特表 2023-537386 抗体ライブラリーを作製するための方法および組成物ならびにそれから単離された抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-31

(54)【発明の名称】抗体ライブラリーを作製するための方法および組成物ならびにそれから単離された抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230824BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20230824BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230824BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C40B40/06 ZNA

C07K16/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023509479

(86)(22)【出願日】2021-08-10

(85)【翻訳文提出日】2023-03-23

(86)【国際出願番号】 US2021045360

(87)【国際公開番号】W WO2022035834

(87)【国際公開日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】63/063,647

(32)【優先日】2020-08-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521358671

【氏名又は名称】インテグラル・モレキュラー・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】トレヴァー・エー・バーンズ

(72)【発明者】

【氏名】ジョセフ・ビー・ラッカー

(72)【発明者】

【氏名】ロス・エス・チャンバーズ

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045AA20

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書で提供される実施形態は、抗体、抗体のライブラリーおよびニワトリ中で生産された抗体のライブラリーの生産および同定ならびにそれを使用する方法を対象とする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）によって挟まれたニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の集団を生産する方法であって、
ａ）ニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で、第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、ニワトリ抗体をコードする核酸分子の第１の集団を増幅することを含み、
第１のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流または下流の領域にアニーリングし、第１のプライマーが、ＣＤＲのすぐ上流または下流にある位置で、認識部位から離れた距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；
第１のプライマーがＣＤＲの上流でアニーリングする場合、第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の距離にある領域にアニーリングする；または
第１のプライマーがＣＤＲの下流でアニーリングする場合、第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流の距離にある領域にアニーリングする、方法。

【請求項2】

核酸分子の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ上流に５’突出部を生産して、消化産物を生産することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記消化産物を、ヒト抗体の第１のＦＲをコードする核酸配列にライゲートすることによって第１のライゲーション産物を製造することをさらに含み、
ヒト抗体の前記第１のＦＲが、第１のＦＲが第１の消化産物の上流にライゲートされるように前記消化産物の突出領域と適合する突出領域をその３’末端に含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである位置で切断し、境界が、ＣＤＲをコードする配列の内部または外部のいずれかにある、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである位置で切断する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

制限酵素が、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流または上流の、ｍＲＮＡ転写物の長さよりも大きくない距離にある領域にアニーリングする、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ニワトリＣＤＲをコードする核酸分子の第２の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で、第３のプライマーおよび第４のプライマーを用いて、増幅された核酸分子の第２の集団を製造することをさらに含み、
第３のプライマーが、第１のライゲーション産物中に存在するＣＤＲをコードする核酸配列のすぐ下流の領域にアニーリングし、第３のプライマーが、ＣＤＲのすぐ下流にあり、認識部位から離れた距離にある位置で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；
第４のプライマーが、ライゲーション産物中のＣＤＲの上流にある距離にある、第１のライゲーション産物中に存在する第１のＦＲをコードする核酸分子の一部にアニーリングする、請求項３に記載の方法。

【請求項13】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである位置で切断する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである位置で切断する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

制限酵素が、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の、ｍＲＮＡ転写物の長さよりも大きくない距離にある領域にアニーリングする、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

核酸分子の第２の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流に５’突出部を生産して、第２の消化産物を生産することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

第２の消化産物を、ヒト抗体の第２のＦＲをコードする核酸配列にライゲートして、第２のライゲーション産物を生産することを含み、前記第２のＦＲは、第２のＦＲが、第２の消化産物の下流にライゲートされるように、前記第２の消化産物の突出領域と適合する突出領域をその５’末端に含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

ヒト抗体の２つのＦＲによって挟まれたＣＤＲをコードする核酸分子の集団を生産するのに十分な条件下で、ヒト抗体の第１のＦＲにアニーリングする第１のＦＷプライマーおよびヒト抗体の第２のＦＲにアニーリングする第２のプライマーを用いて、第２のライゲーション産物を増幅することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＣＤＲが、ニワトリＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

ＦＲが、ヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

第１のＦＲがヒトＦＲ１であり、第２のＦＲがヒトＦＲ２である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

第１のＦＲがヒトＦＲ２であり、第２のＦＲがヒトＦＲ３である、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

第１のＦＲがヒトＦＲ３であり、第２のＦＲがヒトＦＲ４である、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

制限酵素がＩＩＳ型酵素である、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

ＩＩＳ型酵素が、認識配列から少なくとも１０塩基を超えて離れた距離で切断する任意のＩＩＳ型酵素である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ＩＩＳ型酵素が、認識配列から１４～２１塩基離れた距離で切断する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ＩＩＳ型酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、またはＮｍｅＡｌｌＩである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項34】

それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することが、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って生産された第１、第２、および第３のライゲーション産物の重複ＰＣＲを実行することを含み、
第１のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；
第２のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；
第３のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することが、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って生産された第１、第２、および第３のライゲーション産物をライゲートすることを含み、
第１のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；
第２のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；
第３のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子が、抗体可変領域をコードする、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

Ｒが、ＣＴＧＡＡＧ、ＣＧＡＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ、ＧＡＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＣ、ＣＣＡＴＣ、ＡＣＧＧＣ、ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ、ＧＴＡＴＣＣ、ＧＴＣＴＣ、ＡＣＣＴＧＣ、ＡＣＴＧＧＧ、ＣＴＧＧＡＧ、ＣＴＴＧＡＧ、ＧＧＴＣＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧ、ＧＴＣＴＣ、ＣＧＴＣＴＣ、ＧＧＧＡＣ、ＧＡＡＴＧＣ、ＣＴＣＡＧ、ＡＣＣＴＧＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、ＧＣＡＡＴＧ、ＡＣＴＧＧ、ＧＣＧＡＴＧ、ＧＧＡＴＧ、ＧＣＡＧＴＧ、ＣＡＧＴＧ、ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ、ＣＴＣＴＴＣ、ＧＧＣＧＧＡ、ＣＧＴＣＴＣ、ＣＣＣＧＣ、ＧＧＡＴＧ、ＧＡＣＧＣ、ＧＧＴＧＡ、ＣＣＴＴＣ、ＧＡＡＧＡ、ＧＡＧＴＣ、ＴＣＣＲＡＣ、ＣＣＴＣ、ＧＣＣＧＡＧ、ＧＡＧＴＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、またはＧＣＡＴＣである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨ（式中、ＫはＧまたはＴ／Ｕであり；ＭはＡまたはＣであり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴ／Ｕであり；ＳはＣまたはＧであり；ＷはＡまたはＴ／Ｕであり；ＢはＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＤはＡまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＡまたはＣまたはＴ／Ｕである）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項44】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４５）の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＴＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＧＴＧＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６２）の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＧＣＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む核酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子のライブラリーを生産する方法であって、
ｉ）ヒトフレームワーク領域１（ＦＲ１）およびヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）ドメインをコードする核酸分子の第１のライブラリー；
ｉｉ）ヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）およびヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）ドメインをコードする核酸分子の第２のライブラリー；
ｉｉｉ）ヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）およびヒトフレームワーク領域４（ＦＲ４）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ドメインをコードする核酸分子の第３のライブラリー
を組み合わせることを含み、
抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する、方法。

【請求項51】

組み合わせることが、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーをライゲートして、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

組み合わせることが、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーを用いた重複ＰＣＲを実行して、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

請求項１～５２のいずれか１項に従って製造された核酸分子のライブラリー。

【請求項54】

ライブラリーが核酸分子の集団を含み、集団の複数の核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有するポリペプチドをコードする、請求項５３に記載の核酸分子のライブラリー。

【請求項55】

ニワトリ抗体のＣＤＲのすぐ上流または下流の領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドであって、認識部位の下流の距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含み、式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列の配列を含む、オリゴヌクレオチド。

【請求項56】

配列番号１～８５のいずれか１つ、すなわちそこに記載の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーセット。

【請求項57】

ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、核酸分子が請求項１～５２のいずれか１項に従って製造された、ポリペプチド。

【請求項58】

標的に対する結合パートナーを同定する方法であって、標的と、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法に従って製造されたライブラリーによってコードされるタンパク質のライブラリーとを接触させることを含む、方法。

【請求項59】

結合パートナーが、ｓｃＦｖのような抗体である、請求項２４５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、抗体ライブラリーを作製するための方法および組成物ならびにそれから単離された抗体に関する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0002】

一部の実施形態では、２つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）によって挟まれたニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の集団を生産する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ａ）ニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、ニワトリ抗体をコードする核酸分子の第１の集団を増幅することを含み、第１のプライマーは、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流の領域にアニーリングし、第１のプライマーは、ＣＤＲのすぐ上流にあり、認識部位から離れた距離にある位置で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；第２のプライマーは、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の距離にある領域にアニーリングする。一部の実施形態では、制限部位は、核酸の第１の集団を生産するためにＣＤＲの上流にあってもよい。一部の実施形態では、制限部位は、核酸の第１の集団を生産するためにＣＤＲの下流にあってもよい。

【0003】

一部の実施形態では、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子のライブラリーを生産する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ｉ）ヒトフレームワーク領域１（ＦＲ１）およびヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）ドメインをコードする核酸分子の第１のライブラリー；ｉｉ）ヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）およびヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）ドメインをコードする核酸分子の第２のライブラリー；ｉｉｉ）ヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）およびヒトフレームワーク領域４（ＦＲ４）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ドメインをコードする核酸分子の第３のライブラリーを組み合わせることを含み、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子は、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する。

【0004】

一部の実施形態では、ライブラリーが本明細書で提供される方法に従って製造される、核酸分子のライブラリーが提供される。

【0005】

一部の実施形態では、ニワトリのＣＤＲのすぐ上流の領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ニワトリ抗体のＣＤＲのすぐ上流の領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドであって、認識部位の下流の距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含む、前記オリゴヌクレオチドが提供される。

【0006】

一部の実施形態では、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する核酸分子であって、
本明細書で提供される方法に従って製造される前記核酸分子によってコードされるポリペプチドが提供される。

【0007】

一部の実施形態では、標的に対する結合パートナーを同定する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、標的と、本明細書で提供される方法に従って製造されたライブラリーによってコードされるタンパク質のライブラリーとを接触させることを含む。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】プライマー設計の非限定例を例示する図である。下線付きの配列は、ＩＩＳ型制限酵素ＡｃｕＩのための認識部位を表す。

【図2】ニワトリ抗体からＣＤＲを抽出し、隣接するヒトフレームワーク領域中にＣＤＲを埋め込むための非限定的プロセスを例示する図である。

【図3】本明細書で提供される実施形態に従って生産される抗体に由来するモノクローナルｓｃＦｖ結合を例示する図である。９１の親和性成熟したｓｃＦｖクローンの標的結合が例示される。これらのｓｃＦｖ抽出物を、その標的抗原および対照としての第２の非関連膜タンパク質に対して試験した。棒グラフは、ｓｃＦｖ抽出物の標的抗原への結合を描写する。点線は、２０倍のシグナル：バックグラウンド比（標的結合）を表す。５０％を超えるクローンが、非関連タンパク質への結合よりも２０倍高い標的結合を示した。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。

【0010】

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびにそれらの同根語は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。種々の組成物、および方法が、種々の成分または工程を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ことに関して記載されるが（「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味すると解釈される）、組成物、方法、およびデバイスはまた、種々の成分および工程「から本質的になっても（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなっても（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」よく、そのような用語は、本質的に閉じたメンバー群を規定すると解釈されるべきである。

【0011】

本明細書で提供される実施形態は、部分的には、ＣＤＲをコードする核酸分子のライブラリーを生産する方法を対象とする。これらのＣＤＲは、例えば、ニワトリ中で産生される抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、それぞれのＣＤＲがニワトリ抗体に由来する、３つのＣＤＲを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0012】

例えば、一部の実施形態では、２つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）によって挟まれたニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の集団を生産する方法が提供される。

【0013】

一部の実施形態では、方法は、ａ）ニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、ニワトリ抗体をコードする核酸分子の第１の集団を増幅することを含み、第１のプライマーは、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流の領域にアニーリングし、第１のプライマーは、ＣＤＲのすぐ上流にある位置で、認識部位から離れた距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；第２のプライマーは、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の距離にある領域にアニーリングする。一部の実施形態では、すぐ上流での切断は、ＣＤＲ境界から約１、２、３、４、または５ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、すぐ上流での切断は、ＣＤＲ境界から約１、２、または３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第２のプライマーは、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流のｍＲＮＡ転写物の長さよりも大きくない距離にある領域にアニーリングする。

【0014】

一部の実施形態では、方法は、核酸分子の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ上流（例えば、１、２、３、または４ヌクレオチド塩基）に５’突出部を生産して、消化産物を生産することをさらに含む。好ましい実施形態では、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流にある５’突出部は、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、結合部位／突出部はまた、ＣＤＲ中の残基であってもよい。例えば、ＣＤＲ－Ｌ３およびＣＤＲ－Ｈ３のための５’結合部位は、ＣＤＲの上流のシステインである。一部の実施形態では、これは、ＣＤＲの命名規則に応じてＣＤＲの一部と考えられる。したがって、一部の実施形態では、突出部は、ＣＤＲ境界から１（－１）または２（－２）ヌクレオチド外側である。

【0015】

一部の実施形態では、方法は、前記消化産物を、ヒト抗体の第１のＦＲをコードする核酸配列にライゲートすることによって第１のライゲーション産物を製造することを含み、ヒト抗体の前記第１のＦＲは、第１のＦＲが第１の消化産物の上流にライゲートされるような、前記消化産物の突出領域と適合するその３’末端に突出領域を含む。

【0016】

一部の実施形態では、方法は、ニワトリＣＤＲをコードする核酸分子の第２の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で、第３のプライマーおよび第４のプライマーを用いて増幅された核酸分子の第２の集団を製造することをさらに含み、第３のプライマーは、第１のライゲーション産物中に存在するＣＤＲをコードする核酸配列のすぐ下流の領域にアニーリングし、第３のプライマーは、ＣＤＲのすぐ下流にあり、認識部位から離れた距離にある位置で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；第４のプライマーは、ライゲーション産物中のＣＤＲの上流の距離にある第１のライゲーション産物中に存在する第１のＦＲをコードする核酸分子の一部にアニーリングする。一部の実施形態では、すぐ下流にある制限酵素切断部位は、ＣＤＲ境界から約１、２、３、４、または５ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、すぐ下流にある制限酵素切断部位は、ＣＤＲ境界から約１、２、または３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第４のプライマーは、ライゲーション産物中のＣＤＲの上流の距離にある第１のライゲーション産物中に存在する第１のＦＲをコードする核酸分子の一部にアニーリングし、その距離は、第１のＦＲの長さによって決定される。一部の実施形態では、第１のＦＲは、ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３である。

【0017】

一部の実施形態では、方法は、核酸分子の第２の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流に５’突出部を生産し、第２の消化産物を生産することを含む。一部の実施形態では、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流にある５’突出部は、ＣＤＲ境界から約１、２、３、４、または５ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流にある５’突出部は、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである。

【0018】

一部の実施形態では、方法は、第２の消化産物を、ヒト抗体の第２のＦＲをコードする核酸配列にライゲートして、第２のライゲーション産物を生産することを含み、前記第２のＦＲは、第２のＦＲが、第２の消化産物の下流にライゲートされるように、前記第２の消化産物の突出領域と適合する突出領域をその５’末端に含む。

【0019】

一部の実施形態では、方法は、ヒト抗体の２つのＦＲによって挟まれたＣＤＲをコードする核酸分子の集団を生産するのに十分な条件下で、ヒト抗体の第１のＦＲにアニーリングする第１のＦＷプライマーおよびヒト抗体の第２のＦＲにアニーリングする第２のプライマーを用いて、第２のライゲーション産物を増幅することを含む。

【0020】

一部の実施形態では、ＣＤＲは、ニワトリＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である。一部の実施形態では、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４である。一部の実施形態では、第１のＦＲはヒトＦＲ１であり、第２のＦＲはヒトＦＲ２である。一部の実施形態では、第１のＦＲはヒトＦＲ２であり、第２のＦＲはヒトＦＲ３である。一部の実施形態では、第１のＦＲはヒトＦＲ３であり、第２のＦＲはヒトＦＲ４である。

【0021】

制限酵素は、任意の好適な制限酵素であってよい。一部の実施形態では、制限酵素は、ＩＩＳ型酵素である。一部の実施形態では、ＩＩＳ型酵素は、ＡｃｕＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、またはＮｍｅＡｌｌＩである。一部の実施形態では、ＩＩＳ型酵素は、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｓＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＩ－ＨＦ（登録商標）ｖ２（ＢｓａＩ部位で切断するＩＩＳ型制限酵素）、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍ_ＶＡ１２６９Ｉ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、またはＳｆａＮＩである。

【0022】

一部の実施形態では、方法は、それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することをさらに含む。一部の実施形態では、それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産する工程は、本明細書で提供される方法に従って生産される第１、第２、および第３のライゲーション産物の重複ＰＣＲを実行することを含み、第１のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；第２のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；第３のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む。

【0023】

一部の実施形態では、それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産する工程は、本明細書で提供される方法に従って生産される第１、第２、および第３のライゲーション産物をライゲートすることを含み、第１のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；第２のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；第３のライゲーション産物は、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む。

【0024】

一部の実施形態では、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子は、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する。

【0025】

一部の実施形態では、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子は、抗体可変領域をコードする。

【0026】

一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列を含む。

【0027】

一部の実施形態では、Ｒは、ＣＴＧＡＡＧ、ＣＧＡＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ、ＧＡＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＣ、ＣＣＡＴＣ、ＡＣＧＧＣ、ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ、ＧＴＡＴＣＣ、ＧＴＣＴＣ、ＡＣＣＴＧＣ、ＡＣＴＧＧＧ、ＣＴＧＧＡＧ、ＣＴＴＧＡＧ、ＧＧＴＣＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧ、ＧＴＣＴＣ、ＣＧＴＣＴＣ、ＧＧＧＡＣ、ＧＡＡＴＧＣ、ＣＴＣＡＧ、ＡＣＣＴＧＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、ＧＣＡＡＴＧ、ＡＣＴＧＧ、ＧＣＧＡＴＧ、ＧＧＡＴＧ、ＧＣＡＧＴＧ、ＣＡＧＴＧ、ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ、ＣＴＣＴＴＣ、ＧＧＣＧＧＡ、ＣＧＴＣＴＣ、ＣＣＣＧＣ、ＧＧＡＴＧ、ＧＡＣＧＣ、ＧＧＴＧＡ、ＣＣＴＴＣ、ＧＡＡＧＡ、ＧＡＧＴＣ、ＴＣＣＲＡＣ、ＣＣＴＣ、ＧＣＣＧＡＧ、ＧＡＧＴＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、またはＧＣＡＴＣである。式５’－Ｒ（Ｎ）ｎ－３’（式中、Ｒは、認識配列であり、Ｎは、任意の核酸塩基であり、ｎ＝１～２１である）。一部の実施形態では、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＵのような、天然に存在する核酸塩基である。一部の実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、ＤＮＡ二重鎖を安定化する。一部の実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである。一部の実施形態では、縮重核酸塩基は、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである。一部の実施形態では、Ｋは、ＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｍは、ＡまたはＣである。一部の実施形態では、Ｒは、ＡまたはＧである。一部の実施形態では、Ｙは、ＣまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｓは、ＣまたはＧである。一部の実施形態では、Ｗは、ＡまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｂは、ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｈは、ＡまたはＣまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＴＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＧＡＴＣＮＮＮＮ－３’（配列番号４６）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４７）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＡＧＡＣＮＮ－３’（配列番号４８）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＡＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＣＡＴＣＮＮＮＮ－３’（配列番号５０）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＡＣＧＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５１）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＴＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５３）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ－３’（配列番号５５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＡＣＴＧＧＧＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５６）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５７）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＴＴＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５８）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号５９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６０）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６１）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＴＧＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号６３）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＧＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６４）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＡＴＧＣＮ－３’（配列番号６５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６６）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＴＣＴＴＣＮ－３’（配列番号６７）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＡＡＴＧＮＮ－３’（配列番号６８）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＡＣＴＧＧＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＧＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＡＴＧＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＡＧＴＧＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＡＧＴＧＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＴＣＴＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＧＴＣＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＣＣＧＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＧＴＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＣＴＴＣＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＡＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＴＣＴＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは、５’－ＧＣＡＴＣＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。

【0028】

また、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子のライブラリーを生産する方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、ｉ）ヒトフレームワーク領域１（ＦＲ１）およびヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）ドメインをコードする核酸分子の第１のライブラリー；ｉｉ）ヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）およびヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）ドメインをコードする核酸配列の第２のライブラリー；ｉｉｉ）ヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）およびヒトフレームワーク領域４（ＦＲ４）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ドメインをコードする核酸配列の第３のライブラリーを組み合わせることを含み、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子は、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する。

【0029】

一部の実施形態では、組み合わせることは、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーをライゲートして、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む。一部の実施形態では、組み合わせることは、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーを用いた重複ＰＣＲを実行して、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む。一部の実施形態では、これは、連続して行われる。

【0030】

また、本明細書で提供される方法のいずれか１つに従って製造される核酸分子のライブラリーも、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ライブラリーは、核酸分子の集団を含み、集団の複数の核酸分子は、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有するポリペプチドをコードする。

【0031】

一部の実施形態では、ライブラリーは、異なるポリペプチドをコードするライブラリー中に存在する少なくとも２つの核酸分子を含む。

【0032】

一部の実施形態では、ニワトリ抗体のＣＤＲのすぐ上流の領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドであって、認識部位の下流の距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含む、前記オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列の配列を含む。
一部の実施形態では、Ｒは、ＣＴＧＡＡＧ、ＣＧＡＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ、ＧＡＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＣ、ＣＣＡＴＣ、ＡＣＧＧＣ、ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ、ＧＴＡＴＣＣ、ＧＴＣＴＣ、ＡＣＣＴＧＣ、ＡＣＴＧＧＧ、ＣＴＧＧＡＧ、ＣＴＴＧＡＧ、ＧＧＴＣＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧ、ＧＴＣＴＣ、ＣＧＴＣＴＣ、ＧＧＧＡＣ、ＧＡＡＴＧＣ、ＣＴＣＡＧ、ＡＣＣＴＧＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、ＧＣＡＡＴＧ、ＡＣＴＧＧ、ＧＣＧＡＴＧ、ＧＧＡＴＧ、ＧＣＡＧＴＧ、ＣＡＧＴＧ、ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ、ＣＴＣＴＴＣ、ＧＧＣＧＧＡ、ＣＧＴＣＴＣ、ＣＣＣＧＣ、ＧＧＡＴＧ、ＧＡＣＧＣ、ＧＧＴＧＡ、ＣＣＴＴＣ、ＧＡＡＧＡ、ＧＡＧＴＣ、ＴＣＣＲＡＣ、ＣＣＴＣ、ＧＣＣＧＡＧ、ＧＡＧＴＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、またはＧＣＡＴＣである。一部の実施形態では、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である。一部の実施形態では、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＵのような、天然に存在する核酸塩基である。一部の実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、ＤＮＡ二重鎖を安定化する。一部の実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである。一部の実施形態では、縮重核酸塩基は、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである。一部の実施形態では、Ｋは、ＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｍは、ＡまたはＣである。一部の実施形態では、Ｒは、ＡまたはＧである。一部の実施形態では、Ｙは、ＣまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｓは、ＣまたはＧである。一部の実施形態では、Ｗは、ＡまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｂは、ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、Ｈは、ＡまたはＣまたはＴ／Ｕである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＧＡＴＣＮＮＮＮ－３’（配列番号４６）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４７）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＡＧＡＣＮＮ－３’（配列番号４８）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＡＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＡＴＣＮＮＮＮ－３’（配列番号５０）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＧＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５１）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＴＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号５３）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＧＧＧＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＴＣＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＴＧＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＴＣＴＣＮ－３’（配列番号４９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＧＴＣＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＧＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＡＴＧＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＣＴＧＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＴＣＴＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＡＡＴＧＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＧＧＮ－３’（配列番号６９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＧＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７０）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＡＴＧＮＮ－３’（配列番号７１）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＡＧＴＧＮＮ－３’（配列番号７２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＡＧＴＧＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７３）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＣＴＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７４）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＧＴＣＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＣＧＣＮＮＮＮ－３’（配列番号７５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７６）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７７）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＧＴＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７８）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＴＴＣＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号７９）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＡＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８０）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８１）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８２）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８３）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８４）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＴＣＴＴＣＮ－３’の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＣＡＴＣＮＮＮＮＮ－３’（配列番号８５）の配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供または記載される通りである。

【0033】

一部の実施形態では、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書で提供されるいずれかの方法に従って製造される。

【0034】

一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号２の配列、または配列番号２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号３の配列、または配列番号３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号４の配列、または配列番号４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号５の配列、または配列番号５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号４３の配列、または配列番号４３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号６の配列、または配列番号６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、ヒトフレームワークアクセプター断片のような、ライブラリーを作出するために使用されるプライマーセットは、配列番号９の配列、または配列番号９と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。

【0035】

一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号２および配列番号３の配列または配列番号２および／もしくは配列番号３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号４および配列番号５の配列または配列番号４および／もしくは配列番号５と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号４および配列番号４３の配列または配列番号４および／もしくは配列番号４３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号６および配列番号７の配列または配列番号６および／もしくは配列番号７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号８および配列番号９の配列または配列番号８および／もしくは配列番号９と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。本明細書で提供される配列は５’ビオチン化と共に例示することができるが、ビオチンと類似する機能を実行する他のタグを使用することもできるか、または他の改変型のビオチンを使用することができる。

【0036】

一部の実施形態では、プライマーセットは、ＣＤＲセットを生成するために使用することができるフレームワークアクセプター断片を生産するために使用される。一部の実施形態では、４つの異なるヒトフレームワーク領域アクセプター断片が生産される。一部の実施形態では、アクセプター断片の配列は、実施例のセクション中の表３に提供されるように生産される。一部の実施形態では、ＦＲ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲ２断片に対応する一部の実施形態では、フレームワークアクセプター断片は、配列番号１０または配列番号１０と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含んでもよい。このフレームワークアクセプター断片は、例えば、隣接するフレームワークＦＲ１およびＦＲ２に加えて、ヒトＶＨ３－２３生殖系列ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＨ１）を含んでもよい。この断片を、例えば、配列番号２および／もしくは配列番号３を含むプライマーセットまたは配列番号２および／もしくは配列番号３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるプライマーセットを使用して生産することができる。

【0037】

一部の実施形態では、フレームワーク３領域（ＦＲ３）に対応してもよいフレームワークアクセプター断片は、配列番号１１もしくは配列番号４４の配列または配列番号１１もしくは配列番号４４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。例えば、この断片は、例えば、ＦＲ３領域がヒトＶＨ３－２３遺伝子のＣＤＲ２領域に接続することができる末端の突出部と共に、単一のフレームワーク領域を含有してもよい。一部の実施形態では、このアクセプター断片は、配列番号４および配列番号５を含むプライマーセットまたは配列番号４および配列番号４３を含むプライマーセットまたは配列番号４および／もしくは配列番号５または配列番号４および／もしくは配列番号４３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を使用して生成される。一部の実施形態では、ＦＲ３領域の一部を含むアクセプター断片であって、例えば、ＦＲ３領域がヒトＶＨ３－２３遺伝子のＣＤＲ３領域に接続する末端に突出部と共に単一のフレームワーク領域ＦＲ３を含有してもよい、アクセプター断片が提供される。この断片は、例えば、配列番号１２の配列または配列番号１２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含んでもよい。一部の実施形態では、この断片を、例えば、配列番号６および／もしくは配列番号７を含むプライマーセットまたは配列番号６および／もしくは配列番号７と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるプライマーセットを使用して生産することができる。

【0038】

一部の実施形態では、抗体のＦＲ４部分に対応する断片が提供される。一部の実施形態では、断片は、配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、この断片を、例えば、配列番号８および／もしくは配列番号９を含むプライマーセットまたは配列番号８および／もしくは配列番号９と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるプライマーセットを使用して生産することができる。

【0039】

抗体のＣＤＲ２領域は、一部の実施形態では、免疫化されたニワトリのＢ細胞から生産することができる。一部の実施形態では、ＣＤＲ２領域は、免疫化されたニワトリのＢ細胞から誘導された（から抽出された）ＲＮＡから製造されたｃＤＮＡから増幅される。ＣＤＲ２断片を、例えば、限定されるものではないが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３６の配列、または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３６と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含むプライマーを含む、表４に列挙されるもののような、プライマーを使用して増幅することができる。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号１４の配列、または配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３６の配列のうちの１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列、または配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３６のうちの１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列を含む。配列は、ある特定の位置として縮重性をもたらし、縮重核酸塩基は、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨ（式中、ＫはＧまたはＴ／Ｕであり；ＭはＡまたはＣであり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴ／Ｕであり；ＳはＣまたはＧであり；ＷはＡまたはＴ／Ｕであり；ＢはＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＤはＡまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＡまたはＣまたはＴ／Ｕである）である。

【0040】

いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、プライマーのこれらのプールは、できるだけ多くのニワトリ免疫レパートリーをサンプリングするための縮重塩基を含有する。これらのプライマーは、例えば、制限酵素の切断が、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片へのライゲーションのための所望の結合点に突出部を残すように配置されたＡｃｕＩ制限酵素認識部位（表４中のＣＴＧＡＡＧ）を含有してもよい。他の制限部位を使用して、同様の突出部を生成することができる。これらのプライマーはまた、例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズ上での捕捉およびＡｃｕＩを用いた消化による放出のために５’末端上でビオチン化することもできる。５’ビオチンはただの一例であり、ビオチンの代わりに他の結合部分を使用してもよく、公知の捕捉システムと共に使用してもよい。一部の実施形態では、ビオチン（捕捉結合部分）とＡｃｕＩ認識部位（または他の使用される制限部位）との間のランダムスペーサー配列が、消化効率を改善するために含有される。

【0041】

一部の実施形態では、断片を生産した後、それを、限定されるものではないが、ＡｃｕＩのような制限酵素で消化して、ＣＤＲ２がＦＲ３領域に接続する末端に突出部を有するＣＤＲ２を生産する。次いで、ＣＤＲ３断片を、例えば、限定されるものではないが、配列番号１１もしくは配列番号４４、または配列番号１１もしくは配列番号４４と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列のような、ＦＲ３アクセプター断片にライゲートすることができる。次いで、このライゲーション産物を増幅することができる。生産される増幅産物は、例えば、ＣＤＲ２がＦＲ２に接続する末端に突出部を有するＣＤＲ２－ＦＲ３であってもよい。

【0042】

一部の実施形態では、ＣＤＲ２－ＦＲ３断片は、配列番号１０の配列または配列番号１０と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である配列（配列番号１０）のような、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２ヒトフレームワーク領域アクセプター断片にライゲートされる。ライゲーション後、ライゲートされた産物、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３断片を、ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用して、ヒトＶＨ３－２３ ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２およびＦＲ３によって挟まれたＶＨ ＣＤＲ２を生成することができる。次いで、これを、本明細書で提供されるように生産されたＣＤＲ３領域と組み合わせることができる。

【0043】

一部の実施形態では、ＣＤＲ３領域を、免疫化されたニワトリのＢ細胞から抽出されたＲＮＡから製造されたｃＤＮＡから増幅することができる。一部の実施形態では、ＣＤ３は、ＰＣＲおよび消化反応によって抽出される。次いで、ＣＤＲ３断片を、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片上にライゲートし、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３を含有する断片を生成することができる。この非限定例は、図２に例示される。一部の実施形態では、使用することができるプライマーとしては、限定されるものではないが、配列番号２３～３０または３７～４２を含む配列が挙げられる。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号２８または配列番号４２のうちの１つおよび配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のうちの１つを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、配列番号２８または配列番号４２のうちの１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列および配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のうちの１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列を含む。配列は、ある特定の位置として縮重性をもたらし、縮重核酸塩基は、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨ（式中、ＫはＧまたはＴ／Ｕであり；ＭはＡまたはＣであり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴ／Ｕであり；ＳはＣまたはＧであり；ＷはＡまたはＴ／Ｕであり；ＢはＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＤはＡまたはＧまたはＴ／Ｕであり；ＡまたはＣまたはＴ／Ｕである）である。本明細書で提供されるように、プライマーは、制限酵素の切断がヒトフレームワーク領域アクセプター断片へのライゲーションのための所望の結合点に突出部を残すように配置された、限定されるものではないが、ＡｃｕＩ制限酵素認識部位のような、制限酵素認識部位を含有してもよい。これらのプライマーは、ストレプトアビジン磁気ビーズ上での捕捉およびＡｃｕＩを用いた消化による放出のために５’末端上でビオチン化することができる。他のタグまたは捕捉試薬を使用して、同様の機能を実行させることができる。一部の実施形態では、ビオチンとＡｃｕＩ認識部位との間にランダムスペーサー配列を使用して、例えば、消化効率を改善することができる。

【0044】

一部の実施形態では、標的に対する結合パートナーを同定する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、標的と、本明細書で提供される方法に従って製造されたライブラリーによってコードされるタンパク質のライブラリーとを接触させること、および標的に対する結合パートナーを検出することを含む。標的は、任意の標的であってもよい。一部の実施形態では、標的は、複数の膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、リポ粒子のような、ウイルス様粒子の表面上に存在する。複数の膜貫通タンパク質を含むリポ粒子を、任意の方法に従って生成することができる。例えば、米国特許第９，９０２，７６５号、第９，２１３，０２７号、第８，５７４，５９０号、および第８，３７７，６９１号があり、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、結合パートナーは、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ形式または本明細書で提供される他の形式である。

【0045】

本明細書に記載されるように、本明細書で提供されるライブラリーを使用して、抗体を生産および／または同定することができる。抗体を、治療剤、診断試薬、検出試薬などのような様々な目的のために使用することができる。

【0046】

本明細書で使用される用語「抗体」は、広い意味で、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体およびＳｃＦｖまたはヘキサボディのような抗体断片を含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を含むことを意味する（全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００２３４４ Ｊａｎｕａｒｙ ６，２０１６）。

【0047】

「コードすること」は、ヌクレオチドの規定の配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の規定の配列およびそれから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。かくして、ある遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生体系においてタンパク質をもたらす場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は、配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方を、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。

【0048】

「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なｃｉｓ作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントを、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給することができる。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソーム中に含有される）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、全て当業界で公知のものが挙げられる。一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載されるアルファウイルスである。

【0049】

本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」、「操作抗体」、「ヒトフレームワーク適合化」、および「ＨＦＡ」は、ヒト起源の配列から誘導される可変領域フレームワークを有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域は、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、または天然に存在する（例えば、アロタイプ）もしくは突然変異型のヒト生殖系列配列から誘導することができる。ヒト化抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。

【0050】

一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質またはポリペプチドである。無傷抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は、一方の末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、次いで、いくつかの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖に、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる型、すなわち、カッパおよびラムダのうちの１つを割り当てることができる。免疫グロブリンを、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを割り当てることができる。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。

【0051】

用語「抗体断片」は、無傷抗体の一部、一般的には、無傷抗体の抗原結合または可変領域を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、単鎖抗体分子および少なくとも２つの無傷抗体から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0052】

本明細書で使用される用語「抗原」は、直接的または間接的に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。「抗原」の定義に含まれるのは、タンパク質をコードする核酸である。

【0053】

本明細書で使用される場合、「特異的結合」または「免疫特異的結合」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が、所定の抗原または抗原上に存在するエピトープに結合することを指す。一部の実施形態では、抗体は、１０^－７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、または他の非特異的ポリペプチド）への結合に関するそのＫＤの少なくとも２分の１であるＫＤで所定の抗原に結合する。語句「抗原／タンパク質／標的を認識する抗体」および「抗原／タンパク質／標的に特異的な抗体」は、本明細書では、用語「抗原／タンパク質／標的に免疫特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。

【0054】

「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域が存在する。かくして、本明細書で使用される「ＣＤＲ」とは、適切な場合、３つ全部の重鎖ＣＤＲ、または３つ全部の軽鎖ＣＤＲまたは全ての重鎖ＣＤＲと全ての軽鎖ＣＤＲとの両方を指す。

【0055】

ＣＤＲは、抗体の、抗原またはエピトープへの結合のための接触残基の大部分を提供する。目的のＣＤＲを、ドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列から誘導することができ、それらは、天然に存在するＣＤＲのアナログを含み、そのアナログもまた、それらが誘導されたドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を共有または保持する。

【0056】

用語「ホモログ」は、参照配列に対する４０％～１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を意味する。２つのペプチド鎖間の同一性パーセントを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用するペアワイズアラインメントによって決定することができる。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、本明細書に記載の配列に対する少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の配列と比較して保存的置換を有する。一部の実施形態では、置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であってもよい。同一性％または置換に基づいて異なるこれらの分子を、「バリアント」と称することもできる。表１に示される重鎖および軽鎖配列中に保存的置換を有する抗体は、開示される主題の範囲内に包含される。保存的置換は、それらが抗体の特性に有害に影響しない限り、フレームワーク領域中に、または抗原結合部位中に存在してもよい。置換を、抗体の特性、例えば、安定性または親和性を改善するために行うことができる。保存的置換は、そのような改変が行われる分子と類似する機能的および化学的特徴を有する分子をもたらすであろう。例示的なアミノ酸置換は、以下の表に示される。

【0057】

【表1】

【0058】

本明細書で使用される用語「と組み合わせて」は、記載される薬剤が、混合物中で一緒に、単一の薬剤として同時的に、または任意の順序で単一の薬剤と連続的に動物に投与することができることを意味する。

【0059】

ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から誘導される抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体は、集団が実質的に類似するエピトープ結合部位を含有する、抗原に特異的な抗体の実質的に同種の集団を含有する。ＭＡｂを、当業者には公知の方法によって取得することができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５～４９７頁（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８７、１９９２）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２、１９９３）（これらの参考文献の内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびその任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。ｍＡｂを産生するハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕでの高力価のｍＡｂの生産は、これを、本発明の好ましい生産方法にする。

【0060】

キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる動物種に由来する異なる部分の分子であり、例えば、ヒト／マウスキメラｍＡｂが使用されるように、マウスｍＡｂがハイブリドーマからの高い収率を有するが、ヒトにおいては免疫原性がより高い場合、適用における免疫原性を低下させるため、および生産の収率を増加させるために主に使用される。キメラ抗体およびその生産のための方法は、当業界で公知である（Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３２７３～３２７７頁（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１～６８５５頁（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３～６４６頁（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８～２７０頁（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Ｋｕｄｏら、欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６～１０７４頁（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願公開ＷＯ１９８７／００２６７１号（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９～３４４３頁（１９８７）；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４ ２１８頁（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１ １０４３頁（１９８８）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。これらの参考文献は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0061】

抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般的に関連するユニークな決定基を認識する抗体である。ｍＡｂの供給源と同じ種および同じ遺伝子型（例えば、マウス株）の動物を、抗Ｉｄが製造されるｍＡｂを用いて免疫することによって、Ｉｄ抗体を製造することができる。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答するであろう。例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，６９９，８８０号を参照されたい。抗Ｉｄ抗体を、さらに別の動物における免疫応答を誘導するための「免疫原」として使用し、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を生産することもできる。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープ的に同一であってもよい。かくして、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。

【0062】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体（または抗体断片）を意味する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、典型的には、単一の抗原決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えば、マウスｍＡｂを、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５～４９７頁（１９７５）のハイブリドーマ法によって作製することができる。アクセプター抗体（典型的には、ヒトのような別の哺乳動物種）に由来する軽鎖および重鎖定常領域と結合した、ドナー抗体（典型的には、マウス）に由来する軽鎖および重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示された方法によって製造することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（典型的には、マウス）に由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が、場合により、結合親和性を保持するためにフレームワーク支持残基が変更された、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに由来するヒト化ｍＡｂを、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：１００２９～１００３２頁（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１頁（１９９１）に開示された技術によって取得することができる。

【0063】

本明細書に記載の抗体に加えて、ヒト化にとって有用な例示的なヒトフレームワーク配列は、例えば、ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｎｃｂｉ“ｄｏｔ”ｎｌｍ“ｄｏｔ”ｎｉｈ“ｄｏｔ”ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ“ｄｏｔ”ｆｃｇｉ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｎｃｂｉ“ｄｏｔ”ｎｉｈ“ｄｏｔ”ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ａｔｃｃ“ｄｏｔ”ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｍｒｃ－ｃｐｅ“ｄｏｔ”ｃａｍ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ“ｄｏｔ”ｐｈｐ；“ｄｏｔ”ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ“ｄｏｔ”ｃｏｍ／ｔｏｐ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｆｔｐ“ｄｏｔ”ｎｃｂｉ“ｄｏｔ”ｎｉｈ“ｄｏｔ”ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｓｃｉｑｕｅｓｔ“ｄｏｔ”ｃｏｍ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ａｂｃａｍ“ｄｏｔ”ｃｏｍ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ“ｄｏｔ”ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｐｕｂｌｉｃ“ｄｏｔ”ｉａｓｔａｔｅ“ｄｏｔ”ｅｄｕ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｗｈｆｒｅｅｍａｎ“ｄｏｔ”ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５“ｄｏｔ”ｈｔｍ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｈｈｍｉ“ｄｏｔ”ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｐａｔｈ“ｄｏｔ”ｃａｍ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｍｃｂ“ｄｏｔ”ｈａｒｖａｒｄ“ｄｏｔ”ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ“ｄｏｔ”ｃｏｍ；ｐａｔｈｂｏｘ“ｄｏｔ”ｗｕｓｔｌ“ｄｏｔ”ｅｄｕ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ“ｄｏｔ”ｃｏｍ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｎａｌ“ｄｏｔ”ｕｓｄａ“ｄｏｔ”ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｍ“ｄｏｔ”ｅｈｉｍｅ－ｕ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｊｐ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ“ｄｏｔ”ｃｏｍ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ“ｄｏｔ”ｏｒｇ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｂｉｏｔｅｃｈ“ｄｏｔ”ｕｆｌ“ｄｏｔ”ｅｄｕ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｉｓａｃ－ｎｅｔ“ｄｏｔ”ｏｒｇ；ｂａｓｅｒｖ“ｄｏｔ”ｕｃｉ“ｄｏｔ”ｋｕｎ“ｄｏｔ”ｎｌ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｒｅｃａｂ“ｄｏｔ”ｕｎｉ－ｈｄ“ｄｏｔ”ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ“ｄｏｔ”ｂｍｅ“ｄｏｔ”ｎｗｕ“ｄｏｔ”ｅｄｕ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｍｒｃ－ｃｐｅ“ｄｏｔ”ｃａｍ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｉｂｔ“ｄｏｔ”ｕｎａｍ“ｄｏｔ”ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｂｉｏｉｎｆ“ｄｏｔ”ｏｒｇ“ｄｏｔ”ｕｋ／ａｂｓ；ａｎｔｉｂｏｄｙ“ｄｏｔ”ｂａｔｈ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｕｎｉｚｈ“ｄｏｔ”ｃｈ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｃｒｙｓｔ“ｄｏｔ”ｂｂｋ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｕｂｃｇ０７ｓ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｎｉｍｒ“ｄｏｔ”ｍｒｃ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｐａｔｈ“ｄｏｔ”ｃａｍ“ｄｏｔ”ａｃ“ｄｏｔ”ｕｋ／“ｄｏｔ”ａｂｏｕｔ“ｄｏｔ”ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｉｂｔ“ｄｏｔ”ｕｎａｍ“ｄｏｔ”ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｂｉｏｓｃｉ“ｄｏｔ”ｍｉｓｓｏｕｒｉ“ｄｏｔ”ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ“ｄｏｔ”ｈｔｍｌ；ｗｗｗ“ｄｏｔ”ｊｅｒｉｎｉ“ｄｏｔ”ｄｅ；ｉｍｇｔ“ｄｏｔ”ｃｉｎｅｓ“ｄｏｔ”ｆｒ；およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）（それぞれ、全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。本明細書で参照されるワールドワイドウェブアドレス中の“ｄｏｔ”は、必要に応じて「．」と置き換えてもよい。

【0064】

本明細書に記載の抗体は、限定されるものではないが、重鎖定常領域（Ｈ_ｃ）、重鎖可変領域（Ｈ_ｖ）、軽鎖可変領域（Ｌ_ｖ）および軽鎖定常領域（Ｌ_ｃ）のうちの少なくとも１つを含んでもよく、ポリクローナルＡｂ、モノクローナルＡｂ、その断片および／または領域は、標的の一部に結合し、抗原を検出するために使用することができる重鎖可変領域（Ｈ_ｖ）または軽鎖可変領域（Ｌ_ｖ）のうちの少なくとも１つを含む。抗体はまた、ニワトリを免疫することによって作製されるモノクローナル抗体であってもよい。単離されたモノクローナル抗体をコードする核酸配列に由来する可変鎖を、限定されるものではないが、ＰＣＲのような技術を使用することによって単離することができる。次いで、これらの技術によって単離された可変鎖を、ヒトＦｃと共にｓｃＦｖベクター中に入れることができる。したがって、抗体は、ヒトＦｃおよび２つのｓｃＦｖアームを有する抗体であってもよい。次いで、本明細書に記載され、本開示を通じて記載されるもののような抗体を、ヒトまたはヒト化抗体に改変することができる。ニワトリ抗体を含む抗体を改変する方法の例は、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ、Ｃｌａｒｋ Ｍ、Ｗａｌｄｍａｎｎ Ｈ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ（１９８８）、Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（６１６２）：３３２～３２３頁；Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ Ｎ、Ｐａｒｋ Ｍ、Ｐａｋａｂｕｎｔｏ Ｋ、Ｏｎｇ Ｋ、Ａｖｄａｌｏｖｉｃ Ａ、Ｆｕ Ｈ、Ｊｉａ Ａ、Ｖａｓｑｕｅｚ Ｍ、Ｋｕｍａｒ Ｓ．（２００４）；および「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｔｉ－ＩＬ－１２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９５（１－２）：９～１９頁；Ｎｉｓｈｉｂｏｒｉ Ｎ、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｈ、Ｆｕｒｕｓａｗａ Ｓ、Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ．（２００６）、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３（６）：６３４～４２頁（それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見出すことができる。

【0065】

競合的阻害によってｍＡｂの特異性および親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、（１９９２、１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９ ６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「抗原結合領域」とは、抗原と相互作用し、抗体に対して、抗原に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含有する抗体分子のその部分を指す。抗体領域は、抗原結合残基の適切なコンフォメーションを維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合領域は、マウス起源のものであろう。一部の実施形態では、抗原結合領域は、他の動物種、特に、ウサギ、ラットもしくはハムスターのようなげっ歯類、またはニワトリのような鳥類から誘導することができる。抗体の抗原結合機能を、完全長抗体の断片によって実行させることができることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」に包含される結合断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）_２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；ＶＨドメインからなる、ドメイン抗体またはｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４～５４６頁）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、ＣＤＲ３（例えば、内容が参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ０３／０２５０１９を参照されたい）が挙げられる。

【0067】

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖（すなわち、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４）または重鎖（すなわち、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４）のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。かくして、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一である（約８５％以上、通常、９０～９５％以上）であるフレームワーク領域である。構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組合せである、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置し、整列させるのに役立つ。重鎖と軽鎖との両方の可変領域の４つのフレームワークサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）は、超可変配列の３つのストレッチ、またはＫａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら、Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ＤＮＡ－ａ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ、ＰＮＡＳ ７５（５）：２４２９～３３頁、１９７８）において定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）によって中断され、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定するものではないが、他者によって称されるフレームワーク領域は、単一の、天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲ’ｓの組合せを表す。本明細書で使用される場合、ＦＲは、４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲ’ｓは、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。

【0068】

用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、配列可変性に基づく（ＷｕおよびＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１～２５０頁、１９７０）。６つのＣＤＲが存在し、３つは可変重鎖、またはＶＨ中にあり、典型的には、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３と命名され、３つのＣＤＲは可変軽鎖、またはＶＬ中にあり、典型的には、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３と命名されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１）。「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７頁、１９８７）によって定義されたような、構造が可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。６つのＨＶＲが存在し、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中にある。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋは、構造的に保存されたＨＶを「カノニカル構造」と称している。抗原結合部位を形成する領域を記載する別の方法は、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体に由来するＶドメインの比較に基づいてＬｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５～７７頁、２００３）によって提唱されている（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５～７７頁、２００３）。抗原結合部位を、Ａｌｍａｇｒｏ（Ａｌｍａｇｒｏ、Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２～４３頁、２００４）による、「特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）」に基づいて説明することもでき、ＳＤＲＵは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。

【0069】

さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは天然では別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬとＶＨ領域が対形成して、一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９～５８８３頁を参照されたい）を形成する単鎖タンパク質として作製するのを可能にする合成リンカーによって、それらを組換え方法を使用して連結することができる。そのような単鎖抗体は、抗体の用語「抗原結合部分」によって包含される。これらの抗体断片は、当業者には公知の従来の技術を使用して取得され、無傷抗体と同じ様式で使用することができる。

【0070】

本明細書で使用される場合、「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。単離された抗体はまた、無菌性であるか、または発熱源を含まないか、または本明細書に記載の注射可能な医薬品として製剤化することもできる。

【0071】

「抗原」は、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するように動物をさらに誘導することができる抗体が結合することができる分子または分子の一部である。抗原は、１つまたは１つより多いエピトープを有してもよい。上で言及された特異的反応は、抗原が、高度に選択的な様式で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘発される複数の他の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。一部の実施形態では、抗体、抗体の断片および領域に結合する抗原は、少なくとも５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、細胞は、無傷細胞である。無傷細胞は、界面活性剤または他の試薬を使用して溶解または破壊されていない細胞である。細胞膜を破壊するか、または細胞膜に穴を開ける界面活性剤または他の試薬で処理された細胞は、無傷細胞ではない。細胞または粒子、例えば、リポ粒子の表面上に受容体を発現させることによって、受容体は、そうでなければ精製されたタンパク質が使用される場合には存在しない立体的エピトープを提示することができる。例は、本明細書に提供される。一部の実施形態では、アジュバントは使用されないが、アジュバントを使用してもよい。一部の実施形態では、粒子を鳥（例えば、ニワトリ）に注射して、免疫応答を刺激し、粒子の表面上に存在するタンパク質に対する抗体を生成させる。抗体の生成にとって好適な粒子は、米国特許第８，３７７，６９１号、第７，７６３，２５８号、第８，１５８，１３０号ならびに米国特許出願公開第２００５０１２３５６３号および第２０１２０１９５８８２号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物および特許は、膜貫通タンパク質（例えば、複数回膜貫通タンパク質、イオンチャネルなど）を発現させるために使用することができる、リポ粒子を含む、種々の粒子の生成を記載している。

【0072】

用語「エピトープ」は、Ａｂの抗原結合領域の１つまたは複数において抗体によって認識および結合される任意の分子の部分を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基群からなり、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。エピトープの例としては、限定されるものではないが、挙げられる。

【0073】

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、一価、二価または多価免疫グロブリンを含む。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とのジスルフィド架橋によって結合したキメラＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価キメラ抗体は、少なくとも１個のジスルフィド架橋によって結合した２個のＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ_２Ｌ_２）である。例えば、凝集するＣ_Ｈ領域（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖、またはμ鎖に由来する）を用いることによって、多価キメラ抗体を生産することもできる。一部の実施形態では、マウスおよびキメラ抗体、断片および領域は、個々の重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）免疫グロブリンを含む。

【0074】

同じか、または異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体、断片または誘導体を、公知の方法工程による、例えば、以下のＡｕｓｕｂｅｌ、以下のＨａｒｌｏｗ、および以下のＣｏｌｌｉｇａｎ（これらの参考文献の内容は、参照により全体が本明細書に組み入れられる）による、個々のポリペプチド鎖の適切な会合により製造することもできる。この手法を用いて、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主を、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主とは別々に培養し、免疫グロブリン鎖を別々に回収した後、会合させる。あるいは、宿主を同時培養し、鎖を培養培地中で同時に会合させた後、集合した免疫グロブリン、断片または誘導体を回収することができる。

【0075】

非ヒト抗体を産生する細胞、典型的には、天然もしくは組換え抗原、または抗原タンパク質配列のペプチド断片に対して免疫された動物の脾臓細胞の融合によって、ハイブリッド細胞を形成させる。あるいは、非ヒト抗体を産生する細胞は、抗原で免疫された動物の血液、脾臓、リンパ節または他の組織から得られるＢリンパ球であってもよい。

【0076】

不死化機能をもたらす第２の融合パートナーは、それ自身は抗体産生細胞ではないが、悪性であるリンパ芽球様細胞または形質細胞腫細胞または骨髄腫細胞であってもよい。融合パートナーとしては、限定されるものではないが、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）と省略されるハイブリドーマＳＰ２／０－Ａｇ１４および骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、またはその誘導体が挙げられる。例えば、以下のＡｕｓｕｂｅｌ、以下のＨａｒｌｏｗ、および以下のＣｏｌｌｉｇａｎ（これらの参考文献の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

【0077】

抗体を、本明細書に提供される実施例に従って生成することができる。配列が公知となったら、公知の方法に従って抗体を生成することもできる。抗体を、ヒトＩｇＧなどに変換するなど、異なる型に変換することもできる。抗体をヒト抗体に変換することによって、ヒト対象は抗体を異物として識別しないはずである。これは、より有効な応答をもたらすであろう。非ヒトＩｇＧ抗体のヒトＩｇＧ抗体への変換は、周知であり、天然配列が公知となったら、日常的に行うことができる。本明細書で考察されるように、抗体を、公知の方法に従って改変することができる。そのような方法は、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ、Ｃｌａｒｋ Ｍ、Ｗａｌｄｍａｎｎ Ｈ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ（１９８８）、Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（６１６２）：３３２～３２３頁；Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ Ｎ、Ｐａｒｋ Ｍ、Ｐａｋａｂｕｎｔｏ Ｋ、Ｏｎｇ Ｋ、Ａｖｄａｌｏｖｉｃ Ａ、Ｆｕ Ｈ、Ｊｉａ Ａ、Ｖａｓｑｕｅｚ Ｍ、Ｋｕｍａｒ Ｓ．（２００４）；および「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｔｉ－ＩＬ－１２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９５（１－２）：９～１９頁；Ｎｉｓｈｉｂｏｒｉ Ｎ、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｈ、Ｆｕｒｕｓａｗａ Ｓ、Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ．（２００６）、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３（６）：６３４～４２頁（それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。

【0078】

キメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列に寄与する抗体産生細胞を、霊長類のような非ヒト細胞、またはヒト細胞の形質転換によって生産することもできる。例えば、抗体を産生するＢリンパ球に、エプスタイン・バーウイルスのようなウイルスを感染させ、形質転換して、不死抗体産生細胞を得ることができる（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２ ７９（１９８３））。あるいは、Ｂリンパ球を、当業界で周知のように、形質転換遺伝子または形質転換遺伝子産物を提供することによって形質転換することができる。例えば、以下のＡｕｓｕｂｅｌ、以下のＨａｒｌｏｗ、および以下のＣｏｌｌｉｇａｎ（これらの参考文献の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

【0079】

細胞融合は、免疫学の分野の当業者には周知の標準的な手順によって達成される。融合パートナー細胞系ならびにハイブリドーマを融合および選択し、ｍＡｂについてスクリーニングするための方法は、当業界で周知である。例えば、以下のＡｕｓｕｂｅｌ、以下のＨａｒｌｏｗ、および以下のＣｏｌｌｉｇａｎ（これらの参考文献の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

【0080】

抗原特異的マウスまたはキメラｍＡｂを、抗体を分泌するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ細胞を、マウスの腹腔に注入すること、適切な時間の後、高力価のｍＡｂを含有する腹水を収獲すること、およびそれからｍＡｂを単離することによって大量に生産することができる。非マウスハイブリドーマ（例えば、ラットまたはヒト）を用いたｍＡｂのそのようなｉｎ ｖｉｖｏでの生産のために、ハイブリドーマ細胞を、好ましくは照射された、または無胸腺ヌードマウス中で増殖させる。あるいは、ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すること、および細胞培養培地から、または組換え的に、真核もしくは原核細胞中で、分泌されたｍＡｂを単離することによって、抗体を生産することができる。

【0081】

抗体の配列を改変して、ヒトＩｇＧ抗体を得ることができる。本明細書で提供される配列の変換を改変して、他の型の抗体を得ることができる。ＣＤＲを他の抗体、タンパク質、または分子に連結して、標的に結合する抗体断片を作出することもできる。本明細書で提供されるＣＤＲおよび抗体配列はまた、公知の方法に従ってヒト化するか、または完全にヒトにすることもできる。配列を、本明細書に記載のようにキメラ抗体にすることもできる。

【0082】

一部の実施形態では、抗体は、本明細書で提供される配列またはその断片を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書で提供される１つまたは複数のアミノ酸配列、その抗原結合断片、またはそのヒトＩｇＧバリアントを含む。「そのヒトＩｇＧバリアント」とは、出発抗体がヒトＩｇＧ抗体ではない場合に、ヒトＩｇＧとなるように改変された抗体を指す。

【0083】

本明細書に記載されるように、公知の配列を有する抗体の生産は日常的であり、任意の方法によって行うことができる。したがって、一部の実施形態では、抗体またはその断片をコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、核酸は、本明細書で提供される配列をコードする。抗体を、キメラ抗体またはヒト抗体となるように改変することもできる。抗体を、注射可能な医薬組成物中で使用することもできる。また、本明細書に記載されるように、抗体は、単離された抗体または操作された抗体であってもよい。

【0084】

一部の実施形態では、免疫グロブリン断片と機能的に類似する分子種を得るためにトランケートされた、または改変された遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗体の「誘導体」、その断片、領域または誘導体が提供される。改変としては、限定されるものではないが、植物および細菌毒素のような細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加が挙げられる。改変はまた、蛍光または化学発光タグのようなリポータータンパク質を含んでもよい。断片および誘導体を、任意の様式で生産することができる。

【0085】

断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖが挙げられる。これらの断片は、無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより急速に消失し、無傷抗体よりも低い非特異的組織結合を有してもよい（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６ ３２５（１９８３））。これらの断片は、当業界で周知の方法を使用して、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を生産するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_ｆ断片を生産するため）のような酵素を用いたタンパク質溶解的切断によって無傷抗体から生産される。

【0086】

本明細書に記載のＡｂによって認識されるこれらの抗原結合領域および／またはエピトープの同定は、類似する結合特性および本出願の実施形態と同等である治療的または診断的有用性を有するさらなるモノクローナル抗体を生成するのに必要な情報を提供する。

【0087】

本明細書に記載の抗体をコードする核酸配列は、本明細書に記載の少なくとも１つの可変領域をコードする、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。Ｖ領域抗原結合セグメントをコードするＤＮＡの供給源としての染色体遺伝子断片の使用の都合のよい代替手段は、例えば、Ｌｉｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ８４：３４３９頁（１９８７）およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３９：３５２１頁（１９８７）、（これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる））によって報告されたように、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのｃＤＮＡの使用である。ｃＤＮＡの使用には、宿主細胞にとって好適な遺伝子発現エレメントを、所望のタンパク質の合成を達成するための遺伝子と組み合わせることが必要である。ｃＤＮＡ配列の使用は、ｃＤＮＡ配列を適切なＲＮＡスプライシング系を欠く細菌または他の宿主中で発現させることができる点で、ゲノム配列（イントロンを含有する）よりも有利である。

【0088】

例えば、標的を検出、結合、または中和することができるＶ領域抗原結合セグメントをコードするｃＤＮＡを、本明細書で提供されるアミノ酸配列の使用に基づく公知の方法を使用して提供することができる。遺伝子コードは縮重性であるため、１より多いコドンを使用して、特定のアミノ酸をコードさせることができる（Ｗａｔｓｏｎら、下記）。遺伝子コードを使用して、それぞれ、アミノ酸をコードすることができる、１つまたは複数の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる。特定のオリゴヌクレオチドが、実際に、実際のコード配列を構成する確率を、異常な塩基対形成の関係および特定のコドンが抗体または断片を発現する真核または原核細胞中で実際に使用される（特定のアミノ酸をコードする）頻度を考慮することによって見積もることができる。そのような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１ １２（１９８５）によって開示されている。Ｌａｔｈｅの「コドン使用規則」を使用して、抗体可変または定常領域配列をコードすることができる理論的な「最もありそうな」ヌクレオチド配列を含有する、単一のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドのセットが同定される。

【0089】

本明細書に記載の可変領域を、ヒト定常領域またはマウス定常領域を含む任意の型の定常領域と組み合わせることができる。抗体、断片および領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子を、公知の方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリーから誘導することができる。ヒトＣ領域遺伝子を、ヒト免疫グロブリンを発現し、産生するものを含む任意のヒト細胞から誘導することができる。ヒトＣ_Ｈ領域を、ガンマ、μ、α、δまたはεを含むヒトＨ鎖の公知のクラスまたはアイソタイプ、ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４のようなそのサブタイプのいずれかから誘導することができる。Ｈ鎖アイソタイプは抗体の種々のエフェクター機能を担っているため、Ｃ_Ｈ領域の選択は、補体固定、または抗体依存的細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における活性のような所望のエフェクター機能によって導かれるであろう。好ましくは、Ｃ_Ｈ領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、ガンマ４（ＩｇＧ４）、またはμ（ＩｇＭ）から誘導される。ヒトＣ_Ｌ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプ、カッパまたはラムダから誘導することができる。

【0090】

ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子を、標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７、１９９３））によってヒト細胞から取得することができる。ヒトＣ領域遺伝子は、２つのクラスのＬ鎖、５つのクラスのＨ鎖およびそのサブクラスを表す遺伝子を含有する公知のクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａｂ’）_２およびＦａｂのようなキメラ抗体断片を、適切にトランケートされたキメラＨ鎖遺伝子を設計することによって製造することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片のＨ鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ_１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域、次いで、トランケートされた分子を得るための翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含むであろう。

【0091】

一般に、マウス、ヒトまたはマウスおよびキメラ抗体、本明細書に記載の抗体の断片および領域は、抗原特異的抗体のＨおよびＬ鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローニングすること、ならびにこれらのＤＮＡセグメントを、それぞれ、Ｃ_ＨおよびＣ_Ｌ領域をコードするＤＮＡセグメントに結合させて、マウス、ヒトまたはキメラ免疫グロブリンコード遺伝子を生産することによって生産される。

【0092】

かくして、一部の実施形態では、ヒトＣ領域の少なくとも一部をコードする第２のＤＮＡセグメントに連結された、結合（Ｊ）セグメントを有する機能的に再配置されたＶ領域のような、非ヒト起源の少なくとも抗原結合領域をコードする第１のＤＮＡセグメントを含む融合キメラ遺伝子が作出される。

【0093】

したがって、抗体ＶおよびＣ領域をコードするｃＤＮＡ、本明細書に記載の実施形態の一部に従ってキメラ抗体を生産する方法は、以下に例示されるような、いくつかの工程を含む：１．抗抗原抗体を産生する細胞系から、ならびに重鎖および軽鎖定常領域を供給する任意選択のさらなる抗体からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の単離；クローニングおよびそれからのｃＤＮＡ産生；２．ＬおよびＨ鎖の適切なＶおよび／またはＣ領域遺伝子セグメントを、（ｉ）適切なプローブを用いて同定する、（ｉｉ）配列決定する、および（ｉｉｉ）キメラ抗体のための別の抗体に由来するＣまたはＶ遺伝子セグメントと適合性にすることができる、精製されたｍＲＮＡからの完全長ｃＤＮＡライブラリーの製造；３．上記のクローニングされたＣ領域遺伝子へのクローニングされた特異的Ｖ領域遺伝子セグメントの連結による完全なＨまたはＬ鎖コード配列の構築；４．マウス－マウス、ヒト－マウス、ヒト－ヒトまたはヒトマウス抗体を提供するための原核および真核細胞を含む、選択された宿主中でのＬおよびＨ鎖の発現および産生。

【0094】

全ての免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子ならびにそのコードされるｍＲＮＡの１つの共通の構成は、Ｊ領域である。ＨおよびＬ鎖Ｊ領域は、異なる配列を有するが、各群間で、特に、Ｃ領域の近くでは、高い程度の配列相同性が存在する（８０％を超える）。この相同性は、この方法において活用され、ＨおよびＬ鎖Ｊ領域のコンセンサス配列を使用して、Ｖ領域セグメントのヒトＣ領域セグメントへのその後の連結のために有用な制限部位をＪ領域中に導入するためのプライマーとしての使用のためのオリゴヌクレオチドを設計することができる。

【0095】

ヒト細胞から製造されるＣ領域ｃＤＮＡベクターを、部位特異的突然変異誘発によって改変して、ヒト配列中の同様の位置に制限部位を置くことができる。例えば、当業者であれば、完全なヒトカッパ鎖Ｃ（Ｃκ）領域および完全なヒトガンマ－１Ｃ領域（Ｃγ－１）をクローニングすることができる。この場合、Ｃ領域ベクターのための供給源としてのゲノムＣ領域クローンに基づく代替的な方法では、これらの遺伝子を、介在配列を除去するのに必要とされる酵素が存在しない細菌系においては発現させることができないであろう。クローニングされたＶ領域セグメントを切り出し、ＬまたはＨ鎖Ｃ領域ベクターにライゲートする。あるいは、終止コドンを導入することによって、Ｆａｂ分子のＨ鎖部分をコードする遺伝子配列を生成することによって、ヒトγ－１領域を改変することができる。次いで、ＶおよびＣ領域が連結されたコード配列を、原核または真核である適切な宿主中での発現のために適切な発現ビヒクル中に移行させる。

【0096】

連結が、トリプレットの読み枠の変更または中断なしに連続的に翻訳可能な配列をもたらす場合、２つのコードＤＮＡ配列は「作動可能に連結されている」と言われる。連結が、コード配列の発現をもたらすためのその遺伝子発現エレメントの適切な機能をもたらす場合、ＤＮＡコード配列は、遺伝子発現エレメントに作動可能に連結されている。

【0097】

発現ビヒクルは、プラスミドまたは他のベクターを含む。これらの中でも好ましいのは、適切な付着末端を有する任意のＶ_ＨまたはＶ_Ｌ鎖配列をその中に容易に挿入することができるように操作された適切な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣ_ＨまたはＣ_Ｌ鎖配列を担持するビヒクルである。かくして、ヒトＣ_ＨまたはＣ_Ｌ鎖配列を含有するビヒクルは、任意の適切な宿主中での任意の所望の完全なＨまたはＬ鎖の発現のための中間体として役立つ。

【0098】

マウス－ヒトまたはヒト－ヒトのようなキメラ抗体は、典型的には、構築物中で使用されるマウスＨおよびＬ鎖Ｖ領域にとって天然である染色体遺伝子プロモーターによって駆動される遺伝子から合成されるであろう；スプライシングは通常、マウスＪ領域中のスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域の前のスプライスアクセプター部位との間に、また、ヒトＣ領域内に存在するスプライス領域で起こる；ポリアデニル化および転写終結は、ヒトコード領域の下流の天然の染色体部位で起こる。

【0099】

本明細書で使用される場合、および別途指摘しない限り、用語「約」は、それが修飾する値の±５％を意味することが意図される。かくして、約１００は、９５～１０５を意味する。

【0100】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗原の存在を検出するために使用される。本発明の抗体を、抗原の存在を検出するための任意のデバイスまたは方法において使用することができる。

【0101】

抗体を参照する用語「精製された」とは、その天然の環境中の分子と会合する他の材料を実質的に含まない抗体を指す。例えば、精製されたタンパク質は、それが誘導される細胞または組織に由来する細胞材料または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離されたタンパク質が、分析されるために十分に純粋である、または少なくとも７０％～８０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも８０％～９０％（ｗ／ｗ）純粋、９０～９５％純粋；および少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である製造物を指す。一部の実施形態では、抗体は精製される。

【0102】

用語「特異的結合」、「特異的に結合する」などは、２つ以上の分子が、生理的またはアッセイ条件下で測定可能であり、選択的である複合体を形成することを意味する。抗体または抗原結合タンパク質または他の分子は、適切に選択された条件下で、そのような結合は実質的に阻害されないが、同時に、非特異的結合は阻害される場合、タンパク質、抗原、またはエピトープに「特異的に結合する」と言われる。特異的結合は、高い親和性を特徴とし、化合物、タンパク質、エピトープ、または抗原にとって選択的である。非特異的結合は通常、低い親和性を有する。例えば、ＩｇＧ抗体における結合は、一般的には、少なくとも約１０^－８Ｍ以上、または少なくとも約１０^－９Ｍ以上、または少なくとも約１０^－１０Ｍ以上、または少なくとも約１０^－１１Ｍ以上、または少なくとも約１０^－１２Ｍ以上のような、少なくとも約１０^－７Ｍ以上の親和性を特徴とする。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって担持されない特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、その場合、抗原結合ドメインを担持する抗体または抗原結合タンパク質は、一般的には他の抗原には結合しないであろう。一部の実施形態では、捕捉試薬は、その結合パートナー（例えば、抗原）に対する１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、または１０^－１１Ｍ以下のＫｄを有する。一部の実施形態では、捕捉試薬は、その結合パートナーに対する１０^９Ｍ^－１以上のＫａを有する。

【0103】

免疫グロブリンとしても知られる、無傷抗体は、典型的には、それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽鎖（Ｌ）、およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重鎖（Ｈ）から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。抗体中には、ラムダおよびカッパと呼ばれる２つの型の軽鎖が存在する。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは５つの主要なクラスに割り当てられる：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭ、ならびにこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分割することができる。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）から構成される。それぞれの重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域から構成される。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、ＣＨ１と指定される。ＶＨおよびＶＬドメインは、超可変配列の３つの領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）のための足場を形成する、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と命名される比較的保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗体または抗原結合タンパク質と抗原との特異的相互作用を担う多くの残基を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称されるが、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。ＣＤＲ３は、抗体または抗原結合タンパク質結合部位内の分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基または２６個より多いアミノ酸の短さであってもよい。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は、当業界で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら（編）、１９８８を参照されたい。当業者であれば、それぞれのサブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造が、活性断片を含むことを認識できるであろう。例えば、活性断片は、抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットの部分、すなわち、抗原結合断片、またはＦｃ受容体および／もしくは補体に結合する、および／もしくはそれを活性化するＣＨサブユニットの部分からなってもよい。

【0104】

本明細書に記載の断片に加えて、本明細書で使用される用語「抗原特異的抗体」内に包含される結合断片の非限定例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらを合成リンカーによって組換え的に結合し、ＶＬおよびＶＨドメインが対形成して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一のタンパク質鎖を作出することができる。最も一般的に使用されるリンカーは、１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）_３のペプチドであるが、他のリンカーも当業界で公知である。単鎖抗体もまた、用語「抗体または抗原結合タンパク質」または抗体の「抗原結合断片」内に包含されることが意図される。抗体はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗原結合断片、Ｆｃ断片、単鎖抗体、またはその任意の誘導体であってもよい。

【0105】

これらの抗体を、当業者には公知の、および本明細書に記載の従来の技術を使用して取得することができ、断片は、無傷抗体と同じ様式で使用される。抗体多様性は、可変ドメインをコードする複数の生殖系列遺伝子および様々な体細胞事象によって作出される。体細胞事象は、完全なＶＨドメインを作製するための可変遺伝子セグメントと、多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメントとの組換え、および完全なＶＬドメインを作製するための可変および結合遺伝子セグメントの組換えを含む。組換えプロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合部でのアミノ酸の喪失または付加をもたらす。多様性のこれらのメカニズムは、抗原曝露前の発生中のＢ細胞中で起こる。抗原刺激後、Ｂ細胞中の発現された抗体遺伝子は、体細胞突然変異を受ける。生殖系列遺伝子セグメントの見積もられた数、これらのセグメントの無作為組換え、および無作為のＶＨ－ＶＬ対形成に基づいて、最大で１．６×１０^７個の異なる抗体が産生される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版（１９９３）、Ｐａｕｌ（編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）。抗体多様性に起用する他のプロセス（体細胞突然変異など）を考慮に入れる場合、１×１０^１０個を超える異なる抗体が生成されると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ、第２版（１９９５）、Ｊｏｎｉｏら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。多くのプロセスが抗体多様性の生成に関与しているため、同じ抗原特異性を有する独立に誘導されたモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。

【0106】

本明細書に記載の抗原、エピトープ、または他の分子と特異的に相互作用することができる抗体または抗原結合タンパク質分子を、当業者には周知の方法によって生産することができる。例えば、公知の方法によるハイブリドーマの生成により、モノクローナル抗体を生産することができる。次いで、この様式で形成されるハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびバイオセンサー分析のような標準的な方法を使用してスクリーニングして、目的の分子または化合物と特異的に相互作用する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定することができる。

【0107】

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造するための代替手段として、本明細書に記載のポリペプチドとの組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって、あるポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することによって、そのポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするための技術および商業的に入手可能なキットは、当業者には周知である。さらに、抗体または抗原結合タンパク質ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングする際の使用にとって特に適している方法および試薬の例を、文献中に見出すことができる。かくして、本明細書に記載のエピトープを使用して、治療的、診断的に、または研究手段として使用することができる他の抗体についてスクリーニングすることができる。

【0108】

抗体を含む投与、組成物、およびキット
単離された抗体は標的上のエピトープに結合するが、本明細書で提供される実施形態に従って生産された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトおよび動物における状態を処置するための治療剤および予防剤の両方として好適であり得る。

【0109】

一部の実施形態では、方法は、治療または予防有効量の、本明細書で提供される１つまたは複数の抗体または抗体の抗原結合断片を、疑わしい対象に、または抗体が有用であると考えられる状態を示す者に投与することを含む。限定されるものではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含む、任意の活性形態の抗体を投与することができる。

【0110】

一部の実施形態では、使用される抗体は、ＭＡｂに対する免疫応答が、許容できない程度に短い循環半減期をもたらさないか、または対象においてＭＡｂに対する免疫応答を誘導するような、レシピエント種と適合する。一部の実施形態では、投与されるＭＡｂは、対象のＦｃ受容体への結合および抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）メカニズムの活性化のような、いくらかの二次的機能を示す。

【0111】

個体の処置は、治療有効量の本明細書で提供される抗体の投与を含んでもよい。抗体を、以下に記載のキット中に提供することができる。抗体を、単独で、または別の治療剤、鎮痛剤、もしくは診断剤との混合物中で使用または投与することができる。

【0112】

好適なビヒクルならびにその製剤化およびパッケージングは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、Ｔｒｏｙ，Ｄ．（編）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０および４１）に記載されている。さらなる薬学的方法を用いて、作用の持続時間を制御することができる。制御放出製造物を、化合物と複合体化するか、または化合物を吸収するポリマーの使用によって達成することができる。制御放出製造物により作用の持続時間を制御するための別の可能な方法は、化合物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーのようなポリマー材料の粒子中に組み込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子中に組み込む代わりに、例えば、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）－マイクロカプセル中に、またはコロイド薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル中に、またはマクロエマルジョン中にこれらの材料を捕捉することが可能である。

【0113】

一般に、全身用量の抗体を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ～１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ～５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ～１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲にある抗体の投与量をレシピエントに提供することが望ましいが、より低い、またはより高い投与量を投与してもよい。約１．０ｍｇ／ｋｇの低さの投与量は、いくらかの効能を示すと期待される。一部の実施形態では、約５ｍｇ／ｋｇが許容される投与量であるが、約５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量レベルも、特に、治療的使用にとって好ましい。あるいは、１μｇ～１００μｇ、１ｍｇ～１００ｍｇ、または１ｇｍ～１００ｇｍの範囲の量のような、患者の体重に基づかない特定量の抗体の投与を与えてもよい。例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、経膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、または経皮手段のような身体区画または体腔に対するものであってよい。

【0114】

本明細書に記載の抗体組成物を、特に、液体溶液または懸濁液の形態の、非経口（皮下、筋肉内もしくは静脈内）または他の任意の投与のための使用のために製造することができる。製剤はまた、注射可能製剤にとって好適であってもよい。一部の実施形態では、注射可能製剤は、無菌性である。一部の実施形態では、注射可能製剤は、発熱源を含まない。一部の実施形態では、製剤は、本明細書に記載の抗原以外の他の抗原に結合する他の抗体を含まない。

【0115】

ある量は、薬剤の投与量、投与経路、および投薬スケジュールが症状の低減に影響するのに十分なものである場合、そのような応答に「影響する」のに十分であるか、または「治療有効量」であると言われる。抗体投与に対する応答を、イメージング技術または組織試料のｅｘ ｖｉｖｏでの分析などによる、対象の影響を受けた組織、臓器、または細胞の分析によって測定することができる。ある薬剤は、その存在が、レシピエント患者の生理における検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有意である。

【0116】

抗体を公知の方法に従って製剤化して、薬学的に有用な組成物を製造することができ、それにより、これらの材料、またはその機能的誘導体は、薬学的に許容される担体ビヒクルと混合して組み合わされる。処置を、単回用量スケジュールで、または処置の主な過程が１～１０の別々の用量、次いで、応答を維持および／または強化するのに必要とされるその後の時間間隔、例えば、第２の用量については１～４ヶ月で与えられる他の用量、および必要に応じて、数ヶ月後のその後の用量であってもよい、複数用量スケジュールで与えることができる。好適な処置スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月および６ヶ月、（ｉｉ）０、７日および１ヶ月、（ｉｉｉ）０および１ヶ月、（ｉｖ）０および６ヶ月、または疾患症状を低減させる、もしくは疾患の重症度を低下させると予想される所望の応答を惹起するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。一部の実施形態では、抗体は、毎週、２週毎に１回、または３週毎に１回、または月１回投与される。

【0117】

本明細書に記載の実施形態を実行するのに有用であるキットも提供される。本発明のキットは、上記抗体を含有するか、または上記抗体と併せて包装された第１の容器を含む。キットはまた、実施形態を実行するのに必要な、またはそれにとって都合のよい溶液を含有する、またはそれらと併せて包装された別の容器を含んでもよい。容器は、ガラス、プラスチックまたはホイル製であってよく、バイアル、ビン、パウチ、チューブ、袋などであってもよい。キットはまた、実施形態を実行するための手順のような文書情報または第１の容器手段に含有される試薬の量のような分析情報を含有してもよい。容器は、文書情報と共に、別の容器装置、例えば、箱または袋中にあってもよい。

【0118】

一部の実施形態では、以下の実施形態が提供される：
１．２つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）によって挟まれたニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の集団を生産する方法であって、
ａ）ニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸分子の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で、第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いてニワトリ抗体をコードする核酸分子の第１の集団を増幅することを含み、
第１のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流または下流の領域にアニーリングし、第１のプライマーが、ＣＤＲのすぐ上流または下流にある位置で、認識部位から離れた距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；
第１のプライマーがＣＤＲの上流でアニーリングする場合、第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の距離にある領域にアニーリングする；または
第１のプライマーがＣＤＲの下流でアニーリングする場合、第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの上流の距離にある領域にアニーリングする、方法。
２．核酸分子の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ上流に５’突出部を生産して、消化産物を生産することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記消化産物を、ヒト抗体の第１のＦＲをコードする核酸配列にライゲートすることによって第１のライゲーション産物を製造することをさらに含み、
ヒト抗体の前記第１のＦＲが、第１のＦＲが第１の消化産物の上流にライゲートされるように前記消化産物の突出領域と適合する突出領域をその３’末端に含む、実施形態２に記載の方法。
４．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである位置で切断し、境界が、ＣＤＲをコードする配列の内部または外部のいずれかにある、実施形態１に記載の方法。
５．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである位置で切断する、実施形態４に記載の方法。
６．制限酵素が、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態１に記載の方法。
７．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態１に記載の方法。
８．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態７に記載の方法。
９．第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流または上流の、ｍＲＮＡ転写物の長さよりも大きくない距離にある領域にアニーリングする、実施形態１に記載の方法。
１０．すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである、実施形態２に記載の方法。
１１．すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである、実施形態１０に記載の方法。
１２．ニワトリＣＤＲをコードする核酸分子の第２の増幅された集団を生産するのに十分な条件下で、第３のプライマーおよび第４のプライマーを用いて増幅された核酸分子の第２の集団を製造することをさらに含み、
第３のプライマーが、第１のライゲーション産物中に存在するＣＤＲをコードする核酸配列のすぐ下流の領域にアニーリングし、第３のプライマーが、ＣＤＲのすぐ下流にあり、認識部位から離れた距離にある位置で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含有し；
第４のプライマーが、ライゲーション産物中のＣＤＲの上流にある距離にある、第１のライゲーション産物中に存在する第１のＦＲをコードする核酸分子の一部にアニーリングする、実施形態３に記載の方法。
１３．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである位置で切断する、実施形態１２に記載の方法。
１４．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである位置で切断する、実施形態１３に記載の方法。
１５．制限酵素が、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態１２に記載の方法。
１６．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態１２に記載の方法。
１７．制限酵素が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドであり、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド離れた位置で切断する、実施形態１６に記載の方法。
１８．第２のプライマーが、ニワトリ抗体のＣＤＲの下流の、ｍＲＮＡ転写物の長さよりも大きくない距離にある領域にアニーリングする、実施形態１２に記載の方法。
１９．核酸分子の第２の増幅された集団を、前記制限酵素で消化して、ＣＤＲをコードする配列のすぐ下流に５’突出部を生産して、第２の消化産物を生産することをさらに含む、実施形態１２に記載の方法。
２０．すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、３、４、または５ヌクレオチドである、実施形態１９に記載の方法。
２１．すぐ下流にある５’突出部が、ＣＤＲ境界から１、２、または３ヌクレオチドである、実施形態２０に記載の方法。
２２．第２の消化産物を、ヒト抗体の第２のＦＲをコードする核酸配列にライゲートして、第２のライゲーション産物を生産することを含み、前記第２のＦＲは、第２のＦＲが、第２の消化産物の下流にライゲートされるように、前記第２の消化産物の突出領域と適合する突出領域をその５’末端に含む、実施形態１９に記載の方法。
２３．ヒト抗体の２つのＦＲによって挟まれたＣＤＲをコードする核酸分子の集団を生産するのに十分な条件下で、ヒト抗体の第１のＦＲにアニーリングする第１のＦＷプライマーおよびヒト抗体の第２のＦＲにアニーリングする第２のプライマーを用いて第２のライゲーション産物を増幅することをさらに含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．ＣＤＲが、ニワトリＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．ＦＲが、ヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４である、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．第１のＦＲがヒトＦＲ１であり、第２のＦＲがヒトＦＲ２である、実施形態２５に記載の方法。
２７．第１のＦＲがヒトＦＲ２であり、第２のＦＲがヒトＦＲ３である、実施形態２５に記載の方法。
２８．第１のＦＲがヒトＦＲ３であり、第２のＦＲがヒトＦＲ４である、実施形態２５に記載の方法。
２９．制限酵素がＩＩＳ型酵素である、実施形態１～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．ＩＩＳ型酵素が、認識配列から少なくとも１０塩基を超えて離れた距離で切断する任意のＩＩＳ型酵素である、実施形態２９に記載の方法。
３１．ＩＩＳ型酵素が、認識配列から１４～２１塩基離れた距離で切断する、実施形態３０に記載の方法。
３２．ＩＩＳ型酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、またはＮｍｅＡｌｌＩである、実施形態３１に記載の方法。
３３．それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することをさらに含む、実施形態１～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することが、実施形態１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って生産された第１、第２、および第３のライゲーション産物の重複ＰＣＲを実行することを含み、
第１のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；
第２のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；
第３のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む、実施形態３３に記載の方法。
３５．それぞれのＣＤＲがヒトフレームワーク領域によって挟まれた、ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸を生産することが、実施形態１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って生産された第１、第２、および第３のライゲーション産物をライゲートすることを含み、
第１のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ１をコードする核酸分子を含み；
第２のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２をコードする核酸分子を含み；
第３のライゲーション産物が、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３をコードする核酸分子を含む、実施形態３３に記載の方法。
３６．ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する、実施形態３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．ニワトリＣＤＲ１、ニワトリＣＤＲ２、およびニワトリＣＤＲ３を含むタンパク質をコードする核酸分子が、抗体可変領域をコードする、実施形態３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３８．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列を含む、実施形態１～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．Ｒが、ＣＴＧＡＡＧ、ＣＧＡＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ、ＧＡＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＣ、ＣＣＡＴＣ、ＡＣＧＧＣ、ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ、ＧＴＡＴＣＣ、ＧＴＣＴＣ、ＡＣＣＴＧＣ、ＡＣＴＧＧＧ、ＣＴＧＧＡＧ、ＣＴＴＧＡＧ、ＧＧＴＣＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧ、ＧＴＣＴＣ、ＣＧＴＣＴＣ、ＧＧＧＡＣ、ＧＡＡＴＧＣ、ＣＴＣＡＧ、ＡＣＣＴＧＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、ＧＣＡＡＴＧ、ＡＣＴＧＧ、ＧＣＧＡＴＧ、ＧＧＡＴＧ、ＧＣＡＧＴＧ、ＣＡＧＴＧ、ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ、ＣＴＣＴＴＣ、ＧＧＣＧＧＡ、ＣＧＴＣＴＣ、ＣＣＣＧＣ、ＧＧＡＴＧ、ＧＡＣＧＣ、ＧＧＴＧＡ、ＣＣＴＴＣ、ＧＡＡＧＡ、ＧＡＧＴＣ、ＴＣＣＲＡＣ、ＣＣＴＣ、ＧＣＣＧＡＧ、ＧＡＧＴＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、またはＧＣＡＴＣである、実施形態３８に記載の方法。
４０．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態３８に記載の方法。
４１．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態３８に記載の方法
４３．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態４１に記載の方法。
４３．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態３８に記載の方法。
４４．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
４５．ＭがＡまたはＣである、実施形態４３に記載の方法。
４６．ＲがＡまたはＧである、実施形態４３に記載の方法。
４７．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
４８．ＳがＣまたはＧである、実施形態４３に記載の方法。
４９．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
５０．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
５１．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
５２．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態４３に記載の方法。
５３．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４５）の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態５３に記載の方法。
５５．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態５３に記載の方法。
５６．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態５５に記載の方法。
５７．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態５３に記載の方法。
５８．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
５９．ＭがＡまたはＣである、実施形態５７に記載の方法。
６０．ＲがＡまたはＧである、実施形態５７に記載の方法。
６１．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
６２．ＳがＣまたはＧである、実施形態５７に記載の方法。
６３．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
６４．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
６５．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
６６．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態５７に記載の方法。
６７．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
６８．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態６７に記載の方法。
６９．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態６７に記載の方法。
７０．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態６９に記載の方法。
７１．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態６７に記載の方法。
７２．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
７３．ＭがＡまたはＣである、実施形態７１に記載の方法。
７４．ＲがＡまたはＧである、実施形態７１に記載の方法。
７５．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
７６．ＳがＣまたはＧである、実施形態７１に記載の方法。
７７．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
７８．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
７９．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
８０．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態７１に記載の方法。
８１．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＣＴＴＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
８２．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態８１に記載の方法。
８３．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態８１に記載の方法。
８４．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態８３に記載の方法。
８５．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態８１に記載の方法。
８６．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
８７．ＭがＡまたはＣである、実施形態８５に記載の方法。
８８．ＲがＡまたはＧである、実施形態８５に記載の方法。
８９．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
９０．ＳがＣまたはＧである、実施形態８５に記載の方法。
９１．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
９２．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
９３．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
９４．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態８５に記載の方法。
９５．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＧＴＧＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６２）の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
９６．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態９５に記載の方法。
９７．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態９５に記載の方法。
９８．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態９７に記載の方法。
９９．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態９５に記載の方法。
１００．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０１．ＭがＡまたはＣである、実施形態９９に記載の方法。
１０２．ＲがＡまたはＧである、実施形態９９に記載の方法。
１０３．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０４．ＳがＣまたはＧである、実施形態９９に記載の方法。
１０５．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０６．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０７．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０８．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態９９に記載の方法。
１０９．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
１１０．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１０９に記載の方法。
１１２．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１０９に記載の方法。
１１４．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．ＭがＡまたはＣである、実施形態１１３に記載の方法。
１１６．ＲがＡまたはＧである、実施形態１１３に記載の方法。
１１７．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１１８．ＳがＣまたはＧである、実施形態１１３に記載の方法。
１１９．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１２０．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１２１．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１２２．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１１３に記載の方法。
１２３．第１のプライマーおよび第３のプライマーが、５’－ＧＣＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’の配列（式中、Ｎは、天然に存在する、天然には存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１２３に記載の方法。
１２６．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１２５に記載の方法。
１２７．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１２３に記載の方法。
１２８．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．ＭがＡまたはＣである、実施形態１２７に記載の方法。
１３０．ＲがＡまたはＧである、実施形態１２７に記載の方法。
１３１．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１３２．ＳがＣまたはＧである、実施形態１２７に記載の方法。
１３３．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１３４．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１３５．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１３６．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１２７に記載の方法。
１３７．抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子のライブラリーを生産する方法であって、
ｉ）ヒトフレームワーク領域１（ＦＲ１）およびヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）ドメインをコードする核酸分子の第１のライブラリー；
ｉｉ）ヒトフレームワーク領域２（ＦＲ２）およびヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）ドメインをコードする核酸分子の第２のライブラリー；
ｉｉｉ）ヒトフレームワーク領域３（ＦＲ３）およびヒトフレームワーク領域４（ＦＲ４）をコードする核酸配列によって挟まれた、ニワトリ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ドメインをコードする核酸分子の第３のライブラリー
を組み合わせることを含み、
抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する、方法。
１３８．組み合わせることが、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーをライゲートして、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む、実施形態１３７に記載の方法。
１３９．組み合わせることが、核酸分子の第１、第２、および第３のライブラリーを用いた重複ＰＣＲを実行して、抗体のヒト化可変領域をコードする核酸分子を生産することを含む、実施形態１３７に記載の方法。
１４０．実施形態１～１３９のいずれか１項に従って製造された核酸分子のライブラリー。
１４１．ライブラリーが核酸分子の集団を含み、集団の複数の核酸分子が、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有するポリペプチドをコードする、実施形態１４０に記載の核酸分子のライブラリー。
１４２．異なるポリペプチドをコードするライブラリー中に存在する少なくとも２つの核酸分子が存在する、実施形態１４１に記載のライブラリー。
１４３．ニワトリ抗体のＣＤＲのすぐ上流または下流の領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドであって、認識部位の下流の距離で切断する制限酵素によって認識される制限酵素認識部位を含む、オリゴヌクレオチド。
１４４．式：
５’－（Ｎ）ｘＲ（Ｎ）ｎ－３’
（式中、
Ｒは、認識配列であり；
Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基であり；
ｘは、０～１１であり；
ｎは、１～２１である）
を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
１４５．Ｒが、ＣＴＧＡＡＧ、ＣＧＡＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＧＴＡＹＣ、ＧＡＡＧＡＣ、ＧＣＡＧＣ、ＣＣＡＴＣ、ＡＣＧＧＣ、ＣＧＡＮＮＮＮＮＮＴＧＣ、ＧＴＡＴＣＣ、ＧＴＣＴＣ、ＡＣＣＴＧＣ、ＡＣＴＧＧＧ、ＣＴＧＧＡＧ、ＣＴＴＧＡＧ、ＧＧＴＣＴＣ、ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＴＧＣＡＧ、ＧＴＣＴＣ、ＣＧＴＣＴＣ、ＧＧＧＡＣ、ＧＡＡＴＧＣ、ＣＴＣＡＧ、ＡＣＣＴＧＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、ＧＣＡＡＴＧ、ＡＣＴＧＧ、ＧＣＧＡＴＧ、ＧＧＡＴＧ、ＧＣＡＧＴＧ、ＣＡＧＴＧ、ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ、ＣＴＣＴＴＣ、ＧＧＣＧＧＡ、ＣＧＴＣＴＣ、ＣＣＣＧＣ、ＧＧＡＴＧ、ＧＡＣＧＣ、ＧＧＴＧＡ、ＣＣＴＴＣ、ＧＡＡＧＡ、ＧＡＧＴＣ、ＴＣＣＲＡＣ、ＣＣＴＣ、ＧＣＣＧＡＧ、ＧＡＧＴＣ、ＧＣＴＣＴＴＣ、またはＧＣＡＴＣである、実施形態１４４に記載のオリゴヌクレオチド。
１４６．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１４４に記載のオリゴヌクレオチド。
１４７．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１４４に記載のオリゴヌクレオチド。
１４８．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１４７に記載のオリゴヌクレオチド。
１４９．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１４４に記載のオリゴヌクレオチド。
１５０．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５１．ＭがＡまたはＣである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５２．ＲがＡまたはＧである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５３．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５４．ＳがＣまたはＧである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５５．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５６．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５７．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５８．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１４９に記載のオリゴヌクレオチド。
１５９．５’－ＣＴＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号４５）（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６０．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１５９に記載のオリゴヌクレオチド。
１６１．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１５９に記載のオリゴヌクレオチド。
１６２．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１６１に記載のオリゴヌクレオチド。
１６３．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１５９に記載のオリゴヌクレオチド。
１６４．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６５．ＭがＡまたはＣである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６６．ＲがＡまたはＧである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６７．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６８．ＳがＣまたはＧである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１６９．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７０．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７１．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７２．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１６３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７３．５’－ＣＴＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７４．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１７３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７５．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１７３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７６．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１７５に記載のオリゴヌクレオチド。
１７７．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１７３に記載のオリゴヌクレオチド。
１７８．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１７９．ＭがＡまたはＣである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８０．ＲがＡまたはＧである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８１．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８２．ＳがＣまたはＧである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８３．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８４．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８５．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８６．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１７７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８７．５’－ＣＴＴＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
１８８．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態１８７に記載のオリゴヌクレオチド。
１８９．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態１８７に記載のオリゴヌクレオチド。
１９０．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態１８９に記載のオリゴヌクレオチド。
１９１．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態１８７に記載のオリゴヌクレオチド。
１９２．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９３．ＭがＡまたはＣである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９４．ＲがＡまたはＧである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９５．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９６．ＳがＣまたはＧである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９７．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９８．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
１９９．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
２００．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態１９１に記載のオリゴヌクレオチド。
２０１．５’－ＧＴＧＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（配列番号６２）（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
２０２．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態２０１に記載のオリゴヌクレオチド。
２０３．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態２０１に記載のオリゴヌクレオチド。
２０４．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態２０３に記載のオリゴヌクレオチド。
２０５．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態２０１に記載のオリゴヌクレオチド。
２０６．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２０７．ＭがＡまたはＣである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２０８．ＲがＡまたはＧである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２０９．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１０．ＳがＣまたはＧである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１１．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１２．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１３．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１４．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２０５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１５．５’－ＴＣＣＲＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
２１６．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態２１５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１７．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態２１５に記載のオリゴヌクレオチド。
２１８．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態２１７に記載のオリゴヌクレオチド。
２１９．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態２１５に記載のオリゴヌクレオチド。
２２０．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２１．ＭがＡまたはＣである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２２．ＲがＡまたはＧである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２３．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２４．ＳがＣまたはＧである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２５．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２６．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２７．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２８．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２２９．５’－ＧＣＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’（式中、Ｎは、天然に存在する、天然に存在しない、または縮重核酸塩基のような任意の核酸塩基である）の配列を含む核酸配列の配列を含む、実施形態１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３０．天然に存在する核酸塩基が、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＵである、実施形態２２９に記載のオリゴヌクレオチド。
２３１．天然に存在しない核酸塩基が、ＤＮＡ二重鎖を安定化する、実施形態２２９に記載のオリゴヌクレオチド。
２３２．天然に存在しない核酸塩基が、ＡＰ－ｄＣ、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、Ｃ（５）－プロピニルシトシン、またはＣ（５）－プロピニルウラシルである、実施形態２３１に記載のオリゴヌクレオチド。
２３３．縮重核酸塩基が、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｂ、ＤまたはＨである、実施形態２２９に記載のオリゴヌクレオチド。
２３４．ＫがＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３５．ＭがＡまたはＣである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３６．ＲがＡまたはＧである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３７．ＹがＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３８．ＳがＣまたはＧである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２３９．ＷがＡまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２４０．ＢがＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２４１．ＤがＡまたはＧまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２４２．ＨがＡまたはＣまたはＴ／Ｕである、実施形態２３３に記載のオリゴヌクレオチド。
２４３．本明細書で提供される、または記載されるオリゴヌクレオチド。
２４４．ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、
ＦＲ１はヒトＦＲ１であり；
ＣＤＲ１はニワトリＣＤＲ１であり；
ＦＲ２はヒトＦＲ２であり；
ＣＤＲ２はニワトリＣＤＲ２であり；
ＦＲ３はヒトＦＲ３であり；
ＣＤＲ３はニワトリＣＤＲ３であり；
ＦＲ４はヒトＦＲ４である）
の式を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、前記核酸分子が実施形態１～１３９のいずれか１つに従って製造された、ポリペプチド。
２４５．標的に対する結合パートナーを同定する方法であって、標的と、実施形態１～１３９のいずれか１つに記載の方法に従って製造されたライブラリーによってコードされるタンパク質のライブラリーとを接触させることを含む、方法。
２４６．結合パートナーが抗体である、実施形態２４５に記載の方法。
２４７．結合パートナーがｓｃＦｖである、実施形態２４５に記載の方法。

【0119】

実施形態を、種々の実施形態に関して記載してきたが、それらに限定されることは意図されておらず、むしろ、当業者であれば、実施形態の精神およびその範囲内にある変更および改変を行うことができることを認識するであろう。

【実施例1】

【0120】

ニワトリＶＨライブラリーのヒト化：本実施例は、免疫されたニワトリのＢ細胞からのＶＨ ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の抽出、次いで、ニワトリＣＤＲを含有するヒト化ＶＨコード領域を形成するためのヒトフレームワーク領域との集合のための非限定的方法を提示する。

【0121】

ヒトフレームワーク領域アクセプター断片を、生殖系列ヒトＶ遺伝子を含有するプラスミドからのＰＣＲ増幅、次いで、抽出されたニワトリＣＤＲと適合する突出部を残すための制限酵素による消化によって生成した。ニワトリＶ遺伝子に対するアミノ酸レベルでの類似性のため、ＶＨ３－２３を選択した。ヒトＪＨ１（ＦＲ４）に加えてＶＨ３－２３ Ｖ遺伝子の配列（配列番号１）を、表１に示す。ＶＨ３－２３ Ｖ遺伝子＋ＪＨ１をコドン最適化して、計画された接合点でのニワトリコドンとの同一性を確保し、フレームワーク増幅のための鋳型としての使用のためにｐＵＣベクター中に挿入した。

【0122】

【表2】

【0123】

ヒトフレームワーク領域アクセプター断片を生成するために使用されたプライマーを、表２に列挙する（配列番号２～９）。それぞれのプライマー対中の１つのプライマーは、制限酵素の切断が抽出されたニワトリＣＤＲへのライゲーションのための所望の接合点に突出部を残すような位置にＡｃｕＩ制限酵素認識部位（表２中のＣＴＧＡＡＧ）を含有する。このプライマーはまた、ストレプトアビジン磁気ビーズ上での捕捉およびＡｃｕＩを用いた消化による放出のために５’末端上でビオチン化されている。消化効率を改善するために、ビオチンとＡｃｕＩ認識部位との間にランダムスペーサー配列が含まれている。ランダムスペーサー配列は、ＡｃｕＩによる効率的な切断を可能にし、プライマー合成によって長さが制限されている。

【0124】

【表3】

【0125】

ＰＣＲ反応を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、鋳型１ｎｇ（配列番号１）、および０．５μＭの各プライマーを使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、７２℃で１５秒の３０サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。サーマルサイクリングの完了後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して反応物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）５０μｌを使用して捕捉した。捕捉後、ビーズを、洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、次いで、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）で洗浄した。ＡｃｕＩ（ＮＥＢ）、Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、およびＳ－アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）を用いた制限消化反応を設定し、サーモミキサー中、１，５００ｒｐｍで３０分、振とうしながら３７℃でインキュベートすることによって、ビーズからＰＣＲ産物を放出させた。消化後、放出されたＰＣＲ産物を含有する上清を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。

【0126】

４つのヒトフレームワーク領域アクセプター断片を生成し、その配列を表３に列挙した。ＦＲ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲ２断片（配列番号１０）は、隣接するフレームワークＦＲ１およびＦＲ２に加えて、ヒトＶＨ３－２３生殖系列ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＨ１）を含有する。この断片を、表２中のプライマーセットＡを使用して生成した。ＦＲ３（Ｈ２突出部）断片（配列番号１１または配列番号４４）は、ＦＲ３領域がヒトＶＨ３－２３遺伝子のＣＤＲ２領域に接続する末端に突出部を有する単一のフレームワーク領域ＦＲ３を含有する。この断片を、表２中のプライマーセットＢの１つを使用して生成した。ＦＲ３（Ｈ３突出部）断片（配列番号１２）は、ＦＲ３領域がヒトＶＨ３－２３遺伝子のＣＤＲ３領域に接続する末端に突出部を有する単一のフレームワーク領域ＦＲ３を含有する。この断片を、表２中のプライマーセットＣを使用して生成した。ＦＲ４断片（配列番号１３）は、単一のフレームワーク領域ＦＲ４を含有し、これを、表２中のプライマーセットＤを使用して生成した。

【0127】

【表4】

【0128】

ニワトリ抗体ＶＨ鎖のＣＤＲ２領域の取得およびヒトフレームワークへの挿入。免疫されたニワトリのＢ細胞から抽出されたＲＮＡから製造されたｃＤＮＡから、ニワトリＶＨ ＣＤＲ２を増幅させた。ＣＤＲ２断片を、本明細書および上に記載されたようないくつかのＰＣＲおよび消化反応によって抽出した。次いで、ＣＤＲ２断片を、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片上にライゲートし、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ２を含有する断片を生成した。

【0129】

ＣＤＲ２増幅のために使用したプライマーを、表４に列挙する（配列番号１４～２８）。それぞれのＰＣＲ工程について、プライマーセットは、ＣＤＲに隣接するニワトリフレームワーク領域に結合するプライマーのプールを含んでいた。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、プライマーのこれらのプールは、できるだけ多くのニワトリ免疫レパートリーをサンプリングするための縮重塩基を含有する。これらのプライマーは、制限酵素の切断が、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片へのライゲーションのための所望の接合点に突出部を残すように配置されたＡｃｕＩ制限酵素認識部位（表４中のＣＴＧＡＡＧ）を含有する。これらのプライマーは、ストレプトアビジン磁気ビーズ上での捕捉およびＡｃｕＩを用いた消化による放出のために５’末端上でビオチン化されている。消化効率を改善するために、ビオチンとＡｃｕＩ認識部位との間にランダムスペーサー配列が含まれている。ＡｃｕＩ認識部位を含有するプライマーの設計を、図１に示す。

【0130】

【表5】

【0131】

一部の実施形態では、配列番号１５～２２のプライマーは、それぞれ、配列番号３１～３６によって置き換えられる。

【0132】

ニワトリＣＤＲ２断片を得るために、ＰＣＲ反応を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、ｃＤＮＡ １μｌ、０．５μＭのフォワードプライマー（配列番号１４）、および０．５μＭのリバースプライマープール（配列番号１５～１８）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、６５℃で１０秒、７２℃で５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。サーマルサイクリングの完了後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して反応物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）５０μｌを使用して捕捉した。捕捉後、ビーズを、洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、次いで、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）で洗浄した。ＡｃｕＩ（ＮＥＢ）、Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、およびＳ－アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）を用いた制限消化反応を設定し、サーモミキサー中、１，５００ｒｐｍで３０分、振とうしながら３７℃でインキュベートすることによって、ビーズからＰＣＲ産物を放出させた。消化後、放出されたＰＣＲ産物を含有する上清を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。この消化産物は、ＣＤＲ２がＦＲ３領域に接続する末端に突出部を有するニワトリＣＤＲ２を含有する断片である。

【0133】

次の工程は、このニワトリＣＤＲ２断片を、ＦＲ３ヒトフレームワーク領域アクセプター断片（配列番号１１）にライゲートすることであった。ライゲーション反応を、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）およびＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）と共に、それぞれ１ｐモルのニワトリＣＤＲ２断片およびヒトＦＲ３アクセプター断片を使用して設定した。この反応物を、２５℃で５分インキュベートした後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次の工程は、ニワトリＣＤＲ２およびヒトＦＲ３を含有するライゲーション産物を増幅するＰＣＲ反応である。ＰＣＲ反応を、鋳型としての精製されたライゲーション産物、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、０．５μＭリバースプライマー（配列番号３）、および０．５μＭのフォワードプライマープール（配列番号１９～２２）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、６１℃で１０秒、７２℃で５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。サーマルサイクリングの完了後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して反応物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）５０μｌを使用して捕捉した。捕捉後、ビーズを、洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、次いで、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）で洗浄した。ＡｃｕＩ（ＮＥＢ）、Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、およびＳ－アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）を用いた制限消化反応を設定し、サーモミキサー中、１，５００ｒｐｍで３０分、振とうしながら３７℃でインキュベートすることによって、ビーズからＰＣＲ産物を放出させた。消化後、放出されたＰＣＲ産物を含有する上清を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。得られた生成物は、ＣＤＲ２がＦＲ２に接続する末端に突出部を有する、ＣＤＲ２－ＦＲ３の断片である。

【0134】

次の工程は、このＣＤＲ２－ＦＲ３断片を、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２ヒトフレームワーク領域アクセプター断片（配列番号１０）にライゲートすることであった。ライゲーション反応を、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）およびＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）と共に、それぞれ１ｐモルのＣＤＲ２－ＦＲ３断片およびＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２断片を使用して設定した。この反応物を、２５℃で５分インキュベートした後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製されたライゲーション産物（ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３断片）を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、０．５μＭの各プライマー（配列番号２～３）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、７２℃で１５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用する最終ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析し、集合させた断片をゲルから切り出し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。最終生成物は、ヒトＶＨ３－２３ ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２とＦＲ３とによって挟まれたニワトリＶＨ ＣＤＲ２を含有する。

【0135】

ニワトリ抗体ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域の取得およびヒトフレームワークへの挿入。免疫されたニワトリのＢ細胞から抽出されたＲＮＡから製造されたｃＤＮＡから、ニワトリＶＨ ＣＤＲ３を増幅させた。ＣＤＲ３を、いくつかのＰＣＲおよび消化反応によって抽出した。次いで、ＣＤＲ３断片を、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片上にライゲートし、ヒトフレームワーク領域によって挟まれたニワトリＣＤＲ３を含有する断片を生成した。これらの工程を、図２に示す。

【0136】

ＣＤＲ３増幅のために使用したプライマーを、表５に列挙する（配列番号２３～３０）。それぞれのＰＣＲ工程について、プライマーセットは、ＣＤＲに隣接するニワトリフレームワーク領域に結合するプライマーのプールを含む。これらのプライマーのプールは、できるだけ多くのニワトリ免疫レパートリーをサンプリングするために縮重塩基を含有する。これらのプライマーは、制限酵素の切断が、ヒトフレームワーク領域アクセプター断片へのライゲーションのための所望の接合点に突出部を残すように配置されたＡｃｕＩ制限酵素認識部位（表５中のｃｔｇａａｇ）を含有する。これらのプライマーを、ストレプトアビジン磁気ビーズ上での捕捉およびＡｃｕＩを用いた消化による放出のために５’末端上でビオチン化した。消化効率を改善するために、ビオチンとＡｃｕＩ認識部位との間にランダムスペーサー配列が含まれている。

【0137】

【表6】

【0138】

ニワトリＣＤＲ３断片を得るために、ＰＣＲ反応を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、ｃＤＮＡ １μｌ、０．５μＭのフォワードプライマープール（配列番号２３～２７）、および０．５μＭのリバースプライマー（配列番号２８）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、５２℃で１０秒、７２℃で５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。サーマルサイクリングの完了後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して反応物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）５０μｌを使用して捕捉した。捕捉後、ビーズを、洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、次いで、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）で洗浄した。ＡｃｕＩ（ＮＥＢ）、Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、およびＳ－アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）を用いた制限消化反応を設定し、サーモミキサー中、１，５００ｒｐｍで３０分、振とうしながら３７℃でインキュベートすることによって、ビーズからＰＣＲ産物を放出させた。消化後、放出されたＰＣＲ産物を含有する上清を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。得られた生成物は、ＣＤＲ３がＦＲ３領域に接続する末端に突出部を有するニワトリＣＤＲ３を含有する断片である。

【0139】

それぞれ１ｐモルの消化されたＰＣＲ産物およびアクセプター断片、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、ならびにＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を含有するライゲーション反応を設定することによって、この生成物を、ＦＲ３ヒトフレームワーク領域アクセプター断片（配列番号１２）にライゲートした。この反応物を、２５℃で５分インキュベートした後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ライゲーション産物を増幅するために、次のＰＣＲ工程を、鋳型としての精製されたライゲーション産物、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、０．５μＭフォワードプライマー（配列番号６）、および０．５μＭのリバースプライマープール（配列番号２９～３０）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、６８℃で１０秒、７２℃で５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。サーマルサイクリングの完了後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して反応物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ）５０μｌを使用して捕捉した。捕捉後、ビーズを、洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、次いで、１×Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）で洗浄した。ＡｃｕＩ（ＮＥＢ）、Ｃｕｔｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、およびＳ－アデノシルメチオニン（ＮＥＢ）を用いた制限消化反応を設定し、サーモミキサー中、１，５００ｒｐｍで３０分、振とうしながら３７℃でインキュベートすることによって、ビーズからＰＣＲ産物を放出させた。消化後、放出されたＰＣＲ産物を含有する上清を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。得られた生成物は、ＣＤＲ３がＦＲ４に接続する末端に突出部を有する、ＦＲ３－ＣＤＲ３の断片である。

【0140】

それぞれ１ｐモルの消化されたＰＣＲ産物およびアクセプター断片、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、ならびにＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を含有するライゲーション反応を設定することによって、この生成物を、ＦＲ４アクセプター断片（配列番号１３）にライゲートした。この反応物を、２５℃で５分インキュベートした後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製されたライゲーション反応物を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、０．５μＭの各プライマー（配列番号６、９）を使用し、以下のサーマルサイクリング条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、７２℃で１５秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用する最終ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。生成物を、ゲル電気泳動によって分析し、集合させた断片をゲルから切り出し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。最終生成物は、ヒトＶＨ３－２３ ＦＲ３とＦＲ４とによって挟まれたニワトリＶＨ ＣＤＲ３を含有する。

【0141】

一部の実施形態では、配列番号３７～４１の配列が、配列番号２３～２７の代わりに使用される。一部の実施形態では、配列番号４２の配列が、配列番号２８の代わりに使用される。これらのものを使用することができ、本明細書に記載されたような第２のＰＣＲ／消化／ライゲーション工程を含まないように使用することができる、高いＴｍに起因するミスマッチを用いて依然としてプライミングすることができる。

【0142】

ヒト化抗体ＶＨ鎖の集合
ＶＨを、ヒト化ニワトリＣＤＲ２およびＣＤＲ３断片（断片ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３およびＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）を使用して、重複ＰＣＲによって集合させた。ＰＣＲ反応を、２×Ｐｈｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）、０．５μＭの各プライマー（配列番号２、９）、および１ｐモルの各断片を使用し、以下の条件：９８℃で３０秒、９８℃で５秒、７２℃で２０秒の１５サイクル、および７２℃で２分の最終サイクルを使用して設定した。生成物を、ゲル電気泳動によって分析し、集合させた断片をゲルから切り出し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。

【0143】

最終生成物は、ニワトリ由来ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する、ヒトＶＨ３－２３ ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３領域、ヒトＪＨ１を含有する配列をコードするヒト化ＶＨである。これを、同様の様式で製造されたニワトリＣＤＲを含有するヒト化ＶＬ断片と対形成させて、ヒト化抗体ライブラリーを生成する。このライブラリーを、免疫した抗原に対するファージディスプレイによる親和性選択のためにファージミド中にクローニングする。

【0144】

親和性成熟および結合試験。膜タンパク質抗原で本明細書で提供され、上に記載されたように免疫したニワトリから抽出したＣＤＲを使用して、ヒト化ｓｃＦｖライブラリーを構築し、ファージミドベクター中にクローニングした。ファージディスプレイによる標的抗原に対する２ラウンドの親和性選択後、ペリプラズム抽出物を、個々のクローンの細菌培養物から製造した。ｓｃＦｖ抽出物を、ＥＬＩＳＡによって試験した。試験結果を図３に示す。

【0145】

これらの結果は、ここで生産されたライブラリーを使用した抗体の生産が成功し、これを使用して、特異的結合を有する多様なセットの抗体を生成することができることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2023537386000001.app

【国際調査報告】