特表 2023-538231 蛍光クエンチャーポリマーコンジュゲート及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-07

(54)【発明の名称】蛍光クエンチャーポリマーコンジュゲート及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C08G 73/04 20060101AFI20230831BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230831BHJP

【ＦＩ】

C08G73/04

G01N21/64 C

G01N21/64 F

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023504340

(86)(22)【出願日】2021-06-30

(85)【翻訳文提出日】2023-03-16

(86)【国際出願番号】 US2021039813

(87)【国際公開番号】W WO2022020081

(87)【国際公開日】2022-01-27

(31)【優先権主張番号】63/055,375

(32)【優先日】2020-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507308810

【氏名又は名称】エンゾー バイオケム，インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】323006116

【氏名又は名称】ラッバーニ、エラザール

(71)【出願人】

【識別番号】323009623

【氏名又は名称】コールマン、ジャック

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ラッバーニ、エラザール

(72)【発明者】

【氏名】コールマン、ジャック

【テーマコード（参考）】

2G043

4J043

【Ｆターム（参考）】

2G043BA16

2G043DA02

2G043EA01

2G043KA02

4J043PA02

4J043PC206

4J043QA04

(57)【要約】

本発明は、ポリマーへコンジュゲートされた複数の蛍光クエンチング部分を含む化学的コンジュゲート、及び巨大分子性蛍光放射物質（フィコエリトリン等）を包含する放射物質からの蛍光の放射をクエンチするためのかかるコンジュゲートの使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の離散離散蛍光クエンチング部分；及び
ポリマー
を含み、
前記複数の離散蛍光クエンチング部分の各々が、前記ポリマーの離散部位へ化学的にコンジュゲートされる、
蛍光クエンチング化合物。

【請求項2】

前記ポリマーが、ポリペプチドでもポリ核酸でもない、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記ポリマーが、分岐ポリマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項4】

前記ポリマーが、ポリアミンポリマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記ポリマーが、ポリカチオン性ポリマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

前記ポリマーが、分岐ポリエチレンイミンを含む、請求項１に記載の任意の１つの化合物。

【請求項7】

前記ポリマーが、分岐ポリエチレンイミンである、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

前記分岐ポリエチレンイミンが、Ｍｗ１０，０００以上の分子量を有する、請求項６または７に記載の化合物。

【請求項9】

前記分岐ポリエチレンイミンが、Ｍｗ１０，０００以下の分子量を有する、請求項６または７に記載の化合物。

【請求項10】

前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ１を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ２を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ０を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項13】

請求項１～１２に記載の化合物のうちの任意の１つ；及び
その蛍光放射が前記化合物によってクエンチされることが可能な蛍光放射物質
を含む、組成物。

【請求項14】

前記蛍光放射物質が、巨大分子性蛍光放射物質である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記蛍光放射物質が、少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記蛍光放射物質が、正味の負電荷を有する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

前記蛍光放射物質が、フィコエリトリンである、請求項１３に記載の組成物。

【請求項18】

前記蛍光放射物質の前記蛍光放射が、前記化合物によってクエンチされる、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

前記蛍光放射物質の前記蛍光放射をクエンチするための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項20】

前記蛍光放射物質が、巨大分子性蛍光放射物質である、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

前記蛍光放射物質が、少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項１９または２０に記載の使用。

【請求項22】

前記蛍光放射物質が、正味の負電荷を有する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項23】

前記蛍光放射物質が、フィソエリトリン（ｐｈｙｓｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）である、請求項１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２３日に出願された米国仮出願シリアル番号第６３／０５５，３７５号の優先権を主張し、当該仮出願は参照することによってその全体が本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、蛍光クエンチング化合物の分野に関する。

【背景技術】

【0003】

フィコエリトリンは、集光性フィコビリタンパク質ファミリーからの赤色のタンパク質－色素複合体であり、光合成に関与する主要なクロロフィル色素の付属物として紅藻類及び氷雪植物において天然に存在する。すべてのフィコビリタンパク質と同様に、フィコエリトリンは、フィコビリンと呼ばれる発色団へ共有結合されたタンパク質サブユニットから構成される。フィコエリトリンファミリーにおいて、２つのフィコビリンは、フィコエリトロビリン（典型的なフィコエリトリンアクセプター発色団）及びフィコウロビリンである。典型的には、フィコエリトリンは、（αβ）タンパク質サブユニット（通常円盤状の三量体（αβ）３または六量体（αβ）６で組織化される）及び第３のタイプのタンパク質サブユニット（γ鎖）から構成される。

【0004】

強力な巨大分子性蛍光放射物質（フィコエリトリン等）と相互作用すること及び当該放射物質からの蛍光放射をクエンチングすることが可能である、新しい改善された蛍光クエンチング化合物が必要であり、本発明によって提供される。

【発明の概要】

【0005】

本発明の１つの実施形態は、
複数の離散蛍光クエンチング部分（ＥＱ０、ＥＱ１、及び／またはＥＱ２等）；及び
ポリマー（分岐ポリエチレンイミン等の非タンパク質で非核酸ポリマー等）
を含み、
複数の離散蛍光クエンチング部分の各々が、ポリマーの離散部位へ化学的にコンジュゲートされる、
蛍光クエンチング化合物を提供する。

【0006】

本発明の関連実施形態は、
前述の蛍光クエンチング化合物；及び
その蛍光放射が当該化合物によってクエンチされることが可能な蛍光放射物質
を含む組成物を提供する。

【0007】

蛍光放射物質は、例えば巨大分子性蛍光放射物質（フィコエリトリン等）あり得る。

【0008】

本発明の別の実施形態は、
アミン反応性基（ＮＨＳ－エステルまたはスルホ－ＮＨＳエステル等であるがこれらに限定されない）を含む蛍光クエンチング化合物を提供するステップ；
分岐ポリエチレンイミンを提供するステップ；及び
アミン反応性基を含む蛍光クエンチング化合物を分岐ポリエチレンイミンと反応させて、蛍光クエンチング化合物及び分岐ポリエチレンイミンのコンジュゲートを形成するステップ、
を含む、蛍光クエンチング化合物を製造する方法を提供する。

【0009】

本発明の追加の特色、利点、及び実施形態は、以下の発明を実施するための形態、図面、及びもしあれば請求項の考慮から示され得るかまたは明らかであり得るさらに、本発明の前述の要約及び以下の発明を実施するための形態の両方は例示的であり、さらなる説明を請求される本発明の範囲を限定せずに提供することが意図されることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明のポリマークエンチャー実施形態及び比較化合物によるフィコエリトリンに対する蛍光クエンチング効果を示す。

【図2】本発明のポリマークエンチャー実施形態によるフィコエリトリンの蛍光クエンチングに対する塩化ナトリウムの効果を示す。

【図3】本発明のポリマークエンチャー実施形態及び比較化合物による、フィコエリトリンｖｓフルオレセイン標識抗体に対する蛍光クエンチング効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

一態様において、本発明は、複数の蛍光クエンチング部分（ＥＱ０、ＥＱ１、及び／またはＥＱ２等）及びポリマー（分岐ポリエチレンイミン等の非タンパク質ポリマー等）の化学的コンジュゲートである蛍光クエンチング化合物を提供する。ポリマーへコンジュゲートされる蛍光クエンチング部分は、すべて同じであり得るか、または異なる蛍光クエンチング部分（異なる化学構造）を含み得る。

【0012】

多数の第一級アミン基を含有するポリマー（分岐ポリエチレンイミン等）は、アミン反応性基（当技術分野において公知のような、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）またはスルホ－ＮＨＳエステル等）を含む蛍光クエンチング化合物の化学的誘導体へ容易にコンジュゲートされ得る。

【0013】

ＮＨＳエステルは、カルボキシレート分子のカルボジイミド活性化によって形成された反応性基である。ＮＨＳエステル活性化架橋剤及び標識化合物を、生理的な条件から弱アルカリ性の条件（ｐＨ７．２～９）において第一級アミンと反応させて、安定的なアミド結合をもたらす。反応は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を放出する。

【0014】

ＮＨＳエステル架橋反応は、最も一般的には、ｐＨ７．２～８．５のホスフェートバッファー、カーボネート－バイカルボネートバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、またはボレートバッファー中で、室温または４℃で０．５～４時間遂行される。第一級アミンバッファー（トリス（ＴＢＳ）等）は反応を競合するので、適合性がないが、いくつかの手順において、反応をクエンチする（停止する）ためにコンジュゲーション手順の終了時でトリスバッファーまたはグリシンバッファーを添加するには有益である。

【0015】

スルホ－ＮＨＳエステルはＮＨＳエステルに類似するが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド環上にスルホネート（－ＳＯ_３）基を含有する。この荷電基は反応化学に影響がないが、それらを含有する架橋剤の水溶性を増加させる傾向がある。

【0016】

クエンチャー
任意のポリマーへのコンジュゲーションに好適な蛍光クエンチング化合物及びそれらの反応性誘導体（例えばそのＮＨＳ－エステル誘導体）は、本発明に従って使用され得、Ｍｏｎｏａｚｏ Ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｃｌｉｃ Ａｍｉｎｅ ａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓという表題の米国特許第９，９５７，３９３号（参照することによってその全体が本明細書に援用される）中で開示されるもの等であるがこれらに限定されない。

【0017】

限定されないが、クエンチャーの以下のＮＨＳエステル誘導体は、本発明に従って使用され得る。

【化1】

【0018】

ＥＱ０ ＮＨＳエステル（カタログ番号ＥＮＺ－ＣＨＭ２０８－０００１；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は、アミン反応性クエンチャー色素である。ＥＱ０は、４４５ｎｍでの最大吸収の広範な可視吸収を有するが、検出可能な蛍光放射は無く、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）適用においてアクセプターとして有用なものにする。それは、以下のクエンチレポーター色素：ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－Ｘ、ＤＥＡＣ、ＤＥＡＣ－Ｘ、ＭＣＡ、ＭＣＣ、ＣＦ（商標）３５０、ＣＦ（商標）４０５Ｓ、ＣＦ（商標）４０５Ｍ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４０５、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ｉＦｌｕｏｒ（商標）３５０、ｉＦＬｕｏｒ（商標）４０５、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０、ＢＵＶ３９５、及びｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０へ使用され得る。

【0019】

ＥＱ１ ＮＨＳエステル（カタログ番号ＥＮＺ－ＣＨＭ１６５－０００１；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は、アミン反応性クエンチャー色素である。ＥＱ１は、５３５ｎｍでの最大吸収の広範な可視吸収を有するが、検出可能な蛍光放射は無く、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）適用においてアクセプターとして有用なものにする。それは、以下のクエンチレポーター色素：ＦＡＭ、Ｃｙ２、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３．５、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ ５９０、及びＡＴＴＯ ５９４へ使用され得る。

【0020】

ＥＱ２ ＮＨＳエステル（カタログ番号ＥＮＺ－ＣＨＭ１６６－０００１；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は、アミン反応性クエンチャー色素である。ＥＱ２は、５８３ｎｍでの最大吸収の広範な可視吸収を有するが、検出可能な蛍光放射は無く、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）適用においてアクセプターとして有用なものにする。それは、以下のクエンチレポーター色素：ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３．５、ＲＯＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）、パルサー（登録商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ ５５５ ５４６ ５３２ ６５０ ５７０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、及びＡＴＴＯ ６４７へ使用され得る。

【0021】

ポリマー
１つまたは複数タイプの蛍光クエンチャーのコンジュゲーションのために複数の離散部位を有する直鎖状または分岐状のポリマーは、本発明に従って使用され得る。ポリマーは、例えばタンパク質またはポリペプチドでなくてもよい。ポリマーは、例えばポリ核酸ポリマーでなくてもよい。ポリマーは、例えば合成ポリマーであり得る。ポリマーは、例えば炭素原子、窒素原子、及び水素原子から優先的になり得るか、またはそれらのみからなり得る。ポリマーは、例えばポリアミンであり得る。

【0022】

使用され得る１つのポリマーは、分岐ポリエチレンイミン、高カチオン性電荷密度を備えた水溶性ポリアミン（第一級アミン基、第二級アミン基、及び第三級アミン基を含有する）である。例えばＪａｇｅｒ Ｍ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｓ，Ｏｃｈｒｉｍｅｎｋｏ Ｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ＵＳ．（２０１２），Ｂｒａｎｃｈｅｄ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅ）－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．４１（１３）：４７５５－４７６７を参照されたい。商業的に市販される製品は様々な分子量で利用可能であり、例えば分岐ポリエチレンイミン、Ｍｗ６００（ｂＰＥＩ ６００；カタログ番号０２３７１－１００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＨ_２Ｏ中で５０％ｗ／ｖの分岐ポリエチレンイミン溶液、Ｍｎ約６０，０００、Ｍｗ７５０，０００（カタログ番号Ｐ３１４３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が挙げられる。

【0023】

本発明の実施形態は、例えばＭｗ１０００未満；Ｍｗ１０００以上；Ｍｗ５，０００以上；Ｍｗ１０，０００以上；Ｍｗ１００，０００以下；Ｍｗ１，０００，０００以下；及び／またはＭｗ１００～１，０００，０００の範囲中のあるいはその中の全整数値間の任意の部分範囲の分子量を有する分岐ポリエチレンイミンを使用し得る。

【実施例】

【0024】

ＰＥＩ－ＥＱ１コンジュゲートの産生
Ｈ_２Ｏ中で５０％ｗ／ｖの分岐ポリエチレンイミン溶液（「ＰＥＩ」；カタログ番号Ｐ３１４３ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を水中で希釈した（具体的には１．１７９ｍｇ／ｍｌのＰＥＩまたは約２７．４ｍＭのモノマーアミンの最終濃度のために、４２３μｌの水の中へ１μｌ）。

【0025】

使用した対照は、５０ｍｇ／ｍｌまたは約０．０６４３ｍＭのアミン（リジンまたはアルギニン）の濃度のウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」；カタログ番号ＡＭ２６１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。

【0026】

ＰＥＩ及びＢＳＡを、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯカラム（カタログ番号８９８８２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）（カタログ番号Ｃ３３０４１－５０ ＣＡＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）へとバッファー交換した。これを行うために、カラムを最初に１．５ｋ×ｇで１分間遠心して、液体を除去した。カラムを３００μｌの１００ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）により再水和し、続いて１．５ｋ×ｇで１分間遠心分離した。炭酸ナトリウム洗浄を追加の３回反復した。Ｚｅｂａカラムを新しいチューブへ移し、１００μｌのＰＥＩまたはＢＳＡのいずれかを上部に重層し、続いて１．５ｋ×ｇで１分間遠心分離した。フロースルーは、炭酸ナトリウムバッファー中でＰＥＩまたはＢＳＡのいずれかを含有する。

【0027】

１ｍｇのＥＱ１－ＮＨＳエステル（カタログ番号ＥＮＺ－ＣＨＭ１６５－０００１、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、１８６．７μｌのアミン不含有ジメチルホルムアミド（カタログ番号４３４６５－ＡＰ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）中で再懸濁して、１０ｍＭの溶液を作製した。

【0028】

標識のために、１００μｌのＰＥＩまたはＢＳＡを使用した。ＰＥＩについて、６８．５μｌのＥＱ１－ＮＨＳエステルを添加し、ＢＳＡについて、１μｌのＥＱ１－ＮＨＳエステルを添加した。反応を、ローテーター上で３時間室温（２２℃）で３時間実行した。

【0029】

反応後に、混合物を精製し、一度に１００μｌの５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）により前平衡化したＺｅｂａカラムを使用して、バッファー交換した。Ｚｅｂａカラムは、より大きな分子量のＰＥＩまたはＢＳＡから取り込まれていないＥＱ１－ＮＨＳエステルを分離する。

【0030】

ＰＥＩまたはＢＳＡへコンジュゲートされたＥＱ１、または単独のＥＱ１の濃度を、吸光度によって決定した。ＥＱ１は約５３５ｎｍで吸収し、３５．２ｍＭ^－１ｃｍ^－１の消光係数を有する。この事例において、ＥＱ１濃度単独が９４．５μＭであり、ＰＥＩへコンジュゲートされたＥＱ１の濃度は９８３μＭであり、ＢＳＡへコンジュゲートされたＥＱ１の濃度は３６μＭであった。

【0031】

ＰＥＩ－ＥＱ１コンジュゲートによるクエンチング
ＰＥＩ－ＥＱ１が、ＥＱ１単独に比較してフィコエリトリンのクエンチングを促進するかどうかを試験するために、クエンチャーを、２００ｎｇのフィコエリトリン標識抗ＨＰＶ１６－Ｅ７抗体「ＨＰＶ１６ Ｅ７抗体（ＥＤ１７）ＰＥ」（カタログ番号ｓｃ－６９８１ ＰＥ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）と混合した。ＥＱ１の量は、１１０μｌの体積のＰＢＳ中で３９４ｐｍｏｌｅであった。対照として、同じ濃度で単独ＰＥＩを添加した。蛍光を、４８０ｎｍでの励起及び５００～６５０ｎｍの放射捕捉により、上部からの読み取りで、Ｂｉｏｔｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＭｘプレートリーダー上で測定した。

【0032】

この実験の結果を図１中で示す。示されるように、ＰＥＩ単独はフィコエリトリンの蛍光に対して非常に少ない効果を有し、ＥＱ１単独またはＥＱ１－ＢＳＡコンジュゲートも同様である。しかしながら、ＰＥＩへコンジュゲートされたＥＱ１（ＥＱ１－ＰＥＩ）を使用した場合に、フィコエリトリンの蛍光は、存在するクエンチャー無しに起こる蛍光の２％未満まで低減される。

【0033】

図２中で示されるように、塩化ナトリウムが８３３ｍＭの濃度まで添加されるならば、ＥＱ－ＰＥＩによるクエンチングは、フィコエリトリン単独の蛍光の５０％のみである。この結果は、ＥＱ１単独に比べたＥＱ１－ＰＥＩによるクエンチングの促進が、コンジュゲートのＰＥＩ構成要素とフィコエリトリンとの間の塩架橋に関連することを示唆する。

【0034】

次に、ＥＱ１－ＰＥＩによるクエンチングの促進がフィコエリトリンに特異的かどうかを調査するために、フルオレセイン標識抗体（ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４０９３０９）のクエンチングを、ＥＱ１単独、ＥＱ１－ＰＥＩ、ＥＱ１－ＢＳＡ、及びクエンチャー無しの対照を使用して試験した。具体的には、４００ｎｇのＦＩＴＣ標識抗体を、３９４ｐｍｏｌｅのＥＱ１単独、ＰＥＩへ結合されたＥＱ１（ＥＱ１－ＰＥＩ）、またはＢＳＡへ結合されたＥＱ１（ＥＱ１－ＢＳＡ）、あるいはクエンチャー無しの対照によりインキュベーションした。再び、発光スペクトルを４８０ｎｍでの励起により読み取った。図３中で示されるように、ＰＥＩ－ＥＱ１はＥＱ１単独に比べてフルオレセインのクエンチングを促進するが、フィコエリトリンをクエンチする場合に観察されたものとほぼ同じ程度までクエンチしない。

【0035】

限定されないが、以下の実施形態も本発明によって提供される。

【0036】

実施形態１。複数の離散蛍光クエンチング部分；及び
ポリマー
を含み、
前記複数の離散蛍光クエンチング部分の各々が、前記ポリマーの離散部位へ化学的にコンジュゲートされる、
蛍光クエンチング化合物。

【0037】

実施形態２。前記ポリマーが、ポリペプチドでもポリ核酸でもない、実施形態１に記載の化合物。

【0038】

実施形態３。前記ポリマーが、分岐ポリマーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の化合物。

【0039】

実施形態４。前記ポリマーが、ポリアミンポリマーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の化合物。

【0040】

実施形態５。前記ポリマーが、ポリカチオン性ポリマーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の化合物。

【0041】

実施形態６。前記ポリマーが、分岐ポリエチレンイミンを含む、実施形態１に記載の任意の１つの化合物。

【0042】

実施形態７。前記ポリマーが、分岐ポリエチレンイミンである、実施形態６に記載の化合物。

【0043】

実施形態８。前記分岐ポリエチレンイミンが、Ｍｗ１０，０００以上の分子量を有する、実施形態６または７に記載の化合物。

【0044】

実施形態９。前記分岐ポリエチレンイミンが、Ｍｗ１０，０００以下の分子量を有する、実施形態６または７に記載の化合物。

【0045】

実施形態１０。前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の化合物。

【0046】

実施形態１１。前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ２を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の化合物。

【0047】

実施形態１２。前記複数の蛍光クエンチング部分が、一部分としてＥＱ０を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の化合物。

【0048】

実施形態１３。実施形態１～１２に記載の化合物のうちの任意の１つ；及び
その蛍光放射が前記化合物によってクエンチされることが可能な蛍光放射物質
を含む、組成物。

【0049】

実施形態１４。前記蛍光放射物質が、巨大分子性蛍光放射物質である、実施形態１３に記載の組成物。

【0050】

実施形態１５。前記蛍光放射物質が、少なくとも１つのポリペプチドを含む、実施形態１３または１４に記載の組成物。

【0051】

実施形態１６。前記蛍光放射物質が、正味の負電荷を有する、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の組成物。

【0052】

実施形態１７。前記蛍光放射物質が、フィコエリトリンである、実施形態１３に記載の組成物。

【0053】

実施形態１８。前記蛍光放射物質の前記蛍光放射が、前記化合物によってクエンチされる、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載の組成物。

【0054】

本発明は、本明細書において開示されるポリマー性クエンチング化合物の実施形態により、またはそれらのうちの任意のものを使用して、蛍光放射物質（本明細書において開示される蛍光放射物質または蛍光放射物質のタイプのうちの任意のもの等）の蛍光放射をクエンチする方法も提供する。同様に、発明は、蛍光放射物質（本明細書において開示される蛍光放射物質または蛍光放射物質のタイプのうちの任意のもの等）の蛍光放射をクエンチするための、本明細書において開示されるポリマー性クエンチング化合物実施形態のうちの任意のものの使用も提供する。

【0055】

本出願において任意の実施形態またはその一部分の記載と関連して、含むまた包含するという用語（または類似の範囲の用語）が列挙される場合はいつでも、その代りに、から本質的になるという用語、またはからなるという用語（または類似の趣旨の用語）を列挙する対応する実施形態またはその一部分も開示されることを理解されたい。

【0056】

任意の及びすべての出版物、特許、特許出願、及び本出願において引用される他の文書は、あたかも各々個別の出版、特許、特許出願、または他の文書が、参照することによってすべての目的のために援用されることが個別に指示されたかのように、同じ程度まで、それらの全体が参照することによってすべての目的のために本明細書に援用される。

【0057】

様々な具体的な実施形態が例証され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、様々な変化が行われ得ることが認識されるだろう。さらに、本発明の１つの実施形態と関連して記載される特色は、明示的に組み合わせ内で例示されなかったとしても、他の実施形態と併用して使用され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】