(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-06
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230830BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230830BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230830BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230830BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230830BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230830BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230830BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230830BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230830BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230830BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230830BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230830BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230830BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230830BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230830BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C07K14/705
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P35/00
A61K35/17
A61K35/76
A61K31/7088
A61K48/00
C12N5/0783
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023506075
(86)(22)【出願日】2021-06-11
(85)【翻訳文提出日】2023-03-23
(86)【国際出願番号】 CN2021099798
(87)【国際公開番号】W WO2022022113
(87)【国際公開日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】202010734872.6
(32)【優先日】2020-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010733636.2
(32)【優先日】2020-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520285879
【氏名又は名称】中国科学院分子細胞科学卓越創新中心
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＥＸＣＥＬＬＥＮＣＥ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３５， ３２０ Ｙｕｅｙａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｘｕｈｕｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０００３１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】許▲シン▼▲チ▼
(72)【発明者】
【氏名】周秋萍
(72)【発明者】
【氏名】呉微
(72)【発明者】
【氏名】徐心怡
(72)【発明者】
【氏名】何星
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
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4C084AA13
4C084NA05
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4C085AA13
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4C085BB01
4C086AA01
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4C086MA01
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4C086NA05
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4C087AA01
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4C087AA03
4C087BB37
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA72
(57)【要約】
Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の構造は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域が連結されている。前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域とは、ＣＤ３ε細胞内領域のＩＴＡＭにおける２つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したＹ／Ｆ突然変異型ＣＤ３ε細胞内領域のことである。キメラ抗原受容体で改変したＴ細胞は、生存能力が向上し、アポトーシスレベルが低下し、増殖能力が向上し、サイトカインＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現レベルが下方調節される。
【選択図】図１ａ
【選択図】図１ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体であって、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域が連結されており、前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域とは、ＣＤ３ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフにおける２つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したＹ／Ｆ突然変異型ＣＤ３ε細胞内領域のことである、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項2】
更に、（１）前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、
（２）前記細胞内ドメインは、順に連結されるＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０及びＩＣＯＳのうちの１つ又は複数の細胞内セグメントから選択されることを特徴とする請求項２に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項4】
更に、（１）前記ＣＤ２８の細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、
（２）前記ＣＤ３ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項３に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項5】
更に、ａ．前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択され、
ｂ．前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂのうちの１つ又は複数の膜貫通領域から選択され、
ｃ．前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ４ヒンジ領域、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域、又は免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域が連結したヒンジ領域のうちの１つ又は複数から選択される、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項6】
更に、ｄ．前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３から選択され、
ｅ．前記ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであ
り、
ｆ．前記ＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸構造はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項５に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項7】
更に、１）前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はＦＭＣ６３から選択され、ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域から選択され、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通領域から選択され、細胞内ドメインは、順に連結されるＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域、ＣＤ２８の細胞内セグメント及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含み、
２）前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
【請求項8】
（１）請求項１～７のいずれか１項に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列、及び（２）（１）で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。
【請求項9】
前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りであることを特徴とする請求項８に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項10】
核酸構築物であって、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。
【請求項11】
請求項１０に記載の核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む、レンチウイルスベクターシステム。
【請求項12】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、請求項１０に記載の核酸構築物を含むか、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステムに感染していることを特徴とする遺伝子組換えＴ細胞。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項１０に記載の核酸構築物、或いは、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞の生存能力の向上、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（４）Ｔ細胞の増殖及び／又は生存能力の強化、（５）Ｔ細胞の抗腫瘍能力の向上、（６）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γレベルの抑制及びＴＮＦ－αの分泌阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項１０に記載の核酸構築物、或いは、請求項１１に記載のレンチウイルスベクターシステム、或いは、請求項１２に記載の遺伝子組換えＴ細胞の、腫瘍治療製品の製造における使用。
【請求項15】
ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体であって、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフが連結されている、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラキメラ抗原受容体。
【請求項16】
更に、（１）前記ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、
（２）前記細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項17】
前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０及びＩＣＯＳのうちの１つ又は複数の細胞内セグメントから選択されることを特徴とする請求項１６に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項18】
更に、（１）前記ＣＤ２８の細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、
（２）前記ＣＤ３ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１７に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項19】
更に、ａ．前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択され、
ｂ．前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂのうちの１つ又は複数の膜貫通領域から選択され、
ｃ．前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ４ヒンジ領域、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域、又は免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域が連結したヒンジ領域のうちの１つ又は複数から選択される、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項20】
更に、ｄ．前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３から選択され、
ｅ．前記ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであり、
ｆ．前記ＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸構造はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１９に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項21】
更に、１）前記ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はＦＭＣ６３から選択され、ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域から選択され、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通領域から選択され、細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、ＣＤ２８の細胞内セグメント及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含み、
２）前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す通りである、
との特徴のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１５～２０のいずれか１項に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
【請求項22】
（１）請求項１５～２１のいずれか１項に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列、及び（２）（１）で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。
【請求項23】
前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す通りであることを特徴とする請求項２２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項24】
核酸構築物であって、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項25】
請求項２４に記載の核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含むレンチウイルスベクターシステム。
【請求項26】
請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、請求項２４に記載の核酸構築物を含むか、請求項２５に記載のレンチウイルスベクターシステムに感染していることを特徴とする遺伝子組換えＴ細胞。
【請求項27】
請求項１５～２１のいずれか１項に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項２４に記載の核酸構築物、或いは、請求項２５に記載のレンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞の生存能力の向上、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（４）Ｔ細胞の増殖能力の強化、（５）Ｔ細胞の抗腫瘍能力の向上、（６）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γレベルの抑制、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における使用。
【請求項28】
請求項１５～２１のいずれか１項に記載のＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項２４に記載の核酸構築物、或いは、請求項２５に記載のレンチウイルスベクターシステム、或いは、請求項２６に記載の遺伝子組換えＴ細胞の、腫瘍治療製品の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラ抗原受容体の分野に関し、具体的には、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むか、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体は、ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と略称され、特定の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲが搭載されたＴ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と称する。ＣＡＲ－Ｔ療法は、腫瘍の治療（特に、固形腫瘍の免疫療法）に幅広く応用されている。本療法は、腫瘍治療における新型の精密標的療法となっており、ここ数年は、最適化や改良を通じて、臨床の腫瘍治療において良好な効果を得ている。つまり、ＣＡＲ－Ｔ療法は、非常に将来性があり、正確、迅速、効率的で、且つ癌を治癒し得る新型の腫瘍免疫療法である。
【0003】
しかし、ＣＡＲ－Ｔ療法には依然として多くの限界がある。例えば、腫瘍の臨床治療で遭遇するサイトカインストームや、神経毒性の安全性、持続的増殖能力に劣るといった問題がある。２０１５年、「ランセット」に１つの第Ｉ相臨床試験（臨床試験番号：ＮＣＴ０１５９３６９６，２０１５．Ｌａｃｅｔ．Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔｓ－ａ ｐｈａｓｅ １ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ）が発表された。この発表によると、再発性又は難治性急性リンパ性白血病、或いは非ホジキンリンパ腫に罹患した患者（年齢１～３０歳）にＫＴＥ－Ｃ１９（ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ）ＣＡＲ－Ｔ療法を施してから、体内における血中ＣＡＲ－Ｔ細胞の数を検出したところ、１４日目にＣＡＲ－Ｔ細胞の数がピークに達したが、その後は、２８日目、４２日目に顕著な逓減が見られ、６８日目には全ての患者の血液からＣＡＲ－Ｔ細胞を検出できなくなったという。更に、２０１８年にも、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」に１つの第Ｉ相臨床試験（臨床試験番号：ＮＣＴ０１０４４０６９，２０１８．ＮＥＪ．Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）の結果が発表された。この発表でも、再発性急性リンパ性白血病に罹患した５３名の患者にａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ療法を施してから、体内における血中ＣＡＲ－Ｔ細胞の数を検出したところ、中央値が１４日目に現れることが示された。これら２つの研究は、いずれも、２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は持続的増殖・生存能力に比較的劣り、治療効果の向上が望まれることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ＣＡＲ構造自体の改変を設計するにあたっては、抗腫瘍効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすために、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続的生存能力を向上させるとの観点から考慮すればよい。上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むか、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の態様におい
て、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
て、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
【0006】
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域が連結されている。前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域とは、ＣＤ３ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ）における２つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したＹ／Ｆ突然変異型ＣＤ３ε細胞内領域のことである。
【0007】
本発明は、第２の態様において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、（１）本発明の第１の態様で述べたＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
【0008】
本発明は、第３の態様において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、本発明の第２の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
【0009】
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
【0010】
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び本発明の第２の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
【0011】
本発明は、第４の態様において、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、本発明の第３の態様で述べた核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
【0012】
本発明は、第５の態様において、遺伝子組換えＴ細胞、又は当該遺伝子組換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、本発明の第２の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含むか、本発明の第３の態様で述べた核酸構築物を含むか、本発明の第４の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムに感染している。
【0013】
本発明は、第６の態様において、本発明の第１の態様で述べたＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、本発明の第２の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第３の態様で述べた核酸構築物、又は本発明の第４の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞の生存能力の向上、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（４）Ｔ細胞の増殖及び／又は生存能力の強化、（５）Ｔ細胞の抗腫瘍能力の向上、（６）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γレベルの抑制及びＴＮＦ－αの分泌阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における応用を提供する。
【0014】
本発明は、第７の態様において、本発明の第１の態様で述べたＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、本発明の第２の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第３の態様で述べた核酸構築物、本発明の第４の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第５の態様で述べた遺伝子組換えＴ細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
【0015】
上述したように、本発明におけるＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体及びその用途は、以下の有益な効果を有する。
【0016】
本発明におけるキメラ抗原受容体で改変したＴ細胞は、生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上により、Ｔ細胞の持続性を顕著に向上させて、Ｔ細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能である。この優位性により、臨床応用において、更に腫瘍治療効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすことが可能となる。且つ、当該改変Ｔ細胞は、サイトカインＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現レベルを下方調節して、マクロファージ及び単球の活性化によるＩＬ－１β及びＩＬ－６といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能である。
【0017】
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第８の態様において、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
【0018】
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
【0019】
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフが連結されている。
【0020】
本発明は、第９の態様において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、（１）本発明の第８の態様で述べたＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
【0021】
本発明は、第１０の態様において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
【0022】
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
【0023】
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
【0024】
本発明は、第１１の態様において、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、本発明の第１０の態様で述べた核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
【0025】
本発明は、第１２の態様において、遺伝子組換えＴ細胞、又は当該遺伝子組換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含むか、本発明の第１０の態様で述べた核酸構築物を含むか、本発明の第１１の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムに感染している。
【0026】
本発明は、第１３の態様において、本発明の第８の態様で述べたＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第１０の態様で述べた核酸構築物、又は本発明の第１１の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムの、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞の生存能力の向上、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（４）Ｔ細胞の増殖能力の強化、（５）Ｔ細胞の抗腫瘍能力の向上、（６）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γレベルの抑制、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造における応用を提供する。
【0027】
本発明は、第１４の態様において、本発明の第８の態様で述べたＣＤ３ε細胞内塩基性
アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第１０の態様で述べた核酸構築物、本発明の第１１の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第１２の態様で述べた遺伝子組換えＴ細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第９の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第１０の態様で述べた核酸構築物、本発明の第１１の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第１２の態様で述べた遺伝子組換えＴ細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
【0028】
上述したように、本発明におけるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途は、以下の有益な効果を有する。
【0029】
本発明におけるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体で改変したＴ細胞は、生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上によって、Ｔ細胞の持続性を顕著に向上させて、Ｔ細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能である。この優位性により、臨床応用において、更に腫瘍治療効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすことが可能となる。且つ、当該改変Ｔ細胞は、サイトカインＩＦＮγの発現レベルを下方調節して、マクロファージ及び単球の活性化によるＩＬ－１β及びＩＬ－６といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1a】図１ａは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲの概略構造図と、ＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列及びＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列である。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、ＣＤ３εはＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入されている。また、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列は、ＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入されている。
【図1b】図１ｂは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲがＴ細胞に発現したあとの膜上レベルのフローサイトメトリーグラフである。
【図1c】図１ｃは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋の細胞割合のフローサイトメトリーグラフである。
【図1d】図１ｄは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＩＬ－２のサイトカインレベルの比較である。
【図1e】図１ｅは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＩＦＮ－γのサイトカインレベルの比較である。
【図1f】図１ｆは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＴＮＦ－αのサイトカインレベルの比較である。
【図1g】図１ｇは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖状況である。
【図1h】図１ｈは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシス状況である。
【図1i】図１ｉは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存数である。
【図1j】図１ｊは、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性反応である。
【図1k】図１ｋは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとの、細胞の増殖、生存、抗アポトーシスを促進するシグナル分子セリン／トレオニンプロテインキナーゼＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４のリン酸化（ｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）レベルである。
【図1l】図１ｌは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとの、細胞の増殖、生存、抗アポトーシスを促進するシグナル分子セリン／トレオニンキナーゼＡＫＴＳ４７３のリン酸化（ｐＡＫＴＳ４７３）レベルである。
【図1m】図１ｍは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとの、細胞の成長、増殖をマークするシグナル分子リボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化（ｐＳ６Ｓ２３５／２３６）レベルである。
【図2a】図２ａは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲの概略構造図である。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ＣＤ３ε細胞内塩基性リッチな領域のモチーフは、ＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入されている。
【図2d】図２ｄは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＩＬ－２のサイトカインレベルの比較である。
【図2e】図２ｅは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＩＦＮ－γのサイトカインレベルの比較である。
【図2f】図２ｆは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとのＴＮＦ－αのサイトカインレベルの比較である。
【図2j】図２ｊは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗原）で刺激したあとの、細胞の増殖、生存、抗アポトーシスを促進するシグナル分子セリン／トレオニンキナーゼＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルである。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明で記載するＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
【0032】
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
【0033】
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域が連結されている。前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域とは、ＣＤ３ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ）における２つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したＹ／Ｆ突然変異型ＣＤ３ε細胞内領域のことである。
【0034】
更に、前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、具体的には、ＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＦＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＦＳＧＬＮＱＲＲＩである。
【0035】
前記細胞内ドメインは、順に連結されるＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域（当該細胞内領域のＩＴＡＭモチーフにおける２つのチロシンがフェニルアラニンに突然変異している）、共刺激シグナル伝達領域の細胞内領域及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む。
【0036】
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＩＣＯＳのうちの１つ又は複数の細胞内セグメントから選択される。
【0037】
更に好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域はＣＤ２８細胞内セグメントから選択される。この場合、殺傷能力がより強くなる。
【0038】
ＣＤ２８細胞内セグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、具体的には以下とする。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ。
【0039】
一実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３に示す通りである。具体的には、以下とする。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
Ｏ：３に示す通りである。具体的には、以下とする。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
【0040】
一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ））、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択される。
【0041】
好ましくは、標的特異性が良好なＣＤ１９又はメソテリンから選択される。
【0042】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂのうちの１つ又は複数の膜貫通領域から選択される。
【0043】
好ましくは、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通領域から選択される。具体的に、前記ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りである。具体的には、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶとする。
【0044】
前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ４ヒンジ領域、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域、又は免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域が連結したヒンジ領域のうちの１つ又は複数から選択される。即ち、ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ又はＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２ＣＨ３とすることができる。
【0045】
選択的に、前記ヒンジ領域の配列はＣＤ２８ヒンジ領域（ＣＤ２８ ｈｉｎｇｅ）である。また、アミノ酸構造はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りである。具体的には、ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰとする。
【0046】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。
【0047】
一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。
【0048】
一実施形態において、前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３から選択される。
【0049】
ＦＭＣ６３には、市販の製品を使用可能である。
【0050】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
【0051】
一実施形態において、前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はＦＭＣ６３から選択され、ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域から選択される。また、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通領域から選択される。細胞内ドメインは、順に連結されるＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域、ＣＤ２８の細胞内セグメント及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む。
【0052】
一実施形態において、前記Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示す通りであり、具体的には以下とする。
【0053】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲのアミノ酸配列）：（５’→３’）ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖから開始して、順に、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域及びＣＤ３ζ細胞内領域となるよう連結されている。
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＦＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＦＳＧＬＮＱＲＲＩＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＦＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＦＳＧＬＮＱＲＲＩＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
【0054】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲのアミノ酸配列）に対応するヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は次の通りとする（５’→３’）。
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇａｃｔａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃａｇｇｇｃａａｇｔｃａｇｇａｃａｔｔａｇｔａａａｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇａｔｇｇａａｃｔｇｔｔａａａｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔａｃａｔｃａａｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇｇａｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔａｔｔｃｔｃｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃａａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇｔａａｔａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｃｔａａｇｔｔｇｇａａａｔａａｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｇａｇｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｔａｃｃｃｇａｃｔａｔｇｇｔｇｔａａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｃｇａａａｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔａａｔａｔｇｇｇｇｔａｇｔｇａａａｃｃａｃａｔａｃｔａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｇａｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｃａａｃｔｃｃａａｇａｇｃｃａａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａａｔｇａａｃａｇｔｃｔｇｃａａａｃｔｇａｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｃａａａｃａｔｔａｔｔａｃｔａｃｇｇｔｇｇｔａｇｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔ
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【0055】
本発明で記載するＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
【0056】
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
【0057】
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、ＢＲＳモチーフと略称されるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ（Ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ Ｒｉｃｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結されている。
【0058】
更に、前記ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、具体的にはＫＮＲＫＡＫＡＫとする。
【0059】
前記細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む。
【0060】
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＩＣＯＳのうちの１つ又は複数の細胞内セグメントから選択される。
【0061】
更に好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域はＣＤ２８の細胞内セグメントから選択される。この場合、殺傷能力がより強くなる。
【0062】
ＣＤ２８の細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す通りであり、具体的には、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳとする。
【0063】
一実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りである。具体的には、以下とする。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
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【0064】
一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ））、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１７１及びＧＤ２のうちの１つ又は複数から選択される。
【0065】
好ましくは、前記腫瘍表面抗原は、標的特異性が良好なＣＤ１９又はメソテリンから選択される。
【0066】
更に、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂのうちの１つ又は複数の膜貫通領域から選択される。
【0067】
好ましくは、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通領域から選択される。具体的に、前記ＣＤ２８の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りである。具体的には、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶとする。
【0068】
前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ４ヒンジ領域、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域、又は免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域が連結したヒンジ領域のうちの１つ又は複数から選択される。即ち、ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ又はＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２ＣＨ３とすることができる。
【0069】
選択的に、前記ヒンジ領域の配列はＣＤ２８ヒンジ領域（ＣＤ２８ ｈｉｎｇｅ）である。また、アミノ酸構造はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りである。具体的には、ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰとする。
【0070】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。
【0071】
一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。
【0072】
一実施形態において、前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３から選択される。
【0073】
ＦＭＣ６３には、市販の製品を使用可能である。
【0074】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
【0075】
前記ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はＦＭＣ６３から選択され、ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域から選択される。また、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通領域から選択される。細胞内ドメインは、順に連結されるＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、ＣＤ２８の細胞内セグメント及びＣＤ３ζ細胞内セグメントを含む。
【0076】
一実施形態において、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ）は、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ３εＢＲＳモチーフ及びＣＤ３ζ細
胞内領域を含む。
胞内領域を含む。
【0077】
一実施形態において、ＣＤ３ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ）のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１１に示す通りであり、具体的には、以下とする。
ＩＤ ＮＯ：１１に示す通りであり、具体的には、以下とする。
【0078】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲのアミノ酸配列）：（５’→３’）ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖから開始して、順に、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ３εＢＲＳモチーフ及びＣＤ３ζ細胞内領域となるよう連結されている。
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【0079】
Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は次の通りとする（５’→３’）。
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【0080】
本発明のキメラ抗原受容体を形成する上記各部分は、互いを直接連結してもよいし、リンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列は、当該分野において周知の抗体に適用されるリンカー配列とすればよく、例えば、Ｇ及びＳを含むリンカー配列とする。通常、リンカーは、前後で繰り返される１つ又は複数のモチーフを含む。例えば、当該モチーフは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＳＳＧ、ＧＳＧＳＡ及びＧＧＳＧＧとすることができる。好ましくは、当該モチーフは、リンカー配列において隣接しており、繰り返し間にアミノ酸残基は挿入されない。リンカー配列は、１個、２個、３個、４個又は５個の繰り返しモチーフを含んで構成可能である。リンカーの長さは３～２５個のアミノ酸残基とすることができ、例えば、３～１５個、５～１５個、１０～２０個のアミノ酸残基とする。いくつかの実施方案において、リンカー配列はポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列中のグリシンの数に特に制限はなく、通常は２～２０個とし、例えば、２～１５個、２～１０個、２～８個とする。グリシン及びセリン以外にも、リンカーは、その他の既知のアミノ酸残基（例えば、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等）を含み得る。
【0081】
理解すべき点として、遺伝子クローン操作では、適切な酵素切断部位の設計を要することが多い。その場合、発現するアミノ酸配列の末端に必然的に１つ又は複数の無関係な残基が導入されるが、これが標的配列の活性に影響することはない。また、融合タンパク質の作製、組換えタンパク質の発現促進、宿主細胞外に自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、或いは組換えタンパク質の有利な精製のためには、組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は当該タンパク質中のその他の適切な領域内に何らかのアミノ酸を添加せねばならないことが多い（例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長等を含むが、これらに限らない）。シグナルペプチドについては、仮に次のように考えられる。即ち、分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳時にまず合成されるのは、Ｎ末端に疎水性アミノ酸残基を有するシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、小胞体膜上の受容体に認識されて結合する。シグナルペプチドは、膜中タンパク質により形成されるトンネルを経由して小胞体の内腔に到達すると、内腔表面に位置するシグナルペプチダーゼにより加水分解される。シグナルペプチドの誘導により、新生ポリペプチドは小胞体膜を通過して内腔に進入可能となり、最終的に細胞外に分泌される。ＣＡＲのシグナルペプチドについては異なる取得源があり、主に、ＣＤ８及びＣＤ２８、ＧＭ－ＣＳＦ受容体のシグナルペプチドがある。本発明の融合タンパク質（即ち、上記のＣＡＲ）のＮ末端又はＣ末端は、タンパク質タグとして、１つ又は複数のポリペプチドフラグメントを更に含んでもよい。本文では、任意の適切なタグをいずれも使用可能である。例えば、前記タグは、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ、Ｐｏｌｙ－Ａｒｇ、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇＩＩ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ及びＴｙ１とすることができる。これらのタグは、タンパク質の精製に使用可能である。
【0082】
本発明で提供するポリヌクレオチド配列は、（１）上記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
【0083】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ形式であってもよいし、ＲＮＡ形式であってもよい。ＤＮＡ形式は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは、１本鎖であってもよいし、２本鎖であってもよい。ＤＮＡは、コード鎖であってもよいし、非コード鎖であってもよい。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の縮重バリアント（即ち、同一のアミノ酸配列をコードするがヌクレオチド配列の一部が異なるヌクレオチド配列）も含む。
【0084】
通常、本文中で記載するポリヌクレオチド配列はＰＣＲ増幅法で取得可能である。具体的には、本文中で開示するヌクレオチド配列（特に、オープンリーディングフレーム配列）に基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリか、当業者にとって既知の一般的な方法で作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として用い、増幅することで関連の配列を取得する。配列が長い場合には、２回又は複数回のＰＣＲ増幅を行ったあと、各回で増幅した断片を正しい順序で連結せねばならないことが多い。
【0085】
本発明で提供する核酸構築物は、上記のポリヌクレオチド配列を含む。
【0086】
前記核酸構築物は、更に、上記のポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１つ又は複数の調節配列を含む。本発明で記載するＣＡＲのコード配列は、前記タンパク質の発現を保証するために、様々な方式で操作可能である。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの違いや要求に応じて、核酸構築物を操作してもよい。組換えＤＮＡ手法を利用してポリヌクレオチド配列を改変する技術は、当該分野において既知である。
【0087】
調節配列は、適切なプロモーター配列とすることができる。通常、プロモーター配列は、発現されるタンパク質のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。
【0088】
調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞に認識されることで転写を終結させる配列としてもよい。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作的に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に使用可能である。
【0089】
調節配列は、宿主細胞の翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列としてもよい。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に使用可能である。
【0090】
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
【0091】
通常は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を操作可能にプロモーターに連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことで、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の発現を実現する。当該ベクターは、真核細胞の複製及び統合に適したものとすればよい。代表的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節可能な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
【0092】
本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、数多くのタイプのベクターにクローニング可能である。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドにクローニング可能である。更に、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクター形式で細胞に提供可能である。ウイルスベクター技術は当該分野において公知である。ベクターとして用い得るウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれる（ただし、これらに限らない）。通常、適切なベクターには、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製起点、プロモーター配列、都合のよい制限酵素部位、及び１つ又は複数の選択可能なマーカーが含まれる。
【0093】
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ及び前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【0094】
適切なプロモーターの一例としては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列が挙げられる。当該プロモーター配列は、自身に操作可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列を高水準で発現可能とする強い構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例としては、伸長因子－１α（ＥＦ－１α）が挙げられる。ただし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルスの最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーター。ただし、これらに限らない）を含む（ただし、上記に限らない）その他の構成型プロモーター配列を使用してもよい。更に、誘導型プロモーターの使用を検討してもよい。誘導型プロモーターを使用することで分子スイッチが提供される。分子スイッチは、発現を期待する時に、誘導型プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンとすることができ、発現を期待しない場合には発現をオフとする。誘導型プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる（ただし、これらに限らない）。
【0095】
ＣＡＲのポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子うちのいずれか一方又は双方を含んでもよい。このことは、ウイルスベクターによってトランスフェクション又は感染を試みた細胞群から発現細胞を鑑定及び選択するのに都合がよい。他方で、選択可能なマーカーは、単独のＤＮＡ断片に保持されてコトランスフェクション手順に使用することが可能である。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の双方のフランキングは、宿主細胞内で発現可能となるよう、いずれも適切な調節配列を有し得る。有効な選択可能なマーカーには、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【0096】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞の鑑定に用いられるとともに、調節配列の機能性評価にも用いられる。ＤＮＡが受容細胞に導入されたあと、レポーター遺伝子の発現が適切なタイミングで測定される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る。また、適切な発現システムは、公知且つ既知の技術で作製可能であるか、商業的に取得される。
【0097】
遺伝子を細胞に導入する方法及び遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該分野において既
知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞（例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞）に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。
知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞（例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞）に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。
【0098】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。また、興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを使用する方法が含まれる。また、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズといったコロイド分散系や、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。
【0099】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ウイルスベクター（特に、レンチウイルスベクター）を使用する方法が含まれる。これは、遺伝子を哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に導入するための最も汎用的な方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等から入手可能である。遺伝子を哺乳動物の細胞に導入するための数多くのウイルスベースのシステムがすでに開発されており、例えば、レンチウイルスによって、遺伝子導入システムに用いられる便利なプラットフォームが提供されている。当該分野において既知の技術を用いれば、選択した遺伝子をベクターに導入し、レンチウイルス粒子にパッケージングすることが可能である。当該組換えウイルスは、その後分離して体内又は体外の対象細胞に導入可能となる。当該分野では、数多くのレトロウイルスシステムが知られている。また、いくつかの実施方案では、アデノウイルスベクターを使用する。当該分野では、数多くのアデノウイルスベクターが知られている。また、一実施方案では、レンチウイルスベクターを使用する。
【0100】
本発明は、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、上述した核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
【0101】
前記レンチウイルスの補助成分は、レンチウイルスパッケージングプラスミドと細胞株を含む。
【0102】
前記レンチウイルスベクターシステムは、レンチウイルスパッケージングプラスミド及び細胞株の補助のもと、前記核酸構築物がウイルスパッケージングされてなる。前記レンチウイルスベクターシステムの構築方法は、当該分野において常用される方法である。
【0103】
本発明は、Ｔ細胞の体外活性化方法を提供する。前記方法は、前記レンチウイルスを使用して前記Ｔ細胞を感染させるステップを含む。
【0104】
ほかの薬物療法と比較すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞が持つ自己増殖及び生存維持能力に基づき、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で長時間維持することが可能である。また、標的とする特異抗原の刺激を受けると急速に増幅し、標的を有する腫瘍細胞を殺傷し得るとともに、その後は、例えばエフェクター記憶細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）やセントラル記憶細胞（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）といった特異的記憶細胞を形成可能である。
【0105】
本発明は、更に、細胞療法を含む。当該細胞療法において、Ｔ細胞は本文中で記載するＣＡＲを発現するよう遺伝子組換えがなされる。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、これを必要とする適用者に注入される。注入された細胞は、適用者の腫瘍細胞を殺傷可能である。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で複製可能であって、持続的に腫瘍を制御可能な長
期持続性を発揮する。
期持続性を発揮する。
【0106】
ＣＡＲ－Ｔ細胞に起因する抗腫瘍免疫反応は、能動的又は受動的な免疫反応となり得る。このほか、ＣＡＲにより誘導される免疫反応は、養子免疫細胞療法のステップの一部分となり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲの抗原結合部分について特異的な免疫反応を誘導する。
【0107】
治療可能な癌は、血液腫瘍（例えば、白血病やリンパ腫）のような非固形腫瘍とすることができる。特に、本発明のＣＡＲ、そのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス及びＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて治療可能な疾病は、好ましくはＣＤ１９誘導性の疾病であり、特にＣＤ１９誘導性の血液腫瘍である。
【0108】
具体的に、本文中の「ＣＤ１９誘導性の疾病」には、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病といった白血病及びリンパ腫が含まれる（ただし、これらに限らない）。
【0109】
本発明は、遺伝子組換えＴ細胞、又は当該遺伝子組換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、前記核酸構築物を含むか、前記レンチウイルスベクターシステムに感染している。
【0110】
本発明のＣＡＲ－修飾Ｔ細胞は、単独で投与してもよいし、薬物組成物として、希釈剤及び／又はその他の成分（例えば、関連のサイトカイン又は細胞群）と組み合わせて投与してもよい。簡単に言うと、本発明の薬物組成物には、本文中で記載したＣＡＲ－Ｔ細胞と、１又は複数種類の薬学的又は生理学的に許容可能なベクター、希釈剤又は賦形剤の組み合わせが含まれ得る。このような組成物には、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水、硫酸塩緩衝生理食塩水等）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖又はデキストラン、マンニトール）、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤が含まれ得る。
【0111】
本発明の薬物組成物は、治療（又は予防）対象の疾病に適した方式で投与される。投与の数量及び頻度は、例えば、患者の病症、患者の疾病タイプ及び深刻度といった要素から決定する。
【0112】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍－抑制有効量」又は「治療量」を示す場合、投与される本発明の組成物の正確な量は医師により決定可能である。その際には、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び病症の個体差が考慮される。通常、本文中で記載するＴ細胞を含む薬物組成物の投与量は、１０４～１０９細胞／ｋｇ（体重）、好ましくは、１０５～１０６細胞／ｋｇ（体重）とすることができる。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において公知の注入技術で投与可能である。具体的な患者に対する最適な投与量及び治療プランについては、患者の疾病の兆候を観察し、それにより治療を調節することで、医療分野の技術者により容易に決定可能である。
【0113】
対象組成物の投与は、噴霧法、注射、内服、点滴、埋め込み又は移植を含む任意の都合の良い方式で実施可能である。本文中で記載する組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射又は腹膜内注射によって患者に投与可能である。一実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与する。別の実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈注射によって投与する。また、Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注入可能である。
【0114】
本発明のいくつかの実施方案において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はその組成物は、当該分野において既知のその他の治療法と組み合わせ可能である。前記治療法には、化学療法、放射線治療及び免疫抑制剤が含まれる（ただし、これらに限らない）。例えば、各種の放射線治療製剤を組み合わせて治療することが可能である。これらの放射線治療製剤には、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、ＦＫ５０６、フルダラビン、ラパマイシン及びミコフェノール酸等が含まれる。更なる実施方案において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植や、化学療法薬（例えば、フルダラビン）、放射線外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド又は抗体（例えば、ＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ）を利用したＴ細胞アブレーション療法と組み合わせて（例えば、事前、同時又は事後）患者に投与する。
【0115】
本文中の「抗腫瘍能力」とは生物学的な効果を意味し、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、推定寿命の延長又は癌関連の各種生理的症状の改善によって示すことができる。
【0116】
「患者」、「対象」「個体」等は、本文中で互換的に使用可能であり、免疫反応を発生させ得る生体有機体（例えば、哺乳動物）を意味する。これには、例えば、ヒト、犬、猫、マウス、ラット及びその遺伝子組換え種が含まれる（ただし、これらに限らない）。
【0117】
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステムは、（１）Ｔ細胞の作製、（２）Ｔ細胞の生存能力の向上、（３）Ｔ細胞アポトーシスの阻害、（４）Ｔ細胞の増殖及び／又は生存能力の強化、（５）Ｔ細胞の抗腫瘍能力の向上、（６）Ｔ細胞からのサイトカインＩＦＮ－γレベルの抑制及びＴＮＦ－αの分泌阻害、のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造に応用される。
【0118】
生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上により、Ｔ細胞の持続性を顕著に向上させて、Ｔ細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能となる。
【0119】
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステムは、更に、Ｔ細胞の増殖・生存能力、成長・増殖能力又は持続的増殖能力の強化、或いはＴ細胞数の増加のうちのいずれか１つ又は複数の用途の製品の製造にも応用可能である。
【0120】
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステム又は前記遺伝子組換えＴ細胞は、腫瘍治療製品の製造に応用される。
【0121】
選択的に、前記腫瘍は、白血病又は固形腫瘍のうちの１つ又は複数から選択される。
【0122】
選択的に、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択される。
【0123】
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の改変又は変更が可能である。
【0124】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、理解すべき点として、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らない。更に、理解すべき点として、本発明
の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するためのものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、本文中で別途明示している場合を除き、「１つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するためのものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、本文中で別途明示している場合を除き、「１つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
【0125】
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同義である。また、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【0126】
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法には、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。
【実施例1】
【0127】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９２８Ｚ ＣＡＲの配列は、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞内領域という構造（即ち、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．実験室がＮＣＢＩで共有する配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ８５２９５２．１）を含む。遺伝子合成によりａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲを取得し、これをベースに、図１ａに示すＣＡＲ構造の配列を設計した。そして、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドを介して、ｅＧＦＰ及びＣＡＲ配列を同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に連結してコードした。よって、ＣＡＲの発現レベルは、ｅＧＦＰの発現量／蛍光強度で示すことができた。また、重複伸長ＰＣＲ法（ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）に基づく部位特異的変異導入技術及び遺伝子組換え連結技術を用い、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域（当該細胞内領域のＩＴＡＭモチーフにおける２つのチロシンがフェニルアラニンに突然変異している）をＣＤ２８膜貫通領域の後方に挿入して新型のＣＡＲを作製し、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲと命名した。
【0128】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す通りである。具体的には、以下とする。
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【0129】
ＥＹＦ２８Ｚと同じ作製方法で、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域を配列がＣＤ３ε細胞内領域となるよう置換した点のみが異なるａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ Ｃ
ＡＲを作製した。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示す通りであり、具体的には以下とする。
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴａｔｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｇｔｔａｃｃａｃａｃｃｃａｇｃａｔｔｃｃｔｃｃｔｇａｔｃｃｃａＴＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇａｃｔａｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃａｇｇｇｃａａｇｔｃａｇｇａｃａｔｔａｇｔａａａｔａｔｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇａｔｇｇａａｃｔｇｔｔａａａｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔａｃａｔｃａａｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇｇａｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔａｔｔｃｔｃｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃａａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇｔａａｔａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｃｔａａｇｔｔｇｇａａａｔａａｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｇａｇｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｇｔｃａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｔａｃｃｃｇａｃｔａｔｇｇｔｇｔａａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｃｇａａａｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔａａｔａｔｇｇｇｇｔａｇｔｇａａａｃｃａｃａｔａｃｔａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｔｃａａａｔｃｃａｇａｃｔｇａｃｃａｔｃａｔｃａａｇｇａｃａａｃｔｃｃａａｇａｇｃｃａａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａａｔｇａａｃａｇｔｃｔｇｃａａａｃｔｇａｔｇａｃａｃａｇｃｃａｔｔｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｃａａａｃａｔｔａｔｔａｃｔａｃｇｇｔｇｇｔａｇｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇａａｇｔｔａｔｇｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔａｃｃｔａｇａｃａａｔｇａｇａａｇａｇｃａａｔｇｇａａｃｃａｔｔａｔｃｃａｔｇｔｇａａａｇｇｇａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇｇａｃｃｔｔｃｔａａｇｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａａｔａｇａａａｇｇｃｃａａｇｇｃｃａａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｃｇａｇｇａｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｃａａａｇｇｇｇａｃａａａａｃａａｇｇａｇａｇｇｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｔｃｃｃａａｃｃｃａｇａｃ
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ＡＲを作製した。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示す通りであり、具体的には以下とする。
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【0130】
ＣＡＲをレンチウイルス発現プラスミドｐＨＡＧＥベクターにサブクローニングし、ＣＡＲ発現プラスミドとパッケージングプラスミドｐＳＰＡＸ２及びｐＭＤ２Ｇをそれぞれ１０：７．５：３．５の割合で混合したあと、リン酸カルシウムトランスフェクション手法で２９３ＦＴ細胞に導入し、レンチウイルス粒子を生成した。次に、超高速遠心分離手法を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ又はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲをそれぞれ発現したレンチウイルスを濃縮して小体積・高力価ウイルス（～１０８ＩＵ／ｍｌ）としたあと、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ａｂ－ｂｅａｄｓで１日活性化した初代Ｔ細胞（ＭＯＩ＝１０）にそれぞれトランスフェクションした。Ｔ細胞完全培地（ＸＩＶＯ－１５＋１％Ｐ．Ｓ．＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５＋５％ Ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ，１０ｍＭ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ ＮＡＣ）を用いた初代Ｔ細胞の培養期間は、ウイルスを１日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で４日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から５日目に、ＣＡＲ発現量（ｅＧＦＰ蛍光強度で表示）が同じＣＡＲ－Ｔ細胞を分別し、取得したＴ－細胞を、それぞれ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９
２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、ＣＡＲの膜上レベル、ＣＤ４とＣＤ８のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をＣＡＲ－Ｔについて行った。
２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、ＣＡＲの膜上レベル、ＣＤ４とＣＤ８のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をＣＡＲ－Ｔについて行った。
【0131】
指標検出方法及び結果について：
取得したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲの構造と、ＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列及びＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列を図１ａに示す。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、ＣＤ３εはＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。また、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列は、ＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。
取得したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲの構造と、ＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列及びＹ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列を図１ａに示す。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、ＣＤ３εはＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。また、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲにおいて、Ｙ／Ｆ突然変異を有するＣＤ３ε細胞内領域のアミノ酸配列は、ＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。
【0132】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ抗体を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるａｎｔｉ－ＣＤ
１９ ＣＡＲ受容体の膜上レベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図１ｂに示す。これより、三者のＣＡＲ陽性率及び発現量（ＭＦＩ）に差がないことが示された。
１９ ＣＡＲ受容体の膜上レベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図１ｂに示す。これより、三者のＣＡＲ陽性率及び発現量（ＭＦＩ）に差がないことが示された。
【0133】
ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図１ｃに示す。これより、三者のＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は類似していることが示された。
【0134】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の６時間前に１×ＢＦＡを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にＰＢＳでサンプルを１回洗浄した。その後、４％ＰＦＡを用いて室温で５ｍｉｎ固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行い、対応する直接標識抗体でＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αを検出した。その結果、図１ｄ～図１ｆに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９＋細胞による特異的刺激後に産生したＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのサイトカインレベルは明らかに回復し、上昇していた。これは、ＣＤ３ε細胞内領域のＩＴＡＭモチーフがサイトカインの産生に対し重要な阻害作用を有することを意味している。しかし、注意すべき点として、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が分泌したサイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αは、依然としてａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかにやや少なかった（図１ｅ～図１ｆ）。よって、マクロファージ及び単球の活性化によるＩＬ－１β及びＩＬ－６といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
【0135】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ試薬キットの説明書に従い操作して、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ６７－ＡＰＣ抗体により染色してから、Ｋｉ６７の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図１ｇに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞による刺激後の増殖速度が、持続的に一定時間は終始ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも速く、ひいてはａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも速かった。即ち、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力が最も強かった。
【0136】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触
を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＡＰＣ試薬キットの説明書に従って染色してから、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ）の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図１ｈに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞による刺激から持続的に一定時間は、アポトーシスレベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに低かった。
を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＡＰＣ試薬キットの説明書に従って染色してから、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ）の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図１ｈに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞による刺激から持続的に一定時間は、アポトーシスレベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに低かった。
【0137】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体により染色して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生存数を検出した。その結果、図１ｉに示すように、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞による刺激後は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存数が最も多く、その次がａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞となり、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存数が最も少なかった。これは、ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続的生存能力が最も強いことを意味している。
【0138】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を１６４０無血清培地に再懸濁したあと、１×ＣｅｌｌＴｒａｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｄｙｅで予め染色した（３７℃のウォーターバス、３０ｍｉｎ）。続いて、１６４０無血清培地を１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９（ＩＲＥＳ ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞と１：１で混合して標的細胞とした。そして、ＣＡＲ－Ｔ細胞を当該混合型標的細胞と３：１、１：１、１：３の割合で混合し、丸底の９６ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージとＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」をＮとした。Ｎ値は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「Ｎ０＝ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合Ｎ／Ｎ０を算出した。即ち、殺傷率の式は「Ｌｙｓｉｓ（％）＝１－Ｎ／Ｎ０」とした。その結果、図１ｊに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の三者は、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する殺傷毒性が同等であった。
【0139】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で１．５ｍｌのＥＰチューブに移植し、均一に混合したあと、４℃で遠心分離（５００ｇ、２ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促
進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の８％ＰＦＡを加えて室温で５ｍｉｎ固定したあと、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来ｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（図１ｋ）、ウサギ由来ｐＡＫＴＳ４７３（図１ｌ）及びウサギ由来一次抗体ｐＳ６Ｓ２３５／２３６（図１ｍ）をそれぞれ一次抗体染色し、１回洗浄したあと、Ａｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体染色し、１回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図１ｋ～図１ｍに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原による特異的刺激後のｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４及びｐＳ６Ｓ２３５／２３６の全体レベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。また、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＡＫＴＳ４７３リン酸化レベルは、いずれもａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。なお、キメラ抗原受容体ＣＡＲの抗原活性化後のシグナル伝達経路のうち、Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナル経路のシグナル分子セリン／トレオニンプロテインキナーゼＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４のリン酸化レベルと、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路のセリン／トレオニンキナーゼＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、２つの経路の下流のシグナル分子であるリボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら３つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の８％ＰＦＡを加えて室温で５ｍｉｎ固定したあと、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来ｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（図１ｋ）、ウサギ由来ｐＡＫＴＳ４７３（図１ｌ）及びウサギ由来一次抗体ｐＳ６Ｓ２３５／２３６（図１ｍ）をそれぞれ一次抗体染色し、１回洗浄したあと、Ａｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体染色し、１回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図１ｋ～図１ｍに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原による特異的刺激後のｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４及びｐＳ６Ｓ２３５／２３６の全体レベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。また、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＡＫＴＳ４７３リン酸化レベルは、いずれもａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。なお、キメラ抗原受容体ＣＡＲの抗原活性化後のシグナル伝達経路のうち、Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナル経路のシグナル分子セリン／トレオニンプロテインキナーゼＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４のリン酸化レベルと、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路のセリン／トレオニンキナーゼＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、２つの経路の下流のシグナル分子であるリボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら３つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
【0140】
実験データの処理方法：
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２を使用して、データの統計分析を行い、Ｐ＜０．０５（具体的には、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはＭｅａｎ±ＳＤで示した。
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２を使用して、データの統計分析を行い、Ｐ＜０．０５（具体的には、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはＭｅａｎ±ＳＤで示した。
【0141】
【0142】
【0143】
図１ｉでは、二元配置分散分析行った。
【0144】
実験結果：
（１）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ受容体の膜上レベル及びＣＤ４／ＣＤ８比が同等であった。
（１）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ受容体の膜上レベル及びＣＤ４／ＣＤ８比が同等であった。
【0145】
（２）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が産生したＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのサイトカインレベルは明らかに回復し、上昇した。これは、ＣＤ３ε細胞内領域のＩＴＡＭモチーフがサイトカインの産生に対し重要な阻害作用を有することを意味している。しかし、注意すべき点として、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が分泌したこれらのサイトカインは、依然として、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかにやや少なかった（図１ｅ～図１ｆ）。よって、マク
ロファージ及び単球の活性化によるＩＬ－１β及びＩＬ－６といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
ロファージ及び単球の活性化によるＩＬ－１β及びＩＬ－６といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
【0146】
（３）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して増殖能力（即ち、Ｋｉ６７の発現レベル）を測定したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力が最も良好であった。
【0147】
（４）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してアポトーシスレベル（アネキシンＶで示す）を測定したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスレベルは、いずれもａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに低かった。
【0148】
（５）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、増幅したＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を測定したところ、時間の経過に伴って、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の数は、持続的にａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。
【0149】
（６）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ＣＤ１９＋Ｋ５６２：ＣＤ１９－Ｋ５６２を共培養するインビトロ殺傷実験において、ａｎｔｉ－ＣＤ１９
ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８ＺＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。
ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８ＺＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。
【0150】
（７）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、シグナル分子セリン／トレオニンプロテインキナーゼＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、セリン／トレオニンキナーゼＡＫＴＳ４７３及びリボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルを測定した。すると、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原による特異的刺激後のｐＥｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４及びｐＳ６Ｓ２３５／２３６の全体レベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。且つ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＡＫＴＳ４７３リン酸化レベルは、いずれもａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。キメラ抗原受容体ＣＡＲの抗原活性化後のシグナル伝達経路全体のうち、Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナル経路のシグナル分子Ｅｒｋ（１／２）Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４のリン酸化レベルと、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路のＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、２つの経路の下流の共有シグナル分子であるリボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら３つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
【0151】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｅ２８Ｚ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体内における抗皮下腫瘍能力を比較する実験計画は次の通りであった。
【0152】
無菌操作により、３×１０７／ｍｌのＲａｊｉ細胞－ＰＢＳ再懸濁液を準備した。そして、６週齢の各Ｂ－ＮＤＧ雌マウスの左側背部に１００μｌ・３百万個のＲａｊｉ細胞を皮下移植し、この時点をｄａｙ０とした。そして、６日後に、Ｒａｊｉ皮下腫瘍が直径６～７ｍｍまで成長した時点で、マウスをランダムに３群（ＥＹＦ２８Ｚ群、Ｅ２８Ｚ群、２８Ｚ群、ｖｅｃｔｏｒ群）に群分けし、各マウスの尾静脈に１００ｕｌ・８百万個のＴ細胞を注射した。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、腫瘍データ及びマウスの生存期間を記録した。また、腫瘍面積＝長さ×幅とした。
【0153】
実験の結論：ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＹＦ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗腫瘍能力を有していた。
【実施例2】
【0154】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９２８Ｚ ＣＡＲの配列は、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域及びＣＤ３ζ細胞内領域という構造（即ち、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．実験室がＮＣＢＩで共有する配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ８５２９５２．１）を含む。遺伝子合成によりａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲを取得し、これをベースに、図２ａに示すＣＡＲ構造の配列を設計した。そして、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドを介して、ｅＧＦＰ及びＣＡＲ配列を同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に連結してコードした。よって、ＣＡＲの発現レベルは、ｅＧＦＰの発現量／蛍光強度で示すことができた。また、重複伸長ＰＣＲ技術に基づいて、ＣＤ３ε細胞内セグメントのＢＲＳモチーフをＣＤ２８膜貫通領域の後方に挿入することで、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲと称する新型のＣＡＲを作製した。
【0155】
合成により取得したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す通りである。具体的には、以下とする。
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧ
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【0156】
ＣＡＲをレンチウイルス発現プラスミドｐＨＡＧＥベクターにサブクローニングし、ＣＡＲ発現プラスミドとパッケージングプラスミドｐＳＰＡＸ２及びｐＭＤ２Ｇをそれぞれ１０：７．５：３．５の割合で混合したあと、リン酸カルシウムトランスフェクション手法で２９３ＦＴ細胞に導入し、レンチウイルス粒子を生成した。次に、超高速遠心分離手法を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ又はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲをそれぞれ発現したレンチウイルスを濃縮して小体積・高力価ウイルス（～１０８ＩＵ／ｍｌ）としたあと、αＣＤ３／αＣＤ２８ Ａｂ－ｂｅａｄｓで１日活性化した初代Ｔ細胞（ＭＯＩ＝１０）にそれぞれトランスフェクションした。Ｔ細胞完全培地（ＸＩＶＯ－１５＋１％Ｐ．Ｓ．＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５＋５％ Ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ，１０ｍＭ ｎｅｕｔｒａｌｉ
ｚｅｄ ＮＡＣ）を用いた初代Ｔ細胞の培養期間は、ウイルスを１日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で４日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から５日目に、ＣＡＲ発現量（ｅＧＦＰ蛍光強度で表示）が同じＣＡＲ－Ｔ細胞を分別し、取得したＴ－細胞を、それぞれ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、ＣＡＲの膜上レベル、ＣＤ４とＣＤ８のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をＣＡＲ－Ｔについて行った。
ｚｅｄ ＮＡＣ）を用いた初代Ｔ細胞の培養期間は、ウイルスを１日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で４日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から５日目に、ＣＡＲ発現量（ｅＧＦＰ蛍光強度で表示）が同じＣＡＲ－Ｔ細胞を分別し、取得したＴ－細胞を、それぞれ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、ＣＡＲの膜上レベル、ＣＤ４とＣＤ８のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をＣＡＲ－Ｔについて行った。
【0157】
指標検出方法及び結果について：
取得したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲの構造は図２ａに示す通りであった。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ヒトＣＤ３ε細胞内塩基性リッチな領域のモチーフはＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。
取得したａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲの構造は図２ａに示す通りであった。図中のＦＭＣ６３は、ＣＤ１９抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）及び膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ）はヒトＣＤ２８由来である。ヒトＣＤ３ε細胞内塩基性リッチな領域のモチーフはＣＤ２８膜貫通領域の後方且つＣＤ２８細胞内領域の前方に挿入した。
【0158】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ抗体を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の膜表面におけるＣＡＲレベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図２ｂに示す。これより、両者のＣＡＲ陽性率及び発現量（ＭＦＩ）に差がないことが示された。
【0159】
ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体を用い、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図２ｃに示す。これより、両者のＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合は類似していることが示された。
【0160】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の６時間前に１×ＢＦＡを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にＰＢＳでサンプルを１回洗浄した。その後、４％ＰＦＡを用いて室温で５ｍｉｎ固定し、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行い、対応する直接標識抗体でＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αを検出した。その結果、図２ｄ、図２ｅ及び図２ｆに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９＋細胞で特異的に刺激したあと産生されたＩＬ－２及びＴＮＦ－αのサイトカインレベルは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と類似していたが、ＩＦＮ－γのサイトカインレベルはａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低下していた。
【0161】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回
収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ試薬キットの説明書に従い操作して、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ６７－ＡＰＣ抗体により染色してから、Ｋｉ６７の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図２ｇに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあと、持続的に一定時間は終始ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも増殖が速かった。
収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ試薬キットの説明書に従い操作して、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ６７－ＡＰＣ抗体により染色してから、Ｋｉ６７の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図２ｇに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあと、持続的に一定時間は終始ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも増殖が速かった。
【0162】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＡＰＣ試薬キットの説明書に従って染色してから、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるアネキシンＶの発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図２ｈに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞で刺激したあと、後期のアポトーシスレベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに低くなった。
【0163】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で丸底の９６ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとＰＢＳでサンプルを１回洗浄し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ及びａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体により染色して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生存数を検出した。その結果、図２ｉに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞による刺激後の生存数がａｎｔｉ－ＣＤ１９
２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに多かった。
２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに多かった。
【0164】
１０万個のａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＣＤ１９＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉと１：１の割合で１．５ｍｌのＥＰチューブに移植し、均一に混合したあと、４℃で遠心分離（５００ｇ、２ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の８％ＰＦＡを加えて室温で５ｍｉｎ固定したあと、０．１％トリトンＸ－１００を用いて室温で５ｍｉｎ穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来ｐＡＫＴＳ４７３（図２ｊ）及びウサギ由来一次抗体ｐＳ６Ｓ２３５／２３６（図２ｋ）を一次抗体染色し、１回洗浄したあと、Ａｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体染色し、１回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図２ｊ及び図２ｋに示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原による特異的刺激後のｐＡＫＴＳ４７３及びｐＳ６Ｓ２３５／２３６の全体レベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。なお、シグナル分子ＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルは細胞の増殖・生存能力の促進を示し、シグナル分子リボソームタンパク質Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら２つの指標は、シグナル経路の面から、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖・生存能力が比較的良好なことを示していた。
【0165】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、
ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を１６４０無血清培地に再懸濁したあと、１×ＣｅｌｌＴｒａｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｄｙｅで予め染色した（３７℃のウォーターバス、３０ｍｉｎ）。続いて、１６４０無血清培地を１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９（ＩＲＥＳ ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞と１：１で混合して標的細胞とした。そして、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を当該混合型標的細胞とそれぞれ３：１、１：１、１：３の割合で混合し、丸底の９６ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージとＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」をＮとした。Ｎ値は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞又はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「Ｎ０＝ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合Ｎ／Ｎ０を算出した。即ち、殺傷率の式は「Ｌｙｓｉｓ（％）＝１－Ｎ／Ｎ０」とした。その結果、図２ｌに示すように、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であることが示された。
ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を１６４０無血清培地に再懸濁したあと、１×ＣｅｌｌＴｒａｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｄｙｅで予め染色した（３７℃のウォーターバス、３０ｍｉｎ）。続いて、１６４０無血清培地を１回洗浄し、Ｔ細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９（ＩＲＥＳ ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞と１：１で混合して標的細胞とした。そして、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を当該混合型標的細胞とそれぞれ３：１、１：１、１：３の割合で混合し、丸底の９６ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離（４００ｇ、１ｍｉｎ）にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、３７℃のインキュベーター内で１日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージとＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」をＮとした。Ｎ値は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞又はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「Ｎ０＝ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞（ＡＰＣ＋、ｍＣｈｅｒｒｙ－）のパーセンテージ／ＣＤ１９＋Ｋ５６２＿ＣＤ１９細胞（ＡＰＣ－、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合Ｎ／Ｎ０を算出した。即ち、殺傷率の式は「Ｌｙｓｉｓ（％）＝１－Ｎ／Ｎ０」とした。その結果、図２ｌに示すように、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対するａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性は、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であることが示された。
【0166】
実験データの処理方法：
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２を使用して、データの統計分析を行い、Ｐ＜０．０５（具体的には、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはＭｅａｎ±ＳＤで示した。
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２を使用して、データの統計分析を行い、Ｐ＜０．０５（具体的には、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはＭｅａｎ±ＳＤで示した。
【0167】
【0168】
【0169】
図２ｉでは、二元配置分散分析行った。
【0170】
実験結果：
（１）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の膜上レベル及びＣＤ４／ＣＤ８比は同等であった。
（１）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の膜上レベル及びＣＤ４／ＣＤ８比は同等であった。
【0171】
（２）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が産生したＩＬ－２及びＴＮＦ－αのサイトカインレベルは、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と類似していたが、ＩＦＮ－γのサイトカインレベルはａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低下した。
【0172】
（３）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して増殖能力（即ち、Ｋｉ６７の発現レ
ベル）を測定したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔの増殖能力はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。
ベル）を測定したところ、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔの増殖能力はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高かった。
【0173】
（４）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してアポトーシスレベルを測定した。そして、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較したところ、前期は両者が同等であったが、後期には、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスレベルがａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに低くなった。
【0174】
（５）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、増幅したＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を測定したところ、時間の経過に伴って、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の数はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高くなった。
【0175】
（６）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してシグナル分子ＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルを測定した。なお、シグナル分子ＡＫＴＳ４７３のリン酸化レベルは、細胞の増殖・生存能力の促進を示す。すると、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の全体的なｐＡＫＴＳ４７３レベルはａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高く、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖・生存能力がａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高いことが示された。
【0176】
（７）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してシグナル分子Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルを測定した。なお、シグナル分子Ｓ６Ｓ２３５／２３６のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖能力を示す。すると、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の全体的なｐＳ６Ｓ２３５／２３６レベルはａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高く、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の成長・増殖能力がａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに高いことが示された。
【0177】
（８）ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ＣＤ１９＋Ｋ５６２：ＣＤ１９－Ｋ５６２を共培養するインビトロ殺傷実験において、ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力はａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。
【0178】
ａｎｔｉ－ＣＤ１９ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とａｎｔｉ－ＣＤ１９ ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の体内における抗皮下腫瘍能力を比較する実験計画は次の通りであった。
【0179】
無菌操作により、３×１０７／ｍｌのＲａｊｉ細胞－ＰＢＳ再懸濁液を準備した。そして、６週齢の各Ｂ－ＮＤＧ雌マウスの左側背部に１００μｌ・３百万個のＲａｊｉ細胞を皮下移植し、この時点をｄａｙ０とした。そして、６日後に、Ｒａｊｉ皮下腫瘍が直径６～７ｍｍまで成長した時点で、マウスをランダムに３群（ＥＢＲＳ２８Ｚ群、２８Ｚ群、ｖｅｃｔｏｒ群）に群分けし、各マウスの尾静脈に１００ｕｌ・８百万個のＴ細胞を注射した。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、腫瘍データ及びマウスの生存期間を記録した。また、腫瘍面積＝長さ×幅とした。
【0180】
実験の結論：ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＥＢＲＳ２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔは抗腫瘍能力を有していた。
【0181】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的及び実質的になんら制限するものではない。指摘すべき点として、当業者であれば、本発明の方法を逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であって、これらの改良及び補足もまた本発明の保護の範囲とみなすべきである。本専門分野を熟知した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、改変及び変形の等価の変更は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記の実施例に対し実施される任意の等価の変更の修正、改変及び変形は、いずれも本発明の技術方案の範囲に属する。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図1i】
【図1j】
【図1k】
【図1l】
【図1m】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図2j】
【図2k】
【図2l】
【配列表】
【国際調査報告】