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特表2023-537341複数のポリペプチドをアッセイするためのシステム及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-31
(54)【発明の名称】複数のポリペプチドをアッセイするためのシステム及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230824BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20230824BHJP
C12Q 1/6834 20180101ALI20230824BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20230824BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230824BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20230824BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12Q1/25
C12Q1/6834 Z
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6869 Z
C07K17/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023507234
(86)(22)【出願日】2021-07-27
(85)【翻訳文提出日】2023-03-29
(86)【国際出願番号】 US2021043297
(87)【国際公開番号】W WO2022026458
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】63/057,754
(32)【優先日】2020-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＳＰＡＮ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523032526
【氏名又は名称】プロティリオン・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ゴトリク，マイケル・ロイ
(72)【発明者】
【氏名】レイトン，カーティス・ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】バイデャナサン，パバナプレサン・プシュパギリ
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ21
4B063QQ43
4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QR01
4B063QR20
4B063QR58
4B063QR63
4B063QR83
4B063QS15
4B063QS28
4B063QS39
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA54
4H045BA60
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA80
(57)【要約】
本開示は、複数のポリペプチドの機能又は特性をアッセイするための組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ポリペプチドの大きな集団のハイスループット特徴付けのための方法を提供する。各ポリペプチドは、固体表面、例えばビーズ上に提示され、固体表面は、ポリペプチドをコードする核酸も提示する。例えば、各ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸に共有結合され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチド及び核酸は、並行して、同じ装置によってアッセイされる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のポリペプチドのハイスループット解析の方法であって、（ａ）複数のビーズを提供するステップであって、複数のビーズのビーズが、ポリペプチドをコードする異なる核酸分子にコンジュゲートされる、ステップ；
（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸分子をプロセシングして、コードされたポリペプチドを産生するステップであって、前記複数のビーズのビーズが、コードされたポリペプチドにコンジュゲートされる、ステップ；
（ｃ）コードされたポリペプチドをアッセイして、コードされたポリペプチドの１つ又はそれ以上の特性を同定するステップ；
（ｄ）ポリペプチドをコードする核酸分子をシークエンシングして、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列を同定するステップ；並びに
（ｄ）各ポリペプチドの１つ又はそれ以上の特性を、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列にリンクさせるステップを含む、方法。
【請求項2】
コードされたポリペプチドが、ビーズに直接コンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
コードされたポリペプチドが、核酸分子にコンジュゲートされ、それによりポリペプチドをビーズにコンジュゲートする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
（ａ）複数のビーズの各ビーズを核酸分子にコンジュゲートするステップを含み、各核酸分子が複数のポリペプチドのうち１つのポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
（ｂ）核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ、及びポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップ又はポリペプチドを核酸分子にコンジュゲートするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ａ）が、第１のマイクロエマルジョン液滴中で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（ａ）が、各マイクロエマルジョン液滴中で各核酸分子を増幅し、それにより、各ビーズ上の核酸分子の同種集団を産生するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が、第２のマイクロエマルジョン液滴中で実施される、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ステップ（ｂ）が、無細胞系においてｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
核酸分子及びポリペプチドが、発現されたタンパク質のライゲーションにより、又はタンパク質のトランススプライシングにより、コンジュゲートされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ビーズ又は核酸分子が、捕捉部分にコンジュゲートされ、かつポリペプチドが結合タグを含み、捕捉部分及び結合タグがコンジュゲートされ、それによりビーズをポリペプチドにコンジュゲートするか又は核酸分子をポリペプチドにコンジュゲートする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
捕捉部分及び結合タグのコンジュゲーションが、結合酵素によって触媒される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
結合酵素が、第２の核酸によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
結合酵素が、単離された酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
結合酵素が、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、ペプチリガーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、トランスグルタミナーゼ、チューブリンチロシンリガーゼ、ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ、又はＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅである、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
結合酵素が、ソルターゼＡであり、１つの捕捉部分又は結合タグが、遊離のＮ末端グリシン残基を有するポリペプチドを含み、かつ
その他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
結合酵素がブテラーゼ１であり、１つの捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＸＸ（配列番号２）を含むポリペプチドを含み、ここでＸ１はＰ、Ｄ、又はＥを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＩ、Ｌ、Ｖ、又はＣであり；Ｘは任意のアミノ酸であり、かつ
その他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＤＨＶ又はＮＨＶを含むポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
結合酵素がトリプシリガーゼであり、１つの捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＲＨＸＸ（配列番号３）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸であり、かつ
その他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＹＲＨを含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
結合酵素がオムニリガーゼであり、捕捉部分が、カルボキサミド－メチル（ＯＣａｍ）を含み、かつ
結合タグが、アシル－アクセプター求核剤として作用する遊離のＮ末端アミノ酸を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
結合酵素が、ホルミルグリシン生成酵素であり、捕捉部分が、アルデヒド反応基を含み、かつ
結合タグが、アミノ酸配列ＣＸＰＸＲ（配列番号４）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
結合酵素が、トランスグルタミナーゼであり、１つの捕捉部分又は結合タグが、リジン残基又は遊離のＮ末端アミノ基を含むポリペプチドを含み、かつ
他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号５）を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項23】
結合酵素が、チューブリンチロシンリガーゼであり、１つの捕捉部分又は結合タグが、遊離のＮ末端チロシン残基を含むポリペプチドを含み、かつ
他の捕捉部分又は結合タグが、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＤＳＶＥＧＥＥＥＧＥＥ（配列番号６）を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項24】
結合酵素が、チューブリンホスホパンテテニルトランスフェラーゼであり、捕捉部分が、補酵素Ａ（ＣｏＡ）を含み、かつ
結合タグが、アミノ酸配列ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項25】
結合酵素が、ＳｐｙＬｉｇａｓｅであり、１つの捕捉部分又は連結タグが、アミノ酸配列ＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤ（配列番号８）を含むポリペプチドを含み、かつ
他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号９）を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項26】
結合酵素が、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅであり、１つの捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＤＩＰＡＴＹＥＦＴＤＧＫＨＹＩＴＮＥＰＩＰＰＫ（配列番号１０）を含むポリペプチドを含み、かつ
他の捕捉部分又は結合タグが、アミノ酸配列ＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ（配列番号１１）を含むポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項27】
捕捉部分が二本鎖ＤＮＡを含み、かつ結合タグがポリペプチドを含み、捕捉部分及び結合タグがロイシンジッパーを形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項28】
捕捉部分が、核酸配列ＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号１２）を含み、かつ結合タグが、アミノ酸配列ＤＰＡＡＬＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＧＧＣ（配列番号１３）を含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
各ビーズが、１００又はそれ以上のコピーの核酸分子にコンジュゲートされる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
各ビーズが、１００又はそれ以上のコピーのコードされたポリペプチドにコンジュゲートされる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
ステップ（ａ）の複数のビーズが、１×１０６個と１×１０１０個の間のビーズを含み、各前記ビーズが、特有のアミノ酸配列を有するポリペプチドにコンジュゲートされる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
特有のアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のコピーのポリペプチドが、ステップ（ａ）の複数のビーズ内の２つ又はそれ以上のビーズのそれぞれにコンジュゲートされる、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
特有のアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のコピーのポリペプチドが、ステップ（ａ）の複数のビーズ内の２個と１５個の間のビーズのそれぞれにコンジュゲートされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
各前記ポリペプチドの１つ又はそれ以上の機能又は特性の少なくとも１つが、４０℃より高い温度で、８．０より高いｐＨで、かつ／又は６．０より低いｐＨでアッセイされる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
ポリペプチドの機能又は特性が、ポリペプチドの生物学的活性である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
ポリペプチドの１つ又はそれ以上の機能又は特性の少なくとも１つが、ポリペプチドの結合特性である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
結合特性が、リガンド結合アッセイ、平衡結合アッセイ、及び／又はキネティック結合アッセイによって定量される、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ポリペプチドの１つ又はそれ以上の機能又は特性の少なくとも１つが、ポリペプチドの酵素活性である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
ポリペプチドの１つ又はそれ以上の機能又は特性の少なくとも１つが、ポリペプチドの安定性である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
ポリペプチドの安定性が、熱変成アッセイ、化学変性アッセイ、又はｐＨ変性アッセイによって定量される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
（ｂ）（ｉｉ）が、２つ若しくはそれ以上、３つ若しくはそれ以上、４つ若しくはそれ以上、又は５つ若しくはそれ以上のポリペプチドの特性又は機能をアッセイするステップを含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
２つ若しくはそれ以上、３つ若しくはそれ以上、４つ若しくはそれ以上、又は５つ若しくはそれ以上のポリペプチドの特性又は機能をアッセイするステップが、同時に又は順に実施される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
機能又は特性の少なくとも１つが、複数の温度で、複数のｐＨレベルで、複数の塩濃度で、及び／又は複数の緩衝液中でアッセイされる、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
複数のポリペプチドが、抗原、抗体、酵素、基質、又は受容体のライブラリーを含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
抗原のライブラリーが、１つ又はそれ以上のウイルスのウイルスタンパク質エピトープを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
ポリペプチドをビーズにコンジュゲートする方法であって、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸分子を、第１のマイクロエマルジョン液滴中のビーズにコンジュゲートするステップ；及び
（ｂ）第２のマイクロエマルジョン液滴中で核酸分子をプロセシングするステップ
を含み、プロセシングするステップが、
（ｉ）核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ；及び
（ｉｉ）ポリペプチドを核酸分子にコンジュゲートするステップ
を含む、方法。
【請求項47】
核酸分子へのポリペプチドのコンジュゲーションが、結合酵素によって触媒される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
ポリペプチドが、発現されたタンパク質のライゲーションにより、又はタンパク質のトランススプライシングにより、核酸分子にコンジュゲートされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
ポリペプチドが、ロイシンジッパーの形成により、核酸分子にコンジュゲートされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項50】
（ａ）が第１のマイクロエマルジョン液滴内で核酸分子を増幅し、それにより、ビーズ上に核酸分子のクローン集団を産生するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項51】
（ｂ）（ｉ）が無細胞系においてｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
核酸がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
ステップ（ｂ）（ｉｉ）の核酸分子へのポリペプチドのコンジュゲーションが、結合酵素によって触媒される、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
結合酵素が、第２の核酸によってコードされる、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
結合酵素が、単離された酵素である、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
結合酵素が、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、ペプチリガーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、トランスグルタミナーゼ、チューブリンチロシンリガーゼ、ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ、又はＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅである、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
核酸分子が捕捉部分にコンジュゲートされ、かつポリペプチドが結合タグを含み、捕捉部分及び結合タグがコンジュゲートされ、それにより、核酸分子をポリペプチドにコンジュゲートする、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
結合酵素が、捕捉部分と結合タグとのコンジュゲーションを触媒し、それにより、核酸へのポリペプチドのコンジュゲーションを触媒する、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
捕捉部分が二本鎖ＤＮＡを含み、かつ結合タグがポリペプチドを含み、捕捉部分及び結合タグがロイシンジッパーを形成する、請求項５７に記載の方法。
【請求項60】
ポリペプチドが、発現されたタンパク質のライゲーションにより、又はタンパク質のトランススプライシングにより、ｂ（ｉｉ）の核酸分子にコンジュゲートされる、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その開示が、その全体を参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年７月２８日に出願された米国特許仮出願第６３／０５７７５４号の優先権を主張する。
[0001]本出願は、その開示が、その全体を参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年７月２８日に出願された米国特許仮出願第６３／０５７７５４号の優先権を主張する。
【0002】
配列リスト
[0002]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれ配列リストを含有する。２０２０年７月１３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、51351-005001_Sequence_Listing_7_13_20_ST25と名付けられ、サイズは７４９６バイトである。
[0002]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれ配列リストを含有する。２０２０年７月１３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、51351-005001_Sequence_Listing_7_13_20_ST25と名付けられ、サイズは７４９６バイトである。
【背景技術】
【0003】
[0003]定向進化法（ＤＥ）は、現在、所望の特性（例えば、サイズ、安定性、フォールディング効率）及び／又は機能（例えば、結合親和性、特異性、酵素活性）を有する新規のタンパク質を工学的に作成するための唯一の体系的な、信頼性のある手法である。生体分子の大きな候補ライブリラリーから始めて、ＤＥは、自然淘汰のプロセスを真似して、通常、反復の選択ラウンドによって、特定のユーザー定義の目的により、機能性タンパク質及び他の生体分子を同定する又は進化させる。しかしながら、ＤＥによって同定された同様に豊富な生体分子は、それらの特性が大きく変わり得、したがって、ＤＥによって同定された分子は、典型的には、ロースループット定量法を使用する、さらなる機能的特徴付けを依然として必要とする。さらに、ＤＥは、実施が困難で、非常に繊細であり得、許容される結果を産生するのに当業者による数週間の仕事を必要とし得る。
【0004】
[0004]ハイスループットＤＮＡシークエンシング法及び装置は、自動装置で、ミクロンからミクロン以下のＤＮＡ特徴（例えば、アレイでのビーズ又はポロニー）においてＤＮＡの大きなライブラリーを並行してシークエンスすることができる。自動化された、大規模並列的なタンパク質の機能的特徴付けの１つの手法は、それにより、タンパク質がそれらのアイデンティティをコードするＤＮＡと共存し、ＤＮＡをシークエンスするために使用した同じ自動化装置が、同じビーズ上でタンパク質の生物物理学的な特性（例えば、結合親和性）を測定するためにも使用されるような、方法及び組成物を開発することである。さらに、広範な環境条件（ｐＨ、温度、塩又は化学的変性剤濃度等）でタンパク質アッセイを実施するため、そのようなＤＮＡ／タンパク質ディスプレイ法は、非共有結合性の相互作用の代わりに、強固な共有結合を使用することが望ましい。
【0005】
[0005]したがって、生体分子の大きなライブラリーの定量的ハイスループット特徴付けを可能にする組成物及び方法の満たされていない要求がある。ＤＥよりも速く、より効率的であり、より自動化された方法の要求もある。
【発明の概要】
【0006】
[0006]本開示は、複数のポリペプチドの機能及び／又は特性をアッセイするための組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ポリペプチドの大きな集団の定量的ハイスループット特徴付けのための方法を提供する。本明細書に記載の方法は、ポリペプチドのライブラリーの定向進化法及び特徴付けがより速く、より効率的であり、及び／又はその自動化の増加を可能にする。
【0007】
[0007]本開示の組成物及び方法は、少なくとも一部は、ハイスループットであり、大規模で実施される自動化アッセイと適合性である方法で、遺伝子型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸）をコードされた表現型（例えば、ポリペプチド）とリンクさせるための方法に基づく。特定の実施形態では、本組成物及び方法は、ビーズ当たりで、核酸をそのそれぞれのコードされたポリペプチドとリンクさせ、核酸のシークエンシングを使用して、ビーズ上に提示されるポリペプチドを確実に同定する。さらに、記載した方法は、ビーズ当たり十分なコピーの核酸の提示を可能にし、核酸のシークエンシング及びコードされたポリペプチドの同定に十分なシグナルを提供する。さらに、記載した方法は、ビーズ当たり十分なポリペプチド分子の提示を可能にし、タンパク質機能アッセイに十分なシグナルを提供する。一部の実施形態では、シークエンシングによる核酸の同定及び相当するポリペプチドの１つ又はそれ以上の機能アッセイを、ポリペプチドの大きなライブラリーの機能的特徴付けにおけるハイスループット及び効率を可能にする、同じ装置でのビーズベースのライブラリーで実施した。
【0008】
[0008]本明細書に記載の組成物及び方法の一部の実施形態では、各ポリペプチドが固体表面、例えばビーズ上に提示され、固体表面は、ポリペプチドのアイデンティティをコードする核酸も提示する。例えば、各ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸に共有結合することができ、核酸はそれ自体ビーズに結合される。好ましい実施形態では、ポリペプチド及び核酸は、並行して、同じ装置によりアッセイされる。これは、ポリペプチドの大きなライブラリーの特徴付けを可能にする。選択の必要なく、同じライブラリーのポリペプチドで、反復して複数のアッセイを実施することができ、したがって、各メンバーが、先行技術の方法と比較して低コスト、及び非常に時間がかかる方法で複数のパラメーターに渡り特徴付けされる。
【0009】
[0009]一態様では、本開示は、複数のポリペプチドの機能又は特性をアッセイする方法を提供する。方法は、複数のビーズを含み、各ビーズは、ポリペプチドをコードする核酸分子にコンジュゲートされ、各ビーズは、コードされたポリペプチドにさらにコンジュゲートされる。さらに、方法は、任意の順番で、各ビーズにコンジュゲートした核酸分子を並行してシークエンシングして、各ビーズにコンジュゲートしたポリペプチドを同定するステップと、各ビーズにコンジュゲートした各ポリペプチドの１つ若しくはそれ以上の機能又は特性を並行してアッセイするステップを含む。さらに、方法は、各ポリペプチドの１つ若しくはそれ以上の機能又は特性を、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列に関連付けるステップ、それにより複数のポリペプチドの各ポリペプチドのアイデンティティ及び１つ若しくはそれ以上の機能又は特性を決定するステップを含む。
【0010】
[0010]一態様では、本開示は、複数のポリペプチドのハイスループット解析の方法であって、複数のビーズを提供するステップであって、複数のビーズのビーズが、ポリペプチドをコードする異なる核酸分子にコンジュゲートされる、ステップ；ポリペプチドをコードする核酸分子をプロセシングして、コードされたポリペプチドを産生するステップであって、前記複数のビーズのビーズが、コードされたポリペプチドにコンジュゲートされる、ステップ；コードされたポリペプチドをアッセイして、コードされたポリペプチドの１つ又はそれ以上の特性を同定するステップ；ポリペプチドをコードする核酸分子をシークエンシングして、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列を同定するステップ；並びに各ポリペプチドの１つ又はそれ以上の特性を、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列にリンクさせるステップを含む、方法を提供する。
【0011】
[0011]一部の実施形態では、複数のビーズは、少なくとも１×１０５個のビーズ（例えば、少なくとも１×１０６個のビーズ、１×１０７個のビーズ、１×１０８個のビーズ、又は１×１０９個のビーズ、及びその間の値）を含み、各ビーズは、ポリペプチドにコンジュゲートされる（例えば、各ポリペプチドは特有のアミノ酸配列を有する）。
【0012】
[0012]一部の実施形態では、核酸分子のシークエンシング及び各ポリペプチドの１つ若しくはそれ以上の機能又は特性のアッセイは、同じ機械、デバイス、又は装置で実施される（例えば、順に、任意の順序で）。一部の実施形態では、複数のアッセイが実施され、各ポリペプチドの２つ若しくはそれ以上の機能又は特性を決定するか、又は複数のアッセイが実施され、多様な条件で、各ポリペプチドの単一の機能又は特性を決定する。複数のアッセイは、同じ機械、デバイス、又は装置で同時に、又は順に実施されてもよい。例えば、単一の機械、デバイス、又は装置を使用してビーズにコンジュゲートしたポリペプチドを同定するために、各ビーズにコンジュゲートした核酸分子をシークエンスしてもよく；各ポリペプチドの特徴付けのために１つ又はそれ以上のアッセイを実施してもよい（例えば温度及び／又はｐＨを含む多様な実験条件での、例えば、結合親和性、結合特異性、酵素活性、安定性）。好ましい実施形態では、シークエンス及び１つ又はそれ以上のアッセイは、単一の機械、デバイス、又は装置によって測定される蛍光シグナルを産生する。
【0013】
[0013]一部の実施形態では、コードされたポリペプチドはビーズに直接コンジュゲートされる（例えば、共有結合又は非共有結合）。他の実施形態では、コードされたポリペプチドは、ビーズに直接コンジュゲートされる核酸分子にコンジュゲートされ（例えば、共有結合又は非共有結合）、それによりポリペプチドをビーズにコンジュゲートさせる。
【0014】
[0014]一部の実施形態では、各ビーズを核酸分子にコンジュゲートするステップは、核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ、及びポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップ（例えば直接、又は核酸へのコンジュゲートにより）は、第１の区画（例えば、第１のマイクロエマルジョン液滴、チューブ、又はマイクロウェル）で実施される。一部の実施形態では、方法は、各区画内（例えば、各マイクロエマルジョン液滴内）の各核酸分子を増幅するステップ、それにより各ビーズ上の核酸分子の同種集団を産生するステップをさらに含む。増幅した核酸分子は、第１の区画内（例えば、第１のマイクロエマルジョン液滴内）でビーズにコンジュゲートされ得る。
【0015】
[0015]一部の実施形態では、核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ、及び
[0016]ポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップ（例えば、直接又は核酸へのコンジュゲーションにより）は、第２の区画（例えば、第２のマイクロエマルジョン液滴）で実施される。
[0016]ポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップ（例えば、直接又は核酸へのコンジュゲーションにより）は、第２の区画（例えば、第２のマイクロエマルジョン液滴）で実施される。
【0016】
[0017]一部の実施形態では、核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップは、無細胞系においてｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。
[0018]一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである。核酸が、ＤＮＡ又はｃＤＮＡである場合、核酸を発現させるステップは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写及びコードされたポリペプチドを産生するＲＮＡの翻訳（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ））を指す。核酸がＲＮＡである場合、核酸の発現は、コードされたポリペプチドを産生するＲＮＡの翻訳（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ））を指す。
[0018]一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである。核酸が、ＤＮＡ又はｃＤＮＡである場合、核酸を発現させるステップは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写及びコードされたポリペプチドを産生するＲＮＡの翻訳（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ））を指す。核酸がＲＮＡである場合、核酸の発現は、コードされたポリペプチドを産生するＲＮＡの翻訳（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ））を指す。
【0017】
[0019]本開示は、ポリペプチドをビーズにコンジュゲートするための方法を提供する（例えば、ビーズにさらにコンジュゲートされる核酸へのコンジュゲーションを介して）。そのような方法は、ポリペプチド及び核酸をビーズに結合するための、より小さい、及び／又はより安定な方法をもたらす。これは、状態（例えば、温度、ｐＨ、又は塩濃度）を拡大してアッセイが実施されるのを可能にする。さらに、ビーズ上でのより小さいアセンブリーは、コンジュゲーションアセンブリー成分との非特異的又はオフターゲット相互作用を減少させ、それにより複数のポリペプチドのより正確な特徴付けをもたらす。
【0018】
[0020]別の態様では、本開示は、ポリペプチドをビーズにコンジュゲートする方法であって、第１の区画（例えば、マイクロエマルジョン液滴）中で、ポリペプチドをコードする核酸分子をビーズにコンジュゲートするステップ、及び第２の区画（例えばマイクロエマルジョン液滴）中で、核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ、並びに核酸分子にポリペプチドをコンジュゲートし、それによりポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップを含む方法を提供する。
【0019】
[0021]一態様では、本開示は、ポリペプチドをビーズにコンジュゲートする方法であって、第１のマイクロエマルジョン液滴中で、ポリペプチドをコードする核酸分子をビーズにコンジュゲートするステップ、及び核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップを含む、第２のマイクロエマルジョン液滴中で核酸分子をプロセシングするステップ、並びにポリペプチドを核酸分子にコンジュゲートするステップを含む、方法を提供する。
【0020】
[0022]一部の実施形態では、ポリペプチドの核酸分子へのコンジュゲーションは、結合酵素によって触媒される。一部の実施形態では、発現したタンパク質のライゲーションによるか、又はタンパク質のトランススプライシングにより、ポリペプチドは核酸分子にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ロイシンジッパーの形成により、ポリペプチドは核酸分子にコンジュゲートされる。
【0021】
[0023]一部の実施形態では、ビーズ又は核酸分子は、捕捉部分にコンジュゲートされ、ポリペプチドは結合タグを含み、捕捉部分及び結合タグはコンジュゲートされ、それにより、ビーズをポリペプチドにコンジュゲートするか、又は核酸分子をポリペプチドにコンジュゲートする。
【0022】
[0024]一部の実施形態では、捕捉部分及び結合タグのコンジュゲーションは、結合酵素によって触媒される。一部の実施形態では、結合酵素は、第２の核酸によってコードされる。一部の実施形態では、結合酵素は、ＩＶＩＴ又はＩＶＴ中に、コードする核酸の付加により、ポリペプチドと同時に発現される（例えば、第２の区画化ステップ、例えば第２のマイクロエマルジョンステップ中に結合酵素をコードする核酸の付加により）。
【0023】
[0025]一部の実施形態では、結合酵素は、単離された酵素である（例えば、第２の区画化ステップ、例えば、第２のマイクロエマルジョン液滴に導入された、精製された、組換え酵素）。
【0024】
[0026]一部の実施形態では、結合酵素は、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、ペプチリガーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、トランスグルタミナーゼ、チューブリンチロシンリガーゼ、ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ、又はＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅである。
【0025】
[0027]一部の実施形態では、結合酵素はソルターゼＡである。他の実施形態では、結合酵素はソルターゼＡであり、１つの捕捉部分又は結合タグは、遊離のＮ末端グリシン残基を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、その他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。
【0026】
[0028]一部の実施形態では、結合酵素はブテラーゼ１である。別の実施形態では、結合酵素はブテラーゼ１であり、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＸＸ（配列番号２）を含むポリペプチドを含み、ここでＸ１はＰ、Ｄ、又はＥを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＩ、Ｌ、Ｖ、又はＣであり；Ｘは任意のアミノ酸である。他の実施形態では、その他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＤＨＶ又はＮＨＶを含むポリペプチドを含む。
【0027】
[0029]一部の実施形態では、結合酵素はトリプシリガーゼである。別の実施形態では、結合酵素はトリプシリガーゼであり、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＲＨＸＸ（配列番号３）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。別の実施形態では、その他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＹＲＨを含むポリペプチドを含む。
【0028】
[0030]一部の実施形態では、結合酵素はオムニリガーゼである。結合酵素がオムニリガーゼである場合、捕捉部分は、カルボキサミド－メチル（ＯＣａｍ）を含み得る。別の実施形態では、結合タグは、アシル－アクセプター求核剤として作用する遊離のＮ末端アミノ酸を含むポリペプチドを含む。
【0029】
[0031]一部の実施形態では、結合酵素は、ホルミルグリシン生成酵素である。他の実施形態では、結合酵素がホルミルグリシンである場合、捕捉部分はアルデヒド反応基を含む。例えば、結合タグは、アミノ酸配列ＣＸＰＸＲ（配列番号４）を含むポリペプチドを含み得、ここでＸは任意のアミノ酸である。
【0030】
[0032]一部の実施形態では、結合酵素は、トランスグルタミナーゼである。結合酵素がトランスグルタミナーゼである場合、１つの捕捉部分又は結合タグは、リジン残基又は遊離のＮ末端アミノ基を含むポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号５）を含むポリペプチドを含む。
【0031】
[0033]一部の実施形態では、結合酵素は、チューブリンチロシンリガーゼである。他の実施形態では、結合酵素がチューブリンチロシンリガーゼである場合、１つの捕捉部分又は結合タグは、遊離のＮ末端チロシン残基を含むポリペプチドを含む。例えば、他の捕捉部分又は結合タグは、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＤＳＶＥＧＥＥＥＧＥＥ（配列番号６）を含むポリペプチドを含み得る。
【0032】
[0034]一部の実施形態では、結合酵素は、チューブリンホスホパンテテニルトランスフェラーゼである。結合酵素がチューブリンホスホパンテテニルトランスフェラーゼである一実施形態では、捕捉部分は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）を含み得る。別の実施形態では、結合タグは、アミノ酸配列ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）を含むポリペプチドを含む。
【0033】
[0035]一部の実施形態では、結合酵素はＳｐｙＬｉｇａｓｅである。結合酵素がＳｐｙＬｉｇａｓｅである場合、１つの捕捉部分又は連結タグ、アミノ酸配列ＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤ（配列番号８）を含むポリペプチドを含み得る。他の実施形態では、他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号９）を含むポリペプチドを含む。
【0034】
[0036]一部の実施形態では、結合酵素はＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅである。別の実施形態では、結合酵素がＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅである場合、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＤＩＰＡＴＹＥＦＴＤＧＫＨＹＩＴＮＥＰＩＰＰＫ（配列番号１０）を含むポリペプチドを含む。他の実施形態では、他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ（配列番号１１）を含むポリペプチドを含む。
【0035】
[0037]一部の実施形態では、捕捉部分は二本鎖ＤＮＡを含み、かつ結合タグはポリペプチドを含み、捕捉部分及び結合タグはロイシンジッパーを形成する。一部の実施形態では、捕捉部分は、核酸配列ＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号１２）を含む。捕捉部分が核酸配列ＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号１２）を含む一実施形態では、結合タグは、アミノ酸配列ＤＰＡＡＬＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＧＧＣ（配列番号１３）を含み得る。
【0036】
[0038]上記のいずれかの一部の実施形態では、結合タグ又は捕捉部分は、ポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、例示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％の配列同一性、又はその配列を共有する。
【0037】
[0039]一部の実施形態では、各ビーズは、１００又はそれ以上のコピー（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、又はそれ以上のコピー）の核酸分子にコンジュゲートされる。
【0038】
[0040]一部の実施形態では、各ビーズは、１００又はそれ以上のコピー（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、又はそれ以上のコピー）のコードされたポリペプチドにコンジュゲートされる。
【0039】
[0041]一部の実施形態では、複数のビーズは、１×１０６個と１×１０１０個の間のビーズ（例えば、２×１０６個と９×１０９個の間のビーズ、４×１０６個と７×１０９個の間のビーズ、６×１０６個と５×１０９個の間のビーズ、８×１０６個と２×１０９個の間のビーズ、１×１０７個と１×１０１０個の間のビーズ、１×１０８個と１×１０１０個の間のビーズ、又は１×１０９個と１×１０１０個の間のビーズ）を含む。
【0040】
[0042]一部の実施形態では、複数のビーズは、ユニークアミノ酸配列を有する１×１０６と１×１０１０の間のポリペプチドを含む（例えば、２×１０６と９×１０９の間、４×１０６と７×１０９の間のユニークポリペプチド、６×１０６と５×１０９の間のユニークポリペプチド、８×１０６と２×１０９の間のユニークポリペプチド、１×１０７と１×１０１０の間のユニークポリペプチド、１×１０８と１×１０１０の間のユニークポリペプチド、又は１×１０９と１×１０１０の間のユニークポリペプチド）を含む。各ユニークポリペプチドは、ライブラリーに複数回表され得る（例えば、単一又は複数のビーズにコンジュゲートされている複数コピーのユニークポリペプチドのいずれかによる）。
【0041】
[0043]各ポリペプチドのアミノ酸配列は、複数のビーズにより、１つ又はそれ以上のビーズ上で表され得る。一部の実施形態では、複数のビーズは、特有のアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のコピーのポリペプチドにコンジュゲートされる、１個若しくはそれ以上、２個若しくはそれ以上、３個若しくはそれ以上、４個若しくはそれ以上、５個若しくはそれ以上、６個若しくはそれ以上、７個若しくはそれ以上、８個若しくはそれ以上、９個若しくはそれ以上、又は１０個若しくはそれ以上のビーズを含む。一部の実施形態では、複数のビーズは、特有のアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のコピーのポリペプチドにコンジュゲートされる、１個と１５個の間のビーズ（例えば、１個と５個の間、１個と１０個の間、１個と１５個の間、２個と５個の間、２個と１０個の間、２個と１５個の間、５個と１０個の間、又は１０個と１５個の間）を含む。
【0042】
[0044]一部の実施形態では、各ポリペプチドの機能又は特性は、高温でアッセイされる（例えば、４０℃より高いか又は等しい、５０℃より高いか又は等しい、６０℃より高いか又は等しい、７０℃より高いか又は等しい、８０℃より高いか又は等しい、９０℃より高いか又は等しい、又は１００℃より高いか又は等しく、例えば約４５℃と約１００℃の間、約５０℃と約９０℃の間、約６０℃と約８０℃の間、又は約６５℃と約７５℃の間）。
【0043】
[0045]一部の実施形態では、各ポリペプチドの機能又は特性は、高ｐＨでアッセイされる（例えば、ｐＨ８．０より高いか又は等しい、ｐＨ８．５より高いか又は等しい、ｐＨ９．０より高いか又は等しい、ｐＨ９．５より高いか又は等しい、ｐＨ１０．０より高いか又は等しい、例えば、約ｐＨ８．０と約ｐＨ１０．０の間、約ｐＨ８．１と約ｐＨ９．９の間、又は約ｐＨ８．２と約ｐＨ９．８の間）。
【0044】
[0046]一部の実施形態では、各前記ポリペプチドの機能又は特性は、低ｐＨでアッセイされる（例えば、ｐＨ６．０より低いか又は等しい、ｐＨ５．０より低いか又は等しい、ｐＨ４．０より低いか又は等しい、又はｐＨ３．０より低いか又は等しい、例えば約ｐＨ３．０と約ｐＨ６．０の間、又は約ｐＨ３．１と約ｐＨ５．９の間、又は約ｐＨ３．２と約ｐＨ５．８の間）。
【0045】
[0047]一部の実施形態では、各ポリペプチドの機能又は特性は、中性ｐＨで実施される（例えば、約ｐＨ６．０と約ｐＨ８．０の間、例えば約ｐＨ７．０と約ｐＨ７．５の間）。
【0046】
[0048]一部の実施形態では、ポリペプチドの１つ若しくはそれ以上の機能又は特性は、結合特性、例えば、分子又はマクロ分子への結合の定量（例えば、本明細書に記載される、リガンド結合、平衡結合、又はキネティック結合）である。一部の実施形態では、機能又は特性は、酵素活性又は特異性（例えば、本明細書に記載される、酵素活性又は酵素阻害）である。一部の実施形態では、機能又は特性は、タンパク質発現のレベル（例えば、所与の遺伝子の発現レベル）である。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能又は特性は安定性（例えば、熱変性によって測定された熱安定性、例えば、化学変性によって測定された化学的安定性、又は様々なｐＨでの安定性）である。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能又は特性は、ポリペプチドの凝集である。
【0047】
[0049]一部の実施形態では、方法は、複数のポリペプチドの各ポリペプチドの複数の機能又は特性をアッセイするステップを含む（例えば、単一の機械、装置、又はデバイスで）。例えば、方法は、競合分子の存在下での標的への競合結合の決定；複数の異なる標的への結合を測定するステップ；平衡結合及び結合キネティクスを測定するステップ；結合及びタンパク質安定性を測定するステップ；又はこれらの任意の組合せを含み得る。本方法は、様々な条件下での各ポリペプチドの複数の機能又は特性、例えば、複数のｐＨ条件下での結合；複数の温度条件下での結合；複数の塩濃度下での結合；及び／又は複数の緩衝液条件下での結合をアッセイするステップも含み得る。装置が、アッセイされるポリペプチドを同定するために、（コンジュゲートした核酸分子の）シークエンシングステップも実施する、単一の装置で、様々な条件下で複数のアッセイを実施する能力は、本開示の組成物及び方法の優意な利点である。さらに、複数のアッセイは、同じライブラリーのポリペプチドで実施され、したがって、先行技術の方法と比較して効率及びスピードを改善し得る。
【0048】
[0050]一部の実施形態では、複数のポリペプチドは、抗原、抗体、酵素、基質、又は受容体のライブラリーを含む。一部の実施形態では、抗原のライブラリーは、１つ又はそれ以上のウイルスのウイルスタンパク質エピトープを含む。一部の実施形態では、複数のポリペプチドは、自然由来、生物のゲノムデータに含まれるか、又は定向進化法によって先に発見された、酵素（例えば、候補酵素）のライブラリーを含む。一部の実施形態では、複数のポリペプチドは、新しいか又は改変された酵素活性を調査するための酵素基質のライブラリーを含む。一部の実施形態では、複数のポリペプチドは、完全、機能的タンパク質を形成する相補的なタンパク質断片と相互作用する部分的か又は不完全なタンパク質構造をコードし得る（例えば、タンパク質断片相補性）。
【0049】
定義
[0051]本発明の理解を促すため、多くの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関する当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実態のみを指すことを意図しないが、特定の例が例示のために使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、請求項に概説される以外は、それらの使用は本発明を制限しない。
[0051]本発明の理解を促すため、多くの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関する当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実態のみを指すことを意図しないが、特定の例が例示のために使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、請求項に概説される以外は、それらの使用は本発明を制限しない。
【0050】
[0052]本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、記載されている値の１０％前後以内である値を指す。
[0053]本明細書で使用される場合、値の範囲で提供される任意の値は、上限及び下限の両方、並びに上限及び下限内に含有される任意の値を含む。
[0053]本明細書で使用される場合、値の範囲で提供される任意の値は、上限及び下限の両方、並びに上限及び下限内に含有される任意の値を含む。
【0051】
[0054]用語「アッセイ（ａｓｓａｙ）」又は「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、分子の生物学的及び／又は化学的、及び／又は物理的特性及び／又は機能の測定を指す。アッセイの例は、例えば、温度、ｐＨ、又は塩濃度などの条件の範囲での、タンパク質の結合親和性、酵素活性、又は熱安定性の測定である。
【0052】
[0055]用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）」又はその派生語は、本明細書で使用される場合、標的又は鋳型核酸をコピーし、それにより選択した核酸配列のコピー数を増加させるための、当技術分野で公知の１つ又はそれ以上の方法を意味する。増幅は、指数関数的又は線形であり得る。「標的核酸」は、増幅、検出、及び／又はシークエンスされる核酸又はその部分を指す。標的又は鋳型核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、任意の核酸であり得る。この方法で増幅された配列は、「増幅された標的核酸」、「増幅された領域」、又は「アンプリコン」を形成し、本明細書で交換可能に使用される。プライマー及び／又はプローブは、特定の鋳型核酸配列を標的化するように容易に設計され得る。例示的な増幅アプローチとしては、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ニッキング酵素増幅反応、及びラミフィケーション増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。
【0053】
[0056]本明細書で使用される場合、「ビーズ」は、通常、球状粒子又は楕円粒子を指す。ビーズは、固体又は半固体粒子であり得る。ビーズは、ガラス、石英、シリカ、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、樹脂、ハイドロゲル、及びそれらの複合物を含む様々な物質のいずれか１つから構成され得る。ビーズは、ゲルビーズ（例えば、ハイドロゲルビーズ）であり得る。ビーズは、高分子材料から形成され得る。ビーズは、磁気又は非磁気であり得る。さらに、基質は、ビーズの表面に添加され、ＤＮＡ鋳型の結合を促進し得る（例えば、末端アクリルアミド基を持つＤＮＡ鋳型の固定化のためのポリアクリルアミドマトリックス）。
【0054】
[0057]用語「ビーズアリコット」は、本明細書で使用される場合、フローサイトメーターを使用して測定した場合、およそ１００００～５００００ビーズを含むビーズの容積を指す。アリコットの実際の容積は、指定したステップでのビーズの濃度に応じて変化し得る。
【0055】
[0058]用語「捕捉部分」は、本明細書で使用される場合、標的薬剤に結合するか、又はそうでなければ関連する能力を有する、自然の、合成の、又は組換え産生された任意の分子、又はその部分を指す。好適な捕捉部分としては、限定はされないが、核酸、抗体、抗体の抗原結合領域、抗原、エピトープ、細胞受容体（例えば、細胞表面受容体）及びそのリガンド、例えばペプチド増殖因子が挙げられる（例えば、Pigott and Power (1993), The Adhesion Molecule Facts Book (Academic Press New York)；及びReceptor Ligand Interactions: A Practical Approach, Rickwood and Hames (series editors) Hulme (ed.) (IRL Press at Oxford Press NY)を参照）。同様に、捕捉部分は、限定はされないが、毒素、毒液、細胞内受容体（例えば、ステロイド、ホルモン、レチノイド及びビタミンＤ、ペプチドを含む、様々な小リガンドの効果を媒介する受容体）及びそれらのリガンド、薬物（例えば、鎮静剤、ステロイド等）、レクチン、糖、オリゴ糖、他のタンパク質、リン脂質、及びアプタマーなどの構造核酸等も含み得る。当業者は、上記に列挙したもの以外の分子相互作用が文献中に充分に記載され、捕捉部分／標的薬剤相互作用としても寄与し得ることを容易に理解するであろう。ある特定の実施形態では、捕捉部分は、足場と関連し、他の実施形態では、捕捉部分は、捕捉関連オリゴにコンジュゲートされる。
【0056】
[0059]用語「無細胞系」又は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系」又は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応混合物」又は簡単に「反応混合物」は、本明細書において同義的に使用され、当技術分野で認識される、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写及び／又は翻訳を実行するために必要な成分の複合混合物を指す。そのような反応混合物は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物、好ましくは、１つ又はそれ以上の終結因子、例えば、終結因子Ｉ（ＲＦ－Ｉ）、終結因子ＩＩ（ＲＦ－ＩＩ）、及び／又は終結因子ＩＩＩ（ＲＦ－ＩＩＩ）（Short, Biochemistry 1999, 38, pp:8808-8819）を欠損する大腸菌細胞由来、又は、相当するコドンが終止コドンとして本発明の方法で使用される、特定のｔＲＮＡを欠損する細胞由来の細胞溶解物であり得る。反応混合物は、さらに、望まない副産物の形成を減少させる、阻害成分又は組成を含み得る。さらに、反応混合物は、１つ又はそれ以上の望まない副産物を活発に除去する特定の酵素を含み得る。さらに、反応混合物は、ライゲーションを補助するか、又はポリペプチドのフォールディング又は提示を改善する特定の酵素を含み得る。他のそのような反応混合物は、天然又は組換え供給源から精製され得る単一の成分から人工的に再構成され得る。
【0057】
[0060]本明細書で使用される場合、用語「クローン集団」は、特定のヌクレオチド配列に関して相同である核酸の集団を指す。相同配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長、又はそれ以上（例えば、少なくとも５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、又は４０００ヌクレオチド長）であり得る。クローン集団は、単一の標的核酸又は鋳型核酸に由来し得る。クローン集団の基本的に全ての核酸分子は、同じヌクレオチド配列を有する。少数の変異（例えば、ＰＣＲ増幅人為産物による）は、クローン性から逸脱することなく、クローン集団で生じ得ることが理解されるであろう。
【0058】
[0061]「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」又は選択したポリペプチドを「コードする（ｅｎｃｏｄｅｓ)」配列は、転写される（ＤＮＡの場合）及びポリペプチドへと翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定され得る。コード配列としては、限定はされないが、ウイルス、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得る。転写終結配列は、コード配列の３’に位置し得る。
【0059】
[0062]用語「区画」は、本明細書で使用される場合、１つ又はそれ以上の他の成分からの１つ又はそれ以上の成分の物理的分離を指す。例えば、区画化は、特定の生物学的及び／又は化学反応、例えば核酸分子の増幅、物理的支持体（例えば、ビーズ）への核酸分子のコンジュゲーション、核酸分子によってコードされたポリペプチドの発現（例えば、ＩＶＴＴ又はＩＶＴ）、又は物理的支持体へのポリペプチドのコンジュゲーション（例えば、核酸分子へのコンジュゲーションによる）の１つ又はそれ以上を実施するために使用され得る。例示的な区画は、例えば、反応チューブ及びマイクロエマルジョン液滴を含む。
【0060】
[0063]本明細書で使用される場合、「コンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」は、共有結合、非共有結合、及び／又はファンデルワールス力、水素結合、及び／又は他の分子間力による結合による、接着又は結合を意味する。
【0061】
[0064]本明細書で使用される場合、用語「発現させる（ｅｘｐｒｅｓｓ）」は、以下のイベントの１つ又はそれ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’端プロセシングによる）；（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【0062】
[0065]用語「発現タンパク質ライゲーション（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）」又は「ＥＰＬ」は、本明細書で使用される場合、化学的に合成したタンパク質のＣ末端セグメントの、インテインタンパク質スプライシングエレメントへとそのＣ末端を介して融合した組換えＮ末端セグメントへのｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションを可能にする、タンパク質の半合成法を指す。本明細書で使用される場合、用語「機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」及び「特性（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」は、タンパク質若しくはペプチド、又はその断片を含む自然発生及び／又は非自然発生の分子の構造、制御、又は生化学活性を指す。例えば、断片の機能は、機能性タンパク質ドメインの酵素活性（例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシターゼ、アセチラーゼ、又はトランスフェラーゼ）又は結合活性（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ホルモン、リガンド、又は抗原の結合）を含むことができる。
【0063】
[0066]用語「単離した酵素」は、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチドをそのコードする核酸分子に結合する反応の一部を形成する外部的に精製した酵素を指す。単離した酵素は、それが目的のタンパク質と同時に、又は別々に精製された成分として産生されるように捕捉遺伝子として反応に導入され得る。
【0064】
[0067]本明細書で使用される場合、用語「結合酵素」は、結合タグと捕捉部分との間の結合反応に有用な酵素を指す。例示的な結合酵素は、本明細書に詳細に記載される。
[0068]用語「結合タグ」は、本明細書で使用される場合、捕捉部分と相互作用する部分（例えば、ポリペプチド又は小分子）を指す。捕捉分子が第１の実体（例えば、ビーズ、核酸、又はポリペプチド）に結合され、結合タグが第２の実体（例えば、ビーズ、核酸、又はポリペプチド）に結合される場合、捕捉部分と結合タグとの相互作用は、第１の実体と第２の実体とをコンジュゲートする。好ましい実施形態では、結合タグと捕捉部分との相互作用は、共有結合を形成する。好ましい実施形態では、結合タグは、ポリペプチド（例えば、約１～４０、約１～３０、約１～２０、約１～１５、又は約１～１０アミノ酸残基の短いポリペプチド）である。捕捉部分への結合タグの共有結合性コンジュゲーションは、例えば結合酵素によるコンジュゲーションにより、本明細書に記載されるように実施され得る。
[0068]用語「結合タグ」は、本明細書で使用される場合、捕捉部分と相互作用する部分（例えば、ポリペプチド又は小分子）を指す。捕捉分子が第１の実体（例えば、ビーズ、核酸、又はポリペプチド）に結合され、結合タグが第２の実体（例えば、ビーズ、核酸、又はポリペプチド）に結合される場合、捕捉部分と結合タグとの相互作用は、第１の実体と第２の実体とをコンジュゲートする。好ましい実施形態では、結合タグと捕捉部分との相互作用は、共有結合を形成する。好ましい実施形態では、結合タグは、ポリペプチド（例えば、約１～４０、約１～３０、約１～２０、約１～１５、又は約１～１０アミノ酸残基の短いポリペプチド）である。捕捉部分への結合タグの共有結合性コンジュゲーションは、例えば結合酵素によるコンジュゲーションにより、本明細書に記載されるように実施され得る。
【0065】
[0069]用語「マイクロエマルジョン」は、本明細書で使用される場合、培地中の液滴を含む組成物を指し、液滴は通常、１００ｎｍ～１０μｍの範囲の直径を有し、熱力学的に安定な単相液体として存在する。
【0066】
[0070]本明細書で交換可能に使用される、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオシドの高分子形態を指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって接続されたＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）に天然に見出されるヌクレオシドから構成される。用語は、自然発生の核酸に見出されようとなかろうと、化学的又は生物学的に改変された塩基、改変された骨格等を含有する、ヌクレオシド又はヌクレオシド類似物を含有する分子を包含し、そのような分子は、ある特定の適用に好ましいこともある。用語、核酸は、合成、コンジュゲーション、及び／又はシークエンシングの間又は後に改変された天然の核酸も包含する。本出願がポリヌクレオチドを参照する場合、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、及びそれぞれの場合に、一本鎖形態と二本鎖形態の両方（及び各一本鎖分子の相補鎖）が提供されることが理解される。「ポリヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド物質自体及び／又は特定の核酸を生化学的に規定する配列情報（すなわち、塩基の省略形として使用される連続する文字）を指し得る。核酸分子の様々な塩、混合塩、及び遊離の酸形態も含まれる。
【0067】
[0071]本明細書で交換可能に使用される、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「タンパク質」は、限定はされないが、アミノ及び／又はイミノ分子を含むコンパウンドを含む、自然発生又は合成アミノ酸ポリマー又はアミノ酸様分子を含む任意のコンパウンドを指す。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」の使用により、特定のサイズが意図されない。用語「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、全長タンパク質、タンパク質の部分、又はペプチドを指す。定義内に含まれるのは、自然発生及び非自然発生（例えば、合成）の両方の、例えば、アミノ酸の１つ又はそれ以上の類似体（例えば、非天然のアミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、置換した結合、並びに当技術分野で公知の他の改変を有するポリペプチドである。したがって、合成オリゴペプチド、二量体、多量体（例えば、タンデムリピート、複数抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態、直線的に結合されたペプチド）、環化、分岐状分子等が定義内に含まれる。用語は、１つ又はそれ以上のペプトイド（例えば、Ｎ置換グリシン残基）及び他の合成アミノ酸又はペプチド（例えば、米国特許第５８３１００５号；同第５８７７２７８；及び同第５９７７３０１号；Nguyen et al. (2000) Chem. Biol. 7(7):463-473；及びペプチドの説明のためSimon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(20):9367-9371を参照）を含む分子も含む。本発明での使用に好適な非限定的な長さのペプチドは、３～５残基長、６～１０残基長（又はその間の任意の整数）、１１～２０残基長（又はその間の任意の整数）、２１～７５残基長（又はその間の任意の整数）、７５～１００（又はその間の任意の整数）のペプチド、又は１００残基長よりも長いポリペプチドを含む。典型的には、本発明に有用なポリペプチドは、意図した適用に好適な最大の長さを有し得る。さらに、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば合成ポリペプチドは、さらなる分子、例えば標識又は他の化学部分を含み得る。そのような部分は、リガンドとのペプチドの相互作用をさらに増強及び／又は提示されるポリペプチドの検出を増強し得る。したがって、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの参照は、１つ又はそれ以上の自然発生のアミノ酸を含む、アミノ酸配列の派生物も含む。
【0068】
[0072]第１のポリペプチドは、それが（ｉ）第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド由来の第１のポリヌクレオチドによってコードされるか、又は（ｉｉ）本明細書に記載の第２のポリペプチドに配列同一性を示す場合、第２のポリペプチドに由来する。配列（又はパーセント）同一性は、以下に記載のように決定され得る。好ましくは、誘導体は、それらが由来する配列に対して、少なくとも約５０％のパーセント同一性、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは約８５％と９９％の間（又はその間の任意の値）を示す。そのような誘導体は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含み得る。アミノ酸誘導体は、ポリペプチドが所望の活性を維持する限り、天然配列への改変、例えば欠失、付加及び置換（通常天然に保存される）も含み得る。これらの改変は、部位特異的変異誘発により、計画的であってもよく、又はタンパク質を産生する宿主の変異により、又はＰＣＲ増幅中のエラーによるなど、偶然であってもよい。さらに、以下の効果：ポリペプチドの提示、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、機能、又は安定性の効率的な増加の１つ又はそれ以上を有する改変が作成されてもよい。
【0069】
[0073]本明細書で使用される場合、用語「タンパク質トランススプライシング」は、スプリットインテインシステムを含むタンパク質スプライシング反応を指す。スプリットインテインシステムは、ペプチド結合の開裂がアミノ末端のアミノ酸配列とカルボキシ末端のアミノ酸配列の間に存在し、機能性トランススプライシングエレメントへと再会合、又は再構成し得る、Ｎ末端配列とＣ末端配列が別々の分子になる、任意のインテインシステムを指す。スプリットインテインシステムは、自然生物に存在する任意のスプリットインテインシステムを包含する、自然発生のスプリットインテインシステムであり得る。スプリットインテインシステムは、当技術分野で公知の任意の標準的な方法によって、Ｎ－インテイン及びＣ－インテインへと非スプリットインテインを分けることによって生成される任意のスプリットインテインシステムを包含する、工学的に作成したスプリットインテインシステムでもあり得る。非限定的な例としては、工学的に作成したスプリットインテインシステムは、自然発生の非スプリットインテインを適切なＮ－及びＣ－末端配列へと開裂することによって生成され得る。好ましくは、そのような工学的に作成したインテインシステムは、トランススプライシング反応に必須のアミノ酸配列のみを含む。
【0070】
[0074]用語「シークエンシング」は、核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えば、標的核酸又は増幅した標的核酸のヌクレオチド順を決定するための任意の方法を指す。例示的なシークエンシングアプローチとしては、限定はされないが、超並列シークエンシング（例えば、合成によるシークエンシング（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）色素シークエンシング、イオン半導体シークエンシング、又はピロシークエンシング）又はライゲーションによるシークエンシング（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出（ＳＯＬｉＤ（商標））シークエンシング又はポロニーベースのシークエンシング））、ロングリード又は単一分子のシークエンシング（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ（商標）シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシング、及びナノポアシークエンシング）及びサンガーシークエンシングが挙げられる。超並列シークエンシングは、当技術分野において、次世代又は第２世代シークエンシングとも呼ばれ、典型的には、空間的に離され、クローン増幅した鋳型又は単一核酸分子の多数の（例えば、数千、数百万、又は数十億）の並列シークエンシングを含む。ショートリードが、超並列シークエンシングに使用されることも多い。例えば、Metzker, Nature Reviews Genetics 11:31-36, 2010を参照。ロングリードシークエンシング及び／又は単一分子シークエンシングは、第３世代シークエンシングと呼ばれることもある。ハイブリッド手法（例えば、超並列及び単一分子手法又は超並列及びロングリード手法）も使用され得る。一部の手法は、１つより多くのカテゴリーに分けられ、例えば、一部の手法は、第２世代及び第３世代手法の両方と考えることもでき、一部の供給源は、「次世代」シークエンシングとして第２世代及び第３世代シークエンシングの両方を指すと理解される。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1】[0075]図１は、複数のポリペプチドをアッセイする例示的な方法を示す図解である。短いＤＮＡオリゴによって改変されたビーズ表面上で（ステップ１）、エマルジョンＰＣＲが実施され、目的のポリペプチド遺伝子（ＧＯＩ）及びリバースプライマーに共有結合した関連捕捉部分（ＣＭ）を提示する（ステップ２）。エマルジョンｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）を実施して、結合酵素、及び結合タグを含有する目的の標的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する（ＬＴ、ステップ３）。このステップ中、結合酵素はＣＭをＬＴに共有結合的に融合させ、ＰＯＩの共有的な接着をもたらす。エマルジョンは破壊され、複数のビーズが装置上で局在及び物理的に配置される（ステップ４）。ビーズは、目的の蛍光標的（ＴＯＩ）とインキュベートされ、蛍光測定を介してＰＯＩ結合をアッセイする（ステップ５）。ビーズは、次いで、変性され、一本鎖ＤＮＡのみを残した（ｓｓＤＮＡ、ステップ６）。ｓｓＤＮＡは、合成によりシークエンスし（ステップ７）、ステップ４で決定された位置に固定されるそのアイデンティティを決定した。シークエンシングすると、解析は、開始ＤＮＡライブラリーにコードされる複数のポリペプチド全体の生理学的データをもたらす。
【図2】[0076]図２は、目的のタンパク質をそのコードＤＮＡに共有結合的にコンジュゲートするために使用されるＤＮＡオリゴ（アスタリスクによって示される）上、並びにタンパク質上（矢印によって示される）に提示される生体分子及び／又はペプチドモチーフの構造及び配列を示す概略図である。
【図3】[0077]図３Ａ及び図３Ｂは、赤色レーザ（６３３ｎｍ）による励起時に、ＡＰＣ（６６０±２０ｎｍ）蛍光チャネルでフローサイトメトリーにより記録されたイベントのヒストグラムを示す。（図３Ａ)Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７－標識ＤＮＡとのインキュベーション時にＳＡビーズから回収された１００００イベントを示す図である。（図３Ｂ)２０ｍＭの塩化ナトリウムを使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識したアンチセンスＤＮＡ鎖をストリッピングすると、ビーズがベースライン蛍光レベルに戻ることを示す図である。
【図4】[0078]図４Ａ及び図４Ｂは、青色レーザ（４８８ｎｍ）による励起時に、６１０±２０ｎｍ蛍光チャネルでの蛍光ｄｄＮＴＰ取り込み（シークエンシング）後のビーズ集団の分布を示すグラフである（図４Ａ）。赤色レーザ（６３３ｎｍ）による励起時に、６６０±２０ｎｍ蛍光チャネルでのシークエンシング後のビーズ集団の分布を示すグラフである（図４Ｂ）。
【図5-1】[0079]図５Ａ～Ｃは、例示的なフローサイトメトリーの結果を示す。図５Ａは、例示的なフローサイトメトリー解析の図式サマリーである。二本鎖ＤＮＡ、そのコードされたポリペプチド、及び任意の結合した蛍光抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を提示するビーズは、フローサイトメーターに直接通され、３つの連続的なレーザー（青色、赤色、及び紫色）によって励起した。青色レーザー励起時に産生されたシグナルは、Ｍ２抗体に結合する量（アッセイ、ＦＩＴＣチャネル）及び蛍光ｄｄＵＴＰ取り込みの量（Ｕ、ＰＥチャネル）に関する情報をもたらす。赤色励起によって産生されたシグナルは、蛍光ｄｄＣＴＰ又はｄｄＧＴＰ（Ｃ／Ｇ、ＡＰＣチャネル）取り込みの量の情報をもたらす。紫色レーザー励起時に産生されたシグナルは、蛍光ｄｄＡＴＰ（Ａ、ＡｍＣｙａｎチャネル）取り込みの量の情報をもたらす。図５Ｂは、関連チャネル（ＡＰＣ、ＰＥ、ＡｍＣｙａｎチャネル）での各ビーズの蛍光シグナルを示すプロットである。各チャネルでの蛍光シグナルを解析し、ビーズは、ビーズ上にモノクローナルに提示されるオリゴヌクレオチドを同定するベースコールに割り当てられた。異種シグナル生成のため、一部のビーズは十分な蛍光を生じず、それらの提示したオリゴヌクレオチドは決定されない。図５Ｃは、アッセイチャネル（ＦＩＴＣチャネル）での蛍光シグナルを示すグラフのセットである。蛍光シグナルは、各オリゴヌクレオチド集団に凝集され、平均値をフィットして結合親和性の正確な測定を得た（色付き線）。オーバーレイしたバイオリン図は、幾何平均（白丸）、第一四分位（２５％）から第三四分位（７５％）まで伸びる棒（太い線）、及び四分位範囲の１．５倍まで伸びるウィスカー（細い線）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0072】
詳細な説明
[0080]本開示は、複数のポリペプチドの機能又は特性をアッセイするための組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ポリペプチドの大きな集団（複数可）のハイスループット特徴付けのための方法を提供する。各ポリペプチドは、ビーズなどの固体表面に提示され、固体表面は、ポリペプチドをコードする核酸も提示する。例えば、各ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸に共有結合され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチド及び核酸は、並行して、同じ装置によってアッセイされる。これは、ポリペプチドの大きなライブラリーの特徴付けを可能にする。複数のアッセイが、選択の必要なく、ポリペプチドの同じライブラリーで続けて又は同時に実施され、したがって、各メンバーが先行技術の方法と比較して低コスト及び時間をかけずに複数のパラメーターに渡り特徴付けられることを可能にする。
[0080]本開示は、複数のポリペプチドの機能又は特性をアッセイするための組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ポリペプチドの大きな集団（複数可）のハイスループット特徴付けのための方法を提供する。各ポリペプチドは、ビーズなどの固体表面に提示され、固体表面は、ポリペプチドをコードする核酸も提示する。例えば、各ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸に共有結合され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチド及び核酸は、並行して、同じ装置によってアッセイされる。これは、ポリペプチドの大きなライブラリーの特徴付けを可能にする。複数のアッセイが、選択の必要なく、ポリペプチドの同じライブラリーで続けて又は同時に実施され、したがって、各メンバーが先行技術の方法と比較して低コスト及び時間をかけずに複数のパラメーターに渡り特徴付けられることを可能にする。
【0073】
ビーズ上でのハイスループットポリペプチドアッセイのための方法
[0081]本明細書で記載されるのは、ビーズ上で直接実施されるハイスループットタンパク質アッセイのための方法である。本明細書に記載されるハイスループットタンパク質アッセイ方法は、一部の実施形態では、１）特有のクローン集団のタンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ提示する複数のビーズを生成するステップ；２）各ビーズ上で提示されるＤＮＡを転写及び翻訳して、各ビーズのクローンＤＮＡ集団に相当するタンパク質バリアントの特有のクローン集団を生成するステップ；３）クローンタンパク質分子をビーズ上に提示されるＤＮＡ分子に化学結合させ、ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートを生成するステップ；４）ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのタンパク質の複数の物理化学特性、及び／又は生化学機能を共通の機械、及び／又は装置、及び／又はデバイスにおいて特徴付けるステップ；５）ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのＤＮＡ分子の配列を読み、ＤＮＡ及び、したがって、ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのタンパク質配列を同定するステップ；並びに６）自動及び／又は最小限の使用者の介在により、全てのステップを実施するステップを含む。方法の確実な実施は、タンパク質アッセイへのハイスループット手法をもたらし、複数回の従来の定向進化法の必要性を排除する。本ステップ及び本方法の使用のより詳細な概要は以下に提供される。
[0081]本明細書で記載されるのは、ビーズ上で直接実施されるハイスループットタンパク質アッセイのための方法である。本明細書に記載されるハイスループットタンパク質アッセイ方法は、一部の実施形態では、１）特有のクローン集団のタンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ提示する複数のビーズを生成するステップ；２）各ビーズ上で提示されるＤＮＡを転写及び翻訳して、各ビーズのクローンＤＮＡ集団に相当するタンパク質バリアントの特有のクローン集団を生成するステップ；３）クローンタンパク質分子をビーズ上に提示されるＤＮＡ分子に化学結合させ、ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートを生成するステップ；４）ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのタンパク質の複数の物理化学特性、及び／又は生化学機能を共通の機械、及び／又は装置、及び／又はデバイスにおいて特徴付けるステップ；５）ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのＤＮＡ分子の配列を読み、ＤＮＡ及び、したがって、ビーズ－ＤＮＡ－タンパク質コンジュゲートのタンパク質配列を同定するステップ；並びに６）自動及び／又は最小限の使用者の介在により、全てのステップを実施するステップを含む。方法の確実な実施は、タンパク質アッセイへのハイスループット手法をもたらし、複数回の従来の定向進化法の必要性を排除する。本ステップ及び本方法の使用のより詳細な概要は以下に提供される。
【0074】
ビーズ上のポリヌクレオチドの提示
[0082]複数のビーズの表面上にポリヌクレオチドのクローン集団を提示するための方法が記載される。一部の実施形態では、核酸、好ましくはＤＮＡ又はｃＤＮＡ（例えば、少なくとも１×１０５個のバリアント、少なくとも１×１０６個のバリアント、少なくとも１×１０７個のバリアント、少なくとも１×１０８個のバリアント、少なくとも１×１０９個のバリアント、又は少なくとも１×１０１０個のバリアント、例えば、１×１０５～１×１０１０個のバリアント、５×１０５～５×１０８個のバリアント、１×１０６～１×１０８個のバリアント、５×１０６～５×１０７個のバリアント、１×１０７～４×１０７個のバリアント、又は２×１０７～３×１０７個のバリアントの）のライブラリーを含有する水溶液、表面機能化ビーズ（例えば、核酸鋳型の接着を促進する各ビーズの表面に付加された化学基を有するビーズ）、及び核酸を機能化ビーズの表面に結合するための試薬を組み合わせて混合物を生成する。混合物は、好ましくは水溶液溶媒である。一部の実施形態では、核酸バリアントは、表面機能化ビーズへの核酸バリアントの固定化を促進する末端反応基を有するであろう。例えば、各ビーズは、末端アクリルアミド基を持つＤＮＡ鋳型の固定化のための表面上にポリアクリルアミドマトリックスによって機能化され得る。
[0082]複数のビーズの表面上にポリヌクレオチドのクローン集団を提示するための方法が記載される。一部の実施形態では、核酸、好ましくはＤＮＡ又はｃＤＮＡ（例えば、少なくとも１×１０５個のバリアント、少なくとも１×１０６個のバリアント、少なくとも１×１０７個のバリアント、少なくとも１×１０８個のバリアント、少なくとも１×１０９個のバリアント、又は少なくとも１×１０１０個のバリアント、例えば、１×１０５～１×１０１０個のバリアント、５×１０５～５×１０８個のバリアント、１×１０６～１×１０８個のバリアント、５×１０６～５×１０７個のバリアント、１×１０７～４×１０７個のバリアント、又は２×１０７～３×１０７個のバリアントの）のライブラリーを含有する水溶液、表面機能化ビーズ（例えば、核酸鋳型の接着を促進する各ビーズの表面に付加された化学基を有するビーズ）、及び核酸を機能化ビーズの表面に結合するための試薬を組み合わせて混合物を生成する。混合物は、好ましくは水溶液溶媒である。一部の実施形態では、核酸バリアントは、表面機能化ビーズへの核酸バリアントの固定化を促進する末端反応基を有するであろう。例えば、各ビーズは、末端アクリルアミド基を持つＤＮＡ鋳型の固定化のための表面上にポリアクリルアミドマトリックスによって機能化され得る。
【0075】
[0083]一部の実施形態では、核酸バリアントは、表面機能化ビーズへの固定化を促進する末端小分子部分を有するであろう。例えば、各ビーズは、末端ビオチン部分を含有するＤＮＡ鋳型の固定化のためのストレプトアビジンによって機能化され得る。一部の実施形態では、各ビーズは、末端アミノ基を含有するＤＮＡ鋳型の共有結合的な固定化のためのカルボン酸官能基によって機能化され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Diamante et al (2013) Protein Engineering Design and Selection 26 (10): 713-724、Sepp et al (2002) FEBS Letters 532 (2002): 455-458、及びGriffiths and Tawfik (2003) EMBOJ 22(1): 24-35のように、ホスホルアミデート化学によりビーズ表面上で完全に又は部分的に合成され得る。混合物は、例えば第１のマイクロエマルジョン中で乳化され、多数（例えば、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、又は１×１０１０より多い、例えば１×１０５～１×１０１２）の油中水型液滴を作成し得る。混合物の成分は、本明細書に記載されるように、各液滴が、平均１つのビーズ及び１つ又は少しの核酸鋳型コピーを含有することを確実にするように調整され得る。
【0076】
[0084]一部の実施形態では、ビーズは、ガラス、石英、シリカ、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、樹脂、ハイドロゲル、及びそれらの複合物を含む様々な物質のいずれか１つから構成され得る。ビーズは、ゲルビーズ（例えば、ハイドロゲルビーズ）であり得る。ビーズは、高分子材料から形成されてもよい。ビーズは、磁気又は非磁気であってもよい。特定の実施形態では、ビーズは、サイズが実質的に相同であり（＋／－５％分散）、例えば、ビーズ当たり約１０３～１０６個のＤＮＡ分子を提示するのに十分な機能性ハンドルを含有する。
【0077】
[0085]一部の実施形態では、各液滴中の核酸は、固定化したＤＮＡオリゴの伸長により、ビーズの表面上で直接増幅される。一部の実施形態では、核酸は、ビーズを含有しない液滴中で別々に増幅され、次いで、ビーズを含有する別々の液滴と、マイクロ流体チャネル中で融合されてもよい。一部の実施形態では、エマルジョン液滴の生成時に、各液滴中の核酸はポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、各核酸バリアントのクローン集団を作成する。各マイクロエマルジョン液滴中の増幅された核酸の物理的な固定化は、例えば固定化したＤＮＡオリゴのライゲーション又は伸長により達成され、核酸コートビーズを生成し得る（例えば、ＤＮＡコートビーズ）。
【0078】
ビーズ上のポリペプチド提示
[0086]複数のビーズの表面上にポリペプチドを提示する方法が本明細書に記載される。ビーズ上にポリヌクレオチドを提示する方法を使用して調製された核酸コートビーズ（例えば、ＤＮＡコートビーズ）から開始して、コードされたポリペプチドは、発現され、ビーズにコンジュゲートされ得る（例えば、ビーズにコンジュゲートされる核酸へのコンジュゲーションを介して）。ビーズへのポリペプチドのコンジュゲーション（例えば、直接又は核酸への接着を介して）は、第２のマイクロエマルジョンステップで実施され得る。
[0086]複数のビーズの表面上にポリペプチドを提示する方法が本明細書に記載される。ビーズ上にポリヌクレオチドを提示する方法を使用して調製された核酸コートビーズ（例えば、ＤＮＡコートビーズ）から開始して、コードされたポリペプチドは、発現され、ビーズにコンジュゲートされ得る（例えば、ビーズにコンジュゲートされる核酸へのコンジュゲーションを介して）。ビーズへのポリペプチドのコンジュゲーション（例えば、直接又は核酸への接着を介して）は、第２のマイクロエマルジョンステップで実施され得る。
【0079】
[0087]例えば、ＤＮＡコートビーズは、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）法のための試薬を含む混合物と共に第２のマイクロエマルジョン中に乳化され、ビーズ上での転写及び翻訳、並びにコードされたポリペプチド及び／又はタンパク質の産生をもたらす。一部の実施形態では、第２のマイクロエマルジョンは、ＩＶＴＴのための試薬、並びに触媒酵素又は触媒酵素をコードし、核酸上の捕捉部分へのポリペプチドの接着を触媒する溶液相ＤＮＡを含有する。混合物の成分は、本明細書に記載されるように、平均して１つのＤＮＡコートビーズ及び十分なＩＶＴＴ試薬を確実にするように調整され得る。
【0080】
[0088]タンパク質発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞発現系を使用して実行され得る。翻訳は、酵素、ｔＲＮＡ及びアクセサリー因子（終結因子を除く）、アミノ酸及びエネルギー供給（例えば、ＧＴＰ）を含む、翻訳に必要な全ての成分を提供する任意の生物からの粗溶解物を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。大腸菌、小麦胚芽、及びウサギの網状赤血球由来の無細胞発現系が一般的に使用される。大腸菌ベースのシステムは、高収率を提供するが、真核生物ベースのシステムは、翻訳後改変タンパク質を産生するために好ましい。あるいは、人工的に再構成された無細胞系は、タンパク質産生のために使用され得る。最適なタンパク質産生のため、ＤＮＡ鋳型のＯＲＦのコドン利用は、タンパク質翻訳のために選択された特定の無細胞発現系での発現のために最適化され得る。さらに、標識又はタグがタンパク質に付加され、ハイスループットスクリーニングを促進し得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Katzen et al. (2005) Trends Biotechnol. 23:150-156；Jermutus et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:534-548；Nakano et al. (1998) Biotechnol. Adv. 16:367-384；Spirin (2002) Cell-Free Translation Systems, Springer；Spirin and Swartz (2007) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH；Kudlicki (2002) Cell-Free Protein Expression, Landes Bioscienceを参照。一部の実施形態では、無細胞発現系は、精製された成分から再構成した原核生物ＩＶＴＴ混合物を使用する（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ）。一部の実施形態では、ＩＶＴＴは、大腸菌溶解物ベースのシステム（例えば、Ｓ３０）を含み、スケールの増加を促進する（例えば、１０９～１０１０個のビーズ）。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞発現は、提示されるタンパク質の正確なフォールディング又は翻訳後修飾（ＰＴＭ）を達成するために、真核生物システム（例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、ＨｅＬａ細胞溶解物ベース）を使用して実施される。一部の実施形態では、ＩＶＴＴ法を使用して発現されたポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸を含む。
【0081】
[0089]他の実施形態では、複数のポリペプチドがＤＮＡ－ビーズコンジュゲートに結合され、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを産生し得る。一部の実施形態では、タンパク質のＤＮＡコートビーズへの結合は、３部酵素結合システムを使用して達成される。一部の実施形態では、３部酵素結合システムは、１）結合酵素；２）ＤＮＡコートビーズ上のＤＮＡの捕捉部分（例えば、小分子又はペプチド捕捉部分）；及び３）タンパク質の結合タグ（例えば、ペプチド結合タグ）（例えば、図２参照）から構成される。３部酵素結合システムの使用は、捕捉部分をコードするポリヌクレオチド配列を含むように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列への改変を必要とし得る。並行して、結合タグ部分の包括は、タンパク質をコードする配列への改変を実施することによって達成され得る。
【0082】
[0090]本開示は、ビーズにポリペプチドをコンジュゲートするための方法（例えば、ビーズにさらにコンジュゲートされる核酸へのコンジュゲーションによる）も提供する。そのような方法は、ビーズにポリペプチド及び核酸を結合するためのより小さい及び／又はより安定な方法を産生する。これは、条件（例えば、温度、ｐＨ、又は塩濃度）の範囲を増加して実施されるアッセイを可能にする。さらに、ビーズへのより小さいアセンブリーは、オフターゲット効果を減少させ、複数のポリペプチドのより正確な特徴付けを可能にする。
【0083】
[0091]一部の実施形態では、ビーズにポリペプチドをコンジュゲートするための方法（例えば、ビーズにさらにコンジュゲートされる核酸へのコンジュゲーションによる）は、第１のマイクロエマルジョン液滴中で、ポリペプチドをコードする核酸分子をビーズにコンジュゲートするステップ；並びに第２のマイクロエマルジョン液滴中で、核酸分子を発現させて、ポリペプチドを産生するステップ、及びポリペプチドを核酸分子に同時にコンジュゲートし、それによりポリペプチドをビーズにコンジュゲートするステップを含む。
【0084】
[0092]他の実施形態では、ビーズ上に提示される核酸へのポリペプチドのコンジュゲーションは、結合酵素によって触媒される。例えば、結合酵素は、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、ペプチリガーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、トランスグルタミナーゼ、チューブリンチロシンリガーゼ、ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ、又はＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅから選択され得る。
【0085】
[0093]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてソルターゼＡを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、遊離のＮ末端グリシン残基を有するポリペプチドを含み、かつその他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１）を有するポリペプチドを含み得、ここでＸは任意のアミノ酸である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0086】
[0094]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてブテラーゼ１を使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＸＸ（配列番号２）を含むポリペプチドを含み、ここでＸ１はＰ、Ｄ、又はＥを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＩ、Ｌ、Ｖ、又はＣであり；Ｘは任意のアミノ酸であり、かつその他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＤＨＶ又はＮＨＶを含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0087】
[0095]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてトリプシリガーゼを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＲＨＸＸ（配列番号３）を含むポリペプチドを含み、ここでＸは任意のアミノ酸であり、かつその他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＹＲＨを含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0088】
[0096]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてサブチリシン由来酵素（例えば、オムニリガーゼ）を使用して達成され得る。この実施形態では、捕捉部分は、カルボキサミド－メチル（ＯＣａｍ）を含み、かつ結合タグは、アシル－アクセプター求核剤として作用する遊離のＮ末端アミノ酸を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0089】
[0097]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を使用して達成され得る。この実施形態では、捕捉部分は、アルデヒド反応基を含み、かつ結合タグは、アミノ酸配列ＣＸＰＸＲ（配列番号４）を含むポリペプチドを含み得、ここでＸは任意のアミノ酸である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0090】
[0098]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素としてトランスグルタミナーゼを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、リジン残基又は遊離のＮ末端アミノ基を含むポリペプチドを含み、かつその他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号５）を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0091】
[0099]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素として、チューブリンチロシンリガーゼを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、遊離のＮ末端チロシン残基を含むポリペプチドを含み、かつその他の捕捉部分又は結合タグは、Ｃ末端アミノ酸配列ＶＤＳＶＥＧＥＥＥＧＥＥ（配列番号６）を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0092】
[0100]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素として、チューブリンホスホパンテテニルトランスフェラーゼを使用して達成され得る。この実施形態では、捕捉部分は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）を含み、かつ結合タグは、アミノ酸配列ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0093】
[0101]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素として、ＳｐｙＬｉｇａｓｅを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は連結タグは、アミノ酸配列ＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤ（配列番号８）を含むポリペプチドを含み、かつ他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号９）を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0094】
[0102]ビーズ上に提示されるＤＮＡ分子へのタンパク質の酵素結合は、結合酵素として、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを使用して達成され得る。この実施形態では、１つの捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＤＩＰＡＴＹＥＦＴＤＧＫＨＹＩＴＮＥＰＩＰＰＫ（配列番号１０）を含むポリペプチドを含み、かつ他の捕捉部分又は結合タグは、アミノ酸配列ＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ（配列番号１１）を含むポリペプチドを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schmidt et al (2017) Current Opinion in Chemical Biology 38: 1-7、Falck and Muller (2018) Antibodies 7(1): 4及びMassa and Devoogdt (2019) Bioconjugation: Methods and Protocolsを参照）。
【0095】
[0103]一実施形態では、捕捉部分は二本鎖ＤＮＡを含み、結合タグはポリペプチドを含み、かつ捕捉部分及び結合タグはロイシンジッパーを形成する。別の実施形態では、捕捉部分は、核酸配列ＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号１２）を含み、かつ結合タグは、アミノ酸配列ＤＰＡＡＬＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＧＧＣ（配列番号１３）を含む（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Stanojevic and Verdine (1995) Nat Struct Biol 2(6): 450-7を参照。
【0096】
[0104]一部の実施形態では、結合酵素は、精製された成分として第２のマイクロエマルジョンの混合物に導入される。一部の実施形態では、結合酵素は、タンパク質バリアントライブラリーと当時に発現される補充遺伝子の形態で第２にマイクロエマルジョンに導入される。タンパク質の結合タグへのＤＮＡコートビーズ上のＤＮＡの結合を実施し、ビーズ表面積μｍ２当たり１０３～１０６個の分子のタンパク質密度を達成する。
【0097】
[0105]他の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、抗原、抗体、酵素、基質、又は受容体を提示する。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲート上に提示される抗原のライブラリーは、１つ又はそれ以上の病原体又はがんのタンパク質エピトープ（例えば、１～１０エピトープバリアント、１～９エピトープバリアント、１～８エピトープバリアント、１～７エピトープバリアント、１～６エピトープバリアント、１～５エピトープバリアント、１～４エピトープバリアント、１～３エピトープバリアント、１～２エピトープバリアント、１エピトープバリアント、２エピトープバリアント、３エピトープバリアント、４エピトープバリアント、５エピトープバリアント、６エピトープバリアント、７エピトープバリアント、８エピトープバリアント、９エピトープバリアント、又は１０エピトープバリアント）を含む。
【0098】
[0106]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、がんと関連するタンパク質を提示する。例えば、コンジュゲートは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連のがん、ＡＩＤＳ関連のリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部グリオーマ、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、杯細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん（gastric cancer）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭がん、口唇及び口腔内がん、脂肪肉腫、肝臓がん、肺がん、例えば非小細胞及び小細胞肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、潜在性原発を有する転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん（mouth cancer）、多発性内分泌腫瘍症候群、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病、鼻腔がん及び副鼻腔がん、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん（oral cancer）、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔がん及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、クローム親和細胞腫、松果体の星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、腎盂及び尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚癌メルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃がん（stomach cancer）、Ｔ細胞リンパ腫、咽頭がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、絨毛腫瘍（妊娠性）、未知の原発性部位のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワンデルストレーム高ガンマグロブリン血症、及びウィルムス腫瘍から選択されるがんと関連するタンパク質を提示し得る。
【0099】
[0107]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、感染病原体（例えば、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、又は寄生虫タンパク質）と関連するタンパク質を提示する。例えば、コンジュゲートは、ＣＯＶＩＤ－１９、ＨＩＶ、デング熱、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、梅毒、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、正常血液、バレー熱、及びＣ型肝炎ウイルスから選択されるウイルスと関連するタンパク質を提示し得る。
【0100】
[0108]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、炎症性及び／又は自己免疫疾患と関連するタンパク質を提示する。一部の実施形態では、炎症性又は自己免疫疾患は、ＨＩＶ、関節リウマチ、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群、毛細血管拡張性失調症、季節性アレルギー、通年性アレルギー、食物アレルギー、アナフィラキシー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、脾機能亢進症、白血球粘着不全症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、選択性免疫グロブリンＡ欠損症、高ＩｇＭ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、高ＩｇＥ症候群、橋本甲状腺炎、及び／又は細胞内シグナル伝達プロセスの崩壊から選択される。
【0101】
マイクロエマルジョン液滴
[0109]化学及び生化学反応の目的のためのマイクロエマルジョン液滴を産生するための方法が、当業者に公知である。一般に、マイクロエマルジョン液滴は、油相中に懸濁された水相を含有する（例えば油中水型エマルジョン）。一実施形態では、油相は、９５％鉱油、４．５％ Ｓｐａｎ－８０、０．４５％ Ｔｗｅｅｎ－８０、及び０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００から構成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、水相と油相を直接混合及び／又はボルテックスするステップを介して形成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、油相を含有するマイクロ流体チャネルにおいて水相を押し出す圧電ポンプを介して形成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、分散装置又はホモジナイザーを使用する水相及び油相の機械混合により形成される。一実施形態では、各エマルジョン液滴は、平均して単一のプライマーコートビーズ、１つの鋳型ＤＮＡ分子、及び複数のＰＣＲプライマー分子を含有する。温度サイクルを使用して、ビーズ上で鋳型から増幅したクローンＤＮＡを産生することができる。
[0109]化学及び生化学反応の目的のためのマイクロエマルジョン液滴を産生するための方法が、当業者に公知である。一般に、マイクロエマルジョン液滴は、油相中に懸濁された水相を含有する（例えば油中水型エマルジョン）。一実施形態では、油相は、９５％鉱油、４．５％ Ｓｐａｎ－８０、０．４５％ Ｔｗｅｅｎ－８０、及び０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００から構成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、水相と油相を直接混合及び／又はボルテックスするステップを介して形成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、油相を含有するマイクロ流体チャネルにおいて水相を押し出す圧電ポンプを介して形成される。一部の実施形態では、マイクロエマルジョンは、分散装置又はホモジナイザーを使用する水相及び油相の機械混合により形成される。一実施形態では、各エマルジョン液滴は、平均して単一のプライマーコートビーズ、１つの鋳型ＤＮＡ分子、及び複数のＰＣＲプライマー分子を含有する。温度サイクルを使用して、ビーズ上で鋳型から増幅したクローンＤＮＡを産生することができる。
【0102】
タンパク質特性及び機能のハイスループット特徴付け
[0110]１つの自動装置上で大きな複数のタンパク質バリアント（例えば、少なくとも１×１０５個のバリアント、少なくとも１×１０６個のバリアント、１×１０７個のバリアント、１×１０８個のバリアント、又は１×１０９個のバリアント、例えば１×１０５と１×１０１０個の間のバリアント、１×１０６と１×１０１０個の間のバリアント、又は１×１０７と１×１０１０個の間のバリアント）のハイスループットアッセイのための方法が本明細書に記載される。
[0110]１つの自動装置上で大きな複数のタンパク質バリアント（例えば、少なくとも１×１０５個のバリアント、少なくとも１×１０６個のバリアント、１×１０７個のバリアント、１×１０８個のバリアント、又は１×１０９個のバリアント、例えば１×１０５と１×１０１０個の間のバリアント、１×１０６と１×１０１０個の間のバリアント、又は１×１０７と１×１０１０個の間のバリアント）のハイスループットアッセイのための方法が本明細書に記載される。
【0103】
[0111]特定の実施形態では、第２のマイクロエマルジョンにおけるタンパク質生成及び提示後、エマルジョンは破壊され、タンパク質の多くのコピー及びタンパク質をコードするＤＮＡの多くのクローンコピーを提示するビーズの集団を放出することができる。次いで、ビーズは、各ビーズのＤＮＡをシークエンスし、ハイスループット方法で提示したタンパク質の特性及び／又は機能も解析するように設定された装置に導入され得る。一実施形態では、ビーズは、固体表面上に固定化され得る（例えばナノウェルに回収される）。ポリペプチドの固定化されたライブラリーは、次いで、ビーズに流れ得る様々な試薬（例えば、標的薬物、エピトープ、パラトープ、又は抗原）によって提示され、ポリペプチドの機能及び／又は特性は、検出（例えば、蛍光イメージング）及び定量される蛍光シグナルによりアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、試薬は、次いで洗い流され、プロセスが繰り返され得る（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回）。一部の実施形態では、単一のアッセイの実行は、第１の標的（標的「Ａ」）への平衡結合を測定する第１のステップ、標的Ａへの結合キネティクスを測定する第２のステップ、第２の標的（標的「Ｂ」）への平衡結合を測定する第３のステップ、標的Ｂへの結合キネティクスを測定する第４のステップ、続いて様々な環境条件（例えば、温度、ｐＨ、及び／又は等張性）でのタンパク質安定性（例えば、変性）を測定する第５のステップを含み得る。一部の場合では、アッセイの順序は、ポリペプチドに生じる任意の変化（例えば、ポリペプチドへの不可逆的な変化、例えば変性など）が読み出しに影響しないことを確実にするために選択され得る。一部の実施形態では、再生ステップは各アッセイの後に実施され、次のアッセイのためのビーズを調製することができる。再生ステップは、低ｐＨ溶液（例えば、ｐＨ＝４．５）中でビーズをインキュベートし、任意の結合分子を解離させ、次いで例えば洗浄ステップ、及び次のアッセイで使用され得る状態（例えば、中性ｐＨ）にビーズを戻すステップに設定され得る。低ｐＨによる再生は、本開示の方法の利点及びタンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートの組成間の共有結合の性質により、先行技術の方法を超える進展を提示する。低ｐＨへのそのような暴露が、続くアッセイを実施する可能性を制限又は排除するタンパク質－ＤＮＡコンジュゲートの不可逆的な崩壊をもたらすと仮定すると、当分野で先に確立された方法での低ｐＨによる再生は可能ではない。
【0104】
[0112]一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ポリペプチドを特徴付ける広範なアッセイ（例えば、平衡結合アッセイ（Ｋｄ）、キネティック結合アッセイ（会合、Ｋｏｎ）、キネティック結合アッセイ（解離、ｋｏｆｆ）、検出アッセイの限界（ＬｏＤ）、熱変成（平衡アンフォールディング、Ｔｍ）、及び／又は化学変性（平衡アンフォールディング、Ｃ１／２））を実施するために設定され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドのキネティック安定性は、提示されたタンパク質に試薬（例えば、標的薬物、抗原、エピトープ、パラトープ、又は直交抗体）を付加する第１のステップ及び結合シグナル（例えば、蛍光シグナル）が消失するまで温度を上げる及び／又は変性剤の濃度を上げる第２のステップによって測定される。
【0105】
[0113]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートのタンパク質バリアントは、例えば熱安定性及びｐＨ安定性を含む特性を評価される。
[0114]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートのタンパク質バリアントの熱安定性は、温度上昇（例えば、４５℃より高い、４５℃～１００℃の間、５５℃～９０℃の間、６５℃～８０℃の間、４５℃～９０℃の間、５５℃～８０℃の間、６５℃～７０℃の間、４５℃～５５℃の間、５５℃～６５℃の間、６５℃～７５℃の間、７５℃～８５℃の間、８５℃～９５℃の間、９５℃～１００℃の間、４０℃～４５℃の間、４６℃～５０℃の間、５０℃～５５℃の間、５５℃～６０℃の間、６０℃～６５℃の間、６５℃～７０℃の間、７０℃～７５℃の間、７５℃～８０℃の間、８０℃～８５℃の間、８５℃～９０℃の間、９０℃～９５℃の間、９５℃～１００℃の間、又は４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、又は１００℃若しくはそれ以上）に応答するタンパク質バリアントの変性を特徴付けることによって実施される。一部の実施形態では、温度上昇に応答するタンパク質バリアントの変成は、変成したタンパク質の蛍光検出を使用して評価される（例えば、ＦＡＣＳソーティング）。
[0114]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートのタンパク質バリアントの熱安定性は、温度上昇（例えば、４５℃より高い、４５℃～１００℃の間、５５℃～９０℃の間、６５℃～８０℃の間、４５℃～９０℃の間、５５℃～８０℃の間、６５℃～７０℃の間、４５℃～５５℃の間、５５℃～６５℃の間、６５℃～７５℃の間、７５℃～８５℃の間、８５℃～９５℃の間、９５℃～１００℃の間、４０℃～４５℃の間、４６℃～５０℃の間、５０℃～５５℃の間、５５℃～６０℃の間、６０℃～６５℃の間、６５℃～７０℃の間、７０℃～７５℃の間、７５℃～８０℃の間、８０℃～８５℃の間、８５℃～９０℃の間、９０℃～９５℃の間、９５℃～１００℃の間、又は４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、又は１００℃若しくはそれ以上）に応答するタンパク質バリアントの変性を特徴付けることによって実施される。一部の実施形態では、温度上昇に応答するタンパク質バリアントの変成は、変成したタンパク質の蛍光検出を使用して評価される（例えば、ＦＡＣＳソーティング）。
【0106】
[0115]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートのタンパク質バリアントのｐＨ安定性は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０より低い、例えばｐＨ３．０～６．０の間、又はｐＨ４．０～５．０の間、又はｐＨ３．０～３．５の間、又はｐＨ３．５～４．０の間、又はｐＨ４．０～４．５の間、又はｐＨ４．５～５．０の間、又はｐＨ５．０～５．５の間、又はｐＨ５．５～６．０の間、又はｐＨ３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０）に応答するタンパク質バリアントの変性を特徴付けることによって実施される。一部の実施形態では、低ｐＨに応答したタンパク質バリアントの変性は、変性タンパク質の蛍光検出（例えば、ＦＡＣＳソーティング）を使用して評価される。
【0107】
[0116]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートのタンパク質バリアントのｐＨ安定性は、高ｐＨ（例えば、ｐＨ８．０より高い、例えばｐＨ８．０～１０．０の間、又はｐＨ８．０～８．５の間、又はｐＨ８．５～９．０の間、ｐＨ９．０～９．５の間、又はｐＨ９．５～１０．０の間、又はｐＨ８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０）に応答したタンパク質バリアントの変性を特徴付けることによって実施される。一部の実施形態では、高ｐＨに応答したタンパク質バリアントの変性は、変性タンパク質の蛍光検出（例えば、ＦＡＣＳソーティング）を使用して評価される。
【0108】
[0117]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートに提示される、大多数のタンパク質バリアントの生物学的活性（例えば、結合親和性、結合特異性、及び／又は酵素活性）は、１つの自動化装置上で特徴付けられる。一実施形態では、タンパク質バリアントの結合親和性は、タンパク質バリアントと蛍光標識した標的分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、競合阻害剤及び又はアロステリック阻害剤）の間の結合の蛍光検出を使用して決定される。別の実施形態では、タンパク質バリアントの結合特異性は、タンパク質バリアントと蛍光標識した標的分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、競合阻害剤及び／又はアロステリック阻害剤）の間の結合の蛍光検出を使用して決定される。一部の実施形態では、結合親和性及び結合特異性は、大多数のタンパク質バリアントについて、１つの自動化装置上で任意の順序で順番に決定される。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲート上に提示された大多数のタンパク質バリアントの酵素活性は、１つの自動化装置上で特徴付けられる。一実施形態では、酵素活性は、反応産物（複数可）の増加の蛍光検出を使用して、及び／又は反応試薬（複数可）の減少の蛍光検出を使用して決定される。
【0109】
[0118]タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、生体分子（例えば、抗体、パラトープ、抗原、酵素、基質、又は受容体）と薬物（例えば、抗ウイルス薬、アブシキシマブ、アダリブマブ、アレファセプト、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、インフレクトラ、イプリムマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスズマブ、セクキヌマブ、ウテキヌマブ、又はカブリビ（Cabliv））の相互作用を調べるために使用され得る。
【0110】
[0119]他の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、診断及び／又はコンパニオン診断プロセスにおいて使用され得る。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、様々な患者特異的薬物標的を提示して、薬物のコンパニオン診断の一部としてタンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートに結合される薬物の有効性を試験し得る。一部の実施形態では、患者のがん特異的バリアントに対する薬物の有効性を試験するため、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを使用して、患者特異的がんエピトープバリアント（例えば、ナノ抗原）を提示することができる。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを使用して、感染病原体と関連する患者又は集団特異的エピトープを提示し、細菌又はウイルス薬物抵抗性及び薬物有効性を特徴付けることができる。
【0111】
[0120]一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを使用して、バイオマーカー又は他の診断エピトープを提示し、次いで患者の血清とインキュベートし、そこで血清中の患者の抗体がタンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートに結合し、抗ヒト二次抗体によって検出され、診断として患者の抗体応答をアッセイすることができる。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、対象のアレルギー応答を診断及び特徴付けるために、アレルゲンエピトープを提示するように設定され得る。一部の実施形態では、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートは、感染病原体の幅広いグループからの広範なエピトープを提示して、患者の血清を試験し、活動性感染を診断し、免疫保護（例えば、免疫化）を特徴付けることもできる。
【0112】
[0121]一部の実施形態では、ポリペプチドの機能又は特性は、標的に結合することである（例えば、本明細書に記載されるリガンド結合、平衡結合、又はキネティック結合）。一部の実施形態では、機能又は特性は、酵素活性又は特異性である（例えば、本明細書に記載される酵素活性又は酵素阻害）。一部の実施形態では、機能又は特性は、タンパク質発現のレベルである（例えば、所与の遺伝子の発現レベル）。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能又は特性は、安定性である（例えば、熱変成によって測定された熱安定性又は化学変成によって測定された化学安定性）。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能又は特性は、ポリペプチドの凝集である。
【0113】
[0122]一部の実施形態では、１つより多くのアッセイが、同じ装置上で実施される（例えば、２回若しくはそれ以上、３回若しくはそれ以上、４回若しくはそれ以上、又は５回若しくはそれ以上のアッセイ）。複数のアッセイが同じ装置上で同時に又は順に実施され得る。これは、高効率でポリペプチドのライブラリー全体を同時にアッセイする利点を提供する。例えば、方法は、競合分子の存在下で標的への競合結合の決定；複数の異なる標的への結合の測定；平衡結合及び結合キネティクスの測定；結合及びタンパク質安定性の測定；又はこれらの任意の組合せを含み得る。本方法は、様々な条件下での各ポリペプチドの複数の機能又は特性、例えば複数のｐＨ条件下での結合；複数の温度条件下での結合；及び／又は複数の緩衝液条件下での結合をアッセイするステップも含み得る。
【0114】
[0123]ポリペプチドの特性又は機能の例示的なアッセイは、表１に提供される。これらのアッセイの１つ又はそれ以上は、ポリペプチドの同じライブラリーで実施され得る。１つより多くのアッセイが実施される場合、アッセイは、同時に又は順に実施され得る。
【0115】
【表1-1】
【0116】
【表1-2】
【0117】
【表1-3】
【0118】
ビーズ上のＤＮＡのハイスループットシークエンシング
[0124]ビーズ上に提示される大多数のＤＮＡバリアントのシークエンスのハイスループット決定のための方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される方法は、前記タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートにおけるＤＮＡのシークエンシングとして、１つの自動装置上で大多数のタンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートにおけるタンパク質のハイスループット解析を可能にし得る。他の実施形態では、方法は、１つの自動装置上でのハイスループットタンパク質解析及びハイスループットシークエンシングのために使用され得る。さらに他の実施形態では、複数のペプチド提示ビーズが、シークエンシングの前に固体表面上にロードされ、固定化される。タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲート上に提示される大多数のＤＮＡバリアントのシークエンシングは、ハイスループットシークエンシング法及び技術（例えば、合成によるシークエンシング（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）色素シークエンシング、イオン半導体シークエンシング、又はピロシークエンシング）又はライゲーションによるシークエンシング（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出（ＳＯＬｉＤ（商標））シークエンシング又はポロニーベースのシークエンシング）、ロングリード又は単一分子のシークエンシング（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ（商標）シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシング、及びナノポアシークエンシング）及びサンガーシークエンシング））を使用して達成され得る。さらに他の実施形態では、ハイスループットシークエンシングは、それぞれの固定化したビーズ上の組み込まれた塩基の蛍光検出により達成される（合成によるシークエンシング）。
[0124]ビーズ上に提示される大多数のＤＮＡバリアントのシークエンスのハイスループット決定のための方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される方法は、前記タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートにおけるＤＮＡのシークエンシングとして、１つの自動装置上で大多数のタンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートにおけるタンパク質のハイスループット解析を可能にし得る。他の実施形態では、方法は、１つの自動装置上でのハイスループットタンパク質解析及びハイスループットシークエンシングのために使用され得る。さらに他の実施形態では、複数のペプチド提示ビーズが、シークエンシングの前に固体表面上にロードされ、固定化される。タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲート上に提示される大多数のＤＮＡバリアントのシークエンシングは、ハイスループットシークエンシング法及び技術（例えば、合成によるシークエンシング（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）色素シークエンシング、イオン半導体シークエンシング、又はピロシークエンシング）又はライゲーションによるシークエンシング（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出（ＳＯＬｉＤ（商標））シークエンシング又はポロニーベースのシークエンシング）、ロングリード又は単一分子のシークエンシング（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ（商標）シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシング、及びナノポアシークエンシング）及びサンガーシークエンシング））を使用して達成され得る。さらに他の実施形態では、ハイスループットシークエンシングは、それぞれの固定化したビーズ上の組み込まれた塩基の蛍光検出により達成される（合成によるシークエンシング）。
【0119】
ポリヌクレオチドの単一装置シークエンシング及びポリペプチドのアッセイ
[0125]本明細書に記載される、ポリヌクレオチドの単一装置シークエンシング及びアッセイは、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを装置に導入することによって開始され得る（例えば、マイクロウェルへか又はフローセル表面上に無作為に配置される）。一部の実施形態では、シークエンサー／アナライザー装置は、以下の構成要素を含むように設定され得る：（１）単一ビーズレベルでの解析を可能にするビーズを固定化する及び（２）自動化方式で液相試薬を導入するフローセル；並びにシークエンシング及び結合からの蛍光シグナルが全てのビーズに渡って記録される、シークエンシングとタンパク質アッセイの両方のためのシグナルを測定するハイスループットメカニズム（例えば、自動蛍光顕微鏡装置）。一部の実施形態では、シークエンシング及び／又は結合イベントは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８９３６７６３号に記載されるように、全てのビーズに渡って検出されるｐＨの変化をもたらす。
[0125]本明細書に記載される、ポリヌクレオチドの単一装置シークエンシング及びアッセイは、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートを装置に導入することによって開始され得る（例えば、マイクロウェルへか又はフローセル表面上に無作為に配置される）。一部の実施形態では、シークエンサー／アナライザー装置は、以下の構成要素を含むように設定され得る：（１）単一ビーズレベルでの解析を可能にするビーズを固定化する及び（２）自動化方式で液相試薬を導入するフローセル；並びにシークエンシング及び結合からの蛍光シグナルが全てのビーズに渡って記録される、シークエンシングとタンパク質アッセイの両方のためのシグナルを測定するハイスループットメカニズム（例えば、自動蛍光顕微鏡装置）。一部の実施形態では、シークエンシング及び／又は結合イベントは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８９３６７６３号に記載されるように、全てのビーズに渡って検出されるｐＨの変化をもたらす。
【0120】
[0126]一部の実施形態では、試薬の濃度の変動がシークエンス及び解析装置に導入され、蛍光又はｐＨシグナルは、タンパク質－ＤＮＡ－ビーズコンジュゲートへの試薬の結合を報告する。タンパク質及び／又はポリペプチドアッセイ後、一部の実施形態では、タンパク質をコードするＤＮＡのシークエンシングは、ＤＮＡの相補鎖をストリッピングし（例えば、ホルムアミド又はＮａＯＨ）、結合タンパク質を除去し、ビーズに結合した複数のクローン一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子を残すことにより実施される。次いで、プライマーは、ｓｓＤＮＡ分子にアニールされ、シークエンシングを実施して（例えば、合成によるシークエンシング又はライゲーションによるシークエンシング）、ＤＮＡの配列及びアッセイしたタンパク質のアイデンティティを決定することができる。一部の実施形態では、タンパク質のアッセイ及びタンパク質をコードするＤＮＡのシークエンシングは、任意の順番で実施され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡシークエンシングがまず実施され、プレアニールしたプライマーが、シークエンシングプロセスの開始前に存在する必要があり得る。
【実施例】
【0121】
[0127]以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法がどのように使用、作成、及び評価され得るかの記載を当業者に提供するように提示され、純粋に本発明の例示を意図し、本発明者らが彼らの発明と認識するものの範囲を制限することを意図しない。
【0122】
実施例１．単一装置上でのポリペプチドのライブラリーの平衡同定及び機能的特徴付け
[0128]およそ３×１０７個のビーズのライブラリーは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に各ビーズをコンジュゲートすることによって産生した（実施例１、ステップａ）。本明細書に詳細に記載されるように、ＤＮＡ結合ビーズは、各核酸分子をＰＣＲ増幅することによって産生され、１つのプライマーがビーズ結合されて、各ビーズ上におよそ１０５コピーの核酸分子の同種集団を産生する。各ビーズは、核酸配列へのフルオロフォアの組込みによる一塩基シークエンシングによって同定された（実施例１、ステップｂ）。各ビーズ上の核酸によってコードされたポリペプチドは、無細胞転写及び翻訳によって発現され、生じるポリペプチドは、続いて、ソルターゼＡによって触媒される酵素反応でビーズにコンジュゲートされる（実施例１、ステップｃ）。並行して、各ビーズは、（１）ビーズにコンジュゲートされた核酸分子の配列によって同定され；（２）蛍光標識した抗体への、コンジュゲートしたポリペプチドの結合を決定するためにアッセイされ、配列による同定及び機能的特徴付けは、単一装置上で実施された（実施例１、ステップｄ）。
[0128]およそ３×１０７個のビーズのライブラリーは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に各ビーズをコンジュゲートすることによって産生した（実施例１、ステップａ）。本明細書に詳細に記載されるように、ＤＮＡ結合ビーズは、各核酸分子をＰＣＲ増幅することによって産生され、１つのプライマーがビーズ結合されて、各ビーズ上におよそ１０５コピーの核酸分子の同種集団を産生する。各ビーズは、核酸配列へのフルオロフォアの組込みによる一塩基シークエンシングによって同定された（実施例１、ステップｂ）。各ビーズ上の核酸によってコードされたポリペプチドは、無細胞転写及び翻訳によって発現され、生じるポリペプチドは、続いて、ソルターゼＡによって触媒される酵素反応でビーズにコンジュゲートされる（実施例１、ステップｃ）。並行して、各ビーズは、（１）ビーズにコンジュゲートされた核酸分子の配列によって同定され；（２）蛍光標識した抗体への、コンジュゲートしたポリペプチドの結合を決定するためにアッセイされ、配列による同定及び機能的特徴付けは、単一装置上で実施された（実施例１、ステップｄ）。
【0123】
[0129]本実施例は、各ポリペプチドの結合特性を、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列へとリンクさせ、それにより、同じ装置上で並行して複数のポリペプチドの各ポリペプチドのアイデンティティ及び結合機能を決定する能力を実証する。本実施例は、本発明者らが本発明の範囲であると考えるものを限定することを意味しない。ステップの順序、核酸同定の方法、及び／又はポリペプチドの機能的特徴付けの方法は、本明細書に記載の方法に従って、及び当業者の知識に基づいて改変され得る。
【0124】
材料及び試薬
ＤＮＡオリゴヌクレオチド
[0130]記載した本明細書の方法で使用される遺伝子ブロック（ｇＢｌｏｃｋｓ）及びオリゴヌクレオチド（オリゴ）は表２に提供される。
ＤＮＡオリゴヌクレオチド
[0130]記載した本明細書の方法で使用される遺伝子ブロック（ｇＢｌｏｃｋｓ）及びオリゴヌクレオチド（オリゴ）は表２に提供される。
【0125】
【表2-1】
【0126】
【表2-2】
【0127】
ペプチド
[0131]以下のペプチドは、本明細書に記載の方法で使用された。
・ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成されたＧＬＳＳＫ－Ｎ３
緩衝液
[0132]以下の緩衝液は、記載した本明細書の方法で使用された。
[0131]以下のペプチドは、本明細書に記載の方法で使用された。
・ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって合成されたＧＬＳＳＫ－Ｎ３
緩衝液
[0132]以下の緩衝液は、記載した本明細書の方法で使用された。
【0128】
・ストレプトアビジン結合緩衝液（ＳＡＢＢ）：１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０
・ＴＮａＴＥ：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．０５％ Ｔｗｗｅｅｎ－２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４
・ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．２
・１０×ソルターゼ緩衝液：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５Ｍ ＮａＣｌ
・抗体結合緩衝液（ＡＢＢ）：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０
・インキュベーション緩衝液：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
シークエンシングヌクレオチド
[0133]以下のカスタムジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）は、記載した本明細書の方法で使用された。
・ＴＮａＴＥ：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．０５％ Ｔｗｗｅｅｎ－２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４
・ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．２
・１０×ソルターゼ緩衝液：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５Ｍ ＮａＣｌ
・抗体結合緩衝液（ＡＢＢ）：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０
・インキュベーション緩衝液：１×ＰＢＳ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
シークエンシングヌクレオチド
[0133]以下のカスタムジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）は、記載した本明細書の方法で使用された。
【0129】
・７－プロパルギルアミノ－７－デアザ－ｄｄＡＴＰ－ＡＴＴＯ－４２５
・７－プロパルギルアミノ－７－デアザ－ｄｄＧＴＰ－Ｃｙ５
・５－プロパルギルアミノ－ｄｄＣＴＰ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎ
・５－プロパルギルアミノ－ｄｄＵＴＰ－ＤＹ－４８０ＸＬ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ混合物）
[0134]以下のＩＶＴＴ混合物は、記載した本明細書の方法で使用された。
・７－プロパルギルアミノ－７－デアザ－ｄｄＧＴＰ－Ｃｙ５
・５－プロパルギルアミノ－ｄｄＣＴＰ－ＡＴＴＯ－６４７Ｎ
・５－プロパルギルアミノ－ｄｄＵＴＰ－ＤＹ－４８０ＸＬ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ混合物）
[0134]以下のＩＶＴＴ混合物は、記載した本明細書の方法で使用された。
【0130】
・ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
ＤＮＡポリメラーゼ
[0135]以下のポリメラーゼは、記載した本明細書の方法で使用された。
ＤＮＡポリメラーゼ
[0135]以下のポリメラーゼは、記載した本明細書の方法で使用された。
【0131】
・Ｂｓｍ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
・Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
・Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
・Ｐｈｉｒｅ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
ステップａ．ビーズ上のＤＮＡの提示
[0136]ＤＮＡ結合ビーズは、各核酸分子のＰＣＲ増幅によって産生され（表２）、１つのプライマーがビーズ結合されて、各ビーズ上におよそ１０５個の核酸分子の同種集団を産生した。ビーズは３つのチューブに分けられ、各チューブは異なるポリペプチドをコードするＤＮＡ鋳型を含有する。別々のチューブでの区画化は、マイクエマルジョンでの各ビーズの区画化と類似している。ＰＣＲ後、これは、およそ３×１０７個のビーズの集団を生じ、それぞれ３つのポリペプチドをコードする鋳型の１つを提示する。このチューブ区画化したビーズ上でのＰＣＲは、マイクロエマルジョン区画化したＰＣＲを使用しても達成され、当業者に公知の方法に従って、ビーズ上に提示される多くの特有の配列を生成することができる。フローサイトメーターを使用して、単一塩基伸長によって配列の１塩基を読み取ることにより、ＤＮＡをシークエンスした。フローサイトメーターを使用して、理論的に最大４個のポリヌクレオチド（単一塩基読み取りで、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧによって同定される）を読み取ることができる。３つの特有の配列が、複数のビーズの各ビーズ上に提示された。ユニークタンパク質の大集団を特徴付けるためのスループットの拡大は、既存のシークエンシングプラットフォーム及び当業者に公知のマイクロエマルジョン法を使用して達成され得る。
・Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
・Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
・Ｐｈｉｒｅ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）
ステップａ．ビーズ上のＤＮＡの提示
[0136]ＤＮＡ結合ビーズは、各核酸分子のＰＣＲ増幅によって産生され（表２）、１つのプライマーがビーズ結合されて、各ビーズ上におよそ１０５個の核酸分子の同種集団を産生した。ビーズは３つのチューブに分けられ、各チューブは異なるポリペプチドをコードするＤＮＡ鋳型を含有する。別々のチューブでの区画化は、マイクエマルジョンでの各ビーズの区画化と類似している。ＰＣＲ後、これは、およそ３×１０７個のビーズの集団を生じ、それぞれ３つのポリペプチドをコードする鋳型の１つを提示する。このチューブ区画化したビーズ上でのＰＣＲは、マイクロエマルジョン区画化したＰＣＲを使用しても達成され、当業者に公知の方法に従って、ビーズ上に提示される多くの特有の配列を生成することができる。フローサイトメーターを使用して、単一塩基伸長によって配列の１塩基を読み取ることにより、ＤＮＡをシークエンスした。フローサイトメーターを使用して、理論的に最大４個のポリヌクレオチド（単一塩基読み取りで、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧによって同定される）を読み取ることができる。３つの特有の配列が、複数のビーズの各ビーズ上に提示された。ユニークタンパク質の大集団を特徴付けるためのスループットの拡大は、既存のシークエンシングプラットフォーム及び当業者に公知のマイクロエマルジョン法を使用して達成され得る。
【0132】
[0137]特に、機能的に異なるＦＬＡＧペプチドエピトープをコードする３つのオリゴヌクレオチド（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）は、標準的な緩衝液及び１μＭのプライマー、ｂｔ－Ｂｅａｄ＿ＦＰ及びＡＦ６４７－Ｂｅａｄ＿ＲＰを含有する、別々の反応バイアル中で、Ｐｈｉｒｅ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＩＩを使用してＰＣＲ増幅された。これらの遺伝子ブロックは、熱サイクル条件にかけられた（９８℃で２分間；続いて、９８℃で１５秒、５７℃で１５秒、及び７２℃で３０秒を１８サイクル；続いて、７２℃で最後に２分間伸長）。ライゲーションレディリバースプライマーは、４０μＭのＤＢＣＯ－Ｂｅａｄ＿ＲＰを４０×過剰（１．６ｍＭ）のＧＬＳＳＫ－Ｎ３ペプチドと、ＰＢＳ緩衝液中、室温で終夜インキュベートすることによって調製し、ＧＬＳＳＫ－ＢＡ＿ＲＰを生成した。３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧの精製したＰＣＲ産物は、別々に、～１０７ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１マイクロスフェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）と、室温で３０分間、２５μＬ ＳＡＢＢ中５００μＭでインキュベートした。前述のステップからのビーズは、次いで、ＳＡＢＢによって２回洗浄し、ＴＮａＴＥ中に再懸濁した。次いで、ビーズのアリコットをフローサイトメトリーによって解析し、赤色レーザー（６１８ｎｍ、図３Ａ）による励起時にＡＰＣ（６６０±２０ｎｍ）チャネルでの高シグナルによりＤＮＡ捕捉を確認した。全てのビーズは、次いで、以下によって連続的に洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識したアンチセンスＤＮＡ鎖を除去した：
１．ＰＢＳ（１回洗浄）
２．ＴＮａＴＥ（１回洗浄）
３．２０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＯＨ、３回洗浄）
[0138]洗浄したビーズを、次いで、ＴＮａＴＥ中に懸濁し、リバース鎖の除去をフローサイトメトリーによって確認した（図３Ｂ）。集団は、未コートのビーズからは区別できず、第２の鎖の除去を確認する。この時点で、ビーズの３つの別々の集団は、それぞれＦＬＡＧエピトープ（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）をコードするｓｓＤＮＡのクローン集団を提示する。ビーズは、エマルジョンＰＣＲ中にそうであったのと類似した方法で空間的に単離された。
１．ＰＢＳ（１回洗浄）
２．ＴＮａＴＥ（１回洗浄）
３．２０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＯＨ、３回洗浄）
[0138]洗浄したビーズを、次いで、ＴＮａＴＥ中に懸濁し、リバース鎖の除去をフローサイトメトリーによって確認した（図３Ｂ）。集団は、未コートのビーズからは区別できず、第２の鎖の除去を確認する。この時点で、ビーズの３つの別々の集団は、それぞれＦＬＡＧエピトープ（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）をコードするｓｓＤＮＡのクローン集団を提示する。ビーズは、エマルジョンＰＣＲ中にそうであったのと類似した方法で空間的に単離された。
【0133】
ステップｂ．ビーズ上のＤＮＡの単一塩基シークエンシング
[0139]コード領域にＦＬＡＧペプチドの３つのバリアント（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）をコードする３つのＤＮＡ鋳型を提示するビーズが、次いで、合成によるシークエンシングのために調製された。ＤＮＡ鋳型は、シークエンシングプライマーのハイブリダイゼーション部位のすぐ後のヌクレオチドで配列が異なるように特に設計された。フローサイトメーターを、読み取りのスループットを単一塩基に限定するＤＮＡシークエンサーとして使用した。異なる蛍光標識ヌクレオチド（ＡＴＴＯ６４７Ｎ－ｄｄＣＴＰ、ＣＹ５－ｄｄＧＴＰ、及びＤＹ４８０ＸＬ－ｄｄＵＴＰ）による単一塩基伸長後、ビーズはサイトメーターによって読み取られるように調製され、異なるチャネルでの蛍光シグナルに基づき、ビーズ上のＤＮＡの配列を区別した。
[0139]コード領域にＦＬＡＧペプチドの３つのバリアント（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）をコードする３つのＤＮＡ鋳型を提示するビーズが、次いで、合成によるシークエンシングのために調製された。ＤＮＡ鋳型は、シークエンシングプライマーのハイブリダイゼーション部位のすぐ後のヌクレオチドで配列が異なるように特に設計された。フローサイトメーターを、読み取りのスループットを単一塩基に限定するＤＮＡシークエンサーとして使用した。異なる蛍光標識ヌクレオチド（ＡＴＴＯ６４７Ｎ－ｄｄＣＴＰ、ＣＹ５－ｄｄＧＴＰ、及びＤＹ４８０ＸＬ－ｄｄＵＴＰ）による単一塩基伸長後、ビーズはサイトメーターによって読み取られるように調製され、異なるチャネルでの蛍光シグナルに基づき、ビーズ上のＤＮＡの配列を区別した。
【0134】
[0140]ＤＮＡオリゴは、Ｂｅａｄ＿ＲＰのすぐ上流の単一塩基（表２中、３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ ｗｔＦＬＡＧ、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧの下線を引いた塩基を参照）が互いに異なるように設計された。したがって、ＤＮＡのアイデンティティは、どの改変されたｄｄＮＴＰがシークエンス後に各ビーズ上に提示されるか同定することにより決定され得る。特に、ｄｄＧＴＰの組込みは、相補（センス）鎖のシトシン（Ｃ）を示し、ｄｄＵＴＰの組込みは、センス鎖のアデノシン（Ａ）を示し、ｄｄＣＴＰの組込みは、センス鎖のグアノシン（Ｇ）を示し、ｄｄＡＴＰの組込みは、センス鎖のチミン（Ｔ）を示す。それぞれのＦＬＡＧエピトープをコードするｓｓＤＮＡのクローン集団を提示するビーズは、１００μＬのＳＡＢＢによって１回洗浄し、５００ｎＭのＧＬＳＳＫ－ＢＡ＿ＲＰを含有する２０μＬのＳＡＢＢ中に再懸濁した。次いで、ビーズは、２０μＬのＳＡＢＢ中５００ｎＭのＧＬＳＳＫ－ＢＡ＿ＲＰとインキュベートし、４５秒間６３℃に加熱し、氷上で急冷した。次いで、ビーズは、５０μＬの１Ｘ Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ緩衝液によって洗浄し、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液、１μＭ／ｅａ Ｊｅｎａ ｄｄＮＴＰｓ、１０ｎＭのＧＬＳＳＫ－ＲＰ、０．０３２Ｕ／μＬのＢｓｍ酵素（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び０．００８Ｕ／μＬのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ酵素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、５０μＬのコールドＪｅｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ緩衝液中に懸濁した。次いで、ビーズを５分間６５℃、２０分間６３℃に加熱し、氷上で冷却した。この時点で、ビーズは、３つの集団に物理的に分けられ、それぞれＦＬＡＧエピトープをコードする３つのＤＮＡ配列（３ｘ－ＯＫＦＬＡＧ、３ｘ－ｗｔＦＬＡＧ、又は３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧ）のうちの１つ、及びその接着したフルオロフォアが、どのエピトープが提示されるかを示す終結ヌクレオチドをクローン的に発現する。このステップは、各ビーズが、すでに提示されたＤＮＡ配列に応じて、フルオロフォア標識したｄｄＮＴＰのみを拾い上げるため、マイクロエマルジョンによる空間的な単離を必要としなかった。特に、３ｘ－ＯＫＦＬＡＧはＡＴＴＯ６４７Ｎ－ｄｄＣＴＰ（６４４／６６９ｎｍ励起／発光）を採用し、３ｘ－ｗｔＦＬＡＧはＣｙ５－ｄｄＧＴＰ（６４７／６６５ｎｍ励起／発光）を採用し、及び３ｘ－ｓｕｐｅｒＦＬＡＧはＤＹ４８０ＸＬ－ｄｄＵＴＰ（５００／６３０ｎｍ励起／発光）を採用した。ＡＴＴＯ６４７Ｎ及びＣｙ５は、類似の蛍光スペクトルを有するが、ＦＡＣＳ装置は、ＡＰＣチャネルでの相対強度に基づき、別のものから１つを区別するのに十分感受性である（図４Ａ及び４Ｂ）。
【0135】
ステップｃ．ＤＮＡコートしたビーズ上でのコード遺伝子へのペプチドの共有結合的接着
[0141]ポリペプチドを産生するビーズコンジュゲートしたＤＮＡ分子の発現は、ＩＶＴＴの後、ソルターゼＡによる、ビーズコンジュゲートしたＤＮＡ分子への産生したポリペプチドの共有結合的コンジュゲーションを使用して達成された。この結合を確立するため、ビーズ上の核酸分子は、捕捉部分（遊離のＮ末端グリシンを有する）である５’－ＧＬＳＳＫペプチドを有し、ポリペプチドは、結合タグであるＮ末端ＬＰＥＴＧ配列を有するＤＮＡに遺伝的にコードされる。ビーズを第２のマイクロエマルジョン区画に分けるのと同様に、ビーズは、３つの別々のチューブに区画化され、それぞれ３つの異なるＤＮＡ構築物を含有する。３つのチューブでは、ビーズ結合ＤＮＡのＩＶＴＴ発現は、ソルターゼＡによって核酸に結合されるポリペプチドを産生し、両ＤＮＡに結合したビーズをもたらす。ソルターゼＡは、ＩＶＴＴ反応に添加された外因性ＤＮＡによってコードされ、ポリペプチドと同時に酵素を産生した。
[0141]ポリペプチドを産生するビーズコンジュゲートしたＤＮＡ分子の発現は、ＩＶＴＴの後、ソルターゼＡによる、ビーズコンジュゲートしたＤＮＡ分子への産生したポリペプチドの共有結合的コンジュゲーションを使用して達成された。この結合を確立するため、ビーズ上の核酸分子は、捕捉部分（遊離のＮ末端グリシンを有する）である５’－ＧＬＳＳＫペプチドを有し、ポリペプチドは、結合タグであるＮ末端ＬＰＥＴＧ配列を有するＤＮＡに遺伝的にコードされる。ビーズを第２のマイクロエマルジョン区画に分けるのと同様に、ビーズは、３つの別々のチューブに区画化され、それぞれ３つの異なるＤＮＡ構築物を含有する。３つのチューブでは、ビーズ結合ＤＮＡのＩＶＴＴ発現は、ソルターゼＡによって核酸に結合されるポリペプチドを産生し、両ＤＮＡに結合したビーズをもたらす。ソルターゼＡは、ＩＶＴＴ反応に添加された外因性ＤＮＡによってコードされ、ポリペプチドと同時に酵素を産生した。
【0136】
[0142]ＩＶＴＴの間、生物機器との適合性のため、それぞれのポリペプチドエピトープをコードする部分的に二本鎖のＤＮＡを含有するビーズ集団のＤＮＡは、上流のリバースプライマーをアニーリング及び伸長することにより完全な二本鎖を作成しなければならない。ビーズは、１Ｘ Ｂｓｍ緩衝液、２５０μＭ／ｅａ ｄＮＴＰｓ、５００ｎＭ Ｂｅａｄ＿ｕｐｓｔｒｅａｍ－ＲＰ、及び０．０６ Ｕ／μＬ Ｂｓｍ酵素を含有する緩衝液中、６０℃で２０分間伸長した。次いで、ビーズは、ＴＮａＴＥによって２回洗浄し、水によって１回洗浄した。次いで、ビーズは、製造業者のプロトコールに従って１０μＬのＮＥＢ ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｉｘ（ＩＶＴＴ ｍｉｘ）中に再懸濁し、２時間３７℃でインキュベートした。ソルターゼＡをコードするｄｓＤＮＡ（２００ｎｇ）を２０μＬのＮＥＢ ＩＶＴＴ ｍｉｘに添加し、２時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、４μＬのソルターゼＩＶＴＴ ｍｉｘを１０μＬの各ビーズのＩＶＴＴ ｍｉｘに添加した。１０×ソルターゼ緩衝液（１．５５μＬ）を各チューブ（全部で３つのチューブ）に添加し、４℃で終夜インキュベートした。次いで、ビーズを異なるチューブで空間的に分けた。
【0137】
ステップｄ．ＤＮＡコートしたビーズ上に提示される別々のペプチドエプトープの配列及び結合活性の並行決定
[0143]結合アッセイは、ポリペプチド及び核酸を提示するビーズの集団上で実施された。先に区画化された（同定するＤＮＡ上のポリペプチドの忠実な提示を促進する）ビーズを混合し、一連の濃度のペプチド結合抗体との結合インキュベーションに供した。抗体は、ビーズが提示したポリペプチドに様々な親和性を有した。同じ装置上で各ビーズの配列及び結合を読み取るため、蛍光が組み込まれた塩基（合成によるシークエンシング）を有するＤＮＡを提示するビーズ、及び蛍光標識された抗体に結合したポリペプチド（ポリペプチド結合機能のアッセイ）は、次いでシークエンシング装置、ここではフローサイトメーターに置かれる。
[0143]結合アッセイは、ポリペプチド及び核酸を提示するビーズの集団上で実施された。先に区画化された（同定するＤＮＡ上のポリペプチドの忠実な提示を促進する）ビーズを混合し、一連の濃度のペプチド結合抗体との結合インキュベーションに供した。抗体は、ビーズが提示したポリペプチドに様々な親和性を有した。同じ装置上で各ビーズの配列及び結合を読み取るため、蛍光が組み込まれた塩基（合成によるシークエンシング）を有するＤＮＡを提示するビーズ、及び蛍光標識された抗体に結合したポリペプチド（ポリペプチド結合機能のアッセイ）は、次いでシークエンシング装置、ここではフローサイトメーターに置かれる。
【0138】
[0144]ＤＮＡコートしたビーズ上の別々のペプチドエピトープの配列及び結合活性を決定するため、Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒによる洗浄ステップ（２×繰り返した）及びＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中への再懸濁を実施し、消費したＩＶＴＴｍｉｘ及び任意の非共有結合したポリペプチドを除去する。次いで、３つのビーズ集団を新しいチューブ中に等しい比で混合した。ＦＩＴＣ標識したＭ２抗ＦＬＡＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）をインキュベーション緩衝液中で希釈し、以下の濃度：２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ及び０ｎＭ（標的対照無し）のＭ２抗ＦＬＡＧ抗体を含有する、１：２希釈シリーズを調製した。次いで、ビーズ混合物を８個のチューブに分け、上澄み液を除去し、所与の濃度の１００μＬのＭ２抗ＦＬＡＧ抗体希釈シリーズを各チューブに添加した。次いで、ビーズは、室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズは、１００μＬのＰＢＳを使用して２回１５分間の洗浄を受け、２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメーターを使用してアッセイした（図５Ａ～５Ｃ）。この時点で、フローサイトメーターを使用してアッセイした各ビーズは、１５の可能な励起／発光チャネルのそれぞれで、それに関連する蛍光値を有した。これらのチャネルに渡る全てのビーズからの値の分布は、どのＦＬＡＧエピトープを各ビーズが提示するか、高い確実性で確かめることを可能にする。次いで、本発明者らは、これらのビーズをゲートし、ＦＩＴＣ標識したＭ２抗ＦＬＡＧ抗体の様々な濃度に渡り、これらの別々の集団の傾向をプロットして、これらのエピトープの結合特徴を確かめた。可能な場合、複数のチャネルに渡る各ビーズの蛍光を使用して、組み込まれたｄｄＮＴＰのアイデンティティ、したがって、各ビーズ上に提示されるオリゴヌクレオチド及びペプチドのアイデンティティを決定した。同一の抗体濃度で同一のオリゴヌクレオチドを含有するビーズは凝集され、それらの平均蛍光シグナルを以下の等式に当てはめた：
Ｆｐｅｐ ｍｅａｎ（[Ｔ]）＝Ｆｂｇ＋Ｆｐｅｐ ｍａｘ＊（[Ｔ]／（[Ｔ]＋Ｋｄ ｐｅｐ））
式中、Ｆｐｅｐ ｍｅａｎ（[Ｔ]）は、所与の標的濃度でのペプチドの平均蛍光シグナルであり、Ｆｂｇは、[Ｔ]＝０の場合のバックグラウンド蛍光シグナルであり、Ｆｐｅｐ ｍａｘは、完全結合飽和でのペプチドで観察された最大蛍光シグナルであり、及びＫｄ ｐｅｐは、ペプチドの平衡解離定数である。３つの可能なペプチドエピトープのうちの１つを提示するビーズの単一混合物を分け、蛍光抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体の異なる濃度でインキュベ－トし、フローサイトメトリーを使用して解析した。各濃度で、各ビーズから得られた蛍光シグナルは、ビーズ上に提示したオリゴヌクレオチドのアイデンティティを決定するのに十分であり、正確な平衡結合測定（解離定数）がビーズ上に提示されたペプチドについて得られた。生物物理的なアッセイの正確性は、これらの３つのペプチドについて先に測定した親和性とのその相関によって証明される。
Ｆｐｅｐ ｍｅａｎ（[Ｔ]）＝Ｆｂｇ＋Ｆｐｅｐ ｍａｘ＊（[Ｔ]／（[Ｔ]＋Ｋｄ ｐｅｐ））
式中、Ｆｐｅｐ ｍｅａｎ（[Ｔ]）は、所与の標的濃度でのペプチドの平均蛍光シグナルであり、Ｆｂｇは、[Ｔ]＝０の場合のバックグラウンド蛍光シグナルであり、Ｆｐｅｐ ｍａｘは、完全結合飽和でのペプチドで観察された最大蛍光シグナルであり、及びＫｄ ｐｅｐは、ペプチドの平衡解離定数である。３つの可能なペプチドエピトープのうちの１つを提示するビーズの単一混合物を分け、蛍光抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体の異なる濃度でインキュベ－トし、フローサイトメトリーを使用して解析した。各濃度で、各ビーズから得られた蛍光シグナルは、ビーズ上に提示したオリゴヌクレオチドのアイデンティティを決定するのに十分であり、正確な平衡結合測定（解離定数）がビーズ上に提示されたペプチドについて得られた。生物物理的なアッセイの正確性は、これらの３つのペプチドについて先に測定した親和性とのその相関によって証明される。
【0139】
[0145]２つの区画化されたステップ：ＰＣＲ増幅及びポリペプチド発現及びコンジュゲーションのプロセスによる、それらのコードするＤＮＡの同種集団と共に、ポリペプチドの同種集団を共有結合により提示するビーズを生成するための方法が示された。さらに、単一装置上での各ビーズのＤＮＡをシークエンシング及びポリペプチド結合のアッセイすることにより、各ポリペプチドの結合特性は、ポリペプチドをコードする核酸分子の配列にリンクされ、それにより、ビーズ当たりの個々のポリペプチドのアイデンティティ及び結合機能の両方を決定することが実証される。
【0140】
その他の実施形態
[0146]本明細書中に述べた全ての論文、特許、及び特許出願は、それぞれ独立の論文又は特許出願が、特に及び個々に参照により組み込まれると示される限り、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
[0146]本明細書中に述べた全ての論文、特許、及び特許出願は、それぞれ独立の論文又は特許出願が、特に及び個々に参照により組み込まれると示される限り、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【0141】
[0147]本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されるが、それはさらなる改変が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、及び本発明が属する当技術分野内で公知又は慣習であり、前述の基本的な特徴に適用することができ、請求項の範囲に従う、本発明からのそのような逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、又は適応をカバーすることが意図されることが理解されるであろう。他の実施形態は、請求項の内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【配列表】
【国際調査報告】