ＢＡＣ０２８９５．１、ＡＡＷＳ １４５１．１、ＡＡＦ８２１８８．１、ＸＰ－５４４１８９．１、ＮＰ－９９０５６８．１、ＢＡＣ８０２１１．１、ＡＡＷ８２６２０．１、ＡＡＦ９９５９７．１、ＮＰ－５７１０６２．１、ＣＡＣ４４１７９．１、ＡＡＢ９７４６７．１、ＡＡＴ９９３０３．１、ＡＡＤ２８０３８．１、ＡＡＨ５２１６８．１、ＮＰ－００１００４１２２．１、ＣＡＡ７２７３３．１、ＮＰ－０３２１３３．２、ＸＰ－３９４２５２．１、ＸＰ－２２４７３３．２、ＪＨ０８０１、ＡＡＰ９７７２１．１、ＮＰ－９８９６６９．１、Ｓ４３２９６、Ｐ４３０２９、Ａ５５４５２、ＡＡＨ３２４９５．１、ＸＰ－５４２９７４．１、ＮＰ－０３２１３５．１、ＡＡＫ３０８４２．１、ＡＡＫ２７７９４．１、ＢＡＣ３０８４７．１、ＥＡＡ１２０６４．２、ＡＡＰ９７７２０．１、ＸＰ－５２５７０４．１、ＡＡＴ０７３０１．１、ＢＡＤ０７０１４．１、ＣＡＦ９４３５６．１、ＡＡＲ２７５８１．１、ＡＡＧ１３４００．１、ＡＡＣ６０１２７．１、ＣＡＦ９２０５５．１、ＸＰ－５４０１０３．１、ＡＡ０２０８９５．１、ＣＡＦ９７４４７．１、ＡＡＳ０１７６４．１、ＢＡＤ０８３１９．１、ＣＡＡ１０２６８．１、ＮＰ－９９８１４０．１、ＡＡＲ０３８２４．１、ＡＡＳ４８４０５．１、ＡＡＳ４８４０３．１、ＡＡＫ５３５４５．１、ＡＡＫ８４６６６．１、ＸＰ－３９５４２０．１、ＡＡＫ５６９４１．１、ＡＡＣ４７５５５．１、ＡＡＲ８８２５５．１、ＥＡＬ３３０３６．１、ＡＡＷ４７７４０．１、ＡＡＷ２９４４２．１、ＮＰ－７２２８１３．１、ＡＡＲＯ８９０１．１、ＡＡＯ １５４２０．２、ＣＡＣ５９７００．１、ＡＡＬ２６８８６．１、ＡＡＫ７１７０８．１、ＡＡＫ７１７０７．１、ＣＡＣ５１４２７．２、ＡＡＫ６７９８４．１、ＡＡＫ６７９８３．１、ＡＡＫ２８７０６．１、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、ＣＡＧ０２４５０．１、ＡＡＣ４７５５２．１、ＮＰ－００５８０２．１、ＸＰ－３４３１４９．１、ＡＷ３４０５５．１、ＸＰ－５３８２２１．１、ＡＡＲ２７５８０．１、ＸＰ－１２５９３５．３、ＡＡＦ２１６３３．１、ＡＡＦ２１６３０．１、ＡＡＤ０５２６７．１、Ｑ９Ｚ１ Ｗ４、ＮＰ－１－０３１５８５．２、ＮＰ－５７１０９４．１、ＣＡＤ４３４３９．１、ＣＡＦ９９２１７．１、ＣＡＢ６３５８４．１、ＮＰ－７２２８４０．１、ＣＡＥ４６４０７．１、ＸＰ－１－４１７６６７．１、ＢＡＣ５３９８９．１、ＢＡＢ１９６５９．１、ＡＡＭ４６９２２．１、ＡＡＡ８１１６９
．１、ＡＡＫ２８７０７．１、ＡＡＬ０５９４３．１、ＡＡＢ１７５７３．１、ＣＡＨ２５４４３．１、ＣＡＧ１０２６９．１、ＢＡＤ１６７３１．１、ＥＡＡ００２７６．２、ＡＡＴ０７３２０．１、ＡＡＴ０７３００．１、ＡＡＮ１５０３７．１、ＣＡＨ２５４４２．１、ＡＡＫ０８１５２．２、２００９３８８Ａ、ＡＡＲ１２１６１．１、ＣＡＧＯ１９６１．１、ＣＡＢ６３６５６．１、ＣＡＤ６７７１４．１、ＣＡＦ９４１６２．１、ＮＰ－４７７３４０．１、ＥＡＬ２４７９２．１、ＮＰ－１－００１００９４２８．１、ＡＡＢ８６６８６．１、ＡＡＴ４０５７２．１、ＡＡＴ４０５７１．１、ＡＡＴ４０５６９．１、ＮＰ－０３３８８６．１、ＡＡＢ４９９８５．１、ＡＡＧ３９２６６．１、Ｑ２６９７４、ＡＡＣ７７４６１．１、ＡＡＣ４７２６２．１、ＢＡＣ０５５０９．１、ＮＰ－０５５２９７．１、ＸＰ－５４６１４６．１、ＸＰ－５２５７７２．１、ＮＰ－０６０５２５．２、ＡＡＨ３３５８５．１、ＡＡＨ６９０８０．１、ＣＡＧ１２７５１．１、ＡＡＨ７４７５７．２、ＮＰ－０３４９６４．１、ＮＰ－０３８６３９．１、０４２２２１、ＡＡＦ０２７７３．１、ＮＰ－０６２０２４．１、ＡＡＲ１８２４４．１、ＡＡＲ１４３４３．１、ＸＰ－２２８２８５．２、ＡＡＴ４０５７３．１、ＡＡＴ９４４５６．１、ＡＡＬ３５２７８．１、ＡＡＬ３５２７７．１、ＡＡＬ１７６４０．１、ＡＡＣ０８０３５．１、ＡＡＢ８６６９２．１、ＣＡＢ４０８４４．１、ＢＡＣ３８６３７．１、ＢＡＢ１６０４６．１、ＡＡＮ６３５２２．１、ＮＰ－５７１０４１．１、ＡＡＢ０４９８６．２、ＡＡＣ２６７９１．１、ＡＡＢ９５２５４．１、ＢＡＡ１１８３５．１、ＡＡＲ１８２４６．１、ＸＰ－５３８５２８．１、ＢＡＡ３１８５３．１、ＡＡＫ１８０００．１、ＸＰ－１－４２０５４０．１、ＡＡＬ３５２７６．１、ＡＡＱ９８６０２．１、ＣＡＥ７１９４４．１、ＡＡＷ５０５８５．１、ＡＡＶ６３９８２．１、ＡＡＷ２９９４１．１、ＡＡＮ８７８９０．１、ＡＡＴ４０５６８．１、ＣＡＤ５７７３０．１、ＡＡＢ８１５０８．１、ＡＡＳ００５３４．１、ＡＡＣ５９７３６．１、ＢＡＢ７９４９８．１、ＡＡＡ９７３９２．１、ＡＡＰ８５５２６．１、ＮＰ－９９９６００．２、ＮＰ－８７８２９３．１、ＢＡＣ８２６２９．１、ＣＡＣ６０２６８．１、ＣＡＧ０４９１９．１、ＡＡＮ１０１２３．１、ＣＡＡ０７７０７．１ ＡＡＫ２０９１２．１、ＡＡＲ８８２５４．１、ＣＡＣ３４６２９．１、ＡＡＬ３５２７５．１、ＡＡＤ４６９９７． Ｉ、ＡＡＮ０３８４２．１、ＮＰ－５７１９５１．２、ＣＡＣ５０８８１．１、ＡＡＬ９９３６７．１、ＡＡＬ４９５０２．１、ＡＡＢ７１８３９．１、ＡＡＢ６５４１５．１、ＮＰ－６２４３５９．１、ＮＰ－９９０１５３．１、ＡＡＦ７８０６９．１、ＡＡＫ４９７９０．１、ＮＰ－９１９３６７．２、ＮＰ－００１１９２．１、ＸＰ－５４４９４８．１、ＡＡＱ１８０１３．１、ＡＡＶ３８７３９．１、ＮＰ－８５１２９８．１、ＣＡＡ６７６８５．１、ＡＡＴ６７１７１．１、ＡＡＴ３７５０２．１、ＡＡＤ２７８０４．１、ＡＡＮ７６６６５．１、ＢＡＣ１１９０９．１、ＸＰ－１－４２１６４８．１、ＣＡＢ６３７０４．１、ＮＰ－０３７３０６．１、Ａ５５７０６、ＡＡＦ０２７８０．１、ＣＡＧ０９６２３．１、ＮＰ－０６７５８９．１、ＮＰ－０３５７０７．１、ＡＡＶ３０５４７．１、ＡＡＰ４９８１７．１、ＢＡＣ７７４０７．１、ＡＡＬ８７１９９．１、ＣＡＧ０７１７２．１、Ｂ３６１９３、ＣＡＡ３３０２４．１、ＮＰ－１－００１００９４００．１、ＡＡＰ３６５３８．１、ＸＰ－５１２６８７．１、ＸＰ－５１００８０．１、ＡＡＨ０５５１３．１、１ＫＴＺ、ＡＡＨ１４６９０．１、ＡＡＡ３１５２６．１によって特定される。

【0293】

[0312]本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、天然に得ることができるかまたは組換え体であり得る。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡを含む。用語「アクチビンＡ」は、アクチビンＡの断片および誘導体を含み得る。例示的なアクチビンＡの配列は、米国特許出願公開第２００９／０１５５２１８号（’２１８公報）における配列番号１に開示されている。アクチビンＡの他の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号２～１６に提供され、アクチビンＡをコードする核酸の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号３３～３４に提供されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、’２１８公報の配列番号１と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。

【0294】

[0313]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。用語「ＧＤＦ８」は、ＧＤＦ８の断片および誘導体を含み得る。ＧＤＦ８ポリペプチドの配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＡＸ１０８８０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0295】

[0314]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ＧＤＦ８に密接に関連する成長因子、例えば、成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ１１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＦ２１６３０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0296】

[0315]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの成長因子は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する薬剤と置き換えることができる。ＴＧＦ－βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する例示的な薬剤としては、限定されないが、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２が挙げられる。

【0297】

骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤
[0316]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。ＢＭＰシグナル伝達ファミリーは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの多様なサブセットである（Ｓｅｂａｌｄら Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８５：６９７～７１０頁、２００４年）。２０種を超える公知のＢＭＰリガンドは、３つの異なるＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａ、およびＡｃｔＲＩＩｂ）および少なくとも３つのＩ型（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６）受容体によって認識される。二量体のリガンドは、受容体ヘテロマーのアセンブリーを促進し、構成的に活性なＩＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼにＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼをリン酸化させる。活性化Ｉ型受容体は、ＢＭＰ応答性（ＢＲ－）ＳＭＡＤエフェクター（ＳＭＡＤ１、５、および８）をリン酸化して、ＴＧＦシグナル伝達も促進するｃｏ－ＳＭＡＤであるＳＭＡＤ４との複合体における核移行を促進する。さらに、ＢＭＰシグナルは、ＳＭＡＤに依存しない手法で、ＭＡＰＫ ｐ３８などの細胞内エフェクターを活性化し得る（Ｎｏｈｅら Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １６：２９１～２９９頁、２００４年）。可溶性ＢＭＰアンタゴニスト、例えば、ノギン、コーディン、グレムリン、およびフォリスタチンは、リガンド隔離によってＢＭＰシグナル伝達を制限する。

【0298】

[0317]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ－１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：

【0299】

【化1】

【0300】

[0318]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ１９３１８９、１０６２３６８－２４－４、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭ ３１８９、ＤＭ－３１８９、ＩＵＰＡＣ名：４－［６－（４－ピペラジン－１－イルフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノロンとしても公知）を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：

【0301】

【化2】

【0302】

[0319]一部の事例では、ＤＭＨ－１は、ＬＤＮ１９３１８９と比較して、より選択的であり得る。本開示の一部の実施形態では、ＤＭＨ－１は、本明細書において提供される方法に対して特に有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、ＬＤＮ１９３１８９の使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を産生するために、ＬＤＮ１９３１８９、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰＤＸ１陽性膵前駆細胞を産生するための、ＤＭＨ－１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用に関する。

【0303】

[0320]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９の類似体または誘導体、例えば、ＬＤＮ１９３１８９の塩、水和物、溶媒、エステル、またはプロドラッグを含む。一部の実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９の誘導体（例えば、塩）は、ＬＤＮ１９３１８９ヒドロクロリドを含む。

【0304】

[0321]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１１／００５３９３０号からの式Ｉの化合物を含む。

【0305】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤
[0322]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。

【0306】

[0323]一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ－β ＲＩ）シグナル伝達を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ４４６８５９－３３－２、ＲｅｐＳｏｘとしても公知であるＴＧＦ－Ｂ ＲＩキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤、ＩＵＰＡＣ名：２－［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。

【0307】

[0324]一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体（「ＡＬＫ５ｉ」とも称される）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００２１５１９号に記載されている式Ｉの化合物である。

【0308】

[0325]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２６７７３１号に記載されているＴＧＦ－β受容体阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００９／０１８６０７６号および同第２００７／０１４２３７６号に記載されているＡＬＫ５阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ ８３－０１である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ ８３－０１ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ａ ８３－０１を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ４３１５４２である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ４３１５４２ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ４３１５４２を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ ４４７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ ４４７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ｄ ４４７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ７８８３８８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ３６４９４７である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ３６４９４７ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ ３６４９４７を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ５８０２７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ ５８０２７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ ５８０２７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５２５３３４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５２５３３４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ５２５３３４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５０５１２４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ ５０５１２４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ ５０５１２４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ ２０８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ ２０８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＤ ２０８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ６６０４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ６６０４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ６６０４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ ７８８３８８を除外する。

【0309】

[0326]上記化合物のコレクションから、以下のものを様々な供給源から得ることができる：Ｓｉｇｍａ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １４５０８， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ６３１７８－９９１６から入手可能なＬＹ－３６４９４７、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、およびＳＢ－５０５１２４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．），４８０ Ｓ． Ｄｅｍｏｃｒａｔ Ｒｏａｄ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， Ｎ．Ｊ．， ０８０２７から入手可能な６１６４５２および６１６４５３；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ， ９８０ Ｇｒｅａｔ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＴＷ８ ９ＧＳ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能なＧＷ７８８３８８およびＧＷ６６０４；Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ． ４６２８５から入手可能なＬＹ５８０２７６；ならびにＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １４６２７， ５０００ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， Ｎ．Ｃ．， ２７７０９－４６２７から入手可能なＳＭ１６。

【0310】

ＷＮＴシグナル伝達経路
[0327]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤の使用に関する。

【0311】

[0328]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１の誘導体、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の塩、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１のトリヒドロクロリド、ヒドロクロリド塩を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定されないが、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ－ヒメニアルジシン、インディルビン－３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３－ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ ６９３８６８、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＴＷＳ １１９、およびこれらのいずれかの類似体または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤を除外する。

【0312】

線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー
[0329]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＦＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。

【0313】

[0330]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。ＫＧＦのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＫＧＦポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ２１４３１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0314】

[0331]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ＦＧＦ２を含む。ＦＧＦ２のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００１９９７）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0315】

[0332]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。ＦＧＦ８Ｂのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ８Ｂポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ４０９５４）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0316】

[0333]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ１０を含む。ＦＧＦ１０のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＧ４６４８９）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0317】

[0334]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２１を含む。ＦＧＦ２１のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ８９４４４．１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0318】

ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路
[0335]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。

【0319】

[0336]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ２を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ３を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ４を含む。一部の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｃｕｒ６１４１４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、フォースコリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トマチジンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＹ９９４４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トリパラノールを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、化合物Ａまたは化合物Ｂを含む（米国特許出願公開第２００４／００６０５６８号に開示されている）。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００６／０２７６３９１号に開示されているヘッジホッグシグナル伝達にアンタゴナイズするステロイダルアルカロイド（例えば、シクロパミンまたはその誘導体）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤を除外する。

【0320】

Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路
[0337]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）の使用に関する。

【0321】

[0338]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２またはチアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２を含む。一部の事例では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：

【0322】

【化3】

【0323】

[0339]一部の事例では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：

【0324】

【化4】

【0325】

[0340]本明細書において提供される方法および組成物において使用することができるＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、チアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジル/ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、リパスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、オレフィン、イソキノリン、インダゾール、およびピリジンアルケン誘導体、ＲＯＫα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキサミド、Ｒｈｏｓｔａｔｉｎ、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、ＢＡ－２１５、ＢＡ－２８５、ＢＡ－１０３７、Ｋｉ－２３０９５、ＶＡＳ－０１２、ならびにキナゾリンが挙げられる。

【0326】

レチノイン酸シグナル伝達経路
[0341]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターの使用に関する。

【0327】

[0342]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の活性化剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸受容体アゴニストを含む。本明細書において提供される方法および組成物における例示的なレチノイン酸受容体アゴニストとしては、限定されないが、ＣＤ １５３０、ＡＭ ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、ＢＭＳ ９６１、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ ２３１４が挙げられる。

【0328】

[0343]一部の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の阻害剤を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢ（ＩＵＰＡＣ名：２－［２－（ジエチルアミノ）エトキシ］３－プロパ－２－エニルベンズアルデヒド）を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢの類似体または誘導体を含む。

【0329】

[0344]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニストを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸受容体アンタゴニストは、（Ｅ）－４－［２－（５，６－ジヒロド－５，５－ジメチル－８－フェニル－２－ナフタレニル）エテニル］安息香酸、（Ｅ）－４－［［（５，６－ジヒロド－５，５－ジメチル－８－フェニルエチニル）－２－ナフタレニル］エテニル］安息香酸、（Ｅ）－４－［２－［５，６－ジヒロド－５，５－ジメチル－８－（２－ナフタレニル）－２－ナフタレニル］エテニル］－安息香酸、および（Ｅ）－４－［２－［５，６－ジヒロド－５，５－ジメチル－８－（４－メトキシフェニル）－２－ナフタレニル］エテニル］安息香酸を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＢＭＳ １９５６１４（ＣＡＳ番号２５３３１０－４２－８）、ＥＲ ５０８９１（ＣＡＳ番号１８７４００－８５－７）、ＢＭＳ ４９３（ＣＡＳ番号１７０３５５－７８－９）、ＣＤ ２６６５（ＣＡＳ番号１７０３５５－７８－９）、ＬＥ １３５（ＣＡＳ番号１５５８７７－８３－１）、ＢＭＳ ４５３（ＣＡＳ番号１６６９７７－４３－１）、またはＭＭ １１２５３（ＣＡＳ番号３４５９５２－４４－５）を含む。

【0330】

[0345]ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターを除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤を除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤を除外する。

【0331】

プロテインキナーゼＣ
[0346]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのプロテインキナーゼＣ活性化剤の使用に関する。プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最も大きなファミリーのうちの１つであり、種々のアイソフォームから構成される。従来のアイソフォームとしては、ａ、βＩ、βＩＩ、γが挙げられ；新規アイソフォームとしては、δ、ε、η、Θが挙げられ；および非典型的アイソフォームとしては、ξ、およびι／λが挙げられる。ＰＫＣ酵素は、主にサイトゾルであるが、活性化されると膜に移動する。細胞質では、ＰＫＣは他のキナーゼによってリン酸化されるかまたは自己リン酸化される。活性化されるために、一部のＰＫＣアイソフォーム（例えば、ＰＫＣ－ε）は、ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位またはホスファチジルセリン（「ＰＳ」）結合部位に結合するために分子を必要とする。他のものは、いずれの二次的結合メッセンジャーも必要とせず活性化され得る。ＤＡＧ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、ブリオスタチン、ピコローグ（ｐｉｃｏｌｏｇｕｅ）、ホルボールエステル、アプリシアトキシン、およびグニジマクリンが挙げられる。ＰＳ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、多価不飽和脂肪酸およびその誘導体が挙げられる。単独でまたは１つまたは複数の他のβ細胞分化因子と組み合わせて、少なくとも１つのインスリンを産生する内分泌細胞またはその前駆体の、ＳＣ－β細胞への分化を誘導することが可能である任意のプロテインキナーゼＣ活性化剤を本明細書に記載の方法、組成物、およびキットにおいて使用することができることが企図される。

【0332】

[0347]一部の実施形態では、本明細書に開示されるＰＫＣ活性化剤のいずれかは、ＰＫＣ上のＤＡＧ結合部位に結合することができるＰＫＣ活性化剤である。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＫＣのＣ１ドメインに結合することができる。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ベンゾラクタム誘導体である。一部の実施形態では、ベンゾラクタム誘導体は、本明細書ではＴＰＰＢまたはＴＰＢと称することがある（（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム）である。一部の実施形態では、細胞集団をベンゾラクタム誘導体ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＴＰＰＢ）と接触させると、ベンゾラクタム誘導体ＰＫＣ活性化剤で処理されない細胞集団と比較して、細胞収量が増加する。一部の実施形態では、ＰＫＣ活性化剤は、ホルボールエステルである。一部の実施形態では、ホルボールエステルは、本明細書ではＰＤＢＵまたはＰｄｂＵと称することがあるホルボール１２，１３－ジブチレートである。一部の実施形態では、細胞集団をベンゾラクタム誘導体ＰＫＣ活性化剤（例えば、ＴＰＰＢ）と接触させると、ホルボールエステルＰＫＣ活性化剤（例えば、ＰｄｂＵ）で処理された細胞集団と比較して、細胞収量が増加する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＰｄｂＵを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＢを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２０１３／０７１２８２号に記載されているように、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ－１８）、インスリン成長因子、ホルモン、および成長因子活性化剤を含む。一部の実施形態では、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｉｎ）は、ブリオスタチン－１、ブリオスタチン－２、ブリオスタチン－３、ブリオスタチン－４、ブリオスタチン－５、ブリオスタチン－６、ブリオスタチン－７、ブリオスタチン－８、ブリオスタチン－９、ブリオスタチン－１０、ブリオスタチン－１１、ブリオスタチン－１２、ブリオスタチン－１３、ブリオスタチン－１４、ブリオスタチン－１５、ブリオスタチン－１６、ブリオスタチン－１７、またはブリオスタチン－１８を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼＣ活性化剤を除外する。

【0333】

γ－セクレターゼ阻害剤
[0348]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのγ－セクレターゼ阻害剤の使用に関する。

【0334】

[0349]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ－セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。本明細書において提供される方法および組成物における追加の例示的なγ－セクレターゼ阻害剤としては、限定されないが、米国特許第７，０４９，２９６号、同第８，４８１，４９９号、同第８，５０１，８１３号、およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２０１３／０５２７００号に記載のγ－セクレターゼ阻害剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、γ－セクレターゼ阻害剤を除外する。

【0335】

甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤
[0350]本開示の態様は、β細胞分化因子としての甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の使用に関する。

【0336】

[0351]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、ＧＣ－１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３またはＧＣ－１の類似体または誘導体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるＴ３の例示的な類似体としては、以下に限定されないが、選択的および非選択的甲状腺ホルモン模倣物（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ＴＲβ選択的アゴニスト－ＧＣ－１、ＧＣ－２４、４－ヒドロキシ－ＰＣＢ １０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４，３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ－βアゴニスト ＧＣ－１；３－ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５－トリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンチロキシンの生物活性代謝産物（Ｔ（４））；ＫＢ－２１１５およびＫＢ－１４１；チロナミン；ＳＫＦ Ｌ－９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’－ＡＣ－Ｔ２；テトラヨードサイロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン［Ｔ４］およびトリヨードチロニン［Ｔ３］アラニン鎖の酸化的脱アミノ化および脱炭酸化による）、３，３’，５’－トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化による）、３，３’－ジヨードチロニン（３，３’－Ｔ２）および３，５－ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化による）、および３－ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化およびアミノ酸脱炭酸化による）、ならびにＴＨの構造的類似体として、例えば、３，５，３’－トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５－ジブルモ－３－ピリダジノン－１－チロニン（Ｌ－９４０９０１）、Ｎ－［３，５－ジメチル－４－（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルフェノキシ）－フェニル］－オキサミン酸（ＣＧＳ ２３４２５）、３，５－ジメチル－４－［（４’－ヒドロキシ－３’－イソプロピルベンジル）－フェノキシ］酢酸（ＧＣ－１）、３，５－ジクロロ－４－［（４－ヒドロキシ－３－イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ－１４１）、および３，５－ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられる。

【0337】

[0352]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えば、Ｔ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ－３，５，３’，５’－テトラヨードチロニン）を含む。

【0338】

[0353]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、米国特許第７，１６３，９１８号に記載されているヨードチロニン組成物である。

【0339】

上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリー
[0354]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＥＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。

【0340】

[0355]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ベータセルリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦを含む。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、大きな膜内在性タンパク質前駆体からタンパク質分解によって切断された５３アミノ酸のサイトカインである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、バリアントＥＧＦポリペプチド、例えば、米国特許第７，０８４，２４６号に開示されているように、ヒト野生型ＥＧＦポリペプチド配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する単離された上皮細胞成長因子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、米国特許第８，２４７，５３１号に開示されているように、ＥＧＦ受容体に結合し、これをアゴナイズする、操作されたＥＧＦ突然変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦファミリーのシグナル伝達経路を活性化する薬剤と置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、ＥＧＦを模倣する化合物を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＥＧＦファミリーからの成長因子を除外する。

【0341】

エピジェネティック修飾化合物
[0356]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのエピジェネティック修飾化合物の使用に関する。

【0342】

[0357]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクスを起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現を変化させる化合物を意味し得る。エピジェネティクスは遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある種の細胞、例えばβ－細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制することができる。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要であり得る。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し得、これは分化の間に不活性化される。非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

【0343】

[0358]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサーの阻害剤である。ＥＺＨ２はヒストン－リシン Ｎ－メチルトランスフェラーゼ酵素である。本明細書で提供される方法において使用できるＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例には、３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ６４３８、ＥＰＺ００５６８７（Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤）、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、およびＵＮＣ１９９９が含まれる。ＤＺＮｅｐは全てのタンパク質メチルトランスフェラーゼの生成物系阻害剤であるＳ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）の加水分解を阻害してＳＡＨの細胞内濃度の上昇を導き、これが次にＥＺＨ２を阻害することができる。ＤＺＮｅｐはＥＺＨ２に特異的ではなく、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをも阻害することができる。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ１の１５０倍の選択性を有するＳＡＭ競合性ＥＺＨ２阻害剤である。ＵＮＣ１９９９はＧＳＫ１２６の類似体であり、その相当物であるＧＳＫ１２６より選択性が低い。

【0344】

[0359]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０（メルカプトケトン系ＨＤＡＣ阻害剤）、ＭＣ１５６８（クラスＩＩａ ＨＤＡＣ阻害剤）、ＴＭＰ１９５（クラスＩＩａ ＨＤＡＣ阻害剤）、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタット、ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）、チダミド、パノビノスタット（ファリダク）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）、ＳＢ９３９、レスミノスタット（４ＳＣ－２０１）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、キシノスタット（ＪＮＪ－２６４８１５８５）、ＨＢＩ－８０００（ベンザミドＨＤＩ）、ケベトリン、ＣＵＤＣ－１０１、ＡＲ－４２、ＣＨＲ－２８４５、ＣＨＲ－３９９６、４ＳＣ－２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ－１２１５、ＭＥ－３４４、スルホラファン、またはそれらの任意の変異体である。

【0345】

プロテインキナーゼ阻害剤
[0360]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのプロテインキナーゼ阻害剤の使用に関する。

【0346】

[0361]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンの類似体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるスタウロスポリンの例示的な類似体としては、限定されないが、Ｒｏ－３１－８２２０、ビスインドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’－｛５”－［（メトキシカルボニル）アミノ］－２”－メチル｝－フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、スタラログ（ｓｔａｒａｌｏｇ）（例えば、Ｌｏｐｅｚら、「Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｒｏａｄｅｎ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ａｎａｌｏｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１３年；１３５（４８）：１８１５３～１８１５９頁を参照されたい。）、およびｃｇｐ４１２５１が挙げられる。

【0347】

[0362]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、ＰＫＣβの阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、以下の構造を有するＰＫＣβの阻害剤、または以下のような化合物の誘導体、類似体もしくはバリアントである：

【0348】

【化5】

【0349】

[0363]一部の実施形態では、ＰＫＣβの阻害剤は、以下の構造を有するＧＳＫ－２化合物または以下のような化合物の誘導体、類似体もしくはバリアントである：

【0350】

【化6】

【0351】

[0364]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣの阻害剤は、ビスインドリルマレイミドである。例示的なビスインドリルマレイミドとしては、限定されないが、ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩＩ、ヒドロクロリド、またはその誘導体、類似体もしくはバリアントが挙げられる。

【0352】

[0365]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、シュードヒペリシン、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、インドルビン－３－モノオキシム（ｉｎｄｏｒｕｂｌｉｎ－３－ｍｏｎｏｘｉｍｃ）、５－ヨードまたはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼ阻害剤を除外する。
医薬組成物
[0366]本開示は、前記方法のいずれかによって産生された細胞を含有するかまたは前記細胞集団のいずれかを含有する治療用組成物に関する。治療用組成物は、例えば、人工脳脊髄液またはリン酸緩衝生理食塩水を含む生理学的に適合性の溶液をさらに含むことができる。治療用組成物を使用して、糖尿病を処置、予防、または安定化することができる。例えば、体細胞または幹細胞は、処置を必要としている個体または健康な個体から得ることができ、本開示の方法によって幹細胞由来ベータ細胞に再プログラムすることができる。本開示の一実施形態では、幹細胞由来ベータ細胞は、選別され、濃縮され、状態を処置するために個体中に導入される。別の実施形態では、幹細胞は、個体への導入前に、ベータ細胞への分化に好適な条件下で培養され、疾患組織または損傷を受けた組織の正常な機能を置き換えるかまたは補助するために使用することができる。本開示の大きな利点は、移植に好適な同じＨＬＡ型を有する健康な個体からの、患者に特異的なヒトベータ細胞または適合性幹細胞由来ベータ細胞の本質的に制限のない供給を提供することである。細胞療法において、自家細胞および／または適合性細胞の使用は、免疫拒絶を受けやすい非自家細胞の使用に対して、より大きな利益をもたらす。対照的に、自家細胞は、重大な免疫応答を誘発しにくい。

【0353】

[0367]一部の事例では、本開示は、疾患（例えば、糖尿病）の処置のための様々な方法において、非天然膵β細胞（ベータ細胞）集団ならびに細胞の構成成分および生成物を利用することができる医薬組成物を提供する。ある特定の事例は、生細胞（例えば、単独のまたは他の細胞型と混合した非天然膵β細胞）を含む医薬組成物を包含する。他の事例は、非天然膵β細胞の構成成分（例えば、細胞溶解液、可溶性細胞画分、条件培地、ＥＣＭ、または前述のいずれかの構成成分）または生成物（例えば、非天然膵β細胞によってまたは遺伝子修飾によって生成された栄養因子および他の生体因子、非天然膵β細胞の培養からの条件培地）を含む医薬組成物を包含する。いずれかの事例では、医薬組成物は、他の活性剤、例えば、当業者に公知の抗炎症剤、外因性小分子アゴニスト、外因性小分子アンタゴニスト、抗アポトーシス剤、酸化防止剤、および／または成長因子をさらに含んでもよい。

【0354】

[0368]一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞のいずれかは、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、前記破壊は、前記遺伝子配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、前記破壊は、前記遺伝子配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、前記破壊は、前記遺伝子配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞のいずれか（例えば、ＳＣ由来ベータ細胞、または本明細書に開示されるいずれかのクラスター中の細胞のいずれか）は、少なくとも１つの遺伝子配列におけるゲノム破壊を含み、前記破壊は前記遺伝子配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは除去する。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの遺伝子配列は、ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子をコードする。一部の実施形態では、前記ＭＨＣ－クラスＩ遺伝子は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃをコードする。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの遺伝子配列は、ＣＩＩＴＡをコードする。一部の実施形態では、前記細胞は、ナチュラルキラー細胞活性化リガンド遺伝子におけるゲノム破壊を含む。一部の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞活性化リガンド遺伝子は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）をコードする。一部の実施形態では、ゲノム破壊は、遺伝子編集システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ技術の使用によって誘導される。

【0355】

[0369]本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、媒体または賦形剤）と共に製剤化される、非天然膵β細胞、またはその構成成分もしくは生成物を含むことができる。薬学的に許容される担体（または媒体）という用語は、生物学的に適合性の担体または媒体という用語と交換可能に使用することができ、治療上投与される細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症を有することなく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのにも好適である、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指し得る。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、リンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンを挙げることができる。このような調製物は、滅菌され、所望の場合、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、および着色剤などの補助剤と混合され得る。生細胞以外の細胞の構成成分または生成物を含む医薬組成物は、液体として製剤化することができる。生きた非天然膵β細胞を含む医薬組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル、ゲルカプセル、またはリポソーム）または固体（例えば、マトリックス、スキャフォールドなど）として製剤化することができる。

【0356】

[0370]本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指し得る。

【0357】

[0371]本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、１つの器官、または体の部分から、別の器官、または体の部分に対象の化合物を運ぶまたは輸送することに関連する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒カプセル化材料を指し得る。各担体は、製剤の他の成分に適合し、患者に有害でないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質無含有水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの嵩高剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２２）エタノールなどのＣ２～Ｃ１２アルコール；ならびに（２３）医薬製剤中に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤は、製剤中に存在してもよい。例えば、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において交換可能に使用される。

【0358】

[0372]細胞集団に関して本明細書で使用される「治療有効量」という表現は、任意の医学的処置に適用できる合理的なベネフィット／リスク比で、一匹の動物の少なくとも細胞小集団においていくつかの所望の治療効果を生じるのに有効である、本開示の細胞、例えば、ＳＣ－β細胞もしくは成熟膵β細胞の集団、またはＳＣ－β細胞を含む組成物における関連する細胞の量を意味する。例えば、糖化ヘモグロビンレベル、空腹時血中グルコースレベル、低インスリン血症などの１型、１．５型または２型糖尿病の少なくとも１つの症状に、統計的に有意な、測定可能な変化をもたらすのに十分である、対象に投与されたＳＣ－β細胞集団の量。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般的に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象の医学的状態の重篤度および種類、ならびに他の医薬活性剤の投与に応じて変化し得る。

【0359】

[0373]一部の事例では、幹細胞由来ベータ細胞の医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の処理を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の手法で製剤化される。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書に記載の医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）；Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５年；Ｌｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ， Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０年；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９年）に見られる。

【0360】

[0374]医薬組成物は、任意選択で、例えば、例のみとして、従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成（ｄｒａｇｅｅ－ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、捕捉または圧縮プロセスによる従来の手法で製造される。

【0361】

[0375]ある特定の実施形態では、組成物は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウムおよびトリス－ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；クエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、１つまたは複数のｐＨ調整剤または緩衝剤を含むこともできる。このような酸、塩基および緩衝剤は、組成物のｐＨを許容可能な範囲に維持するために必要な量で含まれる。

【0362】

[0376]他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の塩を、組成物のオスモル濃度を許容可能な範囲にするために必要な量で含むこともできる。このような塩は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオンおよび塩化物、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、炭酸水素、硫酸、チオ硫酸または重亜硫酸アニオンを有する塩を含み、好適な塩として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムが挙げられる。

【0363】

[0377]本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）、鼻腔内、頬側、舌下、または直腸投与経路を含むがこれらに限定されない任意の好適な投与経路によって投与される。一部の事例では、医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化される。

【0364】

[0378]本明細書に記載の医薬組成物は、任意の好適な剤形へと製剤化され、この剤形としては、限定するものではないが、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ剤、エリキシル剤、スラリー、懸濁液など（治療される個体による経口摂取のための）、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、速溶製剤、発泡性製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、散剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、遅延放出製剤、徐放製剤、拍動性の放出製剤、多重微粒子製剤、ならびに即時混合放出および制御放出製剤が挙げられる。一部の実施形態では、医薬組成物は、カプセル剤へと製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、溶液剤（例えば、ＩＶ投与のために）へと製剤化される。一部の事例では、医薬組成物は、輸液剤として製剤化される。一部の事例では、医薬組成物は、注射剤として製剤化される。

【0365】

[0379]本明細書に記載の薬学的固体剤形は、任意選択で、本明細書に記載の化合物および１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤、例えば、適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁化剤、風味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、モイスチャリング剤、可塑剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、酸化防止剤、保存剤、またはこれらの１つもしくは複数の組合せを含む。

【0366】

[0380]さらなる他の態様では、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版（２０００年）に記載されているものなど、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周りにフィルムコーティングが与えられる。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全てがコーティングされる。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全てはマイクロカプセル化される。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全ては、マイクロカプセル化されず、コーティングされない。

【0367】

[0381]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される組成物は、微生物の活性を阻害するために１つまたは複数の保存剤を含んでもよい。好適な保存剤としては、水銀含有物質、例えば、メルフェン（ｍｅｒｆｅｎ）およびチオメルサール；安定化二酸化塩素；ならびに第四級アンモニウム化合物、例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリジニウムが挙げられる。

【0368】

[0382]一部の実施形態では、本開示の組成物は、例えば、糖尿病を処置または予防するのに有効な量で、幹細胞由来ベータ細胞を含むことができる。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されている幹細胞由来ベータ細胞を含むことができる。このような組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含むことができる。

【0369】

[0383]医薬組成物は、当業者によく知られているように、補助化合物を含むことができる。例えば、医薬組成物は、使用される酸化防止剤の種類に応じて変わる範囲内で、酸化防止剤を含有することができる。通常使用される酸化防止剤の合理的な範囲は、約０．０１質量対容積％～約０．１５質量対容積％のＥＤＴＡ、約０．０１質量対容積％～約２．０質量対容積％の亜硫酸ナトリウム、および約０．０１質量対容積％～約２．０質量対容積％のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のそれぞれについて、約０．１質量対容積％の濃度を使用することができる。他の保存剤化合物としては、腎投与に好適な他の酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸ナトリウムも用いることができるが、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ－アセチルシステイン、β-メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似種が挙げられる。

【0370】

[0384]緩衝剤は、標的組織における刺激を最小限にするために、約４．０～８．０の範囲で製剤のｐＨを維持するために使用することができる。直接腹腔内注射のために、製剤は、ｐＨ７．２～７．５、好ましくはｐＨ７．３５～７．４５であるべきである。組成物は、腎臓への投与に好適な等張化剤を含んでもよい。これらの中で、血液とほぼ等張である製剤を作製するために、塩化ナトリウムが好適である。

【0371】

[0385]ある特定の事例では、医薬組成物は、粘度増強剤を用いて製剤化される。例示的な薬剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要である場合に添加される共溶媒を有してもよい。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを挙げることができる。保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、またはメチルもしくはプロピルパラベンも含まれてもよい。

【0372】

[0386]細胞、細胞の構成成分または細胞の生成物を含む医薬組成物は、当技術分野で公知のいくつかの送達方法のうちの１つまたは複数で、患者の腎臓に送達されてもよい。一部の事例では、組成物は、腎臓に送達される（例えば、腎被膜の上および／または腎被膜の下に）。別の実施形態では、組成物は、周期的な腹腔内または腎内注射によって、腎臓内の様々な位置に送達されてもよい。あるいは、組成物は、当業者に公知の他の剤形で、例えば、事前に形成されたかまたはｉｎ ｓｉｔｕで形成されたゲルまたはリポソームで適用されてもよい。

【0373】

[0387]半固体または固体担体中に生細胞を含む医薬組成物は、腎被膜の上または下に外科移植するために製剤化されてもよい。液体組成物も外科的手段で投与されてもよいことが認識されるべきである。特定の事例では、半固体または固体の医薬組成物は、非生分解性または生分解性であってもよい半透過性ゲル、格子、細胞スキャフォールドなどを含むことができる。例えば、ある特定の事例では、外因性細胞を、その周辺から隔離し、さらに、細胞が生物学的分子（例えば、インスリン）を周辺細胞または血流に対して分泌および送達できるようにすることが、望ましいかまたは適切である場合がある。これらの事例では、細胞は、移植細胞を宿主組織から物理的に分離する、非分解性で、選択的に透過性の障壁により囲まれた生きた非天然膵β細胞または非天然膵β細胞を含む細胞集団を含む自律性インプラントとして製剤化されてもよい。そのようなインプラントは、「免疫保護性」と呼ばれることもあり、これは薬理学的に誘導された免疫抑制の非存在下で、免疫細胞および巨大分子が移植細胞を死滅させるのを防ぐ能力を有するからである。

【0374】

[0388]他の事例では、様々な分解性ゲルおよびネットワークを、本開示の医薬組成物に対して使用することができる。例えば、持続放出製剤に特に好適な分解性材料としては、生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどが挙げられる。

【0375】

[0389]他の事例では、生分解性、好ましくは、生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅまたはｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）のスキャフォールドまたはマトリックス上またはその中に細胞を送達するのが望ましいかまたは適切であり得る。これらの典型的な三次元生体材料は、スキャフォールドに付着した、スキャフォールド内に分散した、またはスキャフォールドに捕捉された細胞外マトリックスに組み込まれた生細胞を含有する。一旦、身体の標的領域に移植されると、これらの移植片は宿主組織と一体となり、移植細胞が次第に確立されてくる。

【0376】

[0390]本開示において使用することができるスキャフォールドまたはマトリックス（「フレームワーク」と総称されることがある）材料の例としては、不織マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、例えば、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマー、発泡体、および／またはポリ（イプシロン－カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含む繊維を使用して形成されてもよい。

【0377】

[0391]別の実施形態では、フレームワークはフェルトであり、このフェルトは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から製造されたマルチ糸から構成され得る。この糸は、クリンピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を使用してフェルトにされる。別の実施形態では、細胞を混成構造であり得る発泡体スキャフォールド上に播種する。前記実施形態の多くでは、フレームワークは、有用な形状に成型することができる。さらに、非天然膵β細胞は、プレフォーム型の、非分解性外科用または移植用デバイス上で、培養することができる。

【0378】

[0392]マトリックス、スキャフォールドまたはデバイスは、細胞の接着を増強するために、細胞の接種前に処理することができる。例えば、接種前に、ナイロンマトリックスは、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、このナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンも硫酸を使用してて同様に処理することができる。また、フレームワークの外面は、細胞の接着または成長および組織の分化を向上させるために、例えば、フレームワークの血漿コーティングまたは１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン－４－硫酸、コンドロイチン－６－硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、および／または、以下に限定されないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの他の材料の添加などにより修飾することができる。

【0379】

[0393]一態様では、本開示は、少なくとも１つの膵β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスを提供した。本明細書において提供されるデバイスは、対象へと移植された場合に、インスリンを産生および放出するように構成され得る。デバイスは、少なくとも１つの膵β細胞、例えば、非天然膵β細胞を含む細胞クラスターを含み得る。デバイス中の細胞クラスターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＩＳを呈し得る。デバイスは、半透膜をさらに含むことができる。半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持するよう構成され、細胞クラスターによって分泌されるインスリンの通過を可能とすることができる。デバイスの一部の事例では、細胞クラスターは、半透膜によってカプセル化され得る。カプセル化は、当業者に利用可能な任意の技法によって実施され得る。半透膜は、当業者が認識し、検証するように、任意の好適な材料から作製することもできる。例えば、半透膜は、多糖またはポリカチオンから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン－酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、またはそれらの任意の組合せから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、アルギネートを含む。一部の事例では、細胞クラスターは、半透膜で囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中にカプセル化される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）と共有結合によりコンジュゲートしたオリゴペプチドを有するアルギネートコアを含むスキャフォールドを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、安定性の向上した、化学酵素的に操作されたアルギネートを有する、共有結合によって強化されたマイクロカプセルを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、アクリレート官能化されたリン脂質のｉｎ－ｓｉｔｕ重合によってアセンブルされた膜模倣フィルムを生成するために改変される。一部の事例では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して、酵素によって改変されたアルギネートから構成される。一部の事例では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接する層間に共有結合を含む。一部の実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分で連結したアルギネートを含むサブシーブカプセルを含む。一部の事例では、マイクロカプセルは、アルギネート－アガロースを含むスキャフォールドを含む。一部の事例では、ＳＣ－β細胞は、アルギネート内にカプセル化される前にＰＥＧで修飾される。一部の事例では、単離された細胞、例えば、ＳＣ－β細胞の集団は、光反応性リポソームおよびアルギネート内にカプセル化される。マイクロカプセル中に用いられるアルギネートは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キトサン、ポリエステル中空繊維、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＯＤを含むデキストラン、ＢＨＤおよびポリエチレングリコール－ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（ＭＰＣ－コ－ｎ－ブチルメタクリレート－コ－４－ビニルフェニルボロン酸（ＰＭＢＶ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、ならびにこれらの多層の事例を含む他の好適な生体材料で置き換えることができる。一部の事例では、本明細書において提供されるデバイスは、体外のセグメントを含み、例えば、デバイスの一部は、デバイスが対象に移植される場合に、対象の体外に存在し得る。体外セグメントは、本明細書において提供される細胞または細胞クラスターを含むか含まないかに関わらず、デバイスの任意の機能的構成成分を含み得る。

【0380】

処置方法
[0394]対象における疾患を処置または予防するための方法がさらに本明細書において提供される。本明細書において提供されるかまたは本明細書において提供される方法に従って産生される細胞クラスターまたは細胞を含む組成物は、対象の膵機能の度合を回復させるために、対象へと投与することができる。例えば、内因性膵島に類似する細胞クラスター、または内因性の膵α、βおよび／もしくはδ細胞（例えば、非天然膵α、βおよび／もしくはδ細胞）に類似する細胞、またはそれらの前駆体は、糖尿病を処置するために対象に移植することができる。最も典型的には、対象に投与される組成物は、完全に分化した細胞、またはほぼ完全に分化した細胞を含む。しかしながら、細胞のさらなる分化がｉｎ ｖｉｖｏで達成され得るため、本開示は、この点において限定されない。例えば、一部の実施形態では、デバイス中にカプセル化される、および／または対象に投与される組成物は、完全には分化していない細胞（例えば、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞、およびＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む組成物）を含む。

【0381】

[0395]方法は、本出願に開示されている細胞クラスターまたは細胞を対象、例えば、それを必要とする対象に移植するステップを含み得る。用語「移植するステップ」は、所望の部位に導入された細胞または細胞クラスターの少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞もしくは細胞クラスター、細胞もしくはその細胞クラスターの任意の部分、または細胞、細胞クラスターもしくはこれらの任意の部分を含む任意の組成物の対象への配置を指し得る。細胞または細胞クラスターは、膵臓に直接移植されるか、またはあるいは、移植された細胞の少なくとも一部または細胞が生存可能である対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞または細胞クラスターの生存期間は、数時間、例えば、２４時間程度の短さ、数日まで、数年ほどの長期であってもよい。一部の事例では、細胞もしくは細胞クラスター、または細胞もしくは細胞クラスターのいずれかの部分は、例えば、移植した細胞または細胞クラスターを移植した位置に維持し、移動を避けるために、カプセル（例えば、マイクロカプセル）で、膵臓以外の位置、例えば、肝臓内または皮下に、経投与されてもよい。

【0382】

[0396]本明細書で使用される場合、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物（例えば、細胞クラスターまたはその一部）を対象に投与することを指し得る。この開示の目的として、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（例えば、部分的または全体的）が挙げられる。処置することは、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存が延長されることを指し得る。よって、当業者は、処置が、疾患状態を改善することができるが、疾患に対する完全な治癒でなくてもよいことを理解する。本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防を含む。

【0383】

[0397]例示的な投与方式としては、以下に限定されないが、注射、注入、点眼、吸入、または摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注射または注入によって投与される。

【0384】

[0398]疾患または障害の「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、このような疾患または障害の開始を遅延または予防すること、このような疾患または障害に関連する状態の進行、深刻化または悪化、進行または重篤度を、反転、緩和、改善、阻害、緩慢化または停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。

【0385】

[0399]糖尿病の処置は、標準的な医学的方法によって決定される。糖尿病処置の目標は、可能な限り安全に、糖レベルを低下させて、正常に近づけることである。共通して設定される目標は、食前に、１デシリットル当たり８０～１２０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）であり、就寝時に、１００～１４０ｍｇ／ｄｌである。特定の内科医は、他の要因、例えば、多くの場合、患者が低血糖反応をどの程度有するかに応じて、患者に対して異なる標的を設定してもよい。有用な医療的試験としては、血糖レベルを決定するための患者の血液および尿における試験、グリコシル化ヘモグロビンレベル（ＨｂＡ１ｃ；過去２～３カ月にわたる平均血中グルコースレベルの測定、正常範囲は４～６％である。）についての試験、コレステロールおよび脂肪レベルについての試験、ならびに尿タンパク質レベルについての試験が挙げられる。このような試験は、当業者に公知の標準的な試験である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９８年を参照されたい）。好効果の処置プログラムは、そのプログラムにおいて、糖尿病に関する合併症、例えば、目の疾患、腎臓疾患、または神経疾患を患者がほとんど患っていないことによっても決定することができる。

【0386】

[0400]対象における糖尿病の開始を遅延させることは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年またはそれより長い期間、対象の寿命全体を含み得る間、糖尿病の少なくとも１つの症状、例えば、高血糖、低インスリン血症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム硬化症、および高血圧を含む）、神経症、自律神経機能不全、高血糖性高浸透圧昏睡、またはこれらの組合せの開始の遅延を指す。

【0387】

[0401]一部の態様では、本開示は、本明細書において提供される細胞または細胞クラスター（例えば、インスリン産生細胞）を含むデバイスを対象に移植するステップを含む方法であって、デバイスが、対象における血中グルコースレベルの低減に十分な量でインスリンを放出する方法に関する。一部の実施形態では、インスリン産生細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞である。

【0388】

[0402]一部の実施形態では、本明細書において提供される細胞もしくは細胞クラスター、またはデバイスの移植によって誘導されるように、対象における血中グルコースレベルの低減は、糖尿病の閾値よりも低いグルコースの量をもたらす。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒトである。一部の実施形態では、グルコースの量は、移植の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日後に、糖尿病の閾値よりも低く低下される。

【0389】

[0403]上記で詳細に記載されているように、本開示の医薬組成物は、以下の：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水性溶液または懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、頬、舌下、および全身での吸収を標的とするもの）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布用のペースト剤；（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液剤もしくは懸濁剤、または持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による；（３）局所塗布、例えば、クリーム剤、軟膏剤または制御放出パッチもしくは皮膚に塗布されるスプレー剤；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻に採用されたものを含む固体または液体形態での投与用に専用に製剤化され得る。さらに、化合物は、患者に移植するか、または、薬剤送達システムを使用して注射され得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２４：１９９～２３６頁（１９８４年）；Ｌｅｗｉｓ編 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１年）；米国特許第３，７７３，９１９号；および米国特許第３５３，２７０，９６０号明細書を参照されたい。

【0390】

[0404]本明細書の方法によって処置することができる対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の事例では、対象は、哺乳動物であり得る。対象の例としては、以下に限定されないが、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー（bamboo）、またはヒトが挙げられる。一部の事例では、対象は、ヒトである。対象は、以下に限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどを含む非霊長類の動物であってもよい。一部の事例では、処置を受けている対象は、それを必要とする対象、例えば、それを必要とするヒトである。

【0391】

[0405]ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「患者」および「対象」は、本明細書において交換可能に使用される。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、１型糖尿病、２型真性糖尿病、または糖尿病前症の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載の方法を使用して、家畜および／またはペットを処置することができる。対象は、雄であっても雌であってもよい。対象は、糖尿病（例えば、１型または２型）、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を患っているか、または有すると予め診断または特定されている者、および任意選択で、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症に対する処置を受ける必要がなかった者であり得る。対象は、糖尿病または糖尿病前症を患っていない者であってもよい。対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を患っていると診断または特定されているが、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症についての１つまたは複数の処置を受けた結果として、公知の糖尿病リスク要因における改善を示す者であってもよい。あるいは、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を有すると予め診断されていない者であってもよい。例えば、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する合併症、もしくは糖尿病前症についての１つもしくは複数のリスク要因を呈する者、または糖尿病リスク要因を呈さない対象、または糖尿病、１つもしくは複数の糖尿病関連の合併症、もしくは糖尿病前症について無症候である対象であってもよい。対象は、糖尿病もしくは糖尿病前症を患っているかまたは糖尿病もしくは糖尿病前症になるリスクにある者であってもよい。対象は、本明細書で定義されているように、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症または糖尿病前症を有すると診断または特定された者であってもよく、あるいは、対象は、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症または糖尿病前症を有すると予め診断または特定されていない者であってもよい。

【0392】

[0406]方法は、当技術分野の任意の手段を使用して、細胞クラスターを対象に移植するステップを含み得る。例えば、方法は、腹腔内空間、腎被膜下、腎被膜、大網、皮下空間を介して、または膵床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｄ）注入によって、細胞クラスターを移植するステップを含み得る。例えば、移植は、被膜下移植、筋肉内移植、または門脈内移植、例えば、門脈内注入であり得る。免疫防御性カプセル化は、細胞クラスターに免疫防御性を与えるために実行され得る。一部の事例では、本明細書において提供される処置の方法は、移植片（例えば、細胞またはデバイス）に対する移植拒絶応答または他の免疫応答をモジュレートするまたは低減するための免疫応答モジュレーターを投与することを含み得る。この方法において使用することができる免疫応答モジュレーターの例としては、アザチオプリンおよびミコフェノール酸のようなプリン合成阻害剤、レフルノミドおよびテリフルノミドのようなピリミジン合成阻害剤、メトトレキサートのような抗葉酸剤、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、レナリドマイド、ポマリドミド、サリドマイド、ＰＤＥ４阻害剤、アプレミラスト、アナキンラ、シロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗リンパ球グロブリン抗体、ＣＴＬＡ－４、その断片、ならびにアバタセプトおよびベラタセプトのようなその融合タンパク質、エタネルセプトおよびペグスネルセプトのようなＴＮＦ阻害剤、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、エクリズマブのような補体成分５に対する抗体、アダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、インフリキシマブ、およびネレリモマブのような抗ＴＮＦ抗体、メポリズマブのようなインターロイキン５に対する抗体、オマリズマブのような抗ＩｇＥ抗体、ファラリモマブのような抗インターフェロン抗体、エルシリモマブのような抗ＩＬ－６抗体、レブリキズマブおよびウステキヌマブのようなＩＬ－１２およびＩＬ－２３に対する抗体、セクキヌマブのような抗ＩＬ－１７抗体、ムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビシリズマブのような抗ＣＤ３抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、およびザノリムマブのような抗ＣＤ４抗体、エファリズマブのような抗ＣＤ１１ａ抗体、エルリズマブのような抗ＣＤ１８抗体、オビヌツズマブ、リツキシマブ、オクレリズマブおよびパスコリズマブのような抗ＣＤ２０抗体、ゴミリキシマブおよびルミリキシマブのような抗ＣＤ２３抗体、テネリキシマブおよびトラリズマブのような抗ＣＤ４０抗体、アセリズマブのようなＣＤ６２Ｌ／Ｌ－セレクチンに対する抗体、ガリキシマブのような抗ＣＤ８０抗体、ガビリモマブのような抗ＣＤ１４７／ベイシジン抗体、ルプリズマブのような抗ＣＤ１５４抗体、ベリムマブおよびブリシビモドのような抗ＢＬｙＳ抗体、イピリムマブおよびトレメリムマブのような抗ＣＴＬＡ－４抗体、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ、およびメテリムマブのような抗ＣＡＴ抗体、ナタリズマブのような抗インテグリン抗体、トシリズマブのようなインターロイキン－６受容体に対する抗体、オデュリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）のような抗ＬＦＡ－１抗体、バシリキシマブ、ダシリズマブ、およびイノリモマブのようなＩＬ－２受容体／ＣＤ２５に対する抗体、アトロリムマブ、セデリズマブ、フォントリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトックス、バパリキシマブ、およびベパリモマブのようなＴリンパ球（ゾリモマブアリトック）に対する抗体を挙げることができる。

【0393】

[0407]「消泡剤」は、水性分散液の凝固、完成フィルム中の泡を生じさせ得るか、または一般に加工を害し得る、加工中の発泡を減少させる。例示的な消泡剤としては、シリコンエマルジョンまたはソルビタンセスキオレアートが挙げられる。

【0394】

[0408]「酸化防止剤」としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびトコフェロールが挙げられる。ある特定の実施形態では、酸化防止剤は必要に応じて化学的安定性を高める。

【0395】

[0409]本明細書に記載の製剤は、酸化防止剤、金属キレート剤、チオール含有化合物および他の一般的な安定化剤から利益を得ることができる。このような安定化剤の例としては、以下に限定されないが、（ａ）約０．５％～約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％～約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１～約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ～約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％～約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）約０．００３％～約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％～約０．５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）デキストラン硫酸、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ペントサンポリサルフェートおよび他のヘパリン類似物質、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価のカチオン；または（ｎ）これらの組合せが挙げられる。

【0396】

[0410]「結合剤」は、粘着性を与え、例えば、アルギン酸およびその塩；セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））；微結晶性デキストロース；アミロース；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファ化デンプン；トラガカント、デキストリン、糖、例えば、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトース；天然または合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカント、ガティガム、イサポール殻（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋ）の粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ－１０）、ラーチ・アラボガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、ロウ、アルギン酸ナトリウムなどを含む。

【0397】

[0411]「担体」または「担体材料」としては、医薬において一般的に使用される任意の賦形剤が挙げられ、本明細書に開示されている化合物、例えば、イブルチニブの化合物および抗がん剤との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「薬学的に適合性の担体材料」としては、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスフォチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖類 ステアロイルラクチル酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５年；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、１９８０年；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔＴ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照されたい。

【0398】

[0412]「分散剤」、および／または「粘度調整剤」としては、液体媒体または造粒法もしくはブレンド法によって薬物の拡散および均質性を制御する材料が挙げられる。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングまたは浸食性マトリックスの有効性を促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤としては、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０もしくは８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として商業的に公知）、および炭水化物系分散剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、およびＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ Ｋ１００、ＨＰＭＣ Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、非結晶性セルロースなど、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、エチレンオキシドおよびホルムアルデヒドとの４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェノールポリマー（チロキサポールとしても公知）、ポロキサマー（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロック共重合体である、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）、およびＦ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、エチレンジアミンへのプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドの逐次付加から誘導された四官能性ブロック共重合体である、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ９０８（登録商標）としても公知の、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ－６３０）、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールは約３００～約６０００、または約３３５０～約４０００、または約７０００～約５４００の分子量を有し得る、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴムおよびアカシアゴム、グアーゴム、キサンタン（キサンタンゴムを含む）など、糖類、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギネート、キトサンおよびそれらの組合せが挙げられる。セルロースまたはトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用することができる。リポソーム分散液および自己乳化分散液において特に有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロールおよびミリスチン酸イソプロピルである。

【0399】

[0413]１つまたは複数の浸食促進剤の１つまたは複数の拡散促進剤との組合せも本発明の組成物において使用することができる。
[0414]用語「希釈剤」は、送達前に目的の化合物を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤は、それらがより安定な環境を提供し得るため、化合物を安定化させるためにも使用され得る。リン酸緩衝生理食塩水溶液を含むが、これらに限定されない、緩衝溶液中に溶解した塩（これはまた、ｐＨ制御または維持も提供し得る）が当技術分野で希釈剤として利用される。ある特定の実施形態では、希釈剤は、カプセル充填のための均一な配合のために圧縮を促進するかまたは十分なかさを作り出すために、組成物のかさを増加させる。このような化合物としては、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；第二リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース系希釈剤、精製粉末糖；第一硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート；加水分解した穀物固形物、アミロース；粉末化セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどが挙げられる。

【0400】

[0415]「充填剤」としては、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン類、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物が挙げられる。

【0401】

[0416]「滑沢剤」および「流動化剤」は、材料の付着または摩擦を防止、低減または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウムステアリルフマレート、鉱物油などの炭化水素、または水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素添加植物油、高級脂肪酸およびアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛などのそれらのアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ロウ、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００）またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムもしくはナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などが挙げられる。

【0402】

[0417]「可塑剤」は、マイクロカプセル材料またはフィルムコーティングの脆性を低下させるようにそれらを軟化させるために使用される化合物である。好適な可塑剤としては、例えば、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００、ＰＥＧ １４５０、ＰＥＧ ３３５０、およびＰＥＧ ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロースおよびトリアセチンが挙げられる。一部の実施形態では、可塑剤はまた、分散剤または湿潤剤としても機能し得る。

【0403】

[0418]「可溶化剤」としては、例えば、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００～６００、グリコフロール、トランスクトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物が挙げられる。

【0404】

[0419]「安定化剤」としては、任意の酸化防止剤、緩衝剤、酸、保存剤などの化合物が挙げられる。
[0420]「懸濁化剤」としては、例えば、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００～約６０００、または約３３５０～約４０００、または約７０００～約５４００の分子量を有し得る）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガカントガムおよびおよびアカシアガム、グアーガム、キサンタンガムを含むキサンタンなどのガム、糖類、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系材料、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシ化モノラウリン酸ソルビタン、ポリエトキシ化モノラウリン酸ソルビタン、ポビドンなどの化合物が挙げられる。

【0405】

[0421]「界面活性剤」としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物が挙げられる。いくつかの他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素添加ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０が挙げられる。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理安定度を増強するためまたは他の目的のために含まれてもよい。

【0406】

[0422]「粘度増強剤」としては、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサンおよびこれらの組合せが挙げられる。

【0407】

[0423]「湿潤剤」としては、例えば、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクサート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｃｃｕｓａｔｅ）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物が挙げられる。

【実施例】

【0408】

[0424]これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明において与えられる請求項の範囲を限定するものではない。
実施例１．膵内分泌細胞の分化のためのＰＫＣ活性化剤の適用
[0425]この実施例は、膵β、α、δ、またはＥＣ細胞などの異なる膵内分泌細胞の生成におけるＰＫＣ活性化剤の効果を示す。

【0409】

[0426]本開示による例示的な分化プロトコール、例えば、バージョンＡおよびバージョンＢを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコースチャレンジに応答してインスリンを放出することができる成熟β細胞にヒト幹細胞を分化させるために試験した。

【0410】

[0427]バージョンＡとバージョンＢプロトコールはいずれも、類似の試薬および処置時期を共有する６ステージの段階的プロトコールである。バージョンＡプロトコールで、幹細胞を、最初の５ステージ中、以下の連続した順序で試薬により処理した：ステージ１（Ｓ１）、アクチビン－Ａを３日間、また最初の２４時間はＣＨＩＲ９９０２１も；ステージ２（Ｓ２）、ＫＧＦを３日間；ステージ３（Ｓ３）、ＫＧＦ、ＰＤＢＵ、Ｓａｎｔ－１、レチノイン酸（ＲＡ）、アクチビンＡ、およびチアゾビビンを２日間、また１日目はＤＭＨ－１も；ステージ４（Ｓ４）、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ－１、チアゾビビン、アクチビンＡ、およびＲＡを６日間；ステージ５（Ｓ５）、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、ＧＣ－１、ＬＤＮ－１９３１８９、チアゾビビン、スタウロスポリン、およびＤＺＮＥＰを７日間、また最初の２日間はＲＡ、Ｓａｎｔ－１、およびベータセルリンも。バージョンＢプロトコールでは、バージョンＡプロトコールとの違いの１つは、ステージ４の５日目（Ｓ４ｄ５）からステージ５の２日目（Ｓ５ｄ２）まで、細胞にＰＤＢＵを補充したことである。一実験では、５００ｎＭのＰＤＢＵを用いて、Ｓ４ｄ５～Ｓ５ｄ２の間に細胞を処理した。

【0411】

[0428]図１における単一細胞ＲＮＡ配列決定の概略図に示されるように、Ｓ５分化の完了時に、バージョンＢプロトコールを介して産生された細胞（Ｓ５ｃ細胞）およびバージョンＡプロトコールを介して産生されたＳ５ｃ細胞は、ＣＨＧＡ（クロモグラニンＡをコードする遺伝子；膵内分泌細胞の例示的マーカー）を発現する細胞の同程度のパーセンテージ、およびＩＳＬ１（膵島細胞の例示的マーカー）を発現する細胞の同程度のパーセンテージを有した。対照的に、バージョンＢプロトコールを介して産生されたＳ５ｃ細胞は、ＤＤＣ（ドーパ脱炭酸酵素をコードする遺伝子；腸クロム親和性（ＥＣ）細胞の例示的マーカー）を発現する細胞のパーセンテージが大幅に減少した。

【0412】

[0429]一実験では、４つの異なる例示的なステージ６処置パラダイムもまた、バージョンＡまたはバージョンＢプロトコールの最初の５ステージと組み合わせて、Ｓ６で試験した。簡単に説明すると、ｉ）Ｓ６－ａパラダイムで、Ｓ５ｃ細胞を、１％ＨＳＡを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で７～１４日間培養し；ｉｉ）Ｓ６－ｂパラダイムで、Ｓ５ｃ細胞を、０．０５％ＨＳＡと、以下の補充物（１Ｌ当たり、ＭＣＤＢ１３１）：０．４４ｇグルコース、１．２３ｇ ＮａＨＣＯ３、０．０４４ｇビタミンＣ、１０ｍｌ Ｇｌｕｔａｍａｘ、および５ｍｌ ＩＴＳ－ｘを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で培養し；（ｉｉｉ）Ｓ６－ｃパラダイムで、Ｓ５ｃ細胞を、０．０５％ＨＳＡおよびビタミンＣを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で７～１４日間培養し、その間、細胞を１０μＭ Ａｌｋ５ｉ、１μＭ ＧＣ－１、１００ｎＭ ＬＤＮ－１９３１８９、２．５μＭチアゾビビン、３ｎＭ ＳＳＰ、および１００ｎＭ ＤＺＮＥＰで最初の４日間を処置し；ｉｖ）Ｓ６－ｄパラダイムで、Ｓ５ｃ細胞を、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣ、および４ｍＭ Ｇｌｎ、ならびに１０μＭ Ａｌｋ５ｉ、１μＭ ＧＣ－１、１００ｎＭ ＬＤＮ－１９３１８９、２．５μＭチアゾビビン、３ｎＭ ＳＳＰ、および１００ｎＭ ＤＺＮＥＰを含有するＭＣＤＢ１３１培地（グルタミンなしの基本培地）中で４日間培養し、続いて、０．０５％ＨＳＡ、ＩＴＳ－Ｘ、ビタミンＣ、および４ｍＭ Ｇｌｎを含有するが、追加の因子を含まないＭＣＤＢ１３１（グルタミンなしの基本培地）中でさらに３～１０日間培養した。

【0413】

[0430]図２Ａは、フローサイトメトリー（図２Ｂ）によって測定した場合、バージョンＡプロトコールと比較して、バージョンＢプロトコールによって産生されたＣ－ペプチドを発現し、ＶＭＡＴ１（Ｓｃ－β細胞の例示的特徴）を発現しない細胞のパーセンテージの増加を示す。図に示されるように、バージョンＡプロトコールでは、Ｓ６ｄ９またはＳ６ｄ１４でのＣ－ペプチド陽性、ＶＭＡＴ１陰性細胞のパーセンテージは、Ｓ６ｄ９でのＶＡ／Ｓ６－ａおよびＶＡ／Ｓ６－ｄ（いずれも約４０％）を除き、全て約３５％であったが、バージョンＢプロトコールでは、Ｃ－ペプチド陽性、ＶＭＡＴ１陰性細胞のパーセンテージは、Ｓ６ｄ９で４５％～５５％であり、Ｓ６ｄ１４で約４５％であった。

【0414】

[0431]図３～５は、バージョンＡプロトコールと比較して、バージョンＢプロトコールを用いて、α細胞（フローサイトメトリーを介してグルカゴン（ＧＣＧ）を発現するが、ソマトスタチン（ＳＳＴ）を発現しない細胞によって測定される）、δ細胞（フローサイトメトリーを介してＳＳＴを発現するが、ＧＣＧを発現しない細胞によって測定される）、およびＥＣ細胞（フローサイトメトリーを介してＶＭＡＴ１を発現するが、Ｃ－ペプチドを発現しない細胞によって測定される）のパーセンテージの変化を示す。図３に示されるように、バージョンＡプロトコールでは、Ｓ６ｄ９またはＳ６ｄ１４でのα細胞のパーセンテージは全て５％未満またはその周辺であったが、バージョンＢプロトコールでは、α細胞のパーセンテージは、Ｓ６ｄ９で１２．５％～１７％であり、Ｓ６ｄ１４で１５％周辺（ｖＢ／Ｓ６－ｃおよびｖＢ／Ｓ６－ｄ）または２２％周辺（ｖＢ／Ｓ６－ａおよびｖＢ／Ｓ６－ｂ）であった。図４に示されるように、ｖＡプロトコールでは、Ｓ６ｄ９またはＳ６ｄ１４でのδ細胞のパーセンテージは、２％未満もしくはその周辺（ｖＡ／Ｓ６－ａおよびｖＡ／Ｓ６－ｂ）または２％～３％（ｖＡ／Ｓ６－ｃおよびｖＡ／Ｓ６－ｄ）であったが、バージョンＢプロトコールでは、δ細胞のパーセンテージは、Ｓ６ｄ９およびＳ６ｄ１４で５％周辺（ｖＢ／Ｓ６－ａ）、Ｓ６ｄ９で７％周辺ならびにＳ６ｄ１４で５％周辺（ｖＢ／Ｓ６－ｂ）、Ｓ６ｄ９およびＳ６ｄ１４で６％～７％（ｖＢ／Ｓ６－ｃ）、またはＳ６ｄ９およびＳ６ｄ１４で８％周辺（ｖＢ／Ｓ６－ｄ）であった。図５に示されるように、バージョンＡプロトコールでは、Ｓ６ｄ９またはＳ６ｄ１４でのＥＣ細胞のパーセンテージは、４０％～５０％（ｖＡ／Ｓ６－ａ）、３５％～４５％（ｖＡ／Ｓ６－ｂ）、または２５％～３５％（ｖＡ／Ｓ６－ｃおよびｖＡ／Ｓ６－ｄ）であったが、ｖＢプロトコールでは、ＥＣ細胞のパーセンテージは全て、Ｓ６ｄ９およびＳ６ｄ１４で２０％未満であった。

【0415】

[0432]一実験では、ＳＯＸ９発現をバージョンＡとバージョンＢプロトコールの間で比較し、Ｓ５の終わりに、バージョンＡプロトコールと比較してバージョンＢプロトコールでＳＯＸ９を発現する細胞が増加していることが分かった（図６Ａ）。別の実験では、Ｓ５の終わりからＳ６の始まりまでの間に再凝集ステップが導入された。簡単に説明すると、Ｓ５ｃ細胞クラスターを回収し、酵素で細胞懸濁液中に解離し、次にＳ６培養培地中で培養して、新しい細胞クラスターに再凝集させた。図６Ｂは、異なる分化プロトコールによる再凝集ステップ後のＳ６中にＳＯＸ９を発現する細胞のパーセンテージをまとめる。別の実験では、Ｓ６細胞回収パーセンテージを調査し、Ｓ６の開始時（Ｓ５ｃ細胞の解離後、例えば、２００万／ｍｌ）における初期種子密度に対するＳ６のある時点（例えば、Ｓ６ｄ４、Ｓ６ｄ９、またはＳ６ｄ１４）における細胞密度の比を測定した。図７に示されるように、バージョンＢプロトコールは、バージョンＡプロトコールと比較して類似のＳ６細胞回収パーセンテージを有した。

【0416】

[0433]一実験では、バージョンＡおよびバージョンＢプロトコールによって産生されたＳ６ｄ１３細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を調査した。図８に示されるように、バージョンＢプロトコールで産生された細胞は、グルコースチャレンジに対して比較的低い応答性を示し、２．８ｍＭグルコースチャレンジと比較して、２０ｍＭグルコースチャレンジに応答したインスリン分泌の明確な増加はなかった。対照的に、ｖＡ／Ｓ６－ａプロトコールで産生された細胞は、２．８ｍＭグルコースチャレンジと比較して、２０ｍＭに応答したインスリン分泌の急激な増加を示した。一方、バージョンＢプロトコールで産生された細胞中のインスリン含量は、バージョンＢプロトコールで産生された細胞と同等であった（図９）。

【0417】

[0434]一実験では、ＰＤＢＵおよびガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸＩの適用の効果を試験した。この実験では、３つの分化条件を調査し、比較した：バージョンＡプロトコール；バージョンＢ；バージョンＢ＋ＸＸＩ（ＰＤＢＵとＸＸＩの両方をＳ４ｄ５からＳ５ｄ２に適用し、ＸＸＩをＳ５全体にわたって適用し続けた）。図１０Ｂは、フローサイトメトリー（図１０Ａに例示）によって測定した場合、異なるプロトコールを介して産生されたＳ５ｃにおけるＩＳＬ１陽性細胞およびＩＳＬ１陰性細胞のパーセンテージをまとめる。図に示されるように、ＰＫＣ活性化とＳ４中に開始するガンマセクレターゼ阻害の組合せは、ＩＳＬ１陽性細胞の約６５％から９０％を超える強い誘導をもたらしたが、一方、ＰＫＣ活性化単独は、約８０％のＩＳＬ１陽性細胞をもたらした。

【0418】

[0435]別の実験では、２つの異なるＰＫＣ活性化剤が腸クロム親和性細胞およびα細胞に及ぼす影響を調査した。この実験では、３つの分化条件を調査し、比較した：バージョンＡプロトコール；Ｓ４ｄ５、Ｓ５ｄ１、およびＳ５ｄ２（ＶＡ＋ＰＤＢＵ）日目に０．５μＭでＰＤＢＵを適用したバージョンＡ；ならびにＳ４ｄ５、Ｓ５ｄ１、およびＳ５ｄ２（ＶＡ＋ＴＰＰＢ）日目に０．１μＭで（（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム）を有するバージョンＡ。図１１Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合（図１１Ａに例示される）、異なるプロトコールを介して産生されたＳ５ｃにおけるＮＫＸ６．１陽性／ＩＳＬ陰性細胞およびＩＳＬ１陽性／ＮＫＸ６．１陰性細胞のパーセンテージをまとめる。図に示されるように、ＶＡ／ＴＰＰＢは、ｓｃ－ＥＣ細胞を減少させ、α細胞を増加させるのにＶＡ／ＰＤＢＵと同様に有効であった。しかしながら、ＶＡ／ＴＰＰＢは、ＶＡ／ＰＤＢＵ（図１１Ｃ）と比較して、全細胞の収率を驚くべきことに２倍超で増加させた。Ｓ４ｄ５、Ｓ５ｄ１、およびＳ５ｄ２日目のＶＡ／ＴＰＰＢへのＸＸＩの添加は、細胞収量の減少を引き起こした（図１１Ｃ）。

【0419】

[0436]本開示の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には自明であろう。多数の変化、変更、および置換が、ここで、本開示から逸脱することなく当業者に対して生じるであろう。本開示の実施形態に対する様々な代替物が、本開示の実践において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物がそれらによってカバーされることが意図される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【国際調査報告】