特表 2023-538077 がんの治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-06

(54)【発明の名称】がんの治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/20 20060101AFI20230830BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20230830BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20230830BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20230830BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230830BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20230830BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20230830BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20230830BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20230830BHJP

【ＦＩ】

A61K38/20

A61P35/00

A61P15/00

A61P25/00

A61P17/00

A61K47/64

A61K47/65

A61K47/46

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C07K14/54 ZNA

C07K19/00

C07K14/705

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023511932

(86)(22)【出願日】2021-08-17

(85)【翻訳文提出日】2023-03-20

(86)【国際出願番号】 US2021046358

(87)【国際公開番号】W WO2022040223

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】63/066,603

(32)【優先日】2020-08-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/069,423

(32)【優先日】2020-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/131,870

(32)【優先日】2020-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/136,051

(32)【優先日】2021-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/145,762

(32)【優先日】2021-02-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/166,772

(32)【優先日】2021-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520170759

【氏名又は名称】コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ルイス， ヌルディーン

(72)【発明者】

【氏名】シア， チャン リン

(72)【発明者】

【氏名】カーウィン， キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】エコノミデス， キリアコス

(72)【発明者】

【氏名】サティヤナラヤナン， スリラム

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA16

4C076BB13

4C076CC01

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA19

4C084DA12

4C084MA16

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE05

4C085GG02

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、対象のがんを治療する方法に関するものであって、当該対象に、サイトカイン、例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）部分を含む細胞外小胞、例えば、エキソソームを投与することを含む方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、及び／またはカポジ肉腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項2】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項3】

前記ＣＴＣＬが、ＩＡ－ＩＩＢステージにある請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚カポジ肉腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項5】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項6】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、膠芽腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項7】

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法。

【請求項8】

前記ＥＶの投与は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％の客観的奏効率（ＯＲＲ）を示す、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＥＶの投与が、約２５～５６％のＯＲＲを示す、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＥＶの投与は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％の完全寛解（ＣＲ）を示す、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＥＶの投与が、約２２％のＣＲを示す、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＥＶが、スキャフォールド部分をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＩＬ－１２が、前記スキャフォールド部分に連結する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記スキャフォールド部分が、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、前記ＩＬ－１２を、前記ＥＶの外表面に固定させることができるスキャフォールドタンパク質である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；バシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）のクラス、及びこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記スキャフォールド部分が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記スキャフォールド部分が、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記スキャフォールド部分が、配列番号１に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ＩＬ－１２が、リンカーによって前記スキャフォールド部分に連結している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記リンカーが、ポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記リンカーが、非ポリペプチド部分である、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記ＩＬ－１２が、配列番号２に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＩＬ－１２が、配列番号３に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＩＬ－１２が、単一のポリペプチドである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＩＬ－１２が、リンカーによって連結したｐ３５及びｐ４０を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記リンカーが、ＧＳリンカーである、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＧＳリンカーが、（Ｇ_４Ｓ）_ｎまたは（Ｇ_３Ｓ）_ｎを含み、また、ｎは、１と１０との間のあらゆる整数である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＩＬ－１２が、配列番号４に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＥＶを、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内に投与する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＥＶが、エキソソームである、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

ＩＬ－１２を含むＥＶ、及び請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法の使用説明書を含む、キット。

【請求項33】

追加の治療薬をさらに投与することを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記追加の治療薬が、抗腫瘍薬である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記抗腫瘍薬が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、または、これらのあらゆる組み合わせである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＥＶを、少なくとも約０．３μｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約２μｇ、少なくとも約３μｇ、少なくとも約４μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約６μｇ、少なくとも約７μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約９μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１１μｇ、または少なくとも約１２μｇの治療有効量で投与する、請求項１～３１及び３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＥＶを、約１μｇ～約１２μｇ、約１μｇ～約１１μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１μｇ～約９μｇ、約１μｇ～約８μｇ、約１μｇ～約７μｇ、約１μｇ～約６μｇ、約１μｇ～約５μｇ、約２μｇ～約１２μｇ、約２μｇ～約１１μｇ、約２μｇ～約１０μｇ、約２μｇ～約９μｇ、約２μｇ～約８μｇ、約２μｇ～約７μｇ、約２μｇ～約６μｇ、約２μｇ～約５μｇ、約３μｇ～約１２μｇ、約３μｇ～約１１μｇ、約３μｇ～約１０μｇ、約３μｇ～約９μｇ、約３μｇ～約８μｇ、約３μｇ～約７μｇ、約３μｇ～約６μｇ、約３μｇ～約５μｇ、約４μｇ～約１２μｇ、約４μｇ～約１１μｇ、約４μｇ～約１０μｇ、約４μｇ～約９μｇ、約４μｇ～約８μｇ、約４μｇ～約７μｇ、約４μｇ～約６μｇ、または約４μｇ～約５μｇの治療有効量で投与する、請求項１～３１及び３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ＥＶを、約０．３μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１１μｇ、または約１２μｇの治療有効量で投与する、請求項１～３１及び３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記治療有効量を、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回投与する、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記治療有効量を、複数回用量で投与する、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記治療有効量が、同じ用量の組換えＩＬ－１２の投与と比較して、前記対象での全身毒性が小さい、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で投与する、請求項１～３１及び３３～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、毎週ごとに１回、約２週間ごとに１回、約３週間ごとに１回、または約４週間ごとに１回投与する、請求項１～３１及び３３～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約２週間ごとに１回投与する、請求項１～３１及び３３～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約１０～１８日ごとに１回、約１２～約１６日ごとに１回、約１４～約２１日ごとに１回、約１０～１４日ごとに１回、または、約１４～約１８日ごとに１回投与する、請求項１～３１及び３３～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約１４日ごとに１回投与する、請求項１～３１及び３３～４３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出をした配列表の援用
本出願と共に、ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称４０００＿１１４ＰＣ０６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：５６，９８２バイト；作成日：２０２１年８月１０日）で、電子的に提出をする配列表の全内容を、参照により本明細書で援用する。

【0002】

このＰＣＴ出願は、２０２１年３月２６日に出願した米国仮出願第６３／１６６，７７２号；２０２１年２月４日に出願した第６３／１４５，７６２号；２０２１年１月１１日に出願した第６３／１３６，０５１号；２０２０年１２月３０日に出願した第６３／１３１，８７０号；２０２０年８月２４日に出願した第６３／０６９，４２３号；及び、２０２０年８月１７日に出願した第６３／０６６，６０３号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する。

【0003】

開示の分野
本開示は、がんを治療及び／または予防するために使用することができる改変した細胞外小胞、例えば、エキソソーム（例えば、ＩＬ－１２部分を含むもの）に関する。また、本開示は、そのようなＥＶ、エキソソームの製造方法、及びそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
免疫療法は、免疫応答を、誘導、増強、または抑制することで、様々なタイプのがんを治療する主要な手段にまで進展した。免疫療法は、患者自身の免疫系を刺激して、癌細胞を攻撃することができる。インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、Ｔ細胞の成長因子として作用するものであり、Ｔ細胞を活性化して、免疫応答を高めることができる。しかしながら、遊離ＩＬ－１２の投与は、腫瘍微小環境を超えて広範囲にわたって効果を奏し得る。

【0005】

ＥＶ、エキソソームは、細胞間伝達の重要なメディエーターである。また、それらは、数多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーである。薬物送達手段として、ＥＶ、例えば、エキソソームは、数多くの治療分野での新規の治療法として、従来の薬物送達方法（例えば、ペプチド免疫、ＤＮＡワクチン）と比較して、数多くの利点を提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

開示の概要
本開示の特定の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、及び／またはカポジ肉腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。

【0007】

本開示の一部の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。一部の態様では、ＣＴＣＬは、ＩＡ－ＩＩＢステージにある。

【0008】

本開示の一部の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、皮膚カポジ肉腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。

【0009】

本開示の一部の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。

【0010】

本開示の一部の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、膠芽腫の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。

【0011】

本開示の一部の態様は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関する。

【0012】

一部の態様では、ＥＶの投与は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％の客観的奏効率（ＯＲＲ）を示す。一部の態様では、ＥＶの投与は、約２５～５６％のＯＲＲを示す。一部の態様では、奏効率は、例えば、ＣＴＣＬに対するｍＳＷＡＴ分析を用いて測定する。

【0013】

一部の態様では、ＥＶの投与は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％の完全寛解（ＣＲ）を示す。一部の態様では、ＥＶの投与は、約２２％のＣＲを招く。

【0014】

一部の態様では、ＥＶは、スキャフォールド部分をさらに含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、スキャフォールド部分に連結する。一部の態様では、スキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＥＶの外表面にＩＬ－１２を固定させることができるスキャフォールドタンパク質である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；バシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）のクラス、及びこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択する。

【0015】

一部の態様では、スキャフォールド部分は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質である。一部の態様では、スキャフォールド部分は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、スキャフォールド部分は、配列番号１に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0016】

一部の態様では、ＩＬ－１２は、リンカーによってスキャフォールド部分に連結する。一部の態様では、リンカーは、ポリペプチドである。一部の態様では、リンカーは、非ポリペプチド部分である。

【0017】

一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－３は、単一のポリペプチドである。

【0018】

一部の態様では、ＩＬ－１２は、リンカーによって連結したｐ３５及びｐ４０を含む。一部の態様では、リンカーは、ＧＳリンカーである。一部の態様では、ＧＳリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎまたは（Ｇ_３Ｓ）_ｎを含み、また、ｎは、１～１０の間のあらゆる整数である。

【0019】

一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0020】

一部の態様では、ＥＶは、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内で投与する。

【0021】

一部の態様では、ＥＶは、エキソソームである。

【0022】

本開示の特定の態様は、ＩＬ－１２を含むＥＶ、及び本明細書に開示した方法に従って使用するための使用説明書を含むキットに関する。

【0023】

一部の態様では、方法は、追加の治療薬を投与することをさらに含む。一部の態様では、追加の治療薬は、抗腫瘍薬である。一部の態様では、抗腫瘍薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む。

【0024】

一部の態様では、本方法に関するＥＶを、少なくとも約０．３μｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約２μｇ、少なくとも約３μｇ、少なくとも約４μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約６μｇ、少なくとも約７μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約９μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１１μｇ、または少なくとも約１２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶを、約１μｇ～約１２μｇ、約１μｇ～約１１μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１μｇ～約９μｇ、約１μｇ～約８μｇ、約１μｇ～約７μｇ、約１μｇ～約６μｇ、約１μｇ～約５μｇ、約２μｇ～約１２μｇ、約２μｇ～約１１μｇ、約２μｇ～約１０μｇ、約２μｇ～約９μｇ、約２μｇ～約８μｇ、約２μｇ～約７μｇ、約２μｇ～約６μｇ、約２μｇ～約５μｇ、約３μｇ～約１２μｇ、約３μｇ～約１１μｇ、約３μｇ～約１０μｇ、約３μｇ～約９μｇ、約３μｇ～約８μｇ、約３μｇ～約７μｇ、約３μｇ～約６μｇ、約３μｇ～約５μｇ、約４μｇ～約１２μｇ、約４μｇ～約１１μｇ、約４μｇ～約１０μｇ、約４μｇ～約９μｇ、約４μｇ～約８μｇ、約４μｇ～約７μｇ、約４μｇ～約６μｇ、または約４μｇ～約５μｇの治療有効量で投与する。

【0025】

一部の態様では、本方法に関するＥＶを、約０．３μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、または約１２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶを、約６μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶを、約５μｇと約７μｇとの間、例えば、約５μｇ、約６μｇ、または約７μｇの治療有効量で投与する。

【0026】

一部の態様では、方法においてＥＶの治療有効量を、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回投与する。一部の態様では、ＥＶの治療有効量は、複数回用量で投与する。

【0027】

一部の態様では、ＥＶの治療有効量は、同じ用量の組換えＩＬ－１２の投与と比較して、対象での全身毒性が小さい。

【0028】

一部の態様では、ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約毎週ごとに１回、約２週間ごとに１回、約３週間ごとに１回、または約４週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約１０～１８日ごとに１回、約１２～約１６日ごとに１回、約１４～約２１日ごとに１回、約１０～１４日ごとに１回、または、約１４～約１８日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶを、約５μｇ～約７μｇの間、例えば、約６μｇの治療有効量で、約１４日ごとに１回投与する、

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ＩＬ－１２（「ｅｘｏＩＬ－１２」）を表面に有する、遺伝子操作したエキソソームの図である。

【0030】

【図2A】未処置マウス、及び遊離組換えＩＬ－１２、またはｅｘｏＩＬ－１２で処置したマウスでの腫瘍滞留を示す散布図である。

【図2B】未処置マウス、及び遊離組換えＩＬ－１２、またはｅｘｏＩＬ－１２で処置したマウスでのＩＦＮ－ガンマＡＵＣを示す散布図である。

【図2C】未処置マウス、及び遊離組換えＩＬ－１２、またはｅｘｏＩＬ－１２で処置したマウスでの腫瘍増殖を示す散布図である。

【図2D】未処置マウス、及び遊離組換えＩＬ－１２、またはｅｘｏＩＬ－１２で処置したマウスでの再接種した後の腫瘍増殖を示す散布図である。

【図2E】コントロール及びｅｘｏＩＬ－１２処置マウスでの抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示すボックスプロットである。

【0031】

【図3A】０．３μｇ、１．０μｇ、または３．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した後に認められた皮膚及び血漿においてｅｘｏＩＬ－１２で測定した薬物動態のグラフ表示である。

【図3B】０．３μｇ、１．０μｇ、または３．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した後に認められた皮膚でのＩＰ－１０のビヒクルの経時的な倍率変化で測定する組織薬力学のグラフ表示である。

【図3C】０．３μｇ、１．０μｇ、または３．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した後に認められた血漿でのＩＰ－１０のビヒクルの経時的な倍率変化で測定する組織薬力学のグラフ表示である。

【0032】

【図4】健康なボランティア（Ａ）及びがん患者（Ｂ）でのｅｘｏＩＬ－１２治療の安全性及び有効性を評価する臨床研究の概略図である。

【0033】

【図5】血漿（Ａ）及び皮膚（Ｂ）試料生検の概略図である。

【0034】

【図6】投与して７００時間後までに、０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与したヒト対象の血漿ＩＬ－１２（ｐｇ／ｍＬ）濃度のグラフ表示である。それぞれの投与量から得たすべてのデータをプールする。

【0035】

【図7A】０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象の皮膚でのＩＰ－１０レベルのグラフ表示である。

【図7B】０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象の血漿でのＩＰ－１０レベルのグラフ表示である。

【図7C】０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象の皮膚でのＩＰ－１０レベルのグラフ表示である。

【図7D】０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象の血漿でのＩＬ－１２レベルのグラフ表示である。

【0036】

【図8】投与して７００時間後までに、０．３μｇ（ｍｃｇ）、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇ ｅｘｏＩＬ－１２を投与したヒト対象の血漿ＩＦＮγ（ｐｇ／ｍＬ）濃度のグラフ表示である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

開示の詳細な説明
本開示は、がんの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法に関するものであり、ＥＶ、例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２部分を含むエキソソームを対象に投与することを含む。一部の態様では、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面、または、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔側表面の１つ以上のスキャフォールド部分に付着（または、連結）する。一部の態様では、がんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、及び／またはカポジ肉腫からなる群から選択する。

【0038】

一部の態様では、対象には、ＥＶ、例えば、エキソソームを投与せずに、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むように遺伝子操作する。

【0039】

様々な態様の例を本開示に示すが、これらに限定されるものではない。

【0040】

Ｉ．定義
本記載の理解をさらに容易にするために、まず、特定の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明で記載する。

【0041】

用語「ａ」または「ａｎ」が示す実体は、その実体のうちの１つ以上のこと；例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を示す、ことに留意したい。そのように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換可能に使用する。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように記載することができる、ことに留意したい。そのため、この記載は、特許請求の範囲に記載の要素に関連して、「だけの」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または否定的な制限の使用に対する先行詞としての役割を有する。

【0042】

さらに、本明細書で使用する「及び／または」とは、その他のものの有無に関係なく、２つの特定の特性または要素のそれぞれの具体的な開示として解釈するべきである。したがって、本明細書での句「Ａ及び／またはＢ」で用いられている用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、及び「Ｂ」（のみ）を含むことを意図している。同様に、句「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」で使用する用語「及び／または」は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；及びＣ（のみ）のそれぞれを含むことを意図している。

【0043】

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で同様の態様も提供されていない限りは、本明細書に記載したそれぞれの態様は、文言「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」で記載したものと理解する。

【0044】

別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有するものとする。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用する用語の多くに関する一般的な辞書になりうる。

【0045】

単位、接頭語、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認めた形式で記載する。数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。数値範囲が記載する場合、その範囲の記載した上限と下限との間にあるそれぞれの介在する整数値、及びそのそれぞれの分数もまた、そのような値の間のそれぞれの部分範囲とともに具体的に開示する点は理解するべきである。任意の範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含める、または、その範囲から除外することができるが、いずれかの限界値を含む、いずれの限界値も含まない、または両方の限界値を含むそれぞれの範囲もまた、本開示は含む。したがって、本明細書に記載した範囲は、記載する端点を含む、その範囲内のすべての値の簡略的な表記であるものとして理解する。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むものとして理解する。

【0046】

値を明示的に記載する場合、記載する値とほぼ同じ数または量である値もまた、本開示の範囲内に含まれることを理解されたい。ある組み合わせが開示する場合、その組み合わせの要素の部分的な組み合わせのそれぞれも具体的に開示され、本開示の範囲内に含まれる。逆に、異なる要素または要素群を個別に開示している場合、それらの組み合わせも開示する。ある開示のあらゆる要素が複数の選択肢を有するものとして開示する場合、それぞれの選択肢が単独で、またはその他の選択肢とのあらゆる組み合わせとして除外するその開示の例もまた、本明細書に開示する；ある開示の複数の要素が、そのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせを本明細書に開示する。

【0047】

ヌクレオチドは、広く認められているそれらの１文字表記で呼称する。特記しない限り、ヌクレオチド配列は５’から３’の方向に、左から右に向けて記載する。本明細書では、ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する、それらヌクレオチドの一般的に公知の１文字記号で呼称する。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

【0048】

アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に向けて記載する。本明細書では、アミノ酸は、一般的に公知のアミノ酸の３文字表記、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字表記で呼称する。

【0049】

本明細書で示す見出しは、開示の様々な態様を制限するものではなく、本明細書全体を援用することができるものでもない。したがって、直下で定義する用語は、明細書全体を参照することで、十分に定義されている。

【0050】

用語「約」または「およそ」は、本明細書では、概ね、大体、おおよそ、またはその周辺であることを意味するために使用する。用語「約」を、数値範囲とともに使用する場合、記載する数値の上下の境界値を広げて、その範囲を変更する。一般に、用語「約」は、記載した数値の上下の値を、例えば、１０パーセント上下の調整をして（上げる、または上げる）、変更させることができる。一部の態様では、本明細書で使用するこの用語は、参照する量の５％以内を意味しており、例えば、約５０％とは、４７．５％～５２．５％の値の範囲を包含するものとして理解する。

【0051】

本明細書で使用する用語「細胞外小胞」または「ＥＶ」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞のことを指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有するすべての膜結合小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）を含む。一般的に、細胞外小胞は、直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内にある場合、細胞外小胞の外表面に提示する、及び／または膜を貫通しているとのいずれかの形で、様々なマクロ分子ペイロードを含むことができる。一部の態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。特定の態様では、細胞外小胞はスキャフォールド部分を含む。また、例として、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞のフラグメント、直接的操作または間接的操作（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理）によって細胞から誘導する小胞、小胞化オルガネラ、及び生細胞から産生される小胞（例えば、直接の原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によるもの）があるが、これらに限定されない。細胞外小胞は、生きている生物または死んだ生物、外植した組織または臓器、原核細胞または真核細胞、及び／または培養した細胞に由来するものであってよい。一部の態様では、細胞外小胞は、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞で生成する。

【0052】

本明細書で使用する用語「エキソソーム」は、内部空間（すなわち、内腔）を封入する膜を含み、直接の原形質膜出芽によって、または後期エンドソームの原形質膜との融合によって細胞から生成する、当該細胞に由来する小さな（直径２０～３００ｎｍ、例えば、直径４０～２００ｎｍの）小胞のことを指す。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。エキソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）、またはその他の分子を含む。一部の態様では、エキソソームは、スキャフォールド部分を含む。エキソソームは、産生細胞に由来するものであってよく、その大きさ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離することができる。一部の態様では、本開示のエキソソームは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞が生成する。

【0053】

本明細書で使用する用語「ナノ小胞」は、内部空間を封入する膜を含む、細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは、直径３０～１５０ｎｍ）小胞であって、ナノ小胞が操作が無いと産生細胞が産生しないようにする直接的操作または間接的操作によって細胞から生成することを指す。当該産生細胞の適切な操作として、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、一部の事例では、当該産生細胞の破壊につながり得る。ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によって産生細胞から誘導する小胞を実質的に含まないことが好ましい。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または、その他の分子を含む。一部の態様では、ナノ小胞は、スキャフォールド部分を含む。ナノ小胞は、当該操作で産生細胞から誘導すると、その大きさ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて、産生細胞から単離することができる。

【0054】

本明細書で使用する用語「表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム」（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム）とは、ＥＶ、例えば、エキソソームを改変する前に、または自然発生する前に、ＥＶ、例えば、ＥＶの膜または表面を備えたエキソソーム、例えば、その組成物を改変して、遺伝子操作をしたＥＶ、例えば、エキソソームの表面が、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面とは異なるものである、ことを指す。この遺伝子操作は、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面、またはＥＶ、例えば、エキソソームの膜の内部で行うことができる、その結果、ＥＶ、例えば、エキソソームを改変させることができる。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成を改変する。組成は、化学的、物理的、または生物学的方法によって変化させることができる、または組成物を、化学的、物理的、または生物学的方法によって、先行して、もしくは同時に細胞から産生することができる。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作で先に改変させた細胞から産生して変化させることができる。一部の態様では、表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エキソソームを自然に発現しないタンパク質）、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出可能なそのフラグメントもしくはバリアント、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出した部分の固定ポイント（付着）とすることができる。その他の態様では、表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、天然エキソソームタンパク質（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）またはそのフラグメントもしくはバリアントの大きな（例えば、数多くの）発現を招き、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出することができる、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出した部分に対する固定ポイント（付着）とすることができる。

【0055】

本明細書で使用する用語「内腔－遺伝子操作したエキソソーム」（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ－遺伝子操作したエキソソーム）とは、ＥＶ、例えば、エキソソームを改変する前に、または自然発生する前に、ＥＶ、例えば、ＥＶの膜または内腔を備えたエキソソーム、例えば、その組成を改変して、遺伝子操作をしたＥＶ、例えば、エキソソームの内腔が、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔とは異なるものである、ことを指す。この遺伝子操作は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔、またはＥＶ、例えば、エキソソームの膜の内部で直接に行うことができる、その結果、ＥＶ、例えば、エキソソームを改変させることができる。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成を改変する。組成は、化学的、物理的、または生物学的方法で変化させることができる、または組成物を、化学的、物理的、または生物学的方法によって、先行して、もしくは同時に細胞から産生することができる。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作で先に改変させた細胞から産生して変化させることができる。一部の態様では、内腔－遺伝子操作したエキソソームは、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エキソソームを自然に発現しないタンパク質）、またはＥＶ、例えば、エキソソームの内腔に露出可能なそのフラグメントもしくはバリアント、またはＥＶ、例えば、エキソソームの内腔に露出した部分の固定ポイント（付着）とすることができる。その他の態様では、内腔－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、天然エキソソームタンパク質（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）またはそのフラグメントもしくはバリアントの大きな（例えば、数多くの）発現を招き、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔に露出することができる、またはエキソソームの内腔に露出した部分に対する固定ポイント（付着）とすることができる。

【0056】

用語「改変した」は、本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソームとの関連で使用する場合、改変したＥＶ、例えば、エキソソームが天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームとは異なるように行う、ＥＶ、例えば、エキソソームの改変または遺伝子操作のことを指す。一部の態様では、本明細書に記載した改変したＥＶ、例えば、エキソソームは、天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームの膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む（例えば、膜は、高密度または数多くの天然エキソソームタンパク質を含む、及び／または膜は、エキソソームには天然には認められないタンパク質（例えば、ＩＬ－１２部分）を含む。特定の態様では、膜に対するそのような改変は、ＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、本明細書に記載した表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム）の外表面を変化させる。特定の態様では、内腔に対するそのような改変は、ＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、本明細書に記載した内腔－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム）の内腔を変化させる。

【0057】

本明細書で使用する用語「スキャフォールド部分」は、関心のある固定、例えば、ＩＬ－１２部分、またはその他のあらゆる化合物を、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面または外表面のいずれかに、ＥＶ、例えば、エキソソームを固定するために使用できる分子のことを指す。特定の態様では、スキャフォールド部分は、合成分子を含む。一部の態様では、スキャフォールド部分は、非ポリペプチド部分を含む。その他の態様では、スキャフォールド部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。一部の態様では、スキャフォールド部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームに天然には存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。特定の態様では、スキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。一部の態様では、スキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙである。さらなる態様では、スキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸとＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙの両方を含む。特定の態様では、スキャフォールド部分は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ アルファ４、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１アルファ及びベータ、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＤ３イプシロン及びゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＴＣＲベータ、テトラスパニン、または、それらの組み合わせを含む。

【0058】

本明細書で使用する用語「Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ」は、エキソソームの表面で最近になって同定されたエキソソームタンパク質のことを指す。例えば、参照により本明細書でその全内容を援用する米国特許１０，１９５，２９０号を参照されたい。Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の例として：プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンベータ－１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンアルファ－４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）のクラスがあるが、これらに限定されない。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質は、タンパク質全体またはそのフラグメント（例えば、機能的フラグメント、例えば、ＥＶ、例えば、エキソソームの外表面または内腔表面に別の部分を固定することができる最小フラグメント）とすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、エキソソームの外表面または内腔表面の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）に固定することができる。

【0059】

本明細書で使用する用語「Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ」は、エキソソームの内腔表面で新たに同定されたエキソソームタンパク質のことを指す。例えば、本明細書でその全内容を援用する国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号を参照されたい。Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の例として；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）があるが、これらに限定されない。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、タンパク質全体またはそのフラグメント（例えば、機能的フラグメント、例えば、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に部分を固定することができる最小フラグメント）とすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔にＩＬ－２部分を固定することができる。

【0060】

本明細書で使用するタンパク質（例えば、治療用タンパク質、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）の用語「フラグメント」は、天然に存在する配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列、天然に存在するタンパク質と比較してタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端、またはあらゆる部分が欠失したタンパク質のことを指す。本明細書で使用する用語「機能的フラグメント」は、タンパク質機能を保有しているタンパク質フラグメントのことを指す。したがって、一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的フラグメントは、部分を、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面及び／または外表面に固定する能力を保有している。同様に、特定の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の機能的フラグメントは、部分を、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に固定する能力を保有している。フラグメントが機能的フラグメントであるか否かは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及びフラグメントと、例えば、ＧＦＰなどの自家蛍光タンパク質との融合を含む、ＥＶのタンパク質含有量を決定するためのあらゆる周知の方法で評価することができる。特定の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的フラグメントは、天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の能力を、例えば、部分を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保有している。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の機能的フラグメントは、天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の能力を、例えば、別の分子を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％を保有している。

【0061】

本明細書で使用する分子（例えば、機能性分子、抗原、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）の用語「バリアント」は、当該技術分野で周知の方法で比較した場合に、別の分子と特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子のことを指す。例えば、あるタンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再構成を含み得る。

【0062】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘのバリアントは、完全長の成熟したＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質のフラグメント（例えば、機能的フラグメント）と、少なくとも約７０％の同一性を有するバリアントを含む。一部の態様では、ＰＴＧＦＲＮのバリアントまたはそのフラグメントのバリアントは、配列番号１によるＰＴＧＦＲＮまたはその機能的フラグメントと、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。

【0063】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙのバリアントは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１のフラグメントに対して、少なくとも７０％の同一性を有するバリアントを含む。一部の態様では、ＭＡＲＣＫＳのバリアントまたはそのフラグメントのバリアントは、配列番号４７によるＭＡＲＣＫＳまたはその機能的フラグメントと、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。一部の態様では、ＭＡＲＣＫＳＬ１のバリアントまたはそのフラグメントのバリアントは、配列番号４８によるＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能的フラグメントと、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。一部の態様では、ＢＡＳＰ１のバリアントまたはそのフラグメントのバリアントは、配列番号４９によるＢＡＳＰ１またはその機能的フラグメントと、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質のバリアントまたはそのフラグメントのバリアントは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔を特異的に標的化する能力を保有している。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、１つ以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0064】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。したがって、ポリペプチドでのアミノ酸が、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸で置換する場合、その置換は保存的であるとみなす。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。

【0065】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間に関する用語「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」は、比較ウインドウにわたって、それぞれの配列が共有する同一の一致位置の数のことを指しており、２つの配列の最適なアラインメントを得るために導入する必要のある付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮したものである。一致位置とは、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が、標的配列と参照配列の両方に存在するあらゆる位置である。標的配列内に示すギャップは、ヌクレオチドまたはアミノ酸ではないので、カウントしない。同様に、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントするが、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされないので、参照配列内に示すギャップは、カウントされない。

【0066】

配列同一性のパーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が、両方の配列に存在する位置の数を求めて一致位置の数を得て、一致位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割って、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得て計算する。配列同士の比較及び２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用、及びダウンロードの両方で容易に入手可能なソフトウェアを使用して行うことができる。適切なソフトウェアプログラムは、様々な販売元から入手可能であり、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアライメント用のものがある。配列同一性パーセントを決定するための適切なプログラムの１つに、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴパッケージプログラムの一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列の間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用するのに対して、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用する。その他の適切なプログラムとしては、例えば、バイオインフォマティクスプログラムパッケージＥＭＢＯＳＳの一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａで、やはり入手可能なＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒがある。

【0067】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自体の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセントの値は、１０分の１の位を、四捨五入している点に留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は、常に整数である点に留意されたい。

【0068】

当業者であれば、配列同一性パーセントを計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ行われるバイナリー配列間比較に限定されない、ことを理解するであろう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから導出することができる。複数の配列アラインメントを生成するための適切なプログラムの１つに、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手できるＣｌｕｓｔａｌＷ２がある。別の適切なプログラムとして、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手できるＭＵＳＣＬＥがある。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから入手することもできる。

【0069】

配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生データなどの異種ソースからのデータと統合して生成できる、ことも理解するであろう。異種データを統合してマルチプル配列アラインメントを生成する適切なプログラムとして、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、あるいは、例えば、ＥＢＩからも入手可能であるＴ－Ｃｏｆｆｅｅがある。配列同一性パーセントを計算するために使用する最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで整理できる、ことも理解するであろう。

【0070】

ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方に改変を含むことができる。ある態様では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードするポリペプチドの性質または活性を変化させない改変を含む。別の態様では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって作り出す。その他の態様では、５～１０個、１～５個、または１～２つのアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、削除、または付加するバリアント。ポリヌクレオチドバリアントは、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンをその他のもの、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主に変更する）ためなど、様々な理由で作り出すことができる。

【0071】

天然に存在するバリアントは「対立遺伝子バリアント」と称されており、生物の染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの代替形態の１つのことを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子バリアントは、ポリヌクレオチド、及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで異なり得るものであり、本開示に含まれる。あるいは、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技術または直接合成によって生成することもできる。

【0072】

タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、ポリペプチドの特性を改善または改変するためのバリアントを作り出すことができる。例えば、生物学的機能を実質的に喪失せずに、分泌したタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。その全内容を本明細書で援用するＲｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３つ、８つ、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告している。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に最大で１０倍も高い活性を示した。（参照により、その全内容を本明細書で援用するＤｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８））。

【0073】

さらに、バリアントが、天然によく認められるタンパク質と同様の生物学的活性を保有していることを示す十分な証拠がある。例えば、Ｇａｙｌｅと共同研究者（参照により、その全内容を本明細書で援用する、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な突然変異分析を行っている。彼らはランダム突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたってバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸の変化を有する３５００種を超える個々のＩＬ－１ａバリアントを作り出した。可能なすべてのアミノ酸位置で、複数の変異を調べた。これらの研究者は、「これら分子のほとんどは、［結合または生物活性］のいずれにも、ほとんど影響を与えずに改変できる」ことを発見した。（抄録を参照されたい）実際のところ、調べた３５００種を超えるヌクレオチド配列の内、２３種の固有のアミノ酸配列だけが、野生型とは活性が大きく異なるタンパク質を生成した。

【0074】

上記したように、ポリペプチドバリアントには、例えば、改変したポリペプチドがある。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩ固定の形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化（参照により、その全内容を援用するＭｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０））、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及び、アルギニル化などのタンパク質に向けたアミノ酸の転移ＲＮＡの媒介による付加、及びユビキチン化がある。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、あらゆる好適な位置を改変する。

【0075】

本明細書で使用する用語「連結する」または「コンジュゲートする」は、互換的に使用しており、第１の部分と第２の部分との間、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸとＩＬ－１２部分との間のそれぞれに形成する共有または非共有結合のことを指しており、例えば、一部の態様では、スキャフォールド部分は、細胞外小胞内または細胞外小胞上、及びＩＬ－１２部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）が、それぞれ、細胞外小胞の内腔表面または外表面で発現する。

【0076】

用語「封入した」、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、封入、または封入する）は、第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）が、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）の内部にあり、２つの部分が、化学的または物理的に連結されていない状態またはプロセスのことを指す。一部の態様では、用語「封入した」は、「の内腔内」と互換可能に使用することができる。第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）を、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）内に封入する例は、限定を意図するものではなく、本明細書のその他の箇所でも開示している。

【0077】

本明細書で使用する用語「産生細胞」は、ＥＶ、例えば、エキソソームを生成するために使用する細胞のことを指す。産生細胞は、インビトロ、またはインビボで培養した細胞とすることができる。産生細胞として、例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｓ９ｆ細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞の生成に有効であることが公知の細胞があるが、これらに限定されない。特定の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞である。一部の態様では、産生細胞は、細菌細胞である。一部の態様では、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、またはこれらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはこれらのあらゆる組み合わせである。一部の態様では、産生細胞は、細菌細胞ではない。その他の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。

【0078】

本明細書で使用する用語「関連付けた」は、それぞれ、第１の部分、例えば、ＩＬ－１２部分と、第２の部分、例えば、細胞外小胞との間に形成する共有結合または非共有結合；または、第１の部分、例えば、ＩＬ－１２部分を、第２の部分、例えば、細胞外小胞へ封入することを指す。例えば、一部の態様では、スキャフォールド部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）が、細胞外小胞内または細胞外小胞で発現され、及びＩＬ－１２部分を、細胞外小胞の外表面にロードする。ある態様では、用語「関連付けた」は、共有の非ペプチド結合または非共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合を形成する、または架橋することができるチオール基を含む。共有結合の例として、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、不可知論的結合、屈曲結合、双極子結合、パイバック結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合があるが、これらに限定されない。非共有結合の例として、イオン結合（例えば、カチオン－パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低バリア水素結合、または対称水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学的極性があるが、これらに限定されない。その他の態様では、用語「関連付けた」は、第１の部分、例えば、細胞外小胞が、第２の部分、例えば、ＩＬ－１２部分を封入することを意味する。一部の態様では、第１の部分と第２の部分とは、互いに連結することができる。その他の態様では、第１の部分と第２の部分とは、互いに物理的及び／または化学的に連結されない。

【0079】

本明細書で使用する用語「に連結する」または「とコンジュケートする」は、互換可能に使用でき、第１の部分と第２の部分、例えば、それぞれ、ＩＬ－１２部分と細胞外小胞との間に形成する共有または非共有結合のことを指す。一部の態様では、スキャフォールド部分は、細胞外小胞、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の内部または当該小胞上で発現され、及び、ＩＬ－１２部分（例えば、「表面に提示したＩＬ－１２」）は、細胞外小胞の表面に露出したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の部分に連結する、またはコンジュケートする。一部の態様では、スキャフォールド部分は、細胞外小胞、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の内部または当該小胞上で発現され、及び、ＩＬ－１２部分は、細胞外小胞の内腔に露出したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の部分に連結する、またはコンジュケートする。

【0080】

本明細書で使用する用語「ロードした」、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、ロードする（ｌｏａｄ）またはロードした（ｌｏａｄｅｄ））は、第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）が、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）に関連付けた状態またはプロセスのことを指す。一部の態様では、第１の部分は、第２の部分と化学的または物理的に連結する。一部の態様では、第１の部分は、第２の部分と化学的または物理的に連結されない。一部の態様では、第１の部分は、第２の部分内、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔内に存在しており、例えば、「封入する」。一部の態様では、第１の部分は、第２の部分の外表面に関連付けられており、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面、例えば、第２の部分の「表層提示」に連結またはコンジュケートする。

【0081】

用語「封入した」、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、封入、または封入すること）は、第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）が、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）の内部にあり、２つの部分が化学的または物理的に連結されていない状態またはプロセスのことを指す。一部の態様では、用語「封入した」は、「の内腔内」と互換的に使用可能である。第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）を、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）内に封入する例を、本明細書のその他の箇所で開示しているが、それらに限定されない。

【0082】

本明細書で使用する用語「単離する」、「単離した」、及び「単離すること」または「精製する」、「精製した」、及び「精製すること」、ならびに「抽出した」及び「抽出すること」は互換可能に使用でき、１つ以上の精製プロセス、例えば、所望のＥＶ調製物の選択または濃縮が行われた、所望のＥＶの調製（例えば、複数の公知の、または未知の量及び／または濃度）の状態のことを指す。一部の態様では、本明細書で使用する、単離すること、または精製することとは、産生細胞を含有する試料からＥＶを除去、部分的に除去（例えば、画分）するプロセスである。一部の態様では、単離したＥＶ組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さない、あるいは、望ましくない活性のレベルまたは量が、許容可能なレベルまたは量以下である。その他の態様では、単離したＥＶ組成物は、許容可能な量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。その他の態様では、単離したＥＶ組成物は、組成物を得るための出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して濃縮する。この濃縮は、出発材料と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超とすることができる。一部の態様では、単離したＥＶ調製物は、残留する生物学的産物を実質的に含まない。一部の態様では、単離したＥＶ調製物は、いかなる夾雑生物物質も１００％含まない、９９％含まない、９８％含まない、９７％含まない、９６％含まない、９５％含まない、９４％含まない、９３％含まない、９２％含まない、９１％含まない、または９０％含まない。残留する生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）もしくは不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝産物を含み得る。残留する生物学的産物を実質的に含まないとは、ＥＶ組成物が、検出可能な産生細胞を含有せず、ＥＶのみが検出可能であることを意味するものでもある。

【0083】

本明細書で使用する用語「遊離ＩＬ－１２部分」は、細胞外小胞に関連付けられていないＩＬ－１２部分を意味するが、それ以外の点では、細胞外小胞に関連付けたＩＬ－１２部分と同じである。特に、ＩＬ－１２部分に関連付けた細胞外小胞と比較した場合、遊離ＩＬ－１２部分は、細胞外小胞と関連付けた同じＩＬ－１２部分である。一部の態様では、遊離ＩＬ－１２部分を、その有効性、毒性、及び／またはその他のあらゆる特性についてＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞と比較した場合、細胞外小胞に関連付けたＩＬ－１２部分と比較した遊離ＩＬ－１２部分の量は、ＥＶに関連付けたＩＬ－１２部分の量と同じである。

【0084】

本明細書で使用する用語「ｅｘｏＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２部分、例えば、ＩＬ－１２タンパク質またはそのフラグメントをロードしたエキソソームのことを指す。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、エキソソームの外表面（例えば、ＩＬ－１２部分の表層提示）に関連付けられる。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、エキソソームの外表面に連結する、またはコンジュケートする。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、表面露出したスキャフォールドタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結する、またはコンジュゲートする。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、エキソソームの脂質二重層に連結する、またはコンジュゲートする。一部の態様では、エキソソームは、エキソソームの内腔にＩＬ－１２部分を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、エキソソームの内腔表面、例えば、スキャフォールドタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮと関連する。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、エキソソームの内腔内に封入されており、スキャフォールドタンパク質と関連付けされていない。

【0085】

本明細書で使用する用語「リガンド」は、受容体に結合し、受容体を調節して生物学的応答を生じる分子のことを指す。調節は、受容体が媒介する生物学的応答の活性化、非活性化、遮断、または減衰とし得る。受容体は、内因性または外因リガンドのいずれかによって調節し得る。内因性リガンドの例として、抗体及びペプチドがあるが、これらに限定されない。外因性アゴニストの例として、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドがあるが、これらに限定されない。リガンドを、完全リガンド、部分リガンド、またはインバースリガンドとすることができる。

【0086】

本明細書で使用する用語「抗体」は、天然のもの、または部分的もしくは全体的に合成したものであるかに関係なく、免疫グロブリン、及びそのフラグメントを含む。また、この用語は、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を含む。「抗体」は、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらのフラグメントを含むことを意図しており、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ１）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄフラグメントなどの抗体フラグメント、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、所望の生物学的活性または機能を示す限りは、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。

【0087】

本明細書で使用する用語「治療有効量」は、所望の治療効果、薬理学的及び／または生理学的効果を必要とする対象において十分な効果を招く試薬または医薬化合物の量である。予防は、治療とみなすことができるので、治療有効量とは「予防有効量」とすることができる。

【0088】

本明細書で使用する用語「医薬組成物」は、例えば、医薬として許容可能な担体及び賦形剤などの１つ以上のその他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わせる、またはそれと懸濁させたＥＶなど、本明細書に記載した１つ以上の化合物のことを指す。医薬組成物の目的の１つは、ＥＶの調製物の対象への投与を促すことにある。用語「賦形剤」または「担体」は、化合物の投与をさらに促すために医薬組成物に添加する不活性物質のことを指す。用語「医薬として許容可能な担体」または「医薬として許容可能な賦形剤」、及びそれらの文法的変形は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関の承認を受けている、または米国薬局方に記載されている作用物質のいずれかであること、ならびに、対象への組成物の投与が、禁止されている程度の望ましくない生理学的作用の発生を引き起こさない、また、投与した化合物の生物学的活性及び特性を無効化しないあらゆる担体または希釈剤を含む。医薬組成物を調製する上で有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体を含む。

【0089】

本明細書で使用する用語「ペイロード」は、ＥＶと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤のことを指す。ＥＶ及び／または産生細胞に導入することができるペイロードとして、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨げるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または翻訳を妨げるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬及び毒素）などの治療剤がある。

【0090】

用語「投与」、「投与すること」、及びそれらの変形は、ＥＶなどの組成物または作用物質を対象に導入することを指しており、組成物または作用物質の同時及び連続的な導入を含む。対象への組成物または作用物質の導入は、腫瘍内、経口、肺内、鼻腔内、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸内、リンパ管内、くも膜下腔内、眼周囲、または局所的を含むあらゆる適切な経路で行う。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。適切な投与経路によって、組成物または作用物質は、その目的とする機能を奏することができる。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または作用物質を対象の静脈内に導入して投与する。

【0091】

用語「個体」「対象」「宿主」及び「患者」は、本明細書では互換可能に使用しており、診断、処置または治療が望ましいあらゆる哺乳動物対象、特に、ヒトのことを指す。本明細書に記載する組成物及び方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。一部の態様では、対象は哺乳動物であり、その他の態様では、対象はヒトである。本明細書で使用する「哺乳動物対象」として、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むすべての哺乳動物があるが、これらに限定されない。

【0092】

本明細書で使用する用語「実質的に含まない」は、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）濃度比率で１０％未満のマクロ分子しか含まないことを意味する。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％（ｍ／ｖ）未満のマクロ分子を含有し得る。

【0093】

本明細書で使用する用語「マクロ分子」は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせのことを意味する。

【0094】

本明細書で使用する用語「従来のエキソソームタンパク質」は、エキソソームに豊富にあることが従来から知られているタンパク質のことを意味しており、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩ固定タンパク質、ラクタドヘリン（ＭＦＧＥ８）、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、そのフラグメント、またはこれらに結合するペプチドがあるが、これらに限定されない。

【0095】

本明細書で使用する「免疫応答」とは、外因性因子または異常、例えば、感染細胞に対する脊椎動物での生物学的応答のことを指しており、この応答は、これらの因子、及びそれらで発症する疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つ以上の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、または好中球）、及びこれらの細胞または肝臓が産生する可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体など）の作用を媒介し、その結果、脊椎動物の体内に侵入する病原体、病原体に感染した細胞または組織、がん性細胞またはその他の異常な細胞、または自己免疫または病理学的炎症の事例では、正常なヒト細胞または組織に結合する、損傷を招く、破壊する、及び／または排除する、選択的標的化をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＴｒｅｇ細胞の活性化または阻害、または免疫系のあらゆるその他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化または阻害を含む。したがって、免疫応答は、液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞が媒介するもの）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞が媒介するもの）、または体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を含むことができる。一部の態様では、免疫応答は「抑制」免疫応答である。抑制免疫応答は、刺激（例えば、抗原）の効果を遮断または減衰させる免疫応答である。特定の態様では、抑制免疫応答は、刺激に対する阻害抗体の産生を含む。一部の態様では、阻害応答は、サイトカインに対する抗体、例えば、ＩＬ－１２に対する抗体の産生を含む。一部の態様では、免疫応答は「刺激的」免疫応答である。刺激的免疫応答は、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）を破壊する、及び除去することができるエフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）の生成を招く免疫応答である。

【0096】

本明細書で使用する用語「治療する」、「治療」または「治療すること」は、例えば、疾患または状態の重症度の低下、疾患経過の期間短縮、疾患または状態に関連する１つ以上の症状の改善または消失、疾患または状態を必ずしも治癒しなくとも疾患または状態を有する対象に有益な効果をもたらすことを指す。この用語は、疾患もしくは状態またはその症状の予防または防止も含む。一部の態様では、用語「治療する」または「治療」は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。一部の態様では、疾患または状態は、がんである。一部の態様では、がんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、カポジ肉腫、または、それらのあらゆる組み合わせからなる群から選択する。一部の態様では、がんは、黒色腫を含む。

【0097】

本明細書で使用する用語「予防する」または「予防すること」は、特定の転帰の出現または重症度を減少または低下させることを指す。一部の態様では、転帰の予防は、予防的治療によって実現する。一部の態様では、本明細書に記載した、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２部分を含むＥＶ、例えば、エキソソームを、予防的に対象に投与する。一部の態様では、対象は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、黒色腫、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、カポジ肉腫、またはそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択するがんを発症するリスクがある。

【0098】

本明細書で使用する用語「調節する」、「調節すること」、「改変する」及び／または「調節因子」は、一般的には、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能または挙動を増加または減少させる、例えば、直接的または間接的に促進／刺激／アップレギュレートまたは干渉／阻害／ダウンレギュレートすることで変化させる能力のことを指す。一部の事例では、調節因子は、コントロールに対して、または一般的に予想される活性の平均的レベルに対して、または活性のコントロールレベルに対して、特定の濃度、レベル、活性または機能を、増加及び／または減少させることができる。

【0099】

本明細書で使用する「哺乳動物対象」として、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むすべての哺乳動物があるが、これらに限定されない。

【0100】

用語「個体」「対象」「宿主」及び「患者」は、本明細書では互換可能に使用しており、診断、処置または治療が望ましいあらゆる哺乳動物対象、特に、ヒトんおことを指す。本明細書に記載した方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。一部の態様では、対象は哺乳動物であり、その他の態様では、対象はヒトである。

【0101】

本明細書で使用する「原発腫瘍」とは、腫瘍が増殖を開始した対象内の箇所での当初の腫瘍、または最初の腫瘍のことを指す。原発腫瘍は、例えば、原発腫瘍内の細胞の転移による原発腫瘍の箇所以外の箇所での原発腫瘍の増殖の開始後に発生する腫瘍のことを指す「二次腫瘍」とは対照的に使用する。

【0102】

本明細書に記載した範囲は、記載する端点を含むその範囲内のすべての値の簡略的な表記であると理解されたい。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群のあらゆる数、数の組み合わせ、または部分範囲を含む、ものと理解されたい。

【0103】

特記しない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物について言及する場合、そのそれぞれの立体異性体及びその立体異性体のすべての組み合わせを意図する。

【0104】

ＩＩ．本開示の方法
本開示の特定の態様は、がんの治療を必要とする対象に、ＥＶ、例えば、ＩＬ－１２を含むサイトカインを含むエキソソームを投与することを含む、治療の方法に関する。一部の態様では、がんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、カポジ肉腫、及びこれらのあらゆる組み合わせから選択する。一部の態様では、がんは、膀胱癌を含む。一部の態様では、がんは、基底細胞癌（ＢＣＣ）を含む。一部の態様では、ＥＶは、ＩＬ－１２、例えば、ヒトＩＬ－１２を含む。一部の態様では、対象には、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むように遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは投与されない。

【0105】

一部の態様では、本明細書に記載したエキソソームは、ＩＬ－１２部分を含む。特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、ヒトＩＬ－１２、またはそのフラグメントを含む。ヒトＩＬ－１２は、樹状細胞、マクロファージ、好中球、及びＢ－リンパ芽球様細胞が天然に産生するインターロイキンである。ＩＬ－１２は、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファの産生を刺激し、及び、ＩＬ－４が媒介したＩＦＮ－ガンマの抑制を低減させるなど、Ｔ細胞の増殖及び機能を刺激することが知られている。ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞のＴｈｌ細胞への分化にも関与している。また、ＩＬ－１２は、ＮＫ／リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を強める。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）サブユニットとＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットからなるヘテロ二量体サイトカインである。活性ヘテロダイマーは、Ｐ７０としても公知である。ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２９４５９；配列番号２）、及びＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２９４６０；配列番号３）のアミノ酸配列を、表１に示す。

【表1】

【0106】

一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、ｐ３５ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２と、少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、シグナルペプチドを欠いている（表１を参照されたい）。

【0107】

一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、ｐ４０ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３と、少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、シグナルペプチドを欠いている（表１を参照されたい）。

【0108】

一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、ｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメント、及びｐ４０ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、単一のポリペプチドを含み、また、ｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントを、ｐ４０ポリペプチドまたはそのフラグメントに連結する。一部の態様では、ｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントを、リンカーによって、ｐ４０ポリペプチドまたはそのフラグメントに連結する。一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。一部の態様では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカーを含む。一部の態様では、ＧＳリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎを含み、また、ｎは、１と１０との間の整数である。一部の態様では、ＧＳリンカーは、（Ｇ_３Ｓ）_ｎを含み、また、ｎは、１と１０との間の整数である。

【0109】

特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、配列番号４と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４と、少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる。一部の態様では、ＩＬ－１２は、配列番号４に記載のアミノ酸配列から実施的になる。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、シグナルペプチドを欠いている（表１を参照されたい）。

【0110】

一部の態様では、ＥＶの投与は、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、または約８０％～約１００％の客観的奏効率（ＯＲＲ）を示す。一部の態様では、ＥＶの投与は、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％のＯＲＲを示す。一部の態様では、ＥＶの投与は、約２５％～約５６％のＯＲＲを示す。一部の態様では、ＥＶの投与は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％ＯＲＲを示す。一部の態様では、奏効率は、例えば、ＣＴＣＬに対するｍＳＷＡＴ分析を用いて測定する。

【0111】

一部の態様では、ＥＶの投与は、対象において完全寛解を示す。一部の態様では、ＥＶを投与した結果、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の対象で完全寛解（ＣＲ）を示す。一部の態様では、ＥＶを投与した結果、少なくとも約２０％の対象でＣＲを示す。一部の態様では、ＥＶを投与した結果、少なくとも約２２％の対象でＣＲを示す。

【0112】

ある特定のメカニズムに縛られるものではないが、一部の態様では、本明細書に開示したＥＶの投与は、免疫細胞を活性化して、腫瘍細胞を標的として死滅させる。一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、ＩＬ－１２部分をロードしたＥＶは、Ｔ細胞を活性化する。一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、ＩＬ－１２部分をロードしたＥＶは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を活性化する。一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、ＩＬ－１２部分をロードしたＥＶは、ＮＫ細胞を活性化する。

【0113】

ＥＶは、当該技術分野で公知のあらゆる経路で対象に投与することができる。一部の態様では、ＥＶを、非経口、経口、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、腫瘍内（ＩＴ）、鼻腔内、皮下、または腹腔内（ＩＰ）に投与する。特定の態様では、ＥＶは、例えば、ＩＴ送達によって、腫瘍微小環境に直接に投与する。一部の態様では、本明細書に開示したＥＶのＩＴ送達は、全身曝露を減らす、選択的免疫細胞活性化を高める、組織保持を強める（長期応答を提供する）、または、それらのあらゆる組み合わせを示す。

【0114】

一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約０．３μｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約２μｇ、少なくとも約３μｇ、少なくとも約４μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約６μｇ、少なくとも約７μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約９μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１１μｇ、または少なくとも約１２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約０．３μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約１μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約３μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約４μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約５μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約６μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約７μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約８μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約９μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約１０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約１１μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、少なくとも約１２μｇの治療有効量で投与する。

【0115】

一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約０．３μｇ～約１２μｇ、約１μｇ～約１２μｇ、約１μｇ～約１１μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１μｇ～約９μｇ、約１μｇ～約８μｇ、約１μｇ～約７μｇ、約１μｇ～約６μｇ、約１μｇ～約５μｇ、約２μｇ～約１２μｇ、約２μｇ～約１１μｇ、約２μｇ～約１０μｇ、約２μｇ～約９μｇ、約２μｇ～約８μｇ、約２μｇ～約７μｇ、約２μｇ～約６μｇ、約２μｇ～約５μｇ、約３μｇ～約１２μｇ、約３μｇ～約１１μｇ、約３μｇ～約１０μｇ、約３μｇ～約９μｇ、約３μｇ～約８μｇ、約３μｇ～約７μｇ、約３μｇ～約６μｇ、約３μｇ～約５μｇ、約４μｇ～約１２μｇ、約４μｇ～約１１μｇ、約４μｇ～約１０μｇ、約４μｇ～約９μｇ、約４μｇ～約８μｇ、約４μｇ～約７μｇ、約４μｇ～約６μｇ、または約４μｇ～約５μｇの治療有効量で投与する。

【0116】

一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１μｇ～約２μｇ、約２μｇ～約３μｇ、約３μｇ～約４μｇ、約４μｇ～約５μｇ、約５μｇ～約６μｇ、約６μｇ～約７μｇ、約７μｇ～約８μｇ、約８μｇ～約９μｇ、約９μｇ～約１０μｇ、約１０μｇ～約１１μｇ、または約１１μｇ～約１２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１μｇ～約２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約２μｇ～約３μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約３μｇ～約４μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約４μｇ～約５μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約５μｇ～約６μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約６μｇ～約７μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約７μｇ～約８μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約８μｇ～約９μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約９μｇ～約１０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１０μｇ～約１１μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１１μｇ～約１２μｇの治療有効量で投与する。

【0117】

一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約０．３μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、または約１２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約０．３μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約２μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約３μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約４μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約５μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約６μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約７μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約８μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約９μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１１μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、本方法に関するＥＶは、約１２μｇの治療有効量で投与する。

【0118】

一部の態様では、方法におけるＥＶの治療有効量は、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回投与する。一部の態様では、ＥＶの治療有効量は、複数回用量で投与する。

【0119】

一部の態様では、ＥＶの治療有効量は、同じ用量の組換えＩＬ－１２の投与と比較して、対象での全身毒性が小さい。

【0120】

一部の態様では、ＥＶは、約毎週ごとに１回、約２週間ごとに１回、約３週間ごとに１回、または約４週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約毎週ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７～２１日ごとに１回、約７～１８日ごとに１回、約７～１４日ごとに１回、約１０～２１日ごとに１回、約１０～１８日ごとに１回、約１０～１４日ごとに１回、約１０～１６日ごとに１回、約１２～約２０日ごとに１回、約１２～約１８日ごとに１回、約１２～約１６日ごとに１回、約１２～約１４日ごとに１回、約１４～約２１日ごとに１回、約１４～約１６日ごとに１回、約１４～約１８日ごとに１回、または、約１４～約２１日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１６日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回投与する。

【0121】

一部の態様では、ＥＶは、約５μｇと約７μｇの間の治療有効量、例えば、約６μｇで、約毎週ごとに１回、約２週間ごとに１回、約３週間ごとに１回、または約４週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約５μｇと約７μｇの間の治療有効量、例えば、約６μｇで、約毎週ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約５μｇと約７μｇの間の治療有効量、例えば、約６μｇで、約１０～１８日ごとに１回、約１２～約１６日ごとに１回、約１４～約２１日ごとに1回、約１０～約１４日ごとに１回、または約１４～約１８日ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約５μｇと約７μｇの間の治療有効量、例えば、約６μｇで、約１４日ごとに１回投与する。

【0122】

一部の態様では、ＥＶは、約１週間ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約８日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約９日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１１日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１３日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２週間ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１７日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１９日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３週間ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約毎週ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約８日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約９日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１１日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１３日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２週間ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１７日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１９日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３週間ごとに１回、約３．０μｇの治療有効量で投与する。

【0123】

一部の態様では、ＥＶは、約１週間ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約８日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約９日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１１日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１３日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２週間ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１７日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１９日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３週間ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約毎週ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約８日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約９日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１１日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１３日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２週間ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１７日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１９日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３週間ごとに１回、約６．０μｇの治療有効量で投与する。

【0124】

一部の態様では、ＥＶは、約１週間ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約７日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約８日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約９日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１０日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１１日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１３日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１４日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２週間ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１５日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１７日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１８日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１９日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２０日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２１日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３週間ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２２日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２３日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２４日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２５日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２６日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約２７日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。ＥＶは、約２８日ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約４週間ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約毎月ごとに１回、約１２．０μｇの治療有効量で投与する。

【0125】

一部の態様では、ＥＶは、約３．０μｇの治療有効量を、約２週間ごとに、少なくとも１用量、少なくとも約２用量、少なくとも約３用量、少なくとも約４用量、少なくとも約５用量、少なくとも約６用量、少なくとも約７用量、少なくとも約８用量、少なくとも約９用量、少なくとも約１０用量、少なくとも約１１用量、少なくとも約１２用量、少なくとも約１３用量、少なくとも約１４用量、少なくとも約１５用量、少なくとも約１６用量、少なくとも約１７用量、少なくとも約１８用量、少なくとも約１９用量、少なくとも約２０用量、少なくとも約２５用量、少なくとも約３０用量、少なくとも約３５用量、少なくとも約４０用量、少なくとも約４５用量、または少なくとも約５０用量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３．０μｇの治療有効量で、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３２週間、少なくとも約３４週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約３８週間、少なくとも約４０週間、少なくとも約４２週間、少なくとも約４４週間、少なくとも約４６週間、少なくとも約４８週間、少なくとも約５０週間、または、少なくとも約５２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３．０μｇの治療有効量で、少なくとも６週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３．０μｇの治療有効量で、少なくとも１２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約３．０μｇの治療有効量で、治療効果がある限りは、約２週間ごとに１回投与する。

【0126】

一部の態様では、ＥＶは、約６．０μｇの治療有効量を、約２週間ごとに、少なくとも１用量、少なくとも約２用量、少なくとも約３用量、少なくとも約４用量、少なくとも約５用量、少なくとも約６用量、少なくとも約７用量、少なくとも約８用量、少なくとも約９用量、少なくとも約１０用量、少なくとも約１１用量、少なくとも約１２用量、少なくとも約１３用量、少なくとも約１４用量、少なくとも約１５用量、少なくとも約１６用量、少なくとも約１７用量、少なくとも約１８用量、少なくとも約１９用量、少なくとも約２０用量、少なくとも約２５用量、少なくとも約３０用量、少なくとも約３５用量、少なくとも約４０用量、少なくとも約４５用量、または少なくとも約５０用量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約６．０μｇの治療有効量で、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３２週間、少なくとも約３４週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約３８週間、少なくとも約４０週間、少なくとも約４２週間、少なくとも約４４週間、少なくとも約４６週間、少なくとも約４８週間、少なくとも約５０週間、または、少なくとも約５２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約６．０μｇの治療有効量で、少なくとも６週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約６．０μｇの治療有効量で、少なくとも１２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約６．０μｇの治療有効量で、治療効果がある限りは、約２週間ごとに１回投与する。

【0127】

一部の態様では、ＥＶは、約１２．０μｇの治療有効量を、約２週間ごとに、少なくとも１用量、少なくとも約２用量、少なくとも約３用量、少なくとも約４用量、少なくとも約５用量、少なくとも約６用量、少なくとも約７用量、少なくとも約８用量、少なくとも約９用量、少なくとも約１０用量、少なくとも約１１用量、少なくとも約１２用量、少なくとも約１３用量、少なくとも約１４用量、少なくとも約１５用量、少なくとも約１６用量、少なくとも約１７用量、少なくとも約１８用量、少なくとも約１９用量、少なくとも約２０用量、少なくとも約２５用量、少なくとも約３０用量、少なくとも約３５用量、少なくとも約４０用量、少なくとも約４５用量、または少なくとも約５０用量で投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２．０μｇの治療有効量で、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１８週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２２週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２６週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約３０週間、少なくとも約３２週間、少なくとも約３４週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約３８週間、少なくとも約４０週間、少なくとも約４２週間、少なくとも約４４週間、少なくとも約４６週間、少なくとも約４８週間、少なくとも約５０週間、または、少なくとも約５２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２．０μｇの治療有効量で、少なくとも６週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２．０μｇの治療有効量で、少なくとも１２週間は、約２週間ごとに１回投与する。一部の態様では、ＥＶは、約１２．０μｇの治療有効量で、治療効果がある限りは、約２週間ごとに１回投与する。

【0128】

ＩＩ．Ａ．皮膚Ｔ細胞リンパ腫
本開示の特定の態様は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療を必要とする対象に、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、治療の方法に関する。本明細書で使用するＣＴＣＬは、皮膚に影響を及ぼす非ホジキンＴ細胞リンパ腫の一種のことを指す。ＣＴＣＬとして、菌状息肉腫（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、及びＣＤ３０陽性リンパ増殖性疾患と称するＴ細胞新生物のスペクトルなどの幾つかのサブタイプがあるが、これらに限定されない。このように、特定の態様では、本明細書に開示した方法は、ＭＦの治療を必要とする対象においてＭＦを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ＳＳの治療を必要とする対象においてＳＳを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ＣＤ３０陽性リンパ増殖性障害を治療する。

【0129】

一部の態様では、ＣＴＣＬは、悪性表現型を含む。一部の態様では、ＣＴＣＬは、遅発性、すなわち、進行の遅い表現型を含む。

【0130】

ＣＴＣＬには４つの主要なステージ、例えば、ＭＦ、ＳＳ、及び／またはＣＤ３０陽性リンパ増殖性障害がある。ステージ１のＣＴＣＬは、皮膚にのみ影響を与える表現型を特徴としており、沈着または斑として出現する。ステージ１Ａでは、皮膚の１０分の１未満が影響を受ける；ステージ１Ｂの間は、皮膚の１０分の１以上に影響が及ぶ。ステージ２のＣＴＣＬは、異常なリンパ腫細胞が認められない皮膚及び肥大したリンパ節での沈着また斑を特徴としている（ステージ２Ａ）；または、リンパ節の肥大の有無に関係なく、皮膚に盛り上がった１つ以上のしこりまたは腫瘍が認められる（ステージ２Ｂ）。ステージ３のＣＴＣＬは、皮膚の５分の４以上に影響を与える沈着または斑を特徴としており、皮膚には、一般的に、発赤、腫れ、かゆみ、時には痛み（紅皮症）を伴う；異常なリンパ腫細胞が認められない肥大したリンパ節；及び、血中のリンパ腫細胞（菌状息肉腫紅皮症；ステージ３Ａ）、血中の適度の数のリンパ腫細胞（セザリー症候群；ステージ３Ｂ）のいずれもが殆どまたは皆無である。ステージ４のＣＴＣＬは、皮膚に影響を及ぼす、及び、血流、リンパ節、またはその他の臓器にも及ぶ。ステージ４Ａとは、血中の異常な数のリンパ腫細胞（セザリー症候群）またはリンパ節内のリンパ腫細胞の提示のことを指す；及び、ステージ４Ｂは、リンパ腫がその他の臓器へ広がることを指す。

【0131】

一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ１ＡのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ１ＢのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＡのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＢのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＡのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＢのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ４ＡのＣＴＣＬを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ４ＢのＣＴＣＬを治療する。

【0132】

ＩＩ．Ｂ．メルケル細胞癌
本開示の特定の態様は、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）の治療を必要とする対象に対して、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、治療の方法に関する。本明細書で使用するＭＣＣ、または皮膚の神経内分泌癌とは、顔、頭または首に出現することが多い橙色または青みがかった赤色の結節を特徴とする稀少タイプの皮膚癌のことを指す。ＭＣＣは、一般的に、悪性度の高い皮膚癌であり、再発や転移のリスクが大きい。

【0133】

ＭＣＣに対する標準治療療法として、放射線療法、外科手術、全身療法もしくは化学療法、またはそれらの組み合わせがある。さらに、プログラム死１（ＰＤ－１）とそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１）との相互作用を阻害する抗体は、アベルマブを含むＭＣＣの治療法として承認を受けている。

【0134】

ステージ０のＭＣＣとは、皮膚の最上層での異常なメルケル細胞の出現のことを指す。ステージ１のＭＣＣは、直径２ｃｍ以下の腫瘍の出現のことを指す。ステージ２のＭＣＣとは、２ｃｍを超える腫瘍（ステージ２Ａ）または近傍の結合組織、筋肉、軟骨、または骨にまで広がった腫瘍（ステージ２Ｂ）のいずれかのことを指す。ステージ３ＡのＭＣＣとは、（ｉ）近傍の結合組織、筋肉、軟骨、または骨にまで広がっており、またはリンパ節にがんが認められるあらゆる大きさの腫瘍のことを指す；または（ｉｉ）リンパ節への広がりは、診察で認められ、かつ生検で確認することができる。ステージ３ＢのＭＣＣとは、（ｉ）近傍の結合組織、筋肉、軟骨、または骨にまで広がっており、かつリンパ節にがんが認められるあらゆる大きさの腫瘍のことを指す；または（ｉｉ）原発腫瘍と近位及び／または遠位リンパ節との間のリンパ管にまで広がっている。ステージＩＶのＭＣＣとは、皮膚の遠位位置またはその他の臓器、例えば、肝臓、肺、骨、または脳へがんが転移している、ことを指す。

【0135】

一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ０のＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ１のＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＡのＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＢのＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＡのＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＢのＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書で開示した方法は、ステージ４のＭＣＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、再発性ＭＣＣを治療する。

【0136】

ＩＩ．Ｃ．カポジ肉腫
本開示の特定の態様は、カポジ肉腫の治療を必要とする対象に対して、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、治療の方法に関する。本明細書で使用するカポジ肉腫とは、リンパ管または血管の内側を覆う細胞から発生するがんのことを指しており、通常は、皮膚、口中などの粘膜表面、またはリンパ節を含む身体のその他の部分ではさほど頻繁には出現しない腫瘍（紫色、赤色、または茶色の染み）のことを指す。

【0137】

カポジ肉腫には少なくとも４つのタイプ：流行性カポジ肉腫（ＨＩＶに感染した方々が発症する）、古典的カポジ肉腫、風土病のカポジ肉腫、及び医原性（移植関連）のカポジ肉腫がある。大抵の場合、カポジ肉腫は、免疫系が弱くなること、例えば、栄養失調または高齢の患者であること、または慢性ウイルス感染（例えば、ＨＩＶまたはＨＳＶ）に罹患している患者に関連している。

【0138】

カポジ肉腫は、一般的には、特に、ＨＩＶ患者に対しては、免疫再構成によって治療する。また、化学療法として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、及びそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。

【0139】

ＩＩ．Ｄ．トリプルネガティブ乳癌
本開示の特定の態様は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の治療を必要とする対象に対して、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、治療の方法に関する。本明細書で使用するＴＮＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲネガティブ）、プロゲステロン受容体（ＰＲネガティブ）、及びＨＥＲ２（ＨＥＲ２ネガティブ）の発現に関して陰性である腫瘍を特徴とする乳癌のことを指す。ＴＮＢＣは、悪性度の高いがんと考えられており、急速に増殖し、診断時に広がっている可能性が高く、その他の形態の乳癌よりも治療後の再発の発生率が高い。その結果、ＴＮＢＣは、その他の乳癌よりも生存率が低く、限局性ＴＮＢＣの５年生存率は約９１％、局所ＴＮＢＣでは約６５％、遠隔ＴＮＢＣでは約１１％である。

【0140】

ＴＮＢＣは、ＥＲ、ＰＲ、及びＨＥＲ２の発現を欠いているので、ＴＮＢＣに利用可能な治療法は限られている。非転移性ＴＮＢＣに関しては、化学療法と、それに続く手術が主な治療選択肢である。転移性ＴＮＢＣは、通常は、化学療法（例えば、ＰＡＲＰ阻害剤、プラチナをベースとした化学療法、及び／または免疫療法など）を使用して治療する。

【0141】

ステージ０のＴＮＢＣとは、ＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）などの非浸潤性乳癌のことを指す。ステージ０では、がん細胞または非がん性異常細胞が、それらが出現し始めた乳房部分から抜け出て、隣接する正常組織に到達または侵入するような証拠は無い。ステージＩのＴＮＢＣは、浸潤性乳癌のことを指す（がん細胞は、周囲の正常な乳房組織に侵入または浸潤することが認められる）。ステージ１Ａは、腫瘍が、最大で２センチメートル（ｃｍ）の大きさで、がんが、乳房の外に広がっていない（リンパ節にまで影響が及んでいない）浸潤性乳癌のことを指す。ステージ１Ｂとは、（ｉ）リンパ節にがん細胞（直径０．２ｍｍ～２ｍｍ）の小さな群が認められるが、乳房に腫瘍が出現していない、または（ｉｉ）乳房に２ｃｍ以下の腫瘍があり、かつ、リンパ節にがん細胞（直径０．２ｍｍ～２ｍｍ）の小さな群が存在する浸潤性乳癌のことのことを指す。ステージ１の乳癌では、顕微鏡的浸潤が可能である。顕微鏡的浸潤では、がん細胞は、管や小葉の内層の外側の組織に浸潤し始めてはいるが、１ｍｍを超える浸潤したがん細胞は測定されない。ＨＥＲ２ネガティブ乳癌（ＴＮＢＣなど）の場合、２ｃｍ超、５ｃｍ以下であり、リンパ節にまで広がっていない腫瘍を、ステージ１とみなす。ステージ２Ａは、（ｉ）乳房に腫瘍が認められないが、腋窩リンパ節または乳房の近傍のリンパ節に１つ～３つのがん（２ｍｍ以上）が認められる；または、（ｉｉ）腫瘍の大きさが、２ｃｍ以下であり、腋窩リンパ節に広がっている、乳癌のことのことを指す。ステージ２Ｂは、（ｉ）腫瘍の大きさが、２ｃｍ～５ｃｍであり、リンパ節に乳癌細胞（大きさが０．２～２ｍｍ）の小さなグループが出現している；（ｉｉ）腫瘍の大きさが、２ｃｍ～５ｃｍであり、１つ～３つの腋窩リンパ節または胸骨近傍のリンパ節へ転移している；または（ｉｉｉ）腫瘍が５ｃｍより大きいが、腋窩リンパ節にまで広がっていない、浸潤性乳癌のことを指す。ステージ３Ａは、（ｉ）乳房に腫瘍が認められない、または、腫瘍は、あらゆる大きさのものである、及び、４つ～９つの腋窩リンパ節または胸骨近傍のリンパ節に転位が認められる；（ｉｉ）腫瘍の大きさが、５ｃｍより大きく、及びリンパ節に乳癌細胞（大きさが０．２～２ｍｍ）の小さなグループが出現している；または、（ｉｉｉ）腫瘍が５ｃｍより大きく、及び１つ～３つの腋窩リンパ節または胸骨近傍のリンパ節にまでがんが広がっている、浸潤性乳癌のことを指す。ステージ３Ｂとは、あらゆる大きさの腫瘍であり、乳房の胸壁及び／または皮膚にまで広がっており、浮腫または潰瘍を引き起こしており、及び、腫瘍が（ｉ）９つまでの腋窩リンパ節、または（ｉｉ）胸骨近傍のリンパ節に広がっている、浸潤性乳癌のことである。ステージ３Ｃとは、乳房にがんの兆候がない、または腫瘍があっても、あらゆる大きさのものであり、胸壁及び／または乳房の皮膚にまで広がっており、及び、がんが、（ｉ）１０個以上の腋窩リンパ節に広がっている、（ｉｉ）鎖骨の上下のリンパ節、または（ｉｉｉ）胸骨近傍のリンパ節にまで広がっている、浸潤性乳癌のことである。ステージ４、または進行性乳癌とは、乳房及び近傍のリンパ節を超えて、肺、遠隔リンパ節、皮膚、骨、肝臓、脳などの身体のその他の臓器にまで転移した浸潤性乳癌のことを指す。

【0142】

一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ０のＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ１ＡのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ１ＢのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＡのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ２ＢのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＡのＴＮＢＣを処置する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＢのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ３ＣのＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ステージ４のＴＮＢＣを治療する。一部の態様では、本明細書で開示した方法は、再発性ＴＮＢＣを治療する。

【0143】

ＩＩ．Ｅ．膠芽腫
本開示の特定の態様は、膠芽腫の治療を必要とする対象に対して、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含む、治療の方法に関する。本明細書で使用する膠芽腫、別名、「多形性膠芽腫」または「ＧＢＭ」とは、ステージＩＶ星状細胞腫のサブセットであるがんの一種のことを指す。膠芽腫には、幾つかのバリアントがあり、巨細胞性膠芽腫、神経肉腫、古典的膠芽腫、神経性膠芽腫、前神経膠芽腫、及び間葉系膠芽腫などがある。膠芽腫腫瘍は、原発性（デノボ）または続発性であり得る。

【0144】

現在のところ、膠芽腫の治療法は無い。膠芽腫の標準治療は、外科的切除と、それに続く放射線療法と化学療法（例えば、テモゾロミド）である。ベバシズマブは、膠芽腫の二次治療としても使用することができる。診断後の生存期間の中央値は１５～１８か月であるが、この病気の５年生存率は約１０％である。すべての膠芽腫が再発するが、最初の治療は、腫瘍を、数か月、または数年にもわたって制御し続け得る。

【0145】

ＩＩ．Ｆ．併用療法
一部の態様では、本明細書に開示した方法は、ＩＬ－１２部分を含むＥＶ、例えば、エキソソームを、１つ以上の追加の治療薬（例えば、免疫腫瘍学的作用物質）と組み合わせて投与することを含むことができる。一部の態様では、併用療法は、免疫経路の複数の要素を標的とする。このような組合せの例として、ＳＴＩＮＧアゴニスト；腫瘍抗原提示を強める治療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；ネガティブ免疫調節を阻害する治療法、例えば、ＣＴＬＡ－４、及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を阻害する、及び／または、Ｔｒｅｇまたはその他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞）を枯渇または遮断することによって、ネガティブ免疫調節を阻害する治療法；ポジティブ免疫調節を刺激する治療法、例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０、またはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニスト、及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストで、ポジティブ免疫調節を刺激する治療法；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増加させる治療法；腫瘍内のＴｒｅｇｓなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療法、例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用する、またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズを枯渇させることによって、腫瘍内のＴｒｅｇｓなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療法；腫瘍内のサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を与える治療法；腫瘍細胞の免疫原性を高める治療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子改変細胞、例えば、キメラ抗原受容体が改変した細胞を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞導入（ＣＡＲ－Ｔ療法）；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、または一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法；Ｔ細胞のアネルギーまたは消耗を逆転／予防する治療法；腫瘍部位で自然免疫活性化及び／または炎症を引き起こす治療法；免疫刺激性サイトカインの投与；または、免疫抑制性サイトカインの遮断があるが、これらに限定されない。一部の態様では、追加の治療薬は、抗腫瘍薬である。

【0146】

一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、エキソソームと組み合わせて使用することができる免疫腫瘍学的作用物質は、免疫チェックポイント阻害剤（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を通るシグナル伝達を遮断する）を含む。本方法において使用し得る免疫チェックポイント阻害剤の例として、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、及び／または抗ＰＤ－Ｌ抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）、及びこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。

【0147】

一部の態様では、免疫腫瘍作用物質は、免疫チェックポイント活性化因子を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を通るシグナル伝達を促す）。特定の態様では、免疫チェックポイント活性化剤は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、または、それらのあらゆる組み合わせを含む。

【0148】

一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、エキソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニストと組み合わせて使用することもできる。あらゆるＳＴＩＮＧアゴニストを、本明細書に開示した方法及び組成物で使用することができる。ＳＴＩＮＧアゴニストの例として、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト－１、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＭＬ－ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＡＩＭＰ、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、ｃ－ジ－ＧＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＩＭＰ、ｃ－ジ－ＵＭＰ、または、これらのあらゆる組み合わせがあるが、これらに限定されない。好ましい態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、別名、３－３ ｃＡＩＭＰｄＦＳＨである。本明細書に開示した組成物及び方法において使用することができるＳＴＩＮＧアゴニストのさらなる例として、国際公開第ＷＯ ２０２１／０６２０６０号、及び／またはＷＯ ２０１９／１８３５７８号に記載したものがあり、これらの各々の全内容を参照により本明細書で援用する。

【0149】

一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、エキソソームは、１つ以上のさらなる免疫調節剤と組み合わせて使用することもできる。このような作用物質として、例えば、化学療法薬、低分子薬、または所与のがんに対する免疫応答を刺激する抗体を含み得る。一部の態様では、本明細書に記載した方法は、標準治療（例えば、手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせて使用する。

【0150】

一部の態様では、本明細書に開示したＥＶ、例えば、エキソソームと、本明細書に記載した第２の作用物質（例えば、免疫チェックポイント阻害薬）との組み合わせを、医薬として許容可能な担体で、単一の組成物として同時に投与することができる。その他の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームと、本明細書に記載した第２の作用物質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせを、別個の組成物として同時に投与することができる。さらなる態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームと、本明細書に記載した第２の作用物質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせを、連続して投与することができる。一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、第２の作用物質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を投与する前に投与する。

【0151】

ＩＩＩ．細胞外小胞、例えば、エキソソーム
本明細書では、対象の免疫系を調節することができるＥＶ、例えば、エキソソームを開示した。本開示において有用なＥＶ、例えば、エキソソームは、ＩＬ－１２部分を含むように遺伝子操作している。

【0152】

本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソームは、約２０～３００ｎｍの間の直径を有する細胞外小胞である。ある態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、または１９０～２１０ｎｍの間の直径を有する。本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソームの大きさは、後述の記載の方法に従って測定することができる。

【0153】

一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、内部（管腔）表面及び外表面を含む二重脂質膜（「ＥＶ、例えば、エキソソーム、膜」）を含む。特定の態様では、内部（管腔）表面は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内核（すなわち、内腔）に面する。特定の態様では、外表面は、エンドソーム、多胞体、または産生細胞もしくは標的細胞の膜／細胞質と接触することができる

【0154】

一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソーム、膜は、脂質及び脂肪酸を含む。一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソーム、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。

【0155】

一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソーム、膜は、内葉及び外葉を含む。内葉及び外葉の組成は、当該技術分野において公知の二層間分布アッセイによって決定することができる、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。一部の態様では、外葉の組成は、約７０～９０％のコリンリン脂質、約０～１５％の酸性リン脂質、及び約５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、内葉の組成は、約１５～４０％のコリンリン脂質、約１０～５０％の酸性リン脂質、及び約３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。

【0156】

一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソーム、膜は、グリカンなどの１つ以上の多糖を含む。

【0157】

一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、ＩＬ－１２部分を含み、また、ＩＬ－１２部分は、ＥＶの外表面またはＥＶの内腔表面のいずれかで、スキャフォールド部分を介してＥＶに連結する。

【0158】

一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶの内腔にＩＬ－１２部分を含む。その他の態様では、ＥＶは、ＥＶの外表面にＩＬ－１２部分を含み、任意に、第１のスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を介して連結する。その他の態様では、ＥＶは、ＥＶの内腔表面にＩＬ－１２部分を含み、任意に、スキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）を介して連結する。

【0159】

ＩＩＩ．Ａ．スキャフォールド部分
１つ以上のスキャフォールド部分を、本開示のＥＶにＩＬ－１２部分を固定するために使用することができる。一部の態様では、ＩＬ－１２部分を、スキャフォールド部分に連結する。一部の態様では、ＥＶは、複数のスキャフォールド部分を備える。一部の態様では、ＩＬ－１２を、第１のスキャフォールド部分に連結し、第２の部分（例えば、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を、第２のスキャフォールド部分に連結する。一部の態様では、第１のスキャフォールド部分及び第２のスキャフォールド部分は、同じタイプのスキャフォールド部分であり、例えば、第１及び第２のスキャフォールド部分は、両方とも、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質である。一部の態様では、第１のスキャフォールド部分及び第２のスキャフォールド部分は、異なるタイプのスキャフォールド部分であり、例えば、第１のスキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質であり、及び、第２のスキャフォールド部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質である。一部の態様では、第１のスキャフォールド部分は、本明細書に開示したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙである。一部の態様では、第１のスキャフォールド部分は、本明細書に開示したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。一部の態様では、第２のスキャフォールド部分は、本明細書に開示したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙである。一部の態様では、第２のスキャフォールド部分は、本明細書に開示したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。

【0160】

一部の態様では、ＥＶは、１つ以上のスキャフォールド部分を含み、このものは、例えば、ｎ個のＩＬ－１２部分を、ＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、内腔表面または外表面）に固定することができる。特定の態様では、スキャフォールド部分は、ポリペプチド（「スキャフォールドタンパク質」）である。特定の態様では、スキャフォールドタンパク質は、エキソソームタンパク質またはそのフラグメントを含む。その他の態様では、スキャフォールド部分は、非ポリペプチド部分である。一部の態様では、スキャフォールドタンパク質は、エキソソーム膜に、膜貫通タンパク質、内在性タンパク質、及び末梢タンパク質などの様々な膜タンパク質を豊富に含む。それらは、様々なＣＤタンパク質、トランスポーター、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンを含むことができる。特定の態様では、スキャフォールド部分（例えば、スキャフォールドタンパク質）は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘを含む。その他の態様では、スキャフォールド部分（例えば、エキソソームタンパク質）は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙを含む。さらなる態様では、スキャフォールド部分（例えば、エキソソームタンパク質）は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及びＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙの両方を含む。

【0161】

一部の態様では、ＩＬ－１２部分を、ＥＶの外表面のスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）に連結する。一部の態様では、ＩＬ－１２部分を、ＥＶの内腔表面のスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）に連結する。一部の態様では、ＩＬ－１２部分を、ＥＶの内腔表面のスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）に連結する。

【0162】

ＩＩＩ．Ａ．１．Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム
一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、その組成に改変を加えた膜を含む。例えば、それらの膜組成物は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変えることで改変することができる。

【0163】

一部の態様では、表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合などの化学的及び／または物理的方法で生成する。その他の態様では、表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、遺伝子工学によって生成する。遺伝子改変した産生細胞または遺伝子改変細胞の子孫から産生したＥＶ、例えば、エキソソームは、改変した膜組成物を含むことができる。一部の態様では、表面－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、スキャフォールド部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を高密度で、または低密度（例えば、多数）で有する、またはスキャフォールド部分のバリアントまたはフラグメントを含む。

【0164】

例えば、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）―遺伝子操作したＥＶは、スキャフォールド部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）をコードする外因性配列、またはそのバリアントもしくはそのフラグメントで形質転換した細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生することができる。外因性配列から発現するスキャフォールド部分を含むＥＶは、改変した膜組成物を含むことができる。

【0165】

スキャフォールド部分の様々な改変またはフラグメントを、本開示の態様に使用することができる。例えば、結合剤に対して強固な親和性を有するように改変したスキャフォールド部分は、結合剤を用いて精製することができる表面－遺伝子操作したＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ及び／または膜をさらに効果的な標的になるように改変したスキャフォールド部分を使用することができる。エキソソーム膜に対して特異的かつ効果的な標的化に必要な最小限のフラグメントを含むように改変したスキャフォールド部分も使用することができる。

【0166】

スキャフォールド部分は、融合分子、例えば、ＩＬ－１２部分に対するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘの融合分子として発現するように遺伝子操作することができる。例えば、融合分子は、ＩＬ－１２部分に連結した、本明細書に開示したスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらのフラグメントまたはバリアント）を含むことができる。

【0167】

一部の態様では、本明細書に記載した表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）－遺伝子操作したＥＶは、当該技術分野において公知のＥＶと比較して優れた特性を示す。例えば、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）－遺伝子操作した修飾タンパク質は、天然に存在するＥＶまたは従来のエキソソームタンパク質を使用して製造したＥＶよりも、表面に修飾タンパク質を非常に豊富に含む。さらに、本開示の表面（例えば、ＳｃａｆｆｏｌｄＸ）－遺伝子操作したＥＶは、天然に存在するＥＶまたは従来のエキソソームタンパク質を使用して製造したＥＶと比較して、大きな、特異的で、制御の効いた生物学的活性を有することができる。

【0168】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。このＰＴＧＦＲＮタンパク質の別名は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２－アルファ受容体調節タンパク質、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２－アルファ受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５である。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質の全長アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）を配列番号１として表２に示す。このＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１の８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）がある。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド、すなわり、配列番号１のアミノ酸２６～８７９を含まない配列番号１からなる。一部の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチドフラグメントは、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。その他の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチドフラグメントは、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインと、（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端にある少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個のアミノ酸；（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端にある少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個のアミノ酸、または、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。

【0169】

一部の態様では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドのフラグメントは、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。

【0170】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６～８７９のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一のアミノ酸配列を含む。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３３と、少なくとも約少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、ただし、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異がある。これらの変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらのあらゆる組み合わせとすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、及び配列番号３３のＮ末端及び／またはＣ末端において、１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または、それより長いアミノ酸を含む。

【0171】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号９、１４、２１、２２、または２３と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、ＳｃａｆｆｏｌｄＸは、配列番号９、１４、２１、２２、または２３のアミノ酸配列を含む、ただし、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異がある。これらの変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらのあらゆる組み合わせとすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号９、１４、２１、２２、または２３のアミノ酸配列を含み、及び配列番号９、１４、２１、２２、または２３のＮ末端及び／またはＣ末端において、１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または、それより長いアミノ酸を含む。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0172】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号９に記載のバシギン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質の別名は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７である。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｐ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号９のアミノ酸１～２１である。配列番号９のアミノ酸１３８～３２３は細胞外ドメインであり、アミノ酸３２４～３４４は膜貫通ドメインであり、及び配列番号９のアミノ酸３４５～３８５は細胞質ドメインである。

【0173】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号９のアミノ酸２２～３８５と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＢＳＧポリペプチドのフラグメントは、ＩｇＶ、例えば、配列番号９のアミノ酸２２１～３１５の１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１０、１１、または１２と、少なくとも約少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含む、ただし、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異がある。これらの変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらのあらゆる組み合わせとすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１０、１１、または１２のアミノ酸配列を含み、及び配列番号１０、１１、または１２のＮ末端及び／またはＣ末端において、１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または、それより長いアミノ酸を含む。

【0174】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）、別名、ＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ－２）、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質４（ＫＣＴ－４）、ＬＩＲ－Ｄｌ、プロスタグランジン調節様タンパク質（ＰＧＲＬ）またはＣＤ３１６を含む。全長ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔでの受託番号はＱ９６９Ｐ０であり、本明細書では配列番号１４に記載している。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号１４のアミノ酸１～２７）、細胞外ドメイン（配列番号１４のアミノ酸２８～５７９）、膜貫通ドメイン（配列番号１４のアミノ酸５８０～６００）、及び細胞質ドメイン（配列番号１４のアミノ酸６０１～６１３）を有する。

【0175】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１４のアミノ酸２８～６１３と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ８タンパク質は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１５、１６、１７、または１８と、少なくとも約少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含む、ただし、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異がある。これらの変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらのあらゆる組み合わせとすることができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号１５、１６、１７、または１８のアミノ酸配列を含み、及び配列番号１５、１６、１７、または１８のＮ末端及び／またはＣ末端において、１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、または、それより長いアミノ酸を含む。

【0176】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）、別名、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ－３）を含み、及び配列番号２０のアミノ酸配列で示している。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２０のアミノ酸１～１９）、細胞外ドメイン（配列番号２０のアミノ酸２０～１１２４）、膜貫通ドメイン（配列番号２０のアミノ酸１１２５～１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号２０のアミノ酸１１４６～１１９４）を有する。

【0177】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号２０のアミノ酸２８～６１３と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ３タンパク質は、ＩｇＶのような１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。

【0178】

一部の態様では、本開示に関するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、インテグリンベータ－２９（ＩＴＧＢ２１タンパク質）、別名、フィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質Ｉｌａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ－４サブユニットベータ、またはＣＤ２９を含み、及び配列番号２１のアミノ酸配列として示している。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２１のアミノ酸１～２１）、細胞外ドメイン（配列番号２１のアミノ酸２１～７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号２１のアミノ酸７２９～７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号２１のアミノ酸７５２～７９８）を有する。

【0179】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、アミノ酸配列２１のアミノ酸２１～７９８と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＩＴＧＢ１タンパク質は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。

【0180】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＩＴＧＡ４タンパク質を含み、このものは、シグナルペプチド（配列番号２２のアミノ酸１～３３）を欠いている配列番号２２と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＩＴＧＡ４タンパク質は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。

【0181】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含み、このものは、シグナルペプチドを欠いている配列番号２３と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％が同一であるアミノ酸を含む。一部の態様では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いている。

【0182】

その他のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の例は、２０１９年２月５日発行の米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号に認められることができ、その全内容を、参照により援用する。

【0183】

一部の態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠いているスキャフォールド部分のフラグメントをコードする。一部の態様では、配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠いているスキャフォールド部分のフラグメントをコードする。一部の態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠いているスキャフォールド部分のフラグメントをコードする。一部の態様では、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠いているスキャフォールド部分のフラグメントをコードする。

【0184】

一部の態様では、スキャフォールド部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を、１つ以上の異種タンパク質に連結する。１つ以上の異種タンパク質を、スキャフォールド部分のＮ末端に連結することができる。１つ以上の異種タンパク質を、スキャフォールド部分のＣ末端に連結することができる。一部の態様では、１つ以上の異種タンパク質を、スキャフォールド部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結する。一部の態様では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。一部の態様では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。

【0185】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、あらゆる部分、例えば、ＩＬ－１２部分を、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面及び外表面に同時に連結するために使用することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、ＥＶ、例えば、エキソソームの外表面に加えて、内腔内部（例えば、内腔表面）のＩＬ－１２部分に連結するために使用することができる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＩＬ－１２を、ＥＶの内腔表面及び／またはＥＶの外表面に固定することができるスキャフォールドタンパク質である。

【0186】

ＩＩＩ．Ａ．２．Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソーム
一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、天然に存在するＥＶのそれとは異なる内部空間（すなわち、内腔）を備える。例えば、ＥＶは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面の組成が、天然に存在するエキソソームとは異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含量を有するように変更することができる。

【0187】

一部の態様では、遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、スキャフォールド部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）をコードする外因性配列、または、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面の組成もしくは含量を変化させるスキャフォールド部分の改変もしくはフラグメントで形質転換した細胞から製造することができる。ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面で発現することができるエキソソームタンパク質の様々な改変またはフラグメントを、本開示の態様に使用することができる。

【0188】

一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面を変化させることができるエキソソームタンパク質として、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、または、これらのあらゆる組み合わせがあるが、これらに限定されない。

【0189】

一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６６）を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、プロテインキナーゼＣ基質、８０ｋＤａタンパク質、軽鎖としても知られている。全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、長さが３３２アミノ酸であり、及びアミノ酸残基１５２～１７６にカルモジュリン結合ドメインを含む。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９００６）を含む。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１、及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質としても知られている。全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、長さが１９５アミノ酸である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０において脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを有する。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、ＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８０７２３）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａのニューロン組織が豊富な酸性タンパク質、またはニューロン軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２としても知られている。全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、長さが２２７アミノ酸である。選択的スプライシングによって生成する異性体は、配列番号４９のアミノ酸８８～１４１のアミノ酸（異性体１）を欠いている。表３に、本明細書に開示した例示的なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ（すなわち、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰｌタンパク質）の全長配列を提供する。

【表3】

【0190】

成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号４９の最初のＭｅｔを欠失しており、したがって、配列番号４９のアミノ酸２～２２７を含む。同様に、成熟したＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質もまた、それぞれ、配列番号４７及び４８の最初のＭｅｔを欠いている。したがって、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、配列番号４７のアミノ酸２～３３２を含む。成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、配列番号４８のアミノ酸２～２２７を含む。

【0191】

その他の態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、配列番号４９のアミノ酸２～２２７と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または配列番号１００が同一であるアミノ酸配列を含む。その他の態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、ただし、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異がある。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらのあらゆる組み合わせであり得る。

【0192】

一部の態様では、配列番号４７～４９のアミノ酸残基１のＭｅｔを欠いている配列番号４７～４９のいずれかのタンパク質配列は、本開示のためのＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ（例えば、ＩＬ－１２部分に連結したスキャフォールド部分として十分である。一部の態様ではＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、配列番号４７～４９のアミノ酸残基１のＭｅｔを欠いている配列番号４７～４９のいずれかと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または配列番号１００が同一であるアミノ酸配列を含む。

【0193】

本明細書に記載したＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ－遺伝子操作したＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号４７～４９のアミノ酸残基１のＭｅｔを欠いている配列番号４７～４９に記載の配列で形質転換した細胞から製造することができる。

【0194】

一部の態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、また、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と会合している。一部の態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含む；また、細胞内ドメインは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、また、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と関連している。本明細書で使用する用語「関連する」は、スキャフォールドタンパク質と、ＥＶ、例えば、及びエキソソームの内腔表面との間の相互作用のことを指しており、膜成分に対する共有結合には関与しない。例えば、本開示に有用なスキャフォールドは、例えば、脂質固定（例えば、ミリスチン酸）、及び／または膜リン脂質の負に帯電した頭部と静電的に相互作用する多塩基性ドメインを介して、ＥＶの内腔表面と会合することができる。その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）、及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、また、ＮＤは、ＥＶの内腔表面と関連しており、及びＥＤがイオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合しており、また、ＥＤは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続する塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を順番に含む。

【0195】

その他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、また、ＮＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と会合しており、及びＥＤは、イオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合しており、また、ＥＤは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続する塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を順番に含む。

【0196】

一部の態様では、ＮＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と、脂質化、例えば、ミリストイル化を介して会合する。一部の態様では、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。一部の態様では、Ｎ末端Ｇｌｙは、ミリストイル化する。

【0197】

一部の態様では、ＥＤは、イオン相互作用によって、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と会合する。一部の態様では、ＥＤは、静電相互作用、特に、引力静電相互作用によって、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面と会合する。

【0198】

一部の態様では、ＥＤは、（ｉ）１つの塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または、（ｉｉ）ポリペプチド配列において互いに隣り合う２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、また、ｎは、１と１０との間の整数である。

【0199】

その他の態様では、ＥＤのＮ末端が、ＮＤのＣ末端のリジンに直接に連結している場合、ＥＤは、少なくともリジンを含み、及び、ＮＤは、Ｃ末端にリジンを含む、すなわち、リジンは、ＥＤのＮ末端にあり、及びＮＤのＣ末端でリジンに融合している。その他の態様では、ＥＤのＮ末端が、リンカー、例えば、１つ以上のアミノ酸でＮＤのＣ末端に連結している場合、ＥＤは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのリジンを含む。

【0200】

本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Yタンパク質の例は、国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号に開示されており、その全内容を、参照により本明細書で援用する。

【0201】

一部の態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、脂質固定として機能するスキャフォールドタンパク質のＮ末端において、脂質化アミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。一部の態様では、スキャフォールドタンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。Ｎ末端Ｇｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化の絶対要件である。一部の態様では、スキャフォールドタンパク質のＮ末端のアミノ酸残基を合成する。一部の態様では、スキャフォールドタンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。

【0202】

その他の態様では、脂質固定は、当該技術分野で公知のあらゆる脂質固定、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールですることができる。特殊な状況下では、例えば、ミリスチン酸が制限を受ける培養培地を使用することで、短鎖及び不飽和などのその他の一部の脂肪酸を、Ｎ末端グリシンに結合することができる。例えば、ＢＫチャネルでは、ミリスチン酸は、ヒドロキシエステル結合を介して、翻訳後に、内部のセリン／スレオニンまたはチロシン残基に結合する、ことが報告されている。当該技術分野で公知のメンブレン固定を、以下の表に示す：

【表4】

【0203】

ＩＩＩ．Ｂ．リンカー
上記したように、本開示の細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム及びナノ小胞）は、関心のある分子（例えば、ＩＬ－１２部分）をＥＶ（例えば、外表面または内腔表面に）連結する１つ以上のリンカーを含むことができる。一部の態様では、ＩＬ－１２部分は、直接に、またはスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）を介してＥＶに連結する。特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、リンカーによってスキャフォールド部分に連結する。特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、リンカーによって第２のスキャフォールド部分に連結する。

【0204】

特定の態様では、ＩＬ－１２部分を、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘを介してエキソソームの外表面に連結する。さらなる態様では、ＩＬ－１２部分を、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙを介してエキソソームの内腔表面に連結する。リンカーは、当該技術分野において公知のあらゆる化学的部分とすることができる。

【0205】

一部の態様では、２つ以上のリンカーを直列に連結することができる。複数のリンカーが存在する場合、それぞれのリンカーの異同は問わない。一般に、リンカーは柔軟性を与えるか、または立体障害を防止／改善する。リンカーは通常は切断されない；しかしながら、特定の態様では、そのような切断が望ましい場合もある。したがって、一部の態様では、リンカーを、リンカーの配列内に位置させる、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接させることができる１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むことができる。

【0206】

一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。

【0207】

一部の態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然のものである。ある態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直線配列を、第１の直線配列が自然には連結されていない、または遺伝子的に自然に融合されていないアミノ酸の第２の直線配列に連結または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（または、ポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）を含む。例えば、ある態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変した形態（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）である非天然のポリペプチドを含むことができる。

【0208】

一部の態様では、リンカーは、非ポリペプチド部分である。

【0209】

リンカーは、切断（「切断可能なリンカー」）に対して感受性であり得る、それにより、生物学的に活性な分子（例えば、ＩＬ－１２部分）の放出を促す。

【0210】

一部の態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。一部の態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含む。一部の態様では、リンカーは「酸不安定性リンカー」である。一部の態様では、酸不安定性リンカーは、ヒドラゾンを含む。適切な酸不安定性リンカーとして、例えば、ｃｉｓ－アコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらのあらゆる組み合わせもある。

【0211】

一部の態様では、リンカーは、非切断性リンカーを含む、

【0212】

ＩＶ．遺伝子操作したエキソソームを生産する産生細胞
ＥＶ、例えば、エキソソームは、インビトロで増殖させた細胞または対象の体液から産生することができる。エキソソームをインビトロで細胞培養から産生する場合、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、及びＭＳＣを使用することができる。特定の態様では、産生細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらのあらゆる組み合わせではない。

【0213】

産生細胞は、本明細書に記載したＥＶを産生するＩＬ－１２部分をコードする外因性配列を含むように遺伝子改変することができる。遺伝子改変した産生細胞は、一過的な、または安定した形質転換によって外因性配列を含むことができる。外因性配列は、プラスミドとして形質転換することができる。一部の態様では、外因性配列は、ベクターである。外因性配列は、産生細胞のゲノム配列、標的部位、またはランダム部位に安定に組み込むことができる。一部の態様では、内腔を遺伝子操作したエキソソームの産生のために安定な細胞株が生成する。

【0214】

外因性配列は、エキソソームタンパク質をコードする内因性配列の上流（５’末端）または下流（３’末端）内に位置する産生細胞のゲノム配列に挿入することができる。当該技術分野で公知の様々な方法を、産生細胞に対する外因性配列の導入に使用することができる。例えば、様々な遺伝子編集方法（例えば、相同組換えを用いる方法、トランスポゾン媒介系、ｌｏｘＰ－ｃｒｅ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮ）を使用して改変した細胞は、本開示の範囲内にある。

【0215】

外因性配列は、本明細書で開示したスキャフォールド部分またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードする配列を含むことができる。スキャフォールド部分をコードする配列の余分なコピーを導入して、本明細書に記載した（例えば、ＥＶ、例えばエキソソームの表面、または内腔表面に高密度のスキャフォールド部分を有する）エキソソームを生成することができる。スキャフォールド部分の改変またはフラグメントをコードする外因性配列を導入して、スキャフォールド部分の改変またはフラグメントを含む内腔－遺伝子操作した、及び／または表面－遺伝子操作したエキソソームを生成することができる。

【0216】

一部の態様では、産生細胞は、ＩＬ－１２部分に連結したスキャフォールド部分をコードする１つ以上のベクターで改変、例えば、トランスフェクトすることができる。

【0217】

一部の態様では、本明細書で開示した産生細胞は、さらなる外因性配列を含むようにさらに改変する。例えば、内因性遺伝子発現を調節する追加の外因性配列を導入する、またはペイロードとして特定のポリペプチド（例えば、ＩＬ－１２部分）を含むエキソソームを産生することができる。一部の態様では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変しており、一方は、スキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）、またはそのバリアントもしくはフラグメントをコードしており、及び、他方は、ペイロード、例えば、ＩＬ－１２部分をコードする）。一部の態様では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変しており、その一方は、本明細書に開示したスキャフォールド部分、またはそのバリアントもしくはフラグメントをコードする、及び、他方は、エキソソームに追加の機能性を付与するタンパク質をコードする。一部の態様では、産生細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個以上の追加の外因性配列を含むようにさらに改変する。

【0218】

一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、表面－遺伝子操作したエキソソーム、及び／または内腔－遺伝子操作したエキソソーム）を、本明細書に開示した全長の成熟スキャフォールド部分またはＩＬ－１２部分に連結したスキャフォールド部分をコードする配列で形質転換した細胞から産生することができる。本明細書に記載したスキャフォールド部分のいずれでも、プラスミド、ゲノムに挿入した外因性配列、またはその他の外因性核酸、例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から発現させることができる。

【0219】

Ｖ．医薬組成物
本明細書では、所望の純度を有する本開示のＥＶ、例えば、エキソソーム、及び医薬として許容可能な担体または賦形剤を、対象への投与に適した形態で含む医薬組成物を提供する。医薬として許容可能な賦形剤または担体は、一部には、投与する特定の組成物によって、また、組成物を投与するために使用する特定の方法によって決定することができる。したがって、複数の細胞外小胞、例えば、エキソソームを含む医薬組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は、一般的には、無菌状態で、米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規制のすべてに完全に準拠するように製剤する。

【0220】

一部の態様では、医薬組成物は、本明細書に記載した１つ以上の治療薬及びエキソソームを含む。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、医薬として許容可能な担体で、１つ以上の追加の治療薬、例えば、抗腫瘍薬と同時に投与する。一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬、例えば、抗腫瘍薬を投与する前に投与する。その他の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬、例えば、抗腫瘍薬を投与した後に投与する。さらなる態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬、例えば、抗腫瘍薬と同時に投与する。

【0221】

許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、使用する用量及び濃度で、レシピエント、例えば、動物またはヒトに対して無毒であり、及び、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸、及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及び、ｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンなどのその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、などがある。

【0222】

担体または希釈剤の例として、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンがあるが、これらに限定されない。医薬活性物質のための当該媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で周知である。あらゆる従来の培地または化合物が、本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソームと不適合でない限り、組成物でのそれらの使用を企図している。補助治療剤を組成物に添加することもできる。一般的に、医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤する。ＥＶ、例えば、エキソソームは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路または吸入剤として投与することができる。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与する。ＥＶ、例えば、エキソソームは、任意に、ＥＶ、例えば、エキソソームが意図する疾患、障害または状態の治療に、少なくとも部分的に有効であるその他の治療薬と組み合わせて投与することができる。

【0223】

溶液または懸濁液は、次の成分を含むことができる：水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、及び、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧を調節するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。製剤は、ガラスもしくはプラスチックで形成したアンプル、使い捨て注射器、または複数用量バイアルに封入することができる。

【0224】

注射の使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末がある。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。組成物は、一般的に、無菌であり、容易に注射器で使用できる程度の流動性を有する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどで達成することができる。必要に応じて、等張化合物、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを、組成物に添加することができる。例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅延させる化合物を、組成物に含めることで、注射用組成物の長期的吸収を可能にする。

【0225】

ＥＶ、例えば、エキソソームを、有効量で、適切な溶媒において、必要に応じて、本明細書に記載した１つ以上の成分と一緒に加えて滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、ＥＶ、例えば、エキソソームを、塩基性分散媒、及びあらゆる所望のその他の成分を含む無菌溶媒に添加して調製する。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の事例では、調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライであり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分、及びあらゆる追加の所望の成分の粉末が得られる。ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの持続的放出またはパルス放出を可能ならしめる形態で製剤できるデポー注射またはインプラント製剤の形態で投与することができる。

【0226】

ＥＶ、例えば、エキソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜的手段によって行うこともできる。経粘膜投与のために、震盪させるバリアに対して適切な浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は、一般的に、当該技術分野で周知のものであり、例えば、経粘膜投与の場合では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は、例えば、点鼻薬を使用して達成することができる。

【0227】

ある態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、医薬組成物が有益であろう対象に静脈内投与する。特定のその他の態様では、組成物は、例えば、リンパ内注射によって、または節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）： １７９０８（２００８）を参照されたい）によって、または筋肉内注射によって、皮下投与によって、腫瘍内注射によって、胸腺または肝臓への直接注射によって、リンパ系に投与する。

【0228】

ある態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与する。特定の態様では、医薬組成物は、投与した後にデポーを形成することができる製剤として投与する。特定の好ましい態様では、デポーは、ＥＶ、例えば、エキソソームを緩慢に循環させる、またはデポー形態のままとする。

【0229】

一般的に、医薬として許容可能な組成物は、夾雑物を含んでおらず、生体適合性であり、毒性が無く、かつ対象への投与に適するように高度に精製されている。水が担体の構成成分である場合、水は高度に精製されており、及び、例えば、エンドトキシンなどの汚染物質が無いように処理する。

【0230】

医薬として許容可能な担体として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油があるが、これらに限定されない。医薬組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／または保存剤をさらに含むことができる。

【0231】

本明細書に記載した医薬組成物は、本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソーム、及び、任意に、医薬として活性な作用物質または治療薬を含む。治療薬は、生物学的作用物質、低分子作用物質、または核酸剤とすることができる。

【0232】

本明細書に記載したＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物を含む製剤を提供する。一部の態様では、製剤は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤する。一部の態様では、製剤は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤する。

【0233】

特定の態様では、エキソソームの調製は、放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、ＵＶ線に供して、残留複製能力核酸に損傷を与える。

【0234】

特定の態様では、エキソソームの調製では、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用して、ガンマ線照射を与える。

【0235】

特定の態様では、エキソソームの調製では、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、または１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用して、Ｘ線照射を与える。

【0236】

一部の態様では、エキソソームは、国際公開第ＷＯ ２０２１／０６２３１７号に開示した医薬組成物内にあり、この文献の全内容を、参照により、本明細書で援用する。一部の態様では、組成物：
（ａ）本明細書に開示したＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞；
（ｂ）約１４６ｍＭの濃度のスクロース；
（ｃ）約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム；
（ｄ）約５ｍＭの濃度のリン酸一塩基性カリウム；
（ｅ）約１５ｍＭの濃度のリン酸二塩基性ナトリウム、
（ｆ）組成物のｐＨが、約７．２であること、を含む。

【0237】

一部の態様では、組成物は：
（ａ）本明細書に開示したＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞；
（ｂ）約５％の濃度のスクロース；
（ｃ）約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム；
（ｄ）約５ｍＭの濃度のリン酸一塩基性カリウム；
（ｅ）約１５ｍＭの濃度のリン酸二塩基性ナトリウム、
（ｆ）組成物のｐＨが、約７．２であること、を含む。

【0238】

ＶＩ．キット
本明細書に記載した１つ以上のエキソソームを含むキットも本明細書で提供する。一部の態様では、本明細書では、本明細書に記載した医薬組成物の１つ以上の成分、例えば、本明細書に記載した１つ以上のエキソソームなどを充填した１つ以上の容器、任意に使用説明書を含む医薬パックまたはキットを提供する。一部の態様では、キットは、本明細書に記載した医薬組成物、及び本明細書に記載したようなあらゆる予防剤または治療薬を含む。一部の態様では、キットは、本明細書に開示したあらゆる方法に従ってＥＶを投与する指示書をさらに含む。

【0239】

ＶＩＩ．ＥＶの生産方法
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載したＥＶを製造する方法にも関する。一部の態様では、方法は、ＥＶ、例えば、エキソソームを産生細胞から得る工程、また、産生細胞が、ＥＶ、例えば、エキソソームの１つ以上の成分（例えば、ＩＬ－１２部分を含む；及び、任意に、ＥＶ、例えば、エキソソームを単離する。一部の態様では、方法は：本明細書に開示したＥＶの１つ以上の要素（例えば、ＩＬ－１２部分）を導入して産生細胞を改変すること；改変した産生細胞からＥＶ、例えば、エキソソームを得る工程；及び、任意に、得たＥＶ、例えば、エキソソームを単離する、ことを含む。さらなる態様では、方法は：産生細胞からＥＶを得る；得たＥＶを単離する；及び、単離したＥＶを改変する、ことを含む。特定の態様では、方法は、単離したＥＶを、医薬組成物に製剤することをさらに含む。

【0240】

ＶＩＩ．Ａ．産生細胞を改変する方法
上記したように、一部の態様では、ＥＶを製造する方法は、１つ以上の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）で産生細胞を改変することを含む。特定の態様では、１つ以上の部分は、ＩＬ－１２部分を含む。一部の態様では、１つ以上の部分は、本明細書に開示したスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）をさらに含む。

【0241】

一部の態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株とすることができる。特定の態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株の例として：ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株、及びそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。特定の態様では、哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、またはそれらの組み合わせがある。一部の態様では、産生細胞は、初代細胞である。特定の態様では、初代細胞を、初代哺乳動物細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞とすることができる。

【0242】

一部の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）などの免疫細胞ではない。その他の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、またはそのようなあらゆる細胞に由来する細胞）ではない。

【0243】

一部の態様では、１つ以上の部分を、導入遺伝子またはｍＲＮＡとすることができる、及び、トランスフェクション、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、押出、超音波処理、細胞融合、または当業者に公知であるその他の方法で産生細胞に導入することができる。

【0244】

一部の態様では、１つ以上の部分は、トランスフェクションによって産生細胞に導入する。一部の態様では、カチオン性脂質及びポリマーなどの合成高分子を使用して１つ以上の部分を適切な産生細胞に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。一部の態様では、カチオン性脂質は、電荷相互作用によって１つ以上の部分と複合体を形成する。これらの態様の一部は、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。一部のその他の態様では、カチオン性ポリマーを使用して産生細胞をトランスフェクトすることができる。これらの態様の一部では、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して、１つ以上の部分を産生細胞に導入することができる。また、１つ以上の部分は、粒子介在型トランスフェクション、「遺伝子銃」、バイオリステック、またはパーティクルボンバードメント法などの物理的方法を使用して産生細胞に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用して産生細胞のトランスフェクション効率を評価することができる。

【0245】

特定の態様では、１つ以上の部分は、ウイルス形質導入によって産生細胞に導入する。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスなどの数多くのウイルスを遺伝子導入ビヒクルとして使用することができる。ウイルス媒介型遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスをベースとしたベクター、ならびにレトロウイルスをベースとしたベクターを含む。

【0246】

特定の態様では、１つ以上の部分は、エレクトロポレーションによって産生細胞に導入する。エレクトロポレーションは、細胞膜に一時的な細孔を形成し、細胞内への様々な分子の導入を可能ならしめる。一部の態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびにポリペプチド及び非ポリペプチド治療薬を、エレクトロポレーションによって産生細胞に導入することができる。

【0247】

特定の態様では、１つ以上の部分は、マイクロインジェクションによって産生細胞に導入する。一部の態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して、１つ以上の部分を顕微鏡レベルで産生細胞に注入することができる。

【0248】

特定の態様では、１つ以上の部分は、押し出しによって産生細胞に導入する。

【0249】

特定の態様では、１つ以上の部分は、超音波処理によって産生細胞に導入する。一部の態様では、産生細胞は高強度の音波に曝露されると、細胞膜の一時的な破裂が起こり、１つ以上の部分のローディングを可能ならしめる。

【0250】

特定の態様では、１つ以上の部分は、細胞融合によって産生細胞に導入する。一部の態様では、１つ以上の部分は、電気的細胞融合によって導入する。その他の態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、産生細胞を融合するために使用する。さらなる態様では、センダイウイルスを、産生細胞を融合するために使用する。

【0251】

一部の態様では、１つ以上の部分は、低張溶解によって産生細胞に導入する。そのような態様では、産生細胞を低イオン強度緩衝液に曝露して破裂させて、１つ以上の部分のローディングを可能ならしめる。その他の態様では、低張溶液に対する制御した透析を使用して産生細胞を膨潤させて、産生細胞の膜に細孔を形成することができる。その後、産生細胞を、膜の再封止を可能ならしめる条件に曝露する。

【0252】

一部の態様では、１つ以上の部分は、洗剤処理によって産生細胞に導入する。特定の態様では、産生細胞を中性洗剤で処理して、１つ以上の部分のローディングを可能ならしめる細孔を形成することで産生細胞の膜を一時的に破裂させる。産生細胞のローディングを終えた後に、洗剤を洗い流して膜の再封止を行う。

【0253】

一部の態様では、１つ以上の部分は、受容体介在型エンドサイトーシスによって産生細胞に導入する。特定の態様では、産生細胞は、１つ以上の部分の結合時に、受容体及び関連する部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。

【0254】

一部の態様では、１つ以上の部分は、濾過によって産生細胞に導入する。特定の態様では、産生細胞及び１つ以上の部分を、産生細胞より小さい孔径のフィルターに強制的に通すことで、産生細胞の膜を一時的に破裂させて、１つ以上の部分を産生細胞に入れることができる。

【0255】

一部の態様では、産生細胞に対して、数回の凍結融解サイクルを行うことで細胞膜の破裂を招き、１つ以上の部分のローディングが可能となる。

【0256】

ＶＩＩ．Ｂ．ＥＶ、例えば、エキソソームの改変方法
一部の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを製造する方法は、１つ以上の部分を、ＥＶに直接に導入して、単離したＥＶを改変することを含む。特定の態様では、１つ以上の部分は、ＩＬ－１２部分を含む。一部の態様では、１つ以上の部分は、本明細書で開示したスキャフォールド部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）を含む。

【0257】

特定の態様では、１つ以上の部分は、トランスフェクションによってＥＶに導入する。一部の態様では、カチオン性脂質及びポリマーなどの合成高分子を使用して１つ以上の部分をＥＶに導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンなどの化学物質を使用して、１つ以上の部分を、ＥＶに導入することができる。

【0258】

特定の態様では、１つ以上の部分を、エレクトロポレーションによってＥＶに導入する。一部の態様では、ＥＶは、ＥＶ膜に一過的な細孔を生じる電界に曝されて、１つ以上の部分のローディングを可能にする。

【0259】

特定の態様では、１つ以上の部分を、マイクロインジェクションによってＥＶに導入する。一部の態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して、１つ以上の部分を、顕微鏡レベルでＥＶに直接に注入することができる。

【0260】

特定の態様では、１つ以上の部分は、押し出しによってＥＶに導入する。

【0261】

特定の態様では、１つ以上の部分は、超音波処理によってＥＶに導入する。一部の態様では、ＥＶを高強度の音波に曝露して、ＥＶ膜に一時的な破裂を起こして、１つ以上の部分のローディングを可能にする。

【0262】

一部の態様では、１つ以上の部分を、ＥＶの表面にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは、化学的または酵素的に、当該技術分野で公知の方法で達成することができる。

【0263】

一部の態様では、ＥＶは、化学的にコンジュゲートした１つ以上の部分を含む。化学的コンンジュケーションは、リンカーの使用の有無に関係なく、１つ以上の部分と、別の分子との共有結合によって達成することができる。そのようなコンジュゲーションの形成は、当業者の理解の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための様々な技術が公知であり、特定の技術の選択は、コンジュゲーションする材料によって定まる。特定の態様では、ポリペプチドを、ＥＶにコンジュゲートする。一部の態様では、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子などの非ポリペプチドを、ＥＶにコンジュゲートする。

【0264】

一部の態様では、１つ以上の部分を、低張溶解によってＥＶに導入する。このような態様では、ＥＶは、低イオン強度の緩衝剤に曝されて、ＥＶが破裂して、１つ以上の部分のローディングが可能になる。その他の態様では、低張溶液に対する制御透析を使用して、ＥＶを膨潤させて、ＥＶ膜に細孔を作り出すことができる。その後、ＥＶは、膜の再封止を可能にする条件に曝す。

【0265】

一部の態様では、１つ以上の部分は、洗剤処理によってＥＶに導入する。特定の態様では、細胞外小胞は、ＥＶ膜を一時的に損傷させる中性洗剤で処理して、１つ以上の部分のローディングを可能にする細孔を作り出す。ＥＶのローディングを終えた後に、洗剤を洗い流してしまい、それにより、膜が再封止される。

【0266】

一部の態様では、１つ以上の部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってＥＶに導入する。特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の部分の結合時に、受容体及び関連部分の内在化を誘導する表面受容体を有する。

【0267】

一部の態様では、１つ以上の部分は、機械的焼成によってＥＶに導入する。特定の態様では、細胞外小胞には、金マイクロキャリアなどの重質粒子または荷電粒子に付着した１つ以上の部分で衝撃を与えることができる。これらの態様の一部では、粒子は、ＥＶ膜を横断するがごとく、機械的または電気的に加速することができる。

【0268】

一部の態様では、細胞外小胞に対して、数回の凍結融解サイクルを行うことでＥＶ膜を破裂させて、１つ以上の部分のローディングが可能となる。

【0269】

ＶＩＩ．Ｃ．ＥＶ、例えば、エキソソームの単離方法
一部の態様では、本明細書で開示したＥＶを生産する方法は、産生細胞からＥＶを単離することを含む。特定の態様では、産生細胞が放出したＥＶを、細胞培養培地に入れる。ＥＶのすべての公知の単離方法も、本明細書に記載した使用に適しているものとみなす、ことを企図している。例えば、電荷（例えば、電気泳動による分離）、大きさ（例えば、濾過、分子篩など）、密度（例えば、通常の遠心分離または勾配遠心分離）、スヴェドベリ定数（例えば、外力によるもの、または外力によらない沈降など）をベースとした分離など、ＥＶの物理的性質を利用して、培地またはその他の供給材料からそれらを分離することができる。あるいは、または加えて、単離は、１つ以上の生物学的特性をベースとしたものにすることができ、及び、表面マーカーを利用できるような方法（例えば、沈降に関しては、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合など）を含むことができる。

【0270】

単離及び濃縮は、一般的かつ非選択的な方法、一般的には連続遠心分離で行うことができる。あるいは、単離及び濃縮は、ＥＶまたは産生細胞特異的表面マーカーを使用するなど、より特異的かつ選択的な方法で行うことができる。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、アフィニティー精製、及びビーズ結合リガンドを使用する磁気分離などで使用することができる。

【0271】

一部の態様では、サイズ排除クロマトグラフィーは、ＥＶを単離するために利用することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技術は、当該技術分野で公知である。例示的な技術を本明細書で提供するが、それらに限定されない。一部の態様では、空隙容量を単離する、及び対象となるＥＶを含む。さらに、一部の態様では、ＥＶは、当該技術分野において一般的に公知である遠心分離技術（１つ以上のクロマトグラフィー画分）によるクロマトグラフィー分離の後にさらに単離することができる。一部の態様では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、細胞外小胞をさらに単離することができる。特定の態様では、産生細胞由来のＥＶを、その他の起源のＥＶからさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、産生細胞由来ＥＶは、産生細胞に特異的な抗原抗体を使用した免疫吸着捕捉によって非産生細胞由来ＥＶから分離することができる。

【0272】

一部の態様では、ＥＶの単離は、分画遠心法、大きさをベースとした膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離を含む方法の組み合わせと連係させることができるが、これらに限定されない。

【0273】

本開示の実施にあたっては、別段の指示が無い限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を採用する、これらは当業者の技術の範囲内である。そのような技術は、文献でしっかりと説明がされている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２^ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）及び ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。

【0274】

先に引用した全ての参考文献、ならびに本明細書で引用した全ての参考文献は、その全内容を、参照により、本明細書で援用する。

【0275】

以下の実施例は、例示目的に他ならず、限定を意図していない。

【実施例】

【0276】

実施例１
表層提示したＩＬ－１２を有するエキソソームを、ＰＴＧＦＲＮに連結した単一ペプチドＩＬ－１２（ペプチドリンカーｐ４０で連結したｐ２９）を含む融合構築物を、エキソソーム産生細胞で発現させて調製した（図１）。有効性は、ヒトＰＢＭＣまたはマウス脾細胞を使用してインビトロで評価した、及び、マウス皮下腫瘍モデルを使用してインビボで評価した。局所対全身薬理学は、マウスにおける腫瘍内注射、及びサルにおける皮下注射で決定した。すべての研究は、組換えＩＬ－１２（ｒＩＬ－１２）に対してベンチマークをした。

【0277】

ＭＣ３８マウス腫瘍モデルでは、表層提示したＩＬ－１２（ｅｘｏＩＬ－１２）を有するエキソソームの腫瘍内投与は、遊離組換えＩＬ－１２及び未処置コントロールと比較して、増強したＰＫ及び持続的ＰＤを示した。ｅｘｏＩＬ－１２を投与したマウスでは、投与して３、１２、２４、及び４８時間後のＩＬ－１２ｐ７０濃度／腫瘍によって測定した腫瘍滞留は、遊離組換えＩＬ－１２と比較して高かった（約１５倍）（図２Ａ）。加えて、ｅｘｏＩＬ－１２投与は、組換えＩＬ－１２と比較して、約４倍も腫瘍内ＩＦＮ－ガンマＡＵＣを高めた（図２Ｂ）。さらに、ｅｘｏＩＬ－１２の腫瘍内投与は、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍増殖の用量依存的減少を招いた。ＥｘｏＩＬ－１２は、腫瘍増殖阻害についてはｒｌＬ－１２よりも１００倍も有効性が大きく、１００ｎｇのＥｘｏＩＬ－１２を投与したマウスでは、腫瘍増殖を殆ど無く、または皆無であった（図２Ｃ）。ＭＣ３８腫瘍モデルでは、ｅｘｏＩＬ－１２で治療したマウスの６３％で完全寛解が認められた；対照的に、ｒＩＬ－１２は、同等のＩＬ－１２用量での完全寛解は０％であった。このことは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞での用量依存的増加と相関しており、ｅｘｏＩＬ－１２で治療したマウスでは、ほぼ４倍も高くなっていた（図２Ｅ）。

【0278】

腫瘍増殖の抑制を、ＭＣ３８の再接種に続いて改めて観察した（図２Ｄ）。ｅｘｏＩＬ－１２完全レスポンダーマウスの再接種試験は、腫瘍の再増殖、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の枯渇は、ｅｘｏＩＬ－１２の抗腫瘍活性を完全には無効にしない、ことを示した。腫瘍内投与後、ｅｘｏＩＬ－１２は、ｒＩＬ－１２よりも１０倍も大きな腫瘍内曝露を示し、及び、ＩＦＮγ産生を、最長で４８時間にまで延ばした。保たれたｅｘｏＩＬ－１２の局所薬理学は、非ヒト霊長類に皮下注射して、さらに確認をした。

【0279】

毒物学分析は、試験した最高用量、３μｇのｅｘｏＩＬ－１２では、ＮＯＡＥＬ（観察可能な有害作用レベル無し）であり、限られた血漿レベル、及び用量依存性組織レベルを示すことを明らかにした（図３Ａ）。ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０の発現は、単回投与した後に皮膚において持続することが認められたが、血漿中では検出できなかった（図３Ｂ～３Ｃ）。

【0280】

ｅｘｏＩＬ－１２の腫瘍制限薬理学は、全身性ＩＬ－１２曝露及び関連毒性は認められず、優れたインビボ有効性及び免疫記憶を示す。このように、ｅｘｏＩＬ－１２は、ｒＩＬ－１２の主たる制限事項を克服している。

【0281】

実施例２
表層提示ＩＬ－１２を含む遺伝子操作したエキソソームを投与してヒト対象のがんを治療することの安全性及び有効性を試験するための臨床試験を行う（図４Ａ～４Ｂ）。パートＡでは、健康なボランティアに、様々な用量のｅｘｏＩＬ－１２を投与して、有害事象及びバイオマーカーをモニタリングする（図４Ａ）。パートＢでは、ＣＴＣＬ（ステージＩＡ～ＩＩＢ）と診断された対象に、様々な用量のｅｘｏＩＬ－１２を投与して、安全性及びバイオマーカーに関してモニタリングする（図４Ｂ）。臨床試験は、１回以上のＣＴスキャンでモニタリングする。ＣＴＣＬ、ＴＮＢＣ、黒色腫、ＧＢＭ、ＭＣＣ、及び／またはカポジ肉腫の対象は、試験のパートＢの対象となる。

【0282】

実施例３
ｅｘｏＩＬ－１２の第Ｉ相試験を、健康なボランティアで実施した（表４）。研究の最初の段階では、合計で５つのコホートを作り、それぞれのコホートでは５名の対象を登録して、活性薬物とプラセボを３：２に無作為に分けて投与した。それぞれのコホートは、ｅｘｏＩＬ－１２を、単回漸増用量：０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、及び１２．０μｇで皮下投与した。

【表5】

【0283】

このデータは、第１相試験の最初の段階で主たる目的を達成したことを示す。この無作為化プラセボコントロール二重盲検試験では、ｅｘｏＩＬ－１２が、良好な安全性と忍容性プロファイルを示しており、局所的または全身治療関連の有害事象は無く、及び、ＩＬ－１２の検出可能な全身曝露も無いことを実証した。１０日間のフォローアップを通じて、治療関連の有害事象は認められなかった。特に、悪寒、発熱、倦怠感、目眩、筋肉痛、頭痛、または背痛の報告は無かった。これらの症状は、この研究で使用したｅｘｏＩＬ－１２の用量（２μｇ～１２μｇの範囲）と匹敵する用量のｒＩＬ－１２を皮下投与した従前の臨床試験では認められていた。Ｇｏｋｈａｌｅ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１４；３（１）：１１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１４ Ａｐｒ １１．ｄｏｉ：１０．１１８６／２１６２－３６１９－３－１１

【0284】

血漿及び皮膚生検コアを、様々な時点で採取した（図５Ａ～５Ｂ）。血漿薬物動態（ＰＫ）測定は、試験したすべての用量で定量限界を下回るＩＬ－１２レベルでも全身曝露を示さなかった（図６）。対照的に、ｒＩＬ－１２を使用した従前の臨床試験では、５μｇ及び１２μｇの投与量では、用量依存的な全身曝露が認められており、投与して６～１２時間以内には約１２ｐｇ／ｍｌ～４５ｐｇ／ｍｌのＣｍａｘ血漿レベルに達した。Ｇｏｋｈａｌｅ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．２０１４（前掲）を参照されたい。これらのデータは、安全性と忍容性の重大な懸念が故に一般的に限界を有する組換えＩＬ－１２（ｒＩＬ－１２）をベースとした治療法と比較して、ｅｘｏＩＬ－１２の潜在的な利点、例えば、全身毒性が低いことを示している。これらの制限を克服するために、ＩＬ－１２を腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に局在化させて、治療指数を引き上げるために、ＩＬ－１２の用量制御を容易ならしめ、全身曝露及び関連する毒性を制限するように、ｅｘｏＩＬ－１２をデザインした。

【0285】

ＩＬ－１２の局所保持の確認は、処置前、及び処置して２４時間、８日及び１５日後の皮膚パンチ生検でのＩＬ－１２レベルを測定して評価する。いかなる理論にも拘束されるわけではないが、全身性ＩＬ－１２曝露が無いことと符合して、全身性ＩＦＮγ及びＩＰ－１０とｅｘｏＩＬ－１２とプラセボとの間に差異が認められないものと考えられる。

【0286】

局所薬力学的効果は、連続皮膚パンチ生検でのＩＰ－１０レベルを定量する、及び探索的遺伝子発現分析を使用することで評価する。皮膚生検は、Ｓｔｉｅｆｅｌ Ｂｉｏｐｓｙ Ｐｕｎｃｈ（３ｍｍ及び外科用メス）を使用して、表皮及び真皮を貫通して、上部皮下組織に到達させて得た。生検は、ｅｘｏＩＬ－１２の注射部位から少なくとも３０ｍｍ離れた箇所で得た（図５Ｂ）。有効で、持続的なＩＰ－１０効果は、すべての用量レベル（０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２；図７Ａ）のｅｘｏＩＬ－１２を投与した後の皮膚生検で認められた。皮膚生検での最大平均ＩＰ－１０レベルは、６．０μｇ用量を投与した対象で認められた（図７Ａ、菱形）。逆に、０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、または６．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象では、血漿ＩＰ－１０での増加は認められなかったが、３日目に１２．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与することで、血漿ＩＰ－１０でのわずかな増加があった（図７Ｂ）。高レベルのＩＬ－１２及びＩＰ－１０が、６．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象の皮膚生検で認められており、及び、活性は、８日目に測定可能であった（図７Ｃ～７Ｄ）。さらに、０．３μｇ、１．０μｇ、３．０μｇ、６．０μｇ、または１２．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象では、血漿ＩＦＮγでの増加は認められなかった（図８）、それに対して、ｒＩＬ－１２（１２．０μｇ）を投与した後では、血漿ＩＦＮγでの増加が事前に認められていた。これらの結果は、注射部位での少なくとも２４時間のＩＬ－１２の所望の局在性及び維持、ならびに用量に応じて８～１５日間のＩＰ－１０産生が持続していることを示す；及び、これらのデータは、６．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象に関する研究のパートＢでの２週間ごとの投与を支持している。

【0287】

これらの結果は、ｅｘｏＩＬ－１２が、健康なボランティアでは、０．３～１２．０μｇのＳＡＤで十分に許容できていたことを示す。同等量のｒＩＬ－１２を投与された対象の履歴結果とは対照的に、ｅｘｏＩＬ－１２を投与した対象では、ＩＬ－１２の全身曝露は認められなかった。ｅｘｏＩＬ－１２は、６μｇで皮膚での検出が可能であり、このことは、注射部位でｅｘｏＩＬ－１２が保持されていることを示唆している。１．０μｇ～１２．０μｇのＥｘｏＩＬ－１２は、強力な皮膚ＩＰ－１０レベルを示しており、６．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２の投与後に最高レベルが認められた。これらのデータは、２週間ごとに６．０μｇの開始用量を使用するパートＢでの研究を継続することを支持している。第１相臨床試験の次の部分を進めるものとし、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）患者でのｅｘｏＩＬ－１２の安全性と有効性を、６ｕｇの用量で評価する。

【0288】

実施例４
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膠芽腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、カポジ肉腫、基底細胞癌（ＢＣＣ）、膀胱癌、または、それらの組み合わせに罹患した対象を含むがん対象に対して、ｅｘｏＩＬ－１２を投与することの安全性及び有効性を研究するための臨床試験を実施する。対象は、６μｇのｅｘｏＩＬ－１２または１２μｇのｅｘｏＩＬ－１２を、２週間ごとに１回投与する。対象は、奏効率、全生存（ＯＳ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、及び有害事象の発生についてモニタリングを行う。

【0289】

参照による援用
本出願で引用するすべての刊行物、特許、特許出願、及びその他の文献は、それぞれの個別の刊行物、特許、特許出願、またはその他の文献が、あらゆる目的で、参照により、個別に援用することを示している場合と同程度に、あらゆる目的で、それらの全内容を、参照により、本明細書で援用する。

【0290】

均等物
様々な特定の態様を例示及び説明してきたが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱せずとも、様々な変更を行うことができる点は認識されるであろう。数多くの変形例は、本明細書を検討することで、当業者には明らかになるであろう。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】