知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-537631眼障害を処置するためのプラスミドベクターおよびナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-04
(54)【発明の名称】眼障害を処置するためのプラスミドベクターおよびナノ粒子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20230828BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230828BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230828BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230828BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230828BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230828BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230828BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20230828BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
A61K48/00 ZNA
A61P27/02
A61K47/69
A61K9/14
A61K47/18
A61K47/20
A61K47/34
A61K31/713
A61K47/26
C12N15/88 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511610
(86)(22)【出願日】2021-08-16
(85)【翻訳文提出日】2023-04-04
(86)【国際出願番号】 US2021046137
(87)【国際公開番号】W WO2022036318
(87)【国際公開日】2022-02-17
(31)【優先権主張番号】63/065,860
(32)【優先日】2020-08-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】597138069
【氏名又は名称】ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ル，ゼン－ロン
(72)【発明者】
【氏名】サン，ウェンユ
(72)【発明者】
【氏名】サン，ダ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076AA29
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB24
4C076CC10
4C076DD50
4C076DD52
4C076EE23
4C076FF16
4C076FF36
4C076FF63
4C076FF68
4C084AA13
4C084AA17
4C084MA05
4C084MA21
4C084MA41
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA21
4C086MA41
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA33
(57)【要約】
網膜または眼を処置するように構成された機能性治療用タンパク質をコードする１つまたは複数の異種核酸または遺伝子を含むプラスミドベクターは、桿体および錐体の光受容体の両方で異種遺伝子を発現するためにヒトＧＲＫ１プロモータおよびヒトＳ／ＭＡＲエンハンサを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
網膜または眼障害を処置するように構成された機能性治療用タンパク質をコードする１つまたは複数の異種核酸を含むプラスミドベクターであって、桿体および錐体の光受容体の両方で異種遺伝子を発現するためにヒトＧＲＫ１プロモータおよびヒトＳ／ＭＡＲエンハンサを含む、プラスミドベクター。
【請求項2】
前記ＧＲＫ１プロモータが、前記異種遺伝子の上流にあり、前記Ｓ／ＭＡＲエンハンサが、前記異種遺伝子の下流にある、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項3】
ヒトベータ－グロビンポリアデノシン（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項4】
前記ベータ－グロビンポリＡシグナル配列が、前記異種遺伝子の下流で、前記Ｓ／ＭＡＲエンハンサの上流にある、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項5】
前記網膜障害が、眼タンパク質をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされた遺伝性網膜障害である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項6】
前記遺伝性網膜障害が、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、弾性線維性仮性黄色腫、桿体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、ＣＳＮＢ－１Ｃ、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症、脈絡網膜炎（choriorretinopathy）、ＣＳＮＢ２、アッシャー症候群、ワーグナー症候群、または加齢黄斑変性から選択される、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項7】
前記異種遺伝子が、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、（Ｒａｂエスコートタンパク質－１）ＲＥＰ１、Ｌ－オプシン、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ホスホジエステラーゼ６（３（ＰＤＥ６Ｉ３）、ＡＴＰ－結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、遅延型網膜変性／ペリフェリン（ＲＤＳ／ペリフェリン）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｒ（ＭＥＲＴＫ）、イノシン－５’－一リン酸デヒドロゲナーゼＩ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、アリール炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼレギュレータ相互作用タンパク質１（ＰＲＧＲＩＰＩ）、イノシン－５’－一リン酸デヒドロゲナーゼＩ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、アルファトランスデューシングアクティビティポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、環状ヌクレオチド作動性チャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、レチノスキシン１（Ｒｓ１）、眼白皮症１型（ＯＡ１）、眼皮膚白皮症１型（ＯＣＡ１）、チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ－１／Ｃｉｐ１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エンドスタチン、アンギオスタチン、アリールスルファターゼＢ、１３－グルクロニダーゼ、アッシャリン２Ａ（ＵＳＨ２Ａ）、ＣＥＰ２９０、ＡＢＣＣ、ＲＩＭＳ１、ＬＲＰ５、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＴＲＰＭ１、ＩＦＴ－１７２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＴＵＢＧＣＰ６、ＫＩＡＡ１５４９、ＣＡＣＮＡ１Ｆ、ＭＹＯ７Ａ、ＶＣＡＮ、またはＨＭＣＮ１から選択される、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項8】
前記網膜障害が、シュタルガルト病である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項9】
前記異種遺伝子が、ＡＢＣＡ４である、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項10】
配列番号１の前記核酸配列を有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項11】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の１つまたは複数のプラスミドベクターと複合体化した複数のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を含む、自己組織化ナノ粒子。
【請求項12】
前記ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質が、ｐＨ応答性多官能性アミノ脂質を含む、請求項１１に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項13】
約４から約１２、好ましくは約６から約１０のアミン対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有する、請求項１２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項14】
前記ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質が、網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合する少なくとも１つの標的基をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項15】
前記少なくとも１つの標的基が、光受容体間レチノイド結合タンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合するレチノイドまたはレチノイド誘導体を含む、請求項１４に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項16】
前記少なくとも１つの標的基が、全トランス型レチニルアミンまたは（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オールを含む、請求項１４に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項17】
前記ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質が、システイン残基を含み、前記少なくとも１つの標的基が、システイン残基のチオール基にリンカーにより共有結合している、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項18】
前記リンカーが、ポリアミノ酸基、ポリアルキレン基、またはポリエチレングリコール基を含む、請求項１７に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項19】
前記リンカーが、酸不安定結合を含む、請求項１８に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項20】
さらに、ＰＥＧ化されている、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項21】
前記ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質が、（１－アミノエチル）イミノビス［Ｎ－（オレオイルシステイニル－１－アミノ－エチル）プロピオンアミド）（ＥＣＯ）またはそれらの類縁体もしくは誘導体を含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項22】
前記ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質が、式（Ｉ）：【化1】
Ｒ２およびＲ３は、独立して脂肪族基または疎水基である；
Ｒ４およびＲ５は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル基、アルケニル基、アシル基、または芳香族基であるか、ポリマー、標的基、もしくは検出可能な部分を含む；
ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、独立して１から１０の整数である）
を有する化合物；およびその薬学的に許容される塩を含む、請求項１４に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項23】
Ｒ１が：【化2】
ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、１から１０の整数である）
の少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項24】
Ｒ２およびＲ３が、独立してオレイン酸またはリノール酸に由来する疎水基である、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項25】
Ｒ２およびＲ３が同じである、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項26】
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つが、網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合する標的基を含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項27】
Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つが、光受容体間レチノイド結合タンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合するレチノイドまたはレチノイド誘導体を含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項28】
Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つが、全トランス型レチニルアミンまたは（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オールを含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項29】
ａ、ｂ、ｃ、およびｄが、それぞれ２である、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項30】
Ｒ１が、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨの少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項31】
前記標的基が、システイン残基のチオール基にリンカーにより共有結合している、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項32】
前記リンカーが、ポリアミノ酸基、ポリアルキレン基、またはポリエチレングリコール基を含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項33】
前記リンカーが、酸不安定結合を含む、請求項２２に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項34】
さらにＰＥＧ化されている、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項35】
約４から約１２、好ましくは約６から約１０のＮ／Ｐ比を有する、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子。
【請求項36】
請求項２２から３５のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子の水溶液を含む、医薬組成物。
【請求項37】
さらに、異なる貯蔵温度下、前記ナノ粒子の前記安定性を強化するのに有効な量のスクロースを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項38】
前記異なる貯蔵温度が、約－２０℃から約４℃の範囲である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項39】
約５％から約２０％のスクロースを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項40】
実質的に中性のｐＨを有する、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項41】
前記実質的に中性のｐＨが、約６．０から約８．０、約６．２から約７．８、約６．５から約７．５、約６．８から約７．２、または約７である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項42】
賦形剤を含まない、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項43】
約５０ｎｇ／μｌから約５００ｎｇ／μｌ、約１００ｎｇ／μｌから約３００ｎｇ／μｌ、または約１５０ｎｇ／μｌから約２５０ｎｇ／μｌの自己組織化ナノ粒子の濃度を有する、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項44】
それを必要とする被験者において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプラスミドベクター、請求項１１から３５のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子、または請求項３６から４３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記被験者に投与することを含む、方法。
【請求項45】
被験者における障害を処置する方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプラスミドベクター、請求項１１から３５のいずれか一項に記載の自己組織化ナノ粒子、または請求項３６から４３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記被験者に投与することを含む、方法。
【請求項46】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、反復投与される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項47】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、単回用量で投与される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項48】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、局所投与される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、硝子体内投与される、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、網膜下投与される、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、脈絡膜上に投与される、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記障害が、眼障害である、請求項４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記障害が、遺伝性網膜障害である、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記障害が、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、弾性線維性仮性黄色腫、桿体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、ＣＳＮＢ－１Ｃ、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症、脈絡網膜炎（choriorretinopathy）、網膜色素変性症、ＣＳＮＢ２、アッシャー症候群、ワーグナー症候群、または加齢黄斑変性から選択される、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記医薬組成物中の前記自己組織化ナノ粒子の前記濃度が、約５０ｎｇ／μｌから約５００ｎｇ／μｌ、約１００ｎｇ／μｌから約３００ｎｇ／μｌ、または約１５０ｎｇ／μｌから約２５０ｎｇ／μｌである、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記被験者に投与される前記医薬組成物の前記体積が、約０．１μＬから約２μＬ、約０．２μＬから約１．５μＬ、または約０．５μＬから約１μＬである、請求項４４から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記プラスミドベクター、前記自己組織化ナノ粒子、または前記医薬組成物が、前記被験者の視覚機能を処置するのに有効である、請求項４４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
視覚機能が、マイクロペリメトリ、暗順応ペリメトリ、視覚の機動性の評価、視力、ＥＲＧ、またはリーディング評価により評価される、請求項５７の方法。
【請求項59】
前記方法が、結果として前記眼障害の進行による前記被験者の視覚機能の低下の進行を防止または遅延することとなる、請求項４４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年８月１４日に出願された米国仮出願第６３／０６５，８６０号の優先権を主張しており、その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０２０年８月１４日に出願された米国仮出願第６３／０６５，８６０号の優先権を主張しており、その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【0002】
突然変異した遺伝子の健康なコピーを標的細胞に送達し、コードされた機能性タンパク質を発現してその正常な機能を修復する遺伝子置換治療は、シュタルガルト病または他の遺伝性眼疾患の効果的な処置にとって将来性を示している。第１のＦＤＡ承認遺伝子治療は、レーバー先天性黒内障２型（ＬＣＡ２）を処置するためのｈＲＰＥ６５を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。近年の成功により、以前は治療不可能であった遺伝性疾患を治療するための遺伝子治療を開発する熱意が再燃した。多数の遺伝子治療が開発されており、いくらかは、現在臨床試験のさまざまなフェーズにある。臨床開発中のほとんどの遺伝子治療は、ＡＡＶに基づいている。しかし、ＡＡＶベースの遺伝子治療の幅広い用途は、その積荷容量により限定されている。これにより、シュタルガルト病（ＳＴＧＤ）およびアッシャー症候群などの大きい遺伝子における突然変異により引き起こされた眼の遺伝性疾患を処置するためのウイルス遺伝子治療の用途が大幅に制限された。ウイルス系の場合、デュアルＡＡＶ、マルチＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクターなどの戦略は、制限を克服するために試験されている。これらの治療の臨床用途は、機能性タンパク質全体の発現不良および免疫原性を含む種々の制限により妨害されている。非ウイルス遺伝子送達システムは、遺伝子パッケージ容量における制限を有しておらず、また幅広い範囲の遺伝子サイズをカバーする種々の網膜遺伝性疾患を処置するために開発されている。
【0003】
網膜遺伝性疾患における遺伝子治療のチャレンジは、正常な視覚機能を保持するために、長期間の安定したタンパク質発現を維持することである。臨床的に、ＡＡＶ治療の１つの網膜下投与は、ＬＣＡ２患者において数年間継続することができるが、臨床的知見から、経時的に治療効果が減衰することが示唆されている。反復投与は、網膜の構造および機能におけるレスキュー効果を維持するために必要である可能性がある。残念なことに、初期のウイルス遺伝子治療後の免疫応答の進展は、後に続くウイルスベクターの反復注射の効果を喪失させる。非ウイルス遺伝子治療は、低免疫原性を示し、治療効果を延長させるために反復投与することができる。しかし、非ウイルス遺伝子送達システムは、効率の低下を被る可能性がある。
【発明の概要】
【0004】
本明細書に記載の実施形態は、網膜障害または眼障害を処置するように構成された機能性治療用タンパク質の発現における使用のためのプラスミドベクターに関する。網膜障害または眼障害は、網膜または眼のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされた遺伝性網膜障害であり得る。いくらかの実施形態において、遺伝性の網膜障害は、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、弾性線維性仮性黄色腫、桿体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、ＣＳＮＢ－１Ｃ、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症、脈絡網膜炎（choriorretinopathy）、ＣＳＮＢ２、アッシャー症候群、ワーグナー症候群、または加齢黄斑変性から選択される。
【0005】
プラスミドベクターは、網膜障害または眼障害を処置するように構成された機能性治療用タンパク質をコードする１つまたは複数の異種核酸または遺伝子、ヒトＧＲＫ１プロモータ、および桿体および錐体の光受容体の両方で異種遺伝子を発現するためのヒトＳ／ＭＡＲエンハンサを含む。
【0006】
いくらかの実施形態において、ヒトＧＲＫ１プロモータは、異種遺伝子の上流にあり、Ｓ／ＭＡＲエンハンサは、異種遺伝子の下流にある。
【0007】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクターは、ヒトベータ－グロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含むことができる。ヒトベータ－グロビンポリＡシグナル配列は、異種遺伝子の下流で、Ｓ／ＭＡＲエンハンサの上流にあり得る。
【0008】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、（Ｒａｂエスコートタンパク質－１）ＲＥＰ１、Ｌ－オプシン、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ホスホジエステラーゼ６（３（ＰＤＥ６Ｉ３）、ＡＴＰ－結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、網膜変性遅延／ペリフェリン（ＲＤＳ／ペリフェリン）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｒ（ＭＥＲＴＫ）、イノシン－５’－一リン酸デヒドロゲナーゼＩ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、アリール炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼレギュレータ相互作用タンパク質１（ＰＲＧＲＩＰＩ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、アルファトランスデューシングアクティビティポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、環状ヌクレオチド作動性チャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、レチノスキシン１（Ｒｓ１）、眼白皮症１型（ＯＡ１）、眼皮膚白皮症１型（ＯＣＡ１）、チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ－１／Ｃｉｐ１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エンドスタチン、アンギオスタチン、アリールスルファターゼＢ、１３－グルクロニダーゼ、アッシャリン２Ａ（ＵＳＨ２Ａ）、中心体タンパク質２９０（ＣＥＰ２９０）、調節シナプス膜エキソサイトーシス１（ＲＩＭＳ１）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）、コイルドコイルおよびＣ２ドメイン含有２Ａ（ＣＣ２Ｄ２Ａ）、一過性受容体電位型カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー１（ＴＲＰＭ１）、繊毛内タンパク質輸送１７２（ＩＦＴ－１７２）、コラーゲンタイプ１アルファ１チェーン（ＣＯＬ１１Ａ１）、チューブリンガンマ複合体会合タンパク質６（ＴＵＢＧＣＰ６）、ＫＩＡＡ１５４９、電圧依存性カルシウムチャネルサブユニットアルファ１Ｆ（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）、ミオシンＶＩＩＡ（ＭＹＯ７Ａ）、バーシカン（ＶＣＡＮ）、またはヘミセンチン１（ＨＭＣＮ１）から選択される。
【0009】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子はＡＢＣＡ４であり、網膜障害は、シュタルガルト病または加齢黄斑変性である。
【0010】
いくらかの実施形態において、プラスミドは、配列番号１の核酸配列を有する。
【0011】
本明細書に記載の他の実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数のプラスミドベクターと複合体化した複数のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を含む自己組織化ナノ粒子に関する。
【0012】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、ｐＨ応答性多官能性アミノ脂質を含むことができる。
【0013】
いくらかの実施形態において、自己組織化ナノ粒子は、アミン対リン酸（Ｎ／Ｐ）比が約４から約１２、好ましくは約６から約１０であり得る。
【0014】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合する少なくとも１つの標的基をさらに含むことができる。少なくとも１つの標的基は、光受容体間レチノイド結合タンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合するレチノイドまたはレチノイド誘導体を含むことができる。例えば、少なくとも１つの標的基には、全トランス型レチニルアミンまたは（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オールが含まれる。
【0015】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、システイン残基を含み、少なくとも１つの標的基は、システイン残基のチオール基にリンカーにより共有結合している。リンカーは、例えばポリアミノ酸基、ポリアルキレン基、またはポリエチレングリコール基を含む可能性がある。場合によっては、リンカーは、酸不安定結合を含む可能性がある。
【0016】
いくらかの実施形態において、自己組織化ナノ粒子はＰＥＧ化されている。
【0017】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質には、（１－アミノエチル）イミノビス［Ｎ－（オレオイルシステイニル－１－アミノ－エチル）プロピオンアミド）（ＥＣＯ）またはそれらの類縁体もしくは誘導体が含まれ得る。
【0018】
いくらかの実施形態において、ＥＣＯおよびその類縁体または誘導体は、式（Ｉ）：
【0019】
【化1】
【0020】
（式中、Ｒ１は、アルキルアミノ基または少なくとも１つの芳香族基を含む基である；
Ｒ２およびＲ３は、独立して脂肪族基または疎水基である；
Ｒ４およびＲ５は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル基、アルケニル基、アシル基、または芳香族基であるか、ポリマー、標的基、もしくは検出可能な部分を含む；
ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、独立して１から１０の整数である）
を有する化合物、およびその薬学的に許容される塩を含むことができる。
Ｒ２およびＲ３は、独立して脂肪族基または疎水基である；
Ｒ４およびＲ５は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル基、アルケニル基、アシル基、または芳香族基であるか、ポリマー、標的基、もしくは検出可能な部分を含む；
ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、独立して１から１０の整数である）
を有する化合物、およびその薬学的に許容される塩を含むことができる。
【0021】
いくらかの実施形態において、Ｒ１は：
【0022】
【化2】
【0023】
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、独立して水素、アルキル基、疎水基、または窒素含有置換基である；ならびに
ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、１から１０の整数である）
の少なくとも１つを含む。
ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、１から１０の整数である）
の少なくとも１つを含む。
【0024】
他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、独立してオレイン酸またはリノール酸に由来する疎水基である。
【0025】
いくらかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は同じである。
【0026】
いくらかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合する標的基を含む。Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つは、光受容体間レチノイド結合タンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合するレチノイドまたはレチノイド誘導体を含むことができる。例えば、Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つには、全トランス型レチニルアミンまたは（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オールが含まれる。
【0027】
いくらかの実施形態において、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ２である。
【0028】
他の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨの少なくとも１つを含む。
【0029】
いくらかの実施形態において、標的基は、システイン残基のチオール基にリンカーにより共有結合している。リンカーは、ポリアミノ酸基、ポリアルキレン基、またはポリエチレングリコール基、場合によっては、酸不安定結合を含む可能性がある。
【0030】
さらに他の実施形態は、本明細書に記載の自己組織化ナノ粒子の水溶液および／または本明細書に記載のプラスミドベクターを含む医薬組成物に関する。
【0031】
いくらかの実施形態において、医薬組成物は、異なるまたは異なっている貯蔵温度下での安定性を強化するのに有効な量のスクロースを含むことができる。異なるまたは異なっている貯蔵温度は、約－２０℃から約４℃の範囲であり得る。例えば、医薬組成物は、約５％から約２０％のスクロースを含むことができる。
【0032】
いくらかの実施形態において、医薬組成物は、実質的に中性のｐＨを有することができる。実質的に中性のｐＨは、約６．０から約８．０、約６．２から約７．８、約６．５から約７．５、約６．８から約７．２、または約７である。
【0033】
いくらかの実施形態において、医薬組成物は、スクロース以外の賦形剤を含まない。
【0034】
他の実施形態において、医薬組成物は、約５０ｎｇ／μｌから約５００ｎｇ／μｌ、約１００ｎｇ／μｌから約３００ｎｇ／μｌ、または約１５０ｎｇ／μｌから約２５０ｎｇ／μｌの自己組織化ナノ粒子の濃度を含む。
【0035】
本明細書に記載の他の実施形態は、それを必要とする被験者において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法に関する。方法は、被験者にプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または記載の医薬組成物を投与することを含むことができる。
【0036】
本明細書に記載のさらに他の実施形態は、被験者における障害を処置する方法に関する。方法は、被験者にプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または記載の医薬組成物を投与することを含む。
【0037】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、反復投与される。
【0038】
他の実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、単回用量で投与される。
【0039】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、局所投与される。例えば、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、硝子体内、網膜下、または脈絡膜上に投与することができる。
【0040】
いくらかの実施形態において、方法により処置される障害は、網膜または眼のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされた遺伝性網膜障害であり得る。いくらかの実施形態において、遺伝性網膜障害は、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、弾性線維性仮性黄色腫、桿体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、ＣＳＮＢ－１Ｃ、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症、脈絡網膜炎（choriorretinopathy）、ＣＳＮＢ２、アッシャー症候群、ワーグナー症候群、または加齢黄斑変性から選択される。
【0041】
いくらかの実施形態において、医薬組成物中の自己組織化ナノ粒子の濃度は、約５０ｎｇ／μｌから約５００ｎｇ／μｌ、約１００ｎｇ／μｌから約３００ｎｇ／μｌ、または約１５０ｎｇ／μｌから約２５０ｎｇ／μｌである。
【0042】
他の実施形態において、被験者に投与される医薬組成物の体積は、約０．１μＬから約２００μＬ、約０．２μＬから約１５０μＬ、または約０．５μＬから約１００μＬである。
【0043】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、被験者の視覚機能を処置するのに有効であり得る。視覚機能は、マイクロペリメトリ、暗順応ペリメトリ、視覚の機動性の評価、視力、ＥＲＧ、またはリーディング評価により評価することができる。
【0044】
いくらかの実施形態において、方法は、結果として、眼障害の進行による被験者の視覚機能の低下の進行を防止または遅延することとなる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】図１は、ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－ＳＭＡＲプラスミドの図である。ＧＲＫ１プロモータは、ＭｌｕＩ制限部位とＡｇｅＩ制限部位との間に挿入された。Ｓ／ＭＡＲ ＤＮＡは、ＮｏｔＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位との間に挿入された。グロビンポリＡ ＤＮＡは、ＮＥＢ ＨｉＦｉアセンブリクリーニングキットを使用することによりＮｏｔＩ制限部位とＳｐｅＩ制限部位との間に挿入された。
【図2】図２（Ａ～Ｂ）は、標的プラスミドにおける正確なサイズのＤＮＡフラグメントを検証するために複数の制限酵素消化のアガロースゲル電気泳動を図解する。（Ａ）プロモータＧＲＫ１（４００ｂｐ）、ＧＦＰ（７００ｂｐ）、ＡＢＣＡ４フラグメント（６．８ｋｂ）、ポリＡ＋ＳＭＡＲ（２．９ｋｂ）、およびベクターバックボーン（約２．５ｋｂ）を用いた消化後の４つのＤＮＡフラグメントを分離するためのアガロースゲル（１％）。（Ｂ）より鮮明な図のためのバックボーンおよびｐＡ＋ＳＭＡＲフラグメントを分離するための同じアガロースゲルの延長した泳動。（複数の酵素消化のために４つの制限酵素：ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを使用した。）
【図3】図３は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の調製の概略図である。ＥＣＯは、水溶液中、所定のｐＤＮＡ濃度およびアミン／リン酸（Ｎ／Ｐ）比でｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲを用いて自己組織化し、安定なナノ粒子を形成する。
【図4】ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（Ｎ／Ｐ＝８）の形成。サイズ分布のＤＬＳ（Ａ）、ゼータ電位分布（Ｂ）およびアガロースゲル電気泳動によるプラスミドカプセル化（Ｃ）。
【図5】ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（２００ｎｇ／μＬ、１μＬ）の７日間の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現。網膜の異なる位置（Ａ）および網膜全体（Ｂ）でのＡＢＣＡ４発現の共焦点顕微鏡画像。ポリクローナルＡＢＣＡ４抗体を用いる免疫染色。ＡＢＣＡ４発現は、白色で示した。ＰＢＳ注射眼試料を対照として使用した。
【図6】図６は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（４００ｎｇ／μＬ、０．５μＬ）の８日間の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡレベルを反対側のＰＢＳ対照に対して正規化し、個々に示した。
【図7】図７は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子（２００ｎｇ／μＬ、１μＬ）の７日間の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡレベルを反対側のＰＢＳ対照に対して正規化し、個々に示した。
【図8】図８は、ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の調製の概略図である。ＰＥＧ－ＭＡＬリガンド（２．５モル％）を最初に混合し、水溶液中で３０分間ＥＣＯ分子と反応させる。その後、安定なナノ粒子を形成するためにｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲを所定のｐＤＮＡ濃度およびアミン／リン酸（Ｎ／Ｐ）比で溶液に添加した際、ＰＥＧ化ナノ粒子は、自己組織化により形成された。
【図9】図９（Ａ～Ｄ）は、異なる貯蔵温度下、１０％スクロースの有無でのＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の安定性を図解する。０日、７日および１ヶ月で試験した、４℃および－２０℃で貯蔵したＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（Ａ）、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（Ｂ）、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（１０％スクロース）（Ｃ）およびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子（Ｄ）のサイズ分布のＤＬＳ。
【図10】図１０は、０日、７日および１ヶ月での４℃または－２０℃下、１０％スクロースの有無でのＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子のアガロースゲル電気泳動を図解する。
【図11】図１１は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を用いて図解する。（ＮＰ１のｍＲＮＡレベルをＮＰ２に対して正規化した。ＮＰ３のｍＲＮＡレベルをＮＰ１に対して正規化した。）
【図12】図１２は、同じ用量であるが異なる体積のＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。１μＬ注射体積のＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡレベルを用いるＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、０．５μＬ注射体積に対して正規化した。
【図13】図１３は、ＰＥＧ化（２．５％）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下注射７日後のＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を図解する。ｍＲＮＡレベルを５０ｎｇ用量群に対して正規化した。
【図14】図１４は、ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（２．５％ＰＥＧ）ナノ粒子の網膜下注射７日後の異なる齢のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を図解する。
【図15】図１５は、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析により説明された、－２０℃で１週間、２週間および１ヶ月貯蔵したＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する（新しく調製したナノ粒子を対照として使用した）。
【図16】図１６は、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を用いて、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。（ｍＲＮＡレベルを非処置対照マウスに対して正規化した。）
【図17】図１７は、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を用いて、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の硝子体内投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。（ｍＲＮＡレベルを非処置対照マウスに対して正規化した。）
【図18】図１８は、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を用いて、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下および硝子体内投与後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現の比較を図解する。（ｍＲＮＡレベルを非処置対照マウスに対して正規化した。）
【図19】図１９は、ａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡ２Ｅ蓄積を防止するためのＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を図解する。網膜下注射の８ヶ月後の対照マウスに対するＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスの定量的Ａ２Ｅレベル。
【図20】図２０は、ａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡ２Ｅ蓄積を防止するためのＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を図解する。網膜下注射の８ヶ月後の対照およびナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスからのＡ２ＥのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図21】図２１は、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（１００ｎｇ）の網膜下投与の８ヶ月後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡＢＣＡ４発現を図解する。ＡＢＣＡ４発現を緑色で示した。ＲＰＥ６５は赤で標識した。
【図22】図２２は、ａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡ２Ｅ蓄積を防止するためのＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を図解する。網膜下注射１年後の対照マウスに対するＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスの定量的Ａ２Ｅレベル。
【図24】図２４は、多重処置後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡ２Ｅ蓄積を防止するためのＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を図解する。最初の網膜下処置の８ヶ月後の対照マウスに対するＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスの定量的Ａ２Ｅレベル。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）
【図25】図２５は、多重処置後のａｂｃａ４－／－マウスにおけるＡ２Ｅ蓄積を防止するためのＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を図解する。最初の網膜下注射の８ヶ月後の対照およびナノ粒子処置Ａｂｃａ４－／－マウスからのＡ２ＥのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図27】図２７は、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の安全性を図解する。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の遺伝子治療を受けているａｂｃａ４－／－マウスのインビボ安全性は、走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）画像により示された。画像は、１００ｎｇの単回用量網膜下注射の７ヶ月後に蛍光（Ｆ）および赤外線（ＩＲ）チャネルを通じて撮影された。対照は、非処置マウスである。処置マウスでは有害作用は観察されなかった。
【図28】図２８は、多重処置後のＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の安全性を図解する。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の遺伝子治療を受けているａｂｃａ４－／－マウスのインビボ安全性は、走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）画像により示された。画像は、１００ｎｇの最初の用量の網膜下注射の８ヶ月後に蛍光（Ｆ）および赤外線（ＩＲ）チャネルを通じて撮影された。マウスは、３ヶ月ごとに合計２回の注射を受けた。
【図29】図２９は、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＤＮＡナノ粒子の安全性を図解する。眼の状態および５％スクロースを有するＡＣＵ－ＰＥＧ－ＨＺ－ＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＧＦＰナノ粒子で処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの眼におけるＧＦＰ発現。ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰを陽性対照として使用した。処置の１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後の眼の状態およびＧＦＰ発現の走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）画像。白点（ＧＦＰ）、大きい白色領域（潜在的な炎症）。
【発明を実施するための形態】
【0046】
従来の分子生物学技術を含む方法が本明細書に記載されている。そのような技術は、一般に当業者に既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク，１９９２（定期的な更新あり）など、方法論の論文に詳細に記載されている。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本発明が関係する当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。分子生物学用語の一般に理解されている定義は、例えば、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，第５版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：ニューヨーク，１９９１、およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，オックスフォード大学出版：ニューヨーク，１９９４に見つけることができる。本明細書に提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される、ある特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【0047】
明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のものを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに注意する必要がある。したがって、例えば「医薬担体」への言及は、２つまたはそれ以上の担体の混合物などを含む。「任意選択の」または「場合によっては」は、後述された事象または状況が生じる可能性があるか生じる可能性がない、ならびにその説明がその事象または状況が生じる可能性がある場合、そうでない場合を含むことを意味する。例えば、成句「場合によっては置換された低級アルキル」は、低級アルキル基が置換される可能性があるか可能性がないこと、ならびに説明が非置換低級アルキルおよび置換がある低級アルキルの両方を含むことを意味する。
【0048】
用語「アルキル基」は、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合を保持しているＣ２～Ｃ２０アルキル基として本明細書で定義される。
【0049】
本明細書で使用されるような用語「アルキル基」は、１から２５の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。「低級アルキル」基は、１から６の炭素原子を含むアルキル基である。
【0050】
本明細書で使用されるような用語「アシル」基は、式Ｃ（Ｏ）Ｒにより表され、式中、Ｒは、例えば、本明細書で定義されたようなアルキルまたは芳香族基などの有機基である。
【0051】
本明細書で使用されるような用語「アルキレン基」は、互いに結合した２つまたはそれ以上のＣＨ２基を有する基である。アルキレン基は、式（ＣＨ２）ａにより表すことができ、式中、ａは、２から２５の整数である。
【0052】
本明細書で使用されるような用語「芳香族基」は、ベンゼン、ナフタレンなどを含むがこれらに限定されない芳香族基を含む任意の基である。用語「芳香族」はまた、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基として定義されている「ヘテロアリール基」を含む。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるがこれらに限定されない。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハライド、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシが含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の基で置換することができる。
【0053】
成句「窒素含有置換基」は、任意のアミノ基として本明細書で定義される。用語「アミノ基」は、一級、二級、または三級アミノ基として本明細書で定義される。代わりに、窒素含有置換基は、四級アンモニウム基であり得る。窒素含有置換基は、芳香族または脂環式基であり得、窒素原子は、環の一部であるか、１つまたは複数の原子により環に直接または間接的に結合している（すなわちペンダント）。窒素含有置換基は、式ＲＮＨ２を有するアルキルアミノ基であり得、Ｒは、分岐または直鎖のアルキル基であり、アミノ基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【0054】
用語「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアニン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形状、またはそれらの任意のホスホエステル類縁体、例えばいずれも一本鎖の形状または二重螺旋のホスホロチオエートおよびチオエステルを指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。用語の核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次構造と二次構造のみを指し、特定の三次の形状に限定するものではない。したがって、この用語には、とりわけ、直鎖または環状のＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向の配列のみ（すなわち、ｍＲＮＡと配列相同性を有する鎖）を与える通常の慣例にしたがって、本明細書に記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けているＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれるがこれらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載されるような１つまたは複数の核酸を含む。
【0055】
本明細書で使用されるように、「コーディング領域」または「コーディング配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「ストップコドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）が典型的にアミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部とみなすことができるが、任意の隣接配列、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロンなどは、コーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳停止コドンにより典型的に決定される。２つまたはそれ以上のコーディング領域は、例えば単一のベクター上の単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、または例えば別個の（異なる）ベクター上の別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に存在することができる。したがって、単一のベクターには単一のコーディング領域のみを含むことができるか、２つまたはそれ以上のコーディング領域を含むことができる。
【0056】
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列の３’に位置しているヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、翻訳の開始部位の下流に位置している。
【0057】
用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’に位置しているヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態において、上流のヌクレオチド配列は、コーディング領域の５’側または転写の開始点に位置している配列に関する。例えば、ほとんどのプロモータは、翻訳の開始部位の上流に位置している。
【0058】
本明細書で使用されるような用語「発現」は、ポリヌクレオチドが、遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。それには、限定されないがポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを伴う核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質切断を伴うポリペプチドがさらに含まれる。本明細書で使用されるような用語「収量」は、遺伝子の発現により産生されたポリペプチドの量を指す。
【0059】
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローン化および／または転写のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、別の核酸セグメントが結合したセグメントの複製をもたらすように結合することができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボで自律的な複製単位として機能する、すなわち独自の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えばプラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのビヒクルを含む。例えばプラスミド、修飾された真核ウイルス、または修飾された細菌ウイルスを含む多数のベクターは既知であり、当技術分野において使用される。ポリヌクレオチドの適切なベクターへの挿入は、適切なポリヌクレオチドフラグメントを、相補的な付着末端を有する選択されたベクターに結合することにより達成することができる。
【0060】
ベクターは、ベクターを組み込んでいる細胞の選択または同定のために提供される選択マーカーまたはレポーターをコードするように操作することができる。選択マーカーまたはレポーターの発現は、ベクターに含まれる他のコーディング領域を組み込み、発現する、宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当技術分野において既知であり、使用されている選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；ならびに表現型マーカーとして使用されている遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる。当技術分野において既知であり、使用されているレポーターの例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが含まれる。選択マーカーはまた、レポーターであるとみなすことができる。
【0061】
用語「異種」は、比較される、または導入もしくは組み込まれる実体の残りと遺伝子的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、異なる細胞のタイプに遺伝子工学的技術により導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現された場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれている細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、ベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。
【0062】
用語「異種遺伝子」または「異種核酸」は、交換可能に使用され、ウイルスゲノムの一部として自然には発生しない遺伝子または核酸を指す。例えば、異種遺伝子は、哺乳動物遺伝子、例えば治療遺伝子、例えば治療用タンパク質をコードする哺乳動物遺伝子であり得る。いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、標的細胞および／または被験者に欠落しているか存在しないタンパク質またはその一部をコードする。いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、標的細胞および／または被験者に欠落しているか存在しないタンパク質をコードする１つまたは複数のエクソンを含む。例えば、いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１７／０８７９００号に記載されているような１つまたは複数のトランススプライシング分子を含む。いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、治療用核酸、例えば治療用ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）を含む。
【0063】
用語「プロモータ」は、プロモータに動作可能に結合した異種遺伝子の転写を調節する配列を指す。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼおよび効率的な転写に必要な他の転写因子の転写および／または認識部位を誘導するのに十分な配列を提供し、細胞特異的発現を誘導することができる。転写を誘導するのに十分な配列に加えて、プロモータ配列はまた、転写の調節に関与している他の調節エレメントの配列（例えばエンハンサ、コザック配列、およびイントロン）を含むことができる。
【0064】
用語「標的細胞」は、標的遺伝子を発現し、ベクターが感染する、または感染することを意図する任意の細胞を指す。ベクターは、被験者に存在する標的細胞（インサイチュ）または培養中の標的細胞に感染することができる。いくらかの実施形態において、本発明の標的細胞は、有糸分裂後の細胞である。標的細胞は、脊椎動物および無脊椎動物の細胞（および動物由来の細胞系統）の両方を含む。脊椎動物細胞の代表的な例には、哺乳動物細胞、例えばヒト、齧歯類（例えばラットおよびマウス）、および有蹄類（例えばウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ）が含まれる。標的細胞は、眼細胞、例えば網膜細胞を含む。代わりに、標的細胞は、幹細胞（例えば多能性細胞（すなわちその子孫が造血幹細胞または他の幹細胞などのいくらかの制限された細胞のタイプに分化することができる細胞）または全能細胞（すなわちその子孫が生物のあらゆる細胞のタイプ、例えば胚性幹細胞、および造血細胞などの体性幹細胞になることができる細胞））であり得る。さらに他の実施形態において、標的細胞には、卵母細胞、卵子、胚の細胞、受精卵、精子細胞、および肝細胞、神経細胞、筋細胞および血液細胞（例えばリンパ球）などの多種多様の臓器または組織からの体性（非幹性）成熟細胞が含まれる。
【0065】
本明細書で使用されるような用語「宿主細胞」は、例えば、ｓｓＤＮＡまたはベクターのレシピエントとして使用することができるか使用されている、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を指す。その用語は、形質導入された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用されるような「宿主細胞」は、一般に外因性ＤＮＡ配列を用いて形質導入されている細胞を指す。単一の親細胞の子孫が、自然、偶発的、または意図的な突然変異のために、元の親と形態学またはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一であるとは限らないことが理解される。いくらかの実施形態において、宿主細胞は、インビトロ宿主細胞であり得る。
【0066】
用語「突然変異に関連する障害」または「障害に関連する突然変異」は、障害と突然変異との間の相関を指す。いくらかの実施形態において、突然変異に関連する障害は、突然変異により、完全にもしくは部分的にまたは直接もしくは間接的に引き起こされていることが既知であるか、疑いがある。例えば、突然変異を有する被験者は、障害が進行するリスクがあり得、リスクは、他の因子、例えば他の（例えば独立した）突然変異（例えば同じかまたは異なる遺伝子において）、または環境的因子にさらに依存している可能性がある。
【0067】
用語「被験者」は、特定の処置のレシピエントになる、ヒトおよび非ヒト動物（例えば齧歯類、節足動物、昆虫、魚（例えばゼブラフィッシュ））、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ類、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類など）が含まれるが限定されないあらゆる動物を指すことができる。典型的に、用語「患者」および「被験者」は、ヒト被験者に関して本明細書で交換可能に使用されている。
【0068】
用語「約」または「おおよそ」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、用語「約」または「おおよそ」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さについて数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さ±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲を指す。
【0069】
本明細書で使用されたすべてのパーセンテージおよび比は、別段の指定がない限り、重量によるものである。
【0070】
本明細書に記載の実施形態は、網膜または眼障害を処置するように構成されている機能的治療用タンパク質、本明細書に記載の１つまたは複数のプラスミドベクターと複合体化した複数のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を含む自己組織化ナノ粒子、本明細書に記載の自己組織化ナノ粒子および／または本明細書に記載のプラスミドベクターの水溶液を含む医薬組成物を発現する際の使用のためのプラスミドベクター、ならびに異種遺伝子のエピソーム発現を誘導するまたはそれを必要とする被験者における網膜もしくは眼障害を処置する方法に関する。
【0071】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクターは、ベクターの異種遺伝子の長期の転写または発現を提供することができる。いくらかの実施形態において、プラスミドベクターの持続性は、参照ベクターよりも５％から５０％高い、５０％から１００％高い、１倍から５倍、または５倍から１０倍（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上）高い。いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクターは、１週間から４週間、１ヶ月から４ヶ月、４ヶ月から１年、１年から５年、５年から２０年、または２０年から５０年（例えば少なくとも１週間、少なくとも２周間、少なくとも１ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、または少なくとも５０年）持続する。
【0072】
プラスミドベクターは、環状プラスミドベクターであり得る。環状プラスミドベクターは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体などであり得る。好ましくは、環状プラスミドベクターは、単量体または二量体である。他の実施形態において、環状プラスミドベクターは、単量体のスーパーコイル環状分子である。いくらかの実施形態において、プラスミドベクターは、切れ目が入っている可能性がある。いくらかの実施形態において、プラスミドベクターは、開環状であり得る。いくらかの実施形態において、プラスミドベクターは、二本鎖の環であり得る。
【0073】
本明細書に記載のプラスミドベクターは、異種遺伝子を標的細胞に挿入または発現するように使用することができる。本明細書に開示されるように、広範な異種遺伝子は、存在するベクターにより標的細胞に送達され得る。いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、異種遺伝子、例えば治療用タンパク質をコードする遺伝子、例えば標的細胞および／または被験者に欠落しているか存在しないタンパク質の発現により処置することができる疾患に関連する突然変異を有する標的細胞をトランスフェクトするように構成されている。
【0074】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子または核酸は、標的組織において自然に発現する欠陥タンパク質を置換するように実行可能な治療用タンパク質をコードすることが可能である。典型的に、置き換えることができる欠陥遺伝子には、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、劣性ＲＰ、優性網膜色素変性症、Ｘ連鎖性劣性網膜色素変性症、優性不完全型Ｘ連鎖性劣性網膜色素変性症、優性レーバー先天性黒内障、劣性運動失調症、網膜色素変性症を伴う後柱、ＲＰＥの側細動脈蓄積を伴う劣性網膜色素変性症(Recessive retinitis pigmentosa with para-arteriolar preservation of the RPE)、網膜色素変性症ＲＰ１２、アッシャー症候群、感音難聴を伴う優性網膜色素変性症、劣性網膜点状白斑、劣性アルストロム症候群、劣性バルデー・ビードル症候群、黄斑ジストロフィーまたは網膜変性を伴う優性脊髄小脳失調症、劣性無ベータリポタンパク血症、黄斑変性を伴う劣性網膜色素変性症、成人型劣性レフサム病、幼児型劣性レフサム病、劣性増強型Ｓ錐体症候群、精神遅滞を伴う網膜色素変性症、ミオパチーを伴う網膜色素変性症、劣性ニューファンドランド桿体錐体ジストロフィー、無色素性網膜色素変性症（Retinitis pigmentosa sinpigmento）、扇形網膜色素変性症、局所網膜色素変性症、セニオール・ローケン症候群、ジュベール症候群、若年性シュタルガルト病、遅発性シュタルガルト病、シュタルガルト型優性黄斑ジストロフィー、優性シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、劣性黄斑ジストロフィー、劣性黄色斑眼底、劣性錐体桿体ジストロフィー、Ｘ連鎖進行性錐体桿体ジストロフィー、優性錐体桿体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー；ド・グルーシー症候群（de Grouchy syndrome）、優性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖錐体ジストロフィー、劣性錐体ジストロフィー、過剰桿体網膜電図検査を伴う劣性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性萎縮性黄斑ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、優性黄斑ジストロフィー、優性の放射状黄斑ドルーゼン、優性牛眼状黄斑ジストロフィー、優性蝶形黄斑ジストロフィー、優性成人卵黄状黄斑ジストロフィー、優性ノースカロライナ型黄斑ジストロフィー、優性網膜錐体ジストロフィー１、優性嚢胞様黄斑ジストロフィー、優性非典型的卵黄型黄斑ジストロフィー、Ｆｏｖｅｏ黄斑性萎縮症(Foveomacular atrophy)、優性ベスト型黄斑ジストロフィー、進行性の優性ノースカロライナ様黄斑ジストロフィー、貧毛症を伴う劣性若年性黄斑ジストロフィー、劣性の中心窩形成不全および前眼部形成不全、劣性錐体順応遅延、青錐体一色型色覚異常の黄斑ジストロフィー、II型糖尿病および難聴を伴う黄斑性パターンジストロフィー、神鳥斑点網膜、パターンジストロフィー、優性スティックラー症候群、優性マーシャル症候群、優性硝子体網膜変性、優性家族性滲出性硝子体網膜症、優性硝子体網脈絡膜症；優性血管新生炎症性硝子体網膜症(Dominant neovascular inflammatory vitreoretinopathy)、ゴールドマン-ファーブル症候群、劣性色覚異常、優性第三色覚異常、劣性桿体一色型色覚異常、先天性赤緑色覚異常、緑第二色覚異常、赤第一色覚異常、緑色弱、第一色弱、劣性小口病、優性遅発性黄斑ジストロフィー、劣性脳回転状萎縮、優性極大萎縮(Dominant atrophia greata)、優性中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、Ｘ連鎖性コロイデレミア、中心性輪紋状、中心性、乳頭周囲の網脈絡膜萎縮、進行性の優性二巣状網脈絡膜萎縮(Dominant progressive bifocal chorioretinal atrophy)、進行性の二状性網脈絡膜萎縮（Progresive bifocal Choroioretinal atrophy）、優性ドインの蜂巣状網膜変性(マラッティア・レベンティネーズ（Malattia Leventinese)）、エナメル質形成不全、劣性ビエッティ結晶角膜網膜ジストロフィー、レイノー現象および偏頭痛を伴う優性遺伝性血管網膜症、優性ワーグナー病およびびらん性硝子体網膜症(erosive vitreoretinopathy)、劣性小眼球症および網膜疾患症候群；劣性真性小眼球症、劣性精神遅滞、痙性および網膜変性、劣性ボスニアジストロフィー、劣性弾力線維性仮性黄色腫、優性弾力線維性仮性黄色腫；劣性若年性バッテン病(セロイドリポフスチン症)、優性アラジール症候群、マクージック・カウフマン症候群、低ベータリポタンパク血症、有棘赤血球増加症、パラダイアル（palladial）変性症；劣性ハラーホルデン・スパッツ症候群；優性ソースビー眼底変性症、オレゴン眼病(Oregon eye disease)、カーンズ・セイヤー症候群、発達異常および神経異常を伴う網膜色素変性症、バッセン・コーンツヴァイク症候群（Basseb Korenzweig Syndrome）、ハーラー病、サンフィリッポ病、シャイエ病（Scheie disease）、黒色腫随伴網膜症、シーン網膜ジストロフィー(Sheen retinal dystrophy)、デュシェンヌ型黄斑ジストロフィー（Duchenne macular dystrophy）、ベッカー型黄斑ジストロフィー(Becker macular dystrophy)、およびバードショット網脈絡膜症（Birdshot Retinochoroidopathy）などの網膜変性疾患の原因となる遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【0075】
網膜または眼障害に関連する欠損タンパク質を置換するために、実行可能な治療用タンパク質をコードする異種遺伝子の例は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、（Ｒａｂエスコートタンパク質－１）ＲＥＰ１、Ｌ－オプシン、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ホスホジエステラーゼ６（３（ＰＤＥ６Ｉ３）、ＡＴＰ－結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、遅延型網膜変性／ペリフェリン（ＲＤＳ／ペリフェリン）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｒ（ＭＥＲＴＫ）、イノシン－５’－一リン酸デヒドロゲナーゼＩ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、アリール炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼレギュレータ相互作用タンパク質１（ＰＲＧＲＩＰＩ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質、アルファトランスデューシングアクティビティポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、環状ヌクレオチド作動性チャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、レチノスキシン１（Ｒｓ１）、眼白皮症１型（ＯＡ１）、眼皮膚白皮症１型（ＯＣＡ１）、チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ－１／Ｃｉｐ１、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エンドスタチン、アンギオスタチン、アリールスルファターゼＢ、１３－グルクロニダーゼ、アッシャリン２Ａ（ＵＳＨ２Ａ）、中心体タンパク質２９０（ＣＥＰ２９０）、調節シナプス膜エキソサイトーシス１（ＲＩＭＳ１）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）、コイルドコイルおよびＣ２ドメイン含有２Ａ（ＣＣ２Ｄ２Ａ）、一過性受容体電位型カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー１（ＴＲＰＭ１）、繊毛内タンパク質輸送１７２（ＩＦＴ－１７２）、コラーゲンタイプ１アルファ１チェーン（ＣＯＬ１１Ａ１）、チューブリンガンマ複合体会合タンパク質６（ＴＵＢＧＣＰ６）、ＫＩＡＡ１５４９、電圧依存性カルシウムチャネルサブユニットアルファ１Ｆ（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）、ミオシンＶＩＩＡ（ＭＹＯ７Ａ）、バーシカン（ＶＣＡＮ）、またはヘミセンチン１（ＨＭＣＮ１）から選択される。
【0076】
治療用タンパク質の他の例には、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、抗糖尿病因子、抗アポトーシス剤、凝固因子、抗腫瘍因子からなる群より選択される１つまたは複数のポリペプチドが含まれる。種々の網膜由来神経栄養因子は、変性した光受容体細胞をレスキューする可能性を有しており、本明細書に記載されるようなベクターを使用して発現させることができる。好ましい生物活性剤は、ＶＥＧＦ、アンギオテンシン、アンジオポエチン－１、ＤｅＭ、酸性または塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、ＦＧＦ－２、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、散乱係数（ＳＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、ＲｄＣＶＦ（桿体由来錐体生存性因子）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－アルファ）、ＰＥＤＦ、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－アルファ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管透過性因子（ＶＰＦ）、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＰＥＤＦ、ＮＴ３、ＢＦＧＦ、アンジオポエチン、エフリン、ＥＰＯ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ＮＴ５、Ｇａｘ、成長ホルモン、［アルファ］－１－アンチトリプシン、カルシトニン、レプチン、アポリポタンパク質、ビタミンの生合成酵素、ホルモンまたは神経伝達物質、ケモカイン、ＩＬ－１、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３などのサイトカイン、それらの受容体、前記受容体のいずれか１つを遮断する抗体、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ＴＩＭＰ－４などのＴＩＭＰ、アンギオアレスチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩおよびエンドスタチンＸＶなどのエンドスタチン、ＡＴＦ、アンギオスタチン、エンドスタチンおよびアンギオスタチンの融合タンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼ－２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインの融合タンパク質、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子－４（ＰＦ４）、プロラクチンフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、Ｃ３ａおよびＣ５ａ阻害剤、複合攻撃膜阻害剤、因子Ｈ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、カベオリン、ＰＫＣゼータ、結合タンパク質、ＪＡＭ、ＣＤ３６、ＭＥＲＴＫバスキュロスタチン（vasculostatin）、バソスタチン（カルレティキュリンフラグメント）、トロンボスポンジン、フィブロネクチン、特にフィブロネクチンフラグメントｇｒｏ－ベータ、ヘパリナーゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ－１０）、インターフェロンガンマによるモノカイン誘発（Ｍｉｇ）、インターフェロン－アルファ誘導性タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇおよびＩＰ１０の融合タンパク質、可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）受容体、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、Ｂｃｌ－２、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ、ＢｃＩ－ＸショートアイソフォームおよびＧａｘなどのアポトーシスの調節因子、それらのフラグメントもしくは誘導体などから選択することができる。
【0077】
他の実施形態において、異種遺伝子は、例えばエンドヌクレアーゼが、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンのために提供される部位特異的エンドヌクレアーゼをコードすることができる。例えば、優性対立遺伝子は、野生型の場合、網膜構造タンパク質である、および／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠陥コピーをコードし、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ）は、欠陥対立遺伝子を標的とし、欠陥対立遺伝子をノックアウトすることができる。欠陥対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼはまた、欠陥対立遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組換えを刺激するためにも使用することができる。したがって、例えば、本発明の方法は、欠陥対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの両方を送達するために使用することができ、欠陥対立遺伝子の機能的コピーを送達するために使用することができ、結果として欠陥対立遺伝子の修復となり、それによって、機能性網膜タンパク質（例えば、機能性レチノスキシン、機能性ＲＰＥ６５、機能性ペリフェリンなど）の産生を提供する。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７５：２１７を参照されたい。いくらかの実施形態において、ベクターは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；および欠陥対立遺伝子の機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを含み、機能的コピーは、機能性網膜タンパク質をコードする。機能性網膜タンパク質には、例えばレチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン－２などが含まれる。使用に適している部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；および転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、天然に存在せず、特定の遺伝子を標的とするように修飾されている。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、非相同末端結合は、いくらかのヌクレオチドを挿入または削除しながら破断を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも呼ばれる）は、その後、タンパク質をフレームの外に放り出し、効果的に遺伝子をノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
【0078】
他の実施形態において、異種遺伝子は、抗体、またはその一部、フラグメント、もしくは変異体をコードすることができる。抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ（シングルドメイン抗体）および（Ｆａｂ’）２（化学的に結合したＦ（ａｂ’）２を含む）などの抗原に結合することができるフラグメントを含む。抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂフラグメント」と呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、ならびに名前が容易に結晶化する能力を反映した残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有しており、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。抗体はまた、キメラ抗体およびヒト化抗体も含む。さらに、本明細書で提供されるすべての抗体コンストラクトについて、他の生物からの配列を有する変異体も考慮される。したがって、抗体のヒトバージョンが開示される場合、当業者は、ヒト配列ベースの抗体をマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマなどの配列に変換する方法を理解するであろう。抗体フラグメントにはまた、単鎖ｓｃＦｖ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムトリ－ｓｄｃＦｖ、ミニボディなどのいずれかの方向も含まれる。いくらかの実施形態において、例えば、抗体がｓｃＦｖである場合、異種遺伝子の単一のポリヌクレオチドは、一緒に結合された重鎖および軽鎖の両方を含む単一のポリペプチドをコードする。抗体フラグメントにはまた、ナノボティ（例えば、ｓｄＡｂ、単一の単量体ドメイン、例えば軽鎖がない重鎖の一対の可変ドメインを有する抗体）が含まれる。多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体など）は、当技術分野において既知であり、本発明の異種遺伝子の発現産物として考えられる。
【0079】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子には、例えば特定の細胞および組織における異種遺伝子の発現を検証するのに有用であり得るレポーター配列が含まれる。導入遺伝子において提供される可能性があるレポーター配列には、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当技術分野において周知である他のものをコードするＤＮＡ配列が含まれるが限定されない。発現を駆動する調節エレメントに関連付けられている場合、レポーター配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫組織染色を含む、酵素アッセイ、放射線写真アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイまたは他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイおよび免疫学的アッセイを含む、従来の手段による検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを運搬するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを運搬するベクターは、ルミノメータでの色または光生成により視覚的に測定することができる。
【0080】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、コーディング配列を含まない。ｓｈＲＮＡ、プロモータ、エンハンサ、ＤＮＡをマークする配列（例えば抗体認識用）、ＰＣＲ増幅部位、制限酵素部位を定義する配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、核酸に結合および／または修飾するタンパク質により認識される配列、ならびにリンカーなどの非コーディング配列は、ベクターに含まれ得る。異種遺伝子がトランススプライシング分子である場合、非コーディング配列は、標的イントロンを結合する結合ドメインを含む。
【0081】
いくらかの実施形態において、異種遺伝子は、長さが０．１Ｋｂから１００Ｋｂである（例えば、異種遺伝子は、長さが０．２Ｋｂから９０Ｋｂ、０．５Ｋｂから８０Ｋｂ、１．０Ｋｂから７０Ｋｂ、１．５Ｋｂから６０Ｋｂ、２．０Ｋｂから５０Ｋｂ、２．５Ｋｂから４５Ｋｂ、３．０Ｋｂから４０Ｋｂ、３．５Ｋｂから３５Ｋｂ、４．０Ｋｂから３０Ｋｂ、４．５Ｋｂから２５Ｋｂ、４．６Ｋｂから２４Ｋｂ、４．７Ｋｂから２３Ｋｂ、４．８Ｋｂから２２Ｋｂ、４．９Ｋｂから２１Ｋｂ、５．０Ｋｂから２０Ｋｂ、５．５Ｋｂから１８Ｋｂ、６．０Ｋｂから１７Ｋｂ、６．５Ｋｂから１６Ｋｂ、７．０Ｋｂから１５Ｋｂ、７．５Ｋｂから１４Ｋｂ、８．０Ｋｂから１３Ｋｂ、８．５Ｋｂから１２．５Ｋｂ、９．０Ｋｂから１２．０Ｋｂ、９．５Ｋｂから１１．５Ｋｂ、もしくは１０．０Ｋｂから１１．０Ｋｂ、例えば、長さが０．１Ｋｂから０．５Ｋｂ、０．５Ｋｂから１．０Ｋｂ、１．０Ｋｂから２．５Ｋｂ、２．５Ｋｂから４．５Ｋｂ、４．５Ｋｂから８Ｋｂ、８Ｋｂから１０Ｋｂ、１０Ｋｂから１５Ｋｂ、１５Ｋｂから２０Ｋｂ、またはそれより大きい、例えば、長さが０．１Ｋｂから０．２５Ｋｂ、０．２５Ｋｂから０．５Ｋｂ、０．５Ｋｂから１．０Ｋｂ、１．０Ｋｂから１．５Ｋｂ、１．５Ｋｂから２．０Ｋｂ、２．０Ｋｂから２．５Ｋｂ、２．５Ｋｂから３．０Ｋｂ、３．０Ｋｂから３．５Ｋｂ、３．５Ｋｂから４．０Ｋｂ、４．０Ｋｂから４．５Ｋｂ、４．５Ｋｂから５．０Ｋｂ、５．０Ｋｂから５．５Ｋｂ、５．５Ｋｂから６．０Ｋｂ、６．０Ｋｂから６．５Ｋｂ、６．５Ｋｂから７．０Ｋｂ、７．０Ｋｂから７．５Ｋｂ、７．５Ｋｂから８．０Ｋｂ、８．０Ｋｂから８．５Ｋｂ、８．５Ｋｂから９．０Ｋｂ、９．０Ｋｂから９．５Ｋｂ、９．５Ｋｂから１０Ｋｂ、１０Ｋｂから１０．５Ｋｂ、１０．５Ｋｂから１１Ｋｂ、１１Ｋｂから１１．５Ｋｂ、１１．５Ｋｂから１２Ｋｂ、１２Ｋｂから１２．５Ｋｂ、１２．５Ｋｂから１３Ｋｂ、１３Ｋｂから１３．５Ｋｂ、１３．５Ｋｂから１４Ｋｂ、１４Ｋｂから１４．５Ｋｂ、１４．５Ｋｂから１５Ｋｂ、１５Ｋｂから１５．５Ｋｂ、１５．５Ｋｂから１６Ｋｂ、１６Ｋｂから１６．５Ｋｂ、１６．５Ｋｂから１７Ｋｂ、１７Ｋｂから１７．５Ｋｂ、１７．５Ｋｂから１８Ｋｂ、１８Ｋｂから１８．５Ｋｂ、１８．５Ｋｂから１９Ｋｂ、１９Ｋｂから１９．５Ｋｂ、１９．５Ｋｂから２０Ｋｂ、２０Ｋｂから２１Ｋｂ、２１Ｋｂから２２Ｋｂ、２２Ｋｂから２３Ｋｂ、２３Ｋｂから２４Ｋｂ、２４Ｋｂから２５Ｋｂ、またはそれより大きい、例えば、長さが約４．５Ｋｂ、約５．０Ｋｂ、約５．５Ｋｂ、約６．０Ｋｂ、約６．５Ｋｂ、約７．０Ｋｂ、約７．５Ｋｂ、約８．０Ｋｂ、約８．５Ｋｂ、約９．０Ｋｂ、約９．５Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約１１Ｋｂ、約１２Ｋｂ、約１３Ｋｂ、約１４Ｋｂ、約１５Ｋｂ、約１６Ｋｂ、約１７Ｋｂ、約１８Ｋｂ、約１９Ｋｂ、約２０Ｋｂ、またはそれより大きい）。
【0082】
異種遺伝子に加えて、本明細書に記載のプラスミドベクターは、標的細胞における転写、翻訳、および／または発現を可能にする方法で異種遺伝子に動作可能に結合している従来の制御エレメントを含むことができる。
【0083】
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモータ、およびエンハンサ配列；効率的なＲＮＡ処理シグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；転写効率を強化する配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を強化する配列；およびコードされた産物の分泌を強化する配列が含まれる。天然型、構成的、誘導性、および／または組織特異的であるプロモータを含む種々の発現制御配列は、当技術分野において既知であり、利用することができる。得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される可能性があるように、プロモータ領域がその遺伝子の転写を実行することができる場合、プロモータ領域は、異種遺伝子に動作可能に結合している。本明細書に記載のベクターの一部として有用なプロモータには、構造的および誘導性プロモータが含まれる。
【0084】
網膜特異的遺伝子発現を誘導するヒト配列に基づくプロモータの例には、桿体および錐体のためのロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）、錐体のみのためのＰＲ２．１、および網膜色素上皮のためのＲＰＥ６５が含まれる。
【0085】
いくらかの実施形態において、遺伝子発現は、ヒトＧＲＫ１プロモータを使用して達成することができる。したがって、ある特定の実施形態において、プロモータは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモータである。
【0086】
いくらかの実施形態において、本開示のＧＲＫ１プロモータ配列は、２９２のヌクレオチド長を含むか、それからなり、ＧＲＫ１遺伝子のヌクレオチド－１０９から＋１８３を含むか、それからなる。
【0087】
いくらかの実施形態において、ＧＲＫ１プロモータベクターは、異種遺伝子の上流のプラスミドベクターに位置している可能性がある。例えば、ＧＲＫ１は、異種遺伝子の５’末端部分に動作可能に結合している可能性がある。
【0088】
プラスミドベクターはまた、異種遺伝子の下流の３’方向に位置したヒトスカフォールド／マトリックスアタッチメント領域Ｓ／ＭＡＲエンハンサを含むことができる。Ｓ／ＭＡＲエレメントは、核マトリックスとの相互作用を通じて長期的な遺伝子発現を確立するために使用され、ヘテロクロマチンコアから外側に延びるクロマチンループドメインを生成する。Ｓ／ＭＡＲエレメントが明らかなコンセンサスまたは認識可能な配列を含まないが、それらの最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含有量であり、Ｃ塩基は１つの鎖で優勢であるように見える（Ｂｏｄｅ Ｊ，Ｓｃｈｌａｋｅ Ｔ，ＲｉｏｓＲａｍｉｒｅｚ Ｍ，Ｍｉｅｌｋｅ Ｃ，Ｓｔｅｎｇａｒｔ Ｍ，Ｋａｙ ＶおよびＫｌｅｈｒＷｉｒｔｈ Ｄ，「Ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ－ａｔｔａｃｈｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｒｅｔｉｅｓ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｌｏｃｉ」，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｔｒｉｘ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｉｔｏｌｏｇｙ，１６２Ａ：３８９４５３，１９９５）。これらの領域は、鎖が分離しやすい可能性がある曲がった二次構造を形成する傾向がある。それらは多くの場合、塩基不対領域（ＢＵＲ）と呼ばれ、鎖分離の核形成点を表す可能性のあるコア巻き戻しエレメント（ＣＵＥ）を含む（Ｂｅｎｈａｍ Ｃ ａｎｄ ａｌ．，Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ．ＭｏＬ ＢｉｏＬ，２７４：１８１－１９６，１９９７）。いくらかの単純ＡＴリッチ配列モチーフは、多くの場合ＭＡＲ配列内に見出されているが、ほとんどの場合、それらの機能的重要性および潜在的な作用機序は不明のままである。
【0089】
本明細書に記載されるようなＳ／ＭＡＲエンハンサは、１つまたは複数（例えば２つ、３つまたは４つ）の特徴、例えば自然に発生する「Ｓ／ＭＡＲ」を有する上述したものを共有するヌクレオチド配列である。Ｓ／ＭＡＲエンハンサは、前記Ｓ／ＭＡＲにより影響された任意の遺伝子のタンパク質発現を促進する少なくとも１つの特性を有する。Ｓ／ＭＡＲエンハンサはまた、一般に、好ましくはＳ／ＭＡＲ活性を呈示する、特に転写調節、好ましくは増強活性を呈示するが、例えば発現安定化活性および／または他の活性も呈示する、単離および／または精製された核酸である特徴を有する。
【0090】
Ｓ／ＭＡＲエンハンサは、異種遺伝子が動作可能に結合されている、または動作可能に結合することができるプロモータ領域の下流に挿入することができる。しかし、ある特定の実施形態において、Ｓ／ＭＡＲエンハンサが目的の異種遺伝子配列の上流、下流、またはすぐ下流に位置していることが好都合である。シスおよび／またはトランスの両方の他の多重Ｓ／ＭＡＲ配置はまた、本開示の範囲内である。
【0091】
タンパク質をコードする異種遺伝子の場合、ヒトポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列は、異種遺伝子の後または下流に挿入される可能性がある。例えば異種遺伝子の３’に配置されたポリアデニル化シグナル配列により、宿主因子が転写中に初期のｍＲＮＡの末端にポリアデノシン（ポリＡ）テールを追加することができる。ポリＡテールは、ｍＲＮＡを酵素的分解から保護し、また翻訳を支援する３００以下のアデノシンリボヌクレオチドのストレッチである。したがって、本明細書に記載のプラスミドベクターは、ヒトベータグロビンまたはウサギベータグロビンポリＡシグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期または後期ポリＡシグナル、ヒトインスリンポリＡシグナル、またはウシ成長ホルモンポリＡシグナルなどのポリＡシグナル配列を含む可能性がある。一実施形態において、ポリＡシグナル配列は、ヒトベータグロビンポリＡシグナルである。
【0092】
図１に図解されるように、ＧＲＫ１プロモータ、異種遺伝子、ポリＡシグナル配列、およびＳ／ＭＡＲエンハンサは、異種遺伝子の上流の５’方向でＧＲＫ１プロモータ、ならびに異種遺伝子から下流の３’方向でポリＡシグナル配列およびＳ／ＭＡＲエンハンサの順に、またはその逆順に、プラスミドベクター上の適切に追加された制限酵素部位を使用してクローン化することが可能である。例えば、プラスミドベクターは、５’から３’方向で動作可能に結合した：（ｉ）ヒトＧＲＫ１プロモータ、（ｉｉ）異種遺伝子、（ｉｉｉ）ポリアデニル化部位、および（ｉｖ）Ｓ／ＭＡＲエンハンサを含む可能性がある。
【0093】
いくらかの実施形態において、本明細書で提供されたプラスミドベクターは、例えば、ＩＴＲ、ＬＴＲ、または、例えば、環化の結果として他の末端構造に由来している可能性がある末端反復配列を含む。末端反復配列は、少なくとも１０塩基対（ｂｐ）長（例えば、１０ｂｐから５００ｂｐ、１２ｂｐから４００ｂｐ、１４ｂｐから３００ｂｐ、１６ｂｐから２５０ｂｐ、１８ｂｐから２００ｂｐ、２０ｂｐから１８０ｂｐ、２５ｂｐから１７０ｂｐ、３０ｂｐから１６０ｂｐ、または５０ｂｐから１５０ｂｐ、例えば、１０ｂｐから１５ｂｐ、１５ｂｐから２０ｂｐ、２０ｂｐから２５ｂｐ、２５ｂｐから３０ｂｐ、３０ｂｐから３５ｂｐ、３５ｂｐから４０ｂｐ、４０ｂｐから４５ｂｐ、４５ｂｐから５０ｂｐ、５０ｂｐから５５ｂｐ、５５ｂｐから６０ｂｐ、６０ｂｐから６５ｂｐ、６５ｂｐから７０ｂｐ、７０ｂｐから８０ｂｐ、８０ｂｐから９０ｂｐ、９０ｂｐから１００ｂｐ、１００ｂｐから１５０ｂｐ、１５０ｂｐから２００ｂｐ、２００ｂｐから３００ｂｐ、３００ｂｐから４００ｂｐ、または４００ｂｐから５００ｂｐ、例えば、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、２８ｂｐ、２９ｂｐ、３０ｂｐ、３１ｂｐ、３２ｂｐ、３３ｂｐ、３４ｂｐ、３５ｂｐ、３６ｂｐ、３７ｂｐ、３８ｂｐ、３９ｂｐ、４０ｂｐ、４１ｂｐ、４２ｂｐ、４３ｂｐ、４４ｂｐ、４５ｂｐ、４６ｂｐ、４７ｂｐ、４８ｂｐ、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５１ｂｐ、５２ｂｐ、５３ｂｐ、５４ｂｐ、５５ｂｐ、５６ｂｐ、５７ｂｐ、５８ｂｐ、５９ｂｐ、６０ｂｐ、６１ｂｐ、６２ｂｐ、６３ｂｐ、６４ｂｐ、６５ｂｐ、６６ｂｐ、６７ｂｐ、６８ｂｐ、６９ｂｐ、７０ｂｐ、７１ｂｐ、７２ｂｐ、７３ｂｐ、７４ｂｐ、７５ｂｐ、７６ｂｐ、７７ｂｐ、７８ｂｐ、７９ｂｐ、８０ｂｐ、８１ｂｐ、８２ｂｐ、８３ｂｐ、８４ｂｐ、８５ｂｐ、８６ｂｐ、８７ｂｐ、８８ｂｐ、８９ｂｐ、９０ｂｐ、９１ｂｐ、９２ｂｐ、９３ｂｐ、９４ｂｐ、９５ｂｐ、９６ｂｐ、９７ｂｐ、９８ｂｐ、９９ｂｐ、１００ｂｐ、１０１ｂｐ、１０２ｂｐ、１０３ｂｐ、１０４ｂｐ、１０５ｂｐ、１０６ｂｐ、１０７ｂｐ、１０８ｂｐ、１０９ｂｐ、１１０ｂｐ、１１１ｂｐ、１１２ｂｐ、１１３ｂｐ、１１４ｂｐ、１１５ｂｐ、１１６ｂｐ、１１７ｂｐ、１１８ｂｐ、１１９ｂｐ、１２０ｂｐ、１２１ｂｐ、１２２ｂｐ、１２３ｂｐ、１２４ｂｐ、１２５ｂｐ、１２６ｂｐ、１２７ｂｐ、１２８ｂｐ、１２９ｂｐ、１３０ｂｐ、１３１ｂｐ、１３２ｂｐ、１３３ｂｐ、１３４ｂｐ、１３５ｂｐ、１３６ｂｐ、１３７ｂｐ、１３８ｂｐ、１３９ｂｐ、１４０ｂｐ、１４１ｂｐ、１４２ｂｐ、１４３ｂｐ、１４４ｂｐ、１４５ｂｐ、１４６ｂｐ、１４７ｂｐ、１４８ｂｐ、１４９ｂｐ、１５０ｂｐ、またはそれ以上）であり得る。
【0094】
いくらかの実施形態において、１つまたは複数（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上）の核酸は、２つの隣接するエレメント間で重複する。例えば、第１のエレメントの３’末端の１つまたは複数の核酸が、その３’末端に結合した第２のエレメントの５’末端の１つまたは複数の核酸と一致するいくらかの実施形態において、重複した核酸は、繰り返す必要がない。
【0095】
本開示は、本明細書に記載の核酸配列のコドン最適化変異体を包含する。コドン最適化は、遺伝コードにおける冗長性を利用して、コードされたタンパク質の同じアミノ酸配列を維持しながら、ヌクレオチド配列が変更するのを可能にする。
【0096】
コドン最適化は、コードされたタンパク質の発現における増加または減少を促進するために実行することができる。これは、ヌクレオチド配列内のコドン使用を特定の細胞のタイプのものに合わせて調整し、したがって、その細胞のタイプにおける特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応する細胞のコドン偏りを利用することにより実行することができる。対応するｔＲＮＡの相対的存在量に一致するように調整するようにヌクレオチド配列におけるコドンを変更することにより、発現を高めることができる。逆に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞のタイプにおいて稀であることが既知であるコドンを選択することにより発現を低下させることができる。核酸配列のコドン最適化のための方法は、当技術分野において既知であり、当業者は熟知している。
【0097】
本明細書に記載の他の実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数のプラスミドベクターと複合体化した複数のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を含む自己組織化ナノ粒子に関する。ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、プラスミドベクターを凝縮することができ、眼の細胞にプラスミドベクターを送達することができる。ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、プラスミドベクターと複合体化することができるプロトン化可能なアミノヘッド基、疎水性縮合に参加することができる脂肪酸または脂質テール、自己酸化を介してジスルフィド架橋を形成することができる２つのシステイン残基、ならびに光受容体間レチノイド結合タンパク質などの網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合することができる任意選択の標的基を含むことができる。
【0098】
プロトン化可能なアミノヘッド基は、眼の細胞にプラスミドベクターを送達するために、プラスミドベクターと複合体化して自己組織化ナノ粒子を形成することができる。ヘッド基内のアミンは、核酸のエンドソーム脱出を改善するために重要である担体系の本質的なｐＨ応答性特性に寄与する。アミノヘッド基の大きなプロトン化は、細胞取り込み後のエンドソームおよびリソソーム部位の比較的酸性である環境（ｐＨ＝５～６）で生じる可能性がある。これは、プラスミドベクターペイロードの効率的な細胞基質放出に必要な二重層の不安定化およびナノ粒子の電荷中和イベントを促進する、カチオン担体とエンドソーム／リソソーム膜のアニオンリン脂質との間の静電相互作用を強化する。カチオン担体のアミンの数、したがって全ｐＫａに影響することにより、ヘッド基の選択は、最終的に、そのようなプロトン化が生じることができる程度を決定することができる。担体系のｐＨ応答性は、ナノ粒子が細胞外膜の完全性に影響したり、細胞死を引き起したりするのではなく、エンドソームおよびリソソーム膜と選択的に融合し、不安定化することができるようにするために不可欠である。
【0099】
システイン残基は、自己酸化を介してジスルフィド架橋を形成することができ、チオール基を含むものなど、他の化合物の官能基と反応することができる。プラスミドベクターがｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質と複合体化して自己組織化ナノ粒子を形成すると、チオール基は、自己酸化によりジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合または架橋を生成し、オリゴマーおよびポリマーまたは架橋を形成することができる。ジスルフィド結合は、プラスミドベクターおよびｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質の自己組織化ナノ粒子を安定化させることができ、ナノ粒子が細胞内に入ると、プラスミドベクターの放出を達成するのを支援することができる。
【0100】
例えば、還元細胞質におけるナノ粒子内のジスルフィド結合の開裂は、プラスミドベクターの細胞質特異的放出を促進することができる。ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質およびプラスミドベクターを含むナノ粒子は、血漿中、非常に低い遊離チオール濃度（例えば１５μＭ）で安定している。ナノ粒子が標的細胞に組み込まれている場合、細胞（例えば原形質）に存在する高濃度のチオールは、核酸の解離および放出を促進するためにジスルフィド結合を還元する。
【0101】
ジスルフィド結合は、プラスミドベクターとの複合体化の前または酸化剤の存在下での複合体化中に、同じまたは異なるｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を反応させることにより容易に生成することができる。酸化剤は、空気、酸素または他の化学酸化剤であり得る。選択されたジチオール化合物および酸化状態に応じて、ジスルフィド形成の度合いは、遊離ポリマーまたはプラスミドベクターとの複合体で変化することができる。したがって、２つのシステイン残基を含むｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は単量体であり、単量体は、反応条件に応じて二量体化、オリゴマー化、または重合化することができる。
【0102】
脂肪酸または脂質テール基は、疎水性縮合に参加することができ、プラスミドベクターを有するコンパクトで安定したナノ粒子を形成するのを支援することができ、エンドソームおよびリソソーム部位からのナノ粒子のｐＨ応答性脱出を促進するために両親媒性の特性を導入することができる。これは、化合物がインビボ送達デバイスとして使用される場合に特に有用である。
【0103】
一般に、ナノ粒子のトランスフェクション効率は、脂質テール基のアルキル鎖長および飽和の増加に伴って減少することが示されている。飽和の場合、脂肪族鎖が短い（Ｃ１２およびＣ１４）と、より高い膜間脂質混合が好ましく、インビボと比較してインビトロでより良好なトランスフェクション効率を可能にすると報告されているが、より長い鎖（Ｃ１６およびＣ１８）ではその逆が当てはまる。典型的に、１４より多い炭素鎖の飽和脂肪酸は、不飽和のものより上昇した相転移温度および全体的な低い流動性のために核酸トランスフェクションに適していない。しかし、主に、ある程度の剛性が、脂質ナノ粒子製剤におけるコレステロールの広範な使用により証明されるように、粒子安定性に必要であるので、不飽和性および脂質流動性における増加が、トランスフェクション効率と逆相関する限界点が存在することが発見された。
【0104】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、（１－アミノエチル）イミノビス［Ｎ－（オレオイルシステイニル－１－アミノ－エチル）プロピオンアミド）（ＥＣＯ）またはその類縁体もしくは誘導体を含むことができる。ＥＣＯの類縁体および誘導体は、例えばＥＣＬ、ＳＣＯ、ＴＣＯ、ＥＨＣＯ、ＳＨＣＯを含むことができ、それらの全体が参照により本明細書にすべて組み込まれている、米国特許出願公開第２０１０／０００４３１６号、第２０１６／０１４５６１０号、および第２０１９／００９１３４７号、ならびに米国特許第１０，７９２，３７４号に記載されている。他のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、それらの全体が参照によりすべて組み込まれている、「Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｏｎａｂｌｅ ｐｅｎｄａｎｔｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒ」，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１２０（３）：２５０－８（２００７）；「Ｎｅｗ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２６（１７）１３８７４－８２（２０１０）ｌおよび「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ－ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ＳｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１７１（３）：２９６－３０７（２０１３）に記載されている。
【0105】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、光受容体間レチノイド結合タンパク質などの網膜または視覚のタンパク質を標的化するおよび／またはそれに結合する標的基を含むことができる。標的基は、例えばシステイン残基のチオール基により、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質のシステイン残基に結合することができる。標的基は、例えばレチニルアミン（例えば、全トランス型レチニルアミン）またはレチノイド誘導体、例えば（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オール；塩酸塩などのレチノイドを含むことができる。いくらかの実施形態において、標的基は、全トランス型レチニルアミンである。他の実施形態において、標的基は、（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オール；塩酸塩である。さらに他の実施形態において、標的基は、合成レチノイド誘導体、例えば、それらの全体が参照によりすべて組み込まれている、米国特許第７，９５１，８４１号または第７，９８２，０７１号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６２３４３に記載されている合成レチノイド誘導体である。
【0106】
例えば、標的基は、式：
【0107】
【化3】
【0108】
（式中、Ｒ１は、環状または多環状の環であり、環は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである；
ｎ＝１～３；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ個々に水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６の環原子を含むヘテロシクロアルケニル（環原子の１～３は、独立してＮ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル、アシルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト、カルボキシ、カルボキシラト、カルバモイル、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル、アリールカルバモイル、チオカルバモイル、カルバミド、シアノ、イソシアノ、シアナト、イソシアナト、イソチオシアナト、アジド、ホルミル、チオホルミル、アミノ、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド、イミノ、アルキルイミノ、アリールイミノ、ニトロ、ニトロソ、スルホ、スルホナト、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル、アリールスルファニル、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル、ホスホノ、ホスホナート、ホスフィナート、ホスホ、またはホスフィノまたはそれらの組み合わせであり、
Ｒ２およびＲ４は、結合して環状または多環状の環を形成することができ、環は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである）
の一級アミン化合物；およびその薬学的に許容される塩を含むことができる。
ｎ＝１～３；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ個々に水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６の環原子を含むヘテロシクロアルケニル（環原子の１～３は、独立してＮ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル、アシルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト、カルボキシ、カルボキシラト、カルバモイル、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル、アリールカルバモイル、チオカルバモイル、カルバミド、シアノ、イソシアノ、シアナト、イソシアナト、イソチオシアナト、アジド、ホルミル、チオホルミル、アミノ、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド、イミノ、アルキルイミノ、アリールイミノ、ニトロ、ニトロソ、スルホ、スルホナト、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル、アリールスルファニル、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル、ホスホノ、ホスホナート、ホスフィナート、ホスホ、またはホスフィノまたはそれらの組み合わせであり、
Ｒ２およびＲ４は、結合して環状または多環状の環を形成することができ、環は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである）
の一級アミン化合物；およびその薬学的に許容される塩を含むことができる。
【0109】
標的基は、ナノ粒子の形成の前またはその間に、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質のシステイン残基のチオール基に直接またはリンカー（例えばポリエチレングリコール）を介して間接的に共役することができる。標的基の選択に応じて、標的基は、システイン残基のチオール基のいずれかに共役結合することができる。
【0110】
一態様において、標的基は、リンカーによりｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質に間接的に結合している。リンカーの例には、ポリアミン基、ポリアルキレン基、ポリアミノ酸基またはポリエチレングリコール基が含まれるがこれらに限定されない。リンカーおよびリンカーの分子量の選択は、所望の特性に応じて変更することができる。一態様において、リンカーは、分子量が５００～１０，０００、５００～９，０００、５００～８，０００、５００～７，０００、または２，０００～５，０００のポリエチレングリコールである。ある特定の態様において、標的基は、標的基がリンカーに共有結合するような方法で最初にリンカーと反応する。例えば、リンカーは、標的基に存在するアミノ基と反応することができる１つまたは複数の基を保持することができる。リンカーはまた、本明細書に記載の化合物と反応し、共有結合を形成する追加の基を保持する。例えば、リンカーは、チオール基と容易に反応するマレイミド基を保持することができる。リンカーに存在する官能基の選択は、化合物および標的基に存在する官能基に応じて変更することができる。一態様において、標的基は、例えばレチニルアミン（例えば、全トランス型レチニルアミン）またはレチノイド誘導体、例えば（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オール；塩酸塩などのポリエチレングリコールに共有結合しているレチノイドである。
【0111】
いくらかの実施形態において、リンカーは、ヒドラゾンをリンカーに組み込むことにより形成されるような酸不安定結合を含むことができ、それは、網膜または網膜色素上皮細胞などの細胞に取り込まれた後、エンドリソーム環境で加水分解される。例えば、リンカーは、共有加水分解性エステル、共有加水分解性アミド、共有光分解性ウレタン、共有加水分解性エステル、または共有加水分解性アクリル酸チオール結合の少なくとも１つにより化合物に共有結合することができる。化合物の細胞取り込みに続いて、後期エンドソーム内で、ますます酸性になる環境は、酸不安定結合を開裂してＰＥＧなどのポリマーリンカーの脱落を促進することができ、化合物／核酸複合ナノ粒子のコアを曝露することができる。
【0112】
いくらかの実施形態において、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、式（Ｉ）：
【0113】
【化4】
【0114】
（式中、Ｒ１は、アルキルアミノ基または少なくとも１つの芳香族基を含む基である；Ｒ２およびＲ３は、独立して、例えば脂肪酸に由来する脂肪族基または疎水基である；
Ｒ４およびＲ５は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル基、アルケニル基、アシル基、または芳香族基であるか、ポリマー、標的基、もしくは検出可能な部分を含む；ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、独立して１から１０の整数である（例えば、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ２である）；およびその薬学的に許容される塩を有することができる。
Ｒ４およびＲ５は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル基、アルケニル基、アシル基、または芳香族基であるか、ポリマー、標的基、もしくは検出可能な部分を含む；ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、独立して１から１０の整数である（例えば、ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ２である）；およびその薬学的に許容される塩を有することができる。
【0115】
いくらかの実施形態において、Ｒ１は：
【0116】
【化5】
【0117】
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、独立して水素、アルキル基、疎水基、または窒素含有置換基である；ならびにｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、１から１０の整数である）
の少なくとも１つを含むことができる。
の少なくとも１つを含むことができる。
【0118】
例えば、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＨＮ２、またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｄＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の少なくとも１つを含むことができる（式中、ｄは、０から１０である）。
【0119】
いくらかの実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＨＮ２であり得る。
【0120】
他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、独立してオレイン酸またはリノール酸などの脂肪酸に由来する脂肪族基または疎水基であり、同じまたは異なっている。リノール酸における追加の二重結合は、炭化水素骨格に余分なキンクを導入し、オレイン酸よりも広い円錐形を化合物に与え、その流動性を高める。ナノ粒子構造に組み込まれた場合、余分の不飽和度は、細胞取り込みの切迫した膜融合事象中、六方相を形成する傾向を高める。
【0121】
いくらかの実施形態において、Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つは、レチニルアミン（例えば、全トランス型レチニルアミン）またはレチノイド誘導体、例えば（１Ｒ）－３－アミノ－１－［３－（シクロヘキシルメトキシ）フェニル］プロパン－１－オール；塩酸塩などのポリマーリンカー、例えばポリエチレングリコールに共有結合しているレチノイドを含む。
【0122】
一般式Ｉを有するｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、当技術分野において既知の固相技術を使用して合成することができる。一般に、アプローチには、ジチオール化合物を生成するための体系的保護／伸長／脱保護が含まれる。疎水基は、オレイン酸をシステイン残基に存在するアミノ基と反応させることにより生成される。標的基は、ＰＥＧスペーサに共役し、その後マイケル付加反応を介して化合物に共役する。
【0123】
本明細書に記載のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質はいずれも存在することができるか、その塩に変換され得る。一態様において、塩は、薬学的に許容される塩である。塩は、遊離酸を適切な量の化学的または薬学的に許容される塩基で処置することにより調製することができる。代表的な化学的または薬学的に許容される塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどである。一態様において、反応は、水単独または不活性水混和性有機溶媒と組み合わせた中、約０℃から１００℃の温度、例えば室温で実行される。化合物の使用される塩基に対するモル比は、任意の特定の塩について望ましい比を提供するように選択される。例えば遊離酸出発物質のアンモニウム塩を調製するため、出発物質は、おおよそ１等量の塩基で処理され、塩を得ることができる。
【0124】
別の態様において、本明細書に記載のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質はいずれも存在することができるか、そのルイス塩基を用いて塩に変換することができる。化合物は、適切な量のルイス塩基を用いて処理することができる。代表的なルイス塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ＴＨＦ、エーテル、チオール試薬、アルコール、チオールエーテル、カルボン酸塩、フェノラート、アルコキシド、水などである。一態様において、反応は、水単独または不活性水混和性有機溶媒と組み合わせた中、約０℃から１００℃の温度、例えば室温で実行される。化合物の使用される塩基に対するモル比は、任意の特定の複合体について望ましい比を提供するように選択される。例えば遊離酸出発物質のアンモニウム塩、出発物質は、おおよそ１等量の化学的または薬学的に許容されるルイス塩基で処理され、複合体を得ることができる。
【0125】
ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質がカルボン酸基を保持する場合、これらの基は、当技術分野において既知の技術を使用して薬学的に許容されるエステルまたはアミドに変換することができる。代わりに、エステルがデンドリマーに存在する場合、エステルは、エステル交換技術を使用して薬学的に許容されるエステルに変換することができる。
【0126】
プラスミドベクターは、プラスミドベクターおよびｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質を混合することにより、本明細書に記載のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質に複合体化することができる。反応のｐＨは、本明細書に記載のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質に存在するアミノ基をカチオン基に変換するように修飾することができる。例えば、ｐＨはアミノ基をプロトン化するように調節することができる。ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質でのカチオン基の存在で、プラスミドは、化合物に静電気的に結合（すなわち複合体化）することができる。一態様において、ｐＨは、６から７．４である。別の態様において、Ｎ／Ｐ比は、０．５から１００であり得、Ｎは、正電荷を形成することができる化合物に存在するアミノまたは窒素原子の数であり、Ｐは、プラスミドベクターに存在するリン酸基の数である。したがって、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質をヘッド基の適切な数のアミノ基で修飾することにより、プラスミドベクターとｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質との間の結合（例えば結合のタイプおよび強度）を調整することができる。Ｎ／Ｐ比は、プラスミドベクターが送達されるべき細胞のタイプに応じて調節することができる。細胞が光受容体であるいくらかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、少なくとも約６、少なくとも約１０、または少なくとも約１５であり得る。他の実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約６から約２０であり得る。いくらかの実施形態において、自己組織化ナノ粒子は、アミン対リン酸（Ｎ／Ｐ）比が約４から約１２、好ましくは約６から約１０であり得る。
【0127】
いくらかの実施形態において、自己組織化ナノ粒子は、直径が約１０００ナノメートル以下、または約５０ｎｍから約５００ｎｍ、約１００ｎｍから約４００ｎｍ、または約１５０ｎｍから約３００ｎｍであり得る。
【0128】
他の態様において、本明細書に記載の自己組織化ナノ粒子は、プラスミドベクターが、エンドソームおよび／またはリソソーム部位をエンドソーム－リソソームｐＨで脱出するようにデザインすることができる。例えば、自己組織化ナノ粒子は、その構造および両親媒性がエンドソーム－リソソームｐＨ（５．０～６．０）で変化し、エンドソーム－リソソーム膜を破壊し、ナノ粒子が細胞質に入ることを可能にするようにデザインすることができる。一態様において、本明細書に記載の自己組織化ナノ粒子の特定のエンドソーム－リポソーム膜破壊の能力は、プロトン化可能なアミンおよび親油性基の数および構造を変更することによりそれらのｐＨ応答性両親媒性を修飾することによって調整することができる。例えば、プロトン化可能なアミノ基の数が減少すると、ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質により中性ｐＨで生成されるナノ粒子の両親媒性を低下させることができる。一態様において、本明細書に記載のｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質は、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１０、１から８、１から６、１から４、または２のプロトン化可能なアミノ基または置換されたアミノ基を有する。ｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質およびｐＨ応答性多官能性カチオン性脂質により生成されたナノ粒子のｐＨ応答性両親媒性は、ナノ粒子の全体的なｐＫａを微調整するために使用することができる。生理的ｐＨでのナノ粒子の低両親媒性は、核酸／ＭＦＣ系の非特異的細胞膜破壊および非特異的組織取り込みを最小化することができる。ある特定の態様において、担体は、生理的ｐＨで低両親媒性であり、エンドソーム－リソソームｐＨで高両親媒性であり、ナノ粒子での選択的エンドソーム－リソソーム膜破壊のみを引き起こすことが望ましい。
【0129】
場合によっては、ナノ粒子複合体の表面は、例えば、ナノ粒子の重合していない遊離チオールを反応させることによりポリエチレングリコールを共有結合的に組み込むことにより修飾することができ、インビボでの非特異的組織取り込みを低下させることができる。例えばＰＥＧ－マレイミドは、遊離チオール基と迅速に反応する。ＰＥＧの分子量は、担体に付与される所望の親水性の量に応じて変更することができる。担体のＰＥＧ修飾はまた、細胞による取り込み時に核酸で構成されたナノ粒子を酵素的分解（例えばエンドヌクレアーゼ）から保護することができる。
【0130】
いくらかの実施形態において、ナノ粒子の表面に提供された、または結合した標的基の量またはモルパーセントは、ナノ粒子を形成する化合物の約１モル％から約１０モル％、例えばナノ粒子を形成する化合物の約１モル％から約５モル％（例えば約２．５モル％）であり得る。
【0131】
好都合には、化合物を使用して形成された多官能性ｐＨ応答性担体は、被験者に全身投与された場合、改善された安定性を有し、縮合したプラスミドベクターを変性から保護し、細胞取り込み時にエンドソーム脱出および細胞基質放出を促進する。
【0132】
プラスミドベクターおよび／または自己組織化ナノ粒子は、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、プラスミドベクターおよび／または自己組織化ナノ粒子に加えて、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、緩衝液、安定剤または当技術分野において周知の他の物質を含むことができる。そのような物質は、非毒性である必要があり、プラスミドベクターおよび／または自己組織化ナノ粒子の有効性に干渉しない必要がある。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射に応じて当業者により決定することができる。
【0133】
医薬組成物は液状であり得る。液体医薬組成物は、液体担体、例えば水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水溶液、塩化マグネシウム、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含めることができる。
【0134】
患部への注射のために、医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する水溶液の形状であり得る。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液もしくは乳酸リンゲル注射液またはＴＭＮ２００などの等張ビヒクルを使用して適切な溶液を十分に調整することができる。保存料、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加物は、必要に応じて含めることができる。
【0135】
緩衝液は、遺伝子治療のための貯蔵後および注射デバイスの通過後、本明細書に記載のプラスミドベクターおよびナノ粒子の安定性および生体適合性に影響を有する可能性がある。いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクターおよび／または自己組織化ナノ粒子は、ＴＭＮ２００緩衝液に希釈して、生体適合性および安定性を維持することができる。ＴＭＮ２００緩衝液は、２０ｍＭトリス（ｐＨを８．０に調整）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２００ｍＭ ＮａＣｌをｐＨ８で含む。
【0136】
いくらかの実施形態において、医薬組成物は、異なるまたは異なっている貯蔵温度下で、自己組織化ナノ粒子の安定性を強化するのに有効な量のスクロースを含むことができる。異なるまたは異なっている貯蔵温度は、約－２０℃から約４℃の範囲であり得る。例えば、医薬組成物は、約５％から約２０％のスクロースを含むことができる。
【0137】
一実施形態において、医薬組成物は、実質的に中性のｐＨを有することができる。実質的に中性のｐＨは、約６．０から約８．０、約６．２から約７．８、約６．５から約７．５、約６．８から約７．２、または約７である。
【0138】
いくらかの実施形態において、医薬組成物は、スクロース以外の賦形剤を含まない。
【0139】
他の実施形態において、医薬組成物は、約５０ｎｇ／μｌから約５００ｎｇ／μｌ、約１００ｎｇ／μｌから約３００ｎｇ／μｌ、または約１５０ｎｇ／μｌから約２５０ｎｇ／μｌの自己組織化ナノ粒子の濃度を含む。
【0140】
遅延放出のため、プラスミドベクターおよび／または自己組織化ナノ粒子は、場合によっては、徐放性用に製剤化されている医薬組成物に、例えば当技術分野において既知の方法にしたがって生体適合性のあるポリマーから形成されたマイクロカプセル内に含まれる可能性がある。
【0141】
本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、それを必要とする被験者における異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法において使用することができる。方法は、一般に、細胞を本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物と接触させることを含み、プラスミドベクターは、細胞内に取り込まれる。一態様において、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、遺伝子疾患を処置するために欠落または不在の遺伝子産物を供給することにより、または遺伝子発現をサイレンシングすることにより、遺伝子疾患の治療としてのプラスミドベクターの送達を容易にすることができる。当技術分野において既知の技術を使用して、本明細書に記載の化合物が核酸を細胞に送達させる効率を測定することができる。
【0142】
いくらかの実施形態において、標的細胞は、眼内の細胞であり得る。眼内の細胞の例には、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層内側（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、桿体および錐体の外節（ＯＳ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、桿体および錐体の内節（ＩＳ）、結膜の上皮、虹彩、毛様体、角質、および眼皮脂腺の上皮に位置する細胞が含まれ得る。
【0143】
好都合には、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、形質導入された細胞において、ＡＢＣＡ４などの完全長網膜タンパク質の驚くべき高レベルの発現を提供し、網膜タンパク質の不要な切断フラグメントの生成が制限されている。
【0144】
いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子は、視覚を増強および／または正常な視覚を回復するのに有効な量で、視覚サイクルタンパク質、例えばＡＢＣＡ４またはＲＰＥ６５の発現を増加させることができる。前述の方法のいずれかのある特定の実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子は、遺伝性網膜障害（ＩＲＤ）（例えばシュタルガルト病またはＬＣＡ）のナンセンスまたはミスセンス突然変異に関連する視覚サイクルタンパク質（例えばＡＢＣＡ４またはＲＰＥ６５）の発現を増加させる可能性がある。例えば、ある特定の実施形態において、細胞は、ミスセンスまたはナンセンス突然変異のない細胞と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％の遺伝子産物を含む。ある特定の実施形態において、細胞は、ミスセンスまたはナンセンス突然変異のない細胞と比較して、約５％から約８０％、約５％から約６０％、約５％から約４０％、約５％から約２０％、約５％から約１０％、約１０％から約８０％、約１０％から約６０％、約１０％から約４０％、約１０％から約２０％、約２０％から約８０％、約２０％から約６０％、約２０％から約４０％、約４０％から約８０％、約４０％から約６０％、または約６０％から約８０％の遺伝子産物を含む。ある特定の実施形態において、細胞内に検出可能な遺伝子産物はない。遺伝子産物の量または発現は、当技術分野において既知の任意の方法、例えばウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより測定することができる。
【0145】
ある特定の実施形態において、遺伝子は、視覚サイクルタンパク質をコードするナンセンス突然変異を有するＩＲＤ関連遺伝子（例えばＡＢＣＡ４またはＲＰＥ６５遺伝子）であり、本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子は、細胞における視覚サイクルタンパク質（例えばＡＢＣＡ４またはＲＰＥ６５）発現を、ナンセンス突然変異がない細胞、組織、または被験者に対して、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％増加させるために選択することができる。
【0146】
ある特定の実施形態において、細胞における視覚サイクルタンパク質（例えばＡＢＣＡ４またはＲＰＥ６５）発現を、ＲＰＥ６５突然変異を有する細胞、組織、または被験者に対して約２０％から約２００％、約２０％から約１８０％、約２０％から約１６０％、約２０％から約１４０％、約２０％から約１２０％、約２０％から約１００％、約２０％から約８０％、約２０％から約６０％、約２０％から約４０％、約４０％から約２００％、約４０％から約１８０％、約４０％から約１６０％、約４０％から約１４０％、約４０％から約１２０％、約４０％から約１００％、約４０％から約８０％、約４０％から約６０％、約６０％から約２００％、約６０％から約１８０％、約６０％から約１６０％、約６０％から約１４０％、約６０％から約１２０％、約６０％から約１００％、約６０％から約８０％、約８０％から約２００％、約８０％から約１８０％、約８０％から約１６０％、約８０％から約１４０％、約８０％から約１２０％、約８０％から約１００％、約１００％から約２００％、約１００％から約１８０％、約１００％から約１６０％、約１００％から約１４０％、約１００％から約１２０％、約１２０％から約２００％、約１２０％から約１８０％、約１２０％から約１６０％、約１２０％から約１４０％、約１４０％から約２００％、約１４０％から約１８０％、約１４０％から約１６０％、約１６０％から約２００％、約１６０％から約１８０％、または約１８０％から約２００％増加させる本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を選択することができる。
【0147】
遺伝子がナンセンス突然変異を有するＡＢＣＡ４遺伝子である、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子は、網膜細胞または網膜色素上皮細胞におけるＡＢＣＡ４発現を、ナンセンス突然変異がない網膜細胞または網膜色素上皮細胞に対して、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％増加させることができる。
【0148】
ある特定の実施形態において、方法は、網膜細胞または網膜色素上皮細胞におけるＡＢＣＡ４発現を、ＡＢＣＡ４突然変異を有する網膜細胞または網膜色素上皮細胞に対して、約２０％から約２００％、約２０％から約１８０％、約２０％から約１６０％、約２０％から約１４０％、約２０％から約１２０％、約２０％から約１００％、約２０％から約８０％、約２０％から約６０％、約２０％から約４０％、約４０％から約２００％、約４０％から約１８０％、約４０％から約１６０％、約４０％から約１４０％、約４０％から約１２０％、約４０％から約１００％、約４０％から約８０％、約４０％から約６０％、約６０％から約２００％、約６０％から約１８０％、約６０％から約１６０％、約６０％から約１４０％、約６０％から約１２０％、約６０％から約１００％、約６０％から約８０％、約８０％から約２００％、約８０％から約１８０％、約８０％から約１６０％、約８０％から約１４０％、約８０％から約１２０％、約８０％から約１００％、約１００％から約２００％、約１００％から約１８０％、約１００％から約１６０％、約１００％から約１４０％、約１００％から約１２０％、約１２０％から約２００％、約１２０％から約１８０％、約１２０％から約１６０％、約１２０％から約１４０％、約１４０％から約２００％、約１４０％から約１８０％、約１４０％から約１６０％、約１６０％から約２００％、約１６０％から約１８０％、または約１８０％から約２００％増加させる。
【0149】
最適化された組換えを用いて、完全長タンパク質ＡＢＣＡ４は、突然変異網膜タンパク質を有する被験者における光受容体外節において、ビスレチノイド形成を低減し、網膜イメージングで自己蛍光表現型を修正するのに十分なレベルで発現することができる。これらの観察は、シュタルガルト病を処置するための遺伝子治療のためのプラスミドベクターアプローチを支持する。
【0150】
ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異から得られるシュタルガルト病は、最も一般的な遺伝性黄斑ジストロフィーであり、８，０００～１０，０００人に１人が罹患し、ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異に起因する。ＡＢＣＡ４突然変異は、シュタルガルト病ならびに他の錐体および錐体－桿体ジストロフィーの原因である。ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異に起因するシュタルガルト病は、先進国の小児の失明の最も一般的な原因である。疾患は多くの場合、小児期に発症し、患者の生涯にわたって徐々に悪化し、そのため治療介入はいつでも、さらなる失明を防止または遅延させることができる。この疾患は進行性であり、多くの場合、小児期に症状が提示されるようになるが、視力の発達期の後、さらなる失明を防止または遅延させるための治療介入の十分な機会が提供される。
【0151】
ＡＢＣＡ４は、光受容体の外節ディスクから毒性のある代謝物を取り除く。機能性ＡＢＣＡ４がないと、光受容体の変性となる。光受容体外節ディスクは、光感知タンパク質ロドプシンおよび膜貫通タンパク質ＡＢＣＡ４を含む。ＡＢＣＡ４は、ある特定の毒性のある視覚サイクル副産物の排出を制御する。視覚色素は、オプシンおよび発色団、例えば１１－シス－レチナールなどのレチノイドを含む。レチノイドサイクルとも呼ばれることもある視覚サイクルにおいて、レチノイドは漂白され、光受容体と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間で再利用される。光伝達中のロドプシンの活性化で、１１－シス－レチナールは、全トランス型レチナールに異性体化し、オプシンから解離される。全トランス型レチナールは、ＲＰＥに輸送され、貯蔵されるか、１１－シス－レチナールに変換され、光受容体に戻され、視覚サイクルを完了する。
【0152】
ＡＢＣＡ４における突然変異は、光受容体細胞ディスク外膜から網膜色素上皮（ＲＰＥ）にレチノイドを輸送し、これにより、光受容体の外節に、不要なレチノイド誘導体の蓄積がもたらされる。光受容体外節の一定の生成のため、古いディスクがより末端になるにつれて、ＲＰＥにより消費される。光受容体細胞運搬突然変異体、非機能性ＡＢＣＡ４において、ディスク膜に保持されたビスレチノイドは、ＲＰＥ細胞に蓄積し、毒性化合物Ａ２Ｅ、リポフスチンの重要なエレメントの形成をもたらすさらなる生化学的プロセスが行われる。ＡＢＣＡ４突然変異は、光受容体およびＲＰＥにおける毒素の蓄積と関連している。代表的な毒素には、全トランス型レチナール、ビスレチノイドおよびリポフスシンが含まれるがこれらに限定されない。
【0153】
機能性ＡＢＣＡ４の欠如は、管腔から光受容体細胞ディスク外膜の細胞質側への遊離レチンアルデヒドの輸送を防止し、結果として、レチノイド二量体（ビスレチノイド）の形成を高めるか、その形成を増幅させることになる。網膜色素上皮（ＲＰＥ）による光受容体細胞の遠位外節の毎日の食作用で、レチノイド誘導体は、さらに処理され、ビスレチノイドの蓄積がもたらされる。レチノイド誘導体は処理されるが、不溶性であり、蓄積する。この蓄積の結果は、ＲＰＥ細胞の機能不全および最終的には死をもたらし、変性およびその後の死を通じた、重なっている光受容体のその後の二次的喪失を伴う。
【0154】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、被験者の眼の１つまたは複数の細胞において完全長ＡＢＣＡ４導入遺伝子を生成する。いくらかの実施形態において、被験者は、シュタルガルト病を有している。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の細胞は、光受容体細胞を含む。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞を含む。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【0155】
いくらかの実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４遺伝子の発現は、光受容体細胞の変性を示す。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくらかの実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞の死を防止する。いくらか実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞の変性を防止する。いくらかの実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞を健康なまたは生存可能な光受容体細胞に修復する。
【0156】
いくらかの実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、ＲＰＥ細胞の死を防止する。いくらかの実施形態において、被験者の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、ＲＰＥ細胞の死および光受容体細胞の変性を防止する。
【0157】
いくらかの実施形態において、標的細胞におけるヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現する方法は、被験者に、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物を、被験者の眼に投与することを含み、プラスミドベクターは、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞で発現するように、標的細胞に形質導入する。
【0158】
いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射により、被験者の眼に投与することができる。
【0159】
当業者は、個々の網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射に精通しており、十分に実行することができる。
【0160】
網膜下注射は、網膜下腔、すなわち、神経感覚網膜の下への注射である。網膜下注射の間、注射された物質は、光受容体細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に向けられ、それらの間に空間を生成する。
【0161】
小さい網膜切開を通じて注射が実行される場合、網膜剥離を生じる可能性がある。注射された物質により生成される網膜が剥離して隆起した層は、「ブレブ」と呼ばれる。
【0162】
網膜下注射により生成された穴は、投与後に、注射された溶液が硝子体腔に大きく逆流することがないように十分に小さい可能性がある。そのような逆流は、薬剤の効果が標的ゾーンから離れるように向けられるので、薬剤が注射される場合に問題になる。好ましくは、注射は、神経感覚網膜に自己封止型入口点を生成する、すなわち、注射針が取り除かれると、針により生成された穴は、注射された物質が穴からほとんどまたは実質的に放出されないように再封止される。
【0163】
このプロセスを容易にするため、専門の網膜下注射針が市販されている（例えばＤＯＲＣ ４１Ｇテフロン網膜下注射針、Ｄｕｔｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＶ、ザイドラント、オランダ）。これらは、網膜下注射を実行するようにデザインされた針である。
【0164】
いくらかの実施形態において、網膜下注射は、ハミルトンシリンジおよび３４ゲージ針（ＥＳＳラボ、ＵＫ）を用いて後極を通って上網膜までの強膜トンネルアプローチを含む。代わりに、またはさらに、網膜下注射は、ＷＰＩシリンジおよび傾斜した３５Ｇ針システム（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して、網膜下注射の前に３３Ｇ針を用いて前房穿刺を実行することを含むことができる。
【0165】
動物被検体は、例えば、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を含む腹腔内注射により麻酔をかけられ、トロピカミド点眼薬（マイドリアティカム１％、ボシュロム、ＵＫ）およびフェニレフリン点眼薬（フェニレフリン塩酸塩２．５％、ボシュロム、ＵＫ）を用いて瞳孔を完全に拡張することができる。プロキシメタカイン点眼薬（プロキシメタカイン塩酸塩０．５％、ボシュロム、ＵＫ）はまた、網膜下注射の前に適用することもできる。注射後、クロラムフェニコール点眼薬を適用し（クロラムフェニコール０．５％、ボシュロム、ＵＫ）、アチパメゾール（２ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔を解除し、カルボマーゲルを適用して（ヴィスコティアーズ、ノバルティス、ＵＫ）白内障形成を防止することができる。注射中に網膜への損傷が発生する場合を除いて、十分に小さい針が使用される限り、注射された物質は剥離した神経感覚網膜と局在性網膜剥離部位でのＲＰＥとの間に局在したままである（すなわち、硝子体腔に逆流しない）。確かに、短い時間枠のブレブの持続性は、注射された物質が硝子体にほとんど脱出しない可能性があることを示唆する。ブレブは、注射された物質が吸収されるにつれて、より長い時間枠で消失する可能性がある。
【0166】
例えば光干渉断層撮影を使用して、眼、例えば網膜の視覚化を術前に行うことができる。
【0167】
いくらかの実施形態において、記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、第１の溶液の網膜下注射により局在化した網膜剥離が生成される二段階法を使用することにより、正確で安全に送達することができる。第１の溶液は、ベクターを含まない。第２の網膜下注射は、その後、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物を含む薬剤を、第１の網膜下注射により生成されたブレブの網膜下液に送達するために使用される。プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物を送達する注射が網膜を剥離するために使用されないので、特定の体積の溶液をこの第２のステップで注射することができる。
【0168】
網膜を少なくとも部分的に剥離するために注射された溶液の体積は、例えば約１０～１０００μＬ、例えば約５０～１０００μＬ、１００～１０００μＬ、２５０～１０００μＬ、５００～１０００μＬ、１０～５００μＬ、５０～５００μＬ、１００～５００μＬ、２５０～５００μＬであり得る。体積は、例えば約１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬまたは１０００μＬであり得る。
【0169】
注射された医薬組成物の体積は、例えば約０．１～５００μＬ、例えば約０．５～５００μＬ、１～５００μＬ、２～５００μＬ、３～５００μＬ、４～５００μＬ、５～２５０μＬ、１～２５０μＬ、２～２５０μＬまたは５～１５０μＬであり得る。他の実施形態において、被験者に投与された医薬組成物の体積は、約０．１μＬから約２μＬ、約０．２μＬから約１．５μＬ、または約０．５μＬから約１μＬである。
【0170】
いくらかの実施形態において、医薬組成物中の自己組織化ナノ粒子の濃度は、約５０ｎｇ／μＬから約５００ｎｇ／μＬ、約１００ｎｇ／μＬから約３００ｎｇ／μＬ、または約１５０ｎｇ／μＬから約２５０ｎｇ／μＬである。
【0171】
いくらかの実施形態において、例えば末期の網膜変性の間、網膜が薄く、透明であり、その上に存在する破壊され、ひどく色素沈着した上皮に対して見ることが困難であるので、網膜を同定することは困難である。青色生体色素の使用が、網膜剥離処置のために作られた網膜円孔の同定を容易にすることができ、そのため、硝子体腔に逆流するリスクがなく同じ穴を通って医薬組成物を投与することができる。
【0172】
青色生体色素の使用はまた、これらの構造のいずれかを通じた注射が網膜下腔への清潔なアクセスを妨げる可能性があるので、肥厚した内境界膜または網膜上膜がある網膜の任意の領域を同定することができる。さらに、手術期直後のこれらの構造のいずれかの収縮は、硝子体腔への薬剤の逆流をもたらす可能性がある、網膜の入口穴の伸縮をもたらす可能性がある。
【0173】
いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、脈絡膜上注射を介して投与することができる。脈絡膜上注射の任意の手段は、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物のための潜在的な送達システムとして想定される。脈絡膜上注射は、脈絡膜と強膜との間の空間である脈絡膜上腔への注射である。したがって、脈絡膜上腔への注射は、網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または黄斑などの近位眼構造への組成物の送達のための潜在的な投与経路である。いくらかの実施形態において、脈絡膜上腔への注射は、マイクロニードル、マイクロカニューレ、またはマイクロカテーテルを使用して眼の前方部分で行われる。眼の前方部分は、眼の赤道より前方の領域を含むか、それからなる可能性がある。本明細書に記載のプラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子は、脈絡膜上経路を介して注射部位から後方に拡散する可能性がある。いくらかの実施形態において、後眼の脈絡膜上腔は、カテーテルシステムを使用して直接注射される。この実施形態において、脈絡膜上腔は、毛様体扁平部の切開を介してカテーテルを挿入することができる。いくらかの実施形態において、脈絡膜上経路を介した注射または注入は、脈絡膜、ブルッフ膜および／またはＲＰＥ層を横断して、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物を網膜下腔に送達する。いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物が脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含め、強膜、扁平部、脈絡膜、ブルッフ膜、およびＲＰＥ層のうちの少なくとも１つに１回または複数回の注射が行われる。いくらかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物が脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含め、二段階手順を使用して、本明細書に記載のプラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物の送達の前に脈絡膜上腔または網膜下腔にブレブを作成する。
【0174】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は反復投与される。
【0175】
他の実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、単回用量で投与される。
【0176】
いくらかの実施形態において、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物は、被験者の視覚機能の処置において有効であり得る。視覚機能は、マイクロペリメトリ、暗順応ペリメトリ、視覚の機動性の評価、視力、ＥＲＧ、またはリーディング評価により評価することができる。
【0177】
ベースラインまたは被験者の改善された視力は、被験者が回避するための１つまたは複数の障害物を含む、低照度または暗所条件を特徴とする囲いを被験者が通り抜けることにより測定することができる。被験者は、場合によっては本開示の処置の方法により提供される、本開示の組成物を必要としている可能性がある。被験者は、場合によっては１つまたは複数の用量および／または手順／注射で１つまたは両方の眼における処置の方法により提供される、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物を受け取っている可能性がある。エンクロージャは、屋内または屋外である可能性がある。エンクロージャは、昼光を再現するレベルから完全な暗所をシミュレートするレベルまでの範囲の制御された光レベルにより特徴づけられる。この範囲内で、エンクロージャの制御された光レベルは、好ましくは、本開示の組成物を受け取る前に本開示の被験者が視力を低下させている可能性がある自然の夕暮れまたは夕方の光レベルを再現するように設定することができる。本開示の組成物の投与に続いて、被験者は、すべての光レベルで視力が改善する可能性があるが、改善は、自然な夕暮れまたは夕方の光レベル (屋内または屋外) を再現するものを含め、より低い光レベルで測定することが好ましい。
【0178】
エンクロージャのいくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、エンクロージャ内の１つまたは複数の指定された経路および／またはコースと一致する。被験者によるエンクロージャの通過の成功は、指定された経路を通過すること、および指定されていない経路の通過を回避することを含む可能性がある。被験者によるエンクロージャの通過の成功は、経路内または経路の近くのいずれかに配置された１つまたは複数の障害物との接触を回避しながら、指定された経路を含む任意の経路を横断することを含む可能性がある。被験者によるエンクロージャの通過の成功または改善は、経路内または経路の近くのいずれかに配置された１つまたは複数の障害物との接触を回避し、指定された開始位置から指定された終了位置まで経路を横断するのに必要な時間を短縮しながら（例えば、正常な視力を有する健康な個体と比較した場合、または被験者による以前の横断と比較した場合）指定された経路を含む任意の経路を横断することを含む可能性がある。いくらかの実施形態において、エンクロージャは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の経路もしくは指定された経路を含む可能性がある。指定された経路は、意図された開始位置および意図された終了位置を含むものとしての実験者による指定された経路の識別により、指定されていない経路とは異なる可能性がある。
【0179】
エンクロージャのいくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、本開示の表面に固定されていない。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、本開示の表面に固定されている。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、エンクロージャの床、壁および天井を含むがこれらに限定されないエンクロージャの内面に固定されている。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、個体の物体を含む。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、液体の物体（例えば「ウォーターハザード」）を含む。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、少なくとも１つの経路に沿って、または経路に近接して、任意の組み合わせまたは順序で、被験者が迂回する物体；被験者がまたがる物体；歩いたり立ったりしてバランスをとる物体；傾斜、下降、またはそれらの組み合わせを有する物体；触れられる物体（例えば奥行きを知覚および／または判断する被験者の能力を決定するため）；ならびにその下を歩いたり立ったりすることにより横切られる物体（例えば物体を回避するために１つまたは複数の方向を曲げることを含む）を含む。エンクロージャのいくらかの実施形態において、１つまたは複数の障害物は、指定された順序で被験者により遭遇する必要がある。
【0180】
ある特定の実施形態において、ベースラインまたは被験者の改善された視力は、低照度または暗所条件を特徴とし、被験者が回避するための１つまたは複数の障害物を含むコースまたはエンクロージャを被験者が通り抜けることにより測定することができ、コースまたはエンクロージャは、設備内に存在する。特定の実施形態において、設置は、モジュラー照明システムおよび一連の異なるモビリティコース床レイアウトを含む。ある特定の実施形態において、１つの部屋は、１セットの照明器具を備えたすべてのモビリティコースを収容する。例えば、モビリティ試験中、一度に１つのコースを設定することができ、同じ部屋／照明器具は、使用中のコース（床レイアウト）に関係なく、モビリティ試験のために使用することができる。特定の実施形態において、試験のために提供された異なるモビリティコースは、難易度を変更するようにデザインされ、経路のコントラストが低く障害物が見えにくい特徴の難しいコース、および経路のコントラストが高く障害物が見えやすい容易なコースを有する。
【0181】
エンクロージャのいくらかの実施形態において、被験者は、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物の投与の前に、例えば精度および／または速度のベースライン測定値を確立するため、または被験者が、網膜疾患もしくは網膜疾患の発症のリスクを有すると診断するために試験される可能性がある。いくらかの実施形態において、被験者は、プラスミドベクター、自己組織化ナノ粒子、または医薬組成物の投与に続いて、（例えば、視力を改善するための組成物の有効性をモニターする／試験するため）ベースライン測定値からの変化または健康な個体からのスコアとの比較を決定するために試験され得る。
【0182】
ベースラインまたは被験者の網膜細胞生存率の改善された測定値はまた、１つまたは複数のＡＯＳＬＯ技術により測定することができる。走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）は、被験者の眼の網膜の別個の層を観察するために使用することができる。好ましくは、補償光学（ＡＯ）は、ＳＬＯに組み込まれ（ＡＯＳＬＯ）、典型的に、眼の角膜および水晶体を含むがこれらの限定されない前眼の構造により引き起こされるＳＬＯのみからの画像におけるアーティファクトを補正する。ＳＬＯのみを使用することにより生じるアーティファクトは、結果の画像の解像度を低下させる。補償光学は、網膜の層の単一細胞の分析を可能にし、正常または無傷の網膜細胞（例えば正常または無傷の光受容体細胞）からの指向性後方散乱光（導波光）を検出する。
【0183】
本開示のいくらかの実施形態において、ＡＯＳＬＯ技術を使用することで、無傷の細胞は、導波および／または検出可能なシグナルを生じる可能性がある。いくらかの実施形態において、無傷ではない細胞は、導波および／または検出可能なシグナルを生じない。
【0184】
ＡＯＳＬＯは、画像化、好ましくは、被験者の網膜またはその一部を評価するために使用することができる。いくらかの実施形態において、被験者は、ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化された１つまたは両方の網膜を有する。いくらかの実施形態において、被験者は、本開示の組成物の投与の前に（例えば処置後の後に続く比較のためのベースライン測定値を決定するため、ならびに／または網膜疾患の存在および／もしくは重症度を決定するために）ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化された１つまたは両方の網膜を有する。いくらかの実施形態において、被験者は、本開示の組成物の投与に続いて（例えば組成物の有効性を決定するためおよび／または処置から得られる改善について投与に続いて被験者をモニターするために）ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化された１つまたは両方の網膜を有する。
【0185】
いくらかの実施形態において、網膜は、共焦点または非共焦点（分割検出器）ＡＯＳＬＯのいずれかにより画像化され、１つまたは複数の網膜細胞の密度を評価する。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の網膜細胞には、光受容体細胞が含まれるがこれらに限定されない。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の網膜細胞には、錐体光受容体細胞が含まれるがこれらに限定されない。いくらかの実施形態において、１つまたは複数の網膜細胞には、桿体光受容体細胞が含まれるがこれらに限定されない。いくらかの実施形態において、密度は、ミリリットルあたりの細胞の数として測定される。いくらかの実施形態において、密度は、ミリリットルあたりの生細胞または生存細胞の数として測定される。いくらかの実施形態において、密度は、ミリリットルあたりの無傷の細胞（プラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を含む細胞）の数として測定される。いくらかの実施形態において、密度は、ミリリットルあたりの応答細胞の数として測定される。いくらかの実施形態において、応答細胞は、機能性細胞である。
【0186】
いくらかの実施形態において、ＡＯＳＬＯは、被験者の網膜内の光受容体細胞のモザイクの画像をキャプチャするために使用することができる。いくらかの実施形態において、モザイクには、無傷の細胞、無傷ではない細胞またはそれらの組み合わせが含まれる。いくらかの実施形態において、モザイクは、網膜全体、内節、外節、またはその一部を表す画像の合成またはモンタージュを含む。いくらかの実施形態において、モザイクの画像は、プラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を含むか接触している網膜の一部を含む。いくらかの実施形態において、モザイクの画像は、プラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を含むか接触している網膜の一部に併置された網膜の一部を含む。いくらかの実施形態において、モザイクの画像は、処置済みの領域および非処置の領域を含み、処置済みの領域は、プラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を含むか接触しており、非処置の領域は、プラスミドベクターまたは自己組織化ナノ粒子を含まないか接触していない。
【0187】
いくらかの実施形態において、ＡＯＳＬＯは、単独または光干渉断層撮影（ＯＣＴ）と組み合わせて使用され、被験者の網膜、網膜の一部または網膜細胞を直接視覚化することができる。いくらかの実施形態において、補償光学は、ＯＣＴ（ＡＯ－ＯＣＴ）と組み合わせて使用され、被験者の網膜、網膜の一部または網膜細胞を直接視覚化することができる。
【0188】
本開示のいくらかの実施形態において、外節または内節は、共焦点または非共焦点（分割検出器）ＡＯＳＬＯのいずれかにより画像化され、その中の細胞の密度または外節、内節もしくはそれらの組み合わせの完全性のレベルを評価する。いくらかの実施形態において、ＡＯＳＬＯを使用して、内節、外節またはそれらの組み合わせの直径を検出することができる。
【0189】
本明細書に記載のこれらおよび他の実施形態の機能および利点は、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利益を図解し、特定の実施形態を説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示することを意図していない。したがって、実施例が本発明の範囲を限定することを意味していないことが理解されるであろう。
【0190】
実施例
プラスミドコンストラクション：シュタルガルト病を処置するためのヒトＧＲＫ１プロモータおよびヒトポリＡおよびヒトＳ／ＭＡＲエンハンサを有するＡＢＣＡ４プラスミドＤＮＡ
ヒトプロモータおよびエンハンサを有する新規ＡＢＣＡ４プラスミドＤＮＡは、臨床使用のために、錐体および桿体の光受容体の両方でＡＢＣＡ４の特異的発現を促進するように構築されている。ヒトＧＲＫ１（－１０９から＋１０８）プロモータのＤＮＡフラグメントを、以前の刊行物「Ａ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＧＲＫ１ ｇｅｎｅ」，ＩＯＶＳ，２００３にしたがってヒトゲノムＤＮＡから増幅させた。ヒトベータ－グロビンポリＡを、ヒトゲノムＤＮＡから同様に増幅させた。ヒトエンハンサＳ／ＭＡＲ ＤＮＡもまた、プラスミドコンストラクトで使用して、遺伝子発現を強化した。全プラスミドマップを図１に示した。Ｐｕｂｍｅｄデータベースに寄託されたｐＥＰＩプラスミド配列に基づいて配列を分析した。ＧＲＫ１プロモータをＭｌｕＩおよびＡｇｅＩ制限部位に挿入した。Ｓ／ＭＡＲ ＤＮＡをＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。最後に、デザインされたプライマの挿入部位の上流および下流での重複した配列のため、グロビンポリＡ ＤＮＡを、ＮＥＢ ＨｉＦｉアセンブリクローニングキットを使用することにより挿入した。同時に、ＳｐｅＩ制限部位をポリＡとＳ／ＭＡＲとの間に導入した。
プラスミドコンストラクション：シュタルガルト病を処置するためのヒトＧＲＫ１プロモータおよびヒトポリＡおよびヒトＳ／ＭＡＲエンハンサを有するＡＢＣＡ４プラスミドＤＮＡ
ヒトプロモータおよびエンハンサを有する新規ＡＢＣＡ４プラスミドＤＮＡは、臨床使用のために、錐体および桿体の光受容体の両方でＡＢＣＡ４の特異的発現を促進するように構築されている。ヒトＧＲＫ１（－１０９から＋１０８）プロモータのＤＮＡフラグメントを、以前の刊行物「Ａ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＧＲＫ１ ｇｅｎｅ」，ＩＯＶＳ，２００３にしたがってヒトゲノムＤＮＡから増幅させた。ヒトベータ－グロビンポリＡを、ヒトゲノムＤＮＡから同様に増幅させた。ヒトエンハンサＳ／ＭＡＲ ＤＮＡもまた、プラスミドコンストラクトで使用して、遺伝子発現を強化した。全プラスミドマップを図１に示した。Ｐｕｂｍｅｄデータベースに寄託されたｐＥＰＩプラスミド配列に基づいて配列を分析した。ＧＲＫ１プロモータをＭｌｕＩおよびＡｇｅＩ制限部位に挿入した。Ｓ／ＭＡＲ ＤＮＡをＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。最後に、デザインされたプライマの挿入部位の上流および下流での重複した配列のため、グロビンポリＡ ＤＮＡを、ＮＥＢ ＨｉＦｉアセンブリクローニングキットを使用することにより挿入した。同時に、ＳｐｅＩ制限部位をポリＡとＳ／ＭＡＲとの間に導入した。
【0191】
プラスミド構造は、図２に示されたように、異なる制限部位での選択的消化反応のアガロースゲル電気泳動により確認された。ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩの４つの制限酵素は、複数の酵素消化反応において使用された。アガロースゲル（１％）を調製して、消化後に４つのＤＮＡフラグメントを分離した。対照のＧＦＰプラスミドにおいて、消化およびゲル泳動の後に、プロモータＧＲＫ１（４００ｂｐ）、ＧＦＰ（７００ｂｐ）、ポリＡ＋Ｓ／ＭＡＲ（２．９ｋｂ）およびベクターバックボーン（約２．５ｋｂ）を分離した。ＡＢＣＡ４プラスミドにおいて、ＡＢＣＡ４フラグメント（６．８ｋｂ）を同定した（図２Ａ）。同じアガロースゲルの延長した泳動の後、バックボーンおよびｐＡ＋ＳＭＡＲフラグメントの分離が観察された（図２Ｂ）。これらの結果から、プラスミドコンストラクションの成功が確認された。完全長配列決定もまた、新規ＡＢＣＡ４プラスミドに対して実行された。結果は、配列内にあった。
【0192】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の調製
図３に示すように、水溶液中でのＥＣＯおよびｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲの自己組織化を通じてＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を調製した。特に、ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ原液（０．５μｇ／μＬ）を混合し、水溶液中、所定の濃度（２５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、または２００ｎｇ／μＬ）およびＮ／Ｐ比（６、８または１０）で３０分間、室温で振盪させてｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。
図３に示すように、水溶液中でのＥＣＯおよびｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲの自己組織化を通じてＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を調製した。特に、ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ原液（０．５μｇ／μＬ）を混合し、水溶液中、所定の濃度（２５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、または２００ｎｇ／μＬ）およびＮ／Ｐ比（６、８または１０）で３０分間、室温で振盪させてｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。
【0193】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の特徴づけ
ＥＣＯ－ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、種々のＮ／Ｐ比（６、８および１０）で異なるＤＮＡ濃度（２５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬおよび２００ｎｇ／μＬ）を用いて製剤化した。Ｎ／Ｐ比に基づいた所定の量でＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を混合し、３０分間室温でボルテックスした。ＥＣＯを用いたｐＤＮＡのナノ粒子への縮合は、１２０Ｖで２５分間泳動される０．７％アガロースゲル中で調製されたアガロースゲル電気泳動により検証された。ナノ粒子のサイズおよびゼータ電位は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＵＳＡ、アッシュランド、ＶＡ）を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定された。異なるｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ濃度を用いてＮ／Ｐ比８で製剤化されたナノ粒子についての特徴づけのために実施例を以下に与えた（図４）。
ＥＣＯ－ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、種々のＮ／Ｐ比（６、８および１０）で異なるＤＮＡ濃度（２５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬおよび２００ｎｇ／μＬ）を用いて製剤化した。Ｎ／Ｐ比に基づいた所定の量でＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を混合し、３０分間室温でボルテックスした。ＥＣＯを用いたｐＤＮＡのナノ粒子への縮合は、１２０Ｖで２５分間泳動される０．７％アガロースゲル中で調製されたアガロースゲル電気泳動により検証された。ナノ粒子のサイズおよびゼータ電位は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＵＳＡ、アッシュランド、ＶＡ）を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定された。異なるｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ濃度を用いてＮ／Ｐ比８で製剤化されたナノ粒子についての特徴づけのために実施例を以下に与えた（図４）。
【0194】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子製剤の結果を図４に示した。ＥＣＯおよびｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲは、サイズが２００ｎｍであり、正のゼータ電位が４０ｍＶである安定したナノ粒子を形成することができた（図４Ａ、図４Ｂ）。製剤化されたナノ粒子もまた、中性のｐＨを示した。プラスミドカプセル化もまた、アガロースゲル電気泳動により確認された（図４Ｃ）。ＥＣＯは、ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲを高濃度（２００ｎｇ／μＬ）で効率的にカプセル化することができた。
【0195】
マウスにおいて光受容体細胞特異的ＡＢＣＡ４発現を誘導したＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子のＡＢＣＡ４発現をＡｂｃａ４－／－マウスにおいて評価した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子（１μＬ）を右眼の網膜下腔に注射し、ＰＢＳ１μＬを対照として左眼に注射した。１週間後、マウスを犠牲にし、免疫組織染色を実行した。結果を図５に示した。
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子のＡＢＣＡ４発現をＡｂｃａ４－／－マウスにおいて評価した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子（１μＬ）を右眼の網膜下腔に注射し、ＰＢＳ１μＬを対照として左眼に注射した。１週間後、マウスを犠牲にし、免疫組織染色を実行した。結果を図５に示した。
【0196】
免疫組織染色は、注射部位またはその近くで明らかなＡＢＣＡ４発現を示した（図５Ａ）。ＡＢＣＡ４発現は、主に光受容体細胞がある外節（ＯＳ）で観察された。網膜全体では、注射部位から網膜の縁にかけてＡＢＣＡ４発現の減衰が観察された（図５Ｂ）。しかし、ＰＢＳ注射の対照の眼については、ＡＢＣＡ４発現が観察されない。
【0197】
ＡＢＣＡ４発現はまた、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して検証された。溶解緩衝液中でホモジナイザを使用して、眼組織を手動でホモジナイズした。メーカーの説明にしたがってキアゲンＲＮｅａｓｙキットを使用して、ＲＮＡ抽出を実行した。ｍＲＮＡ転写物は、ｍｉＳｃｒｉｐｔＩＩリバーストランスクリプターゼキット（キアゲン、ジャーマンタウン、ＭＤ）を使用してｃＤＮＡに変換された。エッペンドルフＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ機中、ＳＹＢＲグリーンマスターミクス（ＡＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オールストン、ＭＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実行した。ＰＢＳ注射の眼を対照として用いて、倍率変化を１８Ｓに対して正規化した。
【0198】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、２００ｎｇのナノ粒子を用いて処置されたほぼすべての眼で確認された（図６）。
【0199】
マウスにおいてＡＢＣＡ４発現を誘導した、賦形剤（１０％スクロース）を用いて製剤化されたＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたように調製した。スクロース（１０％）をナノ粒子溶液に添加し、３０分間さらに混合した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子溶液（１μＬ）を右眼の網膜下腔に注射し、ＰＢＳ１μＬを対照として左眼に注射した。１週間後、マウスを犠牲にし、ｑＲＴ－ＰＣＲを実行した。
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたように調製した。スクロース（１０％）をナノ粒子溶液に添加し、３０分間さらに混合した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子溶液（１μＬ）を右眼の網膜下腔に注射し、ＰＢＳ１μＬを対照として左眼に注射した。１週間後、マウスを犠牲にし、ｑＲＴ－ＰＣＲを実行した。
【0200】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、処置された眼のすべてで観察された（図７）。処置マウスについては、ＰＢＳ処置対照よりも有意に高いＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現が観察された。
【0201】
ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の調製
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を図８に記載されたように製剤化した。ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびＰＥＧ－ＭＡＬ標的化リガンド（水中０．６２５ｍＭ）（ＥＣＯの２．５モル％）を最初に混合し、水溶液中で３０分間反応させた。Ｎ／Ｐ比（アミン対リン酸比）６、８または１０を有する所定量のプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を、ＥＣＯおよびＰＥＧ－ＭＡＬ混合物に添加し、混合して、３０分間室温で振盪させ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を図８に記載されたように製剤化した。ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびＰＥＧ－ＭＡＬ標的化リガンド（水中０．６２５ｍＭ）（ＥＣＯの２．５モル％）を最初に混合し、水溶液中で３０分間反応させた。Ｎ／Ｐ比（アミン対リン酸比）６、８または１０を有する所定量のプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を、ＥＣＯおよびＰＥＧ－ＭＡＬ混合物に添加し、混合して、３０分間室温で振盪させ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。
【0202】
ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の特徴づけ：異なる温度（－２０℃または４℃）下でのサイズ、ゼータ電位、賦形剤（１０％スクロース）中のカプセル化および安定性
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたように製剤化した。ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびＰＥＧ－ＭＡＬ標的化リガンド（水中０．６２５ｍＭ）（ＥＣＯの２．５モル％）を最初に混合し、水溶液中で３０分間反応させた。Ｎ／Ｐ比（アミン対リン酸比）６、８または１０を有する所定量のプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を、ＥＣＯおよびＰＥＧ－ＭＡＬ混合物に添加し、混合して、３０分間室温で振盪させ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。スクロース（１０％）をＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子溶液に添加し、さらに３０分間振盪させ、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％）ナノ粒子を与えた。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子を以前のセクションで記載されたように調製した。
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたように製剤化した。ＥＣＯ原液（エタノール中２５ｍＭ）およびＰＥＧ－ＭＡＬ標的化リガンド（水中０．６２５ｍＭ）（ＥＣＯの２．５モル％）を最初に混合し、水溶液中で３０分間反応させた。Ｎ／Ｐ比（アミン対リン酸比）６、８または１０を有する所定量のプラスミドＤＮＡ原液（０．５μｇ／μＬ）を、ＥＣＯおよびＰＥＧ－ＭＡＬ混合物に添加し、混合して、３０分間室温で振盪させ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を与えた。スクロース（１０％）をＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子溶液に添加し、さらに３０分間振盪させ、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％）ナノ粒子を与えた。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子を以前のセクションで記載されたように調製した。
【0203】
サイズおよびゼータ電位を、以前記載されたように評価した。ナノ粒子の安定性を、異なる貯蔵条件下で評価した。全ナノ粒子製剤を－２０℃または４℃のいずれかで貯蔵した。ナノ粒子のサイズおよびゼータ電位は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＵＳＡ、アッシュランド、ＶＡ）を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定された。ｐＤＮＡカプセル化は、アガロースゲル電気泳動を使用して評価された。
【0204】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）およびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子のサイズ分布のＤＬＳを図９に要約した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子は、より広いサイズ分布が図９Ａに示された場合、－２０℃下で１ヶ月後に凝集体の形成の開始を示した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）およびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子について、有意な変化は観察されなかった（図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄ）。サイズおよびゼータ電位もまた、表１に要約した。１０％スクロース中のＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子製剤およびＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子および１０％スクロース中のその製剤は、一貫したサイズおよびゼータ電位を示した。
【0205】
【表1】
【0206】
アガロースゲル電気泳動を使用して、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）およびＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（１０％スクロース）ナノ粒子のカプセル化および安定性を評価した。結果を図１０に示した。全ナノ粒子は、４℃および－２０℃の両方で、試験された全時点について効率的なｐＤＮＡカプセル化および優れた安定性を示した。
【0207】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子と比較してマウスにおいて高いＡＢＣＡ４発現を誘導した、ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子
異なる製剤化ナノ粒子のＡＢＣＡ４発現を、Ａｂｃａ４－／－マウスにおいて評価した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子を、以前記載されたようにｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼にＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼にはＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）０．５μＬが注射された。５匹のマウスには、一方の眼にＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（５％スクロース）０．５μＬが、反対側の眼にＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子０．５μＬが注射された。注射の１週間後、マウスを犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
異なる製剤化ナノ粒子のＡＢＣＡ４発現を、Ａｂｃａ４－／－マウスにおいて評価した。ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲおよびＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子を、以前記載されたようにｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼にＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼にはＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）０．５μＬが注射された。５匹のマウスには、一方の眼にＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子（５％スクロース）０．５μＬが、反対側の眼にＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子０．５μＬが注射された。注射の１週間後、マウスを犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0208】
ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子と比較して強化されたＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を示した。ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子は、ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ（５％スクロース）ナノ粒子よりもさらに多くのＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を誘導した（図１１）。ＰＥＧ化（２．５％）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、発現および処置の研究のためのリード製剤として選択した。
【0209】
マウスにおいて異なるＡＢＣＡ４発現を誘導したＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の異なる注射体積
ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬのいずれかで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子１μＬが、反対側の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは６週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬのいずれかで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子１μＬが、反対側の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは６週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0210】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、すべての処置眼について観察された（図１２）。注射体積は、ＡＢＣＡ４発現の有効性において重要な役割を果たした。注射体積が小さいほど、より高いＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現が誘導されるように見えた。１μＬの注射体積は、０．５μＬの注射体積と比較して、わずかに６５％の発現レベルを示した。
【0211】
マウスにおけるＡＢＣＡ４発現に対するＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲの投与の効果
投与の効果を評価するため、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬのいずれかで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼に５０ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。５匹のマウスには、一方の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは５週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
投与の効果を評価するため、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬのいずれかで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。５匹のマウスには、一方の眼に５０ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。５匹のマウスには、一方の眼に１００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは５週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0212】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、すべての処置眼について観察された（図１３）。同じ注射体積では、用量とともにＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の増加が観察された。
【0213】
異なる齢のマウスにおいて異なるＡＢＣＡ４発現を誘導したＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲ
ＰＥＧ化（２．５％）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を異なる齢のａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたようにｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。マウスには、一方の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼にＰＢＳ０．５μＬが注射された。マウスは５週齢、８週齢、１２週齢、２２週齢および５８週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
ＰＥＧ化（２．５％）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を異なる齢のａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ化ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、以前記載されたようにｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。マウスには、一方の眼に２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが、反対側の眼にＰＢＳ０．５μＬが注射された。マウスは５週齢、８週齢、１２週齢、２２週齢および５８週齢で注射され、注射の１週間後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0214】
マウスが新しく生まれたか若年期であった場合、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は低い。マウスが幼若期であった場合またはわずかに齢が高かった場合、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は増加した。マウスが老齢期であった場合、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は低下した（図１４）。
【0215】
ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子は、－２０℃で最大１ヶ月間貯蔵後、同等の遺伝子発現を誘導することができる
－２０℃で異なる期間貯蔵されたＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を研究するため、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子を－２０℃で１週間、２週間および１ヶ月間維持した。その後、ナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに、０．５μＬ（１００ｎｇ用量）の注射体積で網膜下注射を通じて注射した。マウスは、３ヶ月齢で注射され、注射の２週間後および１ヶ月後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
－２０℃で異なる期間貯蔵されたＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を研究するため、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子を－２０℃で１週間、２週間および１ヶ月間維持した。その後、ナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに、０．５μＬ（１００ｎｇ用量）の注射体積で網膜下注射を通じて注射した。マウスは、３ヶ月齢で注射され、注射の２週間後および１ヶ月後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0216】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の網膜下注射により処置されたほぼすべての眼について観察された（図１５）。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現は、１週間、２週間および１ヶ月間貯蔵されたナノ粒子について、平均で有意差を示さなかった。しかし、作りたてのナノ粒子と比較して、－２０℃で維持されたすべてのナノ粒子について、平均でＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現における低下が観察された。しかし、統計的に有意差はなかった。
【0217】
ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子は、網膜下および硝子体内注射の両方を通じて遺伝子発現を誘導することができる
異なる注射経路を通じてＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を示すために、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。１０匹のマウスには、一方の眼に網膜下注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬ（以前同定した用量および注射体積）が、反対側の眼に硝子体内注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは２ヶ月齢で注射され、注射の２週間後および１ヶ月後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
異なる注射経路を通じてＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を示すために、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。１０匹のマウスには、一方の眼に網膜下注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬ（以前同定した用量および注射体積）が、反対側の眼に硝子体内注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは２ヶ月齢で注射され、注射の２週間後および１ヶ月後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0218】
網膜下注射を通じたＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の結果を、図１６に要約した。１０匹のマウスのうち９匹が、非処置対照マウスよりも有意に多くのＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を示した。Ａ２Ｅ分析は、評価の時間枠（６ヶ月）のため、以前選択された１００ｎｇ／眼の処置用量および０．５μＬの注射体積を使用して現在進行中である。
【0219】
異なる注射経路を通じたＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の有効性を示すため、ＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスにおいて試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。１０匹のマウスには、一方の眼に網膜下注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬ（以前同定した用量および注射体積）が、反対側の眼に硝子体内注射を通じて２００ｎｇ／μＬのナノ粒子０．５μＬが注射された。マウスは、２ヶ月齢で注射され、注射の２週間後および１ヶ月後、犠牲にした。ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した。
【0220】
硝子体内注射を通じたＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現の結果を、図１７に要約した。１０匹のマウスのうち６匹が、非処置対照マウスよりも有意に多くのＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を示した。網膜下注射と硝子体内注射との間の比較を、図１８に要約した。全体として、網膜下注射は、硝子体内注射よりも良好な有効性を示した。驚いたことに、ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の硝子体内投与はまた、外側の網膜でＡＢＣＡ４発現を誘導し、硝子体内投与のためのＥＣＯベースのナノ粒子製剤の潜在的な適用を高めることができた。しかし、網膜下注射経路と比較して有効性が限られているため、Ａ２Ｅ分析は、以前決定された用量１００ｎｇ／眼および０．５μＬの注射体積で、ＰＥＧ化ＥＣＯナノ粒子のための網膜下注射経路を使用してのみ実行された。
【0221】
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を使用するＥＣＯベースの遺伝子治療は、８ヶ月間および１年間の単回処置でａｂｃａ４
－／－
マウスにおいてＡ２Ｅ蓄積を防止することができる
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の有効性を示すため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇまたは２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。その後、ナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに０．５μＬの注射体積（１００ｎｇおよび５０ｎｇ用量）で網膜下注射を通じて注射した。注射の８ヶ月後または１年後、マウスを犠牲にした。ＨＰＬＣを使用して、各眼球でのＡ２Ｅ量を分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を評価し、免疫組織染色を使用して、ＡＢＣＡ４タンパク質発現を示した。結果を図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示した。
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の有効性を示すため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇまたは２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。その後、ナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに０．５μＬの注射体積（１００ｎｇおよび５０ｎｇ用量）で網膜下注射を通じて注射した。注射の８ヶ月後または１年後、マウスを犠牲にした。ＨＰＬＣを使用して、各眼球でのＡ２Ｅ量を分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を評価し、免疫組織染色を使用して、ＡＢＣＡ４タンパク質発現を示した。結果を図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示した。
【0222】
非処置対照と比較して高用量（１００ｎｇ／眼）のナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスについてＡ２Ｅ蓄積における約２５％の低下が観察された。低用量（５０ｎｇ／眼）のナノ粒子処置マウスについてＡ２Ｅ蓄積における２０％の低下が観察された。平均して、高用量の遺伝子治療は、結果として良好な予防となり得るが、この実験で選択された低用量と有意差がなかった（図１９）。ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムはまた、対照群よりも処置群でより小さいピークを示した（図２０）。
【0223】
ＡＢＣＡ４タンパク質発現はまた、ａｂｃａ４－／－マウスにおいて、ＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の単回処置の８ヶ月後に観察された。免疫組織染色の助けを借りて、ＡＢＣＡ４タンパク質（緑色で標識）発現は、細胞特異的プロモータＧＲＫ１の取り込みのため、主に光受容体外節（ＯＳ）で観察することができた（図２１）。
【0224】
Ａ２Ｅ蓄積における２０％の同様の低下は、高用量（１００ｎｇ／眼）のナノ粒子処置ａｂｃａ４－／－マウスで観察された。Ａ２Ｅ蓄積の僅かな低下は、低用量（５０ｎｇ／眼）のナノ粒子処置マウスで観察されたが、対照群と有意差がなかった。平均して、高用量の遺伝子治療は、結果として良好な予防となり得る（図２２）。
【0225】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現はまた、ａｂｃａ４－／－マウスにおいて、ＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子の単回処置の１年後にも観察され、平均して低用量で処置されたマウスよりも高い用量で処置されたマウスでより高いｍＲＮＡ発現を有していたが、有意差はなかった（図２３）。
【0226】
ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を使用するＥＣＯベースの遺伝子治療は、最初の処置から８ヶ月後の多重処置でａｂｃａ４
－／－
マウスにおいてＡ２Ｅ蓄積を防止することができる
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の有効性を示すため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇまたは２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。網膜下注射を通じて０．５μＬの注射体積（１００ｎｇ）でナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに注射した。単回注射では、マウスは１回のみ注射された。複数注射では、マウスは３ヶ月ごとに注射された。最初の処置の８ヶ月後、マウスを犠牲にした。ＨＰＬＣを使用して各眼球におけるＡ２Ｅ量を分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を評価した。結果を図１９、図２０、図２１および図２２に示した。
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の有効性を示すため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度１００ｎｇまたは２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。網膜下注射を通じて０．５μＬの注射体積（１００ｎｇ）でナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに注射した。単回注射では、マウスは１回のみ注射された。複数注射では、マウスは３ヶ月ごとに注射された。最初の処置の８ヶ月後、マウスを犠牲にした。ＨＰＬＣを使用して各眼球におけるＡ２Ｅ量を分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現を評価した。結果を図１９、図２０、図２１および図２２に示した。
【0227】
ナノ粒子の単回注射で処置されたａｂｃａ４－／－マウスでＡ２Ｅ蓄積における約１６％の低下が観察された。ナノ粒子の２回用量で注射されたマウスで約３０％の低下が観察された。両方とも対照群と有意差があった。防止効果は、単回注射よりも多重処置群で有意に良好である（図２４）。ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムはまた、対照群よりも処置群、特に多重処置群でより小さいピークを示した（図２５）。
【0228】
ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ発現はまた、ａｂｃａ４－／－マウスの単回および多重処置群の両方について観察された。２群についてＲＮＡレベルに対して発現の有意差は観察されなかった（図２６）。さらなる組織学的研究は、タンパク質レベルに対してＡＢＣＡ４発現を評価するために実行される。
【0229】
単回または多重処置後のａｂｃａ４
－／－
マウスにおいて優れた安全性プロファイルを示したＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を使用するＥＣＯベースの遺伝子治療
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の安全性を評価するため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。その後、網膜下注射を通じて０．５μＬの注射体積（１００ｎｇ）でナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに注射した。走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して、単回用量注射の７ヶ月後または２回注射の８ヶ月後、眼の状態を評価した。遺伝子治療について、処置に関連する副作用は観察されなかった。対照群については、視神経の近くの暗い領域により示されるいくらかの網膜変性イベントが観察された（図２７）。
単回処置後のＥＣＯベースの遺伝子治療の安全性を評価するため、Ａ２Ｅ上のＰＥＧ化（２．５％ＰＥＧ）ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウス（１～２．５ヶ月齢）において試験した。ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｐＧＲＫ１－ＡＢＣＡ４－Ｓ／ＭＡＲナノ粒子を、ｐＤＮＡ濃度２００ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。その後、網膜下注射を通じて０．５μＬの注射体積（１００ｎｇ）でナノ粒子をａｂｃａ４－／－マウスに注射した。走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して、単回用量注射の７ヶ月後または２回注射の８ヶ月後、眼の状態を評価した。遺伝子治療について、処置に関連する副作用は観察されなかった。対照群については、視神経の近くの暗い領域により示されるいくらかの網膜変性イベントが観察された（図２７）。
【0230】
同様に、遺伝子治療について、処置に関連する有意な副作用は観察されなかった。わずかに暗い領域がＳＬＯ画像で観察され、回復することができた（図２８）。
【0231】
２型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）ベースのシステムよりも良好な安全性プロファイルを示したＥＣＯベースのナノ粒子プラットフォーム
ＡＡＶ２ベースのシステムと比較してＥＣＯベースのナノ粒子システムの安全性を評価するため、対照としてＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰを用いるレポーターＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＧＦＰ）を使用して、５％スクロース中で製剤化したＰＥＧ化ＥＣＯナノ粒子を選択した。ＡＣＵ－ＰＥＧ－ＨＺ－ＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＧＦＰナノ粒子を、５％スクロースを有するｐＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子（０．５μＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスの一方の眼の網膜下腔に注射した。反対側の眼には、同じ用量のＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰを注射した。非処置マウスを対照として使用した。走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して眼の状態およびＧＦＰ発現を１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月で評価した（図２９）。ＧＦＰ発現は、製剤化されたＥＣＯナノ粒子およびＡＡＶ２システムの両方についてすべての時点で観察された。
ＡＡＶ２ベースのシステムと比較してＥＣＯベースのナノ粒子システムの安全性を評価するため、対照としてＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰを用いるレポーターＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＧＦＰ）を使用して、５％スクロース中で製剤化したＰＥＧ化ＥＣＯナノ粒子を選択した。ＡＣＵ－ＰＥＧ－ＨＺ－ＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＧＦＰナノ粒子を、５％スクロースを有するｐＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬで、Ｎ／Ｐ＝８で製剤化した。ナノ粒子（０．５μＬ）をＢＡＬＢ／ｃマウスの一方の眼の網膜下腔に注射した。反対側の眼には、同じ用量のＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰを注射した。非処置マウスを対照として使用した。走査型レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して眼の状態およびＧＦＰ発現を１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月で評価した（図２９）。ＧＦＰ発現は、製剤化されたＥＣＯナノ粒子およびＡＡＶ２システムの両方についてすべての時点で観察された。
【0232】
ＡＡＶ２は、飽和した白色領域により示されるＥＣＯナノ粒子よりも多くの病変および潜在的な炎症を誘導するように見えた。ＥＣＯベースのナノ粒子プラットフォームは、深刻な有害事象を示さず、眼の状態は、処置から回復することができた。
【0233】
ＥＣＯは、ソルビトールと比較して賦形剤として５％スクロース中で異なるサイズのｐＤＮＡを有する安定したナノ粒子を製剤化することができる
ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０およびｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０のＥＣＯ／ｐＤＮＡナノ粒子を、アミン／リン酸（Ｎ／Ｐ）比６、８および１０でプラスミドを用いるＥＣＯの自己組織化により最初に調製した。プラスミドｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４およびｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４を対照として使用した。その後、スクロースまたはソルビトールを賦形剤として５％または１０％の濃度で添加してナノ粒子を安定化させた。ナノ粒子は、異なる賦形剤条件下、それらのサイズ分布（図３０）およびゼータ電位分布（図３１）について、動的光散乱（ＤＬＳ）により特徴づけられた。図３０に示されるように、ＥＣＯおよびｐＡＢＣＡ４は、５％および１０％の内容量の両方で、スクロースの存在下、すべてのＮ／Ｐ比で安定したナノ粒子を製剤化した。サイズは、２２０ｎｍから２５０ｎｍであり、分布は、凝集ピークが無視できる単一のピークとして見られ、賦形剤による影響を受けなかった。しかし、ソルビトール添加は、いくらかのＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４製剤に影響した。例えば、Ｎ／Ｐ比が６のＥＣＯ／ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４、Ｎ／Ｐ比が８のＥＣＯ／ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０、Ｎ／Ｐ比が１０のＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４、およびＮ／Ｐ比が１０のＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０は、ソルビトール添加後にサイズ分布の拡大を示した。ゼータ電位分布は、ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子製剤についてスクロース添加後に顕著な変化がなかったことを示した（図３１）。ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子は、スクロース条件下、すべてのＮ／Ｐ比にわたって＋２０ｍＶの周囲で均一な分布を示した。しかし、ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子製剤へのソルビトール添加は、結果としてゼータ電位分布においていくらかの顕著な変化となった。
ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０およびｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０のＥＣＯ／ｐＤＮＡナノ粒子を、アミン／リン酸（Ｎ／Ｐ）比６、８および１０でプラスミドを用いるＥＣＯの自己組織化により最初に調製した。プラスミドｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４およびｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４を対照として使用した。その後、スクロースまたはソルビトールを賦形剤として５％または１０％の濃度で添加してナノ粒子を安定化させた。ナノ粒子は、異なる賦形剤条件下、それらのサイズ分布（図３０）およびゼータ電位分布（図３１）について、動的光散乱（ＤＬＳ）により特徴づけられた。図３０に示されるように、ＥＣＯおよびｐＡＢＣＡ４は、５％および１０％の内容量の両方で、スクロースの存在下、すべてのＮ／Ｐ比で安定したナノ粒子を製剤化した。サイズは、２２０ｎｍから２５０ｎｍであり、分布は、凝集ピークが無視できる単一のピークとして見られ、賦形剤による影響を受けなかった。しかし、ソルビトール添加は、いくらかのＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４製剤に影響した。例えば、Ｎ／Ｐ比が６のＥＣＯ／ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４、Ｎ／Ｐ比が８のＥＣＯ／ｐＲＨＯ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０、Ｎ／Ｐ比が１０のＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４、およびＮ／Ｐ比が１０のＥＣＯ／ｐＣＭＶ－ＡＢＣＡ４－ＳＶ４０は、ソルビトール添加後にサイズ分布の拡大を示した。ゼータ電位分布は、ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子製剤についてスクロース添加後に顕著な変化がなかったことを示した（図３１）。ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子は、スクロース条件下、すべてのＮ／Ｐ比にわたって＋２０ｍＶの周囲で均一な分布を示した。しかし、ＥＣＯ／ｐＡＢＣＡ４ナノ粒子製剤へのソルビトール添加は、結果としてゼータ電位分布においていくらかの顕著な変化となった。
【0234】
本発明の上記の説明から、当業者は、改善、変更および修飾を理解するであろう。当技術分野の技術内のそのような改善、変更および修飾は、添付の特許請求の範囲によりカバーされることが意図されている。本出願で引用されるすべての参考文献、刊行物、および特許は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図1】
【図2A-B】
【図3】
【図4A-C】
【図5A-B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A-D】
【図10A-C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】