▶ リネージ セル セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-06
(54)【発明の名称】胚性幹細胞増殖のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20230830BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023509667
(86)(22)【出願日】2021-08-10
(85)【翻訳文提出日】2023-03-27
(86)【国際出願番号】 US2021045437
(87)【国際公開番号】W WO2022035895
(87)【国際公開日】2022-02-17
(31)【優先権主張番号】63/063,942
(32)【優先日】2020-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519336241
【氏名又は名称】リネージ セル セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】アロン リラチ
(72)【発明者】
【氏名】スカリター ラミ
(72)【発明者】
【氏名】ティコツキ ラビド
(72)【発明者】
【氏名】ハユーン ネーマン ダナ
(72)【発明者】
【氏名】ワイザー オフェル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA23
4B065BB19
4B065BC41
4B065BC42
4B065BC45
(57)【要約】
本明細書では、マイクロキャリアを含む懸濁性増殖複合体を用いたヒト胚性幹の増殖のための方法及び組成物が提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の多能性状態で増殖させかつ維持するための方法であって、以下のステップ：（ａ）成長培地においてヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、
（ｂ）前記懸濁性増殖複合体を一定期間培養することと
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記マイクロキャリアが、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＥＣＭが、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＥＣＭが、ヒトラミニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ヒトラミニンが、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記マイクロキャリアが、コーティングされていない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記マイクロキャリアが、プロタミンまたはポリリジンと結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記マイクロキャリアが、中性であるか、または負に帯電している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記マイクロキャリアが、中性である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記マイクロキャリアが、負に帯電している、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記マイクロキャリアが、親水性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記懸濁性増殖複合体が、少なくとも約１日間、培養される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記懸濁性増殖複合体が、約１日間～約１４日間、培養される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことによって、前記懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を採取し、さらに分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を、前記成長培地を変えることによってさらに分化させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を、未分化かつ多能性のままにする、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５及びＴＲＡ－１－６０のそれぞれの少なくとも約８０％を発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記未分化細胞が、Ｏｃｔ－４及びＮａｎｏｇのそれぞれの少なくとも約７０％を発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
前記未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５の少なくとも約８０％、ＴＲＡ－１－６０の少なくとも約８０％、Ｏｃｔ－４の少なくとも約７０％、及びＮａｎｏｇの少なくとも約７０％を発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを含む、懸濁性増殖複合体組成物。
【請求項23】
成長培地をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうちの１つ以上を含む、請求項２２または請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記マイクロキャリアが、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
前記マイクロキャリアが、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせでコーティングされている、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記ラミニンが、ヒトラミニンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記ヒトラミニンが、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記マイクロキャリアが、コーティングされていない、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
前記マイクロキャリアが、プロタミンまたはポリリジンと結合している、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
前記マイクロキャリアが、中性であるか、または負に帯電している、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記マイクロキャリアが、中性である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記マイクロキャリアが、負に帯電している、請求項３１に記載の組成物。
【請求項34】
前記マイクロキャリアが、親水性である、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１０日に出願された米国仮出願第６３／０６３，９４２号の利益を主張するものであり、この米国仮出願の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に援用する。
本出願は、２０２０年８月１０日に出願された米国仮出願第６３／０６３，９４２号の利益を主張するものであり、この米国仮出願の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【0002】
背景
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、自己複製という基礎的特性を持つため、無尽蔵の細胞源となり、産業規模の細胞治療の構想を可能にする。ｈＥＳＣは、その多能性発生能の可能性により、ほとんどの細胞治療製品の細胞源として位置付けられている。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、自己複製という基礎的特性を持つため、無尽蔵の細胞源となり、産業規模の細胞治療の構想を可能にする。ｈＥＳＣは、その多能性発生能の可能性により、ほとんどの細胞治療製品の細胞源として位置付けられている。
【0003】
ｈＥＳＣの臨床応用では、ｈＥＳＣ由来の治療用細胞を大量に供給することが重要な要件となる。これらの治療用細胞の生産は、現行の医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）の下で、マスターセルバンク（ＭＣＢ）またはワーキングセルバンク（ＷＣＢ）などの認定セルバンクの細胞を解凍することから始まる。細胞バンクの品質は、解凍後のｈＥＳＣの増殖、その後の系統特異的分化の効率、及びプロセス再現性に影響を与えるので、ｈＥＳＣバイオプロセシングにおいて重要な役割を果たす。
【0004】
このようなセルバンクの製造は労働集約的であり、通常は手動の細胞操作が必要であり、フィーダー細胞、非組み換えマトリックス、血清、及び十分に定義されていないその他の材料の使用など、いくつかの重要な原材料によるロット間変動がある。
【発明の概要】
【0005】
概要
このような細胞治療の構想を実現するために、ＧＭＰグレードのｈＥＳＣバンクまたはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）バンクの生産方法が本明細書で提供される。
このような細胞治療の構想を実現するために、ＧＭＰグレードのｈＥＳＣバンクまたはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）バンクの生産方法が本明細書で提供される。
【0006】
一態様では、本開示は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の多能性状態で増殖させかつ維持するための方法であって、以下のステップ：（ａ）成長培地においてヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、（ｂ）懸濁性増殖複合体を一定期間培養することと、を含む方法を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＥＣＭは、ヒトラミニンである。特定の実施形態では、ヒトラミニンは、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである。
【0010】
特定の実施形態では、マイクロキャリアはコーティングされていない。
【0011】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンと結合される。
【0012】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、中性であるか、または負に帯電している。特定の実施形態では、マイクロキャリアは中性である。特定の実施形態では、マイクロキャリアは負に帯電している。特定の実施形態では、マイクロキャリアは親水性である。
【0013】
いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体は、少なくとも約１日間、培養される。いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体は、約１日間～約１４日間、培養される。
【0014】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことによって、懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに増殖させる。
【0015】
いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに分化させる。いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を、成長培地を変えることによってさらに分化させる。
【0016】
いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を、未分化かつ多能性のままにする。いくつかの実施形態では、未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５及びＴＲＡ－１－６０のそれぞれの少なくとも約８０％を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞が、Ｏｃｔ－４及びＮａｎｏｇのそれぞれの少なくとも約７０％を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５の少なくとも約８０％、ＴＲＡ－１－６０の少なくとも約８０％、Ｏｃｔ－４の少なくとも約７０％、及びＮａｎｏｇの少なくとも約７０％を発現する。
【0017】
別の態様では、本開示は、ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを含む懸濁性増殖複合体組成物を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本組成物は、成長培地をさらに含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである。
【0020】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせでコーティングされている。いくつかの実施形態では、ラミニンはヒトラミニンである。特定の実施形態では、ヒトラミニンは、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである。
【0021】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアはコーティングされていない。
【0022】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンと結合している。
【0023】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、中性であるか、または負に帯電している。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは中性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは負に帯電している。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは親水性である。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】継代の間に行った形態評価を示す。ＭＣのＰ１ グループＡ－Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ ＭＣ、グループＢ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ＭＣ。ＭＣ上で成長した細胞を採取し、ＴＣ処理したＴ２５フラスコにＰ２用に播種した。
【図2】ＤＣ分化中にｈＥＳＣスケールアップシステムから採取した細胞の形態を示す。
【図3】ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムプロセスを示す。
【図4】ｈＥＳＣスケールアップシステムにおける細胞の形態を示す。
【図5】ｈＥＳＣスケールアップシステムから採取した細胞をｈＥＳＣ２次元培養として再播種した後の形態を示す。
【図6】試験条件下でのｈＥＳＣスケールアップシステムの形態を示す。
【図7】異なるプラットフォームにおけるｈＥＳＣスケールアップシステムの形態を示す。
【図8】異なるｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８濃度を有するｈＥＳＣスケールアップシステムの形態を示す。
【図9】異なる継代継続期間におけるｈＥＳＣスケールアップシステムの形態を示す。
【図10】２次元培養として凍結保存する前及び解凍後のｈＥＳＣスケールアップシステムで培養された細胞の形態を示す。
【図11】ｈＥＳＣスケールアップシステムで培養し、２次元培養として継代した細胞の培養パラメータ及び多能性マーカー発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
詳細な説明
本明細書の実施形態は、概して、胚性幹細胞を増殖させるための方法、組成物、及びデバイスに関する。
本明細書の実施形態は、概して、胚性幹細胞を増殖させるための方法、組成物、及びデバイスに関する。
【0026】
この説明を読んだ後、当業者には、本開示を様々な代替実施形態及び代替用途で実施する方法が明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な実施形態の全てが本明細書に記載されるわけではない。ここに提示される実施形態は、限定ではなく単なる例示として提示されることを理解されたい。したがって、この様々な代替実施形態の詳細な説明は、本明細書に規定されている本開示の範囲または広さを限定するものと解釈されるべきではない。
【0027】
本技術を開示し説明する前に、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはその使用は、当然ながら変えることができるので、以下に説明する態様は、そのようなものに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0028】
詳細な説明は、読者の便宜のためだけに様々なセクションに分割されており、任意のセクションにある開示が、別のセクションにある開示と組み合わされてもよい。タイトルまたはサブタイトルは、読者の便宜のために本明細書で使用され得るが、本開示の範囲に影響を与えることを意図したものではない。
【0029】
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数形も含むことを意図する。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数形も含むことを意図する。
【0030】
「任意選択の」または「場合により」とは、その後に記載される事象または状況が発生する場合または発生しない場合があり、その説明は、その事象または状況が発生する場合または発生しない場合を含むことを意味する。
【0031】
範囲を含む数値表示、例えば、温度、時間、量、濃度などの数値表示の前に使用する「約」という用語は、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはその間の任意の部分範囲または部分値だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、量に関して使用される場合の「約」という用語は、その量が＋／－１０％だけ変動し得ることを意味する。
【0032】
「含んでいる」または「含む」という用語は、組成物及び方法が、記載されている要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するよう意図されている。組成物及び方法を規定するために使用される場合、「～から本質的になる」は、明示された目的のための組み合わせにとって本質的に重要な意義を持つ他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に規定されている要素から本質的になる組成物は、特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しないことになる。「からなる」とは、微量以上の他の成分の元素及び実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの各接続句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｅｒｍ）によって規定されている実施形態は、本開示の範囲内である。
【0033】
「有効量」は、組成物が存在しない場合と比較して、その組成物が、明示された目的を達成する（例えば、組成物が投与される効果を達成する、疾患を治療する、酵素活性を低減する、酵素活性を増加させる、シグナリング経路を弱める、あるいは疾患または疾病の１つ以上の症状を軽減する）のに十分な量である。「有効量」の例は、疾患の症状または症状類の治療、予防、または軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療的有効量」と称されることもある。症状または症状類（及びこの語句の文法上の同等物）の「軽減」は、症状（複数可）の重篤度もしくは頻度の減少、または症状（複数可）の除去を意味する。薬物（例えば、本明細書に記載の細胞）の「予防有効量」は、それが対象に投与されたときに、意図された予防効果、例えば、傷害、疾患、病状、もしくは疾病の発症（もしくは再発）を予防するもしくは遅延させる効果、あるいは傷害、疾患、病状、もしくは疾病の発症（もしくは再発）の可能性を低減する、またはそれらの症状を軽減する効果を有するであろう薬物の量である。完全な予防効果は、１用量の投与によって必ずしも生じるとは限らず、一連の用量の投与後にのみ生じる場合もある。したがって、予防有効量は、１回以上の投与で投与することができる。「活性減少量」は、本明細書で使用されるとき、拮抗剤の非存在在下と比較して、酵素の活性を減少させるのに必要とされる拮抗剤の量を指す。「機能攪乱量」は、本明細書で使用されるとき、拮抗剤の非存在下と比較して、酵素またはタンパク質の機能を攪乱するのに必要とされる拮抗剤の量を指す。正確な量は、治療の目的によって決まり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能であろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。
【0034】
本明細書に記載される任意の組成物については、治療的有効量は、最初に細胞培養試験から決定することができる。標的濃度は、本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の方法を使用して測定して、本明細書に記載される方法を達成することができる活性組成物（複数可）の濃度（例えば、細胞濃度または細胞数）となる。
【0035】
「対照」または「対照実験」は、その平易な通常の意味に従って使用され、実験の対象または試薬が、実験の手順、試薬、または変数の省略を除き、並列実験として扱われる実験を指す。いくつかの例では、対照は、実験効果の評定における比較の基準として使用される。いくつかの実施形態では、対照は、本明細書（実施形態及び実施例を含む）に記載されている組成物の非存在下でのタンパク質の活性の測定値である。
【0036】
「薬学的に許容される賦形剤」及び「薬学的に許容される担体」は、対象への活性剤の投与及び対象による吸収を助け、患者に対して著しく有害な薬物学的影響をもたらすことなく、本開示の組成物中に含めることができる物質を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料、塩溶液（リンゲル溶液など）、アルコール、油、ゼラチン、例えば、ラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチセルロース、ポリビニルピロリジン、及び顔料などが挙げられる。かかる調製物は、滅菌し、所望により、本開示の組成物と有害に反応しない、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色料、及び／または芳香剤などの助剤と混合することができる。当業者は、他の医薬品賦形剤が、本開示において有用であることを認識するであろう。
【0037】
「細胞」とは、本明細書で使用する場合、そのゲノムＤＮＡを保持または複製するのに十分な代謝機能またはその他の機能を果たす細胞を指す。細胞は、例えば、無傷膜の存在、特定の色素による染色、子孫を産生する能力、または配偶子の場合には、第２の配偶子と合わさって、生存能力のある子を生み出す能力を含む、当技術分野における周知の方法によって同定できる。細胞には、原核細胞及び真核細胞があり得る。原核細胞には、細菌が含まれるが、これに限定されない。真核細胞には、酵母細胞、動植物由来の細胞、例えば哺乳類細胞、昆虫（例えば、スポドプテラ属（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ））細胞及びヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞は、もともと非接着性であるか、または例えばトリプシン処理などによって表面に接着しないように処理されている場合に、有用であり得る。
【0038】
本明細書で使用するとき、「幹細胞」は、特定の特殊化した機能を有する他の細胞型（例えば、完全に分化した細胞）に分化誘導されるまで、培養下の長期間にわたって未分化状態に留まることができる細胞（例えば、多能性幹細胞または複能性幹細胞）を意味する。実施形態では、「幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、成体幹細胞、間葉系幹細胞及び造血幹細胞が含まれる。
【0039】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、体細胞の遺伝子操作によって、例えば、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４などの転写因子を用いる、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のレトロウイルス形質導入によって、体細胞から生成することができる細胞である［Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００７，１（１）：３９－４９；Ａｏｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ Ｆｅｂ １４．（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）；ＩＨ Ｐａｒｋ，Ｚｈａｏ Ｒ，Ｗｅｓｔ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５１：１４１－１４６；Ｋ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ ２００７；１３１：８６１－８７２］。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、またはレシピエント細胞が有糸分裂を停止している場合は接合子への核移植によって生成することができる。さらに、ｉＰＳＣは、例えば小分子または小型ＲＮＡの使用などによる非組み込み法を使用して生成することができる。
【0040】
「胚性幹細胞」という用語は、３つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉及び中胚葉）全ての細胞に分化できるか、または未分化状態に留まることができる胚細胞を指す。「胚性幹細胞」という語句は、妊娠後に形成された胚組織（例えば、胚盤胞）であって胚の着床前に形成された胚組織（すなわち、着床前胚盤胞）から得られる細胞、着床後／原腸形成前段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（ＷＯ２００６／０４０７６３参照）、及び妊娠中の任意の時点、好ましくは妊娠１０週より前に、胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含む。実施形態では、胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を使用して得られる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。
【0041】
市販の幹細胞もまた、本開示の態様及び実施形態で使用できることが理解される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ（ｗｗｗ．ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／）または他のｈＥＳＣレジストリから購入できる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例としては、ＨＡＤ－Ｃ１０２、ＥＳＩ、ＢＧＯ１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１Ｏ、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＣＨＢ－４、ＣＨＢ－５、ＣＨＢ－６、ＣＨＢ－８、ＣＨＢ－９、ＣＨＢ－１０、ＣＨＢ－１１、ＣＨＢ－１２、ＨＵＥＳ１、ＨＵＥＳ２、ＨＵＥＳ３、ＨＵＥＳ４、ＨＵＥＳ５、ＨＵＥＳ６、ＨＵＥＳ７、ＨＵＥＳ８、ＨＵＥＳ９、ＨＵＥＳ１０、ＨＵＥＳ１１、ＨＵＥＳ１２、ＨＵＥＳ１３、ＨＵＥＳ１４、ＨＵＥＳ１５、ＨＵＥＳ１６、ＨＵＥＳ１７、ＨＵＥＳ１８、ＨＵＥＳ１９、ＨＵＥＳ２０、ＨＵＥＳ２１、ＨＵＥＳ２２、ＨＵＥＳ２３、ＨＵＥＳ２４、ＨＵＥＳ２５、ＨＵＥＳ２６、ＨＵＥＳ２７、ＨＵＥＳ２８、ＣｙＴ４９、ＲＵＥＳ３、ＷＡＯ１、ＵＣＳＦ４、ＮＹＵＥＳ１、ＮＹＵＥＳ２、ＮＹＵＥＳ３、ＮＹＵＥＳ４、ＮＹＵＥＳＳ、ＮＹＵＥＳ６、ＮＹＵＥＳ７、ＵＣＬＡ１、ＵＣＬＡ２、ＵＣＬＡ３、ＷＡ０７７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＨＵＥＳ６２、ＨＵＥＳ６３、ＨＵＥＳ６４、ＣＴＩ、ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、ＭＡ１３５、Ｅｎｅａｖｏｕｒ－２、ＷＩＢＲ１、ＷＩＢＲ２、ＷＩＢＲ３、ＷＩＢＲ４、ＷＩＢＲＳ、ＷＩＢＲ６、ＨＵＥＳ４５、Ｓｈｅｆ３、Ｓｈｅｆ６、ＢＩＮｈｅｍ１９、ＢＪＮｈｅｍ２０、ＳＡＧＯ１、ＳＡＯＯ１がある。
【0042】
本明細書で使用するとき、「マイクロキャリア」または「ＭＣ」という用語は、接着細胞が動的細胞培養または静的細胞培養で成長することを可能にし、穏やかに混合して懸濁させておくことができる、懸濁性支持マトリックスを意味する。マイクロキャリアは、ポリスチレン、表面修飾ポリスチレン、化学修飾ポリスチレン、架橋デキストラン、セルロース、アクリルアミド、コラーゲン、アルギン酸塩、ゼラチン、ガラス、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはそれらの組み合わせなどで構成することができるが、これに限定されない。マイクロキャリアは、ラミニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない生物学的支持マトリックスでコーティングされ得る。多くの異なるタイプのマイクロキャリアが市販されており、これにはＨｙＱＳｐｈｅｒｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｈｉｌｌｅｘ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、及び低濃度Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ブランドがあるが、これらに限定されない。マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘブランド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの架橋デキストランから作製することができる。マイクロキャリアは、球形で滑らかなものにすることができ、ＣＹＴＯＰＯＲＥブランド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの微多孔性表面を有したものにすることができ、及び／またはＤＥ－５３（Ｗｈａｔｍａｎ）などの棒状のキャリアにすることができる。マイクロキャリアには、ビーズから細胞を分離するのに役立つ磁性粒子（例えば、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧＥＭ粒子）を含浸させることができる。μＨｅｘ製品（Ｎｕｎｃ）などのチップベースのマイクロキャリアは、従来のマイクロキャリアの高い表面積対体積比を維持しながら、細胞成長のための平坦な表面を提供する。マイクロキャリアの特性は、増殖率と細胞の複能性または多能性とに大きく影響する可能性がある。
【0043】
方法
ある態様では、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の多能性状態で増殖させかつ維持するための方法であって、以下のステップ：（ａ）成長培地においてヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、（ｂ）懸濁性増殖複合体を一定期間培養することと、を含む方法が本明細書で提供される。
ある態様では、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の多能性状態で増殖させかつ維持するための方法であって、以下のステップ：（ａ）成長培地においてヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、（ｂ）懸濁性増殖複合体を一定期間培養することと、を含む方法が本明細書で提供される。
【0044】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことによって、懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに増殖させる。
【0045】
いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに分化させる。
【0046】
ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、通常、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞のヒト胚を胚盤胞の段階まで増殖させることが可能である。ヒトＥＳ細胞の単離では、胚盤胞から透明帯が除去され、穏やかなピペット操作により栄養外胚葉細胞を溶解して無傷の内細胞塊（ＩＣＭ）から除去する手順で、ＩＣＭが単離される。その後、ＩＣＭは、その成長を可能にする適切な培地を含む組織培養フラスコ内に蒔かれる。９～１５日後、ＩＣＭ由来の成長物は、機械的解離または酵素分解のいずれかによって凝集塊に解離され、次いで細胞は、新鮮な組織培養培地に再度蒔かれる。未分化形態を示すコロニーが、マイクロピペットによって個別に選択され、機械的に凝集塊に解離させられ、再度蒔かれる。その後、得られたＥＳ細胞は、４～７日ごとに定期的に分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法のさらなる詳細については、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００，Ｍａｙ：１８（５）：５５９；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，［米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５］；Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６，１９８９］；及びＧａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８］を参照されたい。
【0047】
さらに、ＥＳ細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４－７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８－９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０－８；Ｇｒａｖｅｓ ＆ Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３，３０ ３６：４２４－３３］、いくつかの家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５－６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３－８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９－６７］及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４－８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４－９］を含む他の種から得ることができる。
【0048】
受精後少なくとも９日経過した胚盤胞から、原腸陥入前の段階で、拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）を得ることができる。胚盤胞を培養する前に、内細胞塊を露出させるために、透明帯が［例えばタイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）によって］消化される。次に、胚盤胞は、標準的な胚性幹細胞培養法を用いてインビトロで、受精後少なくとも９日から１４日以内の間（すなわち、原腸陥入事象の前）、全胚として培養される。
【0049】
ＥＳ細胞を調製するための別の方法が、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ ２，１１３－１１７，７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８に記載されている。この方法は、体外受精プロセス中に胚から単一細胞を除去することを含む。このプロセスで胚が壊されることはない。
【0050】
ＥＧ（胚性生殖）細胞は、当業者に知られている実験技術を使用して、妊娠約８～１１週の胎児（ヒト胎児の場合）から得られた始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は、分離されて、小さく切断され、その後、機械的解離によって細胞に分解される。次いで、ＥＧ細胞を、適切な培地を含む組織培養フラスコで成長させる。細胞は、典型的には７～３０日後または１～４回の継代後に、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、培地を毎日交換しながら培養される。ヒトＥＧ細胞の調製方法のさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８］及び米国特許第６，０９０，６２２号を参照されたい。
【0051】
ＥＳ細胞を調製するためのさらに別の方法は、単為生殖によるものである。このプロセスでも胚が壊されることはない。
【0052】
細胞は、マイクロキャリアの有無にかかわらず懸濁液中で、または単層中で増殖させることができる。単層培養または懸濁培養における混合細胞集団の増殖は、当業者に周知の方法により、バイオリアクターまたはマルチ／ハイパースタックでの大量増殖に変更することができる。
【0053】
いくつかの実施形態によれば、増殖期は、少なくとも１週間から２０週間まで、例えば、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、またはちょうど１０週間、行われる。実施形態では、増殖期は、２週間から１０週間、３週間から１０週間、４週間から１０週間、または４週間から８週間など、１週間から１０週間行われる。期間は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分範囲であってよい。
【0054】
さらに他の実施形態によれば、混合細胞集団は、増殖期中に少なくとも１回、増殖期中に少なくとも２回、増殖期中に少なくとも３回、増殖期中に少なくとも４回、増殖期中に少なくとも５回、増殖期中に少なくとも６回、または増殖期中に少なくとも７回継代される。
【0055】
細胞が酵素的に収集される場合、８継代よりも多く、９継代よりも多く、さらには１０継代よりも多く（例えば１１～１５継代）増殖を続けることが可能である。総細胞倍加数は、３０を超えて、例えば３１、３２、３３、３４、またはそれ以上に増やすことができる。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０２１９７３号を参照されたい）。
【0056】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、周囲の細胞に構造的及び生化学的なサポートを提供するコラーゲン、酵素、糖タンパク質、及びヒドロキシアパタイトなどの細胞外高分子及びミネラルからなる３次元網目構造である。多細胞性は異なる多細胞系統で独立して進化したため、ＥＣＭの組成は多細胞性構造によって異なる。ただし、細胞接着、細胞間コミュニケーション、及び分化は、ＥＣＭの共通機能である。
【0057】
動物の細胞外マトリックスには、間質マトリックスと基底膜とがある。間質マトリックスは、様々な動物細胞の間（すなわち、細胞間隙内）に存在する。多糖類及び繊維状タンパク質のゲルが細胞間隙を埋め、ＥＣＭにかかるストレスに対する圧縮緩衝材として機能する。基底膜は、様々な上皮細胞が載るＥＣＭのシート状堆積物である。動物の結合組織の種類ごとに、ＥＣＭには種類がある。すなわち、コラーゲン繊維及び骨ミネラルは、骨組織のＥＣＭを含む。細網線維及び基質は、疎性結合組織のＥＣＭを含む。血漿は、血液のＥＣＭである。
【0058】
本開示の範囲内で使用するための好適な細胞外マトリックス成分には、マトリゲル、ビトロネクチン、ゼラチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン（例えば、ラミニン５２１）、フィブロネクチンポリ－Ｄ－リジン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態では、ヒトラミニンは、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである。
【0059】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、またはシリコーンのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレン、表面修飾ポリスチレン、化学修飾ポリスチレン、架橋デキストラン、セルロース、アクリルアミド、コラーゲン、アルギン酸塩、ゼラチン、ガラス、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはそれらの組み合わせで構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、表面修飾ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、化学修飾ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、架橋デキストランから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、セルロースから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、アクリルアミドから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コラーゲンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、アルギン酸塩から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ゼラチンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ガラスから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ＤＥＡＥ－デキストランから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コーティングされていない。
【0060】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コーティングされている。実施形態では、マイクロキャリアは、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせでコーティングされていてもよい。実施形態では、マイクロキャリアは、ポリリジン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、フィブロネクチン、テネイシン、デキストラン、ペプチド、またはそれらの組み合わせでコーティングされていてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ラミニンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、マトリゲルでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コラーゲンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリリジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ビトロネクチンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、フィブロネクチンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、テネイシンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、デキストランでコーティングされている。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ペプチドでコーティングされている。
【0061】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンと結合していてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは球形である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは楕円である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは棒状である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアはディスク形状である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは多孔性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは非多孔性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは平滑である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは平坦である。
【0062】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは中性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは負に帯電している。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは親水性である。
【0063】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、２５ｃｍ２、５０ｃｍ２、７５ｃｍ２、１００ｃｍ２、１２５ｃｍ２、１５０ｃｍ２、１７５ｃｍ２、２００ｃｍ２、２２５ｃｍ２、２５０ｃｍ２、５００ｃｍ２、６２５ｃｍ２、７５０ｃｍ２、１，０００ｃｍ２、１，２５０ｃｍ２、５，０００ｃｍ２、または７，５００ｃｍ２の表面積を有し得る。表面積は、端点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
【0064】
特定の実施形態では、マイクロキャリアは、細胞付着を増強するために表面処理されており、それによって細胞収率及び細胞生存率を最大化する。マイクロキャリアは、一貫したプラットフォームを提供するＵＳＰクラスＶＩポリスチレン材料で構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、幹細胞増殖のためマイクロキャリア上に合成表面を作り出す。強化された付着表面処理では、細胞付着を改善するために、マイクロキャリアの表面に酸素を注入する。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、非発熱性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、間葉系幹細胞の用途向けに最適化される。特定の実施形態では、ビーズは、１２５～２１２μｍの様々なサイズであり得る。特定の実施形態では、マイクロキャリアの密度は、１．０２６±０．００４であり得る。特定の実施形態では、マイクロキャリアは、３６０ｃｍ２／グラムであり得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、本方法は、キャリア表面への細胞の付着を改善するために、ｈＥＳＣをラミニンまたはその誘導体と組み合わせることを含む。特定の実施形態では、ラミニンは、ヒトラミニン５１１である。代替実施形態として、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、マトリゲル、またはそれらの誘導体などを含むが必ずしもこれらに限定されない、いくつかの他の細胞外マトリックスを細胞付着に使用することができる。
【0066】
いくつかの実施形態では、細胞を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日の間、培養する場合がある。
【0067】
いくつかの実施形態では、細胞は、１０ｍＬ～３，０００ｍＬの間、例えば、約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１，０００ｍＬ、または３，０００ｍＬの作業容量で培養され得る。容量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分範囲であってよい。
【0068】
いくつかの実施形態では、培養細胞をさらに増殖させることがある。
【0069】
いくつかの実施形態では、培養細胞を未分化のままにすることがある。未分化細胞は、ＳＳＥＡ－５、ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ－４、及びＮａｎｏｇなどを含むが必ずしもこれらに限定されない様々なマーカーの発現によって同定することができる。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、ＳＳＥＡ－５を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、ＴＲＡ－１－６０を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、Ｏｃｔ－４を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、Ｎａｎｏｇを発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、ＳＳＥＡ－５及びＴＲＡ－１－６０の両方を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、Ｏｃｔ－４及びＮａｎｏｇの両方を発現する。いくつかの実施形態では、未分化細胞は、ＳＳＥＡ－５、ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ－４、及びＮａｎｏｇを発現する。
【0070】
いくつかの実施形態では、細胞を、フィーダー細胞馴化培地で培養する場合がある。ＥＳ培養法には、幹細胞の繁殖に必要とされる因子を分泌すると同時に、一方で、それらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用が含まれ得る。培養は、典型的には固体表面、例えばゼラチンまたはビメンチンでコーティングされた表面の上で行われる。例示的なフィーダー層としては、ヒト胚性線維芽細胞、成体卵管上皮細胞、初代マウス胚性線維芽細胞（ＰＭＥＦ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス胎児線維芽細胞（ＭＦＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト胚性幹細胞の分化から得られたヒト線維芽細胞、ヒト胎児筋細胞（ＨＦＭ）、ヒト胎児皮膚細胞（ＨＦＳ）、ヒト成人皮膚細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト臍帯線維芽細胞、臍帯または胎盤から得られたヒト細胞、及びヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）が挙げられる。ＥＳＣを未分化状態に維持するために、培地に成長因子が添加され得る。そのような成長因子には、ｂＦＧＦ及び／またはＴＧＦがある。別の実施形態では、ｈＥＳＣを未処理の未分化状態に維持するために、培地に薬剤が添加され得る。例えば、Ｋａｌｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ，３６９：２０１３０５４０を参照されたい。
【0071】
ｈＥＳＣは、典型的には支持培地（例えば、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）またはヒト血清アルブミンを含むＮＵＴ（＋））中で１～４日経過後にフィーダー細胞の上に蒔かれる。ｂＦＧＦ及びＴＧＦＩ３などのＥＳＣの分化を防ぐために、追加の因子を培地に添加する場合がある。十分な量のｈＥＳＣが得られたら、次は細胞を（例えば、無菌チップまたは使い捨ての無菌幹細胞ツール（１４６０２ Ｓｗｅｍｅｄ）を使用することによって）機械的に破砕する。あるいは、酵素処理（例えば、コラゲナーゼＡ、またはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ）によって細胞を除去してもよい。このプロセスは、必要な量のｈＥＳＣに到達するまで数回繰り返され得る。いくつかの実施形態によれば、第１回の増殖に続いて、ｈＥＳＣはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して除去され、第２回の増殖に続いて、ｈＥＳＣはコラゲナーゼＡを使用して除去される。
【0072】
フィーダー細胞を含まないシステムもＥＳ細胞培養に使用されており、そのようなシステムは、フィーダー細胞層の代わりとして、血清代替物、サイトカイン、及び成長因子（ＩＬ６及び可溶性ＩＬ６受容体キメラを含む）を補充したマトリックスを利用する。幹細胞は、培養培地（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｌ７システム、ｍＴｅＳＲ、ＳｔｅｍＰｒｏ、ＸＦＫＳＲ、Ｅ８、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標））の存在下で、細胞外マトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬＲ（商標）、ラミニンまたはビトロネクチン）などの固体表面の上で成長させることができる。フィーダー細胞及び幹細胞の同時成長を必要とし、細胞集団が混在する可能性があるフィーダーベースの培養とは異なり、フィーダーフリーシステムで成長した幹細胞は表面から容易に分離される。幹細胞の増殖に使用される培養培地は、ＭＥＦ馴化培地及びｂＦＧＦなど、分化を効果的に阻害し、成長を促進する因子を含有する。
【0073】
また、本開示の範囲内には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の状態で増殖させかつ維持するための方法であって、非接着性表面上でヒト多能性幹細胞を培養して未分化ｈＥＳＣの集団を得ることと、前記未分化ｈＥＳＣの集団を成長培地中のマイクロキャリアと組み合わせることと、前記細胞集団を増殖させることとを含む方法も含まれる。
【0074】
非接着細胞培養プレートの例には、Ｎｕｎｃによって製造されたもの（例えば、Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ Ｃａｔ Ｎｏ．１７４９１２）などがある。他の実施形態では、非接着性懸濁培養皿が使用され得る（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
【0075】
いくつかの実施形態によれば、細胞が非接着性基材上、例えば細胞培養プレート上で培養される場合、大気酸素状態は２０％である。また一方、大気中酸素の割合が、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、またはさらに約５％未満（例えば、１％～２０％、１％～１０％または０～５％の間）となるように、大気酸素状態を操作することも企図される。他の実施形態によれば、細胞は、最初は通常の大気酸素状態下で、その後、通常よりも低い大気酸素状態下で、非接着性基材上で培養される。
【0076】
いくつかの実施形態では、本方法は、増殖した細胞集団を凍結させる（例えば、凍結保存する）ことをさらに含んでもよい。凍結保存に適した培地の例には、９０％ヒト血清／１０％ＤＭＳＯ、Ｍｅｄｉａ ３ １０％（ＣＳ１０）、Ｍｅｄｉａ２５％（ＣＳ５）及びＭｅｄｉａ１２％（ＣＳ２）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒ、ＰＲＩＭＥ ＸＶ° ＦＲＥＥＺＩＳ、ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＡＳＯＬ（登録商標）、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅなどがあるが、これらに限定されない。
【0077】
さらなる実施形態では、凍結保存培地には、プリンヌクレオシド（例えば、アデノシン）、分岐グルカン（例えば、デキストラン４０）、両性イオン有機化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジンＥＮ′－（２Ｅエタンスルホン酸）））、及び細胞耐性極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））が含まれる。さらにさらなる実施形態では、プリンヌクレオシド、分岐グルカン、緩衝剤、及び極性非プロトン性溶媒のうちの１つ以上は、一般に、米国ＦＤＡによって安全であると認められている。
【0078】
いくつかの実施形態では、凍結保存培地には、糖酸（例えば、ラクトビオン酸）、塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）のうちの１つ以上、抗酸化剤（例えば、Ｌ－グルタチオン）、１つ以上のハロゲン化物塩（例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）、塩基性塩（例、炭酸水素カリウム）、リン酸塩（例、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム）、１つ以上の糖（例えば、デキストロース、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、及び水、のうちの１つ以上がさらに含まれる。
【0079】
他の実施形態では、糖酸、塩基、ハロゲン化物塩、塩基性塩、酸化防止剤、リン酸塩、糖、糖アルコールのうちの１つ以上は、一般に、米国ＦＤＡによって安全であると認められている。
【0080】
ＤＭＳＯは、凍結保存プロセス中に細胞を死滅させる可能性のある氷晶の形成を防ぐための凍結保護剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、凍結保存可能な培地は、約０．１％～約２％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存可能な培地は、約１％～約２０％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存可能な媒体は、約２％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存可能な媒体は、約５％のＤＭＳＯを含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、本方法は、分化細胞を得るために、分化剤を含む培地中、接着性表面上で、増殖した細胞集団を培養することをさらに含み得る。接着性基質または物質の混合物の例には、フィブロネクチン、ラミニン、ポリＤ－リジン、コラーゲン、及びゼラチンが含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、分化は、ニコチンアミドの存在下（例えば、０．０１～１００ｍＭ、０．１～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、５～５０ｍＭ、５～２０ｍＭの間、例えば、１０ｍＭ）で、かつアクチビンＡの非存在下で行われる。濃度は、端点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。
【0082】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、最初は通常の大気酸素状態下で、非接着性基材上で培養され、その後、酸素が通常の大気酸素状態下よりも低くされる。
【0083】
いくつかの実施形態によれば、細胞が接着性基質上、例えばラミニン上で培養される場合、大気酸素状態は２０％である。大気酸素状態は、大気中酸素の割合が、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、より好ましくは約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、及びより好ましくは約５％（例えば、１％～２０％、１％～１０％、または０～５％）となるように操作され得る。量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分範囲であってよい。
【0084】
いくつかの実施形態では、上記で詳細に説明したように、細胞がフィーダー細胞馴化培地で培養される。
【0085】
いくつかの実施形態では、細胞は、フィーダー細胞の非存在下で培養される。
【0086】
いくつかの実施形態では、最初の増殖の後、細胞をさらに増殖させることができる。
【0087】
いくつかの実施形態では、細胞は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日間、培養され得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、培養細胞をさらに増殖させることがある。
【0089】
いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を採取し、さらに分化させる。いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を、成長培地を変えることによってさらに分化させる。いくつかの実施形態では、懸濁性増殖複合体の培養細胞を、未分化かつ多能性のままにする。
【0090】
追加の実施形態
本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する。
本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する。
【0091】
実施形態１－ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を未分化の多能性状態で増殖させかつ維持するための方法であって、以下のステップ：（ａ）成長培地においてヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、（ｂ）前記懸濁性増殖複合体を一定期間培養することと、を含む、前記方法。
【0092】
実施形態２－前記マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、実施形態１に記載の方法。
【0093】
実施形態３－前記マイクロキャリアが、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
【0094】
実施形態４－前記ＥＣＭが、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
【0095】
実施形態５－前記ＥＣＭが、ヒトラミニンである、実施形態１に記載の方法。
【0096】
実施形態６－前記ヒトラミニンが、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである、実施形態５に記載の方法。
【0097】
実施形態７－前記マイクロキャリアが、コーティングされていない、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
【0098】
実施形態８－前記マイクロキャリアが、プロタミンまたはポリリジンと結合している、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
【0099】
実施形態９－前記マイクロキャリアが、中性であるか、または負に帯電している、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
【0100】
実施形態１０－前記マイクロキャリアが、中性である、実施形態９に記載の方法。
【0101】
実施形態１１－前記マイクロキャリアが、負に帯電している、実施形態９に記載の方法。
【0102】
実施形態１２－前記マイクロキャリアが、親水性である、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。
【0103】
実施形態１３－前記懸濁性増殖複合体が、少なくとも約１日間、培養される、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
【0104】
実施形態１４－前記懸濁性増殖複合体が、約１日間～約１４日間、培養される、実施形態１３に記載の方法。
【0105】
実施形態１５－ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことによって、前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を採取し、さらに増殖させる、実施形態１に記載の方法。
【0106】
実施形態１６－前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を採取し、さらに分化させる、実施形態１に記載の方法。
【0107】
実施形態１７－前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を、前記成長培地を変えることによってさらに分化させる、実施形態１６に記載の方法。
【0108】
実施形態１８－前記懸濁性増殖複合体の前記培養細胞を、未分化かつ多能性のままにする、実施形態１に記載の方法。
【0109】
実施形態１９－前記未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５及びＴＲＡ－１－６０のそれぞれの少なくとも約８０％を発現する、実施形態１６に記載の方法。
【0110】
実施形態２０－前記未分化細胞が、Ｏｃｔ－４及びＮａｎｏｇのそれぞれの少なくとも約７０％を発現する、実施形態１６に記載の方法。
【0111】
実施形態２１－前記未分化細胞が、ＳＳＥＡ－５の少なくとも約８０％、ＴＲＡ－１－６０の少なくとも約８０％、Ｏｃｔ－４の少なくとも約７０％、及びＮａｎｏｇの少なくとも約７０％を発現する、実施形態１６に記載の方法。
【0112】
組成物
別の態様では、ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを含む懸濁性増殖複合体組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを含む懸濁性増殖複合体組成物が本明細書で提供される。
【0113】
ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス、及びマイクロキャリアについては、本明細書の他の箇所で詳細に説明されている。
【0114】
増殖複合体の範囲は変動し得る。以下の表では、複合体成分の範囲が、ＥＣＭ成分の単位を変えて列挙される。
【0115】
【表1】
【0116】
ＥＣＭ成分は、ラミニン５１１Ｅ８フラグメントの分子量（１５０ＫＤａ）を使用して、ｍｏｌ／ｃｍ２で表すことができる。
【0117】
【表2】
【0118】
ＥＣＭ成分はまた、アボガドロ数（６．０２２×１０２３）を乗じた分子量（１５０ＫＤａ）を用いることにより、分子数／ｃｍ２で表すことができる。
【0119】
【表3】
【0120】
いくつかの実施形態では、以下の仕様パラメータを拡張することができる：
ｈＥＳＣの数（細胞数） － マイクロキャリア１ｃｍ２あたり４，０００～６００，０００細胞；
ラミニン５１１Ｅ８フラグメント（マイクロキャリア１ｃｍ２あたりのμｇ） － ０．１２５μ／ｃｍ２以上
。
ｈＥＳＣの数（細胞数） － マイクロキャリア１ｃｍ２あたり４，０００～６００，０００細胞；
ラミニン５１１Ｅ８フラグメント（マイクロキャリア１ｃｍ２あたりのμｇ） － ０．１２５μ／ｃｍ２以上
。
【0121】
いくつかの実施形態では、組成物は、成長培地をさらに含む。本開示に従って利用され得る市販の基礎培地の非限定的な例は、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）（ＥＳＣ分化のためのｂＦＧＦ及びＴＧＦなし、ＥＳＣ増殖のためのｂＦＧＦ及びＴＧＦあり）、ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（商標）、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）幹細胞成長培地、またはＸ－ＶＩＶＯ（商標）を含む。基礎培地には、細胞培養を扱う当技術分野で知られている様々な薬剤を補充することができる。以下は、本開示に従って使用されることになる、培養物に含まれ得る様々な補足物への非限定参照である。すなわち、ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）、ＮＵＴＲＩＤＯＭＡ－ＣＳ、ＴＣＨ（商標）、Ｎ２、Ｎ２誘導体、もしくはＢ２７または組み合わせなどであるがこれらに限定されない血清または血清代替物含有培地、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン及びゼラチンなどであるがこれらに限定されない細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分である。そして、ＥＣＭは、成長因子のＴＧＦＩ３スーパーファミリーの１つ以上のメンバー、すなわち、ペニシリン及びストレプトマイシンなどであるがこれらに限定されない抗菌剤、及びＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４などであるがこれらに限定されない、培養物中のＳＣの生存を促進する役割を果たすことが知られている非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）であるニューロトロフィンを運ぶために使用され得る。
【0122】
上記のように、マイクロキャリアは、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、表面修飾ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、化学修飾ポリスチレンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、架橋デキストランから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、セルロースから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、アクリルアミドから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コラーゲンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、アルギン酸塩から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ゼラチンから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ガラスから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、ＤＥＡＥ－デキストランから構成される。
【0123】
上記のように、マイクロキャリアは、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0124】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせでコーティングされていてもよい。いくつかの実施形態では、ラミニンは、ヒトラミニン５１１である。
【0125】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、コーティングされていない。
【0126】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、２５ｃｍ２～７，５００ｃｍ２、例えば、約２５ｃｍ２、５０ｃｍ２、７５ｃｍ２、１００ｃｍ２、１２５ｃｍ２、１５０ｃｍ２、１７５ｃｍ２、２００ｃｍ２、２２５ｃｍ２、２５０ｃｍ２、５００ｃｍ２、６２５ｃｍ２、７５０ｃｍ２、１，０００ｃｍ２、１，２５０ｃｍ２、５，０００ｃｍ２、または７，５００ｃｍ２の表面積を有する。表面積は、端点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
【0127】
いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンと結合している。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは中性である。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは負に帯電している。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアは親水性である。
【0128】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用される全ての出版物、特許、及び特許出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【0129】
追加の実施形態
本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する。
本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する。
【0130】
実施形態２２－ヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを含む、懸濁性増殖複合体組成物。
【0131】
実施形態２３－成長培地をさらに含む、実施形態２２に記載の組成物。
【0132】
実施形態２４－前記マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、磁性粒子、マイクロチップ、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうちの１つ以上を含む、実施形態２２または実施形態２３に記載の組成物。
【0133】
実施形態２５－前記マイクロキャリアが、球形、平滑、マクロ多孔性、棒状、またはそれらの組み合わせである、実施形態２２～２４のいずれかに記載の組成物。
【0134】
実施形態２６－前記マイクロキャリアが、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせでコーティングされている、実施形態２２～２５のいずれかに記載の組成物。
【0135】
実施形態２７－前記ラミニンが、ヒトラミニンである、実施形態２６に記載の組成物。
【0136】
実施形態２８－前記ヒトラミニンが、ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントである、実施形態２７に記載の組成物。
【0137】
実施形態２９－前記マイクロキャリアが、コーティングされていない、実施形態２２～２８のいずれかに記載の組成物。
【0138】
実施形態３０－前記マイクロキャリアが、プロタミンまたはポリリジンと結合している、実施形態２２～２９のいずれかに記載の組成物。
【0139】
実施形態３１－前記マイクロキャリアが、中性であるか、または負に帯電している、実施形態２２～３０のいずれかに記載の組成物。
【0140】
実施形態３２－前記マイクロキャリアが、中性である、実施形態３１に記載の組成物。
【0141】
実施形態３３－前記マイクロキャリアが、負に帯電している、実施形態３１に記載の組成物。
【0142】
実施形態３４－前記マイクロキャリアが、親水性である、実施形態２２～２９のいずれかに記載の組成物。
【実施例】
【0143】
実施例１：ｈＥＳＣ増殖の方法
ｈＥＳＣ生産のスケールアップが、多くの成長プラットフォームで行われている。成長中のｈＥＳＣ細胞懸濁液から、あるいはローラーボトルなどの２次元フラスコ、細胞工場または３次元中空糸、及びＢｉｏＮｏｃＩＩ及びＦｉｂｒａ Ｃｅｌｌ ｄｉｓｃなどのマクロキャリアに付着させる。
ｈＥＳＣ生産のスケールアップが、多くの成長プラットフォームで行われている。成長中のｈＥＳＣ細胞懸濁液から、あるいはローラーボトルなどの２次元フラスコ、細胞工場または３次元中空糸、及びＢｉｏＮｏｃＩＩ及びＦｉｂｒａ Ｃｅｌｌ ｄｉｓｃなどのマクロキャリアに付着させる。
【0144】
完全に制御された閉鎖システムが、単純な哺乳類細胞の成長に長年使用されてきた。それらのシステムは、大量の工業用抗体及びタンパク質の製造を可能にした。これらのシステムのほとんどは、もともと成長している細胞、または単一細胞として懸濁液中で成長するように適応させた細胞を必要とする。懸濁液中でｈＥＳＣを増殖させる初期の試みは、それらが多能性を失い、自発的に分化する傾向がある凝集体を形成したため、成功しなかった。ほとんどの場合、単一細胞懸濁液として成長するｈＥＳＣへの適応は、遺伝的安定性を損ない、核型異常を引き起こした。最近、このような方法論が大幅に改善された（ＡＭＩＴ Ｍｉｃｈａｌ，Ｉｔｚｋｖｉｔｚ Ｅｌｄｏｒ Ｊｏｓｅｐｈ 特許番号ＥＰ２０５９５８６Ｂ１，ＵＳ９０４０２９７Ｂ２）。その革新性は、無血清、無血清代替物、ゼノフリー、フィーダーフリー、及びタンパク質キャリアフリーで、いかなる種類の基質またはコーティングにも付着させることなくｈＥＳＣを成長させることにある。これは、可溶性インターロイキン－６受容体（ｓＩＬ６Ｒ、＞１０ｎｇ／ｍｌ）、可溶性インターロイキン－６（ＩＬ６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ、１０００～３０００ｕ／ｍｌ）、ならびにｂＦＧＦ、ＴＧＦｂ１及びＴＧＦｂ３の添加によって部分的に可能になった。
【0145】
いくつかの研究では、マイクロキャリアを使用してｈＥＳＣ培養物を成長させている。接着細胞が成長するための表面を提供しながら溶液に懸濁するというマイクロキャリアの特性は、閉鎖され制御された環境で接着細胞培養物を成長させるのに理想的であった。大量生産のためにマイクロキャリアを使用する潜在的な利点は、表面積対体積比が、従来の静的培養プロセスよりも大幅に増加するため、細胞密度が増加し、必要なフットプリントが減少し得ることである。
【0146】
多くの異なる種類のマイクロキャリア（ＭＣ）が市販されている。ＭＣは、ＨｙＱＳｐｈｅｒｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びＨｉｌｌｅｘ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ブランドなどのポリスチレンから作製することも、Ｃｙｔｏｄｅｘブランド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの架橋デキストランから作製することもできる。ほとんどのマイクロキャリアは球形かつ平滑であるが、他には、Ｃｙｔｏｐｏｒｅブランド（ＧＥ）などのマクロ多孔性の表面を持つものや、ＤＥ－５３（Ｗｈａｔｍａｎ）などの棒状キャリアなどの代替物を持つものもある。追加の技術的進歩としては、ビーズ（Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧＥＭ粒子）からの細胞分離に役立つ可能性のある、ＭＣへの磁性粒子の注入や、従来のマイクロキャリアの高い表面積対体積比を維持しながら、細胞成長のための従来の平坦な表面を提供するμＨｅｘ製品（Ｎｕｎｃ）などのチップベースのマイクロキャリアが挙げられる。細胞増殖用のマイクロキャリアの選択は簡単なタスクではない。マイクロキャリアの様々な特性は、増殖率、細胞多能性、実行能力（ｈＥＳＣの場合、異なる系統に分化する能力）、遺伝的安定性などに大きく影響する可能性がある。表面化学修飾によっては、細胞接着を改善できるものもある。このような方法には、正電荷または負電荷を加えること、及び細胞外マトリックスタンパク質による任意選択のコーティングが含まれる（Ｌａｍ ２０１５ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ Ｖｏｌｕｍｅ ４．１，Ｃｈｅｒｉａｎ ２０２０ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １１Ａｒｔｉｃｌｅ ６５４）。
【0147】
撹拌懸濁液中のマイクロキャリア上で胚性幹細胞（ＥＳＣ）を増殖させる最初の試みは、２００５～２００７年に発表された（Ｆｏｋ ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；２３：１３３３－１３４２，Ａｂｒａｎｃｈｅｓ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２００７），ｐｐ．１２１１－１２２１，及びＳｔｅｆａｎｉｅ Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ ＆ Ｏｌｉｖｅｒ Ｂｒｕｓｔｌｅ ＵＳ２００７０２６４７１３Ａ１）。ＭＣへのｈＥＳＣの増殖と継代とは、２００９年にＣｙｔｏｄｅｘ１、３及びＳｏｌｏｈｉｌＰｌａｓｔｉｃ、Ｐｌａｓｔｉｃ ｐｌｕｓ、及びＨｉｌｌｅｘ ＩＩ（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ，ＵＳ２０１８０２６５８４２Ａ１，ＵＳ９９６９９７２Ｂ２）を使用して、ＭＣ上の胚体内胚葉細胞及び膵臓細胞、または心筋細胞への分化を含めて実証された（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．ＥＰ２４７９２６０Ｂ１）。開発されたプロセスのほとんどには、マトリゲルによるＭＣのコーティングが含まれており、場合によっては、コラーゲンでプレコーティングされたＭＣのコーティングとして、ラミニンまたはビトロネクチンが使用された。ある研究では、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩでコーティングされたＭＣを使用して、制御環境でｈＥＳＣの増殖が行われた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｉｌｖａ ２０１５）。これらの研究の主な条件と結果とを表４にまとめる。これらの研究では、まだ大型容器には進展していないが、概して、静的フラスコでの標準的技法に匹敵する結果を打ち立てた。しかし、制御環境での大量生産に向けた次のステップは、本開示の前にはまだなされていない。
【0148】
【表4】
【0149】
ＧＭＰグレードのフィーダーフリー及び無血清ｈＥＳＣバンクを、臨床的に承認されたｈＥＳＣ株（ＨＡＤＣ１０２、Ｈ１）から以前に生成した。ここでは、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１－Ｅ８（Ｎｏ．２００９－２３４５８３／ＰＣＴＪＰ２０１０－０６７６１８／ＷＯ２０１１－０４３４０５，Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２ Ｄｅｃ ４；３：１２３６）合成フラグメントを播種溶液に添加することにより、ｈＥＳＣをコーティングしていないフラスコで数回継代してｈＥＳＣを繁殖させた。この方法論を、スケールアッププロセスの開発のためのＭＣでのｈＥＳＣ培養のスケールアップに使用した。概念実証研究では、ｈＥＳＣ（Ｈ１）は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１－Ｅ８（０．１２５μｇｒ／ｃｍ２）を添加したｍＴｅＳＲプラス培地で非接着性Ｔ２５フラスコにて、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩまたはＥｎｈａｎｃｅｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＭＣを使用して培養した。
【0150】
コーティングとしてのヒトラミニン５１１、具体的にはｉＭａｔｒｉｘ－５１１－Ｅ８（ラミニン５１１の合成画分）を、懸濁液中の特定の２つのＭＣ（その他はＰＯＣ研究で試験され、失敗した）と組み合わせて、培養システムでのｈＥＳＣの増殖を可能にすることで、スケールアップが可能になる。ヒトラミニン５１１、具体的にはｉＭａｔｒｉｘ Ｅ８は、スケールアップシステムでＭＣをコーティングするために、初めてここで使用した。以前の出版物は、ラミニンでコーティングされた組織培養でのｈＥＳＣの培養、または概して全てのタンパク質マトリックス（マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはそれらの誘導体もしくは組み合わせ）をカバーする様々な基質を有した異なるＭＣでのｈＥＳＣの培養について教示している。
【0151】
上記のように、この組み合わせにより、ｈＥＳＣの増殖にシングルユースのバイオリアクターを使用することを意図する場合、大規模への移行がはるかに簡単に、かつ直線的に行えるようになる。
【0152】
追加のポイントとして、コーティング手順は、ｉＭａｔｒｉｘ ５１１ Ｅ８のｈＥＳＣに対する高い特異性を利用して行ったため、細胞播種前に基質をプレコーティングするための薬剤としてではなく、むしろ、プロセスを簡略化し、ＭＣと接触する前に細胞懸濁液に直接この薬剤を添加することで使用した。このように、細胞を播種するとき、ＭＣにはプレコーティングしないが、播種溶液にｉＭａｔｒｉｘ ５１１ Ｅ８が含まれていると、その特定のＭＣへの特定の付着が強化される。
【0153】
現在の標準的技法では、マイクロキャリアは細胞接種前にコーティングされる。プレコーティングステップの期間は、３７℃で４時間から４℃で１か月までと非常に可変的であり、長時間の静的なインキュベーションではＭＣがコンパクトになり、表面の一部は隣接するビーズと接触しているためにコーティングしにくくなるので、全ての表面で均一になるようにコーティング手順を制御することは困難である。ＭＣ平衡化及び細胞接種の前に、成長培地中のＭＣに対する平衡化ステップより先に、コーティング溶液を完全に除去する必要がある。ラミニンコーティングは低湿度に敏感であるため、コーティング除去ステップはリスクを伴う。ラミニンが乾燥すると、接着特性が変化する。大容量のスケールアップしたシステムでは、このステップは、播種した細胞の数に影響を与える可能性があるだけではなく、細胞の特性を変化させる可能性があるので、重要である。これまでに記載したｈＥＳＣ増殖システム及び技術に対する本開示の革新性は、ｈＥＳＣスケールアップシステムの簡便な接種を可能にする単一ステップでの成分の組み合わせまたは接種にある。特に、本明細書に記載のシステム及び方法は、上記の単一ステップである播種ステップ、すなわち、（ａ）成長培地でヒト胚性幹細胞、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）、及びマイクロキャリアを同時に組み合わせて、懸濁性増殖複合体を形成することと、（ｂ）懸濁性増殖複合体を一定期間培養することとを含む。例えば、スケールアップしたシステム（特定のＭＣタイプ、細胞を含むｉＭａｔｒｉｘ５１１Ｅ８）に接種するために、関連する全ての材料を共に混合することにより、プレコーティングと、その後の別のステップである播種とを行う必要がない。これには、ＧＭＰ条件下で閉鎖されかつ制御された環境でのｈＥＳＣの増殖も含まれる。スケールアップシステム用のこれらの材料の特定の組み合わせにより、容易かつ安全にＧＭＰへの移行が可能になる。
【0154】
結果
播種を、未処理のＴ２５（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩまたはＥｎｈａｎｃｅｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＭＣ上に２０，０００細胞／ｃｍ２で２時間行った。播種ステップの最後に、８ｍｌのｍＴｅＳＲ ｐｌｕｓを添加した。培地の８０％を２４時間ごとに交換し、乳酸レベル及び細胞形態（図１及び表６）を監視した。採取は、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して播種後４日目に行った。細胞を７０μｍストレーナーでろ過してＭＣを除去した。細胞をＣＳ１０で凍結保存した。ＴＣ処理フラスコでの追跡継代（Ｐ２）の後、解凍した細胞の多能性を評価した（表５、ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ４／Ｎａｎｏｇ）。
播種を、未処理のＴ２５（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩまたはＥｎｈａｎｃｅｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＭＣ上に２０，０００細胞／ｃｍ２で２時間行った。播種ステップの最後に、８ｍｌのｍＴｅＳＲ ｐｌｕｓを添加した。培地の８０％を２４時間ごとに交換し、乳酸レベル及び細胞形態（図１及び表６）を監視した。採取は、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して播種後４日目に行った。細胞を７０μｍストレーナーでろ過してＭＣを除去した。細胞をＣＳ１０で凍結保存した。ＴＣ処理フラスコでの追跡継代（Ｐ２）の後、解凍した細胞の多能性を評価した（表５、ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ４／Ｎａｎｏｇ）。
【0155】
表６に要約されている研究の結果は、両方のタイプのＭＣで細胞の多能性（ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０＞９８％、Ｏｃｔ－４の割合／Ｎａｎｏｇ＞８４％）と自己複製（Ｐ１～４、Ｐ２～３における集団倍加（ＰＤＬ））とを低下させることなく、ＭＣでの効率的なｈＥＳＣの増殖が達成されたことを示している。
【0156】
【表5】
【0157】
【表6】
【0158】
実施例２：製造能力とスケールアップ計画
完全に統合されたチームには、ＰＤ、ＱＣ、ＱＡ、及び製造が含まれる。ＰＳＣ技術の世界的な専門家は、細胞を特定の機能系統に分化させるよう導いた。マイクロキャリアを使用したバイオリアクターでのプロセス開発、製剤化、及び大量生産のための経験豊富なチームが存在する。社内に特化したｃＧＭＰ生産能力には、１）２つの独立したクリーンルーム、２）バイオリアクター細胞生産（現在、バッチあたり５０億個の細胞）、及び３）充填／仕上げ能力が含まれる。
完全に統合されたチームには、ＰＤ、ＱＣ、ＱＡ、及び製造が含まれる。ＰＳＣ技術の世界的な専門家は、細胞を特定の機能系統に分化させるよう導いた。マイクロキャリアを使用したバイオリアクターでのプロセス開発、製剤化、及び大量生産のための経験豊富なチームが存在する。社内に特化したｃＧＭＰ生産能力には、１）２つの独立したクリーンルーム、２）バイオリアクター細胞生産（現在、バッチあたり５０億個の細胞）、及び３）充填／仕上げ能力が含まれる。
【0159】
実施例３：ｈＥＳＣの増殖をスケールアップするためのシステム
上記のように、単一ステップで成分を組み合わせることにより、本開示の教示に従って、ｈＥＳＣスケールアップシステムの簡便な接種が可能になる。現在の標準的技法では、マイクロキャリアは細胞接種前にコーティングされる。プレコーティングステップの期間は、３７℃で４時間から４℃で１か月までと非常に可変的であり、長時間の静的なインキュベーションではＭＣがコンパクトになり、表面の一部は隣接するビーズと接触しているためにコーティングしにくくなるので、全ての表面で均一になるようにコーティング手順を制御することは困難である。ＭＣ平衡化及び細胞接種の前に、成長培地中のＭＣに対する平衡化ステップより先に、コーティング溶液を完全に除去する必要がある。ラミニンコーティングは低湿度に敏感であるため、コーティング除去ステップはリスクを伴う。ラミニンが乾燥すると、接着特性が変化する。大容量のスケールアップしたシステムでは、このステップは、播種した細胞の数に影響を与える可能性があるだけではなく、細胞の特性をも変化させる可能性があるので、重要である。
上記のように、単一ステップで成分を組み合わせることにより、本開示の教示に従って、ｈＥＳＣスケールアップシステムの簡便な接種が可能になる。現在の標準的技法では、マイクロキャリアは細胞接種前にコーティングされる。プレコーティングステップの期間は、３７℃で４時間から４℃で１か月までと非常に可変的であり、長時間の静的なインキュベーションではＭＣがコンパクトになり、表面の一部は隣接するビーズと接触しているためにコーティングしにくくなるので、全ての表面で均一になるようにコーティング手順を制御することは困難である。ＭＣ平衡化及び細胞接種の前に、成長培地中のＭＣに対する平衡化ステップより先に、コーティング溶液を完全に除去する必要がある。ラミニンコーティングは低湿度に敏感であるため、コーティング除去ステップはリスクを伴う。ラミニンが乾燥すると、接着特性が変化する。大容量のスケールアップしたシステムでは、このステップは、播種した細胞の数に影響を与える可能性があるだけではなく、細胞の特性をも変化させる可能性があるので、重要である。
【0160】
本開示の革新性は、プレコーティングと播種の追加ステップとを必要とせずに、スケールアップしたシステム（特定のＭＣタイプ、細胞を含むｉＭａｔｒｉｘ５１１Ｅ８）に接種するために、全ての関連材料を共に混合する、上述の播種ステップを含むところにある。これには、ＧＭＰ条件下で閉鎖されかつ制御された環境でのｈＥＳＣの増殖も含まれる。スケールアップシステム用にこれらの材料を特定の組み合わせにすることで、容易かつ安全なＧＭＰへの移行が可能になる。
【0161】
ここで紹介するプロセス（図３）には、従来のフィーダーを使用しない２次元培養としてのｈＥＳＣの解凍と増殖とが含まれる。次に、ｈＥＳＣを採取し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８を培地に補充したＭＣ上のｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムに、それを直接播種する。スケールアップシステムでのｈＥＳＣ増殖の終わりに、採取した細胞を、さらなる増殖のために、ｈＥＳＣ多能性バンクとして凍結保存すること、及び／または直接継続して分化を開始することができる。
【0162】
細胞成長の評価では、いくつかのパラメータを評価することができる：
１）乳酸測定結果 － 培養に沿った培地中の乳酸濃度の増加は、ｈＥＳＣ培養中の生細胞数に比例する。
２）形態学的評価 － スケールアップシステムでのｈＥＳＣ増殖中に観察されるビーズの塊は、培養中の細胞成長を反映している。
３）継代パラメータ － 収率
パラメータに加えて、細胞の採取密度（生細胞／ｃｍ２）。
１）乳酸測定結果 － 培養に沿った培地中の乳酸濃度の増加は、ｈＥＳＣ培養中の生細胞数に比例する。
２）形態学的評価 － スケールアップシステムでのｈＥＳＣ増殖中に観察されるビーズの塊は、培養中の細胞成長を反映している。
３）継代パラメータ － 収率
【0163】
他のｈＥＳＣ特性評価方法を使用して、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を評価した：
１）多能性マーカーの発現 － ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの培養から凍結保存された採取細胞を、４つのよく知られた多能性マーカー（ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ－４／Ｎａｎｏｇ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。これらのマーカーの高度発現により、ｈＥＳＣスケールアップ培養システムから採取した細胞の同一性及び多能性の状態を確認した。
２）核型分析 － 発育の中で細胞を、ｈＥＳＣスケールアップ培養システムから採取した後に培養し、固定した。細胞核型は、遺伝的安定性を確保するためにギムザバンディング法によって試験した。
１）多能性マーカーの発現 － ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの培養から凍結保存された採取細胞を、４つのよく知られた多能性マーカー（ＳＳＥＡ－５／ＴＲＡ－１－６０、Ｏｃｔ－４／Ｎａｎｏｇ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。これらのマーカーの高度発現により、ｈＥＳＣスケールアップ培養システムから採取した細胞の同一性及び多能性の状態を確認した。
２）核型分析 － 発育の中で細胞を、ｈＥＳＣスケールアップ培養システムから採取した後に培養し、固定した。細胞核型は、遺伝的安定性を確保するためにギムザバンディング法によって試験した。
【0164】
いくつかの種類のＭＣでのｈＥＳＣの培養
ｈＥＳＣをＴフラスコから採取し、播種培地にｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８を補充した数種類のＭＣに、１回の接種ステップで播種した。細胞をｈＥＳＣスケールアップシステムで４日間継代培養した。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで評価したＭＣタイプの詳細を表７に示す。さらに、他のタイプのマイクロキャリア及びマクロキャリア（Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｐｌａｓｔｉｃ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、ＥＳＣＯ ＢｉｏＮＯＣ ＩＩ、ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｆｉｂｒａｃｅｌｌ Ｄｉｓｋ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｘ ＳｐｈｅｒｅＣｏｌ（登録商標）Ｔｙｐｅ Ｉ コラーゲンコーティングビーズ、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３）でのｈＥＳＣの培養を試験した（データは示していない）。これらのマイクロキャリア及びマクロキャリアは、ＭＣの最初の選別後は継続を止めた。
ｈＥＳＣをＴフラスコから採取し、播種培地にｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８を補充した数種類のＭＣに、１回の接種ステップで播種した。細胞をｈＥＳＣスケールアップシステムで４日間継代培養した。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで評価したＭＣタイプの詳細を表７に示す。さらに、他のタイプのマイクロキャリア及びマクロキャリア（Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｓｔａｒ－Ｐｌｕｓ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｈｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｐｌａｓｔｉｃ、Ｐａｌｌ Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓ、ＥＳＣＯ ＢｉｏＮＯＣ ＩＩ、ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｆｉｂｒａｃｅｌｌ Ｄｉｓｋ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｘ ＳｐｈｅｒｅＣｏｌ（登録商標）Ｔｙｐｅ Ｉ コラーゲンコーティングビーズ、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３）でのｈＥＳＣの培養を試験した（データは示していない）。これらのマイクロキャリア及びマクロキャリアは、ＭＣの最初の選別後は継続を止めた。
【0165】
【表7】
【0166】
表７に示す両方のグループからのｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムの形態評価を図４に示す。
【0167】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおける培養後１継代の細胞における採取密度、収率及び多能性マーカーの発現に加えて、２日目から４日目までの培養培地中の乳酸の上昇を表８に示す。
【0168】
【表8】
【0169】
さらなる培養のために播種した採取細胞の形態評価を図５に示す。細胞は典型的なｈＥＳＣの形態を示しており、細胞質に対する核の比率が高いコンパクトな細胞のコロニーとして組織化されている。
【0170】
細胞は、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステム条件下のＣｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ及びＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ＭＣで、正常に培養され、多能性ｈＥＳＣが生成された。
【0171】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムの接種前採取方法
図３に示すように、完全なプロセスには、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムに接種する前に、ｈＥＳＣを２次元培養物として培養することが含まれる。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステム接種の前に、従来のフィーダーを使用しない２次元培養に由来する２つの採取方法（非酵素的 － 細胞の小塊が得られる、酵素的 － 単一細胞が得られる）を使用した。両方の採取法を、上記の両方の種類のＭＣについて試験した。グループを表９に示す。
図３に示すように、完全なプロセスには、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムに接種する前に、ｈＥＳＣを２次元培養物として培養することが含まれる。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステム接種の前に、従来のフィーダーを使用しない２次元培養に由来する２つの採取方法（非酵素的 － 細胞の小塊が得られる、酵素的 － 単一細胞が得られる）を使用した。両方の採取法を、上記の両方の種類のＭＣについて試験した。グループを表９に示す。
【0172】
【表9】
【0173】
表９のｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの培養の形態評価を図６に示す。さらに、全てのグループからの細胞の培養パラメータと多能性マーカーの発現とを表１０に示す。
【0174】
【表10】
【0175】
採取密度及び収率に加えて、多能性マーカーの発現（全ての試験済みマーカーで８６％を超える陽性）、培養中の乳酸濃度の上昇は、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの接種前の採取細胞が、ＴｒｙｐＬＥ ＳｅｌｅｃｔだけでなくＲｅＬｅＳＲでも達成されたことを示した。どちらの方法も、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで接種する前にｈＥＳＣを採取するのに適している。
【0176】
両方のＭＣ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ及びＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）と両方の採取法（ＲｅＬｅＳＲ及びＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ）とは、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムに適している。さらに、上記のデータに基づいて、ＭＣからＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して採取し、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの追加の継代のために播種したｈＥＳＣの培養が実現可能であると仮定することは合理的である。
【0177】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムの培養プラットフォーム
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでのｈＥＳＣの増殖を、様々な培養プラットフォームで、様々な作業容量とＭＣ表面積とで試験した。いくつかの培養プラットフォームの例を表１１に示す。
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでのｈＥＳＣの増殖を、様々な培養プラットフォームで、様々な作業容量とＭＣ表面積とで試験した。いくつかの培養プラットフォームの例を表１１に示す。
【0178】
【表11】
【0179】
表１１のプラットフォームからのｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムの形態評価を図７に示す。
【0180】
培養に沿って乳酸濃度を測定することにより、培養物の成長を評価した。さらに、採取密度と収率とを算出した。培養の最後に、多能性マーカー発現のフローサイトメトリー分析によって、ｈＥＳＣの同一性及び多能性を評価した。さらに、発育中に、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞の核型を試験した。これらの結果を表１２に要約する。
【0181】
【表12】
【0182】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおけるｈＥＳＣの成長を、異なるＭＣ表面積（２５ｃｍ２、１２５ｃｍ２、２５０ｃｍ２、６２５ｃｍ２、１，２５０ｃｍ２及び７，５００ｃｍ２）及び作業容量（１０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、３，０００ｍＬ）の、いくつかの培養容器（未処理Ｔ２５、０．１Ｌ ＰＢＳホイール、０．５Ｌ ＰＢＳホイール、３Ｌ ＰＢＳ－ＭＡＧ）で実現させた。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで培養すると、培養容器や培養条件を変更した後でも、多能性マーカーの非常に高度な発現が維持された。
【0183】
効率的な接種のためのｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８濃度
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの接種を、２つのｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８濃度で行った。試験した条件と細胞成長（４日間の継代の２日目～４日目の乳酸濃度の増加、及び細胞－ＭＣ凝集塊の形成によって評価した）とを、表１３及び図８にまとめる。
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの接種を、２つのｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８濃度で行った。試験した条件と細胞成長（４日間の継代の２日目～４日目の乳酸濃度の増加、及び細胞－ＭＣ凝集塊の形成によって評価した）とを、表１３及び図８にまとめる。
【0184】
【表13】
【0185】
接種中に０．１２５及び０．２５０ｕｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８を使用した場合に、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおけるｈＥＳＣの増殖を達成した。さらに、上記のデータに基づいて、０．１２５～０．２５０ｕｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８濃度が、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおけるｈＥＳＣの効率的な成長をもたらすようになると予測することができる。
【0186】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおけるＭＣでのｈＥＳＣの継代継続期間
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでのｈＥＳＣ培養の柔軟性を確保するために、４日間及び５日間の継代を評価した。異なる継代継続期間のｈＥＳＣ播種密度の調整を行った。４日間の継代後（グループ５．１）及び５日間の継代後（グループ５．２）に採取したｈＥＳＣの採取密度、採取時の乳酸、形態及び多能性マーカー発現の比較を表１４及び図９に示す。採取時の形態評価と乳酸とは、４日～５日の間の継代培養で類似性を示した。さらに、多能性マーカーの発現は両方のグループで高かった（全てのマーカーで＞８９％）。
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでのｈＥＳＣ培養の柔軟性を確保するために、４日間及び５日間の継代を評価した。異なる継代継続期間のｈＥＳＣ播種密度の調整を行った。４日間の継代後（グループ５．１）及び５日間の継代後（グループ５．２）に採取したｈＥＳＣの採取密度、採取時の乳酸、形態及び多能性マーカー発現の比較を表１４及び図９に示す。採取時の形態評価と乳酸とは、４日～５日の間の継代培養で類似性を示した。さらに、多能性マーカーの発現は両方のグループで高かった（全てのマーカーで＞８９％）。
【0187】
【表14】
【0188】
４日間及び５日間の継代継続期間の両方で、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでのｈＥＳＣ培養を実現させた。継代継続期間に従って播種密度を調整することにより、ｈＥＳＣ培養物は、同様の乳酸濃度と採取密度とに達した。さらに、播種密度を調整することにより、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおけるＭＣ上でｈＥＳＣを培養することは、３～７日間の継代で遂行することが可能である。
【0189】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで培養した細胞からのｈＥＳＣバンクの凍結保存
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を凍結保存した。次に、解凍した細胞を多能性マーカーの発現について試験し、２次元の従来のフィーダーフリー培養としてさらに培養するために播種した。解凍した細胞は、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの培養後に、ｈＥＳＣの形態を維持することに加えて、多能性マーカーの高度な発現を示した（表１５）。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおける培養パラメータと多能性マーカー発現とを表１５に示す。追跡のため、解凍後２日目及び５日目に、従来の２次元フィーダーフリーフラスコへ播種したものとともに、ｈＥＳＣ増殖培養システムにおけるＭＣ上で培養中の細胞の形態を図１０に示す。
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を凍結保存した。次に、解凍した細胞を多能性マーカーの発現について試験し、２次元の従来のフィーダーフリー培養としてさらに培養するために播種した。解凍した細胞は、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムでの培養後に、ｈＥＳＣの形態を維持することに加えて、多能性マーカーの高度な発現を示した（表１５）。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムにおける培養パラメータと多能性マーカー発現とを表１５に示す。追跡のため、解凍後２日目及び５日目に、従来の２次元フィーダーフリーフラスコへ播種したものとともに、ｈＥＳＣ増殖培養システムにおけるＭＣ上で培養中の細胞の形態を図１０に示す。
【0190】
【表15】
【0191】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステム細胞からのｈＥＳＣバンクの凍結保存が達成された。細胞は、解凍した細胞を再播種した後、２次元培養としてｈＥＳＣの典型的な形態を維持することに加えて、多能性マーカーの高度発現を示した（試験した全てのマーカーで９５％を超える陽性）。
【0192】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を、２次元ｈＥＳＣ培養として、さらに培養する
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞は、ｈＥＳＣ２次元培養としてさらに増殖させることができる。次の例では、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を、フィーダーを使用しない従来の２次元培養でさらに培養した。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで培養された細胞の形態に加えて、２回連続継代の２次元培養としての培養パラメータ（採取時の乳酸）を、表１６及び図１１に示す。
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞は、ｈＥＳＣ２次元培養としてさらに増殖させることができる。次の例では、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を、フィーダーを使用しない従来の２次元培養でさらに培養した。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムで培養された細胞の形態に加えて、２回連続継代の２次元培養としての培養パラメータ（採取時の乳酸）を、表１６及び図１１に示す。
【0193】
【表16】
【0194】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞は、高度な多能性マーカー発現を示した（試験した全てのマーカーで９４％を超える）。さらに、ｈＥＳＣの典型的な形態が、２次元のさらなる継代の培養の両方で観察された。ｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８を直接コーティングしたフラスコで、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞のさらなる培養を実現させた。
【0195】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップから採取した細胞の分化
多能性幹細胞の主な特徴は、３つの胚葉全てに分化する能力である。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を播種し、確立されたプロトコルに従って樹状細胞に分化させた。分化終了時の樹状細胞マーカーの発現を表１７に示す。
多能性幹細胞の主な特徴は、３つの胚葉全てに分化する能力である。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を播種し、確立されたプロトコルに従って樹状細胞に分化させた。分化終了時の樹状細胞マーカーの発現を表１７に示す。
【0196】
【表17】
【0197】
樹状細胞の分化過程に沿った細胞の形態評価を図２に示す。
【0198】
ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞の樹状細胞への分化が、効率的に達成された。ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムから採取した細胞を、任意の系統及び細胞型へ分化させることは、採取の有無にかかわらず、ｈＥＳＣ増殖スケールアップシステムの細胞から可能であると推定することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】