▶ クローダ インターナショナル パブリック リミティド カンパニーの特許一覧 ▶ クローダ，インコーポレイティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-06
(54)【発明の名称】農薬アジュバント
(51)【国際特許分類】
A01N 25/00 20060101AFI20230830BHJP
A01N 43/90 20060101ALI20230830BHJP
A01P 7/04 20060101ALI20230830BHJP
A01N 47/24 20060101ALI20230830BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20230830BHJP
A01N 43/653 20060101ALI20230830BHJP
C12N 1/14 20060101ALN20230830BHJP
【ＦＩ】
A01N25/00 101
A01N43/90 103
A01P7/04
A01N25/00 102
A01N47/24 G
A01P3/00
A01N43/653 C
C12N1/14 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511820
(86)(22)【出願日】2021-08-13
(85)【翻訳文提出日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 US2021045902
(87)【国際公開番号】W WO2022040038
(87)【国際公開日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】63/066,519
(32)【優先日】2020-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506352278
【氏名又は名称】クローダ インターナショナル パブリック リミティド カンパニー
(71)【出願人】
【識別番号】508276992
【氏名又は名称】クローダ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100182730
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 浩明
(72)【発明者】
【氏名】グレゴリー ジェイムズ リンドナー
(72)【発明者】
【氏名】ブラッドリー アーノルド ハルトリ
(72)【発明者】
【氏名】ラッセル グレイグ カー
(72)【発明者】
【氏名】アリッサ ルイーズ グランワルド
(72)【発明者】
【氏名】ヘベリン コレア ベランディア
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AC14
4B065BA22
4B065BD16
4B065CA18
4B065CA48
4H011AA01
4H011AB01
4H011AB03
4H011AC01
4H011AC04
4H011BA02
4H011BB09
4H011BB13
4H011BC09
4H011DD03
(57)【要約】
ジケトピペラジン及び農薬活性物質から選択されるアジュバントを含む新規農薬製剤。 製剤を形成するのに適した濃縮物も提供される。 ジケトピペラジンは、濃縮物及び農薬製剤にアジュバンシーを提供する。 製剤の製造方法も提供され、農薬製剤におけるアジュバントとしての前記ジケトピペラジンの使用も提供される。メタリジウム・カルネウム（Metarhizium carneum）ＲＫＤＯ５７８の培養からジケトピペラジンを得る方法も記載されている。 抽出されたジケトピペラジンは、植物を処理して害虫を防除するための製剤、又は種子コーティングに使用することができる。 あるいは、菌株ＲＫＤＯ５７８自体を、種子コーティング又は有害生物を防除するための植生を処理するための製剤に使用することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
i) 下記式（I）：【化1】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質、
を含む農薬製剤。
【請求項2】
Ｒ１は、水素、メチル、又はエチルを表し；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、メチル、フェニル、又は置換フェニルを表し、前記置換基は、メチル、エチル、メトキシ、又はエトキシであり；
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方はフェニルを表し、他方は水素、メチル、又はエチルを表し；そして
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して水素又はメチルを表す、請求項１に記載の製剤。
【請求項3】
Ｒ１は、水素、又はメチルを表し；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、フェニル、又は置換フェニルを表し、前記置換基は、メチル、エチル、メトキシ、又はエトキシであり；
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方はフェニルを表し、他方は水素、又はメチルを表し；そして
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して水素を表す、請求項１に記載の製剤。
【請求項4】
前記アジュバントが、下記式（II）：【化2】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表す］で表されるジケトピペラジンから選択される、請求項１～３にいずれか１項に記載の製剤。
【請求項5】
前記アジュバントが、下記式：【化3】
【請求項6】
i) 下記式（I）：【化4】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の農薬製剤を製造するのに適した濃縮物。
【請求項7】
下記式（I）：【化5】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択される化合物の、少なくとも１つの農薬活性物質を含む農薬製剤中のアジュバントとしての使用。
【請求項8】
害虫を防除する植生の処理方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の製剤、又は請求項６に記載の希釈濃縮製剤を、前記植生又は前記植生の直近の環境に適用する方法。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載のアジュバントを得る方法であって、メタリジウム・カルネウム（Metarhizium carneum）からの第１の側面によるアジュバントの代謝合成を促進する条件下で、培地中でメタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８を培養する工程、及び
合成されたアジュバントを培養培地から精製する工程を含む方法。
【請求項10】
メタリジウム・カルネウム、株 ＲＫＤＯ５７８、Agricultural Research Service Culture Collection (ＮＲＲＬ)受託番号 ＮＲＲＬ－６７９５０ からなる生物。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか１項に記載のジケトピペラジンの少なくとも１つを含む、メタリジウム・カルネウム、株 ＲＫＤＯ５７８、Agricultural Research Service Culture Collection (ＮＲＲＬ)受託番号 ＮＲＲＬ－６７９５０ からなる生物から得られた抽出物。
【請求項12】
害虫を防除するための植生の処理方法であって、請求項１０に記載の生物を前記植生又は前記植生の直近の環境に施用する方法。
【請求項13】
請求項１～５のいずれか１項に記載のアジュバント、又は請求項１０に記載の生物を含む種子コーティング組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般的に、農薬活性製剤用の微生物から得られるアジュバント、及び１つ又は複数の農薬活性物質を有する前記アジュバントを含む農薬製剤に補助を提供する方法に関する。 本発明は、作物を前記製剤で処理することも含む。
【背景技術】
【0002】
アジュバントは、一般的に、農薬活性物質の生物学的活性又は有効性を改善することができる化学物質又は化学物質の混合物として定義される。アジュバント自体は害虫を防除したり殺したりしない。 代わりに、これらの添加剤は、標的生物内の分子標的 (細胞壁、イオンチャネル、構造タンパク質、酵素など) と相互作用したり、農薬製剤の特性 (拡散、保持、浸透、液滴サイズなど) を変更したりする可能性があり、これにより、生物に作用する農薬の生物学的活性が改善される。アジュバントとして使用される典型的なタイプの化合物には、低分子、界面活性剤、乳化剤、油、及び塩が含まれる場合がある。 アジュバントは、通常、処理された植物の活性物質の移行を阻害しない。 さらに、アジュバントは、植物に望ましくない植物毒性効果をもたらすべきではない。
【0003】
菌類は陸上環境に広く存在し、農業生産性に大きな課題をもたらす。 真菌感染がチェックされていないと、収穫前及び収穫後の作物の損失が８０％を超える可能性がある。 このような損失を減らし、増加する食料需要を満たすために、殺菌剤を使用して真菌性農業害虫を防除することは、農業害虫管理システムの重要な要素であり、今後もそうであり続けるであろう。
【0004】
農業害虫、特に真菌害虫と闘うための新しい戦略を開発する必要がある。 1つの戦略は、安全で毒性のない化学物質であるアジュバントを開発することである。これは、農業生産性に対する真菌性害虫の影響を防止又は軽減するために、畑及び温室作物での使用がすでに承認されている既存の殺菌剤の有効性を向上させる。これらのアジュバントは、畑や収穫後の害虫の防除を改善し、それによって生産性を高めることができる。 また、望ましいレベルの害虫駆除を達成するために必要な殺菌剤の量を減らすことができるため、持続可能な生産性の向上を達成するという目標に貢献する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、化合物が活性剤の有効性の改善を含む所望のアジュバンシーを提供し得る、農薬活性剤と組み合わせた農薬製剤中の化合物の使用を提供しようとするものである。 本発明はまた、前記アジュバントを含む農薬濃縮物、希釈製剤、及び種子コーティングの使用を提供しようとする。
【0006】
本発明はまた、化合物が既存のアジュバントと比較して同等又は改善されたアジュバンシー特性を提供し得る、農薬製剤中の化合物を提供しようとする。
【0007】
本発明はまた、アジュバントとしての化合物の使用、及び農薬製剤においてアジュバンシーを提供する際に使用するための前記化合物を含む製剤を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１の側面によれば、
i) 下記式（I）：
［式中、
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質を含む農薬製剤が提供される。
i) 下記式（I）：
【化1】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質を含む農薬製剤が提供される。
【0009】
本発明の第２の側面によれば、
i) 下記式（I）：
［式中、
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質を含む、第１の側面の農薬製剤を製造するのに適した濃縮物が提供される。
i) 下記式（I）：
【化2】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択されるアジュバント；及び
ii) 少なくとも1つの農薬活性物質を含む、第１の側面の農薬製剤を製造するのに適した濃縮物が提供される。
【0010】
本発明の第３の側面によれば、
下記式（I）：
［式中、
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択される化合物の、少なくとも１つの農薬活性物質を含む農薬製剤中のアジュバントとしての使用が提供される。
下記式（I）：
【化3】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表されるジケトピペラジンから選択される化合物の、少なくとも１つの農薬活性物質を含む農薬製剤中のアジュバントとしての使用が提供される。
【0011】
本発明の第４の側面によれば、害虫を防除する植生の処理方法が提供され、前記方法は、第１の側面の製剤、又は第２の側面の希釈濃縮製剤を、前記植生又は前記植生の直近の環境に適用することを含む。
【0012】
本発明の第５の側面によれば、第１の側面のアジュバントを得る方法が提供され、前記方法は、
メタリジウム・カルネウム（Metarhizium carneum）からの第１の側面によるアジュバントの代謝合成を促進する条件下で、培地中でメタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８を培養する工程、及び
合成されたアジュバントを培養培地から精製する工程を含む。
メタリジウム・カルネウム（Metarhizium carneum）からの第１の側面によるアジュバントの代謝合成を促進する条件下で、培地中でメタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８を培養する工程、及び
合成されたアジュバントを培養培地から精製する工程を含む。
【0013】
本発明の第６の側面によれば、メタリジウム・カルネウム、株 ＲＫＤＯ５７８、Agricultural Research Service Culture Collection (ＮＲＲＬ)受託番号 ＮＲＲＬ－６７９５０ からなる生物が提供される。
【0014】
本発明の第７の側面によれば、第１の側面のジケトピペラジンの少なくとも１つを含む、メタリジウム・カルネウム、株 ＲＫＤＯ５７８、Agricultural Research Service Culture Collection (ＮＲＲＬ)受託番号 ＮＲＲＬ－６７９５０ からなる生物から得られた抽出物が提供される。
【0015】
本発明の第８の側面によれば、第６の側面の生物を前記植生又は前記植生の直近の環境に施用する、害虫を防除するための植生の処理方法が提供される。
【0016】
本発明の第９の側面によれば、第１の側面のアジュバント、又は第６の側面の生物を含む種子コーティング組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書で定義される化合物は、少なくとも１つの農薬活性物質を有する農薬製剤で使用される場合、所望のアジュバンシー特性を提供することが見出された。 重要なことには、同定されたクラスの化合物であるジケトピペラジンは、固有の殺虫活性を示さない。
【0018】
本明細書で使用される「例えば（for example）」、「例えば（for instance）」、「例えば（such as）」、又は「含む（including）」という用語は、より一般的な主題をさらに明確にする例を紹介することを意味する。特にことわらない限り、これらの例は、本開示に示される用途を理解するための補助としてのみ提供され、決して限定することを意図するものではない。
【0019】
置換基（例えば、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」）中の炭素原子の数を記載する場合、その数は、任意の分枝基中に存在するものを含む、置換基中に存在する炭素原子の総数を指すことが理解されるであろう。さらに、例えば脂肪酸の炭素原子の数を記述する場合、これは、カルボン酸の炭素原子、及び分岐基に存在する炭素原子の総数を指す。
【0020】
ジケトピペラジン (ＤＫＰ) は、２ つのアミド結合を持つ有機アミド化合物である。
【0021】
本発明のアジュバントは、下記式（I）：
［式中、
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表される構造を有するジケトピペラジンから選択される。
【化4】
Ｒ１は独立して水素又はＣ１～Ｃ４アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、フェニル、又は置換フェニルを表し；
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、メトキシ、又はエトキシを表す］で表される構造を有するジケトピペラジンから選択される。
【0022】
本明細書で使用される「Ｃ１～Ｃ４アルキル」という用語は、特にことわらない限り、１～４個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖である飽和炭化水素基を指す。
ＲのいずれかがＣ１～Ｃ４アルキルを表す場合、前記アルキルは、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ｔｅｒｔ-ブチルなどから独立して選択され得る。 好ましくは、メチル又はエチルである。 より好ましくは、メチルである。
ＲのいずれかがＣ１～Ｃ４アルキルを表す場合、前記アルキルは、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ｔｅｒｔ-ブチルなどから独立して選択され得る。 好ましくは、メチル又はエチルである。 より好ましくは、メチルである。
【0023】
本明細書で使用される「Ｃ１～Ｃ６アルキル」という用語は、特にことわらない限り、１～６個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖である飽和炭化水素基を指す。ＲのいずれかがＣ１～Ｃ６アルキルを表す場合、前記アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、２メチル－ブチル、ペンチル、ヘキシル、 シクロヘキシルなどから選択される。好ましくは、メチル又はエチルである。 より好ましくは、メチルである。
【0024】
本明細書で使用される「ヒドロキシル」という用語は、特にことわらない限り、1つの酸素と構造－Ｏ－Ｈを有する1つの水素原子を含み、酸素を介して隣接する基に結合しているヒドロキシル基を指す。
【0025】
本明細書で使用される「フェニル」という用語は、特にことわらない限り、ベンゼン芳香族炭化水素から水素を1つ除去することによって誘導されるＣ６Ｈ５有機基を指す。
【0026】
本明細書で使用される「置換フェニル」という用語は、特にことわらない限り、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、又はハロで置換されたフェニルを指す。前記置換は、芳香環上の任意の位置、好ましくはオルト又はパラ位置にあってもよい。
【0027】
本明細書で使用される「ハロ」という用語は、特にことわらない限り、周期表の第 ＶＩＩ 族 (第 １７ 族) の元素に由来するハロゲン化物基を指す。ハロゲン化物基は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードから独立して選択され得る。 好ましくは、クロロである。
【0028】
本明細書で使用される「メトキシ」及び「エトキシ」という用語は、特にことわらない限り、構造－Ｏ－ＣＨ３ 及び -Ｏ-ＣＨ２ＣＨ３ を持つアルコキシ基を形成し、そして酸素を介して隣接する基に結合される酸素に結合したメチル基及びエチル基を指す。
【0029】
好ましくは、Ｒ１は水素、メチル、又はエチルを表す。 より好ましくは、水素又はメチルである。
【0030】
好ましくは、Ｒ２ 及びＲ３ はそれぞれ独立して、水素、メチル、フェニル、又は置換基がメチル、エチル、メトキシ、又はエトキシである置換フェニルを表す。 より好ましくは、水素又はフェニルである。
【0031】
好ましくは、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つはフェニルを表し、他方は水素、メチル、又はエチルを表す。 より好ましくは、Ｒ２およびＲ３の一方がフェニルを表し、他方が水素又はメチルを表す。 最も好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方がフェニルを表し、他方が水素を表す。
【0032】
好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して水素又はメチルを表す。 より好ましくは、水素である。
【0033】
下記式（II）：
で表されるジケトピペラジンが特に好ましく、前記式中、Ｒ１は式(I)と同じ定義を有する。
【化5】
【0034】
好ましくは、式（ＩＩ）のジケトピペラジンアジュバントを得るための第５の側面による方法が提供される。
【0035】
式（Ｉ）の化合物は、Ｒ２及びＲ３が異なる場合、Ｅ／Ｚ異性体を有し得る。 Ｅ及びＺ異性体の両方が式（Ｉ）のジケトピペラジンの定義に含まれることは理解されるであろう。
【0036】
式（Ｉ）の化合物は、ピロリジン環の２位の炭素の周りで光学異性化を有し得る。 Ｒ及びＳ異性体の両方が式（Ｉ）のジケトピペラジンの定義に含まれることは理解されるであろう。 特に、Ｓ異性体が好ましい場合がある。
【0037】
特に、以下から選択されるジケトピペラジンが好ましい：
【化6】
【0038】
発酵に使用される生物は、メタリジウム属に属する糸状菌である。 メタリジウム カルネウム ＲＫＤＯ５７８ の特定の菌株が、新規アジュバントの製造に特に有用であることがわかっており、そしてこの菌株は、ブダペスト条約に基づいて、the Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, USAに寄託されている：
種 菌株 受入番号 寄託日
メタリジウム・
カルネウム ＲＫＤＯ５７８ ６７９５０ ２０２０ 年４月１３日
種 菌株 受入番号 寄託日
メタリジウム・
カルネウム ＲＫＤＯ５７８ ６７９５０ ２０２０ 年４月１３日
【0039】
ＮＲＲＬ－６７９５０は、本発明のアジュバントを提供する上で特に好ましい。
【0040】
ジケトピペラジンはそれぞれ、メタリジウム・カルネウム、具体的には ＲＫＤＯ５７８ の培養物から形成及び抽出することができる。 所望の化合物は、微生物代謝産物を一般的に収集するために典型的に使用される任意の手段によって、培養液又は真菌バイオマスから抽出及び精製することができる。例としては、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、アルミナ、シリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー、又は結晶化、減圧下での濃縮、又は凍結乾燥を使用することによる分離方法が存在し、これらの手段は、単独で、又はそれらを適切に組み合わせて、又は繰り返し使用することができる。
【0041】
メタリジウム・カルネウム ＲＫＤＯ５７８ の培養物は、天然の供給源から、又は Agricultural Research Service Culture Collection (ＮＲＲＬ) などの培養コレクションから入手できる。 メタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８の分離株は、菌学の分野で知られている方法によって培養することができる。
【0042】
本発明の化合物を生産する手段として、生産生物は、炭素源、窒素源、及び無機塩を適切に含む限り、任意の適切な合成培地又は天然培地上で増殖させることができる。 必要に応じて、培地にビタミンやその他の栄養物質を適切に補充することができる。
【0043】
一般的な炭素源としては、グルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、デンプンなどの糖類、グリセロール、マンニトールなどのアルコール類、グリシン、アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸、及び大豆油、オリーブ油等の油脂類が挙げられるが、但しそれらだけには限定されない。窒素源としては、大豆粉、コーンスティープリカー、ビーフエキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸混合物、魚粉等の有機窒素含有化合物、アンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素化合物等が挙げられる。同様に、無機塩の形態の微量栄養素、例えば、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、および様々なリン酸塩を使用することができる。
【0044】
生物は、微生物が生育し、本発明の化合物が効率的に生産される範囲内の適切な培養温度で生育させることができる。 好ましい培養温度は１０℃～３２℃であり、より好ましくは２０℃～２５℃である。 培養開始時のｐＨは６～８程度が好ましい。培養期間は通常１日～数週間程度である。
【0045】
培養は、本発明化合物の生産量が回収に適した量、好ましくは最大量に達した時点で終了すればよい。培養方法としては、固体培養、通常の攪拌培養等、通常用いられる方法であればいずれの方法も適宜採用することができる。
【0046】
例えば、メタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８の分離株は、栄養分を含む (例えば、ＹＭ (酵母麦芽抽出物)) 寒天上に播種し、観察可能なコロニーが現れるまで室温で数日間インキュベートすることができる。 寒天上の個々のメタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８コロニーは、ジケトピペラジンの産生についてアッセイすることができる。
【0047】
所望の分子を産生するこれらのコロニーを使用してブロス培養物（例えば、ＹＭブロスウイヨン培養物）に接種することができ、これを適切な条件下（例えば、室温で数日間振盪しながら）で培養して種子接種物を得ることができる。種子接種物は、メタリジウム・カルネウム培養を拡大するために、ほぼ室温で数日間 (例えば、４～２８ 日) インキュベートできる、より大きな液体培養 (例えば、ｍｍｋ２ブイヨン) を開始するために使用できる。
【0048】
ジケトピペラジンは、液体培地 (例えば、ｍｍｋ２ブイヨン) に排泄されることがわかっている。ジケトピペラジンは、酢酸エチルと水を含む液体:液体抽出を使用して発酵培養液から単離することができ、化合物を吸収性樹脂 (例えば、Ｄｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０ ) に結合させ、樹脂を水で洗浄し、次に適切な溶媒( 例えば、メタノール又はエタノール）を使用してジケトピペラジンを溶出する。ジケトピペラジンの極性の違いにより、個々の化合物は、フラッシュ クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーと逆相固定相 (Ｃ－１８ など) を使用して分離できる。
【0049】
結果として得られる抽出されたジケトピペラジンは、精製され、個々の均一な化合物として使用され得る。 別の実施形態によれば、抽出された物質は、第１の側面によるジケトピペラジンの組み合わせであってもよく、農薬製剤中で組み合わせて使用されてもよい。
【0050】
他の実施形態によれば、ジケトピペラジンは、他の利用可能な資源、典型的には他の菌類から得ることができる。
【0051】
ジケトピペラジンは、合成技術によっても作られる可能性がある。 ジケトピペラジン及びその誘導体は、科学文献に記載されている市販の材料及び合成方法論を使用して、有機化学の当業者によって化学合成によって生成され得る。
【0052】
そのような方法の 1 つは、カルボジイミド又はホスホニウムベースのカップリング試薬を使用したフェニルプロピオール酸と Ｌ－プロリンアミド間のアミドカップリング反応から始まる２段階合成である。 トリフェニルホスフィンによって触媒される求核性α付加によるその後の分子内環化により、主にＺ配置を有する二重結合を有する式（Ｉ）の所望のジケトピペラジンが得られる。この環化工程は、立体障害を導入するためにアミド位置に Ｎ－アルキル基又は－アリール基を持つ Ｌ－プロリンアミド前駆体を使用することにより、Ｅ 形状に有利に働く可能性がある。 次いで、塩基の存在下でヨードメタンを使用してアミドをメチル化することにより、式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）のジケトピペラジンを得るために第３の工程を行うことができる。
【0053】
アジュバント自体の特性は、前記アジュバントを含む農薬製剤に同じ有利な利点を提供すると理解される。 従って、本発明のアジュバントを含む場合、アジュバント自体の特性の利点を有する農薬製剤が提供される。
【0054】
殺虫剤や殺菌剤を含む農薬活性化合物は、活性化合物が植物/標的生物に取り込まれることを可能にする製剤を必要とする。
【0055】
本明細書で使用される「農薬製剤」という用語は、活性農薬を含む組成物を指し、濃縮物及び噴霧製剤を含むあらゆる形態の組成物を含むことを意図している。 特にことわらない限り、本発明の農薬製剤は、濃縮物、希釈濃縮物、又は噴霧可能な製剤の形態であり得る。
【0056】
本発明のアジュバントは、少なくとも１つの農薬活性物質を含む農薬製剤を形成するために、他の成分と組み合わせることができる。
【0057】
従って、農薬活性化合物は、乳化性濃縮物（ＥＣ）、エマルジョン濃縮物（ＥＷ）、懸濁濃縮物（ＳＣ度）、可溶性液体（ＳＬ）、油性懸濁濃縮物（ＯＤ）、及び／又はサスポエマルジョン（ ＳＥ）として製剤化することができる。
【0058】
ＥＣ製剤及びＳＬ製剤では、活性化合物は溶解した形態で存在し得るが、ＯＤ、ＳＣ、ＥＷ、又はＳＥ製剤では、活性化合物は固体又は乳化液体として存在し得る。
【0059】
本発明のアジュバントは、特にＥＣ、ＥＷ、ＳＣ、ＳＬ、ＯＤ、又はＳＥ製剤で使用されることが想定される。
【0060】
農薬濃縮物は、水性又は非水性であってもよく、対応する噴霧製剤を形成するために水（又は水性液体）で希釈されるように設計された農薬組成物である。 前記組成物には、液体形態（溶液、エマルジョン、又は分散液など）及び顆粒又は粉末などの固体形態（特に水分散性固体形態）のものが含まれる。
【0061】
噴霧製剤は、植物又はそれらの環境に適用することが望まれるすべての成分を含む水性農薬製剤です。 噴霧製剤は、所望の成分（水以外）を含む濃縮物を単純に希釈することによって、又は個々の成分を混合することによって、又は濃縮物を希釈してさらに個々の成分又は成分の混合物を添加することの組み合わせによって作製することができる。 典型的には、そのような最終用途の混合は、製剤が噴霧されるタンク内で、あるいは噴霧タンクを満たすための貯蔵タンク内で行われる。 このような混合及び混合物は、通常、タンク混合及びタンク混合物と呼ばれる。
【0062】
従って、アジュバントは、農薬活性化合物の製剤（缶内／ビルトイン製剤）に組み込むか、又は噴霧液の濃縮製剤の希釈後に添加する（タンクミックス）ことができる。 投薬ミスを回避し、農薬製品の適用中のユーザーの安全性を向上させるために、アジュバントを製剤に組み込むことが有利である。 これにより、タンクミックス製品に追加の包装材料を不必要に使用することも回避できる。
【0063】
顧客の必要に応じて、このように形成された濃縮物は、典型的には９５重量％までの農薬活性物質を含み得る。 前記濃縮物は、約０．５重量％～約１重量％の農薬活性濃度を有する希釈組成物をもたらす使用のために希釈され得る。前記希釈組成物（例えば、噴霧適用率が１０～５００ｌ/ヘクタールであり得る噴霧製剤）において、農薬活性濃度は、噴霧される全製剤の約０．００１重量％～約１重量％の範囲であり得る。
【0064】
本発明のアジュバントは、典型的には、製剤中の活性農薬の量に比例する量で使用される。 農薬製剤濃縮物では、アジュバントの割合は、液体担体中の成分の溶解度に依存する。 典型的には、そのような濃縮物中のアジュバントの濃度は、１重量％～９９重量％である。 好ましくは、１重量％～７０重量％である。 より好ましくは、３重量％～５０重量％である。
【0065】
希釈して、例えば噴霧製剤を形成する際、アジュバントは、典型的には、噴霧製剤の０．０１重量％～２重量％、より通常には０．０３重量％～０．５重量％の濃度で存在する。 さらに好ましくは、噴霧製剤の０．１２重量％～０．４重量％である。
【0066】
農薬製剤中の活性農薬に対するアジュバントの比率は、好ましくは約１：４０～約１：１である。 より好ましくは、約１：２０～約１：１である。 さらに好ましくは、約１：５～約１：１である。 この比率の範囲は、通常、製剤の濃縮形態（例えば、アジュバントが分散性液体濃縮物又は分散性固体顆粒製剤に含まれる場合）及び噴霧製剤で維持される。
【0067】
濃縮物（固体又は液体）が活性農薬及び／又はアジュバントの供給源として使用される場合、濃縮物は典型的には希釈されて噴霧製剤を形成する。 希釈は、噴霧製剤を形成するための水の濃縮物の総重量の１～１０，０００倍、特に１０～１，０００倍であり得る。
【0068】
農薬活性物質が水性最終用途製剤中に固体粒子として存在する場合、ほとんどの場合、それは主に活性農薬の粒子として存在する。
【0069】
しかしながら、必要に応じて、活性農薬は、固体担体、例えばシリカ又は珪藻土に担持することができ、これらは上記の固体担体、充填剤又は希釈剤材料であり得る。
【0070】
噴霧製剤は、典型的には、中程度の酸性（例えば、約３）～中程度のアルカリ性（例えば、約１０）までの範囲内、特に中性付近（例えば、約５～８）のｐＨを有する。 より濃縮された調合物は酸性度/アルカリ度が同程度ですが、ほとんどが非水性である可能性があるため、ｐＨは必ずしもこれの適切な尺度ではない。
【0071】
農薬製剤は、モノプロピレングリコールなどの溶媒（水以外）、噴霧油（非界面活性剤アジュバントとして噴霧製剤に含まれる油）などの植物油又は鉱物油であり得る油を、アジュバントと組み合わせて含み得る。 このような溶媒は、アジュバント用の溶媒として、及び／又は例えば特にプロピレングリコールのような湿潤剤として含めることができる。使用される場合、そのような溶媒は、典型的には、アジュバントの５重量％～５００重量％、望ましくは１０重量％～１００重量％の量で含まれる。 このような組み合わせには、塩化アンモニウム及び／又は安息香酸ナトリウムなどの塩、及び／又は特にゲル阻害助剤としての尿素も含まれ得る。
【0072】
別の実施形態によれば、本発明のアジュバント又は第６の側面による生物のいずれかを、種子に適用するのに適した種子コーティング組成物に含めることができる。 好ましくは、本発明のアジュバントは、種子コーティング組成物に含まれ得る。
【0073】
アジュバントは、種子コーティング組成物中に、組成物の総重量に基づいて、０．５～２５重量％、好ましくは２～１８重量％、より好ましくは５～１５重量％、特に８～１２重量％の範囲の濃度で適切に存在する。
【0074】
コーティングは、当技術分野で知られているように、フィルムコーティング、ペレット化、及びエンクラスティング、又はこれらの技術の組み合わせを含むことができる。 本発明は、すべての前記コーティングタイプ、好ましくはフィルムコーティングに適用されることが想定される。
【0075】
本発明の種子コーティング組成物は、従来の方法で種子に施用することができる。
【0076】
種子は、プライミングされていても、又はプライミングされていなくてもよい（発芽率を改善するための処理、例えばオスモプライミング、ハイドロプライミング、マトリックスプライミングを受けている）。
【0077】
１つの実施形態によれば、本発明の種子コーティング組成物を適用する前には、種子に人工層、例えば、ポリマーなどの結合剤を含むプライマー層を設けない。 従って、種子コーティング組成物は、好ましくは、種子の自然な外面に直接適用される。 それにもかかわらず、種子コーティング組成物を適用する前に、種子表面が表面処理を受けている可能性がある。
【0078】
好ましくは、種子コーティング組成物は、液体組成物及び／又はエマルション及び／又は分散液及び／又はラテックス組成物として適用され、その後固化（硬化及び／又は乾燥を含む）して種子コーティングを形成する。 本出願で使用される「液体コーティング組成物」という用語は、懸濁液、エマルジョン、及び／又は分散液、好ましくは分散液の形態のコーティング組成物を含むことを意味する。
【0079】
種子をコーティングするためには、従来のコーティング手段を使用することができる。 当業者は、様々なコーティング機を利用することができる。 いくつかのよく知られている技術には、ドラムコーター、流動床技術、ロータリーコーター（統合乾燥の有無にかかわらず）、噴出床の使用が含まれる。 好適には、種子コーティング組成物は、ロータリーコーター、ロータリードライコーター、パンコーター又は連続処理機によって種子に適用される。
【0080】
種子コーティング組成物は、例えば、種子コーティング組成物のフィルムコーティング、噴霧、浸漬、又はブラッシングによって適用することができる。 好ましくは、この方法は、種子コーティング組成物を塗布してフィルム又は種子コーティング層を形成することを含む。
【0081】
種子コーティングは、通常、種子の表面にしっかりと接着する透湿性コーティングを形成することを含む。 この方法は、典型的には、植え付け前に液体種子コーティング組成物を種子に適用することを含む。
【0082】
本発明のコーティング層の上に追加のフィルムコート層を任意に適用して、化粧品、被覆、有効成分、栄養分、およびより速い乾燥、シードフロー、耐久性などの加工の改善を含むがこれらに限定されない追加の利点を提供することができる。
【0083】
農薬製剤又は種子コーティング組成物はまた、必要に応じて他の成分を含んでもよい。 これらの他の成分は、以下を含むものから選択され得る：
・結合剤、特にポリビニルピロリドンのような高結合剤濃度で低粘度溶液を与えるために容易に水溶性である結合剤；ポリビニルアルコール; カルボキシメチルセルロース; アラビアガム; 砂糖、例えばスクロース又はソルビトール; スターチ; エチレン－酢酸ビニル共重合体、スクロース及びアルギン酸塩；
・希釈剤、吸収剤又は担体、例えばカーボンブラック；タルク; 珪藻土; カオリン; ステアリン酸アルミニウム、カルシウム又はマグネシウム; トリポリリン酸ナトリウム; 四ホウ酸ナトリウム; 硫酸ナトリウム; ナトリウム、アルミニウム、及び混合ナトリウム－アルミニウムケイ酸塩；及び安息香酸ナトリウム；
・界面活性剤などの崩壊剤、水で膨潤する物質、例えばカルボキシメチルセルロース、コロジオン、ポリビニルピロリドン、微結晶性セルロース膨潤剤；酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸塩又はセスキ炭酸塩、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウムなどの塩類；
・湿潤剤、例えばアルコールエトキシレート及びアルコールエトキシレート/プロポキシレート湿潤剤；
・スルホン化ナフタレンホルムアルデヒド縮合物などの分散剤、及びポリアクリル主鎖上にキャップされたポリエチレングリコール側鎖を有する櫛型コポリマーなどのアクリルコポリマー；
・アルコールエトキシレート、ＡＢＡ ブロック共重合体、ヒマシ油エトキシレートなどの乳化剤；
・消泡剤、例えば 典型的には配合物の０．００５重量％～１０重量％の量のポリシロキサン消泡剤；
・キサンタンガムなどの市販の水溶性又は混和性ガム、及び/又はカルボキシメチル、エチル又はプロピルセルロースなどのセルロース系などの粘度調整剤; 及び/又は
・有機酸などの防腐剤及び/又は抗菌剤、又はそれらのエステルまたはアスコルビン酸などの塩、例えばパルミチン酸アスコルビル、ソルビン、例えばソルビン酸カリウム、安息香酸、例えば安息香酸及び４－ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、プロピオン酸、例えばプロピオン酸ナトリウム、フェノール、例えば２－フェニルフェナートナトリウム；１，２－ベンゾイソチアゾリン－３－オン; 例えば、又はホルムアルデヒド自体又はパラホルムアルデヒド; 又は亜硫酸及びその塩などの無機物質、典型的には製剤の０．０１重量％～１重量％の量で存在する。
・結合剤、特にポリビニルピロリドンのような高結合剤濃度で低粘度溶液を与えるために容易に水溶性である結合剤；ポリビニルアルコール; カルボキシメチルセルロース; アラビアガム; 砂糖、例えばスクロース又はソルビトール; スターチ; エチレン－酢酸ビニル共重合体、スクロース及びアルギン酸塩；
・希釈剤、吸収剤又は担体、例えばカーボンブラック；タルク; 珪藻土; カオリン; ステアリン酸アルミニウム、カルシウム又はマグネシウム; トリポリリン酸ナトリウム; 四ホウ酸ナトリウム; 硫酸ナトリウム; ナトリウム、アルミニウム、及び混合ナトリウム－アルミニウムケイ酸塩；及び安息香酸ナトリウム；
・界面活性剤などの崩壊剤、水で膨潤する物質、例えばカルボキシメチルセルロース、コロジオン、ポリビニルピロリドン、微結晶性セルロース膨潤剤；酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸塩又はセスキ炭酸塩、硫酸アンモニウム、リン酸水素二カリウムなどの塩類；
・湿潤剤、例えばアルコールエトキシレート及びアルコールエトキシレート/プロポキシレート湿潤剤；
・スルホン化ナフタレンホルムアルデヒド縮合物などの分散剤、及びポリアクリル主鎖上にキャップされたポリエチレングリコール側鎖を有する櫛型コポリマーなどのアクリルコポリマー；
・アルコールエトキシレート、ＡＢＡ ブロック共重合体、ヒマシ油エトキシレートなどの乳化剤；
・消泡剤、例えば 典型的には配合物の０．００５重量％～１０重量％の量のポリシロキサン消泡剤；
・キサンタンガムなどの市販の水溶性又は混和性ガム、及び/又はカルボキシメチル、エチル又はプロピルセルロースなどのセルロース系などの粘度調整剤; 及び/又は
・有機酸などの防腐剤及び/又は抗菌剤、又はそれらのエステルまたはアスコルビン酸などの塩、例えばパルミチン酸アスコルビル、ソルビン、例えばソルビン酸カリウム、安息香酸、例えば安息香酸及び４－ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、プロピオン酸、例えばプロピオン酸ナトリウム、フェノール、例えば２－フェニルフェナートナトリウム；１，２－ベンゾイソチアゾリン－３－オン; 例えば、又はホルムアルデヒド自体又はパラホルムアルデヒド; 又は亜硫酸及びその塩などの無機物質、典型的には製剤の０．０１重量％～１重量％の量で存在する。
【0084】
本発明による農薬製剤又は種子コーティング組成物はまた、乳化剤系の一部を形成する界面活性剤材料などの成分を含んでもよい。 前記界面活性剤には、界面活性剤分散剤が含まれ得る。
【0085】
界面活性剤アジュバントなど、本発明の範囲内にない他のアジュバントを、本発明の組成物および製剤に含めて、本発明で使用することができる。例としては、以下のものを含む：アルキル多糖類（より正確にはアルキルオリゴ糖と呼ばれる）; 脂肪アミンエトキシレート、例えばココナッツアルキルアミン２ＥＯ； 及び無水アルキル（アルケニル）コハク酸の誘導体、特にＰＣＴ出願ＷＯ９４／００５０８号及びＷＯ９６／１６９３０号に記載されているもの。
【0086】
製剤／組成物は、１つ又は複数の生物学的に活性な成分（植物増強剤、特に植物保護製品（ＰＰＰとも呼ばれる）を含む）を含むことができる。 活性成分、特に植物増強剤の適切な例は、殺菌剤、殺菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、生物製剤、殺ダニ剤または殺ダニ剤、殺虫剤、及び殺生物剤である。さらに考えられる活性成分には、消毒剤、微生物、殺鼠剤、除草剤（除草剤）、誘引剤、（鳥）忌避剤、植物成長調整剤（ジベレリン酸、オーキシン又はサイトカイニンなど）、栄養素（硝酸カリウム、硫酸マグネシウムなど）、鉄キレート）、植物ホルモン、ミネラル、植物エキス、発芽促進剤、フェロモン、生物学的製剤などが含まれる。
【0087】
本発明による製剤又は種子コーティング組成物で使用するのに適した農薬活性物質は、室温で固体又は液体であり得る全ての農薬活性化合物である。 本発明のアジュバントは、あらゆる種類の農薬活性物質に広く適用できると考えられる。
【0088】
農薬活性物質とは、本発明の文脈において、植物保護剤である殺生物剤、より具体的には、医学、農業、林業、及び蚊の防除などの分野で使用されるさまざまな形態の生物を殺すことができる化学物質を指す。 また、殺生物剤のグループに数えられるのは、いわゆる植物成長調整剤である。
【0089】
本発明の農薬製剤又は種子コーティング組成物で使用するための殺生物剤は、典型的には以下の２つのサブグループに分けられる：
・殺菌剤、除草剤、殺虫剤、殺藻剤、軟体動物駆除剤、殺ダニ剤、殺鼠剤を含む殺虫剤、及び
・殺菌剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗寄生虫剤を含む抗菌剤。
・殺菌剤、除草剤、殺虫剤、殺藻剤、軟体動物駆除剤、殺ダニ剤、殺鼠剤を含む殺虫剤、及び
・殺菌剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗寄生虫剤を含む抗菌剤。
【0090】
特に、殺虫剤、殺菌剤、又は除草剤から選択される殺生物剤が特に好ましい場合がある。
【0091】
「殺虫剤」という用語は、害虫を予防、破壊、忌避、または軽減することを目的とした物質または物質の混合物を指すと理解される。殺虫剤は、昆虫、植物病原体、雑草、軟体動物、鳥、哺乳類、魚、線虫 (回虫) 及び食物をめぐって人間と競合し、財産を破壊し、病気を蔓延させたり、迷惑をかけたりする微生物を含む害虫に対して使用される化学物質又は生物剤（ウイルスやバクテリアなど）である場合がある。以下の実施例では、本発明による農薬組成物に適した殺虫剤が示されている。
【0092】
殺菌剤は、真菌の化学的制御である。 殺菌剤は、庭や作物の菌類の拡散を防ぐために使用される化合物です。 殺菌剤は、真菌感染症と戦うためにも使用される。 殺菌剤は、接触型又は全身型のいずれかである。 接触殺菌剤は、葉の表面に保持された殺菌剤と接触すると、カビを殺す。 浸透性殺菌剤は植物組織に吸収され、宿主に侵入しようとすると真菌を殺す。
【0093】
本発明による適切な殺菌剤の例は、以下の種類を包含する：(３－エトキシプロピル)臭化水銀、２－メトキシエチル塩化水銀、２－フェニルフェノール、硫酸８－ヒドロキシキノリン、オキシキノリン８－フェニル水銀、アシベンゾラール、アシルアミノ酸系殺菌剤、アシペタック、アルジモルフ、脂肪族窒素系殺菌剤、アリルアルコール、アミド系殺菌剤、アンプルホス、アニラジン 、アニリド殺菌剤、抗生物質殺菌剤、芳香族殺菌剤、オーレオファンギン、アザコナゾール、アジチラム、アゾキシストロビン、ポリ硫化バリウム、ベナラキシル－Ｍ、ベノダニル、ベノミル、ベンキノックス、ベンタルロン、ベンチアバリカルブ、塩化ベンザルコニウム、ベンザマクリル、ベンズアミド系殺菌剤、ベンザモルフ、ベンズアニリド系殺菌剤、ベンズイミダゾール系殺菌剤、ベンズイミダゾール前駆体系殺菌剤、ベンズイミダゾリルカルバメート系殺菌剤、ベンゾヒドロキサム酸、ベンゾチアゾール系殺菌剤、ベトキサジン、ビナパクリル、ビフェニル、ビテルタノール、ボルチジオーキシオン 混合物、ボスカリド、架橋ジフェニル殺菌剤、ブロムコナゾール、ブピリメート、ブルゴーニュ混合物、ブチオベート、ブチルアミン、ポリスルフィドカルシウム、キャプタフォール、キャプタン、カルバメート系殺菌剤、カルバモルフ、カルバニレート系殺菌剤、カルベンダジム、カルボキシン、カルプロパミド、カルボン、チェシャント混合物、キノメチオネート、クロベンチアゾン、クロラニホルメタン、クロラニル、クロルフェナゾール、クロロジニトロナフタレン、クロロネブ 、クロロピクリン、クロロタロニル、クロルキノックス、クロゾリネート、シクロピロックス、クリンバゾール、クロトリマゾール、コナゾール殺菌剤、コナゾール殺菌剤（イミダゾール）、コナゾール殺菌剤（トリアゾール）、酢酸銅（II）、炭酸銅（II）、塩基性、銅殺菌剤、水酸化銅、ナフテン酸銅、オレイン酸銅、銅 オキシ塩化物、硫酸銅(II)、硫酸銅、塩基性クロム酸亜鉛銅、クレゾール、クフラネブ、キュプロバン、酸化第一銅、シアゾファミド、シクラフラミド、環状ジチオカルバメート殺菌剤、シクロヘキシミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シペンダゾール、シプロコナゾール、シプロジニル、ダゾメット、ＤＢＣＰ、デバカルブ、デカフェンチン、デヒドロ酢酸、ジカルボキシイミド殺菌剤、ジクロフルアニド、ジクロン、ジクロロフェン、ジクロロフェニル、ジカルボキシイミド系殺菌剤、ジクロゾリン、ジクロブトラゾール、ジクロシメット、ジクロメジン、ジクロラン、ジエトフェンカルブ、ピロ炭酸ジエチル、ジフェノコナゾール、ジフルメトリム、ジメチリモール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニトロフェノール系殺菌剤、ジノブトン、ジノカプ、ジノクトン、ジノペントン、ジノスルホン、ジノテルボン、ジフェニルアミン、ジピリチオン、ジスルフィラム、ジタリムホス、ジチアノン、ジチオカルバメート殺菌剤、ＤＮＯＣ、ドデモルフ、ドジシン、ドジン、ドナトジン、ドラゾキソロン、エジフェンホス、エポキシコナゾール、エタコナゾール、エテム、エタボキサム、エチリモール、エトキシキン、エチル水銀 ２，３－ジヒドロキシプロピルメルカプチド、酢酸エチル水銀、臭化エチル水銀、塩化エチル水銀、リン酸エチル水銀、エトリジアゾール、ファモキサドン、フェナミドン、フェナミドン、フェナミノサルフ、フェナパニル、フェナリモール、フェンブコナゾール、フェンフラム、フェンヘキサミド、フェニトロパン、フェノキサニル、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フェンチン、フェルバム、フェリムゾン、フルアジナム、フルジオキソニル、フルメトオーバー、フルオピコリド、フルオロイミド、フルトリマゾール、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルシラゾール、 フルスルファミド、フルトラニル、フルトリアフォール、フォルペット、ホルムアルデヒド、ホセチル、フベリダゾール、フララキシル、フラメトピル、フラミド系殺菌剤、フラニリド系殺菌剤、フルカルバニル、フルコナゾール、フルコナゾールシス、フルフラール、フルメシクロクス、フロファネート、グリオジン、グリセオフルビン、グアザチン、ハラクリネート、ヘキサクロロベンゼン、ヘキサクロロブタジエン、ヘキサクロロフェン、ヘキサコナゾール、ヘキシルチオホス、ヒドラルガフェン、ヒメキサゾール、イムフナザリル、イミベンコナゾール、イミダゾール 、イミノクタジン、無機殺菌剤、無機水銀殺菌剤、ヨードメタン、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソプロチオラン、イソバレジオン、カスガマイシン、クレソキシムメチル、石灰硫黄、マン銅、マンゼブ、マネブ、メベニル、メカルビンジド、メパニピリム、メプロニル、塩化第二水銀、酸化第二水銀、塩化第二水銀、殺菌剤、メタラキシル 、メタラキシル-M、メタム、メタゾキソロン、メトコナゾール、メタスルホカルブ、メトフロキサム、臭化メチル、イソチオシアン酸メチル、安息香酸メチル水銀、メチル水銀ジシアンジアミド、メチル水銀ペンタクロロフェノキシド、メチラム、メトミノストロビン、メトラフェノン、メトスルフォバックス、ミルネブ、モルホリン系殺菌剤、ミクロブタニル、ミクロゾリン、N-(エチル水銀)-p-トルエンスルホンアニリド、ナバム、ナタマイシン、ニトロスチレン、ニトロタール－イソプロピル、ヌアリモール、ＯＣＨ、オクチリノン、オフレース、有機水銀系殺菌剤、有機リン系殺菌剤、有機スズ系殺菌剤、オリサストロビン、オキサジキシル、オキサチイン系殺菌剤、オキサゾール系殺菌剤、オキシン銅、オキシポコナゾール、オキシカルボキシン、ペフラゾエート、ペンコナゾール、ペンシクロン、ペンタクロロフェノール、ペンチオピラド、フェニル水銀尿素、酢酸フェニル水銀、塩化フェニル水銀、ピロカテコールのフェニル水銀誘導体、硝酸フェニル水銀、サリチル酸フェニル水銀、フェニルスルファミド系殺菌剤、ホスジフェン、フタリド、フタルイミド系殺菌剤、ピコキシストロビン、ピペラリン、ポリカルバメート、高分子ジチオカルバメート系殺菌剤、ポリオキシン、ポリオキソリム、ポリスルフィド殺菌剤、アジ化カリウム、ポリスルフィドカリウム、チオシアン酸カリウム、プロベナゾール、プロクロラズ、プロシミドン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオカルブ、プロチオコナゾール、ピラカルボリド、ピラクロストロビン、ピラゾール殺菌剤、ピラゾホス、ピリジン殺菌剤、ピリジニトリル、ピリフェノクス、ピリメタニル、ピリミジン殺菌剤、ピロキロン、ピロキシクロル、ピロキシフィル、ピロール系殺菌剤、キナセトール、キナザミド、キンコナゾール、キノリン系殺菌剤、キノン系殺菌剤、キノキサリン系殺菌剤、キノキシフェン、キントゼン、ラベンザゾール、サリチルアニリド、シルチオファム、シメコナゾール、アジ化ナトリウム、オルトフェニルフェノキシドナトリウム、ペンタクロロフェノキシドナトリウム、ポリサルファイドナトリウム、ポリサルファイドナトリウム、 ストレプトマイシン、ストロビルリン殺菌剤、スルホンアニリド系殺菌剤、硫黄、スルトロペン、ＴＣＭＴＢ、テブコナゾール、テクロフタラム、テクナゼン、テコラム、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チアジアフルオロ、チアゾール系殺菌剤、チチョフェン、チフルザミド、チオカルバメート系殺菌剤、チオクロルフェンフィム、チオメルサール、チオファネート、チオファネートメチル、チオフェンチオキノクス、チオフェン系殺菌剤、チオキノックス、チラム、チアジニル、チオキシミド、チベド、トルクロホスメチル、トルナフテート、トリルフルアニド、酢酸トリル水銀、トリアジメフォン、トリアジメノール、トリアミホス、トリアモール、トリアズブチル、トリアジン系殺菌剤、トリアゾール系殺菌剤、トリアゾキシド、酸化トリブチルスズ、トリクラミド、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、トリフルミゾール、トリフォリン、トリチコナゾール、未分類殺菌剤、ウンデシレン酸、ウニコナゾール、尿素系殺菌剤、バリダマイシン、バリナミド 殺菌剤、ビンクロゾリン、ザリラミド、ナフテン酸亜鉛、ジネブ、ジラム、ゾキサミド、及びそれらの混合物。
【0094】
除草剤は、不要な植物を殺すために使用される農薬です。 選択的除草剤は、目的の作物を比較的無害のままにして、特定の標的を殺す。 これらのいくつかは、雑草の成長を妨げることによって作用し、多くの場合、植物ホルモンに基づいている。 荒れ地をきれいにするために使用される除草剤は非選択的であり、それらが接触する全ての植物材料を殺す。 除草剤は、農業や造園芝管理で広く使用されている。 これらは、高速道路や鉄道の維持のための総合植生管理 (ＴＶＣ) プログラムに適用されル。 森林、放牧システム、及び野生生物の生息地として確保された地域の管理には、少量が使用されル。
【0095】
適切な除草剤は、以下を含む群から選択され得る：アリールオキシカルボン酸、例えば、ＭＣＰＡ、アリールオキシフェノキシプロピオン酸、例えば、クロジナホップ、シクロヘキサンジオンオキシム、例えば、セトキシジム、ヒドロキシベンゾニトリル、例えば、ブロモキシニル、スルホニルウレア、例えば、ニコスルフロン、トリアゾロピリミジン、例えば、ペノクススラム、トリケチオン、例えば、メソメトリオン、トリアジン、アトリジン除草剤など； クロルスルフロンなどのスルホニル尿素除草剤； レナシル、ブロマシル、テルバシルなどのウラシル; リニュロン、ジウロン、シデュロン、またはネブロンなどの尿素除草剤; アラクロール、またはメトラクロールなどのアセトアニリド除草剤; ベンチオカルブ、トリアレートなどのチオカルバメート系除草剤； オキサジアゾンなどのオキサジアゾロン除草剤； イソキサゾリドン除草剤、フェノキシ酢酸; フルアジホップ、アシフルオルフェン、ビフェノックス、またはオキシフルオルフェンなどのジフェニルエーテル除草剤； トリフルラリンなどのジニトロアニリン除草剤; グルホシネート塩及びエステルならびにグリホセート塩及びエステルなどの有機ホスホネート除草剤； 及び／又はブロモキシニルまたはイオキシニルなどのジハロベンゾニトリル除草剤、安息香酸除草剤、パラコートなどのジピリジリウム除草剤； 及びクロマゾン、カルフェントラゾン、サフルフェナシル、ピロキサスルフォンなどの他の除草剤。
【0096】
特に好ましい除草剤は、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、アトラジン、安息香酸としてのジカンバ、グリホセート、グルホシネート、イミダゾリノンとしてのイマザピック、クロロアセトアミドとしてのメトラクロール、ピリジンカルボン酸又は合成オーキシンとしてのピクロラム、クロピラリド、及びトリクロピル、それらのそれぞれの水溶性塩及びエステル、並びにそれらの混合物から選択され得る。
【0097】
殺虫剤は、あらゆる発生形態の昆虫に対して使用される殺虫剤であり、昆虫の卵と幼虫に対して使用される殺卵剤と幼虫剤が含まれる。 殺虫剤は、農業、医療、産業、家庭で使用されている。
【0098】
適切な殺虫剤は、以下から選択されるものを含み得る：塩素化殺虫剤、例えばカンフェクロール、ＤＤＴ、ヘキサクロロシクロヘキサン、γ－ヘキサクロロシクロヘキサン、メトキシクロール、ペンタクロロフェノール、ＴＤＥ、アルドリン、クロルデン、クロルデコン、ディルドリン、エンドスルファン、エンドリン、ヘプタクロール、マイレックス、及びそれらの混合物；有機リン化合物、例えばアセフェート、アジンホスメチル、ベンスリド、クロレトキシホス、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、ダイアジノン、ジクロルボス（ＤＤＶＰ）、ジクロトホス、ジメトエート、ジスルフォトン、エトプロップ、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、フォスチアゼート、マラチオン、メタミドホス、メチダチオン、メチルパラチオン、メビンホス、ナレド、オメトエート、オキシデメトンメチル、パラチオン、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホステブピリム、リミホスメチル、プロフェノホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、トリブホス、トリクロルフォン及びそれらの混合物; カーバメート、例えばアルジカルブ、カルボフラン、カルバリル、メトミル、２－（１－メチルプロピル)フェニル メチルカルバメート及びそれらの混合物; ピレスロイド、例えばアレスリン、ビフェントリン、デルタメトリン、ペルメトリン、レスメトリン、スミトリン、テトラメトリン、トラロメトリン、トランスフルトリン及びそれらの混合物; 植物毒素由来化合物、例えばデリス（ロテノン）、除虫菊、ニーム（アザディラクチン）、ニコチン、カフェイン及びそれらの混合物；ネオニコチノイド、例えばイミダクロプリド; アバメクチン、例えばエママクチン; オキサジアジン、例えばインドキサカルブ; 及び/又はアントラニルジアミド、例えばリナキシピル。
【0099】
殺ダニ剤は、ダニを殺す殺虫剤である。 抗生物質殺ダニ剤、カーバメート殺ダニ剤、ホルムアミジン殺ダニ剤、ダニ成長調整剤、有機塩素、ペルメトリン及び有機リン酸殺ダニ剤は全てこのカテゴリーに属する。 軟体動物駆除剤は、ガ、ナメクジ、カタツムリなどの軟体動物を防除するために使用される殺虫剤である。 これらの物質には、メタアルデヒド、メチオカルブ、硫酸アルミニウムが含まれる。 殺線虫剤は、寄生線虫 (ワームの門) を殺すために使用される化学殺虫剤の一種です。
【0100】
最も好ましくは、本発明の農薬製剤又は種子コーティング組成物中に存在する活性物質は、トリアゾール殺菌剤、ストロビルリン殺菌剤、又はそれらの組み合わせから選択される。 特に、テブコナゾール、フルトリアフォール、カルベンダジム、アゾキシストロビン、クレソキシムメチル、シプロコナゾール、又はピラクロストロビンである。
【0101】
栄養素は、農薬活性物質に加えて、又はその代替として存在し得る。 そのような製剤／組成物において、栄養素は典型的には乾燥形態である。
【0102】
栄養素は、固相栄養素であることが好ましい。 固形栄養素は、本発明において、融点が２０℃を超える（標準圧で）物質を意味すると理解されるべきである。 固形栄養素には、不溶性栄養成分、すなわち添加後の濃縮物中にかなりの固形分が存在するような水への溶解度を有する栄養成分も含まれる。
【0103】
栄養素とは、植物の成長を促進又は改善するために望まれる、又は必要な化学元素および化合物を指す。 適切な栄養素は、一般的に多量栄養素又は微量栄養素と呼ばれる。 本発明による濃縮物で使用するのに適した栄養素は、すべての栄養化合物である。
【0104】
微量栄養素は通常、微量金属又は微量元素を指し、低用量で適用されることがよくある。 適切な微量栄養素には、亜鉛、ホウ素、塩素、銅、鉄、モリブデン、及びマンガンから選択される微量元素が含まれる。 微量栄養素は、可溶性形態であっても不溶性固体として含まれていてもよく、塩又はキレート化されていてもよい。
【0105】
多量栄養素は、通常、窒素、リン、及びカリウムを含むものを指し、硫酸アンモニウムや水質調整剤などの肥料が含まれる。 適切な多量栄養素には、肥料及び他の窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄含有化合物、及び水調整剤が含まれる。
【0106】
適切な肥料には、窒素、リン、カリウム、又は硫黄などの栄養素を提供する無機肥料が含まれる。 肥料は、比較的低濃度で、又はより濃縮された溶液として希釈製剤に含めることができ、非常に高レベルでは固形肥料及び溶液を含むことができる。
【0107】
栄養素の含有は特定の栄養素に依存し、微量栄養素は典型的には低濃度で含まれ、多量栄養素は典型的には高濃度で含まれると考えられる。
【0108】
生物刺激剤成分を製剤又は種子コーティング組成物に添加して、作物の成長を促進することができる。 生体刺激剤成分は、１つ又は複数の生体刺激剤を含むか、又はそれからなり得る。
【0109】
有用な生体刺激剤の例には、植物成長ホルモン及び植物成長調節因子、例えばサイトカイニン、オーキシン、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸が含まれるが、これらに限定されない。 他の生体刺激剤には、タンパク質加水分解物誘導体、海藻抽出物、アミノ酸、植物抽出物、キトサン誘導体、生体高分子、無機化合物、腐植物質、微生物接種材料および微生物産物、又はそれらの混合物が含まれる。
【0110】
本発明のアジュバントは、それが含まれる農薬製剤にアジュバンシーを提供し、特に、殺菌剤アジュバントを提供する用途を見出すことができる。
【0111】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」又は「アジュバンシー」という用語は、農薬製剤に添加された場合に農薬の所望の効果を改善する化合物を指す。 アジュバントは、活性物質の性能を改善することによって、希釈剤、混合物、活性物質、又は標的に影響を与える可能性がある。 アジュバントは、殺虫剤が機能する領域に殺虫剤を付着させる、殺虫剤の侵入を可能にする葉表面の表皮層を変更する、及び/又は農薬製剤中の活性殺虫剤に対して標的害虫を感作させるために使用できる。
【0112】
特定のアジュバンシー効果は、以下を含むことができる：界面活性剤、乳化剤（分散剤および懸濁剤）、油、乳化性油、相溶化剤、緩衝剤および調整剤、消泡剤、沈着剤、ドリフト制御剤、増粘剤、展着剤（湿潤剤）、ステッカー（ビルダーおよび増量剤）、植物浸透剤、 トランスロケーター、土壌浸透剤、安定剤 (ＵＶ フィルター)、及び/又は活性農薬に対する害虫の感作。
【0113】
好ましくは、本発明のアジュバントは、タンク添加使用のために調合された、又は殺虫剤濃縮物に直接調合されたアジュバントにおける唯一の成分又は主な機能剤としての用途を見出すことができる。
【0114】
Ｂ．シネレアに対する殺菌剤単独(例えば、ピラクロストロビン)の活性に関するアジュバント活性の尺度として、パーセント阻害(アジュバント及び殺菌剤)をパーセント阻害(殺菌剤)で割った値を定義することができ、より高い値が望ましい。従って、値 １ は殺菌剤単独とアジュバント/殺菌剤の組み合わせの活性が等しいことを表し、1 を超える値は殺菌剤単独よりもアジュバント/殺菌剤の組み合わせの活性が高いことを表す。本発明の活性は、１より大きい値を有し得る。好ましくは１．５より大きい、最も好ましくは２より大きい。
【0115】
本明細書に記載された全ての特徴は、任意の組み合わせで、上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【実施例】
【0116】
実施例
本発明をより容易に理解できるようにするために、例として以下の説明を参照する。
本発明をより容易に理解できるようにするために、例として以下の説明を参照する。
【0117】
記載されている全ての試験及び物理的特性は、本明細書に別段の記載がない限り、又は参照されている試験方法及び手順に別段の記載がない限り、大気圧及び室温（すなわち、２０～２５℃）で測定されたものであることが理解される。
【0118】
生成及び抽出
真菌メタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８の培養抽出物のバイオアッセイ誘導分画により、ジケトピペラジンを分離した。分離株 ＲＫＤＯ５７８ を ＹＭ 寒天培地 （ｗ／ｖ: 1％ 麦芽エキス、０．２％ 酵母エキス、1％ グルコース、2％ 寒天) で培養し、２２℃で１４日間インキュベートした。８個のコロニー外植体 (約３ｍｍ３) を使用して、無菌の ５０ｍＬ 試験管内の １５ｍＬの ＹＭ ブイヨン (ｗ／ｖ: １％ 麦芽エキス、０．２％ 酵母エキス、１％ グルコース) に接種し、そして２００ＲＰＭ、２２℃で５日間振盪して種菌を作成した。種培養物を使用して、エルレンマイヤーフラスコに含まれる発酵培地 (ｗ／ｖ: １５％スクロース、２％ 酵母エキス、０．０５％ 硫酸マグネシウム七水和物、及び １％ Ｌ－ロイシン) に接種した。
真菌メタリジウム・カルネウムＲＫＤＯ５７８の培養抽出物のバイオアッセイ誘導分画により、ジケトピペラジンを分離した。分離株 ＲＫＤＯ５７８ を ＹＭ 寒天培地 （ｗ／ｖ: 1％ 麦芽エキス、０．２％ 酵母エキス、1％ グルコース、2％ 寒天) で培養し、２２℃で１４日間インキュベートした。８個のコロニー外植体 (約３ｍｍ３) を使用して、無菌の ５０ｍＬ 試験管内の １５ｍＬの ＹＭ ブイヨン (ｗ／ｖ: １％ 麦芽エキス、０．２％ 酵母エキス、１％ グルコース) に接種し、そして２００ＲＰＭ、２２℃で５日間振盪して種菌を作成した。種培養物を使用して、エルレンマイヤーフラスコに含まれる発酵培地 (ｗ／ｖ: １５％スクロース、２％ 酵母エキス、０．０５％ 硫酸マグネシウム七水和物、及び １％ Ｌ－ロイシン) に接種した。
【0119】
２２℃で２１日間放置した後、発酵物を１倍容量の酢酸エチルで抽出し、１７５ＲＰＭ で６０分間振盪した。 Ｗｈａｔｍａｎ ＃３濾紙を通して濾過することによって抽出物を清澄化し、化学的精製の前に溶媒を真空中で除去した。
【0120】
ＲＫＤＯ５７８ 発酵抽出物を、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｎｅｘｔｇｅｎ ３００＋ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）で２０ 分間にわたって １０％ ＣＨ３ＯＨ：９０％ Ｈ２Ｏ から １００％ ＣＨ３ＯＨ への勾配を使用して、Ｓｉｌｉａｓｅｐ Ｃ１８ フラッシュ カートリッジ (４３ ｇ Ｃ－１８) で分画した。 画分を、ＳＥＤＥＸ ８０ＬＴ ＥＬＳＤ 及び サーモフォトダイオードアレイ (ＰＤＡ) 検出器を備えた Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ エレクトロ スプレー質量分析計 (ＥＳＩ－ＭＳ) と組み合わせた Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣ で分析した。ジケトピペラジンを含む画分を、蒸発光散乱検出器 (Ｗａｔｅｒｓ ２４２４) 及び質量分析計 (Ｗａｔｅｒｓ ３１００) を備えた Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ システムで逆相 Ｃ－１８ＨＰＬＣ (Ｋｉｎｅｔｅｘ ５ μｍ Ｃ１８ カラム、１０ｘ２５０ｍｍ) を使用して精製した。 ジケトピペラジンの最初の精製は、５５％ ＣＨ３ＣＮ 水溶液を ３ｍＬ/分 の流速で定組成溶離して行った。
【0121】
ジケトピペラジンの構造は、質量分析と NMR 分析を組み合わせることによって解明された。 ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ及び１３Ｃについてそれぞれ４００及び１５０ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計で記録した。 スペクトルは、重水素化されていない残りの溶媒ピークを参照した。
【0122】
代謝物のＮＭＲ分析は、文献データと一致し、構造がジケトピペラジン (Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ及びＩｄ) であることを確認した。
【0123】
アジュバンシーの例
パラメータ「パーセント阻害」及び「倍数変化」は、以下のように計算されると理解される；
パーセント阻害 －パーセント阻害は、ビヒクル処理対照と比較して、２２℃で４８時間のインキュベーション後に微生物の目に見える増殖を阻害する殺菌剤及び/又はアジュバントの量を表すと理解される。 これは、次の式を使用して計算される：
[(oeＣ－oeＴ) / oeＣ]ｘ１００％
ここで
oeＣ = ビヒクルを添加した寒天上で増殖したコロニーの直径 (すなわち、ビヒクル処理された対照)、及び
oeＴ = 適切なビヒクル (水 、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＳＯ などの溶媒) に配合された殺菌剤及び/又はアジュバントを添加した寒天上で生育したコロニーの直径。
パラメータ「パーセント阻害」及び「倍数変化」は、以下のように計算されると理解される；
パーセント阻害 －パーセント阻害は、ビヒクル処理対照と比較して、２２℃で４８時間のインキュベーション後に微生物の目に見える増殖を阻害する殺菌剤及び/又はアジュバントの量を表すと理解される。 これは、次の式を使用して計算される：
[(oeＣ－oeＴ) / oeＣ]ｘ１００％
ここで
oeＣ = ビヒクルを添加した寒天上で増殖したコロニーの直径 (すなわち、ビヒクル処理された対照)、及び
oeＴ = 適切なビヒクル (水 、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＳＯ などの溶媒) に配合された殺菌剤及び/又はアジュバントを添加した寒天上で生育したコロニーの直径。
【0124】
倍率変化－倍率変化は、殺菌剤単独と比較した、微生物の阻害におけるアジュバント/殺菌剤の組み合わせの尺度である。 これは、殺菌剤単独と比較してアジュバントがどのように機能するかを示している。これは、次の式を使用して計算される：
ＩＮＨＡＦ/ＩＮＨＦ
ここで
ＩＮＨＡＦ＝ 殺菌剤及びアジュバントで処理した場合の真菌増殖の阻害率、及び
ＩＮＨＦ＝ 殺菌剤単独で処理した場合の真菌増殖の阻害率。
ＩＮＨＡＦ/ＩＮＨＦ
ここで
ＩＮＨＡＦ＝ 殺菌剤及びアジュバントで処理した場合の真菌増殖の阻害率、及び
ＩＮＨＦ＝ 殺菌剤単独で処理した場合の真菌増殖の阻害率。
【0125】
例－アジュバンシー
ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea ）(ＡＴＣＣ ９０４７９) をディフコ ポテト デキストロース寒天 (ＰＤＡ) で ７日間、日周 ＵＶ サイクル (１２ 時間の ＵＶ ライトと１２時間のダーク) で培養した。 胞子を緩衝滅菌生理食塩水 (ｗ／ｖ： １％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ を含む ０．９％ ＮａＣｌ) で採取し、血球計を使用して計数した。 胞子懸濁液を ８．５ｘ１０６ 胞子/ｍＬ の最終濃度に調整して、標準化された接種材料を作成した。
ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea ）(ＡＴＣＣ ９０４７９) をディフコ ポテト デキストロース寒天 (ＰＤＡ) で ７日間、日周 ＵＶ サイクル (１２ 時間の ＵＶ ライトと１２時間のダーク) で培養した。 胞子を緩衝滅菌生理食塩水 (ｗ／ｖ： １％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ を含む ０．９％ ＮａＣｌ) で採取し、血球計を使用して計数した。 胞子懸濁液を ８．５ｘ１０６ 胞子/ｍＬ の最終濃度に調整して、標準化された接種材料を作成した。
【0126】
アジュバント試験用の菌糸断片を調製するために、８．５ｘ１０４ 個の胞子を使用して、１５０ｘ２５ｍｍチューブ内のディフコ ポテト デキストロースブイヨン１０ ｍＬ に接種した。 チューブを２２０ＲＰＭ、２２℃で４８時間インキュベートした。培養物から菌糸断片を作成するために、培養物を直径 ５ ｍｍ の滅菌ガラス ビーズ約 ２０ 個を含む ５０ ｍＬ のプラスチック製円錐チューブに移し、５分間ボルテックスした。 ボルテックスした後、チューブを５分間放置して大きな菌糸塊を沈降させ、次に菌糸断片を含む最上層を取り除き、成長阻害アッセイの接種材料として使用した。
【0127】
殺菌剤とアジュバントをメタノールに溶解し、融解した ＰＤＡ (約 ５０℃) に加え、寒天を１２ウェル マルチウェル プレートのウェルに分配した (１ｍＬ/ウェル)。 プレートを室温まで冷却し、１０μＬ の菌糸接種物を各ウェルの中央に加えた。プレートを ２２℃ で ４８ 時間インキュベートした後、デジタルノギスを使用してコロニーの直径を測定した。 生物学的増殖制御は菌糸とビヒクル (０．０７％ メタノール) で構成され、陰性対照は培地とビヒクル (０．０７％ メタノール) であった。
【0128】
本発明のアジュバント活性物質の結果を表１及び２に示す。試験した各化合物、特に、０．０３μｇ／ｍＬ でピラクロストロビン単独と比較して、殺菌活性が ３．３１ 倍及び３．１４ 倍増加したことを示したジケトピペラジンＩａ及びジケトピペラジンＩｃについて、Ｂ．シネレアに対するピラクロストロビンによるアジュバント活性が観察された。ジケトピペラジンＩａは、０．１９μｇ／ｍＬでテブコナゾール単独と比較して、４．３９ 倍の殺菌活性の増加を示した。 ジケトピペラジン (Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ ＆ Ｉｄ) は、試験した濃度のいずれにおいても、固有の殺菌活性を単独では示さなかった。
【0129】
【表1】
【0130】
【表2】
【0131】
殺真菌活性に対するアジュバントの効果は、成長阻害の倍増として表される。 値 １ は、殺菌活性が増加していないことを示す。１未満の値は殺菌活性の低下を示し、１より大きい値は殺菌活性の増加を示す。
【0132】
例 － 細胞毒性
ジケトピペラジンの細胞毒性を、アフリカミドリザルのベロ腎細胞 (ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１) に対してインビトロで評価した。 細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清 (ＶＷＲ)、１００ μＵ ペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加した１５ｍＬのイーグル最小必須培地 (Ｓｉｇｍａ) で、Ｔ７５ｃｍ２ 細胞培養フラスコで培養した。 細胞を ５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で ２４時間インキュベートした。 培地は ２ ～ ３ 日ごとに新しくし、細胞は８０％ の集密度を超えないようにした。
ジケトピペラジンの細胞毒性を、アフリカミドリザルのベロ腎細胞 (ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１) に対してインビトロで評価した。 細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清 (ＶＷＲ)、１００ μＵ ペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加した１５ｍＬのイーグル最小必須培地 (Ｓｉｇｍａ) で、Ｔ７５ｃｍ２ 細胞培養フラスコで培養した。 細胞を ５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で ２４時間インキュベートした。 培地は ２ ～ ３ 日ごとに新しくし、細胞は８０％ の集密度を超えないようにした。
【0133】
集密度８０％で、細胞を計数し、希釈し、９０μＬの増殖培地中、ウェル当たり１０，０００細胞の細胞密度で、９６ウェル平底細胞培養プレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ)にプレートした。 プレートを ３７℃、５％ＣＯ２ の加湿雰囲気で ２４時間インキュベートし、処理前に細胞をプレートに接着させた。２４時間後、アジュバントを ＤＭＳＯ に可溶化し、段階希釈して、１μｇ／ｍＬ～１２８μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度でウェルに添加した。 ＤＭＳＯは、ウェル内で1％の最終濃度でビヒクルとして使用された。
【0134】
プレートを５％ＣＯ２ の加湿雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートし、その後、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養体積の１０％で各ウェルに添加した。 蛍光は、５６０／１２励起、５９０ｎｍ 発光で、時間ゼロと ａｌａｍａｒＢｌｕｅ 添加後 ４ 時間の両方で、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ プレート リーダーを使用して監視した。 最終読み取り値から時間ゼロ発光５９０ｎｍ 測定値を差し引いた後、ビヒクル 対照 ウェルに対する細胞生存率の推定パーセンテージを計算した。
【0135】
ジケトピペラジン (Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ ＆ Ｉｄ) は、試験した最高濃度 (１２８ μｇ／ｍＬ) でベロ細胞に対して細胞毒性を示さず、このことは試験した濃度でアジュバントが哺乳動物細胞に対して毒性を示さないことを示している。
【0136】
例－植物毒性
ジケトピペラジンの植物毒性を、大豆とバターヘッド レタスの葉で評価した。 大豆の種子にブラディリゾビウム・ ジャプニカム（ Bradyrhizobium japnicum） を接種し、９ｃｍ２のプラスチック ポットの Levington の Ｍ３ 堆肥に播種した。 大豆植物には、ＳＯN-T 球根による補助照明が与えられた。 ビオローネ・アンブリセイウス・クキュメリス（Biolone-Amblyseius cucumeris）による被害を防ぐために、生物学的防除が行われた。温室の温度は、日中は ２２℃ ± ２、夜間は １９℃ ± ２ を維持するように設定された。 レタス植物は、根粒菌を接種せずに同じ方法で栽培された。 補助照明は、ＬＥＤ 電球によって提供された。 全ての植物は十分に水を与えられ、１４ 日間生長した。
ジケトピペラジンの植物毒性を、大豆とバターヘッド レタスの葉で評価した。 大豆の種子にブラディリゾビウム・ ジャプニカム（ Bradyrhizobium japnicum） を接種し、９ｃｍ２のプラスチック ポットの Levington の Ｍ３ 堆肥に播種した。 大豆植物には、ＳＯN-T 球根による補助照明が与えられた。 ビオローネ・アンブリセイウス・クキュメリス（Biolone-Amblyseius cucumeris）による被害を防ぐために、生物学的防除が行われた。温室の温度は、日中は ２２℃ ± ２、夜間は １９℃ ± ２ を維持するように設定された。 レタス植物は、根粒菌を接種せずに同じ方法で栽培された。 補助照明は、ＬＥＤ 電球によって提供された。 全ての植物は十分に水を与えられ、１４ 日間生長した。
【0137】
試験化合物／抽出物を２％ＤＭＳＯ（０．１０％、１．０ｇ／Ｌ）に再懸濁した。 Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ａ１１ ＬＱ を陽性対照として使用し、ＵＥＰ－１００ を陰性対照として使用した。 処理は、葉の表面に ６つの １０ μＬ の液滴として適用された。 植物毒性組織損傷は、治療後 １ 日目と７日目に ０ ～ ３ のスケールで評価された。
【0138】
ジケトピペラジンＩａ は、７ 日後に大豆又はバターヘッド レタスの葉に対して植物毒性を示さなかった。ＲＫＤＯ５７８粗抽出物は、大豆及びバターヘッド レタスに対して７日後に非常にわずかな植物毒性を示した (それぞれスコア ０．４ 及び ０．２)。
【0139】
【表3】
【0140】
１ ｇ／Ｌ での化合物/抽出物の植物毒性効果は、平均植物毒性壊死スコアとして表され、ここで、０＝壊死なし; １＝接種部位のわずかな斑点状の壊死；２＝輪状の壊死；３＝拡張壊死。
【0141】
本発明は、例としてのみ記載された上記の実施形態の詳細に限定されるべきではないことが理解されるべきである。 多くの変形が可能である。
【国際調査報告】