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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-06
(54)【発明の名称】若い無傷ヒト血清アルブミンによる人類の寿命の延長
(51)【国際特許分類】
A61K 38/38 20060101AFI20230830BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20230830BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230830BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230830BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20230830BHJP
【ＦＩ】
A61K38/38
A61P3/02 101
A61P21/00
A61P25/28
C07K14/765 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511637
(86)(22)【出願日】2021-08-11
(85)【翻訳文提出日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 CN2021112093
(87)【国際公開番号】W WO2022033525
(87)【国際公開日】2022-02-17
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/108496
(32)【優先日】2020-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518389990
【氏名又は名称】シェンチェン、プロトゲン、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＰＲＯＴＧＥＮ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】ルオ，ヨンチァン
(72)【発明者】
【氏名】フー，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】タン，ジアゾ
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，アンジ
(72)【発明者】
【氏名】リー，ボヤ
(72)【発明者】
【氏名】ゴン，ユアンチャオ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，シャオセン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，グオドン
(72)【発明者】
【氏名】リー，フイ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084CA36
4C084CA53
4C084DA37
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZC221
4C084ZC222
4C084ZC521
4C084ZC522
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA70
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA00
(57)【要約】
本発明は被験者の寿命延長及び／又は老化防止の方法を提供し、有効量の若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を被験者に投与するステップを含み、上記製剤は、被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
若いヒト個体から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤。
【請求項2】
前記若い個体は３０歳未満、好ましくは１８歳未満である、請求項１に記載の製剤。
【請求項3】
（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）で測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ， ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤。
【請求項4】
Ｃｙｓ－３４残基における前記遊離チオール基の比率は８０％より大きい、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項5】
前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満である、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項6】
前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満である、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項7】
前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項8】
前記Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率は８０％より大きく、前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項9】
前記製剤は組換えによって産生されるか、又は血漿から精製される、前述の請求項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項10】
被験者の寿命延長及び／又は老化防止における若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤の使用であって、前記製剤は、前記被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、使用。
【請求項11】
前記製剤は、（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）で測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ， ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
Ｃｙｓ－３４残基における前記遊離チオール基の比率は８０％より大きい、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項13】
前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項14】
前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項15】
ＥＬＩＳＡで測定した場合、前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項16】
前記Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率は８０％より大きく、前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項17】
前記被験者は患者又は健康な個体である、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項18】
被験者の寿命延長及び／又は老化防止の方法であって、有効量の若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を前記被験者に投与するステップを含み、前記製剤は、前記被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、方法。
【請求項19】
前記製剤は、（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）で測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ， ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
Ｃｙｓ－３４残基における前記遊離チオール基の比率は８０％より大きい、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満である、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
ＥＬＩＳＡで測定した場合、前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率は８０％より大きく、前記ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、前記カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、前記ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記被験者は患者又は健康な個体である、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
請求項１～９のいずれか１項に定義された若い無傷ヒト血清アルブミンの製剤と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項27】
被験者の老化状態の変化を監視するための方法であって、前記被験者からヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）サンプルを得るステップと、
前記サンプルにおいて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベル、（３）カルボニル化のレベル、及び（４）ホモシステイン化のレベルのＨＳＡの４つのパラメータの少なくとも１つ、好ましくはすべてを試験するステップと、
同じ被験者からの以前の試験データに比べて、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が増加し、及び／又はＡＧＥのレベル、カルボニル化のレベル及び／又はホモシステイン化のレベルが低下した場合、被験者の老化状態が改善されたと判定するステップと、を含む、方法。
【請求項28】
被験者の骨格筋機能及び／又は認知能力を改善する方法であって、有効量の請求項１～９のいずれか１項に定義された若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の分野に関し、特に人類の寿命の延長における若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
長寿は人類の永遠の追求である。永遠に生きることを熱狂的に追求する物語は人類の歴史全体に流れている。皮肉なことに、老化が進んでいるが、不老不死の霊薬は発見されていない。老化のメカニズムを理解することは長寿の夢を実現するために非常に重要であるが、老化の複雑さ及び全身性により、この過程はあまり理解されていない。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、部分的に、生理食塩水治療群に比べて、自然老齢のマウスモデルにおける若い無傷組換えマウス血清アルブミン（ｒＭＳＡ）の投与が、寿命を顕著に延長し、骨格筋の強さ及び認知能力を増加するという驚くべき発見に基づいている。
【0004】
本発明の一態様は、若いヒト個体から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を提供する。
【0005】
本発明の別の１つの態様は被験者の寿命延長及び／又は老化防止の方法を提供し、有効量の若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を被験者に投与するステップを含み、該製剤は、前記被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】ｒＭＳＡ治療によりマウスの寿命が延長された
【0007】
Ａ及びＢはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された６Ｍ群における雌（Ａ）及び雄（Ｂ）のマウスの生存曲線である。ＣはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療されたマウスの代表的な画像である。
Ｄ及びＥはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された３Ｍ群における雌（Ｄ）及び雄（Ｅ）のマウスの生存曲線である。Ｆ及びＧはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された１８Ｍ群における雌（Ｆ）及び雄（Ｇ）のマウスの生存曲線である。６Ｍ、３Ｍ及び１８Ｍ群（Ａ～Ｇ）におけるマウスは、３週間ごとに２０ｍｇ／マウスのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療される。Ｈ及びＩは３週間ごとに体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療された１２Ｍ群における雌（Ｈ）及び雄（Ｉ）のマウスの生存曲線である。生存期間の中央値（月単位、Ｍ）及び百分率増加が示されている。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によりｐ値を計算する。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
Ｄ及びＥはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された３Ｍ群における雌（Ｄ）及び雄（Ｅ）のマウスの生存曲線である。Ｆ及びＧはｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された１８Ｍ群における雌（Ｆ）及び雄（Ｇ）のマウスの生存曲線である。６Ｍ、３Ｍ及び１８Ｍ群（Ａ～Ｇ）におけるマウスは、３週間ごとに２０ｍｇ／マウスのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療される。Ｈ及びＩは３週間ごとに体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療された１２Ｍ群における雌（Ｈ）及び雄（Ｉ）のマウスの生存曲線である。生存期間の中央値（月単位、Ｍ）及び百分率増加が示されている。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によりｐ値を計算する。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
【図2】マウスの骨格筋の機能に対するｒＭＳＡの影響
【0008】
Ａ及びＢは１２Ｍ群における体重調整投与量のｒＭＳＡ又は生理食塩水で治療された雌（Ａ）及び雄（Ｂ）のマウスの握力である。Ｃは腓腹筋のトルイジンブルー染色である。縮尺、５０μｍ。Ｄ～ＧはＣにおけるデータの統計結果である。生理食塩水で治療されたマウス、ｒＳＭＡで治療されたマウス、雌、ｎ＝４、雄、ｎ＝６。筋線維の平均サイズ＝横断面積／線維の数。ＨはマウスのＭＨＣ１（緑）及び４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（青）の免疫蛍光染色である。縮尺、５０μｍ。Ｉ及びＪはＩｍａｇｅ Ｊを使用することによるＨにおけるＭＨＣ１の蛍光強度の測定である。３週間ごとに体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水でマウスを８ヶ月治療した。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表し、ｐ値は両側ｔ検定によって計算される。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
【図3】マウスの認知能力に対するｒＭＳＡの影響
【0009】
Ａ及びＣは１２Ｍ群における雄のマウスの一次逃避率（Ａ）及び一次逃避時間（Ｃ）の測定である。ＢはＡの平均値である。ＤはＣの平均値である。Ｅは１２Ｍマウスの皮質におけるｐ－ｔａｕの代表的な画像である。縮尺、５０μｍ。Ｆ～ＨはＥのデータに基づく雄及び雌のマウスの皮質におけるｐ－ａｕレベルの統計結果である。３週間ごとに用体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水でマウスを８ヶ月治療した。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表し、ｐ値は両側ｔ検定によって計算される。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
【図4-1】ｒＭＳＡ治療により老化に関連する４つのパラメータが改善された
【0010】
Ａ～Ｄは１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２８ヶ月齢のマウスの血清サンプルにおけるｒＭＳＡ及び内因性アルブミンの遊離チオール基（Ａ）、カルボニル基（Ｂ）、ＡＧＥ（Ｃ）及びＨｃｙ（Ｄ）のレベルである。Ｅ～Ｈは１２Ｍ群における体重調整投与量のｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療されたマウスの内因性アルブミンの遊離チオール基（Ｅ）、カルボニル基（Ｆ）、ＡＧＥ（Ｇ）及びＨｃｙ（Ｈ）のレベルである。Ｉ～Ｌは１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２０ヶ月齢のマウスの血清サンプルにおけるｒＭＳＡ及び内因性アルブミンの遊離チオール基（Ｉ）、カルボニル基（Ｊ）、ＡＧＥ（Ｋ）及びＨｃｙ（Ｌ）のレベルである。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表し、ｐ値は両側ｔ検定によって計算される。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
【図4-2】ｒＭＳＡ治療により老化に関連する４つのパラメータが改善された
【0011】
Ａ～Ｄは１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２８ヶ月齢のマウスの血清サンプルにおけるｒＭＳＡ及び内因性アルブミンの遊離チオール基（Ａ）、カルボニル基（Ｂ）、ＡＧＥ（Ｃ）及びＨｃｙ（Ｄ）のレベルである。Ｅ～Ｈは１２Ｍ群における体重調整投与量のｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療されたマウスの内因性アルブミンの遊離チオール基（Ｅ）、カルボニル基（Ｆ）、ＡＧＥ（Ｇ）及びＨｃｙ（Ｈ）のレベルである。Ｉ～Ｌは１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２０ヶ月齢のマウスの血清サンプルにおけるｒＭＳＡ及び内因性アルブミンの遊離チオール基（Ｉ）、カルボニル基（Ｊ）、ＡＧＥ（Ｋ）及びＨｃｙ（Ｌ）のレベルである。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表し、ｐ値は両側ｔ検定によって計算される。ｎは各回の分析に用いられるマウスの数である。
【図5】ｒＭＳＡ注射の２１日後、アルブミンの発現及びタンパク質レベルは正常に戻ることができる。 Ａは各マウス（ｎ＝３）に２０ｍｇのｒＭＳＡを注射した後、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定された肝臓でのアルブミン遺伝子の動的発現レベルである。Ｂは各マウス（ｎ＝３）に５０ｍｇのｒＭＳＡを注射した後、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定された肝臓でのアルブミン遺伝子の動的発現レベルである。Ｃは各マウス（ｎ＝３）に２０又は５０ｍｇのｒＭＳＡを注射してから１日（左上）及び２～２１日（右上）の血清アルブミンの動的タンパク質レベルである。表（底部）は平均定量値を示す。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図6】総タンパク質レベル及びアルブミン／グロブリン比に対するｒＭＳＡ注射の影響
【0012】
各マウス（ｎ＝３）に２０又は５０ｍｇのｒＭＳＡを注射してから１日（左上）及び２～２１日（右上）の動的総タンパク質レベル（Ａ）、総グロブリンレベル（Ｂ）及びアルブミン／グロブリン比（Ｃ）。表（底部）は平均定量値を示す。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図7-1】主な血液生化学パラメータに対するｒＭＳＡ注射の影響
【0013】
主な血液生化学パラメータの動的変化（折れ線グラフで表示され、グルタミンＧＬＵ、血中尿素窒素ＢＵＮ、コレステロールＣＨＯ、トリグリセリドＴＧ、乳酸脱水素酵素ＬＤＨ、アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ、アルカリ性ホスファターゼＡＬＰ、γ－グルタミルトランスペプチダーゼＧＧＴ）。表（底部）は平均定量値を示す。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図7-2】主な血液生化学パラメータに対するｒＭＳＡ注射の影響
【0014】
主な血液生化学パラメータの動的変化（折れ線グラフで表示され、グルタミンＧＬＵ、血中尿素窒素ＢＵＮ、コレステロールＣＨＯ、トリグリセリドＴＧ、乳酸脱水素酵素ＬＤＨ、アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ、アルカリ性ホスファターゼＡＬＰ、γ－グルタミルトランスペプチダーゼＧＧＴ）。表（底部）は平均定量値を示す。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図7-3】主な血液生化学パラメータに対するｒＭＳＡ注射の影響
【0015】
主な血液生化学パラメータの動的変化（折れ線グラフで表示され、グルタミンＧＬＵ、血中尿素窒素ＢＵＮ、コレステロールＣＨＯ、トリグリセリドＴＧ、乳酸脱水素酵素ＬＤＨ、アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ、アルカリ性ホスファターゼＡＬＰ、γ－グルタミルトランスペプチダーゼＧＧＴ）。表（底部）は平均定量値を示す。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図8】若い無傷ｒＭＳＡで治療されたマウスはより健康な外観を示した
【0016】
ｒＭＳＡ又は生理食塩水を注射した老齢の雌のマウスの代表的な画像。後弯症（ｋｙｐｈｏｓｉｓ）は矢印で示される。
【図9】体重に対するｒＭＳＡ注射の影響
【0017】
３週間ごとにマウスあたり２０ｍｇのｒＭＳＡ／又は等量の生理食塩水で治療された（Ａ）６Ｍ、（Ｂ）３Ｍ及び（Ｃ）１８Ｍ群における雌及び雄のマウスの体重。Ｄは３週間ごとに体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で治療された１２Ｍ群における雌及び雄のマウスの体重である。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表す。
【図10】バーンズ迷路試験における代表的な移動軌跡
【0018】
Ａは１２Ｍ群における生理食塩水で治療された雄のマウスの代表的な移動軌跡である。
Ｂは１２Ｍ群における体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡで治療された雄のマウスの代表的な移動軌跡である。
Ｂは１２Ｍ群における体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡで治療された雄のマウスの代表的な移動軌跡である。
【図11】ｒＭＳＡのインタクトタンパク質の質量分析
【0019】
ｒＭＳＡの分子量はＱ－ＴＯＦ質量分析法で検証された。
【図12】若い無傷ｒＨＳＡと血液由来の内因性ＨＳＡとの間の４つのパラメータの比較。
【0020】
Ａ～Ｄは若い無傷ｒＨＳＡ及び血液由来の内因性ＨＳＡの遊離チオール基（Ａ）、カルボニル基（Ｂ）、ＡＧＥ（Ｃ）及びＨｃｙ（Ｄ）のレベルである。すべてのグラフは平均値とＳＥＭを表し、ｐ値は両側ｔ検定によって計算される。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書で使用される用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明確に単数の意味を指示しない限り、「１つ及び複数」又は「少なくとも１つ」を意味する。
【0022】
本明細書で使用される用語「及び／又は」は、１つ又は複数の列挙された項目のあらゆる可能な組み合わせを含むことを意図する。
【0023】
本明細書で使用される用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）は、素子、構成要素、特徴、ステップ等の存在を示すことを意図するが、その他の素子、構成要素、特徴、ステップ等の存在を排除するものではない。本発明では、製品が特定の構成要素を含むと言及されている場合、それは、これらの構成要素のみからなる製品も列挙していることを理解すべきである。
【0024】
用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体、緩衝液及び賦形剤のいずれかを含み、緩衝生理食塩水溶液、水及び乳濁液（例えば油／水又は水／油乳濁液）、及び様々なタイプの湿潤剤及び／又は補助剤を含む。適切な薬学的担体及びその製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）を説明するために用いられる。好ましい薬学的担体は活性成分剤の意図する投与モードに決められる。
【0025】
本発明では、特に明記しない限り、配列方向は５’～３’である。
【0026】
本明細書で使用される用語「ヒト血清アルブミン」（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）又は「ＨＳＡ」は交換可能に使用することができ、且つ広い意味で解釈されるべきである。用語「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」は野生型ヒト血清アルブミン（たとえば、遺伝子名：ＡＬＢ、ＮＣＢＩ ＩＤ：２１３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６８を参照）及びその任意の機能的変異体を含み、上記機能的変異体は１つ又はいくつかのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を含み、且つ野生型ＨＳＡと基本的に同じ生物学的機能を維持する。ＨＳＡの生物学的機能は本分野で周知である。
【0027】
本明細書で使用される用語「若い」ＨＳＡ及び「若い無傷」ＨＳＡは同じ意味を有し、交換可能に使用することができ、これは、特定のＨＳＡ製剤（たとえば、３０歳の個体から得られたＨＳＡ製剤）に比べて、タンパク質が新鮮な状態にあり、大きな損傷がないことを意味する。
【0028】
当業者は、用語「若い無傷」ＨＳＡが損傷がまったくないことを厳密に要求するものではないのを理解するであろう。完全に不可能ではないにしても、このような完璧の製剤を調製することは非常に困難である。本発明の目的のために、限られた損傷を含むＨＳＡ製剤は依然として許容される。
【0029】
「若い」ＨＳＡは通常、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、たとえば２つ又は３つ、好ましくはすべてを示す。より若いＨＳＡは通常、より高い遊離チオール基の比率、より低いＡＧＥ、カルボニル基及びホモシステインのレベルを有する。
【0030】
いくつかの実施形態では、「若い」ＨＳＡは、（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）で測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ（たとえば２つ又は３つ）、好ましくはすべてを示す。
【0031】
本明細書で使用される用語「製剤」はプロセスによって調製された材料を指す。たとえば、ＨＳＡ製剤は、ヒト血清アルブミン分子の集団を含む、特定の個体又は複数の個体から調製されたＨＳＡサンプルを指すことができる。「製剤」は包装された市販製品であってもよく、又は溶液又は凍結乾燥粉末等の形態で調製された原料であってもよい。
【0032】
４つのパラメータ及びその測定
遊離チオール基：野生型ＨＳＡ（遺伝子名：ＡＬＢ、ＮＣＢＩ ＩＤ：２１３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６８）は１つの還元されたシステイン残基（Ｃｙｓ－３４残基）を含有し、これは各ＨＳＡ分子が１つの遊離チオール基を有することを意味する。還元されたＣｙｓ－３４残基の遊離チオール基はインビトロ及びインビボで酸化されて酸化形態になることができる。
遊離チオール基：野生型ＨＳＡ（遺伝子名：ＡＬＢ、ＮＣＢＩ ＩＤ：２１３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６８）は１つの還元されたシステイン残基（Ｃｙｓ－３４残基）を含有し、これは各ＨＳＡ分子が１つの遊離チオール基を有することを意味する。還元されたＣｙｓ－３４残基の遊離チオール基はインビトロ及びインビボで酸化されて酸化形態になることができる。
【0033】
ＨＳＡにおける遊離チオール基の比率は以下を意味する。
【0034】
【化1】
【0035】
Ｅｌｌｍａｎ方法：ＤＴＮＢを添加した後、４１２ｎｍでの吸光度は上昇する。
【0036】
ＡＧＥ：血清アルブミンは糖化に非常に敏感な血漿タンパク質である。この過程はメイラード反応（Ｍａｉｌｌａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）とも呼ばれ、ゆっくりとした非酵素反応であり、最初はグルコース又は誘発体とアルブミンの遊離アミン基との結合に関し、シッフ塩基生成物を可逆的に形成し、Ａｍａｄｏｒｉ再配列の後に、安定したフルクトサミン残基（ケトアミン）を形成する。これは初期の糖化過程であり：シッフ塩基とフルクトサミンは初期糖化付加物と呼ばれる。その後、Ａｍａｄｏｒｉ生成物は環化し、ピラノース又はフラノース炭水化物付加物を形成することができる。これらの初期糖化生成物は、再配列、酸化、重合及び解剖など、さらに修飾されると、不可逆的なコンジュゲートが生成され、終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＡＧＥ）と呼ばれる。メーカーの説明書（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットでＡＧＥの質量濃度を測定する。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、且つタンパク質１グラムあたりのＡＧＥのマイクログラムとして表される。
【0037】
カルボニル基：カルボニル基は酸素原子に二重結合している炭素原子を含有する。ここで、カルボニル化はＨＳＡのアミノ酸残基にカルボニル基が形成されることを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ａｂ１２６２８７）はＨＳＡにおけるカルボニル基を定量することに用いられる。該方法は、ＤＮＰＨとタンパク質カルボニル基の反応に基づいており、該反応はＤＮＰヒドラゾンを形成し、且つマイクロプレートリーダーを使用して３７５ｎｍの吸光度で定量化できる。マニュアルに従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２６２８７）を使用してカルボニル基のモル濃度を定量する。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、且つタンパク質１ｍｇあたりのｎｍｏｌカルボニルとして表される。
【0038】
Ｈｃｙ：ホモシステイン（Ｈｃｙ）は必須の食事タンパク質アミノ酸Ｍｅｔから代謝され、非タンパク質構成アミノ酸と見なされ、該非タンパク質構成アミノ酸はタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）に関与することが分かっている。Ｈｃｙは、リジン（Ｌｙｓ）残基へのイソペプチド結合（Ｎ－Ｈｃｙ－タンパク質）を介して、又はＣｙｓ－３４残基へのジスルフィド結合（Ｓ－Ｈｃｙ－タンパク質）を介してタンパク質に結合することができる。Ｎ－ホモシステイン化は新型のＰＴＭであり、それはタンパク質の構造及び機能に影響を与えてタンパク質の損傷を引き起こす。Ｎ－ホモシステイン化はＨｃｙチオラクトンによって提供され、ＨｃｙチオラクトンはＨｃｙのみから生じられる。Ｈｃｙのモル濃度はＥＬＩＳＡ及びＨＰＬＣによって定量的に測定できる。研究では、メーカーの説明に従って、ＥＬＩＳＡでＨｃｙのモル濃度を測定する（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、タンパク質１グラムあたりのｎｍｏｌ Ｈｃｙとして表される。
【0039】
この研究の結果に基づいて、若いＨＳＡはそれを受ける人間の被験者に顕著な健康上の利点をもたらす。
【0040】
発明者は、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベル、（３）カルボニル化のレベル、及び（４）ホモシステイン化のレベルの４つのパラメータでＨＳＡの老化状態を定義するという考え方を創造的に提案する。
【0041】
一態様では、本発明は若い無傷ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）の製剤を提供し、それは、若いヒト個体から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ（たとえば２つ又は３つ）、好ましくはすべてを示す。
【0042】
用語「若い」ヒトの個体は通常、３０歳未満、好ましくは１８歳未満、より好ましくは３歳未満、さらに１歳未満のヒトを指す。
【0043】
１つの実施形態では、（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔで測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す、若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を提供する。
【0044】
野生型ＨＳＡにおいて、１つのみの遊離チオール基はＣｙｓ－３４残基にある。当業者は、該ＨＳＡが野生型ＨＳＡの機能的変異体であり且つ僅かに異なるアミノ酸配列を含むと、Ｃｙｓ－３４残基が３４と僅かに異なる位置にある可能性があることを容易に理解できる。該位置は野生型ＨＳＡのアミノ酸配列に基づいて決定される。
【0045】
１つの実施形態では、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率はＥｌｌｍａｎ方法で測定される。好ましくは、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率は７０％より大きく、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きい。
【0046】
１つの実施形態では、ＡＧＥのレベルはＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定される。好ましくは、ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＡＧＥのレベルは６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質である。
【0047】
１つの実施形態では、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）でカルボニル基のレベルを測定する。好ましくは、カルボニル基のレベルは１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満である。
【0048】
１つの実施形態では、ＥＬＩＳＡでホモシステインのレベル（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）を測定する。好ましくは、ホモシステインのレベルは５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である。
【0049】
当業者は、上記４つのパラメータがその他の認められた方法で試験され得、且つ異なる方法で同じサンプルから試験されたパラメータの値の結果は異なる可能性があることを理解するであろう。当業者は、限られた数の実験によって、異なる方法で試験された結果と、本発明で使用される方法で得られた結果とを比較することができる。
【0050】
好ましい実施形態では、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率は８０％より大きく、ＡＧＥのレベルは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、カルボニル基のレベルは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、ホモシステインのレベルは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満である。
【0051】
若いＨＳＡの製剤は組換えによって産生され得るか又は血漿から精製され得る。好ましくは、ＨＳＡ製剤は組換えによって産生される。
【0052】
別の態様では、被験者の寿命延長及び／又は老化防止における若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤の使用を提供し、それは、上記被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す。
【0053】
この状況では、被験者自体から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、被験者は、「より若い」ＨＳＡ製剤を受けることで健康上の利点を得ることができる。たとえば、被験者が７０歳であると、年齢又は老化状態が７０歳未満（たとえば５０歳、４０歳又は３０歳）である被験者から得られたＨＳＡ製剤は有効である。
【0054】
ＨＳＡ製剤の老化状態は上記４つのパラメータによって評価できる。特定のＨＳＡ製剤の４つのパラメータのうちいくつか又は好ましくはすべてが、特定の年齢、たとえば３０歳の被験者から得られた製剤のパラメータよりも優れていると、該製剤は３０歳未満の老化状態にあると判定される。
【0055】
被験者の寿命延長及び／又は老化を防止の方法を提供し、有効量の若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を被験者に投与するステップを含み、該製剤は、上記被験者から得られた内因性ＨＳＡ製剤に比べて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率がより高く、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルがより低く、（３）カルボニル化のレベルがより低く、及び（４）ホモシステイン化のレベルがより低いという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す。
【0056】
被験者は、健康な個体又は病気やけがをしている患者であってもよい。
【0057】
１つの実施形態では、該製剤は、（１）Ｅｌｌｍａｎ方法で測定した場合、Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が５０％より大きく、たとえば７０％、特に８０％、好ましくは９０％であり、より好ましくは９５％より大きく、（２）ＥＬＩＳＡ（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）で測定した場合、終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが６０μｇ／ｇタンパク質未満、好ましくは４０μｇ／ｇタンパク質、より好ましくは３０μｇ／ｇタンパク質未満であり、（３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔで測定した場合、カルボニル基のレベルが１．７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１．５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満であり、及び（４）ＥＬＩＳＡ（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）で測定した場合、ホモシステインのレベルが５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満、好ましくは３．５ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、より好ましくは２ｎｍｏｌ／ｇタンパク質未満であるという特性の少なくとも１つ、好ましくはすべてを示す。
【0058】
本明細書に定義された若いＨＳＡ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0059】
別の態様では、被験者の老化状態の変化を監視するための方法を提供し、
該被験者からヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）サンプルを得るステップと、
サンプルにおいて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベル、（３）カルボニル化のレベル、及び（４）ホモシステイン化のレベルというＨＳＡの４つのパラメータのうちの少なくとも１つ、好ましくはすべてを試験するステップと、
Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が増加し、及び／又はＡＧＥのレベル、カルボニル化のレベル及び／又はホモシステイン化のレベルが低下すると、同じ被験者からのより前の試験データに比べて、被験者の老化状態が改善されたと判定するステップと、を含む。
該被験者からヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）サンプルを得るステップと、
サンプルにおいて、（１）Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率、（２）終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベル、（３）カルボニル化のレベル、及び（４）ホモシステイン化のレベルというＨＳＡの４つのパラメータのうちの少なくとも１つ、好ましくはすべてを試験するステップと、
Ｃｙｓ－３４残基における遊離チオール基の比率が増加し、及び／又はＡＧＥのレベル、カルボニル化のレベル及び／又はホモシステイン化のレベルが低下すると、同じ被験者からのより前の試験データに比べて、被験者の老化状態が改善されたと判定するステップと、を含む。
【0060】
別の態様では、有効量の上述した若い無傷ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の製剤を被験者に投与するステップを含む、被験者の骨格筋の機能及び／又は認知能力を改善する方法を提供する。
【0061】
免疫反応を回避するために、すべての動物研究はｒＭＳＡ（組換えマウス血清アルブミン）を使用して行われ、異なる年齢のマウスからの内因性ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）に比べて、この４つのパラメータによって、使用されるｒＭＳＡは若い無傷のものである。マウス寿命（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）及び健康寿命（ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ）におけるｒＭＳＡの改善に基づいて、若い無傷ｒＨＳＡが人類で同様な効果を得ると予想するのは合理的である。
【0062】
実施例
１９７２年に、Ｌｕｄｗｉｇらはパラビオシスモデル（ｐａｒａｂｉｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ）において年長のラットの寿命がより若いラットによって延長されることを初めに報告した１。Ｅｇｅｒｍａｎグループ及びＶｉｌｌｅｄａグループはそれぞれ、若いマウスとパラビオシス手術を行った後、老齢のマウスの筋力及び認知能力が改善されたことを発見した２，３。これは、老化の「謎」が血液に存在する可能性があることを表す。循環系の主な構成部分として、血液は全身の細胞及び組織に影響を与えることにより老化の過程を調節することができる。ヒトの血漿プロテオームは年齢に伴って変化することが示されている４。老化は少なくとも部分的に、高分子の構造変化又は損傷の継続的な蓄積に引き起こされると考えられている５－７。先ず、報告されるように、酸化ストレスは老化において非常に重要な役割を果たしており８，９、これは活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）がタンパク質を破壊することに関連する。人類では、年齢の増加とともに、血漿チオール基／ジスルフィド酸化還元状態（ＲＥＤＳＴ）はより酸化促進的になる１０，１１。また、非酵素的タンパク質糖化の重要性は老化研究で注目されている１２－１４。高齢者の血漿終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが上昇している１５。第３、酸化環境において、特にタンパク質のＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＴｈｒ残基の側鎖にもカルボニル基が形成される１６，１７。重要なことは、カルボニル基の濃度は年齢の増加とともに増加する１８。第４、広く報告されるように、ホモシステイン（Ｈｃｙ）は年齢の増加とともに増加し、且つ年齢に関連する退行性疾患に関連する１９－２２。Ｈｃｙは、タンパク質と共有結合し、その正常の機能に干渉することが分かっている２３，２４。要するに、血漿タンパク質の損傷又は不必要な修飾は年齢の増加とともに増加する。血漿タンパク質の損傷又は不必要な修飾を減少することで、寿命を延長し、さらに老化過程を逆転する可能性があると提案するのは合理的である。
１９７２年に、Ｌｕｄｗｉｇらはパラビオシスモデル（ｐａｒａｂｉｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ）において年長のラットの寿命がより若いラットによって延長されることを初めに報告した１。Ｅｇｅｒｍａｎグループ及びＶｉｌｌｅｄａグループはそれぞれ、若いマウスとパラビオシス手術を行った後、老齢のマウスの筋力及び認知能力が改善されたことを発見した２，３。これは、老化の「謎」が血液に存在する可能性があることを表す。循環系の主な構成部分として、血液は全身の細胞及び組織に影響を与えることにより老化の過程を調節することができる。ヒトの血漿プロテオームは年齢に伴って変化することが示されている４。老化は少なくとも部分的に、高分子の構造変化又は損傷の継続的な蓄積に引き起こされると考えられている５－７。先ず、報告されるように、酸化ストレスは老化において非常に重要な役割を果たしており８，９、これは活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）がタンパク質を破壊することに関連する。人類では、年齢の増加とともに、血漿チオール基／ジスルフィド酸化還元状態（ＲＥＤＳＴ）はより酸化促進的になる１０，１１。また、非酵素的タンパク質糖化の重要性は老化研究で注目されている１２－１４。高齢者の血漿終末糖化産物（ＡＧＥ）のレベルが上昇している１５。第３、酸化環境において、特にタンパク質のＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＴｈｒ残基の側鎖にもカルボニル基が形成される１６，１７。重要なことは、カルボニル基の濃度は年齢の増加とともに増加する１８。第４、広く報告されるように、ホモシステイン（Ｈｃｙ）は年齢の増加とともに増加し、且つ年齢に関連する退行性疾患に関連する１９－２２。Ｈｃｙは、タンパク質と共有結合し、その正常の機能に干渉することが分かっている２３，２４。要するに、血漿タンパク質の損傷又は不必要な修飾は年齢の増加とともに増加する。血漿タンパク質の損傷又は不必要な修飾を減少することで、寿命を延長し、さらに老化過程を逆転する可能性があると提案するのは合理的である。
【0063】
ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）は血漿中の最も豊富なタンパク質であり、その血清半減期は約２１日間である２５。それはは安定した血漿コロイド浸透圧を維持するだけでなく、重要な担体でもある２６。ＨＳＡのこれらの機能により、様々な臨床応用が可能になる２６。
【0064】
基本的な特性に加えて、ＨＳＡの酸化及び糖化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）はいくつかの病態に関連することが広く報告されている。ＨＳＡのＣｙｓ－３４残基における単一の遊離チオール基は血漿中の総遊離チオール基の約８０％を占めることが提案されており、それは抗酸化機能を提供する２７，２８。ＨＳＡチオール基の酸化及び老化は年齢に関連する疾患に密接に関連することが注目されている２９。Ｌｅｔｏらは、遊離チオール基とＨＳＡの濃度が年齢の増加とともに減少するだけでなく、遊離チオール基とＨＳＡの比率も年齢の増加とともに減少することを発見した。これは、老化中の酸化還元電位の変化に起因されるものである３０。Ｅｒａらは、細胞外液体の一定の酸化還元電位を維持するために、ＨＳＡが酸化還元緩衝液として機能できることを考える３１。若い男性被験者の還元アルブミンの割合は老齢の被験者よりも大きい。ＨＳＡにおけるチオール基酸化に加えて、カルボニル基のレベルの上昇も老化及び疾患に関連することが発見された３２－３４。アルブミンの糖化は老化や老人性疾患に関連する別の重要な要因である。血清アルブミンは長寿のタンパク質として、インビボで年齢の増加とともにＡＧＥを蓄積する３５。糖化がアルブミンの正常な機能を損ない、且つ炎症反応を誘発する可能性があることが広く報告されており、これは老化及び重篤な疾患の進行に関連する３５，３６。この他、ＨＳＡはＨｃｙ修飾の主な標的であり、従って、それは、その他のタンパク質をＨｃｙの毒性から効果的に保護することができる２３，３７。従って、損傷又は不必要な修飾がほとんどない新鮮に調製された組換え血清アルブミンを用いる治療は、寿命（ｌｉｆｅｓｐａｎ）及び健康寿命（ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ）を延ばす可能性が最も高い。ここで、生理食塩水治療群に比べて、自然老齢のマウスモデルにおいて、若い無傷組換えマウス血清アルブミン（ｒＭＳＡ）で治療された群の寿命が顕著に延長され、骨格筋の強さ及び認知能力が増加することを報告した。
【0065】
実施例１：ｒＭＳＡ治療によりマウスの寿命が延長された
ｒＭＳＡ治療がマウスの寿命を延ばすことができるか否かを検証するために、異なる年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを自然老化モデルに選択した。第１群（６Ｍ）のマウスは６ヶ月齢であり、死亡するまで、３週間ごとに２０ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｓａｌｉｎｅ）を静脈内注射した。ｑＲＴ－ＰＣＲ及び血液生化学分析により、アルブミンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは第１回の注射後８日以内に正常に戻る前に僅かに変動した（図５）。主な血液生化学パラメータは正常レベルで変化しなかった（図６、７）。
ｒＭＳＡ治療がマウスの寿命を延ばすことができるか否かを検証するために、異なる年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを自然老化モデルに選択した。第１群（６Ｍ）のマウスは６ヶ月齢であり、死亡するまで、３週間ごとに２０ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｓａｌｉｎｅ）を静脈内注射した。ｑＲＴ－ＰＣＲ及び血液生化学分析により、アルブミンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは第１回の注射後８日以内に正常に戻る前に僅かに変動した（図５）。主な血液生化学パラメータは正常レベルで変化しなかった（図６、７）。
【0066】
性別ごとの生存曲線は、ｒＭＳＡ治療のマウスの寿命の中央値がそれぞれ４６．４％（雌、５．８ヶ月増加、ｐ＜０．０００１）及び７．６％（雄、１．７ヶ月増加、ｐ＝０．０３８７、以下の検証を参照）増加したことを示している（図１Ａ、Ｂ）。寿命の中央値に達するとき、両性の外見の変化が観察された。興味深いことに、ｒＭＳＡで治療されたマウスは、生理食塩水で治療されたマウスよりも光沢があり、毛が厚い（図１Ｃ）。この他、生理食塩水治療群の後弯症（ｋｙｐｈｏｓｉｓ）がｒＭＳＡ治療群よりも深刻であることが観察された（図８）。これらの現象は、ｒＭＳＡ治療が長期使用に対して安全であり、且つ６Ｍ群におけるＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの寿命を延ばすことができることを表す。
【0067】
ｒＭＳＡで治療し始めたマウスが若いほど、より深刻な効果を達成できることが提案した。従って、第２群（３Ｍ）において、３ヶ月齢のマウスを選択し、６Ｍ群と同じ投与量を使用した。驚くべきことに、生理食塩水治療群に比べるときに、ｒＭＳＡで治療された雌及び雄のマウスの寿命の中央値はそれぞれ６９．４％（雌、７．５ヶ月増加、ｐ＝０．００９３）及び４７．４％（雄、６．３ヶ月増加、ｐ＝０．０００２）増加した（図１Ｄ、Ｅ）。
【0068】
同様に、ｒＭＳＡ治療が老齢のマウスに何れかの影響を与えるか否かを知りたい。第３群（１８Ｍ）において、１８ヶ月齢のマウスを選択した。１８Ｍ群のｒＭＳＡで治療されたマウスの寿命の中央値は２つの性別においていずれも改善され、雌のマウスが９．０％（２．０ヶ月増加、ｐ＝０．０４１４）、雄のマウスが１１．３％（２．６ヶ月増加、ｐ＝０．８６３５）である（図１Ｆ、Ｇ）。この他、すべての群において、ｒＭＳＡは体重に影響を与えなかった（図９）。
【0069】
３Ｍ群及び６Ｍ群において、雄のマウスの寿命延長は、同じ量のｒＭＳＡで治療された雌のマウスほど顕著ではなく、１８Ｍ群において観察されておらず、これは、３Ｍ群及び６Ｍ群における雌と雄のマウスの間の体重に大きな差があるが、１８Ｍにおいて大きな差がないためである可能性がある（図９）。従って、同等の投与量を得るために、体重に応じてｒＭＳＡの量を調整する必要があることを提案した。
【0070】
各マウスのｒＭＳＡ投与量を３週間ごとに体重１グラムあたり２０ｍｇから１．５ｍｇに調整した。第４群（１２Ｍ）において、１２ヶ月齢のマウスを選択して体重調整投与量で注射した。１２Ｍ群におけるｒＭＳＡで治療されたマウスの寿命は顕著に改善され、雌が１７．６％（３．４ヶ月増加、ｐ＝０．０１６４）、雄が２０．３％（３．９ヶ月増加、ｐ＝０．０３４２）であり（図１Ｈ、Ｉ）、これは、体重調整投与量で注射することが２つの性別の間の寿命延長差を減少できることを表す。
【0071】
実施例２：ｒＭＳＡはマウスの骨格筋の機能を強化した
マウスの寿命が驚くべき延長されたことは、健康寿命も改善できるか否かをさらに探査することにつながる。骨格筋の機能障害は常に老化中に観察されるため、１２Ｍ群において体重調整投与量のｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で８ヶ月治療されたマウスの握力の変化を最初に検出した。
マウスの寿命が驚くべき延長されたことは、健康寿命も改善できるか否かをさらに探査することにつながる。骨格筋の機能障害は常に老化中に観察されるため、１２Ｍ群において体重調整投与量のｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で８ヶ月治療されたマウスの握力の変化を最初に検出した。
【0072】
生理食塩水で治療されたマウスに比べて、１２Ｍ群におけるｒＭＳＡで治療されたマウスの前肢の握力は顕著に増加し、雌が１７７．９ｇから２３０．５ｇ（２９．６％増加、ｐ＝０．０００２）に増加し、雄が１８９．６ｇから２２２．５ｇ（１７．４％増加、ｐ＝０．００６９）に増加した（図２Ａ、Ｂ）。
【0073】
インビボでの骨格筋のサイズ及び質に対するｒＭＳＡ注射の影響を評価するために、さらに腓腹筋の組織学的分析を行った（図２Ｃ）。生理食塩水群に比べて、ｒＭＳＡで治療された雌のマウスの筋線維の横断面積及び平均サイズはそれぞれ顕著に増加した（横断面積９４．６％増加、ｐ＝０．０３０４、平均サイズ４０５．２％増加、ｐ＝０．０３４８）ことが発見された（図２Ｄ、Ｅ）。しかしながら、雄のマウスにおいて、同様な現象が観察されなかった（図２Ｆ、Ｇ）。次に、筋力を評価するための別の重要なパラメータである、ｒＭＳＡ及び生理食塩水治療群における遅ミオシン重鎖Ｉ（ＭＨＣ１）の発現レベルを研究した（図２Ｈ）。生理食塩水で治療されたマウスに比べて、ｒＭＳＡで治療された雄のマウスは有意に遅いＭＨＣ１陽性線維を示し（３７．７％増加、ｐ＝０．０３２７）、雌のマウスにおいて同様な結果を得なかった（図２Ｉ、Ｊ）。要するに、研究は、ｒＭＳＡ治療が、雌のマウス腓腹筋線維のサイズを増加し、且つ雄のマウスにおける遅いＭＨＣ１のレベルを増加したが、線維の数及び周長にほとんど影響を与えないことを表す。
【0074】
実施例３：ｒＭＳＡ治療はマウスの認知能力を改善した
次に、バーンズ迷路試験（Ｂａｒｎｅｓ Ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を使用して老化に伴う記憶障害に対するｒＭＳＡの影響を研究した。１２Ｍ群の雄のマウスが選択され、ｒＭＳＡ又は生理食塩水で８ヶ月治療された。生理食塩水治療群に比べて、ｒＭＳＡ治療群の一次逃避率は大幅に増加した（７３．２％対５０．２％、２３．０％増加、ｐ＝０．００１６）（図３Ａ、Ｂ）。同時に、生理食塩水で治療されたマウスに比べて、ｒＭＳＡで治療された雄のマウスは、顕著に短縮された一次逃避時間（８５．８秒対１３３．４秒、４７．６秒速く、ｐ＜０．０００１）を示した（図３Ｃ及びＤ、図１０Ａ及びＢ）。すべてのこれらの結果は、ｒＭＳＡ治療が老齢のマウスの空間学習及び記憶の能力を顕著に向上させたことを表す。
次に、バーンズ迷路試験（Ｂａｒｎｅｓ Ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を使用して老化に伴う記憶障害に対するｒＭＳＡの影響を研究した。１２Ｍ群の雄のマウスが選択され、ｒＭＳＡ又は生理食塩水で８ヶ月治療された。生理食塩水治療群に比べて、ｒＭＳＡ治療群の一次逃避率は大幅に増加した（７３．２％対５０．２％、２３．０％増加、ｐ＝０．００１６）（図３Ａ、Ｂ）。同時に、生理食塩水で治療されたマウスに比べて、ｒＭＳＡで治療された雄のマウスは、顕著に短縮された一次逃避時間（８５．８秒対１３３．４秒、４７．６秒速く、ｐ＜０．０００１）を示した（図３Ｃ及びＤ、図１０Ａ及びＢ）。すべてのこれらの結果は、ｒＭＳＡ治療が老齢のマウスの空間学習及び記憶の能力を顕著に向上させたことを表す。
【0075】
次に、これらの群のマウスを使用して認知能力に関連する組織学的変化を評価した。興味深いのは、皮質の免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果は、生理食塩水群に比べて、ｒＭＳＡ治療が雄のマウスのｐ－ｔａｕレベルを顕著に減少した（７０．１％減少、ｐ＝０．００１２）ことを示した（図３Ｅ、Ｆ）。しかしながら、ｒＭＳＡで治療されたマウスにおけるｐ－ｔａｕレベルが生理食塩水で治療されたマウスよりも低いが、雌群において有意な差がなかった（５７．８％減少、ｐ＝０．１４６９、図３Ｅ、Ｇ）。要するに、ｒＭＳＡを注射することは、マウス、特に雄のマウスのｐ－ｔａｕレベルを減少することができる（６３．２％減少、ｐ＝０．００３６、図３Ｈ）。
【0076】
実施例４：ｒＭＳＡ治療は老化に関連する４つのパラメータを改善した
以前の研究では、老化は、遊離チオール基の酸化、カルボニル化、ＡＧＥ形成及びホモシステイン化の合計４つのパラメータを含むタンパク質損傷レベルの増加に密接に関連することが表される。比較のために、１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２８ヶ月齢のマウスの血清サンプルからの内因性アルブミンを精製した。老化過程で、血清アルブミンは４つのパラメータの一連の変化を起こし、遊離チオール基のレベルが低下し、カルボニル基、ＡＧＥ及びＨｃｙのレベルが上昇した。本研究に使用されたｒＭＳＡは、１．５ヶ月齢の若いマウスの内因性血清アルブミンよりもさらに若く、損傷がよりも少ない。該ｒＭＳＡは、より多くの遊離チオール基（１８．１％増加、ｐ＝０．０５７１）、同等のカルボニル基のレベル、より少ないＡＧＥ（３７．７％減少、ｐ＝０．０５８９）、より少ないＨｃｙ（ｒＭＳＡにおいて検出されない、ｐ＝０．１２１５）（図４Ａ～Ｄ）を含有し、これにより、ｒＭＳＡはより多くの保護を提供することができ、不必要な修飾及び損傷を防止する。
以前の研究では、老化は、遊離チオール基の酸化、カルボニル化、ＡＧＥ形成及びホモシステイン化の合計４つのパラメータを含むタンパク質損傷レベルの増加に密接に関連することが表される。比較のために、１．５ヶ月齢、１２ヶ月齢及び２８ヶ月齢のマウスの血清サンプルからの内因性アルブミンを精製した。老化過程で、血清アルブミンは４つのパラメータの一連の変化を起こし、遊離チオール基のレベルが低下し、カルボニル基、ＡＧＥ及びＨｃｙのレベルが上昇した。本研究に使用されたｒＭＳＡは、１．５ヶ月齢の若いマウスの内因性血清アルブミンよりもさらに若く、損傷がよりも少ない。該ｒＭＳＡは、より多くの遊離チオール基（１８．１％増加、ｐ＝０．０５７１）、同等のカルボニル基のレベル、より少ないＡＧＥ（３７．７％減少、ｐ＝０．０５８９）、より少ないＨｃｙ（ｒＭＳＡにおいて検出されない、ｐ＝０．１２１５）（図４Ａ～Ｄ）を含有し、これにより、ｒＭＳＡはより多くの保護を提供することができ、不必要な修飾及び損傷を防止する。
【0077】
若い無傷ｒＭＳＡがマウスの寿命及び健康寿命を如何に改善するかを探査するために、３週間ごとに体重１ｇあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ又は等量の生理食塩水で１２ヶ月齢のマウスを８ヶ月治療した。最後の注射から２１日後にすべての血清サンプルを収集した。生理食塩水で治療されたマウスに比べて、ｒＭＳＡで治療されたマウスのアルブミンは、より多くの遊離チオール基（１１．６％増加、ｐ＝０．１６３５）、より低いカルボニル基のレベル（２２．１％減少、ｐ＝０．０２３０）、ＡＧＥのレベル（２４．４％減少、ｐ＝０．０２４３）及びホモシステインのレベル（４２．６％減少、ｐ＝０．０３７０）（図４Ｅ～Ｈ）を含有する。
【0078】
４つのパラメータを比較するために、より大きなサンプル量で追加の試験を行い、より顕著な有意性を得た。１．５ヶ月齢のマウスの内因性血清アルブミンに比べるときに、外因性ｒＭＳＡは、より多くの遊離チオール基（９５．５％増加、ｐ＝０．０００２）、より少ないカルボニル基（１３．０％減少、ｐ＝０．２２６２）、より少ないＡＧＥ（４０．６％減少、ｐ＝０．００２０）及びより少ないＨｃｙ（８０．９％減少、ｐ＝０．００５２）（図４Ｉ～Ｌ）を含有し、これにより、ｒＭＳＡはより多くの保護を提供することができ、不必要な修飾及び損傷を防止する。
【0079】
要するに、若い無傷ｒＭＳＡは強力な保護機能を提供し、遊離チオール基酸化、カルボニル化、ＡＧＥ形成及びホモシステイン化を防止する。
【0080】
実施例５：若い無傷ｒＨＳＡは老化に関連する４つのパラメータで内因性ＨＳＡと異なる
若い無傷ｒＨＳＡと内因性ＨＳＡとの間の違いを見つけるために、独立したメーカーから３つの血液由来の内因性ＨＳＡ製品を購入して比較研究を行い、遊離チオール基、カルボニル基、ＡＧＥ及びホモシステインを以下に説明するように試験した。
若い無傷ｒＨＳＡと内因性ＨＳＡとの間の違いを見つけるために、独立したメーカーから３つの血液由来の内因性ＨＳＡ製品を購入して比較研究を行い、遊離チオール基、カルボニル基、ＡＧＥ及びホモシステインを以下に説明するように試験した。
【0081】
先ず、Ｅｌｌｍａｎ方法で遊離チオール基の絶対量を決定し、該絶対量をＨＳＡの量で割って（ＨＳＡ分子は理論的に１つのみの遊離チオール基を有する）、残留の遊離チオール基の含有率を求めた。結果は、ｒＨＳＡ（Ｐｒｏｔｇｅｎ）が損傷を受けていない遊離チオール基を含有し、血液由来のＨＳＡが深刻な損傷（１０２．８％対１７．６％、ｐ＜０．０００１）を受けていることを表す（図１２Ａ）。
【0082】
次に、マニュアルに従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２６２８７）を使用してカルボニル基のモル濃度を定量した。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、且つタンパク質１ｍｇあたりのｎｍｏｌカルボニルとして表される。ｒＨＳＡ（Ｐｒｏｔｇｅｎ）のカルボニル基のレベルは血液由来のＨＳＡよりも低い（１．４６対１．８０ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ｐ＝０．００７２）ことが発見された（図１２Ｂ）。
【0083】
第３、メーカーの説明書（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットでＡＧＥの質量濃度を測定した。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、且つタンパク質１グラムあたりのＡＧＥのマイクログラムとして表される。明らかなように、ｒＨＳＡ（Ｐｒｏｔｇｅｎ）は血液由来のＨＳＡよりも少ないＡＧＥ（２１．４対６６．８μｇ／ｇタンパク質、ｐ＜０．０００１）を含有する（図１２Ｃ）。
【0084】
第４、メーカーの説明（Ｊｉａｎｇｌａｉ，ＪＬ１００２２）に従って、ＥＬＩＳＡでホモシステイン（Ｈｃｙ）のモル濃度を測定した。結果は反応あたりのＨＳＡ濃度によって正規化され、且つ且つタンパク質１ｇあたりのｎｍｏｌ Ｈｃｙとして表される。結果は、ｒＨＳＡ（Ｐｒｏｔｇｅｎ）のＨｃｙレベルが血液由来のＨＳＡよりもはるかに低い（１．４６対５．５６ｎｍｏｌ／ｇタンパク質、ｐ＝０．００６３）ことを表す（図１２Ｄ）。
【0085】
【表1】
【0086】
検討
第１部分 寿命
本発明では、３Ｍ、６Ｍ及び１８Ｍ群において、ｒＭＳＡ治療による寿命延長の百分率は雌性でそれぞれ６９．４％、４６．４％及び９．０％であり、雄性でそれぞれ４７．４％、７．６％及び１１．３％であり、長期のｒＭＳＡ治療によって健康寿命を顕著に長くすることもできる。これらの結果は、治療をできるだけ早く始めると、最適な効果を得ることができることを表す。
第１部分 寿命
本発明では、３Ｍ、６Ｍ及び１８Ｍ群において、ｒＭＳＡ治療による寿命延長の百分率は雌性でそれぞれ６９．４％、４６．４％及び９．０％であり、雄性でそれぞれ４７．４％、７．６％及び１１．３％であり、長期のｒＭＳＡ治療によって健康寿命を顕著に長くすることもできる。これらの結果は、治療をできるだけ早く始めると、最適な効果を得ることができることを表す。
【0087】
しかしながら、同じ量のｒＭＳＡ条件において、３Ｍ及び６Ｍ群の雄のマウスの寿命延長の百分率は雌のマウスほど顕著ではない。これは、この年齢で、雄のマウスの体重が雌のマウスよりもはるかに大きいためである可能性がある。その後、体重に応じてｒＭＳＡの量を調整し、各マウスに同じ投与量で注射し、且つ１２Ｍ群の２つの性別で一致する結果を得た。従って、体重調整投与量は最適な効果を得ることに非常に重要である。
【0088】
第２部分 健康寿命
健康寿命に関して、体重調整投与量のｒＭＳＡの治療により、１２Ｍ群のマウスの前肢の握力は顕著に増加した。ｒＭＳＡ治療による握力の改善は寿命の改善と一致し、これは、ｒＭＳＡが同じ基本原理に基づいて寿命及び健康寿命を調節する可能性が高いことを表す。
健康寿命に関して、体重調整投与量のｒＭＳＡの治療により、１２Ｍ群のマウスの前肢の握力は顕著に増加した。ｒＭＳＡ治療による握力の改善は寿命の改善と一致し、これは、ｒＭＳＡが同じ基本原理に基づいて寿命及び健康寿命を調節する可能性が高いことを表す。
【0089】
この他、ｒＭＳＡは、雄のマウスのＩ型線維の割合を増加し、雌のマウスの筋線維のサイズを大きくすることで、腓腹筋の機能を改善したことが発見された。雄と雌のマウスの間のこれらの違いの１つの解釈は、ホルモンと代謝メカニズムの違いかもしれない。
【0090】
バーンズ迷路試験によって、ｒＭＳＡ注射がマウスの空間学習及び記憶の能力を効果的に向上させ、且つ老齢のマウスの皮質のｐ－ｔａｕレベルを顕著に減少できることが発見された。現在進行中の項目において、記憶力の改善に対するｒＭＳＡ注射の作用は、神経変性疾患モデルにおいてさらに検証されている。
【0091】
第３部分 ４つのパラメータ
分析に基づき、若い無傷ｒＭＳＡが強力な保護機能を提供し、遊離チオール基酸化、カルボニル化、ＡＧＥ形成及びホモシステイン化を防止することを提案することは合理的である。
分析に基づき、若い無傷ｒＭＳＡが強力な保護機能を提供し、遊離チオール基酸化、カルボニル化、ＡＧＥ形成及びホモシステイン化を防止することを提案することは合理的である。
【0092】
ここで、実施例では、「若い」は、ｒＭＳＡが４つのパラメータ（遊離チオール基、カルボニル基、ＡＧＥ及びホモシステイン）によって分析された僅かに１．５ヶ月齢の若いマウスの内因性アルブミンよりもはるかに新鮮であることを意味する。「無傷」は、理論的に損傷を受けていない遊離チオール基、ＡＧＥなし、カルボニル化なし、及びホモシステイン化なしを意味する。実際には、製造過程及び検出方法の原因で、このような完璧なサンプルを得ることはほとんど不可能である。
【0093】
従って、１．５ヶ月齢の若いマウスの内因性血清アルブミンに比べても、ｒＭＳＡはより多くの遊離チオール基、同等レベルのカルボニル基、より少ないＡＧＥ及びホモシステインを含有する。ここで、質量分析法で測定された分子量（図１１）が理論計算値３８とまったく同じであるため、サンプルにおいてその他の損傷が観察されなかったことを強調する必要がある。要するに、本研究に使用されるｒＭＳＡは「若い」だけでなく、ほとんど「無傷」である。
【0094】
マウスの寿命に対するｒＭＳＡと内因性アルブミンの影響を、並行して比較するべきであることに気付けた。この実験を行うために、ｒＭＳＡをいつ使用するかにかかわらず、非常に若い（３ヶ月）から非常に年老いた（データによる２９ヶ月）まで、内因性アルブミンは異なる年齢のマウスから調製するべきである。しかしながら、十分な純度の内因性マウス血清アルブミンは市販されていない。この他、純度が９９％より大きい十分な量のアルブミンを精製するために、少なくとも１００，０００匹の異なる年齢のマウスが必要であり、これは非倫理的である。
【0095】
２０１６年に、米国は、若いドナー（１６～２５歳）から年老いた大人（≧３５歳）への血漿注入の有益な効果を評価することを目的とした臨床試験を始めたが、今までのところ結果は発表されていない（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖＩＤ番号：ＮＣＴ０２８０３５５４）。最近では、Ｃｏｎｂｏｙチームは、５％内因性アルブミンを含有する生理食塩水で古い血漿を交換することにより、マウスの筋肉、肝臓及び海馬の若返りを報告した３９。しかしながら、これらの研究はいずれも組換え血清アルブミンを使用していないため、結果は比較できない。
【0096】
第４部分 寿命及び健康寿命の最適化、延長、及びその他のタンパク質
２０１４年に、Ｗｙｓｓ－Ｃｏｒａｙチームは、若いマウスの血漿が老齢のマウスの学習及び記憶を改善できることを報告した。アルブミンは総血漿タンパク質の約５０％を占めるため、この過程で最も重要な役割を果たす可能性が高く、これはここで発見されるものである。寿命に対するｒＭＳＡの最大の影響を達成するために、最適な投与量、頻度及び薬物送達方法を含む様々な手段が研究されている。耐性及び安全性が保証される前提で、早期で徐放の高投与量のｒＭＳＡの使用は、寿命及び健康寿命をより顕著に延ばすと予測している。
２０１４年に、Ｗｙｓｓ－Ｃｏｒａｙチームは、若いマウスの血漿が老齢のマウスの学習及び記憶を改善できることを報告した。アルブミンは総血漿タンパク質の約５０％を占めるため、この過程で最も重要な役割を果たす可能性が高く、これはここで発見されるものである。寿命に対するｒＭＳＡの最大の影響を達成するために、最適な投与量、頻度及び薬物送達方法を含む様々な手段が研究されている。耐性及び安全性が保証される前提で、早期で徐放の高投与量のｒＭＳＡの使用は、寿命及び健康寿命をより顕著に延ばすと予測している。
【0097】
さらに、若い無傷アルブミンが寿命を長くする概念は、主な血漿タンパク質である免疫グロブリン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、トランスサイレチン、及びハプトグロビン等の任意のその他のタンパク質にも適用できると予測している。
【0098】
遊離チオール基、カルボニル基、ＡＧＥ及びホモシステインを含む４つのパラメータは、糖尿病、心血管疾患、肥満症及びアルツハイマー病等の様々な疾患に密接に関連することは十分に実証されている２０，２４，４０－４３。
【0099】
近い将来、単独した若い無傷タンパク質（組換え又は非組換え）ＨＳＡが人類の寿命を延ばすことが可能であることは注目を集めている。このようにすれば、若い無傷の主な血漿タンパク質の組み合わせは寿命をさらに延ばすことができる。理想的に、すべての若い無傷血漿タンパク質は一緒になって寿命を最大限に延ばすことができる。
【0100】
方法
マウスと薬物治療
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスはＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの販売代理店）から購入された。清華大学実験動物研究センター（ＴＨＵ－ＬＡＲＣ）に輸送する期間で、マウス輸送ストレス症候群は慎重に回避された。新しい環境への適応を保証するために、すべてのマウスは１ヶ月隔離され、品質検出が行われた。動物は、１２時間の暗－光サイクルを有する病原体のないバリア環境に飼育された。室温は２３℃に維持された。マウスが到着した後、研究全体を通して、マウスに放射線滅菌されたＪＡＸ－標準繁殖用飼料（ＳＨＯＯＢＲＥＥ(R)、Ｘｉｅｔｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，１０１００５８）及び滅菌水を投与した。
マウスと薬物治療
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスはＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの販売代理店）から購入された。清華大学実験動物研究センター（ＴＨＵ－ＬＡＲＣ）に輸送する期間で、マウス輸送ストレス症候群は慎重に回避された。新しい環境への適応を保証するために、すべてのマウスは１ヶ月隔離され、品質検出が行われた。動物は、１２時間の暗－光サイクルを有する病原体のないバリア環境に飼育された。室温は２３℃に維持された。マウスが到着した後、研究全体を通して、マウスに放射線滅菌されたＪＡＸ－標準繁殖用飼料（ＳＨＯＯＢＲＥＥ(R)、Ｘｉｅｔｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，１０１００５８）及び滅菌水を投与した。
【0101】
マウスが所定の年齢（３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月及び１８ヶ月）に達したとき、ｒＭＳＡ又は生理食塩水治療群にランダムに分けられた。１キログラムのｒＭＳＡは、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｒｏｔｇｅｎ，Ｌｔｄから提供される。ピキア（ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）によって発現されるＧＭＰグレードのｒＭＳＡの品質は、純度が９９％よりも大きいことを確保するために、厳密に制御されている。最も重要なことは、ＥＬＩＳＡで測定した場合、宿主細胞タンパク質（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＨＣＰｓ）が１μｇ／ｇ ｒＭＳＡ未満であることであり、これは、ｒＭＳＡがほとんどＨＣＰｓを含まないことを意味する。
【0102】
生理食塩水に溶解した１２５ｍｇ／ｍＬのｒＭＳＡをゆっくりと静脈内注射した。毎回注射する前にマウスの体重を量って投与量を計算し、生理食塩水用を陰性対照とした。示されるように、３週間ごとにマウスに注射し、各マウスに２０ｍｇのｒＭＳＡを注射し又はマウス体重１グラムあたり１．５ｍｇのｒＭＳＡ及び等量の生理食塩水を注射した。すべての動物研究は清華大学動物保護・使用委員会（北京，中国）によって承認された。
【0103】
タンパク質レベルの測定
血液の生化学パラメータを測定するために、Ａｖｅｒｔｉｎ(R)（トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ４８４０２）（４００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔した後、マウスの尾静脈又は眼窩洞から血液サンプルを収集した。４℃、１，０００×ｇで２０分間遠心した後に血清サンプルを収集した。血漿サンプルを収集し、ヘパリン ナトリウム塩を新鮮な血液サンプル（２０単位／ｍＬ血液、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３１４９）に添加し、血液の凝固を防止し、次に４℃、１，０００×ｇで３０分間遠心した。自動生化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ ４００）で血清サンプルの主な血液生化学パラメータを測定した。
血液の生化学パラメータを測定するために、Ａｖｅｒｔｉｎ(R)（トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ４８４０２）（４００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔した後、マウスの尾静脈又は眼窩洞から血液サンプルを収集した。４℃、１，０００×ｇで２０分間遠心した後に血清サンプルを収集した。血漿サンプルを収集し、ヘパリン ナトリウム塩を新鮮な血液サンプル（２０単位／ｍＬ血液、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３１４９）に添加し、血液の凝固を防止し、次に４℃、１，０００×ｇで３０分間遠心した。自動生化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ ４００）で血清サンプルの主な血液生化学パラメータを測定した。
【0104】
アルブミンの発現レベルを測定するために、麻酔後に二酸化炭素でマウスを安楽死させた。肝組織サンプルを迅速に取り出して、ホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６０２６）でホモジネート中の全ＲＮＡを分離し、且つＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｋ１６２２）でそれをｃＤＮＡに転化した。ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ(R)Ｔｏｐ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＡＱ１３１）でＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を定量した。２＾－ΔΔＣｔ方法で相対定量を分析した。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部対照とした。独立した実験を３回繰り返した。Ａｌｂフォワード５’－ＴＧＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧＴＧＴＧＴＴ、リバース５’－ＴＴＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＴＴＧＧＣＡ、Ｇａｐｄｈフォワード５’－ＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡ、リバース５’－ ＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧ ＧＴＴＴＣＴＴＡというプライマーを使用した。
【0105】
握力試験
握力は握力計（Ｙｉｙａｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，ＹＬＳ－１３Ａ）で測定された。マウスに金属製のグリッドを把持させ、マウスがグリッドを把持できなくなるまで、一定速度で尻尾を後ろにゆっくりと引いた。各マウスに対して５回の試験を行い、平均値は個々のマウスの握力を表すことに用いられた。
握力は握力計（Ｙｉｙａｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，ＹＬＳ－１３Ａ）で測定された。マウスに金属製のグリッドを把持させ、マウスがグリッドを把持できなくなるまで、一定速度で尻尾を後ろにゆっくりと引いた。各マウスに対して５回の試験を行い、平均値は個々のマウスの握力を表すことに用いられた。
【0106】
バーンズ迷路試験
空間記憶機能を評価するために、１２Ｍ群の雄のマウスに対してバーンズ迷路試験を行った。バーンズ迷路試験において、マウスは、円形のプラットフォームの周りに位置する黒い脱出ボックスに接続される穴を見つけるように訓練された。円形のプラットフォームの直径が９１ｃｍであり、厚さが０．４ｃｍであり、エッジの周りには、直径が５ｃｍの２０個の均一に分布した穴があり、２つのオーバーヘッドライトは嫌悪刺激として使用された。各試験はいずれもプラットフォームに取り付けられたビデオカメラに記録された。プロセスはＲｏｓｅｎｆｅｌｄらの説明と同じであるが、変更がある４４。
空間記憶機能を評価するために、１２Ｍ群の雄のマウスに対してバーンズ迷路試験を行った。バーンズ迷路試験において、マウスは、円形のプラットフォームの周りに位置する黒い脱出ボックスに接続される穴を見つけるように訓練された。円形のプラットフォームの直径が９１ｃｍであり、厚さが０．４ｃｍであり、エッジの周りには、直径が５ｃｍの２０個の均一に分布した穴があり、２つのオーバーヘッドライトは嫌悪刺激として使用された。各試験はいずれもプラットフォームに取り付けられたビデオカメラに記録された。プロセスはＲｏｓｅｎｆｅｌｄらの説明と同じであるが、変更がある４４。
【0107】
アルブミンの精製
予め平衡化したＢｌｕｅ ＢｅｓｔａｒｏｓｅＴＭＦＦカラム（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）に適用する前に、ｐＨ７．８の、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液で指定された群の血清サンプルを希釈し、次に３ベッドボリュームで非特異的結合タンパク質を洗浄した。溶出緩衝液（０．２Ｍ ＮａＳＣＮ、ｐＨ８．０）でマウスアルブミンを溶出し、次にＰＢＳで透析し、且つＡｍｉｃｏｎ(R)超遠心フィルタを用いて、４℃でＵｌｔｒａｃｅｌ－３０再生セルロース膜（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ８０３００８）で濃縮した。タンパク質濃度はメーカーの説明に従ってＰｉｅｒｃｅTM ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２７）によって測定された。Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，ＳＹＮＡＰＴ Ｇ２－Ｓｉ）でサンプルを分析し、該機器は最適化されて高質量タンパク質の分子量分析に用いられた。
予め平衡化したＢｌｕｅ ＢｅｓｔａｒｏｓｅＴＭＦＦカラム（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）に適用する前に、ｐＨ７．８の、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液で指定された群の血清サンプルを希釈し、次に３ベッドボリュームで非特異的結合タンパク質を洗浄した。溶出緩衝液（０．２Ｍ ＮａＳＣＮ、ｐＨ８．０）でマウスアルブミンを溶出し、次にＰＢＳで透析し、且つＡｍｉｃｏｎ(R)超遠心フィルタを用いて、４℃でＵｌｔｒａｃｅｌ－３０再生セルロース膜（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ８０３００８）で濃縮した。タンパク質濃度はメーカーの説明に従ってＰｉｅｒｃｅTM ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２７）によって測定された。Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，ＳＹＮＡＰＴ Ｇ２－Ｓｉ）でサンプルを分析し、該機器は最適化されて高質量タンパク質の分子量分析に用いられた。
【0108】
免疫蛍光アッセイ
マウスから解剖した凍結切片を冷アセトンで固定した。次に１０％ヤギ血清でこれらのサンプルをブロックし、且つ４℃で一次抗体で一晩染色し、次に４℃で適切な二次蛍光標識抗体で一晩染色した。スライドガラスを、ＦＩＴＣ－、Ａｌｅｘａ ５５５－又はＡｌｅｘａ ６４７－結合二次抗体で染色し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。蛍光イメージングをニコンＡ１レーザ走査共焦点顕微鏡で行い、且つＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。
マウスから解剖した凍結切片を冷アセトンで固定した。次に１０％ヤギ血清でこれらのサンプルをブロックし、且つ４℃で一次抗体で一晩染色し、次に４℃で適切な二次蛍光標識抗体で一晩染色した。スライドガラスを、ＦＩＴＣ－、Ａｌｅｘａ ５５５－又はＡｌｅｘａ ６４７－結合二次抗体で染色し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。蛍光イメージングをニコンＡ１レーザ走査共焦点顕微鏡で行い、且つＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。
【0109】
マウス抗リン酸化タウモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＮ１０２０）及び抗ＭＨＣ１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ ８４２１）という抗体を使用した。
【0110】
老化に関連するパラメータの決定
Ｅｌｌｍａｎ法は遊離チオール基の含有量の測定に用いられた４５。マウス血清アルブミン及びｒＭＳＡをそれぞれ等体積の５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬と混合した。本研究に使用されたＤＴＮＢの体積及び濃度はそれぞれ１００μＬ及び２ｍＭであった。８００μＬのＴｒｉｓ緩衝液（１Ｍ）を添加し、反応系の体積を１０００μＬにした。サンプルを室温で３０分間保持した。４１２ｎｍで蛍光吸光度を測定した。マニュアルに従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２６２８７）でタンパク質サンプル中のカルボニル基を定量した。メーカーの説明（ＭＥＩＭＩＡＮ，１２１３）に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でホモシステインの濃度を測定した。メーカーの説明（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）に従って、ＥＬＩＳＡキットでＡＧＥの濃度を測定した。
Ｅｌｌｍａｎ法は遊離チオール基の含有量の測定に用いられた４５。マウス血清アルブミン及びｒＭＳＡをそれぞれ等体積の５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬と混合した。本研究に使用されたＤＴＮＢの体積及び濃度はそれぞれ１００μＬ及び２ｍＭであった。８００μＬのＴｒｉｓ緩衝液（１Ｍ）を添加し、反応系の体積を１０００μＬにした。サンプルを室温で３０分間保持した。４１２ｎｍで蛍光吸光度を測定した。マニュアルに従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１２６２８７）でタンパク質サンプル中のカルボニル基を定量した。メーカーの説明（ＭＥＩＭＩＡＮ，１２１３）に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でホモシステインの濃度を測定した。メーカーの説明（ＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ Ｃｏ．，ＣＥＢ３５３Ｇｅ）に従って、ＥＬＩＳＡキットでＡＧＥの濃度を測定した。
【0111】
統計分析
Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法を生存分析に用い、且つログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって生存曲線を比較した。両側の対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ－検定（２－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）又はＡＮＯＶＡで各群の間の統計的有意差を決定し、ここで、ｐ＜０．０５は有意であると見なされる。特に明記しない限り、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０１ソフトウェアで統計分析及びグラフ化を行った。
Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法を生存分析に用い、且つログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって生存曲線を比較した。両側の対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ－検定（２－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）又はＡＮＯＶＡで各群の間の統計的有意差を決定し、ここで、ｐ＜０．０５は有意であると見なされる。特に明記しない限り、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０１ソフトウェアで統計分析及びグラフ化を行った。
【0112】
REFERENCES
1. Ludwig, F. C. & Elashoff, R. M. Mortality in syngeneic rat parabionts of different chronological age. Trans N Y Acad Sci. 34, 582-587 (1972).
2. Egerman, M. A. et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metab. 22, 164-174 (2015).
3. Villeda, S. A. et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat. Med. 20, 659-663 (2014).
4. Rattan, S. I. Increased molecular damage and heterogeneity as the basis of aging. Biol. Chem. 389, 267-272 (2008).
5. Yin, D. & Chen, K. The essential mechanisms of aging: Irreparable damage accumulation of biochemical side-reactions. Exp. Gerontol. 40, 455-465 (2005).
6. Lehallier, B. et al. Undulating changes in human plasma proteome profiles across the lifespan. Nat. Med. 25, 1843-1850 (2019).
7. Zimniak, P. What is the Proximal Cause of Aging? Front Genet. 3, 189 (2012).
8. Korovila, I. et al. Proteostasis, oxidative stress and aging. Redox Biol. 13, 550-567 (2017).
9. Reeg, S. & Grune, T. Protein Oxidation in Aging: Does It Play a Role in Aging Progression? Antioxid Redox Signal. 23, 239-255 (2015).
10.Hildebrandt, W., Kinscherf, R., Hauer, K., Holm, E. & Droge, W. Plasma cystine concentration and redox state in aging and physical exercise. Mech. Ageing Dev. 123, 1269-1281 (2002).
11.Garcia-Martinez, R. et al. Albumin: pathophysiologic basis of its role in the treatment of cirrhosis and its complications. Hepatology. 58, 1836-1846 (2013).
12.Hipkiss, A. R. Glycation, ageing and carnosine: are carnivorous diets beneficial? Mech. Ageing Dev.126, 1034-1039 (2005).
13.Ahmed, N. Advanced glycation endproducts--role in pathology of diabetic complications. Diabetes Res Clin Pract. 67, 3-21 (2005).
14.Suji, G. & Sivakami, S. Glucose, glycation and aging. Biogerontology. 5, 365-373 (2004).
15.Uribarri, J. et al. Circulating glycotoxins and dietary advanced glycation endproducts: two links to inflammatory response, oxidative stress, and aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 62, 427-433 (2007).
16.Berlett, B. S. & Stadtman, E. R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J. Biol. Chem. 272, 20313-20316 (1997).
17.Chevion, M., Berenshtein, E. & Stadtman, E. R. Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage. Free Radic Res. 33 Suppl, S99-S108 (2000).
18.Pandey, K. B., Mehdi, M. M., Maurya, P. K. & Rizvi, S. I. Plasma protein oxidation and its correlation with antioxidant potential during human aging. Dis. Markers. 29, 31-36 (2010).
19.McLean, R. R. et al. Homocysteine as a predictive factor for hip fracture in older persons. N Engl J Med. 350, 2042-2049 (2004).
20.Ostrakhovitch, E. A. & Tabibzadeh, S. Homocysteine and age-associated disorders. Ageing Res. Rev. 49, 144-164 (2019).
21.McCully, K. S. Vascular pathology of homocysteinemia: implications for the pathogenesis of arteriosclerosis. The American journal of pathology. 56, 111-128 (1969).
22.Seshadri, S. et al. Plasma Homocysteine as a Risk Factor for Dementia and Alzheimer's Disease. The New England Journal of Medicine. 346, 476-483 (2002).
23.Jakubowski, H. Homocysteine is a protein amino acid in humans. Implications for homocysteine-linked disease. J. Biol. Chem. 277, 30425-30428 (2002).
24.Jakubowski, H. Homocysteine Modification in Protein Structure/Function and Human Disease. Physiol. Rev. 99, 555-604 (2019).
25.Rothschild, M. A., Oratz, M. & Schreiber, S. S. Serum albumin. Hepatology. 8, 385-401 (1988).
26.Jr. Peters, T. All about albumin: Biochemistry, genetics, and medical applications.; 1996.
27.Garcia Martinez, R. et al. Albumin: Pathophysiologic basis of its role in the treatment of cirrhosis and its complications. Hepatology. 58, 1836-1846 (2013).
28.Carballal, S. et al. Sulfenic Acid Formation in Human Serum Albumin by Hydrogen Peroxide and Peroxynitrite†. Biochemistry-US. 42, 9906-9914 (2003).
29.Turell, L., Radi, R. & Alvarez, B. The thiol pool in human plasma: The central contribution of albumin to redox processes. Free Radical Bio. Med. 65, 244-253 (2013).
30.Leto, S., Yiengst, M. J. & Barrows, J. C. H. The effect of age and protein deprivation on the sulfhydryl content of serum albumin. Journal of gerontology. 25, 4 (1970).
31.Era, S. et al. Age-related change in redox state of human serum albumin. Biochim Biophys Acta. 1247, 12-16 (1995).
32.Colombo, G. et al. Redox Albuminomics: Oxidized Albumin in Human Diseases. Antioxid. Redox Sign. 17, 1515-1527 (2012).
33.Jana, C. K., Das, N. & Sohal, R. S. Specificity of Age-Related Carbonylation of Plasma Proteins in the Mouse and Rat. Arch. Biochem. Biophys. 397, 433-439 (2002).
34.Wang, Z. et al. Age-related variations of protein carbonyls in human saliva and plasma: is saliva protein carbonyls an alternative biomarker of aging? Age. 37, (2015).
35.Byun, K. et al. Advanced glycation end-products produced systemically and by macrophages: A common contributor to inflammation and degenerative diseases. Pharmacol Ther. 177, 44-55 (2017).
36.Schalkwijk, C. G. & Stehouwer, C. Methylglyoxal, a Highly Reactive Dicarbonyl Compound, in Diabetes, Its Vascular Complications, and Other Age-Related Diseases. Physiol. Rev. 100, 407-461 (2020).
37.Glowacki, R. & Jakubowski, H. Cross-talk between Cys34 and lysine residues in human serum albumin revealed by N-homocysteinylation. J. Biol. Chem. 279, 10864-10871 (2004).
38.Sheng, J. et al. Novel Transgenic Mouse Model for Studying Human Serum Albumin as a Biomarker of Carcinogenic Exposure. Chem. Res. Toxicol. 29, 797-809 (2016).
39.Mehdipour, M. et al. Rejuvenation of three germ layers tissues by exchanging old blood plasma with saline-albumin. Aging (Albany NY). 12, 8790-8819 (2020).
40.Abdulle, A. E. et al. Serum free thiols predict cardiovascular events and all-cause mortality in the general population: a prospective cohort study. BMC Med.18, 130 (2020).
41.Damba, T. et al. Oxidative Stress Is Associated with Suspected Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and All-Cause Mortality in the General Population. Liver Int., (2020).
42.Schalkwijk, C. G. & Stehouwer, C. Methylglyoxal, a Highly Reactive Dicarbonyl Compound, in Diabetes, Its Vascular Complications, and Other Age-Related Diseases. Physiol. Rev. 100, 407-461 (2020).
43.Yaffe, K. et al. Advanced glycation end product level, diabetes, and accelerated cognitive aging. Neurology. 77, 1351-1356 (2011).
44.Rosenfeld, C. S. & Ferguson, S. A. Barnes Maze Testing Strategies with Small and Large Rodent Models. Journal of Visualized Experiments, (2014).
45.Ellman, G. L. A colorimetric method for determining low concentrations of mercaptans. Arch. Biochem. Biophys. 74, 443-450 (1958).
1. Ludwig, F. C. & Elashoff, R. M. Mortality in syngeneic rat parabionts of different chronological age. Trans N Y Acad Sci. 34, 582-587 (1972).
2. Egerman, M. A. et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metab. 22, 164-174 (2015).
3. Villeda, S. A. et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat. Med. 20, 659-663 (2014).
4. Rattan, S. I. Increased molecular damage and heterogeneity as the basis of aging. Biol. Chem. 389, 267-272 (2008).
5. Yin, D. & Chen, K. The essential mechanisms of aging: Irreparable damage accumulation of biochemical side-reactions. Exp. Gerontol. 40, 455-465 (2005).
6. Lehallier, B. et al. Undulating changes in human plasma proteome profiles across the lifespan. Nat. Med. 25, 1843-1850 (2019).
7. Zimniak, P. What is the Proximal Cause of Aging? Front Genet. 3, 189 (2012).
8. Korovila, I. et al. Proteostasis, oxidative stress and aging. Redox Biol. 13, 550-567 (2017).
9. Reeg, S. & Grune, T. Protein Oxidation in Aging: Does It Play a Role in Aging Progression? Antioxid Redox Signal. 23, 239-255 (2015).
10.Hildebrandt, W., Kinscherf, R., Hauer, K., Holm, E. & Droge, W. Plasma cystine concentration and redox state in aging and physical exercise. Mech. Ageing Dev. 123, 1269-1281 (2002).
11.Garcia-Martinez, R. et al. Albumin: pathophysiologic basis of its role in the treatment of cirrhosis and its complications. Hepatology. 58, 1836-1846 (2013).
12.Hipkiss, A. R. Glycation, ageing and carnosine: are carnivorous diets beneficial? Mech. Ageing Dev.126, 1034-1039 (2005).
13.Ahmed, N. Advanced glycation endproducts--role in pathology of diabetic complications. Diabetes Res Clin Pract. 67, 3-21 (2005).
14.Suji, G. & Sivakami, S. Glucose, glycation and aging. Biogerontology. 5, 365-373 (2004).
15.Uribarri, J. et al. Circulating glycotoxins and dietary advanced glycation endproducts: two links to inflammatory response, oxidative stress, and aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 62, 427-433 (2007).
16.Berlett, B. S. & Stadtman, E. R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J. Biol. Chem. 272, 20313-20316 (1997).
17.Chevion, M., Berenshtein, E. & Stadtman, E. R. Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage. Free Radic Res. 33 Suppl, S99-S108 (2000).
18.Pandey, K. B., Mehdi, M. M., Maurya, P. K. & Rizvi, S. I. Plasma protein oxidation and its correlation with antioxidant potential during human aging. Dis. Markers. 29, 31-36 (2010).
19.McLean, R. R. et al. Homocysteine as a predictive factor for hip fracture in older persons. N Engl J Med. 350, 2042-2049 (2004).
20.Ostrakhovitch, E. A. & Tabibzadeh, S. Homocysteine and age-associated disorders. Ageing Res. Rev. 49, 144-164 (2019).
21.McCully, K. S. Vascular pathology of homocysteinemia: implications for the pathogenesis of arteriosclerosis. The American journal of pathology. 56, 111-128 (1969).
22.Seshadri, S. et al. Plasma Homocysteine as a Risk Factor for Dementia and Alzheimer's Disease. The New England Journal of Medicine. 346, 476-483 (2002).
23.Jakubowski, H. Homocysteine is a protein amino acid in humans. Implications for homocysteine-linked disease. J. Biol. Chem. 277, 30425-30428 (2002).
24.Jakubowski, H. Homocysteine Modification in Protein Structure/Function and Human Disease. Physiol. Rev. 99, 555-604 (2019).
25.Rothschild, M. A., Oratz, M. & Schreiber, S. S. Serum albumin. Hepatology. 8, 385-401 (1988).
26.Jr. Peters, T. All about albumin: Biochemistry, genetics, and medical applications.; 1996.
27.Garcia Martinez, R. et al. Albumin: Pathophysiologic basis of its role in the treatment of cirrhosis and its complications. Hepatology. 58, 1836-1846 (2013).
28.Carballal, S. et al. Sulfenic Acid Formation in Human Serum Albumin by Hydrogen Peroxide and Peroxynitrite†. Biochemistry-US. 42, 9906-9914 (2003).
29.Turell, L., Radi, R. & Alvarez, B. The thiol pool in human plasma: The central contribution of albumin to redox processes. Free Radical Bio. Med. 65, 244-253 (2013).
30.Leto, S., Yiengst, M. J. & Barrows, J. C. H. The effect of age and protein deprivation on the sulfhydryl content of serum albumin. Journal of gerontology. 25, 4 (1970).
31.Era, S. et al. Age-related change in redox state of human serum albumin. Biochim Biophys Acta. 1247, 12-16 (1995).
32.Colombo, G. et al. Redox Albuminomics: Oxidized Albumin in Human Diseases. Antioxid. Redox Sign. 17, 1515-1527 (2012).
33.Jana, C. K., Das, N. & Sohal, R. S. Specificity of Age-Related Carbonylation of Plasma Proteins in the Mouse and Rat. Arch. Biochem. Biophys. 397, 433-439 (2002).
34.Wang, Z. et al. Age-related variations of protein carbonyls in human saliva and plasma: is saliva protein carbonyls an alternative biomarker of aging? Age. 37, (2015).
35.Byun, K. et al. Advanced glycation end-products produced systemically and by macrophages: A common contributor to inflammation and degenerative diseases. Pharmacol Ther. 177, 44-55 (2017).
36.Schalkwijk, C. G. & Stehouwer, C. Methylglyoxal, a Highly Reactive Dicarbonyl Compound, in Diabetes, Its Vascular Complications, and Other Age-Related Diseases. Physiol. Rev. 100, 407-461 (2020).
37.Glowacki, R. & Jakubowski, H. Cross-talk between Cys34 and lysine residues in human serum albumin revealed by N-homocysteinylation. J. Biol. Chem. 279, 10864-10871 (2004).
38.Sheng, J. et al. Novel Transgenic Mouse Model for Studying Human Serum Albumin as a Biomarker of Carcinogenic Exposure. Chem. Res. Toxicol. 29, 797-809 (2016).
39.Mehdipour, M. et al. Rejuvenation of three germ layers tissues by exchanging old blood plasma with saline-albumin. Aging (Albany NY). 12, 8790-8819 (2020).
40.Abdulle, A. E. et al. Serum free thiols predict cardiovascular events and all-cause mortality in the general population: a prospective cohort study. BMC Med.18, 130 (2020).
41.Damba, T. et al. Oxidative Stress Is Associated with Suspected Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and All-Cause Mortality in the General Population. Liver Int., (2020).
42.Schalkwijk, C. G. & Stehouwer, C. Methylglyoxal, a Highly Reactive Dicarbonyl Compound, in Diabetes, Its Vascular Complications, and Other Age-Related Diseases. Physiol. Rev. 100, 407-461 (2020).
43.Yaffe, K. et al. Advanced glycation end product level, diabetes, and accelerated cognitive aging. Neurology. 77, 1351-1356 (2011).
44.Rosenfeld, C. S. & Ferguson, S. A. Barnes Maze Testing Strategies with Small and Large Rodent Models. Journal of Visualized Experiments, (2014).
45.Ellman, G. L. A colorimetric method for determining low concentrations of mercaptans. Arch. Biochem. Biophys. 74, 443-450 (1958).
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】