特表 2023-538105 ＣＤ４０アゴニスト抗体及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-06

(54)【発明の名称】ＣＤ４０アゴニスト抗体及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230830BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230830BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230830BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230830BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230830BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230830BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230830BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P37/04

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023512310

(86)(22)【出願日】2021-08-20

(85)【翻訳文提出日】2023-04-13

(86)【国際出願番号】 CN2021113679

(87)【国際公開番号】W WO2022037662

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/110536

(32)【優先日】2020-08-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520442184

【氏名又は名称】ウーシー・バイオロジクス・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＷＵＸＩ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ヤン パオティエン

(72)【発明者】

【氏名】リー チン

(72)【発明者】

【氏名】チョン ヨン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4C085AA13

4C085AA14

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

抗ＣＤ４０アゴニスト抗体、この抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子、抗ＣＤ４０抗体を発現させるために用いる発現ベクターと宿主細胞が提供される。抗体の機能をインビトロで、抗体の有効性を生体内で検証するための方法がさらに提供される。前記抗体は、免疫機能を変化させることを通じ、がんを治療するための非常に強力な薬剤を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
（Ａ）（ｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号４または７を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５を含むＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

（Ａ）（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
（ａ）前記ＶＨが、
（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
を含み；および
（ｂ）前記ＶＬが、
（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
を含む、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって：
（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、または９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号８と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む、
重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）であって：
（ｉ）配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号９または１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号９または１０と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む、
軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

前記単離された抗体がヒトＩｇＧ定常ドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

前記ヒトＩｇＧ定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１定常ドメインまたはヒトＩｇＧ２定常ドメインであり、好ましくはヒトＩｇＧ２定常ドメインである、請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

前記抗体がＣＤ４０に対するアゴニスト抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と、医薬として許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

【請求項15】

前記抗体またはその抗原結合部分をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を適切な条件下で培養する工程；と
その細胞培養物から前記抗体またはその抗原結合部分を回収する工程を含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を作製する方法。

【請求項16】

対象の体内でＣＤ４０に関連する免疫応答を調節する方法であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分、または請求項１４の医薬組成物を前記対象に投与し、その対象の体内で免疫応答を調節することを含む、方法。

【請求項17】

対象の体内で腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分、または請求項１４の医薬組成物を有効量で前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項18】

対象の体内のがんを治療または予防する方法であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分、または請求項１４に記載の医薬組成物を有効量で前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項19】

前記がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、腎細胞癌、肝臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、ＮＳＣＬＣ、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記がんが大腸がんまたは黒色腫である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

対象の体内でＣＤ４０に関連する免疫応答を調節するか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤の製造における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。

【請求項22】

がんを治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。

【請求項23】

前記がんが大腸がんまたは黒色腫である、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

がんの治療または予防に使用するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項25】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分を含む容器を含む、がんの予防、治療、または診断のためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２０年８月２１日に出願された国際特許出願第号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１０５３６号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

配列表
本出願は配列表を含有しており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0003】

本出願は全体として抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＣＤ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体、それを調製する方法、およびその抗体の使用に関する。

【背景技術】

【0004】

免疫チェックポイントの阻止（抗ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、およびＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ）は、最も一般的ながん（例えば肺がん、乳がん）を含め、広い範囲のがんで患者の持続的寛解を提供する可能性がある。しかしこの広範囲の適用性にもかかわらず、がん患者の大半（８０％よりもはるかに多い）はこの療法が奏功しないか、この療法に対して耐性になる^［１］。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー５（ＴＮＦＲＳＦ５、別名ＣＤ４０）は免疫チェックポイントタンパク質の１つであり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を通じたＴ細胞免疫の調節に重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、広い範囲の造血細胞（樹状細胞、Ｂ細胞、単球）^{［４－６］}と非造血細胞^{［７－８］}の表面に発現する。ＡＰＣの表面のＣＤ４０と、活性化されたエフェクタＴ細胞の表面に発現したそのリガンドＣＤ４０Ｌが相互作用する^［９］結果としてＡＰＣライセンシングが起こり、サイトカイン産生、抗原提示分子、共刺激分子、および接着分子がアップレギュレーションされる^{［１０－１１］}。さらに、ＣＤ４０はＴ細胞上の他のＴＮＦファミリーシグナル伝達受容体の近位調節因子である^{［１２－１３］}。ＣＤ４０シグナル伝達の結果として、ＩＬ－１２の産生と、ＡＰＣの表面におけるＣＤ７０、ＣＤ８６、ＯＸ４０リガンド、４－１ＢＢリガンド、およびＧＩＴＲリガンドのアップレギュレーションが起こる。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞上の対応する受容体の刺激にＩＬ－１２とＩ型ＩＦＮが組み合わさると、ロバストなＣＤ８^＋ Ｔ細胞活性化、増殖、およびエフェクタ機能のほか、腫瘍特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞メモリの形成と維持が起こる^［１４］。

【0005】

いくつかの臨床前マウス腫瘍モデル臨床試験において、アゴニストＣＤ４０はがんを治療するための１つの非常に有望な戦略であることが示された。ＣＤ４０を標的とする多重アゴニスト剤が製薬会社（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｒｏｃｈｅ、Ａｂｂｖｉｅ、およびＡｐｅｘｉｇｅｎなど）によって開発されている。Ｐｆｉｚｅｒによって開発されたアゴニストＣＤ４０抗体（ＣＰ－８７０，８９３、現在はセリクレルマブまたはＲＯ７００９７８９と呼ばれる）は、樹状細胞を強く活性化してＴ細胞にＩＦＮ－γを分泌させる完全ヒトＩｇＧ２抗体である^［１５］。ＣＰ－８７０，８９３は、単独で、または他の薬（ゲムシタビンや抗ＣＴＬＡ－４抗体トレメリムマブなど）との組み合わせで、進行したがんを持つ患者において臨床で有効性を示した^{［１６－１８］}。Ａｐｅｘｉｇｅｎは、Ｆｃが変異したヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＣＤ４０アゴニストＡＰＸ００５Ｍも開発中である。小規模なＩｂ相研究の中間解析において、転移した膵管腺癌を持つ２４人の評価可能な患者のうちの２０人（８３％）で、抗ＰＤ－１抗体ニボルマブあり、またはなしでＡＰＸ００５Ｍにゲムシタビンとナブ－パクリタキセルを組み合わせた治療の後に腫瘍が縮小することが実証された^［１９］。ＣｅｌｌＤｅｘのＣＤ４０抗体であるＣＤＸ－１１４０はＣＰ－８７０，８９３よりもアゴニスト活性が低レベルだが、異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を持つ。このＣＤＸ－１１４０が、最大耐量を決めるため、そしてその忍容性と有効性をさらに評価するため、現在１相試験中である^［２０］；さらに、ＡｌｌｉｇａｔｏｒのＡＤＣ－１０１３が、進行した固形腫瘍の治療の可能性を求めてＪ＆Ｊと共同研究された。

【0006】

治療剤としてのＣＤ４０に対する抗体を改善するいくらかの余地がある。共刺激受容体に対するアゴニスト抗体として、毒性（サイトカイン放出症候群など）が最も懸念される問題である可能性があり、それが臨床応用を制限している。試験した最強のアゴニストであるＣＰ－８７０，８９３について、最も一般的な副作用はサイトカイン放出症候群であり、輸液直後の寒気、発熱、悪寒や、それ以外の症状として表出する。ＡＰＸ００５Ｍとニボルマブを組み合わせる研究において、５４％の患者（２４人中１３人）が有害事象を経験して治療の中断につながり、１０人の患者（４２％）は治療に関連する深刻な有害事象を経験した^［１９］。２件の用量制限毒性（グレード３と４の発熱性好中球減少症）が治療中に観察された。

【0007】

本開示では、ＣＤ４０経路に対する適切なアゴニスト活性を有するだけでなく、安全性リスクが最小でもある、ＣＤ４０に対する完全ヒト抗体が生成した。本開示の抗体はヒトＣＤ４０タンパク質に大きな親和性で結合でき；弱いＡＤＣＣ効果を示すかＡＤＣＣ効果をまったく示さず、サイトカイン放出を刺激することがＣＰ－８７０，８９３よりもはるかに少なく；インビトロと生体内で免疫応答を効果的に調節する。

【発明の概要】

【0008】

概要
これらの目的とそれ以外の目的は、広い意味で、有効性が改善された抗体を提供する化合物、方法、および製品に向けられた本開示によって満たされる。本開示によって提供される利点は、抗体による治療剤と診断の分野に広く適用可能であり、多彩な標的と反応する抗体と組み合わせて使用することができる。

【0009】

本開示により、ＣＤ４０に対する抗体、抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸分子、抗ＣＤ４０抗体を発現させるための発現ベクターと宿主細胞、およびインビトロと生体内で抗体の機能を検証する方法が提供される。本開示の抗体は、ヒト免疫機能を調節することにより多くのがんを治療するための非常に強力な薬剤を提供する。

【0010】

いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ４０（ヒトＣＤ４０またはカニクイザルＣＤ４０など）に対する単離された抗体またはその抗原結合部分を含む。この単離された抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０に対するアゴニスト活性を持つことが好ましい。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号７を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５を含むＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）（Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、（Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、配列番号７のバリアントは、配列番号７の２つ以下のアミノ酸位置、好ましくは配列番号７の１つのアミノ酸位置に置換を含む。いくつかのさらなる実施形態では、置換は、配列番号７の３個のアミノ酸「ＮＮＧ」のうちの１つの位置に起こる。少なくとも１つの実施形態では、配列番号７のバリアントは配列番号４に記載されている通りであり、配列番号７とは「ＮＮＧ」の中の「Ｇ」から「Ａ」への１個のアミノ酸置換が異なる。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）（Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、（Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ａ）前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
を含み；
（ｂ）前記ＶＬは、
（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、または９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号８と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む
重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
（Ｂ）（ｉ）配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号９または１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号９または１０と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む
軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８に記載の重鎖可変領域と、配列番号９または１０に記載の軽鎖可変領域を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ定常ドメインをさらに含む。ヒトＩｇＧ定常ドメインとして、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常ドメインが可能であり、ヒトＩｇＧ２定常ドメインが好ましい。

【0019】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性：
（ａ）細胞表面のヒトＣＤ４０またはカニクイザルＣＤ４０に強く結合し、ＥＣ５０は、ＦＡＣＳによって測定するとき、参照抗体と同等であるか、参照抗体よりも優れている；
（ｂ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ヒトのＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、およびＢＣＭＡとの交差反応性はない；
（ｃ）ＣＤ４０への結合をヒトＣＤ４０Ｌと効果的に競合し、ＩＣ５０はｎＭのグレードであり、約１００％の阻害率である；
（ｄ）ＮＦκＢ活性化を濃度に依存して誘導し、Ｂ細胞増殖を用量に依存して効果的に増強し、両方の効果はＢＭＫ４（すなわちＣＰ－８７０，８９３）よりも抑制されている；
（ｅ）中レベルのＩＬ－１２ｐ４０分泌のほか、ＣＤ８０とＣＤ８６のアップレギュレーションを誘導する；
（ｆ）ヒトＢ細胞（例えばＣＤ４０陽性Ｂ細胞）上でＡＤＣＣ活性を媒介しないか、弱く媒介する；
（ｇ）ヒトＰＢＭＣを刺激してサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７Ａを大量に放出させることはない；および
（ｈ）治療されたマウスにおいてすべての用量レベルでよく忍容されつつ、有意な抗腫瘍活性を持つ
の１つ以上を持つ。

【0020】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体であることが好ましい。

【0021】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１４のアミノ酸配列を持つ重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含む。

【0022】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に向けられている。

【0023】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列を含むベクターに向けられている。

【0024】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている発現ベクターを含む宿主細胞に向けられている。

【0025】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合部分と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に向けられている。

【0026】

いくつかの態様では、本開示は、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調製する方法に向けられており、この方法は、前記抗体またはその抗原結合部分を宿主細胞の中で発現させ、その抗体またはその抗原結合部分を前記宿主細胞から単離することを含む。

【0027】

いくつかの態様では、本開示は、対象でＣＤ４０に関連する免疫応答を調節する方法に向けられており、この方法は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分を前記対象に投与してその対象におけるＣＤ４０に関連する前記免疫応答を調節することを含む。

【0028】

いくつかの態様では、本開示は、対象で腫瘍細胞の成長を阻害する方法に向けられており、この方法は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分または医薬組成物を前記対象に有効な量で投与することを含む。

【0029】

いくつかの態様では、本開示は、対象でがんを治療または予防する方法に向けられており、この方法は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分または医薬組成物を有効量で前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記がんは、乳がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、腎細胞癌、肝臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、ＮＳＣＬＣ、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫から選択することができる。一実施形態では、前記がんは大腸がんである。他のいくつかの実施形態では、前記がんは黒色腫である。

【0030】

いくつかの態様では、本開示は、がんを治療または予防するための薬剤の製造における本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分の使用に向けられている。

【0031】

いくつかの態様では、本開示は、がんの治療または予防に使用するための、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分に向けられている。

【0032】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分と本明細書に開示されている医薬組成物を用いるキットまたは装置と、関連する方法に向けられている。

【0033】

上記はまとめであるため、必要により、詳細の単純化、一般化、および省略が含まれる；その帰結として、当業者は、このまとめが説明に過ぎず、いかなる意味でも制限する意図はないことがわかるであろう。本明細書に記載されている方法、組成物、および／または装置、および／または他の主題の他の態様、特徴、および利点は、本明細書に記載されている教示の中で明らかになろう。このまとめは、考え方を選択して簡単化された形で導入するために提示されており、それは下記の発明を実施するための形態の中でさらに説明される。このまとめは、請求項の主題の鍵となる特徴または本質的な特徴を特定することを意図しておらず、請求項の主題の範囲を定める助けに使用することも想定していない。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１～３は、ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ４０改変細胞（図１）、

【図2】Ｒａｊｉ細胞（図２）、および

【図3】Ａ４３１細胞（図３）の表面へのＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋの結合結果を示す。

【図4】図４は、ＦＡＣＳによる、細胞表面のカニクイザルＣＤ４０へのＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋの結合結果を示す。

【図5】図５は、ＦＡＣＳによる、ＣＤ４０への結合に関してＣＤ４０Ｌと競合する抗体の結合結果を示す。

【図6】図６は、ＣＤ４０と相同性を共有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーへのＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋの結合結果を示す。

【図7】図７は、ＥＬＩＳＡによる、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびイヌのＣＤ４０タンパク質へのＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋの結合結果の比較を示す。

【図8】図８～９は、Ｒａｍｏｓ細胞（図８）および

【図9】Ｕ９３７細胞（図９）に基づくＮＦκＢレポーターアッセイの結果を示す。

【図10】図１０は、インビトロＢ細胞増殖アッセイにおいてＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋによって刺激したＢ細胞増殖の結果を示す。

【図11】図１１～１５は、インビトロＤＣ活性化アッセイにおいてＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋによって誘導されるＩＬ－１２ｐ４０分泌（図１１）、

【図12】ＣＤ８０発現（図１２）、

【図13】ＣＤ８６発現（図１３）、

【図14】ＣＤ５４発現（図１４）、および

【図15】ＣＤ８３発現（図１５）の結果を示す。

【図16】図１６は、ヒト初代Ｂ細胞に対する抗体のＡＤＣＣ効果を示す。

【図17】図１７～１８は、ＣＤ４０ヒト化マウスにおけるＭＣ３８マウス大腸癌モデルでの抗体の腫瘍増殖抑制の結果（図１７）および

【図18】体重変化の結果（図１８）を示す。矢印は投与日を示す。

【図19】図１９～２０は、ＣＤ４０ヒト化マウスにおけるＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルでの抗体の腫瘍増殖抑制の結果（図１９）および

【図20】体重変化の結果（図２０）を示す。矢印は投与日を示す。

【図21】図２１は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を有するマウスを抗体で治療した後の生存率曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

詳細な説明
本開示は多くの異なる形態で具体化することができるが、本明細書に開示されているのは、本開示の原理を例示するその特別な説明用の実施形態である。本開示が説明されている特別な実施形態に限定されないことを強調すべきである。さらに、本明細書で使用されている項目の見出しは構成を明確にすることだけを目的としており、記載されている主題を限定すると解釈してはならない。

【0036】

特に断わらない限り、本開示に関して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を持つ。さらに、単数形の用語は複数形を含み、複数形は単数形を含むが、文脈がそうでないことを要求している場合は別である。より具体的には、本明細書と添付の請求項で用いられているように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数への言及を含むが、文脈が明らかにそうでないと述べている場合は別である。したがって例えば「１つのタンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み；「１つの細胞」への言及は複数の細胞の混合物を含む、などである。本出願では、「または」の使用は、そうでないと述べられているのでなければ「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語とそれ以外の形態（「含む」と「含まれる」など）の使用は、列挙に制限がない。それに加え、本明細書と添付の請求項に提示されている範囲は、両方の端点と、それら端点の間のあらゆる点を含む。

【0037】

一般に、本明細書に記載されている細胞と組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質と核酸の化学とハイブリダイゼーションに関して用いられる用語体系と、これらの技術で用いられる用語体系は周知であり、本分野で一般に用いられている。本開示の方法と技術は、特に断わらない限り、一般に、本分野において周知で、本明細書全体を通じて引用し、論じられているさまざまな一般的な参考文献とより特別な参考文献に記載されている従来法に従って実施される。例えばＡｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６^ｔｈ ｅｄ．， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ （２０１０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （２００２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （２００３）を参照されたい。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医薬品・創薬化学の実験室の手続きと技術に関して用いられる用語体系は周知であり、本分野で一般に用いられている。

【0038】

定義

【0039】

本開示をよりよく理解するため、関連する用語の定義と説明を以下に提示する。

【0040】

「抗体」または「Ａｂ」という用語は、本明細書では一般に、ジスルフィド共有結合と非共有結合相互作用によって互いに保持されている２つの重（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字形の四量体タンパク質を指す。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α、およびεに分類することができ、これらはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥという抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖と重鎖において、可変領域は約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、重鎖はさらに、約３個以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域を含む。各重鎖は重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域はさらに、相対的に保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）を間に挟んだ超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分割することができる。それぞれのＶ_ＨとＶ_Ｌは３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、Ｎ末端からＣ末端へとＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番に並んでいる。各重／軽鎖ペアの可変領域（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ）はそれぞれ抗原結合部位を形成する。さまざまな領域またはドメインの中のアミノ酸の分布は、免疫学的に興味あるタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の中の定義に従う。抗体は、抗体アイソタイプが異なる抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。

【0041】

抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、本出願の文脈では交換可能に使用でき、完全長抗体の断片を含むポリペプチドのうちで、完全長抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する能力を保持しているもの、および／または同じ抗原への結合に関して完全長抗体と競合するものを意味する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ， Ｗ編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照されたい（これは、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれている）。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって生成させるか、完全な抗体の酵素による切断または化学的切断によって生成させることができる。いくつかの条件下では、抗原結合断片に含まれるのは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂと相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディと、抗体のうちで少なくとも特異的な抗原結合能力を与えるのに十分な部分を含むポリペプチドである。抗体の抗原結合断片は、所与の抗体（例えば本出願に提示されているモノクローナル抗ヒトＣＤ４０抗体）から当業者に知られている従来の技術（例えば組換えＤＮＡ技術、または酵素切断法または化学的切断法）によって取得し、完全な抗体をスクリーニングするのと同じやり方で特異性に関してスクリーニングすることができる。

【0042】

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書では、単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体は特定の抗原に対して結合特異性と親和性を示す。

【0043】

「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種（マウスなど）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を意味することが想定されている。フレームワーク領域の追加の修飾はヒトフレームワーク配列内で実施することができる。

【0044】

「組換え抗体」という用語は、本明細書では、組換え手段によって調製、発現、創出、または単離された抗体を意味し、その例は、別の種の免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックな動物から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングによって他のＤＮＡ配列にすることを含む他の任意の手段によって調製、発現、創出、または単離された抗体などである。

【0045】

抗体または抗原結合ドメインに関する「完全ヒト」という用語は、抗体または抗原結合ドメインが、ヒトまたはヒト免疫細胞によって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つか、そのようなアミノ酸配列からなること、またはヒト抗体レパートリーまたはヒト抗体をコードする他の配列を利用する非ヒト供給源（トランスジェニック非ヒト動物など）に由来することを意味する。ある実施形態では、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体に由来するアミノ酸残基（特に抗原結合残基）を含まない。

【0046】

「ＣＤ４０」、「ＣＤ４０抗原」、または「ＣＤ４０タンパク質」という用語は本明細書では交換可能に使用され、腫瘍壊死因子／神経成長因子スーパーファミリーの１つのメンバーとして知られる一本鎖糖タンパク質である。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（例えばＢ細胞、マクロファージ、およびＤＣ）のほか、非免疫細胞と腫瘍によって発現される。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０と、ＩＩ型の３９－ｋＤａの膜糖タンパク質にとっての天然のリガンドである。ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌは共刺激分子のペアであり、その相互作用は、多彩な免疫応答と炎症応答（Ｔ細胞依存性免疫グロブリンのクラススイッチ、メモリＢ細胞の発達、および胚中心の形成が含まれる）を媒介する上で不可欠であることが見いだされている。

【0047】

「抗ＣＤ４０抗体」または「ＣＤ４０抗体」または「ＣＤ４０に対する抗体」という用語は、本明細書では、ＣＤ４０（例えばヒトＣＤ４０タンパク質）に結合することのできる、本明細書で定義した抗体を意味する。ある実施形態では、本明細書に開示されている抗ＣＤ４０抗体はＣＤ４０のアゴニストである。

【0048】

「アゴニスト」または「アゴニストの」という用語は、天然配列のペプチドの生物活性を増強または刺激するあらゆる分子を含む。適切なアゴニスト分子は特に、アゴニストペプチド、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアントなどを含む。「ＣＤ４０アゴニスト」という用語は、例えばＣＤ４０に結合してＣＤ４０活性を刺激することによって、または１つ以上のＣＤ４０阻害剤に結合してその阻害剤とＣＤ４０の相互作用を阻止することによってＣＤ４０の活性を刺激すること、活性化させること、または増強することのできる分子を意味する。アゴニストの非限定的な例に含まれるのは、ＣＤ４０阻害剤に向かう抗体とその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生体有機分子、ペプチド模倣体、薬剤とその代謝産物、小分子、融合タンパク質、受容体分子、および誘導体のほか、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、およびリボザイムである。

【0049】

「Ｋａ」という記号は、本明細書では、ある特別な抗体－抗原相互作用の会合速度を意味することが想定されているのに対し、「Ｋｄ」という記号は、本明細書では、ある特別な抗体－抗原相互作用の解離速度を意味することが想定されている。抗体のＫｄ値は本分野でよく確立されている方法を用いて求めることができる。「Ｋ_Ｄ」という記号は、本明細書では、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を意味することが想定されており、解離定数はＫａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られてモル濃度（Ｍ）として表わされる。抗体のＫｄを求める１つの好ましい方法は、好ましくはバイオセンサー系（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）系など）を用いる表面プラズモン共鳴の使用による。

【0050】

ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、本明細書では、標的抗原（例えばＣＤ４０）に対するＫ_Ｄが１×１０^－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－８Ｍ以下、より一層好ましくは１×１０^－８Ｍ以下である抗体を意味する。

【0051】

「ＥＣ_５０」という用語は、「半数効果濃度」とも呼ばれ、本明細書では、指定された曝露時間の後にベースラインと最大値の間の中間の応答を誘導する薬、抗体、または毒物の濃度を意味する。本出願の文脈では、ＥＣ_５０は「ｎＭ」の単位で表わされる。

【0052】

「結合を阻止する」能力は、本明細書では、抗体またはその抗原結合断片が２つの分子の結合を任意の検出可能なレベルで阻止または阻害する能力を意味する。ある実施形態では、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの間の結合は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合断片によって少なくとも５０％阻害することができる。ある実施形態では、そのような阻害効果は６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超である可能性がある。

【0053】

「単離された」という用語は、本明細書では、天然状態から人工的手段によって得られたある状態を意味する。ある「単離された」物質または成分が自然界に存在している場合、そうなることは、その自然環境が変化したためか、その物質が自然環境から単離されたため、またはその両方のために可能である。例えばある生きている動物の体内に、ある単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然に存在していると、そのような天然状態から高純度で単離されたその同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、単離された物質の活性に影響しない混合された人工物質または合成物質も、他の不純な物質も排除しない。

【0054】

「単離された抗体」という用語は、本明細書では、異なる抗原特異性を持つ他の抗体を実質的に含まない（例えばＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ４０タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）抗体を意味することが想定されている。しかしヒトＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種からのＣＤ４０タンパク質など）に対する交差反応性を持つ可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないことが可能である。

【0055】

「ベクター」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチドを中に挿入することのできる核酸担体を意味する。あるベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にするとき、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞の形質転換、宿主細胞への形質導入、またはトランスフェクションによって持ち込まれた遺伝材料エレメントをその宿主細胞の中で発現させることができる。ベクターは当業者に周知であり、その非限定的な例に含まれるのは、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体（酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など）；ファージ（λファージまたはＭ１３ファージなど）、および動物ウイルスである。ベクターとして使用できる動物ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、レトロウイルス（レンチウイルスが含まれる）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）である。ベクターは、発現を制御するための多くのエレメントを含むことができ、その非限定的な例に含まれるのは、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、選択エレメント、およびレポータ遺伝子である。それに加え、ベクターは複製起点を含むことができる。

【0056】

「宿主細胞」という用語は、本明細書では、興味あるタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを産生するように改変した細胞系を意味する。宿主細胞の非限定的な例に含まれるのは、培養した細胞（例えば齧歯類（ラット、マウス、モルモット、またはハムスター）に由来する哺乳類培養細胞であるＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０など）；またはヒト組織またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞と、トランスジェニック動物または培養した組織の中に含まれる細胞である。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。変異または環境の影響によりある修飾が後続世代に起こる可能性があるため、そのような子孫は親細胞と同一でない可能性があるが、それでも「宿主細胞」の用語の範囲に含まれる。

【0057】

「同一」という用語は、本明細書では、２つ以上のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列をアラインメントさせて比較することによって明らかになる、それら配列の間の関係を意味する。「一致率」は、比較される分子内のアミノ酸またはヌクレオチドの間で一致する残基の割合を意味し、比較される分子のうちの最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のため、アラインメントの中のギャップ（存在する場合）は、特別な数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処されることが好ましい。アラインメントされた核酸またはポリペプチドの一致を計算するのに利用できる方法に含まれるのは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．）， １９８８， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， （Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．）， １９９３， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， （Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．）， １９９４， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， １９８７， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．）， １９９１， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ， １９８８， ＳＩＡＭＪ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８：１０７３に記載されている方法である。

【0058】

「免疫原性」という用語は、本明細書では、生物の中で特異的抗体または感作リンパ球の形成を刺激する能力を意味する。この用語は、特定の免疫細胞を刺激して活性化、増殖、および分化させ、最終的に免疫学的エフェクタ物質（抗体と感作リンパ球など）を生成させる抗原の特性を意味するだけでなく、生物が抗原で刺激された後にその生物の免疫系において抗体または感作Ｔリンパ球を形成できるという特異的免疫応答も意味する。免疫原性は抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主の中で免疫応答の生成をうまく誘導できるかどうかは、３つの因子、すなわち抗原の特性、宿主の反応性、および免疫化手段に依存する。

【0059】

「トランスフェクション」という用語は、本明細書では、核酸が真核細胞（特に哺乳類細胞）の中に導入されるプロセスを意味する。トランスフェクションのためのプロトコルと技術の非限定的な例に含まれるのは、脂質トランスフェクションと、化学的・物理的方法（電気穿孔など）である。多数のトランスフェクション技術が本分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｕｐｒａ； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。本開示の特別な一実施形態では、ヒトＣＤ４０遺伝子が２９３Ｆ細胞にトランスフェクトされる。

【0060】

「ハイブリドーマ」という用語と「ハイブリドーマ細胞系」という用語は、本明細書では交換可能に用いることができる。「ハイブリドーマ」という用語と「ハイブリドーマ細胞系」という用語に言及されているとき、これらの用語はハイブリドーマのサブクローンと子孫細胞も含む。

【0061】

「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書では、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を例えばＢＩＡｃｏｒｅ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン国と、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて検出することによりリアルタイムでの生物特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味するともに、その光学現象を含む。さらなる説明については、実施例５とＪｏｎｓｓｏｎ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ． ５１：１９－２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． ８：１２５－１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８：２６８－２７７を参照されたい。

【0062】

「蛍光活性化セルソーティング」または「ＦＡＣＳ」という用語は、本明細書では、特殊なタイプのフローサイトメトリーを意味する。これは、生物細胞の異種混合物を、各セルの特定の光散乱と蛍光特性に基づいて一度に１個の細胞の割合で２つ以上の容器に分類する方法を提供する（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｃ． “Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｏｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ”。２０１７年１１月０９日に回収）。ＦＡＣＳを実施するための装置は当業者に知られており、市販されている。このような装置の例に含まれるのは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（フォスター・シティ、カリフォルニア州）からのＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ、およびＦＡＣＳｏｒｔ装置Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ハイアリア、フロリダ州）からのＥｐｉｃｓ Ｃ、およびＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（コロラド・スプリングズ、コロラド州）からのＭｏＦｌｏである。

【0063】

「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、本明細書では、細胞毒性の１つの形態を意味しており、分泌されたＩｇが細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）の表面に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより、これら細胞傷害性エフェクタ細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後その標的細胞を細胞毒で殺傷することが可能になる。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させるため、そのような殺傷に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞の表面でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２ （１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。興味ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、アメリカ合衆国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイのための有用なエフェクタ細胞に含まれるのは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。その代わりに、またはそれに加えて、興味ある分子のＡＤＣＣ活性は、生体内で、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２－６５６ （１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。

【0064】

「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を含み、ヒトであることが好ましい。

【0065】

「がん」という用語は、本明細書では、あらゆる腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、または転移によって生じる固形腫瘍と非固形腫瘍（白血病など）を意味し、ある医学的状態を開始させる。

【0066】

ある状態の治療の文脈における「治療」、「治療する」、または「治療された」という用語は、本明細書では、一般に、何らかの望む治療効果（例えば状態の進行の阻害）が実現されるヒトまたは動物の治療と療法に関係しており、治療効果には、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の退行、状態の改善、および状態の治癒が含まれる。予防的措置としての治療（すなわち予防、防止）も含まれる。がんについては、「治療する」は、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、または転移、またはこれらの何らかの組み合わせの減速または遅延化を意味することができる。腫瘍については、「治療」は、腫瘍の全体または一部の除去、腫瘍の成長と転移の阻害または減速、腫瘍の発達の阻止または遅延化、またはこれらの何らかの組み合わせを含む。

【0067】

「有効な量」という用語は、本明細書では、望ましい治療計画に従って投与されたとき、合理的なベネフィット／リスク比で何らかの望む治療効果を生じさせる活性化合物または材料の量、活性化合物を含む組成物または剤型の量に関する。例えばＣＤ４０に関連する疾患または状態の治療に関して使用されるときの「有効な量」は、前記疾患または状態を治療するのに有効な量または濃度の抗体またはその抗原結合部分を意味する。

【0068】

哺乳類のある疾患状態に関する「予防する」、「予防」、または「予防している」という用語は、疾患の発症を阻止するか遅延させること、またはその臨床症状または準臨床症状の出現を阻止することを意味する。

【0069】

「医薬として許容可能な」という表現は、本明細書では、媒体、希釈剤、賦形剤、および／またはその塩が、化学的および／または物理的に製剤中の他の成分に適合するとともに、生理学的にレシピエントに適合していることを意味する。

【0070】

本明細書では、「医薬として許容可能な担体および／または賦形剤」という表現は、対象と活性剤に対して薬理学的および／または生理学的に適合していて本分野（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ， １９ｔｈ ｅｄ． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５参照）で周知の担体および／または賦形剤を意味し、その非限定的な例に含まれるのは、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度増強剤である。例えばｐＨ調節剤の非限定的な例に含まれるのはリン酸塩バッファであり；界面活性剤の非限定的な例に含まれるのは、カチオン性、アニオン性、または非イオン性の界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）であり；イオン強度増強剤の非限定的な例に含まれるのは塩化ナトリウムである。

【0071】

本明細書では、「アジュバント」という用語は、抗原とともに生物に送達されたとき、またはあらかじめ生物に送達されたとき、その生物でその抗原に対する免疫応答を増強すること、または免疫応答のタイプを変化させることのできる非特異的免疫増強剤を意味する。多彩なアジュバントが存在しており、その非限定的な例に含まれるのは、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントのアジュバント（例えばフロイントの完全アジュバントとフロイントの不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム、リポ多糖、サイトカインなどである。フロイントのアジュバントは、現在動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。臨床試験では水酸化アルミニウムアジュバントがより一般的に使用される。

【0072】

抗ＣＤ４０抗体

【0073】

いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ４０に対する単離された抗体またはその抗原結合部分を含む。

【0074】

本出願の文脈では、「抗体」に含めることができるのは、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体と霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体、組換えで作製された抗体、イントラボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、１価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体（ムテインとそのバリアントが含まれる）；およびこれらの誘導体（Ｆｃ融合とそれ以外の修飾が含まれる）、およびＣＤ４０タンパク質との優先的な会合または結合を示す場合の他の任意の免疫反応性分子である。さらに、この用語は、あらゆるクラスの抗体（すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）と、あらゆるサブクラス（すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）を含むが、文脈の制約によりそうでないと記載されている場合は別である。好ましい一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。より好ましい一実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体または完全ヒトモノクローナル抗体である。

【0075】

モノクローナル抗体は、本分野で知られている広範囲の技術（ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ提示技術、トランスジェニック動物（例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））、またはこれらの何らかの組み合わせが含まれる）を使用して調製することができる。例えばモノクローナル抗体は、ハイブリドーマと、本分野で認められている生化学の技術と遺伝子改変の技術を用いて調製することができ、そのような技術がより詳細に記述されているのは、Ａｎ， Ｚｈｉｇｉａｎｇ （ｅｄ．） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １^ｓｔ ｅｄ． ２００９；Ｓｈｉｒｅ ｅｔ． ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ， １^ｓｔ ｅｄ． ２０１０；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１） である（そのそれぞれが参照によってその全体が本明細書に組み込まれている）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている抗体は、ハイブリドーマ技術と（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＯＭＴ）Ｃｏｍｐａｎｙによって開発された^{［２－３］}）遺伝子改変されたＯｍｎｉＲａｔを用いることによって得られる。選択された結合配列をさらに変化させ、例えば標的に対する親和性を改善すること、標的結合配列をヒト化すること、細胞培養物の中でのその産生を改善すること、生体内でのその免疫原性を低下させること、多特異性抗体を創出することなどが可能であることと、変化した標的結合配列を含む抗体も本開示の抗体であることを理解すべきである。

【0076】

好ましい一実施形態では、抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を利用して調製される。ハイブリドーマの生成は本分野で周知である。例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

【0077】

本出願では、一連のハイスループットスクリーニングを実施して陽性ハイブリドーマ細胞系を同定する。スクリーニングプロセスの目的は、ＣＤ４０経路に対する適切な機能的活性を持つヒトとカニクイザルのＣＤ４０高親和性バインダの候補を見いだすことである。抗体の配列をさらに最適化する（例えばＰＴＭ除去）と、大きな結合親和性と適切なアゴニスト活性を持つリード抗体が得られる。

【0078】

抗ＣＤ４０アゴニスト抗体

【0079】

アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が開発されているが、アゴニストＣＤ４０はがんを治療するための極めて有望な１つの戦略であることが見いだされている。ＣＤ４０を標的とする多重アゴニスト剤（ＣＰ－８７０，８９３（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＰＸ００５Ｍ（Ａｐｅｘｉｇｅｎ）、ＣＤＸ－１１４０（ＣｅｌｌＤｅｘ）、およびＡＤＣ－１０１３（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ）などでありこれらはすべてアゴニストＣＤ４０抗体である）が臨床試験中である。

【0080】

がんの治療では、ＣＤ４０アゴニスト抗体の主要な機構は、ＡＰＣをライセンス化して抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するというものであり、腫瘍細胞の表面でのＣＤ４０発現を必要としない。ＣＤ４０アゴニスト抗体は、免疫を強化するのに活性化されたＴ細胞の表面上のＣＤ４０Ｌの代替物になりうる。ＣＤ４０によって活性化されたＢ細胞は増殖状態に入り、すると今度はＴ細胞応答が増強される。

【0081】

実施例で実証されているように、本明細書に開示されている抗ＣＤ４０抗体は、（インビトロ増殖アッセイにおいて）Ｂ細胞増殖を効果的に増強することができ、濃度に依存してＮＦκＢ（ＲＧＡアッセイ）の活性化を誘導することができ、参照抗体と比べてはるかに低レベルのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、およびＴＮＦなど）産生を誘導する。したがって本明細書に開示されている抗ＣＤ４０抗体は、臨床試験においてアゴニスト抗ＣＤ４０抗体に関して最も多く報告されている有害事象であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こすリスクがはるかに小さい。

【0082】

ある特性を持つ抗ＣＤ４０抗体

【0083】

本開示の抗体は、これら抗体の特別な機能的特徴または特性によって特徴づけられる。抗体のインビトロでの機能的特徴と医薬活性は、標的に対する作用機序に従って分子と細胞のレベルで十分に評価されている。いくつかの実施形態では、本開示の単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性：
（ａ）細胞表面のヒトＣＤ４０またはカニクイザルＣＤ４０に強く結合し、ＥＣ５０は参照抗体と同等であるか、参照抗体よりも優れている；
（ｂ）ＣＤ４０への結合に関してヒトＣＤ４０Ｌと効果的に競合し、ＩＣ５０は１．４ｎＭ、阻害率は１００％である；
（ｃ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ヒトのＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、およびＢＣＭＡへの交差反応性はない；
（ｄ）ヒトＣＤ４０とカニクイザルＣＤ４０に対する交差反応性を示すが、マウス、ラット、およびイヌのＣＤ４０に対する交差反応性はない；
（ｅ）濃度に依存してＮＦκＢの活性化を誘導し、ＢＭＫ４よりもはるかに抑制された大きさであることが実証されている；
（ｆ）濃度に依存してＢ細胞増殖を効果的に増強し、その効果はＢＭＫ４よりも抑制されている；
（ｇ）中レベルのＩＬ－１２ｐ４０分泌を誘導するほか、ＶＤ８０とＣＤ８６をアップレギュレーションする；
（ｈ）ヒトＩｇＧ２形式であり、ヒトＢ細胞上でＡＤＣＣ活性を媒介しないか、弱く媒介する；
（ｉ）ヒトＰＢＭＣを刺激してサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７Ａを大量に放出させることはない；および
（ｊ）有意な抗腫瘍活性を持ち、治療されたマウスにおいてあらゆる投与レベルでよく忍容される
の１つ以上を持つ。

【0084】

本開示の抗体は、ヒトとカニクイザル両方のＣＤ４０に大きな親和性で結合する。ＣＤ４０への本開示の抗体の結合は、本分野でよく確立された１つ以上の技術（例えばＥＬＩＳＡ）を利用して評価することができる。本開示の抗体の結合特異性は、ＣＤ４０タンパク質を発現している細胞への抗体の結合をモニタすること（例えばフローサイトメトリー）によって明らかにすることもできる。例えば抗体は、その抗体を、ヒトＣＤ４０を発現する細胞系（トランスフェクションにより細胞表面にＣＤ４０を発現するようにされたＣＨＯ Ｋ１細胞など）と反応させるフローサイトメトリーアッセイによって調べることができる。それに加え、またはその代わりに、抗体の結合は、結合動態（例えばＫ_ｄ値）を含め、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで調べることができる。さらに別の適切な結合アッセイに含まれるのは、例えば組換えＣＤ４０タンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイである。例えば本開示の抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイによって求めたとき、ヒトＣＤ４０に１０ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＤ４０に９．５ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＤ４０に９ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＤ４０タンパク質に８．５ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＤ４０タンパク質に８ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＤ４０タンパク質に７．５ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する、またはヒトＣＤ４０タンパク質に７ｎＭ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0085】

さらに、本開示の抗体は、ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を阻止することができる。ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０経路は、免疫調節とホメオスタシスにおけるその顕著な役割が広く認識されている。炎症条件下でＴ細胞と他の非免疫細胞の表面で一過性に発現するＣＤ４０とＣＤ４０リガンドが係合すると、広い範囲の分子プロセスと細胞プロセスが調節される（その中には細胞と液性適応免疫の開始と進行が含まれる）。本開示の抗体はＣＤ４０への結合に関してヒトＣＤ４０Ｌと効果的に競合することが示されており、ＩＣ５０はｎＭのグレードであり、阻害率は約１００％である。

【0086】

ＣＤＲを含む抗ＣＤ４０抗体

【0087】

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号７を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５を含むＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、配列番号７のバリアントは配列番号７の２つ以下のアミノ酸位置、好ましくは７の１つ以下のアミノ酸位置に置換を含む。いくつかのさらなる実施形態では、置換は、配列番号７内のアミノ酸「ＮＮＧ」の１つの位置で例えばアミノ酸「Ｇ」を他の任意のアミノ酸に変異させることによって起こる。一実施形態では、配列番号７のバリアントは配列番号４に示されている通りであり、それは、配列番号７とは「ＮＮＧ」の中の「Ｇ」から「Ａ」への１つのアミノ酸置換だけ異なる。

【0089】

抗体配列の中の可変領域とＣＤＲは、本分野で開発された一般的な規則（上記のように、例えばＫａｂａｔ番号付けシステムなど）に従って同定すること、または配列を既知の可変領域のデータベースに対してアラインメントすることによって同定することができる。これら領域を同定する方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ２００１と、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２０００に記載されている。抗体配列の代表的なデータベースは、Ｒｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３ （Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）： Ｄ６７１－Ｄ６７４ （２００５）に記載されているように、（ユニヴァーシティ・カレッジ・ロンドンの生化学・分子生物学部、ロンドン、イングランドのＡ．Ｃ． Ｍａｒｔｉｎによって維持されている）「Ａｂｙｓｉｓ」のウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓと、ＶＢＡＳＥ２のウェブサイトｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇに記載されており、それらを通じてアクセスすることができる。配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを用いて分析されることが好ましい。書籍Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（編：Ｄｕｅｂｅｌ， Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ＩＳＢＮ－１３： ９７８－３５４０４１３５４７、ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも入手可能）の中のＡｎｄｒｅｗ Ｃ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ博士の章 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓを参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトにはさらに、ＣＤＲを同定するために開発された一般的な規則が含まれており、それを本明細書の教示に従って利用することができる。特に断わらない限り、本明細書に示されているすべてのＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けシステムに従って導出される。

【0090】

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；または
（Ｃ）Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲと、Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む。

【0091】

特別な一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ａ）前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のＨＣＤＲ３
を含み；
（ｂ）前記ＶＬは、
（ｉ）配列番号４または７に記載のＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５に記載のＬＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

【0092】

重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４０抗体

【0093】

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、または９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号８と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む
重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
（Ｂ）（ｉ）配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号９または１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号９または１０と比べて１個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するアミノ酸配列を含む
軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0094】

２つのアミノ酸配列の間の一致率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ． Ｍｅｙｅｒｓｔｏ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４：１１－１７ （１９８８））を、ＰＡＭ１２０重み残基表を用い、ギャップ長のペナルティを１２にし、ギャップペナルティを４にして求めることができる。それに加え、２つのアミノ酸配列の間の一致率は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）の中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３ （１９７０））を、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれかを用い、ギャップの重みを１６、１４、１２、１０、８、６、または４にし、長さの重みを１、２、３、４、５、または６にして求めることができる。

【0095】

それに加え、またはその代わりに、例えば関連する配列を同定するため、本開示のタンパク質配列をさらに「質問配列」として使用し、公開データベースに対して検索を実施することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し、本開示の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップ付きのアラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているようにして用いることができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。

【0096】

特別な一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号９または１０のアミノ酸配列を含むかそのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。

【0097】

他の実施形態では、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％一致していることが可能である。

【0098】

いくつかのさらなる実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および／または軽鎖の可変領域の中にアミノ酸の保存された置換または修飾を含む可能性がある。本分野では、ある保存された配列修飾を、抗原の結合を失わせることなく実現できると理解されている。例えばＢｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６８６４－ ２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’ Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：３４１－６、およびＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ６：２８３５－４３を参照されたい。

【0099】

上述のように、「保存された置換」という用語は、本明細書では、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性が不利な影響を受けたり変化したりしないと考えられるアミノ酸置換を意味する。例えば保存された置換は、本分野で知られている標準的な技術（部位特異的変異誘発や、ＰＣＲを媒介とした変異誘発など）によって導入することができる。保存されたアミノ酸置換に含まれるのは、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基と似た側鎖を持つ別のアミノ酸残基、例えば物理的または機能的に似た残基（似たサイズ、形、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合などを形成する能力を含む）を持つ残基など）で置換される置換である。似た側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは本分野で明確にされている。そのようなファミリーに含まれるのは、アルカリ側鎖を持つアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸とグルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシンなど）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。したがって対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。保存されたアミノ酸置換を同定する方法は本分野で周知である（例えばＢｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２： １１８０－１１８７ （１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １２（１０）： ８７９－８８４ （１９９９）；およびＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ４１２－４１７ （１９９７）を参照されたい。これらは参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0100】

Ｆｃ領域を含むＩｇＧ定常ドメイン

【0101】

本明細書に提示されている抗ＣＤ４０抗体と抗原結合断片は、ＩｇＧ定常ドメイン（ヒトＩｇＧ定常ドメインなど）をさらに含む。ヒトＩｇＧ定常ドメインとしてヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常ドメインが可能であり、ヒトＩｇＧ２定常ドメインが好ましい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域である。例えばＦｃ領域として野生型Ｆｃ領域が可能である；あるいはＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能または他のエフェクタ機能を変化させる１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。

【0102】

ヒトＩｇＧ２はＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＩＡの結合に関する最も弱いアイソタイプであるため、Ｆｃを媒介とした架橋とは独立にアゴニスト活性を誘導することができ、したがってＦｃとＦｃγＲの相互作用を通じた超クラスター化によって生じる潜在的な毒性を減らすことができる。さらに、１つのＣＤ４０Ｌ三量体が２つのＣＤ４０受容体と自然に相互作用する^［２４］。同様に、ヒトＩｇＧ２骨格を有する本明細書に開示されている抗体はＣＤ４０とクラスターになって二量体を形成し、ＣＤ４０Ｌ三量体とＣＤ４０の間の相互作用を模倣することができる。

【0103】

実施例に示されているように、ヒトＩｇＧ２形式であるＷ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２ＫとＢＭＫ４は、ヒトＢ細胞上でＡＤＣＣ活性を媒介しないか弱く媒介したため、ＣＤ４０陽性Ｂ細胞上でＡＤＣＣを開始させることはなかろう。逆に、Ｆｃ骨格がヒトＩｇＧ１であるＢＭＫ５は、用量に依存してヒトＢ細胞上でＡＤＣＣ効果を効果的に誘導することができる。

【0104】

本開示の抗体をコードする核酸分子

【0105】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に向けられている。

【0106】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学の技術を利用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば下により詳しく記載するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体については、そのハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖と重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えばファージ提示技術を利用して）得られる抗体については、そのような抗体をコードする核酸をその遺伝子ライブラリから回収することができる。

【0107】

ＶＨ領域をコードする単離された核酸は、ＶＨをコードする核酸を、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結させることによって完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は本分野で知られており（例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）、上記文献参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域が可能だが、より好ましいのは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。

【0108】

ＶＬ領域をコードする単離された核酸は、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結させることによって完全長軽鎖遺伝子（のほかＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は本分野で知られており（例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記文献参照）、これら領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域としてカッパまたはラムダ定常領域が可能である。

【0109】

ＶＨセグメントとＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらＤＮＡ断片を標準的組換えＤＮＡ技術によってさらに改変し、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に変換すること、Ｆａｂ断片遺伝子に変換すること、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの改変では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片が、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片（抗体定常領域または可撓性リンカーなど）に機能可能に連結される。「機能可能に連結された」という表現は、この文脈では、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるようにこれら２つのＤＮＡ断片が接合されることを意味することが想定されている。

【0110】

本明細書に記載されている抗ＣＤ４０抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸配列を１つの発現ベクターにクローニングすることができる（ただし各ヌクレオチド配列は、適切なプロモータに機能可能に連結されている）。一実施形態では、重鎖と軽鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれは別々のプロモータに機能可能に連結される。あるいは重鎖と軽鎖をコードするヌクレオチド配列を単一のプロモータに機能可能に連結させ、重鎖と軽鎖の両方を同じプロモータから発現させることができる。必要なときには、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、重鎖をコードする配列と軽鎖をコードする配列の間に挿入することができる。

【0111】

いくつかの実施形態では、抗体の２本の鎖をコードするヌクレオチド配列を２つのベクターにクローニングし、それらを同じ細胞または異なる細胞に導入することができる。２本の鎖が異なる細胞の中で発現するとき、それぞれの鎖を、それを発現している宿主細胞から単離することができ、単離された重鎖と軽鎖は、適切な条件下で混合してインキュベートすることにより抗体を形成することができる。

【0112】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体の重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に向けられている。

【0113】

いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、単離された抗体の重鎖可変領域をコードしており、
（Ａ）配列番号８に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）配列番号１１に記載の核酸配列；または
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）の核酸配列の相補的な鎖に非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている単離された抗体の軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に向けられている。

【0115】

いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、単離された抗体の軽鎖可変領域をコードしており、
（Ａ）配列番号９または１０に記載の軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）配列番号１２または１３に記載の核酸配列；または
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）の核酸配列の相補的な鎖に非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0116】

例えば、核酸分子は配列番号１１、１２、または１３からなる。あるいは核酸分子は、配列番号１１、１２、または１３と少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）一致する配列を共有する。いくつかの特別な実施形態では、一致率は遺伝暗号の縮重から導出され、コードされたタンパク質配列は変化しないままである。

【0117】

代表的な非常にストリンジェントな条件に含まれるのは、５×ＳＳＰＥと４５％ホルムアミドの中における４５℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣの中における６５℃での最終洗浄である。本分野では、同等なストリンジェントな条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９４）， ｐｐ． ６．０．３～６．４．１０に記載されているように、温度とバッファ、または塩の濃度を変化させることを通じて実現できると理解されている。ハイブリダイゼーション条件の変更は、経験的に決定すること、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さと割合に基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ， （Ｅｄｓ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）， ｐｐ． ９．４７～９．５１に記載されているようにして計算することができる。

【0118】

宿主細胞

【0119】

本開示に開示されている宿主細胞として、本開示の抗体を発現させるのに適した任意の細胞が可能であり、それは例えば、大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞である。本開示の抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞に含まれるのは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（その中にはＵｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されているｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞が含まれ、例えばＲ． Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ． Ａ． Ｓｈａｒｐ （１９８２） Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１－６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞である。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するための別の発現系は、ＷＯ ８７／０４４６２、ＷＯ ８９／０１０３６、およびＥＰ ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞の中に導入される場合には、抗体は、宿主細胞の中でその抗体が発現すること、または宿主細胞を増殖させる培地の中にその抗体を分泌させることが可能になるのに十分な期間にわたってその宿主細胞を培養することによって生成する。抗体は、標準的なタンパク質精製法を利用して培地から回収することができる。

【0120】

医薬組成物

【0121】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に向けられている。

【0122】

組成物の成分

【0123】

医薬組成物は、場合により、医薬として活性な１つ以上の追加成分（別の抗体または薬など）を含有することができる。本開示の医薬組成物は、併用療法において例えば別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、またはワクチンとともに投与することもできるため、抗ＣＤ４０抗体はワクチンに対する免疫応答を増強する。医薬として許容可能な担体に含めることができるのは、例えば医薬として許容可能な液体、ゲルまたは固体の担体、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、バッファ、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁／分散剤、キレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助物質、諸成分の本分野で知られている他のさまざまな組み合わせなどである。

【0124】

適切な成分は、例えば抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、バッファ、保存剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または安定剤（糖とシクロデキストリンなど）を含むことができる。適切な抗酸化剤は、例えばメチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルを含むことができる。本開示に開示されているように、本開示の抗体または抗原結合断片を含有する溶媒の中には組成物を開示するは１つ以上の抗酸化剤（メチオニンなど）を含み、減っている抗体またはその抗原結合断片を酸化することができる。酸化の減少によって結合親和性の低下を阻止すること、または減らすことができ、そのことによって抗体の安定性が増強され、保管期限が延長される。したがっていくつかの実施形態では、１つ以上の抗体またはその抗原結合断片と、１つ以上の抗酸化剤（メチオニンなど）を含む組成物が提供される。本開示によりさらに、抗体またはその抗原結合断片が１つ以上の抗酸化剤（メチオニンなど）と混合されることで抗体またはその抗原結合断片の酸化を阻止することが可能になり、その保管期限を延長させる、および／または活性を増加させる多彩な方法が提供される。

【0125】

さらに説明すると、医薬として許容可能な担体に含めることができるのは、例えば、水性媒体（塩化ナトリウム液、リンゲル液、等張デキストロース液、減菌水、またはデキストロースと乳酸加リンゲル液など）、非水性媒体（植物起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、またはピーナツ油など）、静菌濃度または静真菌濃度の抗微生物剤、等張剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）、バッファ（リン酸塩またはクエン酸塩バッファなど）、抗酸化剤（硫酸水素ナトリウムなど）、局所麻酔剤（塩酸プロカインなど）、懸濁剤と分散剤（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなど）、乳化剤（ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）など）、封鎖剤またはキレート化剤（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸など）である。担体として使用される抗微生物剤を、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルエステルとｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル、チメロサール、塩化ベンズアルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む多回投与容器の中の医薬組成物に添加することができる。適切な賦形剤に含めることができるのは、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。適切な非毒性の補助物質に含めることができるのは、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増強剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、またはシクロデキストリンなどの薬剤である。

【0126】

投与、製剤、および用量

【0127】

本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、さまざまな経路によって（その非限定的な例に含まれるのは、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、心室内、気管内、口腔内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内である）、あるいはそうでない場合には移植または吸入によって生体内投与することができる。対象とする組成物を製剤化して固体、半固体、液体、または気体の形態の調製物にすることができ；その非限定的な例に含まれるのは、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、浣腸、注射液、吸入剤、およびエアロゾルである。適切な製剤と投与経路は、意図する用途と治療計画に従って選択することができる。

【0128】

腸投与に適した製剤に含まれるのは、硬質または軟質のゼラチンカプセル、ピル、錠剤（被覆錠剤が含まれる）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入剤とその制御放出形態である。

【0129】

非経口投与（例えば注射による投与）に適した製剤は、水性または非水性で、等張で、発熱物質を含まない減菌液体（例えば溶液、懸濁液）を含み、その中の活性成分は、溶解形態、懸濁形態、または他の形態で（例えばリポソームまたは他の微粒子の中に入れて）提供される。そのような液体は、医薬として許容可能な他の成分（抗酸化剤、バッファ、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、および製剤を、想定するレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質など）を追加して含むことができる。賦形剤の例に含まれるのは、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などである。そのような製剤で用いるのに適した等張担体の例に含まれるのは、塩化ナトリウム液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル液である。同様に、具体的な投与計画（用量、時期、および反復回数が含まれる）は、具体的な個体とその個体の病歴のほか、薬物動態（例えば半減期、クリアランス率など）などの経験的考慮事項に依存することになる。

【0130】

投与の頻度は、治療のコース全体にわたって決定し、調節することができ、増殖性細胞または発がん性細胞の数の減少、そのような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少、または転移の発達の遅延に基づく。いくつかの実施形態では、投与される用量は、潜在的な副作用および／または毒性を管理するために調節すること、または減らすことができる。あるいは対象とする治療用組成物の持続的連続放出製剤が適切である可能性がある。

【0131】

当業者は、適切な用量が患者ごとに異なる可能性があることがわかるであろう。最適な用量の決定は、一般に、あらゆるリスクまたは有害な副作用に対して治療の利益のレベルをバランスさせることを含むことになる。選択される用量レベルは多彩な因子に依存することになり、その非限定的な例に含まれるのは、具体的な化合物の活性、投与経路、投与時刻、化合物の排出速度、治療の期間、併用される他の薬、化合物、および／または材料、状態の重症度、および患者の種、性別、年齢、体重、状態、全体的健康、および以前の病歴である。化合物の量と投与経路は最終的には医師、獣医師、または臨床医の裁量になるであろうが、一般に用量は、作用部位において実質的に有害または有毒な副作用を生じさせることなく望む効果を実現する局所濃度が実現されるように選択される

【0132】

一般に、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、さまざまな範囲で投与することができる。範囲に含まれるのは、１回の投与につき体重１ｋｇ当たり約５μｇ～約１００ｍｇ；１回の投与につき体重１ｋｇ当たり約５０μｇ～約５ｍｇ；１回の投与につき体重１ｋｇ当たり約１００μｇ～約１０ｍｇである。他の範囲に含まれるのは、１回の投与につき体重１ｋｇ当たり約１００μｇ～約２０ｍｇと、１回の投与につき体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ～約２０ｍｇである。ある実施形態では、用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約２５０μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約７５０μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０ｍｇである。

【0133】

いずれにせよ、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、それを必要とする対象に必要なときに投与されることが好ましい。投与頻度の決定は、当業者（担当医など）が、治療中の状態、治療中の対象の年齢、治療中の状態の重症度、治療中の対象の健康の全体的状態などを考慮して下すことができる。

【0134】

ある好ましい実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合部分が関与する治療のコースは、選択された薬製品を数週間または数ヶ月間かけて多数回投与することを含むことになろう。より具体的には、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、毎日１回、２日ごと、４日ごと、毎週、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、毎月、６週間ごと、２ヶ月ごと、１０週間ごと、または３ヶ月ごとに投与することができる。この点に関し、患者の応答と臨床での実際に基づき用量を変えること、または間隔を調節することが可能であることがわかるであろう。

【0135】

用量と計画は、開示されている治療用組成物に関して１回以上の投与を受けたことがある個体では経験的に決定することもできる。例えば本明細書に記載されているようにして製造された治療用組成物を個体に漸増用量で与えることができる。選択された実施形態では、用量は、経験的に判断されるか観察された副作用または毒性に基づいて漸増または漸減または漸次減少させることができる。選択された組成物の有効性を評価するため、具体的な疾患、障害、または状態のマーカーを以前に記載されているようにして追跡することができる。がんについては、マーカーに含まれるのは、触診または目視観察による腫瘍のサイズの直接測定、ｘ線または他のイメージング技術による腫瘍のサイズの間接測定；直接的腫瘍生検と腫瘍サンプルの顕微鏡検査によって評価したときの改善；間接的腫瘍マーカー（例えば前立腺がんに関するＰＳＡ）または本明細書に記載されている方法に従って同定された発がん性抗原、痛みまたは麻痺の減少の測定；発話、視覚、呼吸、または腫瘍に関連する他の不具合の改善；食欲増加；または受け入れられている試験によって測定した生活の質の向上、または生存期間の延長である。用量が、個体、新生物のタイプ、新生物のステージ、新生物が個体内の他の位置に転移を始めたかどうか、および過去の治療と現在受けている治療に応じて変わることは当業者には明らかであろう。

【0136】

非経口投与（例えば静脈内注射）に適合した製剤は、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分を約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことになろう。ある選択された実施形態では、抗体またはその抗原結合部分の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００、μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌを含むことになろう。他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分の濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌを含むことになる。

【0137】

本開示の応用

【0138】

本開示の抗体、抗体組成物、および方法には、インビトロと生体内での多くの利用可能性があり、その中には例えばＣＤ４０の検出または免疫応答の増強が含まれる。例えばこれらの分子を培養物の中の細胞、インビトロの細胞、または生体外の細胞に投与して、またはヒト対象（例えば生体内）に投与して、多彩な状況で免疫を増強することができる。免疫応答を調節すること（例えば増大、刺激、またはアップレギュレーション）ができる。

【0139】

例えば対象には、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が含まれる。本開示の方法は、免疫応答（例えばＴ細胞を媒介とする免疫応答）を増大させることによって治療できる障害を持つヒト患者の治療に特に適している。特別な一実施形態では、本開示の方法は、生体内のがんの治療に特に適している。免疫の抗原特異的増強を実現するため、抗ＣＤ４０抗体を興味ある抗原とともに投与することが可能だが、抗原は、治療する対象（例えば腫瘍またはウイルスを持つ対象）にすでに存在している可能性がある。ＣＤ４０に対する抗体を別の薬剤とともに投与するとき、その２つを順番に、または同時に投与することができる。

【0140】

本開示によりさらに、サンプル中のヒトＣＤ４０抗原の存在を検出する方法、またはヒトＣＤ４０抗原の量を測定する方法が提供され、この方法は、サンプルと対照サンプルを、ヒトＣＤ４０に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその一部とヒトＣＤ４０の間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む。その後、複合体の形成を検出する。そのとき対照サンプルと比べてサンプルで異なる複合体が形成された場合には、サンプル中にヒトＣＤ４０抗原が存在することを示している。さらに、本開示の抗ＣＤ４０抗体を用いて免疫親和性精製によりヒトＣＤ４０を精製することができる。

【0141】

がんを含む障害の治療

【0142】

いくつかの態様では、本開示により、哺乳類で障害または疾患を治療する方法が提供され、この方法は、治療を必要とする対象（例えばヒト）に、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合部分を治療に有効な量で投与することを含む。障害または疾患として、がんが可能である。

【0143】

ＣＤ４０が関与する多彩ながんを、悪性であるか良性であるか、または、原発であるか二次的であるかに関係なく、本開示に提示されている方法で治療または予防できる可能性がある。がんとして、固形がんまたは血液悪性腫瘍が可能である。そのようながんの例に含まれるのは、肺がん（気管支原性癌（例えば非小細胞肺がん、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、および腺癌）、肺胞細胞癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫（非がん性）、および肉腫（がん性）など）；心臓がん（粘液腫、線維腫、および横紋筋腫など）；骨がん（骨軟骨腫、軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫瘍、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、および細網細胞肉腫など）；脳がん（神経膠腫（例えば多形膠芽腫）、退形成性星細胞腫、星細胞腫、乏突起膠腫、髄芽腫、脊索腫、神経鞘腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚腫、奇形腫、類皮嚢胞、および血管腫など）；消化器系のがん（大腸がん、平滑筋腫、類表皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、胃腺癌、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸のポリープ、および結腸直腸がんなど）；肝臓がん（肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞癌、線維層板型癌、胆管癌、肝芽腫、および血管肉腫など）；腎臓がん（腎臓腺癌、腎細胞癌、副腎腫、および腎盂の移行上皮癌など）；膀胱がん；血液がん（急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄腫（骨髄性、骨髄由来、骨髄芽球、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えばセザリー症候群と有毛細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄性、骨髄由来、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉症、および骨髄増殖性疾患（真性多血症、骨髄線維症、血小板血症、および慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患が含まれる）；皮膚がん（基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、およびページェット病など）；頭頸部がん；目に関連するがん（網膜芽細胞腫と眼内黒色腫など）；男性生殖器系のがん（良性前立腺肥大症、前立腺がん、および精巣がん（例えばセミノーマ、奇形腫、胎児性癌、および絨毛膜癌）など）；乳がん；女性生殖器系のがん（子宮がん（子宮内膜癌）、子宮頸がん（子宮頸癌）、卵巣のがん（卵巣癌）、陰門癌、膣癌、卵管がん、および胞状奇胎など）；甲状腺がん（乳頭状、濾胞性、退形成性、または髄様がんが含まれる）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非がん性成長；膵臓がん；および血液がん（白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパリンパ腫、およびホジキンリンパ腫など）である。特別な一実施形態では、がんは大腸がんである。別の特別な一実施形態では、がんは黒色腫である。

【0144】

いくつかの実施形態では、がんの非限定的な例に含まれるのは、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マンテル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）のほか、母斑症に付随する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に付随するものなど）、Ｂ細胞増殖性障害、およびメイグス症候群である。より具体的な非限定的な例に含まれるのは、再発または難治性のＮＨＬ、フロントライン低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、および／またはリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、および／または前リンパ球性白血病、および／または小リンパ性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫、および／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、節外性辺縁帯－ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫、および／または形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＨＬ（アグレッシブフロントラインＮＨＬとアグレッシブ再発ＮＨＬが含まれる）、自家幹細胞移植後に再発したＮＨＬまたは自家幹細胞移植に対する難治性ＮＨＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆（末梢）大顆粒リンパ性白血病、菌状息肉症、および／またはセザリー症候群、皮膚（皮膚性）リンパ腫、退形成性大細胞型リンパ腫、血管中心性リンパ腫である。

【0145】

いくつかの実施形態では、がんのさらなる非限定的な例に含まれるのはＢ細胞増殖性疾患であり、そのさらなる非限定的な例に含まれるのはリンパ腫（例えばＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））とリンパ性白血病である。このようなリンパ腫とリンパ性白血病に含まれるのは、例えばａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（エンデミックバーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、および非バーキットリンパ腫が含まれる）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、および脾辺縁帯リンパ腫が含まれる）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫－肺Ｂ細胞リンパ腫が含まれる）、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、および／またはｊ）ホジキン病である。

【0146】

免疫応答の刺激

【0147】

いくつかの態様では、本開示により、対象で免疫応答を増強する（例えば刺激する）方法も提供され、この方法は、本開示の抗体またはその抗原結合部分をその対象に投与し、その対象で免疫応答を増強することを含む。例えば対象は哺乳類である。特別な一実施形態では、対象はヒトである。

【0148】

「免疫応答を増強する」という表現、またはその文法的なバリエーションは、哺乳類の免疫系のあらゆる応答を刺激する、誘起する、増加させる、改善する、または増大させることを意味する。免疫応答として、細胞応答（すなわち細胞を媒介とする（細胞傷害性Ｔリンパ球を媒介とするなど））または液性応答（すなわち抗体を媒介とした応答）が可能であり、一次または二次の免疫応答が可能である。免疫応答の増強の例に含まれるのは、増加したＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞活性と、細胞溶解性Ｔ細胞の生成である。免疫応答の増強は当業者に知られている多数のインビトロまたは生体内での測定を利用して評価することができ、そのような測定の非限定的な例に含まれるのは、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えばＩＬ－２産生またはＩＦＮ－γ産生）、腫瘍の退縮、腫瘍を有する動物の生存、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞毒の測定である。典型的には、本開示の方法は、哺乳類による免疫応答を、治療を受けていない哺乳類、または本明細書に開示されている方法を用いて治療されていない哺乳類による免疫応答と比べて増強する。一実施形態では、免疫応答は、サイトカイン産生、特にＩＦＮ－γ産生またはＩＬ－１２産生である。別の一実施形態では、免疫応答は、増強されたＢ細胞増殖である。

【0149】

共刺激受容体に対するアゴニスト抗体について、毒性（サイトカイン放出症候群など）がその臨床応用を制限する。したがって、大きな細胞毒性、またはサイトカインの大量放出を誘導しないようにするには中レベルのアゴニスト活性が好ましかろう。本明細書に開示されている抗体はＩＬ－１２の分泌とＤＣの活性化マーカーの発現を増強するが、ＢＭＫ４よりも抑制された大きさである。

【0150】

前記抗体またはその抗原結合部分は、単剤療法として単独で使用すること、または化学療法または放射線療法と組み合わせて使用することができる。

【0151】

化学療法との併用

【0152】

前記抗体またはその抗原結合部分は、抗がん剤、細胞毒性剤、または化学療法剤と組み合わせて使用することができる。

【0153】

「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、細胞増殖性障害（がんなど）の治療に使用できるあらゆる薬剤を意味し、その非限定的な例に含まれるのは、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法と放射線療法剤、標的抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、および抗転移剤と免疫療法剤である。上述のような選択された実施形態では、そのような抗がん剤は複合体を含むことができ、開示されている部位特異的抗体と投与前に会合させることができることがわかるであろう。より具体的には、ある実施形態では、選択された抗がん剤は改変された抗体の不対シトシンに連結されて、本明細書に記載の改変された複合体を提供する。したがってそのような改変された複合体は本開示の範囲内であると明示的に考慮される。他の実施形態では、開示されている抗がん剤は、上記の異なる治療剤を含む部位特異的複合体と組み合わせて与えられることになろう。

【0154】

本明細書では、「細胞毒性剤」という用語は、細胞にとって毒性である物質を意味し、細胞の機能を低下させるか阻害する、および／または細胞の破壊を引き起こす。ある実施形態では、その物質は生きている生物に由来する天然分子である。細胞毒性剤の非限定的な例に含まれるのは、細菌の小分子毒素または酵素活性な毒素（例えばジフテリア毒素、緑膿菌の内毒素と外毒素、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ）、真菌の小分子毒素または酵素活性な毒素（例えばα－サルシン、レストリクトシン）、植物の小分子毒素または酵素活性な毒素（例えばアブリン、リシン、モデッシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、アブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、ＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の小分子毒素または酵素活性な毒素（例えば細胞傷害性ＲＮアーゼ（細胞外膵臓ＲＮアーゼなど）；ＤＮアーゼＩであり、断片および／またはそのバリアントが含まれる）である。

【0155】

本開示の目的のため、「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖、および／または生存を非特異的に低下させるか阻害する化合物（例えば細胞毒性剤または静細胞剤）を含む。このような化学剤は細胞の成長または分裂に必要な細胞内プロセスに向けられることがしばしばあるため、一般に、急速に成長して分裂するがん性細胞に対して特に有効である。例えばビンクリスチンは微小管を解重合するため、細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。一般に、化学療法剤は、がん性細胞、またはがんになるか発がん性の子孫（例えばＴＩＣ）を生成させる可能性の高い細胞を阻害するか阻害するように設計された任意の化学剤を含むことができる。このような薬剤が例えばＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどの計画においてしばしば投与され、組み合わせで最も有効であることがしばしばある。

【0156】

本開示の部位特異的コンストラクトと（部位特異的複合体の一成分として、または非複合体状態のいずれかで）組み合わせて使用できる抗がん剤の非限定的な例に含まれるのは、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンとメチラメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エロイテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生剤、エンジイン抗生剤、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質エンジイン抗生剤発色団、アラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤、葉酸補充剤（フォリン酸など）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低下させるＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、および上記の任意のものの医薬として許容可能な塩、酸、または誘導体である。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する作用のある抗ホルモン剤（抗エストロゲンと選択的エストロゲン受容体モジュレータなど）、副腎においてエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、および抗アンドロゲンのほか；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（ＶＥＧＦ発現阻害剤とＨＥＲ２など）；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸトポイソメラーゼｒｍＲＨ；ビノレルビンとエスペラマイシン、および上記の任意のものの医薬として許容可能な塩、酸、または誘導体も含まれる。

【0157】

放射線療法との併用

【0158】

本開示により、抗体またはその抗原結合部分と放射線療法（すなわち腫瘍細胞の中で局所的にＤＮＡ損傷を誘導するためのあらゆる機構（ガンマ線、Ｘ線、ＵＶ放射線、マイクロ波、電子放出など））の組み合わせも提供される。放射性同位体を腫瘍細胞に向けて送達することを利用した併用療法も考慮され、開示されている抗体は、標的に向かう抗がん剤または他の標的化手段と組み合わせて使用することができる。典型的には、放射線療法は約１～約２週間の期間にわたってパルスで投与される。放射線療法は頭頸部がんを持つ対象に約６～７週間にわたって投与することができる。場合により放射線療法は、単回投与として、または多数回の逐次投与として投与することができる。

【0159】

診断

【0160】

本開示により、増殖性障害の検出、診断、またはモニタのためのインビトロと生体内の方法と、発がん性細胞を含む腫瘍細胞を同定するため患者からの細胞をスクリーニングする方法が提供される。このような方法は、治療のために、またはがんの進行をモニタするためにがんを持つ個体を同定することを含んでおり、患者を、または患者から得られたサンプルを（生体内またはインビトロのいずれかで）本明細書に記載されている抗体と接触させ、サンプル中の結合した標的分子または遊離している標的分子の存在または不在、またはそれら標的分子への抗体の会合のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示されている検出可能な標識またはレポータ分子を含むことになろう。

【0161】

いくつかの実施形態では、抗体とサンプル内の特定の細胞の会合は、そのサンプルが発がん性細胞を含有している可能性があることを示すことができるため、それは、がんを持つ個体が本明細書に記載されている抗体で有効に治療される可能性があることを示す。

【0162】

サンプルは多数のアッセイ（例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、およびフローサイトメトリーアッセイ）によって分析することができる。適合性のある生体内での治療診断アッセイまたは診断アッセイは、当業者であれば知っているように、本分野で認められているイメージングまたはモニタリングの技術（例えば磁気共鳴イメージング、コンピュータ化トモグラフィ（例えばＣＡＴ走査）、陽電子トモグラフィ（例えばＰＥＴ走査）、放射線療法、超音波などを含むことができる。

【0163】

医薬パックとキット

【0164】

１回以上の用量の抗体またはその抗原結合部分を収容した１つ以上の容器を含む医薬パックとキットも提供される。ある実施形態では、例えば抗体またはその抗原結合部分を１つ以上の追加薬剤とともに、または１つ以上の追加薬剤なしで含むあらかじめ決められた量の組成物を含有する単位用量が提供される。他の実施形態では、そのような単位用量は、注射のための使い捨てプレフィルド・シリンジに入れて提供される。さらに別の実施形態では、単位用量の中に含まれる組成物は、生理食塩水、スクロースなど；バッファ（リン酸塩など）を含むこと；および／または安定で効果的なｐＨ範囲で製剤化することができる。あるいはある実施形態では、組成物は、適切な液体（例えば減菌水または生理食塩水溶液）を添加して再構成することのできる凍結乾燥粉末として提供することができる。ある好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質の凝集を阻害する１つ以上の物質（その非限定的な例に含まれるのはスクロースとアルギニンである）を含む。容器上の、または容器に付随するあらゆる標識は、中にある複合体組成物が選択した新生物疾患の治療に使用されることを示す。

【0165】

本開示により、抗体と場合により１つ以上の抗がん剤からなる単回用量または多数回用量の投与単位を生成させるためのキットも提供される。このキットは、容器と、その容器上の、または容器に付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。適切な容器に含まれるのは、例えば瓶、バイアル、注射器などである。容器は多彩な材料（ガラスまたはプラスチックなど）で形成することができ、医薬として有効な量の開示されている抗体を複合体形態または非複合体形態で含有する。他の好ましい実施形態では、容器は殺菌アクセスポートを含む（例えば容器として、皮下注射針が貫通するストッパを持つ静脈内溶液バッグまたはバイアルが可能である）。このようなキットは一般に、適切な容器の中に、医薬として許容可能な抗体製剤を含み、場合により同じ容器または異なる容器の中に、１つ以上の抗がん剤を含むことになろう。キットは、診断または併用療法いずれかのため、医薬として許容可能な他の製剤も含むことができる。例えばこのようなキットは、本開示の抗体またはその抗原結合部分に加え、ある範囲の抗がん剤（化学療法薬または放射線療法薬；抗血管新生剤；抗転移剤；標的抗がん剤；細胞毒性剤；および／または他の抗がん剤など）の任意の１つ以上を含むことができる。

【0166】

より具体的には、キットは、開示されている抗体またはその抗原結合部分を追加成分とともに、または追加成分なしで収容した単一の容器を持つこと、または望むそれぞれの薬剤のための別々の容器を持つことができる。複合体を形成するため組み合わせる治療剤が提供される場合には、単一の溶液は、同モルの組み合わせで、または一方の成分を他方よりも過剰にしてあらかじめ混合することができる。あるいはキットの抗体と場合による任意の抗がん剤は、患者に投与する前は別々の容器の中に維持することができる。キットは、医薬として許容可能な減菌バッファまたは他の希釈剤（注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース溶液など）を収容するための第２／第３の容器手段も含むことができる。

【0167】

キットの構成要素が１つ以上の溶液の中に入れて提供されるとき、その溶液は水溶液であることが好ましく、減菌された水溶液または生理食塩水であることが特に好ましい。しかしキットの構成要素は乾燥粉末で提供することができる。試薬または成分が乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は適切な溶媒を添加することによって再構成することができる。溶媒は別の容器で提供することも可能であると考えられる。

【0168】

上に簡単に示したように、キットは、抗体またはその抗原結合部分と場合による任意の成分を患者に投与する手段（例えば１つ以上の針、Ｉ．Ｖ．バッグまたは注射器、それどころか点眼器、ピペット、または他の同様の装置）も含有することができ、その手段から製剤を動物の中に注射または導入するか、身体の疾患領域に適用することができる。本開示のキットは、典型的には、バイアルなどと、市販するため密封される他の構成要素を含有する手段（例えば望むバイアルと他の装置を収容して保持する射出成形またはブロー成形のプラスチック製容器）も含むことになろう。

【0169】

配列表のまとめ

【0170】

多数の核酸とアミノ酸の配列を含む配列表が本出願に添付されている。以下の表Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、含まれる配列のまとめを提供する。

【0171】

本明細書に示されている最終リード抗ＣＤ４０抗体は、「Ｗ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋ」と表記するか「Ｗ３５２５」抗体と略す。その親抗体「Ｗ３５２５－１．９．１６－ｕＩｇＧ２Ｋ」は、Ｗ３５２５とは軽鎖ＣＤＲ１の中の１個のアミノ酸置換だけ異なっている。ＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＬのアミノ酸配列と、可変領域をコードするヌクレオチド配列が、下記の表に掲載されている。

【0172】

【表1】

【0173】

【表2】

【0174】

【表3】

【0175】

【表4】

【実施例】

【0176】

このように一般的に記述した本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。しかし実施例は説明のために提示されているのであり、本開示を制限する意図はない。実施例は、下記の実験が実施したすべての実験であるとか、下記の実験だけを実施したことを表わすことは意図していない。

【0177】

実施例１

【0178】

材料、ベンチマーク抗体、および細胞系の調製

【0179】

１．１ 材料の調製

【0180】

実施例で使用する市販の材料に関する情報を表１に示す。

【0181】

【表5-1】

【表5-2】

【0182】

材料コードの情報を下記の表２に示す。

【0183】

【表6】

【0184】

１．２ 抗原の作製

【0185】

抗原Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＮＰ＿００１２４１．１、２１－１９３）、Ｗ３５２－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＮＰ＿０３５７４１．２、２０－１９３）、Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＮＰ＿００１２４１．１、２１－１９３）、Ｗ３５２－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＮＰ＿０３５７４１．２、２０－１９３）、Ｗ３５２－ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＸＰ＿００５５６９２７４．１、２１－１９３）、Ｗ３５２－ｈｐｒｏ１Ｌ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿００００６５．１、４７－２６１）をヒトＥｘｐｉ－２９３Ｆ細胞の中で発現させ、産生させた。これら抗原タンパク質を精製して－８０℃で保管した。

【0186】

１．３ ベンチマーク抗体の作製

【0187】

抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ３、ＢＭＫ４、ＢＭＫ５、およびＢＭＫ７を以下の研究でベンチマーク抗体として使用した。これら抗体の可変ドメインは各特許の中に開示されている配列に従って合成した。その情報が表３にまとめられている。ＢＭＫ４とＢＭＫ７は可変ドメインをヒトＩｇＧ２（カッパ軽鎖）定常ドメインと融合させることによって構成したのに対し、ＢＭＫ３とＢＭＫ５は可変ドメインをヒトＩｇＧ１（カッパ軽鎖）定常ドメインと融合させることによって構成した。ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体をアイソタイプ対照抗体として使用した。上記の全抗体を－８０℃で保管した。

【0188】

【表7】

【0189】

１．４ 細胞プール／系の作製

【0190】

完全長ヒトＣＤ４０（ＮＭ＿００１２５０．５、ＮＰ＿００１２４１．１）をトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いてヒトＣＤ４０を発現する細胞系Ｗ３５２－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ａ７を生成させた。

【0191】

完全長マウスＣＤ４０（ＮＰ＿０３５７４１．２）をトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いてマウスＣＤ４０を発現する細胞系Ｗ３５２－ＣＨＯＫ１．ｍＰｒｏ１．Ｂ３を生成させた。

【0192】

不安定な形態のＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼ融合タンパク質（ＪＱ５１３３７７．１）の転写を駆動する５コピーのＮＦ－κＢ応答エレメントを含有するベクターをレポータ細胞プールＷ３５２－Ｒａｍｏｓ．ＮＦｋＢＲＥ．ｌｕｃにトランスフェクトした。

【0193】

レポータ細胞プールＷ３５２－Ｕ９３７．ｈＰｒｏ１．ＮＦｋＢＲＥ．ｌｕｃに２つのベクターを同時にトランスフェクトした。一方は完全長ヒトＣＤ４０（ＮＭ＿００１２５０．５、ＮＰ＿００１２４１．１）を含有し、他方は不安定な形態のＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼ融合タンパク質（ＪＱ５１３３７７．１）の転写を駆動する５コピーのＮＦ－κＢ応答エレメントを含有する。

【0194】

レポータ細胞系Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６．Ａ５に２つのベクターを同時にトランスフェクトした。一方はＶ１５８バリアントである完全長ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＮＭ＿０００５６９．７、ＮＰ＿０００５６０．６）を含有し、他方はホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメント（ＤＱ９０４４６２）を含有する。

【0195】

実施例２

【0196】

抗体ハイブリドーマの作製、スクリーニング、および最適化

【0197】

２．１ 免疫化

【0198】

ＯｍｎｉＲａｔはＯｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって開発されたトランスジェニックラットであり、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣ_Ｈ遺伝子座に連結された天然配置のすべてのヒトＤセグメントとＪ_Ｈセグメントである２２個のヒトＶ_Ｈを含む）を完全ヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκと、Ｊλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）とともに有する^{［２－３］}。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼを用いて内在性Ｉｇ遺伝子座を沈黙させた。ＯｍｎｉＲａｔラットは、野生型動物がラット抗体を産生するのと同じくらい効率的にヒトイディオタイプである抗体を産生することができた。

【0199】

６～８週齢の２匹のＯｍｎｉＲａｔ（１匹は雄、１匹は雌）を、４０ μｇのＷ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃとＷ３５２－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃをともに用いて、または交互に用いて免疫化した。免疫化を１または２週間ごとに合計１８２日間にわたって繰り返した。

【0200】

２．２ 血清力価の検出

【0201】

血清サンプル中の抗ヒト／マウスＣＤ４０抗体の力価をＥＬＩＳＡによって求めた。マイクロプレートを、ウエル１つ当たり０．５μｇ／ｍＬのＷ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ＨｉｓまたはＷ３５２－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを含む１００μＬのコーティングバッファ（０．０２ＭのＮａ_２ＣＯ_３と０．１８ＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．２）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。アッセイの当日、１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡでブロックしてから１時間後、希釈したラット血清サンプル（１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡを用いて最初は１：１００に、次いで３倍に希釈）と陰性対照をプレートに添加し、その後プレートを周囲温度で２時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＨＲＰで標識したヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃを添加し、周囲温度で１時間インキュベートした。結合しなかった物質を除去した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を添加し、反応を２ＭのＨＣｌによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート分光光度計によって検出した。

【0202】

免疫化されたＯＭＴラットの血清力価が表４に示されている。２回目の採血の後、最終抗原ブーストのためにラット＃１を選択し、安楽死させてそのリンパ節を回収し、融合に使用した。

【0203】

【表8】

【0204】

２．３ ハイブリドーマの作製

【0205】

リンパ節をＯＭＴラットから減菌条件下で回収し、解離させて単一の細胞懸濁液の中に入れた。その後、単離された細胞を骨髄腫細胞ＳＰ２／０ｔｐと１：１．２の比で混合した。ＢＴＸ ２００１ Ｅｌｅｃｔｒｏ細胞マニピュレータを製造者の指示に従って用いて電気細胞融合を実施した。融合後、融合室からの細胞懸濁液を、より多くの培地を収容した殺菌チューブにただちに移し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータの中で少なくとも２４時間インキュベートした。細胞懸濁液を混合し、９６ウエルのプレートに移した（１×１０^４個の細胞／ウエル）。９６ウエルのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で培養し、定期的にモニタした。ウエル内のクローンが約８０％の集密度に到達したとき、抗体のスクリーニングのため１００μＬの上清を組織培養プレートから９６ウエルのアッセイプレートに移した。

【0206】

２．４ 抗体のスクリーニングとサブクローニング

【0207】

ハイスループットスクリーニングのプロセスは、ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング（ヒトＣＤ４０バインダを探すスクリーニング）、ＦＡＣＳ／ＥＬＩＳＡによる確認スクリーニング（ＦＡＣＳによりヒトとマウスＣＤ４０バインダを探すスクリーニング、ＥＬＩＳＡによりサルＣＤ４０バインダを探すスクリーニング、ヒトＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻止する抗体を探すスクリーニング）、およびＮＦκＢレポータ遺伝子アッセイによる機能的スクリーニング（ＲＧＡによってＣＤ４０経路を活性化させることのできる抗体を探すスクリーニング）を含んでいた。結合、競合、および機能的活性に基づき、合計３０個のハイブリドーマ系がサブクローニングのために同定された。

【0208】

対数期の各ハイブリドーマ細胞系を希釈して半固体ＨＡＴ培地１．５ｍＬ当たり１５０～２００個の細胞にした。この細胞懸濁液をボルテックス・オシレータで軽く混合した後、６ウエルのプレートの１つのウエルに播種した。細胞クラスターが増殖し終わったとき、目視できるそれぞれの単一のコロニーを採取し、１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ培地とともに９６ウエルのプレートに播種した。２～３日間培養した後、単一クローンの上清を回収して精製した。

【0209】

サブクローニングの後、合計５００個の単一クローンが得られ、そのすべてが次のラウンドのハイスループットスクリーニングに進んだ。２６個の陽性クローンが精製とシークエンシングのために選択され、さらに特徴づけられた。

【0210】

２．５ 抗体の最適化

【0211】

２．５．１ ＩｇＧ変換

【0212】

配列分析と機能的スクリーニングの後、完全ヒト抗体を構成するための候補を選択した。

【0213】

これら候補の可変ドメインのＤＮＡ配列を合成し、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃを含有するｐＣＩベクターにクローニングした。配列を確認した後、完全ヒト抗体のＩｇＧ全体を含有する発現ベクターを抗体作製のための一過性トランスフェクションに使用した。

【0214】

２．５．２ ＰＴＭの除去

【0215】

候補Ｗ３５２５－１．９．１６－ｕＩｇＧ２Ｋ軽鎖のＣＤＲ１の中のアミノ酸「ＮＧ」が高リスク脱アミド化部位であると特定されたため、アンチセンス変異誘発ヌクレオチドを設計していくつかの変異を「Ｗ３５２５－１．９．１６－ｕＩｇＧ２Ｋ」軽鎖に導入した。

【0216】

結合親和性とアゴニスト活性の比較に基づき、Ｗ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋ（Ｗ３５２５抗体と呼ぶ）が、バリアントからの最終リード抗体として選択された。

【0217】

実施例３

【0218】

Ｗ３５２５抗体のインビトロでの特徴づけ

【0219】

３．１ ヒトＣＤ４０結合アッセイ（ＦＡＣＳ）

【0220】

Ｗ３５２－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ａ７細胞（１×１０^５個の細胞／ウエル）、Ｒａｊｉ細胞（１×１０^５個の細胞／ウエル）、またはＡ４３１細胞（５×１０^４個の細胞／ウエル）をさまざまな濃度のＷ３５２５抗体（１００ｎＭから０．００５１ｎＭまで３倍段階希釈、または１００ｎＭから０．００１２８ｎＭまで５倍段階希釈）とともに４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体としてＡｌｅｘ６４７で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：２５０）またはＲ－ＰＥで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：１５０）を添加し、細胞を暗所で４℃にて１時間インキュベートした。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの中に再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメトリーによって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体濃度の対数（ｘ軸）に対してＭＦＩ（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてＥＣ５０値を求めた。

【0221】

Ｗ３５２－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ａ７細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＡ４３１細胞へのＷ３５２５の結合結果がそれぞれ図１、２、および３に示されている。Ｗ３５２５は、細胞表面のヒトＣＤ４０に強く結合することができ、ＥＣ５０は１．１ｎＭであり；Ｒａｊｉ細胞に強く結合することができ、ＥＣ５０は０．３６ｎＭであり；Ａ４３１細胞に強く結合することができ、ＥＣ５０は０．１６ｎＭであり、参照抗体と同等以上である。

【0222】

３．２ カニクイザルＣＤ４０結合アッセイ（ＦＡＣＳ）

【0223】

カニクイザルＣＤ４０を一過性にトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞（２×１０^５個の細胞／ウエル）をさまざまな濃度のＷ３５２５（２００ｎＭから０．０１０２ｎＭまで３倍段階希釈）とともに４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体としてＲ－ＰＥで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：１５０）を添加し、細胞を暗所で４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ＭＦＩとＥＣ５０の値を上記のようにして求めた。

【0224】

細胞表面のカニクイザルＣＤ４０へのＷ３５２５の結合結果が図４に示されている。Ｗ３５２５は細胞表面のカニクイザルＣＤ４０への強い結合を示し、ＥＣ５０は参照抗体と同等な２．４ｎＭであった。

【0225】

３．３ リガンド結合競合アッセイ（ＦＡＣＳ）

【0226】

Ｗ３５２－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ａ７細胞を１×１０^５個の細胞／ウエルの密度で９６ウエルのプレートに播種した。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの中で希釈した一定濃度のＷ３５２－ｈＰｒｏ１Ｌ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（５μｇ／ｍＬ）を細胞に添加した後、段階希釈した抗体（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの中で６０ｎＭから０．０２７４ｎＭまで３倍段階希釈）を添加し、よく混合した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。

【0227】

ヒトＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの競合結果が図５に示されている。Ｗ３５２５はＣＤ４０への結合に関して抗ヒトＣＤ４０Ｌと効果的に競合でき、ＩＣ５０が１．４ｎＭであり、１００％の阻害率であるのに対し、ＢＭＫ４はＣＤ４０への結合に関してＣＤ４０Ｌと部分的にだけ競合することができる。注：％阻害＝（ＭＦＩ_ｔｏｐ－ＭＦＩ_{ｂｏｔｔｏｍ}）／ＭＦＩ_ｔｏｐ×１００％。

【0228】

３．４ ＣＤ４０相同タンパク質結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）

【0229】

ウエル１つ当たり１μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＤ４０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、またはＢＣＭＡ細胞外ドメインを含む１００μＬの被覆バッファ（０．０２ＭのＮａ_２ＣＯ_３と０．１８ＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．２）でプレートを４℃にて一晩かけてあらかじめ被覆した。翌日、プレートを１×ＰＢＳＴで１回洗浄した。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡを用いて１時間ブロックした後、１×ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。Ｗ３５２５を６６．７ｎＭの濃度でプレートに添加し、周囲温度で１時間インキュベートした。抗ＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５、抗ＯＸ４０抗体ＭＥＤＩ０５６２、抗４－１ＢＢ抗体ＢＭＳ－６６３５１３、抗ＧＩＴＲ抗体ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、および抗ＢＣＭＡ抗体ＥＭ８０１をそれぞれ陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。インキュベーションの後、１×ＰＢＳＴを用いてプレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡの中で１：５０００の比に希釈して添加し、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで６回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質を供給することによって発色させ、２ＭのＨＣｌを１００μＬ添加することによって反応を停止させた。マイクロプレート分光光度計を用いて吸光度を４５０ｎｍと５４０ｎｍで読んだ。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体濃度（ｘ軸）に対して吸光度（ｙ軸）をプロットした。全サンプルを二連で調べた。

【0230】

ＣＤ４０と相同性を共有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに対するＷ３５２５の結合結果が図６に示されている。Ｗ３５２５抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合することができ、ヒトＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、およびＢＣＭＡに対する交差反応性はない。

【0231】

３．５ 種間タンパク質結合（ＥＬＩＳＡ）

【0232】

ウエル１つ当たり１μｇ／ｍＬの組換えヒト、カニクイザル、マウス、イヌ、またはラットＣＤ４０細胞外ドメインを含む１００μＬの被覆バッファでプレートを４℃にて一晩かけてあらかじめ被覆した。次いでＥＬＩＳＡ手続きを上記のようにして実施した。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。

【0233】

ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびイヌＣＤ４０タンパク質に対するＷ３５２５の結合を比較した結果が図７に示されている。Ｗ３５２５はヒトとカニクイザルＣＤ４０に対して交差反応性を示すが、マウス、ラット、およびイヌＣＤ４０に対しては交差反応性を示さないのに対し、ＢＭＫ４はイヌＣＤ４０に対して交差反応性を示す。

【0234】

３．６ ヒトＣＤ４０に対する親和性（ＳＰＲ）

【0235】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して十分な結合動態分析を実施し、組換えＣＤ４０細胞外ドメインに対するＷ３５２５の結合親和性を定量的に明らかにした。ＳＰＲにより生体分子相互作用を無標識でリアルタイムに検出することができる。ＳＰＲは偏光した光が２つの媒体の界面にある導電性表面に衝突するときに発生する。するとプラズモンと呼ばれる電荷密度波が生成し、共鳴角として知られる特定の角度で反射光の強度がセンサー表面上の質量に比例して低下する。

【0236】

Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを用いてヒトＣＤ４０に対するＷ３５２５の親和性を求めた。アクチベータを、注入の直前に４００ｍＭのＥＤＣと１００ｍＭのＮＨＳを混合することによって調製した。アクチベータを１０μＬ／分の流速で用いてＣＭ５センサーチップを４２０秒間かけて活性化させた。次いでヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５の中に３０μｇ／ｍＬ）を１０μＬ／分の流速でチャネルに４２０秒間注入した。チップを１０μＬ／分の流速の１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌによって４２０秒間かけて脱活性化した。固定化の後、抗体Ｗ３５２５をランニングバッファ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）の中で６６．７ｎＭに希釈し、チャネルＦｃ４の表面に１０μＬ／分の流速で３０秒間にわたって捕獲した。９０秒間の会合相の間、７通りの濃度（０、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）の分析物Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを３０μＬ／分の流速で順番にチャネルに注入した後、３００秒間解離させた。解離相の後、再生バッファとしてグリシン溶液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入してチップを再生させた。

【0237】

ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を用いてヒトＣＤ４０に対するＢＭＫ４とＢＭＫ５の親和性を求めた。アクチベータを、注入の直前に４０ｍＭのＥＤＣと１００ｍＭのスルホ－ＮＨＳを混合することによって調製した。アクチベータを３０μＬ／分の流速で用いてＧＬＭセンサーチップを３００秒間かけて活性化させた。次いでヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５の中に３０μｇ／ｍＬ）を３０μＬ／分の流速でチャネルに３００秒間注入した。チップを３０μＬ／分の流速の１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌによって３００秒間かけて脱活性化した。抗体ＢＭＫ５をランニングバッファ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）の中で１３．３４ｎＭに希釈し、Ｌ４チャネルに３０μＬ／分の流速で１００秒間注入した。チップを９０°回転させ、ベースラインが安定するまでランニングバッファで洗浄した。１２０秒間の会合相の間、６通りの濃度（１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、および０ｎＭ）の分析物Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを１００μＬ／分の流速で順番にＡ１～Ａ６チャネルに注入した後、２４０秒間解離させた。解離相の後、再生バッファとしてグリシン溶液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入してチップを再生させた。再生の後、抗体ＢＭＫ４をランニングバッファ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）の中で１３．３４ｎＭに希釈し、流速３０μＬ／分でＬ３チャネルに８０秒間にわたって注入した。チップを９０°回転させ、ベースラインが安定するまでランニングバッファで洗浄した。２４０秒間の会合相の間、６通りの濃度（４０、２０、１０、５、２．５、および０ｎＭ）の分析物Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを１００μＬ／分の流速で順番にＡ１～Ａ６チャネルに注入した後、６００秒間解離させた。各サイクルの後、再生バッファとしてグリシン溶液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入してチップを再生させた。

【0238】

参照チャネルとバッファチャネルのセンサーグラムを試験センサーグラムから差し引いた。実験データを１：１結合モデルに基づいてフィットさせた。

【0239】

２９ｋＤａの分子量を使用してＷ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓのモル濃度を計算した。Ｗ３５２－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓに対するＷ３５２５の動的親和性が表５に示されており、親和性定数は７．１２ｎＭである。

【0240】

【表9】

【0241】

３．７ サルＣＤ４０に対する親和性（ＳＰＲ）

【0242】

Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを用いてカニクイザルＣＤ４０に対するＢＭＫ４とＢＭＫ５の親和性を求めた。固定化のプロセスは上と同じであった。抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５をランニングバッファ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）の中で希釈して３３．３５ｎＭにし、１０μＬ／分の流速で３０秒間にわたってチャネル６と７のＦｃ２の表面にそれぞれ捕獲した。２４０秒間の会合相の間、７通りの濃度（０、１．５６３、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）の分析物Ｗ３５２－ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを３０μＬ／分の流速で順番にチャネルのＦｃ１とＦｃ２に注入した後、６００秒間解離させた。解離相の後、再生バッファとしてグリシン溶液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入してチップを再生させた。

【0243】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いてカニクイザルＣＤ４０に対するＷ３５２５の親和性を求めた。固定化のプロセスはＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋと同じであった。抗体Ｗ３５２５をランニングバッファ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）の中で３３．３５ｎＭに希釈し、１０μＬ／分の流速で６０秒間かけてＦｃ２の表面に捕獲した。２４０秒間の会合相の間、７通りの濃度（０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）の分析物Ｗ３５２－ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓを３０μＬ／分の流速で順番にＦｃ１とＦｃ２に注入した後、３００秒間解離させた。各サイクルの後、再生バッファとしてグリシン溶液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入してチップを再生させた。

【0244】

２９ｋＤａの分子量を使用してＷ３５２－ｃＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓのモル濃度を計算した。Ｗ３５２－ｃＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓに対するＷ３５２５の動的親和性が表６に示されており、親和性定数は８．４７ｎＭである。

【0245】

【表10】

【0246】

３．８ ＮＦκＢレポーターアッセイ

【0247】

Ｗ３５２－Ｒａｍｏｓ．ＮＦκＢＲＥ．ｌｕｃとＷ３５２－Ｕ９３７．ｈＰｒｏ１．ＮＦκＢＲＥ．ｌｕｃという２つのＮＦκＢルシフェラーゼレポータ細胞系を成長させてＣＤ４０経路に対するＷ３５２５のアゴニスト活性を評価した。細胞を５０μＬの体積で９６ウエルのプレートに４×１０^４個の細胞／ウエルで播種した。その後さまざまな濃度のＷ３５２５（１００ｎＭから０．００００１ｎＭまで１０倍段階希釈）を５０μＬの体積で細胞に添加した。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で５～６時間インキュベートした。再構成されたルシフェラーゼ基質を各ウエル（５０μＬ／ウエル）に添加してよく混合した。マイクロプレート分光光度計（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）を用いてルシフェラーゼの強度を読んだ。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体濃度の対数（ｘ軸）に対してルシフェラーゼの強度の倍数変化（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてＥＣ５０値を求めた。この実験を３回実施し、全サンプルを二連で調べた。

【0248】

ＣＤ４０の活性化を直接実証するため、２つのルシフェラーゼレポータ細胞系（一方はＢリンパ腫細胞系Ｒａｊｉに基づいており、他方は単球性白血病細胞系Ｕ９３７である）を用いてＷ３５２５のインビトロでの効力を定量化した。データが図８と図９に示されており、効力のデータが表７にまとめられている。Ｗ３５２５は濃度に依存してＮＦκＢの活性化を誘導することができ、ＢＭＫ４よりも抑制された大きさであることが実証される。

【0249】

【表11】

【0250】

３．９ インビトロＢ細胞増殖アッセイ

【0251】

ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ１９陽性選択キットＩＩを製造者のプロトコルに従って用いた磁性選択により、ヒトＢ細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。新たに単離したヒト細胞を１００μＬの体積で各ウエルに６×１０^４個の細胞／ウエルの密度で添加した。その後さまざまな濃度の抗体（１００ｎＭから０．００１ｎＭまで１０倍段階希釈）を１００μＬの体積でウエルに添加した。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対象として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした後、Ｂ細胞の増殖レベルをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏにより製造者の指示に従って求めた。マイクロプレート分光光度計（Ｍ５ｅ）を用いてルシフェラーゼの強度を読んだ。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体濃度の対数（ｘ軸）に対して相対光単位（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてＥＣ５０値を求めた。この実験は２回実施し、すべてのサンプルを三連で調べた。

【0252】

活性化されたＴ細胞上のＣＤ４０Ｌの代わりにＣＤ４０アゴニスト抗体を用いて免疫を増強することができる。ＣＤ４０で活性化させたＢ細胞は増幅状態に入り、今度はＴ細胞応答を増強する。Ｗ３５２５によって刺激したＢ細胞増殖の結果が図１０に示されており、効力のデータが表８にまとめられている。Ｗ３５２５は、用量に依存してＢ細胞の増殖を効果的に増強することができ、この効果はＢＭＫ４の効果よりも抑制されている。

【0253】

【表12】

【0254】

３．１０ インビトロＤＣ活性化アッセイ

【0255】

ヒトＣＤ１４マイクロビーズを製造者のプロトコルに従って用いた磁性選択により、ヒト単球をヒトＰＢＭＣから単離した。新たに単離した単球を、８００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦと５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を補足した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地の中で２×１０^６個の細胞／ｍＬに調節した。細胞を４または５日間培養して樹状細胞へと誘導した。これら樹状細胞を１００μＬの体積で９６ウエルのプレートに１×１０^５個の細胞／ウエルの密度で播種した。その後さまざまな濃度の抗体（３０ｎＭから０．１２３５ｎＭまで３倍段階希釈、または１０ｎＭから０．０４１２ｎＭまで３倍段階希釈）を１００μＬの体積でウエルに添加した。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。上清を回収してＥＬＩＳＡによってＩＬ－１２ｐ４０を測定し、細胞ペレットを回収してＦＡＣＳによってＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、および／またはＣＤ５４の発現を検出した。この実験を３回実施し、すべてのサンプルを三連で調べた。

【0256】

ヒトＩＬ－１２（ｐ４０）ＥＬＩＳＡセットキットを以下のようにして用いてヒトＩＬ－１２ｐ４０の分泌をＥＬＩＳＡによって測定した：組換えヒトＩＬ－１２ｐ４０を基準として使用した。段階濃度８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、および０．０３１２５ｎｇ／ｍＬを使用して標準曲線を求めた。ヒトＩＬ－１２ｐ４０に対して特異的な捕獲抗体を１：２５０の希釈比で含む５０μＬの被覆バッファでプレートをあらかじめ被覆した後、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、１×ＰＢＳＴを用いてプレートを１回洗浄した。１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡで１時間ブロックした後、５０μＬの基準またはサンプルをピペットで各ウエルに移し、周囲温度で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、１×ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。結合しなかった基質を除去した後、作業用検出液（ビオチニル化された検出抗体とストレプトアビジン－ＨＲＰを１：２５０の希釈比で含む１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）をウエルに添加し、プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、１×ＰＢＳＴを用いてプレートを６回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ基質溶液を供給して発色させた後、２ＭのＨＣｌを５０μＬ用いて反応を停止させた。マイクロプレート分光光度計（Ｍ５ｅ）を用いて吸光度を４５０ｎｍと５４０ｎｍで読んだ。Ｍ５ｅに組み込まれているソフトウエアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて上清の中のＩＬ－１２ｐ４０の濃度を標準曲線から逆算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体の対数（ｘ軸）に対してＩＬ－１２ｐ４０の濃度（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてシグモイド曲線をフィットさせた。

【0257】

ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＣＤ５４の発現を、対応する市販の蛍光抗体を用いてＦＡＣＳによって測定した。細胞を培養プレートからＦＡＣＳプレートに移し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを一度だけ１回洗浄した。蛍光抗体を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの中で（ＣＤ８３については）２０倍または（ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ５４については）１００倍に希釈し、１００μＬ／ウエルで細胞に添加した。プレートを暗所で４℃にて１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡの中に再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメータによって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体の対数（ｘ軸）に対してＭＦＩ（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてシグモイド曲線をフィットさせた。

【0258】

ＣＤ４０は単球や樹状細胞などのＡＰＣの表面で発現する。単球と樹状細胞のＣＤ４０にＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０アゴニスト抗体が連結する結果として多種類のサイトカイン（ＩＬ－１２など）が分泌されるほか、活性化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、およびＣＤ８３など）がアップレギュレーションされる。Ｗ３５２５によって誘導されたＩＬ－１２ｐ４０分泌の結果が図１１に示されている。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、およびＣＤ８３の発現の結果が図１２、１３、１４、および１５に示されている。ＩＬ－１２ｐ４０の放出と、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、およびＣＤ８３の発現に関する効力のデータが表９にまとめられている。Ｗ３５２５は、ＢＭＫ４と比べると、中レベルのＩＬ－１２ｐ４０の分泌のほか、ＣＤ８０とＣＤ８６のアップレギュレーションを誘導することができる。

【0259】

【表13】

【0260】

３．１１ 抗体依存性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣ）

【0261】

ＣＤ４０陽性血液細胞に対するＷ３５２５のＡＤＣＣ活性を調べるため、ＣＤ４０を発現しているＢ細胞を標的細胞として使用し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６．Ａ５をエフェクタ細胞として使用した。ヒトＣＤ１９マイクロビーズを製造者のプロトコルに従って使用し、ヒト初代Ｂ細胞を磁性選択によってヒトＰＢＭＣから単離した。ヒト初代Ｂ細胞上のＣＤ４０の発現をＦＡＣＳによって調べた。新たに単離したヒトＢ細胞を５０μＬの体積で９６ウエルのプレートに４×１０^４個の細胞／ウエルの密度で播種した。次いでさまざまな濃度の試験抗体（２００ｎＭから０．０００１ｎＭまで８倍段階希釈）を５０μＬの体積でウエルに添加した。抗ヒトＣＤ４０抗体ＢＭＫ４とＢＭＫ５を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。その後、５０μＬのＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６．Ａ５細胞をエフェクタ／標的比を２：１にしてウエルに添加した。プレートを５％ＣＯ_２インキュベータの中で約５時間にわたって３７℃に維持した。ＡＤＣＣにおける抗体生物活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として生成するルシフェラーゼによって定量化した。エフェクタ細胞の中のルシフェラーゼ活性をＯｎｅ－Ｇｌｏによって定量化し、マイクロプレート分光光度計（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）を用いて読んだ。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて抗体濃度の対数（ｘ軸）に対してルシフェラーゼ強度の倍数変化（ｙ軸）をプロットした。４パラメータ用量－応答曲線モデルを用いてシグモイド曲線をフィットさせた。全サンプルを二連で調べた。

【0262】

ＣＤ４０は腫瘍細胞（Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫、および癌腫など）の表面で発現するだけでなく、多種類の正常な細胞（単球、ＤＣ、およびＢ細胞など）の表面でも強く発現するため、ヒト初代Ｂ細胞の表面でのＷ３５２５のＡＤＣＣ活性を評価した。ヒトＢ細胞の表面でのＣＤ４０の発現をＦＡＣＳによって確認した。ＡＤＣＣアッセイの結果が図１６に示されている。Ｆｃ骨格がヒトＩｇＧ１であるＢＭＫ５は、ヒトＢ細胞の表面でＡＤＣＣ効果を用量に依存して効果的に誘導できることを結果は示している。しかしヒトＩｇＧ２形式であるＷ３５２５とＢＭＫ４は、ヒトＢ細胞の表面でＡＤＣＣ活性を媒介しないか、弱く媒介した。Ｗ３５２５がＣＤ４０陽性Ｂ細胞の表面でＡＤＣＣを開始させる可能性は小さいであろうことを結果は示している。

【0263】

がんの治療では、ＣＤ４０－アゴニスト抗体の主要な機構は、腫瘍細胞の表面でのＣＤ４０の発現を必要とせずにＡＰＣに抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導させることである。しかしＩｇＧ１抗体はＣＤ４０を発現しているＤＣとＢ細胞の表面でＦｃエフェクタ機能（ＡＤＣＣなど）を誘導するため、抗腫瘍応答が低下する可能性がある。実際、Ｂ細胞のカウント数の減少が臨床試験で観察された^{［２２－２３］}． Ｗ３５２５はヒトＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体であり、ＣＤ４０陽性の正常細胞に対する潜在的な損傷が回避される。

【0264】

３．１２ サイトカイン放出アッセイ

【0265】

臨床試験においてアゴニスト抗体としての抗ＣＤ４０抗体の最も頻繁に報告されている有害事象はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）であった。サイトカイン放出アッセイは、可溶性条件でヒトＰＢＭＣを用い、他の刺激なしでＷ３５２５のサイトカイン放出プロファイルを評価することが目的であった。

【0266】

ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配遠心分離を使用して健康なドナーから新たに単離するか、ＰＢＭＣの販売者から購入した。精製したＰＢＭＣを１×１０^５個の細胞／１００μＬ／ウエルの密度で各ウエルに添加した。Ｗ３５２５と他の抗体をプレートに６６．７ｎＭの作業濃度にて１００μＬ／ウエルで添加した。抗ＣＤ２８抗体ＴＧＮ１４１２を陽性対照として使用し、ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。ＬＰＳを１μｇ／ｍＬの作業濃度で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２日間インキュベートした。上清を回収し、検出の準備ができるまで－８０℃で保管した。

【0267】

１０セットのサンプルを回収した後、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを製造者のプロトコルに従って使用してサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７Ａを測定した。キットは、７種類のサイトカインがあらかじめ捕獲されたビーズ（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７Ａ）、７種類のサイトカインがあらかじめ混合された基準、ＰＥで標識した検出抗体、および洗浄バッファを含む。ＣＢＡキットは、研究サンプルの中の複数のサイトカインタンパク質を同時に検出するのにビーズアレイ技術を利用する。アッセイ手続きの間、サイトカイン捕獲ビーズと組換え基準または未知のサンプルを混合し、ＰＥで標識した検出抗体とともにインキュベートしてサンドイッチ複合体を形成する。各サンドイッチ複合体のＰＥ蛍光の強度が、そのサイトカインの濃度を明らかにする。フローサイトメータでサンプルを取得した後、各サイトカインの濃度を標準曲線に従って定量することができる。

【0268】

Ｗ３５２５が複数のサイトカインを放出させずにＰＢＭＣを活性化させる能力をインビトロサイトカイン放出アッセイによって予測できるかどうかを調べた。インビトロサイトカイン放出アッセイを実施し、サイトカイン放出の潜在的な害を特定した。Ｗ３５２５を可溶形態のヒトＰＢＭＣの中でサイトカイン放出に関して評価した。このアッセイは１０人のドナーのＰＢＭＣを用いて実施した。抗ＣＤ２８抗体ＴＧＮ１４１２とＬＰＳを陽性対照として使用し；ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２アイソタイプ抗体をアイソタイプ対照として使用した。標準曲線を、サイトカイン濃度をｘ軸に、ＭＦＩをｙ軸にして対数－対数グラフ用紙にプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて基準点を通る最もよくフィットした標準曲線を描いた。各サイトカインの濃度が表１０に示されている。結果は、Ｗ３５２５だけを用いた処理がヒトＰＢＭＣを刺激してサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７Ａを大量に放出させることはなかったことを示している。しかし臨床試験においてサイトカイン放出症候群の問題があったＢＭＫ４は、はるかに高レベルのサイトカイン産生（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、およびＴＮＦなど）を誘導した。すべての値が平均値±ＳＥＭで示されている。

【0269】

【表14】

【0270】

実施例４

【0271】

Ｗ３５２５抗体の生体内特徴づけ

【0272】

４．１ ＣＤ４０ヒト化マウスの中のＭＣ３８マウス大腸癌での生体内有効性研究

【0273】

ＣＤ４０陰性腫瘍モデルでＷ３５２５の抗腫瘍活性を調べるため、腫瘍細胞を接種するのにヒトＣＤ４０トランスジェニックＣＤ４０－Ｈｕマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を使用した。０．１ｍＬのＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸塩緩衝化生理食塩水）に懸濁させた野生型ＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０^５）をＣＤ４０－Ｈｕマウスの右前脇腹に皮下注射して腫瘍を発達させた。平均腫瘍サイズが約８０ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を有する動物をランダムに６つの研究群に割り当てた。各群は８匹のマウスで構成した。示されている表１２の中の研究設計。腫瘍を有するマウスに全抗体を週に２回の頻度で腹腔内投与した。体重と腫瘍の体積を週に２回測定した。あらかじめ決めた健康基準に従ってマウスを安楽死させ、最初の投与の２５日後に研究を終えた。

【0274】

【表15】

【0275】

最良の治療の時点（群分けの２１日後）に腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）を計算して分析した。腫瘍の体積の結果が図１７に示されており、表１３と表１４にまとめられている。

【0276】

【表16】

【0277】

【表17】

【0278】

４回目の注射後、群ＷＢＰ３５２－ＢＭＫ４．ｈＩｇＧ４Ｋ、１０ｍｇ／ｋｇの動物の体重は１０％超減少し、この群の全マウスが不活発かつ低体温であることが見いだされ、それが実験終了まで１週間超継続した。平均体重の結果が表１５と図１８に示されている。

【0279】

【表18】

【0280】

群分けの２１日後、Ｗ３５２５が１０ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値はそれぞれ１０１．０１％と５１．２４％であった。これら２つの群の平均腫瘍体積は、ヒトＩｇＧ２群とは統計的に有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。Ｗ３５２５が０．１ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値は２６．０６％だが、ヒトＩｇＧ２群と統計的に異なっていなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、Ｗ３５２５が１０ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇの用量で有意な抗腫瘍活性を持つことと；０．１ｍｇ／ｋｇの用量で限定された腫瘍増殖抑制活性を持つことを示していた。

【0281】

ＢＭＫ４が１０ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値はそれぞれ１０２．７５％と５４．７９％であった。その一方で、これら群の平均腫瘍体積は、ヒトＩｇＧ２群の平均腫瘍体積と統計的に有意な差があった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＢＭＫ４参照抗体が１０ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇで有意な抗腫瘍活性を持つことを示している。

【0282】

しかしＢＭＫ４が１０ｍｇ／ｋｇの群で４回目の投与の後に１０％超の体重喪失とともに不活発かつ低体温であることが観察され、これらの徴候は１週間超継続した。これは、この参照抗体がこの用量レベルで毒性である可能性を示している。逆にＷ３５２５は、治療を受けたマウスにおいてあらゆる用量レベルでよく忍容された。

【0283】

まとめると、Ｗ３５２５は１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ両方の用量レベルで腫瘍成長に対して有意な阻害効果を示し、阻害効果は用量に依存する。より重要なのは、Ｗ３５２５で治療した群のすべてのマウスがよく忍容されたが、高用量群のマウスはＢＭＫ４治療に対して不耐性を示した。Ｗ３５２５はＢＭＫ４（すなわちＰｆｉｚｅｒのＣＰ－８７０，８９３）と同等の抗腫瘍活性を媒介するが、より少ない毒性を誘導する。これは、アゴニスト作用と毒性を分離できる可能性と、臨床試験における治療剤としてのＷ３５２５の潜在的な有用性を実証している。

【0284】

４．２ ヒト化ＣＤ４０マウスにおけるＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルでの抗体の生体内有効性研究

【0285】

この研究では、冷たい腫瘍Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルでＷ３５２５の抗腫瘍活性を評価した。０．１ｍＬのＤＰＢＳに懸濁させたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（５×１０^６個）をヒトＣＤ４０トランスジェニックＣＤ４０－Ｈｕマウスの右前脇腹に皮下注射して腫瘍を発達させた。平均腫瘍サイズが約６０～８０ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を有する動物をランダムに７つの研究群に割り当てた。各群は７匹のマウスで構成した。示されている表１６の中の研究設計。すべての抗体を、腫瘍を有するマウスにＱ３ｄの頻度で腹腔内投与した。体重と腫瘍体積もＱ３ｄで測定した。マウスをあらかじめ決めた健康基準に従って安楽死させ、最初の投与の２４日後に研究を終えた。

【0286】

【表19】

【0287】

実験全体を通じてすべてのマウスで腫瘍成長と体重を注意深くモニタし、３日ごとに腫瘍のサイズを測定して記録した。最良の治療時点（群分け後の１２日後）で腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）を計算し、分析した。腫瘍の体積の結果が図１９に示され、表１７と表１８にまとめられている。

【0288】

【表20】

【0289】

【表21】

【0290】

この研究では明らかな体重減少は観察されなかった。平均体重の結果を表１９と図２０に示す。

【0291】

【表22】

【0292】

マウスの生存率も求め、図２１に示した。Ｗ３５２５は、３と１０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を移植されたマウスの生存期間を延長させた

【0293】

群分けの１２日後、Ｗ３５２５が３ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値はそれぞれ７１．４５％と７６．４３％であった。これら２つの群の平均腫瘍体積はＤＰＢＳ群と統計的に有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。Ｗ３５２５が１ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値は２５．６１％だが、ＤＰＢＳ群と統計的に異なっていなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、Ｗ３５２５が１０ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇの用量で有意な抗腫瘍活性を持ち；１ｍｇ／ｋｇの用量で限定された腫瘍増殖抑制活性を持つことを示していた。

【0294】

ＡＰＸ００５Ｍが１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ値は、それぞれ１６．０５％、２３．１４％、および３２．２５％であった。しかしこれらの群の平均腫瘍体積はＤＰＢＳ群の平均腫瘍体積と統計的に有意な差がなかった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、参照抗体が上記の３つの用量で抗腫瘍活性をほとんど持たないか弱い抗腫瘍活性を持つことを示している。

【0295】

Ｗ３５２５はＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいてＡＰＸ００５Ｍよりも有効であり、腫瘍の成長を抑制しただけでなく、腫瘍を有するマウスの生存率も改善したことを結果は実証している。

【0296】

ＣＰ－８７０，８９３とＣＤＸ－１１４０を除くそれ以外のＣＤ４０アゴニスト抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１であるか、ＦｃγＲに特異的に結合する能力を増強するため修飾されたＦｃを持つヒトＩｇＧ１であるため、そのアゴニスト活性のためには一般にＦｃγＲ架橋を必要とする。ＣＰ－８７０，８９３は強いアゴニスト活性を持つ完全ヒトＩｇＧ２であり、初期の臨床試験において有望な治療有効性を示した^{［１５－１６］}。しかしＣＰ－８７０，８９３は治療濃度域が制限されていて最大耐量が０．２ｍｇ／ｋｇである。３件の用量制限毒性事象が観察されており、その中には０．３ｍｇ／ｋｇでの静脈血栓塞栓症、０．３ｍｇ／ｋｇでのグレード３の頭痛、および０．２ｍｇ／ｋｇでのグレード３の血清トランスアミナーゼの一過性上昇が含まれる。ＣＰ－８７０，８９３治療に伴う最も一般的な有害事象はサイトカイン放出症候群（グレード１とグレード２）であり、その中には寒気、悪寒、および発熱が含まれていた（ＮＣＴ０２２２５００２）。アクセス可能な腫瘍はＣＰ－８７０，８９３（ＮＣＴ０２６６５４１６）の腫瘍内注入によって制御されるが、この投与経路がその臨床応用を大きく制限してきた。逆に、ＣＤＸ－１１４０は、ヒトＩｇＧ２形式である別のＣＤ４０アゴニスト抗体であり、カニクイザルにおいて良好な安全性プロファイルを持つが、ヒトＣＤ４０に対しては低親和性（約１２０ｎＭ）であるため、ＤＣを活性化させるアゴニスト活性が制限された。ＡＤＣ－１０１３も良好な安全性プロファイルを示したが、臨床研究（ＮＣＴ０２３７９７４１）において単剤として使用したときの治療有効性は限定されていた。増強されたＣＤ３２ｂ結合性を持つヒトＩｇＧ１であるＡＰＸ－００５Ｍについては、以前に治療されていない転移性膵臓腺癌を持つ患者の治療のための２相臨床試験（ＮＣＴ０３２１４２５０）で有望な有効性が観察されたが、安全性も大きな問題である。

【0297】

Ｗ３５２５－１．９．１６－Ｐ５－ｕＩｇＧ２Ｋは、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域を持つ完全ヒトアゴニスト抗体である。この抗体はＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合するのを阻止するのに対し、ＣＰ－８７０，８９３はＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合するのを阻止できなかった。ＣＤ４０Ｌ阻止抗体はＣＤ４０Ｌ非阻止抗体よりも強力なＣＤ４０アゴニスト活性を持つ傾向があることが示されている^［２１］。

【0298】

本開示を、その精神または中心的属性から逸脱することなく、他の具体的な形態に具体化できることが当業者にはさらにわかるであろう。本開示のこれまでの説明は、その代表的な実施形態だけを開示しており、他のバリエーションが本開示の範囲内であるとして考慮されることが理解されるべきである。したがって本開示が、本明細書で詳細に記述した特定の実施形態に限定されることはない。むしろ、本開示の範囲と内容を示すものとして添付の請求項を参照すべきである。

【0299】

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【0300】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

2023538105000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-04-18

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ４０に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
配列番号１を含む重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１；
配列番号２を含むＨＣＤＲ２；
配列番号３を含むＨＣＤＲ３；
配列番号４または７を含む軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１；
配列番号５を含むＬＣＤＲ２；および
配列番号６を含むＬＣＤＲ３；
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって：
（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、または９５％一致するアミノ酸配列を含む；
重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）であって：
（ｉ）配列番号９または１０に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号９または１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む；
軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

前記単離された抗体がヒトＩｇＧ定常領域をさらに含む、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

前記ヒトＩｇＧ定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域またはヒトＩｇＧ２定常領域である、請求項３に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

前記ヒトＩｇＧ定常領域が、ヒトＩｇＧ２定常領域である、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

前記ヒトＩｇＧ定常領域が、野生型であるか、または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能もしくは他のエフェクタ機能を変化させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項３～５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

前記抗体がＣＤ４０に対するアゴニスト抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分と、医薬として許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

【請求項14】

がんの治療または予防において使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記抗体またはその抗原結合部分をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を適切な条件下で培養する工程；と、
その細胞培養物から前記抗体またはその抗原結合部分を回収する工程とを含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を作製する方法。

【請求項16】

前記抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、前記対象においてＣＤ４０に関連する免疫応答の調節に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項17】

前記抗体またはその抗原結合部分を有効量で対象に投与することを含む、前記対象においてＴ細胞の活性化および／または腫瘍細胞の増殖を阻害するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項18】

がんの治療または予防に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項19】

前記がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、黒色腫、膀胱がん、腎細胞癌、肝臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項20】

前記がんが、大腸がんまたは黒色腫である、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項21】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む容器を含む、キット。

【国際調査報告】