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特表2023-537565タンパク質を発現するように改変されたレンチウイルスベクターの調製物から遊離第ＶＩＩＩ因子を除去する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-04
(54)【発明の名称】タンパク質を発現するように改変されたレンチウイルスベクターの調製物から遊離第ＶＩＩＩ因子を除去する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20230828BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230828BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230828BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230828BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230828BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20230828BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230828BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20230828BHJP
C07K 14/745 20060101ALN20230828BHJP
A61K 38/36 20060101ALN20230828BHJP
A61K 38/37 20060101ALN20230828BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
A61K48/00
A61K9/10
A61K47/02
A61K47/26
A61K47/22
A61P43/00 111
A61K35/76
A61P7/04
C12N5/10
C12P21/02 C
C07K14/745
A61K38/36
A61K38/37
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022579993
(86)(22)【出願日】2021-06-24
(85)【翻訳文提出日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 US2021038871
(87)【国際公開番号】W WO2021262963
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/043,697
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/062,120
(32)【優先日】2020-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512147244
【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】511262290
【氏名又は名称】フォンダツィオーネ テレトン イーティーエス
(71)【出願人】
【識別番号】514194370
【氏名又は名称】オスペダーレ サン ラファエレ エス．アール．エル
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】アイマン・イズメール
(72)【発明者】
【氏名】トンヤオ・リウ
(72)【発明者】
【氏名】ムケッシュ・ミヤニ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA22
4C076DD23
4C076DD23D
4C076DD26
4C076DD26Z
4C076DD60
4C076DD60Z
4C076DD67
4C076DD67D
4C076FF11
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA22
4C084CA18
4C084DC10
4C084DC15
4C084MA23
4C084NA20
4C084ZA531
4C084ZA532
4C084ZC021
4C084ZC022
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087NA20
4C087ZC02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA66
4H045EA24
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ウイルスベクター作製プロセスおよび宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法が本明細書において提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、該導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および
（ｉｉ）該クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中の該ウイルスベクターを回収し、それにより、該ウイルスベクターを該導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程
を含む、前記方法。
【請求項2】
（ｉｉｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、該ウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）該ウイルスベクターを該第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程
をさらに含み、
工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から回収されたウイルスベクターを、該ウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）該ウイルスベクターを該第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｉ）および（ｉｉ）は、複数回繰り返される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
工程（ｉ）は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
薬剤はＣａＣｌ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（ｖ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物の塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
工程（ｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が工程（ｉ）の前に実行される場合、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）と（ｉ）の間に実行される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
塩はＮａＣｌである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
標的塩濃度は、約０．２Ｍ～約０．６Ｍである、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
標的塩濃度は約０．４Ｍである、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
標的塩濃度は、約２００ｍＭのＮａＣｌ～約６００ｍＭのＮａＣｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
工程（ｉ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液またはリン酸緩衝液を含むローディング緩衝液中における、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、第１のクロマトグラフィーマトリックスにロードすることによって実行される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
工程（ｉｖ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液またはリン酸緩衝液を含む溶出緩衝液によってウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させることによって実行される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
（ｖｉ）ウイルスベクターを含む医薬組成物を作製するために、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクターを、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程をさらに含み、
該医薬組成物は、該導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない、
請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
工程（ｖｉ）は、製剤化緩衝液による、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクターの限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ＵＦ／ＤＦ工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
製剤化緩衝液は、ＮａＣｌとスクロースとを含むリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
医薬組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在する導入遺伝子タンパク質夾雑物の２０％未満を含有する、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ウイルスベクターは、エンベロープウイルスベクターである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法
【請求項22】
エンベロープウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ウイルスベクターは、導入遺伝子タンパク質夾雑物をコードする、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
導入遺伝子タンパク質夾雑物は、移入プラスミドからの発現によって宿主細胞において産生される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
第１のクロマトグラフィーマトリックスは、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
第１のクロマトグラフィーマトリックスは、導入遺伝子タンパク質夾雑物に特異的に結合する親和性リガンドを含む親和性クロマトグラフィーカラムである、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーマトリックスである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）膜である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
導入遺伝子タンパク質は、凝固因子である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩＸＴＥＮである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
親和性クロマトグラフィーマトリックスは、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物は、宿主細胞を培養し、細胞培養上清を該宿主細胞から分離して清澄化することによって生成された細胞培養上清である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
細胞培養上清は、ヌクレアーゼ処理に供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
宿主細胞からレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を精製する方法であって、該レンチウイルスベクターはＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含み、該方法は：（ｉ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、該ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および
（ｉｉ）該クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中の該レンチウイルスベクターを回収し、それにより、該レンチウイルスベクターをＦＶＩＩＩタンパク質夾雑物から分離する工程
を含む、前記方法。
【請求項37】
（ｉｉｉ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、該レンチウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）該レンチウイルスベクターを該第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程
を含み、
工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、工程（ｉ）の前に実行され、それにより、該レンチウイルスベクターを宿主細胞夾雑物から分離する、
請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から回収されたレンチウイルスベクターを、該レンチウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）該レンチウイルスベクターを該第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
工程（ｉ）および（ｉｉ）は、複数回繰り返される、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
工程（ｉ）は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われる、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
薬剤はＣａＣｌ２である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
（ｖ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物の塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程をさらに含む、請求項３６～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
工程（ｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が工程（ｉ）の前に実行される場合、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）と（ｉ）の間に実行される、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項45】
塩はＮａＣｌである、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
標的塩濃度は、約０．２Ｍ～約０．６Ｍである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
標的塩濃度は約０．４Ｍである、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
（ｖｉ）レンチウイルスを含む医薬組成物を作製するために、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたレンチウイルスベクターを１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程をさらに含み、
該医薬組成物は、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない、
請求項３６～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
工程（ｖｉ）は、製剤化緩衝液による、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたレンチウイルスベクターの限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって実行される、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
製剤化緩衝液は、ＮａＣｌとスクロースとを含むリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
ＵＦ／ＤＦ工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項52】
医薬組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在するＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物の２０％未満を含有する、請求項３６～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
第１のクロマトグラフィーマトリックスは、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムからなる群から選択される、請求項３６～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
第１のクロマトグラフィーマトリックスは、組換えＦＶＩＩＩタンパク質に特異的に結合する親和性リガンドを含む親和性クロマトグラフィーカラムである、請求項３６～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
親和性リガンドはＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、Ｂ－ドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項３６～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項３６～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ分子である、請求項３６～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーマトリックスである、請求項３６～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）膜である、請求項３６～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である、請求項３６～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
ウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物は、宿主細胞を培養し、細胞培養上清を該宿主細胞から分離して清澄化することによって生成された細胞培養上清である、請求項３６～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
細胞培養上清は、ヌクレアーゼ処理に供される、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法によって作製されたウイルスベクターを含む組成物。
【請求項67】
ウイルスベクターと１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤とを含む医薬組成物であり、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない、請求項６６に記載の組成物。
【請求項68】
導入遺伝子タンパク質は、凝固因子である、請求項６６または６７に記載の組成物。
【請求項69】
凝固因子は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＩＸである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項70】
凝固因子は、Ｂ－ドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項71】
凝固因子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項72】
凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ分子である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項73】
ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項74】
第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在する導入遺伝子タンパク質の２０％未満を含有する、請求項６６～７３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮出願第６３／０４３／６９７号および２０２０年８月６日に出願された米国仮出願第６３／０６２，１２０号に対する優先権の利益を主張するものである。先述の仮出願の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮出願第６３／０４３／６９７号および２０２０年８月６日に出願された米国仮出願第６３／０６２，１２０号に対する優先権の利益を主張するものである。先述の仮出願の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
レンチウイルスベクター（ＬＶ）および他のウイルスベクターは、遺伝子療法のための魅力的なツールである（非特許文献１）。ＬＶは、肝細胞、ニューロンおよび造血幹細胞などの非分裂細胞を含む広範な組織に形質導入を行うことができる。さらに、ＬＶは標的細胞ゲノムへの組み込みを行い、長期的な導入遺伝子発現をもたらすことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｔｈｏｍａｓら、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
遺伝子療法のためのウイルスベクターに対する絶えず増加する需要を考慮すると、改良された精製方法が非常に望まれているであろう。本明細書において、本発明者らは、対象への全身投与に適するウイルスベクター組成物を作製するための改良された方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、遺伝子療法用途のためのエンベロープウイルスベクターの精製に関する。本開示は、少なくとも一部において、従来の精製プロセスの間に望ましくない導入遺伝子タンパク質夾雑物をウイルスベクターと同時精製することができるという発見に基づいている。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、生物学的生産の際に生成されるプロモーター媒介性転写産物に起因する、導入遺伝子活性の副生成物または分泌されたタンパク質である（例えば、ウイルスベクターがコードする導入遺伝子タンパク質夾雑物）。例えば、レンチウイルスベクターのパッケージングは、宿主細胞への２つまたはそれ以上のプラスミドのトランスフェクションを必要とする。一部の実施形態では、プラスミドは、以下：（１）エンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＢ－Ｇ）をコードするエンベローププラスミド；（２）目的の導入遺伝子をコードする移入プラスミド；および（３）１つまたはそれ以上のパッケージングプラスミド（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌをコードするプラスミドならびにｒｅｖをコードするプラスミド、あるいはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖをコードするプラスミド）を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、移入プラスミドのプロモーター媒介性転写産物である。ある特定の実施形態では、移入プラスミドのプロモーター媒介性転写産物は、宿主細胞（例えば、宿主パッケージング細胞）によって産生される。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、ウイルスベクター産物試料中に存在し、検出可能な量において存在し得る。
【0006】
ウイルスベクター医薬製品中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の存在は、結果として、治療的処置に使用される場合、１つまたはそれ以上の副作用を生じ得る。これは、ウイルスベクター医薬製品が全身投与される遺伝子療法アプローチにおいて特に重要である。ウイルスベクターの全身投与は、典型的には、患者内での細胞の効率的な形質導入を達成するために、高いウイルスベクター用量を必要とする。導入遺伝子タンパク質夾雑物が十分に減少されないおよび／または排除されない場合、夾雑タンパク質が患者に同時投与され、身体の形質導入された細胞内でのそのタンパク質のウイルスベクター媒介性産生に悪影響を及ぼし得る。したがって、本発明は、ウイルスベクター原体が導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まないように、これらの導入遺伝子タンパク質夾雑物を除去する方法を提供する。
【0007】
一態様では、本発明は、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｉ）クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程を含む方法を提供する。
【0008】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、ウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）ウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される。
【0009】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から回収されたウイルスベクターを、ウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）ウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程をさらに含む。
【0010】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）および（ｉｉ）は、複数回繰り返される。
【0011】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われる。ある特定の例示的な実施形態では、薬剤はＣａＣｌ２である。
【0012】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｖ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物の塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程をさらに含む。
【0013】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される。
【0014】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が工程（ｉ）の前に実行される場合、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）と（ｉ）の間に実行される。
【0015】
ある特定の例示的な実施形態では、塩はＮａＣｌである。
【0016】
ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は、約０．２Ｍ～約０．６Ｍである。ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は約０．４Ｍである。ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は、約２００ｍＭのＮａＣｌ～約６００ｍＭのＮａＣｌである。
【0017】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含むローディング緩衝液中における、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、第１のクロマトグラフィーマトリックスにロードすることによって実行される。ある特定の実施形態では、ローディング緩衝液は、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0018】
他の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてリン酸緩衝液を含むローディング緩衝液中における、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、第１のクロマトグラフィーマトリックスにロードすることによって実行される。ある特定の実施形態では、ローディング緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0019】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉｖ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含む溶出緩衝液によってウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させることによって実行される。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0020】
他の例示的な実施形態では、工程（ｉｖ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてリン酸緩衝液を含む溶出緩衝液によってウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させることによって実行される。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0021】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｖｉ）ウイルスベクターを含む医薬組成物を作製するために、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクターを、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程をさらに含み、ここで医薬組成物は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない。
【0022】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｖｉ）は、製剤化緩衝液による、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクターの限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって実行される。ある特定の例示的な実施形態では、ＵＦ／ＤＦ工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を含む。
【0023】
ある特定の例示的な実施形態では、製剤化緩衝液は、ＮａＣｌとスクロースとを含むリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。
【0024】
ある特定の例示的な実施形態では、医薬組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在する導入遺伝子タンパク質夾雑物の２０％未満を含有する。
【0025】
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスベクターは、エンベロープウイルスベクターである。ある特定の例示的な実施形態では、エンベロープウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0026】
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子タンパク質夾雑物をコードする。ある特定の例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、移入プラスミドからの発現によって宿主細胞において産生される。
【0027】
ある特定の例示的な実施形態では、第１のクロマトグラフィーマトリックスは、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムからなる群から選択される。
【0028】
ある特定の例示的な実施形態では、第１のクロマトグラフィーマトリックスは、導入遺伝子タンパク質夾雑物に特異的に結合する親和性リガンドを含む親和性クロマトグラフィーカラムである。
【0029】
ある特定の例示的な実施形態では、第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーマトリックスである。ある特定の例示的な実施形態では、第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）膜である。
【0030】
ある特定の例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的な実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩＸＴＥＮである。
【0031】
ある特定の例示的な実施形態では、第１のクロマトグラフィーマトリックスは、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィーマトリックスである。
【0032】
ある特定の例示的な実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。ある特定の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞である。
【0033】
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物は、宿主細胞を培養し、細胞培養上清を宿主細胞から分離して清澄化することによって生成された細胞培養上清である。
【0034】
ある特定の例示的な実施形態では、細胞培養上清は、ヌクレアーゼ処理に供される。
【0035】
別の態様では、本発明は、宿主細胞からレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を精製する方法であって、レンチウイルスベクターはＦＶＩＩＩ導入遺伝子を含み、（ｉ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｉ）クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のレンチウイルスベクターを回収し、それにより、レンチウイルスベクターをＦＶＩＩＩタンパク質夾雑物から分離する工程を含む方法を提供する。
【0036】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、レンチウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）レンチウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程をさらに含み、ここで工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、工程（ｉ）の前に実行され、それにより、レンチウイルスベクターを宿主細胞夾雑物から分離する。
【0037】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から回収されたレンチウイルスベクターをレンチウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程、および（ｉｖ）レンチウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させる工程をさらに含む。
【0038】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）および（ｉｉ）は、複数回繰り返される。
【0039】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われる。ある特定の例示的な実施形態では、薬剤はＣａＣｌ２である。
【0040】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｖ）レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物の塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程をさらに含む。
【0041】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｖ）は、工程（ｉ）の前に実行される。
【0042】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が工程（ｉ）の前に実行される場合、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）と（ｉ）の間に実行される。
【0043】
ある特定の例示的な実施形態では、塩はＮａＣｌである。
【0044】
ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は、約０．２Ｍ～約０．６Ｍである。ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は約０．４Ｍである。ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は、約２００ｍＭのＮａＣｌ～約６００ｍＭのＮａＣｌである。
【0045】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含むローディング緩衝液中における、レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、第１のクロマトグラフィーマトリックスにロードすることによって実行される。ある特定の実施形態では、ローディング緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0046】
他の例示的な実施形態では、工程（ｉ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてリン酸緩衝液を含むローディング緩衝液中における、レンチウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、第１のクロマトグラフィーマトリックスにロードすることによって実行される。ある特定の実施形態では、ローディング緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0047】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｉｖ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含む溶出緩衝液によってレンチウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させることによって実行される。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0048】
他の例示的な実施形態では、工程（ｉｖ）は、ｐＨ約７．０～約７．５においてリン酸緩衝液を含む溶出緩衝液によってレンチウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させることによって実行される。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、さらに、約２００～約６００ｍＭのＮａＣｌと、場合により約２ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む。
【0049】
ある特定の例示的な実施形態では、方法は、（ｖｉ）レンチウイルスを含む医薬組成物を作製するために、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたレンチウイルスベクターを１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程をさらに含み、ここで医薬組成物は、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない。
【0050】
ある特定の例示的な実施形態では、工程（ｖｉ）は、製剤化緩衝液による、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたレンチウイルスベクターの限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって実行される。ある特定の例示的な実施形態では、製剤化緩衝液は、ＮａＣｌとスクロースとを含むリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の例示的な実施形態では、ＵＦ／ＤＦ工程は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を含む。
【0051】
ある特定の例示的な実施形態では、医薬組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在するＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物の２０％未満を含有する。
【0052】
ある特定の例示的な実施形態では、第１のクロマトグラフィーマトリックスは、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムからなる群から選択される。
【0053】
ある特定の例示的な実施形態では、第１のクロマトグラフィーマトリックスは、組換えＦＶＩＩＩタンパク質に特異的に結合する親和性リガンドを含む親和性クロマトグラフィーカラムである。ある特定の例示的な実施形態では、親和性リガンドはＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔである。
【0054】
ある特定の例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、Ｂ－ドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＦＶＩＩＩタンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ分子である。ある特定の例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0055】
ある特定の例示的な実施形態では、第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーマトリックスである。ある特定の例示的な実施形態では、第２のクロマトグラフィーマトリックスは、アニオン交換（ＡＥＸ）膜である。
【0056】
ある特定の例示的な実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。ある特定の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＨｅＬａ細胞である。
【0057】
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスベクターとＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物は、宿主細胞を培養し、細胞培養上清を宿主細胞から分離して清澄化することによって生成された細胞培養上清である。
【0058】
ある特定の例示的な実施形態では、細胞培養上清は、ヌクレアーゼ処理に供される。
【0059】
別の態様では、本発明は、本明細書において説明される方法に従って作製されたウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【0060】
ある特定の例示的な実施形態では、組成物は、ウイルスベクターと１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤とを含む医薬組成物であり、ここで組成物は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない。
【0061】
ある特定の例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的な実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＩＸである。ある特定の例示的な実施形態では、凝固因子は、Ｂ－ドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、凝固因子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＦＶＩＩＩタンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ分子である。ある特定の例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0062】
ある特定の例示的な実施形態では、組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物中に存在する導入遺伝子タンパク質の２０％未満を含有する。ある特定の例示的な実施形態では、組成物は、第２のクロマトグラフィーマトリックスによって精製されたが第１のクロマトグラフィーマトリックスでは精製されていない参照ウイルスベクター組成物の１０％未満の総ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。例示的な一実施形態では、組成物は、約１ＩＵ以下の総ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【図1A】遺伝子療法用途のためのエンベロープウイルスベクター原体を製造するための従来のプロセスワークフローの概略図を示す図である。プロセス関連不純物および生成物関連不純物からのウイルスベクターの精製を主に担う単一のベクター捕捉精製クロマトグラフィー工程を伴う、従来の下流ワークフローを示す図である。
【図1B】遺伝子療法用途のためのエンベロープウイルスベクター原体を製造するための従来のプロセスワークフローの概略図を示す図である。一方が本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程である少なくとも２つの精製クロマトグラフィー工程を伴う、本開示の一実施形態による改良された下流ワークフローを示す図である。
【図2】図１Ａに示されるような従来の精製プロセスの各工程における、レンチウイルスベクター１Ｅ９ ＴＵあたりのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子タンパク質の活性を示すプロットである。夾雑ＦＶＩＩＩＸＴＥＮタンパク質活性は、最終原体（ＤＳ）および医薬製品（ＤＰ）など、作製プロセスの様々な段階において、一貫して存在する。
【図3】レンチウイルスベクターによってコードされるＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質からのレンチウイルスベクターの精製に対するＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィーの評価を示すプロットである。実験は、ＦＶＩＩＩ（Ｅｘｐ１）またはＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（Ｅｘｐ２）導入遺伝子タンパク質のどちらかによって行った。図３Ａは、従来の１カラムプロセス（例えば、図１Ａに示されるような）または追加の導入遺伝子タンパク質捕捉工程としてＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを含む本発明の２カラムプロセス（例えば、図１Ｂに示されるような）による精製後の産物中に残る導入遺伝子タンパク質活性のレベルを示すプロットである。図３Ｂは、１カラムプロセスと比較した２カラムプロセスの導入遺伝子タンパク質活性化のパーセント減少を示すプロットである。
【図4】本発明の２カラムプロセスにおいて塩化カルシウムを使用した結果を示すプロットである。ＣａＣｌ２の存在下（「＋ＣａＣｌ２」）または不在下（「－ＣａＣｌ２」）においてＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質を捕捉するために、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィーを用いた。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）をリン酸緩衝液において精製し（Ｅｘｐ３）、その一方で、ＦＶＩＩＩをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＦＶＩＩＩ）をヒスチジン緩衝液において精製した（Ｅｘｐ４）。
【図5】複数の導入遺伝子タンパク質捕捉工程を行った後に、ＦＶＩＩＩをコードするレンチウイルスベクター調製物（ＬＶ－ＦＶＩＩＩ）中に残る総ＦＶＩＩＩ活性を示すプロットである。ウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子タンパク質を捕捉するために、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィー樹脂を複数回通過させることによって、ウイルス試料をリサイクルした。各導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ＣａＣｌ２の存在下で実行した。ウイルスベクターＬＶ－ＦＶＩＩＩは、ヒスチジン緩衝液において精製した。
【図6】本発明の実施形態により、遺伝子療法用途のためのエンベロープウイルスベクター原体を製造するための下流プロセスワークフローの概略図を示す図である。図６Ａは、本開示の一実施形態による改良された下流ワークフローを示す図であり、ここで第２のクロマトグラフィー精製工程のためのロード試料は調整される。図６Ｂは、本開示の一実施形態による改良された下流ワークフローを示す図であり、ここで第１のクロマトグラフィー精製工程のためのロード試料は調整され、第２のクロマトグラフィー精製工程のためのロード試料も調整される。
【図7】本開示の一実施形態による改良された下流ワークフローを使用する精製の効率に対する塩濃度の影響を示すプロットである。図７Ａは、試料をＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィー樹脂に適用する前（黒色の棒）および後（灰色の棒）の全機能的ベクター回収の関数として、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性のレベルを示すプロットであり、ここでロード試料は、４００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ５）または１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ６）を含む。図７Ｂは、試料をＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィー樹脂に適用する前（黒色の棒）および後（灰色の棒）の総Ｐ２４カプシド回収の関数としての、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性のレベルを示すプロットであり、ここでロード試料は、４００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ５）または１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ６）を含む。
【図8】全機能的ベクター回収の関数としての、検出された総ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性（黒色の棒）、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性（暗灰色の棒）、および総Ｐ２４カプシド回収の関数としての検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性のレベル（薄灰色の棒）を示すプロットである。
【図9】ＡＥＸとその後のＴＲＩＳまたはリン酸緩衝液を用いたＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとを使用した２段階精製プロセスにおける、ＦＶＩＩＩをコードするウイルスベクターの精製の際の、夾雑ＦＶＩＩＩ導入遺伝子タンパク質の除去に対する様々な塩濃度（２００ｍＭ、４００ｍＭ、または６００ｍＭのＮａＣｌ）の影響を示すプロットである。ＡＥＸ溶出後かつＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製前のローディング試料において（ＴＲＩＳ緩衝液は黒色の棒；リン酸ローディング緩衝液は灰色の棒）、ならびにＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製後のフロースルー産物フラクションにおいて（ＴＲＩＳ緩衝液は黒色斜線の棒；リン酸緩衝液は灰色斜線の棒）、総夾雑物ＦＶＩＩＩ導入遺伝子活性（ＩＵ）を測定した。
【発明を実施するための形態】
【0064】
本開示は、ウイルスベクターの生物学的生産の際、最終ウイルスベクター製品が導入遺伝子タンパク質夾雑物を含み得るという知見に基づいている。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用するレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＦＶＩＩＩまたはＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）製品の製造の際、予想外なことに、プラスミド（例えば、移入プラスミド）をコードする導入遺伝子における上流ＣＭＶプロモーター活性が、結果として夾雑ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩＸＴＥＮタンパク質を生じるような導入遺伝子ｍＲＮＡ生成を媒介し得ることが見出された。精製の際、そのようなＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子タンパク質夾雑物は、意図せず、ベクター粒子との非特異的会合を介してレンチウイルスベクターと共に同時精製される可能性があり、ならびに、最終的に、意図せず、患者に同時投与される可能性ある。導入遺伝子タンパク質夾雑物を含むウイルスベクター製品の投与は、標的細胞（例えば、患者内の標的細胞）へ形質導入するウイルスベクターの効率を阻害し得、および／または同じ導入遺伝子タンパク質のウイルスベクター媒介性発現を阻害し得る。さらに、レンチウイルスベクター医薬製品（ＬＶ－ＦＶＩＩＩまたはＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）中の夾雑導入遺伝子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）の存在は、導入遺伝子タンパク質夾雑物に対する抗原（例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ））の生成および／またはＬＶ形質導入細胞に対する潜在的細胞障害性Ｔ細胞応答を結果として生じるような望ましくない免疫応答を誘導する可能性があり得る。
【0065】
したがって、ウイルスベクター製品中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の存在の問題を回避するために、本開示は、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、ウイルスベクターがコードする導入遺伝子タンパク質夾雑物の減少および／または排除を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法を用いたウイルスベクターの精製は、結果として、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まないウイルスベクター製品をもたらす。
【0066】
一般に、本明細書において細胞培養および組織培養、分子生物学、生物物理学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学に関連して使用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書中に提供される方法および手法は、別の指示がない限り、一般に、本明細書の全体にわたって引用および考察される様々な一般的およびより特定的な参考文献に記載される、当技術分野において周知の従来法に従って実施される。酵素反応および精製手法は、製造元の仕様書に従って、当技術分野において一般的に遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびにそれらの医薬品化学および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査手順および手法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用される。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療には、標準的な手法が使用される。
【0067】
本明細書で別に定義しない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中に提供される定義が、あらゆる辞書または付帯的な定義よりも優先される。文脈によって必要とされない限り、単数形の語は複数形を含み、複数形の語は単数形を含むものとする。別に明記する場合を除き、「または」の使用は、「および／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態と同様に、限定的ではない。
【0068】
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語をまず定義する。
【0069】
本明細書において使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特定の列挙される数値に関して使用される場合、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ、ｒｏｕｇｈｌｙ、ａｒｏｕｎｄ、またはｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ）を意味する。用語「約」が、数値範囲に関連して使用される場合、それは、説明された数値の上限および下限を拡張することによってその範囲を修飾する。概して、「約」という用語は、本明細書において、言明された値より１０パーセント高いまたは低い変動によって、言明された値を上回るおよび下回る数値を修飾するために使用される。例えば、本明細書に使用される場合、表現「約１００」は、９０および１１０ならびにその間の全ての値（例えば、９１、９２、９３、９４など）を包含する。ある特定の実施形態では、「約」という用語は、値が列挙された値から１％以下において変化し得ることを意味する。例えば、本明細書に使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を包含する。
【0070】
本明細書で用いる場合、「ベクター」という用語は、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞への移入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、別の核酸セグメントを結びつけて、結びついたセグメントの複製をもたらすことができるレプリコンであってよい。「ベクター」と言う用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス性ビヒクルおよび非ウイルス性ビヒクルの両方を含む。例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む多数のベクターが、当技術分野において公知であり、使用される。適するベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、相補的な付着末端を有する選択されたベクター中に、適切なポリヌクレオチド断片をライゲートすることによって実現することができる。
【0071】
本明細書において使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、核酸を細胞に導入するための任意のウイルス性ビヒクルを指す。ウイルスベクターは、任意の方式、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて、核酸を任意の細胞内に導入するために用いることができる。当業者に既知であるように、ウイルスベクターは、パッケージング細胞（例えば、パッケージング細胞系）によってパッケージされる（産生される）一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のプラスミドが、ウイルスベクターを作製するためにパッケージング細胞に導入される。一部の実施形態では、３つまたはそれ以上のプラスミドが、ウイルスベクターを作製するためにパッケージング細胞に導入される。レンチウイルスベクターの作製において、典型的には、（１）目的の導入遺伝子を含む移入プラスミド；（２）エンベロープタンパク質コード配列（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）を含むエンベローププラスミド；および（３）１つまたはそれ以上のパッケージングプラスミドが、パッケージング細胞へコトランスフェクトされる。レンチウイルスパッケージングプラスミドは、単一のプラスミド（例えば、第二世代のレンチウイルスベクター作製の場合）の、または別々のプラスミド（すなわち、１つのパッケージングプラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含み、ならびに、別のパッケージングプラスミドは、ｒｅｖ遺伝子を含む；例えば、第三世代のレンチウイルスベクター作製の場合）の、少なくともｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製において、典型的には、（１）目的の導入遺伝子を含む移入プラスミド；（２）ＡＡＶライフサイクルに必要なｒｅｐおよびｃａｐ電子を含むｒｅｐ／ｃａｐプラスミド；および（３）ＡＡＶ複製を媒介調停する遺伝子を含むヘルパープラスミドが、パッケージング細胞内へとコトランスフェクトされる。ウイルスベクターの作製におけるバリエーションは、当業者に既知である。例えば、当業者は、１つまたはそれ以上のベクターを単一ベクターへと組み合わせることができることを理解するであろう。
【0072】
本明細書で用いる場合、「組換えレンチウイルスベクター」という語句は、パッケージング構成要素の存在下で、標的細胞を感染させ得るウイルス粒子へのＲＮＡゲノム（例えば、異種ＲＮＡゲノム）のパッケージングを可能にする十分なレンチウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組み込みを含み得る。組換えレンチウイルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達されることになる非ウイルス性コード配列を保有する。組換えレンチウイルスベクターは、最終的な標的細胞内で独立に複製して感染性レンチウイルス粒子を生成することが不可能である。通常、組換えレンチウイルスベクターは、機能的なｇａｇ－ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製のために必須な他の遺伝子を欠く。
【0073】
本明細書において使用される場合、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」または「外因性」という用語は、所定の状況において、例えば、細胞またはポリペプチドにおいて通常は見出されない分子を指す。例えば、外因性または異種分子を細胞に導入することができ、ならびに、それらは、例えば、トランスフェクションなどによる細胞の操作の後にのみ存在し、あるいは、遺伝子操作されたまたは異種アミノ酸配列の他の形態は、それが天然には見出されないようなタンパク質に存在することができる。したがって、異種ＲＮＡゲノムを含む組換えレンチウイルスベクターは、レンチウイルスには天然には見出されないＲＮＡゲノムを指す。
【0074】
本明細書において使用される場合、「導入遺伝子タンパク質夾雑物」という用語は、エクスビボでの宿主細胞におけるウイルスベクターの作製の際に宿主細胞において産生される導入遺伝子タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質は、ウイルスベクターの導入遺伝子によってコードされるが、ウイルスベクター作製の際に宿主細胞において非意図的に発現される。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質産物は、宿主細胞での望ましくない導入遺伝子活性の副産物であり得る。他の実施形態では、導入遺伝子タンパク質は、プロモーター媒介性転写に起因して、宿主細胞によって分泌され得る。例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、目的の導入遺伝子を含む移入プラスミドからの偽の発現によって宿主細胞において産生され得る。
【0075】
本明細書において使用される場合、「選択的に結合することができる」という用語は、他の分子よりある特定の分子に結合する（例えば、可逆的に結合する）（例えば、特定の分子に優先的に結合する；特定の分子に対してより高い親和性を有する；他の分子と比べてより大きい程度に、または他の分子を除外して、特定の分子に結合する）能力を有することを指す。例えば、ウイルスベクターを含む組成物が、ウイルスベクターに選択的に結合することができるクロマトグラフィーマトリックスに接触した場合、クロマトグラフィーマトリックスは、組成物中に存在し得る他の分子よりも、ウイルスベクターに結合する（例えば、保持する）であろう（例えば、クロマトグラフィーマトリックスは、実質的に、組成物中に存在する他の分子と比べてより多くのウイルスベクターに結合する）。そのため、クロマトグラフィーマトリックスがウイルスベクターに選択的に結合する場合、ウイルスベクターは、クロマトグラフィーマトリックスによって保持される。
【0076】
本明細書において使用される場合、「治療する」という用語は、障害の１つまたはそれ以上の症状の改善または減少を指す。治療は、治癒であり得るが、必ずしも治癒である必要はない。
【0077】
本明細書において使用される場合、「全身投与する」という語句は、医薬製品が対象の循環系（例えば、血流）に導入されるように、医薬製品を含む医薬組成物を対象に処方することまたは与えることを指す。ある特定の実施形態では、全身投与は、ウイルスベクターが対象の循環系（例えば、血流）に導入されるように、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を含む医薬組成物を対象に処方することまたは与えることを指す。全身投与の経路の例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、中心静脈アクセス、経口投与、筋肉内投与、皮内投与、および皮下投与による、静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入が挙げられる。
【0078】
Ａ．ウイルスベクターの精製
本開示は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を減じるおよび／または排除するための、ウイルスベクター作製プロセスへの精製工程（本明細書において「導入遺伝子タンパク質捕捉工程」）の導入に基づいている。導入遺伝子タンパク質捕捉工程の導入は、ウイルスベクターを含む組成物からの、導入遺伝子タンパク質夾雑物の減少および／または排除を可能にし、これらに限定されるわけではないが、以下の臨床的有益性：（１）患者の体内の細胞を形質導入するために使用されるウイルスベクター医薬製品の効力を向上させること；（２）全身投与される遺伝子療法製品の有効性を潜在的に向上させること；（３）投与の直後にタンパク質抗原に対する潜在的免疫応答を最小化する（例えば、抗薬物抗体の潜在的発生を最小化する）結果として、インビボ遺伝子療法製品の安全性プロファイルを改善すること；（４）導入遺伝子タンパク質産物の存在に起因する任意の負の治療効果または副作用を最小化すること；ならびに（５）産物品質を改良し、産物純度を増加させることを提供し得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、移入プラスミドからの発現によって宿主細胞において産生される。
本開示は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を減じるおよび／または排除するための、ウイルスベクター作製プロセスへの精製工程（本明細書において「導入遺伝子タンパク質捕捉工程」）の導入に基づいている。導入遺伝子タンパク質捕捉工程の導入は、ウイルスベクターを含む組成物からの、導入遺伝子タンパク質夾雑物の減少および／または排除を可能にし、これらに限定されるわけではないが、以下の臨床的有益性：（１）患者の体内の細胞を形質導入するために使用されるウイルスベクター医薬製品の効力を向上させること；（２）全身投与される遺伝子療法製品の有効性を潜在的に向上させること；（３）投与の直後にタンパク質抗原に対する潜在的免疫応答を最小化する（例えば、抗薬物抗体の潜在的発生を最小化する）結果として、インビボ遺伝子療法製品の安全性プロファイルを改善すること；（４）導入遺伝子タンパク質産物の存在に起因する任意の負の治療効果または副作用を最小化すること；ならびに（５）産物品質を改良し、産物純度を増加させることを提供し得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物は、移入プラスミドからの発現によって宿主細胞において産生される。
【0079】
ある特定の態様では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｉ）クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程を含む。当業者によって理解されるであろうが、導入遺伝子捕捉工程は、同じまたは異なる導入遺伝子捕捉工程を使用して１回または複数回（２回以上、３回以上など）実行することができる。結果として得られるウイルスベクターは、次いで、任意の方式、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて、核酸を任意の細胞に導入するために利用され得る。ある特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0080】
当技術分野において既知のように、医薬製品の安全性プロファイルは、医薬製品に対する任意の望ましくない免疫原性の発生（例えば、医薬製品に対する抗薬物抗体の発生）に依存し得る。望ましくない免疫原性の発生は、医薬製品の投与経路（例えば、皮内、皮下、吸入、筋肉内、静脈内経路など）、用量、および投与の頻度によって影響を受ける。本明細書において説明される１つまたはそれ以上の導入遺伝子捕捉工程を組み込んだウイルスベクター精製の方法は、投与可能なウイルスベクター医薬製品中に存在し得る導入遺伝子タンパク質夾雑物を減少させおよび／または排除し、そのため、方法は、導入遺伝子タンパク質夾雑物に対する望ましくない免疫原性の発生を減少させおよび／または排除する。当業者は、望ましくない免疫原性の発生の減少および／または排除が生じさせることができるが、しかしながら、医薬製品（例えば、ウイルスベクター医薬製品）は、任意の投薬量および任意の投薬頻度において投与されることを理解するであろう。
【0081】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程（例えば、導入遺伝子不純物捕捉工程）は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー分離技術の使用を採用する。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーマトリックスの使用を採用する。一部の実施形態では、上記１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーマトリックスは、親和クロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる群から選択される。
【0082】
本明細書において説明される様々な実施形態では、当業者に既知の様々な緩衝液および溶液が使用される。当業者に既知の任意の適する緩衝液および溶液を使用することができる。例えば、精製工程は、いくつかの緩衝液および溶液、例えば、衛生化溶液、平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、ストリッピング緩衝液、再生緩衝液、希釈緩衝液などの使用を必要とし得る。
【0083】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、親和クロマトグラフィーを採用する。「親和性クロマトグラフィー」という用語は、タンパク質が親和性リガンド（例えば、導入遺伝子タンパク質夾雑物に特異的に結合する親和性リガンド）に可逆的および特異的に結合するタンパク質分離技術を指す。本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、他の分子に対して非常に優先的である分子との結合反応を媒介する能力を指す。
【0084】
親和性クロマトグラフィーは、成分を分離するために、分子の間の特異的結合相互作用を利用する。親和性クロマトグラフィーでは、親和性リガンドが、固体支持体、例えば、樹脂などに固定され、それにより、組成物が固体支持体を通過した場合、親和性リガンドに対して特異的結合親和性を有する分子は、樹脂によって保持されることになる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、導入遺伝子タンパク質夾雑物に特異的に結合する親和性リガンドを含む親和性クロマトグラフィーカラムを利用する。一部の実施形態では、親和性リガンドは、親和性リガンド上の特定の官能基（例えば、第一級アミン、スルフィドリル、カルボン酸、アルデヒド）と支持体上の反応基との間の共有化学結合の形成によって、固体支持体材料に直接的に固定されるかまたはカップリングされる。一部の実施形態では、親和性リガンドは、例えば、グルタチオン－ＧＳＴ親和性相互作用によってグルタチオン支持体に捕捉されたグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付け融合タンパク質による、間接的カップリングアプローチによって固定される。タンパク質の一般的にクラス（例えば、抗体）に結合する親和性リガンドまたは一般的に使用される融合タンパク質タグ（例えば、ヒスチジンタグ、またはＨｉｓタグ）は、親和性精製における使用のためにあらかじめ固定された形態において容易に利用可能である。ある特定の実施形態では、より専用化された親和性リガンド、例えば、特異抗体または目的の抗原などを固定することができる。例えば、ペプチド抗原を支持体に固定して、ペプチドを認識する抗体を精製するために使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる親和性クロマトグラフィー精製に供する工程；および、結果として得られる親和性クロマトグラフィー精製のフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法は、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる親和性クロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｉ）親和性クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程を含む。
【0085】
ウイルスベクター製品中の特定の導入遺伝子タンパク質夾雑物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）を減少させるおよび／または排除する目的のために、ある特定の実施形態では、親和性リガンドが、クロマトグラフ固相材料に供給結合によって取り付けられ、それにより、溶液がクロマトグラフ固相材料に接触するときに溶液中の夾雑タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）にアクセス可能である。導入遺伝子タンパク質夾雑物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）は、クロマトグラフ工程の際に親和性リガンドに対するその特異的結合親和性を介して保持されるが、その一方で、混合物（例えば、ウイルスベクター）中の他の溶質および／またはタンパク質は、リガンドに感知できるほどには、または特異的には結合しない。固定されたリガンドへの導入遺伝子タンパク質夾雑物の結合により、所望のウイルスベクターはクロマトグラフ媒体を通過することができるが、その一方で、夾雑タンパク質は、固相上の工程されたリガンドに特異的に結合したままとなる。それぞれの特異的結合パートナーを減少させるおよび／または排除する目的のためのリガンドとして、任意の成分を使用することができる。ある特定の実施形態では、親和性リガンドは、導入遺伝子に対して特異的結合親和性を有する抗体、抗体断片、抗体バリアント、ペプチドミメチック、またはペプチド、例えば、ＦＶＩＩＩに対して結合親和性を有する抗体、抗体断片、抗体バリアント、ペプチドミメチック、またはペプチドである。例示的な実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するリガンドは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｃｙｔｉｖａ製のＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ（商標）である。
【0086】
ある特定の実施形態では、親和性精製は、様々な緩衝液および溶液を採用する。当業者に既知の緩衝液および溶液を使用することができる。例えば、好適な衛生化緩衝液は、０．５ＭのＮａＯＨを含み得；好適な平衡化緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓまたは２０ｍＭのホスフェート、０ｍＭ～２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０～３０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭ～７０ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに、７．２のｐＨを有し；好適なストリッピング緩衝液または清澄化緩衝液は、０．５ＭのＮａＯＨ、リン酸を含む溶液、ベンジルアルコール、または酢酸を含み得、ならびに好適な再生緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有する。
【0087】
一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、クロマトグラフ基材（例えば、マトリックス、樹脂、カラム）内に導入遺伝子タンパク質夾雑物を保持することができるイオン交換クロマトグラフィー精製に供する工程を含む。本明細書において使用される場合、「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、イオン化可能な分子の総表面電荷に基づいたそれらの分子の分離を指す。ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換樹脂を採用する。「カチオン交換樹脂」、「カチオン交換吸着剤」、または「カチオン交換マトリックス」という用語は、負に帯電し、その結果として、固相上または固相中を通過する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する、固相を指す。カチオン交換樹脂を形成するために固相に取り付けられた負に帯電したリガンドは、例えば、カルボキシレートまたはスルホネートであり得る。商業的に入手可能なカチオン交換樹脂としてはカルボキシ－メチル－セルロース、アガロース上に固定されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－ＸＬ、ＳＰ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ．Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＣＡＰＴＯ－Ｓ、およびＣＡＰＴＯ－ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、またはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＳＥ ＨｉＣａｐ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＳＯ３－、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＣＯＯ－、ＥＳＨＭＵＮＯ Ｓ、およびＥＳＨＭＵＮＯ． ＣＰＸ、またはＢｉｏ－Ｒａｄ製のＵＮＯＳＰＨＥＲＥ－ ＳおよびＮＵＶＩＡ－ Ｓ）が挙げられる。
【0088】
一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、クロマトグラフ基材（例えば、マトリックス、樹脂、カラム）内に導入遺伝子タンパク質夾雑物を保持することができる疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）精製に供する工程を含む。「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」という用語は、本明細書に使用される場合、固定相（例えば、樹脂）との疎水性相互作用に基づいた成分の分離を指す。ＨＩＣの溶出順序は、成分をそれらの相対的疎水性に基づいてランク付けすることを可能にする。ＨＩＣの利点としては、例えば、非変性条件の使用、それが有機溶媒または高温の使用を必要としないこと、ならびに分離が、ウイルス精製プロセスにおいて使用される場合にウイルス構造を保存するような生理的ｐＨにおいて行われること、が挙げられる。一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用する。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、それらの表面疎水性における違いに基づいて生体分子を分離する技術である。ＨＩＣクロマトグラフ媒体は、疎水性リガンド、例えば、直鎖状炭化水素（例えば、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ヘキシル（Ｃ６）、またはオクチル（Ｃ８））または芳香族（例えば、フェニル）などを含有する。純水中では、疎水性効果は、リガンドとタンパク質の間、またはタンパク質同士の間の機能的相互作用にとって弱すぎる。しかしながら、リオトロピック塩は、疎水性相互作用を強め、ならびに塩の添加は、ＨＩＣ媒体へのタンパク質の捕捉を駆動する。この理由のため、ＨＩＣ樹脂は、通常、高塩濃度下においてロードされ、より低い塩濃度において溶出される。当業者によって理解されるように、硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］は、ホーフマイスター系列におけるアンモニウムイオンおよび硫酸イオンの両方の高いリオトロピックランク付けならびに塩の高い溶解性により、ＨＩＣクロマトグラフィーによるタンパク質の捕捉を制御するために最も一般的に使用される塩である。当業者が理解できるように、塩（例えば、硫酸アンモニウム）の濃度は、導入遺伝子タンパク質夾雑物の結合にとって最適な濃度を達成するように操作することができる。加えて、共溶媒も疎水性相互作用に影響を及ぼし得る。例えば、エチレンまたはプロピレングリコールは、タンパク質と固定されたリガンドとの間の相互作用を減少させることができ、結果として、溶出プロファイルの改良にとって有用であり得る。好適な疎水性樹脂の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍ、Ｔｏｓｏｈ ＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ ６５０Ｃ、Ｔｏｓｏｈ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｃ、およびＥＭＤ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標） Ｐｈｅｎｙｌ （Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ、ＰＡ）が挙げられる。
【0089】
一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、クロマトグラフ基材（例えば、マトリックス、樹脂、カラム）内に導入遺伝子タンパク質夾雑物を保持することができるマルチモーダルクロマトグラフィー精製に供する工程を含む。本明細書において使用される場合、「混合モードクロマトグラフィー」または「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語は、混合物中の成分の分離を達成するために２つ以上のメカニズムの組合せを採用するクロマトグラフィーを指す。一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ウイルスベクターから生成物関連不純物（例えば、導入遺伝子タンパク質夾雑物）を分離するために、マルチモーダルまたは混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を利用する。一部の実施形態では、ＭＭＣは、少なくとも、ウイルスと不純物との間のサイズの違い、および／または不純物と１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーリガンドとの間において生じる化学相互作用に基づいて作動する。物理的ＭＭＣおよび化学的ＭＭＣを含む、様々なタイプのＭＭＣが、当業者に既知である。化学的ＭＭＣは、これらに限定されるわけではないが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、および親水性相互作用液体クロマトグラフィー、の原理の間の組合せを含む。さらなる例としては、これらに限定されるわけではないが、水素結合、π－π結合、および金属親和性の組合せを利用する樹脂が挙げられる。マルチモーダルクロマトグラフィーの実施例は、ある特定のサイズ、例えば、７００キロダルトン（ｋＤＡ）など、未満の分子を捕獲する疎水性と、正に帯電する特性の両方を有するように設計されたオクチルアミンリガンドを含むＣａｐｔｏ（登録商標） Ｃｏｒｅ ７００クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用を採用する。そのようなクロマトグラフィー樹脂において、ビーズ外側は、不活性であり、ならびに、所望のウイルスベクターは樹脂を通過するが不純物はそこに保持される、サイズ排除によるウイルスベクターの精製を可能にする。
【0090】
ウイルスベクター精製に関与する工程は、当業者に既知の効率を向上させるある特定の薬剤の存在下で行われる。例えば、ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を安定化する薬剤の存在下で行われ、ここで薬剤はＣａＣｌ２である。
【0091】
本明細書において説明される導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、当業者に既知のウイルスベクター作製プロセスに組み込んでもよい。図１Ａは、上流工程（細胞バックバイアル瓶の解凍；細胞増殖および継代；ウイルスベクターを作製するための宿主細胞のトランスフェクトおよび／または誘導）と、その後の一連の下流工程（細胞除去（清澄化）およびヌクレアーゼ処理を含むウイルスベクターの収穫；他の生成物関連不純物およびプロセス関連不純物からベクターを分離するための少なくとも１つの精製工程（本明細書において「ウイルスベクター捕捉工程」）；および、原体の最終製剤化のための限外濾過／透析濾過工程）を含む典型的なウイルスベクター作製プロセスを表す一般的フローダイアグラムである。一般的に、導入遺伝子捕捉工程は、下流プロセスの清澄化工程と最終工程との間の任意のポイントにおいてウイルスベクター作製プロセスに組み込むことができる。
【0092】
ウイルスベクター作製のための上流処理工程は、概して、細胞増加、ベクター産生細胞のトランスフェクションまたは感染、ならびにウイルスベクター作製の工程を含む。概して、ベクター産生細胞のトランスフェクションまたは感染は、一時的トランスフェクション、あるいは哺乳動物細胞または昆虫細胞における安定なプロデューサー細胞系の使用によって達成される。細胞は、構成要素をコードするウイルスベクターによってトランスフェクトされ、ウイルスの数および／またはウイルスの力価を増加するために培養される。トランスフェクションおよび細胞培養の方法は、当業者に既知であり、ならびに、少なくとも、必要な栄養素、例えば、適する培養培地を細胞に提供する工程を含む。細胞を培養する方法としては、例えば、表面付着増殖、懸濁増殖、またはそれらの組合せが挙げられる。培養は、好適な容器、例えば、培養皿、培養フラスコ、またはローラボトルなどにおいて実行することができる。大きなスケールでの培養は、多くの場合、当業者の利用可能な様々なシステム、例えば、バッチシステム、流加バッチシステム、連続システム、中空糸などを使用するバイオリアクターの使用によって実行される。
【0093】
上流処理工程の後、下流処理工程は、典型的には図１Ａに概説される通りであり、清澄化、ヌクレアーゼ処理、ウイルスベクターの捕捉、および無菌濾過の下流処理工程を含む。下流処理の目標は、上流処理の際に生じた様々な不純物からウイルスベクターを分離すること、およびベクターを製剤化および患者への投与にとって適切な状態にすることである。熟練者は、ウイルスベクター製造にとって最も効率的なプロセスを得るために、前述の工程の最適な順序を決定することができるであろう（例えば、最も多くのウイルスベクターをもたらすようなプロセスにおける工程の順序）。
【0094】
清澄化工程は、初期の粗懸濁液からの大きなデブリおよび巨大分子複合体の排除を含む。ある特定の実施形態では、清澄化は、ウイルスベクター収率を向上させるために細胞溶解を含む。溶解を促進するマイクロフルイダイザーまたはヒートショック処理の使用などの物理的方法を含む、細胞を溶解しようとする様々な方法が当業者に既知である。溶解は、多くの場合、界面活性剤の使用によって達成される。界面活性剤は、非イオン性形態、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＮＰ－４０、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドなど、アニオン性形態、例えば、ＳＤＳなど、ならびに双性イオン形態、例えば、ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯなどにおいて利用可能である。一部の実施形態では、清澄化は、細胞デブリおよび他の不純物を除去するために濾過工程によって実行される。好適なフィルターとしては、これらに限定されるわけではないが、セルロースフィルター、例えば、無機フィルター助剤（例えば、フュームドシリカ、パーライト、珪藻土）と組み合わされたセルロースフィルター、有機樹脂と組み合わされたセルロースフィルター、またはそれらの任意の組合せ、ならびに高分子フィルター、例えば、ナイロン、ポリエーテルスルホン、またはポリプロピレンを含むものなどを含むフィルターが挙げられる。当業者に既知の任意の清澄化アプローチは、本発明のウイルスベクター作製プロセスに適するであろう。好適な清澄化アプローチとしては、これらに限定されるわけではないが、遠心分離、精密濾過、デッドエンド濾過、深層濾過、膜濾過、またはその組合せが挙げられる。したがって、清澄化は、孔径を、例えば、０．２μｍまで減少させるフィルターの組合せの使用を含み得る。
【0095】
宿主細胞（例えば、ウイルスベクター産生細胞）の培養工程と、その後の溶解および清澄化工程は、結果として、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を生じる。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物は、宿主細胞を培養し、細胞培養上清を宿主細胞から分離して清澄化することによって生成された細胞培養上清である。宿主細胞は、当業者に既知のウイルスベクター作製に適する任意の宿主細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ＨｅＬａ細胞、および昆虫細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【0096】
細胞溶解工程の間および／またはその後に、核酸（例えば、宿主細胞核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ夾雑物）を分解し、任意の巨大分子複合体を破壊するために、ヌクレアーゼ処理工程を実行してもよい。ヌクレアーゼ処理工程は、清澄化の間および／またはその後に実行される。本発明のウイルスベクター作製プロセスにおける使用に適するヌクレアーゼとしては、これらに限定されるわけではないが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、Ｄｅｎａｒａｓｅ、ならびに当業者に既知の任意の他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ処理の代わりに、またはそれに加えて、例えば、好適な沈降剤、例えば、これらに限定されるわけではないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、テトラデシルトリメチル－塩化アンモニウム（ＴＴＡ）、臭化ドミフェン（ＤＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＴＣ）、および臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などを用いた沈殿によって、核酸不純物の選択的沈殿を実行してもよい。
【0097】
ある特定の実施形態では、細胞分離およびヌクレアーゼ処理は、約７のｐＨを有するリン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液を使用して行われる。
【0098】
細胞分離およびヌクレアーゼ処理の後に、様々な宿主細胞夾雑物からウイルスベクターを精製するために、１つまたはそれ以上のウイルスベクター捕捉工程が採用される。本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程は、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、クロマトグラフ基材内の導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができるクロマトグラフィー精製に供する工程を含むが、その一方で、ウイルスベクター捕捉工程は、クロマトグラフ基材（例えば、マトリックス、樹脂、カラム）内のウイルスベクターに選択的に結合することができるクロマトグラフ基材を採用する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクター捕捉工程は、（ｉ）ウイルスベクター（および１つまたはほとんどの宿主細胞夾雑物）を含む組成物を、ウイルスベクターに選択的に結合することができるクロマトグラフィーマトリックスに接触させる工程；および（ｉｉ）ウイルスベクターをクロマトグラフィーマトリックスから溶出させ、それにより、ウイルスベクターを宿主細胞夾雑物から分離する工程を含む。
【0099】
様々なクロマトグラフ精製技術のうちの１つまたはそれ以上を、ウイルスベクター捕捉のために使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクター捕捉工程のクロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、および固定された金属イオン親和性ークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換樹脂を採用する。「アニオン交換樹脂」、「アニオン交換吸着剤」、または「アニオン交換マトリックス」という用語は、正に帯電し、例えば、固相に取り付けられた１つまたはそれ以上の正に帯電したリガンド、例えば、第四級アミノ基などを有する固相を意味するために本明細書において使用される。アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、正味の負の表面電荷を有する分子に対する親和性を有し、組成物から負に帯電した分子を分離する際に有用である。商業的に入手可能なアニオン交換樹脂としてはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） ＸＬ、ＣＡＰＴＯ（登録商標） ＤＥＡＥ、ＣＡＰＴＯ（登録商標） Ｑ、およびＣＡＰＴＯ（登録商標） Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、あるいはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＥＭＤ ＤＥＡＥ、およびＥＳＨＭＵＮＯ（登録商標） Ｑ、あるいはＢｉｏ－Ｒａｄ製のＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標） ＱおよびＮＵＶＩＡ（登録商標） Ｑが挙げられる。
【0100】
ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、膜交換の使用を含む。膜交換クロマトグラフィーは、膜吸収剤を使用するイオン交換クロマトグラフィーのタイプの１つであり、フラットシート、中空糸、および半径流などの様々なタイプが存在する。一部の実施形態では、膜交換カラムは、ウイルスベクターに結合することができる吸着性部分を有する内部細孔を含む微細孔膜を充填される。吸着膜は、それらを精製目的に対して好適にする様々な形状および化学において利用可能である。
【0101】
当業者に既知の様々な緩衝液および溶液を、ウイルスベクター捕捉のために使用してもよい。例えば、好適な衛生化溶液は、０．５ＭのＮａＯＨを含み得；好適な平衡化緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有し；好適な洗浄緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有し；好適な溶出緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１２００ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有し；好適なストリッピング緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０００ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有し；ならびに好適な再生緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み得、ならびに７．２のｐＨを有する。
【0102】
ある特定の実施形態では、図１Ｂに示されるように、ウイルスベクター捕捉工程は、導入遺伝子タンパク質精製工程の前に実行することができる。例えば、ある特定の態様では、本開示は、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；（ｉｉ）クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から回収されたウイルスベクターを、ウイルスベクターに選択的に結合することができる第２のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｖ）ウイルスベクターを第２のクロマトグラフィーマトリックスから溶出させ、それにより、ウイルスベクターを宿主細胞夾雑物から分離する工程を含む方法を提供する。
【0103】
他の実施形態では、ウイルスベクター捕捉工程は、導入遺伝子タンパク質捕捉工程の後に実行することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞からウイルスベクターを精製する方法であって、（ｉ）ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物を、ウイルスベクターに選択的に結合することができるクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；（ｉｉ）ウイルスベクター（および任意の残留する導入遺伝子タンパク質夾雑物）を第２のクロマトグラフィー樹脂から溶出させる工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液を導入遺伝子タンパク質夾雑物に選択的に結合することができる第１のクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程；および（ｉｖ）クロマトグラフィーマトリックスのフロースルー中のウイルスベクターを回収し、それにより、ウイルスベクターを導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離する工程を含む方法を提供する。
【0104】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程および／またはウイルスベクター捕捉工程を行った後、ウイルスベクター組成物は、ウイルスベクターをさらに濃縮するために、限外濾過の１つまたはそれ以上の工程に供される。限外濾過工程は、場合により、緩衝液交換のために使用される場合に透析濾過と呼ばれる。ある特定の実施形態では、限外濾過／透析濾過工程は、ベクターを濃縮する工程および／または緩衝液を交換する工程を含む。任意の濾過プロセス、例えば、ダイレクトフロー濾過、タンジェンシャルフロー濾過、は、本明細書において説明されるウイルスベクター作製プロセスの限外濾過／透析濾過工程に適している。概して、濾過プロセスは、希釈液を強制的にフィルターを通過させ、そうすることにより、希釈液は組成物から回収されるがベクターはフィルターを通過できず、それにより、結果として濃縮されたベクター組成物を生じさせることによって、ベクターを濃縮する。ある特定の実施形態では、限外濾過／透析濾過工程において、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）が採用される。ＴＦＦシステムは、３つの異なるプロセスストリーム：供給溶液、透過水、および濃縮水（例えば、ウイルスベクターを含む濃縮水）、で構成される。当業者は、ベクターの濃縮および／または緩衝液の交換の目的のためのＴＦＦ用途における使用にとって最適な膜および装置を選択するために、流体特性、試料体積、および処理時間に関して容易に考慮するであろう。例えば、典型的には、保持されるウイルスベクターの分子量より３倍～６倍小さい分子量カットオフを有する膜が、濾過システムにおける使用のために選択される。膜は、フラットシートまたは中空糸であり得る。
【0105】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクター捕捉工程が、導入遺伝子タンパク質捕捉工程の後に行われる場合、ウイルスベクター捕捉工程からの溶出液は、濃縮され、さらに、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって精製される。他の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程が、ウイルスベクター捕捉工程の後に行われる場合、導入遺伝子タンパク質捕捉工程からの溶出液は、濃縮され、さらに、ＵＦ／ＤＦによって精製される。ある特定の実施形態では、溶出液は、ＵＦ／ＤＦに供される前に、最初に希釈される。ある特定の実施形態では、第１の精製工程の溶出液の希釈は、希釈緩衝液、例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓまたは２０ｍＭのホスフェート、２ｍＭのＭｇＣｌ２、３０ｍＭ～１２０ｍＭのＣａＣｌ２を含み、６．５～７．５のｐＨを有する、希釈緩衝液、の使用を含む。ある特定の実施形態では、希釈緩衝液は、希釈の前に冷やされる（＜１５℃の温度を有する）。ある特定の実施形態では、希釈後の導電率は、２０ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍである。
【0106】
本明細書において説明される様々な実施形態では、本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程を実施するために試料をロードする前に、ロード試料は、好適なロード条件に調整される。本明細書において使用される場合、「ロード試料（ｌｏａｄ ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、下流クロマトグラフィーマトリックスに適用される試料を指す。例えば、アニオン交換クロマトグラフィーロード試料は、下流アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスに適用される試料を指す。別の例として、親和性クロマトグラフィーロード試料は、下流親和性クロマトグラフィーマトリックスに適用される試料を指す。
【0107】
例示的な実施形態では、図６Ａに示されるように、ウイルスベクター作製のための下流処理工程が、ウイルスベクター捕捉工程の後に行われる導入遺伝子タンパク質捕捉工程を含む場合、ウイルスベクター捕捉工程の溶出液（第１のクロマトグラフィー精製工程；ウイルスベクター捕捉工程の溶出液は、本明細書において、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード使用とも呼ばれる）は、導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックスに適用される前に好適なロード条件に調整される。そのような実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料（すなわち、ウイルスベクター捕捉工程の溶出液）は、約３００ｍＭ～約１，５００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）濃度を有する溶出緩衝液を使用して、ウイルスベクター捕捉クロマトグラフィーマトリックス（例えば、アニオン交換媒体）から結合したベクターを溶出させることによって得られる。導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料は、次いで、本明細書において説明される好適なロード条件に調整される。
【0108】
別の実施形態では、図６Ｂに示されるように、ウイルスベクター作製のための下流処理工程が、導入遺伝子タンパク質捕捉工程の後に行われるウイルスベクター捕捉工程を含む場合、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料は、導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックスに適用される前に適するロード条件に調整される。導入遺伝子タンパク質捕捉工程からのフロースルー（精製されたウイルスベクターを含むフロースルー）を収集した後、フロースルー試料は、後続のウイルスベクター捕捉クロマトグラフィーマトリックスに適用するために適するロード条件に調整される。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のフロースルー試料（例えば、ウイルスベクター捕捉工程のためのロード試料）は、２０ｍＳ／ｃｍ未満の標的試料導電率を達成するために標的塩濃度に調整される。
【0109】
そのため、ある特定の実施形態では、本開示において説明されるウイルスベクター作製のための下流処理工程は、ウイルスベクターと導入遺伝子タンパク質夾雑物とを含む組成物の塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程を含む。
【0110】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料の調整工程は、塩の濃度を標的塩濃度に調整する工程を含む。導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料の調整は、塩およびイオン成分、例えば、これらに限定されるわけではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、およびＭｇＣｌ２など、の濃度を調整する工程を含み得る。一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料を調整する工程は、ロード試料中の塩の濃度を標的塩濃度まで減少させるために、ロード試料を１：０、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０などの倍率に希釈する工程を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料を調整する工程は、ロード試料中の塩の濃度を標的塩濃度まで増加させるために、塩の追加（例えば、ストック塩のボーラス追加）を含む。当業者は、必要な希釈剤の量、あるいは導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックスへの適用に適する標的塩濃度を達成するためにロード試料に加える必要のある塩の量を容易に特定することができるであろう。導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、約２００ｍＭ（０．２Ｍ）～約６００ｍＭ（０．６Ｍ）の標的塩濃度を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、標的塩濃度は、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、標的塩濃度は、約４００ｍＭである。一部の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料中の塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。そのため、一部の実施形態では導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、約２００ｍＭのＮａＣｌ～約６００ｍＭのＮａＣｌの標的塩濃度を有し得る。ある特定の例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、約４００ｍＭの標的ＮａＣｌ濃度を有する。他の実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、約２００ｍＭのＫＣｌ～約６００ｍＭのＫＣｌの標的塩濃度を有し得る。ある特定の例示的な実施形態では、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、約４００ｍＭの標的ＫＣｌ濃度を有する。理論に拘束されるわけではないが、本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料の塩濃度を調整する工程は、ウイルスベクターが全ての結合した夾雑導入遺伝子タンパク質から分離される最適な塩濃度を提供することによって、導入遺伝子タンパク質捕捉工程の効率を向上させ得る。
【0111】
本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程での夾雑導入遺伝子タンパク質の最適な除去を促進するために、他のイオン成分および／賦形剤を調整するための、導入遺伝子タンパク質捕捉工程のためのロード試料への追加またはその希釈が実行される。緩衝系、例えば、Ｔｒｉｓ、ホスフェート、ビス－Ｔｒｉｓ、または本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程に適する当技術分野において既知の他の緩衝系など、が使用される。そのような緩衝系は、賦形剤、例えば、糖（例えば、スクロース）、ポロクサマー、ポリソルベート、および当技術分野において既知の他の適する賦形剤などを含み得る。ある特定の実施形態では、緩衝系は、導入遺伝子タンパク質捕捉の効率および本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程での除去を高めるために、１つまたはそれ以上のイオン成分、例えば、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、または当技術分野で既知の他のもの、も含有する。ある特定の例示的な実施形態では、イオン成分、例えば、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２など、は、０ｍＭ～約２０ｍＭの標的濃度に調整される。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための好適な調整されたロード試料は、約２００ｍＭ～約６００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、約０ｍＭ～約２０ｍＭのＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２を含み得、ならびに、賦形剤、例えば、糖（例えば、スクロース）、ポロクサマー、ポリソルベート、および／または当技術分野において既知の適する任意の他の賦形剤などを含有し得るかまたは含有し得ない。
【0112】
本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程のための調整されたロード試料は、処理の必要性に応じて、一時的保持のために低温において貯蔵される。ある特定の実施形態では、調整されたロード試料は、導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックスに直接適用される。本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程を実施するために好適な条件（例えば、約４℃～約２５℃の温度）は、当業者に既知であり、ならびに導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックスの製造元によって提供され得る。調整された試料は、導入遺伝子タンパク質夾雑物が導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックス内に保持されるために十分な時間が経過することを可能にする、約４～約１２分の範囲の滞留時間値において、導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーマトリックス（例えば、導入遺伝子タンパク質捕捉クロマトグラフィーカラム）へロードされる。結合していないウイルスベクター粒子はマトリックスをフロースルーし、結果として、精製されたウイルスベクター産物が得られる。任意の残留するウイルスベクター粒子をクロマトグラフィーマトリックス（例えば、充填されたカラムのボイドスペース）から回収するために、平衡化緩衝液の追加がクロマトグラフィーマトリックスに適用され、所望のレベルのウイルスベクター粒子が得られるまで、フロースルーが収集される。
【0113】
本明細書において説明されるウイルス作製プロセスにおけるこの段階において、ウイルスベクター組成物（すなわち、ウイルスベクター溶出液）は、医薬組成物を作製するために、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わされ、次いで、場合により、組成物を臨床使用にとって好適にするために、濾過滅菌に供される。様々な濾過滅菌プロセスおよび滅菌フィルターが、当業者に既知である。したがって、本明細書において説明されるウイルスベクター作製プロセスは、ウイルスベクターを含む医薬組成物を作製するために、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクター（例えば、ウイルスベクター溶出液）を、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクター（例えば、ウイルスベクター溶出液）を、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わせる工程は、製剤化緩衝液による導入遺伝子タンパク質夾雑物から分離されたウイルスベクター（例えば、ウイルスベクター溶出液）のＵＦ／ＤＦによって達成される。
【0114】
ある特定の実施形態では、本明細書において説明されるウイルスベクター作製プロセスは、結果として、ウイルスベクターを含む組成物をもたらし、ここで組成物は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない。本明細書において使用される場合、「導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない」という用語は、本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程を用いずに精製された参照ウイルスベクター組成物（例えば、ウイルスベクター捕捉工程を用いるが導入遺伝子タンパク質捕捉工程は用いない従来の精製プロセスに従って精製されたウイルスベクター組成物）中に存在する導入遺伝子タンパク質夾雑物の約５０％未満を含む組成物を指す。例えば、組成物が、本発明の導入遺伝子タンパク質捕捉工程を用いずに精製された参照ウイルスベクター組成物の約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満を含む場合、組成物は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、組成物は、参照ウイルスベクター組成物中に存在する導入遺伝子タンパク質夾雑物の２０％未満を含有する。
【0115】
導入遺伝子タンパク質夾雑物の量をアッセイする様々な方法が、当業者に既知であり、ならびに、好適である。ある特定の実施形態では、特定の活性（例えば、酵素活性）を有する導入遺伝子タンパク質夾雑物に対して、本発明の組成物中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の活性をアッセイすることができ、ならびに、参照ウイルスベクター組成物中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の活性と比較することができる。例えば、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子活性のレベル（ｍＵ／ｍｌ）は、当業者に既知の様々なクロマトグラフアッセイによってアッセイすることができる。ある特定の実施形態では、精製された本発明のＦＶＩＩＩウイルスベクター組成物は、５００００ｍＵ／ｍｌ未満のＦＶＩＩＩ活性（例えば、４００００ｍＵ未満、３００００ｍＵ未満、２００００ｍＵ未満、１００００ｍＵ未満、または５００ｍＵ未満のＦＶＩＩＩ活性）を有する。ある特定の例示的な実施形態では、精製された本発明のＦＶＩＩＩウイルスベクター組成物は、約１ＩＵ以下の総ＦＶＩＩＩ活性を有する。
【0116】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子タンパク質夾雑物の量は、実際の夾雑タンパク質の存在を定量化する当技術分野において既知の様々な技術によって検出することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の存在をアッセイすることができ、ならびに、参照ウイルスベクター組成物中の導入遺伝子タンパク質夾雑物の存在と比較することができる。例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を実行して、導入遺伝子タンパク質夾雑物の存在を検出することができる。好適であり得る他の例としては分光分析法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および：液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）など）、およびタンパク質検出の抗体ベースの方法（例えば、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動など）が挙げられる。
【0117】
Ｂ．ウイルスベクター
本明細書において提供される方法およびプロセスは、あらゆるウイルスベクターの作製および精製にとって好適である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、エンベロープウイルスベクターである。当技術分野で既知であるように、エンベロープウイルスベクターとしては、これらに限定されるわけではないが、エンベロープＤＮＡウイルスベクター、例えば、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスなど、ならびにエンベロープＲＮＡウイルスベクター、例えば、アルファウイルスおよびパラミクソウイルスなどが挙げられる。エンベロープＲＮＡウイルスベクターとしては、レトロウイルス、例えば、 オンコレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプーマウイルスなど、も挙げられる。ある特定の実施形態では、エンベロープウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、より大きな群であるレトロウイルスベクターの一部である（Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７年）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ、Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ７５８～７６３頁）。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させる能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２年）；ＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４年））。
本明細書において提供される方法およびプロセスは、あらゆるウイルスベクターの作製および精製にとって好適である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、エンベロープウイルスベクターである。当技術分野で既知であるように、エンベロープウイルスベクターとしては、これらに限定されるわけではないが、エンベロープＤＮＡウイルスベクター、例えば、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスなど、ならびにエンベロープＲＮＡウイルスベクター、例えば、アルファウイルスおよびパラミクソウイルスなどが挙げられる。エンベロープＲＮＡウイルスベクターとしては、レトロウイルス、例えば、 オンコレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプーマウイルスなど、も挙げられる。ある特定の実施形態では、エンベロープウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、より大きな群であるレトロウイルスベクターの一部である（Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７年）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ、Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ７５８～７６３頁）。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させる能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２年）；ＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４年））。
【0118】
本明細書において使用される場合、「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスに由来し得る少なくとも１つの構成部分を含むベクターを指す。一部の実施形態では、上記構成部分は、ベクターが細胞を感染させる、遺伝子を発現する、または複製されるための生物学的機構に関与する。一部の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターにおいて、複製のために必須である１つまたはそれ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。したがって、一部の実施形態では組換えレンチウイルスベクターは、複製能欠損性である。また、ウイルスゲノムの一部を導入遺伝子に置換して、それにより、ベクターが、標的非分裂宿主細胞の形質導入および／またはそのゲノムの宿主ゲノム中への組み込みを行えるようにしてもよい。
【0119】
ある特定の実施形態では、組換えエンベロープウイルス（例えば、組換えレンチウイルス）は、組換えレンチウイルスベクターの指向性を変更または修正するようにシュードタイプ化される。シュードタイプ化は、１つまたはそれ以上の利点を付与することができる。例えば、ＨＩＶを基にしたベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、これらのベクターがＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみを感染させるように制限するであろう。一部の実施形態では、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列で置き換えられている場合、それらは、より広い感染スペクトルを付与し得る（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７年））。ラブドウイルスの１つである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある特定のレトロウイルスをシュードタイプ化し得ることが示されているエンベロープタンパク質である。シュードタイプ化されたＶＳＶ－Ｇベクターは、広範な哺乳動物細胞の形質導入のために使用することができる。ＶＳＶ－Ｇタンパク質などの非レンチウイルス性シュードタイプ化エンベロープを組み込むことには、ベクター粒子を、感染性を失うことなく高力価に濃縮し得るという利点がある（Ａｋｋｉｎａら（１９９６年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１～５頁）。
【0120】
レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジ様レンチウイルス群、ヤギレンチウイルス群、および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの開発は、Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら（１９９９年）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：４８１～４９６頁にレビューされている。遺伝子療法に適するレンチウイルスベクターの設計および使用は、例えば、米国特許第６，２０７，４５５号および同第６，６１５，７８２号に記載されている。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２シュードタイプ化、ＨＩＶ－１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0121】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、「第三世代」レンチウイルスベクターである。本明細書で用いる場合、「第三世代」レンチウイルスベクターという用語は、第二世代ベクターシステムの特徴を有し、さらに機能的ｔａｔ遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、ｔａｔ遺伝子が欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物上に提供される。例えば、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～８４７１を参照のこと。本明細書で用いる場合、「第二世代」レンチウイルスベクターシステムとは、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆが欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１～８７５頁を参照のこと。本明細書で用いる場合、「パッケージングシステム」とは、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードするウイルス構築物のセットを指す。典型的には、パッケージングシステムの構築物は、最終的にパッケージング細胞に組み込まれる。
【0122】
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞（例えば、肝細胞）を感染させることができる組換えレンチウイルスのベクターである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、典型的には、レトロウイルスに見出される３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらには２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし；ｅｎｖ遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要な他の全てのシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含む追加の遺伝子を有する（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶにおいて）。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写のため（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なカプシド形成のため（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が隣接している。
【0123】
一部の実施形態では、非分裂細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスを作製方法は、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つまたはそれ以上のベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトする工程を含む。それ故に、例えば、第１のベクターがウイルスｇａｇおよびウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供し、別のベクターがウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することで、パッケージング細胞を生成することができる。本明細書で移入ベクターとして特定される、異種遺伝子を提供するベクターをパッケージング細胞に導入することにより、目的の外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が生じる。
【0124】
ベクターおよび外来遺伝子の上記の構成によれば、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含む、ほぼあらゆる適するウイルスに由来し得る。一部の実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。
【0125】
レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。他のｅｎｖ遺伝子、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ）、肝炎ウイルスおよびインフルエンザのそれも使用することができる。
【0126】
ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ応答エレメント、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、またはその任意の組合せをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。
【0127】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの標的化および／または活性を改善する１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。１つまたはそれ以上のポリペプチドは、レンチウイルスベクターによってコードされるか、または宿主細胞からのレンチウイルスベクターの出芽の間に組み込むことができる。レンチウイルスの生成の間に、ウイルス粒子は産生宿主細胞から出芽する。出芽過程の間に、ウイルス粒子は脂質コートを獲得し、それは宿主細胞の脂質膜に由来する。その結果として、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面に前から存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。
【0128】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト対象への投与後のレンチウイルスベクターに対する免疫応答を阻害する、１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、１つまたはそれ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己マーカー」タンパク質であり、ヒト細胞上に遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７とマクロファージにより発現されるＳＩＲＰαとの相互作用を通じて、内因性細胞のマクロファージ誘導食作用を阻害する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、インビボでヒトマクロファージによって標的化されて破壊される可能性が低い。
【0129】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子をその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高いＣＤ４７発現レベルを有する細胞系において生成される。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはＣＤ４７ｈｉｇｈ細胞で生成され、細胞は細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはＣＤ４７ｈｉｇｈＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で生成され、ＨＥＫ ２９３Ｔは細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有する。一部の実施形態では、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、非改変ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に比してＣＤ４７の発現が増加するように改変される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である。
【0130】
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の表面発現をほとんどまたは全く有しない。表面に発現されるＭＨＣ－Ｉは、細胞内からの「非自己」タンパク質のペプチド断片、例えば、感染を示すタンパク質断片を提示し、細胞に対する免疫応答を促進する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターはＭＨＣ－Ｉｌｏｗ細胞で生成され、細胞は細胞膜上のＭＨＣ－Ｉの発現低下を有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉ－（または「ＭＨＣ－Ｉｆｒｅｅ」、「ＭＨＣ－１ｎｅｇ」または「ＭＨＣ陰性」）細胞において生成され、細胞はＭＨＣ－Ｉの発現を欠く。
【0131】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含みＭＨＣ－Ｉポリペプチドを欠く脂質コートを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉｌｏｗ細胞系、例えば、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－ＩｌｏｗＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系において生成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉｆｒｅｅ細胞系、例えば、ＣＤ４７ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－ＩｆｒｅｅＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系において生成される。
【0132】
レンチウイルスベクターの例は、米国特許第９，０５０，２６９号ならびにＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６、およびＷＯ９８１８９３４に開示されており、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0133】
発現制御エレメント
一部の実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、さらに、少なくとも１つの発現制御配列を含む。発現制御配列は、本明細書に使用される場合、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーの組合せなどの任意の調節ヌクレオチド配列であって、その配列が作動可能に連結するコード核酸の効率的な転写と翻訳を促進する配列である。例えば、本開示の単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、さらに、少なくとも１つの発現制御配列を含む。発現制御配列は、本明細書に使用される場合、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーの組合せなどの任意の調節ヌクレオチド配列であって、その配列が作動可能に連結するコード核酸の効率的な転写と翻訳を促進する配列である。例えば、本開示の単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。
【0134】
遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター、例えば構成的または誘導可能なプロモーターであってよい。哺乳動物の構成的プロモーターとしては、以下の遺伝子に関するプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスからのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。
【0135】
他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとして、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。
【0136】
一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例として、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７頁に記載されている。Ｆ８プロモーターは、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８～１１８３８頁に記載されている。ある特定の実施形態では、プロモーターは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１９／００４８３６２号に開示されているｍＴＴＲプロモーターのいずれか（例えば、ｍＴＴＲ２０２プロモーター、ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔプロモーター、ｍＴＴＲ４８２プロモーター）を含む。
【0137】
１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して、発現レベルをさらに高めて、治療効能を達成することができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独でまたは１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上の複製を含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５～２０７７３頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９５～４０４頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４頁；Ｉｌｌら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３～Ｓ３０頁）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。
【0138】
特定の一例において、本開示のために有用なプロモーターは、ＥＴプロモーターであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても公知である。Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３頁（２００５年）も参照のこと。他の好適なベクターおよび遺伝子調節エレメントの例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、もしくは同第７，１７９，９０３号に記載されている。
【0139】
一般に、発現制御配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、場合により、所望に応じたエンハンサー配列または上流の活性化因子配列を含む。
【0140】
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクター内に、例えば、レンチウイルスベクター内の導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含めることは有用であろう。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つを上回るコピーは、システムの有効性を高めることができる。
【0141】
異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含められる。例えば、１つを上回る導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つを上回るｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にある導入遺伝子を有し得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦列性であってよいが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットを、アンチセンスの向きでレンチウイルスベクター内に挿入することもできる。アンチセンスの向きは、ウイルス粒子の生成において、通常であればプロデューサー細胞に有毒な可能性のある遺伝子産物の発現を回避するために有用となり得る。
【0142】
他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含めるか否か（およびその数）の選択は、意図する組織標的、要求される発現のレベルなどの公知のパラメーターによって導かれると考えられる。
【0143】
一実施形態では、標的配列は、骨髄球拘束前駆細胞において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄系細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的はまた、リンパ球系列または赤血球系列における強固な導入遺伝子発現に依拠する遺伝子療法の適用に適する可能性もある。ｍｉＲ－２２３標的はまた、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。
【0144】
別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａａａｃａｃｔａｃａ（配列番号７））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列の４つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補的配列、例えばｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み込まれ、導入遺伝子をコードする転写物をｍｉＲＮＡ介在ダウンレギュレーションに対して感受性にする。この方法により、導入遺伝子発現を、非造血細胞では維持しながら、造血系列の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で阻止することができる（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００６年）。この戦略は、導入遺伝子発現に対してストリンジェントな転写後制御を課すことができ、それ故に、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性除去を阻止し、かつ／または抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）を誘導して、導入遺伝子によってコードされる抗原に対する強固な免疫寛容を媒介する。
【0145】
一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５年） １７（２）：１５５～１６５頁は、マウス骨髄内のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１を開示している（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それはまた、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられることも開示している。
【0146】
標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全または部分的に相補的であり得る。「完全に相補的な」という用語は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。「部分的に相補的な」という用語は、標的配列が、それが認識するｍｉＲＮＡの配列に対して部分的にのみ相補的であり、その際、部分的に相補的な配列が依然としてｍｉＲＮＡによって認識されることを意味する。換言すれば、本開示の文脈において、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識して、そのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低下を生じさせるのに有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載されており、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0147】
一部の実施形態では、適する第三世代レンチウイルスベクターは、自己不活性化レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ．Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための肝細胞特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、肝細胞特異的プロモーターは、強化トランスサイレチンプロモーターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子産物に対する免疫応答を低下させるためのｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を本開示のレンチウイルスベクターに組み込むことは、所望の導入遺伝子発現プロファイルを可能にする。例えば、ｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことで、血管内および血管外の造血細胞系列における導入遺伝子発現を抑制することができ、一方、非造血細胞では導入遺伝子発現が維持される。
【0148】
Ｃ．ウイルスベクター導入遺伝子
本明細書において説明される方法にとって好適なウイルスベクターは、疾患または障害を患う対象におけるそれらの治療ための、導入遺伝子タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子発現カセットを含む。ウイルスベクターが、インビボにおいて対象に投与される場合、ウイルスベクターは、所望どおりに対象において導入遺伝子のタンパク質産物が発現されるように、導入遺伝子発現カセットによって対象の細胞を形質導入する。しかしながら、導入遺伝子が、エクスビボでのウイルスベクター作製の際に発現される場合、導入遺伝子タンパク質は、ウイルスと共に同時精製することができる夾雑物と見なされる。したがって、本発明の方法は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を除去するために採用することができる。
本明細書において説明される方法にとって好適なウイルスベクターは、疾患または障害を患う対象におけるそれらの治療ための、導入遺伝子タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子発現カセットを含む。ウイルスベクターが、インビボにおいて対象に投与される場合、ウイルスベクターは、所望どおりに対象において導入遺伝子のタンパク質産物が発現されるように、導入遺伝子発現カセットによって対象の細胞を形質導入する。しかしながら、導入遺伝子が、エクスビボでのウイルスベクター作製の際に発現される場合、導入遺伝子タンパク質は、ウイルスと共に同時精製することができる夾雑物と見なされる。したがって、本発明の方法は、導入遺伝子タンパク質夾雑物を除去するために採用することができる。
【0149】
導入遺伝子タンパク質夾雑物は、目的の任意の導入遺伝子に対応し得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、凝固因子、増殖因子、抗体、または代謝酵素から選択されるタンパク質をコードし得る。本明細書において使用される場合、「凝固因子」という用語は、対象における出血エピソードを防ぐかまたはその持続時間を減少させる、天然に存在するかまたは組換え的に産生された分子またはその類似体を指す。換言すれば、それは、凝固促進活性（ｐｒｏ－ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する分子を意味し、すなわち、それは、不溶性フィブリンのメッシュへの線維素原の変換を引き起こし、それは、血液を固まらせるかまたは凝固させる原因となる。「凝固因子」は、本明細書に使用される場合、活性化凝固因子、そのチモーゲン、または活性化可能な凝固因子を含む。「活性化可能な凝固因子」は、活性化形態へと変換することができる不活性形態（例えば、チモーゲン形態）の凝固因子である。「凝固因子」という用語は、これらに限定されるわけではないが、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（Ｆｌｌ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害因子（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、α２－アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子２（ＰＡＩ２）、そのチモーゲン、その活性化形態、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはそのバリアントもしくは断片を含む。他の実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはそのバリアントもしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、凝固因子は、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
【0150】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、異種アミノ酸配列をコードする。異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列またはＦＩＸアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に結合することができ、あるいはＦＶＩＩＩアミノ酸配列またはＦＩＸアミノ酸配列における２つのアミノ酸の間に挿入することができる。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１および同ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号に開示される任意の部位において、ＦＶＩＩＩポリペプチド内に挿入することができる。
【0151】
一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩのＢドメインまたはその断片の中に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩの中の、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号４）のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸のすぐ下流に挿入される。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、成熟ヒトＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸７４６～１６４６の欠失を含み、異種アミノ酸配列は、成熟ヒトＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入される。
【0152】
一部の実施形態では、異種部分は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列、その断片、バリアントまたは誘導体を含む。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ配列」は、小型の親水性アミノ酸で主に構成され、生理的条件下では二次構造または三次構造をとる程度が低いかまたはとらない、天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する、伸長したポリペプチドを指す。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分としての役割を果たすことができる。加えて、ＸＴＥＮは、薬物動態パラメーターおよび溶解特性の強化を含むがこれらに限定されない、所望の特性をもたらすことができる。
【0153】
一部の実施形態では、本開示に関して有用なＸＴＥＮ配列は、約２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個、１０００個、１２００個、１４００個、１６００個、１８００個、または２０００個を上回るアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０～約３０００個を上回るアミノ酸残基、３０～約２５００個を上回る残基、４０～約２０００個を上回る残基、５０～約１５００個を上回る残基、６０～約１０００個を上回る残基、７０～約９００個を上回る残基、８０～約８００個を上回る残基、９０～約７００個を上回る残基、１００～約６００個を上回る残基、１１０～約５００個を上回る残基、または１２０～約４００個を上回る残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが４２アミノ酸よりも長く１４４アミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。
【0154】
本開示のＸＴＥＮ配列は、５～１４個（例えば、９～１４個）のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ここでモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４～６種のアミノ酸（例えば、５種類のアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本開示のキメラタンパク質において異種部分として使用し得るＸＴＥＮ配列の例は、例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２Ａ１、同ＷＯ２０１０／１４４５０２Ａ２、同ＷＯ２０１０／１４４５０８Ａ１、同ＷＯ２０１１／０２８２２８Ａ１、同ＷＯ２０１１／０２８２２９Ａ１、もしくは同ＷＯ２０１１／０２８３４４Ａ２に開示されている。
【0155】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、表１に示されるようなＦＶＩＩＩコード配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子によってコードされる導入遺伝子タンパク質は、表１に示されるようなアミノ酸配列を含む。
【0156】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【0157】
Ｄ．製剤の賦形剤、担体、および他の構成物
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるプロセスまたは方法によって作製されるウイルスベクター組成物は、ウイルスベクターを含む医薬組成物を作製するために、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わされる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるプロセスまたは方法によって作製されるウイルスベクター組成物は、ウイルスベクターを含む医薬組成物を作製するために、１つまたはそれ以上の薬学的賦形剤と組み合わされる。
【0158】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ウイルスベクター（例えば、組換えレンチウイルスベクター）の有効用量を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、レンチウイルスベクターの有効用量を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、製剤化緩衝液を含む。ある特定の実施形態では、製剤化緩衝液は、ＮａＣｌとスクロースとを含むリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、以下：（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ不含緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含み、ここで医薬組成物は、ヒト対象への投与に好適である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％～０．１％の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％～５％の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％、０．０５％、０．０７％、または０．０９％である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％、２％、３％、または４％である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。
【0159】
本開示のウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内に、または任意の粘膜表面を通して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸、経膣により、または肺経路を介して投与することができる。ウイルスベクターは、所望の部位へのベクターの徐放を可能にするバイオポリマー固体支持体の中に植え込むか、またはそれに接続することができる。
【0160】
一実施形態では、ウイルスベクターを含む製剤化された原体の投与の経路は、非経口である。非経口的という用語は、本明細書中で使用する場合、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。静脈内形態の非経口投与が好ましい。投与のこれらの全ての形態は本開示の範囲内にあると明らかに企図されるが、投与のための形態は注射用溶液になると考えられ、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のためにはそうである。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかし、本明細書における教示に適合する他の方法では、ウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位に直接送達して、それにより、患部組織の治療剤への曝露を増加させることができる。
【0161】
非経口投与のための調製物としては、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、植物油、例えばポリエチレングリコール、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。本開示では、薬学的に許容される担体としては、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、補液および栄養素補液、電解質補液、例えば、リンゲルブドウ糖液をベースにするものが挙げられる。保存剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスが存在してもよい。
【0162】
より詳細には、注射用に適する医薬組成物としては、無菌の水性溶液（水溶性）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時使用調製物のための無菌の粉末が挙げられる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射し得る程度に流動性である必要がある。それは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されることが好ましいと考えられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は要求される粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【0163】
微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【0164】
いずれの場合にも、無菌の注射溶液は、必要に応じて、本明細書に列挙された成分の１つまたはその組合せと一緒に、活性化合物（例えば、ポリペプチド単独または他の活性剤との組合せ）を必要な量で適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分とあらかじめ濾過滅菌しておいた溶液からの任意の所望の追加成分との粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。注射のための調製物は、処理されて、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充填され、当技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、調製物をキットの形でパッケージ化して販売することができる。そのような製造品は、付随する組成物が、凝固障害に罹患しているかまたはその素因を有する対象を治療するために有用であることを示すラベルまたは添付文書を有することが好ましいと考えられる。
【0165】
また、医薬組成物を、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または滞留浣腸として直腸投与用に製剤化することもできる。
【0166】
状態の治療のための本開示の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の医薬品、および治療が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知である慣行的な方法を使用して、治療投薬量を調節することができる。
【0167】
ウイルスベクターを含む医薬組成物は、単回用量としてまたは複数回用量として投与することができ、複数回用量は連続的にまたは特定の時間間隔で投与することができる。最適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定するために、インビトロアッセイを用いることができる。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは、当技術分野で公知である。加えて、有効用量を、動物モデル、例えば血友病のイヌ（Ｍｏｕｎｔら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ ９９（８）：２６７０頁）から得られる用量反応曲線から外挿して推定することもできる。
【0168】
上記の範囲内にある中間の用量も、本開示の範囲内にあるものとする。そのような用量を、毎日、隔日、毎週または実証的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば、少なくとも６カ月にわたる複数の投薬による投与を必要とする。
【0169】
ウイルスベクターを含む医薬組成物は、複数の機会に投与することができる。単一の投薬の間隔は、週、週、月または年の単位であってよい。また、間隔が、患者で改変ポリペプチドまたは抗原の血中レベルを測定することによって指示される通りに不規則であってもよい。ウイルスベクターの投薬量および頻度は、患者における導入遺伝子タンパク質産物の半減期によって異なり得る。
【0170】
ウイルスベクターを含む医薬組成物の投与の投薬量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて異なり得る。予防的適用では、ウイルスベクターを含有する組成物は、まだ疾患状態にはない患者に対して、患者の抵抗性を強化するかまたは疾患の影響を最小にするために投与される。そのような量は、「予防的有効用量」と定義される。長期間にわたって、比較的低頻度の間隔で、比較的低い投薬量が投与される。一部の患者は、残りの存命期間中、治療を受け続ける。
【0171】
ウイルスベクターを含む医薬組成物は、場合により、治療（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態の治療において有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【0172】
本明細書で使用する場合、補助療法と併用してまたは組み合わせてのウイルスベクターを含む医薬組成物の投与は、その療法および開示されるポリペプチドの逐次的な、同時の、共存性の、並行性の、併存性のまたは同時発生的な投与または適用を意味する。当業者は、組み合わせる治療レジメンの様々な構成要素の投与または適用の時間を、治療の全体的な効果を強化するために調整し得ることを理解するであろう。当業者（例えば、医師）は、選択される補助療法および本明細書の教示に基づいて、不必要な実験を行わずに有効な併用療法レジメンを容易に見極めることができると考えられる。
【0173】
ウイルスベクターを含む医薬組成物は、（例えば、併用療法レジメンを提供するために）１つまたはそれ以上の薬剤と併用して、または組み合わせて使用することができることは理解されるであろう。ウイルスベクターを含む医薬組成物と組み合わせることができる例示的な薬剤としては、治療される特定の障害に対する現行の標準医療に相当する薬剤が挙げられる。そのような薬剤は、化学的または生物学的な性質のものであり得る。「生物学的」または「生物学的薬剤」という用語は、生体および／またはその産物から作製される、治療薬としての使用を目的とする任意の薬学的活性薬剤を指す。
【0174】
ウイルスベクターを含む医薬組成物と組み合わせて使用される薬剤の量は、対象によって異なることがあり、または当技術分野で公知であるものに従って投与することができる。例えば、ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧ ＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １２３３～１２８７頁の、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版、１９９６年）を参照のこと。別の実施形態では、標準医療に合致するそのような薬剤の量が投与される。
【0175】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを含む医薬組成物は、免疫抑制剤、抗アレルギー剤または抗炎症剤と併用して投与される。これらの薬剤は一般に、本明細書において治療される対象の免疫系を抑制またはマスキングするように作用する物質を指す。これらの薬剤には、サイトカイン産生を抑制するか、自己抗原の発現をダウンレギュレートもしくは抑制するか、またはＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。そのような薬剤の例としては、２－アミノ－６－アリール－５置換ピリミジン；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質コルチコイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾン；抗インターフェロン－γ、－βまたは－α抗体、抗腫瘍壊死因子－α抗体、抗腫瘍壊死因子－β抗体、抗インターロイキン－２抗体および抗ＩＬ－２受容体抗体を含むサイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ－１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ－Ｔ抗体；ＬＦＡ－３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ－β；ストレプトドルナーゼ；ＦＫ５０６；ＲＳ－６１４４３；デオキシスペルグアリン；ならびにラパマイシンが挙げられる。ある特定の実施形態では、薬剤は抗ヒスタミン剤である。本明細書で使用される「抗ヒスタミン剤」は、ヒスタミンの生理作用に拮抗する薬剤である。抗ヒスタミン剤の例としては、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、クロモリンナトリウム、アステミゾール、マレイン酸アザタジン、マレイン酸ブロフェニラミン、マレイン酸カルビノキサミン、塩酸セチリジン、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ｄ－マレイン酸ブロムフェニラミン、ｄ－マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒドラミン、コハク酸ドキシラミン、塩酸フェキソフェンダジン、塩酸テルフェナジン、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン、塩酸メクリジン、クエン酸トリペラナミン、塩酸トリペレナミン、および塩酸トリプロリジンが挙げられる。
【0176】
免疫抑制剤、抗アレルギー剤、または抗炎症剤を、ウイルスベクターを含む医薬組成物の投与レジメンに組み込んでもよい。例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤の投与を、ウイルスベクターを含む医薬組成物の投与の前に開始してよく、その後に単回またはそれ以上の回数の用量において続けてもよい。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤または抗炎症剤は、ウイルスベクターを含む医薬組成物の前投薬として投与される。
【0177】
ウイルスベクターを含む医薬組成物は、投与を容易にするように、ならびに安定性を促進するように、製剤化することができることは理解されるであろう。好ましくは、本開示による医薬組成物は、生理的食塩水、非毒性緩衝液、保存剤などの薬学的に許容される非毒性無菌担体を含む。当然ながら、本開示の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的有効量を提供するために、単回または複数回の用量で投与することができる。
【0178】
本開示を詳細に説明したが、同じことが、例示目的のみのために本明細書に含められかつ、本開示の限定であることを意図しない以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。本明細書において言及される全ての特許、刊行物、および記事は、参照により明確にそして詳細に本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【0179】
材料および方法：
以下は、実施例１～６において概説されるように、本開示の方法を実施するために適する例示的な試薬（表２）および一般的方法である。
以下は、実施例１～６において概説されるように、本開示の方法を実施するために適する例示的な試薬（表２）および一般的方法である。
【0180】
【表2-1】
【表2-2】
【0181】
ＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＶＩＩＩ活性の特定：ＦＶＩＩＩ活性のインビトロ診断光度定量のために、発色アッセイキットＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標） ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ（カタログ番号Ｋ８２４０８６；Ｄｉａｐｈａｒｍａ（商標））を使用することができる。簡潔に説明すると、第Ｘ因子は、カルシウムおよびリン脂質の存在下で第ＩＸａ因子によって第Ｘａ因子へと活性化される。この生成は、ＦＶＩＩＩによって非常に刺激される。最適な量のＣａ２＋およびリン脂質ならびに過剰な第ＩＸａ因子および第Ｘ因子を使用して、第Ｘ因子の活性化速度をＦＶＩＩＩの量に依存させた。第Ｘａ因子は、発色基質（Ｚ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）Ｓ－２７６５（商標）を加水分解し、その結果、発色団ｐＮＡ（ｐ－ニトロアニリン）を遊離する。生成された第Ｘａ因子とその結果として生じる色の純度は、試料のＦＶＩＩＩ活性に比例する。この色は、次いで、４０５ｎｍにおいて光度測定的に読み取ることができる。
【0182】
ウイルスベクターの作製：エンベロープウイルスベクターＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＬＶ－ＦＶＩＩＩを、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞において作製した。この細胞は培養培地に適合されており、ならびに以下のどちらか：（１）プラスミドＤＮＡおよびトランスフェクション剤、例えば、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（カタログ番号１１５－４００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標））、リポフェクタミン（登録商標）２０００（カタログ番号１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（商標））、リポフェクタミン（登録商標）（カタログ番号Ｌ３０００７５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（商標））、または他の同等な試薬などを使用して 一過性にトランスフェクトされるか、または（２）振盪フラスコまたはバイオリアクター（ディスポーザブルシステム、管内の吸着媒体の有無における従来の攪拌式タンク）において安定なプロデューサー細胞が誘導され、ウイルス粒子を作製するために、バッチ式培養、流加バッチ式培養、または連続ケモスタット培養として実行される。ベクター産生細胞は、作製培地、例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３発現培地、ＬＶ－Ｍａｘ（商標）、または、概して血清不含かつ既知組成である同等な培地などにおいて培養することができる。典型的には、懸濁培養は、培地の潅流、交互のタンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）を使用する培地の交換、または栄養素の連続的追加を使用する新鮮な培地の追加を伴い、細胞数を増加させてバッチ培養システムを超える力価を生じさせるために実行される。産物収量、産物純度、および不純物の量は、ベクターを産生する細胞の能力、使用される作製のシステム、またはその組合せに依存する。細胞から産生されるウイルスベクターは、他のプロセス関連不純物および生成物関連不純物ならびにプロセスの間に生じたタンパク質と共に培養上清中に残る。
【0183】
細胞分離および核酸処理：ベクター産生細胞、細胞デブリ、および他の微粒子不純物は、濾過工程を使用して上清から分離することができる。好適なフィルターとしては、連続して２つまたはそれ以上のフィルターを含むものが挙げられ、再生セルロース繊維、無機フィルター助剤もしくは有機樹脂と組み合わされたセルロース繊維、またはそれらの任意の組合せ、ならびに高分子フィルターを利用してもよい。例えば、ナイロンフィルター、ポリプロピレン（ＰＥ）フィルター、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを使用することにより、細胞デブリおよび他の微粒子不純物の効果的な除去を達成することができ、
ならびに、結果として、許容可能な回収をもたらし得る。多段階処理を使用することにより、ベクター収量および不純物減少を向上させることができる。例示的な二段階または三段階プロセスは、細胞、大きな沈殿物、および細胞デブリを除去するための粗フィルターと、その後の０．６５、０．４５、０．２２、または０．２マイクロメートルの公称孔径を有するポリシング第二段階フィルターとからなるであろう。最適な組合せは、デプスフィルターサイズのグレーディング、細胞保持能力、およびフィルター接触表面とウイルスベクターおよび不純物との相互作用の関数であり得る。あるいは、清澄化のために段階操作を実行してもよく、遠心分離を使用する単一段階操作と、その後の０．６５、０．４５、０．２２、または０．２マイクロメートルの公称孔径を有するポリシング段階濾過とを含んでもよい。概して、清澄化アプローチは、これらに限定されるわけではないが、以下の、デッドエンド濾過、精密濾過、遠心分離、および深層濾過のうちの１つまたはそれ以上の組合せを含み、適する清澄度または濁り度の上清ならびに後続の精製工程にとって好適な、粒状物質の不在を提供する。例えば、５～１０マイクロメートルおよび１．２～２．０マイクロメートルの深層濾過を含む２段階深層濾過を、その後の０．２～０．６５μｍの膜濾過と組み合わせて使用することができる。
ならびに、結果として、許容可能な回収をもたらし得る。多段階処理を使用することにより、ベクター収量および不純物減少を向上させることができる。例示的な二段階または三段階プロセスは、細胞、大きな沈殿物、および細胞デブリを除去するための粗フィルターと、その後の０．６５、０．４５、０．２２、または０．２マイクロメートルの公称孔径を有するポリシング第二段階フィルターとからなるであろう。最適な組合せは、デプスフィルターサイズのグレーディング、細胞保持能力、およびフィルター接触表面とウイルスベクターおよび不純物との相互作用の関数であり得る。あるいは、清澄化のために段階操作を実行してもよく、遠心分離を使用する単一段階操作と、その後の０．６５、０．４５、０．２２、または０．２マイクロメートルの公称孔径を有するポリシング段階濾過とを含んでもよい。概して、清澄化アプローチは、これらに限定されるわけではないが、以下の、デッドエンド濾過、精密濾過、遠心分離、および深層濾過のうちの１つまたはそれ以上の組合せを含み、適する清澄度または濁り度の上清ならびに後続の精製工程にとって好適な、粒状物質の不在を提供する。例えば、５～１０マイクロメートルおよび１．２～２．０マイクロメートルの深層濾過を含む２段階深層濾過を、その後の０．２～０．６５μｍの膜濾過と組み合わせて使用することができる。
【0184】
上清は、宿主細胞によって生成された核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）不純物または一過性トランスフェクションプロセスの産物を含有する。そのような核酸は、適するヌクレアーゼ、例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（カタログ番号１．０１６９７．００１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（商標））あるいは求めていないまたは夾雑ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを排除する目的のために当技術分野において一般的に使用される任意の他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅを使用することによって分解することができる。全ての形態のＤＮＡおよびＲＮＡ（一本鎖、二本鎖の直鎖状または環状）を攻撃または分解することによるそのようなヌクレアーゼの機能が、上清の調製のために、細胞分離操作の前または後に実行される。一部の実施形態では、使用するヌクレアーゼの濃度は、１～１００単位／ｍＬの範囲内であり、それらは、細胞分離単位操作の前または後に加えられ、許容可能なレベルへの核酸の消化のために、２０～３７℃において５～６０分の、または可能性のある２～８℃において一晩の、上清培養物によってインキュベートすることができる。あるいは、ヌクレアーゼのそのような添加なしに、ヌクレアーゼ酵素分泌を担う非ベクター産生細胞を加えることができ、あるいは、ＤＮＡ／ＲＮＡ不純物の除去に適する沈殿剤を使用して、選択的沈殿を実行することができる。
【0185】
ウイルスベクターの精製：ウイルスベクターの精製は、ウイルスベクター産物ならびに、導入遺伝子発現カセットの上流のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって媒介される導入遺伝子タンパク質夾雑物などの他のタンパク質関連不純物および非タンパク質関連不純物を含む上清から機能的ベクターを分離する工程を伴う。上清は、図１Ａおよび１Ｂに概説されるように、精製のいくつかの段階、例えば、クロマトグラフィーの潜在的複数段階、ＴＦＦ、および精密濾過プロセスを受ける。原体を実現するために、後続の精製が実行される。
【0186】
一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の連続したクロマトグラフィー工程は、より高いウイルスベクター粒子純度を達成するため、および夾雑タンパク質、核酸、エンドトキシン、および他の産物関連バリアントの除去を確保するために有用であり得る。高いウイルスベクター粒子純度は、疾患を治療するためのヒト対象での使用のためのエンベロープウイルスベクターの製造の要件である。連続するクロマトグラフィー工程は、異なる樹脂を使用することができ、異なる順序において連続して実行することができ、機能的ウイルスベクターのより高い回収率および最終医薬製品中の不純物の最小化のために、最適化することができる。例えば、図１Ｂに示されるように、２つの連続したクロマトグラフィー工程によって達成されるベクター粒子精製は、ウイルスベクター捕捉クロマトグラフィー（第１のクロマトグラフィー精製）と、その後の、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィー（第２のクロマトグラフィー精製）によってコードされる導入遺伝子タンパク質とを採用してもよい。ウイルスベクター捕捉クロマトグラフィー工程および導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィー工程は、任意の順序、例えば、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィー工程が最初に実行され、続いてウイルスベクター捕捉クロマトグラフィー工程が実行される図１Ｂに示される順序とは逆の順序において実行することができる。
【0187】
ある特定の実施形態では、上清が、第１のアニオン交換カラムに適用される。ある特定の実施形態では、アニオン交換カラムは、膜とＤＥＡＥまたはＱ化学との組合せを含む。本発明による使用のためのいくつかの好適なアニオン交換器としては、これらに限定されるわけではないが、ＣＩＭモノリス（ＱまたはＤＥＡＥ、強または弱アニオン交換器、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（ＱまたはＤＥＡＥ、強または弱アニオン交換器、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＥ ６５０Ｃ（ＤＥＡＥ、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ、またはＤＥＡＥ、強または弱アニオン交換器、ＢｉｏＲａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）；ＰＯＲＯＳ ５０（ＨＱ、強アニオン交換器、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＯＲＯＳ ５０（ＸＳ、強アニオン交換器、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＯＲＯＳ ５０（Ｄ、弱アニオン交換器、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＯＲＯＳ ５０（ＰＩ、弱アニオン交換器、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＤＥＡＥ、弱アニオン交換器、Ｃｙｔｉｖａ）；ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｑ、強アニオン交換器、Ｃｙｔｉｖａ）、およびＣａｐｔｏ Ｑ（強アニオン交換器、Ｃｙｔｉｖａ）が挙げられる。
【0188】
アニオン交換カラムは、最初に、製造元の仕様書に従って標準的緩衝液を使用して、または当業者に周知の緩衝液を使用して平衡化される。そのような緩衝液は、これらに限定されるわけではないが、Ｔｒｉｓ、ホスフェート、ヒスチジン塩、および他の賦形剤を、生理的条件に近いｐＨ値において含み得る。例えば、カラムは、１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２の緩衝液、または１０～５０ｍＭのホスフェート、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２の緩衝液によって平衡化される。次いで、試料がロードされ、一方が低塩緩衝液でもう一方が高塩緩衝液である２つの溶出緩衝液が適用される。低塩洗浄および高塩洗浄のそれぞれの後に、フラクションが収集され、標準的技術、例えば、２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍでのＵＶ吸収のモニタリングなどを使用してフラクション中のタンパク質が検出される。アニオン交換器を使用することにより、より高い塩の溶出液からのタンパク質のピークは、ウイルスベクター粒子を含み、それは、低塩または無塩含有溶出緩衝液を使用して希釈され、次の工程のために処理される。あるいは、ベクター含有産物フラクションは希釈され、次の操作工程まで２～１５℃で貯蔵される。アニオン交換カラムの使用を含むウイルスベクター捕捉クロマトグラフィー工程での使用にとって適切な緩衝液は、当分野において周知であり、概して、本質的にカチオン性または双性である。そのような緩衝液としては、これらに限定されるわけではないが、以下の緩衝液イオン：トリエタノールアミン；Ｔｒｉｓ；リン酸ナトリウムもしくはカリウム；Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ；ビスートリスプロパン；Ｎ－メチルジエタノールアミンなどを含む緩衝液が挙げられる。
【0189】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクタークロマトグラフィー工程の溶出液は、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィー工程によってさらに処理することができ、その場合、ウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子タンパク質夾雑物などの所望ではない不純物が捕捉される。ウイルスベクターを含む精製された組成物は、フロースルー産物において受け取られ、ここでウイルスベクターは、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィーマトリックスに特異的に結合することなく、クロマトグラフィー装置を通過する。
【0190】
導入遺伝子不純物質捕捉クロマトグラフィー工程は、以下：導入遺伝子タンパク質夾雑物の相互作用が生じるように架橋する十分なマトリックスを有するポリマーの使用を含み、ここで例えば、親和性、イオン交換性、マルチモーダル、混合モード、または本質的に疎水性であるものなどを含むいずれかの結合基のいくつかも存在する。第２の導入遺伝子不純物質捕捉クロマトグラフィー工程は、ウイルスベクターよって媒介される導入遺伝子タンパク質夾雑物などの不純物の捕捉を伴い、ならびに親和性（例えば、Ｃｙｔｉｖａから入手可能なＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ）、イオン交換（例えば、複数の供給元から入手可能なカチオン交換）、マルチモーダル／混合モード（例えば、Ｃｙｔｉｖａから入手可能なＣａｐｔｏ ＭＭＣ）、および疎水性相互作用（例えば、Ｃｙｔｉｖａから入手可能なＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ）クロマトグラフィー樹脂のうちの１つまたはその組合せを使用する。
【0191】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクター捕捉クロマトグラフィー工程の後に結果として得られる試料は、カラムへの適切な不純物の結合条件およびウイルスベクターの非結合条件を可能にする試料の希釈の後に、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィーマトリックス上にロードされる。例えば、ローディング試料は、これらに限定されるわけではないが、２ ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭ～１２０ｍＭのＣａＣｌ２を伴う、ｐＨ６．５～７．５の、１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌまたは１０～５０ｍＭのホスフェートを含み得、２０ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍの範囲の希釈試料導電率を有する。導入遺伝子不純物質捕捉クロマトグラフィー樹脂は、当業者に既知の平衡化緩衝液、例えば、これらに限定されるわけではないが、０ｍＭ～２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０～３０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭ～７０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２の０～５０ｍＭのＴｒｉｓまたは１０～５０ｍＭのホスフェートを含む緩衝液によって平衡化される。
【実施例1】
【0192】
ウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子タンパク質
ＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩは、血友病Ａの治療における使用のためのウイルスベクターの投与後の血液中において、それぞれＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するように開発されたＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩである。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩ活性は、バイオリアクター細胞培養物、清澄化された上清、精製クロマトグラフィー後に原体において、ならびに精製された医薬製品において、それぞれ、ＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩウイルスベクター作製プロセスの間に得られた。バイオリアクターにおいて作製され、図１Ａに示されるようなプロセスに従って精製された、精製エンベロープウイルスベクターは、医薬製品中にかなりのレベルのタンパク質不純物を含むことが見出された。理論に拘束されるわけではないが、タンパク質不純物は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩ発現カセットの上流のＣＭＶプロモーターによって媒介された導入遺伝子タンパク質の発現に起因して存在し得る。タンパク質不純物（例えば、導入遺伝子タンパク質夾雑物）は、例えば図１Ａに示されたような標準的（すなわち、従来の）下流プロセスワークフローを使用して効率的に精製することができなかった。機能的ウイルスベクターの１Ｅ９ ＴＵあたりの導入遺伝子タンパク質の活性は、図２に示されるように、精製プロセスにおける複数の段階および最終製品試料において一貫していることが見出された。理論に拘束されるわけではないが、ウイルスベクター粒子を捕捉するために利用される精製クロマトグラフィーカラムは、おそらくウイルスベクター産物との導入遺伝子タンパク質夾雑物の同時精製に起因して、導入遺伝子タンパク質夾雑物からエンベロープウイルスベクターを分離することにおいてあまり効率的でないことが見出された。
ＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩは、血友病Ａの治療における使用のためのウイルスベクターの投与後の血液中において、それぞれＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するように開発されたＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩである。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩ活性は、バイオリアクター細胞培養物、清澄化された上清、精製クロマトグラフィー後に原体において、ならびに精製された医薬製品において、それぞれ、ＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＬＶ－ＦＶＩＩＩウイルスベクター作製プロセスの間に得られた。バイオリアクターにおいて作製され、図１Ａに示されるようなプロセスに従って精製された、精製エンベロープウイルスベクターは、医薬製品中にかなりのレベルのタンパク質不純物を含むことが見出された。理論に拘束されるわけではないが、タンパク質不純物は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ／ＦＶＩＩＩ発現カセットの上流のＣＭＶプロモーターによって媒介された導入遺伝子タンパク質の発現に起因して存在し得る。タンパク質不純物（例えば、導入遺伝子タンパク質夾雑物）は、例えば図１Ａに示されたような標準的（すなわち、従来の）下流プロセスワークフローを使用して効率的に精製することができなかった。機能的ウイルスベクターの１Ｅ９ ＴＵあたりの導入遺伝子タンパク質の活性は、図２に示されるように、精製プロセスにおける複数の段階および最終製品試料において一貫していることが見出された。理論に拘束されるわけではないが、ウイルスベクター粒子を捕捉するために利用される精製クロマトグラフィーカラムは、おそらくウイルスベクター産物との導入遺伝子タンパク質夾雑物の同時精製に起因して、導入遺伝子タンパク質夾雑物からエンベロープウイルスベクターを分離することにおいてあまり効率的でないことが見出された。
【実施例2】
【0193】
精製の際の夾雑導入遺伝子タンパク質産物の減少
夾雑導入遺伝子タンパク質産物を減少させるため、図１Ｂに示されるように、下流プロセスワークフローのウイルスベクター精製全体を向上させるためにウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子タンパク質を捕捉するために、第２の精製クロマトグラフィー樹脂または媒体を調査した。図３Ａおよび３Ｂにおいて、第２の精製クロマトグラフィーカラムを追加してＥｘｐ１およびＥｘｐ２を実行した。カラムＸＫ１６／２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５４５０）に、２３ｍＬのカラム容量（ＣＶ）の１１．５ｃｍの床高さまでＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂（カタログ番号１７－５４５０－０１）を充填した。カラムおよびＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂は、Ｃｙｔｉｖａ（ＵＳＡ）から購入した。出発材料は、４トランスフェクションプロセスを用いる、ＨＥＫ２９３細胞（自前）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現（カタログ番号１２３３８－００２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）作製培地、プラスミド（自前）、およびＰＥＩｐｒｏトランスフェクション剤（カタログ番号１１５－４００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いる頓用攪拌タンクバイオリアクターを使用して懸濁培養において作製した。
夾雑導入遺伝子タンパク質産物を減少させるため、図１Ｂに示されるように、下流プロセスワークフローのウイルスベクター精製全体を向上させるためにウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子タンパク質を捕捉するために、第２の精製クロマトグラフィー樹脂または媒体を調査した。図３Ａおよび３Ｂにおいて、第２の精製クロマトグラフィーカラムを追加してＥｘｐ１およびＥｘｐ２を実行した。カラムＸＫ１６／２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５４５０）に、２３ｍＬのカラム容量（ＣＶ）の１１．５ｃｍの床高さまでＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂（カタログ番号１７－５４５０－０１）を充填した。カラムおよびＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂は、Ｃｙｔｉｖａ（ＵＳＡ）から購入した。出発材料は、４トランスフェクションプロセスを用いる、ＨＥＫ２９３細胞（自前）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現（カタログ番号１２３３８－００２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）作製培地、プラスミド（自前）、およびＰＥＩｐｒｏトランスフェクション剤（カタログ番号１１５－４００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いる頓用攪拌タンクバイオリアクターを使用して懸濁培養において作製した。
【0194】
第２の精製クロマトグラフィー樹脂は、特定の導入遺伝子タンパク質夾雑物を捕捉し、ウイルス粒子がカラムに特異的に結合されることなくウイルスベクターがクロマトグラフィーカラムを通過することを可能にした。１カラムプロセスを、導入遺伝子タンパク質夾雑物を捕捉するための第２のクロマトグラフィー樹脂としてＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂を伴う２カラムプロセスと比較し、２カラムプロセスは、医薬製品中におけるより低いレベルのＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＶＩＩＩタンパク質夾雑物を可能にすることを見出した。導入遺伝子タンパク質夾雑物のレベルが、ＬＶ－ＦＶＩＩＩ試料において２０ＩＵ／ｍＬ～３ＩＵ／ｍＬへ（Ｅｘｐ１）、ならびにＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ試料において１２９ＩＵ／ｍＬ～６３ＩＵ／ｍＬへと減少することが見出された（図３Ａ）。これは、それぞれ、ＬＶ－ＦＶＩＩＩおよびＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮウイルスベクター試料における導入遺伝子タンパク質夾雑物レベルの約５１％および４８％の総減少に一致する（図３Ｂ）。図３Ａおよび３Ｂにおいて、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂へのローディングのためのＬＶ－ＦＶＩＩＩおよびＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ試料を、ｐＨ７．２の、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）のスクロース、および０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマーにおいて製剤化した。
【実施例3】
【0195】
精製の間の夾雑導入遺伝子タンパク質の減少の増強
２カラム精製ワークフローでの導入遺伝不純物捕捉を改良するため、ウイルスベクター精製の改良の可能性に対して、ＣａＣｌ２の追加を調査した。１０ｍＭのＣａＣｌ２を、捕捉クロマトグラフィーの前にウイルスベクター試料に加え（＋ＣａＣｌ２）、または加えず（－ＣａＣｌ２）、ロード試料を１０分間インキュベートした後、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィー媒体を使用する精製カラムに試料を供した。第２のクロマトグラフィー精製工程において、カラムにて４５０μＬのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーを実行した。カラムを、分離のためにＦＶＩＩＩに対してはヒスチジン（Ｅｘｐ３）またはＦＶＩＩＩＸＴＥＮに対してはホスフェート（Ｅｘｐ４）を含む製剤化緩衝液を伴う１０体積の樹脂によって平衡化した。実験において、ウイルスベクター試料を、結果として得られる試料５００μｌを、１０ｍＭのＣａＣｌ２と混合して（＋ＣａＣｌ２）、または混合せず（－ＣａＣｌ２）、カラムにロードした。１０分間の接触時間の後、フロースルー中のベクター産物を回収するために、製剤化緩衝液をロードした。
２カラム精製ワークフローでの導入遺伝不純物捕捉を改良するため、ウイルスベクター精製の改良の可能性に対して、ＣａＣｌ２の追加を調査した。１０ｍＭのＣａＣｌ２を、捕捉クロマトグラフィーの前にウイルスベクター試料に加え（＋ＣａＣｌ２）、または加えず（－ＣａＣｌ２）、ロード試料を１０分間インキュベートした後、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィー媒体を使用する精製カラムに試料を供した。第２のクロマトグラフィー精製工程において、カラムにて４５０μＬのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーを実行した。カラムを、分離のためにＦＶＩＩＩに対してはヒスチジン（Ｅｘｐ３）またはＦＶＩＩＩＸＴＥＮに対してはホスフェート（Ｅｘｐ４）を含む製剤化緩衝液を伴う１０体積の樹脂によって平衡化した。実験において、ウイルスベクター試料を、結果として得られる試料５００μｌを、１０ｍＭのＣａＣｌ２と混合して（＋ＣａＣｌ２）、または混合せず（－ＣａＣｌ２）、カラムにロードした。１０分間の接触時間の後、フロースルー中のベクター産物を回収するために、製剤化緩衝液をロードした。
【0196】
フロースルー試料中に残留するＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＶＩＩＩ活性を、発色アッセイによって測定した（上記の材料および方法を参照のこと）。図４は、ウイルスベクター試料がＬＶ－ＦＶＩＩＩと混合される、ヒスチジンを含む製剤化緩衝液のフロースルーまたはウイルスベクター試料がＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮと混合される、ホスフェートを含む製剤化緩衝液のフロースルー中の残留するＦＶＩＩＩＸＴＥＮまたはＦＶＩＩＩ活性を示している。
【0197】
図４に示されるように、「１カラムプロセス」とラベルされた棒は、１つの専用の精製クロマトグラフィー工程を伴う下流ワークフローを示しており、その一方で、「２カラムプロセス」とラベルされた棒は、２つの専用の精製クロマトグラフィー工程を伴う下流ワークフローを示している。Ｅｘｐ３において、ＦＶＩＩＩタンパク質活性は、＋ＣａＣｌ２条件では１５．１ＩＵ／ｍＬ～２．４ＩＵ／ｍＬに減少し、－ＣａＣｌ２条件では４．８ＩＵ／ｍＬに減少した。Ｅｘｐ４において、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮタンパク質活性は、＋ＣａＣｌ２条件では１６８．０ＩＵ／ｍＬ～１３．４ＩＵ／ｍＬに減少し、－ＣａＣｌ２条件では２８．０ＩＵ／ｍＬに減少した。図４に示されるように、プレカラム試料中のＣａＣｌ２の存在は、ウイルスベクター精製の改良を提供する。
【実施例4】
【0198】
リサイクルモードを使用する夾雑導入遺伝子タンパク質の減少の増強
導入遺伝子タンパク質夾雑物を含む試料を、導入遺伝子不純物捕捉精製クロマトグラフィーカラムを複数回通過させるリサイクルモード技術を使用したさらなる減少のために、導入遺伝子タンパク質夾雑物減少を調査した。ＬＶ－ＦＶＩＩＩウイルスベクターとヒスチジン緩衝液中に存在するＦＶＩＩＩタンパク質不純物とを含むロード試料（すなわち、ロード）を、１０ｍＭのＣａＣｌ２でスパイクし（＋ＣａＣｌ２）、１０分間インキュベートして、 ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィーカラムを通過させた。調製したロード試料を、６分の滞留時間（ＲＴ）においてカラムを通過させ、「ＦＴ＿パス１」と呼ばれるカラムのフロースルーを収集し、不純物の活性または濃度について分析した。次いで、「ＦＴ＿パス１」を、１０ｍＭのＣａＣｌ２濃度に調整し、１０分間インキュベートして、カラムを洗浄または再生することなく再び同じカラムにロードした。第２の通過のフロースルーを「ＦＴ＿パス２」と呼んだ。同様に、ＣａＣｌ２濃度の調整と、前のパスと同様のインキュベーション時間の後に、ＦＴ＿パス２ロード試料を、三度目としてカラムを通過させた。三度目のパスのフロースルーを「ＦＴ＿パス３」として収集した。ロード試料、ＦＴ＿パス１試料、ＦＴ＿パス２試料、およびＦＴ＿パス３試料を使用して、不純物活性の含量を特定した。図５に示されるように、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィーによって精製される試料中に存在する総活性量は９８ＩＵであることが見出された。この活性は、複数回のサイクルの後、５２ＩＵ（ＦＴ＿パス１）、４２ＩＵ（ＦＴ＿パス２）、および１０ＩＵ（ＦＴ＿パス３）に減少した。夾雑ＦＶＩＩＩタンパク質活性の量の全減少は、３回のサイクルの後、９０％であることが見出された。
導入遺伝子タンパク質夾雑物を含む試料を、導入遺伝子不純物捕捉精製クロマトグラフィーカラムを複数回通過させるリサイクルモード技術を使用したさらなる減少のために、導入遺伝子タンパク質夾雑物減少を調査した。ＬＶ－ＦＶＩＩＩウイルスベクターとヒスチジン緩衝液中に存在するＦＶＩＩＩタンパク質不純物とを含むロード試料（すなわち、ロード）を、１０ｍＭのＣａＣｌ２でスパイクし（＋ＣａＣｌ２）、１０分間インキュベートして、 ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性クロマトグラフィーカラムを通過させた。調製したロード試料を、６分の滞留時間（ＲＴ）においてカラムを通過させ、「ＦＴ＿パス１」と呼ばれるカラムのフロースルーを収集し、不純物の活性または濃度について分析した。次いで、「ＦＴ＿パス１」を、１０ｍＭのＣａＣｌ２濃度に調整し、１０分間インキュベートして、カラムを洗浄または再生することなく再び同じカラムにロードした。第２の通過のフロースルーを「ＦＴ＿パス２」と呼んだ。同様に、ＣａＣｌ２濃度の調整と、前のパスと同様のインキュベーション時間の後に、ＦＴ＿パス２ロード試料を、三度目としてカラムを通過させた。三度目のパスのフロースルーを「ＦＴ＿パス３」として収集した。ロード試料、ＦＴ＿パス１試料、ＦＴ＿パス２試料、およびＦＴ＿パス３試料を使用して、不純物活性の含量を特定した。図５に示されるように、導入遺伝子不純物捕捉クロマトグラフィーによって精製される試料中に存在する総活性量は９８ＩＵであることが見出された。この活性は、複数回のサイクルの後、５２ＩＵ（ＦＴ＿パス１）、４２ＩＵ（ＦＴ＿パス２）、および１０ＩＵ（ＦＴ＿パス３）に減少した。夾雑ＦＶＩＩＩタンパク質活性の量の全減少は、３回のサイクルの後、９０％であることが見出された。
【実施例5】
【0199】
賦形剤を用いずＴｒｉｓ緩衝系を使用した精製における夾雑導入遺伝子タンパク質の減少
改良された下流ワークフロースキーム（例えば、図１Ｂ、図６Ａ、および図６Ｂに示されるような）において第２のクロマトグラフィー精製工程を使用する夾雑導入遺伝子タンパク質のさらなる除去のために、ベクターの精製を調査した。改良されたスキームにおいて、ベクター産物は、特に夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去のために設計されたクロマトグラフィー媒体に供される。本発明の改良された下流ワークフロースキームでは、夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去の工程は、第２のクロマトグラフィー精製工程であってもよく（図６Ａに示されるように）、または第１のクロマトグラフィー精製工程であってもよい（図６Ｂに示されるように）。
改良された下流ワークフロースキーム（例えば、図１Ｂ、図６Ａ、および図６Ｂに示されるような）において第２のクロマトグラフィー精製工程を使用する夾雑導入遺伝子タンパク質のさらなる除去のために、ベクターの精製を調査した。改良されたスキームにおいて、ベクター産物は、特に夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去のために設計されたクロマトグラフィー媒体に供される。本発明の改良された下流ワークフロースキームでは、夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去の工程は、第２のクロマトグラフィー精製工程であってもよく（図６Ａに示されるように）、または第１のクロマトグラフィー精製工程であってもよい（図６Ｂに示されるように）。
【0200】
図７は、第２のクロマトグラフィー精製の精製効率に対するローディング試料中の塩の濃度の影響を示しており、ここで第２のクロマトグラフィー精製は、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂の使用を含む。この実験において、アニオン交換（ＡＥＸ）カラムを使用する第１のクロマトグラフィー精製を実行し、４００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液によってＡＥＸカラムからベクター産物を溶出させた。次いで、ＡＥＸ溶出液（すなわち、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を含む第２のクロマトグラフィー精製に対するロード試料）を、４００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ５）または１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ６）のどちらかの塩濃度を有するように調整した。Ｅｘｐ５では、調整されたロード試料は、ｐＨ７．２にて、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中における４００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、および２．０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んだ。Ｅｘｐ６では、ロード試料は、ｐＨ７．２にて、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中における１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、および２．０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んだ。
【0201】
図７Ａは、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程の前（黒色の棒；「ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔロード」）および後（灰色の棒；「ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ産物」）に検出された、回収された全機能的レンチウイルスベクターの関数としてのＦＶＩＩＩＸＴＥＮのレベルを示している。上記において説明されるＥｘｐ５およびＥｘｐ６に従って、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔロード試料の調整を実行した。図７Ａに示されるように、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程が４００ｍＭのＮａＣｌを含むロード試料を使用して実行される場合（Ｅｘｐ５）、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程は、結果として、１９４．６ＩＵ／１Ｅ９形質導入単位（ＴＵ）から１５．３ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵへのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の減少を生じ、これは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の９２％の減少に相当した。比較において、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程が１００ｍＭのＮａＣｌを含むロード試料を使用して実行される場合（Ｅｘｐ５）、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程は、結果として、１２７．６ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵから６４ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵへのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の減少を生じ、これは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の５０％の減少に相当した。Ｔｒｉｓ緩衝化ロード試料を使用することにより、ロード試料が４００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ５）に調整された場合、１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ６）と比較して、夾雑ＦＶＩＩＩＸＴＥＮの除去において約２倍の向上を達成した。
【0202】
図７Ｂは、総レンチウイルス粒子数（ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４）の関数として測定されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮレベルに対する、４００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ５）または１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｘｐ６）に調整されたロード試料の結果を示している。図７Ｂに示されるように、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程が４００ｍＭのＮａＣｌを含むロード試料を使用して実行される場合（Ｅｘｐ５）、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程は、結果として、１６７．９ ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４から１６．３ ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４へのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の減少を生じ、これは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の９０％の減少に相当した。比較において、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程が１００ｍＭのＮａＣｌを含むロード試料を使用して実行される場合（Ｅｘｐ５）、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ精製工程は、結果として、１２５．６ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４から７５．８ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４へのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の減少を生じ、これは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の４０％の減少に相当した。
【実施例6】
【0203】
賦形剤を用いたリン酸緩衝系を使用する精製における夾雑導入遺伝子タンパク質の減少
ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の減少に対するＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用する第２のクロマトグラフィー精製工程の精製効率を、賦形剤を含むリン酸緩衝系を使用して調査した。この実験において、ロード試料を、４００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＣａＣｌ２、ならびに１０ｍＭのリン酸ナトリウム、スクロース（３ｗ／ｖ％）、およびポロクサマー（０．０５ｗ／ｖ％）を含むように調整した。図８に示されるように、試料をＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔカラムにおいて１０分間の滞留時間においてインキュベートすることができる場合、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮの総活性は、精製前の１７６８ＩＵから精製後の４２３ＩＵへ減少し、これは、単一パスにおけるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の７６％の減少に相当した。４００ｍＭのＮａＣｌホスフェート緩衝化ロードの機能的ベクターの回収に関して、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性は、精製前の３２４ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵから精製後の８６ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵに減少し、これは、不純物レベルにおける７３％の減少を表し；総レンチウイルス粒子数の関数として検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性は、精製前の７６６ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４から精製後の１９９ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４に減少し、これは、不純物レベルにおける７４％の減少に相当した。
ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の減少に対するＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用する第２のクロマトグラフィー精製工程の精製効率を、賦形剤を含むリン酸緩衝系を使用して調査した。この実験において、ロード試料を、４００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＣａＣｌ２、ならびに１０ｍＭのリン酸ナトリウム、スクロース（３ｗ／ｖ％）、およびポロクサマー（０．０５ｗ／ｖ％）を含むように調整した。図８に示されるように、試料をＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔカラムにおいて１０分間の滞留時間においてインキュベートすることができる場合、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮの総活性は、精製前の１７６８ＩＵから精製後の４２３ＩＵへ減少し、これは、単一パスにおけるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質の７６％の減少に相当した。４００ｍＭのＮａＣｌホスフェート緩衝化ロードの機能的ベクターの回収に関して、検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性は、精製前の３２４ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵから精製後の８６ＩＵ／１Ｅ９ ＴＵに減少し、これは、不純物レベルにおける７３％の減少を表し；総レンチウイルス粒子数の関数として検出されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性は、精製前の７６６ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４から精製後の１９９ＩＵ／１Ｅ６ｎｇ Ｐ２４に減少し、これは、不純物レベルにおける７４％の減少に相当した。
【0204】
１００ｍＭのＮａＣｌ（ＮａＣｌ濃度の調整は行わず）を含む同じリン酸緩衝化されたロード試料、２カラムプロセスのみを使用する実施例２、ｅｘｐ２（図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）は、結果として、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の５１％減少を生じた。比較では、この実験において、リン酸緩衝化ロード試料が４００ｍＭのＮａＣｌに調整される場合、７０％を超えるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ活性の減少が観察され、これは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ夾雑導入遺伝子タンパク質のレベルの減少の著しい増強を表している。
【実施例7】
【0205】
２００ｍＭ～６００ｍＭの塩濃度においてＴｒｉｓおよびリン酸緩衝液を使用する精製における夾雑導入遺伝子タンパク質の減少
改良された下流ワークフロースキーム（例えば、図１Ｂ、図６Ａ、および図６Ｂに示されるような）においてクロマトグラフィー精製工程を使用する夾雑導入遺伝子タンパク質の除去のために、ベクターの精製を調査した。改良されたスキームにおいて、ベクター産物は、ある範囲の塩濃度を含むＴｒｉｓまたはリン酸緩衝液のどちらかに含まれる、特に夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去のために設計されたクロマトグラフィー媒体に供される。本発明の改良された下流ワークフロースキームでは、夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去工程は、第２のクロマトグラフィー精製工程であってもよく（図６Ａに示されるように）、あるいは第１のクロマトグラフィー精製工程であってもよい（図６Ｂに示されるように）。
改良された下流ワークフロースキーム（例えば、図１Ｂ、図６Ａ、および図６Ｂに示されるような）においてクロマトグラフィー精製工程を使用する夾雑導入遺伝子タンパク質の除去のために、ベクターの精製を調査した。改良されたスキームにおいて、ベクター産物は、ある範囲の塩濃度を含むＴｒｉｓまたはリン酸緩衝液のどちらかに含まれる、特に夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去のために設計されたクロマトグラフィー媒体に供される。本発明の改良された下流ワークフロースキームでは、夾雑導入遺伝子タンパク質不純物の除去工程は、第２のクロマトグラフィー精製工程であってもよく（図６Ａに示されるように）、あるいは第１のクロマトグラフィー精製工程であってもよい（図６Ｂに示されるように）。
【0206】
図９は、第２のクロマトグラフィー精製工程の精製効率に対するローディング試料中の塩の濃度の影響を示しており、ここで第２のクロマトグラフィー精製工程は、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂の使用を含む。 この実験において、アニオン交換（ＡＥＸ）カラムを使用する第１のクロマトグラフィー精製工程を実行し、Ｔｒｉｓまたはホスフェートのどちらかと２００ｍＭ～６００ｍＭの総塩濃度とを含む溶出緩衝液によって、ＡＥＸカラムからベクター産物を溶出させた。ＡＥＸ溶出液（すなわち、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を含む第２のクロマトグラフィー精製に対するロード試料）は、ＡＥＸプールの塩濃度が＜６００ｍＭの場合は、調整を必要としなかったが、ＡＥＸプールの塩濃度が＞６００ｍＭのＮａＣｌの場合は、調整を必要とした。調整されたロード試料は、２００ｍＭ～６００ｍＭの範囲のＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中の２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２＋０．３；または、２００ｍＭ～６００ｍＭの範囲のＮａＣｌ、リン酸緩衝液中の２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２＋０．３、のどちらかを含んだ。次いで、調整されたロード試料を、タンパク質不純物に結合し、精製されたベクター製品としてエンベロープベクターが通過することができる、第２のクロマトグラフィー樹脂に適用した。
【0207】
図９に示されるように、ベクター製品中のタンパク質不純物活性値を活性アッセイの定量化の限界未満（＜ＬｏＱ）に減少させつつ、ＦＶＩＩＩタンパク質活性の量は、１０ＩＵ超の活性値～１ＩＵ未満まで低下し、これは、夾雑導入遺伝子活性において少なくとも１０倍の減少を実証しており、その一方で、ベクター製品試料中のタンパク質不純物活性値を活性アッセイの定量化の限界未満（＜ＬｏＱ）に減少させた。したがって、試料からの導入遺伝子タンパク質不純物の除去は、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーにおいてローディング緩衝液としてＴｒｉｓ緩衝液（黒色の棒を黒色斜線の棒と比較する）またはリン酸緩衝液（灰色の棒を灰色斜線の棒と比較する）のどちらが使用されるかにかかわらず、＞９０％において達成された。さらに、夾雑導入遺伝子産物の除去は、緩衝種および塩濃度にかかわらず、一貫して達成された。したがって、これらの実験は、機能的エンベロープウイルスベクターの著しい損失なしに導入遺伝子夾雑物を除去するための、改良された精製プロセスの有効性を実証しており、ならびに、改良された精製プロセスにおける様々な緩衝種および塩濃度の全般的な適性を実証している。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0156】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮出願第６３／０４３／６９７号および２０２０年８月６日に出願された米国仮出願第６３／０６２，１２０号に対する優先権の利益を主張するものである。先述の仮出願の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ書式で電子的に提出された配列表を含み、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０２１年９月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、７１８２０６＿ＳＡ９－４７７ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、サイズは５３，７０７バイトである。
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮出願第６３／０４３／６９７号および２０２０年８月６日に出願された米国仮出願第６３／０６２，１２０号に対する優先権の利益を主張するものである。先述の仮出願の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ書式で電子的に提出された配列表を含み、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０２１年９月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、７１８２０６＿ＳＡ９－４７７ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、サイズは５３，７０７バイトである。
【国際調査報告】