特表 2023-538364 膠芽細胞腫および他のがんの処置のためのＢ細胞ベースの免疫治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-07

(54)【発明の名称】膠芽細胞腫および他のがんの処置のためのＢ細胞ベースの免疫治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20230831BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230831BHJP

   A61K 31/4188 20060101ALI20230831BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230831BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20230831BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230831BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20230831BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61P35/00

A61K31/4188

A61P43/00 121

C12N5/0781 ZNA

C12N15/09 Z

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023511939

(86)(22)【出願日】2021-08-17

(85)【翻訳文提出日】2023-04-14

(86)【国際出願番号】 US2021046331

(87)【国際公開番号】W WO2022040202

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】63/066,533

(32)【優先日】2020-08-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500041019

【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リー－チャン， カタリナ

(72)【発明者】

【氏名】レスニアク， マチェイ エス．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BB19

4B065BB34

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG04

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB05

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB63

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮγを使用して４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を活性化することによって抗がん組成物を作製する方法を提供する。これらの方法によって産生された抗がん組成物は、がんの処置のための免疫治療として、単独で、または放射線、化学療法薬、および／もしくはチェックポイント遮断と組み合わせて使用され得る。（ａ）４－１ＢＢＬ＋（ＣＤ１３７Ｌ＋）Ｂ細胞を回収するステップ；（ｂ）上記Ｂ細胞をＣＤ４０アゴニストとインキュベートするステップ；（ｃ）ＩＦＮ－γを上記のＢ細胞に添加するステップ；および（ｄ）上記Ｂ細胞を腫瘍由来抗原と接触させるステップによって抗がん組成物を作製する方法を本明細書中に提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗がん組成物を作製する方法であって、（ａ）４－１ＢＢＬ＋（ＣＤ１３７Ｌ＋）Ｂ細胞を回収するステップ；（ｂ）前記Ｂ細胞をＣＤ４０アゴニストとインキュベートするステップ；（ｃ）ＩＦＮ－γを前記Ｂ細胞に添加するステップ；および（ｄ）前記Ｂ細胞を腫瘍由来抗原と接触させるステップを含む、方法。

【請求項2】

前記Ｂ細胞を、がんと診断された被験体から回収する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記がんが、膠芽細胞腫、黒色腫、乳がん、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＣＤ４０アゴニストが、ＣＤ１５４およびＣＤ４０抗体またはＣＤ４０をアゴナイズすることができるその一部から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ｂ）において、前記Ｂ細胞をＢＡＦＦともインキュベートする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｂ細胞を、前記ＣＤ４０アゴニストおよび必要に応じてＢＡＦＦと少なくとも１２時間インキュベートする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＩＦＮ－γを少なくとも１０Ｕ／ｍｌの濃度で添加する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＩＦＮ－γを、前記腫瘍由来抗原と接触させる前に少なくとも１２時間添加する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記腫瘍由来抗原が腫瘍細胞ライセートである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記腫瘍細胞ライセートが、がんを有する被験体に由来する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって作製された４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を含む組成物。

【請求項12】

ＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮ－γで少なくとも２０時間ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化され、腫瘍由来抗原でパルスした４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を含む組成物。

【請求項13】

前記ＣＤ４０アゴニストがＣＤ４０抗体またはその一部である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記腫瘍由来抗原が腫瘍細胞ライセートである、請求項１１または１２に記載の組成物。

【請求項15】

がんを有する被験体を処置するために請求項１１～１４のいずれか１項に記載のＢ細胞組成物を使用する方法であって、有効量の前記組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。

【請求項16】

放射線治療を前記被験体に施すステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記放射線治療を前記Ｂ細胞組成物の投与前に施す、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

チェックポイント阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤であり、必要に応じて、前記阻害剤が、ＰＤ１抗体もしくはＰＤ－Ｌ１抗体またはその一部である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

さらなる非Ｂ細胞リンパ球を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記非Ｂ細胞リンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

化学療法薬を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記化学療法薬がテモゾロミドである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記組成物を、静脈内、皮下、リンパ内、皮内、または頭蓋内に投与する、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明を、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ５０ ＣＡ２２１７４７、Ｒ３５ ＣＡ１９７７２５、およびＲ０１ ＮＳ０９３９０３の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明に一定の権利を有する。
関連特許出願の相互参照

【0002】

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０２０年８月１７日提出の米国特許仮出願第６３／０６６，５３３号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
配列表
本願には配列表が添付されており、この配列表は、ファイル名「７０２５８１＿０２００７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、サイズ２００９バイト、作成日２０２１年８月１７日のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されている。配列表は、本出願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂから電子的に提出されており、その全体が本明細書中で参考として援用される。

【背景技術】

【0003】

背景
基礎研究、トランスレーショナル研究、および臨床研究における多大な努力にもかかわらず、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）患者の標準治療は、腫瘍処置分野を除いて（Ｔａｐｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、過去２０年間、実質上変化していない（Ｓｔｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＧＢＭは、免疫学的に「最もコールドな腫瘍」のうちの１つであり、Ｔ細胞が最大限に除去され、骨髄浸潤が顕著である（Ｔｈｏｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。これは、強い免疫抑制（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）、代謝的に厳しい微小環境（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）、およびこれらの腫瘍の変異量の少なさ（Ｉｒａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に起因する。これらの障壁が合わさって、有効な免疫治療の開発が妨げられてきた（Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。

【0004】

クリニックで試験された最初の免疫治療では、ＧＢＭに対する内因性免疫を促進するための方法として樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンが使用された（Ｅａｇｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｐｒｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これらの試験のうちの多くでは、ＤＣが自己腫瘍ライセートでパルスされ、他方では腫瘍関連抗原に対する免疫原性エピトープが注射された（Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。より多くの試験が進行中であるにもかかわらず、今日まで、これらのアプローチの成功は限定されている（Ｅａｇｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。いくつかの新規の治療ストラテジー（チェックポイント遮断（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）またはＧＢＭ抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の養子移入など）も探究されている（Ｐｉｔｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。しかしながら、これらの有効性は、未だ確定されていない。免疫治療は今もなおＧＢＭ患者において魅力的なアプローチであるが、免疫治療アプローチでは、これらの患者において臨床的利点を達成するための抗腫瘍免疫を未だ有意に促進していない。

【0005】

Ｂ細胞ベースのワクチンは、抗がん免疫を高めるためには有望であるが、調査中のアプローチである（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。細胞ベースのワクチンとして、Ｂ細胞には以下の３つの主な利点がある：ｉ）Ｂ細胞は、ｅｘ－ｖｉｖｏで容易に製造できること；ｉｉ）Ｂ細胞は、Ｔ細胞と同種抗原（Ａｇ）特異性を共有することができること（Ｗｅｎｎｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；ｉｉｉ）Ｂ細胞は、移動性が高く、重要な二次リンパ系器官および腫瘍に帰巣することが可能であること（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0006】

しかしながら、Ｂ細胞抗腫瘍ワクチンにあまり関心が寄せられてこなかった主な理由は、Ｂ細胞が周囲の微小環境内で抗腫瘍形成性表現型と腫瘍形成促進性表現型を迅速に切り替えることができる点にある。例えば、Ｂ細胞は、ＧＢＭ内で免疫抑制性を示すようになり、浸潤免疫細胞の約１０％を占める（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。それにもかかわらず、腫瘍浸潤Ｂ細胞は、様々ながんにおいて抗腫瘍効果を示すことは確かである（Ｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。その機能は、抗腫瘍抗体の産生（Ｇａｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ならびにその抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能およびエフェクターＴ細胞の活性化（Ｂｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に関連している。したがって、本分野において腫瘍免疫抑制に抵抗性を示すＢ細胞抗腫瘍ワクチンについての要求は依然として満たされていない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

概要
（ａ）４－１ＢＢＬ＋（ＣＤ１３７Ｌ＋）Ｂ細胞を回収するステップ；（ｂ）上記Ｂ細胞をＣＤ４０アゴニストとインキュベートするステップ；（ｃ）ＩＦＮ－γを上記のＢ細胞に添加するステップ；および（ｄ）上記Ｂ細胞を腫瘍由来抗原と接触させるステップによって抗がん組成物を作製する方法を本明細書中に提供する。

【0008】

上記方法によって作製されたＢ細胞を含む組成物も提供する。組成物は、ＣＤ８６およびＩＦＮ－γ受容体の発現を増加させるためにＣＤ４０アゴニストを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化され、ＩＦＮ－γと少なくとも２０時間さらにインキュベートされ、Ｂ細胞が有効な腫瘍由来抗原提示細胞であるように腫瘍由来抗原で最後にパルスされた４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を含む。

【0009】

さらなる態様では、本発明は、Ｂ細胞組成物を使用して有効量の組成物をがんを有する被験体に投与することによって該被験体を処置するための方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1-1】図１は、ＧＢＭ患者の末梢血中の４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞が抗原提示機能を有することを実証している。（Ａ）新規に診断されたＧＢＭ患者のＰＢＭＣ由来のＣＤ１９^＋ＣＤ２０^＋Ｂ細胞中の４－１ＢＢＬ発現を示す箱ひげ図（ｎ＝９０）。（Ｂ）４－１ＢＢＬ^－（黒線）Ｂ細胞および４－１ＢＢＬ^＋（青線）Ｂ細胞によるＴＮＦαおよびＩＦＮγの細胞内発現、ならびにＣＤ６９およびＣＤ８６の表面発現を示すヒストグラム。（Ｃ）新規に診断されたＧＢＭ患者のＰＢＭＣにおけるＢ細胞による４－１ＢＢＬ発現およびＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＣＤ６９発現の線形回帰分析（ｎ＝６８）。（Ｄ～Ｅ）３人の新規に診断されたＧＢＭ患者（ＮＵ００８５６、ＮＵ０１００６、およびＮＵ００４２９）の末梢血由来の自家４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞および４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞と混合した抗ＣＤ３およびＩＬ２で活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を使用したＣＤ８^＋Ｔ細胞共刺激アッセイ。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を、細胞拡大増殖（Ｄ）ならびに細胞内ＩＦＮγおよびＧｚｍＢの発現（Ｅ）として測定した。実験を３連で行った。（Ｆ）ＧＬ２６１－ＯＶＡマウス由来のＢ_Ｖａｘを、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）でパルスし（Ｂ_{Ｖａｘ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）}）、ＭＨＣクラスＩによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）提示（Ｈ－２Ｋ^ｂ＋ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）抗体）ならびにＭＨＣクラスＩ（Ｈ－２Ｋ^ｂ）ならびに共刺激分子ＣＤ８６および４－１ＢＢＬの共発現について評価した。３つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｇ）Ｂ_Ｖａｘを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートＯＶＡの取り込み能力について試験し［Ｂ_{Ｖａｘ（ＯＶＡ）}］、（Ｈ）は、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ－２Ｋ^ｂ）を介したＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドを示す。Ｈ－２Ｋ^ｂ＋ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）複合体の表面輸送を、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を使用して阻害した。３つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｉ）Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ} ^＋ＩＦＮγ、Ｂ_Ｖａｘ、およびＤＣを、ＯＶＡでパルスし、細胞増殖（拡大増殖指数、Ｘ軸）およびＧｚｍＢの細胞内発現（Ｙ軸）によって査定したＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を促進するそれらの能力について試験した。実験を３連で行った。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｊ）ＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、ＯＶＡおよびアイソタイプコントロールでパルスしたＢ_Ｖａｘ（Ｂ_{Ｖａｘ（ＯＶＡ）} ^＋ＩＣ）、またはＯＶＡおよびＭＨＣクラスＩ遮断ＡｂでパルスしたＢ_Ｖａｘ（Ｂ_{Ｖａｘ（ＯＶＡ）} ^＋抗Ｈ２Ｋ_ｂ）と培養し、これらの細胞拡大増殖について試験した。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。全てのヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【0011】

【図2-1】図２は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘ抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能を特徴づけている。（Ａ）Ｒａｇ１欠損マウスを、オボアルブミンを過剰発現するＧＬ２６１（ＧＬ２６１－ＯＶＡ）で頭蓋内チャレンジした。９日後、マウスにＯＶＡタンパク質でパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}またはＢ_Ｖａｘを静脈内投与した。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のｅＦｌｕｏｒ４５０標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｂ細胞と同時に注射した（ｎ＝４マウス／群）。細胞養子移入の７日後に、腫瘍担持脳および深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）内のｅＦｌｕｏｒ４５０^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって評価した。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｂ）Ｂ細胞欠損（Ｂ ＫＯ）マウスを、ＧＬ２６１－ＯＶＡで頭蓋内チャレンジした。９日後、マウスにＯＶＡタンパク質でパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}またはＢ_Ｖａｘを静脈内投与した。Ｂ_{Ｖａｘ（ＯＶＡ）}の一群を、注射前に百日咳毒素（ＰＴＸ）で前処置した（ｎ＝４マウス／群）。細胞養子移入の７日後に、腫瘍担持脳内のＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）－四量体を使用したフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｃ）Ｂ細胞欠損（Ｂ ＫＯ）マウスを、ＣＴ２Ａ細胞で頭蓋内チャレンジした。９日後、マウスに、ＰＴＸで前処理したか前処理していないＣＴ２Ａ腫瘍ライセートでパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_Ｖａｘを静脈内投与した（ｎ＝５マウス／群）。細胞養子移入の７日後に、腫瘍担持脳、血液、およびｄＣＬＮ内のＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＧｚｍＢおよびＩＦＮγの細胞内発現について評価した。３つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｄ）Ｒａｇ１欠損（ＫＯ）マウスを、ＣＴ２Ａ細胞で頭蓋内チャレンジした。９日後、マウスにＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ Ｂ_Ｖａｘ（赤色）細胞およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）緑色ＣＭＦＤＡ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞（緑色）の両方を同時に静脈内投与した。Ｂ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の脾臓局在化を、蛍光顕微鏡法によって分析した。バーは、１００μｍ（左側の画像、２０倍）および５０μｍ（右側の画像、６３倍）を示す。画像は、３匹のマウスの代表的な脾臓およびＣＬＮを示す。ヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【0012】

【図3-1】図３は、放射線治療がｉｎ ｖｉｖｏでのＢ細胞適応に好ましいことを実証している。（Ａ）ＣＴ２Ａ担持マウスを照射し（ＲＴ）、ＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを静脈内に養子移入した。脾臓、ｄＣＬＮ、および腫瘍担持脳内のＣＤ４５．１^＋細胞を、フローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝４マウス／群）。（Ｂ）ＲＴから３６時間後および５日後に、照射したＣＴ２Ａ担持マウスから採血した（ｎ＝３マウス／群）。血清ＢＡＦＦレベルを分析し、非照射（腫瘍）および非腫瘍担持マウス血清（腫瘍なし）と比較した。（Ｃ）（Ａ）と同一の実験を、ＣＤ４５．１^＋Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ（抗ＣＤ４０およびＩＦＮγで活性化した４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞）、またはＢ_Ｖａｘを使用して行った。脾臓およびｄＣＬＮ中のＣＤ４５．１^＋細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。Ｂ細胞の増殖状況を、Ｋｉ６７の発現によって査定した。各群（ｎ＝３～４マウス／群）の代表的な動物を示す。実験を個別に２回繰り返した。（Ｄ）あるいは、マウス群に、ＢＡＦＦ受容体遮断Ａｂで前処理したＢ細胞を投与した。また、マウスを、Ｂ細胞移入後、３日連続で静脈内処置を施した。（Ｅ）照射されたＣＴ２Ａ担持マウスに、静脈内にビヒクル（モック、黒色の線）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（灰色の線）、パルスしたＢ_Ｖａｘ（黒色破線）、またはパルスしたＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の組み合わせ（ピンク色の点線）を投与した。実験を、ｎ＝１０マウス／群を使用して行った。３つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｆ）照射したＣＴ２Ａ担持マウスに、静脈内にビヒクル（モック、黒色の線）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（灰色の線）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（静脈内）＋皮内（ＤＣ_{Ｖａｘ（ｉｄ）}、黒色破線）または静脈内（ＤＣ_{Ｖａｘ（ｉｖ）}、青色線）のいずれかに投与したパルスしたＤＣ_Ｖａｘ、パルスしたＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ピンク色の点線）を投与した。実験を、ｎ＝１０マウス／群を使用して行った。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。（Ｇ）照射したＣＴ２Ａ担持マウスに、ｅＦｌｕｏｒ４５０標識Ｂ_ＶａｘまたはＤＣを静脈内投与した。ＤＣを、静脈内（ＤＣ_（ｉｖ））または皮内（ＤＣ_（ｉｄ））のいずれかに投与した。細胞移入の７日後に、ｄＣＬＮおよび脾臓内のｅＦｌｕｏｒ４５０^＋細胞を分析した（ｎ＝３～４マウス／群）。２つの独立した実験のうちの代表的な実験を示す。ヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図3-5】同上。

【0013】

【図4-1】図４は、Ｂ_ＶａｘがＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤および増殖を容易にすることを実証している。（Ａ）腫瘍移植７日後にＣＴ２Ａ担持マウスに照射した。４８時間後に、マウスに、ＤＣまたはＢ_ＶａｘをＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ濃赤色標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に静脈内投与した。ＣＤ８^＋細胞によって発せられた遠赤外シグナルを、異なる時点で（２４、３０、５０、および７２時間）モニタリングした。実験を、４マウス／群を使用して行った。１匹のマウスには、いかなるリンパ球も投与せず、ブランクとして使用した。全ての実験において、画像取り込みのみを目的としてマウスを無作為化し、処置群に分けた。（Ｂ）あるいは、マウスに、ＤＣまたはＢ_Ｖａｘ（ＣＴ２Ａライセートでパルスした）をＣＤ４５．１コンジェニックマウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞と同時に投与した。４８時間後に、マウスを、Ｋｉ６７発現の測定によって養子移入したＣＤ４５．１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖状況について評価した。この実験を、５マウス／群を使用して行った。（Ｃ）腫瘍注射７日後にＣＴ２Ａ担持マウスに照射した。照射２４時間後に、マウスに、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞（静脈内）±ＣＴ２Ａタンパク質ライセートでパルスしたＢ_Ｖａｘ（静脈内）±抗ＰＤ－Ｌ１（腹腔内）を投与した。７日後に、腫瘍担持脳、ｄＣＬＮ、および浅頸リンパ節（ｓＣＬＮ）中のＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存続（％ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／総ＣＤ４５^＋白血球）を、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｄ）また、（Ｃ）で使用した養子移入ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ｄＣＬＮ中のＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＧｚｍＢ、およびＩＦＮγについて表現型検査した（注射後）。この表現型を、注射前の表現型と比較した。全てのヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図4-2】同上。

【図4-3】同上。

【図4-4】同上。

【0014】

【図5-1】図５は、Ｂ_ＶａｘがＲＴ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋ＰＤ－Ｌ１遮断物の組み合わせの治療効果を増強することを実証している。（Ａ）照射されたＣＴ２Ａ担持マウスに、ビヒクル（モック、黒色の線）、３回の抗ＰＤ－Ｌ１注射（黒色の点線）、３回のＣＤ８^＋Ｔ細胞および抗ＰＤ－Ｌ１の注射（灰色の線）、または３回のパルスしたＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞および抗ＰＤ－Ｌ１の注射（ピンク色の点線）を投与した。非照射群を対照として維持した（ＲＴなし、黒色破線）。腫瘍チャレンジ７５日後に（矢印）、生存マウスの左半球（最初の腫瘍注射部位の反対側）に、ＣＴ２Ａ細胞を再度チャレンジした。（Ｂ）長期生存マウス（ＬＴＳ）を屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色を使用して腫瘍塊の存在をチェックした。腫瘍を担持しないが頭蓋骨に穴を開けた（ｄｒｉｌｌｅｄ）（腫瘍なし）年齢適合ＣＴ２Ａ担持マウス（対照）を、対照として使用した。漫画で描かれているように切開を行った。Ｂ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞で処置したＬＴＳ（ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８）について、脳の右半球（第１の注射部位、ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８ Ｒ）および左半球（第２の注射部位－再チャレンジ、ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８ Ｌ）の両方を切開した。Ｈ＆Ｅ切片画像は、３つのＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８、２つの対象、および１つの腫瘍なしの脳の代表である。（Ｃ）（Ｂ）で利用した脳と同一の脳を使用して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤について染色した。１つのＬＴＳ－Ｒ接切片の代表的な画像であって、そこでは脈絡叢、注射部位、橋（矢印）、および小脳（矢印）が拡大されている。バーは、１００μｍを示す。（Ｄ）腫瘍なし（ｎ＝２）、対照（ｎ＝３）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のみを投与してＰＤ－Ｌ１遮断したＬＴＳ（ＬＴＳ－ＣＤ８、ｎ＝４）、およびＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８（ｎ＝５）のマウスから新たに切開した脳を、リンパ球表現型について分析した。全てのヒストグラムおよびフローサイトメトリーのデータを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【図5-4】同上。

【0015】

【図6-1】図６は、ＧＢＭ標準治療およびＰＤ－Ｌ１遮断物の組み合わせにおいてＢ_{Ｖ ａｘ}が動物の生存を増強したことを実証している。（Ａ）マウスに全脳放射線治療（Ｂ－ＲＴ）を３日連続で行い（Ｄ７～Ｄ１０、毎日３Ｇｙ）、その後に５０ｍｇ／Ｋｇのテモゾロミド（ＴＭＺ）を５日連続で投与した（Ｄ１１～Ｄ１６）。血清ＢＡＦＦレベルを、選択した治療の終了から３６時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｂ）コンジェニックＣＤ４５．１^＋マウス由来のＢ_Ｖａｘを、ＣＤ４５．２^＋ＣＴ２Ａ担持マウスに養子移入した（ｎ＝４マウス／群）。細胞養子移入の７日後に、脾臓、ｄＣＬＮ、および腫瘍担持脳内のＣＤ４５．１^＋細胞を、フローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝４マウス／群）。（Ｃ）全脳放射線治療（Ｂ－ＲＴ）を受けたマウスにおけるＢ_Ｖａｘ±ＣＤ８^＋Ｔ細胞の治療効果を試験した。非照射（モック、黒色の線）、照射（Ｂ－ＲＴ、灰色の線）を対照として使用した。実験群に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｂ－ＲＴ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、黒色破線）、Ｂ_Ｖａｘ（Ｂ－ＲＴ＋Ｂ_Ｖａｘ、灰色の破線）、または両方（Ｂ－ＲＴ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞＋Ｂ_Ｖａｘ、青色破線）のいずれかを静脈内投与した。実験を、ｎ＝１０マウス／群を使用して行った。（Ｄ）テモゾロミド（ＴＭＺ）で処置したマウスにおけるＢ_Ｖａｘ±ＣＤ８^＋Ｔ細胞の治療効果を試験した。無処置（モック、黒色の線）およびＴＭＺ処置（ＴＭＺ、灰色の線）を、対照として使用した。実験群に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＴＭＺ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、黒色破線）、Ｂ_Ｖａｘ（ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ、灰色の破線）、または両方（ＴＭＺ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞＋Ｂ_Ｖａｘ、青色破線）のいずれかを静脈内投与した。実験を、ｎ＝１０マウス／群を使用して行った。（Ｅ）Ｂ－ＲＴおよびＴＭＺで処置したマウスにおけるＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の治療効果を試験した。細胞治療を、ＴＭＺ処置終了から２４時間後（腫瘍チャレンジ後１９日目）に施した。無処置マウス（モック、黒色の線）、２回のＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内注射のみを受けたマウス（Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ、灰色の線）、およびＴＭＺを投与した照射マウス（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ、黒色破線）を、対照として使用した。Ｂ－ＲＴおよびＴＭＺで処置した実験群に、２回のＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内注射（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ、灰色の破線）、２回のＰＤ－Ｌ１遮断物の腹腔内注射（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ＋ａＰＤＬ１、青色破線）、２回のＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内注射および２回のＰＤ－Ｌ１遮断物の腹腔内注射（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋ａＰＤＬ１、灰色の線）、または２回のＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内注射および２回のＰＤ－Ｌ１遮断物の腹腔内注射（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋ａＰＤＬ１、ピンク色の破線）を受けさせた。実験を、ｎ＝１０～１１マウス／群を使用して行った。ヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図6-2】同上。

【図6-3】同上。

【0016】

【図7-1】図７は、ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘが抗腫瘍ＣＤ８^＋Ｔ細胞を促進することを実証している。（Ａ）新鮮な末梢血および腫瘍の対を、新規に診断されたＧＢＭ患者から採取した（ｎ＝４）。Ｂ_Ｖａｘを生成し、腫瘍ライセートでパルスし、自家ｅＦｌｕｏｒ４５０標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を、細胞増殖（拡大増殖指数として測定されたｅＦｌｕｏｒ４５０蛍光希釈）およびＧｚｍＢの細胞内発現によって査定した。（ＢおよびＣ）原発性ＧＢＭ ＩＤＨ ＷＴ（症例ＮＵ０２１２０、Ｂ）および再発性ＧＢＭ ＩＤＨ ＷＴ（ＮＵ０２２６５、Ｃ）由来のペア試料。Ｂ_Ｖａｘ活性化自家ＣＤ８^＋Ｔ細胞を（Ａ）に示すように入手し、自家神経膠腫細胞を死滅させる能力について試験した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞分析システムを使用して、１２．５時間にわたって定期的に細胞殺滅を測定した。ヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図7-2】同上。

【0017】

【図8-1】図８は、Ｂ_Ｖａｘが治療効果を有する腫瘍反応性抗体を産生することを実証している。（Ａ）ＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを、Ｂ細胞欠損ＣＴ２Ａ担持マウスに養子移入した。７２時間後、ＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを、ｄＣＬＮにおけるフローサイトメトリーによって形質芽球マーカーＣＤ１３８の発現について評価した（ｎ＝４／群）。（Ｂ）Ｂ_Ｖａｘ由来血清免疫グロブリン（Ｉｇ）獲得のスキーム。（Ｃ）Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ、およびＢ_Ｖａｘに由来する血清抗体由来の異なるＩｇサブタイプの分布を示す線図。血清試料のＩｇサブタイプの測定をＥＬＩＳＡによって行い、平均総Ｉｇ濃度を線図の下部に示す（ｍｇ／ｍｌ）。（Ｄ）Ｂ細胞サブセットのＩｇＧ反応性を、免疫蛍光（ＩＦ）によって測定した。血清試料を、Ｂ細胞欠損マウス（Ｂ ＫＯ）由来の腫瘍担持脳切片上でインキュベートした。結合しているＩｇＧを、抗マウスＩｇＧ Ｃｙ５（赤色）二次抗体を使用して検出した。ＤＡＰＩ（青色）を使用して核を検出し、骨髄性細胞を、抗マウスＣＤ１１ｂ ＡＦ４８８抗体（緑色）を使用することによって評価した。バーは、１００μｍを示す。４匹の異なるマウスの代表的な実験を示す。（Ｅ）Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ、およびＢ_Ｖａｘを、オボアルブミンを過剰発現するＧＬ２６１（ＧＬ２６１－ＯＶＡ）腫瘍担持マウスから生成した。Ｂ細胞は、ＧＬ２６１－ＯＶＡ担持Ｂ細胞欠損マウス（ＢＫＯ）中に抗体を産生させた。血清試料を回収し、ＩｇＧを精製し、ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）に対する反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。半定量的測定および光学密度（Ｏ．Ｄ）を示す。Ｂ細胞欠損マウスおよびＣ５７ＢＬ／６ ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）免疫マスス由来の血清を、それぞれ、負の対照および正の対照として使用した（ｎ＝４／群）。（Ｆ）精製したＩｇＧを、ＣＴ２ａＡモデルにおけるその治療効果について試験した。ＩｇＧを、３日間連続して頭蓋内送達した（１２．５μｇ／マウス／注射）。無処置マウス（黒色の線）を、対照として使用した。実験群に、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}由来ＩｇＧ（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}ＩｇＧ、青色線）またはＢ_Ｖａｘ由来ＩｇＧ（Ｂ_ＶａｘＩｇＧ、ピンク色の線）のいずれかを投与した。実験を、ｎ＝１０マウス／群を使用して行った。ヒストグラムを、平均±ＳＤとして示す。統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【0018】

【図9】図９は、４－１ＢＢＬ発現Ｂ細胞のさらなる特徴づけを示す。（Ａ）経時的なＣＴ２Ａ神経膠腫担持マウスの脳、血液、深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）、および浅頸リンパ節（ＣＬＮ）中のＣＤ１９^＋Ｂ細胞による４－１ＢＢＬ発現レベル：腫瘍なし（Ｄ０）、腫瘍移植から７、１４、２１日後（ｎ＝４マウス／時点）。（Ｂ）細胞の拡大増殖および細胞内グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現によって測定されたマウスＢ細胞のＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を促進するそれらの能力を、活性化Ｂ細胞によって査定し、４－１ＢＢＬ欠損（４－１ＢＢＬ ＫＯ）マウス由来のＢ細胞と比較した。３連で実施した合計で３回の独立した実験のうちの代表的実験。この図に示した全ての実験について、複数の群の間の差を、事後テューキー検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、ヒストグラムを平均±ＳＤとして示す。全ての実験において、統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【0019】

【図10-1】図１０は、Ｂ_Ｖａｘ生成を示す。（Ａ）ＰＢＭＣ由来のヒトＢ細胞を、１０Ｕ／ｍｌ ＩＦＮγで２４時間処理した。ＣＤ８６発現を、フローサイトメトリーによって査定した。３回の独立した実験の代表的なヒストグラム。（Ｂ）ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＩＦＮγＲ欠損（ＩＦＮγＲ ＫＯ）マウス由来のマウスＢ細胞を、５μｇ／ｍｌ ＣＤ４０活性化Ａｂ±１０Ｕ／ｍｌ ＩＦＮγとインキュベートした。ＣＤ８６の発現を、フローサイトメトリーによって査定した。４回の独立した実験の代表的なヒストグラム。（Ｃ）ｉｎ－ｖｉｔｒｏでのＢ_Ｖａｘ生成の段階的スキーム。Ｂ_Ｖａｘを、脾臓、深頸リンパ節、および浅頸リンパ節から分離した４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞から産生させる。次いで、細胞を、５μｇ／ｍｌ ＣＤ４０活性化Ａｂで活性化し、１００ｎＭのＢ細胞生存因子ＢＡＦＦを補充した。この細胞は、ＢＡＦＦのみで処理したＢ細胞と比較した場合に、２４時間後にＣＤ８６、Ｈ－２Ｋ^ｂ、およびＩＦＮγＲＩが上方調節される。ＩＦＮγを添加してさらに２４時間後に、抗ＣＤ４０のみで処理したＢ細胞と比較してＣＤ８６がさらに上方調節された。ヒストグラムは、ｎ＝３マウス／処置の平均±ＳＤを示す。（Ｄ）Ｂ_Ｖａｘは、ＢＡＦＦのみで処理したＢ細胞（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}）と比較した場合に、ＩＡ^ｂ（ＭＨＣクラスＩＩ）およびＨ－２Ｋ^ｂの両方を過剰発現する。ｎ＝４マウス／群の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。（Ｅ）Ｂ細胞サブセット（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}±ＩＦＮγおよびＢ_Ｖａｘ）およびＤＣを、細胞増殖および細胞内ＧｚｍＢの発現によって測定されたＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドをＯＴ１ ＣＤ８^＋Ｔ細胞に提示する能力について試験した。３連で行った３回の独立した実験のうちの代表的な実験。（Ｆ）（Ｅ）と同一の実験を、負の対照としてＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞をさらに使用して行った。この図に示した全ての実験について、複数の群の間の差を、事後テューキー検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、ヒストグラムを平均±ＳＤとして示す。全ての実験において、統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図10-2】同上。

【図10-3】同上。

【図10-4】同上。

【図10-5】同上。

【図10-6】同上。

【図10-7】同上。

【0020】

【図11-1】図１１は、４－１ＢＢＬがＢ_Ｖａｘの治療効果の主要なマーカーであることを実証している。（Ａ）Ｂ細胞欠損マウスでは、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_Ｖａｘが流入領域ｄＣＬＮおよび循環中に検出され、Ｂ_Ｖａｘが腫瘍担持脳内に見出された。ヒストグラムは、ｎ＝５マウス／群の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）ＣＤ４５．１^＋Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_Ｖａｘを、腫瘍移植から１０日後にカニューレガイド下の注射を使用して頭蓋内注射した。４日後、ＣＤ４５．１^＋細胞を、腫瘍から磁気分離し、フローサイトメトリーによる細胞増殖（拡大増殖指数）によって測定したＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する能力について試験した。ヒストグラムは、ｎ＝３マウス／群の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ、およびＢ_Ｖａｘを、ＣＴ２Ａ担持Ｂ細胞欠損マウスにおけるその治療効果について試験した（ｎ＝９～１０マウス／群）。（Ｄ）Ｂ_Ｖａｘ（４－１ＢＢＬ遮断Ａｂで処置）±４－１ＢＢＬ遮断Ａｂ（Ｂ_Ｖａｘ養子移入後にｉ．ｐ．で５００μｇ／マウス×３回注射）で処置したＣＴ２Ａ担持Ｂ細胞欠損マウスを、生存についてモニタリングした（ｎ＝１０マウス／群）。この図に示した全ての実験について、複数の群の間の差を、事後テューキー検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、ヒストグラムを平均±ＳＤとして示す。生存曲線を、カプラン・マイヤー法によって作成し、ログランク検定によって比較し、ボンフェローニの方法を使用して多重比較を調整した。全ての実験において、統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図11-2】同上。

【図11-3】同上。

【0021】

【図12-1】図１２は、Ｂ_Ｖａｘの治療効果を実証している。（Ａ）放射線治療（ＲＴ）は、血液中および脾臓内のＣＤ４５^＋白血球によって測定した場合に全身性白血球減少症を誘発する（ｎ＝４マウス／群）。（Ｂ）異なる時点（腫瘍移植から９日後および１５日後）でのＣＴ２Ａ全身腫瘍組織量の組織学的評価。全てのマウスに、腫瘍接種から７日後に９Ｇｙを照射した。（Ｃ）Ｂ_Ｖａｘの治療効果を、腫瘍移植から７日後に放射線治療（ＲＴ）を受けた動物で評価した（ｎ＝１０マウス／群）。（Ｄ）Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞処置の有効性を、異なる時点：腫瘍接種から９日後および１５日後で試験した。全てのマウスに、腫瘍注射から７日後に放射線治療を受けさせた（ｎ＝７マウス／群）。この図に示した全ての実験について、複数の群の間の差を、事後テューキー検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価し、ヒストグラムを平均±ＳＤとして示す。生存曲線を、カプラン・マイヤー法によって作成し、ログランク検定によって比較し、ボンフェローニの方法を使用して多重比較を調整した。全ての実験において、統計的有意性を、ｎｓ：統計的に有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。

【図12-2】同上。

【0022】

【図13-1】図１３は、Ｂ_Ｖａｘ処置によって腫瘍が根絶することを実証している。（Ａ）ＰＤ－Ｌ１膜発現を、Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＢ_{Ｎａｉｖｅ}細胞で評価した。４回の独立した実験の代表的なドットプロット。（Ｂ）対照群におけるＣＴ２Ａ腫瘍中のＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤（腫瘍接種から１４日後、ｎ＝２）。腫瘍領域（腫瘍）対非腫瘍（脳）領域中の切片あたりのＣＤ８^＋Ｔ細胞数を査定した。（Ｃ）Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８、ｎ＝５）またはＣＤ８^＋Ｔ細胞のみ（ＬＴＳ－ＣＤ８、ｎ＝４）のいずれかで処置した長期生存者における免疫細胞浸潤を、対照ＣＴ２Ａ担持（対照、ｎ＝３）およびモック脳（腫瘍なし、ｎ＝２）と比較した。リンパ球区画および骨髄性細胞区画の分布（ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂの発現）ならびにＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の分布を示す代表的なドットプロット。ＣＤ４^＋Ｔ細胞区画内で、ＣＤ４４およびＦｏｘｐ３の発現を評価した。非Ｔ細胞区画（ＣＤ８^－ＣＤ４^－リンパ球）内で、ＩＦＮγおよび４－１ＢＢＬを発現するＣＤ１９^＋Ｂ細胞区画を評価した。目的の集団の値を、平均±ＳＤとして示す。ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘは、抗腫瘍ＣＤ８^＋Ｔ細胞を促進する。（Ｄ）ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘ生成のスキーム。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化および拡大増殖ならびにＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介腫瘍細胞殺滅アッセイを、自家条件で行った。（Ｅ）新たに切除したＧＢＭ患者由来の腫瘍を、腫瘍スフェロイドとしてｅｘ－ｖｉｖｏで培養した。培養５日後の接着細胞の代表的な写真。バーは、１００μｍを示す。

【図13-2】同上。

【図13-3】同上。

【図13-4】同上。

【0023】

【図14-1】図１４は、Ｂ細胞受容体の配列分析を示す。（Ａ）免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）ＤＮＡ配列を、Ｂ_Ｖａｘにおいて分析し、ナイーブＢ細胞（Ｂ_{ｎａｉｖｅ}）および腫瘍浸潤（ＴＩ）Ｂ細胞と比較した。データを、クローンの頻度として示す。統計的有意性を、青色および赤色のスポットで強調している。（Ｂ）３つのクローンが、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}細胞およびＴＩ Ｂ細胞と比較してＢ_Ｖａｘで有意に富化される（灰色；列挙した上の３つ）。６つのクローンが、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}と比較してＢ_Ｖａｘで有意に富化され、これらのクローンは、ＴＩ Ｂ細胞で非常に豊富なクローンと重複する（青色；リスト中の下の６つ）。図は、３回の独立した実験の代表である。

【図14-2】同上。

【0024】

【図15】図１５は、腫瘍内でＢ_Ｖａｘが形質芽球に分化することを示す。（Ａ）ＣＤ４５．１^＋ＣＴ２Ａ担持マウスから得たＢ_Ｖａｘを、ＣＤ４５．２^＋ＣＴ２Ａ担持マウス（Ｔ）およびナイーブマウス（ＮＴ）に静脈内注射した。７２時間後に、マウスを屠殺し、血液、腫瘍担持脳、深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）、および脾臓内のＣＤ４５．１^＋細胞の存在について分析した。腫瘍担持脳のみがＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを保有していた。（Ｂ）ＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘによる形質芽球マーカーＣＤ１３８の発現。ヒストグラムは、ｎ＝８マウス／群の平均±標準偏差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

詳細な説明
免疫治療は、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）患者を処置するための有望なアプローチであるが、その有効性はこれまで非常に限られていた。本出願では、本発明者らは、４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞が抗腫瘍免疫を促進する能力を実証し、これらのＢ細胞が致命的な腫瘍（膠芽細胞腫が挙げられる）を処置するためのワクチンとして使用される得ることを提案する。

【0026】

ｉｎ ｖｉｖｏでの上記Ｂ細胞の抗原提示機能を安定化し、潜在的な免疫抑制機能を回避するために、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘと名付けた活性化４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞を調製した。ＣＤ４０およびＩＦＮγ受容体（ＩＦＮγＲ）ライゲーションを使用してＢ細胞を活性化した。本出願では、本発明者らは、腫瘍特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫を促進することによってＢ_ＶａｘがＧＢＭの成長を阻害することを実証する。さらに、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘの単独ならびに放射線およびチェックポイント遮断との組み合わせの治療有効性を実証する。

【0027】

方法：
本発明は、抗がん組成物を作製する方法を提供する。本方法は、（ａ）４－１ＢＢＬ＋（ＣＤ１３７Ｌ＋）Ｂ細胞を回収するステップ；（ｂ）上記Ｂ細胞をＣＤ４０アゴニストとインキュベートするステップ；（ｃ）ＩＦＮ－γを上記Ｂ細胞に添加するステップ；および（ｄ）上記Ｂ細胞を腫瘍由来抗原と接触させるステップを含む。

【0028】

本明細書中で使用される場合、用語「抗がん組成物」は、がんを罹患している被験体に治療有効量で投与した場合に、（１）がんを治癒させること；（２）がんの進行を遅延させること；（３）腫瘍を後退させること；または（４）がんの１またはそれを超える症状を緩和することなどの治療上の利点を提供する任意の物質を指す。

【0029】

本発明は、細胞プラットフォームとして４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を利用する。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７Ｌとしても公知）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーであり、活性化されたＴ細胞上およびＢ細胞上の両方で発現される共刺激分子である。以前の研究では、この共刺激マーカーを発現するＢ細胞のサブセットが複数の機序（抗原提示、Ｔ細胞共刺激（４－１ＢＢＬおよびＣＤ８６）、およびサイトカイン産生（ＴＮＦα）が挙げられる）を介してＣＤ８^＋Ｔ細胞の抗腫瘍細胞傷害性を増強することが示されている（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。実施例では、本発明者らは、ＧＢＭ患者の４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞が、活性化マーカーレベルを増加させ、４－１ＢＢＬ－Ｂ細胞と比較してＣＤ８^＋Ｔ細胞の共刺激を増強する能力がより高まったことを実証している（図１）。

【0030】

本発明の抗がん組成物は、自家治療（すなわち、被験体自身の細胞を体外で改変し、その後に被験体に再移入する治療）として用いるためにデザインされている。このアプローチの主な利点は、免疫拒絶に起因する生命を脅かす合併症のリスクがより低いことである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明と共に使用される４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を、がんと診断された被験体から回収する。

【0031】

用語「がん」は、細胞の異常な成長を特徴とする任意のがん、新生物疾患、および前新生物疾患を包含することを意味する。がんは、結腸癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、肺がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、直腸がん、泌尿器がん、子宮がん、口腔がん、皮膚がん、胃がん、脳腫瘍、肝臓がん、喉頭がん、食道がん、乳腺腫瘍、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌（ｃｙｓｔａｎｄｅｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、子宮内膜がん、肺癌、小細胞性肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠芽細胞腫、神経鞘腫（ｎｅｕｒｏｎｏｍａ）、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｉｎｇｉｏｍａ）、シュワン細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性真性赤血球増加症（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、小児ヌル急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性巨核球性白血病、バーキットリンパ腫、およびＴ細胞白血病、小および大非小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、急性顆粒球性白血病、胚細胞腫瘍、子宮内膜がん、胃がん、毛様細胞白血病、甲状腺がん、および当該分野で公知の他のがんからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、がんは、膠芽細胞腫、黒色腫、乳がん、および膵臓がんからなる群らから選択される。好ましい実施形態では、がんは膠芽細胞腫である。

【0032】

実施例では、本発明者らは、優れた抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能を有し（図２）、かつｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍免疫抑制に耐性を示す（図３）Ｂ_Ｖａｘと称された活性化Ｂ細胞を産生するためのＣＤ４０アゴニストとＩＦＮ－γの組み合わせを使用した。したがって、本方法では、Ｂ細胞を、ＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮ－γの両方とインキュベートする。ＣＤ４０アゴニストはＩＦＮ－γ受容体の発現を誘導するので、ＣＤ４０アゴニストを一般にＩＦＮ－γの前に添加する。１つの実施形態では、ＣＤ４０アゴニストを、ＩＦＮ－γ添加前に１８～２４時間添加する。

【0033】

本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ４０アゴニスト」は、ＣＤ４０分子に特異的に結合してＣＤ４０シグナル伝達を誘導する試薬を指す。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現され、免疫細胞の共刺激に関与する膜貫通タンパク質受容体である。ＣＤ４０シグナル伝達を誘導するための現在のストラテジーは、抗体ベースのアプローチおよびＣＤ４０リガンドベースのアプローチの両方を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ１５４（すなわち、ＣＤ４０の同族リガンド）およびＣＤ４０抗体またはＣＤ４０をアゴナイズすることができるその一部から選択される。Ｂ細胞は、腫瘍由来抗原の添加前に最大４８時間ＣＤ４０アゴニストとインキュベートされ得る。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＩＦＮ－γの添加前に少なくとも１２時間、および４８時間もの間ＣＤ４０アゴニストとインキュベートされる。実施例では、ＣＤ４０抗体をＣＤ４０アゴニストとして使用し、最終濃度５μｇ／ｍｌで添加する。当業者は、ＣＤ４０アゴニストの添加量が使用されるアゴニストに依存することを認識する。ＣＤ４０アゴニズムが十分であるのかを、ＣＤ８６およびＩＦＮ－γ受容体の過剰発現ならびにＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現の増加についてＢ細胞をアッセイすることによってモニタリングすることができる。

【0034】

インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、先天免疫および適応免疫に重要な可溶性サイトカインである。本発明で使用されるＩＦＮγタンパク質は、任意の起源であってよいが、ヒトＩＦＮγタンパク質が有利である。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるＩＦＮγは、インハウスで（例えば、大腸菌またはヒト細胞株中で）組換え発現され、精製される。他の実施形態では、ＩＦＮγを、商業的供給元（例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）から購入する。ＩＦＮ－γは、ＣＤ４０アゴニスト（ａｇｏｎｓｉｔ）と同時またはＣＤ４０アゴニスト後にＢ細胞に添加され得る。１つの実施形態では、ＩＦＮ－γは、細胞へのＣＤ４０アゴニストの添加の少なくとも１２時間後に添加される。別の実施形態では、ＩＦＮ－γは、ＣＤ４０アゴニストの添加の１８～２４時間後に添加される。

【0035】

本方法では、また、Ｂ細胞は、腫瘍由来抗原と接触させる。用語「抗原」は、免疫系によって認識され、免疫応答を刺激することができる任意の分子を指す。「腫瘍由来抗原」は、腫瘍細胞によって優先的にまたは差次的に発現され、かつ正常で健康な細胞上には発現されることも、差次的に発現されることもない抗原である。したがって、Ｂ細胞を腫瘍由来抗原とインキュベートすることにより、Ｂ細胞は、より有効な抗原提示細胞として作用し、これらの抗原を認識するようにＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するように活性化される（ｓｃｔｉｖａｔｅｄ）。また、これらのＢ細胞は、腫瘍を認識し得る腫瘍特異的抗体を産生することができる場合がある。がん細胞を含む任意の試料は、本発明のための腫瘍由来抗原の供給源として使用され得る。好適な試料としては、例えば、組織試料、腫瘍、腫瘍ライセート、生検、および体液（例えば、血液、血清、血漿、痰、洗浄液、脳脊髄液、尿、精液、汗、涙、唾液）が挙げられる。あるいは、試料は、がん標本から生成したオルガノイド（すなわち、「腫瘍オルガノイド」）を含むことができる。いくつかの実施形態では、腫瘍由来抗原は腫瘍細胞ライセートである。いくつかの実施形態では、腫瘍由来抗原は、腫瘍抗原を含むことが同定された単一または少数のポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞ライセートは、がんを有する被験体に由来する。

【0036】

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは濃度１０Ｕ／ｍｌで添加される。５Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの範囲のＩＦＮ－γを使用することができる。ＩＦＮ－γは、腫瘍由来抗原と接触する４８時間前までに添加され得る。ある特定の実施形態では、ＩＦＮ－γは、腫瘍由来抗原と接触する前に少なくとも１２時間、好適には、少なくとも１８～２４時間添加される。インキュベーションは、４８時間もの間であり得る。

【0037】

実施例では、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘを、その生存を増強するためのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）とインキュベートする。ＢＡＦＦは、強力なＢ細胞アクチベーターとして作用することが公知のサイトカインである。したがって、いくつかの実施形態では、また、Ｂ細胞を、ステップ（ｂ）においてＢＡＦＦとインキュベートする。本発明で使用されるＢＡＦＦは、インハウスで組換えによって産生され得るか、商業的供給元（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入され得る。実施例では、Ｂ細胞の生存度を維持するためにｅｘ ｖｉｖｏプロセス全体にわたって２００ｎＭのＢＡＦＦを使用した。当業者は、この濃度が変動し得ることを認識する。

【0038】

本発明の方法は、４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を、これらの細胞を（１）ＣＤ４０アゴニストおよび必要に応じてＢＡＦＦと約２４時間インキュベートし、（２）その後にＩＦＮ－γを約２４時間添加し、（３）最後に腫瘍由来抗原を添加することによって活性化するステップを含む。

【0039】

組成物：
また、本発明は、本明細書中に開示の方法によって作製された４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮ－γで少なくとも２０時間活性化し、腫瘍由来抗原でパルスした４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０抗体である。いくつかの実施形態では、腫瘍由来抗原は腫瘍細胞ライセートである。好適には、組成物は、４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞ではない細胞を実質的に含まない。４－ＩＢＢＬ＋細胞は、当業者に公知の手順を使用して、血液から採取し、分離され得る。例えば、血液は、被験体から採取され、リンパ球が分離され得る。次いで、Ｂ細胞の４－ＩＢＢＬ＋集団を、４－ＩＢＢＬに対する抗体および抗体が蛍光標識されている場合のＦＡＣＳを使用した分離またはビオチン－アビジン相互作用などを介してビーズ上のリガンドに結合することができるタグで標識された抗体を使用したビーズベースの選別法を使用して分離することができる。標的にされた細胞に結合して分離するための細胞表面タンパク質に特異的に標識された抗体を使用する方法は、当該分野で周知である。

【0040】

組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体をさらに含み得る。用語「薬学的に許容され得る担体」は、製剤の他の成分と適合し、かつレシピエントに有害ではない任意の担体、希釈剤、または賦形剤を指す。薬学的に許容され得る担体は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適な任意の担体である。組成物での使用に好適な薬学的に許容され得る担体の例としては、水、緩衝液、グルコース溶液、油性または細菌培養液が挙げられるが、これらに限定されない。組成物のさらなる構成要素は、例えば、安定剤、防腐剤、希釈剤、乳化剤、および潤滑剤などの賦形剤を好適に含み得る。薬学的に許容され得る担体または希釈剤の例としては、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（アルブミンまたはカゼインなど）、タンパク質含有剤（ウシ血清または脱脂粉乳など）、および緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などの安定剤が挙げられる。

【0041】

処置方法：
さらに、本発明は、がんを有する被験体を処置するために本明細書中に開示のＢ細胞組成物を使用する方法を提供する。本方法は、有効量の組成物を被験体に投与するステップを含む。Ｂ細胞組成物は、他のがん処置（放射線、他の化学療法薬、または他のリンパ球（Ｔ細胞またはＮＫ細胞が挙げられる）が挙げられる）と共投与され（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｎｓｔｅｒｅｄ）得る。共投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｎｔｒａｔｉｏｎ）は、同一の被験体が本明細書中に記載のＢ細胞組成物に加えてさらなる治療薬を投与され得ることを示すために使用される。治療は、個別の処置として、単一の組成物の一部として、または任意の順序で同時に被験体に施され得る。治療薬は、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日間、２日間、４日間、７日間、２週間、４週間、またはそれを超える投与時間の差で一方が他方の前に投与されるように施行され得る。

【0042】

本明細書中に開示の方法は、従来のがん処置レジメンをさらに含むことができる。実施例では、本発明者らは、放射線（すなわち、全身照射または全脳照射のいずれか）およびテモゾロミド（すなわち、ＧＭＢ処置のための現在の標準治療）でマウスを処置すると血清ＢＡＦＦレベルが上昇することを実証した。上に考察されるように、ＢＡＦＦは、Ｂ細胞の適合性および生存度を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、放射線治療を被験体に施すステップをさらに含む。本明細書中で使用される場合、用語「放射線治療」は、電離放射線を使用した固形腫瘍およびがんの任意の処置様式を指し、体外放射線治療、定位放射線治療（ｓｔｅｒｅｏｔａｔｉｃ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、仮想シミュレーション、三次元原体放射線治療、強度変調放射線治療、イオン化粒子治療、および放射性同位体治療が挙げられるが、これらに限定されない。放射線後のＢＡＦＦの全身性産生が増強されると、Ｂ細胞適合のためのｉｎ ｖｉｖｏ環境が改善されるようである。したがって、いくつかの実施形態では、放射線治療は、Ｂ細胞組成物の投与前に施される。

【0043】

いくつかの実施形態では、方法は、化学療法薬を被験体に投与するステップをさらに含む。本方法との使用に好適な化学療法薬としては、白金ベースの薬剤（シスプラチン、ゲムシタビン、およびカルボプラチンなど）；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソ尿素アルキル化剤（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および他のアルキル化剤など）；代謝拮抗物質（メトトレキサートなど）；プリンアナログ代謝拮抗物質；ピリミジンアナログ代謝拮抗物質（フルオロウラシル（５－ＦＵ）およびゲムシタビンなど）；ホルモン抗新生物薬（ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなど）；天然抗新生物薬（タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、アルデスロイキン、インターロイキン－２、エトポシド（ＶＰ－１６）、インターフェロンα、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）など）；抗生物質作用の天然抗新生物薬（ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびマイトマイシンなど）；ならびにビンカアルカロイド系の天然抗新生物薬（ビンブラスチンおよびビンクリスチンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、トリアゼン（ダカルバジン、ミトゾロミド、またはテモゾロミドなど）である。いくつかの実施形態では、化学療法薬はテモゾロミドである。

【0044】

さらに、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘ投与を抗ＰＤ－Ｌ１処置と同時に施すことにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化が増強されることを実証した。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死－リガンド１）は、免疫系の適応力の抑制において主な役割を果たす膜貫通タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、「チェックポイントタンパク質」（すなわち、免疫応答の活性化を低下させ、その発現によってがん細胞が宿主免疫系を回避すると考えられているタンパク質）と見なされている。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、チェックポイント阻害剤を投与するステップをさらに含む。本明細書中で使用される場合、用語「チェックポイント阻害剤」は、チェックポイントタンパク質の免疫抑制活性を遮断または阻害する分子を指す。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に結合する抗体である。抗ＰＤ１抗体もしくは抗ＰＤＬ１抗体またはこれらの断片を含むチェックポイント阻害剤が当業者に公知であり、セミプリマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、およびＡＭＰ－２２４が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むチェックポイント阻害剤としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＫＮ０３５が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、当業者に公知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗体断片、単鎖抗体、または他の抗体バリアント構築物を含み得る。ＰＤ－１阻害剤としては、例えば、ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片（ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏから入手可能であり、米国特許第７５９５０４８号、同第８７２８４７４号、同第９０７３９９４号、同第９０６７９９９号、同第８００８４４９号、および同第８７７９１０５号に記載の抗ＰＤ－１抗体）が挙げられる）；ペムブロリズマブ、および抗ＰＤ－１抗体（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏから入手可能であり、米国特許第８９５２１３６号、同第８３５４５５０９号、同第８９００５８７号、およびＥＰ２１７０９５９号に記載）；アテゾリズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅ）から入手可能であり、米国特許第８２１７１４９号に記載の抗ＰＤ－Ｌ１である；アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７０９７４０７号に記載の製剤）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＷＯ２０１１０６６３８９号）、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｏｆｉ、例えば、米国特許第９９３８３４５号および同第９９８７５００号を参照のこと）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、カムレリズマブ（ＡｉＲｕｉＫａ、Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．）、シンチリマブ（Ｔｙｖｙｔ、Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＫＮ０３５（Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ、Ｔｒａｃｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、例えば、ＷＯ２０１７０２０８０１Ａ１号を参照のこと）；チスレリズマブ（ＢｅｉＧｅｎｅから入手可能であり、米国特許第８７３５５５３号に記載）などがとりわけ挙げられ得るが、これらに限定されない。開発中の他のＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１抗体も、本発明を実施する上で使用され得る（例えば、ＰＤ－１阻害剤（トリパリマブ（ＪＳ－００１、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドスタルリマブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＩＮＣＭＧＡ０００１２（Ｉｎｃｙｔｅ、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ）、ＡＭＰ－２２４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ａｎｄ ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＭＰ－５１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる）およびＰＤ－Ｌ１阻害剤（ＡＵＮＰ１２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）、ＣＡ－１７０（Ａｕｒｉｇｅｎ／Ｃｕｒｉｓ）、およびＢＭＳ－９８６１８９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる）、とりわけ（上記抗体に関する引用文献は、抗体、その構造、および配列に関して、その全体が参考として援用される）が挙げられる）。ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体の断片としては、当該分野で公知の（例えば、ＡＵ２００８２６６９５１号およびＮｉｇａｍ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏＰＥＤ，”Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍａｙ １，２０１８ ｖｏｌ．５９ ｎｏ．ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １ １１０１（その内容全体が参考として援用される）に記載の）ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合して阻害する機能を保持している抗体の断片が挙げられる。

【0045】

実施例では、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘを他のリンパ球（Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＮＫ細胞が挙げられる）と共投与することができることを実証した。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞を被験体に投与するステップをさらに含む。これらの方法で使用されるＴ細胞は、被験体から採取され、次いで、その免疫賦活能を増強するためのＢ_Ｖａｘとのインキュベーションを介してｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖および活性化され得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、腫瘍抗原に対して向けられた抗原受容体を用いて選択または操作され得る。本明細書中で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む遺伝子操作された抗体－Ｔ細胞キメラを指す。キメラ抗原受容体Ｔ細胞治療のための技術は当該分野で公知であり、利用可能である。例えば、Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（２２）：６３８３－９（２０１４）を参照のこと。

【0046】

用語「被験体」および「患者」は、互換的に使用され、特定の処置のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）（ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯類などが挙げられるが、これらに限定されない）を指す。例えば、好適な被験体としては、がんの処置を必要とする被験体が挙げられる。

【0047】

本明細書中で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇすること）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患、状態、または障害と戦うことを目的とする被験体の管理およびケアを記載している。処置することには、症状または合併症の発生を予防するため、症状または合併症を緩和するため、または疾患、状態、または障害を排除するための本発明の組成物の投与が挙げられる。具体的には、本明細書中に開示の組成物を、がんを処置するために使用することができる。がんを処置することとしては、被験体内のがん細胞数または腫瘍サイズの減少、がんのより侵襲性の高い形態への進行の低下、がん細胞の増殖の減少もしくは腫瘍成長速度の低下、がん細胞の殺滅、がん細胞の転移の減少、または被験体におけるがんの再発尤度の減少が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される被験体の処置は、罹患しているか発症リスクのある被験体に利益（被験体の状態（例えば、１またはそれを超える症状）の改善、疾患進行の遅延、症状発生の遅延、または症状進行の遅延などが挙げられる）を付与する任意のタイプの処置を指す。

【0048】

本明細書中で使用される場合、用語「投与」は、医薬調製物を被験体に提供する任意の方法を指す。かかる方法は当業者に周知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、鼻投与、局所投与、膣内投与、眼への投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、および非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与、リンパ内投与、および皮下投与などの注射が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、連続的または断続的であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内または頭蓋内に投与される。

【0049】

用語「有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的なまたは臨床的な結果を得るのに十分な量を指す。この結果は、疾患または状態の１またはそれを超える症状の減少、緩和、阻害、もしくは予防、がん細胞の成長の減少、阻害、もしくは予防、がん細胞の転移もしくはがん細胞の侵襲性もしくは転移の減少、阻害、もしくは予防、またはがんの１またはそれを超える症状もしくはその転移の減少、緩和、阻害、もしくは予防、または生体システムの任意の他の望ましい変化であり得る。いくつかの実施形態では、有効量は、所望の効果を得る（例えば、抗腫瘍応答を得る）のに好適な量である。有効な投与の手段および投与量を決定するための方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される製剤、治療目的、処置される標的細胞、および処置される被験体によって変動する。単回または複数回投与することができ、投与のレベルおよびパターンは、治療担当医師によって選択される。

【0050】

用語「ＣＤ８＋Ｔ細胞応答」は、ＣＤ８＋細胞の活性化であって、上記Ｔ細胞が活性化された抗原を発現する細胞を死滅させることができる活性化を指す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、いくつかの異なる機序（抗腫瘍効果および抗ウイルス性の微生物効果を有するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）の分泌、細胞傷害性顆粒（例えば、パーフォリン、およびグランザイム）の産生および放出が挙げられる）を介して細胞を死滅させることが可能であり、そして／またはＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用を介して感染細胞が破壊される。

【0051】

実施例では、本発明者らは、本発明者らの４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞をワクチンとして記載する。用語「ワクチン」は、本明細書中で使用される場合、免疫応答を惹起することができる抗原または免疫原を含む生物学的調製物を指す。抗原または免疫原は、例えば、感染性因子、病因性の微生物もしくは細胞に類似している分子、または異常な細胞もしくは罹患細胞に関連するタンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。例えば、抗原または免疫原は、上記微生物もしくは細胞またはその毒素の弱毒化形態または不活化形態から作製され得る。ワクチンは、上記抗原または免疫原に対する個体の免疫応答を刺激するために個体に投与される。好ましい実施形態では、抗原は腫瘍由来抗原である。

【0052】

本開示は、本明細書中に記載の構築、構成要素の配置、または方法ステップの具体的な詳細に制限されない。本明細書中に開示の組成物および方法は、以下の開示を考慮して当業者に明らかな種々の方法で作製、実施、使用、実行、および／または形成することができる。本明細書中で使用される表現および専門用語は、説明のみを目的とし、特許請求の範囲の範囲を制限すると見なされないものとする。第１、第２、および第３などの順序の表示は、種々の構造または方法ステップに言及するために説明および特許請求の範囲で使用される場合、かかる構造またはステップに対して、任意の具体的な構造やステップ、任意の特定の順序や配置を示すと解釈されることを意図しない。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書中に提供されたありとあらゆる例または例示を示す文言（例えば、「など」）の使用は、本開示を容易にするためのものに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本開示の範囲のいかなる制限も意味しない。本明細書中の文言および図面に示した構造物は、任意の特許請求されていない要素が、開示の主題の実施に不可欠なものであることを示すものとして解釈されるべきでない。本明細書中での用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、または「ｈａｖｉｎｇ」、およびその異形の使用は、以後に列挙した要素およびその等価物ならびにさらなる要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」と記載した実施形態は、それらのある特定の要素「から本質的になる」および「からなる」ことも意図される。

【0053】

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別様の指示がない限り、各別個の値がその範囲内に入ることを個々に参照するための簡略的な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書にあたかも個々に記載されているが如く、本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲を１％～５０％と記載する場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が本明細書中に明確に列挙されていることを意図する。これらは、具体的に意図されているものの例に過ぎず、列挙された最小値と最大値の間の数値およびこれらを含む数値の全ての可能な組み合わせが本開示に明確に記載されていると見なされるのもとする。特定の列挙された量または量の範囲を記載するための用語「約」の使用は、列挙した量に非常に近似した値（製作公差、装置、および測定値を形成する際のヒューマンエラーなどによって説明され得るか、自然に説明されるであろう値など）がその量に含まれることを示すことを意図する。別段の指示がない限り、量について言及する全ての百分率は、重量を基準とする。

【0054】

いかなる参考文献（本明細書中に列挙された任意の非特許文書または特許文書が含まれる）も先行技術を構成することを容認しない。特に、別段の指示がない限り、本明細書中の任意の文書の言及が、これらの文書のうちのいずれかが米国および他の国における当該分野の一般的知識の一部を形成することを容認すると解釈されないものと理解される。参考文献の任意の考察は著者の主張が記載されており、出願人は、本明細書中に列挙した任意の文書の正確性および妥当性を吟味する権利を留保する。明確に別段の指示がない限り、本明細書中に列挙した全ての参考文献は、参考として完全に援用される。引例に見出された任意の定義および／または説明との間に任意の矛盾がある場合、本開示が優先されるものとする。

【0055】

以下の実施例は、例示のみを意図し、本発明または添付の特許請求の範囲の範囲を制限することを意図しない。

【実施例】

【0056】

実施例
実施例１－膠芽細胞腫処置のためのＢ細胞ベースの免疫治療
免疫治療は、多くの腫瘍の処置に革命を起こしてきた。しかしながら、ほとんどの膠芽細胞腫（ＧＢＭ）患者は、今まで、かかる成功から利益を得ていなかった。抗ＧＢＭ免疫を増大させる方法を調査することを目的として、本発明者らは、ＣＤ４０アゴニズムおよびＩＦＮγ刺激によって活性化された４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞からなるＢ細胞ベースのワクチン（Ｂ_Ｖａｘ）を開発した。ＢＶａｘは重要な二次リンパ系器官に移動し、抗原交差提示に長けており、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存度および機能性の両方を促進する。照射、ＢＶａｘ、およびＰＤ－Ｌ１遮断物の組み合わせは、８０％の処置した腫瘍担持動物で腫瘍を根絶した。この処置によって免疫記憶が惹起され、治癒したマウスにおいてその後の再拒絶の際に新規の腫瘍の成長が妨害される。ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘは、自家ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に成功した；これらのＴ細胞は、自家神経膠腫細胞を死滅させる強力な能力を示した。本開示は、現在の免疫治療アプローチの有効な代替法を提供し、この代替法はクリニックに容易に移行することができる。

【0057】

材料と方法：
ヒト試料。全てのヒト試料（腫瘍、末梢血、および凍結組織）を、施設内審査委員会（ＩＲＢ）のプロトコールＮ°ＳＴＵ００２０２００３の下でノースウェスタン大学の神経系腫瘍バンク（ＮＳＴＢ）によって採取した。全ての患者は書面による同意にサインした。Ｈ＆Ｅ試験で決定した場合に腫瘍細胞充実性が５０％を超えるＧＢＭ患者由来の試料のみを、本研究に含めた。研究を、倫理基準の米国共通規則に従って実施した。

【0058】

マウス。Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＤ４５．１ Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ細胞欠損（μＭＴ、Ｂ ＫＯ）、Ｒａｇ１欠損（Ｒａｇ１ ＫＯ）、およびＯＴ－Ｉマウスの全てを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。４－１ＢＢＬ欠損（４－１ＢＢＬ ＫＯ）マウスを、Ａｍｇｅｎから入手した。動物は、実験開始時点で６～８週齢であった。全ての動物実験プロトコールは、ノースウェスタン大学のプロトコール番号ＩＳ００００２４５９の下で動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されている。特定病原体不在（ＳＰＦ）動物の全ての動物を収容した。

【0059】

細胞株。ＧＬ２６１細胞を、国立がん研究所（ＮＣＩ）から入手した。オボアルブミンを発現するＧＬ２６１細胞を、（Ｐｉｔｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８）で以前に報告された通りに入手した。ＣＴ２Ａ細胞は、Ｐｒ．Ｔｏｍ Ｓｅｙｆｒｉｅｄ（ボストンカレッジ）から提供された。ＧＬ２６１ 細胞株の同一性および純度を、ノースウェスタン大学の配列決定コア施設によって実施されるショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングを使用して毎年評価した。両方のマウス同系神経膠腫細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を有するＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持し、５％ＣＯ２下にて３７°でインキュベートした。全ての細胞株のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ汚染を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－１０１２Ｋ（商標））を使用して、２ヶ月毎に定期的に試験した。

【0060】

脳腫瘍の注射。合計１０^５個のＧＬ２６１細胞またはＣＴ２Ａ細胞を、以前に記載のように頭蓋内（ｉ．ｃ．）に移植した（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ）。マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を含むストック溶液の腹腔内投与により麻酔した。手術部位を剃毛し、ポビドンヨード、続いて７０％エタノールのスワブで準備した。スワビング手順を、合計３回行った。頭蓋骨にアクセスするために、正中線に沿って切開した。直径１ｍｍの穿頭孔を、冠状縫合の後方２ｍｍかつ矢状縫合の外側２ｍｍに開けた。次いで、マウスを定位フレームに入れ、腫瘍細胞を、２６ゲージのブラント針を取り付けたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、深さ３ｍｍに総体積２．５μＬを注射した。次いで、切開部をステープルで留めた。

【0061】

ヒト免疫表現型分析。新規に診断されたＧＢＭ患者から凍結ＰＢＭＣ試料（ｎ＝９０）を回収し、４－１ＢＢＬ発現Ｂ細胞（４－１ＢＢＬ^＋ＣＤ２０^＋ＣＤ１９^＋）およびＣＤ６９発現ＣＤ８^＋Ｔ細胞のレベルをフローサイトメトリーによって分析した。以下の抗ヒト抗体（Ａｂ）（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄより入手）を使用した：４－１ＢＢＬ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５Ｆ４）、ＣＤ１９パシフィックブルー（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２０ ＢＶ５１０（２Ｈ７）、ＣＤ８アレクサフルオロ７００（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ６９ ＰＥ－Ｃｙ７（ＦＮ５０）。グランザイムＢ ＡＰＣ（ＧＢ１１）、ＩＦＮγＡＦ７００（４Ｓ．Ｂ３）、およびＴＮＦαＦＩＴＣ（１Ｄ６）を、細胞内染色のために使用した。死細胞およびデブリを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して分析から除外した。細胞をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙによって取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。

【0062】

マウス免疫表現型分析。腫瘍、血液、およびリンパ節を、以前に記載のように、免疫型分析の目的で処理した（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）。血液、深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）、浅頸リンパ節（ＣＬＮ）、および腫瘍担持脳内のＢ細胞による４－１ＢＢＬの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。マウスＡｂは全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。ＣＤ４５ ＢＶ５１０（３０Ｆ１１）およびＣＤ１１ｂ ＢＶ７１１（ＩＣＲＦ４４）。４－１ＢＢＬ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５Ｆ４）およびＣＤ１９ ＢＶ６５０（１Ｄ３／ＣＤ１９）を使用して、Ｂ細胞中の４－１ＢＢＬ発現レベルを評価した。死細胞およびデブリを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して分析から除外した。細胞をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙによって取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。

【0063】

組換えＩＦＮγを使用したＣＤ８６の上方調節。ヒトまたはマウスのＢ細胞をＰＢＭＣまたは脾臓（それぞれ）から分離し、ヒトまたはマウスのＢ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離した。細胞を２×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁し、１００ｎＭのヒト（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはマウス（Ｒ＆Ｄ）のＢＡＦＦおよび１０Ｕ／ｍｌのヒトまたはマウスのＩＦＮγと共にインキュベートした。ＣＤ８６発現を、上記のようにヒト抗ＣＤ８６パシフィックブルー（ＢＵ６３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗マウスＣＤ８６ ＡＦ７００（ＧＬ１）をＣＤ１９染色と共に用いたフローサイトメトリーによって評価した。

【0064】

マウスＢ_Ｖａｘの生成。Ｂ_Ｖａｘを、腫瘍担持マウスの脾臓およびｄＣＬＮ由来の４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞から生成した。マウスを２×１０^６個の腫瘍細胞でチャレンジし、腫瘍接種の１２～１４日後に屠殺した。Ｂ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＢ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、脾臓およびｄＣＬＮからネガティブ分離した。次いで、４－１ＢＢＬ^＋細胞を、抗マウス４－１ＢＢＬビオチン（５Ｆ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して磁気的にポジティブ分離した。細胞を、１００ｎＭのマウスＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充した２×１０^６細胞／ｍｌ完全ＲＰＭＩに再懸濁し、抗ＣＤ４０（ＦＧＫ４．５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で活性化した。２４時間後に、１０Ｕ／ｍｌのマウスＩＦＮγを培養物に添加した。分離から合計４８時間後に、Ｂ_Ｖａｘを採取し、カウントし、さらなる利用のために準備した。多くの実験では、Ｂ_Ｖａｘを、腫瘍担持マウスの脾臓およびＣＬＮにも由来するＣＤ８^＋Ｔ細胞と同時に注射し、マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離した。

【0065】

Ｂ_ＶａｘのＡＰＣ表現型。マウスＢ_Ｖａｘを、フローサイトメトリーによってＡＰＣ機能に関連する分子の発現について試験した。細胞を、以下の抗マウスＡｂで染色した（別段の指定がない限り、全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄより入手）：ＩＡ^ｂ ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ ７１０（ＡＦ６－１２０．１）、Ｈ－２Ｋ^ｂＰＥ（ＡＦ６－８８．５．５．３）、ＣＤ８６ ＡＦ７００（ＧＬ１）、および４－１ＢＢＬ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（５Ｆ４）。１００ｎｇ／ｍｌ ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でパルスした後に、Ｈ－２Ｋ^ｂを介したペプチド提示を、抗マウスＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）－Ｈ－２Ｋ^ｂＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏ２５－Ｄ１．１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して査定した。

【0066】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ_ＶａｘのＡＰＣ機能。Ｂ_Ｖａｘが全オボアルブミン（ＯＶＡ）を取り込む能力を評価するために、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて蛍光標識したＢ_Ｖａｘを、完全ＲＰＭＩ中で１５μｇ／ｍｌ ＡＦ４８８－ＯＶＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、４０倍の対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＤＭｉ８顕微鏡を用いて可視化した。データを、ＩｍａｇｅＪを使用して処理および定量した。Ｂ_Ｖａｘが全ＯＶＡ取り込み後にＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）を提示する能力を評価するために、細胞を１μｇ／ｍｌ全オボアルブミン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と５時間インキュベートした。Ｈ－２Ｋ^ｂによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）提示を、上記のようにフローサイトメトリーによって査定した。全ＯＶＡをパルスしたＢ_ＶａｘがＴＣＲトランスジェニックＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する能力を試験するために、脾臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離した。本発明者らは、以前に記載のように骨髄由来ＤＣを生成し（Ｍｉｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、交差提示の正の対照として使用した。ＯＶＡタンパク質をパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}（±ＩＦＮγ）、Ｂ_Ｖａｘ、およびＤＣを、固定可能な細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識したＣＤ８^＋Ｔ細胞と１：１の比でインキュベートし、組換えＩＬ２（３０Ｕ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で活性化した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を、フローサイトメトリーにより、細胞増殖（ｅＦｌｕｏｒ４５０希釈）およびＧｚｍＢの細胞内発現によって査定した。あるいは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドまたはＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞を、負の対照として使用した。ＭＨＣクラスＩを介したＡｇ提示の関与を試験するために、Ｂ_Ｖａｘを１０μｇ／ｍｌ Ｈ－２Ｋ^ｂ遮断Ａｂ（クローンＡＦ６－８８．５．５．３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で前処理した。Ａｂを、実験（７２時間）を通して毎日添加した。

【0067】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_ＶａｘのＡＰＣ機能。Ｒａｇ１欠損マウスに、２×１０^５個のオボアルブミンを過剰発現するＧＬ２６１神経膠腫細胞（ＧＬ２６１－ＯＶＡ）を同所注射した。腫瘍注射の７日後に、マウスに、２×１０^６個のＢ_Ｖａｘ細胞（上記のように全ＯＶＡでパルスした）および５×１０^６個のｅＦｌｕｏｒ４５０標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方をｉ．ｖ．共注射した。養子移入の７日後、マウスを屠殺した。腫瘍担持脳およびｄＣＬＮを、（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）に記載のように処理して単一細胞懸濁液を得た。ｅＦｌｕｏｒ４５０^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。あるいは、Ｂ細胞欠損μｕＭＴマウスに、１０^５個のＧＬ２６１－ＯＶＡを同所チャレンジした。７日後、マウスに、２×１０^６個の全ＯＶＡパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ｖａｘ、または２００ｎｇ／ｍｌ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ百日咳毒素（ＰＴＸ、Ｇｉｂｃｏ）にて３７℃で１時間前処置したＢ_Ｖａｘを静脈内投与した。注目すべきは、Ｂ_{Ｖａｘ（ＰＴＸ）}を、注射前にＰＢＳで３回洗浄した。Ｂ細胞養子移入の７日後に、マウスを屠殺し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、以下のＢｉｏＬｅｇｅｎｄの抗マウスＡｂ（別段の指定がない限り）を使用して、フローサイトメトリーによって分析した：ＣＤ４５ ＢＶ５１０（３０Ｆ １１）、ＣＤ１１ｂ ＢＶ７１１（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ８ ＢＶ６０５（５３－６．７）、ＣＤ４４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＩＭ７）、およびＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）－Ｈ－２Ｋ^ｂ ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏ２５－Ｄ１．１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。並列実験では、Ｂ細胞欠損μｕＭＴマウスを、１０^５個のＣＴ２Ａでチャレンジした。７日後に、マウスに、ＣＴ２Ａ細胞ライセートでパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ｖａｘ、またはＢ_Ｖａｘ＋ＰＴＸを静脈内投与した。Ｂ細胞養子移入の７日後に、マウスを屠殺し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、以下の抗マウスＡｂ（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手）を使用して、ＧｚｍＢおよびＩＦＮγの細胞内発現について分析した：ＣＤ４５ ＢＶ５１０（３０Ｆ １１）、ＣＤ１１ｂ ＢＶ７１１（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ８ ＢＶ６０５（５３－６．７）、ＧｚｍＢ ＡＦ６４７（ＧＢ１１）、およびＩＦＮγ ＡＦ７００（ＸＭＧ１．２）。全ての実験において、死細胞およびデブリを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して分析から除外した。細胞をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙによって取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。

【0068】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘの追跡。Ｂ細胞欠損μｕＭＴマウスを、１０^５個のＣＴ２Ａでチャレンジした。９日後に、マウスに、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で事前に標識した５×１０^５個のＢ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ｖａｘ、またはＢ_Ｖａｘ＋ＰＴＸを静脈内投与した。３日後に、マウスを屠殺し、腫瘍担持脳、血液、およびｄＣＬＮを、上記のようにフローサイトメトリーによってＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ^＋ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の存在について分析した。あるいは、腫瘍担持Ｒａｇ１欠損マウスに、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）赤色ＣＭＰＴＸ Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を同時に静脈内投与した。養子移入の３日後に、マウスを屠殺し、脾臓を回収した。組織試料を、ＯＣＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）に包埋し、瞬間凍結した。切片（６μｍ）を得て、Ｂ_Ｖａｘ（赤色細胞）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（緑色）の存在を、蛍光顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）によって分析した。データを、ＩｍａｇｅＪを使用して処理および定量した。

【0069】

ＥＬＩＳＡによる血清ＢＡＦＦの測定。マウスの眼窩後方から採血し、試料を室温で３０分間静置することによって凝固させた。１，０００～２，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離することによって凝塊を除去した。血清を、使用するまで－８０℃で保存した。ＢＡＦＦレベルを、製造者の指示通りにマウスＢＡＦＦ／ＢｌｙｓＴＮＦＳＦ１３Ｂ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して測定した。

【0070】

放射線によるｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘ適応。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０^５個のＣＴ２Ａ細胞で頭蓋内チャレンジした。７日後に、マウスを、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ（Ｂｅｓｔ Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して全身照射した（９Ｇｙ）。２日後に、マウスに、ＣＴ２Ａ担持ＣＤ４５．１マウス由来の５×１０^６個のＢ_Ｖａｘを静脈内投与した。細胞養子移入の７日後に、脾臓、ｄＣＬＮ、および腫瘍担持脳中のＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄの抗マウスＣＤ４５．１ ｅＦｌｕｏｒ４５０（Ａ２０）および総ＣＤ４５ ＰＥ（３０－Ｆ１１）を使用したフローサイトメトリーによって評価した。あるいは、ＣＤ４５．１^＋Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、抗ＣＤ４０およびＩＦＮγで活性化した４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞（Ｂ_Ａｃｔ）、およびＢ_Ｖａｘを、ＣＤ４５．１ ｅＦｌｕｏｒ４５０（Ａ２０）およびＣＤ４５．２ ＰＥ－Ｃｙ７（１０４）を使用したフローサイトメトリーによって測定した。マウスの一群に、１０μｇ／ｍｌ ＢＡＦＦ受容体遮断Ａｂ（７Ｈ２２－Ｅ１６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理したＢ_Ｖａｘを投与した。その後に、マウスに、１００μｇのＢＡＦＦ受容体遮断Ａｂを、７日間毎日腹腔内投与した。ｉｎ－ｖｉｖｏでのＢ細胞増殖を、Ｋｉ６７（ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の発現によって査定した。照射マウスにおけるリンパ球減少を、照射５日後の血液および脾臓中のＣＤ４５^＋白血球数によって査定した。並列実験では、２×１０^６個のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定可能な細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識したＤＣおよびＢ_Ｖａｘを、静脈内に注射した。マウスの一群に、ＤＣを皮内注射した。細胞養子移入の７日後に、マウスを屠殺し、細胞増殖を、フローサイトメトリーによってｄＣＬＮおよび脾臓中のＣＤ４５^＋細胞集団内のｅＦｌｕｏｒ４５０色素の希釈度として査定した。

【0071】

Ｂ_Ｖａｘの治療効果。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０^５個のＣＴ－２Ａ細胞を頭蓋内注射した。７日後に、マウスを、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ（Ｂｅｓｔ Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して全身照射した（９Ｇｙ）。２日後に、マウスに、上記のように分離および処理した１．５×１０^６個のＢ_Ｖａｘ±４～５×１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内投与した。

【0072】

あるいは、Ｂ細胞欠損マウスに、１０^５個のＣＴ－２Ａ細胞を頭蓋内注射した。９日後に、マウスに、上記のように分離および処理した１．５×１０^６個のＢ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ、またはＢ_Ｖａｘ±４～５×１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内投与した。並列実験では、Ｂ_Ｖａｘを、注射前に１０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢＬ遮断Ａｂ（クローンＴＫＳ－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で前処理し、マウスに、５００μｇ／Ｋｇを２回腹腔内注射した。

【0073】

ｉｎ－ｖｉｖｏでのＣＤ８^＋Ｔ細胞輸送のイメージング。Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｌａｇｏ小動物ライブイメージングシステムを使用して、神経膠腫担持マウスの脳へのＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉｎ－ｖｉｖｏ輸送を判定した。腫瘍移植の７日後に、マウスに、上記のように全身照射した（９Ｇｙ）。４８時間後に、各マウスに、５×１０^６個のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１．５×１０^６個のＢ_Ｖａｘ（ｉ．ｖ）または１．５×１０^６個のＤＣ（ｉ．ｄ）と共に静脈内投与した。計画された時点で（細胞養子移入の２４、３０、５０、および７２時間後に）、マウスを麻酔し、６４０ｎｍでの励起および６９０ｎｍでの発光を用いてスキャニングした。関心領域（ＲＯＩ）の蛍光強度を、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計算した。

【0074】

放射線、Ｂ_Ｖａｘ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および抗ＰＤ－Ｌ１の併用療法。ＲＴ、Ｂ_Ｖａｘ、および抗ＰＤ－Ｌ１の組み合わせを投与したマウスにおける養子移入したＣＤ８^＋Ｔ細胞の存続および記憶表現型を評価するために、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６を、２×１０^５個のＣＴ２Ａ細胞で頭蓋内チャレンジし、Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のドナーとして使用した。宿主マウスに、１０^５個のＣＴ２Ａ細胞を頭蓋内投与した。７日後に、マウスを全身照射した（９Ｇｙ、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ、Ｂｅｓｔ Ｔｈｅｒａｔｏｎｉｃｓ）。２日後に、マウスに、ＣＴ２Ａタンパク質ホモジネート（上記のように生成）でパルスした２×１０^６個のＢ_Ｖａｘを投与し、３×１０^６個のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ ＰＥ ＣＭＴＸ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内注射した。２４時間後に、マウスに、５００μｇ／マウスの抗ＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を腹腔内投与した。１０日後に、マウスを屠殺し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。以下の抗マウスＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、養子移入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を分析した：ＣＤ４５ ＢＶ５１０（３０Ｆ １１）、ＣＤ１１ｂ ＢＶ７１１（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ８＋ＢＶ６０５（５３－６．７）、ＣＤ４４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ ＢＶ４２１（ＭＥＬ－１４）、（５３－６．７）、ＣＤ４４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＩＭ７）。

【0075】

動物生存度におけるＲＴ、Ｂ_Ｖａｘ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および抗ＰＤ－Ｌ１の効果を試験するために、マウスに、腫瘍移植の７日後に全身照射した（９Ｇｙ、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ、Ｂｅｓｔ Ｔｈｅｒａｔｏｎｉｃｓ）。４８時間後に、マウスに、１．５×１０^６個のＣＴ２Ａタンパク質ホモジネートでパルスしたＢ_Ｖａｘ（Ｂ_{Ｖａｘ（ＣＴ２Ａ）}）および２×１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内投与した。２４時間後、マウスに、５００μｇ／マウスの抗ＰＤ－Ｌ１を腹腔内投与した。２日後に、マウスに、第２サイクルのＢ_{Ｖａｘ（ＣＴ２Ａ）}＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、その後２００μｇ／マウスの抗ＰＤ－Ｌ１を投与した。２日後に、マウスに、第３サイクルのＢ_{Ｖａｘ（ＣＴ２Ａ）}＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、その後２００μｇ／マウスの抗ＰＤ－Ｌ１を投与した。腫瘍注射の７５日後に、生存マウスの最初の注射部位に対して反対側の半球（左）に、１０^５個のＣＴ２Ａ細胞を頭蓋内に再チャレンジした。

【0076】

長期生存動物の脳の組織学的分析および免疫表現型分析。長期生存動物（ＬＴＳ）を、毎日モニタリングした。最初の腫瘍注射の２４５日後にマウスを屠殺した。３つの脳を、室温で２４時間ホルマリン固定した。注射針の痕を同定し、全てのマウス脳について矢状切断を行った。ＬＴＳについて、脳を、右半球（ＬＴＳ－Ｒ）および左半球（ＬＴＳ－Ｌ）に切断した。組織試料を、免疫組織化学評価のためにパラフィン包埋した。年齢適合（１０月齢）対照マウスを、ＣＴ２Ａ腫瘍注射（１０^５個の細胞／マウス、頭蓋内）の１４日後に屠殺した。全身腫瘍組織量を、Ｈ＆Ｅ染色によって分析した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤を評価するために、切片を、抗マウスＣＤ８（クローン４ＳＭ１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１／１００希釈）およびロバ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。試料の組織学的処理を、ノースウェスタン大学のＭｏｕｓｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＨＰＬ）で行った。５つの脳を、免疫細胞の表現型のために使用した。脳浸潤免疫細胞の免疫表現型分析のために、脳および末梢組織の試料を、（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）に以前に記載のように処理した。細胞を、以下の抗マウスＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄより入手）について染色した：ＣＤ４５ ＢＶ５１０（３０Ｆ １１）、ＣＤ１１ｂ ＢＶ７１１（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ４ ＰＥ－Ｃｙ７またはＡＦ７００（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ｂ ＦＩＴＣ（ＹＴＳ１５６．７．７）またはＣＤ８ ＢＶ６０５（５３－６．７）、ＣＤ４４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＩＭ７）、ＣＤ４４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＩＭ７）、ＫＬＲＧ１ ＡＰＣ（２Ｆ１／ＫＬＲＧ１）、ＴＩＧＩＴ ＰＥ－Ｃｙ７（１Ｇ９）、ＰＤ－１ ＦＩＴＣ（２９Ｆ．１Ａ１２）、Ｆｏｘｐ３ ＢＶ４２１（ＦＪＫ－１６Ｓ）、ＣＤ１９ ＰＥまたはＢＶ６０５（１Ｄ５）、４－１ＢＢＬ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＴＫＳ－１）、およびＬＡＰ／ＴＧＦβ ＰＥ（ＴＷ７－１６Ｂ４）。

【0077】

全脳放射線、テモゾロミドおよびＢ_Ｖａｘ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および抗ＰＤ－Ｌ１の併用療法。あるいは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０^５個のＣＴ－２Ａ細胞を頭蓋内注射した。７日後に、マウスの脳に、合計９Ｇｙ（３回×３Ｇｙに分割、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ、Ｂｅｓｔ Ｔｈｅｒａｔｏｎｉｃｓ）を照射した。腫瘍注射の１１日後に、マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＴＭＺを５日間連続して腹腔内投与した。最後のＴＭＺ投与から２４時間後に、マウスに、上記のように分離および処理した１．５×１０^６個のＢ_Ｖａｘ±４～５×１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を投与した。

【0078】

患者由来Ｂ_Ｖａｘの生成および自家ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化アッセイ。ＧＢＭ患者の末梢血試料をＥＤＴＡ処理したチューブに採取し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分離した。ＰＢＭＣのＢ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞分離キットＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して得た。次いで、４－１ＢＢＬ発現Ｂ細胞を、ヒト抗４－１ＢＢＬビオチン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびその後に抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して磁気分離した。４－１ＢＢＬ発現Ｂ細胞を、完全ＲＰＭＩ中に２×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁し、５μｇ／ｍｌヒト抗ＣＤ４０（クローン、ＦＧＫ４．５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で刺激した。２４時間後に、１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。細胞を、さらに２４～４８時間インキュベートした。Ｂ細胞に、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ活性化プロセスの全体にわたって１００ｎＭの組換えヒトＢＡＦＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離し、１０μＭのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ ４５０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した。細胞を、ＩＬ２（５０Ｕ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＴ細胞アクチベーターである抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）にて１：３のビーズ：Ｔ細胞比で活性化し、腫瘍浸潤Ｂ細胞またはＰＢＭＣ ＣＤ１９^＋Ｂ細胞と１：１の比で７２時間共培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖（ｅＦｌｕｏｒ４５０希釈）および活性化の状況（細胞内のＧｚｍＢおよびＩＦＮγの発現）を、フローサイトメトリーを使用して分析した。

【0079】

ヒトＢ_Ｖａｘ媒介自家ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化および腫瘍殺滅アッセイ。新たに切除した腫瘍試料を、剃刀の刃を使用してさいの目に切り、およそ２グラムの腫瘍組織あたり８ｍｇのコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、８０μｇ ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および４０μｇ ＴＬＣＫ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した４ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）からなる消化緩衝液を有する組織培養皿（直径１００ｍｍ）中にて３７℃で３０分間インキュベートした。試料を、１０分毎に数回ピペットで上下することによって混合した。次いで、細胞懸濁液を、組織ホモジナイザー（Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍ ＰＴＦＥ乳棒）を使用して、ＨＢＳＳ中で機械的に解離させた。細胞を、１％Ｂ２７サプリメント、０．２５％Ｎ２サプリメント、１％ペニシリンストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌヘパリン、２０ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦ、および２０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦを有する神経細胞用基礎培地中で腫瘍スフェロイドとしてｅｘ－ｖｉｖｏで培養した。末梢血を、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって処理して、末梢血単核球を得た。

【0080】

腫瘍ライセートの調製：腫瘍単一細胞浮遊液を、１０^６個の細胞／ｍｌＰＢＳで再懸濁し、５サイクルの凍結融解および１分間の超音波処理に供した。

【0081】

Ｂ_Ｖａｘの生成：Ｂ細胞を、ヒトＢ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離した。４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞を、抗ヒト４－１ＢＢＬビオチン（クローン５Ｆ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して磁気分離した。細胞を、２×１０^６個の細胞／ｍｌで、５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４０（クローン５Ｃ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および１００ｎＭの組換えヒトＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充したｃＲＰＭＩ中にて培養した。２４時間後、１０００Ｕ／ｍｌの組換えＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を培養物に添加し、さらに１８～２０時間培養した。Ｂ_Ｖａｘを腫瘍ライセートで３７℃にて５時間パルスした。細胞をｃＲＰＭＩで２回洗浄した。

【0082】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化アッセイ：ＰＢＭＣ分離後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離し、Ｂ_Ｖａｘが生成されるまで３０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と２４時間培養し、腫瘍ライセートでパルスした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定可能な細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識し、３０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ２を補充してＢ_Ｖａｘと１：１の比で混合した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーによって細胞増殖（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素の希釈度）および細胞内ＧｚｍＢの発現として査定した。

【0083】

腫瘍細胞の細胞傷害性アッセイ：Ｂ_Ｖａｘとの共培養後の活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害能を査定するために、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ８ ビオチン（クローンＳＫ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して磁気分離した。注目すべきは、対照群（Ｂ_Ｖａｘなし）およびＢ_Ｖａｘ処理群の両方で磁気分離した。分離したＣＤ８^＋Ｔ細胞に、標識したｅｘ－ｖｉｖｏ腫瘍細胞を種々のエフェクター：標的比で添加し、細胞傷害性を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞分析システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用してアッセイした。腫瘍細胞を、製造者のプロトコールに従ってＣＦＳＥで予め標識し、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１のエフェクター：標的細胞比でエフェクター細胞を添加した場合または添加しない場合の２５０ｎＭ ＩｎｃｙＣｙｔｅ Ｃｙｔｏｔｏｘ赤色試薬を有する９６ウェルプレート中で培養した。自発的標的細胞死（標的細胞のみ）および最大細胞死（標的細胞＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ）を説明するためのアッセイ対照を、細胞殺滅の定量を可能にするために含めた。生細胞画像（ウェルあたり４枚、１０倍対物レンズを使用）を、時間０から２．５時間までは３０分間隔で、その後、プレーティングから１２．５時間後のアッセイ完了までは１時間間隔で取得した。画像解析のために、５％緑色蛍光を赤色チャネルから取り出し、［総赤色カウント］の［総緑色細胞カウント］に対する比として各実験条件で定量した。アッセイを通して、総赤色カウントは細胞死を示し、総緑色細胞カウントは生存細胞および細胞増殖を示す。各条件の殺滅率（自発的および最大細胞死対照によって設定されたスケールとの比較）を計算するために、各条件で以下の計算を行った：％殺滅＝（％実験的放出－％自発的放出）／（％最大放出－％自発的放出）×１００。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析を、ノースウェスタン大学シンプソンクエリーインスティチュートの分析バイオナノテクノロジーコア施設で行った。ＡＮＴＥＣは、現在、Ｓｏｆｔ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ（ＳＨｙＮＥ）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＮＳＦＥＣＣＳ－１５４２２０５）から援助を受けている。

【0084】

Ｂ_Ｖａｘ由来ＩｇのＥＬＩＳＡ。Ｂ細胞サブセット由来Ｉｇサブタイプを、Ｉｇ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｔａｎｔ ＥＬＩＳＡ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して測定した。

【0085】

Ｂ_Ｖａｘ由来Ｉｇを使用した脳切片のＩＦ。ＣＴ２Ａ担持Ｂ細胞欠損マウスを、腫瘍注射の１４日後に屠殺した。マウスを、冷却ＰＢＳで灌流し、脳を採取し、ＯＣＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）中で凍結した。脳組織切片を、予め冷却したメタノールにて－２０℃で１０分間固定した。切片を洗浄し、ＰＢＳを用いて室温で２０分間再水和し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ＋５％ロバ血清（ＮＤＳ）にて室温で１時間ブロッキングした。マウス血清を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：１０に希釈し、ブロッキング緩衝液で洗浄せずに切片に適用した。切片を、室温でさらに２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５００に希釈した二次抗マウスＩｇＧであるＣｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて室温で４５分間染色した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ添加Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてマウントした。

【0086】

Ｂ_Ｖａｘ由来Ｉｇの精製。マウス血清ＩｇＧを、ＮＡｂ（商標）プロテインＡ／Ｇスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分離した。溶出したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ｍｌ ３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して濃縮した。最終ＩｇＧ濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。

【0087】

ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）反応性Ｂ_Ｖａｘ ＩｇのＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡ９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を、ＰＢＳで希釈したいずれかの１０μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で４℃にて一晩コーティングした。プレートを、０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄して、非結合ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）を除去した。体積１００μｌのＰＢＳ－ＢＳＡ １％を、室温で１時間のブロッキングのために使用した。５０マイクロリットル／ウェルの希釈したＩｇＧ試料を、対応するウェルに２連で添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。オボアルブミン特異的抗体を測定するために、ペルオキシダーゼに結合させた抗マウスＩｇＧを、１：１，０００に希釈してウェルに添加した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）。二次抗体を室温で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄し、５０μｌのホース－ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と結合させたストレプトアビジンをプレートに添加し、室温で２０分間インキュベートした。３回の洗浄後、５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによってシグナルを明らかにし、プレートを、室温にて暗所で１５分間インキュベートした。２５μｌのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を添加することによって反応を停止させた。４９２ｎｍでの光学密度を、Ｇｅｎｅｍａｔｅ Ｕｎｉｒｅａｄ８００プレートリーダーを使用して測定した。

【0088】

Ｂ_Ｖａｘ由来Ｉｇの治療効果。Ｂ細胞欠損マウスに、カニューレシステムを使用して１０^５個のＣＴ２Ａ細胞を頭蓋内投与した。簡潔に述べれば、マウスを麻酔し、長さ約１０ｍｍの皮膚切開を頭頂骨の中央前部に作製して頭蓋表面を露出させた。マウス用の２６ゲージの滅菌ガイドカニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ）を、上記のように腫瘍移植の間に生成した穿頭孔を介してマウス脳の深さ２ｍｍの位置に取り付けた。組織接着剤を穿頭孔周囲に塗布し、カニューレの突出部を確実に長期間安全に配置した。外科用接着剤を移植部位の周囲に使用して頭皮を閉鎖した。保護用のダミーカニューレを使用して、術後の回復期間中およびその後の観察期間に突出部を保護した。抗ＣＤ２０注射のために、３３ゲージの滅菌シリンジをガイドカニューレに挿入した。シリンジを、ガイドカニューレの先端から１ｍｍ突出するようにデザインされたスリーブで覆うことができる。精製された血清ＩｇＧ（１２．５μｇ／マウス／注射）を、脳（最終体積２．５μＬ／注射）に注射した。注射後、カニューレを、マウス用の３３ゲージダミーカニューレを使用して覆った。

【0089】

統計分析。データを、連続変数については平均±ＳＤとして、カテゴリー変数については数値（百分率）として示す。２群間の差を、必要に応じてスチューデントｔ検定またはウィルコクソンの順位和検定によって解析した。複数の群の間の差を、テューキーの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ、またはクラスカル・ワリスＨ検定後の事後Ｄｕｎｎの多重検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｓ）を必要に応じて使用して評価した。生存曲線を、カプラン・マイヤー法によって作成し、ログランク検定によって比較し、多重比較を、ボンフェローニの方法を使用して調整した。カテゴリー変数を、フィッシャーの正確検定またはカイ二乗検定を必要応じて使用して解析した。全ての検定は両側検定であり、０．０５未満のｐ値またはＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整偽発見率を有意と見なした。統計分析を、ＳＡＳ９．４およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０３を使用して行った。

【0090】

結果：
４－１ＢＢＬ発現Ｂ細胞の機能の状態
ＧＢＭ患者の末梢血では、４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞は、総ＣＤ４５^＋区画の１３．７５±２．３％であった（ＰＢＭＣ、ｎ＝９０、表１および図１Ａ）。これらの４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞は、４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞と比較して細胞内のＴＮＦαおよびＩＦＮγのレベル、ならびに活性化マーカーＣＤ８６およびＣＤ６９の発現レベルが増加し（図１Ｂ）、これらの細胞が活性化状態であることが示唆された。４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞の相対存在量は活性化ＣＤ６９^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞数の増加に関連し（図１Ｃ）、患者の免疫プロフィールが全身性に活性化されたことを示唆していた。したがって、細胞増殖（拡大増殖指数として測定、図１Ｄ）の増加ならびにエフェクターＩＦＮγおよびＧｚｍＢ発現細胞の拡大増殖（図１Ｅ）によって示されるように、ＧＢＭ患者由来４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞は、４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞と比較して外因性ＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３）の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞の共刺激を増強する能力がより高いことを示す。前臨床ＣＴ２Ａ神経膠腫マウスモデルでは、Ｂ細胞上の４－１ＢＢＬ発現は、腫瘍担持脳で検出されなかった。その発現は、腫瘍接種後の深頸リンパ節および浅頸リンパ節の両方（ＣＬＮ）由来のＢ細胞で有意により高く、Ｂ細胞による４－１ＢＢＬ発現の腫瘍媒介誘導が示唆された（図９Ａ）。Ｂ細胞がＣＤ８^＋Ｔ細胞を共刺激する能力は、４－１ＢＢＬ発現に大いに依存した。Ｂ細胞における４－１ＢＢＬの上方調節は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激およびＣＤ４０同族体の補助後に駆動される（Ｆｕｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。これらの所見の裏付けとして、ＢＣＲおよびＣＤ４０に刺激されたＢ細胞は、ＢＡＦＦの存在下でエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を促進することができた（図９Ｂ）。ＢＡＦＦの非存在下ではＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化機能が減弱したので（図９Ｂ）、この機能には、これらのＢ細胞が４－１ＢＢＬを発現する能力が必要であった。概して、これらのデータは、４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞エフェクター表現型を拡大増殖および促進することができる活性化された細胞であることを示唆している。

【表1】

略語：四分位間範囲：ＩＱＲ。

【0091】

ＣＤ４０およびＩＦＮγＲの刺激は、４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞のＡＰＣ表現型および機能を増強する。
ＣＤ４０ライゲーションは、Ｂ細胞の活性化、増殖、ならびにＡｇ提示および共刺激機能の増強をもたらす十分に研究された過程である（Ａｈｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）（図９Ｂ）。しかしながら、異なる炎症条件および自己免疫条件における免疫抑制性Ｂ細胞および制御性Ｂ細胞の生成にも関連している（Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。安定なＡＰＣであるＢ細胞を生成するために、ＩＦＮγＲはＢ細胞共刺激分子の発現を駆動することができるので（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、本発明者らは、ＩＦＮγＲの活性化を試験した。本発明者らは、ＩＦＮγが非刺激ヒトＢ細胞上のＣＤ８６（ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化における重要な共刺激分子（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４））の発現を上方調節することを観察した（図１０Ａ）。ＩＦＮγの活性化促進効果は、ＩＦＮγＲを欠損するＢ細胞を利用することによって証明された（図１０Ｂ）。しかしながら、ＩＦＮγのみではＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３）の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化できるようにＢ細胞を促進できず（図９Ｂ）、ＩＦＮγＲ刺激がＢ細胞媒介性のＣＤ８^＋Ｔ細胞共刺激を開始するよりもむしろ増強することができることが示唆された。さらに、本発明者らは、ＣＤ４０刺激およびＩＦＮγＲ刺激の両方がＣＤ８６をさらに上方調節することを認め（図１０Ｂ）、二重活性化がＢ細胞のＡＰＣ様表現型をさらに促進することができることを示唆していた。

【0092】

これらの結果に基づいて、ＣＤ４０アゴニズムおよびＩＦＮγを使用して、神経膠腫担持マウスの二次リンパ系器官（深頸リンパ節および浅頸リンパ節ならびに脾臓など）から分離した４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞をｉｎ－ｖｉｔｒｏで活性化した（図１０Ｃ）。ＢＡＦＦを使用して、Ｂ細胞生存度を増強した。合計４８時間の培養後、細胞を回収し、ＡＰＣマーカーの発現について評価した。ＢＡＦＦのみとインキュベートした４－１ＢＢＬ^－Ｂ細胞（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}と命名）と比較して、活性化された４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞（Ｂ_Ｖａｘと命名）は、その表面上で主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）－クラスＩ（Ｈ－２Ｋ^ｂ）およびＩＩ（ＩＡ^ｂ）の両方を上方調節した（図１０ＣおよびＤ）。オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）で細胞をパルスした後、Ｂ_Ｖａｘは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）－Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体ならびに共刺激マーカーＣＤ８６および４－１ＢＢＬを高度に共発現する（図１Ｆ）。

【0093】

プロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩを介して外因性の抗原をＣＤ８^＋Ｔ細胞に交差提示する能力が知られている（Ｆｕ ａｎｄ Ｊｉａｎｇ，２０１８）。Ｂ_Ｖａｘが交差提示できるかどうかを評価するために、Ｂ_Ｖａｘを蛍光コンジュゲートＯＶＡタンパク質（ＡｌｅｘａＦｕｏｒ４８８－ＯＶＡ、図１Ｇ）とインキュベートした。ＯＶＡタンパク質の取り込みを、落射蛍光顕微鏡法を使用して可視化した（図１Ｇ）。３時間後に、本発明者らは、フローサイトメトリー分析によって観察した場合にＢ_Ｖａｘが相当なレベルの表面Ｈ２Ｋ^ｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）複合体を有した一方で、ゴルジ輸送体阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）で処理したＢ_Ｖａｘではそうではなかったことを認めた（図１Ｈ）。次に、本発明者らは、ＯＶＡ－パルスしたＢ_ＶａｘがＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）特異的ＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する能力を評価した。本発明者らは、交差提示できるプロフェッショナルＡＰＣのゴールドスタンダードとして骨髄由来ＤＣを含めた。ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドでパルスしたＢ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ｖａｘ、およびＤＣは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖、およびそのグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の上方調節を誘導した（図１０Ｅ）。非パルス細胞（Ａｇなし）がＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化に失敗し（図１０Ｅ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）パルスＡＰＣがＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化できなかったので（図１０Ｆ）、この現象はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－ライゲーションに依存していた。しかしながら、Ｂ細胞およびＤＣをＯＶＡタンパク質でパルスした場合、Ｂ_ＶａｘおよびＤＣのみがＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を首尾よく活性化することができた（図１Ｉ）。ＭＨＣ－クラスＩを遮断するとＢ_ＶａｘのＡＰＣ機能が無効になった（図１Ｊ）。要するに、これらのデータは、Ｂ_ＶａｘがＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を促進するための適切な表面分子群を有し、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでプロフェッショナルＡＰＣとしてＭＨＣ－クラスＩを介して抗原を交差提示することができることを示唆している。

【0094】

Ｂ_Ｖａｘはｉｎ ｖｉｖｏでの強力なＡＰＣである
次に、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_ＶａｘのＡＰＣ機能を試験することを目的とした。最初に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＯＶＡタンパク質を過剰発現するＧＬ２６１（ＧＬ２６１－ＯＶＡ）を頭蓋内注射した。これらのマウスを、Ｂ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞のドナーとして使用した。Ｂ_ＶａｘをＯＶＡでパルスし、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素を使用して蛍光標識し、同時に、ＧＬ２６１－ＯＶＡ腫瘍を担持するＲａｇ１欠損マウスに静脈内注射した。Ｂ_Ｖａｘを投与すると、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}または未処置モック群と比較した場合に腫瘍担持脳および深ＣＬＮ内のｅＦｌｕｏｒ４５０^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞数が増加した（図２Ａ）。次に、ＧＬ２６１－ＯＶＡを担持するＢ細胞欠損（ＢＫＯ）マウスに、ＯＶＡをパルスしたＢ_Ｖａｘを投与した。処置したマウスは、腫瘍担持脳に浸潤している内因性のＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に増加した（図２Ｂおよび図１０Ｇ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにて百日咳毒素（ＰＴＸ）（Ｇタンパク質媒介細胞移動を阻害する）（Ｃｙｓｔｅｒ ａｎｄ Ｇｏｏｄｎｏｗ，１９９５）で前処置したＢ_Ｖａｘを投与したマウス群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞も誘導しなかった（図２Ｂ）。ＣＴ２Ａ神経膠腫モデルでは、ＣＴＡ－腫瘍ライセートでパルスしたＢ_Ｖａｘ（Ｂ_{Ｖａｘ（ＣＴ２Ａ）}）は、腫瘍担持脳内で活性化されたＧｚｍＢおよびＩＦＮγを産生するＣＤ８^＋Ｔ細胞数を増加させた（図２Ｃ）。Ｂ_{Ｖａｘ（ＣＴ２Ａ）}＋ＰＴＸを投与したマウスにおけるＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化の喪失は、Ｂ_Ｖａｘの組織動員の重要性を強調している。したがって、Ｂ_Ｖａｘは、同時静脈内注射後に二次リンパ系器官（脾臓およびＣＬＮなど）内でＣＤ８^＋Ｔ細胞と共存する（図２Ｄ）。さらに、Ｂ_Ｖａｘ（およびＢ_{Ｎａｉｖｅ}）が流入領域ｄＣＬＮおよび循環で検出された一方で、腫瘍担持脳内ではＢ_Ｖａｘのみが見出された（図１１Ａ）。本発明者らは、骨髄由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）が腫瘍付近に制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）を生成することを最近報告しているので（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｂ）、本発明者らは、次に、腫瘍浸潤Ｂ_Ｖａｘが免疫抑制性Ｂ細胞に変換され得るかどうかを判定した。本発明者らのデータは、腫瘍浸潤Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_ＶａｘがＣＤ８ Ｔ細胞活性化を促進するそれらの能力が異なることを示した。頭蓋内注射後に、Ｂ_ＶａｘはそのＣＤ８＋Ｔ細胞活性化機能を維持したのに対して、Ｂ_{ｎａｉｖｅ}を注射するとＴ細胞阻害をもたらした（図１１Ｂ、注射後）。要するに、これらの結果から、Ｂ_Ｖａｘが腫瘍免疫抑制に耐性であり、ｉｎ ｖｉｖｏでのそのＴ細胞活性化機能を維持したことが確認される。この裏付けとして、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}または活性化Ｂ細胞（Ｂ_Ａｃｔ）で処置したマウスと比較した場合に、Ｂ_Ｖａｘ治療はＣＴ２Ａ担持動物を延命した（モック生存日数中央値：２４；Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}：１７．５；Ｂ_Ａｃｔ：１８；Ｂ_Ｖａｘ：３４；モック対Ｂ_Ｖａｘ：ｐ＝０．００６；図１１Ｃ）。Ｂ_Ｖａｘの治療効果は、４－１ＢＢＬ遮断Ａｂを使用した場合に妨げられ（モック生存日数中央値：２３．５；Ｂ_Ｖａｘ：３５．５；Ｂ_Ｖａｘ＋抗４－１ＢＢＬ：２２．５；Ｂ_Ｖａｘ：３４；Ｂ_Ｖａｘ対Ｂ_Ｖａｘ＋抗４－１ＢＢＬ：ｐ＝０．００１６；図１１Ｄ）、この分子がＢ_Ｖａｘ媒介免疫機能において重要な役割を果たすことが示唆された。

【0095】

放射線治療は二次リンパ系器官内でのＢ_Ｖａｘの拡大増殖および存続を促進する
ＧＢＭ患者において、放射線およびテモゾロミド（ＴＭＺ）処置によってＢＡＦＦ（Ｂ細胞生存の重要な因子）の全身性の産生が増加することが報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓａｒａｓｗａｔｈｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これは、現在の処置がＢ細胞にｉｎ ｖｉｖｏでの適切な適応環境を提供する可能性があることを示唆している。この仮説を試験するために、ＣＴ２Ａ担持マウスに、リンパ球枯渇線量の照射を行った（ＲＴ、図１２Ａ）。次いで、マウスに、ＣＤ４５．１^＋コンジェニックマウスから得たＢ_Ｖａｘを投与した。５日後に、本発明者らは、ＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘカウントが無処置モック群と比較した場合にＲＴで処置したマウスにおいて増加したことを認めた（図３Ａ）。血清ＢＡＦＦレベルは、ＲＴ群において有意に高く、このレベルは実験中維持された（５日間、図３Ｂ）。腫瘍担持マウスにおけるＢＡＦＦレベルが無腫瘍マウスより低かったので、これは、腫瘍がＢ細胞の恒常性のバランスを破壊し、末梢区画で認められた劇的なＢ細胞枯渇を駆動し得ることを示唆している（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）。ＢＡＦＦが任意のＢ細胞サブタイプの生存因子であるので（Ｍａｃｋａｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，２００２）、本発明者らは、同一のＣＤ４５．１^＋Ｂ細胞の養子移入を行ったが、異なるＢ細胞サブセット（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、ＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮγで活性化されたが４－１ＢＢＬ^－であるＢ細胞（Ｂ_Ａｃｔ）、ならびにＢ_Ｖａｘなど）を使用した。全てのＢ細胞サブタイプは、脾臓で見出されたが、しかしながら、中枢神経系に流入することが公知（Ｌｏｕｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）のｄＣＬＮ中により多くのＢ_Ｖａｘが得られた（図３Ｃ）。ｄＣＬＮホーミングＢ_Ｖａｘの大部分は、Ｋｉ６７の発現によって示されるように、増殖細胞状態であった（図３Ｃ）。Ｂ細胞の前処置およびＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）遮断抗体の全身注射により、ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘのカウントが減少し（図３Ｄ）、ＲＴの際のＢＡＦＦ分泌がｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘ適応を制御することを示唆していた。

【0096】

次に、Ｂ_Ｖａｘの治療効果を、ＲＴで処置した場合または処置しなかった場合のマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。組織学によって腫瘍の生着および有意な腫瘍塊を確認した後に、ＣＴ２Ａ担持マウスを、腫瘍移植の７日後にＲＴで処置し、ＣＴ２Ａ－腫瘍ライセートでパルスしたＢ_ＶａｘをＲＴの２日後に静脈内注射した（図１２Ｂ）。腫瘍ライセートでパルスしたＢ_Ｖａｘは、ＲＴとの組み合わせにおいて、わずかではあるが有意に動物の生存期間を延長させた（モック生存日数中央値：１７；ＲＴ：１８；Ｂ_Ｖａｘ：２２；Ｂ_Ｖａｘ＋ＲＴ：２８．Ｂ_Ｖａｘ対Ｂ_Ｖａｘ＋ＲＴ ｐ＜０．０００１、図１１Ｃ）。ＲＴが総リンパ球数の減少を誘導したので（図１２Ａ）、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘの標的細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）の欠如がワクチンの治療有効性を制限しているのであろうと仮定した。したがって、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘ（腫瘍ライセートでパルスした）を、ＣＴ２Ａ神経膠腫担持マウスから得たＣＤ８^＋Ｔ細胞と同時に投与した。ＲＴおよび単回投与のＢ_Ｖａｘを受けたマウスは、全体的な生存度が改善した（モック対Ｂ_Ｖａｘ ｐ＝０．０００１）。しかしながら、Ｂ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を投与したマウスは、全ての他の群と比較してより長く生存した（モック生存日数中央値：１６日間；ＣＤ８^＋Ｔ：１９日間；Ｂ_Ｖａｘ：２７．５日間；Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ：３５日間、Ｂ_Ｖａｘ対Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ ｐ＝０．０００１、図３Ｅ）。腫瘍進行の後期でＢ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞で処置したマウスにおいて顕著ではないが類似の結果が得られた（腫瘍移植の１５日後；モック生存日数中央値：２０；Ｂ_Ｖａｘ（Ｄ９）：２６；Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ（Ｄ９）：３５；Ｂ_Ｖａｘ（Ｄ１５）：１９；Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ（Ｄ１５）：２５；Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ（Ｄ９）対Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ（Ｄ１５）ｐ＝０．０００３、図１２Ｄ）。Ｂ_Ｖａｘ（腫瘍ライセートでパルスした）＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の組み合わせの単回投与は、静脈内または皮内のいずれかに投与されたＤＣ（腫瘍ライセートでパルスした）と比較して治療上の利点を改善した（モック生存日数中央値：１６；ＣＤ８^＋Ｔ：２２；ＤＣ_（ｉｄ）＋ＣＤ８^＋Ｔ：１６；ＤＣ_（ｉｖ）＋ＣＤ８^＋Ｔ：２０；Ｂ_{Ｖａｘ（ｉｖ）}＋ＣＤ８^＋Ｔ：３４；ＤＣ_（ｉｖ）＋ＣＤ８^＋Ｔ対Ｂ_{Ｖａｘ（ｉｖ）}＋ＣＤ８^＋Ｔ ｐ＝０．００２９；図３Ｆ）。これらの異なる細胞ベースの治療のｉｎ ｖｉｖｏでの存続が異なる結果に関連するかどうかを試験するために、Ｂ_ＶａｘおよびＤＣを、細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０で蛍光標識し、ＲＴ処置したＣＴ２Ａ担持マウスに投与した。養子移入の５日後に、ｅＦｌｕｏｒ４５０^＋細胞を定量した。Ｂ_Ｖａｘの蓄積は、ＤＣよりも有意に高かった。ｅＦｌｕｏｒ４５０色素の希釈を試験することにより、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘの多くが増殖表現型を有することを認めた（図３Ｇ）。

【0097】

さらに、本発明者らは、遠赤外蛍光で標識し、Ｂ_ＶａｘまたはＤＣ（両方ともＣＴ２Ａ－腫瘍ライセートでパルスした）のいずれかを共注射したＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの追跡を行った。ＣＴ２Ａ担持脳内のＣＤ８^＋Ｔ細胞の蓄積は、注射の３０時間後に細胞をＢ_Ｖａｘと同時に投与した場合に増強された（図４Ａ）。後期の時点でのシグナルの減少は、色素蛍光の表示が制限されていることに起因し得る。したがって、並列実験では、マウスに、ＣＤ４５．１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＢ_ＶａｘまたはＤＣと共に投与した。細胞養子移入の５日後に、腫瘍担持脳を回収し、Ｋｉ６７の発現によって測定される、増殖しているＣＤ８^＋Ｔ細胞の量について評価した。図４Ｂに示すように、Ｂ_Ｖａｘを投与した動物は、より大量のＫｉ６７^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５．１^＋Ｔ細胞を示した。

【0098】

併用療法は動物を長期生存させる
Ｂ細胞の活性化により、免疫調節分子ＰＤ－Ｌ１の上方調節をもたらし得る（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。動物への注射時点でおよそ５０％の細胞がＰＤ－Ｌ１を発現するので、これはＢ_Ｖａｘの共通の特徴である（図１３Ａ）。Ｂ細胞によるＰＤ－Ｌ１の獲得ががんという状況での免疫抑制機能と関連するので、この現象はＢ_Ｖａｘの連続注射の有害作用に至り得る（Ｅｐｅｌｄｅｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）。したがって、本発明者らは、さらなる抗ＰＤ－Ｌ１処置がＢ_Ｖａｘのエフェクター機能および治療結果を改善し得るとの仮説を立てた。第１に、本発明者らは、ＲＴ後のＣＴ２Ａ担持マウスにおいてＢ_Ｖａｘ＋抗ＰＤ－Ｌ１がＣＤ８^＋Ｔ細胞の存続を改善するかどうかを評価した。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、親油性蛍光色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ）で蛍光標識した。養子移入の７日後に、マウスを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在量について評価した。腫瘍を担持する脳、ｄＣＬＮ、および脾臓は、Ｂ_Ｖａｘを抗ＰＤ－Ｌ１と共に投与した場合に養子移入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞のカウントが有意に増加した（図４Ｃ）。さらに、免疫表現型分析から、養子移入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^ＨｉＩＦＮγ^＋記憶表現型を獲得したことが明らかとなった（図４Ｄ）。

【0099】

次に、ＣＴ２Ａ担持マウスに、ＲＴおよびＣＴ２ＡライセートでパルスしたＢ_ＶａｘおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の３回の静脈内注射を行った。各細胞治療後に、マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１（それぞれ、５００、２００、および２００μｇ／マウス）を腹腔内注射した。この組み合わせにより、有意な臨床上の利点が得られ、８０％のマウスが長期間生存した（ＲＴなしの生存日数中央値：１８；モック（ＲＴ）：２５、抗ＰＤ－Ｌ１：２８；ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１：３９、Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１：未決定；抗ＰＤ－Ｌ１対Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１ ｐ＜０．０００１；図５Ａ）。腫瘍注射の７５日後に、生存マウスの反対側の半球に、ＣＴ２Ａを再チャレンジした（矢印、図５Ａ）。マウスはいかなる腫瘍成長の兆候も示さず、その臨床状態は不変であった。２４５日後に、生存マウスを屠殺し、脳を腫瘍塊およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方の存在について評価した。ＲＴ、Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞、ならびにＰＤ－Ｌ１遮断物で処置された長期生存動物（ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８）の脳切片を、右半球（第１の注射部位、ＬＴＳ－ＣＤ８＋Ｂ_Ｖａｘ Ｒ）および左半球（第２の注射部位、ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８ Ｌ）から得た。腫瘍注射の１４日後に屠殺された年齢適合対照ＣＴ２Ａ担持脳と比較して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）での染色によって測定したところ、腫瘍塊の兆候はなかった（図５Ｂ）。対照腫瘍担持脳内の大部分のＣＤ８^＋Ｔ細胞は腫瘍周囲に存在しており、その境界から外側のカウントは最小であった（図１３Ｂ）。対照的に、腫瘍塊を欠くＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８動物では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、注射部位付近に見出されたが、異なる位置（脈絡叢、橋、および小脳など）でもあった。このＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤パターンは、右半球および左半球の両方で類似していた（図５Ｃ）。さらなる免疫プロファイリング分析では、ＬＴＳ－ＣＤ８マウスおよびＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８マウスの両方の脳内の大部分の浸潤免疫細胞がＣＤ８^＋Ｔ細胞であるが明らかとなった（図５Ｄ）。さらに、ＬＴＳ－ＣＤ８＋Ｂ_Ｖａｘマウス由来の脳浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、活性化されたＩＦＮγ発現表現型を示した。重要なことは、対照の腫瘍担持脳由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較した場合に全てのＬＴＳ群において疲弊および／または阻害分子（ＰＤ－１、ＫＬＧＲ１、またはＴＩＧＩＴなど）の発現はほとんどないか全くなかった（図５Ｄ）。少量の骨髄性細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞のみが認められた。ＣＤ４^＋Ｔ細胞区画内で、Ｆｏｘｐ３の発現が劇的に減少した。ＬＴＳ－Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８脳のみが４－１ＢＢＬ^＋ＩＦＮγ^＋Ｂ細胞の蓄積が増加し（図１３Ｃ）、Ｂ_Ｖａｘ処置が炎症誘発性Ｂ細胞の蓄積も促進し得ることを示唆していた。要するに、データは、ＲＴ、Ｂ_Ｖａｘベースの免疫治療、およびチェックポイント遮断の組み合わせが腫瘍を首尾よく根絶させたことを実証している。この臨床所見は、脳内の機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤および存続に関連していた。

【0100】

Ｂ_ＶａｘはＧＢＭ標準治療と組み合わせると動物を延命する
次に、本発明者らは、ＣＴ２Ａ担持マウスにおける全脳照射（合計９Ｇｙ、３回×３Ｇｙに分割、Ｂ－ＲＴ）およびテモゾロミド（５０ｍｇ／Ｋｇの５回の腹腔内注射、ＴＭＺ）と組み合わせたＢ_Ｖａｘ処置の効果を評価した。全身ＲＴと同様に、血清ＢＡＦＦレベルを、ＴＭＺで処置した無腫瘍マウスおよびＣＴ２Ａ担持マウスにおいて評価し、このレベルはＢ－ＲＴと組み合わせた場合にさらに増加した（図６Ａ）。これは、標準治療がｉｎ ｖｉｖｏでのＢ細胞適合性を促進することができることを示唆している。これらの結果は、標準治療で処置したＣＴ２Ａ担持マウスの脾臓、ｄＣＬＮ、および腫瘍内の養子移入したＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘがより多数であることと関連していた（図６Ｂ）。Ｂ_Ｖａｘ治療の有効性を、Ｂ－ＲＴ（図６Ｃ）またはＴＭＺ（図６Ｄ）のいずれかで処置したマウスにおいて最初に評価した。本発明者らは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞と組み合わせたＢ_ＶａｘのみがＢ－ＲＴ処置後に動物を有意に延命したことを認めた（モック生存日数中央値：２０；Ｂ－ＲＴ：２６；Ｂ－ＲＴ＋ＣＤ８^＋Ｔ：２６；Ｂ－ＲＴ＋Ｂ_Ｖａｘ：２８、Ｂ－ＲＴ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ：３０。Ｂ－ＲＴ対Ｂ－ＲＴ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ ｐ＝０．０１；図６Ｃ）。ＴＭＺで処置した腫瘍担持マウスにおいて類似の結果が得られた（モック生存日数中央値：２０；ＴＭＺ：２１；ＴＭＺ＋ＣＤ８^＋Ｔ：２１；ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ：２１．５；ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ：２７．５。ＴＭＺ対ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ ｐ＜０．０００１；図６Ｄ）。次に、本発明者らは、Ｂ－ＲＴおよびＴＭＺの両方とのＢ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞治療の組み合わせを試験した。本発明者らはこのチェックポイント遮断ストラテジーがＢ_Ｖａｘと相乗効果を示して腫瘍を根絶することを以前に認めていたので、マウスの一群に抗ＰＤ－Ｌ１も投与した（図５Ａ）。この実験のために、マウスにＢ_Ｖａｘ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を２回連続して注射した。各細胞治療の後に、マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１を腹腔内注射した。この組み合わせにより、有意な臨床上の利点が得られ、５０％のマウスが長期間生存した（モック生存日数中央値：２０；Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ：２６；Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ：２９；Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ：３８．５；ＲＴ＋ＴＭＺ＋抗ＰＤ－Ｌ１：３２；ＲＴ＋ＴＭＺ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１：３３；ＲＴ＋ＴＭＺ＋Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１：５５；抗ＰＤ－Ｌ１対Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１ ｐ＜０．０００１；抗ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ８^＋Ｔ対Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ＋抗ＰＤ－Ｌ１ ｐ＜０．０００１；図６Ｅ）。要するに、このデータは、標準治療ストラテジー（Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ）、Ｂ_Ｖａｘベースの細胞治療、およびＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断の組み合わせが動物の生存度を有意に増強したことを実証している。

【0101】

ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘは自家抗神経膠腫ＣＤ８^＋Ｔ細胞を拡大増殖および活性化する
次に、本発明者らは、ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘが抗腫瘍ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を促進するそれらの能力を試験した。４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＧＢＭ患者の末梢血から分離後、マウスＢ_Ｖａｘと同一のプロトコールを使用してヒトＢ_Ｖａｘを生成した。次いで、本発明者らは、Ｂ_ｖａｘをパルスするためのタンパク質ホモジネートの供給源（腫瘍ライセート）として新たに切除した腫瘍を使用した（図１３Ｄ）。Ｂ_Ｖａｘ（±腫瘍ライセート）を、パルスしたＢ_Ｖａｘを自家ｅＦｌｕｏｒ４５０標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養することによってＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を誘導する能力について試験した。培養物に組換えヒトＩＬ２を補充し、外因性ＴＣＲ刺激物質（抗ＣＤ３／ＣＤ２８など）を培養物に添加しなかった。本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘと共に５日間培養したＣＤ８^＋Ｔ細胞が非常に拡大増殖し、高レベルのＧｚｍＢを発現したことを認めた。この所見は、自家腫瘍ライセートをパルスしたＢ_Ｖａｘにほぼ限定されていた（拡大増殖指数平均％±ＳＤ：Ｂ_Ｖａｘ対Ｂ_{Ｖａｘ（腫瘍ライセート）}３．１±１．８対６．０５±１．４、ｐ＜０．０５；ＧｚｍＢ発現の％（平均±ＳＤ）：Ｂ_Ｖａｘ対Ｂ_{Ｖａｘ（腫瘍ライセート）}２６．２±６．６対４９．３±１８．５５、ｐ＜０．０５、図７Ａ）。

【0102】

最後に、本発明者らは、活性化および拡大増殖されたＣＤ８^＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させる能力をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって試験した。結果は、新規に診断されたＧＢＭ（ＮＵ症例０２１２０、図７Ｂ）および再発（ＮＵ症例０２２６５、図７Ｃ）の両方の状況において、パルスしたＢ_Ｖａｘシステムによって活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞が神経膠腫細胞を潜在的に死滅させ、非腫瘍接着細胞を温存する（図１３Ｅ）ことができることを示していた。これらの結果は、Ｂ_ＶａｘのＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介抗神経膠腫免疫を促進する潜在能を確認するものである。

【0103】

Ｂ_Ｖａｘは腫瘍反応性免疫グロブリンを産生する
養子移入後に、およそ半分のＢ_ＶａｘがＣＤ１３８（シンデカン－１としても公知の最終分化したＡｂ産生細胞で発現される分子（ＭｃＣａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７））を発現する（図８Ａ）。したがって、次に、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘの体液性免疫応答およびＢ_Ｖａｘ由来Ａｂが腫瘍クリアランスに関与するかどうかを試験した。Ｂ_Ｖａｘ由来免疫グロブリン（Ｉｇ）を得るために、ＣＴ２Ａ担持マウスから得たＢ_Ｖａｘを、Ｂ細胞欠損（ＢＫＯ）ＣＴ２Ａ担持マウスに静脈内注射した。また、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_Ａｃｔを投与した対照群を試験に加えた。２週間後、マウスを屠殺し、血清を回収した（図８Ｂ）。血清試料を使用して、ＥＬＩＳＡを用いてＩｇサブタイプを測定した。本発明者らは、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}およびＢ_Ａｃｔが支配的にＩｇＭを産生し、一方で、Ｂ_ＶａｘはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂを主に産生したことを認めた（図８Ｃ）。並行して、血清試料を、免疫蛍光（ＩＦ）を使用してＢ細胞欠損マウス由来のＣＴ２Ａ担持脳上のＣＴ２Ａに対するその反応性について試験した。これらのマウスは成熟Ｂ細胞を欠損しているので、内因性Ｉｇの産生を欠いている。血清Ｂ_Ｖａｘ由来ＩｇＧの反応性は、健康な脳領域（Ｂ）と比較した場合に腫瘍領域（Ｔ）で高かったが、ＣＤ１１ｂ^＋骨髄性細胞で共標識しておらず（図８Ｄ）、Ｂ_Ｖａｘが腫瘍特異的Ａｂを産生することが示唆された。これらのＡｂが腫瘍関連Ａｇを認識することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、ＯＶＡ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）システムを利用した。Ｂ_Ｖａｘを、ＯＶＡを発現するＧＬ２６１腫瘍担持マウス（ＧＬ２６１－ＯＶＡ）から最初に生成し、次いで、ＧＬ２６１－ＯＶＡ担持Ｂ細胞欠損マウスに注射した。細胞養子移入の２週間後に、血清ＩｇＧを、プロテインＡ／Ｇカラムを使用して精製した。タンパク質濃度の正規化後、試料を、ＥＬＩＳＡを使用してそのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）反応性について試験した。本発明者らは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）免疫マウス由来のＡｂを正の対照として含めた。本発明者らは、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}由来ＩｇＧと比較した場合にＢ_Ｖａｘ由来ＩｇＧでＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）反応性が有意に増加したことを認めた（図８Ｅ）。次に、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘ由来ＩｇＧ（Ｂ_ＶａｘＩｇＧ）が腫瘍成長を制御することができるかどうかを試験した。Ｂ_Ｖａｘ由来ＩｇＧを前記のように回収し、頭蓋内注射した（３回連続、１２．５μｇ／注射）。Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}由来ＩｇＧ（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}ＩｇＧ）を対照として使用した。Ｂ_ＶａｘＩｇＧは、動物を有意に延命した（モック生存日数中央値：２０；Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}ＩｇＧ：１６；Ｂ_ＶａｘＩｇＧ：３１．５；モック対Ｂ_ＶａｘＩｇＧ：ｐ＝０．０１７；図８Ｆ）。これらの結果から、体液性エフェクター機能がＢ_Ｖａｘの抗腫瘍性において役割を果たすことが確認される。

【0104】

考察：
以前の研究において、本発明者らは、ＣＴ２Ａ神経膠腫モデルにおいて、Ｂ細胞が局所的に枯渇され、ほとんどの末梢Ｂ細胞が残っている場合にのみリツキシマブを使用したＢ細胞枯渇から有益な結果を得られることを報告していた（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）。対照的に、全身性のＢ細胞枯渇は、同一の治療効果が明らかになっていない。これは、異なる機能（抗腫瘍発生または腫瘍発生促進）を有するＢ細胞が腫瘍発生中に活性化され得る可能性を強調する。したがって、最近、腫瘍微小環境内のＢ細胞浸潤および細胞外小胞の形成が、黒色腫および肉腫におけるチェックポイント遮断に対する正の反応性と関連付けられている（Ｃａｂｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｈｅｌｍｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｐｅｔｉｔｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかしながら、ＧＢＭはＢ細胞浸潤を制限し（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｂ）、リンパ球枯渇を特徴とする（Ｔｈｏｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）ので、ＧＢＭは腫瘍微小環境内にこれらのリンパ構造を形成させない。しかしながら、いくつかのＢ細胞サブセットは、依然として抗腫瘍応答を促進することができるかもしれない。Ｂ細胞上に４－１ＢＢＬが発現されることにより、Ａｇを経験した活性化Ｂ細胞が識別される（Ｆｕｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞が、高レベルの炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦαなど）および共刺激分子（ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化に中心的な役割を果たすことが示されているＣＤ８６など）を発現することが以前に示されていた（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。神経膠腫担持マウスにおいて、４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞は、末梢リンパ系器官内で増加することが見出されており、これらは、腫瘍微小環境中で見出される免疫抑制性Ｂ細胞とは異なる（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）。ＧＢＭ患者の末梢血では、Ｂ細胞による４－１ＢＢＬの発現レベルとＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化状態（ＣＤ６９の発現）との間に関連があり、これらの患者内に炎症誘発性免疫シグネチャーが存在する可能性が示唆された。ｅｘ－ｖｉｖｏでのさらなる機能研究により、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化が４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞に関連することが確認された。したがって、本発明者らは、この珍しいが高度に活性化されたＢ細胞サブセットをＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介腫瘍殺滅を増強するための潜在的な細胞プラットフォームと見なした。

【0105】

４－１ＢＢＬは、４－１ＢＢ（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）（長期免疫学的記憶を確立するためにＡｇを経験したＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化で基本的役割を果たすＴＮＦ受容体ファミリー共刺激受容体）の公知の単一リガンドである（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、４－１ＢＢアゴニズムは、異なるがん（非ホジキンリンパ腫および黒色腫が挙げられる）の状況においてＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫を高めるための魅力的なストラテジーであり続けている（Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。Ｂ細胞中の４－１ＢＢＬ発現にはＢＣＲおよびＣＤ４０の刺激を必要とし（Ｆｕｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）、４－１ＢＢ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化し、抗腫瘍免疫を促進することができる活性化Ｂ細胞の特異的サブセットが明らかにされている（Ｂｏｄｏｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＰＣ表面上での４－１ＢＢＬの過剰発現は、このマーカーの異常な存在が急性炎症を誘発し得るので、一過性かつ厳密に制御されている（Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｖｉｎａｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，１９９８）。本開示では、本発明者らは、神経膠腫担持マウス（二次リンパ系器官）由来の４－１ＢＢＬ^＋活性化Ｂ細胞またはＧＢＭ患者由来ＰＢＭＣを細胞ベースのワクチン（本発明者らによりＢ_Ｖａｘと命名）の供給源として利用した。ＡＰＣ機能を増強および安定化する目的で、４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞を、ＣＤ４０およびＩＦＮγＲでの活性化を使用して短期間（４８時間）さらに活性化し、腫瘍タンパク質ライセートでパルスしてワクチンを生成した。ナイーブＢ細胞と異なり、Ｂ_Ｖａｘは、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでＤＣほどの強さで交差提示することができた；したがって、Ｂ_ＶａｘをプロフェッショナルＡＰＣと見なすことができる。これは、Ｉ型糖尿病の状況においてＢ細胞によって示された交差提示が自己免疫ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化するという以前の研究と一致する（Ｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ほとんどのＢ細胞ベースのワクチンは、総循環Ｂ細胞（ＣＤ２０マーカーまたはＣＤ１９マーカーを使用して分離した）を利用し、ＣＤ４０アゴニズム、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、恒常性サイトカイン（ＩＬ４またはＩＬ２１など）を使用してｅｘ－ｖｉｖｏで活性化される（Ｗｅｎｎｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。いくつかの研究では、ＣＤ２７^＋記憶Ｂ細胞が使用されている（Ｊｏｕｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、本開示では、本発明者らは、Ａｇを経験したＢ細胞の選別（４－１ＢＢＬを介する）および強力なＡＰＣ機能の付与をＢ細胞ベースの治療における固有のツールとして使用することができることを示す。しかしながら、マウスモデルおよびヒトにおける４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞の供給源が本開示を制限している。前臨床環境においてＢ_Ｖａｘ供給源として二次リンパ系器官を使用することを選択したのは、血液の体積（および循環中の４－１ＢＢＬ＋Ｂ細胞の相対的な希薄さ）ではマウス由来のＰＢＭＣから生成されたＢ_Ｖａｘを維持できないからである。

【0106】

ＧＢＭ患者では、放射線治療および化学療法の１つの結果はリンパ球減少であり、これは重症で持続し得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｎａｂｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。以前の研究では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ１９^＋Ｂ細胞がＲＴ／ＴＭＺの共投与に特に影響を受けることが示された（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。著者は、Ｔ細胞の恒常性因子（ＩＬ７またはＩＬ１５など）が不変であることを認め、このことは、患者によっては、Ｔ細胞が標準治療に対して特に脆弱であることを示唆している（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。並行研究では、ＲＴ／ＴＭＺ誘発リンパ球減少症患者において、Ｂ細胞生存因子ＢＡＦＦ（ＢＬｙＳとしても公知）のレベルが有意に上昇したことが認められ（Ｓａｒａｓｗａｔｈｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、標準治療がＢ細胞の適応および存続のためのより最適な環境を提供し得ることを示唆している。現在の細胞ベースの免疫治療ではＢ細胞がｉｎ－ｖｉｖｏで存続されないという重大な制限があるので、これは臨床的に意義がある（ＤｅＲｅｎｚｏ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，２０１９）。したがって、ＲＴ処置ＣＴ２Ａ担持マウスは、血中ＢＡＦＦが高レベルで維持された。ＢＡＦＦは、全てのＢ細胞サブタイプの普遍的な恒常性因子である。この所見は、全ての試験されたＢ細胞サブタイプ（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、Ｂ_Ａｃｔ、またはＢ_Ｖａｘ）がｉｎ－ｖｉｖｏで存続する能力に関連していた。ＢＡＦＦ受容体遮断Ａｂでの処置は、ｉｎ－ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘの生存度に影響を及ぼした。Ｂ_Ｖａｘの別の興味深い潜在能力は、そのＢＣＲレパートリーの決定、ひいては、その抗体特異性である。どのようにしてこれらの抗体が抗神経膠腫免疫または腫瘍進行に影響を及ぼし得るかについては、進行中の研究の課題である。

【0107】

二次リンパ系器官へのＢ_Ｖａｘの移動能力の遮断がＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化機能を抑制するので、Ｂ_Ｖａｘの組織動員はその有効性の基本となる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＢ_Ｖａｘとの間の依存性は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉｎ－ｖｉｖｏ追跡によって強く支持されており、Ｂ_Ｖａｘを同時に投与した場合に腫瘍担持脳内のＣＤ８^＋Ｔ細胞の蓄積が増強された。ＡＰＣによる最適なＴＣＲ刺激、その後のＴ細胞の出現は、相互作用の１～２日後に起こる（Ｍｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、脳内のＣＤ８^＋Ｔ細胞の最大の蓄積は、細胞Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞注射の３０時間後に認められた。

【0108】

多数の免疫細胞と同様に、活性化されたＢ細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、それは、炎症を制御するための機序としての可能性が最も高い。本発明者らは、このことをＢ_Ｖａｘおよび抗ＰＤ－Ｌ１免疫治療を組み合わせるための原理として使用した。Ｂ_Ｖａｘ＋抗ＰＤ－Ｌ１で処置すると、腫瘍担持脳および流入頸部リンパ節の両方においてＲＴの際にｉｎ－ｖｉｖｏでのＣＤ８^＋Ｔ細胞の存続が促進された。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、顕著な記憶表現型およびＩＦＮγの発現を示し、これは機能的な監視ＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡大増殖を示していた。これと一致して、Ｂ_Ｖａｘおよび抗ＰＤ－Ｌ１を反復投与すると、８０％の処置マウスにおいて反対側の半球への注射の際に、養子移入したＣＤ８^＋Ｔ細胞が腫瘍を根絶させ、その再成長を予防した。腫瘍根絶は、注射部位（チャレンジ部位および再チャッレンジ部位の両方）でのＣＤ８^＋Ｔ細胞の顕著な浸潤と相関していた。また、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、脈絡叢（脳脊髄液脳関門を介した中枢神経系（ＣＮＳ）免疫監視で基本的役割を果たすことが公知の構造）で見出された（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかしながら、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、小脳および橋のようなより遠位の部位にも存在し、ＣＮＳを保護するための臓器全体の監視が示唆された。したがって、ＣＮＳ浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、阻害分子（ＰＤ－１またはＴＩＧＩＴなど）の非存在とともに、ＩＦＮγおよびＣＤ４４の発現を特徴とする活性化表現型を示す。これらの所見は、完全に機能的な記憶様ＣＤ８^＋Ｔ細胞が標的器官で存続していることを示唆している。これらの細胞が養子移入したＣＤ８^＋Ｔ細胞のプールから生じるのか、またはＲＴ駆動リンパ球減少に起因するリンパ球補充の際に新たに分化した細胞から生じるのかについては、今後の研究対象である。活性化されたオリゴクローン性Ｂ細胞の蓄積は、ネオアジュバント処置の状況において免疫チェックポイント遮断に応答した転移性黒色腫患者の腫瘍で見出された（Ｈｅｌｍｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。また、Ｂ細胞系譜の遺伝子シグネチャーは、肉腫患者におけるＰＤ１遮断に対する応答性と相関していた（Ｐｅｔｉｔｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。患者の膠芽細胞腫はＢ細胞浸潤が低く、腫瘍微小環境で見出されたものは強力な免疫抑制性プロフィールを示す（Ｌｅｅ－Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｂ）。しかしながら、前臨床環境において、Ｂ_Ｖａｘ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方で処置されたＬＴＳは、脳内に炎症誘発性４－１ＢＢＬ^＋ＩＦＮγ＋Ｂ細胞が蓄積していた。これがＰＤ－Ｌ１遮断の状況でのＣＤ８ Ｔ細胞応答の増強で役割を果たすかどうかについては今後を待たねばならない。また、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子移入（Ｂ_Ｖａｘなし）および抗ＰＤ－Ｌ１の反復によっても処置マウスの小群で腫瘍を根絶させたことに留意することが重要である。これらの結果は、Ｂ_Ｖａｘとは独立した機序もＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性のＣＮＳ免疫監視を促進させることを示唆している。本発明者らは、抗ＰＤ－Ｌ１治療が腫瘍関連骨髄性細胞（ＴＡＭＣ）（ＧＢＭにおいて最も顕著な非新生物細胞集団）を直接標的にすることができるという仮説を唱えることができた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。全身ＲＴと共に、養子移入したＣＤ８^＋Ｔ細胞は、腫瘍微小環境内で成長し、ＧＢＭ細胞を死滅させることができた。

【0109】

全身ＲＴと同様に、Ｂ－ＲＴ＋ＴＭＺ治療は、標準治療（ＳｏＣ）を受けたＧＢＭ患者で認められるように、血清ＢＡＦＦレベルの増加を促進した（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓａｒａｓｗａｔｈｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。血清ＢＡＦＦレベルの増加は、ｉｎ－ｖｉｖｏでのＢ_Ｖａｘ存続の増強およびＢ_Ｖａｘの治療効果と相関していた。ＳｏＣ、Ｂ_Ｖａｘ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＰＤ－Ｌ１遮断物の組み合わせは、５０％の処置マウスにおいて腫瘍を根絶した。しかしながら、全身ＲＴで処置したマウスと異なり、全脳ＲＴで処置したマウスにおいてＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｂ_Ｖａｘなし）＋ＰＤ－Ｌ１遮断物の効果はほとんどないか全くなかった。これは、ＧＢＭ ＳｏＣがＢ細胞ベースの治療に養子移入治療のみを超える固有の利点を提供することを示唆している。

【0110】

最後に、本発明者らは、ＧＢＭ患者由来Ｂ_Ｖａｘを生成し、同一の患者由来の新たに切除した腫瘍に由来するタンパク質ライセートでのパルス後に、自家ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化および拡大増殖した。これらのＢ_Ｖａｘ活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、自家神経膠腫細胞を死滅させ、同時に、接着細胞を温存した。外因性活性化（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化）を行わない場合にはＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を誘導する必要があったという事実は、患者由来Ｂ_ＶａｘがＡｇを経験したＣＤ８^＋Ｔ細胞に腫瘍関連Ａｇを提示することを示唆している。ＧＢＭ患者では、末梢Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とクローン性を共有し（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、腫瘍特異的Ｔ細胞が循環中に存在し得ること、および、Ｂ_Ｖａｘがこれらの細胞を拡大増殖し、その細胞傷害効果を増強するための理想的なプラットフォームであり得ることを示唆している。

【0111】

動物の生存に基づいてＢ_ＶａｘがＤＣを凌ぐ１つの主な理由を、活性化されたＢ細胞が最終的にｉｎ－ｖｉｖｏでＡｂ産生細胞になるという固有の能力によって説明することができる。これらのデータは、Ｂ_Ｖａｘが、腫瘍細胞および腫瘍関連Ａｇに反応するＩｇＧを主に産生し、動物を延命することを示す。したがって、Ｂ_Ｖａｘは、血液脳関門を通過してＡｂ依存性細胞の細胞傷害性を介して腫瘍細胞を攻撃することができる腫瘍特異的Ａｂを産生し得る。しかしながら、本発明者らは、Ｂ_Ｖａｘが遊走して腫瘍に浸潤することができることも認めた。さらに、長期生存動物からの結果は、相当量の４－１ＢＢＬ^＋ＩＦＮγ^＋Ｂ細胞が腫瘍移植の２４５日後に脳内に存在することを示す。したがって、腫瘍浸潤Ｂ_Ｖａｘが異所性胚中心反応の原因となり、ｉｎ－ｓｉｔｕでのＡｂの供給源として作用することができるとの仮説を立てることができた。Ｂ_Ｖａｘ由来ＩｇＧの正確な反応性およびそのエフェクター免疫機能を解明するためにはさらなる研究が必要であるが、Ｂ_Ｖａｘが細胞性（ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性）および液性（Ａｂ産生）の機能の両方を融合させた固有の免疫治療プラットフォームを提供することは否定し難い。

【0112】

概して、本開示は、強力な細胞性および液性の免疫治療の供給源として４－１ＢＢＬ^＋Ｂ細胞を利用することを提案する。これは短期間のＣＤ４０およびＩＦＮγＲの活性化のみを必要とする自家ワクチンであり、その臨床解釈を非常に実行可能にする。

【0113】

実施例２－ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ_ｖａｘの表現型
材料および方法：
Ｂ_Ｖａｘ、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}、および腫瘍浸潤Ｂ細胞（ＴＩ Ｂ）のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）のＤＮＡ配列決定によって分析した（図１４）。有意に富化されたクローン型を、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈプラットフォームを使用して分析した。クローン型を、アミノ酸配列として分析した。

【0114】

Ｂ_ＶａｘおよびＢ_{Ｎａｉｖｅ}を、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから得た。Ｂ細胞を、腫瘍担持および非腫瘍担持のＢ細胞欠損マウス（ＣＤ４５．２遺伝子型）に静脈内移入した。血液、脳、深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）、および脾臓内のＣＤ４５．１^＋Ｂ細胞のカウントおよび表現型を、７２時間後にフローサイトメトリーによって分析した（図１５）。

【0115】

結果：
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）ＤＮＡ配列を、Ｂ_Ｖａｘにおいて分析し、ナイーブＢ細胞（Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}）および腫瘍浸潤（ＴＩ）Ｂ細胞におけるＩｇＨ配列と比較した（図１４Ａ）。Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}細胞およびＴＩ Ｂ細胞と比較してＢ_Ｖａｘで３つのクローンが有意に富化されたことが見出された（灰色、図１４Ｂ）。Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}と比較してＢ_Ｖａｘで６つのクローンが有意に富化され、これは、ＴＩ Ｂ細胞で非常に豊富なクローンと重複する（青色）。

【0116】

ＣＤ４５．１^＋ＣＴ２Ａ担持マウスから得たＢ_Ｖａｘを、ＣＤ４５．２^＋ＣＴ２Ａ担持マウス（Ｔ）およびナイーブマウス（ＮＴ）に静脈内注射した。７２時間後に、マウスを屠殺し、血液、腫瘍担持脳、深頸リンパ節（ｄＣＬＮ）、および脾臓内のＣＤ４５．１^＋細胞の存在について分析した。腫瘍担持脳のみがＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘを保有していた（図１５Ａ）。腫瘍担持脳に浸潤しているいくつかのＣＤ４５．１^＋Ｂ_Ｖａｘは、形質芽球マーカーＣＤ１３８の発現によって示されるように形質芽球様表現型を示した（図１５Ｂ）。

【0117】

考察：
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の配列決定により、Ｂ_{Ｎａｉｖｅ}と比較した場合に、集団として、Ｂ_Ｖａｘが９つの有意に富化されたＢＣＲクローンを含むことが明らかとなった。これら９つのクローンのうちで６つのクローンが内因性ＴＩ Ｂ細胞と重複し、細胞の異種Ｂ_Ｖａｘプール内でクローン集団が腫瘍反応性であることを示唆していた。この所見は、Ｂ_Ｖａｘが腫瘍内で形質芽球に分化して、腫瘍に対して特異的に向けられた抗体を局所的に産生し得ることを示唆している。

【0118】

参考文献：
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【配列表】

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【国際調査報告】