▶ スーチョウ プラジュナ バイオテック カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-04
(54)【発明の名称】突然変異型オルフウイルス及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/39 20060101AFI20230828BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230828BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230828BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20230828BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230828BHJP
A61K 9/02 20060101ALI20230828BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230828BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230828BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20230828BHJP
【ＦＩ】
C12N15/39 ZNA
C12N7/01
A61P35/00
A61K35/768
A61K9/06
A61K9/02
A61K9/10
A61K9/14
A61K9/70 401
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511666
(86)(22)【出願日】2021-08-13
(85)【翻訳文提出日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 CN2021112408
(87)【国際公開番号】W WO2022033573
(87)【国際公開日】2022-02-17
(31)【優先権主張番号】202010813096.9
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】319004434
【氏名又は名称】スーチョウ プラジュナ バイオテック カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フー，ミンジェ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BA21
4B065BD16
4B065CA44
4C076AA01
4C076AA06
4C076AA22
4C076AA30
4C076AA72
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB29
4C076BB30
4C076BB31
4C076CC27
4C076FF01
4C076FF11
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA16
4C087MA28
4C087MA32
4C087MA43
4C087MA56
4C087MA60
4C087MA63
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、突然変異型オルフウイルス（ＯＲＦＶ）及びその医薬組成物の癌を治療するための使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の機能性発現産物を欠失することを特徴とする突然変異型オルフウイルス。
【請求項2】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２の機能性発現産物の欠失は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の完全欠失又は一部欠失により引き起こされる請求項１に記載のウイルス。
【請求項3】
遺伝子ＯＲＦＶ１１１の機能性発現産物の欠失は、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全欠失又は一部欠失により引き起こされる請求項１に記載のウイルス。
【請求項4】
発現産物がタンパク質及び／又は核酸である請求項１～３のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項5】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２を完全欠失又は一部欠失するか、及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１を完全欠失又は一部欠失することを特徴とする突然変異型オルフウイルス。
【請求項6】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２の発現産物の発現及び／又は活性を低下又は除去すること、及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の発現産物の発現及び／又は活性を低下又は除去することを含むオルフウイルスの操作方法。
【請求項7】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２を完全又は一部削除することを含む請求項６に記載の方法。
【請求項8】
遺伝子ＯＲＦＶ１１１を完全又は一部削除することを含む請求項６に記載の方法。
【請求項9】
発現が転写及び／又は翻訳である請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
遺伝子ＯＲＦＶ１１２を完全又は一部削除すること、及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１を完全又は一部削除することを含むオルフウイルスの操作方法。
【請求項11】
請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法により得られるウイルス。
【請求項12】
遺伝子ＯＲＦＶ００２（ＮＦ－κＢ核阻害剤）、ＯＲＦＶ００５（Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＯＲＦＶ００７（ｄＵＴＰａｓｅ）を完全欠失する請求項１～５及び１１のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項13】
複製及び腫瘍溶解性能力を備える請求項１～５、１１及び１２のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項14】
ＣＣＴＣＣ受託番号Ｖ２０２０２９で受託されたオルフウイルス。
【請求項15】
請求項１～５及び１１～１４のいずれか１項に記載のウイルスのゲノム。
【請求項16】
請求項１～５及び１１～１４のいずれか１項に記載のウイルスと薬学的に許容されるベクターとを含む、組成物。
【請求項17】
粉剤、液剤、経皮パッチ、軟膏、又は座薬の形式である請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内、又は腹腔内の路径により投与される請求項１６に記載の組成物。
【請求項19】
請求項１～５及び１１～１４のいずれか１項に記載のウイルス製造の、癌を治療するための薬物への使用。
【請求項20】
前記癌が固形腫瘍である請求項１９に記載の使用。
【請求項21】
前記固形腫瘍が、子宮頸癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、頭頚部癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫又は脳腫瘍である請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年８月１３日により提出されて出願番号第２０２０１０８１３０９６．９号の中国出願の優先権を主張する。
本願は、２０２０年８月１３日により提出されて出願番号第２０２０１０８１３０９６．９号の中国出願の優先権を主張する。
【0002】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的に突然変異型オルフウイルス（ＯＲＦＶ）及びその医薬組成物の癌を治療するための使用に関する。
【背景技術】
【0003】
オルフウイルス（ＯＲＦＶと略称）は、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）におけるパラポックスウイルス属（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）に属する。この属には、さらにウシ丘疹性口内炎ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、偽ウシポックスウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ニュージーランドアカシカパラポックスウイルス（ｐａｒａｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
ｒｅｄ ｄｅｅｒ ｉｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）、アザラシボックスウイルス（Ｓｅａｌｐｏｘ）等、複数種のウイルスが含まれ、ヒツジとヤギの接触伝染性、上皮向性の疾患を引き起こす。ウイルスがヒツジを感染した後、その病気の経過は、まず、ヤギやヒツジの口唇、舌、鼻、乳房等の部位から紅斑が発生し、さらに丘疹、水疱、膿疱に発展し、最後に結痂し、過形成性炎症を典型的な特徴とする。
ｒｅｄ ｄｅｅｒ ｉｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）、アザラシボックスウイルス（Ｓｅａｌｐｏｘ）等、複数種のウイルスが含まれ、ヒツジとヤギの接触伝染性、上皮向性の疾患を引き起こす。ウイルスがヒツジを感染した後、その病気の経過は、まず、ヤギやヒツジの口唇、舌、鼻、乳房等の部位から紅斑が発生し、さらに丘疹、水疱、膿疱に発展し、最後に結痂し、過形成性炎症を典型的な特徴とする。
【0004】
中国特許ＣＮ１０４０１７７７６Ｂには、分離及び細胞継代培養された弱毒化ＯＲＦＶをワクチン創製に用いることが開示されている。中国特許公開ＣＮ１０８０２６５４２Ａには、ウイルス株Ｄ１７０１を用いて組み換えＯＲＦＶベクターの構築を行い、ウイルス抗原、腫瘍抗原等を発現させてワクチン製造に用いることが記載されている。
【0005】
腫瘍溶解性ウイルス療法（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）は、天然に存在するウイルス又は操作されたウイルスを選択、使用して腫瘍を治療する全身療法である。そもそも腫瘍細胞の増殖及び生存を促進する特定の遺伝子突然変異は、ちょうど溶解機能を有するウイルスがその中での成長を促進することができ、これは、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を精確に攻撃する原因の１つである［１、２、３］。癌細胞を感染した腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスライフサイクル内の適切な時点で癌細胞の溶解、死亡を促進させ、感染性ウイルス粒子を放出して、周囲の感染されていない癌細胞を感染することができる。また、癌細胞の溶解により放出されたネオアンチゲン（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）が、免疫系を活性化することにより、癌に対して後続の攻撃を行う［４］。現在、世界中で腫瘍溶解性ウイルスを用いてヒト悪性腫瘍を治療する臨床試験が９０つ以上であり、中でも、Ｔ－Ｖｅｃ腫瘍溶解性ウイルス薬物がＦＤＡの承認を取得した［５］。
【0006】
ＯＲＦＶウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであり、長さが約１３４～１３９ｋｂである。ウイルス粒子の長さが２３０～２８０ｎｍ、幅が１５０～２００ｎｍであり、楕円形のコイル状をしている［６］。ＯＲＦＶウイルスは以下の特徴を有する。１）同じファミリのポックスウイルス科メンバーに類似して、ＯＲＦＶウイルスは、宿主細胞の細胞質のみにおいて複製し、細胞核に入らないため、宿主細胞のゲノムに取り込まないので、安全性が高く、発癌性の確率が極めて低い［７、１０］。２）破損した皮膚を通して動物の感染部位と接触し、ヒトを感染することができ、感染部位（一般的に指である）において、臨床上、症状が軽いの膿疱が発生し、ほとんど他の好ましくない副反応がなく、一般的に致命的な疾患を引き起こさず、６～８週間後、自己治癒できる［８、１１］。３）感染時に細胞表面の関連受容体により制限されず［９、１０］、固形腫瘍の高ヘテロジェニティ
ーを克服するためのルートを提供する見込みがある。４）ゲノムが膨大であり、外来遺伝子の挿入及び高効率な発現に有利である。５）ウイルスゲノムが安定し、複製の忠実度が高い。６）宿主の体内で中和抗体がほとんど又は全く発生せず、複数回、感染を繰り返すことができ［１１］、繰り返しの静脈内注射を実現することができる。７）生体の先天性（Ｉｎｎａｔｅ）及び適応性（Ａｄａｐｔｉｖｅ）抗腫瘍免疫反応を誘発することができる［１２］。８）同じファミリにおけるワクシニアウイルスを抗天然痘ワクチンとして、既に全世界で数十億人に使用されており、臨床適用のリスクが低い。９）それ自体の特性に基づき、コールド（Ｃｏｌｄ）腫瘍をホット（Ｈｏｔ）腫瘍に形質転換する能力を有する［１８］。以上の特徴により、当該種属のウイルスは、新規な腫瘍溶解性ウイルスとして固形腫瘍治療に用いられる見込みがある。
ーを克服するためのルートを提供する見込みがある。４）ゲノムが膨大であり、外来遺伝子の挿入及び高効率な発現に有利である。５）ウイルスゲノムが安定し、複製の忠実度が高い。６）宿主の体内で中和抗体がほとんど又は全く発生せず、複数回、感染を繰り返すことができ［１１］、繰り返しの静脈内注射を実現することができる。７）生体の先天性（Ｉｎｎａｔｅ）及び適応性（Ａｄａｐｔｉｖｅ）抗腫瘍免疫反応を誘発することができる［１２］。８）同じファミリにおけるワクシニアウイルスを抗天然痘ワクチンとして、既に全世界で数十億人に使用されており、臨床適用のリスクが低い。９）それ自体の特性に基づき、コールド（Ｃｏｌｄ）腫瘍をホット（Ｈｏｔ）腫瘍に形質転換する能力を有する［１８］。以上の特徴により、当該種属のウイルスは、新規な腫瘍溶解性ウイルスとして固形腫瘍治療に用いられる見込みがある。
【0007】
ＯＲＦＶウイルス株は、一般的に約１３０～１３４個の遺伝子をコードする。現在、既に確認された毒性因子は、主にウイルスインターフェロン阻害タンパク質（ＯＶＩＦＮＲ，ＯＲＦＶ０２０）、ケモカイン結合タンパク質（ＣＢＰ，ＯＲＦＶ１１２）、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－２阻害タンパク質（ＧＩＦ，ＯＲＦＶ１１７）、ウイルスインターロイキン１０（ｖＩＬ－１０，ＯＲＦＶ１２７）及び血管内皮成長因子様タンパク質（ＶＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＲＦＶ１３２）等が挙げられる［１１］。これらの遺伝子がコードするタンパク質は、生体の免疫反応を調節することもできる［１３］。
【0008】
遺伝子ＯＲＦＶ００２は、タンパク質合成後に細胞核内に局在して細胞核内でＮＦ－κＢ経路を阻害するウイルス後期遺伝子であり、ＯＲＦＶウイルスにより産生する最初のＮＦ－κＢ核阻害剤であると同定されている［１９］。
【0009】
遺伝子ＯＲＦＶ００５は、仮想タンパク質（Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子であり、その作用メカニズムは、まだ明らかにされていない。
【0010】
遺伝子ＯＲＦＶ００７は、長さが約４８３ｂｐであり、デオキシウリジントリホスファターゼ（ｄｕＴＰａｓｅ）をコードする［１５］。当該タンパク質は、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオシド三リン酸）の合成における重要な酵素である。通常、正常な細胞におけるｄＮＴＰ濃度が厳密に調節されているので、ウイルスの複製に不利である。しかしながら、癌細胞では、比較的高い濃度のｄＮＴＰがあり、ウイルスの複製を促進することができる［１６］。ＯＲＦＶ００７遺伝子を欠失することにより、当該ウイルスは、正常な細胞における複製が妨害されるが、腫瘍細胞における増幅には影響が及ぼされず、ＯＲＦＶウイルスの、癌細胞における選択的複製の目的が達成される。
【0011】
遺伝子ＯＲＦＶ１１１は、仮想タンパク質（Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子であり、その作用メカニズムは、まだ明らかにされていない。
【0012】
ＣＢＰタンパク質をコードする遺伝子ＯＲＦＶ１１２（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ケモカイン結合タンパク質）は、長さが約８６４ｂｐであり、その機能が免疫細胞の抗ウイルスメカニズムを阻害することである［１４］。当該タンパク質は、構造及び機能において他のポックスウイルスのＣＢＰ－ＩＩタンパク質に類似し、ＤＣ細胞の炎症部位への移動を抑制することができるとともに、ＤＣ細胞がＴ細胞を活性化することを阻害することもできる。
【0013】
現在、公開され、かつ腫瘍溶解性ウイルスの研究に用いられるＯＲＦＶウイルス株は、ＮＺ－２、ＮＺ－７、Ｄ１７０１、ＮＡ１／１１等が挙げられる。従来技術において、ＯＲＦＶウイルスは、比較的膨大な外来性ＤＮＡ断片が挿されすることができるので、通常、それをベクターとして、ある種類の腫瘍特異性抗原又はウイルス抗原、サイトカイン等に挿入し、遺伝子組み換えウイルスを取得し、研究に供する。
【0014】
国際公開ＷＯ２０１２１２２６４９Ａ１には、特定の宿主範囲遺伝子（ＳＰＩ－１、Ｋ１Ｌ、Ｃ７Ｌ、Ｂ５Ｒ、ｐ２８／Ｎ１Ｒ、Ｅ３Ｌ等）を含有する腫瘍細胞を感染して、癌薬物の創製に用いる組み換えＯＦＲＶウイルス（ワクシニアウイルスＥ３Ｌ遺伝子を挿入した）が開示されている。中国特許公開ＣＮ１０８２２０２５１Ａには、組み換え伝染性膿疱性腫瘍溶解性ウイルス及びその製造方法ならびに使用が開示されており、主にＮＡ１／１１ウイルス株のＯＲＦＶ１３２（ＶＥＧＦ）遺伝子をノックアウトした後、同一位置にＰ５３－ＥＧＦＰ融合タンパク質遺伝子を挿入し、癌薬物の創製に用いることである。上記の２つの特許文献に記載されているウイルス株は、いずれもＯＲＦＶ１１２遺伝子の欠失が報告されておらず、ＯＲＦＶ００７遺伝子の欠失も報告されていない。
【0015】
本明細書は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の機能性発現産物を欠失することを特徴とする突然変異型オルフウイルスを提供し、機能性発現産物の欠失は、ＣＢＰをコードする遺伝子ＯＲＦＶ１１２、及び／又は仮想タンパク質１１１をコードする遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全欠失又は一部欠失により引き起こされる。本発明者は、驚くべきことに、前記ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子の完全欠失又は一部欠失がウイルスの抗腫瘍効果に対して明らかな強化作用を有することを見出した。さらに、前記突然変異型オルフウイルスのゲノム配列を、他の開示されている全てのＯＲＦＶウイルス株のゲノム配列と比較したところ、前記突然変異型オルフウイルスはＯＲＦＶ００７ ｄＵＴＰａｓｅ遺伝子を完全欠失していることを見出した。さらに、上記比較により、前記オルフウイルスもＯＲＦＶ００２及びＯＲＦＶ００５遺伝子を完全欠失していることも実証されている。
【0016】
従って、本公開の突然変異型オルフウイルスは、このようなウイルスの抗腫瘍薬物の創製への使用に対して有益な指導的役割を有する。
【発明の概要】
【0017】
発明者は、驚くべきことに、遺伝子ＯＲＦＶ１１２（ＣＢＰタンパク質をコードする）及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１（仮想タンパク質をコードし、以下、仮想タンパク質１１１と称する）の完全欠失又は一部欠失（特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の５’部分の欠失、及び遺伝子ＯＲＦＶ１１１の３’部分の欠失）は、オルフウイルスの抗腫瘍活性を強化できることを見い出した。さらに、発明者は、また、驚くべきことに、前記突然変異型オルフウイルスが遺伝子ＯＲＦＶ００７を完全欠失していることを見い出した。機能性ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１を欠失するオルフウイルスは、通常の分子生物学的手法（例えば、分子クローニング、ＤＮＡ組み換え、相同組み換え、ＰＣＲ、制限ヌクレアーゼ、遺伝子ノックアウト、サイレンシング等）又は新興の分子生物学的手法（例えば、遺伝子編集等）により得られる。
【0018】
１つの態様において、本発明は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の機能性発現産物を欠失することを特徴とする突然変異型オルフウイルスを提供する。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の機能性発現産物の欠失は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の全部又は一部（例えば、５’部分又は３’部分、特に、５’部分）欠失により引き起こされる。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の発現産物の成熟配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の完全配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される通りである。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を完全欠失する。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を一部欠失し、例えば１～１１６１個、１～１１４０個、１～５３８個、５３９～１１３９個又は１１４１～１１６０個の５’端塩基を欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ
１１１の機能性発現産物の欠失は、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の全部又は一部（例えば、５’部分又は３’部分、特に３’部分）欠失により引き起こされる。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の発現産物の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される通りである。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全欠失する。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を一部欠失し、例えば１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の３’端塩基を欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示される通りである。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５９を完全欠失する。１つの実施形態において、発現産物は、タンパク質及び／又は核酸（特に、機能性核酸）である。１つの実施形態において、本発明は、前記ウイルスのゲノムを提供する。
１１１の機能性発現産物の欠失は、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の全部又は一部（例えば、５’部分又は３’部分、特に３’部分）欠失により引き起こされる。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の発現産物の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される通りである。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全欠失する。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を一部欠失し、例えば１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の３’端塩基を欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示される通りである。１つの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５９を完全欠失する。１つの実施形態において、発現産物は、タンパク質及び／又は核酸（特に、機能性核酸）である。１つの実施形態において、本発明は、前記ウイルスのゲノムを提供する。
【0019】
１つの態様において、本発明は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の発現産物の発現及び／又は活性を低下又は除去することを含むオルフウイルスの操作方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２を完全又は一部（例えば、５’部分又は３’部分、特に、５’部分）削除することを含む。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の発現産物の成熟配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の完全配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される通りである。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を一部削除することを含み、例えば１～１１６１個、１～１１４０個、１～５３８個、５３９～１１３９個又は１１４１～１１６０個の５’端塩基を削除する。１つの実施形態において、当該方法により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で示される一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１２を発生させる。１つの実施形態において、当該方法は、遺伝子ＯＲＦＶ１１１を完全又は一部（例えば、５’部分又は３’部分、特に３’部分）削除することを含む。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の発現産物の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示される通りである。１つの実施形態において、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される通りである。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５９を一部削除すること、例えば１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の３’端塩基を削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示される一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１１を発生させる。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、発現は、転写及び／又は翻訳である。１つの態様において、本発明は、前記方法により得られたウイルスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、前記ウイルスのゲノムを提供する。本発明の方法は、一般的な分子生物学的技術（例えば、分子クローニング、ＤＮＡ組み換え、相同組み換え、ＰＣＲ、制限ヌクレアーゼ、遺伝子ノックアウト、サイレンシング等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、遺伝子編集等）により行われてもよい。
ＩＤ ＮＯ：５９を一部削除すること、例えば１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の３’端塩基を削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示される一部欠失型遺伝子ＯＲＦＶ１１１を発生させる。１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、発現は、転写及び／又は翻訳である。１つの態様において、本発明は、前記方法により得られたウイルスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、前記ウイルスのゲノムを提供する。本発明の方法は、一般的な分子生物学的技術（例えば、分子クローニング、ＤＮＡ組み換え、相同組み換え、ＰＣＲ、制限ヌクレアーゼ、遺伝子ノックアウト、サイレンシング等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、遺伝子編集等）により行われてもよい。
【0020】
もう１つの態様において、本発明は、前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムを同定する方法、特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１（の存在又は配列）及び／又はその発現産物（の存在及び／又は活性）を検出する方法を提供する。本発明の方法は、タンパク質の存在及び／又は活性、及び／又は核酸の存在、及び／又は配列を検出する一般的な分子生物学的技術（例えば、活性測定法、ハイブリダイゼーション（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、Ｎｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、又はＷｅｓｔｅｒｎハイブリダイゼーション）、制限エンドヌクレアーゼ、ＰＣＲ、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動であり、タンパク質電気泳動及び核酸電
気泳動を含み、アガロース電気泳動及びＰＡＧＥ電気泳動を含み、還元電気泳動及び非還元電気泳動を含む）、配列決定（タンパク質配列決定及び核酸配列決定を含む）等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、次世代配列決定等）により行われてもよい。本発明は、特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全性を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、ＰＣＲ及びゲル電気泳動により行われる。１つの実施形態において、当該方法は、ハイブリダイゼーション又は配列決定により行われてもよい。
気泳動を含み、アガロース電気泳動及びＰＡＧＥ電気泳動を含み、還元電気泳動及び非還元電気泳動を含む）、配列決定（タンパク質配列決定及び核酸配列決定を含む）等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、次世代配列決定等）により行われてもよい。本発明は、特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１の完全性を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、ＰＣＲ及びゲル電気泳動により行われる。１つの実施形態において、当該方法は、ハイブリダイゼーション又は配列決定により行われてもよい。
【0021】
もう１つの態様において、本発明は、前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムを使用して被験者に対して癌を治療する方法を提供する。もう１つの態様において、本公開は、前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムの、被験者に対する癌治療への使用を提供する。もう１つの態様において、本公開は、前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムの、被験者に対する癌治療のための薬物の製造への使用を提供する。もう１つの態様において、本公開は、被験者に対する癌治療のための前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムを提供する。もう１つの態様において、本公開は、前記突然変異型オルフウイルス及び／又はそのゲノムの、被験者に対する癌治療のための薬物の製造への使用を提供する。１つの実施形態において、前記癌が固形腫瘍である。１つの実施形態において、前記固形腫瘍が子宮頸癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、頭頚部癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫、脳腫瘍等である。１つの実施形態において、前記被験者が哺乳類であり、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図１は、ＯＲＦＶ１１２遺伝子特異的フォワードプライマー及びリバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６）を使用してＰＣＲ増幅を行った後、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を示す。図中、番号１のサンプルはＯＲＦＶ１１２遺伝子を欠失するウイルス株ＰＯＶ－６０１－１Ａ１であり、番号２のサンプルはＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８であり、ＭがＤＮＡサイズｍａｒｋｅｒである。
【図3】図３は、ＯＲＦＶ１１２遺伝子を欠失するウイルス株ＰＯＶ－６０１－１Ａ１とＰＯＶ－６０４－１Ｄ１、及びＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８の、Ｂ１６－Ｆ１０マウス由来メラノーマ腫瘍モデルにおける腫瘍抑制効果を示す。
【図5】図５は、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株を投与した後、ヒトＣ－３３Ａ子宮頸癌両側腫瘍播種モデルにおけるマウス免疫系の変化状況を示す。図５Ａ及び図５Ｂにおいて、正方形は、右側に腫瘍内投与を行った結果を示し、円は、左側に投与を行わなかった結果を示す。腫瘍内投与により、腫瘍内のＣＤ４５＋及びＮＫ細胞の活性化割合が向上した。図５Ｃは、血液中のＮＫ細胞の活性化状況を示し、静脈内投与により、ＮＫ細胞の活性化割合が向上した。
【図7】図７は、本発明のＣＢＰタンパク質の完全配列と他のパラポックスウイルス株のＣＢＰタンパク質の完全配列との比較を示す。図中、「３Ｆ８」はＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ Ｓｔｒａｉｎを表し、「Ｂ０２９」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ Ｂ０２９を表し、「ＧＯ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＧＯを表し、「ＮＡ１１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１／１１を表し、「ＮＺ２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＺ２を表し、「ＮＡ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１７を表し、「ＯＶ－ＳＡ００」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＳＡ００を表し、「ＯＶ－ＩＡ８２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＩＡ８２を表し、「ＳＪ１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＪ１を表し、「ＳＹ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＹ１７を表し、「ＯＶ－ＮＨ３＿１２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＨＮ３／１２を表し、「ＮＰ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＰを表し、「ＹＸ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＹＸを表す。
【図8-1】図８は、本発明のＯＲＦＶ１１２遺伝子の完全配列と他のパラポックスウイルス株ＯＲＦＶ１１２遺伝子の完全配列との比較を示す。図中、「３Ｆ８」はＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ Ｓｔｒａｉｎを表し、「Ｂ０２９」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ Ｂ０２９を表し、「ＧＯ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＧＯを表し、「ＮＡ１１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１／１１を表し、「ＮＺ２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＺ２を表し、「ＮＡ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１７を表し、「ＯＶ－ＳＡ００」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＳＡ００を表し、「ＯＶ－ＩＡ８２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＩＡ８２を表し、「ＳＪ１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＪ１を表し、「ＳＹ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＹ１７を表し、「ＯＶ－ＮＨ３＿１２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＨＮ３／１２を表し、「ＮＰ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＰを表し、「ＹＸ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＹＸを表す。
【図10】図１０は、本発明の仮想タンパク質１１１の完全配列と他のパラポックスウイルス株の仮想タンパク質１１１の完全配列の比較を示す。図中、「ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８」はＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ Ｓｔｒａｉｎを表し、「Ｂ０２９」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ Ｂ０２９を表し、「ＧＯ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＧＯを表し、「ＮＡ１１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１／１１を表し、「ＮＺ２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＺ２を表し、「ＮＡ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１７を表し、「ＯＶ－ＳＡ００」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＳＡ００を表し、「ＯＶ－ＩＡ８２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＩＡ８２を表し、「ＳＪ１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＪ１を表し、「ＳＹ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＹ１７を表し、「ＯＶ－ＮＨ３＿１２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＨＮ３／１２を表し、「ＮＰ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＰを表し、「ＹＸ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＹＸを表す。
【図11-1】図１１は、本発明のＯＲＦＶ１１１遺伝子の完全配列と他のパラポックスウイルス株ＯＲＦＶ１１１遺伝子の完全配列の比較を示す。図中、「ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８」はＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ Ｓｔｒａｉｎを表し、「Ｂ０２９」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ Ｂ０２９を表し、「ＧＯ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＧＯを表し、「ＮＡ１１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１／１１を表し、「ＮＺ２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＺ２を表し、「ＮＡ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１７を表し、「ＯＶ－ＳＡ００」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＳＡ００を表し、「ＯＶ－ＩＡ８２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＩＡ８２を表し、「ＳＪ１」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＪ１を表し、「ＳＹ１７」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＳＹ１７を表し、「ＯＶ－ＮＨ３＿１２」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＯＶ－ＨＮ３／１２を表し、「ＮＰ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＮＰを表し、「ＹＸ」はＯＲＦＶ Ｓｔｒａｉｎ ＹＸを表す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は、突然変異型オルフウイルス（ＯＲＦＶ）及びその医薬組成物の、癌治療への使用を提供する。
【0024】
文献の報告によれば、野生型オルフウイルスの毒性遺伝子は、主にＯＶＩＦＮＲ（ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ，インターフェロン阻害タンパク質）、ＣＢＰ（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ケモカイン結合タンパク質）、ＧＩＦ（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－２阻害タンパク質）、ｖＩＬ－１０（ｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０，ウイルスインターロイキン１０）及びＶＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，血管内皮成長因子様タンパク質）等である［１１，１３］。通常、分子及び／又は細胞生物学的手法により、当該ウイルスのある毒性因子遺伝子を削除することにより、弱毒株を得ることができる。例えば、中国特許ＣＮ１０４８７８０４３Ｂには、オルフウイルス株ＳＨＺ１に毒性遺伝子ＯＶＩＦＮＲを欠失させることにより、その毒性の迅速な低下を実現することにより、弱毒株を取得する方法、及び弱毒ワクチンの製造への使用が開示されている。
【0025】
本発明に開示されている突然変異型オルフウイルスは、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）で受託（受託番号：Ｖ２０１７１３）されたオリジナルＰＯＶ－６０１ウイルス株を改変、スクリーニングして得られる。
【0026】
発明者は、文献［１７］に基づいて、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の特異的プライマーを設計した。フォワードプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）が番号ＯＲＦＶ１１１の遺伝子コーディング領域に設計されており、リバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）が番号ＯＲＦＶ１１２の遺伝子コーディング領域に設計されており、これにより、ＰＯＶ－６０１弱毒株ＯＲＦＶ１１２遺伝子の完全性を同定するために、ＰＣＲを基礎とした分子生物学的同定技術を構築した。その後、オリジナルＰＯＶ－６０１ウイルス株でアフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１を感染し、ウイルスで感染された細胞を収集し、フローサイトメトリーを用いて単一細胞スクリーニング及び培養増幅を行う。上記のＯＲＦＶ１１２遺伝子特異的プライマー対を用いて、増幅された、ウイルスで感染された細胞からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、構築された分子生物学的同定技術により、前記ＯＲＦＶ１１２遺伝子を一部欠失するＯＲＦＶウイルス弱毒株を得、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１と命名した。当該ウイルス株は、ＯＲＦＶ１１２遺伝子コーディング領域配列において５’端の３１２個の塩基を欠失し、５５２個の塩基が残り、３’端の非コーディング領域において７２個の塩基が残り、合計６２４個の塩基が残りＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。また、ＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８をも取得しており、そのコーディング領域及び非コーディング領域が合計１１６２個の塩基を有し、そのＯＲＦＶ１１２遺伝子の完全配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す。
【0027】
前記ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス弱毒株に対して動物腫瘍薬力学的モデル評価を行
ったところ、驚くべきことに、前記ウイルス株はＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８よりも優れる抗腫瘍効果を有することを見い出した。
ったところ、驚くべきことに、前記ウイルス株はＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８よりも優れる抗腫瘍効果を有することを見い出した。
【0028】
もう１つの態様において、本発明者は、前記ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株に対して、さらに人為的に遺伝子編集手段を使用し、ウイルス株の遺伝子ＯＲＦＶ１１２の残りのコーディング領域を全てノックアウトしてみた。実施例において、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の残りのコーディング領域が全てノックアウトされ（３’端の非コーディング領域の２２個の塩基のみを残し、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７参照）、ＤＮＡ配列決定で実証された。これにより得られたウイルス株をＰＯＶ－６０４－１Ｄ１と命名する。動物腫瘍薬力学的モデル評価を行う際に、驚くべきことに、当該弱毒株もＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全なウイルス株ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８よりも優れる抗腫瘍効果を有することを見い出した。さらに、ＣＢＰタンパク質を発現させない任意の方法（例えば、遺伝子ＯＲＦＶ１１２のコーディング領域及び非コーディング領域の幾つかの配列をノックアウト又は改変する）でも同様の効果を得ることができる。
【0029】
ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株は、２０２０年０５月１９日にブダペスト条約の規定に従い、中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）（武漢）に受託され、ＣＣＴＣＣ受託番号がＶ２０２０２９であった。
【0030】
実施例において、本公開の突然変異型オルフウイルスは、メラノーマ細胞（Ｂ１６－Ｆ１０）、膀胱癌細胞（ＭＢ４９）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐａ１－６）、結腸癌細胞（ＣＴ２６）、ヒト子宮頸癌細胞（Ｃ－３３Ａ）、ヒト卵巣癌細胞（ＳＫ－ＯＶ－３）等を選択的に感染し、その中で複製することができる。
【0031】
実施例において、本公開の突然変異型オルフウイルスは、驚くべきことに、遺伝子ＯＲＦＶ００７を完全欠失することが見出されたが、ＮＣＢＩで公布されている全てのオルフウイルスのウイルス株（例えば、ＮＺ－２、ＮＺ－７、Ｄ１７０１、ＮＡ１／１１株等）も遺伝子ＯＲＦＶ００７が完全である。ＯＲＦＶ００７遺伝子は、デオキシウリジントリホスファターゼ（ｄｕＴＰａｓｅ）をコードする。当該タンパク質は、ｄＮＴＰ合成における重要な酵素である。通常、正常な細胞におけるｄＮＴＰ濃度が厳密に調節されているので、ウイルスの複製に不利である。しかしながら、癌細胞では、比較的高い濃度のｄＮＴＰがあり、ウイルスの複製を促進することができる［１６］。ＯＲＦＶ００７遺伝子の欠失により、当該ウイルスの、正常細胞における複製が妨害されるが、腫瘍細胞中での増幅に影響が及ぼさず、ＯＲＦＶウイルスの癌細胞における選択的複製の目的を達成する。
【0032】
野生型ＯＲＦＶウイルスは、通常、ウシ、ヒツジ類動物組織初代細胞（ＣＮ１０３９５２３７７Ａ）中で培養することができ、国際公開ＷＯ２０１２１２２６４９Ａ１には、当該ウイルスはヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ中で増殖して拡大培養することができることが初めて開示されている。さらに、本発明は、哺乳類細胞系を宿主細胞として使用し、好ましくは、アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１を宿主細胞として使用して、ウイルスの感染、増幅に用いる、前記突然変異型オルフウイルスの製造方法を提供する。
【0033】
さらに、上述したウイルスの個体癌治療への使用を提供する。前記癌は、任意の固形腫瘍癌である。前記固形腫瘍癌の種類は、子宮頸癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、頭頚部癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫、脳腫瘍等を含む。また、さらに、前記個体が哺乳類動物であり、げっ歯類動物及び人類を含む。
【0034】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍成長を阻害するメカニズムは、通常、１）感染された腫瘍細胞内で複製、増幅し、癌細胞を溶解し、腫瘍溶解性の目的を達成すること、２）腫瘍溶解
した後、癌細胞に格納されている特異的情報（例えば、腫瘍ネオアンチゲン）を放出し、免疫系を活性化することにより、残存の癌細胞に対して全身攻撃を行う。
した後、癌細胞に格納されている特異的情報（例えば、腫瘍ネオアンチゲン）を放出し、免疫系を活性化することにより、残存の癌細胞に対して全身攻撃を行う。
【0035】
実施例において、本公開の突然変異型オルフウイルスは、ＮＫ細胞を代表とする自己免疫系を効果的に活性化することができる。両側に腫瘍を播種したヒトＣ－３３Ａ子宮頸癌細胞モデルにおいて、ウイルスを腫瘍内注射及び／又は静脈内注射することにより、腫瘍及び／又は血液内のＣＤ４５＋及びＮＫ細胞の活性化割合を増加させることができる。
【0036】
Ｉ．汎用技術
別途説明がない限り、本発明の実施は、分子生物学（組み換え技術を含む）、ウイルス学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を採用し、これらはいずれも本分野の技術範囲内にある。
別途説明がない限り、本発明の実施は、分子生物学（組み換え技術を含む）、ウイルス学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を採用し、これらはいずれも本分野の技術範囲内にある。
【0037】
ＩＩ．定義
●「ＯＶ」という用語は、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓであり、すなわち、腫瘍溶解性ウイルスの略称である。
●「ＯＶ」という用語は、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓであり、すなわち、腫瘍溶解性ウイルスの略称である。
【0038】
●「固形腫瘍」という用語は、血液学的腫瘍と区別するために使用されて複数の細胞から構成される腫瘍の実体を指し、子宮頸癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、頭頚部癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫、脳腫瘍等であってもよい。癌は、初期又は末期段階でありうる。
【0039】
●「連続細胞株」という用語について、初代培養物又は細胞系から得られた特別な遺伝的特性、生化学的特性又は特異的マーカを有する細胞集団を、細胞株（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）と称し、連続的に継代する細胞株を連続細胞株と称する。
【0040】
●「ＣＰＥ」という用語は、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）であり、すなわち、ウイルスで培養細胞を感染した後に発生する細胞変性である。インビトロ試験において、細胞殺傷性ウイルスを細胞培養及び播種し、一定時間経過後、顕微鏡で細胞が丸くなり、壊死し、フラスコ壁から剥がれるなどの現象が観察され、細胞変性効果と称される。
【0041】
●「オルフウイルス（ヒツジ伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス）」という用語は、ヒツジ口瘡ウイルス、口瘡ウイルス、ＯＲＦＶ、ｏｒｆ ｖｉｒｕｓ等とも称され、ヒツジ及びヤギの接触伝染性、上皮向性疾患を引き起こすポックス科のウイルスである。
【0042】
●「有効量」という用語は、必要な投与量及び時間で所望の治療又は予防効果を実現する量を指す。治療有効量は、さらに治療上の有益な効果が任意の毒性又は有害な結果を上回る治療剤の量を指す。
【0043】
●「ＰＢＳ」という用語は、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ、すなわち、リン酸塩緩衝液の略称である。
【0044】
●「ＭＯＩ」という用語は、感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）であり、ウイルスが細胞を感染する過程において、ウイルス粒子の数と標的細胞の総細胞数との比率（ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）を指す。
【0045】
●「ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株」という用語において、「ＰＯＶ」は、「Ｐｒａｊｎａ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ」の略称であり、当該ウイルス株が蘇州般若生物科技有限公司から得られたことを意味し、蘇州般若生物科技有限公司の内部試験記録
では、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１、ｖ６０１－１Ａ１、ｖ６０１－ｐ０－１Ａ１及び１Ａ１は、いずれも同一ウイルス株を表す。当該ウイルス株のＣＣＴＣＣ受託登録表中での名称が「オルフウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１」であり、ポックスウイルス科のパラポックスウイルス属におけるオルフウイルスに属する。
では、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１、ｖ６０１－１Ａ１、ｖ６０１－ｐ０－１Ａ１及び１Ａ１は、いずれも同一ウイルス株を表す。当該ウイルス株のＣＣＴＣＣ受託登録表中での名称が「オルフウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１」であり、ポックスウイルス科のパラポックスウイルス属におけるオルフウイルスに属する。
【0046】
●「ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ウイルス株」という用語において、「ＰＯＶ」は、「Ｐｒａｊｎａ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ」を表し、当該ウイルス株が蘇州般若生物科技有限公司から得られたことを表し、蘇州般若生物科技有限公司の内部試験記録では、ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８、ｖ６０１－３Ｆ８、ｖ６０１－ｐ０－３Ｆ８及び３Ｆ８はいずれも同一ウイルス株を表す。
【0047】
●「ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１ウイルス株」という用語において、「ＰＯＶ」は、「Ｐｒａｊｎａ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ」を表し、当該ウイルス株が蘇州般若生物科技有限公司から得られたことを表し、蘇州般若生物科技有限公司の内部試験記録では、ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１、ｖ６０４－１Ｄ１及び１Ｄ１はいずれも同一ウイルス株を表す。
【0048】
●「ウイルス保管緩衝液」という用語について、その調製方法は以下の通りである。５００ｍＬのＰＢＳ（すなわち、リン酸塩緩衝液、ＣＯＲＮＩＮＧ、品番：２１－０４０－ＣＶＲ）を吸い取り、１．２５ｍＬの１ＭｍｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（生工生物工程（上海）股▲分▼有限公司、品番：Ａ６１０３２８－０５００）を添加し、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの最終濃度を２．４８ｍＭにし、次いで、２．５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（生工生物工程（上海）股▲分▼有限公司、品番：Ｂ５４８１２８－０５００）を添加し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの最終濃度を４．９６ｍＭにし、均一に混合し、ウイルス保管緩衝液（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの理論最終濃度が２．５ｍＭであり、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの理論最終濃度が５ｍＭである）を得る。
【0049】
ＩＩＩ．組成物及び方法
１．ＯＲＦＶ１１２遺伝子の発現産物、ＣＢＰタンパク質
本発明は、（天然型）ＣＢＰタンパク質に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性の成熟配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。もう１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－４２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列、及び相応する成熟配列を含む（又は有する）。
１．ＯＲＦＶ１１２遺伝子の発現産物、ＣＢＰタンパク質
本発明は、（天然型）ＣＢＰタンパク質に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性の成熟配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。もう１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－４２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列、及び相応する成熟配列を含む（又は有する）。
【0050】
本発明は、さらに、突然変異型ＣＢＰタンパク質に関する。１つの実施形態において、突然変異は、天然型配列に対して１個又は複数個のアミノ酸残基の添加、削除もしくは置き換え、又はそれらの任意の組み合わせである。１つの実施形態において、突然変異型ＣＢＰタンパク質の機能が低下又は欠失する。
【0051】
本発明は、さらに、ＣＢＰタンパク質（例えば、天然型ＣＢＰタンパク質又は突然変異型ＣＢＰタンパク質）の発現の低下又は欠失に関する。
【0052】
例えば、低下とは、天然型の機能及び／又は発現と比べて少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下し、１００％となるまで低下することをいう。
【0053】
２．ＯＲＦＶ１１２遺伝子
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列を含む（又は有する）か、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する成熟配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成されるＣＢＰタンパク質をコードする。もう１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３１～４２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列、及び相応する成熟配列を含む（又は有する）。
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列を含む（又は有する）か、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する成熟配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成されるＣＢＰタンパク質をコードする。もう１つの実施形態において、（天然型）ＣＢＰタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３１～４２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する完全配列、及び相応する成熟配列を含む（又は有する）。
【0054】
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子に関し、１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示され（又はそのコーディング領域）、それと同じアミノ酸配列をコードするか又はそれ同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の全長が１１６２個の塩基であり、中でも、第１～２２６位の塩基が５’非コーディング領域であり、第２２７～１０９０位の塩基がタンパク質コーディング領域であり、第１０９１～１１６２位の塩基が３’非コーディング領域である。もう１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３－５４で示され（又はそのコーディング領域）、それと同じアミノ酸配列をコードするか又はそれ同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む（又は有する）。
【0055】
本発明は、さらに突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子に関する。１つの実施形態において、突然変異体は、天然型配列に対して１個又は複数個の塩基の添加、削除もしくは置き換え、又はそれらの任意の組み合わせである。１つの実施形態において、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、完全欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子である。完全欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＯＲＦＶ１１２遺伝子を全部欠失する。１つの実施形態において、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、一部欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子である。一部欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の１個又は複数個の塩基（全ての塩基ではない）を欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、５’非翻訳領域、コーディング領域及び／又は３’非翻訳領域の１個又は複数個の塩基、又はそれらの任意の組み合わせを欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、５’端欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子であり、すなわち、５’端の１個又は複数個の塩基を欠失し、例えば５’非翻訳領域の全部又は一部を欠失するか、５’非翻訳領域の全部とコーディング領域の全部又は一部を欠失するか、あるいは、５’非翻訳領域の全部、コーディング領域の全部及び３’非翻訳領域の全部又は一部を欠失する。１つの実施形
態において、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の欠失は、上流側（ＯＲＦＶ１１１／１１２遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子、特に３’端）及び／又は下流側（ＯＲＦＶ１１２／１１３遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１３遺伝子、特に、５’端）に伸張する。
態において、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の欠失は、上流側（ＯＲＦＶ１１１／１１２遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子、特に３’端）及び／又は下流側（ＯＲＦＶ１１２／１１３遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１３遺伝子、特に、５’端）に伸張する。
【0056】
天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～１１６１個の塩基を欠失する。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、５’端欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の５’端の１個又は複数個の塩基、特に、５’端の１～１１６１個、１～１１４０個、１～５３８個、５３９～１１３９個又は１１４１～１１６０個の塩基を欠失する。１つの実施形態において、５’端欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４３－５４で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、５’端欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３－５４で示される配列の５’端の１個又は複数個の塩基、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の５’端の１１４０個又は５３８個の塩基に対応するセグメントの１個又は複数個の塩基を欠失する。５’非翻訳領域及び／又は開始コドンを欠失するので、これらの欠失型遺伝子は、タンパク質を発現できない。
ＩＤ ＮＯ：４３－５４で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、５’端欠失型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３－５４で示される配列の５’端の１個又は複数個の塩基、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の５’端の１１４０個又は５３８個の塩基に対応するセグメントの１個又は複数個の塩基を欠失する。５’非翻訳領域及び／又は開始コドンを欠失するので、これらの欠失型遺伝子は、タンパク質を発現できない。
【0057】
１つの実施形態において、本発明の突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、機能性ＣＢＰタンパク質の低下又は欠失（ＣＢＰタンパク質の発現及び／又は活性の低下又は欠失を含む）を引き起こす。例えば、低下とは、天然型の機能及び／又は発現と比べて少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下し、１００％となるまで低下することをいう。
【0058】
３．ＯＲＦＶ１１１遺伝子の発現産物、仮想タンパク質１１１
本発明は、（天然型）仮想タンパク質１１１に関する。１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。もう１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－７２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）。
本発明は、（天然型）仮想タンパク質１１１に関する。１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。もう１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－７２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）。
【0059】
本発明は、さらに突然変異型仮想タンパク質１１１に関する。１つの実施形態において、突然変異は、天然型配列に対して１個又は複数個のアミノ酸残基の添加、削除もしくは置き換え、又はそれらの任意の組み合わせである。１つの実施形態において、突然変異型仮想タンパク質１１１の機能が低下又は欠失する。
【0060】
本発明は、さらに仮想タンパク質１１１（例えば、天然型仮想タンパク質１１１又は突然変異型仮想タンパク質１１１）の発現の低下又は欠失に関する。
【0061】
例えば、低下とは、天然型の機能及び／又は発現と比べて、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下し、１００％となるまで低下することをいう。
【0062】
４．ＯＲＦＶ１１１遺伝子
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される仮想タンパク質１１１をコードする。もう１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－７２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）。
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子に関する。１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される仮想タンパク質１１１をコードする。もう１つの実施形態において、（天然型）仮想タンパク質１１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－７２で示されるもの又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む（又は有する）。
【0063】
本発明は、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子に関し、１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示され（又はそのコーディング領域）、それと同じアミノ酸配列をコードするか、又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の全長は７９４個の塩基であり、中でも、第１～２８位の塩基が５’非コーディング領域であり、第２９～５６８位の塩基がタンパク質コーディング領域であり、第５６９～７９４位の塩基が３’非コーディング領域である。もう１つの実施形態において、（天然型）ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３－８４で示され（又はそのコーディング領域）、それと同じアミノ酸配列をコードするか、又はそれと同じもしくは近似する生物学的ソース（例えば、株、種、属、科）に由来してそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む（又は有する）。
【0064】
本発明は、さらに突然変異型ＯＲＦＶ１１１遺伝子に関する。１つの実施形態において、突然変異体は、天然型配列に対して１個又は複数個の塩基の添加、削除もしくは置き換え、又はそれらの任意の組み合わせである。１つの実施形態において、突然変異型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、完全欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子である。完全欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＯＲＦＶ１１１遺伝子を全部欠失する。１つの実施形態において、突然変異型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、一部欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子である。一部欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＯＲＦＶ１１１遺伝子の１個又は複数個の塩基（全ての塩基ではない）を欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、３’非翻訳領域、コーディング領域及び／又は５’非翻訳領域の１個又は複数個の塩基、あるいはそれらの任意の組み合わせを欠失する。１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、３’端欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子であり、すなわち、３’端の１個又は複数個の塩基を欠失し、例えば３’非翻訳領域の全部又は一部を欠失するか、３’非翻訳領域の全部とコーディング領域の全部又は一部を欠失するか、あるいは３’非翻訳領域の全部、コーディング領域の全部および５’非翻訳領域の全部又は一部を欠失する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失が下流側（ＯＲＦＶ１１１／１１２遺伝子間
領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１２遺伝子、特に、５’端）及び／又は上流側（ＯＲＦＶ１１０／１１１遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１０遺伝子、特に３’端）に伸張する。
領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１２遺伝子、特に、５’端）及び／又は上流側（ＯＲＦＶ１１０／１１１遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、及び／又はＯＲＦＶ１１０遺伝子、特に３’端）に伸張する。
【0065】
天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、一部欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～７９３個の塩基を欠失する。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、３’端欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の３’端の１個又は複数個の塩基、特に３’端の１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の塩基を欠失する。１つの実施形態において、３’端欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３－８４で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、３’端欠失型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３－８４で示される配列の３’端の１個又は複数個の塩基、特に、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５９の３’端の３０９個の塩基に対応するセグメントの１個又は複数個の塩基を欠失する。３’非翻訳領域を欠失するので、これらの欠失型遺伝子はタンパク質を発現できない可能性がある。
ＩＤ ＮＯ：５９の３’端の３０９個の塩基に対応するセグメントの１個又は複数個の塩基を欠失する。３’非翻訳領域を欠失するので、これらの欠失型遺伝子はタンパク質を発現できない可能性がある。
【0066】
１つの実施形態において、本発明の突然変異型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、機能性仮想タンパク質１１１の低下又は欠失（仮想タンパク質１１１の発現及び／又は活性の低下又は欠失を含む）を引き起こす。例えば、低下とは、天然型の機能及び／又は発現と比べて、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％低下し、１００％となるまで低下することをいう。
【0067】
５．ＯＲＦＶウイルスゲノム
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノムに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスゲノムは、上述したＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子（天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子と、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を含む）を有する。本発明は、特にＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムは、上述した突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を含む。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）は、ＯＲＦＶ００７遺伝子を完全欠失する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’非コーディング領域がＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’非コーディング領域と重なる。
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノムに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスゲノムは、上述したＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子（天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子と、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を含む）を有する。本発明は、特にＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムは、上述した突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を含む。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）は、ＯＲＦＶ００７遺伝子を完全欠失する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’非コーディング領域がＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’非コーディング領域と重なる。
【0068】
６．ＯＲＦＶウイルス
本発明は、ＯＲＦＶウイルスに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスは、上述したＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１（天然型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１及び突然変異型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１を含む）を有する。本発明は、特にＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルスに関する。１つの実施形態において、ＣＢＰタンパク質
及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルスは、機能性ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の低下又は欠失を引き起こす。機能性ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の低下又は欠失は、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の発現及び／又は活性の低下又は欠失であってもよい。
本発明は、ＯＲＦＶウイルスに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスは、上述したＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１（天然型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１及び突然変異型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１を含む）を有する。本発明は、特にＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルスに関する。１つの実施形態において、ＣＢＰタンパク質
及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルスは、機能性ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の低下又は欠失を引き起こす。機能性ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の低下又は欠失は、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１の発現及び／又は活性の低下又は欠失であってもよい。
【0069】
本発明は、ＯＲＦＶウイルスに関する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスは、上述したＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子（天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子及び突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を含む）を有する。１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルスは、上述したＯＲＦＶウイルスゲノム（ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムを含む）を有する。本発明は、特に上述した突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子又は上述したＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノムを含む、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルスに関する。
【0070】
１つの実施形態において、ＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）欠失型遺伝子ＯＲＦＶ００７の機能性転写及び／又は翻訳産物は、発現及び／又は活性の欠失を含む。
【0071】
７．ＯＲＦＶウイルスの操作方法
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノム又はＯＲＦＶウイルスの操作方法に関する。１つの実施形態において、当該方法は、ＯＲＦＶウイルスゲノムにおけるＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を突然変異体させることを含む。１つの実施形態において、当該方法は、添加、削除もしくは置き換えを含み、特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子の１個又は複数個の塩基、特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’端の１個又は複数個の塩基及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’端の１個又は複数個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～１１６２個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の５’端の１個又は複数個の塩基、特に、５’端の１～１１６１個、１～１１４０個、１～５３８個、５３９～１１３９個又は１１４１～１１６０個の塩基、例えば５３８個又は１１４０個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を完全に削除すること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１１４０個又は５３８個の５’端塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、前記ヌクレオチド配列を完全に削除すること、又は前記ヌクレオチド配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１１４０個又は５３８個の５’端塩基に対応するセグメントを削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～７９４塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオ
チド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の３’端の１個又は複数個の塩基、特に３’端の１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の塩基、例えば３０９個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全に削除すること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の３０９個の３’端塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、前記ヌクレオチド配列を完全に削除すること、又は前記ヌクレオチド配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の３０９個の３’端塩基に対応するセグメントを削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子及び天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５９を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、さらにＯＲＦＶウイルスゲノム（特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）におけるＯＲＦＶ００７遺伝子を突然変異（例えば、削除（完全削除又は一部削除を含む））させることを含む。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’非コーディング領域がＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’非コーディング領域と重なる。本発明の方法は、一般的な分子生物学的技術（例えば、分子クローニング、ＤＮＡ組み換え、相同組み換え、ＰＣＲ、制限ヌクレアーゼ、遺伝子ノックアウト、サイレンシング等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、遺伝子編集等）により行うことができる。本発明は、前述した方法により得られたＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及びＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）に関する。
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノム又はＯＲＦＶウイルスの操作方法に関する。１つの実施形態において、当該方法は、ＯＲＦＶウイルスゲノムにおけるＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子を突然変異体させることを含む。１つの実施形態において、当該方法は、添加、削除もしくは置き換えを含み、特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子の１個又は複数個の塩基、特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’端の１個又は複数個の塩基及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’端の１個又は複数個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～１１６２個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列の５’端の１個又は複数個の塩基、特に、５’端の１～１１６１個、１～１１４０個、１～５３８個、５３９～１１３９個又は１１４１～１１６０個の塩基、例えば５３８個又は１１４０個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を完全に削除すること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１１４０個又は５３８個の５’端塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、前記ヌクレオチド配列を完全に削除すること、又は前記ヌクレオチド配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１１４０個又は５３８個の５’端塩基に対応するセグメントを削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の１個又は複数個の塩基、例えば１～７９４塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオ
チド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示される配列の３’端の１個又は複数個の塩基、特に３’端の１～７９３個、１～３０９個又は３１０～７９２個の塩基、例えば３０９個の塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９を完全に削除すること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の３０９個の３’端塩基を削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、前記ヌクレオチド配列を完全に削除すること、又は前記ヌクレオチド配列のうちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の３０９個の３’端塩基に対応するセグメントを削除することを含む。天然型ＯＲＦＶ１１１遺伝子及び天然型ＯＲＦＶ１１２遺伝子は、他のヌクレオチド配列（又はそのコーディング領域）を含む（又は有する）か、あるいは（実質的に）それにより構成される場合において、１つの実施形態において、当該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５９を完全に削除することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、さらにＯＲＦＶウイルスゲノム（特に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）におけるＯＲＦＶ００７遺伝子を突然変異（例えば、削除（完全削除又は一部削除を含む））させることを含む。１つの実施形態において、ＯＲＦＶ１１１遺伝子の３’非コーディング領域がＯＲＦＶ１１２遺伝子の５’非コーディング領域と重なる。本発明の方法は、一般的な分子生物学的技術（例えば、分子クローニング、ＤＮＡ組み換え、相同組み換え、ＰＣＲ、制限ヌクレアーゼ、遺伝子ノックアウト、サイレンシング等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、遺伝子編集等）により行うことができる。本発明は、前述した方法により得られたＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及びＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）に関する。
【0072】
８．ＯＲＦＶウイルスゲノム及びＯＲＦＶウイルスを同定する方法
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノム又はＯＲＦＶウイルスを同定する方法、特に、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１（特に、突然変異型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１）（の存在又は活性）及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子（特に、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子）（の存在又は配列）を検出する方法に関する。本発明の方法は、タンパク質の存在及び／又は活性、及び／又は核酸の存在、及び／又は配列を検出する一般的な分子生物学的技術（例えば、活性測定法、ハイブリダイゼーション（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、Ｎｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、又はＷｅｓｔｅｒｎハイブリダイゼーション）、制限ヌクレアーゼ、ＰＣＲ、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動（タンパク質電気泳動及び核酸電気泳動を含み、アガロース電気泳動及びＰＡＧＥ電気泳動を含み、還元電気泳動及び非還元電気泳動を含む）、配列決定（タンパク質配列決定及び核酸配列決定を含む）等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、次世代配列決定等）により行われる。本発明は、特に遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又はＯＲＦＶ１１１完全性（又は長さ）を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、ＰＣＲ及びゲル電気泳動により行われる。１つの実施形態において、当該方法は、核酸ハイブリダイゼーション又は配列決定により行われてもよい。
本発明は、ＯＲＦＶウイルスゲノム又はＯＲＦＶウイルスを同定する方法、特に、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１（特に、突然変異型ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１）（の存在又は活性）及び／又は遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子（特に、突然変異型ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子）（の存在又は配列）を検出する方法に関する。本発明の方法は、タンパク質の存在及び／又は活性、及び／又は核酸の存在、及び／又は配列を検出する一般的な分子生物学的技術（例えば、活性測定法、ハイブリダイゼーション（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、Ｎｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、又はＷｅｓｔｅｒｎハイブリダイゼーション）、制限ヌクレアーゼ、ＰＣＲ、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動（タンパク質電気泳動及び核酸電気泳動を含み、アガロース電気泳動及びＰＡＧＥ電気泳動を含み、還元電気泳動及び非還元電気泳動を含む）、配列決定（タンパク質配列決定及び核酸配列決定を含む）等）又は新興の分子生物学的技術（例えば、次世代配列決定等）により行われる。本発明は、特に遺伝子ＯＲＦＶ１１２及び／又はＯＲＦＶ１１１完全性（又は長さ）を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、ＰＣＲ及びゲル電気泳動により行われる。１つの実施形態において、当該方法は、核酸ハイブリダイゼーション又は配列決定により行われてもよい。
【0073】
プライマー及びプローブの設計は、当業者の能力範囲内である。当業者であれば、プライマー及びプローブの標的配列における標的領域をどのように選択するかがはっきりわかる。例えば、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の完全性を検出するために、１つの態様において、上
流側プライマーの標的領域は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の５’端に設けるか、あるいは上流側に伸張するように設けてもよいが、これらに限られず、例えばＯＲＦＶ１１１／１１２遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１（特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の３’端、例えば３’非翻訳領域）に入らせる。もう１つの態様において、下流側プライマーの標的領域は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の３’端に設けるか、あるいは下流側に伸張するように設けてもよく、例えばＯＲＦＶ１１２／１１３遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、又は遺伝子ＯＲＦＶ１１３（特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１３の５’端、例えば５’非翻訳領域）に入らせる。同様に、類似する原則に基づいてプライマー／プローブの標的を設計することができる。
流側プライマーの標的領域は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の５’端に設けるか、あるいは上流側に伸張するように設けてもよいが、これらに限られず、例えばＯＲＦＶ１１１／１１２遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、又は遺伝子ＯＲＦＶ１１１（特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１１の３’端、例えば３’非翻訳領域）に入らせる。もう１つの態様において、下流側プライマーの標的領域は、遺伝子ＯＲＦＶ１１２の３’端に設けるか、あるいは下流側に伸張するように設けてもよく、例えばＯＲＦＶ１１２／１１３遺伝子間領域に入り、もし存在すれば、又は遺伝子ＯＲＦＶ１１３（特に、遺伝子ＯＲＦＶ１１３の５’端、例えば５’非翻訳領域）に入らせる。同様に、類似する原則に基づいてプライマー／プローブの標的を設計することができる。
【0074】
９．ＯＲＦＶウイルスゲノム及びＯＲＦＶウイルスの用途
本発明は、一定量、特に、有効量、例えば治療有効量又は予防有効量の本発明のＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及び／又はＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）を含む薬物組成物を提供する。１つの実施形態において、前記組成物は、薬学的に許容されるベクターを含む。
本発明は、一定量、特に、有効量、例えば治療有効量又は予防有効量の本発明のＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及び／又はＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）を含む薬物組成物を提供する。１つの実施形態において、前記組成物は、薬学的に許容されるベクターを含む。
【0075】
１つの実施形態において、前記組成物は、粉剤、液剤、経皮パッチ、軟膏、又は座薬の形式である。１つの実施形態において、前記組成物は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内又は腹腔内経路により投与される。
【0076】
本発明は、被験者に対して疾患を治療するか、又は疾患の発展を遅延させる方法に関し、当該方法は、一定量、特に、有効量、例えば治療有効量又は予防有効量の本発明のＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及び／又はＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）を投与することを含む。
【0077】
本発明は、一定量、特に、有効量、例えば治療有効量又は予防有効量の本発明のＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及び／又はＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）の、薬物の製造への使用に関する。１つの実施形態において、前記薬物は、被験者に対して疾患を治療すること又は疾患の発展を遅延させるために用いられる。
【0078】
本発明は、被験者に対して疾患を治療すること又は疾患の発展を遅延させるために用いられる、一定量、特に、有効量、例えば治療有効量又は予防有効量の本発明のＯＲＦＶウイルスゲノム（例えば、ＯＲＦＶ１１２遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１１遺伝子欠失型ＯＲＦＶウイルスゲノム）及び／又はＯＲＦＶウイルス（例えば、ＣＢＰタンパク質及び／又は仮想タンパク質１１１欠失型ＯＲＦＶウイルス）に関する。
【0079】
１つの実施形態において、前記疾患が癌である。１つの実施形態において、前記癌が固形腫瘍である。１つの実施形態において、前記固形腫瘍が子宮頸癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、頭頚部癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、膵臓癌、肉腫、脳腫瘍等である。
【0080】
１つの実施形態において、前記被験者が哺乳類であり、げっ歯動物（例えば、マウス及びラット）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びヒトを含む。
【0081】
実施例
実施例１：突然変異型オルフウイルススクリーニング精製方法
●ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１ウイルス株（中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）、受託番号：Ｖ２０１７１３）
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫／中国科学院上海生命科学研究院）
実施例１：突然変異型オルフウイルススクリーニング精製方法
●ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１ウイルス株（中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）、受託番号：Ｖ２０１７１３）
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫／中国科学院上海生命科学研究院）
【0082】
●フローサイトメトリー及びモノクローン性スクリーニング方法
１）ＰＯＶ－６０１ウイルス株でアフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１を感染した後、ウイルスで感染された細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ）でスクリーニングし、スクリーニングされた細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェル当たり１個の細胞を接種した。
１）ＰＯＶ－６０１ウイルス株でアフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１を感染した後、ウイルスで感染された細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ）でスクリーニングし、スクリーニングされた細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェル当たり１個の細胞を接種した。
【0083】
２）スクリーニングされた９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２濃度の二酸化炭素培養器（Ｔｈｅｒｍｏ，１６０ｉ）に移動して培養を行った。毎日、ウイルスの感染状況を観察した。
【0084】
３）ウイルスで感染された細胞において十分なＣＰＥが現れた場合、ウイルスを収集、凍結保存した。
【0085】
４）収集されたモノクローン性ウイルスに対して、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔTM ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｃａｔ＃：ＱＥ０９０５０，Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いてそれぞれウイルスゲノムＤＮＡを抽出した。
【0086】
５）設計したＯＲＦＶ１１２遺伝子特異的フォワード、リバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６）を用いて、モノクローン性ウイルスから抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ目的断片の増幅及びアガロースゲル電気泳動を行った。図１は、モノクローン性ウイルス株ＰＯＶ－６０１－１Ａ１及びＰＯＶ－６０１－３Ｆ８の電気泳動結果を示し、これらのバンドのサイズがそれぞれ約５００ｂｐ及び約１０００ｂｐである。また、ＯＲＦＶ１１２遺伝子特異的フォワード、リバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と６）及びＰＯＶ－６０１－３Ｆ８フォワード、リバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５と５６）をそれぞれ用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物に対してサンガー配列決定（Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（蘇州金維智生物科技有限公司）を行い、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ＯＲＦＶ１１２遺伝子コーディング領域が５’端の５３８個の塩基（５’端の非コーディング領域の２２６個の塩基及び５’端のＯＲＦＶ１１２タンパク質コーディング領域の３１２個の塩基を含む）を欠失したことが確認された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を参照）。また、ＰＯＶ－６０１－３Ｆ８は、完全なＯＲＦＶ１１２遺伝子配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を参照）。
【0087】
●ＰＣＲプログラムパラメータ：９４℃で５ｍｉｎ予備変性を行い、９４℃で３０ｓ変性を行い、６２℃で３０ｓアニーリングを行い、６８℃で１ｍｉｎ伸張を行う工程を３０回繰り返し、６８℃で７ｍｉｎ最終伸張を行った。
【0088】
実施例２：突然変異型オルフウイルスの種、属の確認
ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株に対してウイルスゲノム抽出を行い（Ｍｏｕｓｅ Ｔａｉｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ，Ｃａｔ＃：ＣＷ２０９４Ｓ）、第三者配列決定会社に送って次世代配列決定を行った（蘇州金維智生物科技有限公司）。配列決定結果に対して組み立てを行った。当該ウイルス株のＢ２Ｌ遺伝子［２１］（ＯＲＦＶ０１１遺伝子）の完全配列結果に対してＢＬＡＳＴ核酸配列で検索した後、配列決定結果との類似性が高いほうがＯＶ／ＨＬＪ／０４であり、類似性が９９．９１％であり、分離されたウイルス株がＯＲＦＶであることを確認した。
ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株に対してウイルスゲノム抽出を行い（Ｍｏｕｓｅ Ｔａｉｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ，Ｃａｔ＃：ＣＷ２０９４Ｓ）、第三者配列決定会社に送って次世代配列決定を行った（蘇州金維智生物科技有限公司）。配列決定結果に対して組み立てを行った。当該ウイルス株のＢ２Ｌ遺伝子［２１］（ＯＲＦＶ０１１遺伝子）の完全配列結果に対してＢＬＡＳＴ核酸配列で検索した後、配列決定結果との類似性が高いほうがＯＶ／ＨＬＪ／０４であり、類似性が９９．９１％であり、分離されたウイルス株がＯＲＦＶであることを確認した。
【0089】
【表1】
【0090】
実施例３：突然変異型オルフウイルスの構築
●ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株（中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）、受託番号：Ｖ２０２０２９）
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－７０TM）
●ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株（中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）、受託番号：Ｖ２０２０２９）
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－７０TM）
【0091】
●組み換えオルフウイルスの構築方法は、主に以下の工程を含む。
１）特別に設計され、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有するプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－１２）を採用し、ＰＣＲ方法によりＯＲＦＶ１１２遺伝子のフランキング配列（左相同性アーム及び右相同性アーム）及びＥＧＦＰレポーター遺伝子をクローニングする。
２）ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＵＣ１９プラスミドを酵素切断する。
３）工程１）におけるＰＣＲ産物と酵素切断後のｐＵＣ１９プラスミドとを連結し、ＣＢＰシャトルプラスミドを取得する。
４）工程３）で得られたＣＢＰシャトルプラスミド連結産物をテンプレートとして、ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有する特定のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－１４）を用いて、ＰＣＲ方法により増幅を行い、線形ＣＢＰシャトルベクターを取得する。
５）ｐｘ３３０プラスミドベクターをテンプレートとして、ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有する特定のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５－１８）を採用し、ＰＣＲ方法により、核局在化シグナル（ＮＬＳ）Ｃａｓ９を有さない新しいｐｘ３３０プラスミドベクター及びｐｘ３３０プラスミドベクター骨格（ｐｘ３３０ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を増幅させる。
６）ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩを用いて工程５）における新しいｐｘ３３０プラスミドベクター及びｐｘ３３０プラスミドベクター骨格（ｐｘ３３０ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を酵素切断し、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅで酵素切断産物を連結し、連結産物をスクリーニング宿主菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性モノクローナルを得、さらに拡大培養を行い、プラスミドを抽出する。Ｓａｎｇｅｒ配列決定の同定を行い、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有さない組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）を取得する。
７）ＣＢＰ ｇＲＮＡｓを合成し、ＢｂｓＩを用いて組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）を酵素切断し、ＣＢＰ ｇＲＮＡｓと、酵素切断した組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）とを連結し、宿主菌ＤＨ５α（上海生工、Ｂ５２８４１３－００２０）に形質転換して、陽性モノクローナルを得、さらに拡大培養を行い、プラスミドを抽出する。ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡ発現プラスミドを取得する。
８）得られたｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡ発現プラスミドで特定のパラポ
ックスウイルス宿主細胞ＣＶ－１をトランスフェクションし、その後、トランスフェクションされたＣＶ－１細胞をＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株で感染する。工程（４）で得られた線形ＣＢＰシャトルベクターを、トランスフェクションされたｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡプラスミドと、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルスを感染したＣＶ－１細胞とにトランスフェクションする。
９）ＥＧＦＰ蛍光ウイルスを含む標的細胞を濃縮培養して収集し、その後、フローサイトメトリーでスクリーニングして９６ウェルプレートに播種し、１ウェル当たり１個の細胞を播種し、培養、増幅を行う。ＥＧＦＰ蛍光ウイルスリッチのウェルから標的細胞を収集し、ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ方法を用いて同定を行い（プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９－３０）、標的バンドが現れたウイルスで再びＣＶ－１細胞を感染し、拡大培養を行う。
１０）ウイルス播種、スクリーニング、ウイルス収集、ＰＣＲ同定を複数回行い、最後に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全欠失する精製モノクローン性ウイルスを得、ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１と命名する。
１）特別に設計され、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有するプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－１２）を採用し、ＰＣＲ方法によりＯＲＦＶ１１２遺伝子のフランキング配列（左相同性アーム及び右相同性アーム）及びＥＧＦＰレポーター遺伝子をクローニングする。
２）ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＵＣ１９プラスミドを酵素切断する。
３）工程１）におけるＰＣＲ産物と酵素切断後のｐＵＣ１９プラスミドとを連結し、ＣＢＰシャトルプラスミドを取得する。
４）工程３）で得られたＣＢＰシャトルプラスミド連結産物をテンプレートとして、ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有する特定のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－１４）を用いて、ＰＣＲ方法により増幅を行い、線形ＣＢＰシャトルベクターを取得する。
５）ｐｘ３３０プラスミドベクターをテンプレートとして、ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をそれぞれ末端に有する特定のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５－１８）を採用し、ＰＣＲ方法により、核局在化シグナル（ＮＬＳ）Ｃａｓ９を有さない新しいｐｘ３３０プラスミドベクター及びｐｘ３３０プラスミドベクター骨格（ｐｘ３３０ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を増幅させる。
６）ＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩを用いて工程５）における新しいｐｘ３３０プラスミドベクター及びｐｘ３３０プラスミドベクター骨格（ｐｘ３３０ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を酵素切断し、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅで酵素切断産物を連結し、連結産物をスクリーニング宿主菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性モノクローナルを得、さらに拡大培養を行い、プラスミドを抽出する。Ｓａｎｇｅｒ配列決定の同定を行い、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有さない組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）を取得する。
７）ＣＢＰ ｇＲＮＡｓを合成し、ＢｂｓＩを用いて組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）を酵素切断し、ＣＢＰ ｇＲＮＡｓと、酵素切断した組み換えプラスミド（ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ）とを連結し、宿主菌ＤＨ５α（上海生工、Ｂ５２８４１３－００２０）に形質転換して、陽性モノクローナルを得、さらに拡大培養を行い、プラスミドを抽出する。ｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡ発現プラスミドを取得する。
８）得られたｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡ発現プラスミドで特定のパラポ
ックスウイルス宿主細胞ＣＶ－１をトランスフェクションし、その後、トランスフェクションされたＣＶ－１細胞をＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルス株で感染する。工程（４）で得られた線形ＣＢＰシャトルベクターを、トランスフェクションされたｐｘ３３０－ΔＮＬＳ－ＣＢＰ ｇＲＮＡプラスミドと、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルスを感染したＣＶ－１細胞とにトランスフェクションする。
９）ＥＧＦＰ蛍光ウイルスを含む標的細胞を濃縮培養して収集し、その後、フローサイトメトリーでスクリーニングして９６ウェルプレートに播種し、１ウェル当たり１個の細胞を播種し、培養、増幅を行う。ＥＧＦＰ蛍光ウイルスリッチのウェルから標的細胞を収集し、ウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ方法を用いて同定を行い（プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９－３０）、標的バンドが現れたウイルスで再びＣＶ－１細胞を感染し、拡大培養を行う。
１０）ウイルス播種、スクリーニング、ウイルス収集、ＰＣＲ同定を複数回行い、最後に、ＯＲＦＶ１１２遺伝子が完全欠失する精製モノクローン性ウイルスを得、ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１と命名する。
【0092】
実施例４：突然変異型オルフウイルスの増幅培養
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－７０TM）
ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１、ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１及びＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ウイルス株
宿主細胞由来：アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＶ－１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－７０TM）
ウイルス株由来：ＰＯＶ－６０１、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１、ＰＯＶ－６０４－１Ｄ１及びＰＯＶ－６０１－３Ｆ８ウイルス株
【0093】
●ウイルス感染細胞：
１）必要な量に応じてＣＶ－１細胞継代培養を行い、一定量となるまで増幅した場合、培養ボトル中の細胞飽和度が９０％程度となった場合に、ウイルス感染を行うことができる。
２）ウイルス液を２％ＦＢＳのＤＭＥＭ完全培地で適切に希釈した。
３）培養ボトル中の古い培地を廃棄し、適量の新鮮な２％ＦＢＳのＤＭＥＭ完全培地を補充した。
４）ＭＯＩ ０．５に従って、希釈されたウイルス液を加え、培養ボトルを軽く揺るぎ、ウイルス液を均一に分布させ、培養ボトルにマークを付け、３７℃、５％ ＣＯ２の培養器で培養した。
１）必要な量に応じてＣＶ－１細胞継代培養を行い、一定量となるまで増幅した場合、培養ボトル中の細胞飽和度が９０％程度となった場合に、ウイルス感染を行うことができる。
２）ウイルス液を２％ＦＢＳのＤＭＥＭ完全培地で適切に希釈した。
３）培養ボトル中の古い培地を廃棄し、適量の新鮮な２％ＦＢＳのＤＭＥＭ完全培地を補充した。
４）ＭＯＩ ０．５に従って、希釈されたウイルス液を加え、培養ボトルを軽く揺るぎ、ウイルス液を均一に分布させ、培養ボトルにマークを付け、３７℃、５％ ＣＯ２の培養器で培養した。
【0094】
●ウイルスで感染された細胞の凍結保存
１）ウイルスで感染された細胞の９０％以上は、ＣＰＥが現れた場合、ウイルスを採取できる。
２）ウイルスで感染された細胞を細胞培養器から取り出し、上清を収集し、まだ壁に付着している細胞を消化した後、上清に合併した。
３）３０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心した。
４）ＰＢＳで１回すすいだ。
５）適量のＰＢＳで再び細胞を再懸濁した。
６）－８０℃に移動して貯蔵した。
１）ウイルスで感染された細胞の９０％以上は、ＣＰＥが現れた場合、ウイルスを採取できる。
２）ウイルスで感染された細胞を細胞培養器から取り出し、上清を収集し、まだ壁に付着している細胞を消化した後、上清に合併した。
３）３０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心した。
４）ＰＢＳで１回すすいだ。
５）適量のＰＢＳで再び細胞を再懸濁した。
６）－８０℃に移動して貯蔵した。
【0095】
●ウイルスによる溶解、放出：
１）ウイルスで感染された細胞を－８０℃から３７℃の水浴鍋に移動して解凍した。
２）超音波処理（型番：ＦＢ１２０，Ｔｈｅｒｍｏ）：「ＡＰＬＩＴＵＤＥ」が１００％であり、「Ｔｉｍｅ」が１ｍｉｎであり、合計３回行った。
３）ベンゾナーゼ（１ミリリットルの細胞溶解液懸濁液当たり、２５単位）を添加し、均一に混合し、３７℃で３０ｍｉｎ処理した。
４）１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。
５）ウイルス上清を収集し、－８０℃に移動して貯蔵した。
１）ウイルスで感染された細胞を－８０℃から３７℃の水浴鍋に移動して解凍した。
２）超音波処理（型番：ＦＢ１２０，Ｔｈｅｒｍｏ）：「ＡＰＬＩＴＵＤＥ」が１００％であり、「Ｔｉｍｅ」が１ｍｉｎであり、合計３回行った。
３）ベンゾナーゼ（１ミリリットルの細胞溶解液懸濁液当たり、２５単位）を添加し、均一に混合し、３７℃で３０ｍｉｎ処理した。
４）１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。
５）ウイルス上清を収集し、－８０℃に移動して貯蔵した。
【0096】
実施例５：突然変異型オルフウイルスの、マウス由来膀胱癌腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の評価
【0097】
Ａ．試験設計
【表2】
【0098】
Ｂ．試験動物：オスＣ５７ＢＬ／６マウス、６Ｗ、浙江維通利華試験動物技術有限公司から得られた。
【0099】
Ｃ．試験過程
オスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＭＢ４９細胞（広州吉▲尼▼欧生物科技有限公司）を皮下播種し、細胞密度が２×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を播種する日をＤａｙ０と定義した。対照群の腫瘍の体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表１の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ３０、全てのマウスを安楽死させた。
オスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＭＢ４９細胞（広州吉▲尼▼欧生物科技有限公司）を皮下播種し、細胞密度が２×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を播種する日をＤａｙ０と定義した。対照群の腫瘍の体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表１の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ３０、全てのマウスを安楽死させた。
【0100】
研究全体にわたって、毎週、マウスの体重秤量、腫瘍測定を２回行った。ノギス（型番：１６ＥＲ; Ｍａｈｒ ＧｍｂＨ）を用いて腫瘍体積を測定し、結果を図２に示した。
【0101】
下記の式で腫瘍体積を算出する。長さ及び幅を垂直に測定した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは、腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは、腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
【0102】
下記の式で相対平均腫瘍体積を測定した。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
【0103】
ＡＮＯＶＡ統計を使用してデータを分析する
ＡＮＯＶＡ検定方法を用いて治療群の腫瘍体積と対照群の腫瘍体積とに有意差があるか
否かを比較した。全てのデータをＳＰＳＳ １７で分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差を有することを意味する。
ＡＮＯＶＡ検定方法を用いて治療群の腫瘍体積と対照群の腫瘍体積とに有意差があるか
否かを比較した。全てのデータをＳＰＳＳ １７で分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差を有することを意味する。
【0104】
Ｄ．結果
【表3】
【0105】
実施例６：突然変異型オルフウイルスの、マウス由来メラノーマモデルにおける抗腫瘍活性の評価
Ａ．試験設計
Ａ．試験設計
【表4】
【0106】
Ｂ．試験動物－メスＣ５７ＢＬ／６マウス、６－８Ｗ、浙江維通利華試験動物技術有限公司から得られた。
【0107】
Ｃ．試験過程
メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＢ１６－Ｆ１０細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が５×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０を定義した。対照群の腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表３の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ１５、全てのマウスを安楽死させた。
メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＢ１６－Ｆ１０細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が５×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０を定義した。対照群の腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表３の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ１５、全てのマウスを安楽死させた。
【0108】
研究全体にわたって、毎週、マウスの体重秤量、腫瘍測定を２回行った。ノギス（型番
：１６ＥＲ; Ｍａｈｒ ＧｍｂＨ）を用いて腫瘍体積を測定し、結果を図３に示した。
：１６ＥＲ; Ｍａｈｒ ＧｍｂＨ）を用いて腫瘍体積を測定し、結果を図３に示した。
【0109】
下記の式で腫瘍体積を算出する。長さ及び幅を垂直に測定した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
【0110】
下記の式で相対平均腫瘍体積を算出した。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
【0111】
ＡＮＯＶＡ統計を使用してデータを分析する
ＡＮＯＶＡ検定方法を用いて治療群の腫瘍体積と対照群の腫瘍体積とに有意差があるか否かを比較した。全てのデータもＳＰＳＳ １７で分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差を有することを意味する。
ＡＮＯＶＡ検定方法を用いて治療群の腫瘍体積と対照群の腫瘍体積とに有意差があるか否かを比較した。全てのデータもＳＰＳＳ １７で分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差を有することを意味する。
【0112】
Ｄ．結果
【表5】
【0113】
実施例７：突然変異型オルフウイルスの安全性評価
Ａ．試験設計
Ａ．試験設計
【表6】
【0114】
Ｂ．測定品及び対照品
測定品－腫瘍溶解性ウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１、対照品－リン酸塩緩衝液
測定品－腫瘍溶解性ウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１、対照品－リン酸塩緩衝液
【0115】
Ｃ．試験動物：メスＣ５７ＢＬ／６マウス、６－８Ｗ、浙江維通利華試験動物技術有限公司
【0116】
Ｄ．試験操作
メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、測定品及び対照品を皮下又は尾静脈内注射した。１回目注射する日をＤａｙ０と定義した。マウスを完全に無作為にグループ分けし、表５の説明に従って投与処理を行い、全てのマウスに対して、投与後の１５日目、観察を終了した。全研究期間にわたって、１週間目、毎日マウスの体重を秤量し、その後、２～３日間につきマウスの体重を秤量した。
メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側背部に、測定品及び対照品を皮下又は尾静脈内注射した。１回目注射する日をＤａｙ０と定義した。マウスを完全に無作為にグループ分けし、表５の説明に従って投与処理を行い、全てのマウスに対して、投与後の１５日目、観察を終了した。全研究期間にわたって、１週間目、毎日マウスの体重を秤量し、その後、２～３日間につきマウスの体重を秤量した。
【0117】
マウスの体重変化をモニタリングした。ＭＬ１６０２Ｔ電子天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ）を用いて動物の体重を測定した。以下の式で相対体重変化率を算出し、結果を図４に示した。
相対体重変化（％）＝［重量日新／重量日０］×１００。
相対体重変化（％）＝［重量日新／重量日０］×１００。
【0118】
実施例８：突然変異型オルフウイルスの免疫系に対する調節作用
Ａ．試験設計
Ａ．試験設計
【表7】
【0119】
Ｂ．測定品及び対照品：
測定品－腫瘍溶解性ウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１
対照品－リン酸塩緩衝液
測定品－腫瘍溶解性ウイルスＰＯＶ－６０１－１Ａ１
対照品－リン酸塩緩衝液
【0120】
Ｃ．試験動物：メスＢａｌｂ／ｃ－ｎｕｄｅマウス、６Ｗ、北京華阜康生物科技股▲分▼有限公司
【0121】
Ｄ．試験方法
メスＢａｌｂ／ｃ－ｎｕｄｅマウスの両側の背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＣ－３３Ａ細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が１×１０８／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０と定義した。腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、表６の説明に従って投与処理を行った。最終回の投与後２４ｈ、試験を終了し、マウス全血、腫瘍を収集し、組織を切断して消化し、単一細胞懸濁液に調製し、蛍光抗体標識（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４９ｂ－ＰＥ、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ６９ ＡＰＣ）を行い、その後、フロー検出（ＡＦＣ２，Ｔｈｅｒｍｏ）を行い、図５（同図のＡ～Ｃ）を示した。
メスＢａｌｂ／ｃ－ｎｕｄｅマウスの両側の背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＣ－３３Ａ細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が１×１０８／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０と定義した。腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３程度となった場合、表６の説明に従って投与処理を行った。最終回の投与後２４ｈ、試験を終了し、マウス全血、腫瘍を収集し、組織を切断して消化し、単一細胞懸濁液に調製し、蛍光抗体標識（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４９ｂ－ＰＥ、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ６９ ＡＰＣ）を行い、その後、フロー検出（ＡＦＣ２，Ｔｈｅｒｍｏ）を行い、図５（同図のＡ～Ｃ）を示した。
【0122】
実施例９：突然変異型オルフウイルスのインビトロ細胞に対する感染作用
ウイルス株：ＰＯＶ－６０１－１Ａ１
１）培養された各腫瘍細胞を消化した後に収集してカウントし、１．５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２４ｈ培養した後に播種した。
２）２％ ＦＢＳの完全培地でウイルス液をそれぞれ１．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０７ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０５ｐｆｕ／ｍｌの４つの濃度に希釈した。
３）希釈されたウイルス液を９６ウェル細胞プレートに添加し、各ウェルに添加されるウイルスのＭＯＩをそれぞれ１０００、１００、１０、１となるまで１ウェル当たり１００μｌ添加し、各濃度について３つの重複ウェルを設置した。
４）３つのウェルを設置し、ウイルス液を含まない２％ＦＢＳの完全培地を添加して、陰性対照とした。
５）軽く揺るがしてウイルス液を単層細胞表面に均一に被覆させ、隅々まで被覆されることを確保した。
６）対照品又はウイルスを播種した９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の培養器に戻して７２ｈ培養した。
７）培養器から９６ウェルプレートを取り出し、１ウェル当たり１０μｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃：２０７２０６０）を添加し、培養プレートを軽く揺るがして染料を均一に分散させ、アルミ箔で９６ウェルプレートを被覆して３７℃で培養器中で遮光培養した。
８）培養終了後、カバーを取り除き、９６ウェルプレートをエライザ（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ Ｍ４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に配置し、励起波長を５６０ｎｍ、発光波長を５９０ｎｍに設置し、吸光度検出を行い、下記の換算式で細胞死亡率換算を行い、結果を分析した。
９）その結果、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルスは、メラノーマ細胞（Ｂ１６－Ｆ１０）、膀胱癌細胞（ＭＢ４９）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐａ１－６）、結腸癌細胞（ＣＴ２６）、ヒト子宮頸癌細胞（Ｃ－３３Ａ）、ヒト卵巣癌細胞（ＳＫ－ＯＶ－３）等の細胞に対して感染性を有し、ＭＯＩ値の上昇につれて、ウイルス感染性が増加したが、ｖｅｒｏ細胞に対してほとんど感染しなかったことがわかった。
ウイルス株：ＰＯＶ－６０１－１Ａ１
１）培養された各腫瘍細胞を消化した後に収集してカウントし、１．５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２４ｈ培養した後に播種した。
２）２％ ＦＢＳの完全培地でウイルス液をそれぞれ１．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０７ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１．５×１０５ｐｆｕ／ｍｌの４つの濃度に希釈した。
３）希釈されたウイルス液を９６ウェル細胞プレートに添加し、各ウェルに添加されるウイルスのＭＯＩをそれぞれ１０００、１００、１０、１となるまで１ウェル当たり１００μｌ添加し、各濃度について３つの重複ウェルを設置した。
４）３つのウェルを設置し、ウイルス液を含まない２％ＦＢＳの完全培地を添加して、陰性対照とした。
５）軽く揺るがしてウイルス液を単層細胞表面に均一に被覆させ、隅々まで被覆されることを確保した。
６）対照品又はウイルスを播種した９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の培養器に戻して７２ｈ培養した。
７）培養器から９６ウェルプレートを取り出し、１ウェル当たり１０μｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃：２０７２０６０）を添加し、培養プレートを軽く揺るがして染料を均一に分散させ、アルミ箔で９６ウェルプレートを被覆して３７℃で培養器中で遮光培養した。
８）培養終了後、カバーを取り除き、９６ウェルプレートをエライザ（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ Ｍ４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に配置し、励起波長を５６０ｎｍ、発光波長を５９０ｎｍに設置し、吸光度検出を行い、下記の換算式で細胞死亡率換算を行い、結果を分析した。
【数1】
９）その結果、ＰＯＶ－６０１－１Ａ１ウイルスは、メラノーマ細胞（Ｂ１６－Ｆ１０）、膀胱癌細胞（ＭＢ４９）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐａ１－６）、結腸癌細胞（ＣＴ２６）、ヒト子宮頸癌細胞（Ｃ－３３Ａ）、ヒト卵巣癌細胞（ＳＫ－ＯＶ－３）等の細胞に対して感染性を有し、ＭＯＩ値の上昇につれて、ウイルス感染性が増加したが、ｖｅｒｏ細胞に対してほとんど感染しなかったことがわかった。
【0123】
【表8】
【0124】
実施例８：突然変異型オルフウイルスの、マウス由来結腸癌モデルにおける抗腫瘍活性の評価
Ａ．試験設計
Ａ．試験設計
【表9】
【0125】
Ｂ．試験動物－メスＢａｌｂ／ｃマウス、６－８Ｗ、浙江維通利華試験動物技術有限公司から得られた。
【0126】
Ｃ．試験過程
メスＢａｌｂ／ｃマウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＣＴ－２６細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が５×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０とした。対照群の腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表８の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ２５、全てのマウスを安楽死させた。
メスＢａｌｂ／ｃマウスの右側背部に、ＰＢＳ中で再懸濁したＣＴ－２６細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫）を皮下播種し、細胞密度が５×１０６／ｍｌであり、播種量が０．１ｍｌ／匹であった。細胞を注射する日をＤａｙ０とした。対照群の腫瘍体積平均値が１００ｍｍ３となった場合、腫瘍サイズに応じて無作為にグループ分けし、表８の説明に従って投与処理を行い、細胞播種後のＤａｙ２５、全てのマウスを安楽死させた。
【0127】
研究全体にわたって、毎週、マウスの体重秤量、腫瘍測定を２回行った。ノギス（型番：１６ＥＲ; Ｍａｈｒ ＧｍｂＨ）を用いて腫瘍体積を測定し、結果を図１４に示す。
【0128】
下記の式で腫瘍体積を算出する。長さ及び幅を垂直に測定した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは、腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは、腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２
（式中、ａは、腫瘍の長さ（ｍｍ）であり、ｂは、腫瘍の幅（ｍｍ）である。）
【0129】
下記の式で相対平均腫瘍体積を算出した。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）＝Ｖｔ／Ｖ０
（式中、Ｖ０は、グループ分けて投与する時に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは、毎回測定した平均腫瘍体積である。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％
（ＴＲＴＶは、治療群ＲＴＶであり、ＣＲＴＶは、対照群ＲＴＶである。）
腫瘍抑制率ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
【0130】
ＡＮＯＶＡ統計を使用してデータを分析し、治療群の腫瘍体積と対照群の腫瘍体積比に有意差があるか否かを比較した。全てのデータをＳＰＳＳ １７で分析した。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを意味する。
【0131】
Ｄ．結果
【表10】
【0132】
実施例９：組み換え突然変異型オルフウイルスの、マウス由来メラノーマモデルにおける抗腫瘍活性の評価
組み換え方法により、ＯＲＦＶ１１１遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１２遺伝子コーディング領域及び／又は非コーディング領域を完全又は一部削除したオルフウイルスを構築し
、別途説明がない限り、実施例６に記載されている方法で効果を測定した。
組み換え方法により、ＯＲＦＶ１１１遺伝子及び／又はＯＲＦＶ１１２遺伝子コーディング領域及び／又は非コーディング領域を完全又は一部削除したオルフウイルスを構築し
、別途説明がない限り、実施例６に記載されている方法で効果を測定した。
【0133】
【表11】
【0134】
【表12】
【0135】
【表13】
【0136】
材料受託
以下の材料は、ブダペスト条約の規定に従って中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）（中国，武漢，武漢大学，４３００７２）で受託されている。
以下の材料は、ブダペスト条約の規定に従って中国典型培養物保蔵中心（ＣＣＴＣＣ）（中国，武漢，武漢大学，４３００７２）で受託されている。
【0137】
【表14】
【0138】
引用文献
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【0139】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【表27】
【表28】
【表29】
【表30】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】