特表 2023-537610 ゲノム及びサブゲノムウイルスＲＮＡのＲＮＡｉを介した調節のための基質配列

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-04

(54)【発明の名称】ゲノム及びサブゲノムウイルスＲＮＡのＲＮＡｉを介した調節のための基質配列

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230828BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20230828BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12Q1/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023510394

(86)(22)【出願日】2021-08-12

(85)【翻訳文提出日】2023-03-15

(86)【国際出願番号】 US2021045790

(87)【国際公開番号】W WO2022036128

(87)【国際公開日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】63/064,446

(32)【優先日】2020-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523049063

【氏名又は名称】スペラタム バイオファーマ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＥＲＡＴＵＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】マリン－ミュラー、クリスチャン ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】マルティネス、オスバルド ベガ

(72)【発明者】

【氏名】バルベルデ－エルナンデス、ファン カルロス

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA08

4B063QA18

4B063QQ52

4B063QS40

(57)【要約】

ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって：一つ以上の７－ｍｅｒをｇＲＮＡからスクリーニングするステップと、第一数の前記一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップと、前記一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上のヒット部位を特徴づけるステップと、前記７－ｍｅｒの各々についてゲノム領域当たりのヒットを算出するステップと、第二数の前記７－ｍｅｒを選択するステップと、前記７－ｍｅｒの各々に関連する一つ以上の１５－ｍｅｒの頻度行列を作成するステップと、前記７－ｍｅｒの各々について一つ以上の生成された１５－ｍｅｒを生成させるステップと、前記一つ以上の生成された１５－ｍｅｒの各々について前記ｇＲＮＡにおけるヒットを特徴づけるステップと、累積ヒット頻度及び長さに基づいてサマリーインデックスを算出するステップと、一つ以上の生成した特徴及び一つ以上の構造的特徴に基づいて前記ＲＮＡｉ配列を選択するステップと、を含む、方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって：
ａ．潜在的７－ｍｅｒ配列を識別するステップと、
ｂ．一つ以上のヒット部位を登録するステップであって、前記一つ以上のヒット部位は、前記潜在的７－ｍｅｒ配列が存在するゲノムＲＮＡ配列中の一つ以上の位置である、ステップと、
ｃ．前記一つ以上のヒット部位とともに、前記７－ｍｅｒ配列が見いだされた前記ゲノム領域の名称、及び７－ｍｅｒ配列開始位置から始まる登録された１５－ｍｅｒ配列を登録するステップと、
ｄ．前記登録された１５－ｍｅｒ配列を使用して、ヌクレオチド位置頻度行列及び、各位置の最高頻度のヌクレオチドに基づいて各７－ｍｅｒ配列について生成された１５－ｍｅｒを生成させるステップと、
ｅ．前記生成された１５－ｍｅｒ配列を使用して、推定ＲＮＡｉ分子の一つ以上のヒットを予測するステップと、
ｆ．前記一つ以上の登録されたヒット部位についてヒット可能性指数を算出するステップと、
ｇ．総合指数を生成させるステップと、
ｈ．サマリー行列を作成するステップとを含む、方法。

【請求項2】

前記潜在的７－ｍｅｒ配列を、標的ＲＮＡ中の前記最多７－ｍｅｒについてスクリーニングすることによって識別する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記推定ＲＮＡｉ分子に対する前記一つ以上のヒットを完全マッチに基づいて予測する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒット可能性指数を、マッチ配列ΔＧ値並びにヒット部位から３０ヌクレオチド上流及び下流のＡＵ含有割合に基づいて、各ヒット部位に対して重みを割り当てる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ヒット可能性指数を次式：

【数1】

式中、ｎは、ｍヒット部位を予測するために使用される前記生成された１５－ｍｅｒであり、Ｈは前記ヒット可能性であり、ΔＧは、塩基対形成のみを考慮したマッチが起こるために必要な自由エネルギーであり、ｐ（ＡＵ）は、前記ヒット部位から３０ｎｔ上流及び下流の割合である、により算出する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記総合指数を次式：

【数2】

式中、ＩＧは、前記ヒットの効果をまとめる前記総合指数であり、Ａは、前記マッチの前記ｎの生成された１５－ｍｅｒのヒット量である、により算出する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記サマリー行列が、前記７－ｍｅｒ、前記７－ｍｅｒの生成された１５－ｍｅｒ、センス鎖、前記ＲＮＡｉ提案配列、前記ヒット可能性指数、及び前記総合指数を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記サマリー行列が提案されたアンチセンス鎖をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記サマリー行列が、シード配列ＧＣ含有量とガイド鎖ＧＣ含有量とをさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって：
ａ．一つ以上の７－ｍｅｒをｇＲＮＡからスクリーニングするステップと、
ｂ．第一数の前記一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第一数は、前記一つ以上の７－ｍｅｒの前記頻度に基づく、ステップと、
ｃ．前記一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上のヒット部位を特徴づけるステップと、
ｄ．前記一つ以上の７－ｍｅｒの各々についてゲノム領域当たりのヒットを算出するステップと、
ｅ．第二数の前記一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第二数がｓｇＲＮＡ中の前記最多ヒットに基づく、ステップと、
ｆ．前記一つ以上の７－ｍｅｒの各々に関連する一つ以上の１５－ｍｅｒの頻度行列を作成するステップと、
ｇ．最高頻度のヌクレオチドに基づいて、前記一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上の生成された１５－ｍｅｒを生成させるステップと、
ｈ．前記一つ以上の生成された１５－ｍｅｒの各々について前記ｇＲＮＡにおけるヒットを特徴づけるステップと、
ｉ．累積ヒット頻度及び長さに基づいてサマリーインデックスを算出するステップと、
ｊ．一つ以上の生成した特徴及び一つ以上の構造的特徴に基づいて第三数の前記ＲＮＡｉ配列を選択するステップと、を含む、方法。

【請求項11】

前記第一数が５００である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第二数が５０である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記第三数が５である、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記一つ以上の生成した特徴及び前記一つ以上の構造的特徴がサマリーインデックスの関数である、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本願は、２０２０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０６４，４４６号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

本発明は、概して、ＲＮＡｉ配列の分野に関する。さらに詳細には本発明は、ＲＮＡｉ配列識別のための装置、方法、及びシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患の世界的パンデミックにつながるウイルスの大流行を引き起こした。現在の状況の結果、世界的な公衆衛生上の緊急事態が発生している。

【0004】

世界保健機関（ＷＨＯ）によると、ヒト病原体として、２０２０年８月の時点で、１８００万を超えるＣｏｖｉｄ－１９の症例が世界中で確認されており、少なくとも６８万７千人が死亡している。２０２１年８月までで、世界中の症例及び死亡者数は増加して２億人を超え、少なくとも４００万人が死亡している。

【0005】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトからヒトへ容易に伝染し、複数の大陸に広がり、２０２０年１月３０日にＷＨＯが国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）を宣言するに至ったと現在では理解されている。

【0006】

科学者によって、実行できる新しい治療の開発が進められてきたが、そのような非常に実験的な治療の有効性や安全性はまだ立証されておらず、多くの疑問が未解決のままである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用のワクチンや他の抗ウイルス治療が非常に必要とされているが、まだ多くは有効性に欠ける。

【0007】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックの治療にとって有効性は重要であるが、そのような治療は安全であることも示されなければならない。実際、広範な有効性試験に取りかかる前に、小規模の安全性試験を実施して安全性を証明しなければならず、その結果、さらに時間がかかる。

【0008】

したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療の成功と認可までの潜在的時間を最大化するために、有効性と安全性の可能性を高めた治療を提供することが望ましい。

【発明の概要】

【0009】

一実施形態において、本開示の発明は、ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって、潜在的７－ｍｅｒ配列を識別するステップと、一つ以上のヒット部位を登録するステップであって、前記一つ以上のヒット部位が、潜在的７－ｍｅｒ配列が存在するゲノムＲＮＡ配列中の一つ以上の位置であるステップと、を含む方法であり得る。一実施形態において、方法は、一つ以上のヒット部位と共に、７－ｍｅｒ配列がいだされたゲノム領域の名称と、７－ｍｅｒ配列開始位置から始まる登録された１５－ｍｅｒ配列を登録するステップと、登録された１５－ｍｅｒ配列を使用して、ヌクレオチド位置頻度行列と、各位置の最高頻度のヌクレオチドに基づいて各７－ｍｅｒ配列について生成させた１５－ｍｅｒを生成させるステップと、生成させた１５－ｍｅｒ配列を使用して、推定ＲＮＡｉ分子に対して一つ以上のヒットを予測するステップと、をさらに含んでもよい。一実施形態において、方法はまた、一つ以上の登録されたヒット部位のヒット可能性指数を算出するステップと、総合指数を生成するステップと、サマリー行列を作成するステップと、を含んでもよい。

【0010】

一実施形態において、潜在的７－ｍｅｒ配列は、標的ＲＮＡ中の最多７－ｍｅｒについてスクリーニングすることによって識別できる。一実施形態において、推定ＲＮＡｉ分子に対する一つ以上のヒットは、完全マッチに基づいて予測できる。一実施形態において、ヒット可能性指数は、マッチ配列ΔＧ値並びにヒット部位から３０ヌクレオチド上流及び下流のＡＵ含有割合に基づいて各ヒット部位に対して重みを割り当てることができる。ヒット可能性指数は、次式によって算出できる：

【0011】

【数1】

【0012】

（式中、ｎは、ｍのヒット部位を予測するために使用される生成された１５－ｍｅｒであり、Ｈはヒット可能性であり、ΔＧは、塩基対形成のみを考慮したマッチが起こるために必要な自由エネルギーであり、ｐ（ＡＵ）はヒット部位の３０ｎｔ上流及び下流の割合である）。

【0013】

一実施形態において、総合指数は次式によって算出できる：

【0014】

【数2】

【0015】

（式中、ＩＧはヒットの効果をまとめた総合指数であり、Ａは、マッチのｎ個の生成された１５－ｍｅｒに対するヒット量である）。サマリー行列は、７－ｍｅｒ、７－ｍｅｒの生成された１５－ｍｅｒ、センス鎖、ＲＮＡｉ提案配列、ヒット可能性指数、及び総合指数を含んでもよい。さらなる実施形態において、サマリー行列は提案されたアンチセンス鎖を含んでもよい。さらに別の実施形態において、サマリー行列は、シード配列ＧＣ含有量及びガイド鎖ＧＣ含有量をさらに含んでもよい。

【0016】

一実施形態において、本開示の発明は、ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって、ｇＲＮＡから一つ以上の７－ｍｅｒをスクリーニングするステップと、第一数の一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第一数は一つ以上の７－ｍｅｒの頻度に基づくものであるステップと、一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上のヒット部位を特徴づけるステップと、を含む方法であってよい。方法は、一つ以上の７－ｍｅｒの各々のゲノム領域当たりのヒットを算出するステップと、第二数の一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第二数が、ｓｇＲＮＡにおける最多のヒットに基づくものであるステップと、一つ以上の７－ｍｅｒの各々に関連する一つ以上の１５－ｍｅｒの頻度行列を作成するステップと、をさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、方法はまた、最高頻度のヌクレオチドに基づいて、一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上の生成された１５－ｍｅｒを生成するステップと、一つ以上の生成された１５－ｍｅｒの各々についてｇＲＮＡにおけるヒットを特徴づけるステップと、累積ヒット頻度及び長さに基づいてサマリーインデックスを算出するステップと、一つ以上の生成された特徴及び一つ以上の構造的特徴に基づいて第三数のＲＮＡｉ配列を選択するステップとを含む。

【0017】

一実施形態において、第一数、第二数、及び第三数は任意の適切な量であってよい。一実施形態において、第一数は５００であってよい。一実施形態において、第二数は５０であってよい。一実施形態において、第三数は５であってよい。一実施形態において、一つ以上の生成された特徴及び一つ以上の構造的特徴は、サマリーインデックスの関数であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、本発明によるＲＮＡｉデザインワークフローの一実施形態を示す。

【図2A】図２Ａは、五つのＲＮＡｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サイレンシング配列を示す表である。

【図2B】図２Ｂは、ＲＮＡｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サイレンシング配列のマッチング部位の数を示す表である。

【図3A】図３Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを攻撃し得る配列の表である。

【図3B】図３Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの３’ＵＴＲ（未翻訳領域）の図である。

【図4】図４は、ＮＰＭ－ＳＣ２配列３’ＵＴＲ調節のグラフである。

【図5】図５は、ＮＰＭ－ＳＣ２配列細胞毒性のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本明細書ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新規治療を提供する。一実施形態において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子などのリボ核酸（ＲＮＡ）を利用する。ＲＮＡｉ分子はウイルスＲＮＡ翻訳の下方調節のために使用できる。

【0020】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、特定の標的配列と結合するようにデザインできる。オフターゲット効果は、非特異的結合により起こる可能性があり、ｓｉＲＮＡデザインに制限を与える。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は天然に存在するＲＮＡｉ分子である。ｍｉＲＮＡは、不完全な対形成により複数の異なる標的を同時に標的とするように進化してきた可能性がある点で、ｓｉＲＮＡとは異なる。この不完全な対形成は、標準的ｓｉＲＮＡ調節とは異なる調節応答差につながる。一実施形態によると、本明細書中に記載のＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡと同様の方法であるが、ｍｉＲＮＡと同様に不完全な対形成の許容性を考慮して、合成分子としてデザインされる。したがって、生成された抗ウイルスオリゴヌクレオチドは、より広範で、より柔軟な標的化をもたらし、オフターゲット効果を期待できる。

【0021】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、３０ｋｂ又は同様のサイズの一本鎖ウイルスＲＮＡの独自のネステッド複製戦略により、Ｎｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ目で見いだされ、多くのより小さなメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に処理され、各々は複数のタンパク質をコード化する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含み、標的部位は、ネステッドＲＮＡ複製プロセスが開始されてもインタクトなままである。したがって、本発明によると、そのようなネステッド配列を標的とするための、ウイルスＲＮＡに対するＲＮＡｉベースの攻撃が提案される。

【0022】

本発明によると、限定されるものではないが、以下のうちの一つ以上を含むｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列が提案される：鎖特異的（ｓｓＲＮＡ）；非標準的処理；パッセンジャー鎖が無いこと；ウイルスゲノムにおける標的を最大化するためのヒトゲノムにおける標的の最小化；好適な核酸輸送ビヒクルで投与可能であること；サイレンシング率の上昇、生理活性状態への短い処理経路；種間の遺伝的変動を低減するための複数の標的部位；標準的な二本鎖と比較して、産生及び単離／精製が簡略化されていること、並びに代替ｓｉＲＮＡコンストラクトデザインに挿入可能であること。

【0023】

本発明の原理によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムの理解を使用して、Ｃｏｖｉｄ－１９に関連する新規コロナウイルスを治療するために調整された薬物及び治療の開発することができる。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルスＲＮＡは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療：ｓｉＲＮＡの標的となり得る。

【0024】

一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ上の複数の標的部位に対して作用する能力及び可能性を伴って特異的にデザインされる。一実施形態では、特に、ｓｉＲＮＡは、（１）ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域、及び（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのコーディング領域（ＣＤＳ）上の複数の部位に対して作用するようにデザインされる。翻訳終止コドンの直後に位置するために、３’ＵＴＲ ｍＲＮＡは遺伝子発現の調節に関与している可能性があり、したがって、治療を受けるのに非常に適している。そのような部位をｓｉＲＮＡで標的化することによって、Ａｇｏ２を介した切断が起こる可能性があり、その結果、リボソームに入る前にウイルスＲＮＡの破壊が起こる可能性があり、それによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス複製が減少する可能性がある。あるいは、ウイルスＲＮＡ翻訳の阻害は、リボソームドロップオフの抑制又はウイルスＲＮＡの隔離によって起こり得るが、全て標的配列との相互作用によって起こり得る。

【0025】

ＲＮＡウイルスは、変異する可能性が高く、そのようなウイルスに対してＲＮＡｉ誘導分子を使用することで、ｓｉＲＮＡ活性に必要な特異的相補性のために、不完全マッチとなる場合がある。さらに、ｓｉＲＮＡは比較的長い配列の完全性を必要とする傾向があるので、意図する標的ＲＮＡと適切にマッチするために、変異がさらに面倒になる可能性がある。

【0026】

したがって、本発明は、ｍｉＲＮＡのように挙動する合成オリゴヌクレオチドの生成を通して、ｓｉＲＮＡの起こり得る変異および高い相補性の要件に対処することを想定する。多くの場合、ｍｉＲＮＡは、特異性が低く、より適切には、標的ＲＮＡあたりより多数のマッチ部位とマッチする可能性がある。したがって、調節標的部位の乱交雑が増大しているため、特定のＲＮＡ標的に対するｍｉＲＮＡ調節は、ｓｉＲＮＡ標的化と比較して、遺伝的変動及び変異により適している可能性がある。マッチ部位が一つしか存在しないため、ｓｉＲＮＡ相補性部位の欠失により、標的ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡのサイレンシング効果が排除され、変異がその調節を破壊する可能性が増大する。それに対して、標的上に複数の相補性部位を有するｍｉＲＮＡは、一つのマッチ部位が欠失又は変更される場合でも、調節を維持することができる。しかしながら、一実施形態において、正しい配列を有する単一の標的部位が、有効な調節のために充分であり得る。

【0027】

したがって、一実施形態では、選択されたＲＮＡ標的中の相補性部位の数を最大化させつつ、サイレンシング特異性を増大させるように特別に配合された、独自のＲＮＡｉが提供される。したがって、ＲＮＡベースのウイルスは、変異率が高くても、効果的に処理することができる。したがって、多くの実施形態によると、本発明は、変異及び標的破壊のリスクを減少させつつ、抗ウイルス標的化を最大化するために、潜在的標的部位を識別するシステム及び方法を提供し、標的配列をデザインするシステム及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子の組み合わせを、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡデザイン分子のいずれかと共に使用できるか、又は単独で使用してもよい。ＲＮＡｉ分子は、ウイルスゲノムのいずれか又は複数の部分を標的とする可能性がある。

【0028】

図１を参照すると、図１は、本発明によるＲＮＡｉデザインワークフローの非限定例を示す。第一ステップ１０２で、潜在的ＲＮＡｉ配列の識別を実施する（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇＲＮＡからの７－ｍｅｒスクリーニング）。第二ステップ１０４では、標的ＲＮＡ中の最高頻度の７－ｍｅｒ（例えば、５００の選択された最高頻度の７－ｍｅｒ）を検索することによって、潜在的７－ヌクレオチドシード配列を検索できる。非限定例として、５’ＵＴＲ及びＣＤＳは、５’ＵＴＲ及びＣＤＳにおける調節を通して転写物のサイレンシングを引き起こすＲＮＡ誘導サイレンシングプロセスのために評価することができる。一実施形態において、７’ｍｅｒをコンパイルした後、ステップ１０４において、最高頻度の５００個をさらなる分析のために選択できる。

【0029】

次のステップ１０６では、ヒット部位として知られる、選択された７－ｍｅｒが存在するゲノムＲＮＡ配列中の全ての位置を、その位置、７－ｍｅｒが見いだされたゲノム領域の名称、及び７－ｍｅｒ開始位置から始まる１５－ｍｅｒと共に登録してもよい。例えば、ｇＲＮＡ中の７－ｍｅｒヒット部位を特徴づけることができる。最も多くのヒット領域を有する５０個の７－ｍｅｒを選択することができる。ステップ１０８では、ゲノム領域当たりのヒットを７－ｍｅｒごとに算出することができる。ステップ１１０では、ｓｇＲＮＡ中に最も多くのヒットを有する上位５０を選択することができる。

【0030】

ステップ１１２では、登録された１５－ｍｅｒを使用して、ヌクレオチド位置頻度行列を生成させることができ、そして１５－ｍｅｒを生成させることができる。ステップ１１４では、各７－ｍｅｒは、各位置の最高頻度のヌクレオチドに基づき、この配列はＲＮＡｉの提案されたセンス鎖に対応する。したがって、非標準的塩基対形成及びシード配列外対形成が促進され得る。

【0031】

ステップ１１６では、生成された１５－ｍｅｒ配列のヒットは、完全マッチに基づいて推定ＲＮＡｉ分子について予測され得る。したがって、完全シード配列マッチ及びシード配列外マッチを検索してもよい。例えば、登録される場合、６～２２ヌクレオチド長のマッチである。大規模な研究によって６、７及び８ヌクレオチド長のマッチの効果が裏付けられ、検証されているが、５ヌクレオチド長のマッチなどの短いＲＮＡｉの転写物とのマッチや１０及び１５マットなどのより長いマッチは、ＲＮＡ分子のサイレンシングに関与することが示される可能性がある。

【0032】

ステップ１１８では、登録されたヒット部位ごとに、ヒット可能性指数を算出できる。全てのヒットに対して、そのマッチ配列ΔＧ値とヒット部位から３０ｎｔ上流及び下流のＡＵ含有割合とに基づいて、重みを割り当てることができる。累積ヒット頻度及び長さをまとめる指数の計算を実施することができる。ステップ１２０では、生成された特徴及び構造的特徴に基づいて、５個の最良のＲＮＡｉオプションの選択を行うことができる。

【0033】

したがって、シード配列の構造がその標的サイレンシング能力に大きく関与する実施形態では、ΔＧシード配列対形成値が低いほど、高い抑制レベルと相関する傾向がある。
ＲＮＡｉ結合部位の近くでより高いＡＵ含有量が見られる場合、これは、より多くの転写物及びタンパク質サイレンシングと相関する可能性があり、通常、安定性が低い二次構造を意味する。

【0034】

【数3】

【0035】

上で開示されているのは例示的な式であり、式中、ｎは、ｍのヒット部位を予測するために使用される生成された１５－ｍｅｒであり、Ｈはヒット可能性であり、ΔＧは、塩基対形成のみを考慮したマッチが起こるために必要な自由エネルギーであり、ｐ（ＡＵ）はヒット部位の３０ｎｔ上流及び下流の割合である。次に、生成された１５－ｍｅｒについて二つの指数を算出できる：

【0036】

【数4】

【0037】

一実施形態において、ＩＧは、ヒットの効果をまとめる総合指数であり、Ａは、マッチのｎ個の生成された１５－ｍｅｒのヒット量である。
ステップ１１２を参照して、７－ｍｅｒ、その生成された１５－ｍｅｒ又は提案されたアンチセンス鎖、センス又はガイド鎖、ＲＮＡｉ提案配列、シード配列ＧＣ含有量、ガイド鎖ＧＣ含有量、並びにすべての前記指数を考慮する行列を作成することができる。一実施形態において、シードオフターゲット効果によってサイレンシングされ得るヒト転写物は、ｍｉＲＤＢプラットフォームのカスタムマイクロＲＮＡ予測機能を使用して検索できる。

【0038】

図２Ａを参照すると、表は、実施形態による五つのＲＮＡｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サイレンシング配列を示す。
図２Ｂを参照すると、表は、ＲＮＡｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サイレンシング配列のマッチ部位の数を示す。

【0039】

本明細書中で開示する場合、本発明は、想定されるように、化学修飾によって修飾することができる。あるいは、分子提示は、ＲＮＡｉ模倣物として、又はウイルス、プラスミドなどの発現ベクターとして、治療薬を投与するように修飾できる。

【0040】

様々な実施形態は、ＬＮＰ、ポリマーナノ粒子、アプタマー関連送達、抗体送達、アフィマー関連送達又は金属ナノ粒子などの様々な送達方法と組み合わせて修飾できる。
さらに、治療薬は、線状若しくは環状ＲＮＡとして、又はより長い非コーディングＲＮＡの一部としてのいずれかで投与できる。治療薬はまた、プラスミド若しくは他のシステムベクター、又はｓｈＲＮＡベクターシステムを介するなど、ＤＮＡ対応物として投与できる。

【0041】

本明細書中で開示する実施形態は、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの利点を組み合わせて、ｓｉＲＮＡと同様の高い特異性を促進しつつ、ｍｉＲＮＡにおいてと同様に、複数の相補性部位を有する能力を追加する。さらに、これは、変異の問題に対処でき、単一又は複数の選択されたＲＮＡを標的とするようにＲＮＡｉ分子をデザインするために使用できる。

【0042】

したがって、様々な実施形態は、コーディング及び非コーディングＲＮＡをサイレンシングするように、又は単一の選択されたＲＮＡ若しくはＲＮＡの組み合わせをサイレンシングするように、デザインできる。さらに、標的とされるＲＮＡの内部の領域は、標的部位について濃縮できる。これらの実施形態は、臨床的又は非臨床的に実施でき、単独又は他の化合物と組み合わせて投与できる。

【0043】

一実施形態において、多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２インビトロサロゲート発現法が存在し得る。
細胞培養に関して、一実施形態では、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２発現ヒト結腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３７（商標））、ヒト胚腎臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６（商標））及びミドリザル腎臓細胞株Ｖｅｒｏ Ｅ６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））は、１０％ウシ胎仔血清（Ｆ２４４２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗生物質－抗真菌溶液（Ａ５９５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１×非必須アミノ酸溶液（Ｍ７１４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加したＤＭＥＭ培地（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持することができる。

【0044】

プラスミドコンストラクトデザインに関して、一実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デザインｍｉＲＮＡ模倣物の治療可能性の第一アプローチに関して、ホタル－ウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクター及びＳ－タンパク質／Ｎ－タンパク質発現ベクターを以下のようにデザインできる：（ａ）ホタル－ウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクターについては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ユニバーサル３’ＵＴＲ配列を合成し、外部サービス（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によってｐｍｉｒＧＬＯベクター（Ｅ１３３０、Ｐｒｏｍｅｇａ）のホタルルシフェラーゼ転写物の３’末端においてクローニングすることができる。ウミシイタケルシフェラーゼ転写物は、内因性対照であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２要素を含んでいなくてもよい；（ｂ）Ｓ－タンパク質／Ｎ－タンパク質発現ベクターについては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質及びＮ－タンパク質（１）ｍＲＮＡ完全配列及び（２）３’ＵＴＲ対形成配列変異ｍＲＮＡを合成でき、外部サービス（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によりｐｈＭＧＦＰベクター（Ｅ６４２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）においてクローニングすることができる。これらのデザインにより、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デザインｍｉＲＮＡ模倣物の３’ＵＴＲ－ＣＤＳ調節能力と５’ＵＴＲ－ＣＤＳ調節能力を区別することが可能になり得る。

【0045】

トランスフェクションについて、一実施形態では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌ３００００１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、製造業者の指示にしたがって、Ｃａｃｏ－２、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞株上のプラスミドコンストラクトの一過性発現のために使用できる。

【0046】

ルシフェラーゼアッセイについては、一実施形態では、製造業者の指示にしたがって、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｅ２９４０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイを実施できる。

【0047】

真核生物発現アッセイについて、一実施形態、具体的にはＲＴ－ｑＰＣＲでは、全ＲＮＡは、製造業者の指示どおりにｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（ＡＭ１５６１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって、細胞株から抽出することができ、ＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｑ ｑＰＣＲマシン（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）で製造業者の指示どおりにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩワンステップＲＴ－ＰＣＲシステムキット（１２５７４０２６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって実施できる。

【0048】

ウェスタンブロットについて、一実施形態では、全タンパク質は、推奨されるプロトコルにしたがって、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｒ０２７８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、プロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｓ８８２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｎｃｈ）を使用することによって、細胞株から抽出できる。全タンパク質定量化は、製造業者の指示どおりにＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用することによって実施できる。

【0049】

生ウイルスを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２インビトロモデルにおけるウイルス力価の評価については、一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（受入：ＮＣ＿０４５５１２．２）ストックは、すでに記載した条件にしたがって培養できる。ウイルスストックは、バイオセイフティーレベル４（ＢＳＬ－４）の施設において、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））で滴定される。ウイルス滴定アッセイは、すでに記載したプロトコルにしたがって実施できる。ウイルス力価は、式：ＰＦＵ／ｍＬ＝カウントされたプレートの数／（接種体積（この場合は５０ｕＬ）＊サンプル希釈率）を使用して算出できる。

【0050】

例えば、この研究は、外部サービス又は協働により実施してもよい。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ウイルスＲＮＡ量及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定のアイデンティティを確認するために使用できる。ウイルスＲＮＡ増幅のための標準的で認可された方法を使用してもよい。

【0051】

非近交系マウスモデルにおける用量範囲発見安全性試験に関しては、ＣＤ－１マウス（ＣＤ－１（商標）ＩＧＳマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を実験対象として使用できる。マウスを体重に応じてグループ分けしてもよい。実験対象は、２００μＬの最終注入体積中、決定された投薬量で、１か月間一日おきに静脈内処置できる。治療レジメンが完了したら、限定されるものではないが、肝機能及び腎機能の参考因子をはじめとする血液パラメータを、安全性基準として評価できる。様々な身体組織の病理分析は、認定獣医病理学者が実施してもよい。

【0052】

トランスジェニックマウスまたは他の動物モデルにおける有効性研究について、一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を研究するために新規トランスジェニックマウスモデルを開発できる。そのような場合、特定の病原体を含まない、６～１１月齢のメス野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（０００６６４）及びトランスジェニック（ＴＧ）Ｋ１８－ｈＡＣＥ２（０３４８６０）マウスを入手できる。一実施形態では、二つの実験を実施できる：（ａ）ナノ粒子製剤送達：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２フリーＷＴ及びＴＧマウスに、ｑ．ｏ．ｄレジメン（Ｍ、Ｗ、Ｆ）で抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｉＲＮＡ模倣物を含むナノ粒子製剤を静脈内投与できる。治療完了後、マウスを処分し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍｉＲＮＡ模倣物をＲＴ－ｑＰＣＲによって呼吸器系で定量化できる；（ｂ）有効性研究：ＴＧマウスに１０^５ＴＣＩＤ_５０の投与量でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内接種できる。一実施形態において、感染が確認された後、マウスを二つのグループに分ける：（１）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍｉＲＮＡ模倣物を含むナノ粒子製剤のｑ．ｏ．ｄレジメン（Ｍ、Ｗ、Ｆ）での静脈内投与、（２）スクランブルｍｉＲＮＡ模倣物を含むナノ粒子製剤のｑ．ｏ．ｄレジメン（Ｍ、Ｗ、Ｆ）での静脈内投与。動物を毎日継続して観察して、体重、臨床症状、外部刺激に対する応答性及び死亡を記録することができる。

【0053】

しかしながら、前記モデルが利用可能でないか、又は代替動物モデルがより適切であるとみなされるならば、適切な代替研究法が提案される場合がある。
ヒト血液免疫応答エクスビボアッセイについては、一実施形態では、配合されたナノ粒子がヒトサイトカイン応答を誘導するか否かを判定するために、健常なボランティアから集めた全血中で２４時間インキュベートすることができる。抗凝固剤を全血に添加して凝血を防止でき、配合されたナノ粒子を三つの異なる濃度で試験することができる。インキュベーション後、血漿を遠心分離によって分離でき、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＮＦα、及びＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって分析できる（ＫＨＣ００１１、ＢＭＳ２２３ＨＳ、ＫＨＣ０１２１、ＢＭＳ２１３ＨＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

【0054】

したがって、一連のＲＮＡｉ誘導ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ分子は、異なる位置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡを特異的に標的とするようにデザインできる。図３Ａに示す配列が合成されている可能性があり、「Ｄ」と標識された第一候補についての結果が得られている可能性がある。スクランブル化された効力のない配列「ＮＣ」を「負の対照」として使用できる。

【0055】

配列「Ｄ」は、図３Ｂに示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの３’ＵＴＲ（未翻訳領域）を含むようにデザインされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトに対する有効性について試験できる。

【0056】

２９３個のＴ細胞を、前述のように、ルシフェラーゼレポーターコンストラクト及び抗ウイルス配列「Ｄ」の両方でトランスフェクトしてもよい。４８時間後、プレートリーダーを使用して、レポーターコンストラクトのルシフェラーゼ発現を調査できる。配列「Ｄ」のトランスフェクション後にルシフェラーゼ活性が有意に減少する可能性があり、デザインされた配列の調節の可能性及び有効性を示す。結果の非限定例を図４に示す。

【0057】

線維芽細胞における配列「Ｄ」の潜在的な細胞毒性効果も試験できる。細胞を正の細胞毒性対照、ＮＣ、又は配列「Ｄ」のいずれかでトランスフェクトできる。一実施形態において、トランスフェクション後４８時間でＭＴＳアッセイによって細胞変性効果は観察されない可能性があり、このことは、配列の相対的安全性を示す。結果の非限定例を図５に示す。

【0058】

一実施形態において、本開示の発明は、ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって、潜在的７－ｍｅｒ配列を識別するステップと、一つ以上のヒット部位を登録するステップであって、前記一つ以上のヒット部位が、潜在的７－ｍｅｒ配列が存在するゲノムＲＮＡ配列中の一つ以上の位置であるステップと、を含む方法であり得る。一実施形態において、方法は、一つ以上のヒット部位と共に、７－ｍｅｒ配列が見いだされたゲノム領域の名称と、７－ｍｅｒ配列開始位置から始まる登録された１５－ｍｅｒ配列を登録するステップと、登録された１５－ｍｅｒ配列を使用して、ヌクレオチド位置頻度行列と、各位置について最高頻度のヌクレオチドに基づいて各７－ｍｅｒ配列について生成させた１５－ｍｅｒとを生成させるステップと、生成させた１５－ｍｅｒ配列を使用して、推定ＲＮＡｉ分子に対して一つ以上のヒットを予想するステップと、をさらに含んでもよい。一実施形態において、方法はまた、一つ以上の登録されたヒット部位のヒット可能性指数を算出するステップと、総合指数を生成するステップと、サマリー行列を作成するステップと、を含んでもよい。

【0059】

一実施形態において、潜在的７－ｍｅｒ配列は、標的ＲＮＡ中の最多の７－ｍｅｒについてスクリーニングすることによって識別することができる。一実施形態において、推定ＲＮＡｉ分子に対する一つ以上のヒットは、完全マッチに基づいて予想することができる。一実施形態において、ヒット可能性指数は、マッチ配列ΔＧ値並びにヒット部位から３０ヌクレオチド上流及び下流のＡＵ含有割合に基づいて各ヒット部位に対して重みを割り当てることができる。ヒット可能性指数は次式によって算出できる：

【0060】

【数5】

【0061】

（式中、ｎは、ｍのヒット部位を予測するために使用される生成された１５－ｍｅｒであり、Ｈはヒット可能性であり、ΔＧは、塩基対形成のみを考慮したマッチが起こるために必要な自由エネルギーであり、ｐ（ＡＵ）はヒット部位の３０ｎｔ上流及び下流の割合である）。

【0062】

一実施形態において、総合指数は次式によって算出できる：

【0063】

【数6】

【0064】

（式中、ＩＧはヒットの効果をまとめた総合指数であり、Ａはマッチのｎ個の生成された１５－ｍｅｒに対するヒット量である）。サマリー行列は、７－ｍｅｒ、７－ｍｅｒの生成した１５－ｍｅｒ、センス鎖、ＲＮＡｉ提案配列、ヒット可能性指数、及び総合指数を含み得る。さらなる実施形態において、サマリー行列は提案されたアンチセンス鎖を含んでもよい。さらに別の実施形態において、サマリー行列は、シード配列ＧＣ含有量及びガイド鎖ＧＣ含有量をさらに含んでもよい。

【0065】

一実施形態において、本開示の発明は、ＲＮＡｉ配列を識別する方法であって、ｇＲＮＡから一つ以上の７－ｍｅｒをスクリーニングするステップと、第一数の一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第一数は一つ以上の７－ｍｅｒの頻度に基づくものであるステップと、一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上のヒット部位を特徴づけるステップと、を含む方法であってよい。方法は、一つ以上の７－ｍｅｒの各々のゲノム領域当たりのヒットを算出するステップと、第二数の一つ以上の７－ｍｅｒを選択するステップであって、前記第二数はｓｇＲＮＡにおける最多のヒットに基づくものであるステップと、一つ以上の７－ｍｅｒの各々に関連する一つ以上の１５－ｍｅｒの頻度行列を作成するステップとをさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、方法はまた、最高頻度のヌクレオチドに基づいて、一つ以上の７－ｍｅｒの各々について一つ以上の生成された１５－ｍｅｒを生成するステップと、一つ以上の生成された１５－ｍｅｒの各々についてｇＲＮＡにおけるヒットを特徴づけるステップと、累積ヒット頻度及び長さに基づいてサマリーインデックスを算出するステップと、一つ以上の生成した特徴及び一つ以上の構造的特徴に基づいて第三数のＲＮＡｉ配列を選択するステップとを含む。

【0066】

一実施形態において、第一数、第二数、及び第三数は任意の適切な量であってよい。一実施形態において、第一数は５００であってよい。一実施形態において、第二数は５０であってよい。一実施形態において、第三数は５であってよい。一実施形態において、一つ以上の生成した特徴及び一つ以上の構造的特徴は、サマリーインデックスの関数であってよい。

【0067】

本発明を上で概説した実施形態に関連して記載してきたが、多くの代替物、修正及び変形は、以下の開示を読めば当業者には明らかになるであろう。例えば、前記実施形態は、特定の量、化学物質、化合物、遺伝子材料、配列、期間、又は他の量を含み得る。様々な実施形態において、前記量のいずれも非限定的であり得る。したがって、本発明の実施形態は、上述のように、限定的ではなく例示を意図する。本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】