2023-537534 多特異性抗ＴＣＲデルタ可変１抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-01

(54)【発明の名称】多特異性抗ＴＣＲデルタ可変１抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20230825BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230825BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20230825BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230825BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230825BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230825BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230825BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230825BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230825BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C07K16/32

A61P35/00

A61P35/02

A61P31/00

A61P29/00

A61K39/395 D

A61K39/395 E

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 R

A61K39/395 Y

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023510439

(86)(22)【出願日】2021-08-14

(85)【翻訳文提出日】2023-04-07

(86)【国際出願番号】 IB2021057509

(87)【国際公開番号】W WO2022034562

(87)【国際公開日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】PCT/GB2020/051959

(32)【優先日】2020-08-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2102222.3

(32)【優先日】2021-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2102224.9

(32)【優先日】2021-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522058062

【氏名又は名称】ガンマデルタ セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100218268

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】ウーデン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】チュナ，ミフリバン

(72)【発明者】

【氏名】マウント，ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】グッド，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】フリードマン，ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】ブンブラ，シェファリ

(72)【発明者】

【氏名】ヌスバウマー，オリバー

(72)【発明者】

【氏名】メフタ，ラージ ジェイスクラル

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ガンマデルタＴ細胞のＴ細胞受容体及び１つの他の抗原と特異的に結合する、多特異性抗体、特に二重特異性抗体、ならびにその断片及び変異体に関する。より詳細には、本発明は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖及びがん抗原またはがん関連抗原と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ならびにγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖及び免疫調節性抗原と結合する二重特異性デュアル免疫調節薬（ＤＩ）という、少なくとも２つの新たなクラスの二重特異性抗体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ． γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである第１の標的エピトープ、及び
ｂ． 第２の標的エピトープ
と特異的に結合する、多特異性抗体またはその断片。

【請求項2】

前記第１の標的エピトープが、配列番号１及び／または配列番号１２８のアミノ酸残基１～９０内のエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項3】

前記第１の標的エピトープが、
（ｉ）配列番号１の３～２０、及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７
のアミノ酸領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項4】

前記第１の標的エピトープが、γδＴ細胞の活性化エピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項5】

前記活性化エピトープの結合が、（ｉ）前記γδＴＣＲを下方制御する、（ｉｉ）前記γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する、及び／または（ｉｉｉ）γδＴ細胞媒介性殺傷を促進する、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項6】

前記第１の標的エピトープが、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、ＣＤ６９及び／またはＫｉ６７の発現を上方制御するエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項7】

前記多特異性抗体またはその断片が、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ未満、１．３×１０^－７Ｍ未満、１．０×１０^－７Ｍ未満、または５．０×１０^－８Ｍ未満の結合親和性（ＫＤ）で前記第１のエピトープと結合する、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項8】

前記第２のエピトープがＶδ１＋Ｔ細胞上にある、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項9】

前記第２のエピトープが、がん抗原またはがん関連抗原のエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項10】

前記がん抗原またはがん関連抗原が、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、アルファ－フェトプロテイン、アンドロゲン受容体、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＡＡ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ベータカテニン、ベータＨＣＧ、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＢＯＲＩＳ、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３、ＣＡ １９５、ＣＡ １９－９、ＣＡ ２４２、ＣＡ ２７．２９、ＣＡ ７２－４、ＣＡ－５０、ＣＡＭ １７．１、ＣＡＭ４３、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、癌胎児抗原、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＯ－０２９、ＣＳＰＧ４、サイクリンＢ１、シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＣＹＰ１Ｂ１、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＢ２、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、ＦＧＦ－５、Ｆｏｓ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、ＧｌｏｂｏＨ、糖脂質Ｆ７７、ＧＭ３、ＧＰ １００、ＧＰ １００（Ｐｍｅｌ １７）、Ｈ４－ＲＥＴ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＨＴｇｐ－１７５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、イディオタイプ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、ＬＡＧＥ－１ａ、ＬＣＫ、レクチン反応性ＡＦＰ、レグマイン、ＬＭＰ２、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ、Ｍ－ＣＳＦ、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、メソテリン、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、Ｍｕｍ－１、ｈｓｐ７０－２、ＭＹＣＮ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＮＡ１７、ＮＢ／７０Ｋ、ニューロングリア抗原２（ＮＧ２）、好中球エラスターゼ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＮｕＭａ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＣＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、Ｐａｇｅ４、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＬＡＣ１、ポリシアル酸、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、Ｒａｓ、Ｒａｓ－突然変異体、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ＳＡＲＴ３、ＳＤＣＣＡＧ１６、ｓＬｅ（ａ）、精子タンパク質１７、ＳＳＸ２、ＳＴｎ、サバイビン、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ－７２、テロメラーゼ、チログロブリン、Ｔｉｅ ２、ＴＬＰ、Ｔｎ、ＴＰＳ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２、ＴＳＰ－１８０、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＩＳＴＡ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ １、４３－９Ｆ、５Ｔ４、及び７９１Ｔｇｐ７２からなる群から選択される、請求項９に記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項11】

前記多特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャー二重特異性抗体である、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項12】

前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２（ＣＤ３４０）、ＥＧＦＲ、ＦＡＰαまたはメソテリンのエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項13】

前記第２のエピトープが免疫細胞上にある、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項14】

前記第２のエピトープが、免疫調節性抗原のエピトープである、請求項１～８または請求項１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項15】

前記免疫調節性抗原が、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－ＤＣ（ＣＤ２７３）、Ｂ７－Ｈ１（ＣＤ２７４）、Ｂ７－Ｈ２（ＣＤ２７５）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ５４、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＸＣＬ９、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、及びＴＩＭ－３（ＣＤ３６６）からなる群から選択され得る、請求項１４に記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項16】

前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＴＩＧＩＴのエピトープである、請求項１～８または１３～１５のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項17】

前記第２の標的エピトープが、細胞膜分化ＣＤ抗原のエピトープである、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項18】

前記ＣＤ抗原が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｂ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｍ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０Ａ、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５８Ａ、ＣＤ１５８Ｂ１、ＣＤ１５８Ｂ２、ＣＤ１５８Ｃ、ＣＤ１５８Ｄ、ＣＤ１５８Ｅ１、ＣＤ１５８Ｅ２、ＣＤ１５８Ｆ１、ＣＤ１５８Ｆ２、ＣＤ１５８Ｇ、ＣＤ１５８Ｈ、ＣＤ１５８Ｉ、ＣＤ１５８Ｊ、ＣＤ１５８Ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３０、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、及びＣＤ３７１からなる群から選択される、請求項１７に記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項19】

前記多特異性抗体またはその断片が、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）、ノブ・イン・ホール（共通軽鎖）、電荷ペア、Ｆａｂ－アーム交換、ＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλボディ、直交性Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）、ナノボディ、Ｎａｎｏｂｙ－ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、ダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、ドック・アンド・ロック、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡボディ、ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ、タンデムｓｃＦｖ－毒素、ＩｇＧ－ＩｇＧ、ｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、デュオボディ、ｍａｂ^２及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２からなる群から選択される多特異性抗体である、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項20】

前記多特異性抗体またはその断片が、ヒト抗体またはその抗原結合性断片である、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項21】

前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＩｇＧ多特異性抗体であり、場合により、前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＩｇＧ１多特異性抗体である、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項22】

前記多特異性抗体が、Ｆｃ有効型である、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項23】

前記多特異性抗体が、
ａ． Ｖδ１ Ｔ細胞上のＴＣＲの下方制御を引き起こすこと、
ｂ． ＣＤＣまたはＡＤＣＣを示さないこと、及び
ｃ． Ｖδ１ Ｔ細胞を枯渇させないこと
を特徴とする、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項24】

前記多特異性抗体が、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを介して、生存可能なＶδ１ Ｔ＋細胞集団の約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満の枯渇を引き起こす、先行請求項のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【請求項25】

先行請求項のいずれかに記載の組換え多特異性抗体を生成する方法であって、
ａ． 第１の標的エピトープと特異的に結合する第１の単特異性抗体を選択するステップであって、前記第１の標的エピトープが、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである、前記選択するステップと、
ｂ． 前記第１の抗体の前記抗体またはその抗原結合性断片を、第２のエピトープをターゲティングする結合ドメインを含む抗体またはその断片と組み合わせて、前記組換え多特異性抗体を生成するステップと
を含み、場合により、前記組換え多特異性抗体が、請求項１～２４のいずれか１項において定義されたような多特異性抗体である、前記方法。

【請求項26】

請求項１～２４のいずれか１項において定義されたような前記多特異性抗体またはその断片と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む、医薬組成物。

【請求項27】

対象の疾患もしくは障害を処置する方法、または対象の免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、請求項１～２４のいずれか１項に記載の多特異性抗体もしくはその断片、または請求項２６に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。

【請求項28】

前記疾患もしくは障害が、がん、感染性疾患もしくは炎症性疾患であるか、または免疫応答が調節される前記対象が、がん、感染性疾患もしくは炎症性疾患を有する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

対象の免疫応答を調節することが、γδＴ細胞を活性化すること、γδＴ細胞の増殖を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の増大を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の脱顆粒を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞殺傷活性を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞傷害性を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の動員を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の生存を増加させること、及びγδＴ細胞の消耗に対する抵抗性を増加させることからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

疾患細胞は殺傷され、健康細胞は温存される、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の多特異性抗体もしくはその断片、または請求項２６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ガンマデルタＴ細胞のＴ細胞受容体及び１つの他の抗原と特異的に結合する、多特異性抗体、特に二重特異性抗体、ならびにその断片及び変異体に関する。

【背景技術】

【0002】

がんに対するＴ細胞免疫療法への関心の高まりは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋アルファベータ（αβ）Ｔ細胞のサブセットががん細胞を認識し、特にＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及び他の受容体により発揮される抑制経路の臨床的媒介拮抗作用によって抑制が解除された場合、宿主保護機能性を媒介する明らかな能力に焦点を当てている。しかし、αβＴ細胞は、移植片対宿主病を引き起こし得るＭＨＣ拘束性である。

【0003】

ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）は、表面に別個の典型的なγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞のサブセットを表す。このＴＣＲは１つのガンマ（γ）鎖と１つのデルタ（δ）鎖とで構成されており、鎖の各々は鎖の再構成を受けるが、αβＴ細胞と比較してＶ遺伝子の数が限られている。Ｖγをコードする主なＴＲＧＶ遺伝子セグメントは、ＴＲＧＶ２、ＴＲＧＶ３、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ５、ＴＲＧＶ８、ＴＲＧＶ９及びＴＲＧＶ１１、ならびに非機能遺伝子ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ１１、ＴＲＧＶＡ及びＴＲＧＶＢである。最も頻度の高いＴＲＤＶ遺伝子セグメントはＶδ１、Ｖδ２、及びＶδ３をコードし、更にＶδ及びＶαの両方の名称を有する幾つかのＶセグメントをコードする（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２９６：３０－４０（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。ヒトγδＴ細胞はＴＣＲ鎖に基づいて大まかに分類できる。これは、ある特定のγ型及びδ型が、１つまたは複数の組織型において排他的ではないがより一般的に細胞で見出されるためである。例えば、ほとんどの血液常在性γδＴ細胞は、Ｖδ２ ＴＣＲ、一般的にはＶγ９Ｖδ２を発現するが、これは、ガンマ鎖と対になる、例えば腸内ではしばしばＶγ４と対になるＶδ１ ＴＣＲをより頻繁に使用する、皮膚などに存在する組織常在性γδＴ細胞においてはあまり一般的ではない。

【0004】

γδＴ細胞は、免疫監視において重要な役割を果たし、ストレスマーカーのパターンを通じて悪性細胞または形質転換細胞（がん細胞など）を認識し、次いで強力かつ選択的な細胞傷害性を発揮する。したがってγδＴ細胞は、免疫応答を司るものとして作用し得る。これらの細胞をｉｎ ｓｉｔｕで調節すると、突然変異荷重の低い腫瘍においても免疫原性を増加させる可能性がもたらされるが、これは他の免疫療法では困難であることが判明している。腫瘍のγδＴ細胞による認識は、いずれかの単一の腫瘍抗原及びγδＴ細胞の調節因子に依存するものではなく、したがって、血液系悪性腫瘍と固形悪性腫瘍との両方を含む広範な疾患の兆候において可能性を有する。γδＴ細胞の認識メカニズムは、ＭＨＣ拘束性ではない。

【0005】

ＷＯ２０１９１４７７３５の著者らは、一部のγδ細胞が腫瘍促進活性を有するか、またはαβＴ細胞によって媒介される抗がん免疫応答を阻害するとの仮説を立てている。同著者らは、γδＴ細胞が免疫抑制剤であると仮定し、したがって、がんの状況では抗体を用いてこれらを枯渇、阻害、または遮断すべきであると示唆している。

【0006】

しかしながら、抗γδ抗体がγδ細胞を遮断または殺傷することにより、このような細胞の機能を負に調節するという支配的な見解にもかかわらず、γδＴ細胞の浸潤と患者の予後及び／または生存との間に正相関が存在することが見出されている。

【0007】

αβ ＴＣＲ受容体／リガンドの相互作用と比較して、ｖδ１ ＴＣＲ受容体／リガンドの相互作用に関する理解は限られている。そのような理解がない中で、これまでのｖδ１ ＴＣＲを認識する抗体は主に、この相互作用を調べるための探索的ツールである。このようなツールは通常、未精製の遮断抗体であり、ＴＣＲ受容体／リガンドの相互作用がｖδ１＋細胞の遮断、抑制、またはアブレーションをもたらすことを示唆している。例えば、ツール抗体のＴＳ８．２及びＴＳ－１は複数の研究で抗γδ遮断抗体として用いられており、これらの研究は、前記抗体がｖδ１細胞の細胞傷害性を低減させることを示唆している。これらの研究を他のものと合わせると、ｉｎ ｓｉｔｕ疾患の状況においてこのような抗ｖδ１抗体を使用してｖδ１細胞の細胞傷害性を良好に調節することは考えられず、したがって、ｖδ１細胞傷害性を低減させるのではなく増加させる抗体が必要であることが示唆される。

【0008】

免疫療法のためにγδＴ細胞を活用するには、細胞をｉｎ ｓｉｔｕで増大させるか、またはそれらを採取してそれらを再注入する前にｅｘ ｖｉｖｏで増大させるための手段が必要である。後者のアプローチは、外因性サイトカインの付加を使用するものが既報である。例えばＷＯ２０１７／０７２３６７及びＷＯ２０１８／２１２８０８を参照のこと。薬理学的に改変された形態のヒドロキシ－メチルブタ－２－エニルピロホスフェート（ＨＭＢＰＰ）または臨床的に承認されたアミノビスホスホネートを使用する、患者自身のγδＴ細胞を増大させる方法が説明されている。これらのアプローチにより、２５０名を超えるがん患者が、一見したところ安全に処置されているが、完全寛解の発生はきわめて稀である。しかしながら、多数のγδＴ細胞を増大させる能力が証明されている活性化剤が依然として必要とされている。

【0009】

更に、ｉｎ－ｓｉｔｕでＶδ１＋細胞を優先的にターゲティングする、またはそれと結合する、またはそれを認識する、またはそれを特異的に調節する、またはその数を増加させることができる結合剤または活性化剤は、薬物として非常に望ましい場合がある。

【0010】

しかしながら、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）などのアミノビスホスホネートを含め、Ｖδ２＋細胞を調節する可能性のある薬物は存在するが、前記医薬は主に、骨再吸収を緩徐化するために設計されている。また、前記Ｖδ２＋の調節にかかわらず、Ｖδ１＋細胞と結合する、それをターゲティングする、調節する、活性化する、またはその数を増加させるために特別に設計された医薬を開発する必要がある。その理由は、例えば、Ｖδ２＋調節の繰り返しが、持続性で漸進的に消耗される表現型をもたらし得るためである。

【0011】

更に、Ｖδ１＋細胞の優勢組織常在性を所与とすると、Ｖδ１＋を調節することができる理想的な薬物はまた、「オフターゲット」の望ましくない効果をあまり示さず、急速な腎クリアランスを示すであろう。典型的に、前記の望ましくない効果は、小分子化学物質を用いる際に顕在化し得る。例えば、別個のクラスのＶδ２＋細胞を調節できることが示されている（骨に対する一次的な調節効果に対する二次的効果として）前述のアミノビスホスホネートは、腎機能の悪化及び潜在的な腎不全として顕在化する腎毒性に関連する（例えば、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６４（１）：２８１－２８９）。Ｚｏｍｅｔａについて欧州医薬品庁が列挙した追加の望ましくない効果には、貧血、過敏反応、高血圧、心房細動、筋痛、全身痛、倦怠感、血中尿素増加、嘔吐、関節腫脹、胸痛などが含まれる。

【0012】

ｖδ１＋細胞自体が見出されるｉｎ ｓｉｔｕ環境についても更なる検討を行わなければならない。例えば、非造血組織常在性γδＴ細胞は、組織から最初に分離されたときに強力な増殖応答を示したが、これは自己由来の線維芽細胞と直接的に細胞が接触していない場合に限られたことが以前に示されている。非造血組織常在性Ｔ細胞（γδＴ細胞）が機能するためには非造血性細胞（例えば間質細胞、特に線維芽細胞）から分離されていなければならないことが見出されている。その理由は、リンパ球の間質細胞または上皮細胞との直接接触が組織常在性γδＴ細胞の増大を阻害すると思われるためである。ｉｎ ｓｉｔｕの活性化前の細胞が更に抑制された状態で存在するという観察は、ｖδ１細胞がこれまで有望な治療標的とみなされてこなかった別の理由である。実際、本明細書に記載される発見があるまで、血液及び組織のｖδ１＋細胞が「休止」、「活性化前」または「非活性化」状態と典型的にみなされる場合に、これらの細胞をｉｎ ｓｉｔｕで良好かつ選択的に調節し得る方法は考案されていない。

【0013】

様々なフォーマットの二重特異性抗体及び多特異性抗体が、種々の治療用途のために開発されてきた。二重特異性抗体及び多特異性抗体は、生物学的標的のタイプ及び作用様式に基づいて、重複するが別個のクラスに分けることができる。例えば、このような多特異性抗体は、細胞傷害性エフェクター細胞リダイレクター（二重特異性Ｔ細胞動員抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ＴＣＥ、またはＢｉＴＥとしても知られている）及びデュアル免疫調節薬（ｄｕａｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＤＩ）などのクラスに分けることができる。

【0014】

ＴＣＥは、Ｔ細胞を腫瘍細胞にターゲティングすることまたはその逆を行うことで、腫瘍に対する患者の免疫応答を増強することを意図しており、Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体の第１のエピトープ（通常はＣＤ３）と、がん抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのがん関連抗原である第２のエピトープとをターゲティングすることによって働く。このような抗体は、腫瘍細胞及びＴ細胞に共局在化して腫瘍細胞殺傷を促進する。ＢｉＴＥの例としては、ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体ブリナツモマブ、ＣＤ３×ＥｐＣＡＭ二重特異性抗体カツマキソマブ、及びＣＤ３×ＨＥＲ２二重特異性抗体エルツマキソマブが挙げられる。ＢｉＴＥなどのＴＣＥはｓｃＦｖフォーマットで提供されるのが一般的だが、他のフォーマットも提供されている。例えば、ＢｉＫＥはＢｉＴＥと類似しているが、ＣＤ３ではなくＮＫ細胞のＣＤ１６をターゲティングする。

【0015】

このＴ細胞受容体は、哺乳動物免疫系の受容体構造で最も複雑なものと説明されている。これは、いくつかのＣＤ３鎖に近接したＴ細胞受容体を含む膜貫通多タンパク質受容体複合体を含む。例えば、哺乳動物において、このような複合体の典型的なものは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、組み合わさったζ鎖（ゼータ鎖）と共にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合し、次いでＴリンパ球において典型的な活性化シグナルを生成する。しかしながら、代替的な複合体も報告されている。例えば、Ｔ細胞受容体及びゼータ鎖ホモ二量体を含むＴ細胞受容体複合体について説明されている。ＣＤ４及びＣＤ８など、追加の共受容体もＴＣＲ機能を補助することができる。

【0016】

受容体複合体の組成にかかわらず、前記複合体が細胞表面結合事象を細胞内リン酸化シグナル伝達カスケードに翻訳することは十分に確立されている。これらのリン酸化事象は、最終的に、サイトカインならびにグランザイム及びパーフォリンなどのエフェクタータンパク質の発現増加につながるＮＦＡＴ及びＮＦｋＢなどの転写因子の活性化をもたらす。しかしながら、このようなＴＣＥを使用してがんを処置するのは依然として説得力のある概念であるが、これまで、初期臨床開発においてＴＣＥを進展させようと３０年間の協調努力がなされた後でさえ、このような二重特異性抗体の多くは、さえない安全性、有効性、及び製造性プロファイルを示している。実際、２０２０年１月の時点で、承認後撤回されていないＴＣＥは依然としてブリナツモマブのみである。このＴＣＥ多特異性抗体断片は、Ｔ細胞受容体複合体と第１の結合アームで結合し、ＣＤ１９標的と第２の結合アームで結合する。

【0017】

二重特異性Ｔ細胞動員抗体は、Ｌｅｊｅｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：７６２に記述されている。しかしながら、このカテゴリにおける既存の二重特異性抗体、特にＣＤ３結合を介してＴ細胞を動員するものは、シグナル伝達因子としてのＣＤ３抗原の効力及び患者のＴ細胞集団におけるその遍在性を考慮すれば、重度の有害効果をもたらす著しいオフターゲット効果を有する。よって、カツマキソマブ（現在は撤回されている）などのＣＤ３ターゲティング二重特異性薬の例については、全身送達（例えば静脈内）は現実的に不可能である。代わりに、術中、腹腔内、腹内などのような、より制限された送達が、より頻繁に企図される。これにより、薬物としての前記二重特異性薬の選択可能性及び使用が限定される。実際、エフェクター減弱型の抗ＣＤ３抗体（すなわち、ＣＤ３ターゲティングＴ細胞複合体エンゲージャーだが二重特異性薬ではない）でさえ、関連する毒性によって静脈内（Ｉ．Ｖ．）送達が困難になる。例えば、曝露を限定し毒性を低減させるために、現在は、抗ＣＤ３抗体のフォラルマブが経口送達のために（例えば腸疾患の処置において）企図されることがほとんどである。

【0018】

初期臨床試験においてこのようなＴＣＥに関して観察される現在の問題の多くは、用いられる高親和性Ｔ細胞複合体結合ドメインに起因するものだとよく言われている。更に、その理由は、これらのＴＣＥの設計者が天然のＴＣＲ複合体結合事象の低い親和性を十分に考慮せず、重度の用量制限毒性が妨げとなり、治療域がきわめて狭くなったためであると提唱されている。これに関して、初期ＴＣＥ薬の開発者の多くが、ＯＫＴ３、ＳＰ３４、及びＵＣＨＴ１に由来する３つの抗ＣＤ３ Ｔ細胞複合体結合ドメインに依存したことが明らかになっている。そして、これらの元の結合ドメインはすべて、天然結合事象と比べてほぼ１，０００倍高い親和性に等しい、一桁から低い二桁のｎＭ範囲における比較的高い親和性で結合する。この結果、Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞受容体複合体の天然の結合と比較して著しく異なる（そして多くの場合で好ましくない）影響を受けると提唱されている。例えば、より親和性の高いＯＫＴ３に基づくプラットフォームを使用するＴＣＥ開発者は、ＯＫＴ３がＩＬ－２の存在下でＴ細胞のアポトーシスを誘導するということに困惑する可能性がある。

【0019】

これらの理由で、より低い親和性のＴ細胞複合体の結合は、Ｔ細胞と会合する二重特異性抗体治療薬の設計パラメータの決定に関する重要な検討事項であることが明らかになっている。

【0020】

前記ＴＣＥを設計する際の別の問題は、Ｆｃ機能を減弱させる必要性である。実際、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するＦｃの結合は免疫エフェクター細胞の活性化につながるので、ＴＣＥは、治療有効性を最大化してオフターゲット毒性を最小限に抑えるために、Ｆｃ媒介性エフェクター機能の完全な抑制を必要とすることが一般的である。実際のところ、現在臨床に用いられているＣＤ３ターゲティング二重特異性抗体の大多数は、ＦｃγＲに対する結合活性が低減したＦｃドメインを有するか、または意図的にＦｃ領域を含まない二重特異性断片である。一般的には、減弱されていないＦｃ機能を有するＴＣＥは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）効果を誘導し、それにより、抗体によって認識されるγδＴ細胞集団を枯渇させると予想されるであろう。しかしながら、また繰り返しになるが、毒性／安全性の複雑さを回避するためにこのような機能性を減弱させると、例えば、ＣＤ１６＋免疫細胞もしくはＣＤ３２＋免疫細胞もしくはＣＤ６４＋免疫細胞と会合することにより、または二重特異性薬（例えば、ＢＩＴＥなどのより小さな二重特異性抗体断片を用いる場合）の半減期が低減することにより、重要な可能性がある有効性の観点も減弱し得る。ＦｃγＲとＴＣＥとの相互作用を低減させる（例えば、前記相互作用を低減させるように設計されたＩｇＧフォーマットを使用する）方法は、ＴＣＥのＦｃ媒介性固定化を低減させるとともに、固定化されたＴＣＥとの架橋によってＴＣＲクラスター化を低減させると予想されるであろう。

【0021】

これらの問題点のすべてではないが一部に対処するために、Ｘｅｎｃｏｒ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）などの多くの企業が、それぞれのＴＣＥプラットフォームにおけるＴ細胞受容体複合体結合アームの結合親和性を低減させることをつい最近報告している。しかしながら、前記結合の親和性を低減させると、ＴＣＥの設計及び機能性に関して有効性の低下及び選択可能性の低下が生じ得る。例えば、このようなＴＣＥにおける結合ドメインの親和性はｉｎ ｖｉｖｏの分布プロファイルを駆動することが現在実証されている。具体的には、ＴＣＥの分布はその親和性の最も高い標的に偏っていることが通常観察される。よって、Ｔ細胞複合体に対するＴＣＥ結合ドメインの親和性を低減させると、まさにこのようなＴＣＥの有効性を駆動するために必要な細胞であるＴ細胞から分布の偏りが遠ざかることが一般的である。ＴＣＥの治療域が「きわめて狭い」と言われるのは、部分的にはこのような理由のためである。

【0022】

よって、より高い選択可能性をもたらし、Ｆｃドメインの非活性化もしくは減弱またはＴＣＲ複合体に対する特異的親和性に依存せず、有害副作用が低減したより安全な治療薬を提供するプラットフォームを含む、既存療法及び候補療法に関するこれらの問題に対処する向上したＴＣＥ型薬物が必要である。

【0023】

デュアル免疫調節薬抗体（ＤＩ）は、２つの異なる免疫調節性標的と結合する抗体である。免疫調節性標的は、例えば、免疫チェックポイント阻害薬ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ及びＶＩＳＴＡを含む（例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ，１８：１５５を参照のこと）。このクラスの化合物の典型例は、２つの免疫調節性シグナル伝達経路のターゲティングを組み合わせる。このようなＤＩの例は、典型的には少なくとも２つの結合ドメインを含み、両ドメインは、Ｔ細胞などの免疫細胞に存在する２つの別個の標的タンパク質または複合タンパク質にあるエピトープをそれぞれターゲティングする。これまで、免疫抑制性腫瘍微小環境を克服してそれを「コールド」から「ホット」に変えるのに役立ち、炎症誘発性サイトカインの蓄積及びＴ細胞の浸潤、ならびに腫瘍細胞の殺傷を促進する、少なくとも２つの免疫調節性標的をターゲティングするＤＩであって、そのような標的の１つがＴＣＲδ１鎖に対するものであるＤＩを生成することは、考案されることもなければ、実際に可能とみなされることもなかった。既存のＤＩアプローチは、併用療法に関連する高い毒性を低減させるまたは克服する（かつ、併用処置と比べて有効性を向上させる）試みにおいて研究されているが、その多くは注意深いモニタリングを必要とし、成功率はまちまちである。がんなどの状態を処置するための代替的な免疫調節性アプローチが依然として必要であり、本発明は、これまでに企図されなかったＤＩ抗体の全く新しく代替的なアプローチを提供する。

【0024】

よって、感染症、自己免疫状態、及びがんを処置するための向上した薬物、特に多特異性抗体及び二重特異性抗体が必要とされている。

【発明の概要】

【0025】

本発明は、γδＴ細胞及び別の抗原をターゲティングする多特異性抗体に関する。したがって、本発明の第１の態様では、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ（Ｖδ）鎖のエピトープである第１の標的エピトープ、及び第２の標的エピトープと特異的に結合する、多特異性抗体またはその断片が提供される。好ましい実施形態では、多特異性抗体は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである第１の標的エピトープ、及び第２の標的エピトープと結合する。

【0026】

本発明の多特異性抗体は、２つのクラスに分けることができる。１つ目は、Ｔ細胞エンゲージャーである多特異性抗体である。２つ目は、デュアル免疫調節薬である多特異性抗体である。

【0027】

したがって、本発明の第２の態様では、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープと特異的に結合する多特異性抗体が提供され、第１の標的エピトープは、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープであり、第２の標的エピトープは、がん抗原またはがん関連抗原のエピトープである。

【0028】

本発明の第３の態様では、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープと特異的に結合する多特異性抗体が提供され、第１の標的エピトープは、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープであり、第２の標的エピトープは、免疫調節性抗原のエピトープである。

【0029】

本発明の第４の態様では、本発明の多特異性抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。

【0030】

本発明の第５の態様では、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。本発明のポリヌクレオチド配列または本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。細胞培養培地中で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明の多特異性抗体またはその断片のいずれかを産生するための方法も提供される。

【0031】

本発明の更なる態様において、本発明の多特異性抗体またはその断片を含む組成物が提供される。本発明の多特異性抗体またはその断片と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む医薬組成物も提供される。

【0032】

本発明の更なる態様において、本発明の多特異性抗体もしくは断片または本発明の医薬組成物を含み、場合により使用説明書及び／または追加の治療活性剤を含むキットが提供される。

【0033】

本発明の更なる態様において、対象の疾患または障害を処置する方法であって、対象に、本発明の多特異性抗体もしくは断片、または本発明の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。対象の免疫応答を調節する方法であって、対象に、本発明の多特異性抗体もしくは断片、または本発明の医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。

【0034】

本発明の更なる態様において、本発明の多特異性抗体または断片を調製する方法に従って調製された抗体を用意することと、多特異性抗体を少なくとも１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体と合剤化することとを含む、医薬組成物を調製する方法が提供される。

【0035】

本発明の更なる態様において、本発明の多特異性抗体を生成する方法であって、第１の標的エピトープと特異的に結合する第１の単特異性抗体を選択するステップであって、第１の標的エピトープが、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである、選択するステップと、前記第１の抗体の抗体またはその抗原結合性断片を、第２のエピトープをターゲティングする結合ドメインを含む抗体またはその断片と組み合わせて、組換え多特異性抗体を生成するステップとを含む方法が提供される。

【0036】

本発明のなおも更なる態様では、医薬に使用するための、本発明の多特異性抗体もしくはその断片、または本発明の医薬組成物、または本発明のキットが提供される。薬物の製造における本発明の多特異性抗体またはその断片の使用も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】直接コーティングされた抗原の抗Ｖδ１Ａｂ（ＲＥＡ１７３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によるＥＬＩＳＡ検出。Ｖδ１ドメインを含有する抗原でのみ検出が見られた。ロイシンジッパー（ＬＺ）フォーマットはＦｃフォーマットよりも強力であるように見受けられ、これはセルベースのフロー競合アッセイと一致している（データは示していない）。

【図2】ＤＶ１選択のためのポリクローナルファージＤＥＬＦＩＡデータ。（Ａ）ヘテロ二量体選択：ラウンド１及び２でヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲフォーマット、両ラウンドでヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲの選択解除。（Ｂ）ホモ二量体選択：ラウンド１はホモ二量体Ｆｃ融合ＴＣＲを使用して行い、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを選択解除し、続いてラウンド２はヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲに対して行い、ヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲを選択解除した。各グラフには、異なるライブラリからの選択を表すために、各標的に対して２つのバーが含まれている。

【図3】ＩｇＧ捕捉：左）抗Ｌ１ ＩｇＧとＬ１との相互作用のセンサグラム、右）利用可能な場合の定常状態のフィット。実験はすべて室温にてＭＡＳＳ－２機器で行った。定常状態のフィッティングはＬａｎｇｍｕｉｒ １：１結合に従う。

【図4】クローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４、１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７及び１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５（Ａ）、またはクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６ １２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９、１１３８＿Ｐ０１＿Ｂ０９、１２５１＿Ｐ０２＿Ｇ１０及び１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（Ｂ）についてのＴＣＲ下方制御アッセイの結果。

【図5】クローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４、１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７及び１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５（Ａ）、またはクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９、１１３８＿Ｐ０１＿Ｂ０９、及び１２５１＿Ｐ０２＿Ｇ１０（Ｂ）についてのＴ細胞脱顆粒アッセイの結果。

【図6】クローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４、１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７及び１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５（Ａ）、またはクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９、１１３８＿Ｐ０１＿Ｂ０９、及び１２５１＿Ｐ０２＿Ｇ１０（Ｂ）についての殺傷アッセイ（ＴＨＰ－１フローベースのアッセイ）の結果。

【図7】実施例１０の実験１中の総細胞数。様々な濃度の本明細書に記載される抗Ｖδ１抗体と共に試料を培養し、コンパレータ抗体または対照と共に培養した試料と比較した。グラフは、（Ａ）７日目、（Ｂ）１４日目、及び（Ｃ）１８日目の総細胞数を示す。

【図8】実施例１０の実験１中のＶδ１ Ｔ細胞の分析。グラフは、１８日目の試料中の（Ａ）Ｖδ１ Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）Ｖδ１ Ｔ細胞数、及び（Ｃ）Ｖδ１変化倍率を示す。

【図9】実施例１０の実験２中の総細胞数。様々な濃度の本明細書に記載される抗Ｖδ１抗体と共に試料を培養し、コンパレータ抗体または対照と共に培養した試料と比較した。グラフは、（Ａ）７日目、（Ｂ）１１日目、（Ｃ）１４日目、及び（Ｄ）１７日目の総細胞数を示す。

【図10】実施例１０の実験２中のＶδ１ Ｔ細胞の分析。グラフは、１７日目の試料中の（Ａ）Ｖδ１ Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）Ｖδ１ Ｔ細胞数、及び（Ｃ）Ｖδ１変化倍率を示す。

【図11】細胞組成分析。実験２の１７日目に試料（非Ｖδ１細胞を含む）に存在する細胞型を測定した。細胞を採取し、Ｖδ１、Ｖδ２及びαβＴＣＲの表面発現についてフローサイトメトリーで分析した。パーセンテージ値は表７にも提示する。

【図12】ＳＹＴＯＸフロー殺傷アッセイ結果。ＳＹＴＯＸフロー殺傷アッセイを使用して細胞の機能性を試験し、（Ａ）１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比の細胞を使用した実験１の１４日目、ならびに（Ｂ）１：１及び１０：１のＥ：Ｔ比の細胞を使用した実験２の１７日目（凍結解凍後）について結果を提示している。

【図13】凍結解凍後の総細胞数。グラフは、凍結前にＢ０７、Ｃ０８、Ｅ０７、Ｇ０４またはＯＫＴ－３抗体と接触させた培養物についての凍結解凍後に細胞を７日間培養した後の総細胞数を示す。

【図14】細胞増大のモニタリング。凍結解凍後に培養した細胞について、総細胞数を４２日目までモニタリングした。

【図15】改変された抗Ｖδ１抗体の結合同等性研究。

【図16】ヒト生殖系Ｖδ１抗原及びその多型変異体に対する抗Ｖδ１抗体結合同等性研究。

【図17】抗Ｖδ１抗体は、Ｖδ１＋細胞のサイトカイン分泌レベルの上昇を付与した。組織由来γδＴ細胞を示されている抗体と共にインキュベートした。（Ａ）観察されたＴＮＦ－アルファのレベル。（Ｂ）観察されたＩＦＮ－ガンマのレベル。

【図18】抗Ｖδ１抗体は、Ｖδ１＋細胞グランザイムＢレベル／活性の上昇を付与した。がん細胞を、１時間にわたり、組織由来γδＴ細胞と一定の１：２０のＴ：Ｅ比で、かつ示されている抗体と共培養した。結果は、共培養終了時のがん細胞で検出されたグランザイムＢの量を明らかにしている。

【図19】抗Ｖδ１抗体は、ヒト組織における免疫細胞の調節及び増殖を付与した。ヒト皮膚パンチ生検（５名の異なるドナー由来）を、示されている抗体と共に培養下で２１日間インキュベートした。（Ａ）生存可能な汎γδ＋細胞の数。（Ｂ）生存可能なＶδ１＋細胞の数。（Ｃ）生存可能な二重陽性Ｖδ１＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージ。

【図20】抗Ｖδ１抗体は、ヒト腫瘍における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の調節及び増殖を付与した。腎細胞癌（ＲＣＣ）±抗体に関する研究。（Ａ）ＴＩＬ Ｖδ１＋細胞の増加倍率。（Ｂ）ＴＩＬ Ｖδ１＋細胞の総数。（Ｃ）ゲーティングストラテジーの例。（Ｄ）ＴＩＬ Ｖδ１＋細胞の細胞表面表現型プロファイルの比較。（Ｅ）ＴＩＬ Ｖδ１陰性でゲーティングした画分の分析。

【図21】抗Ｖδ１抗体は、Ｖδ１＋媒介性細胞傷害性及び疾患細胞特異的細胞傷害性の増強を付与した。Ｖδ１＋エフェクター細胞、ＴＨＰ－１単球性がん細胞、及び非疾患の健康な初代単球の三種培養を含むモデル系における細胞傷害性／効力アッセイ。（Ａ）抗Ｖδ１ ｍＡｂまたは対照の存在下のγδＴ細胞を用いる三重共培養下のＴＨＰ－１及び単球細胞の数の数量化。（Ｂ）疾患細胞の特異的殺傷と非疾患健康との間のウィンドウを強調する棒グラフ表現：左側の棒グラフ；非疾患細胞（初代ヒト単球）の殺傷と対比した疾患細胞（ＴＨＰ－１）の殺傷の増加倍率；右側の棒グラフ；同じデータだが、対照に対する殺傷増強率として表されている。（Ｃ）ＴＨＰ－１標的細胞±ｍＡｂのＶδ１＋エフェクター細胞殺傷効力の向上率をまとめた表形式の結果。（Ｄ）５０％のＴＨＰ－１細胞殺傷を付与するのに必要なγδＴ細胞数として表されている、図（Ａ）から計算されたＥＣ５０値の表形式の結果。

【図22】多特異性抗体は、Ｖδ１＋エフェクター細胞媒介性細胞傷害性の増強を付与した。組織中心疾患関連抗原のターゲティング：（Ａ～Ｄ）抗Ｖδ１ ＶＬ＋ＶＨ結合ドメイン（第１の標的に対する）を抗ＥＧＦＲ結合部位（第２の標的に対する）のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインと組み合わせた抗Ｖδ１×抗ＴＡＡ（ＥＧＦＲ）二重特異性結合部位を含む多特異性抗体ありまたはなし（＋／－）での、Ｖδ１＋エフェクター細胞とＡ－４３１がん細胞との共培養の例。（Ｅ～Ｈ）抗Ｖδ１結合ドメイン（第１の標的に対する）が完全長抗体（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３／ＶＬ－ＣＬ）を含み、次いで抗ＥＧＦＲセツキシマブ由来ｓｃＦｖ結合部位（第２の標的に対する）と組み合わさった、抗Ｖδ１×抗ＴＡＡ（ＥＧＦＲ）二重特異性結合部位を含む多特異性抗体ありまたはなしでの、Ｖδ１＋エフェクター細胞とＡ－４３１がん細胞との共培養の例。（Ｉ～Ｊ）データを表現する代替的なアプローチ：構成部分に対して相対的なＥＧＦＲ＋細胞に対するＶδ１＋エフェクター細胞傷害性に多特異性抗体が付与する向上のパーセンテージ。

【図23】多特異性抗体は、Ｖδ１＋媒介性細胞傷害性及び疾患細胞特異的細胞傷害性の増強を付与した。造血疾患関連抗原のターゲティング。（Ａ）５０％のＲａｊｉ細胞殺傷を誘導するのに必要なＥ：Ｔ比。（Ｂ）Ｖδ１－ＣＤ１９多特異性抗体の付加による向上のパーセンテージ。

【図24】抗Ｖδ１／ＣＤ１９二重特異性抗体は、親モノクローナルＶδ１ ｍＡｂに匹敵する、ヒトＶδ１及びカニクイザルＶδ１に対する高親和性結合を示す。Ｖδ１／ＣＤ１９二重特異性薬を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行い、ヒトＶδ１及びＣＤ１９抗原への結合を評価した。二重特異性抗体はヒト及びカニクイザルの両方のＶδ１と結合し、両抗原に対する親和性の低減はごくわずかである。

【図25】Ｖδ１－ＣＤ１９二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、健康なＣＤ１９＋Ｂ細胞を温存しながら、ＣＤ１９＋標的細胞傷害性及びγδＴ細胞の活性化を増強する。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された、がん性ＮＡＬＭ－６、Ｒａｊｉ、Ｂ細胞、及びＶδ１γδＴ細胞におけるＣＤ１９の発現。（Ｂ～Ｄ）ＮＡＬＭ－６細胞（Ｂ）、Ｒａｊｉ細胞（Ｃ）、及びＢ細胞傷害性（Ｄ）に対する抗Ｖδ１－ＣＤ１９ ＢｉＴＥの効果。１：１のＥ：Ｔ比のＶδ１γδＴ細胞の存在下で１２時間にわたって抗体を滴定した。生細胞率はハイコンテント共焦点顕微鏡法により計算し、Ｖδ１γδＴ細胞の非存在下での生細胞数に対して正規化した。（Ｅ）Ｖδ１γδＴ細胞を（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に提示したようにＶδ１ ＢｉＴＥ及び対照の存在下でＮＡＬＭ－６、ＲａｊｉまたはＢ細胞のいずれかと１２時間共培養した後の生細胞数のパーセントを表す棒グラフ。（Ｆ～Ｇ）４時間の共培養後にフローサイトメトリーによって決定された、ＮＡＬＭ－６標的細胞（Ｆ）及び健康なＢ細胞（Ｇ）の存在下でのＶδ１ ＴＣＲ表面発現に対するＶδ１－ＣＤ１９ ＢｉＴＥの効果。（Ｈ）最高濃度（３μｇ／ｍｌ）における（Ｆ）及び（Ｇ）に提示したＴＣＲ下方制御の最大率を表す棒グラフ。（Ｉ～Ｊ）４時間の共培養後にフローサイトメトリーによって決定された、ＮＡＬＭ－６標的細胞（Ｉ）及び健康なＢ細胞（Ｊ）の存在下でのＶδ１細胞表面におけるＣＤ１０７ａの上方制御に対するＶδ１－ＣＤ１９二重特異性薬の効果。（Ｋ）Ｂ細胞及びＮＡＬＭ－６細胞におけるＣＤ１０７ａの上方制御。すべてのデータは平均±標準偏差を示し、ｎ＝３の代表である。すべてのアッセイでブリナツモマブ（ＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ）を対照として含めた。

【図26】二重特異性フォーマットの親和性成熟Ｖδ１クローンは、Ｈｅｒ２^＋標的細胞に結合し、Ｖδ１γδＴ細胞への結合の増強、及びＨｅｒ２^＋標的細胞の細胞傷害性の増強を示す。乳癌細胞株及びＶδ１γδＴ細胞におけるＨｅｒ２（Ａ）及びＶδ１（Ｂ）の細胞表面発現。（Ｃ～Ｅ）Ｖδ１－Ｈｅｒ２二重特異性抗体及びＨｅｒ２ ｍＡｂ対照（トラスツズマブ）の、Ｈｅｒ２＋（ＳＫ－ＢＲ－３（Ｃ）、ＢＴ－４７４（Ｄ））、Ｈｅｒ２^－（ＭＤＡ－ＭＤ－２３１（Ｅ））、及びＶδ１^＋細胞（Ｆ）に対する結合。（Ｇ～Ｉ）Ｖδ１－Ｈｅｒ２二重特異性抗体の存在下にて、Ｖδ１γδＴ細胞及びＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｇ）、ＢＴ－４７４（Ｈ）、ならびにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（Ｉ）と１：１のＥ：Ｔ比で２４時間共培養した後に残存していた生細胞率。（Ｊ）２４時間後のＶδ１γδＴ細胞Ｖδ１－Ｈｅｒ２二重特異性抗体における細胞傷害性の増加率を表す棒グラフ。

【図27A】抗Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、ヒトＥＧＦＲへの高親和性結合及びその親ｍＡｂに匹敵するヒトＶδ１結合親和性を示す。Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性薬を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行い、ヒトＶδ１への結合を評価した。比較を目的として、親ｍＡｂ、セツキシマブ、及び陰性対照ｍＡｂを含めた。

【図27B】抗Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、ヒトＥＧＦＲへの高親和性結合及びその親ｍＡｂに匹敵するヒトＶδ１結合親和性を示す。Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性薬を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行い、ヒトＥＧＦＲ抗原への結合を評価した。比較を目的として、親ｍＡｂ、セツキシマブ、及び陰性対照ｍＡｂを含めた。

【図28】Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ＋Ａ４３１標的細胞及びＶδ１γδＴ細胞に結合する。（Ａ～Ｄ）Ａ４３１細胞株及び初代Ｖδ１γδＴ細胞におけるＥＧＦＲの細胞表面発現。（Ｅ、Ｆ）Ａ４３１細胞株または初代Ｖδ１γδＴ細胞への抗Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体による結合のレベル。標的細胞を様々な濃度の抗体で染色した後、蛍光抗ヒトＩｇＧ検出抗体で染色した。すべてのインキュベーションステップは４℃で行い、フローサイトメトリーを使用して蛍光レベル中央値を測定することでｍＡｂ結合を判定した。対数４パラメータ用量応答曲線のフィッティングはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して行った。

【図29】Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ特異的Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を誘導し、Ａ４３１標的細胞のγδＴ細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらす。（Ａ）Ａ４３１細胞の存在下または非存在下で二重特異性抗体と共に２４時間培養した後の初代Ｖδ１γδＴ細胞におけるγδＴＣＲの細胞表面発現。（Ｂ、Ｃ）様々な濃度の抗体と併せて１：１の比で２４時間共培養した後の生存可能なＡ４３１細胞の数（Ｂ）及び初代Ｖδ１γδＴ細胞の活性化状態。生存率は生死判別色素により測定し、活性化状態はＣＤ２５抗体を使用して測定した。（Ｄ）様々な濃度の抗体と併せて１：１の比でＡ４３１細胞と４時間共培養した後の初代Ｖδ１γδＴ細胞の脱顆粒。脱顆粒は、フルオロフォアにコンジュゲートした抗ＣＤ１０７α抗体を共培養開始時に細胞－抗体ミックスに直接加えることによって決定した。（Ｅ）１０ｐＭの抗体及び様々な量の初代Ｖδ１γδＴ細胞と２４時間共培養した後の生存可能なＡ４３１細胞の数。（Ａ～Ｅ）すべての場合において、蛍光レベル中央値を測定するためにフローサイトメトリーを使用して蛍光を決定した。対数４パラメータ用量応答曲線のフィッティングはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して行った。データは、２つの生物学的複製物の平均±ＳＤとして表されている。

【図30】ＣＤ３の下方制御。（Ａ）ｍＡｂ標的会合の指標としての抗体刺激時のｖδ１ ＴＣＲのＭＦＩを示す。（Ｂ）陽性ゲーティングされたｖδ１細胞におけるＣＤ３発現のＭＦＩを示す。ｖδ１抗体による刺激はｖδ１細胞を会合させ、ｖδ１細胞上のｖδ１及びＣＤ３の両方の下方制御をもたらした。

【図31】Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及びＦＡＰα^＋線維芽細胞の溶解を増強する。（Ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された、組換えヒトＶδ１及びＦＡＰαに対する、抗Ｖδ１、抗ＦＡＰαモノクローナル、及び抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体の結合動態を示す。（Ｂ、Ｃ）抗Ｖδ１抗体及び抗ＦＡＰα抗体の、ＦＡＰα^＋線維芽細胞（Ｂ）及びＶδ１γδＴ細胞（Ｃ）に対する結合。（Ｄ、Ｅ）ＦＡＰα^＋線維芽細胞の非存在下（Ｄ）または存在下（Ｅ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。（Ｆ～Ｇ）ＦＡＰα^＋線維芽細胞の非存在下（Ｆ）または存在下（Ｇ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＣＤ１０７ａの上方制御に対する、抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。（Ｈ）２４時間の共培養後のＶδ１γδＴ細胞による線維芽細胞の溶解に対する、抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。生細胞率はハイコンテント共焦点顕微鏡法により計算し、Ｖδ１γδＴ細胞の非存在下での生細胞数に対して正規化した。

【図32】Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及びＭＳＬＮ^＋標的細胞の溶解を増強する。（Ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された、組換えヒトＶδ１及びＭＳＬＮに対する、抗Ｖδ１、抗ＭＳＬＮモノクローナル、及び抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体の結合動態。（Ｂ、Ｃ）抗Ｖδ１抗体及び抗ＭＳＬＮ抗体の、ＭＳＬＮ^＋ＨｅＬａ細胞（Ｂ）及びＶδ１γδＴ細胞（Ｃ）への結合。（Ｄ、Ｅ）ＭＳＬＮ^＋ＯＶＣＡＲ－３細胞の非存在下（Ｄ）または存在下（Ｅ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体及びモノクローナル抗体の効果。（Ｆ、Ｇ）ＭＳＬＮ^＋ＯＶＣＡＲ－３細胞の非存在下（Ｆ）または存在下（Ｇ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＣＤ１０７ａの上方制御に対する、抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。（Ｈ）２４時間の共培養後のＶδ１γδＴ細胞によるＨｅＬａ細胞の溶解に対する、抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。生細胞率はハイコンテント共焦点顕微鏡法により計算し、Ｖδ１γδＴ細胞の非存在下での生細胞数に対して正規化した。

【図33】Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強し、ＰＤ－１^＋Ｔ細胞のチェックポイント遮断を阻害する。Ａ）組換えヒトＶδ１及びＰＤ－１に結合する、抗Ｖδ１、抗ＰＤ－１、抗ＲＳＶＩｇＧ対照×抗ＰＤ－１、及び抗Ｖδ１×抗ＰＤ－１二重特異性抗体のＳＰＲ分析。Ｂ）ＳＰＲによって決定された、組換えヒトＰＤ－１及びＶδ１に対する抗Ｖδ１及び抗ＰＤ－１二重特異性抗体の二重結合。Ｃ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現。Ｄ）ＰＤ－１^＋活性化ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞ならびにＶδ１γδＴ細胞に対する抗Ｖδ１及び抗ＰＤ－１抗体の結合。Ｅ）ＰＤ－１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞の非存在下または存在下でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。Ｆ）ＰＤ－１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞の存在下または非存在下でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体のＥＣ５０。Ｇ）ＰＤ－１^＋Ｔ細胞の活性化に対する、Ｖδ１架橋型抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体の効果。

【図34】Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞及び４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の活性化を増強する。Ａ）組換えヒトＶδ１及び４－１ＢＢに結合する、抗Ｖδ１、抗４－１ＢＢ、抗ＲＳＶＩｇＧ対照×抗４－１ＢＢ、及び抗Ｖδ１×抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＳＰＲ分析。Ｂ）ＳＰＲによって決定された、組換えヒト４－１ＢＢ及びＶδ１に対する抗Ｖδ１及び抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の二重結合。Ｃ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞における４－１ＢＢの発現。Ｄ）４－１ＢＢ^＋活性化ＣＤ８ Ｔ細胞及びＶδ１γδＴ細胞に対する抗Ｖδ１抗体及び抗４－１ＢＢ抗体の結合。Ｅ～Ｆ）４－１ＢＢ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の非存在下（Ｅ）または存在下（Ｆ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。Ｇ）４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の活性化に対する、Ｖδ１架橋型抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の効果。

【図35】Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞及びＯＸ４０^＋Ｔ細胞の活性化を増強する。Ａ）組換えヒトＶδ１及びＯＸ４０に結合する、抗Ｖδ１、抗ＯＸ４０、抗ＲＳＶＩｇＧ対照×抗ＯＸ４０、及び抗Ｖδ１×抗ＯＸ４０二重特異性抗体のＳＰＲ分析。Ｂ）ＳＰＲによって決定された、組換えヒトＯＸ４０及びＶδ１に対する抗Ｖδ１及び抗ＯＸ４０二重特異性抗体の二重結合。Ｃ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＯＸ４０の発現。Ｄ）ＯＸ４０^＋活性化ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶδ１γδＴ細胞に対する抗Ｖδ１及び抗ＯＸ４０抗体の結合。Ｅ～Ｆ）ＯＸ４０^＋ＣＤ４ Ｔ細胞の非存在下（Ｅ）または存在下（Ｆ）でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。Ｇ）ＯＸ４０^＋Ｔ細胞の活性化に対する、Ｖδ１架橋型抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体の効果。

【図36】Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強し、ＴＩＧＩＴ^＋Ｔ細胞のチェックポイント遮断を阻害する。Ａ）組換えヒトＶδ１及びＴＩＧＩＴに結合する、抗Ｖδ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＲＳＶＩｇＧ対照×抗ＴＩＧＩＴ、及び抗Ｖδ１×抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＳＰＲ分析。Ｂ）ＳＰＲによって決定された、組換えヒトＴＩＧＩＴ及びＶδ１に対する抗Ｖδ１及び抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の二重結合。Ｃ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現。Ｄ）ＴＩＧＩＴ^＋活性化ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞ならびにＶδ１γδＴ細胞に対する抗Ｖδ１及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合。Ｅ）ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の非存在下または存在下でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体及びモノクローナル対照の効果。Ｆ）ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞の存在下または非存在下でのＶδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する、抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＥＣ５０。Ｇ）ＴＩＧＩＴ^＋Ｔ細胞の活性化に対する、Ｖδ１架橋型抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の効果。

【図37】ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、抗ｖδ１抗体の結果としてＡＤＣＣを示さない。標的細胞、すなわちγδ細胞を、抗ｖδ１抗体、抗ｖδ１ ＬＡＧＡ抗体（Ｆｃ無効型）、及びＲＳＶアイソタイプ対照の存在下で、ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞と共にインキュベートした。発光シグナルは相対光単位（ＲＬＵ）として記録し、誘導倍率は方法に記載するように計算した。「抗ｖδ１抗体」、「抗ｖδ１ ＬＡＧＡ抗体」、「ＲＳＶ」、「ＯＫＴ３」についてはＮ＝２のγδドナー（技術的二連（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行った）。「リツキシマブ＋Ｒａｊｉ」条件（技術的二連）についてはＮ＝１のＲａｊｉ細胞株、「抗ｖδ１抗体＋エフェクター」及び「抗ｖδ１ ＬＡＧＡ抗体＋エフェクター」条件（それぞれ技術的二連及び単回（ｓｉｎｇｌｉｃａｔｅ）で行った）についてはｎ＝１のγδドナー。エフェクター：標的比は３：１。

【図38】Ｖδ１－ＣＤ１９二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、健康なＣＤ１９＋Ｂ細胞を温存しながら、ＣＤ１９＋標的細胞傷害性及びγδＴ細胞の活性化を増強する。Ａ～Ｆ）Ｒａｊｉ細胞または健康な初代Ｂ細胞のγδＴ細胞またはαβＴ細胞媒介性溶解に対する、抗Ｖδ１×ＣＤ１９及びＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体の効果。Ｒａｊｉ細胞または健康な初代Ｂ細胞の陽性率は、Ｖδ１γδＴ細胞とＲａｊｉ細胞（Ａ）及び健康な初代Ｂ細胞（Ｂ）の三種培養物；αβＴ細胞とＲａｊｉ細胞（Ｃ）及び健康な初代Ｂ細胞（Ｄ）の三種培養物；またはＶδ１γδＴ細胞及びαβＴ細胞とＲａｊｉ細胞（Ｅ）及び健康な初代Ｂ細胞（Ｆ）の四種培養物において、共焦点顕微鏡法によって２４時間時点で決定した。Ｇ～Ｉ）抗Ｖδ１×ＣＤ１９及びＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性抗体による刺激の２４時間後のγδＴ細胞またはαβＴ細胞からのＩＬ－１７Ａ分泌の数量化。Ｒａｊｉ細胞、初代Ｂ細胞、及びγδＴ細胞（Ｇ）；またはαβＴ細胞（Ｈ）；またはγδＴ細胞及びαβＴ細胞（Ｉ）の共培養物からの細胞培養上清を収集し、ＩＬ－１７Ａ分泌をＭＳＤによって決定した。点線は数量化の最低レベルを表す。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本発明は、可変デルタ鎖、例えばγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖、及び第２の抗原をターゲティングする、新たなクラスの多特異性抗体を提供する。第２の抗原は、例えば、がん抗原またはがん関連抗原（ＴＡＡなど）であり得、したがって本抗体は、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）と称され得る。あるいは、第２の抗原は、例えば、免疫調節性抗原であり得、したがって本抗体は、デュアル免疫調節性抗体であり得る。

【0039】

本発明のＴＣＥは、先行技術のＴＣＥと比べて幾つかの利点を提供する。特に、本件のＴＣＥは、全く新規かつ独特のメカニズムを介してＴ細胞受容体複合体をターゲティングすることにより、先行技術のＴＣＥに関連する課題の多くを克服し得る。実際、ＴＲＤＶ１ドメイン上のエピトープに結合することのみを介してＴ細胞受容体複合体を特異的にターゲティングする（及び活性化する）ことにより、以下を含む複数の利点が実現される：
・ すべてのＴ細胞ではなく一部のＴ細胞のみと会合する（例えば、がんの状況におけるＴ－ｒｅｇの会合は望ましくない場合がある）；
・ 主に「組織常在性」であり、その存在が、がん／腫瘍の状況において良好な予後と正に相関することが多い、一部のＴ細胞（ＴＲＤＶ１＋Ｔ細胞）のみと会合する；
・ ＴＲＤＶ１の会合を介してＴ細胞受容体複合体を活性化することによって、より高い選択可能性をもたらす（例えば、この結合ドメインの親和性を増加する）。例えば、ＣＤ３を介してではなく、ＴＲＤＶ１ドメインのみを介してＴ細胞受容体複合体と会合する組換えＴＣＥを開発することにより、増加した親和性が、より好ましい機能性を駆動し得る。例えば、高親和性ＴＲＤＶ１結合性ＴＣＥは、Ｔ細胞を消耗させずに活性化し得る；及び／または
・ 前記新規手段を介して、かつ組換えＴＲＤＶ１結合ドメインを介してＴＣＥ複合体と会合すると、有害効果が低下し得るので、前記ＴＣＥ部位におけるＦｃ機能性を減弱させる必要性が低減し得る。これは次いで、例えば、ＴＲＤＶ１ ＴＣＥに１つの結合ドメインを介してＴＲＤＶ１＋細胞と会合させること、第２の結合アームによって第２の細胞型（がん性細胞など）と会合すること、及び機能的なＦｃドメインを介してＣＤ１６＋免疫細胞またはＣＤ３２＋免疫細胞またはＣＤ６４＋免疫細胞のような他のエフェクター細胞と会合することにより、追加の選択可能性をもたらし得る。

【0040】

よって、本発明者らは、本明細書に記載される発見を通して、新規のクラスの組換えＴＣＥを生成した。具体的には、本発明者らは、前記Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体における他のドメインではなくＴＲＤＶ１ドメインを介してＴ細胞受容体と会合する新たなクラスのＴＣＥを発見した。より具体的には、本発明者らは、ＴＲＤＶ１の活性化エピトープを介してこの複合体と会合し、以前に報告されている高親和性Ｔ細胞受容体複合体の会合に関連した有害効果の一部を付与する可能性がなく、より高い親和性で結合し得る新たなクラスのＴＣＥを発見した。更に、この新たなクラスのＴＣＥは、野生型Ｆｃの機能性も許容し得るかたちで会合することができ、それにより、追加の有効性の可能性ももたらされる。

【0041】

本発明のＤＩは、全くユニークなデュアル免疫調節性標的会合の完全に新規の方法を提供し、がんなどの免疫調節を必要とする広範な新規療法の可能性を提供する。本発明のＤＩプラットフォームは、既存のＤＩアプローチに対する重要な代替または改良をもたらし得る新たなクラスの治療薬を提供する。以前には、本明細書に記載されるＴＲＤＶ１特異的結合機能がＤＩフォーマットに組み込まれ得るとは企図されていなかった。

【0042】

本発明の多特異性抗体は、同等の単特異性抗体と比較して向上した特性を呈する可能性もある。例えば、本発明の多特異性抗体は、多特異性抗体の構成部分と同じ抗原結合ドメインを有する単特異性抗体と比較して向上した特性を呈する可能性もある。一部の実施形態において、例えば、組換え多特異性抗体は、第２のエピトープを発現する疾患細胞に対して、同等量の前記第１の単特異性抗体によって付与される細胞傷害性と比較して増加したガンマデルタＴ細胞媒介性細胞傷害性を付与する。本発明の多特異性抗体はまた、依然として健康細胞を温存しながらも、疾患細胞に対する向上した細胞傷害性を呈し得る。

【0043】

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、下記のそれぞれ与えられる意味を有する。

【0044】

ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、表面に別個の典型的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の小さなサブセットを表す。このＴＣＲは、１つのガンマ（γ）鎖及び１つのデルタ（δ）鎖から構成されている。各鎖には、可変（Ｖ）領域、定常（Ｃ）領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部が含まれている。Ｖ領域には、抗原結合部位が含まれている。ヒトγδＴ細胞には２つの主要なサブタイプがあり、１つは末梢血で優勢であり、もう１つは非造血組織で優勢である。２つのサブタイプは、細胞に存在するδ及び／またはγの種類によって定義され得る。例えば、末梢血で優勢であるγδＴ細胞は、デルタ可変２鎖（Ｖδ２）を主に発現する。非造血組織で優勢である（すなわち組織常在性である）γδＴ細胞は、デルタ可変１鎖を主に発現する。「Ｖδ１ Ｔ細胞」または「Ｖδ１＋Ｔ細胞」への言及は、Ｖδ１鎖を有するγδＴ細胞、すなわちＶδ１^＋細胞を指す。

【0045】

「デルタ可変１」への言及は、Ｖδ１またはＶｄ１と称されることもあり、この領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＤＶ１」と称されることがある。γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖδ１に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲデルタ可変１抗体またはその断片」または「抗Ｖδ１抗体またはその断片」または「抗ＴＲＤＶ１抗体またはその断片」または「抗ＴＲＤＶ１抗体またはその断片」と称され得る。

【0046】

本明細書では、「デルタ可変２」鎖などの他のデルタ鎖にさらに言及する。これらは同様な様式で称され得る。例えば、デルタ可変２鎖は、Ｖδ２と称されることがあり、この領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、「ＴＲＤＶ２」と称されることがある。好ましい実施形態において、γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片は、Ｖδ２のような他のデルタ鎖とは相互作用しない。本発明において、抗体は、ＴＲＤＶ１に特異的であり、ＴＲＤＶ２（配列番号１７４）またはＴＲＤＶ３（配列番号１７５）のような他の抗原には結合しない。

【0047】

本明細書では、「ガンマ可変鎖」への言及もなされる。これらは、γ鎖またはＶγと称されることがあり、この領域を含有するＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチド、またはこの領域を含むＴＣＲタンパク質複合体は、ＴＲＧＶと称されることがある。例えば、ＴＲＧＶ４は、Ｖγ４鎖を指す。好ましい実施形態において、γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片は、Ｖγ４（ＴＲＧＶ４、配列番号１７３）などのガンマ鎖とは相互作用しない。好ましい実施形態では、抗体は、ＴＲＤＪ、ＴＲＤＣ、ＴＲＧＪまたはＴＲＧＣなど、γδＴＣＲ内に見出される他のドメインと結合することも相互作用することもない。

【0048】

「Ｔ細胞受容体複合体」という用語は、種々の抗原を認識することに関与するＴ細胞の表面に見出される「Ｔ細胞受容体」（または「ＴＣＲ」）を含むタンパク質の複合体である。Ｔ細胞受容体複合体の正確な構成は様々であり得るが、Ｔ細胞受容体複合体は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖及びベータ鎖を含むか、またはガンマデルタＴ細胞の場合には、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖及びデルタ鎖、ならびに最大６本またはそれ以上の追加の鎖、例えばＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζを含むかのいずれかである。Ｔ細胞受容体複合体は、Ｔ細胞活性化につながり得る、Ｔ細胞における細胞内シグナル伝達を媒介する。

【0049】

「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含む、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む、任意の抗体タンパク質構築物を含む。抗体は、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（及びそれらのサブタイプ）の免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない。２つの同一の重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てられた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の全体的な構造は十分に確立されており、哺乳動物で高度に保存されている（Ｐａｄｌａｎ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７）。

【0050】

従来の抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各鎖は、定常領域と可変ドメインに分割される。重（Ｈ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＨと略され、軽（Ｌ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＬと略される。これらのドメイン、それに関連するドメイン及びそれに由来するドメインは、本明細書では免疫グロブリン鎖可変ドメインと称され得る。ＶＨドメイン及びＶＬドメイン（ＶＨ領域及びＶＬ領域とも称される）は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と称されるより保存されている領域と共に散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される領域に更に分割され得る。フレームワーク領域及び相補性決定領域は、明確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ９１－３２４２）。ＣＤＲ配列には、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３に提示されているもの、またはＩＭＧＴ．ｏｒｇによってまとめられているもののような、代替的な番号付け規則もある。従来の抗体において、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖をもつ従来の抗体四量体は、例えばジスルフィド結合によって相互接続された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖、ならびに同様に接続された重鎖で形成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから成る。重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインである。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。

【0051】

本明細書で使用する場合、抗体の断片（「抗体断片」、「免疫グロブリン断片」、「抗原結合性断片」または「抗原結合性ポリペプチド」とも称され得る）は、標的であるγδＴ細胞受容体のデルタ可変１（Ｖδ１）鎖に特異的に結合する抗体の一部（または前記一部を含有する構築物）（例えば、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが標的に特異的に結合する分子）を指す。抗体断片という用語に包含される結合性断片の例には、以下が含まれる。
（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂ断片からなる二価の断片）、
（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖ）一本鎖可変断片ｓｃＦｖ（組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価の分子を形成する１本のタンパク質鎖になることを可能にする合成リンカーによって結合したＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖｉ）ＶＨ（ＶＨドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉ）ＶＬ（ＶＬドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかからなる）、
（ｉｘ）ミニボディ（ＣＨ３ドメインを介して連結された一対のｓｃＦｖ断片からなる）、
（ｘ）ダイアボディ（１つの抗体のＶＨドメインが小さなペプチドリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに接続されたものからなるｓｃＦｖ断片の非共有結合二量体からなる）。

【0052】

本明細書で言及される多特異性抗体の断片は、抗原結合性断片である。より具体的には、多特異性抗体の抗体断片は、完全な多特異性抗体が結合するものと同じ抗原と結合する。例えば、ＴＲＤＶ１及び第２の抗原と特異的に結合する多特異性抗体の断片も、ＴＲＤＶ１及び同じ第２の抗原と特異的に結合する。

【0053】

「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。前記ヒト抗体を投与されたヒト対象は、前記抗体内に含有される一次アミノ酸に対する種間抗体応答（例えば、ＨＡＭＡ－ヒト抗マウス抗体－応答と称される）を生成しない。前記ヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発または体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、この用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図していない。宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体など、組換え手段により調製、発現、作出もしくは単離されたヒト抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段により調製、発現、作出もしくは単離された抗体は、「組換えヒト抗体」とも称され得る。

【0054】

非ヒト免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域における少なくとも１つのアミノ酸残基をヒト可変ドメイン由来の対応する残基で置換することは、「ヒト化」と称される。可変ドメインのヒト化は、ヒトにおける免疫原性を低下させ得る。

【0055】

「特異性」とは、特定の抗体またはその断片が結合できる異なるタイプの抗原または抗原決定基の数を指す。抗体の特異性は、特定の抗原を固有の分子実体として認識し、それを別の抗原と区別する抗体の能力である。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野でよく理解されている用語である。分子が、他の標的との反応よりも特定の標的抗原またはエピトープとより頻繁に、より迅速に、より持続的に及び／またはより高い親和性で反応する場合、前記分子は「特異的結合」を示すと言われる。抗体が標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」のは、それが他の物質に結合するより高い親和性で、より高いアビディティで、より容易に、及び／またはより高い持続性で結合する場合である。

【0056】

本発明の抗体は多特異性抗体である。「多特異性抗体」は、複数の異なるエピトープに同時にまたは連続的に結合することができる抗体である。一般に、これらのエピトープは同じ抗原に存在しない。よって、多特異性抗体は、複数の異なる結合ドメインを介して異なる抗原に存在するエピトープに選択的に結合する能力を有する。これは、この能力を有しない従来の単特異性抗体とは対照的である。むしろ、「単特異性抗体」は、１つの抗原に特異的な結合性のみを有する。ただし、この１つの抗原に対して複数の結合部位を有してもよい（例えば、完全ヒトＩｇＧ抗体の結合価は２であり、他の抗体の結合価はより高い場合があるが、抗体が１つの抗原しか認識しない場合、これは依然として単特異性抗体と分類される）。よって、本発明の多特異性抗体は、複数の異なる抗原と同時に及び／または連続的に結合する。

【0057】

本発明の好ましい実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。「二重特異性抗体」は、２つの異なるエピトープと同時に及び／または連続的に結合することができる抗体である。一般に、これらのエピトープは同じ抗原に存在しない。よって、二重特異性抗体は、２つの異なる結合ドメインを介して２つの異なる抗原に存在する２つの異なるエピトープに選択的に結合する能力を有する。これは、この能力を有しない従来の単特異性抗体とは対照的である。よって、本発明の二重特異性抗体は、２つの異なる抗原と同時に及び／または連続的に結合する。

【0058】

抗原と抗原結合性ポリペプチドとの解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される「親和性」とは、抗原決定基と抗体（またはその断片）上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である。ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合性ポリペプチドとの間の結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、親和定数（ＫＡ）、１／ＫＤとして表すこともできる。親和性は、目的の特定の抗原に応じて、公知の方法で決定することができる。例えば、ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。

【0059】

１０^－６未満のＫＤ値はいずれも、結合を示すとみなされる。抗原または抗原決定基に対する抗体またはその断片の特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば蛍光アッセイを使用する）、ならびに当技術分野で公知のこれらの様々な変形を含む、任意の好適な公知の様式で決定することができる。

【0060】

「アビディティ」は、抗体またはその断片と、関連する抗原との間の結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗体上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗体上に存在する適切な結合部位の数の両方に関連している。

【0061】

「ｉｎ ｓｉｔｕ」は、別の場所に移されるのではなく、天然または元の場所にあることを意味する。例えば、患者においてｉｎ ｓｉｔｕのＶδ１＋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの細胞ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏのｖδ１細胞を指す。

【0062】

「ヒト組織Ｖδ１＋細胞」、ならびに「造血及び血液Ｖδ１＋細胞」及び「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）Ｖδ１＋細胞」は、それぞれヒト組織もしくは造血血液系もしくはヒト腫瘍のいずれかに含まれる、またはそれらに由来するＶδ１＋細胞と定義される。すべての前記細胞型は、それらの（ｉ）位置またはそれらの由来、及び（ｉｉ）Ｖδ１＋ＴＣＲのそれらの発現によって同定することができる。

【0063】

「調節性抗体」は、抗体が結合する標的を発現する細胞に接触または結合すると、細胞周期、及び／または細胞数、及び／または細胞生存率、及び／または１つもしくは複数の細胞表面マーカー、及び／または１つもしくは複数の分泌性分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエンなど）の分泌、及び／または機能（標的細胞または疾患細胞に対する細胞傷害性など）における測定可能な変化を含むがこれらに限定されない、測定可能な変化を付与する抗体である。細胞またはその集団を「調節する」方法とは、前記細胞もしくは複数の細胞またはそれらからの分泌における少なくとも１つの測定可能な変化が誘起されて、１つまたは複数の「調節された細胞」を生成する方法を指す。

【0064】

「免疫応答」は、調節性抗体の付加に応じた、免疫系の少なくとも１つの細胞、または１つの細胞型、または１つの内分泌経路、または１つの外分泌経路における測定可能な変化である（細胞媒介性応答、体液性応答、サイトカイン応答、ケモカイン応答を含むがこれらに限定されない）。

【0065】

「免疫細胞」は、ＣＤ３４＋細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４５＋（リンパ球共通抗原）細胞、アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、形質細胞、好中球、単球、マクロファージ、赤血球、血小板、樹状細胞、食細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系の細胞と定義される。典型的には、コンビナトリアル細胞表面分子分析を用いて（例えば、フローサイトメトリーにより）免疫細胞を分類して、免疫細胞を同定する、または亜集団にグループ分けもしくはクラスター化して区別する。これらは次いで、追加の分析によってなおも更に細分され得る。例えば、ＣＤ４５＋リンパ球は、ｖδ陽性集団とｖδ陰性集団とに更に細分され得る。

【0066】

「モデル系」は、抗体またはその断片などの医薬がどのように疾患の徴候または症状の改善において薬物として機能し得るかについての理解を助けるように設計された生物学的モデルまたは生物学的表現である。このようなモデルは通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏの疾患細胞、非疾患細胞、健康細胞、エフェクター細胞、及び組織などの使用を含み、前記薬物の性能を研究し比較する。

【0067】

「疾患細胞」は、がんなどの疾患、ウイルス感染などの感染、または炎症性状態もしくは炎症性疾患の進行に関連する表現型を示す。例えば、疾患細胞は、腫瘍細胞、自己免疫組織、またはウイルスに感染した細胞であり得る。したがって、前記疾患細胞は、腫瘍状のもの、またはウイルスに感染したもの、または炎症性のものと定義され得る。

【0068】

「健康細胞」は、病的ではない正常細胞を指す。これらは「正常」細胞または「非疾患」細胞とも称され得る。非疾患細胞には、非がん性細胞、または非感染細胞、または非炎症性細胞が含まれる。前記細胞は、薬物によって付与される疾患細胞特異性を決定するため及び／または薬物の治療指数をよりよく理解するために、関連性のある疾患細胞と共に用いられることが多い。

【0069】

「疾患細胞特異性」は、エフェクター細胞またはその集団（例えば、Ｖδ１＋細胞集団など）が、非疾患細胞または健康細胞を温存しながら、がん細胞などの疾患細胞を区別し殺傷するのに、どれほど効果的であるかの尺度である。この能力はモデル系で測定することができ、エフェクター細胞またはエフェクター細胞集団が疾患細胞を選択的に殺傷または溶解する傾向を、前記エフェクター細胞が非疾患細胞または健康細胞を殺傷または溶解する能力に対して比較することを含み得る。前記疾患細胞特異性は、薬物の潜在的な治療指数についての情報を提供し得る。

【0070】

「増強された疾患細胞特異性」は、疾患細胞を特異的に殺傷する能力を更に増加させるように調節されている、例えばＶδ１＋細胞などのエフェクター細胞またはその集団の表現型を表す。この増強は、疾患細胞の殺傷の特異性または選択性における、変化倍率または増加のパーセンテージを含む種々のかたちで測定することができる。

【0071】

「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」は、細胞の表面抗原に結合した抗体でコーティングされた細胞に対する免疫応答を表す。これは、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞など）が、細胞に結合した抗体を認識し、標的細胞の脱顆粒及び溶解を誘起する、細胞媒介性プロセスである。通常、これはＦｃ－Ｆｃγ相互作用によって媒介される。細胞に結合した抗体のＦｃ領域が、Ｆｃγ受容体を発現するエフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）を動員し、エフェクター細胞の脱顆粒及び標的細胞の死をもたらす。

【0072】

「Ｆｃ有効型」とは、機能的Ｆｃ領域（断片結晶化可能領域）、すなわち突然変異または別の方法で無効化されていないＦｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ有効型抗体は、減弱されていないＦｃ機能を示す。Ｆｃ有効型抗体は、１つまたは複数のＦｃガンマ受容体に対する結合を低減させるように改変されても工学操作されても構築されてもいない、ＩＭＧＴに収載されているヒトＩＧＨＣ重鎖配列を含み得る。例えば、ＩＧＨＣヒンジ突然変異を介するか、またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２ＡもしくはＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＩＧＨＣ配列のキメラもしくはハイブリッドである重鎖定常ドメインを含む抗体の構築による。好適には、本発明の抗体またはその断片（すなわちポリペプチド）は単離されている。「単離された」ポリペプチドは、元の環境から除去されたものである。「単離された」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すように使用され得る（例えば、Ｖδ１と特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、Ｖδ１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離された」という用語は、単離された抗体が、医薬組成物の活性成分として配合された場合、治療的に投与されるのに十分な純度である、または少なくとも７０～８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは、少なくとも８０～９０％（ｗ／ｗ）の純度、更により好ましくは、９０～９５％の純度、かつ、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）の純度である調製物を指すように使用されることもある。

【0073】

好適には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドは、元の環境から除去されたものである。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは、それが天然系で共存する材料のいくつかまたはすべてから分離されている場合に単離されている。ポリヌクレオチドは、例えば、それがその自然環境の一部ではないベクターにクローン化されている場合、またはそれがｃＤＮＡ内に含まれている場合、単離されたとみなされる。

【0074】

抗体またはその断片は、天然に存在する対立遺伝子変異体及び突然変異体またはあらゆる他の天然に存在しない変異体も含む「機能的に活性な変異体」であり得る。当技術分野では公知であるように、対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有することを特徴とする（ポリ）ペプチドの代替形態である。非限定的な例として、ＣＤＲを含有するフレームワークが改変されても、ＣＤＲ自体が改変されても、前記ＣＤＲが代替のフレームワークにグラフトされても、またはＮ末端もしくはＣ末端の伸長が組み込まれても、前記機能的に活性な変異体は依然として機能し得る。更に、ＣＤＲ含有結合ドメインは、別の抗体と共有されるものなどの異なるパートナー鎖と対になっていてもよい。いわゆる「共通」軽鎖または「共通」重鎖と共有されても、前記結合ドメインは依然として機能し得る。更に、前記結合ドメインは、多量体化されたときに機能し得る。更に、「抗体またはその断片」には、ＶＨもしくはＶＬもしくは定常ドメインが異なるカノニカル配列（例えば、ＩＭＧＴ．ｏｒｇに収載されているもの）から離れるように、またはそれに近づくように改変されており、かつ依然として機能する機能的変異体も含まれ得る。

【0075】

２つの密接に関連するポリペプチド配列を比較する目的で、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「％の配列同一性」は、ポリペプチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＰ）を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を使用して計算され得る。２つの密接に関連するポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「％の配列同一性」は、ヌクレオチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＮ）を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を使用して計算され得る。

【0076】

ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性を共有する場合、他のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と同じまたは「同一」であると言われる。配列内の残基は、左から右に、すなわちポリペプチドの場合はＮ末端からＣ末端に、ポリヌクレオチドの場合は５’末端から３’末端に番号が付けられる。

【0077】

一部の実施形態において、配列の任意の特定の％の配列同一性は、抗体の６つすべてのＣＤＲの配列なしで計算される。例えば、抗Ｖδ１抗体またはその抗原結合性断片は、特定の可変重鎖領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する可変重鎖領域配列、及び／または特定の可変軽鎖領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する可変軽鎖領域配列を含み得、あらゆるアミノ酸変異は、可変重鎖領域配列及び可変軽鎖領域配列のフレームワーク領域でのみ発生する。そのような実施形態において、ある特定の配列同一性を有する抗Ｖδ１抗体またはその抗原結合性断片は、対応する抗Ｖδ１抗体またはその抗原結合性断片の完全な重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を保持する。

【0078】

配列間の「差異」とは、第１の配列と比較した、第２の配列のある位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す。２つのポリペプチド配列は、１つ、２つまたはそれ以上のそのようなアミノ酸の差異を含むことができる。第１の配列と他の点では同一である（１００％の配列同一性）第２の配列における挿入、欠失または置換により、配列同一性の割合が減少する。例えば、同一の配列が９アミノ酸残基長である場合、第２の配列における１つの置換により、配列同一性が８８．９％になる。第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列が９のアミノ酸残基長であり、６の同一の残基を共有する場合、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６％を超える同一性を共有する（第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６．７％の同一性を共有する）。

【0079】

あるいは、第１の参照ポリペプチド配列を第２の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第２の配列を生成するために第１の配列に対して行われた付加、置換及び／または欠失の数は確認され得る。「付加」とは、第１のポリペプチドの配列への１つのアミノ酸残基の付加である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む）。「置換」とは、第１のポリペプチドの配列における１つのアミノ酸残基を１つの異なるアミノ酸残基で置換することである。前記置換は、保存的でも非保存的でもよい。「欠失」とは、第１のポリペプチドの配列からの１つのアミノ酸残基の欠失である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む）。

【0080】

三文字コード及び一文字コードを使用すると、天然に存在するアミノ酸は、次のように称され得る：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）及びスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸またはアスパラギンであり得る場合、記号ＡｓｘまたはＢが使用され得る。残基がグルタミン酸またはグルタミンであり得る場合、記号ＧｌｘまたはＺが使用され得る。残基が任意のアミノ酸であり得る場合、記号ＸａａまたはＸが使用され得る。文脈上別段の定めがない限り、アスパラギン酸への言及にはアスパラギン酸塩が含まれ、グルタミン酸にはグルタミン酸塩が含まれる。

【0081】

「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられ、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど影響を及ぼさないと予想されるアミノ酸置換である。そのような保存的置換は、好適には、以下の群内の１つのアミノ酸が同じ群内からの別のアミノ酸残基によって置換される置換である。

【表1】

【0082】

好適には、疎水性アミノ酸残基は非極性アミノ酸である。より好適には、疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＣから選択される。一部の実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから選択される。

【0083】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド配列の番号付けならびにＣＤＲ及びＦＲの定義は、文脈で示されるように、ＥＵ及び／またはＩＭＧＴの番号付けシステムに従って定義されるとおりである。第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「対応する」アミノ酸残基は、文脈で示されるように、第２の配列におけるアミノ酸残基と、ＥＵ及び／またはＩＭＧＴの番号付けシステムに従って同じ位置を共有する、第１の配列親和性のアミノ酸残基であり、一方で第２の配列におけるアミノ酸残基は、第１の配列とは同一性が異なる場合がある。好適に対応する残基は、フレームワーク及びＣＤＲがＥＵまたはＩＭＧＴの定義に従って同じ長さである場合、同じ番号（及び文字）を共有する。アラインメントは、手作業で、または例えば、標準設定を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮ）などの配列アラインメントのための公知のコンピューターアルゴリズムを使用することによって達成することができる。

【0084】

本明細書での「エピトープ」への言及は、抗体またはその断片によって特異的に結合される標的の一部を指す。エピトープは「抗原決定基」とも称され得る。抗体は、両方が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、別の抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同一または重複するエピトープに結合するかどうかを判断するために一般的に使用される方法は、競合アッセイである。これは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して複数の様々なフォーマットで構成され得る（例えば、放射性標識もしくは酵素標識を使用したウェルプレート、または抗原発現細胞でのフローサイトメトリー）。抗体が別の抗体と「同じエピトープ」と結合するのは、両抗体が同一のエピトープを認識する（すなわち、抗原と抗体との間のすべての接触点が同じである）場合である。例えば、抗体／抗原架橋結合ＭＳ、ＨＤＸ、Ｘ線結晶解析、クライオ電子顕微鏡、または突然変異誘発などの特性評価法を用いて、抗原の特定領域におけるすべての接触点が同じであると同定された場合、抗体は別の抗体と同じエピトープと結合し得る。

【0085】

更に、このような特性評価法を用いて、同一の接触点のすべてではないがいくつかを認識することによって、本質的に同じエピトープと結合する抗体を特性評価することも可能である。具体的には、このような抗体は、特定の抗原領域において十分な数の同一の接触点を共有して、ほぼ同等の技術的効果及び／または同等の抗原相互作用の選択性を提供し得る。更に、抗体が本質的に同じエピトープを認識し、ほぼ同等の技術的効果及び／または相互作用の選択性を付与するいくつかの場合において、最Ｎ末端の抗原接触点から最Ｃ末端の抗原接触点までを含む抗原接触の全体によってエピトープ結合フットプリントを定義することも有用であり得る。

【0086】

タンパク質標的に見られるエピトープは、「線状エピトープ」または「配座エピトープ」として定義され得る。線状エピトープは、タンパク質抗原のアミノ酸の連続配列によって形成される。配座エピトープは、タンパク質配列が不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折りたたまれると一緒になるアミノ酸で形成されている。

【0087】

本明細書で使用する場合「ベクター」という用語は、核酸分子であって、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すよう意図されている。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターならびにエピソーム哺乳動物ベクター及び酵母ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、ならびにバクテリオファージ及びファージミド系など、このような他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図されている。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、例えば、そのような細胞の子孫が、細胞株または細胞バンクを作るために用いられ、次いで細胞株または細胞バンクが、本明細書に記載される抗体もしくは多特異性抗体またはそれらの断片を製造するために場合により貯蔵、提供、販売、譲渡、または利用される場合、前記子孫も指すことを意図している。

【0088】

「対象」、「患者」または「個体」への言及は、処置される対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（ウシなど）、スポーツ用動物、または愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラットまたはマウスを含む。一部の実施形態において、対象はヒトである。代替的な実施形態において、対象はマウスなどの非ヒト哺乳動物である。

【0089】

「十分な量」という用語は、所望の効果を生成するのに十分な量を意味する。「治療上有効な量」という用語は、疾患または障害の症状を改善するのに有効な量である。予防は療法とみなすことができるため、治療上有効な量は「予防上有効な量」であり得る。

【0090】

疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、このような徴候もしくは症状が対象によって経験される頻度、またはその両方が減少した場合、疾患または障害は「改善」されている。

【0091】

本明細書で使用する場合、「疾患または障害を処置すること」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度及び／または重症度を低減させることを意味する。

【0092】

本明細書で使用する場合、「がん」とは、細胞の異常な増殖または分裂を指す。一般的に、がん細胞の増殖及び／または寿命は、その周囲の正常な細胞及び組織の増殖及び／または寿命を超えており、協調していない。がんは、良性、前悪性または悪性であり得る。がんは、口腔（例えば、口、舌、咽頭など）、消化器系（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肝臓、胆管、胆嚢、膵臓など）、呼吸器系（例えば、喉頭、肺、気管支など）、骨、関節、皮膚（例えば、基底細胞、扁平細胞、髄膜腫など）、乳房、生殖器系、（例えば、子宮、卵巣、前立腺、精巣など）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿管など）、眼、神経系（例えば、脳など）、内分泌系（例えば、甲状腺など）、及び造血系（例えば、リンパ腫、骨髄腫、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）を含む、種々の細胞及び組織において発生する。

【0093】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用されるときの「約」という用語には、指定された値より最大１０％大きくこれを含む値及び最大１０％低くこれを含む値が含まれ、好適には指定された値より最大５％大きくこれを含む値及び最大５％低くこれを含む値が含まれ、特に指定された値が含まれる。「間」という用語には、指定された境界の値が含まれる。

【0094】

多特異性抗体またはその断片
本明細書では、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ可変１鎖（Ｖδ１）、及び別の抗原に特異的に結合することができる、多特異性（好適には二重特異性）抗体またはその断片が提供される。本発明は、処置される対象に投与するための薬物としての前記多特異性抗体の使用に関する。

【0095】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えばＶＨまたはＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディまたはモノクローナル抗体である。更なる実施形態において、抗体またはその断片はｓｃＦｖである。

【0096】

本発明の多特異性抗体は、任意の種類、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはこれらのアイソタイプであり得、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含むことができる。一実施形態において、多特異性抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、アイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの少なくとも１つである。更なる実施形態において、多特異性抗体は、エフェクター機能を低減させる、半減期を延長する、ＡＤＣＣを変化させる、またはヒンジ安定性を向上させるために突然変異したＦｃを有するなど所望の特性を付与するように改変されているＩｇＧフォーマットなどのフォーマットであり得る。そのような改変は、当技術分野において周知である。

【0097】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片はヒトである。したがって、多特異性抗体またはその断片は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）配列に由来し得る。抗体（またはその断片）のＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列に由来し得る。ＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列について実質的に同一であり得る。ヒト多特異性抗体を使用する利点は、それらがヒトにおいて低免疫原性または非免疫原性であることである。

【0098】

多特異性抗体またはその断片は、キメラ、例えばマウス－ヒト抗体キメラであってもよい。

【0099】

あるいは、多特異性抗体またはその断片は、マウスなどの非ヒト種に由来する。このような非ヒト抗体は、ヒトにおいて天然に産生される抗体変異体との類似性を高めるように改変することができ、したがって、抗体またはその断片は、部分的または完全にヒト化され得る。したがって、一実施形態において、抗体またはその断片はヒト化されている。

【0100】

多特異性抗体の配列
本発明の単離された抗Ｖδ１抗体またはその断片は、ＴＲＤＶ１結合を付与するそれらのＣＤＲ配列を参照して説明され得る。しかしながら、本発明は、例えばＴＣＥプラットフォームまたはＤＩプラットフォームでＴＲＤＶ１と結合するように、多特異性抗体を使用してＴＲＤＶ１をターゲティングする全く新しい原理に基づくため、本発明は、このような配列に限定されない。同様に、本発明は、第２の抗原（がんもしくはがん関連抗原または免疫調節性抗原など）への結合を付与するドメインの特定の配列に限定されない。

【0101】

本発明の一態様によれば、
配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２６～３７及び配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または
配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１
のうちの１つまたは複数を含む、単離された多特異性抗Ｖδ１抗体またはその断片が提供される。

【0102】

本発明の一態様によれば、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む、単離された抗Ｖδ１多特異性抗体またはその断片が提供される。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。

【0103】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。

【0104】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ２を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ１を含む。

【0105】

本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0106】

本発明の特定の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３もしくは４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５もしくは１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３もしくは４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５もしくは１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0107】

本発明の特定の態様によれば、配列番号８～１３、特に８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号８～１３、特に８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0108】

本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0109】

本発明の特定の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３、４もしくは５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５、１６もしくは１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３、４もしくは５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５、１６もしくは１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0110】

本発明の特定の態様によれば、配列番号８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0111】

本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0112】

本発明の特定の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３、４もしくは５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５、１６もしくは１７のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号２～７、特に２～６、例えば２、３、４もしくは５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば１４、１５、１６もしくは１７のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0113】

本発明の特定の態様によれば、配列番号８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の別の態様によれば、配列番号８、９、１０もしくは１１のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０、２１、２２もしくは２３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0114】

本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。本発明の更なる態様によれば、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0115】

本明細書で「少なくとも８０％」または「８０％以上」と言及している実施形態は、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％など、８０％以上のすべての値の配列同一性を含むと理解されるであろう。一実施形態において、本発明の抗体または断片は、指定された配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【0116】

配列同一性のパーセンテージの代わりに、１つまたは複数のアミノ酸変化、例えば、１つまたは複数の付加、置換及び／または欠失で実施形態が定義されることもある。一実施形態において、配列は、最大５つのアミノ酸変化、例えば最大３つのアミノ酸変化、特に最大２つのアミノ酸変化を含み得る。更なる実施形態において、配列は、最大５つのアミノ酸置換、例えば最大３つのアミノ酸置換、特に最大１つまたは２つのアミノ酸置換を含み得る。例えば、本発明の多特異性抗体またはその断片のＣＤＲ３は、配列番号２～２５のいずれか１つと比較して、２つ以下、より好適には１つ以下の置換（複数可）を有する配列を含むか、またはより好適にはそれからなる。

【0117】

好適には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の残基で、配列番号２～６１及び配列番号１６０～１７１における対応する残基と異なるものはいずれも、それらの対応する残基に関して保存的置換である。例えば、配列番号２～２５における対応する残基とは異なるＣＤＲ３の残基はいずれも、それらの対応する残基に関して保存的置換である。

【0118】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号２６～３７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、
（ｉｉｉ）配列番号３８～４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域、
（ｉｖ）配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｖ）配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び／または
（ｖｉ）配列番号５０～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む。

【0119】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号２６～３７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号３８～４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を備えた重鎖を含む。

【0120】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｉｉ）配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号５０～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を備えた軽鎖を含む。

【0121】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２、３、４、５または６、例えば２、３、４または５、特に２、３または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分（すなわち結合ドメイン）は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２６、２７、２８、２９または３０、例えば２６、２７、２８または２９、特に２６、２７または２８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号３８、３９、４０、４１または４２、例えば３８、３９、４０または４１、特に３８、３９または４０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。

【0122】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号３２、３３、３４または３５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号４４、４５、４６または４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。

【0123】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２６の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号３８の配列からなる。

【0124】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２７の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号３９の配列からなる。

【0125】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２８の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４０の配列からなる。

【0126】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号５の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２９の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４１の配列からなる。

【0127】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号６の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３０の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４２の配列からなる。

【0128】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号８の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３２の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４４の配列からなる。

【0129】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４５の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号９の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３３の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４５の配列からなる。

【0130】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３４のＣＤＲ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ１配列を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３４の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４６の配列からなる。

【0131】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３５のＣＤＲ２配列、及び配列番号４７のＣＤＲ１配列を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１１の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３５の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号４７の配列からなる。

【0132】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１４～２５、例えば配列番号１４、１５、１６、１７または１８、例えば１４、１５、１６または１７、特に１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１６０～１７１、例えば配列番号１６０、１６１、１６２、１６３または１６４、例えば１６０、１６１、１６２または１６３、特に１６０、１６１または１６２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それらからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号５０～６１、例えば配列番号５０、５１、５２、５３または５４、例えば５０、５１、５２または５３、特に５０、５１または５２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それらからなる）。

【0133】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６０の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５０の配列からなる。

【0134】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１５の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６１の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５１の配列からなる。

【0135】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１６の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６２の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５２の配列からなる。

【0136】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１７の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６３の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５３の配列からなる。

【0137】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号１８の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６４の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５４の配列からなる。

【0138】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列：１６６、１６７、１６８または１６９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号５６、５７、５８または５９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む（またはＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、それからなる）。

【0139】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号２０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６６の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５６の配列からなる。

【0140】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号２１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５７の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２１の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６７の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５７の配列からなる。

【0141】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号２２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２２の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６８の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５８の配列からなる。

【0142】

一実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ３は配列番号２３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号１６９の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５９の配列からなる。

【0143】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２６の配列を含むＣＤＲ２、配列番号３８の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号２の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２６の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号３８の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１４の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６０の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５０の配列からなる。

【0144】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ２、配列番号３９の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号３の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２７の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号３９の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１５の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６１の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５１の配列からなる。

【0145】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２８の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４０の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号４の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２８の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４０の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１６の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６２の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５２の配列からなる。

【0146】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２９の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４１の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号５の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２９の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４１の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１７の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６３の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５３の配列からなる。

【0147】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３０の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４２の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号６の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３０の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４２の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１８の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６４の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５４の配列からなる。

【0148】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３１の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４３の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６５の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５５の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号７の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３１の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４３の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１９の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６５の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５５の配列からなる。

【0149】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３２の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４４の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号８の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３２の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４４の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２０の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６６の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５６の配列からなる。

【0150】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４５の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５７の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号９の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３３の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４５の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２１の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６７の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５７の配列からなる。

【0151】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３４の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４６の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号１０の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３４の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４６の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２２の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６８の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５８の配列からなる。

【0152】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３５の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４７の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１６９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号１１の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３５の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４７の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２３の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１６９の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５９の配列からなる。

【0153】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３６の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４８の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１７０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号１２の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３６の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４８の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２４の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１７０の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号６０の配列からなる。

【0154】

一実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３７の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４９の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号１７１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ３は配列番号１３の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３７の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４９の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２５の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列番号１７１の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号６１の配列からなる。

【0155】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるような１つまたは複数のＣＤＲ配列を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｂ０７の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１１３８＿Ｐ０１＿Ｂ０９の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、表３に記載されるようなクローン１２５１＿Ｐ０２＿Ｇ１０の１つまたは複数の（例えばすべての）ＣＤＲ配列を含む。

【0156】

好適には、上述のＶＨ領域及びＶＬ領域は各々、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つの配列を含むフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つの配列からなるフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。

【0157】

本明細書に記載される抗体は、ＴＲＤＶ１結合を付与する完全な軽鎖及び／または重鎖の可変配列によって定義され得る。したがって、本発明の更なる態様によれば、配列番号６２～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された多特異性抗Ｖδ１抗体またはその断片が提供される。本発明の更なる態様によれば、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分が、配列番号６２～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、単離された多特異性抗Ｖδ１抗体またはその断片が提供される。

【0158】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６２、６３、６４、６５または６６、例えば６２、６３、６４または６５、特に６２、６３または６４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６２、６３、６４、６５または６６、例えば６２、６３、６４または６５、特に６２、６３または６４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２または７３、例えば６８、６９、７０または７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２または７３、例えば６８、６９、７０または７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0159】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号７４、７５、７６、７７または７８、例えば７４、７５、７６または７７、特に７４、７５、または７６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号７４、７５、７６、７７または７８、例えば７４、７５、７６または７７、特に７４、７５、または７６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号８０、８１、８２、８３、８４または８５、例えば８０、８１、８２または８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号８０、８１、８２、８３、８４または８５、例えば８０、８１、８２または８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0160】

更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0161】

更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0162】

更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0163】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0164】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６３のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６８のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７０のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７１のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0165】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0166】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７５のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７４のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７６のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８０のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８１のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８３のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0167】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0168】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６３のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）及び配列番号７５のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６２のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）及び配列番号７４のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６４のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）及び配列番号７６のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６８のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）及び配列番号８０のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号６９のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）及び配列番号８１のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７０のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）及び配列番号８２のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号７１のアミノ酸配列からなるＶＨ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）及び配列番号８３のアミノ酸配列からなるＶＬ領域（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0169】

ＶＨ領域及びＶＬ領域の両方を含む断片の場合、これらは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合またはリンカーを介して）または非共有結合のいずれで会合してもよい。本明細書に記載される多特異性抗体断片は、ｓｃＦｖ、すなわち、リンカーによって結合されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む断片を含み得る。一実施形態において、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、（例えば合成）ポリペプチドリンカーによって結合されている。ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎリンカー（ここで、ｎ＝１～８、例えば２、３、４、５または７である）を含み得る。ポリペプチドリンカーは、［（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_３ＡｌａＳｅｒ）_ｍ］_ｐリンカー（ここで、ｎ＝１～８、例えば２、３、４、５または７であり、ｍ＝１～８、例えば０、１、２または３であり、ｐ＝１～８、例えば１、２または３である）を含み得る。更なる実施形態において、リンカーは配列番号９８を含む。更なる実施形態において、リンカーは配列番号９８からなる。

【0170】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８７のアミノ酸配列（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８６のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号８８のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号９２のアミノ酸配列（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号９３のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号９４のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）を含む。代替的な実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号９５のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）を含む。

【0171】

一実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号８６～９７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号８６～９７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。なおも更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号８７のアミノ酸配列（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号８６のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号８８のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号９２のアミノ酸配列（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号９３のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号９４のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）からなる。代替的な実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号９５のアミノ酸配列（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）からなる。

【0172】

当業者には、翻訳、精製、及び検出を助けるためにＮ末端及びＣ末端の改変を含むｓｃＦｖ構築物を設計及び作製できることが理解されるであろう。例えば、ｓｃＦｖ配列のＮ末端において、カノニカルＶＨ配列（例えばＱＶＱまたはＥＶＱで始まる）の前に、追加のメチオニン及び／またはアラニンアミノ酸残基を含めてもよい。Ｃ末端（すなわち、ＩＭＧＴ定義のとおりに終わるカノニカル成熟ＶＬドメイン配列のＣ末端側）には、精製及び検出を助けるために、（ｉ）定常ドメインの部分的配列、及び／または（ｉｉ）Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグなどのタグを含む追加の合成配列といった、追加の配列を含めてもよい。一実施形態において、配列番号１２４が、配列番号８６、８８～９０、９２～９７のいずれか１つのＣ末端に付加される。一実施形態において、配列番号１２５が、配列番号８６、８８～９０、９２～９７のいずれか１つのＣ末端に付加される。一実施形態において、配列番号１２６が、配列番号８７または９１のいずれか１つのＣ末端に付加される。一実施形態において、配列番号１２７が、配列番号８７または９１のいずれか１つのＣ末端に付加される。前記ｓｃＦｖのＮ末端配列またはＣ末端配列は任意であり、代替のｓｃＦｖ設計、翻訳、精製または検出ストラテジーが採用される場合には除去、改変、または置換され得ることが十分に理解されている。

【0173】

本明細書に記載されるように、抗体は任意のフォーマットであり得る。好ましい実施形態において、多特異性抗体はＩｇＧ１フォーマットである。したがって、一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１１１～１１６、例えば配列番号１１１～１１３及び１１６のアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１１７～１２２、例えば配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、配列番号１１１、１１２、１１６～１２０、例えば配列番号１１１、１１２もしくは１１６、または配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列を含む。

【0174】

一実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。なおも更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号１１１～１１６、例えば配列番号１１１～１１３及び１１６のアミノ酸配列からなる。なおも更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号１１７～１２２、例えば配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列からなる。なおも更なる実施形態において、ＴＲＤＶ１結合を付与する多特異性抗体の成分は、配列番号１１１、１１２、１１６～１２０、例えば配列番号１１１、１１２もしくは１１６、または配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列からなる。

【0175】

一実施形態において、多特異性抗体は、本明細書で定義される抗体もしくはその断片と同じもしくは本質的に同じＴＲＤＶ１エピトープに結合するか、または本明細書で定義される抗体もしくはその断片と競合する。当技術分野で公知の定型的方法を使用することにより、多特異性抗体が参照抗Ｖδ１抗体と同じＴＲＤＶ１エピトープに結合するかどうか、または参照抗Ｖδ１抗体と結合を競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗Ｖδ１抗体と同じＴＲＤＶ１エピトープに結合するかどうかを決定するためには、参照抗体を飽和条件下でＶδ１タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、Ｖδ１鎖に結合する試験多特異性抗体の能力を評価する。試験多特異性抗体が参照抗Ｖδ１抗体との飽和結合後にＶδ１に結合することができれば、試験多特異性抗体は、参照抗Ｖδ１抗体とは異なるＴＲＤＶ１エピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、試験多特異性抗体が参照抗Ｖδ１抗体との飽和結合後にＶδ１鎖に結合することができなければ、試験多特異性抗体は、本発明の参照抗Ｖδ１抗体が結合するエピトープと同じＴＲＤＶ１エピトープに結合し得る。当然ながら、ＴＲＤＶ１エピトープへの結合は、ＴＲＤＶ１のエピトープである第１の標的エピトープへの結合を付与する多特異性抗体の成分を指す。同じまたは異なるエピトープに対する結合の試験は、代替的に、本明細書で提供される多特異性抗体の配列を使用して、しかし単特異性フォーマットで実施してもよい。

【0176】

本発明には、本明細書で定義される抗体もしくはその断片（多特異性または単特異性のいずれかのフォーマット）、または本明細書に記載される例示的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体と、Ｖδ１への結合を競合する多特異性抗Ｖδ１抗体も含まれる。例えば、どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストがＶδ１鎖への結合を本発明の抗体と競合するか及び／またはエピトープを共有するかを決定するために、本発明の抗体を用いて競合アッセイを行うことができる。これらのアッセイは、当業者には容易に分かる。これらは、タンパク質、例えばＶδ１における限られた数の結合部位についてのアンタゴニスト間またはリガンド間の競合を評価する。抗体（またはその断片）は競合の前または後に固定化または不溶化され、Ｖδ１鎖に結合した試料は、例えば、デカント（抗体が事前に不溶化された場合）または遠心分離（抗体が競合反応後に沈殿した場合）によって非結合試料から分離される。また、競合結合は、タンパク質への抗体の結合または結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えば、抗体分子が標識などの酵素活性を阻害するか強化するかどうかによって決定され得る。当技術分野において公知であり、かつ本明細書に記載されるような、ＥＬＩＳＡ及び他の機能アッセイを使用することができる。

【0177】

２つの抗体は、各々が標的抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、他方の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％、９０％または更には９９％阻害する。あるいは、一方の抗体の結合を低減または消失させる標的抗原における本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低減または消失させる場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。

【0178】

次いで、追加の定型的実験（例えばペプチド突然変異及び結合分析）を行って、観察された試験抗体の結合の欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものかどうか、または立体障害（または別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認できる。この類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行うことができる。

【0179】

一部の実施形態において、抗体またはその断片は、Ａｓｎ ２９７（ＥＵ番号付けスキーム）に連結された糖の変異を介して改変されたエフェクター機能を含む。更なる前記改変において、Ａｓｎ ２９７は、フコシル化されていないか、または低減したフコシル化を示す（すなわち、脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体）。フコシル化には、分子への糖フコースの付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及び糖脂質へのフコースの結合が含まれる。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースが定常領域の炭水化物鎖に結合していない。抗体は、抗体のフコシル化を防止または阻害するために改変され得る。典型的に、グリコシル化改変は、ターゲティングされた工学操作によるか、またはターゲティングもしくは偶然による宿主もしくはクローンの選択による、代替のグリコシル化プロセシング機能を含む宿主細胞における前記抗体またはその断片の発現を含む（例えば実施例１３を参照）。これら及び他のエフェクター改変は、本明細書に組み込まれているＸｉｎｈｕａ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｃｅｌｌ ９：６３－７３及びＰｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ｍＡｂｓ １０（５）：６９３－７１１などによる最近の概説に更に記述されている。

【0180】

抗体配列の改変
多特異性抗体及びその断片は、公知の方法を使用して改変することができる。本明細書に記載される抗体分子に対する配列改変、特にＶδ１結合を付与する多特異性抗体の一部に対するものは、当業者であれば容易に取り入れることができる。以下の例は非限定的である。

【0181】

ファージライブラリからの抗体の発見及び配列の回収の間に、所望の抗体可変ドメインは、サブクローン化によって完全長ＩｇＧに再編成され得る。プロセスを加速するために、可変ドメインは制限酵素を使用して移されることがよくある。これらのユニークな制限部位は追加の／代替のアミノ酸を導入し、カノニカル配列から離れ得る（このようなカノニカル配列は、例えば、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ［ＩＭＧＴ］情報システムに見出され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照）。これらは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の配列改変として導入され得る。

【0182】

カッパ軽鎖の改変
可変カッパ軽鎖の可変配列は、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を使用してクローン化され得る。より具体的には、カッパ軽鎖のＮ末端に、クローン化をサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列が導入された。好ましくは、この追加のＡＳ配列は、その後、カノニカルＮ末端配列を生成するような更なる開発の間に除去される。よって、一実施形態において、本明細書に記載されるカッパ軽鎖含有抗体は、Ｎ末端にＡＳ配列を含有しない。すなわち、配列番号７４、７６～７８及び８０～８５は、最初のＡＳ配列を含まない。更なる実施形態において、配列番号７４及び７６～７８は、最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、本明細書に含まれる、この配列を含有する他の配列（例えば配列番号８６、８８～９０及び９２～９７）にも適用されることが理解されよう。

【0183】

クローン化をサポートするために、追加のアミノ酸変化を行ってもよい。例えば、本明細書に記載される抗体では、カッパ軽鎖可変ドメイン／定常ドメインの境界で、バリンからアラニンへの変化を導入してクローン化をサポートした。これにより、カッパ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインが

【化1】

で（ＮｏｔＩ制限部位から）始まることになる。好ましくは、この配列は、

【化2】

で始まるカノニカルカッパ軽鎖定常領域を生成するように、更なる開発中に改変され得る。よって、一実施形態において、本明細書に記載されるカッパ軽鎖含有抗体は、配列ＲＴＶで始まる定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態において、配列番号１１１～１１４及び１１７～１２２の配列

【化3】

は、配列

【化4】

で置き換えられる。例えば、実施例１３及び配列番号１２９、１３０を参照のこと。

【0184】

ラムダ軽鎖の改変
上述のカッパの例と同様に、ラムダ軽鎖可変ドメインも、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を導入することによりクローン化され得る。より具体的には、ラムダ軽鎖のＮ末端に、クローン化をサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列が導入され得る。好ましくは、この追加のＡＳ配列は、その後、カノニカルＮ末端配列を生成するような更なる開発の間に除去される。よって、一実施形態において、本明細書に記載されるラムダ軽鎖含有抗体は、Ｎ末端にＡＳ配列を含有しない。すなわち、配列番号７５及び７９は、最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、本明細書に含まれる、この配列を含有する他の配列（例えば配列番号８７、９１、１１５及び１１６）にも適用されることが理解されよう。一実施形態において、配列番号７５は最初の６つの残基を含有しない。すなわち、ＡＳＳＹＥＬ配列が除去されている。

【0185】

別の例として、本明細書に記載される抗体では、ラムダ軽鎖可変ドメイン／定常ドメインの境界で、リジンからアラニンへの配列変化を導入してクローン化をサポートした。これにより、ラムダ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインが

【化5】

で（ＮｏｔＩ制限部位から）始まることになる。好ましくは、この配列は、

【化6】

で始まるカノニカルラムダ軽鎖定常領域を生成するように、更なる開発中に改変され得る。よって、一実施形態において、本明細書に記載されるラムダ軽鎖含有抗体は、配列ＧＱＰＫで始まる定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態において、配列番号１１５または１１６の配列

【化7】

は、配列

【化8】

で置き換えられる。

【0186】

重鎖の改変
典型的に、ヒト可変重鎖配列は、塩基性グルタミン（Ｑ）または酸性グルタミン酸（Ｅ）のいずれかで始まる。しかしながら、そのような配列は両方とも、その後、酸性アミノ酸残基であるピログルタミン酸（ｐＥ）に変換されることが知られている。ＱからｐＥへの変換は抗体の電荷を変化させるが、ＥからｐＥへの変換は抗体の電荷を変化させない。よって、経時的な電荷変化の変動を回避するための１つの選択肢は、開始重鎖配列の最初のＱをＥに改変することである。よって、一実施形態において、本明細書に記載される抗体の重鎖は、Ｎ末端にＱからＥへの改変を含有する。特に、配列番号６２、６４及び／または６７～７１の最初の残基は、ＱからＥへ改変され得る。この実施形態は、本明細書に含まれる、この配列を含有する他の配列（例えば配列番号８６、８８、９１～９７及び１１１、１１２、１１５、１１７～１２０）にも適用されることが理解されよう。例えば、実施例１３及び配列番号１２９、１３０を参照のこと。

【0187】

更に、ＩｇＧ１定常ドメインのＣ末端はＰＧＫで終わる。しかしながら、末端の塩基性リジン（Ｋ）は、次いで発現中に（例えばＣＨＯ細胞において）切断されることが多い。その結果、Ｃ末端リジン残基の様々な喪失により、抗体の電荷が変化する。したがって、１つの選択肢は、最初のリジンを除去して、ＰＧで終わる均一かつ一貫した重鎖Ｃ末端配列をもたらすことである。よって、一実施形態において、本明細書に記載される抗体の重鎖は、そのＣ末端から末端Ｋが除去されている。特に、本発明の抗体は、末端リジン残基が除去されている配列番号１１１～１２２のいずれか１つを含み得る。例えば、配列番号１４１を参照のこと。

【0188】

任意のアロタイプの改変
抗体の発見中に、特定のヒトアロタイプが用いられ得る。場合により、抗体は、開発中に異なるヒトアロタイプに切り替えることができる。非限定的な例として、カッパ鎖には、３つのＫｍ対立遺伝子を定義するＫｍ１、Ｋｍ１，２及びＫｍ３と呼ばれる３つのヒトアロタイプがある（アロタイプ番号付けを使用）。Ｋｍ１はバリン１５３（ＩＭＧＴ Ｖ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ１，２はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ３はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びバリン１９１（ＩＭＧＴ Ｖ１０１）と相関する。したがって、場合により、標準的なクローン化アプローチによって配列を１つのアロタイプから別のものに改変することができる。例えば、Ｌ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）の変化により、Ｋｍ１，２アロタイプがＫｍ３アロタイプに変換される。このようなアロタイプの詳細については、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ＭＡｂｓ １（４）：３３２－８を参照のこと。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0189】

よって、一実施形態において、本明細書に記載される多特異性抗体は、同じ遺伝子の別のヒトアロタイプに由来するアミノ酸置換を含有する。更なる実施形態において、抗体は、ｃ－ドメインをｋｍ１，２からｋｍ３アロタイプに変換するためのカッパ鎖のＬ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）置換を含有する。例えば、実施例１３及び配列番号１２９、１３０を参照のこと。

【0190】

ＴＲＤＶ１エピトープをターゲティングする抗体
本明細書では、γδＴＣＲのＶδ１鎖のエピトープに結合する（さらに、他の箇所に記述する第２のエピトープと結合する）抗体（またはその断片）が提供される。このような結合は、場合により、活性化などのγδＴＣＲ活性に影響を及ぼし得る。本発明の抗体は、好ましくはγδＴＣＲのＶδ１鎖に特異的であり、γδＴＣＲのＶδ２鎖またはγδＴＣＲのＶδ３鎖などの他の抗原のエピトープと結合しない。本発明の抗体は、少なくとも結合時にＶδ１細胞に付与されるアゴニスト作用に関して、アゴニスト抗体とみなすことができる。

【0191】

一実施形態において、エピトープは、γδＴ細胞の活性化エピトープであり得る。「活性化」エピトープは、例えば、細胞の脱顆粒、ＴＣＲ下方制御、細胞傷害性、増殖、動員、生存もしくは消耗に対する抵抗性の増加、細胞内シグナル伝達、サイトカインもしくは成長因子の分泌、表現型の変化、または遺伝子発現の変化などのＴＣＲ機能の刺激を含み得る。例えば、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞集団、好ましくはＶδ１＋Ｔ細胞集団の増大（すなわち増殖）を刺激し得る。したがって、これらの多特異性抗体を使用して、γδＴ細胞活性化を調節し、それによって免疫応答を調節することができる。したがって、一実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴＣＲを下方制御する。追加のまたは代替的な実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する。更なる追加のまたは代替的な実施形態において、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞媒介性殺傷を促進する。

【0192】

一部の実施形態において、ＴＲＤＶ１の活性化エピトープは、抗体が結合すると受容体の下方制御をもたらし、場合によりＶδ１細胞を活性化するものである。一部の実施形態において、受容体の前記下方制御は、関連するＣＤ３分子の下方制御ももたらす。一部の実施形態において、活性化エピトープは、Ｖδ１細胞上の活性化マーカー、例えばＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、ＣＤ６９及び／またはＫｉ６７の発現を上方制御するものである。一部の実施形態において、活性化エピトープは、Ｖδ１細胞上の活性化マーカー、例えばＣＤ１０７及びＣＤ２５、ならびに場合によりＣＤ６９及び／またはＫｉ６７の発現を上方制御するものである。一部の実施形態において、１つまたは複数の活性化マーカー（ＣＤ１０７ａなど）の上方制御は、がん細胞の存在下での上方制御であり得る。本発明の好ましい実施形態では、多特異性抗体は、ＴＲＤＶ１の活性化エピトープと、特にＴＲＤＶ１結合ドメインを介して結合する。

【0193】

Ｔ細胞受容体は他のタンパク質と複合体を形成することが多いため、Ｖδ１抗体結合を介したＴ細胞受容体の下方制御は、Ｔ細胞受容体に関連する他のタンパク質の下方制御を引き起こし得る（すなわち、Ｖδ１抗体の結合は、Ｔ細胞受容体複合体の下方制御を引き起こす）。例えば、一部の実施形態では、ＴＲＤＶ１の活性化エピトープは、結合するとＴＣＲ／ＣＤ３受容体複合体を下方制御するものである。このように、本発明の抗体は、抗体が結合していないがＴ細胞受容体と複合体を形成している細胞表面タンパク質の間接的な下方制御を引き起こし得る。ガンマデルタ１鎖を発現するＴ細胞（すなわちＶδ１細胞）が全Ｔ細胞集団のごく少数に相当することを考慮すると、本発明の抗体を使用して、ＣＤ３などのＴＣＲ複合体中のタンパク質をＶδ１細胞のみで下方制御することにより、それらを選択的に（かつ間接的に）下方制御することができる。

【0194】

一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体複合体の活性化エピトープは、活性化されるとＴ細胞受容体複合体を下方制御するが、前記ＴＲＤＶ１ ＴＣＲ複合体に関連しないＣＤ３分子は下方制御しないものである。

【0195】

このエピトープは、好ましくは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の少なくとも１つの細胞外部分、可溶性部分、親水性部分、または外側部分から成る。

【0196】

特に、このエピトープは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の超可変領域、特にＶδ１鎖のＣＤＲ３に見出されるエピトープを含まない。好ましい実施形態において、このエピトープは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の非可変領域内にある。このような結合は、高度に可変のＴＣＲの配列（特にＣＤＲ３）に制限されることなく、Ｖδ１鎖のユニークな認識を可能にすることが理解されるであろう。抗原を認識する様々なγδＴＣＲ複合体は、このようなかたちで、Ｖδ１鎖の存在のみによって認識され得る。したがって、Ｖδ１鎖を含むγδＴＣＲはいずれも、γδＴＣＲの特異性に関係なく、本明細書で定義される抗体またはその断片を使用して認識され得ることが理解されよう。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０内の１つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３配列の一部ではないＶδ１鎖の一部を含む。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域９１～１０５（ＣＤＲ３）内のアミノ酸残基を含まない。

【0197】

一部の実施形態において、エピトープは、ＴＲＤＶ－１ ＣＤＲ２配列中のアミノ酸を含む。

【0198】

十分に特性評価されているαβＴ細胞と同様に、γδＴ細胞は、体細胞性に再構成された可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、結合（Ｊ）遺伝子、及び定常（Ｃ）遺伝子の独特のセットを利用するが、γδＴ細胞は、αβＴ細胞よりも少ないＶセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメントを含有する。一実施形態において、抗体（またはその断片）が結合するエピトープは、Ｖδ１鎖のＪ領域（例えば、ヒトデルタ１鎖生殖系にコードされる４つのＪ領域：配列番号１５２（Ｊ１^＊０）もしくは１５３（Ｊ２^＊０）もしくは１５４（Ｊ３^＊０）もしくは１５５（Ｊ４^＊０）のうちの１つ）またはＶδ１鎖のＣ領域（例えばＣ末端膜近傍／膜貫通領域を含有する配列番号１５６（Ｃ１^＊０））に見出されるエピトープを含まない。一実施形態において、抗体（またはその断片）が結合するエピトープは、Ｖδ１鎖のＮ末端リーダー配列（例えば配列番号１５０）に見出されるエピトープを含まない。したがって、抗体または断片は、Ｖδ１鎖のＶ領域（例えば配列番号１５１）でのみ結合し得る。したがって、一実施形態において、エピトープは、γδＴＣＲのＶ領域（例えば配列番号１のアミノ酸残基１～９０）内のエピトープからなる。

【0199】

エピトープへの言及は、配列番号１として示される、Ｌｕｏｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１０３２－１０４２に記載の配列、ならびにＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋエントリ：４ＭＮＨ及び３ＯＭＺに由来するＶδ１配列との関連でなされる。
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＳＬＴＲＡＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳ（配列番号１）

【0200】

配列番号１は、Ｖ領域（可変ドメインとも称される）、Ｄ領域、Ｊ領域、及びＴＣＲ定常領域を含む可溶性ＴＣＲを表す。Ｖ領域はアミノ酸残基１～９０を含み、Ｄ領域はアミノ酸残基９１～１０４を含み、Ｊ領域はアミノ酸残基１０５～１１５を含み、定常領域（Ｔ細胞受容体アルファ由来）はアミノ酸残基１１６～２０９を含む。Ｖ領域内で、ＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸残基２５～３４と定義され、ＣＤＲ２は配列番号１のアミノ酸残基５０～５４と定義され、ＣＤＲ３は配列番号１のアミノ酸残基９３～１０４と定義される（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８（６）：２４１４－２４１９（２０１１））。

【0201】

したがって、本発明の一態様によれば、
（ｉ）配列番号１の３～２０、及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７
のアミノ酸領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープに結合する、単離された抗体またはその断片が提供される。

【0202】

更なる実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１２８のアミノ酸残基１～９０のエピトープを含む多型Ｖ領域をさらに認識する。よって、配列番号１のアミノ酸１～９０及び多型生殖系変異体配列（配列番号１２８のアミノ酸１～９０）は、本明細書に記載されるエピトープを定義する際に同義とみなされ得る。本明細書で提示する研究は、本発明の抗体がこの生殖系配列の両方の変異体を認識できることを実証した。例として、本明細書で定義される抗体またはその断片が、配列番号１のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープを認識すると記載される場合、これは、配列番号１２８の同じ領域、具体的には配列番号１２８のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０も指す。

【0203】

一実施形態において、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域１～９０内の１つまたは複数のアミノ酸残基と、配列番号１２８の領域１～９０で同等の位置にあるアミノ酸とを認識する。より具体的には、一実施形態において、本明細書で定義される抗体またはその断片は、ヒト生殖系エピトープを認識し、前記生殖系は、配列番号１の７１位でアラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）のいずれかをコードする。

【0204】

一実施形態において、エピトープは、記載された領域内における、１つまたは複数の、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。

【0205】

更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３～２０内の１つまたは複数の（例えば５個以上、例えば１０個以上の）アミノ酸残基を含む。代替的な実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～７７（例えばアミノ酸領域５０～５４）内の１つまたは複数の（例えば５個以上、例えば１０個以上の）アミノ酸残基を含む。なおも更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３～２０（例えば５～２０または３～１７）内の１つまたは複数の（例えば５個以上、例えば１０個以上の）アミノ酸残基と、アミノ酸領域３７～７７（例えば６２～７７または６２～６９）内の１つまたは複数の（例えば５個以上、例えば１０個以上の）アミノ酸残基とを含む。

【0206】

前記抗体（またはその断片）は、定義された範囲内のすべてのアミノ酸に結合する必要はないことが更に理解されよう。このようなエピトープは、線状エピトープと称され得る。例えば、配列番号１のアミノ酸領域５～２０内のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体は、前記範囲内のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数、例えば、場合により範囲内のアミノ酸（すなわちアミノ酸５、９、１６及び２０）を含む、範囲の両端のアミノ酸残基（すなわちアミノ酸５及び２０）のみと結合し得る。

【0207】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基３、５、９、１０、１２、１６、１７、２０、３７、４２、５０、５３、５９、６２、６４、６８、６９、７２または７７のうちの少なくとも１つを含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基３、５、９、１０、１２、１６、１７、２０、３７、４２、５０、５３、５９、６２、６４、６８、６９、７２または７７から選択される１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸を含む。

【0208】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１（または上述のとおり配列番号１２８）の以下のアミノ酸領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む：
（ｉ）３～１７、
（ｉｉ）５～２０、
（ｉｉｉ）３７～５３、
（ｉｖ）５０～６４、
（ｖ）５９～７２、
（ｖｉ）５９～７７、
（ｖｉｉ）６２～６９、及び／または
（ｖｉｉｉ）６２～７７。

【0209】

更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる。

【0210】

更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：３、５、９、１０、１２、１６、１７、６２、６４、６８及び６９を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：３、５、９、１０、１２、１６、１７、６２、６４、６８及び６９からなる。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５、９、１６、２０、６２、６４、７２及び７７を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：５、９、１６、２０、６２、６４、７２及び７７からなる。なおも更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：３７、４２、５０、５３、５９、６４、６８、６９、７２、７３及び７７を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：３７、４２、５０、５３、５９、６４、６８、６９、７２、７３及び７７からなる。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５０、５３、５９、６２及び６４を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：５０、５３、５９、６２及び６４からなる。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５９、６０、６８及び７２を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：５９、６０、６８及び７２からなる。

【0211】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び／または６２～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び６２～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる。代替的な更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０または６２～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。このようなエピトープを有する抗体もしくはその断片は、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の配列の一部もしくはすべてを有してもよく、またはこのような抗体もしくはその断片は、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７に由来してもよい。例えば、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の１つもしくは複数のＣＤＲ配列または１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７のＶＨ配列及びＶＬ配列の一方もしくは両方を有する抗体またはその断片は、このようなエピトープと結合し得る。

【0212】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５０～６４内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５０～６４内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる。このようなエピトープを有する抗体もしくはその断片は、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の配列の一部もしくはすべてを有してもよく、またはこのような抗体もしくはその断片は、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８に由来してもよい。例えば、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の１つもしくは複数のＣＤＲ配列または１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８のＶＨ配列及びＶＬ配列の一方もしくは両方を有する抗体またはその断片は、このようなエピトープと結合し得る。

【0213】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３及び／または５９～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３及び５９～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる。代替的な更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３または５９～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。このようなエピトープを有する抗体もしくはその断片は、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の配列の一部もしくはすべてを有してもよく、またはこのような抗体もしくはその断片は、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４に由来してもよい。例えば、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の１つもしくは複数のＣＤＲ配列または１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４のＶＨ配列及びＶＬ配列の一方もしくは両方を有する抗体またはその断片は、このようなエピトープと結合し得る。

【0214】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９～７２内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９～７２内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる。このようなエピトープを有する抗体もしくはその断片は、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の配列の一部もしくはすべてを有してもよく、またはこのような抗体もしくはその断片は、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５に由来してもよい。例えば、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の１つもしくは複数のＣＤＲ配列または１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５のＶＨ配列及びＶＬ配列の一方もしくは両方を有する抗体またはその断片は、このようなエピトープと結合し得る。

【0215】

一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域１１～２１内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域２１～２８内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９及び６０内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態において、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内のアミノ酸残基を含まない。

【0216】

一実施形態において、エピトープは、ＴＳ－１またはＴＳ８．２などの市販の抗Ｖδ１抗体が結合するエピトープと同じではない。ＷＯ２０１７１９７３４７に記載されているように、可溶性ＴＣＲに対するＴＳ－１及びＴＳ８．２の結合は、δ１鎖がＶδ１ Ｊ１配列及びＶδ１ Ｊ２配列を含んでいたときに検出されたが、Ｖδ１ Ｊ３鎖に対しては検出されず、ＴＳ－１及びＴＳ８．２の結合にはデルタＪ１及びデルタＪ２領域内の重要な残基が関与することを示している。

【0217】

本明細書における「内（ｗｉｔｈｉｎ）」への言及は、定義された範囲の両端を含む。例えば、「アミノ酸領域５～２０内」は、残基５から残基２０までを含むアミノ酸残基のすべてを指す。

【0218】

どのエピトープに抗体が結合するかを確定するための様々な技術が当技術分野では公知である。例示的な技法には、例えば、定型的なクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析、ペプチド切断分析結晶学的実験、及びＮＭＲ分析が含まれる。更に、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、及び化学修飾などの方法を用いることができる。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用できる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である（実施例９に記載のとおり）。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、その後、重水素で標識したタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移動し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。その結果、タンパク質／抗体の界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、そのため、界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。

【0219】

多特異性抗体及びその断片は、好適には、ヒトＴＲＤＶ１（配列番号１及び配列番号１２８の多型変異体）とカニクイザルＴＲＤＶ１（配列番号１７２）との両方に、ＴＲＤＶ１結合ドメインを介して特異的に結合する。

【0220】

第２の抗原のエピトープをターゲティングする抗体
本発明の抗体は多特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）であるため、ＴＲＤＶ１と特異的に結合することに加えて、第２の抗原と特異的に結合する。第２の抗原の同一性は、抗体が本明細書で記述される２つのカテゴリ：Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）抗体またはデュアル免疫調節薬（ＤＩ）抗体のうちの１つであるかどうかを決定する。

【0221】

ＴＣＥに関する実施形態では、第２の抗原は、がん抗原またはがん関連抗原である。このような実施形態では、抗体は、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープと特異的に結合し、第１の標的エピトープは、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープであり、第２の標的エピトープは、がん抗原またはがん関連抗原のエピトープである。このカテゴリで考えられる特定の第２の抗原の同一性については、他の箇所に記述する。しかしながら、第２の抗原は、がん細胞によって発現され、前記がん細胞のＶδ１－Ｔ細胞媒介性殺傷（例えば直接的な殺傷、または腫瘍細胞に結合した際の他の免疫細胞へのシグナル伝達の免疫ライセンシング効果を介した殺傷）を促進する任意の抗原であり得る。このようなＶδ１細胞によるがん細胞の殺傷は、Ｖδ１－Ｔ細胞及びがん細胞の共局在化、ならびに、多特異性抗体の結合、特にＶδ１－Ｔ細胞の活性化エピトープに対する結合を介した、Ｖδ１－Ｔ細胞の活性化によって促進される。本発明は、ＴＣＥ型抗体のための完全に新規のプラットフォームを例示する。

【0222】

一部の実施形態において、第２の抗原は、卵巣癌の抗原ではない。一部の実施形態において、第２の抗原は、Ｍｏｖ１９＋卵巣癌の抗原ではない。一部の実施形態において、多特異性（好適には二重特異性）抗体は、Ｍｏｖ１９＋卵巣癌細胞に特異的に結合しない。一部の実施形態において、多特異性（好適には二重特異性）抗体は、アルファ葉酸受容体（アルファ－ＦＲ）に特異的に結合しない。アルファ－ＦＲは、葉酸受容体１、ＦＯＬＲ１、葉酸受容体アルファ、またはＦＲαとしても知られている。これはＦＯＬＲ１遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３２８）によってコードされ、配列番号１７６の配列を有する。一部の実施形態において、多特異性（好適には二重特異性）抗体は、ｓｃＦｖ ＭＯＶ１９が結合するエピトープに特異的に結合しない。

【0223】

一部の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は二重特異性抗体であり、第２の抗原はアルファ葉酸受容体ではない。

【0224】

一部の実施形態において、多特異性抗体は、組換え宿主細胞から発現される組換え核酸の単数または複数のオープンリーディングフレームによってコードされるヒト組換え抗体である。一部の実施形態において、多特異性抗体は、Ｂ細胞融合ハイブリドーマ技術から導出された齧歯類抗体または他の非ヒト抗体ではない。一部の実施形態において、多特異性抗体は、齧歯類由来のハイブリドーマに見出される配列など、非ヒト動物種でのみ見出される非ヒトＩｇＧ定常ドメイン配列を含まない。

【0225】

ＤＩに関する実施形態では、第２の抗原は免疫調節性抗原である。このような実施形態では、抗体は、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープと特異的に結合し、第１の標的エピトープは、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープであり、第２の標的エピトープは、免疫調節性抗原である。「免疫調節性」抗原は、抗体媒介性免疫及び／または細胞媒介性免疫を調節する（例えば促進する）抗原である。免疫調節性抗原は、Ｔ細胞の細胞表面に存在するものである。第２の抗原が免疫調節性抗原である本発明の実施形態では、第２の抗原はＴ細胞受容体でもＴ細胞受容体複合体の成分でもない。例えば、第２のエピトープが免疫調節性抗原のエピトープである本発明の実施形態では、第２のエピトープはＴＲＤＶ１のエピトープではない。第２のエピトープが免疫調節性抗原のエピトープである本発明の好ましい実施形態において、第２のエピトープは、Ｔ細胞受容体複合体のエピトープではない。例えば、一部の実施形態において、第２のエピトープはＣＤ３のエピトープではない。よって、これらの実施形態の抗体は、ＴＲＤＶ１を介してＴ細胞に特異的に結合し、さらに、Ｔ細胞受容体複合体のエピトープではない第２の異なるエピトープを介してＴ細胞に結合し得るので、「デュアル免疫調節薬」である。第２の抗原の例としては、例えば、免疫チェックポイント阻害薬ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ及びＶＩＳＴＡが挙げられる。例えば、固形腫瘍は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの免疫抑制細胞を動員し、これらはすべて、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を阻害する。したがって、固形腫瘍においてＤＩを最も効果的に使用するには、免疫抑制性ＴＭＥを克服し、免疫除外型（ｉｍｍｕｎｅ ｅｘｃｌｕｄｅｄ）または免疫砂漠型（ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｓｅｒｔ）の「コールドな」腫瘍を炎症性の「ホットな」ものにすることを助けるために、多特異性部位を使用して複数のＴ細胞調節経路を組み合わせてターゲティングすることがおそらく必要である。しかしながら、本発明は、ＤＩ型抗体のための完全に新規のプラットフォームを提示するため、特定の第２の免疫調節性抗原に限定されない。

【0226】

好ましい実施形態では、本発明の多特異性抗体（好適には二重特異性抗体）は、ＣＤ３と特異的に結合しない（または直接相互作用しない）。好ましい実施形態では、第２の抗原はＣＤ３ではない。

【0227】

抗体結合
本発明の多特異性抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合し得る。好ましい実施形態において、ＫＤは１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満である。更なる実施形態において、ＫＤは、１．３×１０^－７Ｍ（すなわち１３０ｎＭ）以下、例えば１．０×１０^－７Ｍ（すなわち１００ｎＭ）以下である。なおも更なる実施形態において、ＫＤは、５．０×１０^－８Ｍ（すなわち５０ｎＭ）未満、例えば４．０×１０^－８Ｍ（すなわち４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち３０ｎＭ）未満、または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち２０ｎＭ）未満である。例えば、一部の態様によれば、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合するヒト多特異性抗体が提供される。

【0228】

本発明の一態様において、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に４．０×１０^－８Ｍ（すなわち４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち３０ｎＭ）未満、または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち２０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0229】

本発明の多特異性抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）で第２の抗原（または第２の抗原のエピトープ）に結合し得る。好ましい実施形態において、ＫＤは１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満である。更なる実施形態において、ＫＤは、１．３×１０^－７Ｍ（すなわち１３０ｎＭ）以下、例えば１．０×１０^－７Ｍ（すなわち１００ｎＭ）以下である。なおも更なる実施形態において、ＫＤは、５．０×１０^－８Ｍ（すなわち５０ｎＭ）未満、例えば４．０×１０^－８Ｍ（すなわち４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち３０ｎＭ）未満、または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち２０ｎＭ）未満である。例えば、一部の態様によれば、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）で第２の抗原（または第２の抗原のエピトープ）に結合するヒト多特異性抗体が提供される。

【0230】

本発明の一態様において、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に４．０×１０^－８Ｍ（すなわち４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち３０ｎＭ）未満、または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち２０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）で第２の抗原（または第２の抗原のエピトープ）に結合する多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0231】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片の結合親和性は、抗体またはその断片を直接的または間接的に（例えば抗ヒトＩｇＧ Ｆｃによる捕捉によって）センサ（例えばアミン高用量チップまたは同等物）の表面上にコーティングし、抗体またはその断片が結合した標的（例えばγδＴＣＲのＶδ１鎖）をチップ上に流して結合を検出することによって確定される。好適には、ＭＡＳＳ－２機器（Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２とも称され得る）を３０μｌ／分でＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０のランニングバッファー中２５℃で使用する。

【0232】

本明細書には、抗体機能を定義するために使用され得る他のアッセイも記載する。例えば、本明細書に記載される抗体またはその断片は、γδＴＣＲの会合により、例えば抗体結合時のγδＴＣＲの下方制御を測定することで評価され得る。抗体またはその断片（場合により細胞の表面に提示される）の適用後のγδＴＣＲの表面発現を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。本明細書に記載される抗体またはその断片は、γδＴ細胞の脱顆粒を測定することで評価することもできる。例えば、抗体またはその断片（場合により細胞の表面に提示される）をγδＴ細胞に適用した後、細胞の脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａの発現を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。本明細書に記載される抗体またはその断片は、γδＴ細胞殺傷活性を測定することによって（抗体がγδＴ細胞の殺傷活性に影響を与えるかどうかを試験するために）評価することもできる。例えば、標的細胞を、抗体またはその断片（場合により細胞の表面に提示される）の存在下でγδＴ細胞と共にインキュベートしてもよい。インキュベーション後、培養物を細胞生死判別色素で染色して、生きている標的細胞と死んでいる標的細胞を区別することができる。次いで、死細胞の割合を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。

【0233】

多特異性抗体
本発明の抗体は二重特異性または多特異性である。多特異性抗体は、概して、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的である場合もあり、または複数の標的ポリペプチドに特異的である場合もある。しかしながら本発明では、抗体は概して、２つ（またはそれ以上）の異なる抗原と特異的に結合する。

【0234】

様々な実施形態において、第２の標的エピトープは、がん抗原またはがん関連抗原（例えば腫瘍関連抗原）のエピトープである。様々な実施形態において、がん抗原またはがん関連抗原は、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、アルファフェトプロテイン、アンドロゲン受容体、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＡＡ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ベータカテニン、ベータＨＣＧ、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＢＯＲＩＳ、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３、ＣＡ １９５、ＣＡ １９－９、ＣＡ ２４２、ＣＡ ２７．２９、ＣＡ ７２－４、ＣＡ－５０、ＣＡＭ １７．１、ＣＡＭ４３、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、癌胎児抗原、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＯ－０２９、ＣＳＰＧ４、サイクリンＢ１、シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＣＹＰ１Ｂ１、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＢ２、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、ＦＧＦ－５、Ｆｏｓ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、ＧｌｏｂｏＨ、糖脂質Ｆ７７、ＧＭ３、ＧＰ １００、ＧＰ １００（Ｐｍｅｌ １７）、Ｈ４－ＲＥＴ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＨＴｇｐ－１７５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、イディオタイプ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、ＬＡＧＥ－１ａ、ＬＣＫ、レクチン反応性ＡＦＰ、レグマイン、ＬＭＰ２、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ、Ｍ－ＣＳＦ、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、メソテリン、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、Ｍｕｍ－１、ｈｓｐ７０－２、ＭＹＣＮ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＮＡ１７、ＮＢ／７０Ｋ、ニューロングリア抗原２（ＮＧ２）、好中球エラスターゼ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＮｕＭａ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＣＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、Ｐａｇｅ４、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＬＡＣ１、ポリシアル酸、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、Ｒａｓ、Ｒａｓ－突然変異体、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ＳＡＲＴ３、ＳＤＣＣＡＧ１６、ｓＬｅ（ａ）、精子タンパク質１７、ＳＳＸ２、ＳＴｎ、サバイビン、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ－７２、テロメラーゼ、チログロブリン、Ｔｉｅ ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＬＰ、Ｔｎ、ＴＰＳ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２、ＴＳＰ－１８０、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＩＳＴＡ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ １、４３－９Ｆ、５Ｔ４、及び７９１Ｔｇｐ７２から選択されるものである。

【0235】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＥｒｂＢサブファミリーのものである。Ｅｒｂ－Ｂ１（ＥＧＦＲ）、Ｅｒｂ－Ｂ２（ＨＥＲ２）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のスーパーファミリーのサブクラスＩのメンバーである。一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＲＴＫである。ＲＴＫは、細胞外リガンド結合ドメイン及び単一膜貫通ヘリックスから成る同様のタンパク質構造を共有する。これらは主に、それらの細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びカルボキシル（Ｃ）末端尾部の性質により、別々のサブクラスに更に細分される。ＲＴＫの細胞外ドメイン領域は、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインを含む種々の保存されたエレメントを示す。一部の実施形態において、第２のエピトープは、受容体チロシンキナーゼのエピトープである。ＲＴＫファミリーの例としては、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＰＤＧＦＲベータ、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４０Ａ、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ２２０、ＣＤ２４６、ＣＤ３０３ ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３及びＣＤ３４０が挙げられる。

【0236】

例えば、一部の実施形態では、第２の標的エピトープはＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）である。ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ－２またはＣＤ３４０としても知られている）は、がん関連抗原であり、ＥｒｂＢサブファミリーの受容体チロシンキナーゼの一例である。ＨＥＲ２の発現は健康な組織では低く、Ｈｅｒ２＋がんでは正常組織と比較して最大４０～１００倍の発現増加がある。Ｈｅｒ２の過剰発現は、多くの乳癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、子宮体癌、ＮＳＣＬＣ、及び大腸癌と関連している。多くのがんにおいて、ＨＥＲ２は他のＥｒｂＢ受容体と二量体化し、様々な下流シグナル伝達経路の活性化をもたらし、その結果、コントロールされない増殖及びアポトーシス抵抗性につながる。ＨＥＲ２の過剰発現は生存率の低下と相関するため、予後を向上させる標的であり、腫瘍マーカーでもある。ＨＥＲ２のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、トラスツズマブは、ＨＥＲ２のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0237】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＥＧＦＲである。ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）は、がん関連抗原であり、ＥｒｂＢサブファミリーの受容体チロシンキナーゼの一例である。ＥＧＦＲは複数の臓器で発現し、上皮細胞及び上皮由来の腫瘍の挙動を司るシグナル伝達の開始において重要な役割を果たす。ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達は、多様な細胞経路を制御することにより、細胞の増殖、移動、生存、及び転移をコントロールすることにも関与している。他の受容体チロシンキナーゼと同様に、ＥＧＦＲ活性に影響を与えるまたはＥＧＦＲ上方制御につながる突然変異は、多くのがんに関連している。実際、ＥＧＦＲの遺伝子変異は固形腫瘍の最大３０％で観察され、典型的に予後不良と関連している。細胞外ドメインへのＥＧＦの結合を阻害すること、または細胞内チロシンキナーゼ活性を阻害することによってＥＧＦＲシグナル伝達を破壊すると、ＥＧＦＲ発現腫瘍の増殖を制限することができる。したがって、ＥＧＦＲ阻害薬は抗がん剤になり得る。実際、ある特定の腫瘍細胞はＥＧＦＲシグナル伝達に依存しており、したがって「癌遺伝子中毒」を有するため、この受容体は療法の標的として魅力的である。ＥＧＦＲのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、セツキシマブは、ＥＧＦＲのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0238】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、Ｂリンパ球抗原のエピトープである。Ｂ細胞で特に発現する抗原の例としては、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ ＣＤ３７、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７９Ａ、ＣＤ１７９Ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８５、ＣＤ１５０、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１７、ＣＤ２４４、ＣＤ２５５、ＣＤ２２９、ＣＤ２３２、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７７、ＣＤ２７９、ＣＤ２９０、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３０５、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３１６、ＣＤ３１９、ＣＤ３２７、ＣＤ３５２、及びＣＤ３６１が挙げられる。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＣＤ１９である。ＣＤ１９（細胞膜分化抗原１９）は、がん関連抗原である。ＣＤ１９は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通糖タンパク質の一例でもある。一部の実施形態において、第２の標的は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーに存在するエピトープである。このファミリーの例としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５５、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６が挙げられる。ＣＤ１９はＢ細胞においてその発生過程で広く発現し、Ｂ細胞が成熟するにつれてＣＤ１９の表面密度が増加する。ＣＤ１９は、細胞質からのシグナル伝達タンパク質の動員に関与している。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路にも関与しており、Ｂ細胞受容体の機能に不可欠である。Ｂ細胞で発現するため、白血病及び腫瘍性リンパ球に対する有用な標的となるだけでなく、Ｂ細胞から発生するがんの診断バイオマーカーにもなる。ＣＤ１９突然変異は抗体産生の低減及び免疫不全につながる可能性があり、したがってＣＤ１９は、自己免疫疾患の処置の標的にもなり得る。ＣＤ１９のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、ブリナツモマブは、ＣＤ１９のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0239】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、腫瘍間質抗原に存在する。腫瘍間質抗原の例としては、ＦＡＰアルファ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６が挙げられる。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＦＡＰα（線維芽細胞活性化タンパク質α）である。ＦＡＰαは、セプラーゼまたはプロリルエンドペプチダーゼＦＡＰとしても知られるがん関連抗原であり、様々な上皮癌の間質で選択的に発現される。ＦＡＰαは、ジペプチジルペプチダーゼファミリーの細胞表面セリンプロテアーゼの一例である。ＦＡＰαは、腫瘍微小環境で重要な役割を果たす、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）によって発現される。ＣＡＦで選択的に発現される他の分子には、ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１４０Ａ、及びＣＤ１４０Ｂが含まれる。一部の実施形態において、第２のエピトープは、ＣＡＦで選択的に発現される分子に存在するエピトープである。上皮癌（乳癌、ＣＲＣ皮膚癌、及び膵癌）の９０％以上が、周囲の間質のＣＡＦの表面にＦＡＰαを発現することが分かっている。ＣＡＦは、Ｔ細胞上のＣＸＣＲ４に結合する免疫抑制性のケモカインＣＸＣＬ１２を分泌する。ＦＡＰαは、侵襲性黒色腫細胞株で発現することが分かっており、乳癌の転帰及び生存率が不良な患者で著しく増加する。ＦＡＰαはコラゲナーゼ及びジペプチダーゼの両方の活性を有し、腫瘍の増殖、移動、浸潤、転移、及びＥＣＭの分解を促進する。正常で健康な成体組織では、組織リモデリングまたは創傷治癒の領域の外で検出可能なＦＡＰα発現がなく、したがって、ＦＡＰαの発現がほぼ腫瘍間質のみに限られ、がん進行の様々な態様でＦＡＰαが直接的役割を果たすため、ＦＡＰαは有望な抗がん標的である。ＦＡＰαのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、シブロツズマブは、ＦＡＰαのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0240】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、細胞表面糖タンパク質に存在する。タンパク質グリコシル化は、重要かつ一般的な翻訳後修飾である。ヒトタンパク質の５０％超が、タンパク質の機能性を調節するためにグリコシル化されると考えられている。異常なグリコシル化は、炎症性皮膚疾患、真性糖尿病、循環器障害、関節リウマチ、アルツハイマー病及びプリオン病、ならびにがんなどの幾つかの疾患と相関している。細胞表面糖タンパク質の例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２１、ＣＤ３６、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ１７７、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３８、ＣＤ２４３、ＣＤ２２７及びＣＤ３０１が挙げられる。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはメソテリン（ＭＳＬＮ）である。ＭＳＬＮはがん関連抗原であり、細胞表面糖タンパク質の一例である。ＭＳＬＮは、健康細胞での発現は限られるが（胸膜、腹膜、及び心膜を覆う中皮細胞）、いくつかのがん（悪性中皮腫及び膵臓、胆管細胞癌、卵巣腺癌及び肺腺癌、悪性中皮腫、膵癌、卵巣癌、子宮体癌、胆道癌、胃癌、ならびに小児急性骨髄性白血病）でも発現する。ＭＳＬＮは腫瘍分化抗原の一例である。ＭＳＬＮの生理学的機能は不明だが、ＭＳＬＮはＭＳＬＮ＋腫瘍に療法を限局させるための有用な標的であり、または腫瘍マーカーとして利用することもできる。ＭＳＬＮのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、アネツマブは、ＭＳＬＮのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0241】

様々な実施形態において、第２の標的エピトープは、免疫調節薬抗原のエピトープである。免疫調節薬抗原は、免疫系を調節する（活性化または抑制する）抗原である。一部の実施形態において、免疫調節薬抗原は、細胞表面タンパク質（すなわち、細胞の表面に発現する抗原、特にリンパ球、好中球、単球またはマクロファージなどの免疫細胞の表面に発現する抗原）である。免疫調節薬抗原は、Ｖδ１＋Ｔ細胞で発現されることもあれば、異なる細胞、例えばＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、または異なる免疫細胞によって発現されることもある。免疫調節性抗原は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－ＤＣ（ＣＤ２７３）、Ｂ７－Ｈ１（ＣＤ２７４）、Ｂ７－Ｈ２（ＣＤ２７５）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ５４、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＸＣＬ９、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、及びＴＩＭ－３（ＣＤ３６６）からなる群から選択され得る。

【0242】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、刺激性免疫チェックポイント分子のエピトープである。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。ＯＸ４０は免疫調節薬抗原であり、ＴＮＦＲスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの一例である。一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＴＮＦＲＳＦ分子に存在するエピトープである。これらのタンパク質は、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体のスーパーファミリーである。例としては、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２６５、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ３５７及びＣＤ３５８が挙げられる。そのような例の１つであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に発現する後期共刺激性免疫チェックポイント受容体である。ＯＸ４０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞でより高度に発現され、ＯＸ４０の発現はＴ細胞の完全な活性化に依存するため、ナイーブＴ細胞では構成的に発現されない。活性化されると（例えばＯＸ４０Ｌによって）、ＯＸ４０は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、エフェクター及びメモリーＴ細胞の生存及び増大を促進し、また、Ｔｒｅｇ活性を抑制する。これは、腫瘍による免疫回避を抑制する。ＯＸ４０は刺激性標的であるため、ＯＸ４０をターゲティングする療法は、ＯＸ４０発現免疫細胞を活性化して、腫瘍に対する免疫応答（例えば、ＣＤ４８＋Ｔ細胞応答）を刺激する。ＯＸ４０のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、ポガリズマブは、ＯＸ４０のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0243】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに存在するエピトープである。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープは４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のエピトープである。４－１ＢＢは、免疫調節薬抗原であり、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーの一例でもある。これは、ＣＤ７０、ＣＤ１３７、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、及びＣＤ２５８を含むＴＮＦ相同性ドメインを含有するＩＩ型膜貫通タンパク質のタンパク質スーパーファミリーである。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、Ｔ細胞、ならびにＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、単球、好中球及びＢ細胞で発現される誘導性の共刺激性免疫チェックポイント受容体である。４－１ＢＢは、刺激性抗原であり、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞で特に発現される。ｉｎ ｖｉｔｒｏの４－１ＢＢは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ及びＤＣの増大、ならびにサイトカイン産生を刺激する。ｉｎ ｖｉｖｏの４－１ＢＢは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に偏っており、４－１ＢＢの架橋がＴ細胞の増殖、ＩＬ－２の分泌、生存、及び細胞溶解活性を増強することが示されているため、強力な抗腫瘍活性を示す。４－１ＢＢは刺激性標的であるため、４－１ＢＢをターゲティングする療法は、４－１ＢＢ発現免疫細胞を活性化して、腫瘍に対する免疫応答（例えば細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を刺激する。４－１ＢＢのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、ウトミルマブは、４－１ＢＢのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0244】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、免疫チェックポイント阻害薬分子である。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）である。ＴＩＧＩＴは免疫調節薬抗原であり、γδＴ細胞を含むＴ細胞、及びＮＫ細胞に発現する免疫チェックポイント阻害薬の一例である。ＴＩＧＩＴは、免疫恒常性に関与し、そのリガンド（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）に結合することにより自己免疫を防止して、Ｔ細胞を抑制する。ＴＩＧＩＴは、腫瘍浸潤リンパ球で過剰発現する。ＴＩＧＩＴの治療的遮断は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、及び脱顆粒を増加させるため望ましい。ＴＩＧＩＴのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、チラゴルマブは、ＴＩＧＩＴのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0245】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、免疫チェックポイント阻害薬分子である。例えば、一部の実施形態において、第２の標的エピトープはＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）である。ＰＤ－１は免疫調節薬抗原であり、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面受容体メンバーの一例である。ＰＤ－１は、活性化ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにγδＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージなどの他のタイプの免疫細胞で発現される免疫チェックポイント阻害薬の一例である。ＰＤ－１がそのリガンドに結合すると、Ｔ細胞の活性化が阻害される。通常の状況下では、これは免疫恒常性に関与し、Ｔｒｅｇのアポトーシスを減少させ抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを増加させることにより、自己免疫から保護する。がんの状況では、これは細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞を不活性化することにより、腫瘍細胞の免疫回避をもたらす。したがって、ＰＤ－１の遮断は有望な治療標的である。ＰＤ－１のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。例えば、ペムブロリズマブは、ＰＤ－１のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0246】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、刺激性免疫チェックポイント分子である。刺激性免疫チェックポイント分子には、例えば、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌが含まれる。一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌから選択される１つまたは複数である。一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＯＸ４０及び４－１ＢＢから選択される１つまたは複数である。

【0247】

一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、免疫チェックポイント阻害薬分子である。免疫チェックポイント阻害薬分子には、例えば、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ及びＴＩＭ－３が含まれる。一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ及びＴＩＭ－３から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態において、第２の標的エピトープは、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１から選択される１つまたは複数である。

【0248】

本明細書において、細胞「上」にある抗原への言及は、細胞表面膜上で発現されるか、またはそのような細胞の細胞表面膜（その細胞外側）に関連する抗原を指す。

【0249】

様々な実施形態において、第２の標的エピトープは、細胞膜分化ＣＤ抗原のエピトープである。細胞膜分化抗原（ＣＤ）の命名法は、細胞表面分子を同定して命名するための統一体系である。典型的に、細胞表面タンパク質には、前記細胞表面タンパク質に対する少なくとも２つのモノクローナル抗体が産生されるまでＣＤ番号が割り当てられない。したがって、この体系は、ＣＤ番号が割り当てられたすべての細胞表面タンパク質が特定のモノクローナル抗体またはその断片によって認識され結合されやすいことを保証する。様々な実施形態において、ＣＤ抗原は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｂ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｍ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０Ａ、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５８Ａ、ＣＤ１５８Ｂ１、ＣＤ１５８Ｂ２、ＣＤ１５８Ｃ、ＣＤ１５８Ｄ、ＣＤ１５８Ｅ１、ＣＤ１５８Ｅ２、ＣＤ１５８Ｆ１、ＣＤ１５８Ｆ２、ＣＤ１５８Ｇ、ＣＤ１５８Ｈ、ＣＤ１５８Ｉ、ＣＤ１５８Ｊ、ＣＤ１５８Ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５［１７］、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３０、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、及びＣＤ３７１から選択されるものである。

【0250】

健康細胞の温存
γδＴ細胞が抗原を認識し、健康細胞と疾患細胞とを区別するメカニズムは完全には理解されていないが（Ｍｉｎｇ Ｈｅｎｇ ａｎｄ Ｍａｄａｌｅｎｅ Ｈｅｎｇ，Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ γδ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ．Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］，Ａｕｓｔｉｎ（ＴＸ）：Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；２０００－２０１３）、γδＴ細胞が健康細胞と疾患細胞とを区別し、顕著な疾患細胞の多細胞傷害性（表１の細胞型の非限定的な例を参照のこと）を示すことができるという事実は、これらを活用して向上した治療域を有する向上した薬物を提供できることを意味する。更に、このようなγδＴ細胞の能力を活用することにより、特定のがん抗原、炎症性抗原、もしくは病原体抗原が未知である場合、または特定の患者の健康細胞上にも存在する場合でさえ、γδＴ細胞を疾患細胞と共局在化させることにより、健康細胞を温存しながら疾患を処置する機会が提供される。

【表2-1】

【表2-2】

【0251】

１つの非限定的な例として、ＣＤ３×ＨＥＲ２多特異性薬に関する最近の研究は、現在または従来のアプローチの課題を明らかにしている。具体的には、そのような従来のアプローチの使用は、あまり好ましくない毒性プロファイルをもたらし得る。その理由は、他の多くの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と同様に、ＨＥＲ２抗原が乳癌などのがんで発現されるだけでなく、心臓細胞などの健康な組織でも発現されるからである。よって、すべてのＴ細胞と会合してＨＥＲ２陽性細胞と共局在化させるＣＤ３×ＨＥＲ２薬物の使用により、あまり好ましくない治療域または治療指数がもたらされる可能性がある。その理由は、そのような薬物は、循環中の大部分がαβＴ細胞（ＣＤ４＋陽性、ＣＤ８＋陽性など）であるすべてのＴ細胞と会合するからである。そして、αβＴ細胞がＨＥＲ２陽性細胞と共局在化すると、そのような従来のαβＴ細胞は、ＨＥＲ２＋健康細胞を温存する能力の制限、及び罹患したＨＥＲ２＋疾患細胞のみを殺傷する能力の制限を示す。したがって、そしてこの例によれば、このようなＣＤ３×ＨＥＲ２二重特異性薬を投与したカニクイザルの研究において、状況によっては（投薬当日であっても）早期安楽死が必要であった。更に、この研究例では（Ｓｔａｆｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ５（７）：ｅ１３３７５７を参照のこと）、ＨＥＲ２発現細胞を殺傷するためのＴ細胞のリターゲティングが、ＨＥＲ２発現組織に対する有害効果を誘導し得ると結論付けられた。肝臓を除いて、すべての影響を受けた組織または損傷した組織がＨＥＲ２を発現したことが認められた。

【0252】

更なる非限定的な例において、第２の結合特異性は、免疫細胞機能のコントロールまたは調節にも関与する腫瘍関連部位に対するものであり得る。例えば、第２の特異性は、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）またはＣＤ１５５などのいわゆる「チェックポイント阻害薬」をターゲティングするように設計され得る。繰り返しになるが、ＰＤＬ－１もＣＤ１５５も１００％疾患特異的ではない。両方のタンパク質が健康細胞でも発現され得る。しかしながら、Ｖδ１＋細胞をＰＤ－Ｌ１陽性細胞またはＣＤ１５５陽性細胞のいずれかに特異的に共局在化させるように設計された多特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ１５５陽性の疾患細胞またはがん性細胞の選択的殺傷をもたらし得る。がん細胞などの疾患細胞上に存在する疾患関連チェックポイント阻害薬を更にターゲティングすると、そのような腫瘍にＶδ１＋細胞を共局在化させるだけでなく、例えば、さもなければ疾患に対するＴ細胞媒介性免疫応答を負に制御し得るＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５シグナル伝達を調節または抑制することにより、追加の好ましい効果を付与することもできる。

【0253】

よって、そのような従来のアプローチを用いる代わりに、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つの第１の結合特異性がＶδ１＋細胞と結合することができ、少なくとも１つの第２の結合特異性が疾患組織及び細胞上に存在する標的と結合することができる多特異性抗体である。このような多特異性抗体をこのように使用することで、第２の標的を発現する疾患細胞へのＶδ１＋細胞の共局在化がもたらされ得る。更に、このような疾患関連標的がしばしば１００％疾患特異的ではないことを考慮すると、Ｖδ１＋エフェクター細胞を特異的にターゲティングして共局在化させるこのアプローチは、従来のアプローチよりも好ましい可能性がある。その理由は、Ｖδ１＋エフェクター細胞が疾患細胞または感染細胞におけるストレスパターンを認識でき、したがって同様に同じ標的を発現する健康細胞を温存しながら疾患細胞を選択的に殺傷できる可能性があるためである。

【0254】

したがって、本明細書で提示される多特異性抗体は、ｖδ１細胞のＴＣＲに会合できるが、腫瘍細胞も存在しない限り完全な活性化は起こらない。本書で提示される抗体がＴＣＲに完全に会合すると部分的な下方制御が生じ、本書で提示される抗体が結合したｖδ１細胞は、腫瘍細胞などのストレスを受けた細胞の存在下でのみ完全に活性化され、細胞傷害性になると考えられる。これは例えば、図２５、Ｉ、Ｊ、Ｋ、及び図３８Ａ～Ｆに示されている。これは、本明細書で提示されるアプローチに関する別の重要な安全上の利点を表す。なぜなら、オフターゲット細胞傷害性が低減し、ｖδ１細胞を活性化させる多特異性抗体の効力の全てが腫瘍細胞の存在下でのみ解放され、つまり健康細胞（更には多特異性抗体の第２の標的抗原を発現する健康細胞）が温存されるからである。

【0255】

γδＴ細胞が腫瘍細胞のストレスシグナルを検出できるメカニズムの１つは、それらが発現するＮＣＲ（天然細胞傷害性受容体）に起因すると考えられている。ＮＣＲは、腫瘍細胞上のＮＣＲリガンドに会合することができる。したがって、腫瘍細胞を感知して完全な活性化及び細胞傷害性を有効にすることができるＮＣＲを介するものを含む、ＴＣＲ刺激を介してγδＴ細胞が活性化される、活性化のデュアルメカニズムが用いられ得る。

【0256】

これは、例えばＣＤ３を介したαβＴ細胞の刺激とは対照的であり、αβＴ細胞の刺激は、すべての刺激がＴＣＲを介する。したがって、そのような細胞は、例えばＮＣＲを介した、抗原提示に依存しない腫瘍細胞の感知などのメカニズムを有しないため、健康細胞または形質転換細胞の区別がほぼ不可能である。したがって、ＣＤ３抗体がＦｃ有効型であれば、それらは他の免疫細胞を誘引し、これがサイトカインストーム、免疫細胞の消耗及び更には過剰活性化といった予想外の望ましい事象のカスケードを誘起し、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の殺傷などをもたらすことができる。本件のアプローチでは、γδＴ細胞がそれらのＮＣＲ感知メカニズムを介するものを含めて健康細胞と腫瘍細胞とを区別することができ、したがってこの疾患細胞特異性のためにがん細胞またはウイルス感染細胞などのストレスを受けた細胞を選択的に殺傷することができるため、本書で提示される多特異性抗体によるγδＴ細胞の刺激は、このような懸念を生じない。

【0257】

更なる非限定的な例において、患者は肝臓癌を有し得、患者において肝臓癌特異的抗原は未知である。この場合、多特異性抗体の第２の特異性は、多数またはすべての肝臓細胞上に存在するエピトープ、例えばアシアロ糖タンパク質受容体１などに対するものであり得る。これは次いでγδＴ細胞を肝臓に共局在化させ、ここでγδＴ細胞は健康な肝臓細胞を温存しながら肝臓癌細胞を殺傷し得る。これは例えば、図２５、Ｉ、Ｊ、Ｋ及び図３８Ａ～ｆに示されている。第３の非限定的な例として、患者が肺癌を有し、患者において肺癌抗原が未知の場合には、多特異性抗体の第２の特異性は、正常な肺細胞上のエピトープ、例えばＳＰ－１などに対するものであり得る。これはγδＴ細胞を肺に共局在化させ、ここでγδＴ細胞は健康な肺細胞を温存しながら肺癌細胞を殺傷し得る。第４の非限定的な例として、患者がＢ細胞リンパ腫を有し、患者においてＢ細胞リンパ腫抗原が未知の場合には、多特異性抗体の第２の特異性は、正常なＢ細胞上のエピトープ、例えばＣＤ１９などに対するものであり得る。これはγδＴ細胞をＢ細胞に共局在化させ、ここでγδＴ細胞は健康なＢ細胞を温存しながらリンパ腫細胞を殺傷し得る。細胞特異的抗原、細胞関連抗原、組織特異的抗原、及び組織関連抗原は当技術分野において周知であり、そのような抗原はいずれも、本発明の多特異性抗体の第２の特異性によってターゲティングすることができる。

【0258】

第２の結合特異性は、Ｖδ１と同じ細胞上の、または同じ組織型もしくは異なる組織型の異なる細胞上の抗原をターゲティングし得る。ある特定の実施形態において、標的エピトープは、異なるＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞またはウイルス感染細胞を含む異なる細胞上にあり得る。あるいは、標的エピトープは同じ細胞上にあり得る。

【0259】

多特異性抗体またはその断片は、抗体またはその断片が複数の特異性を有する限り、任意のフォーマットで作製することができる。概して、本発明の多特異性（好適には二重特異性）抗体は、少なくとも２つの結合ドメイン、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含む。第１の結合ドメインは、第１の標的抗原（または第１の標的抗原のエピトープ）に対する結合特異性を付与し、ここで第１の標的エピトープは、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１またはＴＲＤＶ１）鎖のエピトープである。第２の結合ドメインは、第２の標的抗原（または第２の標的抗原のエピトープ）に対する結合特異性を付与する。第２の標的抗原は、がん抗原もしくはがん関連抗原でもよく、または第２の抗原は、免疫調節性抗原でもよい。

【0260】

多特異性抗体フォーマットの例は、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）、ノブ・イン・ホール（共通軽鎖）、電荷ペア、Ｆａｂ－アーム交換、ＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλボディ、直交性Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）、ナノボディ、Ｎａｎｏｂｙ－ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、ダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、ドック・アンド・ロック、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡボディ、ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ、タンデムｓｃＦｖ－毒素、ＩｇＧ－ＩｇＧ、ｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、デュオボディ、ｍａｂ^２及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２を含むが、これらに限定されない（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７：９５－１０６を参照のこと）。

【0261】

本明細書に記載される抗体またはその断片は、二重特異性または三重特異性フォーマットなどの多特異性フォーマットでの機能性増強の能力を測定することによって評価することもできる。驚くべきことに、そのような研究を通じて、本明細書に記載される抗体またはその断片の性能におけるなおも更なる機能的向上を特定することが可能である（実施例２０及び２１を参照のこと）。

【0262】

様々な抗体由来の多特異性フォーマットが既報であり、典型的には成分結合部分から経験的に構築される。典型的には、本明細書に記載されるような多特異性または複数標的結合フォーマットが構築されたら、その性能を前述のモデル系（細胞殺傷、細胞増殖、健康細胞温存／疾患細胞特異的モデルなど）のうちの１つまたは複数で測定することができる。これらはまた、場合により、前記構成部分及び他のコンパレータ分子と比較される。

【0263】

このアプローチに限定されるものではないが、抗体を多特異性抗体として構築する場合は概して、各標的（第１、第２、第３など）に対する結合ドメインモジュールは、場合により、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えばＶＨまたはＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディまたは完全長抗体から構築される。例えば、前記結合ドメインまたはモジュールの各々は、可変ドメインを含む結合ドメイン、及び／または完全長抗体、及び／または抗体断片が連続して作動可能に連結されて多特異性抗体を生成する、以下の非限定的なフォーマットのうちの１つまたは複数において作出される。

【0264】

注目すべきことに、本明細書に記載されるようなγδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つ（第１）の結合ドメインを含む多特異性抗体は、前記第１の結合ドメインが組織（「固体」）及び造血系（「液体」）の疾患または細胞型に関連する標的のいずれかに対する少なくとも１つの第２の結合ドメインを含む多特異性抗体フォーマットでフォーマットされる場合に更に増強される。

【0265】

多特異性抗体－非限定的な例：
アプローチの適用可能性を概説するために、多特異性抗体の一連の非限定的な例を構築した。これらの多特異性抗体は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つ（第１）の結合ドメインと、疾患関連標的をターゲティングする少なくとも１つ（第２）の結合ドメインとを含んでいた。

【0266】

第１の例；Ｖδ１－ＥＧＦＲ多特異性抗体：
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的には、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。結果として得られる二重特異性フォーマットは、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット」と呼ばれることがある。この事例において、第１の結合ドメインはγδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングし、第２の結合ドメインはＥＧＦＲをターゲティングする（実施例２０を参照のこと）。

【0267】

第２の例；Ｖδ１－ＥＧＦＲ多特異性抗体：
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、抗体可変ドメイン（具体的にはＶＨ及び同族のＶＬドメインを含む）を含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）内の結合ドメインを含む（ＥＰ２５４６２６８ Ａ１表１／ＥＰ３４８７８８５ Ａ１も参照のこと）。結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、ＥＧＦ受容体をターゲティングする第２の結合ドメインとを含む（実施例２０を参照のこと）。

【0268】

第３の例；Ｖδ１－ＣＤ１９多特異性抗体：
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、ＣＤ１９をターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例２１を参照のこと）。

【0269】

第４の例；更なるＶδ１－ＣＤ１９多特異性抗体
この例では、ＴＲＤＶ１及びＣＤ１９の両方に特異的に結合する追加の多特異性抗体を調製し、抗原結合（ヒト及びカニクイザルＴＲＤＶ１の両方を含む）、Ｖδ１細胞の活性化、及びＶδ１細胞傷害性について試験した（実施例２２及び２３を参照のこと）。

【0270】

第５の例；Ｖδ１－Ｈｅｒ２多特異性抗体
この例では、ＴＲＤＶ１及びＨｅｒ２の両方に特異的に結合する多特異性抗体を調製し、抗原結合、Ｖδ１細胞の活性化、及びＶδ１細胞傷害性について試験した（実施例２４を参照のこと）。

【0271】

第６の例；更なるＶδ１－ＥＧＦＲ多特異性抗体
この例では、ＴＲＤＶ１及びＥＧＦＲの両方に特異的に結合する追加の多特異性抗体を調製し、抗原結合、Ｖδ１細胞の活性化、及びＶδ１細胞傷害性について試験した（実施例２６及び２７を参照のこと）。

【0272】

第７の例；Ｖδ１－ＦＡＰα多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、ＦＡＰαをターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例２９を参照のこと）。

【0273】

第８の例；Ｖδ１－メソテリン多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、メソテリンをターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例３０を参照のこと）。

【0274】

第９の例；Ｖδ１－ＰＤ－１多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第２の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第１の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、ＰＤ－１をターゲティングする第１の結合ドメインと、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例３２を参照のこと）。

【0275】

第１０の例；Ｖδ１－４－１ＢＢ多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、４－１ＢＢをターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例３３を参照のこと）。

【0276】

第１１の例；Ｖδ１－ＯＸ４０多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第１の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第２の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第１の結合ドメインと、ＯＸ４０をターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例３４を参照のこと）。

【0277】

第１２の例；Ｖδ１－ＴＩＧＩＴ多特異性抗体
この例では、１つの結合ドメイン（第２の標的に対する）は、インタクトな抗体部位、具体的にはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬパートナーを含み、第２の結合ドメイン（第１の標的に対する）は、抗体断片、具体的にはｓｃＦｖフォーマットを含んでいた。次いで、リンカーを用いて２つの結合モジュールを融合させた。この例では、結果として得られる二重特異性は、ＴＩＧＩＴをターゲティングする第１の結合ドメインと、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする第２の結合ドメインとを含んでいた（実施例３５を参照のこと）。

【0278】

注目すべきことに、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つ（第１）の結合ドメインと、第２のエピトープをターゲティングする少なくとも１つの第２のドメインとを含む前記例のすべてにおいて、対照及び構成部分と比べて機能性の増強が観察された（本明細書の実施例２０～３５を参照のこと）。

【0279】

まとめると、これらの非限定的な例は、本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片の柔軟性を明らかにしている。これらの非限定的な例は、生殖系Ｖδ１鎖（配列番号１のアミノ酸１～９０）をターゲティングする抗体またはその断片を第２の結合ドメインと組み合わせて多特異性抗体を形成することによって更に増強できる多特異性抗体アプローチを概説する。非限定的な例として、本明細書では、機能性が増強され、インタクトな抗体（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬ）、及び／または可変ドメイン（ＶＨ及び同族のＶＬまたはＶＨ－ＣＨ１及び同族のＶＬ－ＣＬ）、及び／または抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む結合ドメインを含有する多特異性抗体が提供される。

【0280】

一実施形態において、γδＴＣＲのＶδ１鎖（第１の標的）をターゲティングする多特異性抗体結合ドメインは、（ｉ）重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）及び同族の軽鎖パートナー（ＶＬ－ＣＬ）を各々が含む１つもしくは２つ以上の抗体結合ドメイン、及び／または（ｉｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ、またはＶＨ－ＣＨ１）及び同族の軽鎖可変ドメインパートナー（ＶＬ、またはＶＬ－ＶＣ）を各々が含む１つもしくは２つ以上の抗体結合ドメイン、及び／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ含有抗体断片を各々が含む１つもしくは２つ以上の抗体結合ドメインを含み得る。

【0281】

一実施形態において、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つの第１の抗体由来結合ドメインを含み、これが第２のエピトープをターゲティングする少なくとも１つの第２の抗体結合ドメインに作動可能に連結している多特異性抗体が提供される。場合により、前記結合ドメインは、少なくとも１つもしくは複数のＶＨ及び同族のＶＬ結合ドメイン、または１つもしくは複数のＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３及び同族のＶＬ－ＣＬ結合ドメイン、または１つもしくは複数の抗体断片結合ドメインを含む。場合により、前記第２の結合ドメインは、細胞の細胞表面に関連する、または細胞表面上で発現される、第２のエピトープをターゲティングする。場合により、前記第２のエピトープは、疾患細胞または腫瘍細胞またはウイルス感染細胞または自己免疫組織細胞に関連する細胞表面ポリペプチド上に位置する。場合により、前記第２のエピトープまたは複数のエピトープは、疾患及び細胞型に関連するＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＦＡＰα、メソテリン、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＴＩＧＩＴ抗原上に位置する。場合により、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つの第１の抗体由来結合ドメインを含む前記多特異性抗体は、ＥＧＦ受容体と結合し、ＥＵ命名法に従う以下の重鎖改変のうちの１つまたは複数を含む、第２の結合ドメインに作動可能に連結している；Ｌ３５８Ｔ及び／またはＴ３５９Ｄ及び／またはＫ３６０Ｄ及び／またはＮ３６１Ｇ及び／またはＱ３６２Ｐ及び／またはＮ３８４Ｔ及び／またはＧ３８５Ｙ及び／またはＱ３８６Ｇ及び／またはＤ４１３Ｓ及び／またはＫ４１４Ｙ及び／またはＳ４１５Ｗ及び／またはＱ４１８Ｙ及びまたはＱ４１９Ｋ。

【0282】

場合により、γδＴＣＲのＶδ１鎖をターゲティングする少なくとも１つの第１の抗体由来結合ドメインを含む多特異性抗体は、配列番号１４７もしくは配列番号１４８もしくは配列番号１４９もしくは配列番号１５７またはそれらの機能的に同等な結合変異体を含み、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、ＦＡＰα、メソテリン、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＴＩＧＩＴをターゲティングする、第２の結合ドメインに作動可能に連結している。場合により、結果として得られる多特異性抗体は、配列番号１４０または配列番号１４１または配列番号１４２または配列番号１４４または配列番号１４５または配列番号１４６または配列番号１５８または配列番号１５９を含む。前記実体は、理解を助けるための非限定的な新規組成物としてここに含まれている。

【0283】

本発明の一態様において、本発明の多特異性抗体は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を改善するような、疾患または障害を処置するために治療上有効な量で使用され得る。

【0284】

一実施形態において、多特異性抗体フォーマットにおけるγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法が提供され、ここで、前記多特異性抗体は、前記多特異性実体によってＶδ１＋細胞に対して（例えば、前記Ｖδ１＋表現型及び／または細胞傷害性及び／または疾患細胞特異性及び／またはその増強に対して）付与される効果を測定するために、Ｖδ１＋細胞に適用される。

【0285】

イムノコンジュゲート
本発明の多特異性抗体またはその断片は、細胞毒素または化学療法剤などの治療部位にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートは、イムノコンジュゲートと称され得る。本明細書で使用する場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、細胞毒素、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的部位もしくはレポーター部位、酵素、毒素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤などの別の部位に化学的または生物学的に連結された抗体を指す。抗体は、その標的と結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的部位もしくはレポーター部位、酵素、毒素、ペプチドまたは治療剤に連結されていてよい。イムノコンジュゲートの例には、抗体薬物コンジュゲート及び抗体－毒素融合タンパク質が含まれる。一実施形態において、薬剤は、Ｖδ１に対する第２の異なる抗体であり得る。ある特定の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に特異的な薬剤にコンジュゲートされ得る。抗Ｖδ１抗体にコンジュゲートされ得る治療部位の種類は、処置すべき状態及び達成すべき所望の治療効果を考慮したものになる。一実施形態において、薬剤は、Ｖδ１以外の分子に結合する第２の抗体またはその断片であり得る。

【0286】

γδＴ細胞を調節するための薬物
本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、ＴＲＤＶ１結合ドメインを介して、患者のデルタ可変１鎖（Ｖδ１）Ｔ細胞をｉｎ ｓｉｔｕ（すなわちｉｎ ｖｉｖｏ）で調節するために使用され得るか、または調節するために有用であり得る。多特異性抗体またはその断片は、そのような目的のための薬物に含まれ得る。

【0287】

Ｖδ１ Ｔ細胞の調節は以下を含み得る：
－ 例えばＶδ１ Ｔ細胞の数を選択的に増加させることによるＶδ１ Ｔ細胞の増大、またはＶδ１ Ｔ細胞の生存の促進；
－ 例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞効力を増加させること、すなわち標的細胞の殺傷を増加させることによる、Ｖδ１ Ｔ細胞の刺激；
－ 例えば、Ｖδ１ Ｔ細胞の持続性を増加させることによる、Ｖδ１ Ｔ細胞消耗の防止；
－ Ｖδ１ Ｔ細胞の脱顆粒；
－ ＮＣＲ発現の増加；
－ 例えば、Ｖδ１ ＴＣＲ 細胞表面発現の下方制御による、すなわち、Ｖδ１ ＴＣＲの内部移行もしくはＶδ１ ＴＣＲタンパク質の発現低下を引き起こすこと、またはＶδ１ ＴＣＲの結合を遮断することによる、Ｖδ１ Ｔ細胞の免疫調節；及び／または
－ ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御。

【0288】

Ｖδ１ Ｔ細胞の枯渇に焦点を当てる先行技術の抗Ｖδ１抗体とは異なり、本発明の多特異性抗体は、ＴＲＤＶ１結合ドメインを介したＶδ１ Ｔ細胞の活性化に有用である。これらは、結合するＴ細胞上のＴＣＲの下方制御を引き起こし得るが、Ｖδ１ Ｔ細胞の枯渇を引き起こすことはなく、むしろＴ細胞を刺激するため、Ｔ細胞のこのコンパートメントの活性化から恩恵を受ける治療状況において有用であり得る。Ｖδ１ Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ下方制御、ＣＤ３下方制御、ＣＤ２５及びＫｉ６７などの活性化マーカーならびに脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの変化から明らかである。Ｖδ１ Ｔ細胞の活性化は、結果として、ＩＮＦγ及びＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの放出を誘起して、免疫ライセンシングを促進する。

【0289】

本発明の一実施形態において、
ａ． Ｖδ１ Ｔ細胞上のＴＣＲの下方制御を引き起こすこと、
ｂ． ＣＤＣまたはＡＤＣＣを示さないこと、及び
ｃ． Ｖδ１ Ｔ細胞を枯渇させないこと
を特徴とする、多特異性抗Ｖδ１抗体またはその抗原結合性断片が提供される。

【0290】

一部の実施形態において、多特異性抗Ｖδ１抗体または抗原結合性断片は、Ｖδ１ Ｔ細胞の増殖も刺激する。

【0291】

Ｔ細胞枯渇は、Ｔ細胞死の除去または低減のプロセスである。Ｖδ１ Ｔ細胞を枯渇させない多特異性抗体または抗原結合性断片への言及は、コントロールされた研究において任意の好適な手段によって測定した場合の（例えば、コントロールされたフローサイトメトリー方法による、または他の確立されたコントロールされたアッセイによる）、本明細書に記載される本発明の抗体のうちの１つまたは複数による、インキュベート時の生存可能なＶδ１ Ｔ＋細胞集団の約３０％未満または約２０％未満（好ましくは約１０％未満）の枯渇を指す。

【0292】

ＡＤＣＣ及びＣＤＣは、Ｔ細胞枯渇を発生させ得るメカニズムである。本明細書における、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを引き起こさない抗体または抗原結合性断片への言及は、任意の好適な手段によって測定した場合の（例えば、コントロールされたフローサイトメトリー方法による、または他の確立されたコントロールされたアッセイによる）、本明細書に記載される本発明の抗体のうちの１つまたは複数による、インキュベート時のＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを介した、生存可能なＶδ１ Ｔ＋細胞集団の約３０％未満または約２０％未満（好ましくは約１０％未満）の枯渇を指す。

【0293】

一実施形態において、ＩＬ－１７Ａの分泌を誘導しないことを特徴とする多特異性抗Ｖδ１抗体またはその抗原結合性断片が提供される。ＩＬ－１７Ａ（インターロイキン－１７Ａ）は、活性化されたＴ細胞によって産生される腫瘍形成促進性サイトカインである。ＩＬ－１７Ａは、腫瘍の増殖を増強し、抗がん免疫応答を抑制し得る。図３８、Ｇ～Ｉに示すように、抗ｖδ１抗体はＩＬ－１７Ａの分泌を誘導しないが、抗ＣＤ３抗体は誘導する。本明細書における、ＩＬ－１７Ａの分泌を誘導しない抗体または抗原結合性断片への言及は、同等なＣＤ３多特異性抗体によって誘導されるＩＬ－１７Ａ分泌の約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満を誘導することを指す。

【0294】

以下のセクションの一部は、単特異性フォーマットで提供され、本発明では多特異性（好適には二重特異性）フォーマットでの使用が特に企図される、抗Ｖδ１抗体に関する。好適には、単特異性フォーマットで提供される場合の抗体の機能特性は、さらに第２の抗原に特異的に結合する本発明の多特異性抗体によって共有される。

【0295】

Ｖδ１＋細胞上の免疫細胞マーカーを調節する薬物
多特異性抗体またはその断片は、患者に投与されると、Ｖδ１＋細胞の免疫細胞マーカーを調節し得る。

【0296】

本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、γδＴ調節を測定することにより、その治療的使用への適性について評価することもでき、そのような評価は、抗体が単特異性フォーマットで提供される場合に行うことができる。例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞またはモデル系の細胞に存在するＣＤ２５またはＣＤ６９またはＣＤ１０７ａのレベルの変化を測定することによる。そのようなマーカーは、リンパ球調節（例えば増殖または脱顆粒）のマーカーとして使用されることが多く、本明細書に記載される抗体またはその断片の適用後、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。驚くべきことに、そのような評価において（例えば実施例７、１７、１８などを参照のこと）、本明細書に記載される多特異性抗体の単特異性バージョンは、標的Ｖδ１＋Ｔ細胞における測定可能により高いレベルのＣＤ２５またはＣＤ６９またはＣＤ１０７ａレベルを付与したことが観察された。場合により、モデル系で試験したＶδ１＋細胞またはその集団の表現型の変化を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３、ＴＳ８．２など）を前記同等なγδＴ細胞に適用したときの表現型の変化と比較してもよい。

【0297】

よって、本発明の一態様において、治療的使用のためのγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に抗体またはその断片を投与することと、Ｖδ１＋細胞の表面上のＣＤ２５及び／またはＣＤ６９及び／またはＣＤ１０７ａのレベルに対する効果を決定することとを含む方法が提供される。ＣＤ２５、ＣＤ６９及び／またはＣＤ１０７ａのレベルに対する効果は、一定期間にわたって決定／測定され得る。この効果は、同じ期間にわたって前記抗体を前記細胞に適用しない場合のＶδ１＋細胞の表面上のＣＤ２５及び／またはＣＤ６９及び／またはＣＤ１０７ａのレベルと比較して測定され得ることは理解されよう。本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に前記抗体を付加し、次いで前記Ｖδ１＋細胞の表面上のＣＤ２５またはＣＤ６９またはＣＤ１０７ａのレベル（または発現）を測定することによって行われる方法が提供される。

【0298】

Ｖδ１＋細胞の増殖特性または数を調節する薬物
多特異性抗体またはその断片は、患者に投与されると、Ｖδ１＋細胞の増殖特性を調節し得る。例えば、多特異性抗体またはその断片は、Ｖδ１＋細胞を増大させ得る。

【0299】

γδＴ増殖を測定するための代替のアプローチは、Ｖδ１＋細胞を含有するモデル系に、本明細書に記載される抗体またはその断片を適用したときの前記細胞の相対数における経時的な変化を測定することを含み得る。驚くべきことに、そのような評価において、本明細書に記載される抗体は、単特異性フォーマットで提供された場合、前記Ｖδ１＋Ｔ細胞の数を測定可能に増加させることができたことが観察された（例えば実施例１０、１７及び１８などを参照のこと）。場合により、この数の変化は、代替的なコンパレータ抗体（例えば抗ＯＫＴ３）を前記モデル系に適用したときに観察される数の変化と比較してもよい。

【0300】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に抗体またはその断片を投与することと、集団内のＶδ１＋細胞の数に対する効果を決定することとを含む方法が提供される。細胞数に対する効果は、一定期間にわたって決定／測定され得る。この効果は、同じ期間にわたって前記抗体を細胞集団に適用しない場合に観察される細胞数に対する効果と比較して測定され得ることは理解されよう。本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に前記抗体を適用し、次いで前記細胞の数を経時的に測定することによって行われる方法が提供される。

【0301】

Ｖδ１＋細胞の増殖能力及び数を調節する薬物
γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される理想的な治療用多特異性抗体またはその断片は、ｉｎ ｖｉｖｏでＶδ１＋細胞の増殖を増強できるものであり得る。そのような抗体は、対象または患者のＶδ１＋細胞数を特異的に増加させるように設計された薬物として用いることができる。例を以下に示す。

【0302】

がん：
Ｖδ１＋細胞の数における相対的増加は、多くのがんについて転帰の向上に関連する正の予後指標として報告されている（例えば、Ｇｅｎｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２１：９３８－９４５、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．１１（５１３）：ｅａａｘ９３６４、Ｃａｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９（５）：２０７８－２０８５を参照のこと）。一実施形態において、本明細書で提示されるのは、がん患者においてｉｎ ｓｉｔｕでＶδ１＋細胞の相対数または絶対数を増加させることができる薬物である。

【0303】

病原性／寄生虫／ウイルス感染症：
Ｖδ１＋細胞の濃縮は、多数の後天性病原性／寄生虫／ウイルス感染症に対する宿主防御中に観察される。最近の総説については、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２０１８：５０８１６３４を参照のこと。さらに、Ｖδ１＋の数の増加は、種々のＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの感染を防ぐとも考えられている。例えば、数の増加は、同種異系移植片に関連するＣＭＶ感染においても防御的であると考えられている（ｖａｎ Ｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １７（２）：Ｓ２１７を参照のこと）。さらに、Ｖδ＋細胞数は、コロナウイルス感染患者において増加する（Ｐｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９３（９）：１２４４－１２４９）。

【0304】

別の実施形態において、本明細書で提示されるのは、病原性感染症を有する対象または患者におけるＶδ１＋細胞の相対数または絶対数を増加させることができる薬物である。

【0305】

幹細胞移植：
Ｖδ１＋細胞数の増加は、疾患再発の減少、ウイルス感染の減少、全生存率及び無病生存率の上昇、ならびに造血幹細胞移植中の全般的に良好な臨床転帰にも関連している（例えば、Ａｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｌｏｏｄ ３（２１）：３４３６－３４４８及びＧｏｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３９：７５１－７５７を参照のこと）。よって、別の実施形態で、本明細書で提示されるのは、幹細胞移植を支持する処置レジメンの一部として、対象におけるＶδ１＋細胞の相対数または絶対数を増加させることができる薬物である。

【0306】

したがって、ｉｎ－ｓｉｔｕでＶδ１＋細胞の数を優先的または特異的に増加させることができる薬物が非常に望ましい。

【0307】

Ｖδ１＋細胞のサイトカイン分泌を維持する、または誘導する、または増加させる薬物
サイトカインは、免疫系の特定の細胞によって分泌されるタンパク質、ペプチド、または糖タンパク質の大きなグループである。それらは、免疫、炎症、及び造血を媒介し制御するシグナル伝達分子のカテゴリである。いくつかのサイトカインは、腫瘍及び細胞の微小環境、自己免疫組織及び関連する微小環境、またはウイルスに感染した組織もしくは細胞の環境の直接的または間接的な調節を通じて、疾患の徴候及び症状を改善させることに関係付けられてきた。例示的な炎症誘発性サイトカインには、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）及びインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）が含まれる。

【0308】

しかしながら、そのようなサイトカインの多くは、全身投与すると好ましくない毒性を示す。例えば、ＴＮＦαは移植された腫瘍の出血性壊死を誘導することができ、他の化学療法薬と組み合わせると相乗的な抗腫瘍効果を発揮することが報告されているが、全身性組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）を用いる様々な臨床試験は、低血圧、悪寒、静脈炎、血小板減少、白血球減少及び肝毒性、発熱、疲労、悪心／嘔吐、倦怠感及び脱力感、頭痛、胸部絞扼感、腰背痛、下痢ならびに息切れを含む重大な用量制限副作用を明らかにしている。

【0309】

組換えＩＦＮγの使用にも同様の全身毒性の課題がある。例えば、がんの状況において、ＩＦＮγは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの上方制御を含む好ましい多面的効果を発揮して、抗腫瘍免疫を刺激し、Ｔ細胞浸潤を増加させ、抗血管新生効果を付与し、ケモカイン／サイトカインの分泌を誘導し、直接的ながん細胞増殖抑制効果を発揮し得るが、有害な副作用も観察されている。これらには、発熱、頭痛、寒気、疲労、下痢、悪心、嘔吐、食欲不振、肝トランスアミナーゼの一時的増加、ならびに顆粒球数及び白血球数の一時的減少が含まれる。

【0310】

全身性組換えＴＮＦα及びＩＦＮγの可能性及び制限の両方に関する最近の概説については、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ．５１（４）：ｅ１２４４１を参照のこと。

【0311】

よって、そのようなサイトカインの、よりｉｎ ｓｉｔｕでコントロールされた、より局所化された、より組織特異的または細胞特異的な産生が必要である。例えば、炎症誘発性サイトカインのよりコントロールされた発現または誘導が、「コールド」腫瘍を「ホット」に変えることができる１つのアプローチとして提唱されている。ホット腫瘍は、ＣＤ４５＋Ｔ細胞の数または密度の増加も観察されるため、「Ｔ細胞炎症性」と呼ばれることもある。最近の概説については、Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１６８を参照のこと。

【0312】

このような理由で、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される理想的な多特異性抗体またはその断片は、ｉｎ ｖｉｖｏでＶδ１＋細胞におけるサイトカインの分泌を維持する、または増強する、または誘導することができるものであり得る。このような抗体は、対象または患者において、より局所的で全身的ではない様式でサイトカインを特異的に増加させるまたは誘導するように設計された薬物として、かつ前記対象または患者におけるＶδ１＋細胞の分布とよりよく相関するものとして用いられ得る。

【0313】

注目すべきことに、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される多特異性抗体の単特異性バージョンをＶδ１＋細胞に適用すると、著しく高いレベルの分泌サイトカインが観察される。より具体的には、また非限定的な例として、著しく高いレベルのＴＮＦα及びＩＦＮγが観察される。例えば実施例１５を参照のこと。

【0314】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体もしくは多特異性抗体またはそれらの断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に抗体またはその断片を投与することと、細胞集団によって産生された少なくとも１つのサイトカインの量を決定することとを含む方法が提供される。産生されたサイトカインの量は、一定期間にわたって決定／測定してもよく、場合により、同じ期間にわたって前記抗体を細胞集団に適用しない場合に観察される量と比較してもよい。一実施形態において、抗体を細胞集団に投与した場合に産生されるサイトカインの観察されるレベルは、抗体を適用しない場合に産生されるサイトカインのレベルに比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約５０％超、約１００％超、約１５０％超、約２００％超、約２５０％超、約３００％超、約３５０％超、約４００％超、約４５０％超、約５００％超、約１０００％超である。本発明の更なる態様において、サイトカインは炎症誘発性サイトカインである。本発明の更なる態様において、サイトカインはＴＮＦ－αサイトカインである。本発明の更なる態様では、ＩＦＮ－γサイトカインである。

【0315】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体もしくは多特異性抗体またはそれらの断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に前記抗体を適用し、次いで生成された少なくとも１つのサイトカインのレベルを測定することにより行われる方法が提供される。本発明の更なる態様において、測定されるサイトカインは、ＴＮＦ－αサイトカイン及び／またはＩＦＮ－γサイトカインである。

【0316】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体もしくは多特異性抗体またはそれらの断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に前記抗体またはその断片を適用し、産生された炎症誘発性サイトカインの量及び／または腫瘍もしくは腫瘍微小環境に存在するＣＤ４５＋Ｔ細胞の数もしくは密度を決定することによって、抗体がよりコールドまたはコールドな腫瘍を調節してよりホットまたはホットな腫瘍にする効果を測定することにより行われる方法が提供される。

【0317】

Ｖδ１＋細胞のグランザイムＢ活性を維持する、または誘導する、または増加させる薬物
グランザイムＢは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及び細胞傷害性Ｔ細胞の顆粒に一般的に見出されるセリンプロテアーゼである。グランザイムＢは、これらの細胞によってポア形成タンパク質パーフォリンと共に分泌され、疾患細胞などの標的細胞のアポトーシスを媒介する。

【0318】

モデル系において標的疾患細胞（がん細胞など）との共培養物でＶδ１＋細胞をインキュベートすると、溶解前の標的疾患細胞においてグランザイムＢレベル及び活性のレベルを測定することができる。注目すべきことに、このようなモデル系で、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を、Ｖδ１＋細胞及びがん細胞のこのような共培養物に適用すると、細胞死前の疾患がん細胞においてより高いグランザイムＢレベル及び活性が観察される（例えば実施例１６を参照のこと）。

【0319】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞及び疾患細胞（がん細胞など）を含む共培養物に抗体またはその断片を投与することと、共培養物中の疾患細胞によって産生されたグランザイムＢの量に対する効果を測定することとを含む方法が提供される。産生されたサイトカインの量は、一定期間にわたって決定／測定してもよく、場合により、同じ期間にわたって前記抗体を前記共培養物に適用しない場合に観察される量と比較してもよい。一実施形態において、前記抗体を前記共培養物に適用した場合に測定されるグランザイムＢのレベルは、前記抗体を適用しない場合に観察されるグランザイムＢレベルに比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約１００％超、約２００％超である。

【0320】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞及び疾患細胞を含む共培養物に前記抗体を適用し、次いで疾患細胞におけるグランザイムＢの量または活性を測定することによって行われる方法が提供される。

【0321】

ポリクローナルＶδ１＋細胞集団を増大させる薬物
理想的な多特異性抗体薬物は、Ｖδ１＋細胞の増大が超可変ＣＤＲ３配列レベルでクローン的に集中しすぎないことを保証するように設計されたものでもあり得る。よって、理想的な抗体薬物は、特定のまたは「プライベートな」δ１＋ＣＤＲ３配列パラトープに結合することによってＶδ１＋細胞の増殖を誘導することを回避するように設計され得る。むしろ、抗体は、一部のＶδ１＋細胞のみで提示される配列に結合するのではなく、すべてのＶδ１＋Ｔ細胞受容体に存在する保存された生殖系配列を介して、かつガンマ鎖に依存しない様式で結合し得る。

【0322】

よって、理想的な抗体薬物は、Ｖδ１＋細胞の増大を刺激して、ＣＤＲ３配列の混合物を含有する複数のＶδ１＋細胞を生成することができる。この結果、デルタ可変１鎖上に異なるＣＤＲ３配列を提示するＶδ１＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏで増大した異種ポリクローナル集団が得られる。注目すべきことに、Ｖδ１＋細胞を含有する免疫細胞の出発集団に本明細書に記載される抗体またはその断片を付加する方法によって生成された、増大したＶδ１＋細胞集団の分析中に、抽出されたＲＮＡのＣＤＲ３超可変領域を通してシーケンシングするように設計されたＲＮＡｓｅｑベースの方法によって、高度のポリクローナル性が観察されている（例えば実施例１０を参照のこと）。

【0323】

したがって、一態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞を含む細胞集団に抗体またはその断片を投与することと、増大したＶδ１＋細胞のポリクローナル性を決定することとを含む方法が提供される。抗体薬物が、複数のＶδ１＋ＣＤＲ３配列を含有する増大したポリクローナル集団を生成することが望ましい。ポリクローナル性は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、前記Ｖδ１＋細胞のＶδ１鎖超可変ＣＤＲ３含有量を分析することができる核酸シーケンシングアプローチによって決定することができる。

【0324】

ポリクローナルＶδ１＋細胞を長時間増大させる薬物
理想的な多特異性抗体薬物は、初代Ｖδ１＋細胞をｉｎ ｖｉｖｏで消耗することなく、かかる細胞の増殖を増強する、または促進する、または刺激することができる可能性がある。例えば、比較として、ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３薬物（例えばムロノマブ）は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を増大させることができる一方で、消耗する、またはアネルギーを誘導することもある。本明細書に記載されるγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する多特異性抗体の単特異性バージョンが生存可能なＶδ１＋細胞の持続的な細胞分裂を駆動する能力を評価するために、単特異性抗体を使用してより長期の増殖研究を行った。注目すべきことに、これらの研究により、本明細書に記載される、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する多特異性抗体の単特異性バージョンが、生存可能で依然として機能的に細胞傷害性であるＶδ１＋細胞の細胞分裂／増殖を４０日以上駆動できることが明らかになった（例えば実施例１０を参照のこと）。

【0325】

一実施形態において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、抗体またはその断片を細胞集団に適用することと、Ｖδ１＋細胞の分裂が起こる時間の長さをモニタリングすることとを含む方法が提供される。抗体は、５～６０日間、例えば少なくとも７～４５日間、７～２１日間、または７～１８日間にわたってＶδ１＋細胞の分裂を刺激することができるのが理想的である。

【0326】

更なる実施形態では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合し、患者に投与されるとＶδ１＋細胞の分裂を刺激して、その数を少なくとも２倍の数、少なくとも５倍の数、少なくとも１０倍の数、少なくとも２５倍の数、少なくとも５０倍の数、少なくとも６０倍の数、少なくとも７０倍の数、少なくとも８０倍の数、少なくとも９０倍の数、少なくとも１００倍の数、少なくとも２００倍の数、少なくとも３００倍の数、少なくとも４００倍の数、少なくとも５００倍の数、６００倍の数で、少なくとも１，０００倍の数だけ増加させることができる、本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片が提供される。

【0327】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞、またはＶδ１＋細胞を含有する混合細胞集団に前記抗体を適用し、次いでＶδ１＋細胞数を経時的に測定することによって行われる方法が提供される。

【0328】

Ｖδ１＋免疫細胞のターゲティングによって非Ｖδ１＋免疫細胞を調節する薬物
本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、他の免疫細胞のＶδ１＋細胞媒介性調節を測定することによって評価することもできる。例えば、非γδＴ細胞「画分」で観察される変化が、ヒト組織αβ細胞及びγδＴ細胞を含むものなどの免疫細胞の混合集団を含むモデル系に、本明細書に記載される抗体またはその断片を適用した後に測定され得る。更に、前記モデルにおける非γδ細胞型に対する効果は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、γδＴ細胞及び非γδＴ細胞を含む混合培養物に、本明細書に記載される抗体またはその断片を付加した際の、ＣＤ８＋αβＴ細胞の数における相対的変化を測定することによる。場合により、非γδＴ細胞ＣＤ８＋リンパ球集団の数または表現型において観察される変化を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３）を前記混合集団に適用した場合の数の変化と比較してもよい。

【0329】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞及びＶδ１陰性免疫細胞を含む免疫細胞または組織の混合集団に抗体またはその断片を投与することと、Ｖδ１陰性免疫細胞に対する効果を測定することとを含む方法が提供される。この効果は、一定期間にわたって決定／測定してもよく、場合により、同じ期間にわたって前記抗体を適用しない場合にＶδ１陰性細胞で観察される効果と比較してもよい。この効果は、Ｖδ１陰性免疫細胞の数の変化として測定され得る。例えば、抗体は、Ｖδ１陰性免疫細胞の数を、前記抗体を適用しない場合に観察されるレベルに比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約１００％超、約５００％超増加させ得る。

【0330】

本発明の更なる態様において、調節されるＶδ１陰性細胞は、ＣＤ４５＋細胞である。本発明の更なる態様において、調節される細胞は、αβＴ細胞である。本発明の更なる態様において、調節されるαβ＋細胞は、ＣＤ８＋リンパ球である。本発明の更なる態様において、調節されるαβＴ細胞またはその集団は、細胞分裂の増強の証拠を示す。本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞及びＶδ１陰性免疫細胞を含む免疫細胞の混合集団に前記抗体を投与し、次いで前記抗体またはその断片によって調節されたＶδ１＋細胞によりＶδ１陰性細胞集団に付与された効果を測定することによって行われる方法が提供される。

【0331】

場合により、本明細書に記載される抗体またはその断片によって付与される「Ｖδ１＋細胞媒介性免疫系調節」中に、Ｖδ１＋細胞数の付随する増加も観察される。そして、この理論に束縛されるものではないが、Ｖδ１＋細胞数における前記増加は、αβＴ細胞などの共存するＶδ１陰性免疫細胞の同時増大を駆動する原因となり得る可能性がある。代替の仮説は、Ｖδ１＋Ｔ細胞からの抗体誘導性サイトカイン分泌がＶδ１陰性免疫細胞の増大を刺激するというものであり得る。

【0332】

本発明の更なる態様において、αβ＋ＣＤ８＋リンパ球集団で観察される増加は、ＯＫＴ３抗体または代替の抗Ｖδ１抗体などのコンパレータ抗体と比較される。本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋Ｔ細胞及びαβＴ細胞を含む免疫細胞の混合集団に前記抗体を適用し、次いでＣＤ８＋αβ＋Ｔ細胞リンパ球の数を経時的に測定することによって行われる方法が提供される。

【0333】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調節する薬物
本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、モデル系において腫瘍浸潤集団（ＴＩＬ）に付与される効果を測定することによって評価することもできる。驚くべきことに（例えば実施例１８を参照のこと）、そのような評価において、本明細書に記載される多特異性抗体の単特異性バージョンは、ヒト腫瘍におけるＴＩＬ集団を測定可能に調節した。例えば、γδ＋リンパ球ＴＩＬ集団または非γδリンパ球ＴＩＬ集団の数または表現型のいずれかにおける変化が、本明細書に記載される抗体またはその断片をヒト腎細胞癌などのヒト腫瘍に適用した後に測定される。場合により、γδ＋リンパ球ＴＩＬ集団または非γδリンパ球ＴＩＬ集団のいずれかの数または表現型において観察される変化を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３）を前記モデル系に適用した場合に観察される変化と比較してもよい。

【0334】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、ヒト腫瘍内に位置するまたはヒト腫瘍に由来するＴＩＬに抗体またはその断片を投与することと、ＴＩＬの数に対する効果を決定することとを含む方法が提供される。この効果は、一定期間にわたって決定／測定してもよく、場合により、同じ期間にわたって前記抗体を適用しない場合に観察されるＴＩＬ数と比較してもよい。この効果は、ＴＩＬの数の増加であり得る。例えば、抗体は、ＴＩＬの数を、前記抗体を適用しない場合に観察されるＴＩＬの数に比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約１００％超増加させ得る。更なる態様において、数が観察されるＴＩＬは、γδ＋リンパ球ＴＩＬ細胞及び／または非γδリンパ球ＴＩＬ細胞である。

【0335】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲ細胞抗体のＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、ヒト腫瘍内に位置するまたはヒト腫瘍に由来するＴＩＬまたは複数のＴＩＬに前記抗体を適用し、次いでＴＩＬまたは複数のＴＩＬの数の変化を経時的に測定することによって行われる方法が提供される。

【0336】

ヒトＶδ１＋細胞傷害性を調節する薬物
本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、Ｖδ１＋媒介性細胞傷害性に付与される効果を測定することによって評価することもできる。驚くべきことに、本明細書に記載される多特異性抗体の単特異性バージョン及びいくつかの多特異性抗体自体のそのような評価において（例えば実施例１９、２３、２４及び２７などを参照のこと）、測定可能に増強されたＶδ１＋媒介性細胞傷害性が観察された。例えば、がん細胞の数の低減、または殺傷されたがん細胞の数の増加が、Ｖδ１＋細胞及び前記がん細胞を含む混合培養物を含むモデル系に抗体またはその断片を適用した後に観察される。場合により、がん細胞の数の低減、または殺傷されたがん細胞の数の増加を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３）を前記モデル系に適用した場合の転帰と比較してもよい。

【0337】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞及びがん細胞を含む細胞の混合集団に抗体またはその断片を適用することと、がん細胞に対するＶδ１＋細胞の細胞傷害性を測定することとを含む方法が提供される。細胞傷害性は、一定期間にわたる死んだがん細胞の数の増加によって測定することができ、場合により、同じ期間にわたって前記抗体を細胞の混合集団に適用しない場合に観察される死んだがん細胞の数と比較してもよい。例えば、前記抗体を適用した場合の死細胞で観察される増加は、前記抗体を適用しない場合に観察される死細胞の数に比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約１００％超、約２００％超、約５００％超であり得る。

【0338】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲ細胞のＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、ヒトＶδ１＋細胞及びがん細胞を含む免疫細胞の前記混合集団に前記抗体を付加し、次いで死んだがん細胞の増加を経時的に測定することによって行われる方法が提供される。

【0339】

Ｖδ１＋細胞標的対エフェクター細胞比（Ｔ：Ｅ比）を調節する薬物
本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、前記抗体を潜在的な薬物として評価するために、モデル系で標的細胞の５０％（ＥＣ５０）が殺傷される標的細胞対エフェクター細胞比を決定することにより、前記抗体がどのようにＶδ１＋媒介性がん細胞傷害性を増強するかを測定することによって評価することもできる。例えば、標的がん細胞とヒトＶδ１＋エフェクター細胞を含む混合培養物。驚くべきことに、そのような評価において（例えば実施例１９ｓ及び２３などを参照のこと）、本明細書に記載される多特異性抗体（及びここに記載する多特異性抗体の単特異性バージョン）は、モデル系におけるＥＣ５０ Ｔ：Ｅ比を有利に改変する。そのような改変は、一定期間でがん細胞の５０％の殺傷を観察するのに必要なＶδ１＋細胞の数として測定することができる。これはまた、前記がん細胞に対する細胞傷害性の変化または向上倍率または向上率として報告することもできる。場合により、本発明の抗体によって付与されるＴ：Ｅ比を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３）を前記モデル系に適用した場合のＴ：Ｅ比と比較してもよい。いくつかのシナリオでは、本発明の多特異性抗体は、単特異性抗体と比較して、より低いＥ：Ｔ比でもがん細胞傷害性を向上させる機会を提示する。

【0340】

よって、本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する多特異性抗体またはその断片を評価する方法であって、ヒトＶδ１＋細胞及びがん細胞を含む細胞の混合集団に抗体またはその断片を適用することと、がん細胞の５０％を殺傷するのに必要なＶδ１＋細胞の数を測定することとを含む方法が提供される。これは、場合により同じ期間にわたって、前記抗体を適用せずにがん細胞の５０％を殺傷するのに必要なＶδ１＋細胞の数に比して測定され得る。例えば、前記抗体を適用した場合にがん細胞の５０％を殺傷するのに必要なＶδ１＋細胞の数の低減は、前記抗体を適用しない場合にがん細胞の５０％を殺傷するのに必要なＶδ１＋細胞の数に比して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約１００％超、約２００％超、約５００％超であり得る。

【0341】

本発明の更なる態様において、Ｖδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞とがん細胞を含む前記細胞集団に前記抗体を付加し、次いでがん細胞の５０％を殺傷するのに必要なＶδ１＋細胞の数を測定することによって行われる方法が提供される。

【0342】

Ｖδ１＋細胞のＥＣ５０細胞傷害性を増強する薬物
ヒトＶδ１＋細胞またはその集団の観察される細胞傷害性の増強を測定する代替方法は、条件Ａ（例えば出発対照）で一定期間にわたってがん細胞の５０％を殺傷するのに必要な細胞の数を測定し、これを条件Ｂ（例えば本明細書に記載される本発明の抗体の適用時）で一定期間にわたってがん細胞の５０％を殺傷するのに必要な細胞の数と比較することである。

【0343】

そのようなパラメータを測定するには種々の方法があることは認識されているが、理解を助けるために、以下の非限定的な仮説例について概説する。

【0344】

仮説上、エフェクター細胞傷害性の増強は次のように測定できる：条件Ａ（対照処置）では、一定期間（例えば５時間）にわたってがん細胞の５０％を殺傷するのに１０００個のＶδ１＋細胞が必要であることが観察される。条件Ｂ（例えば、本明細書に記載される本発明の多特異性抗体の適用）では、同じ期間にわたってがん細胞の５０％を殺傷するのに５００個のＶδ１＋細胞が必要であったと観察される。よって、この例では、抗体の適用によってＶδ１＋細胞集団の細胞傷害性が２００％増強された：
（１０００／５００）×１００＝２００％

【0345】

例えば（例えば実施例１９を参照のこと）、驚くべきことに、本明細書に記載される本発明の抗体について、このようなパーセンテージの増強が観察された。

【0346】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、Ｖδ１＋細胞及びがん細胞を含む免疫細胞の前記混合集団に前記抗体を付加し、細胞の前記混合物に前記抗体を適用しない同等または対照の実験に対する細胞傷害性の相対的変化または変化率を決定することによって行われる方法が提供される。

【0347】

健康細胞を温存しながらＶδ１＋細胞の疾患細胞特異性を増強する薬物
本明細書に記載されるその多特異性抗体を評価する別のアプローチは、前記抗体がどのように疾患細胞特異的な細胞傷害性を調節するかを測定することである。驚くべきことに、このような研究において、単特異性抗体及び多特異性抗体が、健康細胞または非疾患細胞を温存しながら、がん細胞などの疾患細胞のＶδ１＋細胞特異的殺傷を特異的に増強し得ることが発見された（例えば実施例１９及び２３などを参照のこと）。がんの症状を改善するために患者に投与される理想的な抗体薬物は、健康細胞を温存しながら、特に疾患細胞に対して増強された細胞傷害性を付与する。そして、特にがん細胞などの疾患細胞に対するエフェクター細胞傷害性を増強する薬物は、特に前記疾患細胞に対するエフェクター細胞傷害性を選択的に増強しない薬物よりも高い治療指数（ＴＩ）を示すと言うことができる。治療指数は、治療比とも称され、薬物の相対的安全性の定量的測定値である。これは、治療効果を引き起こす治療剤の量と、例えば関連するまたは関連性のある健康細胞集団に望ましくない死をもたらすことによって毒性を引き起こす量との比較である。本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片は、モデル系において健康細胞以上に疾患細胞を選択的に殺傷するＶδ１＋細胞の能力を変化させる、または増強する、または倍増させる能力を測定することによって評価することができる。例えば、前記モデル系は、Ｖδ１＋エフェクター細胞、がん細胞、及び対照細胞（健康細胞など）を含み得る。場合により、本発明の多特異性抗体によって付与される選択的な疾患細胞の殺傷における向上倍率を、代替的なコンパレータ抗体（例えばＯＫＴ－３）を前記モデル系に適用した場合に観察される向上倍率と比較してもよい。

【0348】

Ｖδ１＋細胞の疾患細胞特異性及び疾患細胞特異性の増強は、Ｖδ１＋細胞、疾患細胞、及び健康細胞を含む培養物において測定することができる。例えば、疾患細胞に対するＶδ１＋特異性は、Ｖδ１＋細胞によって殺傷されるがん細胞の数を観察し、次いでＶδ１＋細胞によって殺傷される健康細胞の数を比較することによって測定することができる。このような比較は、Ｖδ１＋細胞も含むモデル系に同数の疾患細胞及び健康細胞を含めること、例えば「三種培養」によってコントロールすることができる。例えば、分析または機器の制限により、３つ以上の細胞型のすべてを単一のアッセイ（Ｖδ１＋細胞、疾患細胞、及び非疾患細胞を含む）で並列に区別し追跡する能力が低減する場合には、代替的な比較方法を検討することもできる。前記の事例では、１つの実験において疾患細胞に対するＶδ１＋細胞傷害性を比較し、次いで別個の同等な実験において健康細胞に対するＶδ１＋細胞傷害性を比較することで、このような研究の代替アプローチが提供される。

【0349】

本発明の別の態様では、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する多特異性抗体またはその断片を評価する方法であって、Ｖδ１＋細胞及び標的細胞を含む細胞集団に多特異性抗体またはその断片を投与することと、標的細胞に対する細胞傷害性特異性を測定することとを含む方法が提供される。一実施形態において、第１の標的細胞型に対する細胞傷害性特異性を、第２の標的細胞型に対して観察される細胞傷害性と比較してもよく、したがって、この方法は、異なる標的細胞型を使用して繰り返してもよい。本発明の更なる態様において、第１の標的細胞型は疾患細胞であり、第２の標的細胞型は、健康細胞、または第１の標的細胞型とは異なる疾患を有する細胞などの対照細胞である。

【0350】

本発明の更なる態様において、γδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片を選択する、または特性評価する、または比較する方法であって、前記抗体が（ｉ）第１の細胞型及び（ｉｉ）第２の細胞型に対するＶδ１＋細胞傷害性に付与する効果が測定及び比較される方法が提供される。本発明の更なる態様において、第２の細胞型に対するものよりも第１の細胞型に対する特異的細胞傷害性を増強する抗体がこれによって選択される。本発明の更なる態様において、第１の細胞型は疾患細胞であり、第２の細胞型は健康細胞である。

【0351】

本明細書に記載されるように、アッセイで使用される多特異性抗体またはその断片は、表面に、例えばＦｃ受容体を含む細胞などの細胞の表面に提示され得る。例えば、抗体またはその断片は、ＴＩＢ－２０２（商標）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能）などのＴＨＰ－１細胞の表面に提示され得る。あるいは、多特異性抗体またはその断片は、アッセイで直接使用してもよい。

【0352】

このような機能アッセイにおいて、「ＥＣ５０」または「５０パーセント有効濃度」とも称される最大半量濃度を計算することによって、出力を測定できる。「ＩＣ５０」という用語は、阻害濃度を指す。ＥＣ５０及びＩＣ５０はいずれも、フローサイトメトリー法など、当技術分野において公知の方法を使用して測定することができる。いくつかの事例では、ＥＣ５０及びＩＣ５０は同じ値であるか、または同等とみなすことができる。例えば、ある特定の細胞型の５０％を阻害する（例えば殺傷する）のに必要なエフェクター細胞の有効濃度（ＥＣ）は、５０％阻害濃度（ＩＣ）とみなすこともできる。疑義を避けるために付言すると、抗体に関する場合、本願におけるＥＣ５０の値は、ＩｇＧ１フォーマットの抗体を使用して提供されている。このような値は、抗体フォーマットの分子量に基づいて、次のように同等の値に容易に変換できる：
（μｇ／ｍｌ）／（ｋＤａ単位のＭＷ）＝μＭ

【0353】

抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御についてのＥＣ５０は、０．５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４０μｇ／ｍｌ未満、０．３０μｇ／ｍｌ未満、０．２０μｇ／ｍｌ未満、０．１５μｇ／ｍｌ未満、０．１０μｇ／ｍｌ未満、０．０６μｇ／ｍｌ未満または０．０５μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態において、抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御についてのＥＣ５０は、０．１０μｇ／ｍｌ未満である。特に、抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御についてのＥＣ５０は、０．０６μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０５μｇ／ｍｌ未満、０．０４μｇ／ｍｌ未満または０．０３μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１フォーマットで測定された場合のものである。例えば、γδＴＣＲ下方制御のＥＣ５０値は、フローサイトメトリーを使用して測定することができる（例えば実施例６及び２３などのアッセイに記載のとおり）。

【0354】

抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒についてのＥＣ５０は、０．０５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０４０μｇ／ｍｌ未満、０．０３０μｇ／ｍｌ未満、０．０２０μｇ／ｍｌ未満、０．０１５μｇ／ｍｌ未満、０．０１０μｇ／ｍｌ未満または０．００８μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒についてのＥＣ５０は、０．００５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．００２μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態において、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒についてのＥＣ５０は、０．００７μｇ／ｍｌ未満である。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１フォーマットで測定された場合のものである。例えば、γδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０値は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１０７ａ発現（すなわち細胞脱顆粒のマーカー）を検出することによって測定することができる（例えば実施例７のアッセイに記載のとおり）。一実施形態において、ＣＤ１０７ａ発現は、抗ヒトＣＤ１０７ａ ＢＶ４２１（クローンＨ４Ａ３）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用して測定される。

【0355】

抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞殺傷についてのＥＣ５０は、０．５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４０μｇ／ｍｌ未満、０．３０μｇ／ｍｌ未満、０．２０μｇ／ｍｌ未満、０．１５μｇ／ｍｌ未満、０．１０μｇ／ｍｌ未満または０．０７μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態において、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞殺傷についてのＥＣ５０は、０．１０μｇ／ｍｌ未満である。特に、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞殺傷についてのＥＣ５０は、０．０６０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０５５μｇ／ｍｌ未満、特に０．０２０μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１フォーマットで測定された場合のものである。例えば、γδＴ細胞殺傷のＥＣ５０値は、抗体、γδＴ細胞及び標的細胞のインキュベーション後のフローサイトメトリーを使用して、死細胞の割合を（すなわち細胞生死判別色素を使用して）検出することによって測定することができる（例えば実施例８のアッセイに記載のとおり）。一実施形態において、標的細胞の死は、細胞生死判別色素であるＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定される。

【0356】

これらの態様で説明されるアッセイにおいて、抗体またはその断片は、ＴＨＰ－１細胞、例えばＴＩＢ－２０２（商標）（ＡＴＣＣ）などの細胞の表面に提示され得る。ＴＨＰ－１細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの色素で場合により標識される。

【0357】

Ｖδ１ ＴＣＲに関連するＣＤ３分子を下方制御する薬物。
現在の多特異性ＴＣＥフォーマットの薬物は、典型的には、ＣＤ３結合事象を介してＴ細胞に会合し、それを活性化させる。これは、Ｔ細胞の表面からのＣＤ３分子複合体の下方制御をもたらし得る。しかしながら、ＴＣＥがこのような会合及び下方制御を介してＴ細胞を過剰に刺激する可能性もあることも十分に理解されている。ＣＤ３分子複合体は、１つのクラスのＴ細胞に特異的ではないため、正確に狙える標的ではない。ＣＤ３を介してすべてのＴ細胞（主にαβサブタイプ）を刺激すると、結果としてサイトカインの過剰産生が起こり、急性のサイトカインフレア（いわゆるサイトカインストーム）につながり得る。さらに、ＣＤ３を介してすべてのＴ細胞に会合して活性化する標的を定めないアプローチでは、逆説的にＴ細胞が過剰に活性化される可能性があり、これは慢性的なＴ細胞消耗及び／またはＴ細胞死につながる。実際、本明細書で提示するアプローチはエフェクター集団と特異的に相互作用するのに対し、この非特異的な汎Ｔ細胞活性化は、エフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞の両方の活性化につながる。したがって、この「スレッジハンマー」アプローチは、選択的なＴ細胞のみを上方制御することが望まれ得る場合には決して理想的とは言えない。

【0358】

対照的に、本明細書で提示されるのは、Ｔ細胞／ＣＤ３複合体と別様に会合する多特異性抗体、特にＴ細胞エンゲージャーである。具体的には、これらのＴＣＥは、Ｖδ１＋細胞上でのみ発現されるＶδ１ ＴＣＲのＴＲＤＶ１ドメインを介して会合することができる。そうすることで、このようなＴＣＥベースの薬物は別様に機能する。まず、これらのＴＣＥは、ＴＲＤＶ－１エピトープとの会合を介してＴＣＲを下方制御することができる。その結果、この会合事象は、ＴＣＲ関連ＣＤ３分子複合体を下方制御することができる。このようなＣＤ３の下方制御は、Ｔ細胞の活性化と同義である。しかしながら、このようにＴＲＤＶ１ドメインを介してＴ細胞／ＣＤ３複合体と会合することにより、Ｖδ１ ＴＣＲに関連するＣＤＲ３分子のみが下方制御される。Ｖδ１細胞を特異的にターゲティングして活性化するこのアプローチにより、上記の問題（例えばサイトカインストーム、Ｔ細胞の消耗／枯渇、及びＡＤＣＣ）の多くを回避することができる。このメカニズムは図３０に明示されている。

【0359】

ＣＤ３「スレッジハンマー」アプローチによるＴ細胞の刺激は、ＡＤＣＣなどのＦｃガンマ受容体が駆動するメカニズムを介したＴ細胞の枯渇にも寄与し得る。したがって、現在臨床に用いられているＣＤ３ターゲティング二重特異性抗体の大多数は、ＦｃγＲに対する結合活性が低減したＦｃドメインを有するか、または意図的にＦｃ領域を含まない二重特異性断片である。ＣＤ３ターゲティング療法では、Ｔ細胞受容体複合体結合アームの結合親和性が低減する場合もある。

【0360】

この親和性の低減は、ＴＣＥの設計及び機能性に関して有効性の低減及び選択可能性の低下をもたらし得る。例えば、このようなＴＣＥにおける結合ドメインの親和性はｉｎ ｖｉｖｏの分布プロファイルを駆動することが知られている。具体的には、ＴＣＥの分布はその親和性の最も高い標的に偏っていることが通常観察される。よって、Ｔ細胞複合体に対するＴＣＥ結合ドメインの親和性を低減させると、まさにこのようなＴＣＥの有効性を駆動するために必要な細胞であるＴ細胞から分布の偏りが遠ざかることが一般的である。ＴＣＥの治療域が「きわめて狭い」と言われるのは、部分的にはこのような理由のためである。

【0361】

ここで提示するアプローチは、ｖδ１細胞を特異的にターゲティングして活性化し、場合により、Ｆｃ機能を除去するまたは親和性を低減させる必要を回避する。

【0362】

さらに、ここで提示するアプローチでは、抗体はｖδ１細胞のＴＣＲに会合するが、腫瘍細胞も存在しない限り完全な活性化は起こらない。本明細書で提示される抗体がＴＣＲに完全に会合すると部分的な下方制御が生じ、本明細書で提示される抗体が結合したｖδ１細胞は、腫瘍微小環境でのみ完全に活性化され、細胞傷害性になる。これは、本件のアプローチに関する別の重要な安全上の利点を表す。なぜなら、オフターゲット細胞傷害性が低減し、ｖδ１細胞を活性化させる本抗体の効力の全てが腫瘍細胞の存在下でのみ解放されるからである。

【0363】

γδＴ細胞が腫瘍細胞のストレスシグナルを検出できるメカニズムの１つは、それらが発現するＮＣＲ（天然細胞傷害性受容体）に起因すると考えられている。ＮＣＲは、腫瘍細胞上のＮＣＲリガンドに会合することができる。したがって、ＴＣＲ刺激を介してγδＴ細胞が活性化され、ＮＣＲが腫瘍細胞を感知して完全な活性化及び細胞傷害性を有効にする、活性化のデュアルメカニズムが用いられる。

【0364】

これは、ＣＤ３を介したαβＴ細胞の刺激とは対照的であり、αβＴ細胞の刺激は、すべての刺激がＴＣＲを介する。したがって、そのような細胞は、ＮＣＲを介した抗原提示に依存しない腫瘍細胞の感知をしないため、健康細胞または形質転換細胞の区別がほぼ不可能である。したがって、ＣＤ３抗体がＦｃであれば、それらは他の免疫細胞を誘引し、これがサイトカインストーム、免疫細胞の消耗及び更には過剰活性化といった予想外の望ましい事象のカスケードを誘起し、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の殺傷などをもたらすことができる。本件のアプローチでは、両方のγδＴ細胞（及びＮＫ細胞などの他の免疫細胞）が健康細胞と腫瘍細胞とを区別することができるため、本明細書で提示される抗体によるγδＴ細胞の刺激は、このような懸念を生じない。例えば、それらのＮＣＲ感知メカニズムを介し、したがって互いを殺傷しない。

【0365】

例えば、ヒト及びカニクイザルの両方のｖδ１抗原（配列番号１及び配列番号１７２）に対する特異性を有する、本明細書で提示される抗ｖδ１ Ｆｃ有効型多特異性抗体を用いた初期のカニクイザル研究では、用量漸増反復投与ｉｎ－ｖｉｖｏ研究において、測定されたすべてのパラメータにより、安全かつ忍容性良好であることが見出された。サイトカインの放出または体重減少など、Ｔ細胞活性化に通常関連する副作用は観察されなかった。

【0366】

これらの所見は、本明細書に記載されるアプローチの別の利点も明らかにしている。具体的には、ＣＤ３エンゲージャーなどに代表されるＴＣＥとは異なり、本発明のＴＣＥ二重特異性薬は、場合により、例えばＶＬ－ＣＬフォーマットの同族軽鎖を伴うＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットの重鎖を含む完全長抗体として設計され得る。より小さい二重特異性フォーマット（例えば７０ＫＤａ未満）とは異なり、このような完全長二重特異性フォーマットは、ｉｎ－ｖｉｖｏでより長い半減期を示すことができ、したがって必要な投薬レジメンの頻度が減る。このようなフォーマットによって観察される半減期がより長いのは、サイズの増加（＞７０ＫＤａ）を含む種々の理由によるものであり、サイズの増加は、このようなフォーマットが腎臓によって濾過されないことを意味する（糸球体の孔径のカットオフは６０～７０ＫＤａ）。一実施形態において、多特異性抗体は、約７０ＫＤａより大きくてもよく、ＩＭＧＴに収載されているヒトＩＧＨＣ配列（例えばＩＧＨＡ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＭ、ＩＧＨＧ配列）を含み得る。このようなＩｇＧ１フォーマットは、ＦｃＲｎメカニズムによって再循環することもできる。特にＴＣＥ二重特異性薬に関するこのような完全長抗体フォーマットの明らかな欠点は、このようなフォーマットが、クリアランス率の低下、曝露の増加、及びより慢性的な曝露に起因する好ましくない安全性プロファイルを示すことである。

【0367】

したがって、本件のアプローチは、ＮＫ細胞がγδＴ細胞を殺傷することまたはその逆のような、オフターゲット効果の懸念のないＦｃ機能性の可能性を可能にする。したがって、本件のアプローチは、腫瘍環境外の付帯的損傷を制限するためにＣＤ３親和性の低減、Ｆｃ機能の消失などのような対策が必要であるという制約をもつＣＤ３指向性アプローチよりも優れている。ここで提示する多特異性抗体、特にＴ細胞エンゲージャーは、損傷の可能性なしにｖδ１細胞に結合することができ、完全な活性化及び細胞傷害性の増強は、ｖδ１細胞が腫瘍細胞と密接に接触している場合にのみ起こる。

【0368】

よって、一実施形態において、ＴＣＥ多特異性抗体によって細胞表面上のＴＲＤＶ１含有Ｖδ１ ＴＣＲ及び関連するＣＤ３分子複合体を下方制御する方法、ならびにこの目的のためのそのような多特異性抗体の使用が提供される。

【0369】

ポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明の一態様において、本発明の多特異性抗体または断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１１０のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態において、発現ベクターは、配列番号９９～１１０のいずれか１つのＶＨ領域を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号９９～１１０のいずれか１つのＶＬ領域を含む。更なる実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１１０を含むか、またはそれからなる。更なる態様において、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡが提供される。ポリヌクレオチドは、第２の結合ドメインをコードする配列を更に含んでもよく、第２の結合ドメインは、第２の抗原に対する特異性を付与し得る。

【0370】

本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターは、コードされるアミノ酸配列を参照して記載されることもある。したがって、一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６２～８５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態において、発現ベクターは、配列番号６２～７３のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号７４～８５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。ポリヌクレオチド及び発現ベクターは、更なる結合ドメインをコードする配列を更に含んでもよく、更なる結合ドメインは、第２の抗原に対する特異性を付与し得る。

【0371】

抗体またはその断片を発現させるには、遺伝子が転写制御配列及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、本明細書に記載されるような軽鎖及び重鎖の一部または完全長をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入する。したがって、本発明の一態様において、本明細書で定義されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。

【0372】

本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、翻訳、精製及び検出を助けるためにアミノ酸残基をコードする追加の配列を含んでもよいが、使用される発現系に応じて代替的な配列が使用され得ることは理解されよう。例えば、配列番号９９～１１０の最初（５’末端）の９ヌクレオチド、及び配列番号９９～１００、１０２～１０３、１０５～１１０の最後（３’末端）の３６ヌクレオチド、または配列番号１０１及び１０４の最後（３’末端）の３９ヌクレオチドは、任意選択の配列である。これらの任意選択の配列は、代替の設計、翻訳、精製または検出ストラテジーが採用される場合には除去、改変、または置換されてもよい。

【0373】

ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡに対して、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが特定の宿主における翻訳のために好ましいコドンを提供する突然変異を起こしてもよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ならびに哺乳動物、特にヒトにおける核酸の翻訳のための好ましいコドンは公知である。

【0374】

ポリペプチドの突然変異は、例えば、ポリペプチドをコードする核酸に対する置換、付加または欠失によって達成され得る。ポリペプチドをコードする核酸に対する置換、付加または欠失は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、ＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰アンサンブル突然変異誘発、指数アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構築、人工遺伝子合成、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはこれらの方法の組み合わせを含む多くの方法によって導入され得る。核酸に対する改変、付加または欠失も、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート改変ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有テンプレート突然変異誘発、ギャップ二重鎖突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射性突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸多量体作製、またはこれらの組み合わせを含む方法によって導入され得る。

【0375】

特に、人工遺伝子合成を使用することができる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、固相ＤＮＡ合成によって合成的に生成することができる。前駆体テンプレートＤＮＡを必要とせずに、遺伝子全体をｄｅ ｎｏｖｏに合成することができる。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、構成要素は、生成物の配列によって必要とされる順序で、成長するオリゴヌクレオチド鎖に連続的に結合される。鎖構築が完了すると、生成物は固相から溶液に放出され、脱保護され、収集される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生成物を単離し、所望のオリゴヌクレオチドを高純度で得ることができる。

【0376】

発現ベクターには、例えば、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来エピソームが含まれる。ポリヌクレオチドは、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列がポリヌクレオチドの転写及び翻訳を制御する意図された機能を果たすように、ベクターにライゲーションされる。発現及び／または制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コード配列の５’側の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンを含み得る。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。配列番号９９～１１０には、合成リンカー（配列番号９８をコードする）によって結合されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、本発明の多特異性抗体に含まれ得る一本鎖可変断片をコードするヌクレオチド配列が含まれる。本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、またはその両方（場合によりリンカーを含む）を含み得ることが理解されるであろう。したがって、ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドが別々のベクターに挿入されてもよく、あるいは両方の領域をコードする配列が同じ発現ベクターに挿入される。ポリヌクレオチド（複数可）は、標準的な方法（例えば、ポリヌクレオチド及びベクターの相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。

【0377】

簡便なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものであり、本明細書に記載されるように、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列を容易に挿入及び発現できるように工学操作された適切な制限部位を備える。発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体（またはその断片）の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドが抗体のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。

【0378】

本発明の一態様において、本明細書で定義されるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む細胞（例えば、組換え宿主細胞などの宿主細胞）が提供される。細胞は、抗体またはその断片の軽鎖をコードする第１のベクター、及び抗体またはその断片の重鎖をコードする第２のベクターを含み得ることが理解されよう。あるいは、重鎖及び軽鎖の両方が、細胞に導入される同じ発現ベクター上にコードされる。

【0379】

一実施形態において、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、抗体またはその断片に融合された膜アンカーまたは膜貫通ドメインをコードし、抗体またはその断片は細胞の細胞外表面に提示される。

【0380】

形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によることができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、微粒子銃注入、及び核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。更に、核酸分子をウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。

【0381】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、及びいくつかの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスターの細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって選択される。使用できる他の細胞株は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞である。ｓｃＦｖ断片及びＦｖ断片などの抗体の抗原結合性断片は、当技術分野で公知の方法を使用して単離し、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させることができる。

【0382】

抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収され得る。

【0383】

本発明の抗体（または断片）は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０１２）４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに開示されている技法を使用して取得及び操作することができる。

【0384】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、特定の抗体産生Ｂ細胞を、組織培養で増殖する能力及び抗体鎖合成の欠如のために選択された骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と融合させることによって産生され得る。

【0385】

決定された抗原に対するモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原で、不死細胞で及び好ましくは骨髄腫細胞で以前に免疫化された動物の末梢血から得られたリンパ球を不死化すること、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回収すること
によって取得することができる。

【0386】

あるいは、ハイブリドーマ細胞を使用する必要はない。本明細書に記載の標的抗原に結合することができる抗体は、例えば、当技術分野で公知のファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または哺乳動物ディスプレイ技術を使用する、定型的手法を介して好適な抗体ライブラリから単離することができる。したがって、モノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ベクターに、特にファージ及びより具体的には糸状バクテリオファージに、リンパ球、特に動物（好適には決定された抗原で以前に免疫されている）の末梢血リンパ球から取得されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列をクローン化するステップ、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で、上記のベクターで原核細胞を形質転換するステップ、
ｃ）抗体を抗原親和性選択にかけることにより、抗体を選択するステップ、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回収するステップ
を含むプロセスによって取得することができる。

【0387】

場合により、本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドは、疾患の徴候または症状を改善するための薬物として用いられるのに十分な量を作製するように容易に製造することもできる。このように薬物として用いられる場合、通常、目的のポリヌクレオチドはまず、対象または患者において前記抗体またはその断片を発現するように設計された発現ベクターまたは発現カセットに作動可能に連結される。このような発現カセット及びポリヌクレオチドまたはしばしば「核酸系」薬物と呼ばれるものの送達方法は、当技術分野では周知である。最近の概説については、Ｈｏｌｌｅｖｏｅｔ ａｎｄ Ｄｅｃｌｅｒｃｋ（２０１７）Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１５（１）：１３１を参照のこと。

【0388】

細胞内でプラスミドまたはベクターのコード核酸配列を発現させる条件下で細胞培養培地中で本発明の組換え宿主細胞を培養することを含む、多特異性抗体またはその抗原結合性断片もしくは変異体の産生のための方法も提供される。両方の結合ドメインが同じ組換え細胞で産生される場合、この方法は、多特異性抗体またはその抗原結合性断片もしくは変異体を細胞培養上清から取得することを更に含み得る。取得された多特異性抗体またはその断片は、次いで、医薬組成物へと更に処理及び／または製剤され得る。あるいは、多特異性抗体の結合ドメインが別個の組換え宿主細胞で生成される場合、多特異性抗体は、まず別個の細胞上清をそれぞれの組換え宿主細胞から収集した後に、前記結合ドメインを組み合わせて多特異性抗体にすることによって取得してもよく、次いでこれを医薬組成物へと更に処理及び／または製剤してもよい。更に、多特異性抗体またはその断片もしくは変異体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、本発明のプラスミドまたはベクターを前記細胞にトランスフェクトすることを含む方法が提供される。次いで、多特異性抗体またはその断片もしくは変異体を産生するために前記細胞を培養することができる。

【0389】

医薬組成物
本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を含む組成物が提供される。このような実施形態において、組成物は、場合により他の賦形剤と組み合わせて、多特異性抗体を含み得る。１つまたは複数の追加の活性剤（例えば、本明細書で言及される疾患を処置するのに好適な活性剤）を含む組成物も含まれる。

【0390】

本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を、薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む医薬組成物が提供される。本発明の多特異性抗体は、対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができる。典型的に、医薬組成物は、本発明の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、塩、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つまたは複数、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。抗体またはその断片の貯蔵寿命または有効性を増強する、湿潤剤などの薬学的に許容される物質、または湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくはバッファーなどの微量の補助物質。

【0391】

本発明の組成物は種々の形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形、例えば溶液（例えば注射可能及び注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、及び坐薬が含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。

【0392】

好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、鞘内）である。好ましい実施形態において、抗体は静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。

【0393】

治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散系、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤され得る。

【0394】

本明細書に記載の疾患の処置のための治療方法において、このような疾患の処置に通常使用される他の確立された療法の補助として、またはそれと併せて、本発明の医薬組成物を使用することは、本発明の範囲内にある。

【0395】

本発明の更なる態様において、抗体、組成物または医薬組成物は、少なくとも１つの活性剤と共に、連続的に、同時にまたは別々に投与される。

【0396】

処置方法
本発明の更なる態様によれば、薬物として使用するための、本明細書で定義される単離された多特異性抗体またはその断片が提供される。本明細書における、薬物としてまたは療法において「使用するための」多特異性抗体またはその断片への言及は、対象への抗体またはその断片の投与に限定される。そのような使用には、細胞培養物への（すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの）多特異性抗体またはその断片の投与は含まれず、前記細胞培養物または派生細胞療法生成物は治療薬として使用される。

【0397】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明は、多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象の疾患または障害を処置する方法である。様々な実施形態において、疾患または障害は、がん、感染性疾患または炎症性疾患である。一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するためのものであり、健康細胞を温存しながら疾患細胞の死をもたらす。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、がんの処置に使用するためのものである。

【0398】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するためのものである。更なる実施形態において、多特異性抗体またはその断片は、がんの処置に使用するためのものである。

【0399】

本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するためのものである。更なる実施形態において、医薬組成物は、がんの処置に使用するためのものである。

【0400】

本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される治療上有効な量の単離された多特異性抗体またはその断片を投与することを含む、それを必要とする対象の免疫応答を調節する方法が提供される。様々な実施形態において、対象の免疫応答を調節することは、γδＴ細胞と結合するもしくはγδＴ細胞をターゲティングすること、γδＴ細胞を活性化すること、γδＴ細胞の増殖を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞の増大を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞の脱顆粒を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞媒介性殺傷活性を引き起こすもしくは増加させること、健康細胞を温存しながらγδＴ細胞媒介性殺傷活性を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞傷害性を引き起こすもしくは増加させること、健康細胞を温存しながらγδＴ細胞傷害性を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞の動員を引き起こすもしくは増加させること、γδＴ細胞の生存を増加させること、またはγδＴ細胞の消耗に対する抵抗性を増加させることを含む。対象の免疫応答を調節することは、第２の抗原と結合するまたは第２の抗原をターゲティングすることを更に含み得る。例えば、一部の実施形態では、第２の抗原の結合は、特にそれが免疫調節性抗原である場合、ＴＲＤＶ１への多特異性抗体の結合による免疫調節に加えて、第２の抗原による免疫調節を刺激し得る。よって、免疫応答の調節は、ＴＲＤＶ１抗原の会合を介して調節される第１のシグナル伝達経路と、第２の免疫調節性抗原の会合を介して調節される第２のシグナル伝達経路との、２つの異なるシグナル伝達経路を介する調節を含み得る。

【0401】

本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される治療上有効な量の単離された多特異性抗体またはその断片を投与することを含む、それを必要とする対象のがん、感染性疾患または炎症性疾患を処置する方法が提供される。あるいは、治療上有効な量の医薬組成物が投与される。

【0402】

本発明の更なる態様によれば、例えばがん、感染性疾患または炎症性疾患の処置における、薬物の製造のための本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片の使用が提供される。

【0403】

一実施形態において、多特異性抗体またはその断片が対象に投与され、対象は、がん、感染性疾患または炎症性疾患を有する。

【0404】

本発明の更なる態様によれば、薬剤として使用するための本明細書で定義される医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物が対象に投与され、対象は、がん、感染性疾患または炎症性疾患を有する。

【0405】

本発明の更なる態様によれば、本明細書で定義される治療上有効な量の単離された多特異性抗体またはその断片を対象に投与する方法が提供され、対象は、がん、感染性疾患または炎症性疾患を有する。あるいは、治療上有効な量の医薬組成物が投与される。

【0406】

本発明の更なる態様によれば、例えば対象に投与するための、薬物の製造のための本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片の使用が提供され、対象は、がん、感染性疾患または炎症性疾患を有する。

【0407】

様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得るがんは、急性リンパ芽球性、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、虫垂癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫、視覚路及び視床下部神経膠腫、脳脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌（胃がん）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、神経膠腫脳幹、神経膠腫大脳星状細胞腫、視覚路及び視床下部の神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路の神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、真菌症、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵癌、乳頭腫症、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂及び尿管、第１５染色体のｎｕｔ遺伝子が関与する呼吸器癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイングファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、胃がん（胃癌）、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌（ｔｈｒｏａｔ ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得るがんは処置され、健康細胞は温存される。

【0408】

様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得る炎症性疾患は、アカラシア、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性運動性軸索型ニューロパチー、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、アジソン病、有痛脂肪症、成人スチル病、成人発症スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（抗ＮＭＤＡ）受容体脳炎、抗リン脂質症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ、ＡＰＬＳ）、抗シンテターゼ症候群、抗尿細管基底膜腎炎、再生不良性貧血、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性共存症、自己免疫性自律神経異常、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性末梢性ニューロパチー、自己免疫性多内分泌症候群（ＡＰＳ）１型、自己免疫性多内分泌症候群（ＡＰＳ）２型、自己免疫性多内分泌症候群（ＡＰＳ）３型、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性血管炎、軸索型及び神経型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー同心円性硬化症、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性閉塞性肺疾患、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠乏症、複合性局所疼痛症候群、先天性心ブロック、結合組織、全身性、及び多臓器、接触性皮膚炎、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、真性糖尿病１型、消化器系、円板状ループス、ドレスラー症候群、薬剤誘発性ループス、湿疹、子宮内膜症、付着部炎関連関節炎、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、食道アカラシア、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、外分泌、フェルティ症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維筋痛症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス眼症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、橋本脳症、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性ヘルペスまたは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反転型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、特発性巨細胞性心筋炎、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＡ血管炎（ＩｇＡＶ）、ＩｇＧ４関連疾患、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、炎症性腸疾患、中間部ブドウ膜炎、間質性膀胱炎（ＩＣ）、間質性肺疾患、ＩＰＥＸ症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、ループス腎炎、ループス血管炎、慢性ライム病、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、限局性強皮症、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、神経系、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、オシュトラン症候群、回帰性リウマチ（ＰＲ）、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害（ＰＡＮＤＡＳ）、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、天疱瘡、尋常性天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性胆汁性肝硬変、原発性免疫不全症、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬、乾癬性関節炎、真性赤血球系無形成症（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグ症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマチ性血管炎、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、精液精巣自己免疫、脊椎関節症、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎（ＳＯ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、蕁麻疹（Ｕｔｉｃａｒｉａ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにフォークト・小柳・原田病を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得る炎症性疾患は処置され、健康細胞は温存される。

【0409】

様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得る感染性疾患は、アシネトバクター感染症、放線菌症、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症）、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、アメーバ感染症、アメーバ症、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ感染症、アナプラズマ症、住血線虫症、アニサキス症、炭疽、アルボウイルス病、神経浸潤性及び非神経浸潤性、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ感染症、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、トリインフルエンザ、バベシア症、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ感染症、細菌感染症、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、バルトネラ症、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ感染症、ＢＫウイルス感染症、黒色砂毛症、ブラストシスチス症、ボリビア出血熱、ボツリヌス症、ボツリヌス症（食品由来）、ボツリヌス症（乳児）、ボツリヌス症（その他）、ボツリヌス症（創傷）、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺ペスト、バークホルデリア感染症、ブルーリ潰瘍、カリシウイルス感染症（ノロウイルス及びサポウイルス）、カリフォルニア血清型ウイルス病、カンピロバクター、カンピロバクター症、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、臨床、カンジダ症（モニリア症；鵞口瘡）、毛細虫症、カルバペネマーゼ産生カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＰ－ＣＲＥ）、カルバペネム耐性感染症（ＣＲＥ／ＣＲＰＡ）、カリオン病、猫ひっかき病、蜂巣炎、シャーガス病（トリパノソーマ症）、軟性下疳、水痘、チクングニアウイルス感染症（チクングニア）、クラミジア、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症、コレラ、黒色分芽菌症、ツボカビ症、シガテラ、肝吸虫症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ大腸炎、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、コクシジオイデス症真菌感染症（渓谷熱）、コロラドダニ熱（ＣＴＦ）、普通感冒（急性ウイルス性鼻咽喉炎；急性コリーザ）、先天性梅毒、結膜炎、ＣＯＶＩＤ－１９（新型コロナウイルス感染症）、ＣＰ－ＣＲＥ、エンテロバクター菌種、ＣＰ－ＣＲＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＰ－ＣＲＥ、クレブシエラ菌種、クロイツフェルト・ヤコブ病、伝達性海綿状脳症（ＣＪＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）、カキ殻状疥癬、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症（クリプト）、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）、サイクロスポラ、サイクロスポラ症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デングウイルス感染症、デング、１，２，３，４（デング熱）、デング様疾患、Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ感染症、下痢性疾患、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジナ虫症、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ感染症、志賀毒素産生（ＳＴＥＣ）、東部ウマ脳炎ウイルス疾患、エボラ出血熱（エボラ）、エキノコックス症、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ感染症、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ感染症、エーリキア症、アナプラズマ症、脳炎、アルボウイルス脳炎または傍感染性脳炎、腸蟯虫症（蟯虫感染）、エンテロコッカス感染症、エンテロウイルス感染症、Ｄ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、エンテロウイルス感染症、非ポリオ（非ポリオエンテロウイルス）、発疹チフス、エプスタイン・バーウイルス伝染性単核球症（モノ）、伝染性紅斑（第五病）、突発性発疹（第六病）、肝蛭症、肥大吸虫症、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、第五病、フィラリア症、感冒（季節性）、食中毒、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる食中毒、自由生息アメーバ感染症、真菌感染症、フソバクテリウム感染症、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死）、性器ヘルペス、性器疣贅、ゲオトリクム症、風疹、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、ジアルジア症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径肉芽腫、鼠径肉芽腫（ドノバン症）、Ａ群連鎖球菌感染症、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌感染症、ガナリトウイルス、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ疾患、Ｂ型（ＨｉｂまたはＨ－ｆｌｕ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染症、手足口病（ＨＦＭＤ）、ハンセン病、ハンタウイルス感染症、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、ハートランドウイルス疾患、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、ヘンドラウイルス感染症、Ａ型肝炎（Ｈｅｐ Ａ）、Ｂ型肝炎（Ｈｅｐ Ｂ）、Ｃ型肝炎（Ｈｅｐ Ｃ）、Ｄ型肝炎（Ｈｅｐ Ｄ）、Ｅ型肝炎（Ｈｅｐ Ｅ）、ヘルペス、ヘルペスＢウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、帯状疱疹ＶＺＶ（シングルス）、Ｈｉｂ病、ヒストプラスマ症感染症（ヒストプラスマ症）、鉤虫感染症、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、ヒトボカウイルス感染症、ヒトＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ症（Ｈｕｍａｎ ｅｗｉｎｇｉｉ ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ）、ヒト顆粒球性アナプラズマ症（ＨＧＡ）、ヒト免疫不全ウイルス／ＡＩＤＳ（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒト単球性エーリキア症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ヒトパラインフルエンザウイルス感染症、膜様条虫症、膿痂疹、インフルエンザ（感冒）、インフルエンザ（季節性）、侵襲性肺炎球菌症、イソスポーラ症、フニンウイルス、川崎症候群、角膜炎、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ感染症、クールー、ラッサ熱、ラッサウイルス、レジオネラ症（レジオネラ病）、リーシュマニア症、ライ病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症（リステリア）、ルジョウイルス、ライム病、リンパ性フィラリア症（象皮症）、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）、性病性リンパ肉芽腫感染症（ＬＧＶ）、マチュポウイルス、マラリア、マールブルグウイルス感染症、麻疹、類鼻疽（ウィットモア病）、髄膜炎、細菌性髄膜炎、ウイルス性髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、横川吸虫症、微胞子虫症、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、伝染性軟属腫（ＭＣ）、サル痘、単核球症、蚊媒介性疾患、ＭＲＳＡ、ムンプス、発疹熱（地方病性発疹熱）、菌腫、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ感染症、マイコプラズマ肺炎、ハエ幼虫症、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、新生児結膜炎（新生児眼炎）、ニパウイルス感染症、ノカルジア症、ノロウイルス、オンコセルカ症（河川盲目症）、オピストルキス症、オーフウイルス（ただれ口）、パラコクシジオイデス症（南アメリカブラストミセス症）、肺吸虫症、麻痺性貝中毒（麻痺性貝中毒、シガテラ）、パスツレラ症、ＰＥＰ、寄生虫感染症、百日咳（疫咳）、ピンクアイ、肺炎球菌疾患、肺炎球菌感染症、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）、肺炎、肺ペスト、灰白髄炎（ポリオ）、麻痺性灰白髄炎、ポリオウイルス感染症、ポンティアック熱、ポワッサンウイルス疾患、プレボテラ感染症、原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）、進行性多巣性白質脳症、原虫感染症、オウム病（オウム熱）、膿疱性発疹症（天然痘、サル痘、牛痘）、狂犬病、アライグマ回虫、鼠咬熱、レクリエーション用水疾患、再帰熱、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ライエ症候群、リノスポリジウム症、ライノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア症（ロッキー山紅斑熱）、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、白癬、ロタウイルス感染症、三日はしか、サビアウイルス、サルモネラ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ感染症、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ感染症、サルモネラ症、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）、疥癬、猩紅熱、住血吸虫症、サバ亜目、敗血症、敗血症性ショック、敗血症性ペスト、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、志賀毒素産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、赤痢菌、細菌性赤痢、シングルス、シングルス（帯状疱疹）、天然痘、ただれ口（オーフウイルス）、スポロトリクム症、紅斑熱リケッチア症、セントルイス脳炎ウイルス疾患、ブドウ球菌感染症、ブドウ球菌感染症（メチシリン耐性（ＭＲＳＡ））、ブドウ球菌性食中毒、ブドウ球菌感染症（バンコマイシン中等度耐性（ＶＩＳＡ））、連鎖球菌性咽頭炎、Ａ群連鎖球菌症（侵襲性）（Ｓｔｒｅｐ Ａ（侵襲性））、Ｂ群連鎖球菌症（Ｓｔｒｅｐ－Ｂ）、連鎖球菌毒素ショック症候群、糞線虫症、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、テニア症、破傷風感染症、マダニ媒介疾患、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、手白癬、黒癬、足白癬、爪白癬、癜風、毒素ショック症候群、トキソカラ症（眼幼虫移行症（ＯＬＭ））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症（ＶＬＭ））、トキソプラズマ症、トラコーマ、旋毛虫症、トリコモナス症、旋毛虫感染症（旋毛虫症）、鞭虫症（鞭虫感染症）、結核（ＴＢ）、野兎病（ウサギ熱）、チフス熱、Ｄ群チフス熱、チフス、発疹チフス、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ感染症、膣症、渓谷熱、変異体クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ、ｎｖＣＪＤ）、水疱瘡（水痘）、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ腸炎、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ感染症、ビブリオ症、ウイルス感染症、ウイルス性出血熱、ウイルス性出血熱（エボラ、ラッサ、マールブルグ）、ウイルス性出血熱（ＶＨＦ）、ウイルス性肺炎、西ナイルウイルス病、西部ウマ脳炎ウイルス疾患、白色砂毛（ｔｉｎｅａ ｂｌａｎｃａ）、疫咳、黄熱病、エルセニア（エルシニア）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染症、エルシニア症、ジアスポラ（Ｚｅａｓｐｏｒａ）、ジカ熱、ジカウイルス、先天性ジカウイルス病、非先天性ジカウイルス病、ジカウイルス感染症（ジカ）、先天性ジカウイルス感染症、非先天性ジカウイルス感染症、ならびに接合真菌症を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、開示される方法及び組成物によって処置され得る感染性疾患は処置され、健康細胞は温存される。

【0410】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を投与するステップを含む、対象における少なくとも１つのγδＴ細胞を活性化する方法である。

【0411】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞の増殖を引き起こすまたは増加させる方法である。

【0412】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞の脱顆粒を引き起こすまたは増加させる方法である。

【0413】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞殺傷活性（例えばＴ細胞媒介性殺傷活性）を引き起こすまたは増加させる方法である。一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、健康細胞を温存しながら対象におけるγδＴ細胞殺傷活性（例えばＴ細胞媒介性殺傷活性）を引き起こすまたは増加させる方法である。

【0414】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞傷害性を引き起こすまたは増加させる方法である。一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、健康細胞を温存しながら対象におけるγδＴ細胞傷害性を引き起こすまたは増加させる方法である。

【0415】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞の動員を引き起こすまたは増加させる方法である。

【0416】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞の生存を増加させる方法である。

【0417】

一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される多特異性抗体またはその断片を対象に投与するステップを含む、対象におけるγδＴ細胞の消耗に対する抵抗性を増加させる方法である。

【0418】

本発明の更なる態様によれば、対象の免疫応答を刺激する方法が提供され、この方法は、免疫応答を刺激するのに有効な量で多特異性抗体またはその断片を対象に投与することを含む。

【0419】

抗体またはその断片の使用
本発明の更なる態様によれば、γδＴ細胞（特にＶδ１ Ｔ細胞）の抗原認識、活性化、シグナル伝達または機能を研究するための、本明細書に記載される多特異性抗体またはその断片の使用が提供される。本明細書に記載されるように、抗体は、γδＴ細胞機能を調査するために使用され得るアッセイにおいて活性があることが示されている。このような多特異性抗体は、γδＴ細胞の増殖を誘導するのにも有用であり得、したがってγδＴ細胞（Ｖδ１ Ｔ細胞など）を増大させる方法で使用することができる。

【0420】

Ｖδ１鎖に結合する多特異性抗体は、γδＴ細胞を検出するために使用できる。例えば、抗体を検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識してもよく、または試料中のＶδ１ Ｔ細胞を選択的に検出及び／または単離するための捕捉リガンドとして使用してもよい。標識抗体は、例えば、免疫組織化学及びＥＬＩＳＡといった当技術分野で公知の多くの方法で使用されている。

【0421】

検出可能な標識またはレポーター分子は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓもしくは^１２５ｌなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光部位または化学発光部位、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。本発明の抗体に適用された蛍光標識は、次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法で使用され得る。

【0422】

したがって、様々な実施形態において、本発明は、γδＴ細胞を調節するｉｎ ｖｉｖｏ法、γδＴ細胞と結合する方法、γδＴ細胞をターゲティングする方法、γδＴ細胞を活性化する方法、γδＴ細胞を増殖させる方法、γδＴ細胞を増大させる方法、γδＴ細胞を検出する方法、γδＴ細胞の脱顆粒を引き起こす方法、γδＴ細胞殺傷活性を引き起こす方法、抗体またはその断片を選択する方法を含み、これらの方法は、本明細書に記載されるように対象に多特異性抗体またはその断片を投与するステップを含む。

【0423】

本発明の他の特徴及び利点は、本明細書で提供される説明から明らかになるであろう。しかしながら、この説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、当業者には様々な変更及び修正が明らかになるので、例示のためにのみ与えられていることが理解されよう。次に、本発明を、以下の非限定的な実施例を用いて説明する。

【実施例】

【0424】

実施例１．材料及び方法
ヒト抗体の発見
ヒトファージディスプレイを用いて、本明細書に記載されるヒト抗ヒト可変Ｖδ１＋ドメイン抗体を生成した。ライブラリは、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，８（１１）：Ｒ２５４）に記載されているように構築され、約４００億個のヒトクローンの一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）提示ライブラリを含んでいた。このライブラリを、本明細書に記載される抗原、方法、選択、選択解除、スクリーニング、及び特性評価のストラテジーを使用してスクリーニングした。

【0425】

抗原の調製
以下の実施例で使用されるＴＣＲα及びＴＣＲβ定常領域を含む可溶性γδＴＣＲヘテロ二量体の設計は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ １０８：２４１４－２４１９に従って生成された。ＶγドメインまたはＶδドメインは、膜貫通ドメインを欠くＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常領域にインフレームで融合され、ロイシンジッパー配列またはＦｃ配列、及びヒスチジンタグ／リンカーが続いた。

【0426】

発現構築物を哺乳動物ＥＸＰＩ ＨＥＫ２９３浮遊細胞に一過性にトランスフェクトした（ヘテロ二量体の単一トランスフェクションまたは同時トランスフェクションとして）。分泌された組換えタンパク質は、親和性クロマトグラフィーによって培養上清から回収及び精製された。モノマー抗原の良好な回収を確実にするために、試料は分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して更に精製された。精製された抗原の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、凝集状態を分析ＳＥＣによって分析した。

【0427】

抗原の機能検証
デルタ可変１（Ｖδ１）鎖を含有する抗体の特異性を、ＤＥＬＦＩＡイムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及びＲＥＡ１７３－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ抗Ｖδ１抗体を使用したγδＴ細胞と競合するフローベースのアッセイで確認した。

【0428】

解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）
抗原の特異性を確認するために、プレートに直接コーティングした抗原（５０μＬのＰＢＳ中３μｇ／ｍＬの抗原、４℃で一晩（Ｎｕｎｃ＃４３７１１１）及び３００ｎＭから始まる一次抗体の系列希釈を用いてＤＥＬＦＩＡイムノアッセイを行った。検出のために、ＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ－Ｎ１抗ヒトＩｇＧ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃１２４４－３３０）を、５０μＬの３％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ＋３％（ｗ／Ｖ）脱脂粉乳）中１／５００の希釈度で二次抗体として使用した。展開には５０μＬのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃４００１－００１０）を用いた。

【0429】

ＤＥＬＦＩＡイムノアッセイを使用して目的の抗体の親和性のランク付けを行った。ＤＥＬＦＩＡイムノアッセイでは、プレート上にコーティングしたＧタンパク質により抗体を捕捉し、可溶性ビオチン化Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）抗原を５０μＬ（３ＭＰＢＳ）中５ｎＭで加えた。検出には５０μＬのストレプトアビジン－Ｅｕ（アッセイバッファー中１：５００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液でシグナルを発生させた。Ｄ１．３ ｈＩｇＧ１（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２１２９－２１３６に記載されている）を陰性対照として使用した。

【0430】

ファージディスプレイ選択出力をｓｃＦｖ発現ベクターｐＳＡＮＧ１０（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４６）にサブクローン化した。可溶性ｓｃＦｖを発現させ、直接固定化した標的に対するＤＥＬＦＩＡでの結合についてスクリーニングした。ヒットは、３０００蛍光単位を超えるＤＥＬＦＩＡシグナルとして定義した。

【0431】

抗体の調製
選択したｓｃＦｖを、市販のプラスミドを使用してＩｇＧ１フレームワークにサブクローン化した。ｅｘｐｉ２９３Ｆ浮遊細胞に前記プラスミドをトランスフェクトして抗体を発現させた。便宜上、別段の記載がない限り、これらの実施例で特性評価した抗体は、ｓｃＦｖとしてファージディスプレイから選択されたＩｇＧ１フォーマットの抗体を指す。しかしながら、本発明の抗体は、前述のように任意の抗体フォーマットであり得る。

【0432】

抗体精製
ＩｇＧ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清からバッチ精製した。次いで、濃縮されたプロテインＡ溶出液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製した。精製されたＩｇＧの質を、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して分析した。

【0433】

γδＴ細胞の調製
濃縮されたγδＴ細胞の集団を、ＷＯ２０１６／１９８４８０（すなわち血液由来γδＴ細胞）またはＷＯ２０２０／０９５０５９（すなわち皮膚由来γδＴ細胞）に記載の方法に従って調製した。簡潔に述べると、血液由来γδＴ細胞については、ＰＢＭＣを血液から取得し、αβＴ細胞の磁気枯渇に供した。次いで、αβが枯渇したＰＢＭＣを、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｓｅｒ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、ＯＫＴ－３（またはそれぞれの抗Ｖδ１抗体）、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１及びＩＬ－１βの存在下で、７日間培養した。培養７日目に、培地にＯＫＴ－３（またはそれぞれの抗Ｖδ１抗体）、ＩＬ－２１及びＩＬ－１５を補い、更に４日間おいた。培養１１日目に、培地にＯＫＴ－３（またはそれぞれの抗Ｖδ１抗体）及びＩＬ－１５を補い、更に３日間おいた。培養１４日目に、培地の半分を新鮮なＣｏｍｐｌｅｔｅ ＯｐＴｍｉｚｅｒと交換し、ＯＫＴ－３（またはそれぞれの抗Ｖδ１抗体）、ＩＬ－１５及びＩＦＮ－γを補った。培養１７日目以降、培養物にＯＫＴ－３（またはそれぞれの抗Ｖδ１抗体）及びＩＬ－１５を３～４日毎に補い、培地の半分を７日毎に新鮮な培地と交換した。

【0434】

皮膚由来γδＴ細胞については、皮下脂肪を除去して皮膚試料を調製し、３ｍｍ生検パンチを使用して複数のパンチを作製する。パンチをカーボンマトリックスグリッド上に置き、Ｇ－ＲＥＸ６（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）のウェルに入れる。各ウェルは、ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＬ－２及びＩＬ－１５を含有する完全単離培地で満たす。培養の最初の７日間は、アンホテリシンＢ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する完全単離培地を使用した（「＋ＡＭＰ」）。プレートまたはバイオリアクターの底部にある細胞を乱さないようにしながら、上方の培地を穏やかに吸引し、２Ｘ完全単離培地（ＡＭＰなし）と交換することにより、培地を７日毎に交換した。培養下で３週間を超えてから、得られた放出細胞を、新しい組織培養容器ならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を加えた新鮮な培地（例えばＡＩＭ－Ｖ培地またはＴｅｘＭＡＸ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））で継代培養した後に採取する。場合により、培養物中に同じく存在するαβＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉによって提供されているものなどのαβＴ細胞枯渇キット及び関連するプロトコルを用いて除去する。詳細については、ＷＯ２０２０／０９５０５９を参照のこと。

【0435】

γδＴ細胞結合アッセイ
一定濃度の精製抗体を２５００００個のγδＴ細胞と共にインキュベートすることにより、γδＴ細胞への抗体の結合を試験した。このインキュベーションは、Ｆｃ受容体を介した抗体の非特異的結合を防止する遮断条件下で行った。検出は、ヒトＩｇＧ１に対する二次蛍光色素コンジュゲート抗体の添加によって行った。陰性対照については、ａ）アイソタイプ抗体のみ（組換えヒトＩｇＧ）、ｂ）蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体のみ、ならびにｃ）ａ）及びｂ）の組み合わせを用いて細胞を調製した。完全に染色されていない細胞の対照ウェルも調製し、分析した。陽性対照として、精製されたマウスモノクローナルＩｇＧ２抗ヒトＣＤ３抗体と、精製されたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗ヒトＴＣＲ Ｖδ１抗体とを２つの異なる濃度で使用し、蛍光色素コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体で染色した。より低い濃度の陽性対照のＦＩＴＣチャネルにおける平均蛍光強度が、最も高い陰性対照の少なくとも１０倍高ければ、アッセイを合格とした。

【0436】

ＳＰＲ分析
アミン大容量チップを備えたＭＡＳＳ－２機器（両方ともＳｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）を使用してＳＰＲ分析を行った。Ｇタンパク質により、１５ｎＭのＩｇＧをアミン大容量チップ（ＴＳ８．２で１００ｎＭ）に捕捉した。Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）抗原を、２０００ｎＭ～１５．６２５ｎＭの１：２希釈系列で、会合１８０秒、解離６００秒、流速３０μＬ／分、ランニングバッファーＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０のパラメータを用いて細胞上に流した。実験はすべて室温にてＭＡＳＳ－２機器で行った。定常状態のフィッティングは、ソフトウェアＳｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．２を使用したＬａｎｇｍｕｉｒ １：１結合に従って決定した。

【0437】

コンパレータ抗体
本発明の抗体を、記載される試験アッセイにおいて市販の抗体と比較した。

【表3】

【0438】

γδＴＣＲ下方制御及び脱顆粒アッセイ
試験抗体の負荷ありまたはなしのＴＨＰ－１（ＴＩＢ－２０２（商標）、ＡＴＣＣ）標的細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ２９２７）で標識し、ＣＤ１０７ａ抗体（抗ヒトＣＤ１０７ａ ＢＶ４２１（クローンＨ４Ａ３）ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５６２６２３）の存在下でγδＴ細胞と２：１の比でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、フローサイトメトリーを使用して、γδＴ細胞におけるγδＴＣＲの表面発現（ＴＣＲ下方制御を測定するため）及びＣＤ１０７ａの発現（脱顆粒を測定するため）を評価した。

【0439】

殺傷アッセイ（例えば図６）
ガンマデルタＴ細胞殺傷活性及びγδＴ細胞の殺傷活性に対する試験抗体の効果をフローサイトメトリーによって入手した。γδＴ細胞とＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ２９２７）で標識したＴＨＰ－１細胞（抗体の負荷ありまたはなし）とを２０：１の比で４時間ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養した後、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、５２０ ６５－０８６７－１４）で染色して標的ＴＨＰ－１細胞の生死を区別した。試料の取得中に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ陽性で標的細胞をゲーティングし、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅの取り込みに基づいて細胞死を検査した。ＣＭＴＭＲ及びｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０二重陽性細胞は、死んだ標的細胞として認識された。γδＴ細胞の殺傷活性を、死んだ標的細胞の割合として提示した。

【0440】

エピトープマッピング
エピトープマッピングに使用したすべてのタンパク質試料（抗原Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）ならびに抗体１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５及び１１４１＿Ｐ０１＿Ｅ０１）を、タンパク質の完全性及び凝集レベルについて、高質量ＭＡＬＤＩを使用して分析した。

【0441】

Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５、及びＬ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１１４１＿Ｐ０１＿Ｅ０１複合体のエピトープを高分解能で決定するために、タンパク質複合体を重水素化架橋剤とインキュベートし、トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンを使用した多酵素タンパク分解に供した。架橋ペプチドを濃縮した後、試料を高分解能質量分析（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）で分析し、生成されたデータをＸＱｕｅｓｔ及びＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して分析した。

【0442】

ＳＹＴＯＸフロー殺傷アッセイ
ＳＹＴＯＸアッセイは、フローサイトメトリーを使用して標的細胞のＴ細胞媒介性細胞溶解の数量化を可能にする。原形質膜が損なわれた細胞にのみ浸透し、健康細胞のインタクトな細胞膜は通過できない死細胞染色剤（ＳＹＴＯＸ（登録商標）ＡＡＤｖａｎｃｅｄ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ１０２７４）により、死んだ／瀕死の細胞が検出される。ＮＡＬＭ－６標的細胞は、ＣＴＶ色素（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃ３４５５７）で標識したため、未標識のエフェクターＴ細胞から区別可能であった。死んだ／瀕死の標的細胞は、死細胞色素及び細胞トレース色素の二重染色によって識別される。

【0443】

示されているエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ、１：１または１０：１）でエフェクター及びＣＴＶ標識標的細胞を１６時間ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養した後、細胞をＳＹＴＯＸ（登録商標）ＡＡＤｖａｎｃｅｄ（商標）で染色し、ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）（ＢＤ）で取得した。殺傷結果は、エフェクター細胞を加えていない対照ウェル中の生きている標的細胞（最大数）に対する、試験試料中の生きている標的細胞の数（試料数）を考慮することにより計算される標的細胞低減率（％）として提示される：
標的低減％＝１００－（（試料数／最大数）×１００）

【0444】

実施例２．抗原の設計
ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、ＣＤＲ３ポリクローナル性を備えたポリクローナルである。生成された抗体がＣＤＲ３配列に対して選択される状況を回避するために（ＣＤＲ３配列はＴＣＲクローンごとに異なるため）、抗原設計には異なるフォーマットで一貫したＣＤＲ３を維持することが含まれていた。この設計は、生殖細胞系にコードされ、したがってすべてのクローンで同じである可変ドメイン内の配列を認識する抗体を生成し、γδＴ細胞のより広いサブセットを認識する抗体を提供することを目的とした。

【0445】

抗原調製プロセスの別の重要な態様は、タンパク質としての発現に好適な抗原を設計することであった。γδＴＣＲは、鎖間及び鎖内にジスルフィド結合を備えたヘテロ二量体を含有する複雑なタンパク質である。ロイシンジッパー（ＬＺ）フォーマット及びＦｃフォーマットを使用して、ファージディスプレイの選択で使用する可溶性ＴＣＲ抗原を生成した。ＬＺフォーマット及びＦｃフォーマットはどちらも良好に発現し、ＴＣＲ（特にヘテロ二量体ＴＣＲ、例えばＶδ１Ｖγ４）の提示に成功した。

【0446】

γδＴＣＲの公開データベースエントリからのＣＤＲ３配列は、タンパク質として良好に発現することが見出された（ＲＣＳＢタンパク質データバンクエントリ：３ＯＭＺ）。したがって、これを抗原調製のために選択した。

【0447】

デルタ可変１鎖を含有する抗原を、ＬＺフォーマットでヘテロ二量体として（すなわち、異なるガンマ可変鎖との組み合わせ－「Ｌ１」、「Ｌ２」、「Ｌ３」）、また、Ｆｃフォーマットでヘテロ二量体として（「Ｆ１」、「Ｆ２」、「Ｆ３」）、またはホモ二量体として（すなわち、別のデルタ可変１鎖との組み合わせ－「Ｆｃ１／１」）のいずれかで発現させた。抗原のデルタ可変１鎖はすべて、３ＯＭＺ ＣＤＲ３を含有していた。同様のフォーマットを使用して、異なるデルタ可変鎖（デルタ可変２及びデルタ可変３など）を含有する別の一連のγδＴＣＲ抗原を設計し、非特異的またはオフターゲットの結合を示す抗体（「Ｌ４」、「Ｆ９」、「Ｆｃ４／４」、「Ｆｃ８／８」）を選択解除するために使用した。また、これらの抗原は、ＣＤＲ３領域内で結合する抗体も選択解除されることを確実にするために３ＯＭＺ ＣＤＲ３を含むように設計した。

【0448】

設計された抗原が抗ＴＲＤＶ１（ＴＣＲデルタ可変１）抗体及び多特異性抗体を生成するのに好適であることを確認するために、抗原の機能検証を行った。δ１ドメインを含有する抗原でのみ検出が見られた（図１）。

【0449】

実施例３．ファージディスプレイ
ヒトｓｃＦｖのライブラリに対し、ラウンド１及び２でいずれかのヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲフォーマットを使用してファージディスプレイ選択を行い、両ラウンドでヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲを選択解除した。または、ホモ二量体Ｆｃ融合ＴＣＲを使用し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを選択解除するラウンド１を行い、続いてラウンド２はヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲに対して行い、ヘテロ二量体ＬＺ ＴＣＲを選択解除した（表２参照）。

【表4】

【0450】

選択は、１００ｎＭのビオチン化タンパク質を使用して溶液相で行った。選択解除は、１μＭの非ビオチン化タンパク質を使用して行った。

【0451】

ファージディスプレイ選択の成功をポリクローナルファージＥＬＩＳＡ（ＤＥＬＦＩＡ）によって分析した。すべてのＤＶ１選択出力が、標的Ｆｃ１／１、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ１及びＦ３に対する所望の結合を示した。非標的Ｌ４、Ｆ９、Ｆｃ４／４、Ｆｃ８／８及びＦｃに対しては様々な程度の結合が検出された（図２Ａ及びＢを参照のこと）。

【0452】

実施例４．抗体及び多特異性抗体の選択
実施例３で得られたヒットをシーケンシングした（当技術分野において公知の標準的方法を使用した）。ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３のユニークな組み合わせを示した、１３０のユニークなクローンが同定された。これら１３０のユニークなクローンのうち、１２５はユニークなＶＨ ＣＤＲ３を示し、１０９はユニークなＶＬ ＣＤＲ３を示した。

【0453】

ユニークなクローンを再整列させ、特異性をＥＬＩＳＡ（ＤＥＬＦＩＡ）によって分析した。ＴＲＤＶ１（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）とは結合するがＴＲＤＶ２（Ｌ４）とは結合しない９４のユニークなヒトｓｃＦｖバインダーのパネルが、選択から同定された。

【0454】

先に進めるクローンの選択を助けるために、選択されたバインダーの親和性のランク付けを含めた。多数のバインダーがナノモル範囲の親和性を示し、２５～１００ｎＭのビオチン化抗原と反応した。少数のバインダーは５ｎＭの抗原との強い反応を示し、１桁のナノモル親和性の可能性を示した。いくつかのバインダーは１００ｎＭの抗原との反応を示さず、マイクロモル範囲の親和性を示した。

【0455】

ＩｇＧ変換に進むクローンを選択するために、できるだけ多くの生殖細胞系列及びできるだけ多くの異なるＣＤＲ３を含めることが目的であった。更に、グリコシル化、インテグリン結合部位、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８結合部位、不対システインなどの配列傾向は避けた。更に、種々の親和性を含めた。

【0456】

選択されたクローンを、天然の細胞表面発現γδＴＣＲへの結合について、異なるドナーから取得された皮膚由来γδＴ細胞を使用してスクリーニングした。ＩｇＧに変換するために選択されたクローンを表３に示す。さらに、前記抗ＴＲＤＶ１バインダーを、標準的な組換え、発現、プロセシング、及び単離方法により、多特異性抗体へとフォーマットした。その後、第１の標的抗原（ＴＲＤＶ１）及び第２の抗原の両方への結合を前記多特異性フォーマットで確認した。

【表5】

【0457】

実施例５：抗体ＳＰＲ分析
調製したＩｇＧ抗体をγδ細胞結合アッセイにかけ、更なる機能的及び生物物理学的な特性評価のために５つを選択した。ＳＰＲ分析を行って、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。試験した抗体と分析物との相互作用のセンサグラムを、定常状態のフィット（利用可能な場合）と共に図３に提示する。８０ＲＵのＩｇＧがチップ上に捕捉されたＴＳ８．２については結合が検出されなかった。結果を表４にまとめる。

【表6】

【0458】

実施例６：ＴＣＲ会合アッセイ
本発明者らは、選択された抗体の機能的特性評価のために使用される幾つかのアッセイを設計した。第１のアッセイでは、抗体結合時のγδＴＣＲの下方制御を測定することにより、γδＴＣＲの会合を評価した。選択された抗体を、陽性対照として使用した市販の抗ＣＤ３抗体及び抗Ｖδ１抗体に対して、または陽性対照としての（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６及び１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９のための）１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８に対して試験した。市販の抗汎γδは、可変鎖に関係なくすべてのγδＴ細胞を認識する汎γδ抗体であり、したがって異なる作用機序を有する可能性が高いため、これを陰性対照として使用した。

【0459】

このアッセイは、３つの異なるドナー試料（純度９４％、８０％及び５７％の試料）から取得された皮膚由来γδＴ細胞を使用して行った。結果を図４に示す。ＥＣ５０値は以下の表４にまとめる。

【0460】

実施例７：Ｔ細胞脱顆粒アッセイ
第２のアッセイではγδＴ細胞の脱顆粒を評価した。γδＴ細胞は、アポトーシスのパーフォリン－グランザイム媒介性活性化によって標的細胞の殺傷を媒介し得ると考えられている。γδＴ細胞の細胞質内の溶解性顆粒は、Ｔ細胞が活性化すると標的細胞に向かって放出され得る。したがって、ＣＤ１０７ａに対する抗体による標的細胞の標識、及びフローサイトメトリーによる発現の測定を使用することで、脱顆粒しているγδＴ細胞を同定することができる。

【0461】

実施例６に関しては、選択された抗体を、陽性対照としての市販の抗ＣＤ３抗体及び抗Ｖδ１抗体に対して、または陽性対照としての（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６及び１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９のための）１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８に対して試験した。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、及びＤ１．３抗体を陰性対照として使用した。このアッセイは、３つの異なるドナー試料（純度９４％、８０％及び５７％の試料）から取得された皮膚由来γδＴ細胞を使用して行った。結果を図５に示す。ＥＣ５０値は以下の表５にまとめる。

【0462】

実施例８：殺傷アッセイ
第３のアッセイでは、選択された抗体で活性化されたγδＴ細胞が標的細胞を殺傷する能力を評価した。

【0463】

実施例６に関しては、選択された抗体を、陽性対照としての市販の抗ＣＤ３抗体及び抗Ｖδ１抗体に対して、または陽性対照としての（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４、１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７、１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６及び１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９のための）１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８及び陰性対照としての抗汎γδに対して試験した。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、及びＤ１．３抗体もアイソタイプ対照として使用した。このアッセイは、２名のドナーから取得した皮膚由来γδＴ細胞（純度９４％及び８０％）を使用して行った。結果を図６に示す。

【0464】

実施例６～８で試験した３つの機能アッセイの結果を表５にまとめる。

【表7】

【0465】

実施例９：エピトープマッピング
抗原／抗体複合体のエピトープを高分解能で決定するために、タンパク質複合体を重水素化架橋剤とインキュベートし、多酵素切断に供した。架橋ペプチドを濃縮した後、試料を高分解能質量分析（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）で分析し、生成されたデータをＸＱｕｅｓｔ（バージョン２．０）及びＳｔａｖｒｏｘ（バージョン３．６）ソフトウェアを使用して分析した。

【0466】

重水素化されたｄ０ｄ１２と共にタンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７をトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンでタンパク分解した後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７との間に１３個の架橋ペプチドが検出された。結果を図７に提示する。

【0467】

重水素化されたｄ０ｄ１２と共にタンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８をトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンでタンパク分解した後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８との間に５個の架橋ペプチドが検出された。結果を図８に提示する。

【0468】

重水素化されたｄ０ｄ１２と共にタンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４をトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンでタンパク分解した後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４との間に２０個の架橋ペプチドが検出された。結果を図９に提示する。

【0469】

重水素化されたｄ０ｄ１２と共にタンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５をトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンでタンパク分解した後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５との間に５個の架橋ペプチドが検出された。結果を図１０に提示する。

【0470】

別の抗体、クローンＩＤ １１４１＿Ｐ０１＿Ｅ０１でもエピトープ結合を試験した。重水素化されたｄ０ｄ１２と共にタンパク質複合体Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）／１１４１＿Ｐ０１＿Ｅ０１をトリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ及びサーモリシンでタンパク分解した後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、Ｌ１（ＤＶ１－ＧＶ４）と抗体１１４１＿Ｐ０１＿Ｅ０１との間に２０個の架橋ペプチドが検出された。結果を図１１に提示する。

【0471】

エピトープマッピング結果の概要を表６に提示する。

【表8】

【0472】

実施例１０：Ｖδ１ Ｔ細胞の増大
単離されたγδＴ細胞の増大について、選択された抗体及びコンパレータ抗体の存在下で調査した。コンパレータ抗体は、陽性対照としてのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、陰性対照としての無抗体、またはアイソタイプ対照としてのＩｇＧ１抗体から選択した。市販の抗Ｖδ１抗体であるＴＳ－１及びＴＳ８．２も比較のために試験した。

【0473】

実験１：
最初の調査は、実施例１の血液由来γδＴ細胞に関する「γδＴ細胞の調製」に記載されているようにＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ及びサイトカインと共に７０，０００細胞／ウェルを播種することによって実施した。選択された抗体及びコンパレータ抗体を４．２ｎｇ／ｍｌ～４２０ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で試験した。この実験は、プラスチックへの抗体の結合／固定化を可能にする組織培養プレートを使用して実施した。

【0474】

７日目、１４日目、及び１８日目に細胞を採取し、細胞計数器（ＮＣ２５０、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）を使用して総細胞数を決定した。結果を図７に示す。各採取時にＶδ１ Ｔ細胞の細胞生存率も測定したところ、すべての抗体が実験全体を通して細胞生存率を維持したことが示された（データは示していない）。１８日目には、Ｖδ１ Ｔ細胞のパーセンテージ、細胞数、及び変化倍率も分析した。結果を図８に示す。

【0475】

図７から分かるように、抗体を含む培養物中で産生された細胞の総数は培養中絶えず増加し、市販の抗Ｖδ１抗体に匹敵するかそれよりも良好であった。１８日目に、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４（「Ｇ０４」）、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７（「Ｅ０７」）、１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７（「Ｂ０７」）及び１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（「Ｃ０８」）の各抗体の存在下でのＶδ１陽性細胞の割合は、試験したほとんどの濃度において、ＯＫＴ３、ＴＳ－１またはＴＳ８．２の対照抗体が存在した培養物中よりも大きかった（図８Ａ参照）。

【0476】

実験２：
実施例１の「γδＴ細胞の調製」に記載したようなサイトカインを含む培養容器中の単離細胞に対して、後続の実験を行った。実験１と比較して、表面が抗体の結合／固定化を促進しない異なる培養容器を使用した。選択された抗体及びコンパレータ抗体を、４２ｐｇ／ｍｌ～４２ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で試験した。実験２では、三連で実行した実験から結果を得た。

【0477】

７日目、１１日目、１４日目及び１７日目に細胞を採取し、前出の細胞計数器を使用して総細胞数を決定した。結果を図９に示す。１７日目には、Ｖδ１ Ｔ細胞のパーセンテージ、細胞数、及び変化倍率も分析した。結果を図１０に示す。

【0478】

実験２では、非Ｖδ１細胞を含む細胞組成も測定した。１７日目の細胞を採取し、Ｖδ１、Ｖδ２及びαβＴＣＲの表面発現についてフローサイトメトリーで分析した。各培養における各細胞型の割合を図１１にグラフで示し、パーセンテージ値を表６に提示する。

【表9】

【0479】

これらの結果から分かるように、Ｖδ１陽性細胞の割合は、ＯＫＴ３、ＴＳ－１またはＴＳ８．２の対照と比較すると、Ｂ０７、Ｃ０８、Ｅ０７及びＧ０４が存在する培養物中でより大きい。したがって、試験された抗体は、培養物中に低濃度で存在する場合でも、市販の抗体よりも効率的にＶδ１陽性細胞を産生し増大させる。

【0480】

実験２の１７日目の細胞を、ＣＤ３－ＣＤ５６＋を含む追加の細胞マーカーについても分析して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ２７を発現する（すなわちＣＤ２７＋）Ｖδ１ Ｔ細胞の存在を同定した。結果を表７にまとめる。

【表10】

【0481】

実施例１１：Ｖδ１ Ｔ細胞の機能性
選択された抗体の存在下で増大したＶδ１ Ｔ細胞は、ＣＤＲ３領域のポリクローナルレパートリーを保持し、ＳＹＴＯＸフロー殺傷アッセイを使用して機能性についても試験した。結果は、１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比の細胞を使用した実験１の１４日目に得られた細胞（図１２Ａ）、ならびに１：１及び１０：１のＥ：Ｔ比の細胞を使用した実験２の１７日目（凍結解凍後）に得られた細胞（図１２Ｂ）について提示している。

【0482】

図１２から分かるように、すべての抗体の存在下で増大したＶδ１陽性細胞が標的細胞を効果的に溶解し、細胞を凍結し解凍した後でもそれらが機能的であることが示された。

【0483】

実施例１２：貯蔵後の細胞の機能性
凍結した後に解凍する貯蔵ステップ後の細胞の機能性についても調査した。実験２の１７日目に細胞の一部を培養物から取り出し、凍結した。次いで、細胞を解凍し、ＩＬ－１５を含む培養物中で更に増大させた。図１３は、凍結前にＢ０７、Ｃ０８、Ｅ０７、Ｇ０４またはＯＫＴ－３抗体と接触させた培養物についての凍結解凍後に細胞を７日間培養した後の総細胞数を示す。すべての培養物が貯蔵後に増殖する能力を示した。培養は４２日目まで継続し、この期間中、総細胞数をモニタリングした（結果を図１４に示す）。総細胞数は、選択された抗体に以前に曝露された培養物中では維持されたか、または増加した。

【0484】

実施例１３：改変された抗Ｖδ１抗体の結合同等性研究
ＥＬＩＳＡベースの抗原滴定結合研究を行って、ＨＥＫで製造された１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４抗体を、ＣＨＯで製造されたその配列変異体及びグリコシル化変異体と比較した。具体的には、フレームワーク、アロタイプ、ヒンジ媒介性エフェクター機能性、Ａｓｎ ２９７グリコシル化、及び／または製造方法に改変を行い、次いでこの研究に含めた。アッセイＥＬＩＳＡのセットアップは次のとおりであった：抗原は抗原Ｌ１（ＴＲＤＶ１／ＴＲＧＶ４）を含んでいた；ブロッキングバッファーは２％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ；ｍＡｂは５μｇ／ｍｌから始まる１／２希釈系列で希釈；ＥＬＩＳＡプレートでの抗原－抗体のインキュベーションは１時間；非特異的結合を除去するための洗浄は３×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ、次いで３×ＰＢＳ；用いた二次抗体は１／５００希釈のＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ標識抗ヒトＩｇＧ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；カタログ番号：１２４４－３３０；５０μｇ／ｍｌ）；その後１時間インキュベーションしてからＤＥＬＦＩＡ増強溶液を添加（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、説明どおりに使用）；時間分解蛍光測定法（ＴＲＦ）により測定。ＣＨＯで作られた抗体については、重鎖及び軽鎖カセットを含有する標準的な発現ベクターをアニオン交換クロマトグラフィーに基づく内毒素の低い条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍの波長で吸収を測定することによって決定した。配列はサンガーシーケンシングで検証した（ｃＤＮＡのサイズに応じてプラスミド毎に最大２つのシーケンシング反応を用いた）。懸濁に適合させたＣＨＯ Ｋ１細胞（元々ＡＴＣＣからのものを懸濁培養での無血清増殖に適合させた）を製造に用いた。シード細胞は、既知組成で動物成分を含まない無血清培地で増殖させた。次いで細胞にベクター及びトランスフェクション試薬をトランスフェクトし、細胞を更に増殖させた。上清を遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）によって採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）を使用して抗体を精製した後に製剤した。例示的な脱フコシル化抗体を生成するために、ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ＨＨ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０（１２）：１６０７－１８に最初に記載されたプロトコルを、発現及び精製の前に上述のＣＨＯ発現プラットフォームに導入した。製造及び精製の後、ｍＡｂの脱フコシル化をＭＳベースの分析によって確認した。

【0485】

この研究の結果を図１５にまとめる。図中、ｙ軸はＥＬＩＳＡシグナルを示し、ｘ軸は用いられたＶδ１抗原濃度（ｕｇ／ｍｌ）を示す。この滴定研究に含まれた抗体は概説されており、更に詳述すると、ＲＳＶは抗ＲＳＶ対照ｍＡｂ対照である（ＣＨＯで作製）。Ｇ０４は１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４である（ＨＥＫで作製、配列番号１１２）。ＡＤ３は変異体Ｇ０４である（ＣＨＯで作製；配列番号１２９、かつ可変ドメイン配列の配列番号１３１及び配列番号１３２を含み、定常ドメインの配列番号１３３及び配列番号１３４を含む）。ＡＤ４はヒンジ改変ＡＤ３である（ＣＨＯで作製；配列番号１３０、かつ定常ドメインの配列番号１３３及び配列番号１３５を含む）。ＡＤ３ｇｌｙは、工学操作されたＣＨＯで作製された脱フコシル化ＡＤ３である。すべての滴定において、すべての変異体で同等の抗原結合が観察された。

【0486】

実施例１４：ヒト生殖系Ｖδ１抗原及びその多型変異体に対する抗Ｖδ１抗体結合同等性研究。
ＥＬＩＳＡベースの結合研究比較を行って、ＩＭＧＴデータベースによるヒト生殖系Ｖδ１抗原（配列番号１を参照）への抗Ｖδ１抗体の結合を、多型ヒト生殖系Ｖδ１抗原（配列番号１２８）への結合と対比して調べた。具体的には、抗原Ｌ１（カノニカルなＴＲＤＶ１／ＴＲＧＶ４生殖系配列を含有する）及びＬ１ＡＶ（前記ＴＲＤＶ１生殖系多型を含む変異体ＴＲＤＶ１／ＴＲＧＶ４）との抗体結合及び交差反応性の比較を行った。結果を図１６に提示する。示されている抗体は次のとおりである：Ｇ０４＝１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４（配列番号１１２）；Ｇ０４ ＬＡＧＡ＝ヒンジＦｃ改変を有するＧ０４（Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡＥＵ番号付け；配列番号１３６）。Ｅ０７ ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを有する１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７、配列番号１３７。Ｃ０８ ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを有する１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８、配列番号１３８、Ｄ１．３＝対照。前記抗原に対する各抗体の系列希釈を行ったところ、すべての希釈度で、各抗体変異体について、両抗原に対する同等の結合が観察された。示されているのは、前記系列の１つの希釈例（１ｎＭ抗体）で観察された同等の結合である。

【0487】

実施例１５：抗Ｖδ１抗体の結合は、Ｖδ１＋細胞のサイトカイン分泌の増加を付与した
手短に述べると、すべての抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈し、一晩インキュベートして抗体をプレートに結合させた後、洗浄した。２つの異なる皮膚のドネーションから、本明細書の他の箇所に概説されるように（実施例１；特に、皮膚由来γδＴ細胞の調製に関するセクションを参照のこと）、皮膚由来γδＴ細胞を調製した。次いで、これらの皮膚細胞を、示されている結合抗体を含む組織培養プレートに加えた（ウェル当たり細胞１００，０００個）。次いで、細胞を１日放置してから上清を採取し、－８０℃で貯蔵した。上清のサイトカイン分析には、ＭＳＤ Ｕ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ａｓｓａｙ：Ｋ１５１ＴＴＫ－１、Ｋ１５１ＵＣＫ－１を用いた（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。この研究で用いた抗体には、ＩｇＧ１（非Ｖδ１結合対照）、Ｂ０７（１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７）、Ｅ０７（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）、Ｇ０４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４；１２４５）、及びＣ０８（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）が含まれていた。この研究の結果は図１７に提示する。具体的には、図１７（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれ、皮膚由来γδＴ細胞の上清で検出されたＴＮＦ－アルファ及びＩＦＮ－ガンマの量、ならびに示されている抗Ｖδ１抗体を適用したときに観察されたより高いレベルを概説している。

【0488】

実施例１６：抗Ｖδ１抗体は、Ｖδ１＋細胞のグランザイムＢレベル／活性の増加を付与した
本明細書の他の箇所に概説されるように（実施例１；皮膚由来γδＴ細胞の調製に関するセクションを参照のこと）、皮膚由来γδＴ細胞を調製した。まずＴＨＰ－１細胞に、ＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘプローブ（細胞透過性の蛍光発生基質は、標的細胞におけるグランザイムＢ活性を検出するように設計されている）を製造元の説明書（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＵＳ）に従ってロードした。次いで、ＴＨＰ－１細胞を図１８に示される抗体１０μｇ／ｍｌでパルスしてから、１：２０の標的／エフェクター比で皮膚由来γδＴと混合した。次いで、共培養物を手短に遠心分離して、迅速なコンジュゲート形成を確実にし、その後、１時間の共培養を行い、ＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘプロトコルに従って後続のフロー分析を行った。この研究で用いた抗体には、ＩｇＧ１（非Ｖδ１結合対照）、Ｂ０７（１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７）、Ｅ０７（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）、Ｇ０４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４；１２４５）、及びＣ０８（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）が含まれていた。結果は図１８に提示されており、示されている抗Ｖδ１抗体をこのＶδ１＋／ＴＨＰ－１共培養モデル系に適用したときに観察された標的がん細胞中のグランザイムＢのより高いレベルを明らかにしている。

【0489】

実施例１７：抗Ｖδ１抗体は、ヒト組織における免疫細胞の調節及び増殖を付与した。
ヒト皮膚パンチ生検（５名の異なるドナー由来）を、示されている抗体と共に培養下で２１日間インキュベートした。皮膚試料は、本明細書の他の箇所に記載されるように（実施例１；皮膚由来γδＴ細胞の調製に関するセクションを参照のこと）、皮下脂肪などを除去することによって調製した。次いで、各ドネーションからのパンチ複製物をカーボンマトリックスグリッド上に置き、次いでこれらをＧ－ＲＥＸ６（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）のウェルに入れた。本明細書の他の箇所にも記載されているように、各ウェルを完全培地で満たした。異なる抗体の効果を調査し比較するために、これらを０日目、７日目、１４日目に加えて１００ｎｇ／ｍｌの使用濃度とした。２１日間の培養後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。前記研究の結果は図１９に提示されており、異なる抗体の調節効果における顕著な差異を特に明らかにしている：左から右への順序：Ｖｄ１ ＴＳ８．２＝ＴＳ８．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）；ＯＫＴ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；Ｃ０８ ＩｇＧ１＝１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８；Ｅ０７＝１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７；Ｇ０４＝１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４。図１９（Ａ）は、培養終了時に観察された生存可能な汎γδＴＣＲ陽性細胞の平均量を明らかにしている；結果は、フローサイトメトリーによって分析された総生細胞集団のうちのゲーティングした画分（パーセント平均＋標準偏差）として提示されている。汎γδ含有量分析のフローゲーティングストラテジーは次のとおりである：一重項＞生細胞＞汎γδ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１３－５０８）。図１９（Ｂ）は、培養終了時に観察された生存可能なＶδ１＋ＴＣＲ陽性細胞の平均量を明らかにしている；結果は、フローサイトメトリーによって分析された総生細胞集団のうちのゲーティングした画分率（パーセント平均＋標準偏差）として提示されている。Ｖδ１＋細胞含有量分析に関して、フローゲーティングストラテジーは次のとおりである：一重項＞生細胞＞汎γδ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１３－５０８）＞Ｖδ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１００－５５３）。図１９（Ｃ）は、培養終了時に観察された生存可能な二重陽性Ｖδ１＋ＣＤ２５＋細胞の数を明らかにしている；結果は、総生細胞集団のうちのゲーティングした画分（パーセント平均＋標準偏差）として提示されている。ＣＤ２５＋Ｖδ１＋細胞含有量分析に関して、フローゲーティングストラテジーは次のとおりである：一重項＞生細胞＞汎γδ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１３－５０８）＞Ｖδ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１００－５５３）＞ＣＤ２５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１３－２８６。この研究の複合結果は、コンパレータ抗体ＴＳ８．２及びＯＫＴ３に比して異なる、本明細書に記載される本発明の抗体の効果を要約している。また、この理論に束縛されるものではないが、ＴＳ８．２またはＯＫＴ３がＶδ１＋細胞にあまり好ましくない効果を付与する可能性の１つは、このモデル系でこれらのコンパレータ分子が免疫細胞機能に経時的に付与する有害効果に起因するものであり得る。

【0490】

実施例１８：抗Ｖδ１抗体は、ＴＩＬにおける免疫細胞の調節及び増殖を付与した。
抗Ｖδ１抗体によって付与されるヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の調節及び増殖を調査するために、複数の研究を行った。これらの研究では、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍生検が新鮮な状態で輸送され、受領時に処理された。具体的には、組織を約２ｍｍ^２に細断した。最大１ｇの組織を、４．７ｍＬのＲＰＭＩ及びＭｉｌｔｅｎｙｉのＴｕｍｏｕｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔの酵素（関連細胞表面分子の切断を防止するために０．２倍濃度で使用した酵素Ｒを除いては製造元が推奨する濃度）と共に、各Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｃチューブに入れた。Ｃチューブをヒーター付きｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒに配置した。軟部腫瘍の解離のためのプログラム３７Ｃ＿ｈ＿ＴＤＫ＿１を選択した。次いで、消化物を７０ｍＭフィルタで濾過して単一細胞懸濁液を生成した。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩを消化物に加えて、酵素活性をクエンチした。細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳで２回洗浄し、計数のために再懸濁した。次いで、得られた細胞をＴＣウェル（２４ウェルＧ－ＲＥＸ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）にウェル当たり２．５×１０ｅ６で播種した。次いで、サイトカインなしまたはなしで、そして抗体ありまたはなしで、細胞を１８日間インキュベートした。この研究に含まれた抗体を図２０に概説する。これらには、ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌまで）、及び本明細書では「Ｃ０８」ともいう１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（５００ｎｇ／ｍｌまで）が含まれる。含まれた場合、これらの抗体のボーラス添加は、０日目、７日目、１１日目、及び１４日目に加えた。前記インキュベーション中、１１日目及び１４日目に培地を新鮮な培地と交換した。フローサイトメトリー分析を０日目及び１８日目に行って、リンパ球表現型及び細胞数の変化倍率を決定した。細胞はまず、生きているＣＤ４５＋細胞でゲーティングし、次いで示されているようにゲーティングした。組換えサイトカインが含まれたアームでは、これらは次のように添加した。０日目：ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＩＬ－１β。追加のＩＬ－１５は７日目、１１日目、１４日目に含めた。追加のＩＬ－２１及びＩＦＮ－γは、それぞれ７日目及び１４日目に含めた。図２０（Ａ）は、示されているようなサイトカイン補助（ＣＫ）あり及びなしで、Ｃ０８またはＯＫＴ３の存在下で１８日間培養した後のＴＩＬ Ｖδ１＋細胞の増加倍率を示す。これらの結果は、抗体またはサイトカイン単独と比較した、サイトカインの存在下でＣ０８またはコンパレータＯＫＴ３抗体のいずれかを適用したＴＩＬ Ｖδ１＋細胞における実質的な増加倍率を示す。図２０（Ｂ）は、次の採取時の総Ｖδ１細胞数の増加を示す。これらの結果は、抗体またはサイトカイン単独と比較した、サイトカインの存在下でＣ０８またはコンパレータＯＫＴ３抗体と共に培養した後のＴＩＬ Ｖδ１＋細胞数における実質的な増加を示す。図２０（Ｃ）は、細胞のフローサイトメトリー分析で使用されるゲーティングストラテジーの一例を提示する。生きているＣＤ４５＋細胞集団から、細胞をそれらの前方散乱及び側方散乱の特性（図示せず）に基づいてリンパ球でゲーティングし、次いでγδＴ細胞をＴ細胞受容体の染色によりαβＴ細胞から分離した。最後に、総γδＴ細胞集団内のＶδ１細胞の割合を決定した。１８日目の実施例データが、図示の２つの条件（±１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）について示されている：６４．３％の細胞はＣＤ４５＋であり、これらのＣＤ４５％細胞のうち、５３．１％はγδ＋であり、γδ細胞のうち、８９．７％はＶδ１＋であった。図２０（Ｄ）は、採取時のＴＩＬ Ｖδ１＋細胞の細胞表面表現型プロファイルを提示する。Ｃ０８抗体を用いた培養後、より高いレベルのＣＤ６９が観察された。図２０（Ｅ）は、採取時の生きているＣＤ４５陽性ゲート内のＴＩＬ γδ陰性、ＣＤ８陽性リンパ球画分の分析を提示する。まとめると、複合結果は、本明細書に記載される本発明の抗Ｖδ１抗体によってＴＩＬ集団に付与される調節効果を明らかにしている。

【0491】

実施例１９：抗Ｖδ１抗体は、Ｖδ１＋細胞媒介性細胞傷害性及び疾患細胞特異的細胞傷害性の増強を付与した。
図２１に示されるように、Ｖδ１＋エフェクター細胞、ＴＨＰ－１単球性がん細胞、及び健康な初代単球±本明細書に記載される抗Ｖδ１抗体（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４；１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７；１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）の三種培養物を含み、対照（ｍＡｂなしまたはＤ１．３）を含むモデル系において、細胞傷害性／効力アッセイ及び研究を行った。手短に述べると、すべての抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、３８４ウェルウルトライメージングアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で一晩４℃でインキュベートして抗体をプレートに結合させた後、ＰＢＳで洗浄した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した負の選択により、健康な対照単球を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；Ｌｏｎｚａ）から単離した。単球及び培養したＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ）をそれぞれ［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で２０分間染色した後、１：１の比で混合した。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、ある範囲のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）となるように系列希釈した後、ＴＨＰ１：単球細胞懸濁液に加えた。細胞懸濁液を３８４ウェルアッセイプレートに播種して、最終的な細胞播種密度をウェル当たりＴＨＰ－１細胞１，０００個、ウェル当たり単球１，０００個、及びある範囲のγδＴ細胞（最高Ｅ：Ｔ比６０：１）とした。２４時間後の生きているＴＨＰ－１及び健康な対照単球の数を決定するために、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、生細胞染色のサイズ、形態、質感、及び強度に基づいて数量化した。結果を図２１に提示する。図２１（Ａ）は、示されているようにプレートに結合したｍＡｂまたは対照の存在下のγδＴ細胞を用いる三重共培養下の２４時間後のＴＨＰ－１及び単球細胞の数を提示する。細胞数は、生細胞イメージングを使用したハイコンテント共焦点顕微鏡法を使用して計算した。図２１（Ｂ）は、最高Ｅ：Ｔ比（６０：１）における２４時間の共培養後の疾患細胞の特異的殺傷と非疾患健康細胞の温存との間のウィンドウを強調するように設計された棒グラフ表現を提示する。左側の棒グラフ；非疾患細胞（初代ヒト単球）の殺傷と対比した疾患細胞（ＴＨＰ－１）の殺傷の増加倍率。右側の棒グラフ；同じデータだが、対照に対する殺傷増強率として表されている。図２１（Ｃ）は、図（Ａ）から計算されたｍＡｂなしの対照と比較した、Ｖδ１ ｍＡｂの存在下でＴＨＰ－１標的細胞を殺傷するＶδ１ γδＴ細胞の効力の向上率をまとめた表形式の結果を提示する。図２１（Ｄ）は、５０％のＴＨＰ－１細胞殺傷を付与するのに必要なγδＴ細胞数として表されている、図（Ａ）から計算されたＥＣ５０値の表形式の結果を提示する。図２１に概説される複合結果及び発見は、本明細書に記載される抗体がＶδ１＋細胞の細胞傷害性及び疾患細胞特異性を増強する能力を明らかにしている。

【0492】

実施例２０：多特異性抗体は、Ｖδ１＋エフェクター細胞媒介性細胞傷害性の増強を付与した；組織中心疾患関連抗原のターゲティング。
細胞傷害性／効力アッセイ研究を行って、Ｖδ１＋エフェクター細胞及びＡ－４３１がん細胞の共培養物に対する多特異性抗体の効果を調査した。Ａ－４３１（ＥＧＦＲ^＋＋；ＡＴＣＣ）標的細胞を３８４ウェルイメージングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に１，０００細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）において３７℃で一晩インキュベートした。示されている抗体及び多特異性抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈してアッセイプレートに加えた（最終アッセイ濃度２μｇ／ｍｌ）。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、ある範囲のＥ：Ｔ比（最高Ｅ：Ｔ比６０：１）となるように系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。Ａ－４３１細胞をＶδ１γδＴ細胞と共に、抗体または対照の存在下、３０℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて細胞を染色した（最終２μＭ）。生きているＡ－４３１細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、生細胞染色のサイズ、形態、質感、及び強度に基づいて数量化した。示されている対照、コンパレータ、抗体及び多特異性抗体ありまたはなしのモデル系において標的細胞の５０％が殺傷されるＥＴ比を決定するためのエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）時間経過研究。結果を図２２に提示する。

【0493】

第１に、図２２（Ａ～Ｄ）は、抗Ｖδ１ ＶＬ＋ＶＨ結合ドメイン（第１の標的に対する）を抗ＥＧＦＲ結合部位（第２の標的に対する）のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインと組み合わせた抗Ｖδ１×抗ＴＡＡ（ＥＧＦＲ）二重特異性結合部位を含む多特異性抗体ありまたはなしで、Ｖδ１＋／Ａ－４３１共培養物を研究した共培養結果の例を提示する。用いた対照及びコンパレータは示されているとおりである；左から右：ｍＡｂなし＝抗体の添加なし；Ｄ１．３＝Ｄ１．３対照；Ｄ１．３ ＩｇＧ ＬＡＧＡ＝Ｄ１．３＋Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ；Ｄ１．３ ＦＳ１－６７＝ＥＧＦＲ結合定常ドメインとＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含むＤ１．３可変ドメイン（配列番号１３９）；セツキシマブ（インハウスで生成した）。より具体的には、図２２（Ａ）は、前述の対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｃ０８－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（配列番号１３８）；Ｃ０８ ＦＳ１－６７＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含有するＥＧＦＲ結合ドメインと組み合わせた１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（配列番号１４０）を用いた５時間の共培養の結果を提示する。図２２（Ｂ）は、前述の対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｇ０４－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４；Ｇ０４ ＦＳ１－６７＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含有するＥＧＦＲ結合ドメインと組み合わせた１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４（配列番号１４１）を用いた５時間の共培養の同等のデータを提示する。図２２（Ｃ）は、対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｅ０７－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７；Ｅ０７ ＦＳ１－６７＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含有するＥＧＦＲ結合ドメインと組み合わせた１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７（配列番号１４２）を用いた５時間の共培養の同等のデータを提示する。図２２（Ｄ）は、５時間、１２時間、及び２４時間にわたる、対照、コンパレータ、及び試験品の存在下のＶδ１γδＴ細胞の細胞傷害性の向上率をまとめた表を提示する。本明細書に記載される抗体またはその断片を多特異性フォーマットで提示した場合、４５０％を超える増強が観察され得る。

【0494】

第２に、図２２（Ｅ～Ｈ）は、抗Ｖδ１結合ドメイン（第１の標的に対する）が完全長抗体（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３／ＶＬ－ＣＬ）を含み、次いで抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ結合部位（第２の標的に対する）と組み合わさった、抗Ｖδ１×抗ＴＡＡ（ＥＧＦＲ）二重特異性結合部位を含む多特異性抗体ありまたはなしで、Ｖδ１＋／Ａ－４３１共培養物を研究した結果の例を提示する。用いた対照及びコンパレータは示されているとおりである；左から右：ｍＡｂなし＝抗体の添加なし；Ｄ１．３＝対照；Ｄ１．３ ＩｇＧ ＬＡＧＡ＝Ｄ１．３＋Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ；Ｄ１．３ ＬＡＧＡセツキシマブ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡとＣ末端セツキシマブ由来ｓｃＦｖを含むＤ１．３（配列番号１４３）；セツキシマブ（インハウスで生成した）。より具体的には、図２２（Ｅ）は、前述の対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｃ０８－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８；Ｃ０８ ＬＡＧＡセツキシマブ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＣ末端セツキシマブ由来ｓｃＦｖを含む１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８（配列番号１４４）を用いた５時間の共培養を提示する。図２２（Ｆ）は、前述の対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｇ０４－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４；Ｇ０４ ＬＡＧＡセツキシマブ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＣ末端セツキシマブ由来ｓｃＦｖを含む１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４（配列番号１４５）を用いた５時間の培養を提示する。図２２（Ｇ）は、対照、コンパレータ、及び次の試験品：Ｅ０７－ＬＡＧＡ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａを含む１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７；Ｅ０７ ＬＡＧＡセツキシマブ＝Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＣ末端セツキシマブ由来ｓｃＦｖを含む１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７（配列番号１４６）を用いた５時間の培養を提示する。図２２（Ｈ）は、５時間、１２時間、及び２４時間にわたる、対照、コンパレータ、及び試験品の存在下のＶδ１γδＴ細胞の効力の向上率をまとめた表を提示する。本明細書に記載される抗体またはその断片を多特異性フォーマットで提示した場合、３００％を超える増強が観察され得る。

【0495】

第３に、図２２（Ｉ及びＪ）は、データを表現する代替的なアプローチの一例を概説する。具体的には、示されているすべての構成部分及びコンパレータに対して相対的な２４時間の時点でのＥＧＦＲ＋細胞に対するＶδ１＋エフェクター細胞傷害性に多特異性抗体Ｅ０７ ＦＳ１－６７（Ｉ）またはＣ０８ ＦＳ１－６７（Ｊ）が付与する向上のパーセンテージが示されている。

【0496】

実施例２１：多特異性抗体は、Ｖδ１＋媒介性細胞傷害性及び疾患細胞特異的細胞傷害性の増強を付与した；造血系中心疾患関連抗原のターゲティング。
二重特異性フォーマットの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に連結したＶδ１モノクローナル抗体が特定の標的細胞のＶδ１γδＴ細胞殺傷を増強し得るかどうかを判定するために、三種培養のＶδ１＋エフェクター細胞、及びＲａｊｉがん細胞、及び健康な初代単球±抗Ｖδ１×抗ＴＡＡ（ＣＤ１９）多特異性抗体を含む多特異性抗体を含むモデル系において細胞傷害性／効力アッセイ及び研究を行った。具体的には、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋＋；ＡＴＣＣ）をＶδ１×ＣＤ１９多特異性抗体の存在下でＶδ１γδＴ細胞と共にインキュベートした。すべての抗体を４μｇ／ｍｌに希釈し（最終アッセイ濃度１μｇ／ｍｌ）、３８４ウェルイメージングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に加えた。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、ある範囲のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）となるように系列希釈した。Ｒａｊｉ細胞を［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄで染色した後、滴定したＶδ１γδＴ細胞と１：１の比で混合した。細胞懸濁液を３８４ウェルアッセイプレートに播種して、最終的な細胞播種密度をウェル当たりＲａｊｉ細胞１，０００個、及びある範囲のγδＴ細胞（最高Ｅ：Ｔ比３０：１）とした。２４時間後の生きているＲａｊｉの数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、生細胞染色のサイズ、形態、質感及び強度に基づいて数量化した。結果は図２３に記録してある。ここで用いた抗体及びコンパレータは示されているとおりである。具体的には、ＲＳＶ ＩｇＧは、モタビズマブ非結合対照であり、Ｇ０４は、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４であり、Ｅ０７は、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７であり、Ｄ１．３ ＶＨＶＬは、重鎖Ｃ末端抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含むＤ１．３ ＨＥＬであり（用いたｓｃＦｖ結合モジュールについては配列番号１５７を参照のこと）、Ｇ０４ ＶＨＶＬは、重鎖Ｃ末端抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４ ＬＡＧＡ（配列番号１５８）であり、Ｅ０７ ＶＨＶＬは、重鎖Ｃ末端抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７ ＬＡＧＡ（配列番号１５９）である。図２３（Ａ）は、（ｉ）５０％のＲａｊｉ細胞殺傷を誘導するのに必要なγδＴ細胞数またはＥ：Ｔ比として表されているＥＣ５０計算値、及び（ｉｉ）ｍＡｂなしの対照と比較したＥＣ５０における向上のパーセンテージをまとめた表である。図２３（Ｂ）は、Ｖδ１－ＣＤ１９多特異性抗体の存在下でＲａｊｉ標的細胞の５０％を溶解するγδＴ細胞の能力における向上のパーセンテージを表す棒グラフである。

【0497】

実施例２４：ヒト及びカニクイザルＶδ１に対するＶδ１－ＣＤ１９二重特異性抗体の結合親和性
標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖、ヒト及びカニクイザルの両方の抗原）に対する抗体の結合親和性は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはカニクイザルＶδ１ヘテロ二量体を細胞上に流した。実験はすべて室温で行った。これらのデータは、二重特異性抗体がヒト及びカニクイザルの両方のＶδ１と結合することを実証する。

【0498】

実施例２５Ａ：Ｖδ１γδＴ細胞活性化及び細胞傷害性アッセイにおけるＶδ１－ＣＤ１９二重特異性抗体。
負の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なＢ細胞をＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ）から単離した。がん性ＮＡＬＭ－６細胞（ＡＴＣＣ）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）、及び健康な単離Ｂ細胞におけるＣＤ１９の発現を決定した。簡潔に述べると、５×１０＾４個の細胞をＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に１５分間４℃でインキュベートした後、洗浄し固定した。ＣＤ１９の発現をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）によって決定した。結果を図２５Ａに示す。

【0499】

ＣＤ１９^＋標的細胞傷害性及びＣＤ１９^＋健康細胞の温存に対するＣＤ１９－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のハイコンテント共焦点イメージングを使用して決定した。ＮＡＬＭ－６、Ｒａｊｉ、及びＢ細胞を［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で２０分間染色した。二重特異性抗体及び対照をＰＢＳに系列希釈した後、３８４ウェルイメージングアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に加えた。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、基礎増殖培地に再懸濁した後、懸濁状態でＮＡＬＭ－６、Ｒａｊｉ、またはＢ細胞のいずれかと１：１で混合した。細胞懸濁液を３８４ウェルアッセイプレートに播種して、最終的な細胞播種密度をウェル当たりＮＡＬＭ－６細胞、Ｒａｊｉ細胞またはＢ細胞２，０００個、及びウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２，０００個とした。最終アッセイ抗体濃度は６．６ｎＭ～６６ｐＭの範囲であった。細胞を２４時間共培養した後にＤＲＡＱ７（１：３００最終、Ａｂｃａｍ）で染色した。生きている標的細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、ＣＦＳＥ染色のサイズ、形態、質感及び強度、ならびにＤＲＡＱ７染色の非存在に基づいて数量化した。結果を図２５、Ｂ～Ｅに示す。

【0500】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及び脱顆粒に対するＣＤ１９－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御及びＣＤ１０７ａの上方制御をＣＤ１９^＋標的細胞及びＣＤ１９^＋健康細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗体をＰＢＳで系列希釈した後、Ｕ底９６ウェルプレートに加えた。ＮＡＬＭ－６及び単離Ｂ細胞を［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で２０分間染色した。皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を培養フラスコから剥離し、細胞懸濁液をＮＡＬＭ－６またはＢ細胞と０．５：１で混合した。細胞懸濁液をウェル当たりＮＡＬＭ－６またはＢ細胞５×１０＾４個に対してウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は６０ｎＭ～３ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、及びａＣＤ１０７ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の表面発現について３０分間４℃で染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した後、４℃の暗所で一晩インキュベートした。翌日、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーにより、ＶＤ１ ＴＣＲ発現レベルを測定した。結果を図２５、Ｆ～Ｋに示す。

【0501】

結論：Ｖδ１－ＣＤ１９二重特異性抗体は、健康なＣＤ１９^＋細胞を温存しながら、ＣＤ１９^＋標的細胞のγδＴ細胞媒介性細胞傷害性を増強する。

【0502】

実施例３８：Ｖδ１－ＣＤ１９二重特異性抗体は、健康細胞を温存しながら、がん細胞に対するＶδ１γδＴ細胞の細胞傷害性効果を選択的に増強する
ＣＤ１９＋標的細胞傷害性及びＣＤ１９＋健康細胞の温存に対するＣＤ１９－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のハイコンテント共焦点イメージングを使用して決定した。負の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なＢ細胞をＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ）から単離した。Ｒａｊｉ細胞及び健康な初代Ｂ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ色素で染色した。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞及びドナー適合αβＴ細胞を培養物から取り出し、洗浄し、培養培地に再懸濁した後、Ｒａｊｉ細胞及びＢ細胞と１：１で混合した。二重特異性抗体及び対照をＰＢＳで系列希釈した後、３８４ウェルイメージングアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に加えた。γδＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＢ細胞、またはαβＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＢ細胞、またはＶδ１γδＴ細胞、αβＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＢ細胞のいずれかの細胞懸濁液を３８４ウェルイメージングアッセイプレートに加えて、ウェル当たり各細胞型２，０００個、及び６．６ｎＭ～６６ｐＭの範囲の最終的な抗体アッセイ濃度を達成した。生きている標的細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、２４時間時点のＣＦＳＥ染色のサイズ、形態、質感及び強度に基づいて数量化した。結果を図３８、Ａ～Ｆに示す。

【0503】

Ｖδ１γδＴ細胞またはαβＴ細胞の活性化が腫瘍形成促進性サイトカインＩＬ－１７の産生上昇をもたらすかどうかを判定するために、２４時間時点で画像を取得した後、上清をイメージングプレートから収集した。上清をＵ－Ｐｌｅｘ １０－ｐｌｅｘ Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）に流し、ＩＬ－１７Ａレベルを数量化した。結果を図３８、Ｇ～Ｉに示す。

【0504】

ＩＬ－１７Ａ（インターロイキン－１７Ａ）は、活性化されたＴ細胞によって産生される腫瘍形成促進性サイトカインである。ＩＬ－１７Ａは、腫瘍の増殖を増強し、抗がん免疫応答を抑制し得る。図３８、Ｇ～Ｉに示すように、抗ｖδ１抗体はＩＬ－１７Ａの分泌を誘導しないが、抗ＣＤ３抗体は誘導する。

【0505】

結論：Ｖδ１－ＣＤ１９二重特異性抗体は、健康なＣＤ１９＋細胞を温存しながら、ＣＤ１９＋標的細胞のγδＴ細胞媒介性細胞傷害性を増強する。対照的に、抗ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性薬は、γδＴ細胞及びαβＴ細胞の両方によるＣＤ１９＋標的細胞の溶解を増強させたが、αβＴ細胞の活性化は、健康な初代ＣＤ１９＋Ｂ細胞の溶解、及び腫瘍形成促進性サイトカインＩＬ－１７Ａの分泌も増強させた。

【0506】

実施例２６：結合アッセイ及びハイコンテント細胞傷害性アッセイにおけるＶδ１－Ｈｅｒ２二重特異性抗体。
Ｈｅｒ２及びＶδ１の発現を、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃａｌｔａｇ－Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）、ＢＴ－４７４細胞（ＡＴＣＣ）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ細胞（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＶδ１γδＴ細胞で測定した。簡潔に述べると、５×１０＾４個の細胞をＨｅｒ２及びＶδ１抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）と共に１５分間４℃でインキュベートした後、洗浄し固定した。Ｈｅｒ２及びＶδ１の発現をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）によって決定した。結果を図２６Ａ及び２６Ｂに示す。ある範囲の濃度の抗Ｖδ１抗体もしくはＶδ１二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照またはトラスツズマブ）と共に標的細胞を１５分間インキュベートすることにより、Ｈｅｒ２－Ｖδ１二重特異性抗体の結合を決定した。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図２６、Ｃ～Ｆに示す。

【0507】

Ｈｅｒ２^＋／Ｈｅｒ２^－標的細胞傷害性に対するＨｅｒ２－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のハイコンテント共焦点イメージングを使用して決定した。簡潔に述べると、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３８４ウェルイメージングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に播種して最終的な播種密度をウェル当たり標的細胞２，０００個とした後、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。抗体をＰＢＳに希釈し、１：１０に系列希釈した後、アッセイプレートに加えて最終アッセイ濃度を３３３ｎＭ～０．３３ｐＭとした。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、基礎増殖培地に再懸濁した後、アッセイプレートに１：１のエフェクター：標的比でウェル当たり細胞２，０００個を加えた。細胞を２４時間共培養した後にＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０００最終、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＲＡＱ７（１：３００最終、Ａｂｃａｍ）で染色した。生きている標的細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、生細胞染色のサイズ、形態、質感及び強度、ならびにＤＲＡＱ７染色の非存在に基づいて数量化した。結果を図２６、Ｇ～Ｊに示す。

【0508】

結論：Ｖδ１－Ｈｅｒ２二重特異性抗体は、Ｈｅｒ２－細胞を温存しながら、Ｈｅｒ２＋標的細胞のγδＴ細胞媒介性細胞傷害性を増強する。

【0509】

実施例２７：ヒトＶδ１及びヒトＥＧＦＲ抗原に対するＶδ１－ＥＧＦＲ二重特異性抗体の結合親和性
標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＥＧＦＲ）に対する抗体の結合親和性は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＥＧＦＲを、１００ｎＭの濃度で、会合１８０秒、解離４８０秒、流速２５μＬ／分、ランニングバッファーＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０のパラメータを用いて細胞上に流した。実験はすべて室温で行った。結果を図２７Ａ及び２７Ｂに示す。

【0510】

結論：このデータは、Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体が、ヒトＥＧＦＲ結合能力の導入に加えて、その親単特異性抗体に匹敵するヒトＶδ１への結合を示すことを実証する。

【0511】

実施例２８：Ｖδ１－ＥＧＦＲ二重特異性抗体の標的細胞結合
ＥＧＦＲ／Ｖδ１二重特異性抗体の結合の特異性及び親和性を決定するために、ＥＧＦＲ陽性Ａ４３１及びＶδ１陽性初代γδＴ細胞をアッセイした。標的細胞を組織培養フラスコから剥離し、ＰＢＳに再懸濁し、ｖ底９６ウェルプレートにウェル当たり細胞１００，０００個の最終密度で播種した。細胞を遠心分離にかけ、製造元の説明書に従って細胞ペレットをＦｃＲブロッキング試薬に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートしてから更に洗浄した。抗体をＰＢＳで５００ｎＭに希釈し、ＰＢＳで１：１０に系列希釈して５０ｐＭとし、細胞に加えた後、４℃で２０分間のインキュベーションを行った。細胞表面に結合したｍＡｂの量を決定するために、生死判別色素に加えて、ＡＰＣにコンジュゲートされたマウス抗ヒトＩｇＧ二次抗体（製品コード．．、希釈度１：１００）で細胞を染色した。４℃で２０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔを使用して蛍光を測定した。結果を図２８、Ａ～Ｆに示す。

【0512】

結論：このデータは、Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体が、ＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞株への結合の導入に加えて、その親単特異性ｍＡｂに匹敵するＶδ１γδＴ細胞への結合を示すことを実証する。

【0513】

実施例２９：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのγδＴ細胞の活性化及び標的細胞傷害性の評価
増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞及びＡ４３１細胞を組織培養フラスコから剥離し、基礎増殖培地に再懸濁し、所望のエフェクター：標的比に応じた適切な細胞希釈度で９６ウェルプレートに播種した。ｍＡｂを希釈し、規定濃度で各ウェルに加えた。次いで培養物を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間（Ｄ）または２４時間（Ａ～Ｃ、Ｅ）インキュベートした。生細胞の数を決定するために、細胞を採取し、１：１０００の希釈度の生死判別色素で２０分間染色した。ＣＤ２５の状態を決定するために、細胞を採取した後、細胞表面を抗ＣＤ２５抗体で染色した。脱顆粒を測定するために、フルオロフォアにコンジュゲートした抗ＣＤ１０７α抗体を共培養開始時に細胞－抗体ミックスに直接加えた。２回の洗浄及び細胞固定の後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔを使用して蛍光を測定し、生細胞数及び蛍光強度中央値を決定した。結果を図２９、Ａ～Ｅに示す。

【0514】

結論：このデータは、Ｖδ１／ＥＧＦＲ二重特異性抗体が初代Ｖδ１陽性γδＴ細胞の活性化及び脱顆粒を誘導し、ＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞株の細胞媒介性溶解を増加させることを実証する。

【0515】

実施例３０：抗ｖδ１抗体は、ｖδ１細胞におけるＣＤ３下方制御を引き起こす。
複数の研究を行って、ｖδ１細胞におけるＣＤ３の下方制御に関する、抗ｖδ１抗体によるｖδ１細胞の刺激／活性化の効果を調査した。これは、抗ｖδ１クローンＡＤＴ１－４－２をＰＢＭＣと共にインキュベートし、次いで表現型解析によりＴＣＲを分析することによって試験した。

【0516】

凍結保存されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を商業的に調達し、丸底９６ウェル組織培養プレートに、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を含む２５０ｕｌの完全培地（１０％ＦＣＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びＨＥＰＥＳを補ったＲＰＭＩ）中、２５０，０００細胞／ウェルで播種した。滴定ｖδ１抗体ＡＤＴ１－４－２を、１ｕｇ／ｍｌ（６．６７ｎＭ）、０．０１ｕｇ／ｍｌ（０．０６７ｎＭ）、または０．０００１ｕｇ／ｍｌ（０．０００６７ｎＭ）の最終濃度まで加えた。一致する濃度の対照としてＲＳＶ ＩｇＧ抗体を含めた。３日毎に培地及び抗体を補充しながら、培養物を１４日間インキュベートした。各条件でｖδ１細胞及びＴＣＲ発現の表現型解析を行うために、エンドポイントでフローサイトメトリー分析を行った。細胞はまず、生きている一重項でゲーティングし、続いて汎γδ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ５９２；１３０－１１３－５０８）でゲーティングし、これはｖδ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ１７３；１３０－１００－５５３）のための親ゲートであり、これ自体がＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ６１３；１３０－１１３－１４２）のための親ゲートであった。細胞集団を陽性染色によって同定し、次いでＭＦＩによって試料間の各マーカーの相対的な発現レベルを同定した。

【0517】

図３０Ａは、ｍＡｂ標的会合の指標としての抗体刺激時のｖδ１ ＴＣＲのＭＦＩを示す。図３０Ｂは、陽性ゲーティングされたｖδ１細胞におけるＣＤ３発現のＭＦＩを示す。ｖδ１抗体クローンＡＤＴ１－４－２による刺激はｖδ１細胞を会合させ、ｖδ１細胞上のｖδ１及びＣＤ３の両方の下方制御をもたらした。

【0518】

実施例３１：Ｖδ１－ＦＡＰα二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及びＦＡＰα＋線維芽細胞の溶解を増強する。
抗Ｖδ１抗体、抗ＦＡＰα抗体、及び抗Ｖδ１×ＦＡＰα抗体のそれらの標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＦＡＰα）に対する結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＦＡＰαを、１００ｎＭの濃度で、会合１８０秒、解離４８０秒、流速２５μＬ／分、ランニングバッファーＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０のパラメータを用いて細胞上に流した。実験はすべて室温で行った。結果を図３１、Ａに示す。

【0519】

ある範囲の濃度の抗Ｖδ１抗体もしくはＶδ１二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗ＦＡＰα）と共にＦＡＰα^＋標的細胞またはＶδ１^＋エフェクター細胞を１５分間インキュベートすることにより、Ｖδ１－ＦＡＰα二重特異性抗体の結合を決定した。洗浄後、細胞を抗ヒトＦｃ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３１、Ｂ～Ｃに示す。

【0520】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及び脱顆粒に対するＶδ１－ＦＡＰα二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御及びＣＤ１０７ａの上方制御をＦＡＰα^＋標的細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗ＦＡＰα、及び抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、Ｕ底９６ウェルプレートに加えた。ＦＡＰα^＋標的細胞（ＢＪ線維芽細胞またはヒト皮膚線維芽細胞）を［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で２０分間染色した。皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を培養フラスコから剥離し、細胞懸濁液をＦＡＰα^＋標的細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たりＦＡＰα^＋標的細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、及びａＣＤ１０７ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の表面発現について３０分間４℃で染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した後、４℃の暗所で一晩インキュベートした。翌日、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーにより、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により決定されるＶＤ１ ＴＣＲ及びＣＤ１０７ａの発現レベルを測定した。結果を図３１Ｄ～Ｇに示す。

【0521】

ＦＡＰα^＋線維芽細胞の非存在下では中程度のＶδ１ ＴＣＲ下方制御が観察される（図３１、Ｄ）。しかしながら、ＦＡＰα^＋線維芽細胞の存在下では、抗ＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体はＴＣＲ下方制御を大幅に増強する（図３１、Ｅ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する抗ＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体の効果が、隣接細胞上のＦＡＰαなどの腫瘍特異的抗原への結合を介して増強されることを示す。

【0522】

抗Ｖδ１×ＦＡＰα二重特異性抗体及びＦＡＰα^＋線維芽細胞の存在下では、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒のマーカー）がＶδ１γδＴ細胞においてモノクローナル対照と比較して上方制御される（図３１、Ｇ）。ＦＡＰα^＋線維芽細胞が存在しない場合、ＣＤ１０７ａはＶδ１γδＴ細胞においてモノクローナル対照と比較して上方制御されない（図３１、Ｆ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞におけるＣＤ１０７ａの上方制御に対する抗ＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体の効果が特異的であり、抗ＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体がＦＡＰα^＋細胞の存在下でＶδ１γδＴ細胞の脱顆粒及び活性化を増強することを示す。

【0523】

ＦＡＰα^＋標的細胞傷害性に対するＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のハイコンテント共焦点イメージングを使用して決定した。ＦＡＰα^＋標的細胞（ＢＪ線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞）を３８４ウェルイメージングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に播種し、２４時間インキュベートした。二重特異性抗体及び対照をＰＢＳに系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、基礎増殖培地に再懸濁した後、アッセイプレートに１：１のエフェクター：標的比で加えた。最終アッセイ抗体濃度は６．６ｎＭ～６６ｆＭの範囲であった。細胞を２４時間共培養した後にＤＲＡＱ７（１：３００最終、Ａｂｃａｍ）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１：１，０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。生きている標的細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色のサイズ、形態、質感及び強度、ならびにＤＲＡＱ７染色の非存在に基づいて数量化した。結果を図３１、Ｈに示す。抗ＦＡＰα－Ｖδ１二重特異性抗体の存在下では、抗Ｖδ１及び抗ＦＡＰα対照と比較して、線維芽細胞傷害性の顕著な増加が観察された（図３１、Ｈ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞を標的細胞と直接架橋すると、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及び細胞傷害性効果を特異的に増強できることを示している。

【0524】

結論：抗Ｖδ１－ＦＡＰα二重特異性抗体は、Ｖδ１^＋γδＴ細胞及びＦＡＰα＋標的細胞に特異的に結合し、上昇したＶδ１ ＴＣＲ下方制御、ＣＤ１０７ａ上方制御、及びＦＡＰα^＋線維芽細胞の溶解によって示されるように、ＦＡＰα^＋細胞の存在下のＶδ１γδＴ細胞の活性化を増強させる。

【0525】

実施例３２：Ｖδ１－ＭＳＬＮ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及びＭＳＬＮ^＋標的細胞の溶解を増強する。
抗Ｖδ１抗体、抗ＭＳＬＮ（メソテリン）抗体、及び抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ抗体のそれらの標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＭＳＬＮ）に対する結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＭＳＬＮを、１００ｎＭの最高濃度で、会合１８０秒、解離４８０秒、流速２５μＬ／分、ランニングバッファーＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０のパラメータを用いて細胞上に流した。実験はすべて室温で行った。結果を図３２、Ａに示す。

【0526】

ある範囲の濃度の抗Ｖδ１抗体もしくはＶδ１二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗ＭＳＬＮ）と共にＭＳＬＮ^＋標的細胞またはＶδ１^＋エフェクター細胞を１５分間インキュベートすることにより、ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の結合を決定した。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３２、Ｂ～Ｃに示す。

【0527】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及び脱顆粒に対するＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御及びＣＤ１０７ａの上方制御をＭＳＬＮ^＋標的細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗ＭＳＬＮ、及び抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、Ｕ底９６ウェルプレートに加えた。ＭＳＬＮ^＋標的細胞（ＯＶＣＡＲ－３またはＨｅＬａ）を［０．５μＭ］ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で２０分間染色した。皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を培養フラスコから剥離し、細胞懸濁液をＭＳＬＮ^＋標的細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たりＭＳＬＮ^＋標的細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、及びａＣＤ１０７ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の表面発現について３０分間４℃で染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した後、４℃の暗所で一晩インキュベートした。翌日、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーにより、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により決定されるＶＤ１ ＴＣＲ及びＣＤ１０７ａの発現レベルを測定した。結果を図３２Ｄ～Ｇに示す。

【0528】

ＭＳＬＮ^＋標的細胞の非存在下では中程度のＶδ１ ＴＣＲ下方制御が観察される（図３２、Ｄ）。しかしながら、ＭＳＬＮ^＋ＯＶＣＡＲ－３細胞の存在下では、抗ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体はＴＣＲ下方制御を大幅に増強する（図３２、Ｅ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞におけるＶδ１ ＴＣＲの下方制御に対する抗ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の効果が、隣接細胞上のＭＳＬＮなどの腫瘍特異的抗原への結合を介して増強されることを示す。

【0529】

抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体及びＭＳＬＮ^＋ＯＶＣＡＲ－３細胞の存在下では、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒のマーカー）がＶδ１γδＴ細胞においてモノクローナル対照と比較して上方制御される（図３２、Ｇ）。ＭＳＬＮ^＋ＯＶＣＡＲ－３細胞が存在しない場合、ＣＤ１０７ａはＶδ１γδＴ細胞においてモノクローナル対照と比較して上方制御されない（図３２、Ｆ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞におけるＣＤ１０７ａの上方制御に対する抗ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の効果が特異的であり、抗ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体がＭＳＬＮ^＋細胞の存在下でＶδ１γδＴ細胞の脱顆粒及び活性化を増強することを示す。

【0530】

ＭＳＬＮ^＋標的細胞傷害性に対するＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の効果を、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のハイコンテント共焦点イメージングを使用して決定した。ＭＳＬＮ^＋標的細胞（ＨｅＬａまたはＯＶＣＡＲ－２）を３８４ウェルイメージングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に播種し、２４時間インキュベートした。二重特異性抗体及び対照をＰＢＳに系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。増大した皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞を組織培養フラスコから剥離し、基礎増殖培地に再懸濁した後、アッセイプレートに１：１のエフェクター：標的比で加えた。最終アッセイ抗体濃度は６．６ｎＭ～６６ｆＭの範囲であった。細胞を２４時間共培養した後にＤＲＡＱ７（１：３００最終、Ａｂｃａｍ）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１：１，０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。生きている標的細胞の数を決定するため、９つの視野を１０倍拡大率でキャプチャするＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントプラットフォームを使用して共焦点像を取得した。生細胞数は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色のサイズ、形態、質感及び強度、ならびにＤＲＡＱ７染色の非存在に基づいて数量化した。結果を図３２、Ｈに示す。抗ＭＳＬＮ－Ｖδ１二重特異性抗体の存在下では、抗Ｖδ１及び抗ＭＳＬＮ対照と比較して、標的細胞傷害性の顕著な増加が観察された（図３２、Ｈ）。これは、Ｖδ１γδＴ細胞を標的細胞と直接架橋すると、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化及び細胞傷害性効果を特異的に増強できることを示している。

【0531】

結論：抗Ｖδ１×ＭＳＬＮ二重特異性抗体は、Ｖδ１^＋γδＴ細胞及びＭＳＬＮ^＋標的細胞に特異的に結合し、上昇したＶδ１ ＴＣＲ下方制御、ＣＤ１０７ａ上方制御、及びＭＳＬＮ^＋標的細胞の溶解によって示されるように、ＭＳＬＮ^＋細胞の存在下のＶδ１γδＴ細胞の活性化を増強させる。

【0532】

実施例３３：Ｖδ１－ＰＤ－１二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞活性化を増強し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害を遮断する
抗Ｖδ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗Ｖδ１×ＰＤ－１抗体が結合する（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＰＤ－１）結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＰＤ－１を１００ｎＭの最高濃度で細胞上に流した。結果を図３３Ａに示す。

【0533】

両方の標的リガンドに対する二重特異性抗体の二重結合を評価するため、組換えＰＤ－１をまずＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０ｕｇ／ｍｌで固定化してから、二重特異性抗体を１００ｎＭで流した。次いで、組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体を１００ｎＭで流すことにより、その後にＶδ１γδＴＣＲに結合する能力を評価した。実験はすべて室温で行った。結果を図３３Ｂに示す。

【0534】

Ｖδ１γδＴ細胞及びＰＤ－１^＋免疫細胞に対する抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。最初に、全血から抽出されたＰＢＭＣバフィーコートからの磁気選別により、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の負の選択を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化の後、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＰＤ－１の細胞表面発現を検出した。活性化されたＴ細胞及びＶδ１γδＴ細胞を、ある範囲の濃度の抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗ＰＤ－１）と共に１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３３Ｃ、Ｄに示す。

【0535】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御をＰＤ－１^＋Ｔ細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗ＰＤ－１、及び抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。ＰＤ－１^＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で染色し、皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たりＰＤ－１^＋Ｔ細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＶδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）について染色した。細胞を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーで測定した蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により、ＶＤ１ ＴＣＲ発現レベルを決定した。結果を図３３Ｅ、Ｆに示す。

【0536】

ＰＤ－１^＋Ｔ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体の効果を評価するため、ＰＤ－１^＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＪＡ２１９１）を抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体または対照（ＰＤ－１モノクローナル抗体または抗ＲＳＶＩｇＧ×抗ＰＤ－１）と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。このアッセイは、不透明な白色９６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで予めコーティングした組換えＶδ１タンパク質の存在下または非存在下で行った。５時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に１：１の比で加えた。室温で５分間インキュベートした後、発光シグナルをＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで検出した。生の発光シグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）の倍率に変換した。結果を図３３Ｇに示す。

【0537】

結論：抗Ｖδ１×ＰＤ－１二重特異性抗体は、例えば、ＰＤ－１^＋ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を介して架橋すること、及びＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害を遮断することにより、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強する。

【0538】

実施例３４：Ｖδ１－４－１ＢＢ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を増強する
抗Ｖδ１抗体、抗４－１ＢＢ抗体、及び抗Ｖδ１×４－１ＢＢ抗体のそれらの標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及び４－１ＢＢ）に対する結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒト４－１ＢＢを１００ｎＭの最高濃度で細胞上に流した。結果を図３４Ａに示す。

【0539】

両方の標的リガンドに対する二重特異性抗体の二重結合を評価するため、組換え４－１ＢＢをまずＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０ｕｇ／ｍｌで固定化してから、二重特異性抗体を１００ｎＭで流した。次いで、組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体を１００ｎＭで流すことにより、その後にＶδ１γδＴＣＲに結合する能力を評価した。実験はすべて室温で行った。結果を図３４Ｂに示す。

【0540】

Ｖδ１γδＴ細胞及び４－１ＢＢ^＋免疫細胞に対する抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。最初に、全血から抽出されたＰＢＭＣバフィーコートからの磁気選別により、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の負の選択を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化の後、ＣＤ８ Ｔ細胞における４－１ＢＢの細胞表面発現は上昇していた。活性化された４－１ＢＢ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞及びＶδ１γδＴ細胞を、ある範囲の濃度の抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗４－１ＢＢ）と共に１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３４Ｃ、Ｄに示す。

【0541】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御を４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗４－１ＢＢ、及び抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。４－１ＢＢ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で染色し、皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たり４－１ＢＢ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＶδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）について染色した。細胞を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーで測定した蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により、ＶＤ１ ＴＣＲ発現レベルを決定した。結果を図３４、Ｅ、Ｆに示す。

【0542】

４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体の効果を評価するため、４－１ＢＢ^＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＪＡ２１９１）を抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体または対照（抗４－１ＢＢモノクローナル抗体または抗ＲＳＶＩｇＧ×抗４－１ＢＢ）と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。アッセイは、不透明な白色９６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで予めコーティングした組換えＶδ１タンパク質の存在下または非存在下で行った。５時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に１：１の比で加えた。室温で５分間インキュベートした後、発光シグナルをＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで検出した。生の発光シグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）の倍率に変換した。結果を図３４、Ｇに示す。

【0543】

結論：抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体は、例えば、４－１ＢＢ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞に架橋すること、及び４－１ＢＢ^＋Ｔ細胞を活性化することにより、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強する。

【0544】

実施例３５：Ｖδ１－ＯＸ４０二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を増強する
抗Ｖδ１抗体、抗ＯＸ４０抗体、及び抗Ｖδ１×ＯＸ４０抗体のそれらの標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＯＸ４０）に対する結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＯＸ４０を１００ｎＭの最高濃度で細胞上に流した。結果を図３５、Ａに示す。

【0545】

両方の標的リガンドに対する二重特異性抗体の二重結合を評価するため、組換えＯＸ４０をまずＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０ｕｇ／ｍｌで固定化してから、二重特異性抗体を１００ｎＭで流した。次いで、組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体を１００ｎＭで流すことにより、その後にＶδ１γδＴＣＲに結合する能力を評価した。実験はすべて室温で行った。結果を図３５、Ｂに示す。

【0546】

Ｖδ１γδＴ細胞及びＯＸ４０^＋免疫細胞に対する抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。最初に、全血から抽出されたＰＢＭＣバフィーコートからの磁気選別により、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の負の選択を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化の後、ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＯＸ４０の細胞表面発現は上昇していた。活性化されたＯＸ４０^＋ＣＤ４ Ｔ細胞及びＶδ１γδＴ細胞を、ある範囲の濃度の抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗ＯＸ４０）と共に１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３５、Ｃ、Ｄに示す。

【0547】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御をＯＸ４０^＋Ｔ細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗ＯＸ４０、及び抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。ＯＸ４０^＋ＣＤ４ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で染色し、皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たりＯＸ４０^＋ＣＤ４ Ｔ細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＶδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）について染色した。細胞を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーで測定した蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により、ＶＤ１ ＴＣＲ発現レベルを決定した。結果を図３５、Ｅ、Ｆに示す。

【0548】

ＯＸ４０^＋Ｔ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体の効果を評価するため、ＯＸ４０^＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＪＡ２１９１）を抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体または対照（ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）、抗ＯＸ４０または抗ＲＳＶＩｇＧ×抗ＯＸ４０）と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。アッセイは、不透明な白色９６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで予めコーティングした組換えＶδ１タンパク質の存在下または非存在下で行った。５時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に１：１の比で加えた。室温で５分間インキュベートした後、発光シグナルをＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで検出した。生の発光シグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）の倍率に変換した。結果を図３５、Ｇに示す。

【0549】

結論：抗Ｖδ１×ＯＸ４０二重特異性抗体は、例えば、ＯＸ４０^＋ＣＤ４ Ｔ細胞に架橋すること、及びＯＸ４０^＋Ｔ細胞を活性化することにより、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強する。

【0550】

実施例３６：Ｖδ１－ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、Ｖδ１γδＴ細胞活性化を増強し、ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ（ＣＤ１５５）チェックポイント阻害を遮断する
抗Ｖδ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ抗体のそれらの標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖及びＴＩＧＩＴ）に対する結合の結合動態は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＳＰＲ分析によって確立される。抗体（１．５ｕｇ／ｍＬ）をＰｌａｎａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコーティングして、およそ５００ｕＲＩＵのベースラインの増加をもたらす。組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体またはヒトＴＩＧＩＴを１００ｎＭの最高濃度で細胞上に流した。結果を図３６、Ａに示す。

【0551】

両方の標的リガンドに対する二重特異性抗体の二重結合を評価するため、組換えＴＩＧＩＴをまずＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０ｕｇ／ｍｌで固定化してから、二重特異性抗体を１００ｎＭで流した。次いで、組換えヒトＶδ１ヘテロ二量体を１００ｎＭで流すことにより、その後にＶδ１γδＴＣＲに結合する能力を評価した。実験はすべて室温で行った。結果を図３６、Ｂに示す。

【0552】

Ｖδ１γδＴ細胞及びＴＩＧＩＴ^＋免疫細胞に対する抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。最初に、全血から抽出されたＰＢＭＣバフィーコートからの磁気選別により、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の負の選択を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による活性化の後、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞における４－１ＢＢの細胞表面発現を検出した。活性化されたＴ細胞及びＶδ１γδＴ細胞を、ある範囲の濃度の抗Ｖδ１×４－１ＢＢ二重特異性抗体または対照（ＩｇＧ対照または抗４－１ＢＢ）と共に１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に更に１５分間インキュベートしてから、洗浄し固定した。各細胞型に結合した抗体の量をフローサイトメトリーによって決定した。結果を図３６、Ｃ、Ｄに示す。

【0553】

Ｖδ１γδＴ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の効果を決定するため、Ｖδ１ ＴＣＲの下方制御をＴＩＧＩＴ^＋Ｔ細胞の存在下で数量化した。簡潔に述べると、抗Ｖδ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体をＰＢＳで系列希釈した後、アッセイプレートに加えた。ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ生細胞色素で染色し、皮膚由来Ｖδ１γδＴ細胞と１：１で混合したか、または培地で１：１に希釈した。細胞懸濁液を、ウェル当たりＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞２．５×１０＾４個の存在下または非存在下にて、ウェル当たりＶδ１γδＴ細胞２．５×１０＾４個でアッセイプレートに播種した。最終アッセイ抗体濃度は２００ｎＭ～２ｐＭの範囲である。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてから洗浄し、死細胞（ｅＦｌｏｕｒ ５２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＶδ１ ＴＣＲ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）について染色した。細胞を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｆｉｘ（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６を使用したフローサイトメトリーで測定した蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により、ＶＤ１ ＴＣＲ発現レベルを決定した。結果を図３６、Ｅ、Ｆに示す。

【0554】

ＴＩＧＩＴ^＋Ｔ細胞の活性化に対する抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の効果を評価するため、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＪＡ２１９１）を抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体または対照（抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体または抗ＲＳＶＩｇＧ×抗ＴＩＧＩＴ）と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。アッセイは、不透明な白色９６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで予めコーティングした組換えＶδ１タンパク質の存在下または非存在下で行った。５時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に１：１の比で加えた。室温で５分間インキュベートした後、発光シグナルをＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで検出した。生の発光シグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）の倍率に変換した。結果を図３６、Ｇに示す。

【0555】

結論：抗Ｖδ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞を介して架橋すること、及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５免疫チェックポイント阻害を遮断することにより、Ｖδ１γδＴ細胞の活性化を増強する。

【0556】

実施例３７：抗ｖδ１抗体はＡＤＣＣを誘導しない。
ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、抗ｖδ１抗体によって誘導されるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）のレベルを対照抗体と比較して評価した。

【0557】

ＡＤＣＣとは、抗体によってタグ付けされた標的細胞をエフェクター細胞が殺傷する生物学的現象を指す。エフェクター細胞は、Ｆｃγ受容体を介して抗体に結合し、続いて標的細胞を殺傷する。ここで提示するＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）経路による遺伝子転写の活性化を介してＡＤＣＣの早期開始を検出することにより、アッセイ内で試験される抗体の潜在的なＡＤＣＣ作用メカニズムを明らかにする。このレポーターアッセイは、ＮＦＡＴ経路に連結した高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ受容体を発現するエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔｓ）を利用する工学操作系であり、活性化されるとホタルルシフェラーゼ酵素のさらなる活性化を誘導するように、さらに工学操作されている。ルシフェラーゼ活性は、発生するＡＤＣＣのレベルに相関し得る発光の読み取り値によって数量化される。

【0558】

このアッセイは、抗ｖδ１抗体、または好適には多特異性抗体の抗ｖδ１アームが、ＡＤＣＣ反応を駆動するかどうかを理解するために利用した。利用した標的細胞は、ｖδ１γδＴＣＲを介して抗ｖδ１抗体に結合するγδ細胞であった。ＡＤＣＣ作用メカニズムが存在する場合、抗ｖδ１抗体は、アッセイエフェクター細胞上のＦｃγ受容体と結合し、発光シグナルを生成する。シグナルが生成されなければ、これはＡＤＣＣが発生していないことを示唆する。

【0559】

このアッセイには、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイバッファーのボトル１本を解凍し、基質ボトルに移した。この混合物を４～６時間室温に保った。次の抗体：本発明の抗ｖδ１抗体、同じ抗ｖδ１抗体だがＦｃ無効型（Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ）、リツキシマブ、ＲＳＶ及びＯＫＴ３について、１０ｎＭ～０．０１ｎＭ（最終濃度）の範囲の抗体濃度（３Ｘ濃度）で希釈プレートを調製した。標的細胞（γδ細胞）をウェル当たり２５μｌで２つのアッセイプレートに播種した。次いで、抗体希釈プレートから適切な抗体溶液２５μｌを適切なウェルに移した。エフェクター細胞（工学操作されたＪｕｒｋａｔ細胞）を温かいアッセイバッファーに解凍し、４ｍｌのアッセイバッファーに再懸濁し、２５μｌのエフェクター細胞溶液を各ウェルにピペットで入れた。次いで、プレートを３７℃で４．５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを室温まで平衡化させ、その後、７５μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ試薬を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏｔｅｋ Ｈ４プレートリーダーを使用してプレートを読み取り、プレートから発光シグナル（相対光単位ＲＬＵとして）を収集した。誘導倍率は、次の等式を使用して計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ（誘導－バックグラウンド）／ＲＬＵ（無抗体対照－バックグラウンド）。

【0560】

陽性対照として、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）を使用した。追加の陽性対照として、対照ウェルにはγδ細胞の代わりにＲａｊｉ細胞を播種した。Ｒａｊｉ細胞は、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブと併用すると強力なＡＤＣＣ反応を示すように使用される一般的に許容されている細胞株である。内部対照として、かつ抗ｖδ１抗体がγδ細胞におけるｖδ１結合の非存在下でＡＤＣＣを駆動するかどうかを理解するために、本発明の抗ｖδ１抗体と、同じ抗ｖδ１抗体だがＦｃ無効型（Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ）とを、エフェクター細胞単独と共に加えた。

【0561】

結果を図３７に示す。

【0562】

結論：Ｒａｊｉ細胞と共にリツキシマブを使用した陽性対照では強力なＡＤＣＣ反応が示され、γδ細胞に対するＯＫＴ３ではさらに強力なＡＤＣＣ反応が示された。対照的に、本発明の抗ｖδ１抗体、同じ抗ｖδ１抗体だがＦｃ無効型でもあるＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、またはＲＳＶ陰性対照を使用したいずれの条件でもＡＤＣＣ反応は検出されなかった。これは、この系において、ｖδ１に結合する本発明の抗体（抗ｖδ１ ｍＡｂまたは抗ｖδ１多特異性抗体など）が、ＡＤＣＣ作用メカニズムの証拠を示さないことを実証する。注目すべきことに、Ｆｃ有効型抗Ｖδ１抗体でさえγδＴ細胞を枯渇させず、そのため、例えば高Ｆｃγ腫瘍環境において、本明細書で提示される抗Ｖδ１抗体のＦｃ機能を維持し、機能性を付加するオプションが提供される。これは、かかる抗Ｖδ１抗体が本明細書に記載されるような二重特異性抗体フォーマットに含まれる適性をさらに明らかにしている。

【0563】

好適には、単特異性フォーマットで提供される場合の抗体の機能特性は、さらに第２の抗原に特異的に結合する本発明の多特異性抗体によって共有される。

【0564】

実施形態
本発明は、少なくとも以下の番号付けされた実施形態を含む。

【0565】

１．
ａ． γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである第１の標的エピトープ、及び
ｂ． 第２の標的エピトープ
と特異的に結合する、多特異性抗体またはその断片。

【0566】

２．
前記多特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態１に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0567】

３．
前記第２の標的エピトープが、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の前記可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープではない、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0568】

４．
前記第２の標的エピトープが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープではない、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0569】

５．
前記第１の標的エピトープが、γδＴＣＲのＶδ１鎖のＶ領域内のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0570】

６．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１及び／または配列番号１２８のアミノ酸残基１～９０内のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0571】

７．
前記第１の標的エピトープが、
（ｉ）配列番号１の３～２０、及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７
のアミノ酸領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0572】

８．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基３、５、９、１０、１２、１６、１７、２０、３７、４２、５０、５３、５９、６２、６４、６８、６９、７２または７７のうちの少なくとも１つを含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0573】

９．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0574】

１０．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つまたは複数のアミノ酸残基からなる、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0575】

１１．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び６２～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0576】

１２．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域５０～６４内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0577】

１３．
前記第１の標的エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３及び５９～７７内の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0578】

１４．
前記第１の標的エピトープが、γδＴＣＲのＶδ１鎖のＣＤＲ３に見出されるエピトープではない、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0579】

１５．
前記第１の標的エピトープが、配列番号２７２のアミノ酸領域９１～１０５（ＣＤＲ３）内のエピトープではない、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0580】

１６．
前記第１の標的エピトープが、γδＴ細胞の活性化エピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0581】

１７．
前記活性化エピトープの結合が、（ｉ）前記γδＴＣＲを下方制御する、（ｉｉ）前記γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する、及び／または（ｉｉｉ）γδＴ細胞媒介性殺傷を促進する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその抗原結合性断片。

【0582】

１８．
前記第１の標的エピトープが、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、ＣＤ６９及び／またはＫｉ６７の発現を上方制御するエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0583】

１９．
前記多特異性抗体またはその断片が、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に１．５×１０^－７Ｍ未満の結合親和性（ＫＤ）で前記第１のエピトープと結合する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0584】

２０．
前記多特異性抗体またはその断片が、１．３×１０^－７Ｍ未満またはそれ以下、例えば１．０×１０^－７Ｍ未満、特に５．０×１０^－８Ｍ未満のＫＤで前記第１のエピトープと結合する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0585】

２１．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴＣＲの下方制御について０．５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0586】

２２．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴＣＲの下方制御について０．０６μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0587】

２３．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴ細胞の脱顆粒について０．０５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0588】

２４．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴ細胞の脱顆粒について０．００５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．００２μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0589】

２５．
前記γδＴ細胞の脱顆粒のＥＣ５０値が、ＣＤ１０７ａ発現を検出することによって測定される、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0590】

２６．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴ細胞媒介性殺傷について０．５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0591】

２７．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴ細胞媒介性殺傷について０．０５５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０２０μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0592】

２８．
前記多特異性抗体またはその断片が、結合時のγδＴＣＲの下方制御について０．５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値、結合時のγδＴ細胞の脱顆粒について０．０５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値、及び／または結合時のγδＴ細胞媒介性殺傷について０．５μｇ／ｍｌ未満であるＥＣ５０値を有する、いずれかの先行実施形態のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0593】

２９．
前記ＥＣ５０値がフローサイトメトリーを使用して測定される、実施形態２１～２８のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0594】

３０．
前記第２のエピトープが細胞表面タンパク質である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0595】

３１．
前記第２のエピトープがＶδ１＋Ｔ細胞上にある、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0596】

３２．
前記第２のエピトープがＶδ１＋Ｔ細胞上にはない、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0597】

３３．
前記第２のエピトープが免疫細胞上にある、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0598】

３４．
前記第２のエピトープが、がん抗原またはがん関連抗原のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0599】

３５．
前記がん抗原またはがん関連抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施形態３４に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0600】

３６．
前記がん抗原またはがん関連抗原が、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、アルファ－フェトプロテイン、アンドロゲン受容体、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＡＡ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ベータカテニン、ベータＨＣＧ、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＢＯＲＩＳ、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３、ＣＡ １９５、ＣＡ １９－９、ＣＡ ２４２、ＣＡ ２７．２９、ＣＡ ７２－４、ＣＡ－５０、ＣＡＭ １７．１、ＣＡＭ４３、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、癌胎児抗原、ＣＤ２２、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＯ－０２９、ＣＳＰＧ４、サイクリンＢ１、シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＣＹＰ１Ｂ１、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、エフリンＢ２、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、ＦＧＦ－５、Ｆｏｓ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、ＧｌｏｂｏＨ、糖脂質Ｆ７７、ＧＭ３、ＧＰ １００、ＧＰ １００（Ｐｍｅｌ １７）、Ｈ４－ＲＥＴ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＨＴｇｐ－１７５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、イディオタイプ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、ＬＡＧＥ－１ａ、ＬＣＫ、レクチン反応性ＡＦＰ、レグマイン、ＬＭＰ２、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ、Ｍ－ＣＳＦ、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、メソテリン、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、Ｍｕｍ－１、ｈｓｐ７０－２、ＭＹＣＮ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＮＡ１７、ＮＢ／７０Ｋ、ニューロングリア抗原２（ＮＧ２）、好中球エラスターゼ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＮｕＭａ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＣＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、Ｐａｇｅ４、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＬＡＣ１、ポリシアル酸、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、Ｒａｓ、Ｒａｓ－突然変異体、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、ＳＡＲＴ３、ＳＤＣＣＡＧ１６、ｓＬｅ（ａ）、精子タンパク質１７、ＳＳＸ２、ＳＴｎ、サバイビン、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ－７２、テロメラーゼ、チログロブリン、Ｔｉｅ ２、ＴＬＰ、Ｔｎ、ＴＰＳ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２、ＴＳＰ－１８０、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＩＳＴＡ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ １、４３－９Ｆ、５Ｔ４、及び７９１Ｔｇｐ７２からなる群から選択される、実施形態３５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0601】

３７．
前記多特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャー二重特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0602】

３８．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２（ＣＤ３４０）、ＥＧＦＲ、ＦＡＰαまたはメソテリン（ＭＳＬＮ）のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0603】

３９．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＣＤ１９のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0604】

４０．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、Ｈｅｒ２（ＣＤ３４０）のエピトープである、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0605】

４１．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＥＧＦＲのエピトープである、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0606】

４２．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＦＡＰαのエピトープである、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0607】

４３．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、メソテリン（ＭＳＬＮ）のエピトープである、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0608】

４４．
前記第２のエピトープが、免疫調節性抗原のエピトープである、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0609】

４５．
前記免疫調節性抗原が、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－ＤＣ（ＣＤ２７３）、Ｂ７－Ｈ１（ＣＤ２７４）、Ｂ７－Ｈ２（ＣＤ２７５）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ５４、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＸＣＬ９、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、及びＴＩＭ－３（ＣＤ３６６）からなる群から選択され得る、実施形態４４に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0610】

４６．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、刺激性免疫チェックポイント分子である、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0611】

４７．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、阻害性免疫チェックポイント分子である、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0612】

４８．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＰＤ－１、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０またはＴＩＧＩＴのエピトープである、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0613】

４９．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＰＤ－１のエピトープである、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0614】

５０．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のエピトープである、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0615】

５１．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＯＸ４０のエピトープである、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0616】

５２．
前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記第２のエピトープが、ＴＩＧＩＴのエピトープである、実施形態４４または４５に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0617】

５３．
前記第２の標的エピトープが、細胞膜分化ＣＤ抗原のエピトープである、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0618】

５４．
前記ＣＤ抗原が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｂ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｍ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０Ａ、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５８Ａ、ＣＤ１５８Ｂ１、ＣＤ１５８Ｂ２、ＣＤ１５８Ｃ、ＣＤ１５８Ｄ、ＣＤ１５８Ｅ１、ＣＤ１５８Ｅ２、ＣＤ１５８Ｆ１、ＣＤ１５８Ｆ２、ＣＤ１５８Ｇ、ＣＤ１５８Ｈ、ＣＤ１５８Ｉ、ＣＤ１５８Ｊ、ＣＤ１５８Ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３０、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、及びＣＤ３７１からなる群から選択される、実施形態５３に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0619】

５５．
前記多特異性抗体またはその断片が、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）、ノブ・イン・ホール（共通軽鎖）、電荷ペア、Ｆａｂ－アーム交換、ＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλボディ、直交性Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）、ナノボディ、Ｎａｎｏｂｙ－ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、ダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、ドック・アンド・ロック、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡボディ、ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ、タンデムｓｃＦｖ－毒素、ＩｇＧ－ＩｇＧ、ｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、デュオボディ、ｍａｂ^２及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２からなる群から選択される多特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0620】

５６．
前記多特異性抗体またはその断片が、ヒト抗体またはその抗原結合性断片である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0621】

５７．
前記多特異性抗体またはその断片抗体が、二重特異性抗体コンジュゲート（例えばＩｇＧ２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＫｉＨ二重特異性抗体、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット二重特異性抗体（ＩｇＧ－ＨＣ－ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、または完全長二重特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0622】

５８．
前記多特異性抗体が、約７０ＫＤａよりも大きい、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0623】

５９．
前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＹの多特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0624】

６０．
前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＩｇＧ多特異性抗体であり、例えば、前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＩｇＧ１多特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0625】

６１．
前記多特異性抗体またはその抗原結合性断片が、モノクローナル多特異性抗体である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0626】

６２．
前記多特異性抗体が、Ｆｃ有効型である、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0627】

６３．
前記多特異性抗体が、
ａ． Ｖδ１ Ｔ細胞上のＴＣＲの下方制御を引き起こすこと、
ｂ． ＣＤＣまたはＡＤＣＣを示さないこと、及び
ｃ． Ｖδ１ Ｔ細胞を枯渇させないこと
を特徴とする、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0628】

６４．
前記多特異性抗体が、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを介して、生存可能なＶδ１ Ｔ＋細胞集団の約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満の枯渇を引き起こす、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0629】

６５．
前記多特異性抗体が、ＩＬ－１７Ａの分泌を誘導しない、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0630】

６６．
前記多特異性抗体が、同等のＣＤ３多特異性抗体によって誘導されるＩＬ－１７Ａ分泌の約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満を誘導する、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0631】

６７．
配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２６～３７及び配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または
配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１
のうちの１つまたは複数を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0632】

６８．
配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＨＣＤＲ３、
配列番号２６～３７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＨＣＤＲ２、
配列番号３８～４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号１６０～１７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＬＣＤＲ２、及び／または
配列番号５０～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＬＣＤＲ１
を含む、実施形態６７に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0633】

６９．
配列番号２～１３のいずれか１つの配列を含むＨＣＤＲ３、
配列番号２６～３７のいずれか１つの配列を含むＨＣＤＲ２、
配列番号３８～４９のいずれか１つの配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１４～２５のいずれか１つの配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号１６０～１７１のいずれか１つの配列を含むＬＣＤＲ２、及び／または
配列番号５０～６１のいずれか１つの配列を含むＬＣＤＲ１
を含む、実施形態６７に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0634】

７０．
配列番号６２～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0635】

７１．
配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0636】

７２．
配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0637】

７３．
配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0638】

７４．
配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態に記載の多特異性抗体またはその断片。

【0639】

７５．
配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0640】

７６．
配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0641】

７７．
前記多特異性抗体が、配列番号６２～７３のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0642】

７８．
前記多特異性抗体が、配列番号６２～７３のいずれかに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれかに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0643】

７９．
前記多特異性抗体が、配列番号６２～７３のいずれかのアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれかのアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載の多特異性抗体またはその断片。

【0644】

８０．
先行実施形態のいずれかにおいて定義されたような前記多特異性抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列。

【0645】

８１．
実施形態８０において定義されたような前記ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。

【0646】

８２．
実施形態８０において定義されたような前記ポリヌクレオチド配列または実施形態８１において定義されたような前記発現ベクターを含む宿主細胞。

【0647】

８３．
前記宿主細胞が組換え宿主細胞である、実施形態８２に記載の宿主細胞。

【0648】

８４．
前記第１のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、前記第２のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む、実施形態８２または実施形態８３に記載の宿主細胞。

【0649】

８５．
前記第１のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクターと、前記第２のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターとを含む、実施形態８２または実施形態８３に記載の宿主細胞。

【0650】

８６．
前記第１のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、前記第２のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む、実施形態８２または実施形態８３に記載の宿主細胞。

【0651】

８７．
実施形態８２～８６のいずれか１つに記載の宿主細胞を細胞培養培地中で培養することを含む、実施形態１～７９のいずれか１つに記載のいずれかの多特異性抗体またはその断片を産生する方法。

【0652】

８８．
前記多特異性抗体またはその断片を前記培養培地から単離することを更に含む、実施形態８７に記載の方法。

【0653】

８９．
先行実施形態のいずれかに記載の組換え多特異性抗体を生成する方法であって、
ａ． 第１の標的エピトープと特異的に結合する第１の単特異性抗体を選択するステップであって、前記第１の標的エピトープが、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープである、前記選択するステップと、
ｂ． 前記第１の抗体の前記抗体またはその抗原結合性断片を、第２のエピトープをターゲティングする結合ドメインを含む抗体またはその断片と組み合わせて、前記組換え多特異性抗体を生成するステップと
を含む前記方法。

【0654】

９０．
前記第１の単特異性抗体が、実施形態５～１８のいずれか１つにおいて定義されたようなエピトープと結合する、実施形態８９に記載の方法。

【0655】

９１．
前記第１の単特異性抗体が、実施形態１９～２０のいずれか１つにおいて定義されたようなＫＤでＴＲＤＶ１に結合する、及び／または前記第１の単特異性抗体が、実施形態２１～２９のいずれか１つにおいて定義されたようなＥＣ５０を有する、実施形態８９または実施形態９０に記載の方法。

【0656】

９２．
前記第１の単特異性抗体が、請求項６７～７９のいずれか１項において定義されたような配列を含む、実施形態８９～９１のいずれか１つに記載の方法。

【0657】

９３．
第２のエピトープをターゲティングする結合ドメインを含む前記抗体またはその断片が、実施形態３４～５５のいずれか１つにおいて定義されたようなエピトープをターゲティングする、実施形態８９～９１のいずれか１つに記載の方法。

【0658】

９４．
前記組換え多特異性抗体が、請求項１～７９のいずれか１項において定義されたような多特異性抗体である、実施形態８９に記載の方法。

【0659】

９５．
前記組換え多特異性抗体が、前記第２のエピトープを発現する疾患細胞に対して、同等量の前記第１の単特異性抗体によって付与される細胞傷害性と比較して増加したガンマデルタＴ細胞媒介性細胞傷害性を付与する、実施形態８９～９４のいずれか１つに記載の方法。

【0660】

９６．
実施形態８９～９５のいずれか１つに記載の方法に従って調製された、または調製可能である、多特異性抗体またはその断片。

【0661】

９７．
実施形態１～７９または９６のいずれか１つにおいて定義されたような前記多特異性抗体またはその断片を含む組成物。

【0662】

９８．
実施形態１～７９または９６のいずれか１つにおいて定義されたような前記多特異性抗体またはその断片と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む、医薬組成物。

【0663】

９９．
実施形態１～７９もしくは９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体もしくはその断片または実施形態９８に記載の医薬組成物を含むキット。

【0664】

１００．
追加の治療活性剤を更に含む、実施形態９９に記載のキット。

【0665】

１０１．
使用説明書を更に含む、実施形態９９または実施形態１００に記載のキット。

【0666】

１０２．
対象の疾患または障害を処置する方法であって、前記対象に、実施形態１～７９もしくは９６１のいずれか１つに記載の多特異性抗体もしくはその断片、または実施形態９８に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。

【0667】

１０３．
前記疾患または障害が、がん、感染性疾患または炎症性疾患である、実施形態１０２に記載の方法。

【0668】

１０４．
同時にまたは任意の順序で連続的に、第２の薬剤を前記対象に投与することを更に含む、実施形態１０２～１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0669】

１０５．
対象の免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、実施形態１～７９もしくは９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体もしくはその断片、または実施形態９８に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。

【0670】

１０６．
前記対象が、がん、感染性疾患または炎症性疾患を有する、実施形態１０５に記載の方法。

【0671】

１０７．
対象の免疫応答を調節することが、γδＴ細胞を活性化すること、γδＴ細胞の増殖を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の増大を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の脱顆粒を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞殺傷活性を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞傷害性を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の動員を引き起こすまたは増加させること、γδＴ細胞の生存を増加させること、及びγδＴ細胞の消耗に対する抵抗性を増加させることからなる群から選択される少なくとも１つを含む、実施形態１０５または実施形態１０６に記載の方法。

【0672】

１０８．
疾患細胞は殺傷され、健康細胞は温存される、実施形態１０２～１０７のいずれか１つに記載の方法。

【0673】

１０９．
医薬に使用するための、実施形態１～７９もしくは９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体もしくはその断片、または実施形態９８に記載の医薬組成物、または実施形態９９～１０１のいずれか１つに記載のキット。

【0674】

１１０．
がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置に使用するための、実施形態１～７９～９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体もしくはその断片、または実施形態９８に記載の医薬組成物、または実施形態９９～１０１のいずれか１つに記載のキット。

【0675】

１１１．
薬物の製造における、実施形態１～７９または９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片の使用。

【0676】

１１２．
がん、感染性疾患または炎症性疾患の処置のための薬物の製造における、実施形態１～７９または９６のいずれか１つに記載の多特異性抗体またはその断片の使用。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図22F】

【図22G】

【図22H】

【図22I】

【図22J】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図25E】

【図25F】

【図25G】

【図25H】

【図25I】

【図25J】

【図25K】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図26G】

【図26H】

【図26I】

【図26J】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図28E】

【図28F】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図29E】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図31E】

【図31F】

【図31G】

【図31H】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図32D】

【図32E】

【図32F】

【図32G】

【図32H】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図33E】

【図33F】

【図33G】

【図34A】

【図34B】

【図34C】

【図34D】

【図34E】

【図34F】

【図34G】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【図35E】

【図35F】

【図35G】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図36E】

【図36F】

【図36G】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図38D】

【図38E】

【図38F】

【図38G】

【図38H】

【図38I】

【配列表】

2023537534000001.app

【国際調査報告】