特表 2023-537902 大型鏡像タンパク質の化学合成及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-06

(54)【発明の名称】大型鏡像タンパク質の化学合成及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20230830BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20230830BHJP

   C07K 1/04 20060101ALI20230830BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20230830BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20230830BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230830BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230830BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20230830BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230830BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230830BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z

C12N9/10 ZNA

C07K1/04

C07K2/00

C12Q1/6876 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C12M1/00 A

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023507742

(86)(22)【出願日】2021-05-13

(85)【翻訳文提出日】2023-03-24

(86)【国際出願番号】 IB2021054106

(87)【国際公開番号】W WO2022029512

(87)【国際公開日】2022-02-10

(31)【優先権主張番号】63/061,844

(32)【優先日】2020-08-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513322718

【氏名又は名称】清華大学

【氏名又は名称原語表記】ＴＳＩＮＧＨＵＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】１ Ｑｉｎｇｈｕａｙｕａｎ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジュー ティン

(72)【発明者】

【氏名】ファン チュヤオ

(72)【発明者】

【氏名】デン チアン

(72)【発明者】

【氏名】シュー ユアン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029FA10

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS32

4B063QX02

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045AA40

4H045DA89

4H045EA50

4H045FA33

4H045FA34

(57)【要約】

ＲＮＡ／ＤＮＡを操作する酵素を含む、大型の（４００ａａ長を超える）Ｄ－アミノ酸タンパク質であって、（その天然に存在するＬ－アミノ酸対応物に対して）鏡像タンパク質とも称されるもの、を製造するための一般的な方法、並びに広範囲にわたる研究、実用的なデータストレージ及び医薬利用におけるその使用が提供される。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質を化学的に製造する方法であって、前記タンパク質の少なくとも２つのライゲーション誘導性セグメントを連結することを含み、前記ライゲーション誘導性セグメントの各々が化学的に合成可能であり、且つ
ｉ．前記タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、前記タンパク質の前記アミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数のライゲーション誘導性セグメントを得ること、及び
ｉｉ．前記ライゲーション誘導性セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること、
ｉｉｉ．前記ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、前記構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、前記構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入し、前記タンパク質の前記アミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースし、そして前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること
によって得ることが可能な、方法。

【請求項2】

ステップ（ｉ）において、前記ライゲーション誘導性配列の少なくとも１つが前記タンパク質中の構造喪失セクションにある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｉｉｉ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（ｉ）の前に、
ａ）前記タンパク質の前記アミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割すること、
ｂ）前記ドメイン形成セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、前記ドメイン形成セグメントの各々を化学的に合成すること、及び
ｃ）前記ドメイン形成セグメントを一緒に折り畳み、それにより前記タンパク質を得ること
を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ａ）を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ドメイン形成セグメントの１つが化学的に合成可能でない場合、
ｄ）前記ドメイン形成セグメント中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、そして前記ドメイン形成セグメントのアミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数の化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントを得、
ｅ）前記ドメイン形成セグメントが本質的にライゲーション誘導性配列を欠いている場合、又は前記ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、前記ドメイン形成セグメント又は前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、
ｆ）前記構造喪失セクション又は前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、前記構造喪失セクション又は前記ライゲーション誘導性セグメント中にライゲーション誘導性配列を導入し、そして前記ドメイン形成セグメントの前記アミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースすることにより、化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントの複数の配列を得、 ｇ）前記化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成する、
請求項４に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ｆ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記タンパク質が、対応する生物学的に製造されたタンパク質の活性の少なくとも５％を呈する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記活性が、触媒活性、特異的結合活性及び構造活性からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記タンパク質が少なくとも２４０アミノ酸残基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記タンパク質が少なくとも約４００アミノ酸残基を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ライゲーション誘導性セグメントの少なくとも１つにおいて、以下の疎水性の順序：Ｉｌｅ＞Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ＞Ｖａｌ＞Ｍｅｔ＞Ｐｒｏ＞Ｔｒｐ＞Ｈｉｓ（０）＞Ｔｈｒ＞Ｇｌｕ（０）＞Ｇｌｎ＞Ｃｙｓ＞Ｔｙｒ＞Ａｌａ＞Ｓｅｒ＞Ａｓｎ＞Ａｓｐ（０）＞Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｈｉｓ＋＞Ｇｌｕ＞Ｌｙｓ＋＞Ａｓｐ－に従い、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基をより疎水性の低いアミノ酸で置換することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記タンパク質が、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して製造される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記タンパク質が、対応する生物学的に製造されたタンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

少なくとも１つのＩｌｅ残基を、Ｄ－Ａｌａ残基、Ｄ－Ｖａｌ残基、Ｄ－Ｌｅｕ残基、Ｄ－Ｔｈｒ残基、Ｄ－Ｐｈｅ残基、Ｄ－Ｍｅｔ残基、Ｇｌｙ残基及びＤ－Ｐｒｏ残基からなる群から選択されるＤ－アミノ酸残基で置換することを更に含む、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって調製されるタンパク質であって、少なくとも約２４０アミノ酸残基長であるタンパク質。

【請求項17】

非共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である少なくとも２つのドメイン形成セグメントを含み、前記ドメイン形成セグメントが、少なくとも１つの対応する生物学的に製造されたタンパク質中における共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である、請求項１６に記載のタンパク質。

【請求項18】

酵素、輸送タンパク質、構造／機構タンパク質、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、抗体、体液平衡化タンパク質、ｐＨ平衡化タンパク質、細胞チャネル及び細胞ポンプからなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載のタンパク質。

【請求項19】

酵素であり、前記酵素が、対応する生物学的に製造された酵素によって触媒される反応を触媒することができる、請求項１８に記載のタンパク質。

【請求項20】

前記酵素が、ＤＮＡテンプレートを用いてリボヌクレオチドからＲＮＡを合成することができるＲＮＡポリメラーゼである、請求項１９に記載のタンパク質。

【請求項21】

前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項２０に記載のタンパク質。

【請求項22】

前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している、請求項２１に記載のタンパク質。

【請求項23】

前記酵素が、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成することができるＤＮＡポリメラーゼである、請求項１９に記載のタンパク質。

【請求項24】

前記ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２３に記載のタンパク質。

【請求項25】

Ｄ－アミノ酸タンパク質を化学的に製造する方法であって、前記Ｄ－アミノ酸タンパク質の少なくとも２つのライゲーション誘導性セグメントを連結することを含み、前記ライゲーション誘導性セグメントの各々が少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を含み、且つ化学的に合成可能であり、且つ
ｉ．対応するＬ－アミノ酸タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、前記アミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数のライゲーション誘導性セグメントを得ること、及び
ｉｉ．前記ライゲーション誘導性セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること、
ｉｉｉ．前記ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、前記構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、前記構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入し、前記ライゲーション誘導性セグメントのアミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースし、そして少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること
によって得ることが可能な、方法。

【請求項26】

ステップ（ｉ）において、前記ライゲーション誘導性配列の少なくとも１つが、前記対応するＬ－アミノ酸タンパク質中の構造喪失セクションにある、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ステップ（ｉｉｉ）を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

ステップ（ｉ）の前に、
ａ）前記Ｌ－アミノ酸タンパク質の前記アミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割すること、
ｂ）前記ドメイン形成セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して前記ドメイン形成セグメントの各々を化学的に合成すること、及び
ｃ）前記ドメイン形成セグメントを一緒に折り畳み、それにより前記Ｄ－アミノ酸タンパク質を得ること
を更に含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記ドメイン形成セグメントの１つが化学的に合成可能でない場合、
ｄ）前記ドメイン形成セグメント中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、そして前記ドメイン形成セグメントのアミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数の化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントを得、
ｅ）前記ドメイン形成セグメントが本質的にライゲーション誘導性配列を欠いている場合又は前記ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、前記ドメイン形成セグメント又は前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、
ｆ）前記構造喪失セクション又は前記ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、前記構造喪失セクション又は前記ライゲーション誘導性セグメントにライゲーション誘導性配列を導入し、そして前記ドメイン形成セグメントの前記アミノ酸配列を前記ライゲーション誘導性配列でパースし、
ｇ）少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成し、それにより前記ドメイン形成セグメントを得る、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ステップ（ｉｉｉ）を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

前記Ｄ－アミノ酸タンパク質が前記Ｌ－アミノ酸タンパク質の活性の少なくとも１０％を呈する、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記活性が、触媒活性、特異的結合活性及び構造活性からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記Ｄ－アミノ酸タンパク質が少なくとも２４０アミノ酸残基を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｄ－アミノ酸タンパク質が少なくとも４００アミノ酸残基を含む、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ライゲーション誘導性セグメントの少なくとも１つにおいて、以下の疎水性の順序：Ｄ－Ｉｌｅ＞Ｄ－Ｌｅｕ＞Ｄ－Ｐｈｅ＞Ｄ－Ｖａｌ＞Ｄ－Ｍｅｔ＞Ｄ－Ｐｒｏ＞Ｄ－Ｔｒｐ＞Ｄ－Ｈｉｓ（０）＞Ｄ－Ｔｈｒ＞Ｄ－Ｇｌｕ（０）＞Ｄ－Ｇｌｎ＞Ｄ－Ｃｙｓ＞Ｄ－Ｔｙｒ＞Ｄ－Ａｌａ＞Ｄ－Ｓｅｒ＞Ｄ－Ａｓｎ＞Ｄ－Ａｓｐ（０）＞Ｄ－Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｄ－Ｈｉｓ＋＞Ｄ－Ｇｌｕ＞Ｄ－Ｌｙｓ＋＞Ｄ－Ａｓｐ－に従い、少なくとも１つの疎水性Ｄ－アミノ酸残基をより疎水性の低いアミノ酸で置換することを更に含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記Ｄ－アミノ酸タンパク質が、前記Ｌ－アミノ酸タンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を有する、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

少なくとも１つのＩｌｅ残基を、Ｄ－Ａｌａ残基、Ｄ－Ｖａｌ残基、Ｄ－Ｌｅｕ残基、Ｄ－Ｔｈｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｄ－Ｐｈｅ残基、Ｄ－Ｍｅｔ残基及びＤ－Ｐｒｏ残基からなる群から選択されるＤ－アミノ酸残基で置換することを更に含む、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって調製されるＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項39】

対応するＬ－アミノ酸タンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を有している、請求項３８に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項40】

非共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である少なくとも２つのドメイン形成セグメントを含み、前記ドメイン形成セグメントが、少なくとも１つの対応するＬ－アミノ酸タンパク質中における共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である、請求項３８又は３９に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項41】

酵素、輸送タンパク質、構造／機構タンパク質、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、抗体、体液平衡化タンパク質、ｐＨ平衡化タンパク質、細胞チャネル及び細胞ポンプからなる群から選択される、請求項３８又は３９に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項42】

Ｄ－アミノ酸酵素であり、前記酵素が、対応するＬ－アミノ酸酵素と比較してエナンチオマー反応を触媒することができる、請求項４１に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項43】

前記Ｄ－アミノ酸酵素が、Ｌ－ＤＮＡテンプレートを使用してＬ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼである、請求項４２に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項44】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼがＤ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＤ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項４３に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項45】

前記Ｄ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項４４に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項46】

少なくとも１つの分裂部位と、Ｋ３６３とＰ３６４との間の第１の分裂部位と、Ｎ６０１とＴ６０２との間の第２の分裂部位とを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項４４に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項47】

前記分裂部位が、３５７位～３６６位及び／又は５６４位～６０７位に位置するように選択される、請求項４６に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項48】

前記Ｄ－アミノ酸酵素が、Ｌ－デオキシリボヌクレオチドからＬ－ＤＮＡを合成することができるＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４２に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項49】

前記Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼがＤ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４８に記載のＤ－アミノ酸タンパク質。

【請求項50】

Ｋ３６３とＰ３６４との間の分裂及び／又はＮ６０１とＴ６０２との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項51】

Ｉ６Ｖ、Ｉ１４Ｌ、Ｉ７４Ｖ、Ｉ８２Ｖ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ１１７Ｌ、Ｉ１４１Ｖ、Ｉ２１０Ｍ、Ｉ２４４Ｌ、Ｉ２８１Ｖ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３２２Ｌ、Ｉ３３０Ｖ及びＩ３６７Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む、請求項５０に記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項52】

配列番号８３と比較して少なくとも８０～９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。

【請求項53】

Ｋ４６７とＭ４６８との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項54】

Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ及びＩ５４０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む、請求項５３に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項55】

Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む、請求項４４、５３、又は５４のいずれか一項に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項56】

Ｄ２１５Ａ、Ａ４８６Ｙ及びＬ４９０Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの変異（配列番号７７）を更に含む、請求項４４、５３、又は５４に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項57】

ＤＮＡ結合構造ドメインを更に含み、前記ＤＮＡ結合構造ドメインがｓｓｏ７ｄ構造ドメイン（配列番号７８）である、請求項４４、５３、又は５４に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項58】

ＲＮＡ重合活性を呈する、請求項５５に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項59】

３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性の欠損及びジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）選択性の増加を呈する、請求項５６に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項60】

増幅速度及び伸長能力の向上を呈する、請求項５７に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項61】

配列番号５１と比較して少なくとも８０～９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７９と比較して少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有する、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項62】

Ｄ－アミノ酸タンパク質の使用であって、前記Ｄ－アミノ酸タンパク質が、対応するＬ－アミノ酸酵素によって合成される分子のエナンチオモルフである産物の合成を触媒する、又は対応するＬ－アミノ酸酵素の対応する基質のエナンチオモルフである基質の反応を触媒する酵素である、請求項３８に記載のＤ－アミノ酸タンパク質の使用。

【請求項63】

Ｌ－ポリデオキシリボ核酸分子を酵素的に製造するプロセスであって、
請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって調製され、且つＬ－デオキシリボヌクレオチドからＬ－ＤＮＡを合成することができる、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼを提供すること、及び
前記Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼをテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡプライマー及び複数のＬ－デオキシリボヌクレオチドと反応させて、前記Ｌ－ＤＮＡ分子を酵素的に製造すること
を含む、プロセス。

【請求項64】

前記Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６３に記載のプロセス。

【請求項65】

前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、本質的に本明細書で提供するとおりである、請求項６４に記載のプロセス。

【請求項66】

Ｌ－ポリリボ核酸（Ｌ－ＲＮＡ）分子を酵素的に製造するプロセスであって、
請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって調製され、且つＬ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを提供すること、及び
前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼをテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡ／ＲＮＡプライマー及び複数のＬ－リボヌクレオチドと反応させ、前記Ｌ－ＲＮＡ分子を酵素的に製造すること
を含む、プロセス。

【請求項67】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体であり、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している、請求項６６に記載のプロセス。

【請求項68】

前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、本質的に本明細書で提供するとおりである、請求項６７に記載のプロセス。

【請求項69】

ラセミ結晶を形成する方法であって、目的の分子及び前記目的の分子のエナンチオモルフを共結晶化させ、それによりエナンチオマー対の前記ラセミ結晶を形成することを含み、前記目的の分子の前記エナンチオモルフが、請求項３８に記載のＤ－アミノ酸タンパク質又はその産物である、方法。

【請求項70】

請求項３８に記載のＤ－アミノ酸タンパク質を含む分子プローブであって、それに取り付けられた標識部分を有し、且つ分析物に対する親和性を有し、前記分析物が対応するＬ－アミノ酸タンパク質の対応する分析物のエナンチオモルフである、分子プローブ。

【請求項71】

Ｌ－核酸アプタマー又はＤ－ペプチド結合部分を製造する方法であって、
請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって調製されるＤ－アミノ酸タンパク質を提供すること、及び
前記Ｄ－アミノ酸タンパク質を試験管内進化法に供すること
を含み、それにより前記Ｌ－核酸アプタマー又はＤ－ペプチド結合部分を得る、方法。

【請求項72】

ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を増幅する方法であって、前記ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のテンプレートを、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって調製したＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含み、前記反応が、本質的に天然酵素及び／又は天然ＤＮＡ／ＲＮＡの混入なしに達成される、方法。

【請求項73】

本明細書で提供するとおりのＤ－アミノ酸ＤＮＡ又はＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼと、ホスホロチオエート Ｌ－ｄＮＴＰ又はホスホロチオエート Ｌ－ＮＴＰと、２つの異なる色素で５’－標識された２つのプライマーとを使用して、Ｌ－ＤＮＡ又はＬ－ＲＮＡをシーケンシングする方法。

【請求項74】

本明細書で提供するとおりのＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと、Ｌ－ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、２つの異なる色素で５’－標識された２つのプライマーとを使用して、Ｌ－ＤＮＡをシーケンシングする方法。

【請求項75】

前記色素がＦＡＭ及びＣｙ５である、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項76】

データストレージシステムであって、
情報データをコードする配列を有する少なくとも１つのＬ－核酸分子と、
前記Ｌ－ＤＮＡ分子を合成及び／又はシーケンシングするためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
を含むデータストレージシステム。

【請求項77】

前記Ｌ－核酸分子が化学的に調製されたか、又は鏡像酵素触媒反応によって調製されたものである、請求項７６に記載のシステム。

【請求項78】

前記Ｌ－核酸分子が化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる、請求項７６に記載のシステム。

【請求項79】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７６に記載のシステム。

【請求項80】

前記Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼが、請求項５３～６１のいずれか一項に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項７６に記載のシステム。

【請求項81】

キラル・ステガノグラフィー手法であって、
カバー情報データをコードする配列を有する少なくとも１つのＤ－核酸分子と、
ステゴ情報データを解読するための暗号鍵をコードする配列を有する少なくとも１つのＬ－核酸分子及び／又はＤ－／Ｌ－キメラ核酸分子と、
前記Ｌ－ＤＮＡ分子を合成及び／又はシーケンシングするためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造されたＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
を含む、キラル・ステガノグラフィー手法。

【請求項82】

前記Ｌ－核酸分子が化学的に調製されたもの、又は鏡像酵素触媒反応によって調製されたものである、請求項８１に記載のシステム。

【請求項83】

前記Ｌ－核酸分子が化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる、請求項８１に記載のシステム。

【請求項84】

前記Ｄ－／Ｌ－キメラ核酸分子が化学的に調製されたもの、又は天然／鏡像酵素触媒反応によって調製されたものである、請求項８１に記載のシステム。

【請求項85】

Ｄ－／Ｌ－キメラ核酸分子のＬ－ＤＮＡ／ＲＮＡ部分が化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる、請求項８１に記載のシステム。

【請求項86】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８１に記載のシステム。

【請求項87】

前記Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼが、請求項５３～６１のいずれか一項に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項８１に記載のシステム。

【請求項88】

ＤＮＡクリプトグラフィーと組み合わされて、暗号化されたデータを使用した追加のセキュリティ層を提供し得る、請求項８１に記載のシステム。

【請求項89】

Ｌ－ＲＮＡの加水分解を研究する方法であって、
高次化構造及び長い鎖長の配列を有する少なくとも１つのＬ－ＲＮＡ分子と、
前記Ｌ－ＲＮＡ分子を合成するためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
を含む方法。

【請求項90】

ＲＮＡ分解を研究する方法であって、
高次化構造及び長い鎖長の配列を有する少なくとも１つのＬ－ＲＮＡ分子と、
前記Ｌ－ＲＮＡ分子を合成するためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
を含む方法。

【請求項91】

ＲＮアーゼ阻害試薬の有効性を評価するために使用され得る、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを含む、転写ＡＮＤ論理。

【請求項93】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項９２に記載のシステム。

【請求項94】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１つの分裂部位と、Ｋ３６３とＰ３６４との間の第１の分裂部位と、Ｎ６０１とＴ６０２との間の第２の分裂部位とを含む、請求項９２に記載のシステム。

【請求項95】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１つの分裂部位を含み、前記部位が３５７位～３６６位及び／又は５６４位～６０７位の同じループ内にある、請求項９２に記載のシステム。

【請求項96】

Ｌ－ＲＮＡマーカー／ラダーを製造する方法であって、
Ｌ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができる、請求項１３～１５又は２５～３７のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを提供すること、及び
前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを、それぞれ長さの異なるテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡ／ＲＮＡプライマー及び複数のＬ－リボヌクレオチドと反応させること
を含み、それぞれ異なる長さのＬ－ＲＮＡ分子を酵素的に製造し、それらを精製後に一定の濃度で一緒に混合する、方法。

【請求項97】

前記Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼが、本質的に本明細書で提供するとおりのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項９６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０２０年８月６日に出願された米国仮特許出願第６３／０６１，８４４号明細書の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表に関する記載
本願の出願と同時に提出された、８７５９７＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称の２０２１年５月６日作成の１８０，２８６バイトを含むＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に援用される。

【0003】

本発明は、その一部の実施形態において、生化学に関し、より詳細には、限定されないが、大型タンパク質及びその鏡像対応物の化学的全合成のための方法並びにその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

全てが非天然のＤ－アミノ酸及びアキラルなアミノ酸であるグリシンで構成されるタンパク質は、その自然（ｎａｔｉｖｅ）のＬ－タンパク質対応物の鏡像体である。近年の化学的タンパク質合成の進歩により、ドメインサイズの鏡像Ｄ－タンパク質を独自に簡便に合成で利用できるようになったため、「鏡の国」に入り、これまで達成できなかった方法でタンパク質研究を行うことが可能となっている。Ｄ－タンパク質は、結晶化が困難なその自然のＬ体の構造決定を容易にすることができ（ラセミ体Ｘ線結晶構造解析）、Ｄ－タンパク質は、ライブラリスクリーニングのベイトとしての役割を果たし、最終的に薬理学的に優れたＤ－ペプチド／Ｄ－タンパク質治療薬をもたらすことができ（鏡像ファージディスプレイ）、さらにＤ－タンパク質は、生物学、創薬及び免疫学における分子イベントを探索する強力な機構的手段としても使用することができる。

【0005】

１６０年余り前に、パスツールが苦心して初めて酒石酸塩の左右晶を分離して以来、科学者も一般人も、生体分子が一方の利き手のみを有することに大いに興味をかき立てられてきた。近年、幾つもの理論的及び実験的調査により、恐らく前生物的ラセミ体世界であったと思われるものから、どのように一方のエナンチオマーが他方より優位を占めるようになったかについてのモデルの記述が促進されている。Blackmond, D.G.［“The Origin of Biological Homochirality”, Cold Spring Harb Perspect Biol., 2010, 2(5), a002147］は、化学的過程又は物理的過程のいずれか一方又は両方の組み合わせを含むエナンチオ濃縮機構に強調している。かかる試みを促す科学的原動力の１つは、生体分子のホモキラリティーが生命の刻印であることを踏まえて、生命の起源を理解したいという関心から生じている。他の動機は、例えば、安全なデータストレージのための、自然不透過性の分子システムを提供することのできる直交性の生物学的ツールなど、実際的及び応用科学的な関心から生じている。

【0006】

核酸の最前線では、ホスホロアミデート化学により、ＤＮＡで最大約１５０ｎｔ及びＲＮＡで約７０ｎｔのオリゴヌクレオチド（オリゴ）合成が可能となっている。タンパク質の最前線では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）とネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）との連携により、様々なタンパク質の化学的全合成を可能にする強力な方法がもたらされている（５、１４～２０）。具体的には、鏡像バージョンの１７４ａａアフリカ豚コレラウイルスポリメラーゼＸ（ＡＳＦＶ ｐｏｌ Ｘ）（５）、続いてより効率的で熱安定性の高い３５２ａａのSulfolobus solfataricus P2のＤＮＡポリメラーゼＩＶ（Ｄｐｏ４）（１７～１９）をベースとする鏡像遺伝子複製及び転写システムが実現しており、鏡像ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＩ－ＰＣＲ）並びに鏡像遺伝子転写及び逆転写の実現につながっている（２１）。詳細には、変異体バージョンのＤ－Ｄｐｏ４で完全長５Ｓ ｒＲＮＡが１２０ｎｔで酵素的に転写されており、これは、他の場合には長過ぎて化学的に合成できなかった偉業である（２１）。

【0007】

鏡像タンパク質は、構造生物学、ペプチド／タンパク質ドラッグデザイン及び生物学的過程の機構研究において幅広い応用性のある強力なツールである。化学的タンパク質合成技法がよりロバストになり、異分野の科学者にも容易に利用できるようになれば、化学的、生物学的及び生物医学的研究における鏡像タンパク質の莫大な可能性が余すところなく解放されることになるであろう。ネイティブケミカルライゲーション及び鏡像ファージディスプレイという２つの実施可能な技術は特に魅力的であり、様々なヒト疾患の治療に向けた新規クラスの薬理学的に優れたペプチド及びタンパク質治療薬の創薬に多大な影響を及ぼすことになるであろう。

【0008】

レビュー“Mirror image proteins”［Zhao, L. and Lu, W., Current Opinion in Chemical Biology, 2014, 22, pp. 56-61］は、構造生物学、創薬及び免疫学への鏡像タンパク質の応用における最近の進展を調べている。

【0009】

Hartrampf, N. et al.［“Synthesis of proteins by automated flow chemistry”, Science, 2020, 368(6494), pp. 980-987］は、３２７回の連続反応で１６４アミノ酸長のペプチド鎖を直接製造するための自動ファストフロー機器に適合する極めて高効率の化学を報告し、ここでは、酵素、構造単位及び制御因子に相当する９つの異なるタンパク質鎖の化学合成によって実証されるとおり、ペプチド鎖伸長が数時間で完了する。この研究者らは、精製及び折り畳み後、この合成材料が、生物学的に発現したタンパク質に匹敵する生物物理学的及び酵素的特性を示すことを報告しており、忠実度の高い自動化されたフロー化学、即ち自動ファストフローペプチド合成（ＡＦＰＳ）が、リボソームを用いずにシングルドメインタンパク質を製造する代替技術であることを示している。

【0010】

しかしながら、鏡像タンパク質は、依然として比較的小さいタンパク質に限られている。一方、約４００アミノ酸（ａａ）残基を超える大型タンパク質の合成を実現することは、ペプチドセグメントの合成及びライゲーション効率に限界があることを主な原因として、はるかに困難となっている。最近開発された自動ファストフローペプチド合成（ＡＦＰＳ）技術は、これまで常法どおりの標準的なＳＰＰＳによって到達可能であったものの３倍を超える長さのペプチド鎖をもたらすことができるが、一見して大型鏡像分子を合成する適切な方法論はなく、そのため、鏡像バイオロジーシステムの開発及び情報ストレージなどでのその応用は、極端に制約されている。

【発明の概要】

【0011】

本発明の態様は、そのアミノ酸残基のＬ型及びＤ型の両方の利き手で比較的大型の（４００ａａより長い）タンパク質の化学的全合成方法及び本明細書に開示される方法によって調製されるＤ－アミノ酸タンパク質への応用に関する。本発明の実施形態によれば、多重配列アラインメント及び／又は構造情報に基づき、タンパク質の機能に悪影響を及ぼすことなくアミノ酸残基を置換ること（変異）のできるアミノ酸配列中のセクションを探すことにより、大型タンパク質が生化学的巨大分子の関与又は存在なしに化学的に合成される。本明細書に開示される発明によれば、タンパク質配列への変異の導入により、タンパク質配列に分裂部位及び／又はライゲーション部位が挿入されると共に、ライゲーション誘導性ポリペプチドの疎水性も減少し、且つタンパク質中のＩｌｅ残基の数が減少することにより、Ｄ－アミノ酸タンパク質の調製コストが減少する。また、限定なしに、バイオ直交性の分子データストレージ、アプタマー開発のためのＳＥＬＥＸ及びＸ線タンパク質結晶構造解析における結晶成長戦略など、Ｄ－アミノ酸タンパク質の使用も提供される。

【0012】

このように、本発明の一部の実施形態のある態様によれば、タンパク質を化学的に製造する方法であって、タンパク質の少なくとも２つのライゲーション誘導性セグメントを連結することによって実行する方法が提供され、ここで、ライゲーション誘導性セグメントの各々は、化学的に合成可能であり、且つ
ｉ．タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、タンパク質のアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数のライゲーション誘導性セグメントを得ること、及び
ｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること、
ｉｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクション（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ－ｌｏｓｅ ｓｅｃｔｉｏｎ）を同定し、構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入し、タンパク質のアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースし、そしてライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること
によって得ることが可能である。

【0013】

本発明の一部の実施形態では、ステップ（ｉ）において、ライゲーション誘導性配列の少なくとも１つは、タンパク質中の構造喪失セクションにある。

【0014】

本発明の一部の実施形態において、本願で提供する方法は、ステップ（ｉｉｉ）を含む。

【0015】

本発明の一部の実施形態において、本願で提供する方法は、ステップ（ｉ）の前に、
ａ）タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割すること、
ｂ）ドメイン形成セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、ドメイン形成セグメントの各々を化学的に合成すること、及び
ｃ）ドメイン形成セグメントを一緒に折り畳み、それによりタンパク質を得ること
を更に含む。

【0016】

本発明の一部の実施形態において、本願で提供する方法は、タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割するステップ（ａ）を含む。

【0017】

本発明の一部の実施形態によれば、ドメイン形成セグメントの１つが化学的に合成可能でない場合、本方法は、さらに、
ｄ）ドメイン形成セグメント中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、そしてドメイン形成セグメントのアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数の化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントを得、
ｅ）ドメイン形成セグメントが本質的にライゲーション誘導性配列を欠いている場合又はライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、ドメイン形成セグメント又はライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、
ｆ）構造喪失セクション又はライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、構造喪失セクション又はライゲーション誘導性セグメント中にライゲーション誘導性配列を導入し、且つドメイン形成セグメントのアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースすることで、化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントの複数の配列を得、
ｇ）化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成する
ことによって実行する。

【0018】

本発明の一部の実施形態において、本願で提供する方法は、ステップ（ｆ）を含む。

【0019】

本発明の一部の実施形態によれば、合成タンパク質は、対応する生物学的に製造されたタンパク質の活性の少なくとも１％、５％又は少なくとも１０％を呈する。

【0020】

本発明の一部の実施形態によれば、活性は、触媒活性、特異的結合活性及び構造活性からなる群から選択される。

【0021】

本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質は、少なくとも２４０アミノ酸残基を含む。

【0022】

本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質は、少なくとも約４００アミノ酸残基を含む。

【0023】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供する方法は、ライゲーション誘導性セグメントの少なくとも１つにおいて、以下の疎水性の順序：Ｉｌｅ＞Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ＞Ｖａｌ＞Ｍｅｔ＞Ｐｒｏ＞Ｔｒｐ＞Ｈｉｓ（０）＞Ｔｈｒ＞Ｇｌｕ（０）＞Ｇｌｎ＞Ｃｙｓ＞Ｔｙｒ＞Ａｌａ＞Ｓｅｒ＞Ａｓｎ＞Ａｓｐ（０）＞Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｈｉｓ＋＞Ｇｌｕ＞Ｌｙｓ＋＞Ａｓｐ－に従い、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基をより疎水性の低いアミノ酸で置換することを更に含む。

【0024】

本発明の一部の実施形態によれば、合成タンパク質は、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して製造される。

【0025】

本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質は、対応する生物学的に製造されたタンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を有する。

【0026】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供する方法は、少なくとも１つのＩｌｅ残基を、Ｄ－Ａｌａ残基、Ｄ－Ｖａｌ残基、Ｄ－Ｌｅｕ残基、Ｄ－Ｔｈｒ残基、Ｄ－Ｐｈｅ残基、Ｄ－Ｍｅｔ残基、Ｇｌｙ残基及びＤ－Ｐｒｏ残基からなる群から選択されるＤ－アミノ酸残基で置換することを更に含む。

【0027】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本願で提供する方法によって調製されるタンパク質であって、少なくとも約２４０アミノ酸残基長であるタンパク質が提供される。

【0028】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供する化学的に合成されたタンパク質は、非共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である少なくとも２つのドメイン形成セグメントを含み、このドメイン形成セグメントは、少なくとも１つの対応する生物学的に製造されたタンパク質中における共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である。

【0029】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供するタンパク質は、酵素、輸送タンパク質、構造／機構タンパク質、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、抗体、体液平衡化タンパク質、ｐＨ平衡化タンパク質、細胞チャネル及び細胞ポンプからなる群から選択される。

【0030】

本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質は、対応する生物学的に製造された酵素によって触媒される反応を触媒することができる酵素である。

【0031】

本発明の一部の実施形態によれば、化学的に合成された酵素は、ＤＮＡテンプレートを用いてリボヌクレオチドからＲＮＡを合成することができるＲＮＡポリメラーゼである。

【0032】

本発明の一部の実施形態によれば、化学的に合成されたＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。

【0033】

本発明の一部の実施形態によれば、化学的に合成されたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している。

【0034】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ２１５Ａ、Ａ４８６Ｙ及びＬ４９０Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの変異（配列番号７７）を更に含む。

【0035】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ結合構造ドメインを更に含み、ＤＮＡ結合構造ドメインは、ｓｓｏ７ｄ構造ドメイン（配列番号７８）である。

【0036】

本発明の一部の実施形態によれば、化学的に合成された酵素は、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成することができるＤＮＡポリメラーゼである。

【0037】

本発明の一部の実施形態によれば、化学的に合成されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0038】

本発明の実施形態の別の態様によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質（鏡像タンパク質）を化学的に製造する方法であって、Ｄ－アミノ酸タンパク質の少なくとも２つのライゲーション誘導性セグメントを連結することを含む方法が提供され、ここで、ライゲーション誘導性セグメントの各々は、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を含み、且つ化学的に合成可能であり、且つ
ｉ．対応するＬ－アミノ酸タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、アミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数のライゲーション誘導性セグメントを得ること、及び
ｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用してライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること、
ｉｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、ライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入し、ライゲーション誘導性セグメントのアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースし、そして少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用してライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成すること
によって得ることが可能である。

【0039】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、ステップ（ｉ）において、ライゲーション誘導性配列の少なくとも１つが、対応するＬ－アミノ酸タンパク質中の構造喪失セクションにあることを含む。

【0040】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、ステップ（ｉｉｉ）を含む。

【0041】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、ステップ（ｉ）の前に、
ａ）Ｌ－アミノ酸タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割すること、
ｂ）ドメイン形成セグメントの各々が化学的に合成可能である場合、少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用してドメイン形成セグメントの各々を化学的に合成すること、及び
ｃ）ドメイン形成セグメントを一緒に折り畳み、それによりＤ－アミノ酸タンパク質を得ること
を更に含む。

【0042】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法において、ドメイン形成セグメントの１つが化学的に合成可能でない場合、
ｄ）ドメイン形成セグメント中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、そしてドメイン形成セグメントのアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースすることで、複数の化学的に合成可能なライゲーション誘導性セグメントを得、
ｅ）ドメイン形成セグメントが本質的にライゲーション誘導性配列を欠いている場合又はライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、ドメイン形成セグメント又はライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、
ｆ）構造喪失セクション又はライゲーション誘導性セグメント中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換して、構造喪失セクション又はライゲーション誘導性セグメントにライゲーション誘導性配列を導入し、そしてドメイン形成セグメントのアミノ酸配列をライゲーション誘導性配列でパースし、
ｇ）少なくとも９０％がＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用してライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成し、それによりドメイン形成セグメントを得る。

【0043】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、ステップ（ｉｉｉ）を含む。

【0044】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法において、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、対応するＬ－アミノ酸タンパク質の活性の少なくとも１％、少なくとも５％又は少なくとも１０％を呈する。

【0045】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質の活性は、触媒活性、特異的結合活性及び構造活性からなる群から選択される。

【0046】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供するＤ－アミノ酸タンパク質は、少なくとも２４０、３００、４００又は少なくとも５００アミノ酸残基を含む。

【0047】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、ライゲーション誘導性セグメントの少なくとも１つにおいて、以下の疎水性の順序：Ｄ－Ｉｌｅ＞Ｄ－Ｌｅｕ＞Ｄ－Ｐｈｅ＞Ｄ－Ｖａｌ＞Ｄ－Ｍｅｔ＞Ｄ－Ｐｒｏ＞Ｄ－Ｔｒｐ＞Ｄ－Ｈｉｓ（０）＞Ｄ－Ｔｈｒ＞Ｄ－Ｇｌｕ（０）＞Ｄ－Ｇｌｎ＞Ｄ－Ｃｙｓ＞Ｄ－Ｔｙｒ＞Ｄ－Ａｌａ＞Ｄ－Ｓｅｒ＞Ｄ－Ａｓｎ＞Ｄ－Ａｓｐ（０）＞Ｄ－Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｄ－Ｈｉｓ＋＞Ｄ－Ｇｌｕ＞Ｄ－Ｌｙｓ＋＞Ｄ－Ａｓｐ－に従い、少なくとも１つの疎水性Ｄ－アミノ酸残基をより疎水性の低いアミノ酸で置換することを更に含む。

【0048】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、対応するＬ－アミノ酸タンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を呈する。

【0049】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像タンパク質を製造する方法は、少なくとも１つのＩｌｅ残基を、Ｄ－Ａｌａ残基、Ｄ－Ｖａｌ残基、Ｄ－Ｌｅｕ残基、Ｄ－Ｔｈｒ残基、Ｇｌｙ残基、Ｄ－Ｐｈｅ残基、Ｄ－Ｍｅｔ残基及びＤ－Ｐｒｏ残基からなる群から選択されるＤ－アミノ酸残基で置換することを更に含む。

【0050】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本願で提供する方法によって調製されるＤ－アミノ酸タンパク質が提供される。

【0051】

本発明の一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、対応するＬ－アミノ酸タンパク質（例えば、対応する生物学的に製造されたタンパク質）の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を有している。

【0052】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、非共有結合的に取り付けられたリペプチド鎖である少なくとも２つのドメイン形成セグメントを含み、このドメイン形成セグメントは、少なくとも１つの対応するＬ－アミノ酸タンパク質中における共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である。

【0053】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、酵素、輸送タンパク質、構造／機構タンパク質、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、抗体、体液平衡化タンパク質、ｐＨ平衡化タンパク質、細胞チャネル及び細胞ポンプからなる群から選択される。

【0054】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、対応するＬ－アミノ酸酵素と比較してエナンチオマー反応を触媒することができる、即ち、対応する基質のエナンチオモルフを用いて、対応する産物のエナンチオモルフを形成する、対応する生物学的に製造された酵素の酵素反応に匹敵する反応の触媒能を有するＤ－アミノ酸酵素である。

【0055】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸酵素は、Ｌ－ＤＮＡテンプレートを使用してＬ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼである。

【0056】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、Ｄ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＤ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。

【0057】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する。

【0058】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質は、少なくとも１つの分裂部位と、Ｋ３６３とＰ３６４との間の第１の分裂部位と、Ｎ６０１とＴ６０２との間の第２の分裂部位とを含む、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0059】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸酵素は、Ｌ－デオキシリボヌクレオチドからＬ－ＤＮＡを合成することができるＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼである。

【0060】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0061】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｋ３６３とＰ３６４との間の分裂及び／又はＮ６０１とＴ６０２との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが提供される。

【0062】

一部の実施形態において、本願で提供するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｉ６Ｖ、Ｉ１４Ｌ、Ｉ７４Ｖ、Ｉ８２Ｖ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ１１７Ｌ、Ｉ１４１Ｖ、Ｉ２１０Ｍ、Ｉ２４４Ｌ、Ｉ２８１Ｖ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３２２Ｌ、Ｉ３３０Ｖ及びＩ３６７Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む。

【0063】

本発明の実施形態の別の態様によれば、配列番号８３と比較して少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有する、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが提供される。

【0064】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｋ４６７とＭ４６８との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが提供される。これらの２つのポリペプチド鎖は、互いにその主鎖間の共有結合によって結び付いているのではない。

【0065】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ及びＩ５４０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む。

【0066】

一部の実施形態において、本願で提供するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｉ３８Ｆ、Ｉ６２Ｖ、Ｉ６５Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｉ１２７Ｖ、Ｉ１３７Ｍ、Ｉ１５８Ｌ、Ｉ１７１Ａ、Ｉ１７６Ｖ、Ｉ１９１Ｖ、Ｉ１９７Ｖ、Ｉ１９８Ｖ、Ｉ２０５Ｖ、Ｉ２０６Ｖ、Ｉ２２８Ｖ、Ｉ２３２Ｌ、Ｉ２４４Ｍ、Ｉ２５６Ｖ、Ｉ２６４Ａ、Ｉ２６８Ｌ、Ｉ２８２Ｖ、Ｉ３３１Ａ、Ｉ４０１Ｖ、Ｉ４３４Ｖ、Ｉ４４６Ｆ、Ｉ４７８Ｋ、Ｉ５５７Ｖ、Ｉ５９８Ｖ、Ｉ６０５Ｔ、Ｉ６１１Ｖ、Ｉ６１９Ａ、Ｉ６３１Ｌ、Ｉ６４３Ｖ、Ｉ６４８Ｔ、Ｉ６５６Ｖ、Ｉ６７７Ｔ、Ｉ７１６Ｙ、Ｉ７３４Ｖ、Ｉ７４５Ｖ及びＩ７７２Ｐからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む。

【0067】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む。

【0068】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ重合活性を呈する。

【0069】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ２１５Ａ、Ａ４８６Ｙ及び／又はＬ４９０Ｗからなる群から選択される変異を更に含む。

【0070】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性の欠損及びジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）選択性の増加を呈する。

【0071】

一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ結合構造ドメインを更に含み、ＤＮＡ結合構造ドメインは、ｓｓｏ７ｄ構造ドメイン（配列番号７８）である。

【0072】

一部の実施形態において、ｓｓｏ７ｄ構造ドメインで修飾されたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅活性の向上を呈する。

【0073】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、配列番号５１と比較して少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７９と比較して少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％の配列同一性によって特徴付けられるアミノ酸配列を有するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが提供される。

【0074】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本願で提供するＤ－アミノ酸タンパク質の使用を提供する。ここで、Ｄ－アミノ酸タンパク質は酵素であり、対応するＬ－アミノ酸酵素によって合成される分子のエナンチオモルフである産物の合成を触媒する、又は対応するＬ－アミノ酸酵素の対応する基質のエナンチオモルフである基質の反応を触媒するための使用である。

【0075】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｌ－ポリデオキシリボ核酸分子を酵素的に製造するプロセスであって、本願で提供する方法によって調製され、且つＬ－デオキシリボヌクレオチドからＬ－ＤＮＡを合成することができる、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼを提供すること、及びＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼをテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡプライマー及び複数のＬ－デオキシリボヌクレオチドと反応させて、Ｌ－ＤＮＡ分子を酵素的に製造することによって実行するプロセスが提供される。

【0076】

本プロセスの態様の一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0077】

本プロセスの態様の一部の実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、本質的に本明細書で提供するとおりである。

【0078】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｌ－ポリリボ核酸（Ｌ－ＲＮＡ）分子を酵素的に製造するプロセスであって、本願で提供する方法によって調製され、且つＬ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができる、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを提供すること、及びＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼをテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡ／ＲＮＡプライマー及び複数のＬ－リボヌクレオチドと反応させて、Ｌ－ＲＮＡ分子を酵素的に製造すること、によって実行するプロセスが提供される。

【0079】

本プロセスの態様の一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体であり、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している。

【0080】

本プロセスの態様の一部の実施形態において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、本質的に本明細書で提供するとおりである。

【0081】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、目的の分子のラセミ結晶を形成する方法であって、目的の分子及び目的の分子のエナンチオモルフを共結晶化させ、それによりエナンチオマー対のラセミ結晶を形成することによって実行する方法が提供され、ここで、目的の分子のエナンチオモルフは、本明細書に提示される方法によって提供されるＤ－アミノ酸タンパク質又はかかるＤ－アミノ酸タンパク質の産物である。

【0082】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本明細書で提供するとおりのＤ－アミノ酸タンパク質を含む分子プローブであって、それに取り付けられた標識部分を有し、且つ対応するＬ－アミノ酸タンパク質の対応する分析物のエナンチオモルフである分析物に対する親和性を有する分子プローブが提供される。

【0083】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｌ－核酸アプタマー又はＤ－ペプチド結合部分を製造する方法であって、
本明細書に提示される方法によって調製されるＤ－アミノ酸タンパク質を提供すること、及び
Ｄ－アミノ酸タンパク質を試験管内進化法に供し、それによりＬ－核酸アプタマー又はＤ－ペプチド結合部分を得ること
によって実行する方法が提供される。

【0084】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を増幅する方法であって、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のテンプレートを、本願で提供する方法によって調製されるＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む方法が提供され、ここで、この反応は、本質的に天然酵素及び／又は天然ＤＮＡ／ＲＮＡの混入なしに達成される。

【0085】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本明細書で提供するとおりのＤ－アミノ酸ＤＮＡ又はＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼと、ホスホロチオエートＬ－ｄＮＴＰ又はホスホロチオエートＬ－ＮＴＰと、２つの異なる色素で５’－標識された２つのプライマーとを使用して、Ｌ－ＤＮＡ又はＬ－ＲＮＡをシーケンシングする方法が提供される。

【0086】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、本明細書で提供するとおりのＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと、Ｌ－ジデオキシヌクレオシド三リン酸と、２つの異なる色素で５’－標識された２つのプライマーとを使用して、Ｌ－ＤＮＡをシーケンシングする方法が提供される。

【0087】

一部の実施形態において、色素は、ＦＡＭ及びＣｙ５である。

【0088】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、データストレージシステムであって、
情報データをコードする配列を有する少なくとも１つのＬ－核酸（例えば、Ｌ－ＤＮＡ、Ｌ－ＲＮＡ及びこれらのＤ－核酸セグメントとの任意のキメラ）分子と、
Ｌ－核酸を合成及び／又はシーケンシングするためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、本願で提供する方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
を含むデータストレージシステムが提供される。

【0089】

本システムの一部の実施形態において、Ｌ－核酸分子は、化学的に調製されたか、又は鏡像酵素触媒反応によって調製さたものである。Ｌ－ＤＮＡデータストレージシステムの一部の実施形態において、情報格納用Ｌ－ＤＮＡセグメントは、Ｄ－酵素を使用する鏡像アセンブリＰＣＲによって調製されたものである。

【0090】

本システムの一部の実施形態において、Ｌ－核酸分子は、化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる。

【0091】

本システムの一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、本願で提供するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0092】

本システムの一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼは、本願で提供するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0093】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、キラル・ステガノグラフィー手法であって、
カバー情報データをコードする配列を有する少なくとも１つのＤ－核酸分子と、
ステゴ情報データを解読するための暗号鍵をコードする配列を有する少なくとも１つのＬ－核酸分子及び／又はＤ－／Ｌ－キメラ核酸分子と、
Ｌ－ＤＮＡ分子を合成及び／又はシーケンシングするためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、本明細書で提供するとおりに製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
によって実行する、キラル・ステガノグラフィー手法が提供される。

【0094】

一部の実施形態において、Ｌ－核酸分子は、化学的に調製されたもの、又は鏡像酵素触媒反応によって調製されたものである。

【0095】

一部の実施形態において、Ｌ－核酸分子は、化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる。

【0096】

一部の実施形態において、Ｄ－／Ｌ－キメラ核酸分子は、化学的に調製されたもの、又は天然／鏡像酵素触媒反応によって調製されたものである。

【0097】

一部の実施形態において、Ｄ－／Ｌ－キメラ核酸分子のＬ－ＤＮＡ／ＲＮＡパートは、化学的にシーケンシングされるか、又は鏡像酵素を使用するシーケンシング・バイ・シンセシス方法によってシーケンシングされる。

【0098】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書で提供するとおりのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0099】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書で提供するとおりのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0100】

一部の実施形態において、本システムは、ＤＮＡクリプトグラフィーと組み合わされて、暗号化されたデータを使用して追加のセキュリティ層を提供し得る。

【0101】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｌ－ＲＮＡ加水分解を研究する方法であって、
高次化構造及び長い鎖長の配列を有する少なくとも１つのＬ－ＲＮＡ分子と、
Ｌ－ＲＮＡ分子を合成するためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、本願で提供する方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼ
によって実行する方法が提供される。

【0102】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、ＲＮＡ分解を研究する方法であって、
高次化構造及び長い鎖長の配列を有する少なくとも１つのＬ－ＲＮＡ分子、
Ｌ－ＲＮＡ分子を合成するためのＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼであって、本願で提供する方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼと
によって実行する方法が提供される。

【0103】

一部の実施形態において、本方法を使用して、ＲＮアーゼ阻害試薬の有効性を評価することができる。

【0104】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、転写ＡＮＤ論理であって、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼであって、本願で提供する方法によって製造されるＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼによって実行する転写ＡＮＤ論理が提供される。

【0105】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、本願で提供するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0106】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの分裂部位、Ｋ３６３とＰ３６４との間の第１の分裂部位及びＮ６０１とＴ６０２との間の第２の分裂部位を含む。

【0107】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの分裂部位を含み、上述の部位は、同じループ、即ち３５７位～３６６位及び／又は５６４位～６０７位にある。

【0108】

本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、Ｌ－ＲＮＡマーカー／ラダーを製造する方法であって、
Ｌ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができる、本願で提供する方法によって調製されたＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを提供すること、及び
Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼを、それぞれ長さの異なるテンプレートＬ－ＤＮＡ分子、Ｌ－ＤＮＡ／ＲＮＡプライマー及び複数のＬ－リボヌクレオチドと反応させること
を含み、それぞれ異なる長さのＬ－ＲＮＡ分子を酵素的に製造し、それらを精製後に特定の濃度で一緒に混合する、方法が提供される。

【0109】

一部の実施形態において、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、本質的に本明細書で提供するとおりのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0110】

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施又は試験では、本明細書に記載されるものと同様の又は同等な方法及び材料を使用し得るが、例示的方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾が生じる場合、本特許明細書が定義を含めて優先するものとする。加えて、材料、方法及び例は、例示的に過ぎず、必ずしも限定することを意図するわけではない。

【0111】

本発明の一部の実施形態は、本明細書において、単に例として添付の図を参照して説明される。ここで、具体的にそれらの図を詳細に参照するが、示される詳細は、例であり、本発明の実施形態の例示的な考察を目的としていることが強調される。この点において、この説明を図と併せて解釈すると、本発明の実施形態をどのように実施し得るかについて当業者に明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1】本発明の一部の実施形態による、本願で提供する方法を図解するフローチャートである。

【図2A】追加的なＮＣＬ部位（Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ）を導入してライゲーション誘導性セグメントを形成し、２５個のイソロイシン残基を置換した変異体Ｐｆｕ－Ｎ断片の合成経路の設計フロー（図２Ａ）、及び追加的なＮＣＬ部位（Ｉ５４０Ａ）を導入すると共に、他の１５個のイソロイシン残基の変異も導入した変異体Ｐｆｕ－Ｃ断片の合成経路の設計フロー（図２Ｂ）を提示する。これらの変異を導入することにより、ＳＰＰＳでのタンパク質合成及びライゲーションプロセスを容易にし、鏡像バージョンの合成コストを削減する。

【図2B】同上

【図3A】置換３６９ａａ（Ｎ末端に付加されるＨｉｓ_６タグを含む）変異体Ｔ７－分裂－Ｎ断片（図３Ａ）、２３８ａａ変異体Ｔ７－分裂－Ｍ断片（図３Ｂ）、及び２８２ａａ変異体Ｔ７－分裂－Ｃ断片（図３Ｃ）の合成経路の設計フローを提示する。設計フローには、イソロイシン残基の置換、新規ＮＣＬ及びＫ３６３とＰ３６４との間の新規分裂部位が含まれ、これら変異は、ＳＰＰＳでのタンパク質合成及びライゲーションプロセスを容易にし、且つ鏡像バージョンの合成コストを削減するために導入した。

【図3B】同上

【図3C】同上

【図4】Ｌ－ＤＮＡをＸＮＡの例示的の一種として使用した、本発明の一部の実施形態による分子データストレージについて図解するフローチャートである。

【図5】本発明の一部の実施形態によるＤＮＡベースのステガノグラフィーを図解するフローチャートであって、一見して通常のＤ－ＤＮＡストレージライブラリにキメラＤ－ＤＮＡ／Ｌ－ＤＮＡ鍵分子を埋め込んで秘密のメッセージを運ぶものを提示する。

【発明を実施するための形態】

【0113】

本発明は、その一部の実施形態において、生化学に関し、より詳細には、限定されないが、大型タンパク質及びその鏡像対応物の化学的全合成方法並びにその使用に関する。

【0114】

本発明の原理及び動作は、図及び付随する説明を参照してよりよく理解され得る。

【0115】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その応用の点で、以下の説明に示されるか又は実施例に例示される詳細に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法での実施若しくは実行が可能である。

【0116】

タンパク質の基本的なビルディングブロックであるα－アミノ酸は、２つの形態、即ち、Ｌ－エナンチオマー（左旋性又は左利きの「Ｌ」）及びＤ－エナンチオマー（右旋性又は右利きの「Ｄ」）として存在するキラル分子である。利き手又はキラリティーが異なる、これらの２つの重ね合わせることができない形態のアミノ酸は、互いの鏡像であり、他の点では同一の物理的及び化学的特性を有する。しかしながら、地球上の生命は、多様な生物学的機能を果たすタンパク質の構築にＬ－アミノ酸及びアキラルなアミノ酸であるグリシンのみを使用する。Ｄ－アミノ酸は、自然界に存在し、特に細胞壁のペプチドグリカン及び細菌起源のペプチド抗生物質、昆虫、カタツムリ及び両生類などの下等動物のタンパク質、更に神経伝達物質として脳にまで存在するものの、様々な生物において、それは、親のＬ－エナンチオマーから酵素触媒による翻訳後反応を通して変換されると考えられている。どうして、そしてどのように地球上の生命がこれらの左利き分子を好むのかという興味をそそる問いは、数十年にわたり、化学者、物理学者、生物学者、更に天文学者までも巻き込む激しい論争のテーマとなっている。α－アミノ酸のホモキラリティーの起源は、引き続き謎のままであるが、科学者は、キラルＤ－アミノ酸のみを有する非天然の又は人工的なＤ－ペプチド及びＤ－タンパク質の物理化学的及び生物学的特性を研究することにより、既に多くのことを学んでいる。

【0117】

本発明者らは、本発明を実施化する中で、合理的に考えて、実験室で鏡像バイオロジーシステムを構築するための中核となる工程が、２つの技術的柱としての鏡像核酸及びタンパク質の化学合成の利点を生かして（５）、キラル反転バージョンの分子生物学におけるセントラルドグマを構築することであると判断した（５～７）。本発明者らは、合理的に考えて、長いＬ－核酸分子を合成する際の障害を克服する１つの方法が、鏡像ポリメラーゼによる酵素的重合を通した方法であると判断しており、これは、本発明の企図するところにつながるものであり、概念実証の実現につながるものである。それにもかかわらず、以前のバージョンの鏡像ポリメラーゼシステムは、ポリメラーゼの活性とサイズとの間の消極的な妥協案としての化学的全合成のモデルとして選択されたものであった（５）。ＡＳＦＶ ｐｏｌ Ｘ及びＤｐｏ４など、小さいポリメラーゼに固有のプロセシビティ及び忠実度の低さ（１０^－４～１０^－２程度の大きさのエラー率）のため、長い鏡像遺伝子の正確なアセンブリ、増幅及び転写には、これらは不適とされてきた（５、１７、１８、２１）。

【0118】

このように、本発明者らは、一見していかなるタンパク質でも化学的全合成を可能にし得る方法を企図し、それによりＤ－アミノ酸タンパク質への道を開いた。

【0119】

本発明の実施形態による大型タンパク質の化学的全合成方法は、本分野でこれまで乗り越えられなかった障害を系統的に取り除くことであり、標的タンパク質のアミノ酸配列に特異的変異を導入して、タンパク質の特異的活性を無効にすることなく長さの問題を緩和しようとすることに基づいている。

【0120】

分裂タンパク質の設計：
本発明者らは、合理的に考えて、分裂タンパク質設計の利点を生かすことにより、大型タンパク質の化学的合成の問題が、インビトロで一緒に折り畳んで機能的にインタクトな酵素にすることのできる２つの又は更に細かいタンパク質断片の合成へと劇的に単純になり得ると判断した。更に、この分裂タンパク質戦略では、分裂タンパク質断片毎の合成、精製、ライゲーション及び脱硫を並行して実施することが可能になるため、大型タンパク質の合成に必要な全体的な時間並びに１つ又は複数のある種の断片にエラーが発生したときの修正にかかるコスト及び時間が削減されることになる。一部の酵素は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含め、天然の又は操作された分裂バージョンを有し、例えば、そのフィンガードメインのコイルドコイルモチーフにおけるＫ４６７とＭ４６８との間の既知の分裂部位は、ポリメラーゼを２つの断片（４６７ａａのＰｆｕ－Ｎ断片及び３０８ａａのＰｆｕ－Ｃ断片へと、そのＰＣＲ活性及び忠実度を大きく改変することなく分割する。上述の分裂部位は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのフィンガードメインのコイルドコイルモチーフにおける上述の配列位置の近傍、例えば４４９位と４９８位との間でも選択され得る。

【0121】

このように、本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質を化学的に製造する方法は、タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割することを含み、その各々は、より小さいポリペプチドセグメントのライゲーションから化学的に合成するのに十分に短く、しかしドメイン形成セグメントが折り畳み誘導性条件下で一緒に折り畳まれて一体になると、機能タンパク質中の機能ドメインに折り畳まれるのに十分に長い。

【0122】

本発明の一部の実施形態によれば、ドメイン形成セグメントがＳＰＰＳ又はＡＦＰＳにより化学的に合成可能である場合又は約１２０、１５０又は２００アミノ酸残基長以下である場合、それは、典型的には、それを化学的に合成することができ、他のドメイン形成セグメントと一緒に折り畳むのに好適であるため、従ってそのタンパク質を入手し得ることを意味する。

【0123】

用語「化学的に合成可能」は、本明細書で使用されるとき、主に、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）又は自動ファストフローペプチド合成（ＡＦＰＳ）など、任意の非生物学的合成プロセスにより実現し得るポリペプチドの長さを指す。一般に、約１０～１２０アミノ酸残基長のポリペプチドを固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって製造することができ、約１０～１８０アミノ酸残基長のポリペプチドを自動ファストフローペプチド合成（ＡＦＰＳ）によりもたらし得ることが公知である。一部の実施形態において、用語「化学的に合成可能」は、約１２０、１５０又は２００アミノ酸長のポリペプチド鎖を指す。一部の実施形態において、用語「化学的に合成可能」は、化学的に合成されたポリペプチドを精製し、且つ任意選択で単離する能力も指す。

【0124】

ドメイン形成セグメントが化学合成に好適なものよりも長い場合、それは、ライゲーション誘導性セグメントに更にセグメント化され、それらが連結されることにより、（比較的長い）ドメイン形成セグメントが形成される。

【0125】

本発明の実施形態との関連において、用語「断片」は、本説明および本明細書全体を通して、用語「ドメイン形成セグメント」と同義的に使用される。用語「ドメイン形成セグメント」は、本明細書で使用されるとき、この用語が当技術分野で公知であるとおり、認識可能な１つ又は複数のタンパク質ドメインに折り畳まれる連続したポリペプチド鎖を指す。一部の実施形態によれば、ドメイン形成セグメントは、そのポリペプチドがインビボ又は生物学的／生理的条件下で折り畳まれたときのそれらのドメインの構造と類似する又は本質的に同一の１つ以上のドメインにインビトロで折り畳まれ得る。

【0126】

本発明の実施形態との関連において、ドメイン形成セグメントは、マルチドメインタンパク質であり得るか、又は単一の認識可能なドメインを含み得る。ドメインの認識又は同定は、当業者の能力の範囲内であり、典型的には、多重配列アラインメント、ＳＣＯＰ［ｓｃｏｐ（ｄｏｔ）ｂｅｒｋｅｌｅｙ（ｄｏｔ）ｅｄｕ／］、ＣＡＴＨ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃａｔｈｄｂ（ｄｏｔ）ｉｎｆｏ］、ＥｘＰＡＳｙ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｘｐａｓｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ］、ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ］、ＰＦＡＭ［ｐｆａｍ（ｄｏｔ）ｘｆａｍ（ｄｏｔ）ｏｒｇ］、ＰＤＢ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｒｃｓｂ（ｄｏｔ）ｏｒｇ］等（これらは、全て当業者の範囲及び判断の範囲内にある）、１つ以上の公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを用いて行われる。

【0127】

以上で考察したとおり、一部のタンパク質は、天然で２つ以上のポリペプチド鎖で構築され、それらは、本明細書で考察される多ドメイン又はドメイン形成セグメントと同等である。本明細書に提示される方法では、ドメイン形成セグメントへのかかる天然の又は意図的な分裂を活用することができる。

【0128】

一部のタンパク質は、１つの連続したポリペプチド鎖で構築され得るが、しかしながら、その進化上のファミリーメンバーには、２つ以上のポリペプチド鎖で構築されるように進化したものも含まれ得る。可能性のある分裂に関する情報は、ファミリーメンバーの多重配列アラインメントから生じるものであり得、且つ化学的製造のために目的のタンパク質のファミリーメンバーを意図的に分割することから生じるものであり得る。任意選択の分裂部位に関する別の情報源は、構造アラインメントによって補助される、目的のタンパク質又はタンパク質のファミリーメンバーの構造情報からもたらされ得る － タンパク質中のある種のセクションは、保存性が低く、従ってその配列中に分裂部位が意図的に導入された場合にもタンパク質の活性を乱さないと予想されることが明らかとなる。

【0129】

可能性のある分裂部位としての役割を果たし得るタンパク質中のセクションは、その同定につながる情報が配列データからもたらされるか、及び／又は構造データからもたらされるかにかかわらず、本明細書では、構造喪失セクションと称される。このように、「構造喪失セクション」は、多重配列アラインメントを用いることにより、及び／又は目的のタンパク質並びに／若しくはタンパク質のファミリーのメンバーからの構造情報から同定可能である。

【0130】

本発明の一部の実施形態によれば、ＳＰＰＳ又はＳＰＰＳとライゲーションとの組み合わせによって実際に化学的に直接製造するには、タンパク質が長過ぎる場合、目的のタンパク質の配列に分裂部位を導入することができ、それらのドメイン形成セグメントは、化学的に合成されると、一緒に折り畳まれてタンパク質になるであろうことが見込まれる。

【0131】

化学的ライゲーション：
本発明者らが本発明を実施化する間に見出したとおり、一緒に折り畳むことによってタンパク質が実現できたとしても、分裂設計手法の実施後、ドメイン形成セグメントの各々又はその１つが、化学合成によって実現するには長過ぎることもあり得る。

【0132】

ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）は、化学的ライゲーション分野の延長線上にあり、２つ以上の保護されていないペプチドセグメントのアセンブリによって形成される大型ポリペプチドを構築するという概念である。特に、ＮＣＬは、小型及び中程度のサイズの天然骨格タンパク質又は修飾されたタンパク質を合成する強力なライゲーション方法である。ネイティブケミカルライゲーションでは、保護されていないペプチドのＮ末端システイン残基のチオール基が、第２の保護されていないペプチドのＣ末端チオエステルを攻撃する。この可逆的チオエステル交換ステップは、化学選択的且つ位置選択的であり、チオエステル中間体の形成につながる。この中間体が分子内Ｓ，Ｎ－アシルシフトにより転位する結果、ライゲーション部位に天然アミド（ペプチド）結合が形成されることになる。

【0133】

本発明の実施形態との関連において、用語「ライゲーション誘導性配列」は、タンパク質配列中において、ＮＣＬによって形成され得るアミノ酸配列を呈する箇所を指す。例えば、Ｎ末端システイン残基を使用すると、既知の条件下で化学的ライゲーションを実行することができる。ライゲーション誘導性配列の同定及び利用については、十分に当業者の範囲内にあり、文献中に追加情報が容易に得ることが可能である（例えば、レビュー論文“Native Chemical Ligation and Extended Methods: Mechanisms, Catalysis, Scope, and Limitations” 、Agouridas, V. et al.著［Chem Rev. 2019,119(12), pp. 7328-7443］）。

【0134】

このように、本発明の一部の実施形態によれば、タンパク質又はその長鎖ドメイン形成セグメントは、初めにタンパク質のアミノ酸配列中にライゲーション誘導性配列を同定し、次に配列をそれらのライゲーション誘導性配列又はその少なくとも一部でパースすることで、各々が実際に化学的に合成及び精製するのに十分な短さの、タンパク質のライゲーション誘導性セグメントの複数の配列を得ることにより合成し得る。その後、化学的に合成することのできるライゲーション誘導性セグメントの各々が連結されると、タンパク質又はドメイン形成セグメントが形成される。

【0135】

一般に、本発明の一部の実施形態によれば、ライゲーション誘導性配列／セグメントは、化学的に合成可能であるか、又は約１０～１２０、約１０～１５０若しくは約１０～２００アミノ酸長である。

【0136】

セグメントの長さに基づいて、タンパク質が望ましい位置にライゲーション誘導性配列を呈しない場合、タンパク質のアミノ酸配列の変異によってライゲーション誘導性配列を導入することができる。このように、本発明の一部の実施形態によれば、ライゲーション誘導性セグメントのいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、即ち、約１２０、１５０若しくは２００アミノ酸残基長より長い場合又は実際に合成及び精製できない他の長さである場合、この方法は、ライゲーション誘導性配列中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定し、前記構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基で置換することにより、前記構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入し、それに続いて変異によってもたらされるライゲーション誘導性配列でタンパク質のアミノ酸配列をパースし、それに更に続いて前記ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成することによって実行する。

【0137】

例えば、３５２ａａ（４０ｋＤａ）のＤｐｏ４よりはるかに大きい４６７ａａ（５４ｋＤａ）のＰｆｕ－Ｎ断片単独の合成は、なおも大きい課題を突き付ける。課題の１つは、ＳＰＰＳによって調製される合成ペプチドのＮＣＬでは、ライゲーション部位にＮ末端システイン残基が必要であるが、野生型（ＷＴ）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼには、４個のシステイン残基しかない（Ｐｆｕ－Ｎ断片（配列番号５７）のＣ４２９及びＣ４４３、Ｐｆｕ－Ｃ断片（配列番号６７）のＣ５０７及びＣ５１０）という点である。本発明者らは、既報告の金属フリーラジカルベースの脱硫手法の利点を生かし、ＮＣＬ後に保護のないシステインをアラニン残基に変換して、アラニン残基のある別の８ヵ所のライゲーション部位（Ｐｆｕ－Ｎ断片のＡ４０、Ａ１６３、Ａ２２３及びＡ４０８、Ｐｆｕ－Ｃ断片のＡ５０１、Ａ５９６、Ａ６５２及びＡ７１５）も使用できるようにしたが、これらのペプチドセグメントの一部は、ＳＰＰＳによって調製するにはなおも長過ぎた。従って、本発明者らは、配列アラインメントに基づき、５個の点変異（Ｐｆｕ－Ｎ断片のＥ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ及びＶ３６７Ｌ、Ｐｆｕ－Ｃ断片のＩ５４０Ａ）を有する変異型のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを設計して、ポリメラーゼのＰＣＲ活性を大きく改変することなく、追加のライゲーション部位又はライゲーション誘導性配列を導入した（分裂Ｐｆｕ－５ｍ、配列番号４８）。

【0138】

疎水性及びバルク：
別の課題は、水性条件下での疎水性ペプチドセグメントの合成及びライゲーションである。この問題を克服する現行の方法は、高度に疎水性の及び／又はかさ高いアミノ酸残基の数を減らすため、標的ペプチドに様々な変異及び／又は化学修飾を導入することに主な焦点が置かれている。本発明の一部の実施形態によれば、化学修飾は、例えば、Ｈｍｂ－Ｎ^α保護、除去可能な可溶化タグ、シュードプロリン及びデプシペプチド（Ｏ－アシルイソペプチド）によって実行するが、これらを実際に使用すると、骨の折れる手順、低収率及び高価なアミノ酸誘導体の必要性によって制約を受けることが多い。

【0139】

本発明の一部の実施形態によれば、化学合成、ライゲーション及び化学的に製造されたタンパク質の様々なセグメントが一緒に折り畳まれるのを容易にするために、一部の高度に疎水性の及び／又はかさ高い残基を、疎水性の低い及び／又はあまりかさ高くない残基に置換する（変異させる）。かかる置換の判断基準は、ＭＳＡ、構造情報及び他の変異データに依拠し得る。

【0140】

疎水性とかさ高さとは、互いに関わりがあり、ほとんどの場合に密接に関連しているものの、必ずしも同じ特性ではなく、それらの特性は、異なる環境下では、ｐＨ、イオン強度、対イオン、水分活性、温度及び他の要因に応じて異なって変わり得る。ポリペプチド鎖に関連して、アミノ酸残基の疎水性及びかさ高さの値及び順位は、いずれの文献中に示されるものを参照するかによってやや異なるが、イソロイシンが「群を抜いてかさ高さ及び疎水性の高いアミノ酸の１つ」であるという一般的な見解がいずれでも成立している。疎水性及びかさ高さに関する例示的情報源としては、これに限定されるものではないが、Kyte, J. and Doolittle, R.F., “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”［J. Mol. Biol., 1982, 157(1), pp. 105-132］及びEllington, A. and Cherry, J.M., “Characteristics of amino acids”［Curr Protoc Mol Biol, 2001, A.1C.1-A.1C.12］が挙げられる。例えば、本発明の実施形態は、アミノ酸の変異に関する基本的な判断基準として、以下の非限定的な例示的順序：Ｉ＞Ｌ＞Ｃ＞Ｔ＞Ｖ＞Ｐ＞Ｓ＞Ａ＞Ｇに従ってかさ高さを減少させ、以下の非限定的な例示的順序：Ｉ＞Ｖ＞Ｌ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｍ＞Ａ＞Ｇ＞Ｔに従って疎水性を減少させる得る。

【0141】

一般に、当技術分野で公知のとおり、残基を置換する指針は、以下の疎水性の順序：Ｉｌｅ＞Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ＞Ｖａｌ＞Ｍｅｔ＞Ｐｒｏ＞Ｔｒｐ＞Ｈｉｓ（０）＞Ｔｈｒ＞Ｇｌｕ（０）＞Ｇｌｎ＞Ｃｙｓ＞Ｔｙｒ＞Ａｌａ＞Ｓｅｒ＞Ａｓｎ＞Ａｓｐ（０）＞Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｈｉｓ＋＞Ｇｌｕ＞Ｌｙｓ＋＞Ａｓｐ－に従うものとなる。

【0142】

本明細書に提示される方法がＤ－アミノ酸タンパク質の化学的合成に用いられるとき、この方法は、その一部の実施形態によれば、以下の疎水性の順序：Ｄ－Ｉｌｅ＞Ｄ－Ｌｅｕ＞Ｄ－Ｐｈｅ＞Ｄ－Ｖａｌ＞Ｄ－Ｍｅｔ＞Ｄ－Ｐｒｏ＞Ｄ－Ｔｒｐ＞Ｄ－Ｈｉｓ（０）＞Ｄ－Ｔｈｒ＞Ｄ－Ｇｌｕ（０）＞Ｄ－Ｇｌｎ＞Ｄ－Ｃｙｓ＞Ｄ－Ｔｙｒ＞Ｄ－Ａｌａ＞Ｄ－Ｓｅｒ＞Ｄ－Ａｓｎ＞Ｄ－Ａｓｐ（０）＞Ｄ－Ａｒｇ＋＞Ｇｌｙ＞Ｄ－Ｈｉｓ＋＞Ｄ－Ｇｌｕ＞Ｄ－Ｌｙｓ＋＞Ｄ－Ａｓｐ－に従い、ライゲーション誘導性セグメントの少なくとも１つにおける少なくとも１つの疎水性Ｄ－アミノ酸残基をより疎水性の低いアミノ酸で置換することを更に含み得る。

【0143】

例えば、Ｐｆｕ－Ｃ－４セグメントは、アセトニトリル又は６ＭのＧｎ・ＨＣｌ水溶液中での溶解度が低く、標準的なＦｍｏｃ－ＳＰＰＳによる合成が困難であった。イソロイシンは、群を抜いてかさ高さ及び疎水性の高いタンパク質原性アミノ酸の１つであると考えられたことから、疎水性ペプチド中の１つ又は複数のイソロイシンを、代わりとなるが、潜在的にかさ高さ又は疎水性の低いアミノ酸（例えば、バリン、アラニン、ロイシン、トレオニン、グリシン、フェニルアラニン、メチオニン又はプロリン等）に変異させるか、又は１つ以上の他のかさ高い又は疎水性のアミノ酸（バリン、トレオニン、フェニルアラニン及びロイシン等）を、より極性の高いアミノ酸などのかさ高さ又は疎水性の低い他のものに変異させれば、そのペプチドセグメントの物理化学的特性が変わるはずであった。

【0144】

本発明の一部の実施形態によれば、配列アラインメント及び構造情報に基づいた系統的なイソロイシン置換手法を開発し、ポリメラーゼのＰＣＲ活性を大きく改変することなく、このセグメントの７個のイソロイシン残基の全てを変異させた（Ｉ５９８Ｖ、Ｉ６０５Ｔ、Ｉ６１１Ｖ、Ｉ６１９Ａ、Ｉ６３１Ｌ、Ｉ６４３Ｖ及びＩ６４８Ｔ）。実際、これらの７個の点変異により、このペプチドセグメントの合成が容易に実現し、これは、下流精製及びＮＣＬのためのアセトニトリル及び６ＭのＧｎ・ＨＣｌ水溶液中への可溶化も可能になったため、その合成のために他の化学修飾を用いる必要を回避することが可能になった。

【0145】

コスト削減：
技術的課題に加えて、大型鏡像（Ｄ－アミノ酸）タンパク質の合成は、全体的に見て低い収率及び高い試薬コストに起因して経済的障害にも直面する。鏡像バージョンのタンパク質原性アミノ酸は、いずれも市販されており、ほとんどは、その天然の対応物と同程度の価格であるが、Ｄ－イソロイシンは、Ｌ－イソロイシン及び他のＤ－アミノ酸と比べて約５０～３００倍高価であり、その原因は、主に、２つのキラル中心が存在するため、その合成及び精製が困難であり、損失が大きくなることにある。鏡像タンパク質を合成するときは、Ｄ－アミノ酸のコストが８０～９０％を占める（典型的には約５％である、天然タンパク質中のイソロイシンの存在量に依存する）。このように、本発明の一部の実施形態によれば、配列アラインメント及び構造情報に基づいて系統的なイソロイシン置換手法を適用することにより、ポリメラーゼのＰＣＲ活性を大きく改変することなく、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ中の多数（７１個中４１個、即ち５８％）のイソロイシンをバリン、ロイシン及びアラニン等の他のアミノ酸に変異させる（分裂Ｐｆｕ－５ｍ－３０Ｉ、配列番号５１）。

【0146】

この系統的なＩｌｅ減量手法の結果、このポリメラーゼを合成する際のＤ－アミノ酸コストはほぼ半分に減少し、これは、将来のその大規模合成及び適用にとって有益となり得る。

【0147】

一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質を化学的に製造する方法は、少なくとも１つのＩｌｅ残基をＡｌａ残基、Ｖａｌ残基、Ｌｅｕ残基、Ｇｌｙ残基、Ｔｈｒ残基、Ｐｈｅ残基、Ｍｅｔ残基又はＰｒｏ残基に置換することを含む。従って、結果として得られるＤ－アミノ酸タンパク質は、一部又は全てのＩｌｅ残基位置が、Ｄ－Ａｌａ残基、Ｄ－Ｖａｌ残基、Ｄ－Ｌｅｕ残基、Ｇｌｙ残基、Ｄ－Ｔｈｒ残基、Ｄ－Ｐｈｅ残基、Ｄ－Ｍｅｔ残基及びＤ－Ｐｒｏ残基からなる群から選択される非Ｉｌｅ Ｄ－アミノ酸残基を呈する。

【0148】

大型タンパク質の化学的全合成方法：
上記に説明し、且つ以下に続く実施例の節で実証するとおり、本願で提供する方法を実施することにより、忠実度の高い９０ｋＤａのＤ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの化学的全合成がもたらされた。これは、Ｌ－ＤＮＡ配列の正確な書き込み及び読み取り並びにキロベースサイズの鏡像遺伝子の正確なアセンブリを実行した。天然酵素タンパク質の平均サイズは、約３００～５００ａａであり、約０．９～１．５ｋｂのコード遺伝子配列に対応する。このように、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのような大型の鏡像型の酵素タンパク質を合成可能であり、従って長い鏡像遺伝子をアセンブリ可能であることは、鍵となる実現技術であり、生命の鏡像体を構築することに向けた重要な足掛かりである。第１世代鏡像ポリメラーゼＡＳＦＶ ｐｏｌ Ｘ、第２世代Ｄｐｏ４から現在の第３世代Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼに至るまで、技術の向上に伴い、自然が提供する最良の酵素的手段を利用する大型鏡像タンパク質の化学的全合成は、現実のものとなっている。これらの効率的な次世代鏡像酵素は、一層洗練された鏡像バイオロジーシステムの実現並びにバイオテクノロジー及び医学用分子ツールボックスの拡大に向けた機会の新しい扉を開く。

【0149】

このように、本発明の一部の実施形態のある態様によれば、比較的大型の機能タンパク質の化学的全合成方法であって、タンパク質の少なくとも２つのライゲーション誘導性セグメントを連結することによって実行する方法が提供される。ここで、ライゲーション誘導性セグメントの各々は、化学的に合成可能であるか、又は典型的には、ＳＰＰＳのために約１０～１２０アミノ酸残基長であり、ライゲーション誘導性セグメントは、以下によって得ることが可能である。

【0150】

ｉ．タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定し、タンパク質のアミノ酸配列をそれらのライゲーション誘導性配列でパース（分割）し、それによりライゲーション誘導性セグメントの複数の配列を得る。一部の実施形態によれば、天然に存在するライゲーション誘導性配列の少なくとも１つは、タンパク質の構造喪失セクションに見出される。

【0151】

ｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントの各々の配列をＳＰＰＳ及び／又はＡＦＰＳによって実際に合成することができ、実際に精製することができる場合、ライゲーション誘導性セグメントの各々を化学的に合成して、ライゲーションのために準備することができる。

【0152】

ｉｉｉ．ライゲーション誘導性セグメントの配列のいずれか１つが化学的に合成可能でない場合、即ち約１２０、１５０若しくは２００アミノ酸残基長よりも長い場合又は実際に合成及び精製できない他の長さである場合、そうした配列を分析して、その中の少なくとも１つの構造喪失セクションを同定する。この分析については、以上に説明し、且つ当技術分野で公知のとおりである。ライゲーション誘導性配列を変異によって導入するために、構造喪失セクション中の少なくとも１つのアミノ酸をライゲーション誘導性アミノ酸残基（例えば、システイン）で置換して、構造喪失セクション中にライゲーション誘導性配列を導入する。その後、この新たに導入されたライゲーション誘導性配列でタンパク質のアミノ酸配列を分割し（パースし）、結果として得られた１２０ａａよりも小さいライゲーション誘導性セグメントを化学的に合成する。

【0153】

以上で考察したとおり、既存の分裂部位を利用するか又はタンパク質のアミノ酸配列に分裂部位を導入すると、タンパク質の化学的全合成が容易となる。このように、本発明の一部の実施形態によれば、本方法は、以上に提示したステップ（ｉ）の前に、タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも２つのドメイン形成セグメントに分割し、且つドメイン形成セグメントの各々が化学的に合成可能である場合（約１２０、１５０又は２００アミノ酸残基長以下）、ドメイン形成セグメントの各々を化学的に合成し、続いてそれらのドメイン形成セグメントを一緒に折り畳み、それによりタンパク質を得ることを更に含む。

【0154】

一部の実施形態によれば、ドメイン形成セグメントの１つが化学的に合成可能でない場合（例えば、約１２０、１５０又は２００アミノ酸残基より長い場合）又は実際に合成及び精製することができない他の長さである場合、それがライゲーション誘導性セグメントに更に分割され、これについては、以上で考察したとおりである。

【0155】

好ましくは、ドメイン形成セグメントは、その中の構造喪失セクションでパースされる。これは、ドメイン形成セグメントの範囲内にある構造喪失セクションを同定することから始まり、次に、構造喪失セクション中の少なくとも１つのライゲーション誘導性配列を同定することが続き、その後、ドメイン形成セグメントのアミノ酸配列をそれらのライゲーション誘導性配列でパースすることが続く。この場合もやはり、セグメント又は構造喪失セクションが本質的にライゲーション誘導性配列を欠いている場合、上述したとおり、変異によってそれを導入することができる。ドメイン形成セグメントがパースされ、化学的に合成可能な（ＳＰＰＳには約１０～１２０ａａ、ＡＦＰＳには約１０～１８０）ライゲーション誘導性セグメント配列となったところで、それらを化学的に合成し、連結すると、ドメイン形成セグメントが形成される。

【0156】

図１は、本願で提供する方法をフローチャートの形式で図解するものであり、「ボックス１」において、使用者は、目的のタンパク質、好ましくは何らかのタンパク質ファミリー及び構造情報が利用可能なものを選択し、「ボックス２」において、本方法によれば、ＭＳＡ及び構造データを使用して、ライゲーション誘導性ａａの変異、分裂部位及びＩｌｅ残基の置換を導入するための構造喪失セクションを同定することが求められる。目的のタンパク質が約４００ａａよりも短い場合、「ボックス３」において、本方法によれば、ライゲーション誘導性ａａを見つけ出すか又はそれに変異させることによってライゲーション誘導性配列中に見つけ出す及び／又はそれを導入することにより、タンパク質の配列をライゲーション誘導性セグメントにパースすることで、各々が化学的に合成可能である複数のライゲーション誘導性セグメント配列を形成することが求められる。目的のタンパク質が約４００ａａよりも長い場合、「ボックス４」において、本方法によれば、少なくとも１つの分裂部位を見つけ出すか又はそれを導入してそれぞれが約４００ａａ未満のドメイン形成セグメントを形成することが求められ、「ボックス５」において、本方法によれば、ライゲーション誘導性配列中に見つけ出す及び／又はそれを導入することにより、ドメイン形成セグメントの各々の配列をライゲーション誘導性セグメントにパースすることで、各々が化学的に合成可能である複数のライゲーション誘導性セグメント配列を形成することが求められる。「ボックス６」において、本方法によれば、ＭＳＡ及び／又は構造情報に従う配列保存の判断基準に基づき、ドメイン形成セグメントの各々又は結果として得られるライゲーション誘導性セグメント中にある疎水性ａａを置換することが求められる。目的のタンパク質がＤ－アミノ酸タンパク質である場合、「ボックス７」では、ＭＳＡ及び／又は構造情報が許容する限り多くのＩｌｅ残基を、各ドメイン形成セグメント又は結果として得られるライゲーション誘導性セグメント中にある類似のａａで変異させることが求められ、そして「ボックス８」において、本方法によれば、Ｄ－アミノ酸を使用して全てのライゲーション誘導性セグメントを合成し、且つそれに応じてセグメントを連結することが求められ、目的のタンパク質がＬアミノ酸タンパク質である場合、「ボックス９」では、全てのライゲーション誘導性セグメントをＬ－アミノ酸を使用して合成し、それに応じてロットを連結することが求められ、そして最後に「ボックス１０」において、本方法によれば、全てのドメイン形成セグメントを一緒に折り畳んで目的のタンパク質を得ることが求められる。

【0157】

本発明の一部の実施形態において、本方法によれば、目的のタンパク質のアミノ酸配列を化学的全合成に好適なものにするため、変異させるステップが要件となる。この要件は、目的のタンパク質の長さが過剰であることに起因し得、その場合、対応する生物学的に発現したタンパク質に存在しない分裂部位又は対応する生物学的に発現したタンパク質に存在しないライゲーション誘導性配列を導入するため、さらにはＳＰＰＳ（又はポリペプチドを製造する他の化学的方法）によって実現するのに十分に短いと定義されるライゲーション誘導性セグメントを提供するために、変異が必要となる。この要件は、ライゲーション誘導性セグメントの疎水性が過剰であるため、水性条件下でのポリペプチドの合成及びライゲーションが困難となることに起因し得る。一方、その疎水性を低下させれば、ポリペプチドは、この課題に一層好適になる。

【0158】

本発明の一部の実施形態において、本方法によれば、特に、タンパク質をＤ－アミノ酸タンパク質、即ちその対応する生物学的に製造された（又は発現した）タンパク質の鏡像である、即ち、同等のＬ－アミノ酸タンパク質の鏡像として実現するとき、目的のタンパク質のアミノ酸配列を、化学的全合成コストが低下したものとなるように変異させるステップが必要となる。

【0159】

本発明の実施形態との関連において、用語「対応するタンパク質」、「対応する生物学的に製造されたタンパク質」、「対応する生物学的に発現したタンパク質」は、同義的に使用される用語であって、本願で提供する方法によって製造されるタンパク質と、その機能及びある程度は構造の点において同等であるが、製造過程及びアミノ酸配列は異なるものであり、上述したように、本願で提供する方法を実行する過程において、変異させることのできるタンパク質を意味する。鏡像タンパク質の場合、用語「対応するＬ－アミノ酸タンパク質」は、用語「対応する生物学的に製造されたタンパク質」に、同等のＬ－アミノ酸タンパク質と比較した構造的反転を加えたものと類似する。このように、本願で提供する方法によって製造されるＤ－アミノ酸タンパク質は以下の点で同等のタンパク質と関連する：分裂部位を導入してドメイン形成セグメントをもたらすために起こり得る変異、及び／又はライゲーション誘導性配列を導入するために起こり得る変異、及び／又は残基の疎水性を低減するために起こり得る変異、及び／又はＩｌｅ残基の数を低減するために起こり得る変異以外は実質的に同様の配列を有すること；少なくとも９０％がＬ－アミノ酸残基でなく、むしろＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基で出来ている組成を有すること；実質的に反転した（鏡像）構造を有すること；及び鏡像のリガンド、基質、製造物等を有することを除き、同様の活性を有すること。これらの配列、組成、構造及び活性は、本発明の一部の実施形態による化学的に製造されたタンパク質と、その対応する生物学的に製造されたタンパク質との間にもある程度存在するが、しかし、これらの２つがＬ－アミノ酸残基で出来ており、従って構造及び活性の点で互いの鏡像でないことを除く。

【0160】

タンパク質を化学的に合成する方法の一部には、複数の化学的に合成された鎖のライゲーション後又は連結して一緒に折り畳んだ後の、結果として得られたタンパク質の精製及び単離が含まれる。精製プロトコルは、かかるタンパク質精製作業のための公知の任意のプロトコルであり得、標的タンパク質が熱安定性である一部の場合、このプロトコルは、加熱ステップを含むことで、この熱安定性の利点を生かすことができる。即ち、このプロトコルは、合成／ライゲーションステップ、続く折り畳みステップ、更に続く加熱沈殿ステップを最終結果の精製の一部として含む。加熱沈殿温度は、通常、標的タンパク質の最高安定温度と、不純物（誤って折り畳まれたポリペプチド鎖及び誤ったアミノ酸配列のポリペプチド鎖）の多くについての最低沈殿温度との間に設定される。例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの場合、最高安定温度は、約９５℃であり、従って、加熱沈殿温度は、約８５℃に設定される。Ｄｐｏ４の場合、最高安定温度は、約８６℃であり、従って、加熱沈殿温度は、約７８℃に設定される。沈殿した（熱不安定性の）不純物は、概して、超遠心法及び／又はろ過によって除去されるが、一方、正しく折り畳まれた熱安定性のタンパク質は、上清中に見出され、それから単離することができる。本明細書では、正しく折り畳まれたタンパク質の全収率を増加させるため、複数回の折り畳み及び加熱沈殿ラウンドが実施されることが言及され、１回又は複数回の前の折り畳み及び加熱沈殿ラウンドから沈殿したタンパク質は、かかる手順でよく行われるように廃棄されるのでなく、むしろ更なる再折り畳み及び再加熱沈殿ラウンドに供される。

【0161】

上記に加えて、本発明の範囲は、生物学的に製造されたタンパク質及び／又はタンパク質断片を使用して、合成的に製造されたタンパク質及び／又はタンパク質断片の正しい折り畳みを誘導する場合を包含する。このように、合成タンパク質及びその断片はまた、本発明の一部の実施形態によれば、生物学的に製造されたタンパク質又はその断片と一緒に折り畳まれることによってもたらされるが、一方、その最終結果は、生物学的に製造された部分と、合成的に製造された部分とを有するキメラ多断片／多ドメインタンパク質となり得る。

【0162】

化学的に合成されたタンパク質：
本発明の一部の実施形態のある態様によれば、本明細書に開示される方法によって化学的に合成されるタンパク質が提供される。一部の実施形態において、化学的に製造されたタンパク質は、少なくとも約２４０アミノ酸残基長、又は少なくとも約２５０アミノ酸残基長、又は少なくとも約３００アミノ酸残基長、又は少なくとも約３５０アミノ酸残基長、又は少なくとも約４００アミノ酸残基長、又は少なくとも約４５０アミノ酸残基長、又は少なくとも約５００アミノ酸残基長、又は少なくとも約５５０アミノ酸残基長、又は少なくとも約６００アミノ酸残基長である。

【0163】

化学的に合成されたタンパク質は、目的のタンパク質のいずれでもあり得、酵素、輸送タンパク質、構造／機構タンパク質、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、抗体、体液平衡化タンパク質、ｐＨ平衡化タンパク質、細胞チャネル又は細胞ポンプ等として機能し得る。

【0164】

化学的に合成されたタンパク質は、本明細書では、対応する生物学的に製造されたタンパク質とも称される、その生物学的に製造された及び／又は組換えによって製造された対応物と同じように機能性である。化学的に製造されたタンパク質は、対応する生物学的に製造されたタンパク質の活性の少なくとも５％を保持している。一部の実施形態において、化学的に製造されたタンパク質は、対応する生物学的に製造されたタンパク質の活性の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％を保持している。

【0165】

対応する生物学的に製造されたタンパク質の活性の少なくとも何らかの割合を保持しているとは、生物学的に製造されたタンパク質が触媒活性、特異的結合活性及び／又は任意の構造的に関係のある活性を呈する場合、本発明の対応する化学的に製造されたタンパク質がその活性の少なくとも５％を呈することを意味する。Ｄ－アミノ酸タンパク質の場合、活性は、化学的に得られるか、及び／又は生物学的に得られるかにかかわらず、その対応するＬ－アミノ酸タンパク質と比較したときの、そのエナンチオマータンパク質に対応する適切な／対応するエナンチオマー基質、エナンチオマー反応物、エナンチオマー試薬などを使用して定義、判定及び測定される。

【0166】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｄ－アミノ酸タンパク質であり、このタンパク質は、その対応する生物学的に製造されたＬ－アミノ酸タンパク質の３次元構造と比較して本質的に鏡像を成す３次元構造を呈する。本願においては、（その対応するＬ－アミノ酸タンパク質又は天然に存在するタンパク質に対する）鏡像タンパク質とも称されるＤ－アミノ酸タンパク質を製造するとは、ライゲーション誘導性セグメントを化学的に製造する際に少なくとも７５％、８０％、９０％又は少なくとも９５％のＧｌｙ以外のＤ－アミノ酸残基を使用して、製造することを意味する。

【0167】

タンパク質が少なくとも２つのドメイン形成セグメントを含むと言うとき、それは、本発明の実施形態による、結果として得られる化学的に製造されたタンパク質が、少なくとも２つの非共有結合的に取り付けられた（主鎖原子によって取り付けられているのでない）ポリペプチド鎖を含み、それぞれがドメイン形成セグメントに対応することを意味する。一部の実施形態において、対応するドメイン形成セグメントは、生物学的に製造されたタンパク質の少なくとも１つの対応するファミリーメンバーに共有結合的に取り付けられたポリペプチド鎖である。

【0168】

本願においては、合成Ｌ－／Ｄ－タンパク質を任意の反応に使用すると、その反応混合物を単離して、合成タンパク質をアフィニティー精製によって再生利用し、将来の反応に使用する、又はその稀少な高コストのアミノ酸残基のために再使用できることが注記される。例えば、合成タンパク質は、Ｈｉｓ_６タグなど、任意の公知のアフィニティータグを伴って製造することができ、その使用後、反応混合物を対応するアフィニティー樹脂又はビーズと共にインキュベートすると、反応混合物から合成Ｌ－／Ｄ－酵素をその上に単離させることができる。

【0169】

本方法によって調製される例示的タンパク質：
本発明の一部の実施形態の別の態様によれば、少なくとも約２４０、３００、３５０、４００、５００アミノ酸残基長又はそれを超える、本願で提供する方法によって製造されるタンパク質が提供される。このタンパク質は、対応するライゲーション誘導性セグメントの例えばＳＰＰＳによる化学合成において使用されるアミノ酸に応じて、Ｌ－アミノ酸タンパク質又はＤ－アミノ酸タンパク質であり得る。

【0170】

以下の表１及び表２は、遺伝子にコードされるアミノ酸（表１）及び本発明で使用することのできる非標準／修飾アミノ酸の非限定的な例（表２）を列挙する。

【0171】

【表1】

【0172】

【表2-1】

【0173】

【表2-2】

【0174】

【表2-3】

【0175】

【表2-4】

【0176】

タンパク質の化学的全合成方法を実証するため、本発明者らは、その対応する生物学的に製造された酵素によって触媒される反応を触媒することができる活性酵素を合成した。そうした酵素の１つは、ＤＮＡテンプレートを用いてリボヌクレオチドからＲＮＡを合成することができるＲＮＡポリメラーゼである。以下に続く実施例の節では、例示的ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。別の例において、酵素は、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成することができるＤＮＡポリメラーゼである。以下に続く実施例の節では、例示的ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0177】

本願で提供する方法がＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼの製造に使用されるとき、このユニークな鏡像酵素は、Ｌ－ＤＮＡテンプレートを使用してＬ－リボヌクレオチドからＬ－ＲＮＡを合成することができる。例えば、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼは、Ｄ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0178】

以下に提示するとおり、Ｄ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの分裂部位と、ＷＴ位置番号付けスキームを用いてＫ３６３とＰ３６４との間の第１の分裂部位と、Ｎ６０１とＴ６０２との間の第２の分裂部位とを含むように調製される。代替的に、Ｄ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び本願で提供する方法によって製造されるＬ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ３６３とＰ３６４との間の分裂及び／又はＮ６０１とＴ６０２との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。更に、前記分裂部位は、同じループ、即ち３５７位～３６６位及び／又は５６４位～６０７位にある上述の部位の近傍に選択され得る可能性がある。

【0179】

本発明の一部の実施形態によれば、本願で提供する方法によって製造されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｉ６Ｖ、Ｉ１４Ｌ、Ｉ７４Ｖ、Ｉ８２Ｖ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ１１７Ｌ、Ｉ１４１Ｖ、Ｉ２１０Ｍ、Ｉ２４４Ｌ、Ｉ２８１Ｖ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３２２Ｌ、Ｉ３３０Ｖ及びＩ３６７Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含み得る。これらの変異は、コストのかかるＤ－Ｉｌｅ残基を別の適合性のあるＤ－アミノ酸残基に置換することにより、コスト削減戦略を促進する。

【0180】

本発明のある態様によれば、本願で提供する方法によって製造されるＤ－又はＬ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが提供され、これは、配列番号８３と同一であるか、又は配列番号８３と少なくとも８０～９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有している。

【0181】

本願で提供する方法がＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼの製造に使用されるとき、このユニークな鏡像酵素は、Ｌ－デオキシリボヌクレオチドからＬ－ＤＮＡを合成することができる。例えば、Ｄ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0182】

このように、本発明の別の態様によれば、Ｋ４６７とＭ４６８との間の分裂によって形成される少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む（ここで、位置の番号付けは、対応するＷＴ酵素のアミノ酸位置番号付けに基づく）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが提供される。本明細書では、この部位の近傍、即ちＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのフィンガードメインのコイルドコイルモチーフ中において、例えば４４９位と４９８位との間に他の分裂部位を選択し得ることが注記される。

【0183】

一部の実施形態によれば、本願で提供する合成Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ及びＩ５４０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む。他の実施形態によれば、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を更に含む、本願で提供するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0184】

本発明のある態様によれば、本願で提供する方法によって製造される、ＤＮＡ結合構造ドメイン（配列番号７８）を有する又は有しないＤ－又はＬ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが提供され、これは、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択されるか、又は配列番号５１と少なくとも８０～９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0185】

バイオ直交性データストレージ：
世界的にデータの製造されるペースが一層速まっていることを受け、大量の情報を保存するための信頼できる高密度媒体の必要性の高まりが生じている。天然のＤＮＡは、情報を符号化、格納及び伝搬するように精巧に進化している。

【0186】

緊密に詰め込まれた染色体に膨大なゲノム命令をコードする選り抜かれた天然の分子であるＤＮＡによるストレージが、有望な解決法として浮上している（１～３）。他方で、鏡像ＤＮＡは、バイオ直交性の情報ストレージという課題に独自の適性を示し、その目的上、Ｌ－ＤＮＡデータの登録及び検索方法論が不可欠であるが、大部分は調査されないままである。

【0187】

本発明者らは、同じ情報容量を備えるキラル反転した（鏡像）ＤＮＡが、生物学的分解及び混入を回避する独自の能力を保持し、従って高度にロバストなバイオ直交性データ保管庫としての役割を果たし得ることを企図した。本発明を実施化する中で、Ｌ－ＤＮＡ配列の正確な書き込み及び読み取りのための、本発明の一部の実施形態による忠実度の高い９０ｋＤａのＤ－アミノ酸Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを化学的に合成した。

【0188】

本発明者らは、本発明の一部の実施形態の態様の１つである、鏡像ＤＮＡにおけるデジタルテキストの一節全体の格納を実証した。以下に続く実施例の節を見ると分かるとおり、未精製環境水試料中の痕跡量のメッセージを担持するＬ－ＤＮＡバーコードは、何ヵ月間にもわたり及び潜在的にそれを越えて安定し、増幅可能なままであった。更に、本発明の一部の実施形態によって製造される高忠実度のＤ－ポリメラーゼによれば、鏡像翻訳の実現及び鏡像セントラルドグマの確立に向けて不可欠な工程である完全長キロベースサイズの鏡像遺伝子の正確なアセンブリが可能であった。次世代鏡像酵素ツールの合成、従って長い鏡像遺伝子のアセンブリのこの成功は、鏡像バイオロジーシステムの開発及びその新たに生じつつある応用の探索を変容させるものであった。

【0189】

簡潔に言えば、ＤＮＡは、本質的にデータストレージ分子である。ＤＮＡは、細胞（又は生物全体）が自らを維持するために必要とするあらゆる命令を収容している。こうした命令は、遺伝子中に見出され、遺伝子とは、ＤＮＡにおいて特定のヌクレオチド配列で構成されている各区間である。遺伝子内に収容されている命令を実行に移すには、それが発現するか又はコピーされて、細胞が生命を支えるために必要なタンパク質の産生に使用できる形態にならなければならない。ＤＮＡ内に格納されている命令は、細胞によって二段階、即ち転写及び翻訳を経て読み取られ、プロセシングされる。これらの段階は、それぞれ複数の分子が関わる別個の生化学的過程である。転写時、細胞のＤＮＡの一部は、ＲＮＡ分子を作り出すためのテンプレートとしての役割を果たす。ある場合には、新たに作り出されたＲＮＡ分子自体が最終産物であり、それが細胞内で重要な機能を果たす。他の場合、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡから細胞中のプロセシングのための他の部分にメッセージを運ぶ。ほとんどの場合、この情報は、タンパク質の製造に用いられる。ＤＮＡに格納されている情報を細胞の他の領域に運ぶ特定の種類のＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡと呼ばれる。

【0190】

図４は、Ｌ－ＤＮＡを例示的なＸＮＡとして使用した、本発明の一部の実施形態による分子データストレージを図解するフローチャートである。

【0191】

このように、本発明の実施形態のある態様によれば、Ｄ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ又はＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼ及びそれぞれＬ－リボ核酸又はＬ－デオキシリボ核酸を使用して、バイオ直交性データストレージポリマーを形成する方法が提供され、ここで、前記ポリメラーゼは、本願で提供する方法によって製造される。

【0192】

本発明の実施形態の別の態様によれば、本願で提供するＤ－アミノ酸ＲＮＡポリメラーゼ又は本願で提供するＤ－アミノ酸ＤＮＡポリメラーゼ及びそれぞれＬ－リボ核酸又はＬ－デオキシリボ核酸を使用して、バイオ直交性データストレージポリマーを形成する方法が提供される。

【0193】

本発明の実施形態の別の態様によれば、本願で提供する方法によって製造される少なくとも１つのＤ－アミノ酸タンパク質を使用して、バイオ直交性データストレージポリマーを復号する方法が提供され、ここで、バイオ直交性データストレージポリマーは、Ｌ－リボ核酸又はＬ－デオキシリボ核酸残基を含む。

【0194】

更に本発明の実施形態の別の態様によれば、実質的に上述したような、下記を含むバイオ直交性データストレージシステムが提供される：Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣの４つの文字を使用して配列中に情報データをコードする少なくとも１つのＬ－ＤＮＡと、Ｌ－ＤＮＡの合成（ＤＮＡ配列へのコードの書き込み）及び／又はＬ－ＤＮＡのシーケンシング（ＤＮＡ配列中のコードの読み取り）のためのＤ－アミノ酸ＲＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ。

【0195】

本発明の範囲には、本願及び当技術分野において「ゼノ核酸」又はＸＮＡと称する、他の種類の天然に存在しない又は標準的でないヌクレオチド及びその重合体の使用が含まれることを意図することをここに注記する。このように、本発明の一部の実施形態によれば、分子データストレージを製造及び使用するためのここに提供されるシステム及び方法は、例えば、Eremeeva, E and Herdewijn, P.によって、刊行物“Non canonical genetic material”［Current Opinion in Biotechnology, 2019, 57, pp. 25-33］において考察されるもの、及びChaput, J.C. et al.［Chem. Biol., 2012, 21;19(11), pp. 1360-71］によって考察されるものなどのＸＮＡの使用を含む。

【0196】

Ｌ－ＤＮＡの正確なアセンブリ、増幅及びシーケンシングは、バイオ直交性情報ストレージ、環境及び食品のバーコード化、医療インプラントのモニタリング、法医学検査並びに安全なメッセージングの絶好の機会を提供することができる。これらは、少量の情報伝達Ｌ－ＤＮＡ分子を増幅及びシーケンシングするには余りにも非効率化且つエラー率が高過ぎたことが原因で、ＡＳＦＶ ｐｏｌ Ｘ又はＤｐｏ４などの以前のバージョンの鏡像ポリメラーゼシステムでは実現することのできなかったものである（５、１７、１８、２１）。鏡像遺伝子、更に将来的にはゲノム全体までも正確にアセンブリできれば、本システムは、ゲノムバンク化及び惑星間輸送を目的とした自然界の生物の鏡像ゲノムバックアップコピーの製造にも好適となる可能性がある。

【0197】

鏡像リボソーム：
鏡像セントラルドグマの確立における次の段階は、機能的鏡像リボソームを構築することによって鏡像翻訳を実現することである。本発明者らは、近年、合成Ｌ－ＤＮＡテンプレートを１２０ｎｔの完全長５Ｓ ｒＲＮＡに転写することにより、Ｌ－ＲＮＡ化学合成の限界（典型的には約７０ｎｔ未満）を打破したが、１．５ｋｂの１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２．９ｋｂの２３Ｓ ｒＲＮＡ、並びに翻訳のためのｍＲＮＡを得るには、鏡像遺伝子をより長いＬ－ＲＮＡに転写する能力を有する一層効率的な酵素システムが要求される。１つの可能性は、これまでに実証されているとおり、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに変異させることである。実際、本発明者らは、分裂Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（７個の点変異Ｖ９３Ｑ、Ｅ１０２Ａ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋを有する）を効率的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにリエンジニアリングすることに成功した。しかしながら、長い一本鎖（ｓｓ）Ｌ－ＤＮＡテンプレートの調製及び精製は、別の課題を突き付けるものであり、最初に対処しなければならない。代替的に、二本鎖（ｄｓ）Ｌ－ＤＮＡテンプレートを使用する鏡像バージョンの１００ｋＤａ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを合成できれば、あらゆる鏡像ｒＲＮＡ及び鏡像翻訳に必要なｍＲＮＡの酵素的転写が可能となるはずである。本発明の実施化の過程で、以下に続く実施例の節に提示するとおり、本発明の一部の実施形態による化学的全合成によってＤ－アミノ酸Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが実現した。

【0198】

ラセミ体結晶構造解析：
タンパク質結晶構造解析の技術分野で公知のとおり、タンパク質構造の解明における最初の及び恐らく最大の律速段階は、Ｘ線回折可能な結晶を得ることである。小分子の結晶化実験では、ある分子の２つのエナンチオマーのラセミ混合物が高品質の回折結晶を形成する傾向があることが観察されており、単位格子に観察される対称操作の少なくとも１つは、反転である。構造生物学における新たに出現したラセミ体結晶構造解析領域では、特に大型鏡像タンパク質を探し求めるとき、その希少性に起因して鏡像タンパク質試料の不足に悩まされる。

【0199】

このように、本発明の一部の実施形態によれば、目的のタンパク質の結晶を形成する方法であって、目的のタンパク質と、本明細書で提供するとおりに得られる、その目的のタンパク質のエナンチオモルフとを共結晶化させて、それによりエナンチオマータンパク質対の結晶を形成することによって実行する方法が提供され、ここで、エナンチオモルフは、Ｄ－アミノ酸（鏡像）タンパク質及び対応する目的のＬ－アミノ酸タンパク質である。

【0200】

本発明の別の種類の実施形態において、鏡像エナンチオモルフは、本願で提供するように、鏡像タンパク質によって製造される。例えば、本願で考察するとおりに提供される忠実度の高い鏡像ＲＮＡポリメラーゼを使用してＬ－ＲＮＡを転写し、それによりその対応するＤ－ＲＮＡのエナンチオモルフを製造することができ、次にそれをＤ－ＲＮＡとのエナンチオマー／ラセミ体共結晶化に使用してＲＮＡ構造を解くことができる。

【0201】

ラセミ体結晶構造解析に関する追加情報については、例えば、Matthews, B.W., “Racemic crystallography-Easy crystals and easy structures: What’s not to like?”, Protein Science, 2009, 18(6), pp. 1135-1138、Yeates, T.O. and Kent, S.B.H., “Racemic Protein Crystallography”, Annual Review of Biophysics, 2012,41(1), pp. 41-61、及びMandal, P.K. et al., “Racemic DNA Crystallography”, Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53(52), pp. 14424-14427（これらの内容は、それが本明細書に全て説明されたものとして全体が参照により本明細書に援用される）を参照することができる。

【0202】

シーケンシング：
本発明の一部の実施形態によれば、本合成タンパク質をシーケンシング及び化学的に合成された鏡像ＤＮＡオリゴを分離するための変性シーケンシングＰＡＧＥに使用すると、－１及び－２ｎｔ産物の圧倒的多数が減少することにより、合成オリゴのクオリティが実質的に向上し得る。Ｄ－又はＬ－アミノ酸合成タンパク質のいずれかをこのように使用すると、シーケンシングプロセスの忠実度が向上し、最終的にアセンブルされる遺伝子配列の大多数が正しい配列となる。

【0203】

本発明の一部の実施形態によれば、鏡像ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅されるＬ－ＤＮＡ産物のゲル精製に要求される規模を低減するために、変性シーケンシングＰＡＧＥ（これは、特定の所要量をその「デッドボリューム」として有する）による精製の前に、未標識の担体Ｄ－（又はＬ－）ＤＮＡを試料に加える。本発明の一部の実施形態によれば、Ｌ－ＤＮＡ及びＬ－ＲＮＡなどの鏡像核酸のシーケンシング・バイ・シンセシスには、忠実度の高い合成鏡像ポリメラーゼをホスホロチオエートＬ－ｄＮＴＰと共に使用することができる。また、２つの異なる色素（それぞれＦＡＭ及びＣｙ５）で５’－標識された２つのプライマーによる双方向シーケンシング戦略の使用も、１回の反応におけるリード長を、１６０～１７０ｂｐを超えるまで向上させるために用いられる。

【0204】

試験管内進化法：
本発明の一部の実施形態による、例えば本願で提供する鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用するシーケンシング・バイ・シンセシスの開発は、厄介なＬ－ＤＮＡ化学的シーケンシング手法と比較して一層有効なＬ－ＤＮＡシーケンシング技法の実現に向かう、新たな一歩である。

【0205】

試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）は、インビトロ選択又はインビトロ進化とも称され、１つ又は複数の標的リガンドに特異的に結合する一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかのオリゴヌクレオチドを製造するための分子生物学におけるコンビナトリアルケミストリー技法である。このプロセスは、プライマーとしての役割を果たす、定常の５’末端及び３’末端が隣接した固定長のランダムに製造された配列からなる大型オリゴヌクレオチドライブラリの合成から始まる。長さｎのランダムに製造された領域について、ライブラリ中に存在し得る配列の数は、４^ｎである（各位置について、４つの可能性（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）を有する位置がｎ個）。ライブラリ中の配列が標的リガンド（これは、タンパク質又は小さい有機化合物であり得る）に曝露され、標的に結合しないものは、通常、アフィニティークロマトグラフィー又は常磁性ビーズでの標的捕捉により除去される。結合した配列が溶出され、ＰＣＲによって増幅されて、後続の選択ラウンドのために調製され、溶出条件のストリンジェンシーを増加させると、最も緊密に結合する配列を同定することができる。ＳＥＬＥＸは、臨床目的及び研究目的の両方にとって興味深い標的と結合する幾つものアプタマーの開発に用いられている。また、このような目的で、ＳＥＬＥＸ反応には、化学的に修飾された糖及び塩基を有する幾つものヌクレオチドが取り入れられている。こうした修飾ヌクレオチドにより、新規の結合特性を備え、且つ潜在的に安定性が向上したアプタマーの選択が可能となる。

【0206】

今後、鏡像サンガーシーケンシング及び更に自動化されたハイスループットＬ－ＤＮＡシーケンシング技法のための高忠実度の鏡像ポリメラーゼの（例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性のない変異体又はトランケートバージョンの合成を通した）リエンジニアリングに取り組んでいくことは、マルチプレックスＬ－ＤＮＡシーケンシング及びＬ－アプタマー薬物の直接的な選択のための鏡像試験管内進化法（ＭＩ－ＳＥＬＥＸ）などの新規応用につながり得る（１７、１８）。

【0207】

本願から満了までの特許の存続期間中、多くの関連性のある大型合成Ｄ／Ｌ－タンパク質が開発されるであろうことが予想され、大型合成Ｄ／Ｌ－タンパク質という用語の範囲には、全てのかかる新規技術が先験的に含まれることが意図される。

【0208】

本明細書で使用されるとき、用語「約」は、±１０％を指す（例えば、「約３０」は、２７～３３又は３０±３を意味する）。

【0209】

用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」及びこれらの活用変化形は、「～を含むが、それに限定されない」を意味する。

【0210】

用語「からなる」は、「～を含み、且つそれに限定される」を意味する。

【0211】

用語「から本質的になる」は、組成物、方法又は構造に追加の成分、ステップ及び／又は部品が含まれ得るが、但し、その追加の成分、ステップ及び／又は部品によって特許請求される組成物、方法又は構造の基本的な新規の特徴が事実上変わらない場合に限られることを意味する。

【0212】

本明細書で使用されるとき、ある種の物質に関連して、語句「実質的に欠いている」及び／又は「本質的に欠いている」とは、その物質を完全に欠いているか、又は組成物の総重量若しくは総体積基準で物質を約５、１、０．５若しくは０．１パーセント未満のみ含む組成物を指す。代替的に、プロセス、方法、特性又は特徴に関連して、語句「実質的に欠いている」及び／又は「本質的に欠いている」とは、ある種のプロセス／方法のステップ、又はある種の特性若しくは特徴を完全に欠いているプロセス、組成物、構造又は物品、或いは所与の標準的なプロセス／方法と比較して、ある種のプロセス／方法のステップを約５、１、０．５若しくは０．１パーセント未満のみ実行するプロセス／方法、又は所与の標準と比較して、特性若しくは特徴が約５、１、０．５若しくは０．１パーセント未満であることをもって特徴付けられる特性若しくは特徴を指す。

【0213】

用語「例示的」は、本明細書では、「例、事例又は実例として供すること」を意味して使用される。「例示的」と記載されるいずれの実施形態も、必ずしも他の実施形態と比べて好ましい又は有利であると解釈されるべきとは限らず、及び／又は他の実施形態からの特徴の援用を除外すべきとは限らない。

【0214】

単語「任意選択で」又は「代替的に」は、本明細書では、「一部の実施形態では提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味して使用される。本発明の任意の詳細な実施形態は、複数の「任意選択の」特徴を、かかる特徴が矛盾しない限り含み得る。

【0215】

本明細書で使用されるとき、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、用語「ある化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物を、その混合物を含めて含み得る。

【0216】

本願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上のものであり、簡潔にするために過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されてはならないことが理解されなければならない。それに応じて、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲及びその範囲内にある個々の数値が具体的に開示されたものと考えなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分的範囲並びにその範囲内にある個々の数字、例えば１、２、３、４、５及び６が具体的に開示されたものと考えなければならない。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0217】

本明細書において数値の範囲が指示される場合には常に、指示される範囲内にある引用されるいずれの数（分数又は整数）も含むことが意味される。第１の指示される数と第２の指示される数との「間の範囲をとる／間にある範囲」及び第１の指示される数「から」第２の指示される数「までの範囲をとる／までの範囲」という語句は、本明細書では同義的に使用され、第１及び第２の指示される数並びにそれらの間にある全ての分数及び整数を含むことが意味される。

【0218】

本明細書で使用されるとき、用語「プロセス」及び「方法」は、限定されないが、化学、材料、機械、計算及びデジタル技術分野の当業者に公知であるか、又はその当業者によって公知の様式、手段、技法及び手順から容易に開発されるかのいずれかである様式、手段、技法及び手順を含め、所与の課題を達成するための様式、手段、技法及び手順を指す。

【0219】

本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、病態を解消すること、実質的に阻害すること、その進行を遅らせるか若しくは好転させること、病態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善すること又は病態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に予防することが含まれる。

【0220】

詳細な配列表が参照されるとき、かかる参照は、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じさせる他の変化によって生じる軽微な配列変異を含むとおりの、その相補配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきであり、但し、かかる変異の頻度は、５０ヌクレオチドに１つ未満、代替的に１００ヌクレオチドに１つ未満、代替的に２００ヌクレオチドに１つ未満、代替的に５００ヌクレオチドに１つ未満、代替的に１０００ヌクレオチドに１つ未満、代替的に５，０００ヌクレオチドに１つ未満、代替的に１０，０００ヌクレオチドに１つ未満であるものとする。

【0221】

明確にするため、別々の実施形態に関連して記載されている本発明のある種の特徴は、単一の実施形態に組み合わせても提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするため、単一の実施形態に関連して記載されている本発明の様々な特徴は、別々に若しくは任意の好適な部分的組み合わせにおいて、又は本発明の任意の他の記載される実施形態において好適なものとしても提供され得る。様々な実施形態に関連して記載されるある種の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が実施不能となるのでない限り、それらの実施形態の必須の特徴と考えられてはならない。

【0222】

以上に明示したとおりの且つ以下の特許請求の範囲の節に主張するとおりの本発明の様々な実施形態及び態様について、以下の例に実験的な及び／又は計算されたサポートが見出される。

【実施例】

【0223】

ここで、以下の実施例に参照するが、これらの実施例は、上記の説明と併せて、本発明の一部の実施形態を非限定的な形式で例示するものである。

【0224】

実施例１
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの化学的全合成
天然（Ｌ－アミノ酸タンパク質）及び鏡像型の両方のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの化学的全合成により、本発明の一部の実施形態の概念実証を行った。

【0225】

本願で提供する方法の実施における第一段階は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼに関する利用可能な情報を使用することにより、酵素の化学的全合成につながるような既存の配列特徴を同定すること、及び配列中において、構造的安定性、従って酵素の所望の活性を損なうことなくそこに変異を導入することを可能にするのに十分な構造的柔軟性（緩さ）を備える位置を同定することであった。そのため、Ｐｆｕ－ＷＴ（配列番号４７）、Ｐｆｕ－５ｍ（配列番号４８）、Ｐｆｕ－５ｍ－５５Ｉ（配列番号４９）、Ｐｆｕ－５ｍ－４６Ｉ（配列番号５０）、Ｐｆｕ－５ｍ－３０Ｉ（配列番号５１）、Ｐｆｕ－５ｍ－０Ｉ（配列番号５２）、ＫＯＤ１（配列番号５３）、Ｔｇｏ（配列番号５４）、９°Ｎ－７（配列番号５５）及びＴｏｋ（配列番号５６）ポリメラーゼを使用して多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を実施した。ＭＳＡにより、高度に保存されたアミノ酸が明らかとなり、それらは変わらないままにしておいた一方で、ＭＳＡの他の部分は、そこに追加的なＮＣＬ部位、分裂部位を導入するための変異、疎水性を低下させる変異及びＩｌｅを減量する変異につながる多様性を示した。このように、ＭＳＡに基づいて、Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ及びＩ５４０Ａを、配列の多様なアミノ酸セクションにライゲーション誘導性アミノ酸を導入するため（且つ５４０位のイソロイシンを置換するため）の変異として選択した。ＭＳＡ分析及びタンパク質構造情報に基づいて、イソロイシンＷＴ残基であるＩ３８、Ｉ６２、Ｉ６５、Ｉ８０、Ｉ１２７、Ｉ１３７、Ｉ１５８、Ｉ１７１、Ｉ１７６、Ｉ１９１、Ｉ１９７、Ｉ１９８、Ｉ２０５、Ｉ２０６、Ｉ２２８、Ｉ２３２、Ｉ２４４、Ｉ２５６、Ｉ２６４、Ｉ２６８、Ｉ２８２、Ｉ３３１、Ｉ４０１、Ｉ４３４、Ｉ４４６、Ｉ４７８、Ｉ５５７、Ｉ５９８、Ｉ６０５、Ｉ６１１、Ｉ６１９、Ｉ６３１、Ｉ６４３、Ｉ６４８、Ｉ６５６、Ｉ６７７、Ｉ７１６、Ｉ７３４、Ｉ７４５及びＩ７７２を他の適合性のある残基に置換した。加えて、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸の両方の型で効率的なＲＮＡポリメラーゼに変えるため、Ｖ９３Ｑ、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｙ４１０Ｇ、Ａ４８６Ｌ及びＥ６６５Ｋ変異を導入した。

【0226】

Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を、本発明の一部の実施形態により、本願においてＰｆｕ－Ｎ断片（配列番号５７）及びＰｆｕ－Ｃ断片（配列番号６７）と称する２つのドメイン形成セグメントに分割した。以下の図２Ａ～図２Ｂに見られるとおり、Ｐｆｕ－Ｎ断片を、４０～６２ａａ長の範囲の９個のペプチドセグメント（配列番号５８～６６）に分け、及びＰｆｕ－Ｃ断片を、３３～６３ａａの範囲の６個のセグメント（配列番号６８～７３）に分けた。

【0227】

図２Ａ～図２Ｂは、追加的なＮＣＬ部位（Ｅ１０２Ａ、Ｅ２７６Ａ、Ｋ３１７Ｇ、Ｖ３６７Ｌ）を導入してライゲーション誘導性セグメントを形成し、且つ２５個のイソロイシン残基を置換した変異体Ｐｆｕ－Ｎ断片の合成経路の設計フロー（図２Ａ）、及び追加的なＮＣＬ部位（Ｉ５４０Ａ）を導入すると共に、他の１５個のイソロイシン残基の変異も導入した変異体Ｐｆｕ－Ｃ断片の合成経路の設計フロー（図２Ｂ）を提示する。一方、これらの変異を導入することにより、ＳＰＰＳでのタンパク質合成及びライゲーションプロセスを容易にし、鏡像型の合成コストを削減した。

【0228】

ペプチドセグメントをＦｍｏｃベースのＳＰＰＳによって調製し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により精製し、収束的アセンブリ戦略によるヒドラジドベースのＮＣＬによりアセンブルした後、続いて金属－フリーラジカルベースの脱硫を行った。Ｌ－ポリメラーゼについては、４．３ｍｇのＬ－Ｐｆｕ－Ｎ断片が、分子量（Ｍ．Ｗ．）実測値５４８３０．０Ｄａ（Ｍ．Ｗ．計算値５４８２９．９Ｄａ、分析的ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより決定したとき、図示せず）、２．２ｍｇのＬ－Ｐｆｕ－Ｃ断片が、Ｍ．Ｗ．実測値３５５６３．２Ｄａ（Ｍ．Ｗ．計算値３５５６３．０２Ｄａ）で得られ、Ｄ－ポリメラーゼについては、１６．５ｍｇのＤ－Ｐｆｕ－Ｎ断片がＭ．Ｗ．実測値５４８２９．５Ｄａ、１１．９ｍｇのＤ－Ｐｆｕ－Ｃ断片がＭ．Ｗ．実測値３５５６１．９Ｄａで得られた。合成Ｌ－ポリメラーゼ及びＤ－ポリメラーゼは共に、連続的な透析、続く８５℃での加熱沈殿により折り畳まれ、この加熱沈殿により、正しく折り畳まれたタンパク質の純度が更に向上した（ＥＳＩ－ＭＳ、図示せず）。次に、これらのポリメラーゼのＰＣＲ活性について、短い１００ｂｐの合成Ｄ－又はＬ－ＤＮＡテンプレートで試験し（配列番号１２）、組換え及び合成Ｌ－ポリメラーゼ及びＤ－ポリメラーゼ間で同等の増幅効率が測定された（３％で篩分ける（ｓｉｅｖｉｎｇ）アガロースゲル電気泳動による分析、ＥｘＲｅｄ．Ｍ，ＤＮＡマーカーによる染色、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。ＭはＤＮＡマーカー）。合成Ｌ－ポリメラーゼの忠実度もｐＵＣ１９プラスミド（配列番号８０）からの１．２ｋｂのＤ－ＤＮＡ配列で定量化し、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングによれば、３．６×１０^－６未満のエラー率が測定され（以下の表３を参照されたい）、これは、先行研究に報告されるＷＴ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのものと一致している。

【0229】

【表3】

【0230】

材料：
Ｌ－ＤＮＡオリゴは、Ｈ－８オリゴシンセサイザー（独国、Ｋ＆Ａ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ社）でＬ－デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（米国、マサチューセッツ州、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社）によって合成した。組換えタンパク質発現のためのプライマーは、Ｇｅｎｅｗｉｚ社（中国、北京）に注文した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アセンブリのためのプライマーは、変性シーケンシングＰＡＧＥにより精製した。他のＤＮＡオリゴは、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（ＯＰＣ）（中国、北京、Ｒｕｉｂｉｏｔｅｃｈ社）によって精製した。ＰＡＧＥ ＤＮＡ精製キットは、Ｔｉａｎｄｚ Ｉｎｃ．（中国、北京）から購入した。トリス塩基、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＫＣｌ、塩酸グアニジン（Ｇｎ・ＨＣｌ）及びβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）は、Ａｍｒｅｓｃｏ Ｉｎｃ．（米国、ペンシルベニア州）から購入した。イミダゾール及びＥＤＴＡは、Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（中国、北京）から購入した。２－クロロトリチルクロリド樹脂（ローディング＝０．６ｍｍｏｌｅ／ｇ）は、Ｔｉａｎｊｉｎ Ｎａｎｋａｉ Ｈｅｃｈｅｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．（中国、天津）から購入した。Ｗａｎｇ Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂は、ＣＳＢｉｏ Ｌｔｄ（中国、上海）から購入した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－Ｌ－アミノ酸及びＯ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）は、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．（中国、上海）から購入した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、チオアニソール、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、１，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）、塩化パラジウム（ＰｄＣｌ_２）、２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）及び２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ－０４４）は、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（中国、北京）から購入した。４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（中国、上海）から購入した。ピペリジン、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_２）及び無水酢酸は、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．（中国、上海）から購入した。ＮａＣｌ、ＮａＯＨ及び塩酸は、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ社（中国、北京）から購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｉｔａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．（中国、上海）から購入した。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）、カルバジン酸９－フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ－ＮＨＮＨ_２）、シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（Ｏｘｙｍａ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びＤＬ－１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、Ａｄａｍａｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．（中国、上海）から購入した。還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社（米国、ニュージャージー州）から購入した。無水エーテルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｏｎｇｇｕａｎｇ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（中国、北京）から購入した。アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（米国、ニュージャージー州）から購入した。

【0231】

Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成（Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ）：
ペプチドは、全てＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロ波ペプチドシンセサイザー（米国、ノースカロライナ州、ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＰｒｅｌｕｄｅ Ｘ自動ペプチドシンセサイザー（米国、アリゾナ州、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）でＦｍｏｃベースのＳＰＰＳにより合成した。Ｐｆｕ－Ｎ－９及びＰｆｕ－Ｃ－６などのＣ末端カルボン酸を有するペプチドは、１番目のＣ末端残基を予め負荷したＷａｎｇ Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂（中国、上海、ＣＳＢｉｏ Ｌｔｄ）上で合成した。全ての他のペプチドは、Ｆｍｏｃ－ヒドラジン２－クロロトリチルクロリド樹脂で合成してペプチドヒドラジドを調製した。各ペプチド酸について、１番目の残基は、二重カップリング法によりＷａｎｇ Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂に手動で取り付けた：最初のカップリング反応では、４当量のアミノ酸、３．８当量のＨＣＴＵ及び８当量のＤＩＥＡを使用してアミノ酸を３０℃で１時間カップリングし、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、脱保護することなく、４当量のアミノ酸、４当量のＯｘｙｍａ及び４当量のＤＩＣで第２のカップリング反応を２５℃で一晩行った。全ての樹脂は、ＤＭＦ中で５～１０分間膨潤させた後に使用した。樹脂及びアセンブルされたアミノ酸の両方のＦｍｏｃ基とも、８５℃のＤＭＦ中２０％ピペリジン及び０．１ｍｏｌ／ＬのＯｘｙｍａで処理することによって除去した。Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを除くアミノ酸のカップリングは、４当量のアミノ酸、４当量のＯｘｙｍａ及び８当量のＤＩＣを使用して８５℃で行った。Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨのカップリング反応は、高温での副反応を回避するため、５０℃で１０分間行った。トリフルオロアセチルチアゾリジン－４－カルボン酸－ＯＨ（Ｔｆａ－Ｔｈｚ－ＯＨ）は、Ｏｘｙｍａ／ＤＩＣ活性化を用いて室温でカップリングした。ペプチド鎖アセンブリの完了後、Ｈ_２Ｏ／チオアニソール／トリイソプロピルシラン／１，２－エタンジチオール／トリフルオロ酢酸（０．５／０．５／０．５／０．２５／８．２５）を使用して樹脂からペプチドを切断した。切断反応は、２７℃で撹拌下において２．５時間かかった。混合物中のほとんどのＴＦＡをＮ_２ブローによって除去し、冷エーテルを加えて粗ペプチドを沈殿させた。遠心後、上清を廃棄し、沈殿物をエーテルで２回洗浄した。粗ペプチドをＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏに溶解させて、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより分析し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。

【0232】

ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）：
Ｃ末端ペプチドヒドラジドセグメントを、酸性化したライゲーション緩衝液（６ＭのＧｎ・ＨＣｌ及び０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ３．０の水溶液）に溶解させた。この混合物を氷塩浴（－１０℃）で冷却し、酸性化したライゲーション緩衝液（ｐＨ３．０）中１０当量のＮａＮＯ_２を加えた。活性化反応系を氷塩浴に撹拌下で２５分間置き、その後、ライゲーション緩衝液中４０当量のＭＰＡＡ及び１当量のＮ末端システインペプチドを加え、溶液のｐＨを室温で６．５に調整した。一晩の反応後、ライゲーション緩衝液（ｐＨは７．０に調整）中の１５０ｍＭのＴＣＥＰを加えて反応系を２倍希釈し、この反応系を撹拌下で室温に３０分間置いた。最後に、ライゲーション産物をＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより分析し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。注目すべきことに、Ｐｆｕ－Ｃ－１及びＰｆｕ－Ｃ－２セグメントをライゲーションする間、不溶性Ｐｆｕ－Ｃ－２セグメントに起因して、このライゲーションが極めて非効率的であることが発見され、従ってＧｎ・ＨＣｌの初期濃度を８Ｍに増加させたところ（最終Ｇｎ・ＨＣｌ濃度は約７Ｍ）、それによりこれらの２つのペプチドセグメントの溶解度及びライゲーション効率が大幅に向上した。

【0233】

脱硫：
Ｃｙｓ含有ペプチド（３ｍｇ／ｍｌ）を脱硫緩衝液（６Ｍ Ｇｎ・ＨＣｌ、２００ｍＭのＴＣＥＰ、４０ｍＭの還元型Ｌ－グルタチオン及び２０ｍＭのＶＡ－０４４を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝水溶液、ｐＨ６．８）に溶解した。この混合物を３７℃で一晩撹拌下に置き、脱硫産物をＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより分析し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。

【0234】

Ａｃｍ脱保護：
アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基をＰｄ補助脱保護戦略により除去した。Ａｃｍ保護されたペプチドをＡｃｍ脱保護緩衝液（６Ｍ Ｇｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍのリン酸塩及び４０ｍＭのＴＣＥＰの水溶液、ｐＨ７．０）に１ｍＭの最終濃度となるように溶解し、その後、２０当量のＰｄＣｌ_２を加えた。この反応混合物を撹拌しながら２５℃で一晩インキュベートした。最終濃度が５０ｍＭとなるようにＤＴＴを加えて反応をクエンチした。この反応混合物を撹拌下に１時間置き、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。

【0235】

インビトロでの分裂Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの折り畳み：
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの凍結乾燥したＮ断片及びＣ断片を、１０ｍＭのβ－ＭＥを含有するそれぞれ４Ｍ及び５ＭのＧｎ・ＨＣｌに溶解した。等濃度の２つの断片（０．５μＭ）を混合した後、続いて４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロールを含有する緩衝液で４℃において一晩透析することにより、インビトロでのタンパク質の折り畳みを実施した。折り畳まれたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを８５℃に１５分間加熱することにより熱不安定性ペプチドを沈殿させて、続いてそれを４℃において２０，０００×ｇで４０分間遠心することにより除去した。上清を濃縮し、ストレージ緩衝液である１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０％のグリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＮＰ－４０非イオン性界面活性剤、０．２％のＴｗｅｅｎ ２０、２ｍＭのＤＴＴで透析した。

【0236】

ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳ：
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析及び精製は、全てＳＰＤ－２０Ａ紫外可視検出器及びＬＣ－２０ＡＴ溶媒送達ユニットを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム（日本、京都、島津製作所）で行った。分析では、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ４カラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）（中国、上海、Ｗｅｌｃｈ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社）を１ｍｌ／分の流速で使用してライゲーション反応をモニタし、ペプチド産物の純度を分析した。Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ４及びＣ１８カラム（５μｍ、２１．２×２５０ｍｍ又は５μｍ、１０×２５０ｍｍ）（中国、上海、Ｗｅｌｃｈ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社）を使用して、それぞれ粗ペプチド及びライゲーション産物を４～８ｍｌ／分の流速で分離した。精製した産物をＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ－２０２０システム（日本、京都、島津製作所）でＥＳＩ－ＭＳにより特徴付けた。

【0237】

タンパク質発現及び精製：
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子をｐＥＴ－２８ｃプラスミドにクローニングし、ｐＥＡＳＹ－Ｕｎｉシームレスクローニング及びアセンブリキット（中国、北京、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によって変異体を構築した。Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグに融合したタンパク質をＬＢ培地中のE. coli株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して発現させた。誘導した細胞を回収し、溶解緩衝液（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのβ－ＭＥ、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、ｐＨ８．０）に再懸濁した。細胞ライセートを８５℃で１５分間加熱し、続いて熱不安定性タンパク質を４℃において２０，０００×ｇで４０分間遠心することによって除去した。上清をＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（中国、蘇州、Ｓｅｎｈｕｉ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈ．社）中４℃で１時間インキュベートした。４０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール及び１０ｍＭのβ－ＭＥを含有する緩衝液によって樹脂を洗浄し、次にそれを、４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール及び１０ｍＭのβ－ＭＥを含有する緩衝液によって溶出させた。精製及び濃縮したＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び変異体を、１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０％のグリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＮＰ－４０非イオン性界面活性剤、０．２％のＴｗｅｅｎ ２０及び２ｍＭのＤＴＴを含有するストレージ緩衝液で透析した。

【0238】

ＰＣＲ活性及び忠実度：
１×Ｐｆｕ緩衝液（中国、北京、Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、テンプレート及びポリメラーゼと共に含有する５０μｌの反応系で天然及び鏡像ＰＣＲ反応を実施した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体のＰＣＲ活性を定量化するため、ポリメラーゼを１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって野生型（ＷＴ）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼと同じ濃度に調整した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、E. coliから発現させて精製した組換え分裂変異体Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの断片と、同じ配列の合成の天然及び鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼとの分子量が類似していることが確認された（結果は図示せず）。ＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、５０～６５℃（Ｔｍに依存する）で３０秒及び７２℃で１～７分（アンプリコンの長さに依存する）を１０～３５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）とした。合成Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの増幅効率を定量化するため、１００ｂｐのＤＮＡ配列をテンプレートとして使用した。組換え、合成Ｌ－及び合成Ｄ－Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（分裂Ｐｆｕ－５ｍ－３０Ｉ）によるＰＣＲ増幅について、３％の篩分けアガロースゲル電気泳動により分析し、ＥｘＲｅｄによって染色した（結果は図示せず）。合成Ｄ－Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅効率は、産物バンドの強度に基づいて推定して、約１．５と測定された。最初の９サイクルの増幅産物について、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により分析した。合成Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を調べるため、天然ＰＣＲ（１．２ｋｂのＤ－ＤＮＡ）におけるサイクル４５後の産物をＶ－ｅｌｕｔｅゲルミニ精製キット（中国、北京、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｏｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）により精製し、サンガーシーケンシングのためにゼロバックグラウンドＺＴ４ Ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｌｕｎｔ Ｆａｓｔ Ｃｌｏｎｅ Ｋｉｔ（中国、北京、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｏｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によりクローニングし、先述の方法に従って計算した。

【0239】

実施例２
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの化学的全合成及びその使用
上記で考察したとおり、二本鎖（ｄｓ）Ｌ－ＤＮＡテンプレートを使用する鏡像バージョンのＲＮＡポリメラーゼを合成すれば、あらゆる鏡像ｒＲＮＡ及び鏡像翻訳に必要なｍＲＮＡの酵素的転写が可能となり得る。そのため、本発明の一部の態様の概念実証における別の段階として、２分裂部位設計である天然（Ｌ－アミノ酸タンパク質）及び鏡像バージョンの両方の１００ｋＤａのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを化学的に合成した。

【0240】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、公知の分裂形態を有し、例えば、Segall-Shapiro et al.［Mol Syst Biol., 2014, 30(10), pp. 742］は、トランスポゾンベースの方法を用いてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ中の幾つかの分裂部位を見つけ出した。Tiyun Han et al.［ACS Synth Biol., 2017, 6(2), pp. 357-366.］は、異なる状況で光活性化型遺伝子発現を実施するため、分裂Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをベースとして、光活性化が可能な遺伝子スイッチを設計した。しかしながら、これらの天然酵素で使用される分裂部位は、必ずしもＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの化学合成に好適とは限らない：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの分裂部位の一部は、その酵素活性を大幅に変化させることになり、一部は、タンパク質ペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端の近傍にあるため、１つ以上の大型タンパク質断片（４００～５００ａａを超える）が生じることになり、それは、化学的に合成するにはなおも大き過ぎるであろうものである。

【0241】

実際的なドメイン形成セグメントをもたらすため、低い配列保存性及び構造的柔軟性という判断基準を用いて、本発明の一部の実施形態による、これまで提案されたことのない第２の分裂部位、即ちＫ３６３とＰ３６４との間の分裂部位を同定した。Segall-Shapiro et al.によって報告されるＮ６０１とＴ６０２との間の分裂部位と、本発明を実施化する間に発見されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの構造の溶媒露出ループ中の分裂部位（Ｋ３６３とＰ３６４との間）とが一緒になって、酵素活性及び忠実度を大きく改変することなく、化学合成に好適な（典型的には４００～５００ａａ未満の）ほぼ等しい長さの以下の３つの断片にポリメラーゼを分割した：３６９ａａ Ｔ７－分裂－Ｎ断片（Ｎ末端にＨｉｓ_６タグが取り付けられている）、２３８ａａ Ｔ７－分裂－Ｍ断片及び２８２ａａ Ｔ７－分裂－Ｃ断片。上述の分裂部位は、同じループ、即ち３５７位～３６６位及び／又は５６４位～６０７位にある上述の部位の近傍にあるように選択することができる。同時に、分裂Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを転写ＡＮＤ論理として使用することができる。例えば、タンパク質を断片に分割し、且つ制御ドメインを用いてその再構成を調節するというエンジニアリング戦略に伴い、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの活性が外部シグナルによって直接制御される遺伝子スイッチを得ることができる。優れた遮光時オフ／入光時オン特性を備えるロバストな切替可能システムが、制御ドメインとしての光活性化可能なＶＶＤドメイン及びその変異体により得ることができる。

【0242】

また、Ｔ７－ＷＴ（配列番号８２）、Ｔ７－３７Ｉ（配列番号８３）、ＹｅｎＰ（配列番号８４）、ｐｈｉＥａｐ（配列番号８５）及びＫｐｎＰ（配列番号８６）ポリメラーゼを使用した多重配列アラインメント（ＭＳＡ）並びに構造情報に基づいて、系統的イソロイシン置換手法も実施し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ中の幾つものイソロイシン（５１個中１４個又は２７％のＩｌｅ残基）を、その酵素活性及び忠実度を大きく改変することなく、バリン、ロイシン及びメチオニンなどの他のアミノ酸に変異させた（Ｉ６Ｖ、Ｉ１４Ｌ、Ｉ７４Ｖ、Ｉ８２Ｖ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ１１７Ｌ、Ｉ１４１Ｖ、Ｉ２１０Ｍ、Ｉ２４４Ｌ、Ｉ２８１Ｖ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３２２Ｌ、Ｉ３３０Ｖ、Ｉ３６７Ｌ）。この手法により、このＤ－ポリメラーゼを合成するためのアミノ酸コストが削減されることになった。これは、将来のその大規模合成及び実際的応用を促進するであろう。

【0243】

図３Ａ～図３Ｃは、イソロイシン残基の置換、新規ＮＣＬ及びＫ３６３とＰ３６４との間の新規分裂部位（これらは、ＳＰＰＳにおけるタンパク質合成及びライゲーションプロセスを容易にし、且つ鏡像バージョンの合成コストを削減するために導入した）を含めた、３６９ａａ変異体Ｔ７－分裂－Ｎ断片（配列番号８７）（図３Ａ）、２３８ａａ変異体Ｔ７－分裂－Ｍ断片（配列番号９４）（図３Ｂ）及び２８２ａａ変異体Ｔ７－分裂－Ｃ断片（配列番号１０１）（図３Ｃ）の合成経路の設計フローを提示する。

【0244】

ライゲーション誘導性残基の置換を導入することにより、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの化学的全合成を更に行った。Ｔ７－分裂－Ｎ断片を３２～７６ａａ長の範囲の７個のペプチドセグメント（配列番号８８～９４）に分け、Ｔ７－分裂－Ｍ断片を２３～４５ａａ長の範囲の６個のペプチドセグメント（配列番号９６～１０１）に分け、Ｔ７－分裂－Ｃ断片を４１～７５ａａ長の範囲の５個のペプチドセグメント（配列番号１０３～１０７）に分けた。これらのペプチドセグメントは、ＦｍｏｃベースのＳＰＰＳによって調製し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により精製し、収束的アセンブリ戦略でヒドラジドベースのＮＣＬによりアセンブリした後、続いて金属－フリーラジカルベースの脱硫を行った。合成、ライゲーション、精製及び凍結乾燥後、Ｌ－ポリメラーゼについては、約３ｍｇのＴ７－分裂－Ｎ断片が分子量（Ｍ．Ｗ．）実測値４１３６９．０Ｄａ（Ｍ．Ｗ．計算値４１３７２．６Ｄａ）、約２．５ｍｇのＴ７－分裂－Ｍ断片のＭ．Ｗ．が２６７８６．０Ｄａ（Ｍ．Ｗ．計算値２６７８７．４Ｄａ）、約４．８ｍｇのＴ７－分裂－Ｃ断片がＭ．Ｗ．３１４５９．０Ｄａ（Ｍ．Ｗ．計算値３１４５９．９Ｄａ）で得られ、Ｄ－ポリメラーゼについては、約９ｍｇのＤ－Ｔ７－分裂－Ｎ断片が分子量（Ｍ．Ｗ．）実測値４１３７３．０Ｄａ、約８ｍｇのＴ７－分裂－Ｍ断片がＭ．Ｗ．２６７８７．０Ｄａ、約１５ｍｇのＴ７－分裂－Ｃ断片のＭ．Ｗ．が３１４５９．０Ｄａで得られた。

【0245】

インビトロでの合成ポリメラーゼの折り畳み：
連続透析、続く限外ろ過によって不純物を沈殿させることにより、合成ポリメラーゼを折り畳んだ。

【0246】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの凍結乾燥した合成Ｎ、Ｍ及びＣ断片を、それぞれ６ＭのＧｎ・ＨＣｌ及び２０ｍＭのＤＴＴを含有する変性緩衝液に溶解した。Ｎ、Ｍ及びＣ断片を等しく（０．５ｎｍｏｌ／ｍｌ）混合し、且つ復元緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）で４℃において２４時間、穏やかに撹拌しながら透析することにより、タンパク質の折り畳みを実施した。復元後、５０％のグリセロール、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０ｍＭのＤＴＴを含有するストレージ緩衝液で酵素を４℃で１２時間、穏やかに撹拌しながら透析した後、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｔｒａ遠心フィルタ（０．５ｍｌ、１００，０００ＭＷＣＯ）を使用して限外ろ過を行った。

【0247】

合成Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写活性及び忠実度：
１×Ｔ７反応緩衝液（中国、北京、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を、５００μＭの各ｒＮＴＰ、１０％のＤＭＳＯ、５ｍＭのＤＴＴ、テンプレート及びポリメラーゼをすべて含有する１０μｌの反応系で天然及び鏡像転写を実施した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びその変異体の転写活性を定量化するため、１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥによってポリメラーゼを野生型（ＷＴ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと同じ濃度に調整した（結果は図示せず）。反応液を３７℃で様々な時間にわたってインキュベートした。天然及び鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写活性が示したところによれば、このポリメラーゼは、１６０ｂｐのＤＮＡテンプレート（配列番号１０８）及び１．５ｋｂのＤＮＡテンプレート（配列番号１０９）の転写を成功させることができ、合成鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって１．５ｋｂのＬ－ＤＮＡテンプレートから広範囲にわたる長さのＬ－ＲＮＡ分子を製造できることが指摘される（結果は図示せず）。異なる長さの精製及び濃度決定された一本鎖Ｌ－ＲＮＡ転写物の混合物は、未変性又は変性ゲル上でのＲＮＡのサイズ処理及び定量化の際のＲＮＡマーカー（又はＲＮＡラダー）として使用することができ、これは、その天然ＲＮアーゼ耐性のため、市販のＤ－ＲＮＡマーカー（Ｄ－ＲＮＡラダー）よりも優れている。合成Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの忠実度も、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ高忠実度逆転写酵素によるＤＮアーゼＩ消化した転写産物の逆転写、続く高忠実度のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅及びサンガーシーケンシングによるアンプリコンのシーケンシングによって調べ、先行研究に報告されるＷＴ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのエラー率と一致するエラー率（１０^－６程度の大きさ）が測定された。

【0248】

Ｌ－ｔＲＮＡ^Ｓｅｒチャージ：
変異型の鏡像Ｄｐｏ４（Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ）によってＬ－ｔＤＮＡ^Ｓｅｒ（配列番号１１０）をアセンブルした。Ｌ－ｔＲＮＡ^Ｓｅｒを高忠実度鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、１×Ｔ７反応緩衝液Ａ（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）を２ｍＭの各Ｌ－ｒＮＴＰ、１０％のＤＭＳＯ、０．３μＭのテンプレート及び２μＭのポリメラーゼと共に含有する反応系を３７℃で一晩インキュベートした。産物を変性ＰＡＧＥによって単一ヌクレオチド分解能で精製し、精製産物を１０％の変性ＰＡＧＥにより分析した（結果は図示せず）。２５ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、２μＭのＬ－ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ及び１０μＭのＬ－ｄＦｘ中でＬ－ｔＲＮＡ^Ｓｅｒチャージを実施した。この反応系を９５℃で２分間加熱し、ゆっくりと室温に冷却してアニーリングさせた。次に、この系に１００ｍＭのＭｇＣｌ_２を加え、反応系を室温で１０分間、次に４℃で１０分間インキュベートした。最後に、この系に５ｍＭのＤ－Ｓｅｒ－ＤＢＥを加え、反応系を４℃で６時間インキュベートした。１０分の１容量の３ＭのＮａＯＡｃ及び２．５容量のエタノールを加えることによりエタノール沈殿を実施し、－２０℃で一晩インキュベートした。産物を８％の酸性ＰＡＧＥにより分析した（結果は図示せず）。

【0249】

Ｌ－１６Ｓ ｒＲＮＡ精製：
Ｌ－１６Ｓ ｒＤＮＡ（配列番号１０９）を高忠実度の鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによってアセンブリした。Ｌ－１６Ｓ ｒＲＮＡを高忠実度の鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、１×Ｔ７反応緩衝液（中国、北京、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を５００μＭの各Ｌ－ｒＮＴＰ、１０％のＤＭＳＯ、５ｍＭのＤＴＴ、テンプレート及びポリメラーゼと共に含有する反応系を３７℃で一晩インキュベートした。２％の低融点アガロースゲル（米国、Ａｍｅｒｓｃｏ社）からβ－アガラーゼ消化により転写産物を精製した。ＲＮＡ試料を含有するゲル切片を１０容量の１×β－アガラーゼ緩衝液によって室温で６０分間平衡化させて、次に７０℃で１５分間融解させて、４５℃に冷却した。融解したアガロース溶液を２単位のβ－アガラーゼ（中国、北京、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）と共に４５℃で６０分間インキュベートした後、続いて－２０℃に１５分間置き、４℃で１５分間遠心した。上清を新しい微量遠心管に移して１０分の１容量の３ＭのＮａＯＡｃ及び２．５容量のエタノールを加えることによりエタノール沈殿させて、－２０℃で一晩インキュベートした。精製産物を３％のアガロースゲルによって分析した（結果は図示せず）。

【0250】

Ｌ－グアニンセンサー：
合成Ｌ－及びＤ－Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤ－及びＬ－グアニンセンサーの特異性を追うことにより、グアニンセンサーの分子識別能を実証した。Ｌ－グアニンセンサーＤＮＡテンプレート（配列番号１１１）をＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによってアセンブリした。Ｌ－グアニンセンサーを高忠実度の鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、１×Ｔ７反応緩衝液Ａ（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）を２ｍＭの各Ｌ－ｒＮＴＰ、１０％のＤＭＳＯ、０．２μＭのテンプレート及び２μＭのポリメラーゼと共に含有する反応系を３７℃で一晩インキュベートした。産物を８Ｍの尿素中のポリアクリルアミドゲルにより精製し、精製産物を１０％の変性ＰＡＧＥにより分析した（結果は図示せず）。４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１２５ｍＭのＫＣｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中で１μＭのＬ－グアニンセンサー及び１０μＭのＤＦＨＢＩを３７℃でインキュベートした。次に、この溶液に１ｍＭのグアニンを速やかに加え、以下の機器パラメータ：励起波長、４６０ｎｍ、発光波長、５００ｎｍ、スリット幅、１２ｎｍを用いて常時照明下において３７℃で１５分間にわたって蛍光発光を記録した。０．１μＭのＲＮＡ及び１０μＭのＤＦＨＢＩを１００μＭのグアニン又は競合分子と共にインキュベートし、５００ｎｍの蛍光発光に関してアッセイした。グアニンセンサーは、１００μＭのグアニンで飽和し、同じ濃度でＧＴＰ及びアデニンに対して高度な分子識別能を示した（結果は図示せず）。

【0251】

Ｌ－３８－６ ＲＮＡ重合反応：
Ｌ－３８－６リボザイムのＤＮＡテンプレート（配列番号１１２）及びＬ－クラスＩリガーゼＤＮＡテンプレート（配列番号１１３）をＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによってアセンブリした。ＲＮＡを高忠実度の鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、１×Ｔ７反応緩衝液Ａ（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）を２ｍＭの各Ｌ－ｒＮＴＰ、１０％のＤＭＳＯ、０．３μＭのテンプレート及び２μＭのポリメラーゼと共に含有する反応系を３７℃で一晩インキュベートした。産物を８Ｍの尿素中のポリアクリルアミドゲルによって精製した（結果は図示せず）。ＲＮＡ重合反応には、１００ｎＭのＬ－３８－６リボザイム（配列番号１１４）、８０ｎＭのＬ－５’－ＦＡＭ標識プライマー（配列番号１１５）及び１００ｎＭのＬ－クラスＩリガーゼテンプレート（配列番号１１６）を使用した。ＲＮＡをアニーリングさせるため、初めに８０℃で３０秒間加熱し、次にゆっくりと１７℃に冷却し、次に各４ｍＭのＬ－ｒＮＴＰ、２００ｍＭのＭｇＣｌ_２、２５ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．３及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する反応混合物に加え、それを１７℃で様々な時間にわたってインキュベートした。産物をｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（米国、カリフォルニア州、ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）によって濃縮し、次に変性緩衝液（９８％のホルムアミド、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ）と混合した後、続いて６５℃になるまで１０分間加熱し、次に迅速に氷上に置いた。この試料を８Ｍ尿素中１０％のポリアクリルアミドゲルにより分離し、Ｃｙ２モードで動作するＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ＋システムによってスキャンした。

【0252】

天然及び鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡ分解の反応速度：
制御された条件下におけるＲＮＡの完全性を評価するため、天然１６Ｓ ｒＲＮＡ、天然１６Ｓ ｒＲＮＡとＲＮアーゼ阻害薬及び鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡを含む３つの調製転写物をバイオアナライザー（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）方法によって検出し、解析した。天然及び鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡをそれぞれ天然及び鏡像Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、２％低融点アガロースゲルからβ－アガラーゼＩ消化によって精製した。精製したＲＮＡを３７℃に５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間、７日間、１５日間、３０日間、６０日間及び１００日間置き、ＲＮＡの品質をマイクロチップゲル電気泳動の電気泳動図に基づいて判定した。天然１６Ｓ ｒＲＮＡについて、３７℃に３０分間置いたとき分解の徴候は、最小限しか観察されず、１時間で分解は一層明白となり、ベースラインの実質的な上昇があった。３７℃で６時間後、分解が進んだことに起因してピークが完全に消失した。ＲＮアーゼ阻害薬を伴う天然１６Ｓ ｒＲＮＡの試料では、３７℃に４時間置いたとき、分解の徴候は最小限しか観察されず、８時間でＲＮＡの分解は一層明白となり、ベースラインの実質的な上昇があった。３７℃で４８時間後、分解が進んだことに起因してピークが完全に消失した。鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡの試料では、３７℃に１５日間置いたときでさえ、分解の徴候は検出できなかった。これは、ＲＮアーゼを完全に取り除いた条件下では、ＲＮＡがより強い安定性を有することを示している。Ｌ－ＲＮＡシステムを使用してＲＮＡの異なる条件下での加水分解反応速度を測定すると、ＲＮアーゼ阻害試薬の有効性を評価するための対照を供することができる。

【0253】

実施例３
鏡像ＤＮＡ情報ストレージ
高忠実度の鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの入手後、Ｌ－ＤＮＡ配列の正確な書き込み及び読み取りを通して鏡像ＤＮＡ情報ストレージにおけるその応用を探索することにより、本発明の一部の実施形態による鏡像ＤＮＡ情報ストレージの概念実証を行った。

【0254】

鏡像分子及び鏡像バイオロジーシステムの概念が初めて提案されたルイ・パスツールによる１８６０年の刊行物からの下記の一節をＤＮＡ配列にコードし（表４を参照されたい）、それぞれ４個の７０～９０ｎｔの短い合成Ｌ－ＤＮＡオリゴからアセンブルした１１個の２２０ｂｐ長のＬ－ＤＮＡセグメントにアーカイブ化した（表５）。
Pasteur: “And consequently, if the mysterious influence to which the
asymmetry of natural products is due should change its sense or direction,
the constitutive elements of all living beings would assume the opposite
asymmetry. Perhaps a new world would present itself to our view. Who could
foresee the organisation of living things if cellulose, right as it is,
became left; if the albumen of the blood, now left, became right? These
are mysteries which furnish much work for the future, and demand henceforth
the most serious consideration from science.”

【0255】

【表4】

【0256】

各々４個の７０～９０ｎｔの短い合成Ｌ－ＤＮＡオリゴから鏡像アセンブリＰＣＲを用いて鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによってアセンブルした２２０ｂｐの情報格納用二本鎖Ｌ－ＤＮＡセグメント及び１１個のセグメントの全てを含むＬ－ＤＮＡストレージライブラリ（Ｌ－ライブラリ）を２．５％のアガロースゲル電気泳動により分析し、ＥｘＲｅｄ．Ｍ，ＤＮＡマーカーによって染色し（結果は図示せず）、表５に掲載した。表５は、Ｌ－ＤＮＡ情報ストレージに使用した配列を示し、小文字は、増幅のためのＭ１３－Ｆ及びＭ１３－Ｒ配列であり、下線を付した（アンダースコア、アンダーストライク）文字は、個々のセグメントのシーケンシングのためのユニークな配列である。

【0257】

【表5-1】

【0258】

【表5-2】

【0259】

Ｌ－ＤＮＡの読み取りは、シーケンシング・バイ・シンセシスにより、ホスホロチオエート手法（Ｌ－デオキシヌクレオシドα－チオ三リン酸（Ｌ－ｄＮＴＰαＳ）及び２－ヨードエタノールによる切断を伴う）によって鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用するか、又はＬ－ジデオキシヌクレオシド三リン酸（Ｌ－ｄｄＮＴＰ）での連鎖停止手法によって変異体鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して実現することができる。双方向シーケンシング手法も適用しており、２つの異なる色素（それぞれＦＡＭ及びＣｙ５）による５’標識プライマーを使用したところ、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ、ＰＣＲ増幅）による１回の反応における最大リード長が約１８０ｂｐまで向上した。ストレージ媒体中にある情報を担持するＬ－ＤＮＡの２０３ｂｐ配列を、ＤＮアーゼＩ処理したＬ－ＤＮＡストレージライブラリからＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによってセグメント特異的シーケンシングプライマーでそれぞれ増幅し、２．５％のアガロースゲル電気泳動により分析し、ＥｘＲｅｄ．Ｍ，ＤＮＡマーカーによって染色し（結果は図示せず）、且つＬ－ＤＮＡストレージセグメントＳ１（配列番号１）をホスホロチオエート手法によって鏡像ＤＮＡポリメラーゼを使用してシーケンシングすることにより、コードされたデジタルデータを取得した。具体的には、Ｌ－ＤＮＡ Ｓ１セグメントを４回の別個のＰＣＲ反応でＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによって５’－ＦＡＭ標識（フォワード）及び５’－Ｃｙ５標識（リバース）シーケンシングプライマーで特異的に増幅し、その反応内において、Ｌ－ｄＮＴＰの１つが対応するＬ－ｄＮＴＰαＳに置換され、各々が２－ヨードエタノールによって切断された。１０％の変性ＰＡＧＥにより分析し、Ｃｙ２及びＣｙ５モードで動作するＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ＋システムによってスキャンした。Ｌ－ｄＮＴＰαＳ及び５’標識フォワード及びリバースシーケンシングプライマーでのＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによる情報格納用Ｌ－ＤＮＡセグメントＳ１のシーケンシングクロマトグラムをＩｍａｇｅＪソフトウェアによって処理した（結果は図示せず）。鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌ－ＤＮＡストレージセグメントの増幅及びシーケンシングが可能であるものの、実際の実験には、その合成の簡便さからＤ－Ｄｐｏ４を使用した。

【0260】

キラル・ステガノグラフィー：
ステガノグラフィーは、受取人以外にメッセージを見ることができないか又はその存在を知ることができないようにメッセージを隠す技術及び科学として公知である。これは、情報自体の存在を隠すのでなく、その内容のみを隠すクリプトグラフィーとは対照的である。本願で提供するＬ－ＤＮＡ情報ストレージシステムは、キラル・ステガノグラフィー実験の設計を通してセキュリティ通信にも適用することができ、この実験は、ルイ・パスツールの１８６０年の一節をコードするＤ－ＤＮＡストレージライブラリが「カバーテキスト」としての役割を果たし、Ｌ－ＤＮＡ鍵が「ステゴテキスト」（秘密のメッセージ）の解読を支援するというものである。秘密のメッセージをなおも更に偽装するため、キメラＤ－ＤＮＡ／Ｌ－ＤＮＡ鍵分子（配列番号４６）が読み取りのキラリティーに応じて偽のメッセージ「エラー」又は秘密のメッセージ「ミラー」のいずれかを伝えるように設計した。Ｄ－ＤＮＡストレージライブラリをサンガーシーケンシングによりシーケンシングして、「カバーテキスト」を取得した。天然ＰＣＲを使用すると、ストレージライブラリに埋め込まれたキメラ鍵のＤ－ＤＮＡ部分のみを増幅及びシーケンシングすることができ、偽のメッセージが明らかとなる。一方、鏡像ＰＣＲを使用すると、キメラ鍵のＬ－ＤＮＡ部分を増幅及びシーケンシングすることができ、秘密のメッセージが明らかとなる。ステガノグラフィー及びクリプトグラフィーは、データの秘密を守る２つの卓越した技法である。ステガノグラフィーは、秘密のメッセージの存在を隠匿する技術であり、一方、クリプトグラフィーは、秘密のメッセージを読み取り不能な形式に変換する慣用手段を指す。ここで開発したキラル・ステガノグラフィーは、ＤＮＡクリプトグラフィーと組み合わせることにより、暗号化されたデータを使用して追加のセキュリティ層を提供できる可能性がある。

【0261】

図５は、本発明の一部の実施形態による、一見して通常のＤ－ＤＮＡストレージライブラリにキメラＤ－ＤＮＡ／Ｌ－ＤＮＡ鍵分子を埋め込むことにより、秘密のメッセージを運ぶＤＮＡベースのステガノグラフィーを図解するフローチャートを提示する。

【0262】

Ｌ－ＤＮＡ情報ストレージ媒体が自然環境からの生物学的分解及び混入を回避する能力を実証するため、地域の池から淡水試料を採取し、採取した水試料に対し、試料採取場所の情報（「蓮池、北京」）をコードする痕跡量の１００ｂｐのＬ－ＤＮＡバーコード（配列番号１２）（５０μｇ／Ｌ又は７７０ｐＭ）（表５）を加えた。顕著なことに、メッセージ担体のＬ－ＤＮＡバーコードは、最長７ヵ月（任意に選択された時間）にわたり及び潜在的にそれを越えて安定し、増幅可能なままであった。比較すると、同じ配列及び濃度のＤ－ＤＮＡバーコードは、１日経ったのみで増幅不可能となった。具体的には、２４時間後のＬ－Ｄｐｏ４－５ｍによるＤ－ＤＮＡバーコードの増幅後、及び１年後のＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによるＬ－ＤＮＡバーコードの増幅後に、続いてアガロースゲル電気泳動を行った。は４０ｍｌの池水試料中で、Ｌ－Ｄｐｏ４－５ｍによる２４時間後のＤ－ＤＮＡバーコードのＰＣＲ増幅を実行し、４０ｍｌの池水試料中で、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍによる１年後のＬ－ＤＮＡバーコードのＭＩ－ＰＣＲ増幅を実行し、３％の篩分けアガロースゲル電気泳動により分析し、ＥｘＲｅｄ．Ｍ，ＤＮＡマーカーによって染色した（結果は図示せず）。

【0263】

更に、水試料から抽出した微生物ＤＮＡのＬ－ＤＮＡバーコード化も、それがＤ－ポリメラーゼ及びＬ－ＤＮＡプライマーによる鏡像ＰＣＲによって特異的に増幅可能であったと共に、Ｄ－ＤＮＡメタゲノム微生物シーケンシング結果に影響を及ぼさなかった点でバイオ直交性である。

【0264】

Ｌ－ＤＮＡ配列の正確な書き込み及び読み取りに後押しされて、高忠実度の鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる完全長１．５ｋｂの鏡像細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のアセンブリを行った。この試みは、以下の二段階アセンブリ手順を用いて、Ｄ－ＤＮＡに対して合成Ｌ－ポリメラーゼを使用して遺伝子アセンブリを試験することから始めた：初めに約９０ｎｔの短い合成オリゴから４５０～６００ｂｐのＤＮＡブロックをアセンブルし（表６）、続いてＤＮＡブロックを完全長１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号８１）にアセンブルする第２段階を行った。

【0265】

【表6-1】

【0266】

【表6-2】

【0267】

最初の試みでは、完全長Ｄ－ＤＮＡ産物のサンガーシーケンシングにおいて、アセンブルされた配列のうち、正しいものは僅か約４０％であったことが示され（表３）、エラーのほとんどは、ヌクレオチド欠失であり、オリゴ合成からのマイナス１ｎｔ及び２ｎｔ産物から生じたものと思われた。従って、単一ヌクレオチド分解能での変性ＰＡＧＥを用いてオリゴ精製手法を変更すると、マイナス１ｎｔ及び２ｎｔ産物の大多数が除去されたことによって合成オリゴのクオリティが実質的に向上し、その後、欠失エラーのほとんどがなくなり、最終的にアセンブルされた配列の約９０％が正しかった（残りの配列は、ランダムに現れた変異を１つのみ含んでいた）。従って、同じオリゴ精製手法及び鏡像アセンブリＰＣＲを用いて、完全長１．５ｋｂの鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のアセンブリを実施した。この遺伝子は、将来、機能性鏡像リボソームを構築する際の要となる鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡに酵素的に転写するためのテンプレートとなるであろう。具体的には、鏡像１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによってアセンブルした後、続いてアガロースゲル電気泳動にかけ、完全長である１．５ｋｂの鏡像細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用した鏡像アセンブリＰＣＲにより得て、１．５％アガロースゲル電気泳動により分析し、ＥｘＲｅｄ．Ｍ，ＤＮＡマーカーによって染色した。（結果は図示せず）。

【0268】

ＤＮＡテンプレートを用いたＲＮＡ重合：
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（米国、マサチューセッツ州、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、３ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．６２５ｍＭの各ＮＴＰ、０．５μＭの５’－ＦＡＭ標識ＤＮＡプライマー（２１ｎｔ）、及び１μＭのｓｓＤＮＡテンプレート（４１ｎｔ）、及びポリメラーゼにおいてＲＮＡ重合を実施した。ポリメラーゼを加える前に、アニーリングのためこの反応系を９４℃で３０秒間加熱し、４℃にゆっくりと冷却した。プライマー伸長反応を６５℃で１０分間行った。９８％のホルムアミド、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０１２５％のＳＤＳを含有するローディング緩衝液を加えることによって反応を停止させて、産物を８Ｍの尿素中、２０％の変性ＰＡＧＥにより分析した。具体的には、種々の変異体Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡテンプレートを用いたＲＮＡ重合活性アッセイの後にＰＡＧＥ分析を行い、ここでは、４１ｎｔの一本鎖ＤＮＡテンプレート、５’－ＦＡＭ標識した２１ｎｔのＤＮＡプライマー及びＮＴＰを用い、６５℃で１０分間インキュベートする、種々のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体によるＤＮＡテンプレート特異的プライマー伸長を行い、８Ｍの尿素中、２０％のＰＡＧＥにより分析した（結果は図示せず）。

【0269】

Ｌ－ＤＮＡの書き込み及び読み取り：
５５０文字を含むルイ・パスツールによる１８６０年の刊行物からの一節（上記のテキストを参照されたい）を１６５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列に変換し（表４）、それぞれ７０～９０ｎｔの４個の短い合成Ｌ－ＤＮＡオリゴからアセンブルした１１個の２２０ｂｐ長のＬ－ＤＮＡセグメントにコードした（表５）。アセンブリＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分（アンプリコンの長さに依存する）を３５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）とした。ホスホロチオエート手法については、５’－ＦＡＭ標識（フォワード）及び５’－Ｃｙ５標識（リバース）プライマーを用い、Ｄ－Ｄｐｏ４－５ｍ（その化学合成を容易にするための変異型のＤｐｏ４）によって、４回の別個のＰＣＲ反応でＬ－ＤＮＡセグメントを増幅し、毎回の反応内において、Ｌ－ｄＮＴＰの１つを対応するＬ－ｄＮＴＰαＳに置換した。ＰＣＲプログラム設定は、８６℃で３分（初期変性）、８６℃で３０秒、５４℃（Ｔｍに依存する）で１分及び６５℃で１～２．５分（アンプリコンの長さに依存する）を４５サイクル、６５℃で５分（最終伸長）とした。ＰＣＲ産物（同じ長さの非標識担体ｄｓＤＮＡと１：２０ｗ／ｗで混合した）を８％ＰＡＧＥにより精製し、約２００ｎｇ／μｌの濃度となるように水に溶解した。各シーケンシング反応につき２．５μｌの二重標識Ｌ－ＤＮＡを、２％（ｖ／ｖ）の２－ヨードエタノールを含有する２．５μｌの変性緩衝液（９８％のホルムアミド、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ）と混合した後、続いて９５℃で３分間加熱し、次に迅速に氷上に置いた。連鎖停止手法については、５’－ＦＡＭ標識（フォワード）及び／又は５’－Ｃｙ５標識（リバース）プライマーを用い、鏡像Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｄ２１５Ａ、Ｌ４９０Ｗ）（配列番号７７）によって、４回の別個のＰＣＲ反応でＬ－ＤＮＡセグメントを増幅し、毎回の反応内において、Ｌ－ｄＮＴＰの１つを対応するＬ－ｄｄＮＴＰに一定の比率で置換した。ＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、５４℃（Ｔｍに依存する）で３０秒及び７２℃で３０～６０秒（アンプリコンの長さに依存する）を２０サイクル、７２℃で５分（最終伸長）とした。二重標識ＰＣＲ産物をそれぞれ等容積の変性緩衝液（９８％ホルムアミド、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合した後、続いて９５℃で３分間加熱し、次に迅速に氷上に置いた。ｄｄＮＴＰ及び５’－Ｃｙ５標識（リバース）シーケンシングプライマーを用いた発現されたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｄ２１５Ａ、Ｌ４９０Ｗ）による連鎖停止手法で得たＤ－ＤＮＡセグメントＳ１、及びｄｄＮＴＰ及び５’－Ｃｙ５標識リバースシーケンシングプライマーを用いたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｄ２１５Ａ、Ｌ４９０Ｗ）によるＤ－ＤＮＡセグメントＳ１の増幅産物のシーケンシングゲルを、１０％変性ＰＡＧＥにより分析し、Ｃｙ５モードで動作するＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ＋システムによってスキャンした。ＡはｄＡＴＰが部分的にｄｄＡＴＰに置き換わったもの、ＣはｄＣＴＰが部分的にｄｄＣＴＰに置き換わったもの、ＧはｄＧＴＰが部分的にｄｄＧＴＰに置き換わったもの、ＴはｄＴＴＰが部分的にｄＴＴＰに置き換わったものである（結果は図示せず）。シーケンシング試料を０．４ｍｍ×３４０ｍｍ×３００ｍｍのスラブにロードし、８Ｍの尿素中、１０％のポリアクリルアミドゲルによって分離した。ゲルは、５０Ｗ（定出力）で２時間、３０～４０℃に加熱されるまで予め泳動を行った。ローディング後、ゲルを５０Ｗ（定出力）で１．５時間の泳動を行い、蛍光スキャンのために中断した後、ゲルの泳動を続け、１時間おきにスキャンし、これを総泳動時間が最長５時間になるまで行った。ポリアクリルアミドゲルを、それぞれＣｙ２及びＣｙ５モードで動作するＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ^＋システムによってスキャンした。ゲル定量化及びクロマトグラム分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって実施した。

【0270】

キラル・ステガノグラフィー：
上記に記載される方法を用いて、キメラＤ－ＤＮＡ／Ｌ－ＤＮＡオリゴをＤ－及びＬ－デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトで合成した。オリゴＤ－Ｆ１、Ｄ－Ｒ１、Ｄ／Ｌ－Ｆ２及びＤ／Ｌ－Ｒ２（表７）をアニーリングのため９５℃に３分加熱し、ゆっくりと４℃に冷却し、アニールした二本鎖ＤＮＡをＴ３ ＤＮＡリガーゼ（米国、マサチューセッツ州、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）によって２５℃で１．５時間連結した。Ｌ－ＤＮＡストレージライブラリのときと同じような方法を用いて、「カバーテキスト」としての役割を果たすＤ－ＤＮＡストレージライブラリをＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ Ｆｌｙポリメラーゼ（中国、北京、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によって調製した。アガロースゲルによって精製したキメラ二本鎖Ｄ－ＤＮＡ／Ｌ－ＤＮＡ鍵をＤ－ＤＮＡストレージライブラリに各Ｄ－ＤＮＡセグメントとして１：１の濃度比で加えた。１１個の情報格納用Ｄ－ＤＮＡセグメント及びキメラ鍵のＤ－ＤＮＡ部分をそれぞれストレージライブラリからセグメント特異的プライマーで増幅し、サンガーシーケンシングのためにゼロバックグラウンドＺＴ４ Ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｌｕｎｔ Ｆａｓｔクローンキット（中国、北京、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｏｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によってクローニングした（補表Ｓ６）。キメラ鍵のＬ－ＤＮＡ部分をストレージライブラリからのＤ－Ｄｐｏ４－５ｍによってＬ－Ｍ１３Ｆ及びＬ－Ｍ１３Ｒプライマーで増幅し、ホスホロチオエート手法によりシーケンシングした。

【0271】

表７は、キラル・ステガノグラフィーに使用した配列を提示し、小文字は、Ｄ－ＤＮＡ配列であり、大文字は、Ｌ－ＤＮＡ配列であり、下線を付した（アンダースコア、アンダーストライク）文字は、個々のセグメントの増幅及びシーケンシングのためのユニークな配列である。

【0272】

【表7】

【0273】

Ｌ－ＤＮＡバーコード化：
２０１９年１２月８日に清華大学の蓮池（４０°０’２７”Ｎ、１１６°１９’３４”Ｅ）から未精製の環境水試料を採取した。合成Ｄ－及びＬ－ＤＮＡオリゴをアニーリングのため９５℃に５分間加熱し、ゆっくりと４℃に冷却し、アニールしたｄｓＤＮＡを水試料に５０μｇ／Ｌの濃度となるように加えた。ＤＮＡバーコード（配列番号１２）を増幅するため、２ｍｌの水試料を０．２２μｍのフィルタ（米国、ウィスコンシン州、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってろ過し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｔｒａ遠心フィルタユニット（０．５ｍｌ、１０，０００ＭＷＣＯ）によってＤＥＰＣ処理水に再懸濁した後、Ｄ－／Ｌ－Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって増幅した。ＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分を２５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）とした。メタゲノム微生物ＤＮＡ抽出のために、水試料を０．２μｍ Ｓｕｐｏｒ ２００ ＰＥＳメンブレンディスクフィルター（米国、ニューヨーク州、Ｐａｌｌ社）でろ過し、ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（米国、メリーランド州、Ｑｉａｇｅｎ社）によって微生物ＤＮＡを抽出した。

【0274】

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アセンブリ：
各０．００５～０．０２μＭ（内側）又は各０．２μＭ（外側）の濃度の約９０ｎｔ長の合成オリゴを二段階で完全長遺伝子にアセンブルした。最初の段階では、アセンブリＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３分を３５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）とした。第２段階では、予めアセンブルした約４５０～５５０ｂｐ長のＤＮＡブロックを１．５％アガロースゲルにより精製した後、アセンブリＰＣＲに供した。アセンブリＰＣＲプログラム設定は、９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で７分を３５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）とした。アセンブルした産物を、ＰＣＲプログラム設定：９４℃で３分（初期変性）、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で７分を３５サイクル、７２℃で１０分（最終伸長）によって更に増幅した。天然アセンブリＰＣＲの最終Ｄ－ＤＮＡ産物（配列番号８１）をＶ－ｅｌｕｔｅゲルミニ精製キット（中国、北京、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｏｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によって精製し、ゼロバックグラウンドＺＴ４ Ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｌｕｎｔ Ｆａｓｔクローンキット（中国、北京、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｏｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社）によってサンガーシーケンシングのためにクローニングした。

【0275】

本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されているが、多くの代替形態、改良形態及び変形形態が明らかであろうことは、当業者に明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広義の範囲内にあるかかる代替形態、改良形態及び変形形態が全て包含されることが意図される。

【0276】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、本明細書において、それぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的且つ個別的に指示されたものとみなすのと同程度に、全体として参照により本明細書に援用される。加えて、本願における任意の参考文献の引用又は特定は、かかる参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものと解釈されてはならない。節の見出しが使用される限り、それらは、必ずしも限定するものではないと解釈されるべきである。加えて、本願の任意の１つ又は複数の優先権書類は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0277】

加えて、本願の任意の１つ又は複数の優先権書類は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0278】

参照文献
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【配列表フリーテキスト】

【0279】

配列番号１： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号２： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号３： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号４： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号５： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号６： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号７： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号８： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号９： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号１０： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号１１： Ｌ－ＤＮＡ核酸配列
配列番号１２： ＤＮＡバーコード核酸配列
配列番号１３： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１４： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１５： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１６： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１７： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１８： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号１９： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２０： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２１： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２２： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２３： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２４： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２５： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２６： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２７： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２８： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号２９： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３０： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３１： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３２： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３３： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３４： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３５： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３６： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３８： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号３９： 短い合成オリゴ核酸配列
配列番号４０： 短い合成Ｄ－／Ｌ－キメラオリゴ核酸配列
配列番号４１： 短い合成Ｄ－／Ｌ－キメラオリゴ核酸配列
配列番号４２： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４３： 単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４４： 単鎖Ｌ－ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４５： 単鎖Ｌ－ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４６： Ｄ－／Ｌ－キメラＤＮＡ核酸配列
配列番号４７： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
配列番号４８： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号４９： Ｐｆｕ－５ｍ－５５Ｉアミノ酸配列
配列番号５０： Ｐｆｕ－５ｍ－４６Ｉアミノ酸配列
配列番号５１： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号５２： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号５３： ＫＯＤ１ポリメラーゼ
配列番号５４： Ｔｇｏポリメラーゼ
配列番号５５： ９度のＮ－７ポリメラーゼのアミノ酸配列
配列番号５６： Ｔｏｋポリメラーゼ
配列番号５７： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片
配列番号５８： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片
配列番号５９： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片
配列番号６０： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号６１： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号６２： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片
配列番号６３： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号６４： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号６５： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号６６： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＮ断片
配列番号６７： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片
配列番号６８： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片
配列番号６９： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片
配列番号７０： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片
配列番号７１： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号７２： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号７３： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ断片
配列番号７４： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号７５： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号７６： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号７７： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異型
配列番号７８： ｓｓｏ７ｄ構造ドメインのアミノ酸配列
配列番号７９： Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列
配列番号８０： ｐＵＣ１９プラスミドの核酸配列
配列番号８１： 細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡテンプレート
配列番号８２： Ｔ７－ＷＴアミノ酸配列
配列番号８３： Ｔ７－３７Ｉ（Ｉ６Ｖ，Ｉ１４Ｌ，Ｉ７４Ｌ，Ｉ８２Ｖ，Ｉ１０９Ｖ，Ｉ１１７Ｌ，Ｉ１４１Ｖ，Ｉ２１９Ｍ，Ｉ２４４Ｌ，Ｉ２８１Ｖ，Ｉ３２０Ｖ，Ｉ３２２Ｌ，Ｉ３３０Ｖ，Ｉ３６７Ｌ）アミノ酸配列
配列番号８４： ＹｅｎＰアミノ酸配列
配列番号８５： ｐｈｉＥａｐアミノ酸配列
配列番号８６： ＫｐｎＰアミノ酸配列
配列番号８７： Ｔ７－分裂－Ｎ断片のアミノ酸配列
配列番号８８： Ｔ７－Ｎ－１アミノ酸配列
配列番号８９： Ｔ７－Ｎ－２アミノ酸配列
配列番号９０： Ｔ７－Ｎ－３アミノ酸配列
配列番号９１： Ｔ７－Ｎ－４アミノ酸配列
配列番号９２： Ｔ７－Ｎ－５アミノ酸配列
配列番号９３： Ｔ７－Ｎ－６アミノ酸配列、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号９４： Ｔ７－Ｎ－７アミノ酸配列
配列番号９５： Ｔ７－分裂－Ｍ断片のアミノ酸配列
配列番号９６： Ｔ７－Ｍ－１アミノ酸配列
配列番号９７： Ｔ７－Ｍ－２アミノ酸配列
配列番号９８： Ｔ７－Ｍ－３アミノ酸配列
配列番号９９： Ｔ７－Ｍ－４アミノ酸配列、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号１００： Ｔ７－Ｍ－５アミノ酸配列、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号１０１： Ｔ７－Ｍ－６アミノ酸配列
配列番号１０２： Ｔ７－ｓｐｌｉｔ－Ｃ断片のアミノ酸配列
配列番号１０３： Ｔ７－Ｃ－１アミノ酸配列
配列番号１０４： Ｔ７－Ｃ－２アミノ酸配列
配列番号１０５： Ｔ７－Ｃ－３アミノ酸配列
配列番号１０６： Ｔ７－Ｃ－４アミノ酸配列、１位はＮ末端トリフルオロ酢酸チアゾリジン－４－カルボン酸（Ｔｆａ－Ｔｈｚ）結合
配列番号１０７： Ｔ７－Ｃ－５のアミノ酸配列
配列番号１０８： ＤＮＡテンプレートの核酸配列
配列番号１０９： Ｔｔ １６ＳのＤＮＡテンプレートの核酸配列
配列番号１１０： ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）のＤＮＡテンプレート
配列番号１１１： Ｌ－グアニンセンサーのＤＮＡテンプレート
配列番号１１２： Ｌ－ ３８－６リボザイムのＤＮＡテンプレート
配列番号１１３： Ｌ－クラスＩリガーゼのＤＮＡテンプレート
配列番号１１４： Ｌ－３８－６リボザイム
配列番号１１５： Ｌ－５’－ＦＡＭ－標識プライマー、１位はＦＡＭ標識、１位はＦＡＭ結合
配列番号１１６： Ｌ－クラスＩリガーゼのテンプレート

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】